WO2016058074A1 - Composição de insetos parasitoides e fungos entomopatogênicos, método de disseminação e/ou vetorização de fungo entomopatogênico, uso da composição e método para controle biológico de pragas agrícolas - Google Patents

Composição de insetos parasitoides e fungos entomopatogênicos, método de disseminação e/ou vetorização de fungo entomopatogênico, uso da composição e método para controle biológico de pragas agrícolas Download PDF

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WO2016058074A1
WO2016058074A1 PCT/BR2015/050182 BR2015050182W WO2016058074A1 WO 2016058074 A1 WO2016058074 A1 WO 2016058074A1 BR 2015050182 W BR2015050182 W BR 2015050182W WO 2016058074 A1 WO2016058074 A1 WO 2016058074A1
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fungus
composition
flavipes
parasitoid
spores
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PCT/BR2015/050182
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Éder Antônio GIGLIOTI
Carlos Zanon SUARDI
Elaine Cristina Vicente BOVI
Francine Carla Morini RODRIGUES
Geovane César Bovi VICENTE
Inajara Dos Santos LIMA
Maria Luisa De OLIVEIRA
Mariza Lopes DURAN
Rosângela Marques ROMUALDO
Simone Ribeiro Da Silva BOVE
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Giglioti Éder Antônio
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    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/30—Microbial fungi; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
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    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to the biological control of agricultural pests. More specifically, the present invention relates to a composition of parasitoid insects and entomopathogenic fungi for biological control of agricultural pests. Additionally, the present invention further relates to a system of dissemination and / or vectorization of an entomopathogenic fungus, use of said composition and method for biological control of agricultural pests.
  • Pest damage has increased the importance of natural enemies due to the costs and negative social and ecological impacts of chemicals on the environmental balance.
  • Biological control is the use of an organism (predator, parasitoid or pathogen) that causes damage by attacking pests on crops. They are called population control agents and occur naturally in ecosystems.
  • Cultural practices such as genetically uniform monoculture plants, extensive and homogeneous planting of pest-susceptible cultivars and application of fertilizers at concentrations that favor increased insect density have strengthened the destructive potential of plant pests.
  • Biological control includes the conservation, inoculation and / or flooding of natural enemies in an environment.
  • Conservation is an indirect method and corresponds to agroecosystem management to ensure the preservation of natural enemies to restore or promote natural biological control. It is smart to consider the action of natural biological control and to seek the conservation of natural enemies in different agroecosystems, particularly those less impacted and ecologically fragile, as in the case of the Amazon.
  • the first microbial control work using entomopathogenic fungus was performed by Russian zoologist and pathologist Ilya Metchnikoff in 1879, who applied Metarhizium anisopliae to control larvae of a curculionidae, an important beet pest.
  • Krassilstschik continued research, producing in 1884 about 55 kg of the fungus, achieving control of 55 to 80% of insects in small areas, after ten to fifteen days of application.
  • Entomopathogenic fungi are microorganisms that cause diseases in insects, responsible for 80% of diseases that result in epizootic outbreaks of ecosystems and agroecosystems and are more easily disseminated, as some species have the ability to penetrate through the arthropod cuticle and directly reach to hemocele, even in the case of carapace scale insects.
  • the fungus Metarhizium is a deuteromycete of the Moniliaceae family that is characterized by attacking a large number of insect species. Widely distributed in nature, it can easily be found in soils, where it survives for long periods. The attacked insects become hard and covered with a powdery layer of conidia. At the end of conidiogenesis the corpse may show shades of green ranging from light to dark, gray or whitish with green dots.
  • the genus Metarhizium is believed to occur naturally over more than 300 species of insects of different orders, including major pests.
  • the genus Beauveria is a parasite of a large number of arthropods, occurring in over 200 species of insects and mites, including caterpillars and even ticks.
  • the attacked individuals are covered by white mycelium that sporulates under adequate conditions of humidity and light.
  • Beauveria bassiana is widespread in all countries, being the most frequent on insects and soil samples, where it can subsist for a long time in saprogenesis. This was the first fungus to be studied in detail by the Italian Agostino Bassi. Under laboratory conditions, it can colonize most insects, and in the field it occurs in the enzootic and epizootic form in beetles, lepidoptera, hemiptera and enzootic occurrences on dipteros, hymenoptera and orthoptera.
  • infection usually occurs via the integument, where the fungus germinates within 12 to 18 hours, depending on the presence of nutrients, represented by glucose, chitin, nitrogen and so on. Oral infection may occur for some insects, such as Solenopsis spp. It is also possible to penetrate via the respiratory system through the spiracle. Integumentary penetration occurs due to a mechanical and chemical (enzymatic) action, which takes about 12 hours. After 72 hours of inoculation, the insect is fully colonized, being the fat tissue heavily attacked, followed by intestinal tissue, Malpighi tubes and etc., resulting in death due to lack of nutrients and accumulation of toxic substances. Over the corpse occurs the formation of large quantities of conidiophores and conidia characteristic of the species, and within them, besides the fungal structures, crystals of different toxins occur.
  • Nomuraea The genus Nomuraea is characterized by having septate mycelia and phyllid conidiophores originating from the same point.
  • Nomuraea rileyi occurs naturally on pests of some economic crops.
  • the growth of the fungus in the culture medium is characterized by an "bacterial culture-like" yeast-like early stage whose duration is variable as a function of nutrition and may be 1-2 days in the medium with chrysalis flour. and from 4 to 5 days in SMAY, which slowly becomes mycelium, with abundant or sparse sporulation.
  • Alves (1998) described in his article that the fungus penetrates the insect, often via the integument, using mechanical pressure and enzymatic activities resulting from secretion of proteases, chitinases and lipases. Oral contamination has also been reported in Anticarsia gemmatalis caterpillars.
  • the complete cycle of the fungus on Trichoplusia ni caterpillars is 8 to 12 days at 25 ° C. According to Ignoffo (1981), germination can occur within 12 hours and hemocele invasion within 24 hours. Host colonization lasts about 3 to 5 days and death can occur between 6 to 7 days. Conidiophores and conidia form 8-12 days after the onset of infection.
  • the fungus N. rileyi has been extensively studied in recent years for its use in pest control. That This pathogen occurs in more than 32 insect species of the orders Coleoptera, Lepdoptera and Orthoptera. About 90% of hosts of ⁇ 7. rileyi belong to the order Lepdoptera.
  • soybean producers know the great efficiency of the fungus ⁇ 7. rileyi in the natural control of A. gemmatalis in rainy periods and under mild temperatures. These pathogens have caused epizootic diseases in pest populations, providing satisfactory control and contributing to decrease the use of pesticides.
  • the inoculum from fungus applications serves to contaminate the first nymphs or adults that, upon death, fall into the cane leaf cartridge or the top leaf sheaths of the pointer.
  • the fungus sporulates on the corpses, being the conidia carried by rain water, dew or wind to other parts of the plant.
  • the new nymphs that hatched from the eggs laid on the old leaves, the soil or the lower leaves of the plants are rising up the stalk towards the cane leaf cartridge when they come into contact with a large amount of inoculum produced by the corpses.
  • the abundant foam released by nymphs creates a pathogen-friendly environment. Many of these nymphs die forming the primary outbreaks of the disease, and others develop into contaminated adults who spread the disease through sugarcane.
  • Another example of pest control with entomopathogenic fungi is the control of the banana borer, Cosmopolites sordidus, which is one of the main pests of banana culture, with the fungi Metarhizium anisopliae and Beauveria bassiana. . Both larvae and adults open galleries in the rhizome and base of the pseudostem. Damage due to cluster size reduction can reach 50% of yield. In addition to this damage, the attack of the pest increases the fall of banana trees and also favors the attack of the fungus that causes panama disease. This pest is widespread in all banana producing regions.
  • Predators during their evolutionary cycle, can consume several prey. They are usually more generalist because they attack different species, which may belong to different families or orders, including pest insects or not. Parasitoids are generally more specific, ie specialized to certain hosts. Thus, they are usually more restricted to species, family or order.
  • the wasp locates D. saccharalis and through its ovopositor inserts the eggs into the caterpillar (inoculation), laying from 60 to 65 eggs. Egg deposition occurs in the hemocele of the caterpillars. After three or four days the larvae hatch, which pass through three instars, over a period of approximately four to twelve days. Third instar larvae have a bright milky white color and 10 to 15 days after inoculation pierce the caterpillar's integument and kill it exhausted. The larvae nest close to the D. saccharalis caterpillar and they are lined with white-colored cocoons that form a white-colored "mass". The adults are black and are 2 to 3 mm.
  • Biological control systems are widely used to control insects harmful to agricultural crops.
  • the most important pest species in agricultural crops such as sugar cane, soybeans, coffee, corn, tomatoes, sorghum, wheat and rice are termites (Hetterotermes tenius, Hetterotermes longiceps,
  • Procornitermes triacifer Procornitermes triacifer
  • Beetles Megdolus fryanus
  • Sugarcane borer Diatraea saccharalis
  • elasmo caterpillar Elasmopalpus lignosellus
  • root leafhopper Procornitermes triacifer
  • Beetles Megdolus fryanus
  • Sugarcane borer Diatraea saccharalis
  • elasmo caterpillar Elasmopalpus lignosellus
  • root leafhopper Procornitermes triacifer
  • Beetles Megdolus fryanus
  • Sugarcane borer Diatraea saccharalis
  • elasmo caterpillar Elasmopalpus lignosellus
  • root leafhopper Procornitermes triacifer
  • Beetles Megdolus fryanus
  • Sugarcane borer Diatraea saccharalis
  • elasmo caterpillar Elasmopalpus lignosellus
  • insects or parasitoids of the family can be controlled with predatory insects or parasitoids of the family: Syphidae, Tachinidae, Chrysopidae, Vespidae, Aphelinidae, Bethylidae, Braconidae, Chalcididae, Encyrtidae, Eulophidae, Ibaliidae, Ichneumonidae, Scelionidae, Trichogrammatidae,
  • Pentatomidae Redoviidae, Carabidae, Coccinellidae and Chrysopidae.
  • predatory or parasitoid insects and entomopathogenic fungi should be implanted shortly after pest detection to prevent a high rate of infestation and to keep the pest population under control.
  • predatory or parasitoid insects and entomopathogenic fungi are able to survive and continue to develop in the target pest itself after it has been controlled.
  • an alternative to controlling these pests would be the use of chemical pesticides that would not only attack the pest, but also some possible natural enemy of the pest, as well as having a great environmental impact and having a high cost.
  • Another alternative would be a biological control with the use of predatory insects or parasitoids following the use of entomopathogenic fungi, generating a high cost in the application.
  • the composition will act with the two biological control methods together, having greater efficiency by bringing entomopathogenic fungus spores directly to the target with greater control efficiency and a cost below separate applications.
  • a sampling is performed to determine the population density of the target pest, where the amount of individuals to be released in the area will be determined. After a few days of release a new sampling is performed to determine the control index of the target pest.
  • entomopathogenic fungus the most common application method is spraying, with aerial spraying as its most used technique, where it generates a very high cost with the transportation and storage of entomopathogenic fungus, which must be done in a refrigerated truck, labor for preparation of the application syrup and the biggest cost would be the airplane with its high expenses being they with fuel, maintenance and labor of the pilot.
  • aerial application is the weather conditions required for application, being days with high relative humidity, preferably with drizzle or drizzle so that the fungus can reach its target, which does not occur with the developed compound, since the predatory insect or parasitoid brings entomopathogenic fungus spores straight to the target.
  • One of the fundamental conditions for entomopathogenic fungus consolidation in the host is a firm adhesion of the spores to the insect cuticle.
  • PI 0504136-8 provides a composition containing only an isolated entomopathogenic fungus (Beauveria bassiana), grown and prepared in a talc formulation for use in coffee crops to prevent damage from the coffee borer (CBB). .
  • PI 0504136-8 does not mention or suggest use in conjunction with another entomopathogenic fungus or a parasitoid insect for dispersion of the claimed composition in coffee crops.
  • the insect pests mentioned in this document are cotton weevil (Anthonomus grandis, also known as cotton boll weevil), cotton (Pseudatomoscelis seriatus), and sweet potato whitefly (Bemisia tabaci).
  • the entomopathogenic fungi mentioned in the specification of said document may be used in the composition are Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae among others, although the embodiments of the invention presented use only the former.
  • PI 9205513-3 provides for a composition containing only one entomopathogenic fungus together with other components.
  • PI 9205513-3 uses components such as feed stimulants and pheromones to attract the pest to a bait in the form of liquid, powder, granules or small particles, where it is inoculated with the entomopathogenic fungus of the composition.
  • PI 9205513-3 does not mention or suggest use in conjunction with another entomopathogenic fungus or a parasitoid insect for the dispersion of the claimed composition in coffee crops.
  • document PI 9205513-3 provides for the control of different pests (cotton weevil (Anthonomus grandis, also known as cotton boll weevil), cotton flea (Pseudatomoscelis seriatus), and sweet potato whitefly (Bemisia tabaci). ) in a cotton plant culture, different from the present invention.
  • the pest insects presented in the examples of PI 9008037-8 are Germanic Blatella (German cockroach), American Periplanette (American cockroach), Fannia canicularis (small housefly), Musca domestica (domestic fly) and Diabrotica undecimpunctata (adult form of pest). corn root).
  • Document PI 9008037-8 provides for the use of an infection chamber which keeps the spores of entomopathogenic fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae protected from environmental conditions to which insects are attracted and inoculated. Fungi are grown within said chambers to continuously produce spores and prolong their effect.
  • PI 9008037-8 uses in its embodiment examples a composition containing the same entomopathogenic fungi of the present invention for combating an agricultural pest, PI 9008037-8 does not provide for the use of a parasitoid insect for spreading the composition. .
  • the present invention relates to a method for biological control of agricultural pests comprising biological compositions containing at least one entomopathogenic fungus population selected from Metarhizium anisopliae and Beauveria bassiana in combination with at least one predatory or parasitoid insect population, preferably Cotesia flavipes, which It is commonly used to control Diatraea saccharalis (sugarcane borer).
  • the method of application of the present invention is based on the spread of a parasitoid insect along with at least one entomopathogenic fungus, which is more efficient as predatory insects or parasitoids visit various pests, carrying thus efficiently and at low cost, entomopathogenic fungal spores them directly to agricultural pests.
  • WO 2013026114 relates to the preparation of a composition synergistic and its use to ensure high yield of maize crop, reducing overgrowth of maize plants and strengthening their root system and adventitious roots.
  • the fight against diseases and pests is also foreseen, since the increase in density creates a favorable environment for the growth of pests and diseases that do not normally affect this type of crop.
  • it is used as biological insecticide Metarhi zium anisopliae and to combat the weed borer Diatraea saccharalis, among others.
  • the main purpose of WO 2013026114 is to produce a composition which enables reduction in overgrowth of maize plants, as maize plants tend to overgrow for light and, as a result, break and fall, resulting in significant losses.
  • composition claimed in WO 2013026114 has in its composition biological agents, such as Metarhizium anisopliae, in combating the development and growth of pests, including the sugarcane borer Diatraea saccharalis, its main purpose is to reduction in overgrowth of maize plants.
  • the present invention relates to a method for biological control of agricultural pests comprising biological compositions containing at least one entomopathogenic fungus population selected from Metarhizium anisopliae and Beauveria bassiana in combination with at least one predatory or parasitoid insect population, preferably Cotesia flavipes, which is commonly used to control Diatraea saccharalis (sugarcane borer).
  • the application methods may be: seed coating, soil drenching, directly into soil furrows and / or foliar spraying.
  • the method of application of the present invention is based on the dissemination of a parasitoid insect together with at least one entomopathogenic fungus, which is more efficient, as predatory insects or parasitoids visit various pests, thus transporting efficiently and cost-effectively. entomopathogenic fungi spores directly to agricultural pests.
  • Use of a halogenated pesticide in combination with a biological pest control agent refers to the use of a composition comprising halogenated compounds selected from Formula (I) together with at least one biological control agent selected from a group that Contains entomopathogenic fungi for the control of agricultural pests in ornamental plants, lawns and forest trees, such as forest trees for food, feed, fuel and industrial purposes.
  • This preparation is advantageous as it broadens the spectrum of activity for other agricultural pests and / or pesticide resistant agricultural pest strains.
  • EP 2540165 describes the use of entomopathogenic fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae, the latter being preferred in combination with halogenated compounds selected from Formula (I).
  • the present invention relates to a method for biological control of agricultural pests comprising biological compositions containing at least one entomopathogenic fungus population selected from Metarhizium anisopliae and Beauveria bassiana in combination with at least one predatory or parasitoid insect population, preferably Cotesia flavipes, which is commonly used to control Diatraea saccharalis (Sugarcane borer).
  • the application methods may be: seed coating, soil drenching, directly into soil furrows and / or foliar spraying.
  • the descriptive report mentions application methods by dipping, spraying, irrigating, evaporating, dusting, misting, broadcasting, foam, painting, scattering, irrigating (dosing), and irrigation by drip.
  • the method of application of the present invention is based on the dissemination of a parasitoid insect together with at least one entomopathogenic fungus, which is more efficient, as predatory insects or parasitoids visit various pests, thus transporting efficiently and cost-effectively. entomopathogenic fungi spores directly to agricultural pests.
  • Pretreatment means that the fungus can be used prior to field release of wasp Cotesia flavipes.
  • Drill control Several measures are used for Integrated Prague Management. At the same time, when it says, it is saying that the two control methods, Metarhizium and Cotesia can be used in the same cycle of sugarcane crop without interfering with each other.
  • the present invention will provide significant advantages over existing biological pest control methods, enabling an increase in their performance and having a more favorable cost / benefit ratio.
  • the present invention relates to a novel method of biological control comprising at least one predatory or parasitoid insect population and at least one entomopathogenic fungus population.
  • the present invention relates to a novel method for spreading at least one entomopathogenic fungus population.
  • the present invention relates to a composition of at least one predatory insect or parasitoid population and an entomopathogenic fungus population for pest control in agricultural crops.
  • the present invention relates to the use of a composition of at least one predatory or parasitoid insect population and an entomopathogenic fungus population or the spreading system for pest control in agricultural crops.
  • Figures 1 to 17 show the graphs of C. flavipes mortality rate over the five days of evaluation, when gray matter (hatching point;
  • Figures 18 to 47 show the C. flavipes mortality rate graphs over the five days of evaluation, when inoculated with the different dosages in white mass, gray matter and hatched mass, respectively of isolates IBCB 215 and BBIO 195. ;
  • Figures 48 to 50 show the C. flavipes mortality rate graphs over the five assessment days when white, gray and hatched masses were inoculated, respectively;
  • Figure 51 shows the percentage mortality data at different stages of C. flavipes development
  • Figure 52 shows the average percentage of individuals parasitized by B. bassiana
  • Figure 53 shows a graph of the average colonies formed on composition (wasp + fungus) and control (wasp only).
  • Figure 54 shows a graph of the percentage of parasitism between composition (fungus + wasp) and C. flavipes.
  • Figure 55 shows a graph of the parasitism percentage of the entomopathogenic fungus and C. flavipes composition in the different inoculation methods.
  • Figure 56 shows a graph showing the percentage mortality of individuals of the entomopathogenic fungus composition after the third day in which they were prepared in the different inoculation methods.
  • Figure 57 shows a graph showing the average of colonies formed in the entomopathogenic fungus composition in the different inoculation methods.
  • Figure 58 shows a graph showing the amount of conidia carried by male and female C. flavipes individuals in the entomopathogenic fungus composition when prepared in the different inoculation methods.
  • Fig. 59 shows a graph of the average germinated spores per day;
  • Figure 60 shows a graph showing the percentage mortality of individuals from the entomopathogenic fungus composition after the third day when they were prepared with different amounts of C. flavipes individuals.
  • Figure 61 is a graph showing the average of colonies formed in the entomopathogenic fungus composition with different amounts of C. flavipes.
  • Figure 62 shows a graph of the amount of conidia carried by male and female C. flavipes individuals in the entomopathogenic fungus composition when prepared in different amounts of C. flavipes.
  • Figure 63 shows a graph of the parasitism percentage of the entomopathogenic fungus and C. flavipes composition, where the entomopathogenic fungus composition was prepared with different amounts of C. flavipes.
  • Figure 64 shows a graph of the average mortality of C. flavipes inoculated with isolate M1 on the days after laboratory inoculation;
  • Figure 65 shows a graph of the average mortality of C. flavipes inoculated with the M2 isolate in the days after laboratory inoculation
  • Figure 66 shows a graph of the average mortality of C. flavipes inoculated with isolate M3 in the days after laboratory inoculation;
  • Figure 67 shows a graph of the average mortality of C. flavipes inoculated with isolate M4 on days after laboratory inoculation
  • Figure 68 shows a graph of the average mortality of C. flavipes inoculated with isolate M5 in the days after laboratory inoculation.
  • Figure 69 shows a graph of the average mortality of C. flavipes inoculated with isolate M6 in the days after laboratory inoculation;
  • Figure 70 shows a graph of the average mortality of C. flavipes inoculated with isolate M7 in the days after laboratory inoculation;
  • Figure 71 shows a graph of the average mortality of C. flavipes inoculated with isolate M8 in the days after laboratory inoculation;
  • Figure 72 shows a graph of the average mortality of C. flavipes inoculated with isolate M9 in the days after laboratory inoculation.
  • Figure 73 shows a graph of the average mortality of C. flavipes inoculated with the M 10 isolate on the days after laboratory inoculation;
  • Figure 74 shows a graph of the average mortality of C. flavipes inoculated with isolate M 11 in the days after laboratory inoculation;
  • Figure 75 shows a graph of the average mortality of C. flavipes inoculated with isolate M 12 on days after laboratory inoculation
  • Figure 76 shows a graph of the average mortality of C. flavipes inoculated with isolate M13 in the days after laboratory inoculation;
  • Figure 77 shows a graph of the average mortality of C. flavipes inoculated with isolate M 14 on days after laboratory inoculation;
  • Figure 78 shows a graph of the average mortality of C. flavipes inoculated with isolate M 15 on days after laboratory inoculation;
  • Figure 79 shows a graph of the average mortality of C. flavipes inoculated with isolate M 16 in the days after laboratory inoculation;
  • Figure 80 shows a graph of the average mortality of C. flavipes inoculated with isolate M 17 in the days after laboratory inoculation;
  • Figure 81 shows a graph of the average mortality of C. flavipes inoculated with isolate M 18 in the days after laboratory inoculation.
  • Figure 82 shows a graph of the average mortality of C. flavipes inoculated with isolate M 19 on days after laboratory inoculation.
  • Figure 83 shows a graph of the average mortality of C. flavipes inoculated with isolate M 20 on days after laboratory inoculation;
  • Figures 84 to 98 are graphs of C. flavipes mortality rate over the five days of evaluation when inoculated with different dosages of white mass, gray matter and hatched mass, respectively of isolate IBCB 425;
  • Figures 99 to 113 show that the MBIO 104 isolate achieved a high mortality rate at dosages of 15 and 18 mg at all stages of C. flavipes development;
  • Figures 114 to 116 are graphs of C. flavipes mortality rate over the five days of evaluation when white matter, gray matter and hatched masses were inoculated, respectively;
  • Figure 117 shows a graph showing the mortality rate caused by Metarhizium spp over five days at different stages of C. flavipes development.
  • Figure 118 shows a graph of the parasitism percentage of the entomopathogenic fungus and C. flavipes composition, where the composition was prepared using different methods of Metarhizium spp inoculation.
  • Figure 119 shows a graph showing the percentage mortality of subjects in the composition after the third day when they were prepared with different Metarhizium spp inoculation methods.
  • Figure 120 shows a graph with the average of colonies. formed in the composition entomopathogenic fungus and C. flavipes prepared in different inoculation methods with Metarhizium spp.
  • Figure 121 shows a graph showing the amount of conidia carried by male and female C. flavipes individuals in the composition when prepared using different Metarhizium spp inoculation methods.
  • Figure 122 shows individuals of Diatraea saccharalis parasitized by C. flavipes and Metarhizium spp.
  • Figure 123 shows C. flavipes individuals in petri dishes (A) with BDA culture medium for evaluation of colony formation (B) of entomopathogenic fungi.
  • the present invention relates to a novel biological control method comprising at least one predatory insect or parasitoid population and at least one entomopathogenic fungus population which can be employed to create a biological control agent to be released in an agricultural crop. .
  • the invention relates to a novel method of vectoring and / or disseminating entomopathogenic fungi to be directed specifically to the target pest body by the parasitoid or predator insect.
  • the present invention also comprises a method for biological pest control in an agricultural crop employing the composition of at least one predatory insect or parasitoid population and at least one entomopathogenic fungus population and the vectoring and / or spreading systems according to the invention. invention.
  • the present invention relates to a novel method of biological control comprising at least one predatory or parasitoid insect population and at least one entomopathogenic fungus population.
  • the present invention relates to a novel method for spreading at least one entomopathogenic fungus population.
  • the present invention relates to a composition of at least one predatory insect or parasitoid population and at least one entomopathogenic fungus population or spreading system for pest control in agricultural crops.
  • the present invention relates to the use of a composition of at least one predatory or parasitoid insect population and at least one entomopathogenic fungus population or the spreading system for pest control in agricultural crops.
  • COMPOSITION was used to designate a composition of parasitoid insects and entomopathogenic fungi for biological control of agricultural pests.
  • a composition comprising an insect population is prepared.
  • predator or parasitoid and at least one entomopathogenic fungus population, in which the entomopathogenic fungus will remain associated with the predatory or parasitoid insect not killing it.
  • the predatory or parasitoid insect directs the entomopathogenic fungus to the target agricultural pest.
  • composition of a predatory or parasitoid insect population and an entomopathogenic fungus population By applying the composition of a predatory or parasitoid insect population and an entomopathogenic fungus population, excellent results will be obtained due to the fact that predatory or parasitoid insects go directly to the target (pest) carrying entomopathogenic fungus spores in their body. thus greater efficiency and effectiveness in pest control in agricultural crops with a lower application cost.
  • Table 1 Main predators / parasitoids, entomopathogenic fungi, pests, as well as the cultures, respectively, used with the present invention.
  • Entomopathogenic fungus Entomopathogenic fungus
  • a composition comprising the fungus Beauveria bassianae and the wasp Cotesia flavipes is prepared, in which the fungus remains associated with the wasp, the wasp acting as a vector of the fungus for agricultural pests.
  • the aim of this experiment was to evaluate the toxicity of Beauveria bassiana isolates on the Cotesia flavipes parasitoid, thus allowing the selection of less toxic isolates, optimizing the composition.
  • the rearing was carried out using D. saccharalis caterpillars as the third host. Parasitoid adults at 24 hours of age were confined in plastic cups (50 ml), containing a small hole in the lid of each cup for adult exit. Then, the caterpillars were placed close to the hole, aiming the deposition of the parasitoid eggs inside. After the parasitism, the caterpillars were transferred to polyethylene boxes, containing artificial diet, where they remained until the formation of the parasitoid pupae. The cocoa masses (pupae) were removed and transferred to plastic cups (150 ml), where they remained until the emergence of the adults.
  • Beauveria spp. Isolates were used. and standard IBCB 215 and those of Biointelligence do Brasil SA BBI01, BBI02, BBI03, BBI04, BBI05, BBI06, BBI07, BBI08, BBI09, BBIO10, BBI011, BBI012, BBI014, BBI015, BBI016, BBI017 Biofactory of Biological Control agents.
  • the isolates were refreshed at 3 instar caterpillars D. saccharalis.
  • the fungi were picked in BDA (potato dextrose agar) and, after seven days, the isolates of Beauveria spp.
  • the viability evaluation of the isolate was determined by counting the germinated and non-germinated conidia under optical microscope 16 hours after BDA plating, and 100 conidia were taken per plate to obtain the germination percentage.
  • the experimental design consisted of 22 treatments (including the control) with 04 replicates each treatment.
  • Beauveria bassiana isolate IBCB 215 conidia were weighed and stored in plastic tubes and used as standard.
  • the spores were weighed with the aid of an analytical balance to obtain a quantity of 0.012g (standard predetermined measure) that was stored in a plastic tube. This amount of spores was used to inoculate the cups on average 1500 individuals of C. flavipes. After inoculation, the cups were separated into plastic trays and classified into treatments.
  • Each treatment contained 20 cups, four for each of the five assessment days, totaling 380 cups in the experiment. Insect cups were kept in a climate-controlled room at a temperature of ⁇ 26 ° C, a relative humidity of 70 ⁇ 10% and a photophase of 12 hours.
  • the samples were destructive and mortality was evaluated daily for 05 days after fungal application. Subjects remained alive in the cups during the assessment days were released into the open area for 2 hours. The glasses with dead individuals were closed and stored for later counting of C. flavipes dead individuals per glass. The evaluated variable was the mortality of C. flavipes parasitoid in percentage (%). Cotesia flavipes counting software was used, considering that each cup initially placed 1,500 individuals of the parasitoid.
  • Figures 1 to 17 show graphs of C. flavipes mortality rate over the five days of evaluation, when gray masses were inoculated hatching).
  • the isolates BBI04, BBI05, BBI09, BBIO10, BBI012, BBI013, BBI017 presented the lowest toxicity.
  • the most suitable isolates for inoculating the cups during the composition manufacturing process presented the lowest toxicity.
  • the mortality rate over the days was high and these isolates were more toxic to the parasitoid and therefore should be avoided in the composition. of the product ( Figures 2 to 17). If these isolates are used, the inoculation method should provide as little contact as possible between fungus and Cotesia flavipes.
  • the rearing was performed using as standard host caterpillars of Diatraea saccharalis in the third instar for the creation of Cotesia flavipes.
  • Adults of the 24-hour parasitoid were confined in plastic containers (5 cm x 7 cm), containing a small hole in the lid for each adult exit. Then, the caterpillars were placed close to the hole, aiming the deposition of the parasitoid eggs inside. After parasitism, the caterpillars were transferred to plastic boxes with 19 partitions (30 x 18 x 04 cm), containing artificial diet, where they remained until the formation of the parasitoid pupae.
  • the parasitoid cocoon (pupae) masses were removed and transferred back to the inoculation cage, where they remained until the emergence of the adults.
  • the spores produced in plaque were inoculated in tubes containing autoclaved rice and kept in a climate room at 26 ⁇ 1 ° C, relative humidity of ⁇ 40% and photophase of 12 hours for 10 days. Ready, the tubes were transferred to autoclaved rice bags containing 500g each. After 3 days in the incubation room, after mycelium formation, the bags were selected for contamination, only uncontaminated bags were opened and their contents dumped into trays that were taken to the "Drying Room" at a temperature of 21 to 28 ° C and photophase of at least 16 hours. After 12 to 15 days, that is, when the sporulation of the fungus was completed, the material was dried to obtain the spores. Then the spores were stored in plastic bags. The viability evaluation of the isolate was determined by counting the germinated and non-germinated conidia under optical microscope 16 hours after plating in BDA + A, and 100 conidia were taken per plate to obtain the germination percentage.
  • the experimental design was factorial: 6 dosages X 3 stages of Cotesia flavipes X 2 isolated from Beauveria spp. For each treatment 4 repetitions were used, being the sample unit represented by a cup containing 30 masses of C. flavipes.
  • All treatments contained 60 cups each, totaling 360 cups for the IBCB 215 isolate and the same amount for the BBIO 195 isolate. Trays containing the insect-containing cups were kept on shelves in a climate-controlled room at ⁇ 26 ° C. relative humidity 70 ⁇ 10% and photophase 12 hours.
  • Figures 18 to 32 show the C. flavipes mortality rate graphs over the five days of evaluation, when they were inoculated with different dosages in white mass, gray mass and hatched mass, respectively of the IBCB 215 isolate.
  • the isolate reached a high mortality rate at 15 and 18 mg in all phases of C. flavipes development.
  • the insects reached a 50% mortality rate between the second and third day, remaining the same as the control.
  • the dosages of 9 and 12 mg in the white matter stage, there was no significant difference in the percentage of mortality between them and the control.
  • isolate BBIO 195 also achieved a high mortality rate. at dosages of 15 and 18 mg, at all stages of development of C. flavipes. At dosages of 6, 9 and 12 mg, in the white matter stage, the insects reached more than 60% mortality on the third day after inoculation, remaining the same as the control.
  • the best dosage for fungal inoculation in the vector insect is 12 mg of Beauveria spp. in the early stage (white mass) of C. flavipes development or during the beginning of hatching, due to no significant differences with the control, thus, the ideal methodology for the composition of the entomopathogenic fungus with the vector insect for the development of the composition. . Therefore, the present study defined the timing and dosage of Beauveria spp. in the composition.
  • composition must further consider this high toxicity and place at least 10% more individuals in the cups. This can be offset by choosing a less toxic isolate (another activity of the present project selected 4 less toxic isolates than the IBCB 215 standard).
  • the fungi used in the composition should have the lowest possible toxicity to C. flavipes. For this reason, in addition to selection of isolates and determination of optimal dosage, the optimal time for inoculation when toxicity is minimal should be determined. For this reason, the present experiment was conducted to evaluate the toxicity of Beauveria spp. at different stages of C. flavipes, determined the best time of inoculation of the Beauveria spp. in glasses containing C. flavipes, aiming at lower toxicity to the parasitoid in the composition.
  • Diatraea saccharalis caterpillars were used as standard host in the third instar for the creation of C. flavipes.
  • Adults of the 24-hour parasitoid were confined in plastic containers (5 cm x 7 cm) containing a small hole in the lid of each container for adult exit. Then, the caterpillars were placed close to the hole, aiming the deposition of the parasitoid eggs inside. After parasitism, the caterpillars were transferred to plastic boxes with 19 partitions (30 x 18 x 04 cm), containing artificial diet, where they remained until the formation of the parasitoid pupae.
  • the parasitoid cocoon (pupae) masses were removed and transferred back to the inoculation cage, where they remained until the emergence of the adults.
  • Plaque spores were inoculated into tubes containing autoclaved rice and kept in a climate room at 26 ⁇ 1 ° C, relative humidity of ⁇ 40% and photophase of 12 hours for 10 days. Ready, the tubes were transferred to autoclaved rice bags containing 500g each. After 3 days in the incubation room, after mycelium formation, the bags were selected for contamination, only uncontaminated bags were opened and their contents dumped into trays that were taken to the "Drying Room" at a temperature of 21 to 28 ° C and photophase of at least 16 hours. After 12 to 15 days, that is, when the sporulation of the fungus was completed, the material was dried to obtain the spores. Then the spores were stored in plastic bags. The viability evaluation of the isolate was determined by counting the germinated and non-germinated conidia under optical microscope 16 hours after plating in BDA + A, and 100 conidia were taken per plate to obtain the germination percentage.
  • the experimental design consisted of 06 treatments (including the control stages) with 04 replications each.
  • the conidia of isolate IBCB 215 from Beauveria spp. were weighed and stored in plastic tubes.
  • Each treatment contained 20 cups, totaling 120 cups per experiment.
  • Insect cups were kept in a room with a temperature of ⁇ 26 ° C, relative humidity of 70 ⁇ 10% and photophase of 12 hours. Mortality was evaluated daily for 05 days after fungal application. Subjects remained alive in the cups during the evaluation days were released in an open area for 2 hours. The cups with dead individuals were closed and stored for later counting of C. flavipes dead individuals per cup. The evaluated variable was the mortality of C. flavipes parasitoid in percentage (%), in its different stages of development. C. flavipes counting software was used, considering that each cup initially had 1500 individuals of the parasitoid.
  • Figures 48 to 50 show the C. flavipes mortality rate graphs over the five assessment days when white, gray and hatched masses were inoculated, respectively.
  • the white mass ( Figure 48) and hatched mass ( Figure 50) presented the lowest toxicity to the fungus of Beauveria spp. IBCB 215, these being, therefore, the most suitable moments for inoculation of the cups during the comosition manufacturing process.
  • the mortality rate reaches 100% already on the second day with the mass inoculated with the fungus, this being the most sensitive phase of the parasitoid and, therefore, should be avoided as inoculation moment (Figure 49).
  • the present experiment evaluated, under laboratory conditions, the percentage of Cotesia flavipes individuals that carry Beauveria spp spores in their body. The colonies formed in petri dishes with BDA culture medium were observed. Comparing the data obtained in the plot using Cotesia flavipes + Beauveria spp with the control data, which is the use of only Cotesia flavipes.
  • the isolate IBCB 215 obtained from the mycotheca of the Biofactory Laboratory of Biological Control Agents, was used. The isolate was chosen because of its use in sugarcane for the control of the Diatraea saccharalis pest, and based on preliminary tests. 0 isolate was refreshed crawlers 3 instar D. saccharalis.
  • the fungus was picked in yeast culture medium, incubated in a BOD type climate chamber at 26 ⁇ 1 ° C and 12 hour photophase, where they remained for 21 days.
  • the slab powder was applied to rice-containing tubes and kept in a climate room at 26 ⁇ 1 ° C for a period of 10 days.
  • the tubes were transferred to autoclaved rice bags containing 500g each. After 3 days in the incubation room, after mycelium formation, the bags were selected for contamination, only uncontaminated bags were opened and their contents dumped into trays that were taken to the "Drying Room" at a temperature of 21 to 28 ° C and photophase of at least 16 hours. After 12 to 15 days, that is, when the sporulation of the fungus was completed, the material was dried to obtain the spores. After the dry sporulated period, the rice was separated from the fungus powder in a brushing process and the powder was stored in plastic bags. The viability evaluation of the isolate was determined by counting the germinated and non-germinated conidia under optical microscope 16 hours after plating in BDA + A, and 100 conidia were taken per plate to obtain the germination percentage.
  • Caterpillars of Diatraea saccharalis were used as standard host in the third instar for the creation of Cotesia flavipes.
  • Adults of the 24-hour parasitoid were confined in plastic containers (5 cm x 7 cm), containing a small hole in the lid for each adult exit. Then, the caterpillars were placed close to the hole, aiming the deposition of the parasitoid eggs inside. After parasitism, the caterpillars were transferred to boxes plastic (2 x 6cm), containing artificial diet, where they remained until the formation of the parasitoid pupae. The cocoa masses (pupae) were removed and transferred back to the plastic container where they remained until the emergence of the adults.
  • Caterpillars of the species Diatraea saccharalis were obtained through artificial breeding carried out at the Biofabrica Laboratory of Biological Control Agents of the Bioimpuls do Brasil S / A Company in the city of Lucélia - SP.
  • the BDA Culture Medium (Potato + Dextrose + Agar) was used in the work, where it was weighed 39 grams of it for each liter of water, being autoclaved at 120oC for 30 minutes and then adding approximately 15 ml of culture medium. in each 9 cm x 1.5 cm Petri dish until a total of 200 culture medium plates are added.
  • the collected individuals were inserted into the Petri dishes with BDA culture medium and 5 individuals in each Petri dish, thus having 2 plates for each cup of Cotesia flavipes.
  • Annex 1 shows a photograph A) of the Petri dish with BDA culture medium and Beauveria spp colonies (composition); B) Petri dish with BDA culture medium and Cotesia flavipes individuals without colony growth (Control).
  • the composition must have high parasitism capacity of the target pest and should not affect the behavior and performance of Cotesia flavipes parasitoid. For this reason, the present experiment was conducted to evaluate the behavior and parasitism of the composition Cotesia flavipes + fungus Beauveria spp., In comparison with the control (Cotesia flavipes only).
  • the present experiment evaluated the composition parasitism of caterpillars of Diatraea saccharalis under cage conditions.
  • the composition Cotesia flavipes + fungus Beauveria spp.
  • Beauveria bassiana To obtain and produce Beauveria bassiana, we used the standard isolate Beauveria spp IBCB 215 obtained from the mycotheca of the Biofactory Laboratory of Biological Control Agents. 0 isolate was refreshed crawlers 3 instar D. saccharalis. For the bioassay, the fungus was subcultured in BDA + A (potato dextrose agar + streptomycin sulfate) and after seven days it was subcultured in complete medium (MC), incubated in a climate room at 26 ⁇ 1 ° C and photophase of 12 hours, where it remained for ten days.
  • BDA + A potato dextrose agar + streptomycin sulfate
  • Plaque spores were inoculated into tubes containing autoclaved rice and kept in a climate room at 26 ⁇ 1 ° C, relative humidity of ⁇ 40% and photophase of 12 hours for 10 days. Ready, the tubes were transferred to autoclaved rice bags containing 500g each. After 3 days in the incubation room, after mycelium formation, the bags were selected for contamination, only uncontaminated bags were opened and their contents dumped into trays that were taken to the "Drying Room" at a temperature of 21 to 28 ° C and photophase of at least 16 hours. After 12 to 15 days, that is, when the sporulation of the fungus was completed, the material was dried to obtain the spores.
  • the rice was separated from the fungus spores using brushes and sieves. Then the spores were stored in plastic bags. The viability assessment of the isolate was determined by counting the germinated and non-germinated conidia under optical microscope 16 hours after plating in BDA + A, and 100 conidia per plate were taken to obtain the germination percentage.
  • Caterpillars of Diatraea saccharalis were used as standard host in the third instar for the creation of Cotesia flavipes.
  • Adults of the 24-hour parasitoid were confined in plastic containers (5 cm x 7 cm), containing a small hole in the lid for each adult exit. Then, the caterpillars were placed close to the hole, aiming the deposition of the parasitoid eggs inside. After parasitism, the caterpillars were transferred to plastic boxes with (2 x 6cm), containing artificial diet, where they remained until the formation of the parasitoid pupae. The cocoa masses (pupae) were removed and transferred back to the plastic container, where they remained until the emergence of the adults.
  • Caterpillars of the species Diatraea saccharalis were obtained through artificial breeding carried out at the Biofabrica Laboratory of Biological Control Agents of the Bioimpuls do Brasil S / A Company in the city of Lucélia - SP.
  • the structures were assembled with a 2.5m x 2.5m dimension with iron frames. Mounted the skeletons of the cages, used for coating white fabric TNT to prevent C. flavipes from escaping. In Next was a sealed velcro door for entry and insect collecting. TNT openings were also made in the form of plastic sealed rectangles in each cage, so that they could have visibility from the outside into the cage, avoiding interference with the development of the experiment.
  • each cage Prior to each of the five repetitions of the experiment, with the aid of a spray bottle, each cage was sterilized with 70% alcohol and then placed 5 open BDA Petri dishes in each cage and left for 30 minutes to ensure that no there was the fungus of Beauveria spp. in the indoor environment. After this period to detect the presence of the fungus, the plates were sealed and incubated in a 26 ⁇ 1 ° C climate room for 10 days. Proving no contamination of the environment with the fungus, the cages were sterilized again and the experiment was started.
  • saccharalis caterpillar During this period, 180 boxes of 3.5 cm diameter polyethylene were sterilized, and 1.5 cm sugar cane cubes were cut to serve as food for the caterpillars. Both sugarcane canes and thatched cubes were sterilized with 70% alcohol, and 90 boxes of the composition and 90 Witness boxes (only wasp) were identified. After 5 hours he removed the caterpillars from the cage, first the Witness and then the composition with the help of tweezers. To avoid contamination and cannibalism, after each collection of each caterpillar, the forceps were sterilized and the caterpillars were individualized in the boxes. The sugarcane cubes for food were placed in the boxes and these were evaluated daily for 30 days. This procedure was repeated once a week for 5 weeks, constituting five randomized block repetitions.
  • composition with the composition C. flavipes + Beauveria spp. provided a significant increase in D. saccharalis parasitism, with an average of 52.6% against only 19.3% of C. flavipes control alone, ie, it was 2.7 times more efficient.
  • the composition was more effective in all of them, standing out in some with more than 20% parasitism than the Witness, in some having full fungal appearance in 5 days, while in the Witness the masses began to appear with 10 days. Therefore, in addition to increasing parasitism, the composition provided a faster death of the pest. By four days, the caterpillars parasitized by the fungus were already immobile and without food.
  • composition in all replications showed greater control efficiency, concluding that C. flavipes transports the entomopathogenic fungus Beauveria spp to the Diatraea saccharalis caterpillar, being a new alternative for more efficient control of the borer.
  • death is faster and fungal spores can contaminate other individuals in the same pest generation.
  • One of the factors that may explain the higher composition efficiency is the fact that C. flavipes male also acts as a fungus disseminator and vector and the female lands on more than one caterpillar taking the fungus to more individuals.
  • Caterpillars of Diatraea saccharalis were used as standard host in the third instar for the creation of Cotesia flavipes.
  • Adults of the 24-hour parasitoid were confined in plastic containers (5 cm x 7 cm), containing a small hole in the lid of each container for adult exit. Then, the caterpillars were placed close to the hole, aiming the deposition of the parasitoid eggs inside. After parasitism, the caterpillars were transferred to plastic boxes with 19 partitions (30 cm x 18 cm x 04 cm), containing artificial diet, where they remained for 14 days for the formation of the parasitoid pupae. The cocoa masses (pupae) were removed and transferred back to the inoculation cage, where they remained for six days until the adults emerged completely.
  • the IBCB 66 isolate supplied by the Biological Control Laboratory of the Campinas Biological Institute, was used. 0 isolate was refreshed crawlers 3 instar D. saccharalis.
  • the fungus was subcultured in yeast culture medium, incubated in a climate room at 26 ⁇ 1 ° C and 12 hours photophase, where it remained for 21 days.
  • the slab powder was applied to rice-containing tubes and kept in a climate room at 26 ⁇ 1 ° C for a period of 10 days. Ready, the tubes were transferred to autoclaved rice bags containing 500g each.
  • the bags were selected in relation to contamination, only the uncontaminated bags were opened and their contents dumped in trays that were taken to the "Drying Room" at a temperature of 21 to 28 ° C and photophase of at least 16 hours.
  • the material was dried to obtain the spores.
  • the rice was separated from the fungus powder in a brushing process and the powder stored in plastic bags. The viability evaluation of the isolate was determined by counting the germinated and non-germinated conidia under optical microscope 16 hours after plating in BDA + A, and 100 conidia were taken per plate to obtain the germination percentage.
  • the experiment was carried out at the Biofactory Factory of Biological Control Agents of the company Bioimpulsy do Brasil S / A.
  • the experimental design was completely randomized containing seven treatments with five replications each.
  • the plot was represented by a field containing 30 C. flavipes ash masses.
  • Figures 55 to 58 show the results graphs of the experiments on parasitism efficiency in caterpillars, individual longevity, colony growth and conidia count per individual of C. flavipes, respectively.
  • the hourly shake capsule and double sided tape methods reached 100% of total parasitism, while the hourly shake capsule methods presented 97.00% parasitism. by Beauveria bassiana.
  • Data obtained for C. flavipes longevity (Figure 56) provided mortality of 46.84% of individuals in the freshly stirred capsule method, indicating lower mortality compared even with the current inoculation method, which was 52.01%. .
  • Colony growth ( Figure 57) showed no considerable variation between unstirred capsule treatments (32 colonies), freshly stirred capsule (36 colonies), and shake-after capsule treatments (31 colonies).
  • the objective of this experiment was to evaluate the viability of Beauveria bassiana spores found in the composition through germination.
  • the peak of the highest efficiency of the composition is on the first day, on the other days there is a satisfactory decrease in the viability of the product, since we know that even if the composition is stored there will be no significant losses, since its decrease of Viability is only 11% by day four, a satisfactory result because it is a living organism.
  • the volumes of the containers used were 0.15Lt, 0.5Lt, 5Lt, 15Lt, 25Lt and 38 Lt, having respectively 1,500, 5,000, 50,000, 150,000, 250,000 and 380,000 individuals of Cotesia flavipes in each device.
  • B. bassiana IBCB 66 isolate obtained from the Biological Control Laboratory of the Campinas Biological Institute was used. The isolate was refreshed crawlers 3 instar D. saccharalis.
  • BDA + A potato dextrose agar + streptomycin sulfate
  • MC complete medium
  • the spores produced in plaque were inoculated in tubes containing autoclaved rice and kept in a climate room at 26 ⁇ 1 ° C, relative humidity of ⁇ 40% and photophase of 12 hours for 10 days. Ready, the tubes were transferred to autoclaved rice bags containing 500g each. After 3 days in the incubation room, after mycelium formation, the bags were selected for contamination, only uncontaminated bags were opened and their contents dumped into trays that were taken to the "Drying Room" at a temperature of 21 to 28 ° C and photophase of at least 16 hours. After 12 to 15 days, that is, when the sporulation of the fungus was completed, the material was dried to obtain the spores by brushing. Then the spores were stored in plastic bags. The viability evaluation of the isolate was determined by counting the germinated and non-germinated conidia under optical microscope 16 hours after plating in BDA + A, and 100 conidia were taken per plate to obtain the germination percentage.
  • the experiment was carried out at the Biofactory Biological Control Agents Laboratory of Bioimpulsy do Brasil S / A.
  • the experimental design consisted of six treatments (including the control stages) with four replications each.
  • the conidia of Beauveria bassiana isolate IBCB 66 were weighed and stored in plastic tubes.
  • the spores were weighed with the aid of an analytical balance to obtain the following quantities: 0.012g (0.15 Lt container), 0.04g (0.5Lt container), 0, 4g (5Lt container), 1.2g (15Lt container), 2g (25Lt container) and 3.04g (38Lt container) that were stored in a plastic tube. This amount of spores was used to inoculate the containers with C. flavipes adults.
  • Tl 1,500 individuals
  • T2 5,000 individuals
  • T3 50,000 individuals
  • T4 150,000 individuals
  • T5 250,000 individuals
  • T6 380,000 individuals.
  • Insect containers were kept in a climate-controlled room at a temperature of ⁇ 26 ° C, a relative humidity of 70 ⁇ 10% and a photophase of 12 hours.
  • Figures 60 to 63 present the graphs of results of evaluations of parasitism efficiency on caterpillars, individual longevity, colony growth and conidia count per individual of C. flavipes, respectively. According to the data obtained on parasitism efficiency (Figure 60) the different amounts of individuals and different recipients showed a high efficiency in all treatments. The data obtained from longevity ( Figure 61) showed no significant difference in the mortality of individuals, thus not reducing the useful life of the composition.
  • Colony growth shows that Cotesia flavipes individuals continue to carry conidia capable of forming Beauveria bassiana colonies in compositions with large numbers of individuals.
  • the data observed in the individual conidia count graph show that males also carry considerable amounts of spores, so males and females are effective for composition.
  • a composition comprising the fungus Metarhizium anisopliae and the wasp Cotesia flavipes, in which the fungus remains associated with wasp, the wasp acting as a vector of the fungus for agricultural pests.
  • the aim of this experiment was to evaluate the effect of Metarhizum anisopliae isolates on the Cotesia flavipes parasitoid, thus obtaining a less toxic isolate in association with Cotesia, thus making the composition possible.
  • the rearing was carried out using D. saccharalis caterpillars as the third host.
  • Parasitoid adults at 24 hours of age were confined in plastic cups (50 ml), containing a small hole in the lid of each cup for adult exit.
  • the caterpillars were placed close to the hole, aiming the deposition of the parasitoid eggs inside.
  • the caterpillars were transferred to polyethylene boxes, containing artificial diet, where they remained until the formation of the parasitoid pupae.
  • cocoa masses (pupae) were removed and transferred to plastic cups (150 ml), where they remained until the emergence of the adults.
  • Metarhizium anisopliae was obtained from the standard M. anisopliae isolate IBCB 425, MBI01, MBI02, MBI03, MBI04, MBI05, MBI06, MBI08, MBI08, MBIO10, MBI011, MBI012, MBI014, MBI015, MBI015 MBI017, MBI018, MBI019, MBIO20 obtained from the Biofactory Laboratory Laboratory of Biological Control Agents. The isolates were refreshed at 3 instar caterpillars D. saccharalis. For the bioassay, the fungi were picked in BDA (potato dextrose-agar) and after seven days, M.
  • BDA potato dextrose-agar
  • anisopliae isolates were picked again in BDA, incubated in a climate chamber at 26 ⁇ 1 ° C and a 12-hour photophase. where they stayed for ten days.
  • the spores produced in plaque were inoculated in tubes containing autoclaved rice, kept in a climate room at 26 ⁇ 1 ° C, relative humidity of ⁇ 40% and photophase of 12 hours, for a period of 10 days. Ready, the tubes were transferred to autoclaved rice bags containing 500g each.
  • the bags were selected for contamination, only uncontaminated bags were opened and their contents dumped into trays that were taken to the "Drying Room" at a temperature of 21 to 28 ° C and photophase of at least 16 hours.
  • the material was dried to obtain the spores.
  • the rice was separated from the fungus spores by brushing. Then the spores were stored in plastic bags.
  • the viability evaluation of the isolate was determined by counting the germinated and non-germinated conidia under optical microscope 16 hours after plating in BDA + A, and 100 conidia were taken per plate to obtain the germination percentage.
  • the experimental design consisted of 22 treatments (including the control) with 04 replicates each treatment.
  • the conidia of Metarhizium anisopliae isolate IBCB 425 were weighed and stored in plastic tubes and used as standard.
  • the spores were weighed with the aid of an analytical balance to obtain a quantity of 0.012g (standard predetermined measure) that was stored in a plastic tube. This amount of spores was used to inoculate the cups on average 1500 individuals of C. flavipes. After inoculation, the cups were separated into plastic trays and classified into treatments:
  • Table 1 Metarhizium anisopliae isolates used in the experiment.
  • the samples were destructive and mortality was evaluated daily for 05 days after fungal application. Subjects remained alive in the cups during the assessment days were released into the open area for 2 hours. The glasses with dead individuals were closed and stored for later counting of C. flavipes dead individuals per glass. The evaluated variable was the mortality of C. flavipes parasitoid in percentage (%). Cotesia flavipes counting software was used, considering that each cup initially had an average of 1500 parasitoid individuals.
  • Figures 64 to 83 graph the C. flavipes mortality rate over the five days of evaluation when ash masses were inoculated (almost hatching).
  • the isolates MBI01, MBI011 and MBI016 presented the lowest toxicity, being therefore the most suitable isolates for inoculation of the cups during the composition manufacturing process.
  • MBI02, MBI03, MBI04, MBI05, MBI06, MBI07, MBI08, MBI09, MBIO10, MBI012, MBI013, MBI014, MBI015, MBI017, MBI018, MBI019, MBIO20 the mortality rate over the days was high.
  • the objective of this experiment was to use different spore concentrations of Metarhizium spp. at different stages of development of Cotesia flavipes to determine the best dosage and lowest toxicity to make the composition.
  • the rearing was performed using as standard host caterpillars of Diatraea saccharalis in the third instar. for the creation of Cotesia flavipes.
  • Adults of the 24-hour parasitoid were confined in plastic containers (5 cm x 7 cm), containing a small hole in the lid for each adult exit. Then, the caterpillars were placed close to the hole, aiming the deposition of the parasitoid eggs inside. After parasitism, the caterpillars were transferred to plastic boxes with 19 partitions (30 x 18 x 04 cm), containing artificial diet, where they remained until the formation of the parasitoid pupae. The cocoa masses (pupae) were removed and transferred back to the inoculation cage, where they remained until the emergence of the adults.
  • isolates IBCB 425 and MBIO 104 were obtained from the mycotheca of the Biofactory Laboratory of Biological Control agents. The isolates were chosen due to their use in sugarcane for the control of the pest Mahanarva posticata, based on preliminary tests. The isolates were refreshed at 3 instar caterpillars D. saccharalis.
  • the fungi were picked in oat-based culture medium and incubated in a BOD type climate chamber at 26 ⁇ 1 ° C and a 12-hour photophase, where they remained for 15 days.
  • the slab powder was applied to rice-containing tubes and kept in a climate room at 26 ⁇ 1 ° C for a period of 10 days.
  • the tubes were transferred to autoclaved rice bags containing 500g each. After 3 days in the incubation room, after mycelium formation, the bags were selected for contamination, only the bags not Contaminants were opened and their contents dumped in trays that were taken to the "Drying Room" at a temperature of 21 to 28 ° C and photophase of at least 16 hours. After 12 to 15 days, that is, when the sporulation of the fungus was completed, the material was dried to obtain the spores. After the dry sporulated period, the rice was separated from the fungus powder in a brushing process and the powder was stored in plastic bags. The viability evaluation of the isolates was determined by counting the germinated and non-germinated conidia under optical microscope 16 hours after plating in BDA + A, and 100 conidia were taken per plate to obtain the germination percentage.
  • the experimental design was factorial: 6 dosages X 3 stages of Cotesia flavipes X 2 isolated from Metarhizium spp. For each treatment 4 repetitions were used, being the sample unit represented by a cup containing 30 masses of Cotesia flavipes.
  • Figures 84 to 98 show graphs of C. flavipes mortality rate over the five days of evaluation when inoculated with different dosages of white mass, gray matter and hatched mass, respectively of the IBCB 425 isolate.
  • the isolate achieved a high mortality rate at 15 and 18 mg in all stages of Cotesia flavipes development.
  • the insects reached a mortality rate above 50% between the second and third day, remaining the same as the control.
  • the MBIO 104 isolate achieved a high mortality rate at dosages of 15 and 18 mg at all stages of Cotesia flavipes development.
  • the best dosage for fungal inoculation in the vector insect for the IBCB 425 isolate is 12mg of Metarhizium spp.
  • Cotesia flavipes were in the early stage (white matter) of Cotesia flavipes development, due to no significant differences with the control.
  • the best dosage for fungal inoculation in the vector insect is 9 mg of Metarhizium spp.
  • the ideal methodology for the composition of the entomopathogenic fungus with the vector insect for the development of the composition object of the present invention due to not presenting significant differences with the control, thus, the ideal methodology for the composition of the entomopathogenic fungus with the vector insect for the development of the composition object of the present invention. Therefore, the present experiment defined the timing and dosage of Metarhizium spp. in the composition. The development of the composition must further consider this high toxicity and place at least 10% more individuals in the cups. This can be offset by choosing a less toxic isolate (another activity of the present project selected 4 less toxic isolates than the IBCB 425 standard).
  • the objective of this experiment is to determine the best time of inoculation of the fungus Metarhizium anisopliae in Cotesia flavipes cups, aiming at lower toxicity to the parasitoid in the composition.
  • Caterpillars of Diatraea saccharalis were used as standard host in the third instar for the creation of Cotesia flavipes.
  • Adults of the 24-hour parasitoid were confined in plastic containers (5 cm x 7 cm), containing a small hole in the lid for each adult exit. Then, the caterpillars were placed close to the hole, aiming the deposition of the parasitoid eggs inside. After parasitism, the caterpillars were transferred to plastic boxes with 19 partitions (30 x 18 x 04 cm), containing artificial diet, where they remained until the formation of the parasitoid pupae.
  • the parasitoid cocoon (pupae) masses were removed and transferred back to the inoculation cage, where they remained until the emergence of the adults.
  • M. anisopliae isolate IBCB 245 obtained from the mycotheca of the Biofactory Laboratory of Biological Control Agents was used. 0 isolate was refreshed crawlers 3 instar D. saccharalis.
  • BDA + A potential dextrose-agar + streptomycin sulfate
  • M. anisopliae isolate was picked again on BDA + A, incubated in a 26 ⁇ 1 climate chamber. ° C and photophase of 12 hours, where it remained for ten days.
  • the spores produced in plaque were inoculated in tubes containing autoclaved rice, kept in a climate room at 26 ⁇ 1 ° C, relative humidity of ⁇ 40% and photophase of 12 hours, for a period of 10 days. Ready, the tubes were transferred to autoclaved rice bags containing 500g each. After 3 days in the incubation, after the formation of mycelium, the bags were selected for contamination, only the uncontaminated bags were opened and their contents dumped into trays that were brought to the "Drying Room” at a temperature of 21 to 28 ° C and photophase of at least 16 hours. After 12 to 15 days, that is, when the fungus sporulation was completed, the material was dried to obtain the spores by brushing process.
  • the viability evaluation of the isolate was determined by counting the germinated and non-germinated conidia under optical microscope 16 hours after plating in BDA + A, and 100 conidia were taken per plate to obtain the germination percentage.
  • the experiment was carried out at the Biofactory Laboratory of Biological Control Agents of Bioimpuls S / A.
  • the experimental design consisted of 06 treatments (already including the control stages) with 04 replications each treatment.
  • the conidia of Metarhizium anisopliae isolate IBCB 245 were weighed and stored in plastic tubes.
  • Mortality was evaluated daily for 05 days after fungal application. Subjects remained alive in the cups during the assessment days were released into the open area for 2 hours. The glasses with dead individuals were closed and stored for later counting of C. flavipes dead individuals per glass. The evaluated variable was the mortality of C. flavipes parasitoid in percentage (%) in its different stages of development. Cotesia flavipes counting software was used, considering that each cup initially had 1,500 individuals of the parasitoid.
  • Figures 114 to 116 are graphs of C. flavipes mortality rate over the five assessment days when white matter, gray matter and hatched masses were inoculated, respectively.
  • the hatched mass ( Figure 116) presented the lowest toxicity to the fungus of Metarhizium anisopliae IBCB 245, which is therefore the best time for inoculation of the cups during the composition manufacturing process.
  • the mortality rate reaches 100% on the fourth day with the fungal inoculated mass, which is the most sensitive phase of the parasitoid and, therefore, should be avoided as inoculation moment (Figure 115).
  • Caterpillars of Diatraea saccharalis were used as standard host in the third instar for the creation of Cotesia flavipes.
  • Adults of the 24-hour parasitoid were confined in plastic containers (5 cm x 7 cm), containing a small hole in the lid for each adult exit. Then, the caterpillars were placed close to the hole, aiming the deposition of the parasitoid eggs inside. After parasitism, the caterpillars were transferred to plastic boxes with 19 partitions (30 cm x 18 cm x 04 cm), containing artificial diet, where they remained for 14 days. days for the formation of the parasitoid pupae. The cocoa masses (pupae) were removed and transferred back to the inoculation cage, where they remained for six days until the adults emerged completely.
  • the isolate IBCB 425 was used, supplied by the Biological Control Laboratory of the Biological Institute of Campinas. 0 isolate was refreshed crawlers 3 instar D. saccharalis.
  • the fungus was subcultured in yeast culture medium, incubated in a climate room at 26 ⁇ 1 ° C and 12 hours photophase, where it remained for 21 days.
  • the slab powder was applied to rice-containing tubes and kept in a climate room at 26 ⁇ 1 ° C for a period of 10 days. Ready, the tubes were transferred to autoclaved rice bags containing 500g each. After seven days the rice was removed from the sachets, remaining in the same open room for another seven days.
  • the fungal rice After being sporulated, the fungal rice remained for seven days in the drying room in a climate room at 26 ⁇ 1 ° C and relative humidity ⁇ 40%. After this sporulation and drying period, the rice was separated from the fungus powder in a brushing process and the powder was stored in plastic bags. The viability evaluation of the isolate was determined by counting the germinated and non-germinated conidia under optical microscope 16 hours after plating in BDA + A, and 100 conidia were taken per plate to obtain the germination percentage.
  • the experiment was carried out at the Biofactory Factory of Biological Control Agents of the company Bioimpuls do Brasil S / A.
  • the experimental design was completely randomized. containing seven treatments with five repetitions each.
  • the plot was represented by a glass containing 30 C. flavipes ash masses.
  • the IBCB 425 isolate from Metarhizium anisopliae was weighed with the aid of an analytical balance at a concentration of 50 mg per plastic tube.
  • C. flavipes adult glasses were exposed to the fungus in different methods, separated in plastic trays and classified into treatments: Tl - cups without the fungus (Witness); T2 - dusting the cups with 50 mg spores from a plastic tube (50 mg) each; T3 - sprinkled cups with a 25 mL solution of autoclaved water + 7.5 mL molasses + 50 mg pure spores; T4 - cups inoculated with a capsule punctured at both ends containing 50 mg of pure spores and the cups were not shaken; T5 - cups inoculated with a capsule punctured at both ends containing 50 mg of pure spores and the cups were shaken after inoculation; T6 - cups inoculated with a capsule pierced at both ends containing
  • Figures 118 to 121 present the graphs of the results of caterpillar parasitism efficiency, individual longevity, colony growth and conidia count by C. flavipes, respectively.
  • the double-sided tape and unstirred capsule methods reached a total parasitism percentage of 76.04% and 72%, and the last one showed Cotesia flavipes and Metarhizium anisopliae in the same 2% host ( Figure 122).
  • Data obtained for C. flavipes longevity ( Figure 119) provided mortality of 37.82% of individuals in the double-sided tape method, indicating lower mortality compared even with the current inoculation method, which was 54.70%.
  • Colony growth shows no growth in molasses spray treatment, double sided tape treatments (49 colonies), capsule shaken after hatching (40 colonies) and current method (39 colonies) obtained the highest results.
  • the device used in the composition is a capsule for conveying the fungal spore + pesticide acceptable carrier to the wasp.
  • the shell is made up of two open cylindrical gelatin or starch at one end with a hemispherical bottom with a capacity of 100 mg.
  • Fungus spores will be weighed together with the pesticide-acceptable vehicle following the amounts described in the table above (without device) and sprinkled under the wasp masses that are already ready to hatch and are packed in plastic cups.
  • the fungus spores will be weighed together with the poorly acceptable carrier following the amounts described in the above table (with device) and will be packaged in a 100 mg capacity gel or starch capsule.
  • This capsule will receive a hole at each end so that when the product goes into the field it will be agitated so that the spores of the fungally acceptable vehicle + fungus come out of the holes and spread under the Cotesia masses (cocoons).
  • After making the holes in the capsule it will be placed in a plastic cup containing the Cotesia masses (cocoons).
  • the shell is made up of two open cylindrical gelatin or starch at one end with a hemispherical bottom with a capacity of 100 mg.
  • Fungus spores will be weighed together with the pesticide-acceptable carrier following the amounts described in the above table (without device) and will be sprinkled under the wasp masses (pods) ready to hatch that are packaged in plastic cups.
  • the fungus spores will be weighed together with the pesticide-acceptable carrier following the amounts described in the above table (with device) and will be packaged in a 100 mg capacity gel or starch capsule.
  • This capsule will receive a hole at each end so that when the product goes into the field it will be agitated so that the spores of the pesticide-acceptable fungus + vehicle spill out of the holes and spread under the Cotesia masses (cocoons).
  • After making the holes in the capsule it will be placed in a plastic cup containing the Cotesia masses (cocoons).

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Abstract

A presente invenção se refere a urn novo método de controle biológico compreendendo pelo menos uma população de inseto predador ou parasitoide e pelo menos uma população de fungo entomopatogênico, assim como um veículo pesticidamente aceitável. A presente invenção se refere ainda a um novo método para disseminação de uma população de fungo entomopatogênico, assim como ao uso de uma composição de uma população de inseto predador ou parasitoide e uma população de fungo entomopatogênico ou ao sistema de disseminação para controle de pragas em safras agrícolas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: "COMPOSIÇÃO DE INSETOS PARASITOIDES E FUNGOS
ENTOMOPATOGÊNICOS, MÉTODO DE DISSEMINAÇÃO E/OU VETORIZAÇÃO DE FUNGO ENTOMOPATOGÊNICO, USO DA COMPOSIÇÃO E MÉTODO PARA CONTROLE BIOLÓGICO DE PRAGAS AGRÍCOLAS".
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção se refere ao controle biológico de pragas agrícolas. Mais especificamente, a presente invenção se refere a uma composição de insetos parasitoides e fungos entomopatogênicos para o controle biológico de pragas agrícolas. Adicionalmente, a presente invenção ainda se refere a um sistema de disseminação e/ou vetorização de um fungo entomopatogênico , uso da referida composição e método para controle biológico de pragas agrícolas.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Os avanços científicos e as inovações tecnológicas têm melhorado a produtividade da agricultura, porém criando-se um modelo dependente de insumos externos e insustentáveis em longo prazo. Além do mais, a agricultura convencional e os métodos de controle de pragas comumente provocam impactos negativos nos componentes dos agroecossistemas , sobretudo na fauna benéfica e no meio ambiente, tornando necessária a busca de novas abordagens para solucionar os problemas da agricultura industrial moderna.
Os danos provocados por pragas têm aumentado a importância dos inimigos naturais, em razão dos custos e impactos sociais e ecológicos negativos dos produtos químicos no equilíbrio ambiental.
0 controle biológico consiste no emprego de um organismo (predador, parasitoide ou patógeno) que causa danos atacando as pragas nas lavouras. São chamados de agentes de controle populacional e ocorrem naturalmente nos ecossistemas. Práticas culturais, tais como plantas geneticamente uniformes em monoculturas, o plantio extensivo e homogéneo de cultivares susceptíveis a pragas e aplicação de fertilizantes em concentrações que favorecem o aumento da densidade dos insetos têm fortalecido o potencial destrutivo das pragas de plantas.
0 controle biológico inclui a conservação, inoculação e/ou inundação de inimigos naturais em um ambiente. A conservação é um método indireto e corresponde ao manejo do agroecossistema para garantir a preservação dos inimigos naturais visando restaurar ou promover o controle biológico natural. É inteligente considerar a ação do controle biológico natural e buscar a conservação de inimigos naturais nos diferentes agroecossistemas , particularmente, naqueles menos impactados e frágeis ecologicamente, como no caso dos amazônicos.
0 sucesso de programas de controle biológico de pragas depende da produção uniforme de inimigos naturais com elevado desempenho biológico e reprodutivo, e que seja eficiente após a liberação no campo.
0 controle biológico de insetos não é uma técnica recente. Desde o séc. III a.C, formigas predadoras eram utilizadas pelos chineses para controlar pragas em plantas cítricas. Na Arábia medieval, os agricultores transportavam colónias de formigas predadoras para o controle de formigas fitófagas em palmáceas .
0 primeiro trabalho de controle microbiano usando fungo entomopatogênico foi realizado pelo zoologista e patologista russo Ilya Metchnikoff em 1879, que aplicou Metarhizium anisopliae para controle de larvas de um curculionídeo, importante praga da beterraba.
Krassilstschik continuou as pesquisas, chegando a produzir em 1884 cerca de 55 kg do fungo, conseguindo um controle de 55 a 80% dos insetos em pequenas áreas, após dez a quinze dias da aplicação.
Os estudos com fungo entomopatogênico no Brasil começaram em 1923, quando foram identificadas duas espécies de cigarrinha infectadas pelo fungo Metarhizium anisopliae . Esse fungo foi utilizado para combater a cigarrinha Tomaspis liturata, no primeiro trabalho de pulverização realizado no pais. (ALVES; FARIA, 2003).
Os fungos entomopatogênicos são microorganismos que causam doenças em insetos, responsáveis por 80% das enfermidades que resultam em surtos epizoóticos dos ecossistemas e agroecossistemas e são de mais fácil disseminação, pois algumas espécies possuem a capacidade de penetrar através da cutícula íntegra de artrópodes e atingir diretamente a hemocele, até mesmo no caso de cochonilhas providas de carapaça.
Existem fungos importantes no controle biológico de pragas em nível de campo. Entre eles, as espécies Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana e Nomuraea rileyi são as mais frequentes em agroecossistemas.
0 fungo Metarhizium é um deuteromiceto da família Moniliaceae que se caracteriza por atacar um grande número de espécies de insetos. Amplamente distribuído na natureza, pode ser encontrado facilmente nos solos, onde sobrevive por longos períodos. Os insetos atacados tornam-se duros e cobertos por uma camada pulverulenta de conídios. No final da conidiogenese o cadáver pode mostrar tons de verde que variam de claro a escuro, acinzentados ou ainda esbranquiçados com pontos verdes.
Acredita-se que o género Metarhizium ocorra naturalmente sobre mais de 300 espécies de insetos das diferentes ordens, incluindo pragas importantes.
De acordo com ST. LEGER et al . (1996), em seu artigo intitulado "Construction of an improved mycoinsecticide overexpressing a toxic protease", o processo de infecção do fungo Metarhizium anisopliae sobre os hospedeiros depende de uma sequência de eventos de ordem mecânica e bioquímica que ocorre de forma sincronizada pela deposição do conídio sobre a cutícula do hospedeiro, seguida pela germinação do conídio, penetração através da cutícula dada por ação mecânica-enzimática, invasão, colonização do corpo do inseto e produção de toxinas, exteriorização das estruturas fúngicas, produção de conídios sobre a carcaça do hospedeiro e disseminação. 0 tempo de infecção e colonização pode variar dependendo do hospedeiro e das condições ambientais. Mais detalhadamente, ALVES, (1998 b) descreveu que este ciclo apresenta as seguintes fases: adesão, germinação, formação de apressório, formação do grampo de penetração, penetração, colonização, reprodução e disseminação do patógeno.
0 género Beauveria é parasita de um grande número de artrópodos, ocorrendo em mais de 200 espécies de insetos e ácaros, incluindo lagartas e até carrapatos. Os indivíduos atacados apresentam-se cobertos por micélio branco que esporula em condições adequadas de umidade e luz .
A espécie Beauveria bassiana é de ocorrência generalizada em todos os países sendo a mais frequente sobre os insetos e em amostras de solo, onde pode subsistir por longo tempo em saprogênese. Esse foi o primeiro fungo a ser estudado com detalhes pelo italiano Agostino Bassi. Em condições de laboratório, pode colonizar a maioria dos insetos, sendo que em campo ocorre na forma enzoótica e epizoótica em coleópteros, lepidópteros , hemípteros e em ocorrências enzoóticas sobre dipteros, himenópteros e ortópteros .
De acordo com o trabalho de Robinson 1966, a infecção ocorre normalmente via tegumento, onde o fungo germina em 12 a 18 horas, dependendo da presença de nutrientes, representados por glucose, quitina, nitrogénio e etc. A infecção oral pode ocorrer para alguns insetos, como é o caso de Solenopsis spp . , sendo também possível a penetração via sistema respiratório pelo espiráculo. A penetração tegumentar ocorre devido a uma ação mecânica e química (enzimática), o que leva cerca de 12 horas. Decorridas 72 horas da inoculação, o inseto apresenta-se totalmente colonizado, sendo o tecido gorduroso bastante atacado, seguido por tecido intestinal, tubos de Malpighi e etc, advindo a morte em função da falta de nutrientes e do acúmulo de substancias toxicas. Sobre o cadáver ocorre a formação de grandes quantidades de conidióforos e conídios característicos da espécie, e dentro deles, além das estruturas fúngicas, ocorre cristais de diferentes toxinas.
Barson (1977) comentou em seu artigo intitulado "Laboratory evaluation of Beauveria bassiana as a pathogen of the larval stage of the large elm bark beetle, Scolytus scolytus" que as condições favoráveis para o desenvolvimento de Beauveria sobre os insetos são umidade relativa em torno de 90% e temperatura na faixa de 23 a 28° C, sendo o limite mínimo e máximo de crescimento aproximadamente de 5 a 35° C, respectivamente, dependendo do isolado do fungo. Temperaturas altas e baixas retardam o desenvolvimento da doença. As altas são mais prejudiciais ao patógeno, o qual tem sido referido como capas de causar infecções em temperaturas de 0 a 5°C.
0 género Nomuraea caracteriza-se por apresentar micélio septado e conidióforos com fiálides originando-se do mesmo ponto.
A espécie Nomuraea rileyi, ocorre naturalmente sobre pragas de algumas culturas económicas. Em muitas regiões do mundo, o crescimento do fungo em meio de cultura caracteriza-se por um estágio inicial leveduriforme "semelhante à cultura de bactéria" cuja duração é variável em função da nutrição, podendo ser de 1 a 2 diasno meio com farinha de crisálida e de 4 a 5 dias em SMAY, no qual vagarosamente vai se transformando em micélio, com esporulação abundante ou esparsa.
Alves (1998) descreveu em seu artigo que o fungo penetra no inseto, frequentemente via tegumento, utilizando pressão mecânica e atividades enzimáticas decorrentes de secreção de proteases, quitinases e lipases. A contaminação via oral também já foi relatada em lagartas de Anticarsia gemmatalis .
0 ciclo completo do fungo sobre lagartas de Trichoplusia ni é de 8 a 12 dias a 25°C. Segundo Ignoffo (1981), a germinação pode ocorrer em 12 horas e a invasão da hemocele em 24 horas. A colonização do hospedeiro dura cerca de 3 a 5 dias e a morte pode ocorrer entre 6 a 7 dias. Os conidióforos e conidios se formam após 8 a 12 dias do inicio da infecção.
0 fungo N. rileyi vem sendo muito estudado nos últimos anos visando a sua utilização no controle de pragas. Esse patógeno ocorre em mais de 32 espécies de insetos das ordens Coleóptera, Lepdoptera e Orthoptera. Cerca de 90% dos hospedeiros de Λ7. rileyi pertencem à ordem Lepdoptera.
No Brasil os produtores de soja conhecem a grande eficiência do fungo Λ7. rileyi no controle natural de A. gemmatalis em períodos chuvosos e sob temperaturas amenas. Esses patógenos têm provocado epizootias nas populações de pragas, proporcionando um controle satisfatório e concorrendo para diminuir o uso de defensivos agrícolas.
Um dos projetos de controle biológico usando fungo entomopatogênico no Brasil é o das cigarrinhas Mahanarva posticata e Mahanarva fimbriolata que incluídas dentre as principais pragas da cana-de-açúcar , com o fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae . No Brasil, essas pragas, ocorrem causando prejuízos económicos em culturas localizadas nos estados de são Paulo (M. fimbriolata) , Rio de Janeiro, Espírito Santo, e na região nordeste onde somente a espécie M. posticata incide em aproximadamente 800.000 ha da cultura. Nessa região, causa prejuízos de 11% na produção agrícola e 15% no rendimento industrial.
0 inoculo, proveniente das aplicações de fungo, servem para contaminar as primeiras ninfas ou adultos que, após a morte, caem no cartucho foliar da cana ou nas bainhas das folhas superiores do ponteiro. Nesses locais, o fungo esporula sobre os cadáveres, sendo os conídios levados pela água da chuva, orvalho ou vento para outras partes da planta. Nessa ocasião, as ninfas novas que eclodiram dos ovos colocados nas folhas velhas, no solo ou nas folhas baixeiras das plantas estão subindo pelo colmo em direção ao cartucho foliar da cana quando entram em contato com uma elevada quantidade de inoculo produzida pelos cadáveres. Além disso, a espuma abundante liberada pelas ninfas cria um ambiente favorável ao patógeno. Muitas dessas ninfas morrem formando os focos primários da doença e outras se desenvolvem em adultos contaminados que disseminam a doença pelo canavial.
Outro exemplo de controle de pragas com fungos entomopatogênicos é o controle da broca-da-bananeira, Cosmopolites sordidus, que é uma das principais pragas da cultura da banana, com os fungos Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana , sendo que o ultimo vem dando melhores resultados. Tanto as larvas como os adultos abrem galerias no rizoma e base do pseudocaule. Os danos devido à redução do tamanho dos cachos podem atingir 50% da produção. Além desse prejuízo, o ataque da praga aumenta a queda das bananeiras e também favorece o ataque do fungo causador do mal-do-panamá . Essa praga encontra-se disseminada em todas as regiões produtoras de banana.
Os predadores, durante seu ciclo evolutivo, podem consumir diversas presas. Normalmente são mais generalistas, pois atacam diferentes espécies, que podem pertencer a diferentes famílias ou ordens, incluindo insetos-pragas ou não. Os Parasitoides são em geral mais específicos, ou seja, especializados a determinados hospedeiros. Assim, normalmente são mais restritos à espécie, família ou ordem.
De acordo com Berti Filho & Ciociola (2002), o impacto de predadores é mais difícil de avaliar do que os parasitoides, pois estes podem ser observados em seus hospedeiros, enquanto os predadores dificilmente deixam sinais de ataque, principalmente quando consomem toda a presa. Ao contrário dos predadores, os parasitoides têm alta capacidade de encontrar seus hospedeiros, inclusive quando a densidade populacional de filófagos é baixa. Um exemplo de controle biológico de sucesso através de insetos parasitoide é o controle de Diatraea saccharalis utilizando Cotesia flavipes. Considerada como originária da região asiática, parasitando insetos em culturas como milho e arroz, Cotesia flavipes foi exportada para o novo mundo para controle de Diatraea saccharalis em cana-de-açúcar .
MOUTIA & COURTOIS, 1952 já descreveram no trabalho intitulado "Parasites of the moth-borers of sugar-cane in Mauritius" que Cotesia flavipes é um endoparasitoide gregário com desenvolvimento holometabólico . Seu ciclo de vida é de aproximadamente 20 dias. Reproduz-se sexuadamente ou por partenogênese arrenótica. No primeiro caso, as fêmeas fecundadas depositam ovos fertilizados que dão origem aos descendentes de ambos os sexos na proporção aproximada de 1:1. No caso de partenogênese arrenótica, a prole é composta 100% por machos -eclodidos de ovos não fertilizados .
No Brasil, foi introduzida em 1971, importadas de Trinidade e Tobago pela Esalq/SP e COPERSUCAR. Porém, apenas em 1974 iniciou-se a criação massal e as liberações (GALLO et al . , 2002) . Em 1978, linhagens adicionais foram trazidas da índia e do Paquistão (MACEDO, 1978) . A Cotesia flavipes é responsável pelo maior programa de controle biológico no mundo, sendo que no Brasil, mais de 2 milhões de hectares recebem essa medida para o controle da Diatraea saccharalis .
A vespa localiza D. saccharalis e por meio de seu ovopositor insere os ovos na lagarta (inoculação), depositando de 60 a 65 ovos. A deposição dos ovos se dá na hemocele das lagartas. Depois de três ou quatro dias ocorre à eclosão das larvas, que passam por três instares, em um período de aproximadamente quatro a doze dias. As larvas de terceiro instar têm coloração branco-leitoso brilhante e 10 a 15 dias após a inoculação perfuram o tegumento da lagarta e matam-na exaurida. As larvas empupam bem próximas à lagarta de D. saccharalis e estas são revestidas por casulos de coloração branca que formam uma "massa" de coloração branca. Os adultos são pretos e tem de 2 a 3 mm.
A ideia de que, quanto maior o consumo de defensivos, maior é a produção agrícola de um país, está mudando. Atualmente, considera-se o custo ecológico da utilização desses produtos. Uma conscientização quanto às adversidades causadas pelo uso abusivo de agrotóxicos, está gerando nos consumidores uma busca por alimentos mais saudáveis, permitindo, assim, que a agricultura orgânica cresça bastante. É possível que a agricultura alternativa aumente consideravelmente nos países em desenvolvimento. Atualmente, no Brasil, a área cultivada com agricultura orgânica é de apenas 100 mil hectares, enquanto na Europa é superior a 2 milhões de hectares.
Os sistemas de controle biológico são amplamente utilizados para controle de insetos danosos às safras agrícolas. As espécies de pragas mais importantes em safras agrícolas como, por exemplo, cana-de-açúcar , soja, café, milho, tomate, sorgo, trigo e arroz, são os cupins ( Hetterotermes tenius, Hetterotermes longiceps,
Procornitermes triacifer) , besouros (Migdolus fryanus) , Broca-da-cana (Diatraea saccharalis) , Lagarta-Elasmo (Elasmopalpus lignosellus) , Cigarrinha-das-raí zes
(Mahanarva fimbriolata) , Gorgulho-raj ado ( Sphenophorus levis ), Lagarta-da-soj a (Anticarsia gemmattalis) , Lagarta Helicoverpa (Helicoverpa armigera) , Lagarta-mede-palmo (Pseudoplusia includens) , Broca-das-axilas (Epinotia aporema) , Percevej o-verde (Nezara viridula) , Percevejo- pequeno (Piezodorus guildinii) , Percevejo- marrom (Euschistus heros ) , Bicho Mineiro ( Perileucoptera coffeella) , Broca do café (Hypothenemus hampei) , Lagarta dos cafezais (Eacles imperialis magnifica) , Cochonilha verde (Coccus viridis) , Cochonilha parda (Saissetia coffeae) , Cochonilha de cadeia (Cerococcus catenarius) , Cochonilha branca (Planococcus citri) , Cochonilha de placa (Orthezia praelonga) , Cochonilha da Raiz (Dysmicoccus cryptus) , Mosca das raízes (Chiromyza vittata) , Ácaro vermelho (Oligonychus ilicis) Ácaro Plano (Brevipalpus phoenicis) , Lagarta-rosca (Agrotis ipsilon) , Lagarta-do- cartucho (Spodoptera frugiperda) , Curuquerê-dos-capinzais (Moeis latipes) , Cigarrinha-das-pastagens (Deois flavopicta) , Cigarrinhas (Peregrinus maidis e Dalbulus maidis) , Pulgão-do-milho (Rhopalosiphum maidis) , Lagarta- da-espiga (Helicoverpa zea) , Traça-do-tomateiro (Tuta absoluta) , Mosca-branca (Bemisia argentifolii) , Ácaro-do- bronzeamento (Aculops lycopersici) , Larva-minadora
(Liriomyza huidobrensis, L. trifolii, L. sativae) , Tripés (Frankliniella spp . e Thrips spp.), Broca-grande
(Helicoverpa zea), Lagarta-militar (Spodoptera frugiperda e S. littoralis) Broca-pequena (Neoleucinodes elegantalis) Burrinho (Epicauta suturalis e E. attomaria) Larva-arame (Conoderus scalaris) , Bicho-bolo (Eutheola, Dyscinetus, Stenocrates, Diloboderus, Cyclocephala , Phytalus e Phyllophaga) , Percevej o-Castanho (Scaptoris castânea) , Mosca-do-sorgo ( Stenodiplosis sorghicola) , Percevej o-gaucho (Leptoglossus zonatus) , Percevej o-verde (Nezara viridula) , Percevej o-pardo (Thyanta perditor) , Percevej o-do-sorgo (Sthenaridea carmelitana) Percevej o-chupador-do-arroz
(Oebalus spp.) , Lagarta-do-trigo (Pseudaletia sequax ), Percevejo do colmo (Tibraca limbativentris) e Percevejos das panículas (Oebalus ypsylongriseus e O. poecilus) .
Essas pragas podem ser controladas com insetos predadores ou parasitoides das famílias: Syphidae, Tachinidae, Chrysopidae, Vespidae, Aphelinidae, Bethylidae, Braconidae, Chalcididae, Encyrtidae, Eulophidae, Ibaliidae, Ichneumonidae, Scelionidae, Trichogrammatidae,
Forficulidae, Amthocoridae, Lygaeidae, Nabeidae,
Pentatomidae , Redoviidae, Carabidae, Coccinellidae e Chrysopidae .
Na ausência de predadores, essas espécies de pragas são capazes de se estabelecerem e se manterem em plantações que proporcionam os fatores ideais para seu desenvolvimento, tais como cana-de-açúcar (Saccharum officinarum), café (Coffea arábica) , soja (Glycine max) , sorgo (Sorghum spp.), arroz (Oryza sativa) e milho (Zea mays) . Desta forma os insetos predadores ou parasitoides e fungos entomopatogênicos , devem ser implantados logo após a constatação da praga para evitar um alto índice de infestação e manter a população de pragas controlada. Além disso, os insetos predadores ou parasitoides e os fungos entomopatogênicos são capazes de sobreviver e continuarem a desenvolver-se na própria praga alvo após ela ter sido controlada .
Com a aplicação da composição de uma população de inseto predador ou parasitoide e uma população de fungo entomopatogênico serão obtidos excelentes resultados, devido ao fato de os insetos predadores ou parasitoides irem diretamente ao alvo (praga) transportando em seu corpo esporos de fungo entomopatogênico, tendo, assim, um maior ganho no controle de pragas nas safras agrícolas com um menor custo de aplicação. Em safras agrícolas nas quais os esporos de fungo entomopatogênico e insetos predadores ou parasitoides não se encontram livremente disponíveis, tais como em safras virgens, onde nunca foi plantado nenhum tipo de lavoura o índice de pragas será maior. Nestes casos, uma alternativa para controlar estas pragas seria utilização de defensivos químicos que agrediria não só a praga, mas também algum possível inimigo natural da praga, além de causar um grande impacto ambiental e ter um custo elevado. Outra alternativa, seria um controle biológico com a utilização de insetos predadores ou parasitoides em seguida ao uso de fungos entomopatogênicos , gerando um alto custo na aplicação. A composição irá agir com os dois métodos de controle biológico juntos, tendo uma maior eficiência por levar esporos de fungo entomopatogênico direto ao alvo com maior eficiência de controle e um custo abaixo das aplicações separadas.
Para liberação de insetos predadores ou parasitoides, é realizada uma amostragem para determinar a densidade populacional da praga alvo, onde será determinada a quantidade de indivíduos que deverá ser liberado na área. Após alguns dias da liberação é realizada uma nova amostragem para determinar o índice de controle da praga alvo .
No caso do fungo entomopatogênico, o método de aplicação mais comum é a pulverização, tendo a pulverização aérea como sua técnica mais utilizada, onde gera um altíssimo custo com o transporte e armazenamento do fungo entomopatogênico , que deve ser feito em caminhão frigorifico, mão de obra para preparação da calda de aplicação e o maior custo seria o avião com seus altos gastos sendo eles com combustível, manutenção e mão de obra do piloto. Uma das complicações da aplicação aérea são as condições climáticas necessárias para aplicação, sendo dias com alta umidade relativa, preferencialmente, com garoa ou chuvisqueiro para que o fungo consiga atingir seu alvo, o que não ocorre com o composto desenvolvido, já que o inseto predador ou parasitoide leva os esporos de fungo entomopatogênico direto ao alvo.
Uma das condições fundamentais para a consolidação do fungo entomopatogênico no hospedeiro, é uma firme adesão dos esporos na cutícula dos insetos.
Estudos recentes mostram que certas considerações práticas devem ser tidas em relação à aplicação de fungos entomopatogênicos , por exemplo, algumas formulações utilizando blastosporos , provavelmente, deve conter líquidos aquosos ou não polares que podem revelar-se mais bem sucedidos no controle biológico de certos hospedeiros em comparação com os conídios aéreos. Em contraste, o uso de detergentes a fim de evitar a agregação de conídios aéreos pode vir a ser prejudicial durante a aplicação, pois a presença de detergente pode diminuir a adesão às superfícies, gerando assim uma grande desvantagem aos sistemas atuais de aplicação dos fungos entomopatogênicos .
0 Pedido de patente Brasileiro PI 0504136-8 A2, depositado em 24 de junho de 2005, em nome de DEPARTMENT OF BIOCHEMI STRY e UNIVERSITY OF MYSORE, intitulado: "PROCESSO PARA PREPARAR UMA FORMULAÇÃO DE BIOPESTICIDA" descreve o processo para preparação de uma formulação biopesticida para uso contra a broca de café (CBB) utilizando uma formulação económica e de fácil liberação contendo o fungo entomopatogênico Beauveria bassiana . A composição reivindicada é preparada a partir de fungos isolados de um exemplar morto da broca do café que são cultivados em meio liquido, purificados e preparados em uma formulação na forma de talco para uso em culturas de café. Como pode ser observado o documento PI 0504136-8 prevê uma composição contendo somente um fungo entomopatogênico (Beauveria bassiana) isolado, cultivado e preparado em uma formulação de talco para uso em culturas de café para prevenir os danos causados pela broca do café (CBB) . 0 documento PI 0504136-8 não menciona nem sugere o uso em conjunto com outro fungo entomopatogênico ou um inseto parasitoide para a dispersão da composição reivindicada nas culturas de café .
0 Pedido de patente Brasileiro PI 9205513-3 A2 (correspondente do pedido norte-americano US 9200033), depositado em 9 de janeiro de 1992, em nome de James E. Wright (US), Laurence D. Chandler (US) e Tyrone A. Knauf (US), intitulado: "Cultura biologicamente pura de Beauveria bassiana, composição e processo para controlar praga, composição biopesticida, e elementos de composição" se refere a uma composição biopesticida para controlar pragas de inseto em culturas de algodão compreendendo um fungo entomopatogênico , um arrestante e estimulante de alimentação, e, opcionalmente, um feromônio, por exemplo, feromônio sexual. Os insetos pragas mencionados no referido documento são gorgulho do algodão (Anthonomus grandis, também conhecido como bicudo do algodoeiro), pulga do algodão (Pseudatomoscelis seriatus) , e mosca branca da batata doce (Bemisia tabaci) . Os fungos entomopatogênicos mencionados no relatório descritivo do referido documento podem ser utilizados na composição são Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae entre outros, embora os exemplos de concretização da invenção apresentados utilizem somente o primeiro. Como observado, o documento PI 9205513-3 prevê uma composição contendo somente um fungo entomopatogênico em conjunto com outros componentes. 0 documento PI 9205513- 3 utiliza componentes como estimulantes de alimentação e feromônios para atrair a praga a uma isca na forma de liquido, pó, grânulos ou pequenas partículas, onde ela é inoculada com o fungo entomopatogênico da composição. Assim, o documento PI 9205513-3 não menciona nem sugere o uso em conjunto com outro fungo entomopatogênico ou um inseto parasitoide para a dispersão da composição reivindicada nas culturas de café. Cabe ressaltar também que o documento PI 9205513-3 prevê o combate a pragas diferentes (gorgulho do algodão (Anthonomus grandis, também conhecido como bicudo do algodoeiro), pulga do algodão (Pseudatomoscelis seriatus) , e mosca branca da batata doce (Bemisia tabaci)) em uma cultura de plantas de algodão, diferente da presente invenção.
0 Pedido de patente Brasileiro PI 9008037-8 A2 (correspondente do pedido norte-americano US 9005246), depositado em 14 de setembro de 1990, em nome de ECOSCIENCE CORPORATION (US) e intitulado: "Aparelho para controle de insetos e processo para aumentar a taxa de mortalidade de uma espécie como alvo de insetos" se refere ao controle biológico de pragas compreendendo o uso de fungos entomopatogênicos em uma câmara de infecção para o controle de insetos. Os fungos preferidos para uso na composição são Beauveria bassiana e Metarhizium anisopliae . Os insetos praga apresentados nos exemplos do documento PI 9008037-8 são Blatella germânica (barata alemã) , Periplaneta americana (barata americana) , Fannia canicularis (mosca doméstica pequena) , Musca domestica (mosca doméstica) e Diabrotica undecimpunctata (forma adulta da praga da raiz de milho) . 0 documento PI 9008037-8 prevê o uso de uma câmara de infecção que mantém os esporos dos fungos entomopatogênicos Beauveria bassiana e Metarhizium anisopliae protegidos das condições ambientais, para onde os insetos são atraídos e inoculados. Os fungos são cultivados dentro das referidas câmaras, de modo a produzir continuamente esporos e prolongar o seu efeito. Apesar do documento PI 9008037-8 utilizar nos seus exemplos de concretização uma composição contendo os mesmos fungos entomopatogênicos da presente invenção para o combate a uma praga agrícola, o documento PI 9008037-8 não prevê o uso de um inseto parasitoide para a disseminação da composição.
O pedido de patente Brasileiro PI 0400297-0 A2, depositado em 19 de março de 2004, em nome de JOSÉ OTÁVIO MARIANO SILVA, NELSON GASTALDO E GLÁUCIO ADRIANDO CARRIT ANTIGA e intitulado: "Método e desespumante para controle de cigarrinhas em cultura de cana-de-açúcar, capins de pastagens, milho, arroz e outras gramíneas" se refere a uma formulação que atua como um agente desestruturante e desespumante da espuma produzida pelas ninfas da cigarrinha Mahanarva fimbiolata compreendendo produtos químicos, como descritos no relatório descritivo, em conjunto com esporos de Metarhizium anisopliae para controle desta praga {Mahanarva fimbiolata) em culturas de cana-de-açúcar e capins de pastagem. A formulação do documento PI 0400297-0 prevê a desestabilização da espuma produzida pelas ninfas da cigarrinha Mahanarva fimbiolata que, assim, ficam desprotegidas e são inoculadas pelo fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae presente na composição. Apesar da composição do documento PI 0400297-0 prever a sua utilização em pragas diferentes das descritas na presente invenção, o documento prevê a sua utilização na mesma cultura agrícola, a saber, culturas de cana-de-açúcar . A presente invenção se refere a um método para controle biológico de pragas agrícolas compreendendo composições biológicas contendo pelo menos uma população de fungo entomopatogênico selecionado de Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana em combinação com pelo menos uma população de inseto predador ou parasitoide, preferencialmente Cotesia flavipes, que é comumente utilizado no controle da Diatraea saccharalis (broca da cana) .
0 Pedido de Patente Internacional WO 2008087294 A2, depositado em 24 de julho de 2008; em nome de NATURAL PLANT PROTECTION e intitulado: "Use of entomopathogenic fungi as a means for the biological control of Paysandisia archon" se refere ao uso do fungo entomopatogênico Beauveria bassiana para o controle e prevenção de danos causados pela praga da palmeira Paysandisia archon (ordem Lepidoptera, família Castniidae) . A invenção também se refere ao uso do referido fungo para o tratamento de plantas contra uma infestação por Paysandisia archon.
O Pedido de Patente Internacional WO 2011117351 Al, depositado em 29 de setembro de 2011 em nome de GEORG- AUGUST-UNIVERSITÀT GÕTTINGEN e intitulado: "Bio-pesticide and method for pest control" descreve uma metodologia para controle de pestes e prevê a inoculação de plantas e partes de plantas com quantidade eficaz do fungo entomopatogênico Beauveria bassiana. 0 documento WO 2011117351 prevê ainda biopesticidas e composições para controle de pestes, em particular o controle de insetos herbívoros e ou patógenos de plantas. 0 documento menciona que na época desse pedido (2011), Beauveria bassiana era usado como biopesticida padrão. No documento WO 2011117351, os métodos de aplicação podem ser na forma de soluções, dispersões, escleródios, gel, creme, revestimento de sementes, banhos, etc. O método de aplicação da presente invenção é fundamentado na disseminação de um inseto parasitoide juntamente com pelo menos um fungo entomopatogênico, que é mais eficiente, pois os insetos predadores ou parasitoides visitam várias pragas, transportando assim de maneira eficiente e com baixo custo, os esporos dos fungos entomopatogênicos diretamente para as pragas agrícolas.
0 Pedido de Patente Internacional WO 2013026114 Al, depositado em 28 de fevereiro de 2013; em nome de FMC QUÍMICA DO BRASIL LTDA. e intitulado: "Composição agroquimica, seus usos e processo de preparação, bem como método para garantir elevada produtividade de culturas" descreve uma composição sinérgica, que compreende um regulador de crescimento de planta e/ou um fungicida e/ou inseticida e/ou acaricida e seu processo de preparação. O componente inseticida reivindicado no WO 2013026114 é selecionado de um grupo que contém componentes 'biológicos', entre outros. Na lista de componentes biológicos está Metarhizium anisopliae. O documento WO 2013026114 se refere à preparação de uma composição sinérgica e o seu uso para garantir elevada produtividade de cultura de milho, reduzindo o crescimento excessivo das plantas de milho e fortalecendo seu sistema radicular e raízes adventícias. É previsto também o combate de doenças e pragas, uma vez que o aumento da densidade gera um ambiente propício para o crescimento de pragas e doenças que normalmente não afetam esse tipo de cultura. Em seu quadro reivindicatório, é utilizado como inseticida biológico Metarhi zium anisopliae e combate à praga broca da cana Diatraea saccharalis, entre outras. 0 principal objetivo do documento WO 2013026114 é produzir uma composição que possibilite a redução no crescimento excessivo das plantas do milho, uma vez que as plantas de milho tendem a crescer demasiadamente em busca de luz e, como resultado, quebram e caem, gerando perdas significativas na sua produtividade. Uma redução no crescimento das plantas de milho leva ao fortalecimento de seu sistema radicular e raízes, criando um microambiente propício para o desenvolvimento de doenças e crescimento de pragas. A composição reivindicada prevê ainda um fungicida e/ou inseticida e/ou acaricida para combater e conferir resistência a doenças e pragas. Por fim, cabe observar que apesar da composição reivindicada no WO 2013026114 apresentar em sua composição agentes biológicos, tais como Metarhizium anisopliae, no combate ao desenvolvimento e crescimento de pragas, incluindo a broca da cana Diatraea saccharalis, o referido documento tem como objetivo principal a redução no crescimento excessivo de plantas de milho .
0 Pedido de patente internacional WO 2012171914 Al, depositado em 12 de junho de 2012; em nome de BAYER INTELLECTUAL PROPERTY GMBH e intitulado: " Use of an enaminocarbonyl compound in combination with a biological control agent" se refere ao uso de uma composição compreendendo compostos enaminocarbomil selecionados a partir da Fórmula (I), em conjunto com pelo menos um agente de controle biológico selecionado de um grupo que contém fungos entomopatogênicos , entre outros agentes biológicos, para o controle de pestes em safras de culturas de plantas, incluindo a cana-de-açúcar . 0 relatório descritivo do WO 2012171914 menciona o uso do fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae . A presente invenção se refere a um método para controle biológico de pragas agrícolas compreendendo composições biológicas contendo pelo menos uma população de fungo entomopatogênico selecionado de Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana em combinação com pelo menos uma população de inseto predador ou parasitoide, preferencialmente, Cotesia flavipes, que é comumente utilizado no controle da Diatraea saccharalis (broca da cana) . No documento WO 2012171914, os métodos de aplicação podem ser: revestimento de sementes, encharcamento do solo, diretamente em sulcos no solo e/ou pulverização foliar. 0 método de aplicação da presente invenção é fundamentado na disseminação de um inseto parasitoide juntamente com pelo menos um fungo entomopatogênico, que é mais eficiente, pois os insetos predadores ou parasitoides visitam várias pragas, transportando, assim, de maneira eficiente e com baixo custo, os esporos dos fungos entomopatogênicos diretamente para as pragas agrícolas.
0 Pedido de patente Europeu EP 2540165 Al, depositado em 30 de junho de 2011; em nome de BAYER CROPSCIENCE AG., e intitulado "Use of a halogenated pesticide in combination with a biological pest control agent" se refere ao uso de uma composição compreendendo compostos halogenados selecionados a partir da Fórmula (I), em conjunto com pelo menos um agente de controle biológico selecionado de um grupo que contém fungos entomopatogênicos para o controle de pestes agrícolas em plantas ornamentais, gramados e árvores florestais, tais como árvores florestais para a obtenção de alimentos, rações, combustíveis e para fins industriais. 0 uso dessa preparação é vantajoso, pois amplia o espectro de atividade para outras pestes agrícolas e/ou cepas de pestes agrícolas resistentes a pesticidas. 0 relatório descritivo do documento EP 2540165 menciona o uso dos fungos entomopatogênicos Beauveria bassiana e Metarhizium anisopliae, sendo este último preferido em combinação com compostos halogenados selecionados a partir da Fórmula (I) . A presente invenção se refere a um método para controle biológico de pragas agrícolas compreendendo composições biológicas contendo pelo menos uma população de fungo entomopatogênico selecionado de Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana em combinação com pelo menos uma população de inseto predador ou parasitoide, preferencialmente, Cotesia flavipes, que é comumente utilizado no controle da Diatraea saccharalis (Broca da cana) . No documento EP 2540165, os métodos de aplicação podem ser: revestimento de sementes, encharcamento do solo, diretamente em sulcos no solo e/ou pulverização foliar. Em particular são mencionados no relatório descritivo os métodos de aplicação por imersão, pulverização, irrigação, evaporação, poeira, nebulização, radiodifusão, espuma, pintura, espalhamento, rega (dosadora) , e irrigação por gotejamento. 0 método de aplicação da presente invenção é fundamentado na disseminação de um inseto parasitoide juntamente com pelo menos um fungo entomopatogênico , que é mais eficiente, pois os insetos predadores ou parasitoides visitam várias pragas, transportando, assim, de maneira eficiente e com baixo custo, os esporos dos fungos entomopatogênicos diretamente para as pragas agrícolas. Por fim, cabe observar que os exemplos de concretização da invenção apresentados no documento EP 2540165 não mencionam o uso dos fungos entomopatogênicos Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana, descritos como na presente invenção, ou fazem qualquer sugestão ou descrição do uso de um inseto entomopatogênico para uso na disseminação da composição pleiteada .
0 Resumo de trabalho (PT.03.32) de Simi LD, Batista Filho A, Almeida AMB, Schimidt FS e Almeida JEM, intitulado: "Interação entre Cotesia flavipes e Metarhizium anisopliae sobre a mortalidade da broca da cana-de-açúcar Diatraea saccharalis", apresentado no 12° SICONBIOL, Simpósio de Controle Biológico de 18 a 21 de julho de 2011 se refere ao controle biológico de Diatraea sacharalis (broca da cana) realizado com o parasitoide Cotesia flavipes, juntamente com o uso do fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae . No final do resumo, os autores citam que "0 pré-tratamento com o fungo {Metarhizium anisopliae) não influencia no parasitismo pelo himenóptero {Cotesia flavipes) , sendo possível utilizar concomitantemente as duas técnicas sem redução da eficiência de ambas no controle de Diatraea saccharalis". Pré-tratamento significa que o fungo pode ser usado antes das liberações da vespa Cotesia flavipes no campo. No controle da broca várias medidas são utilizadas para o Manejo Integrado da Praga. 0 referido documento quando diz, concomitantemente, está dizendo que os dois métodos de controle, Metarhizium e Cotesia podem ser usados em um mesmo ciclo da cultura da cana-de-açúcar , sem que um interfira no outro. Isso está claro na metodologia, quando os autores descrevem que "Lagartas de terceiro instar foram pulverizadas em torre de Potter com lmL do isolado IBCB 425 de Metarhizium anisopliae na concentração IO8 conidios . mL_1 e, após 24 horas, submetidas ao parasitismo por C. flavipes . 0 processo inverso também foi realizado, inicialmente submetendo as lagartas ao parasitismo e pulverizando-as com o fungo após 24 horas". Portanto, o trabalho trata de controle subsequente. É extremamente comum, no Manejo Integrado de Pragas, utilizar mais de uma medida fitossanitária para controlar as pragas. Mesmo para o controle da broca da cana-de-açúcar (Diatraea saccharalis) , é comum o uso de até cinco metodologias ( Trichogramma , Cotesia flavipes, Fisiológico, Inseticida, Fungo Entomopatogênico ) . Em nenhum momento, o referido trata, descreve ou muito menos sugere de a Cotesia flavipes agir como agente vetor e disseminador do fungo Metarhizium anisopliae, como acontece na presente invenção.
A Tese de doutorado de Cinthia Conceição Matias da Silva (sob orientação do professor Edmilson Jacinto Marques) intitulada: "Associação de Cotesia flavipes (CAM.) com Metarhizium anisopliae (METSCH.) SOROK. E Beauvería bassiana (BALS.) VUILL no controle da broca de cana de açúcar Diatraea flavípennella (BOX) (LEPIDOPTERA :
CRAMBIADAE) ", apresentada em fevereiro de 2013 ao Programa de Pós-Graduação em Entomologia Agrícola, da Universidade Federal Rural de Pernambuco, como parte dos requisitos para obtenção do grau de Doutor em Entomologia Agrícola se refere à associação do inseto parasitoide Cotesia flavipes com os fungos entomopatogênicos Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana no controle da broca de cana de açúcar Diatraea flavipennella, uma vez que o uso de Cotesia flavipes no controle desse tipo de praga tem sido questionado devido à crescente dominância dessa espécie na região analisada (canaviais de Pernambuco) . No Capítulo 1, referente à Introdução e Literatura Citada, a autora cita que o "objetivo desse estudo foi avaliar o desempenho de C. flavipes juntamente com M. anisopliae e B. bassiana sobre as brocas da cana-de-açúcar" . Quando a autora utiliza a palavra juntamente quer dizer o uso dos três agentes biológicos para o controle das brocas, mas sempre o uso de um após o outro. Isso fica claro nos capítulos 3 e 4 que tratam i) da interação de fungos entomopatogênicos com o parasitoide Cotesia flavipes e ii) do efeito de Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana nas diferentes fases de desenvolvimento do parasitoide Cotesia flavipes, respectivamente. No Capítulo 3, fica claro que os fungos foram aplicados sobre as lagartas com suspensões fúngicas obtidas pela adição de 10 mL de água destilada esterilizada mais espalhante adesivo. No Capítulo 3, a autora informa que, quando utilizada em conjunto, no Tratamentos 4, as lagartas foram inoculadas com Cotesia flavipes e, após um dia, pulverizadas com suspensão de M. anisopliae . No Tratamento 5 as lagartas foram pulverizadas com M. anisopliae e, após um dia, inoculadas com C. flavipes . No Tratamento 6, as lagartas foram inoculadas com C. flavipes e, após um dia, inoculadas com B. bassiana . No Tratamento 7, as lagartas foram inoculadas com B. bassiana e, após um dia, inoculadas com C. flavipes. Além disso, a autora relata que os fungos foram aplicados sobre as lagartas com suspensões fúngicas obtidas pela adição de 10 mL de água destilada esterilizada mais espalhante adesivo Tween 80 a 0,01% ajustadas a uma concentração de 107 conidios mLr1. Portanto, sempre as inoculações de fungos ocorreram antes ou depois da inoculação com C. flavipes. Em nenhum momento foi sugerida ou muito menos revelada uma composição de Cotesia flavipes para agir como vetor e disseminador dos fungos Metarhizium e Beauveria.
Como pode ser observado nenhum documento do estado da técnica descreve ou sugere uma composição de insetos parasitoides e fungos entomopatogênicos para o controle biológico de pragas agrícolas como apresentado pela presente invenção.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Para contornar os problemas acima mencionados, a presente invenção propiciará vantagens significativas em relação aos métodos de controle biológico de pragas agrícolas já existentes, possibilitando um aumento do seu desempenho e apresentando uma relação custo/benefício mais favorável .
A presente invenção, de acordo com um primeiro de seus aspectos, se refere a um novo método de controle biológico compreendendo pelo menos uma população de inseto predador ou parasitoide e pelo menos uma população de fungo entomopatogênico .
De acordo com o segundo aspecto, a presente invenção se refere a um novo método para disseminação de pelo menos uma população de fungo entomopatogênico . De acordo com o terceiro aspecto, a presente invenção se refere a uma composição de pelo menos uma população de inseto predador ou parasitoide e uma população de fungo entomopatogênico para o controle de pragas em safras agrícolas
De acordo com o quarto aspecto, a presente invenção se refere ao uso de uma composição de pelo menos uma população de inseto predador ou parasitoide e uma população de fungo entomopatogênico ou ao sistema de disseminação para controle de pragas em safras agrícolas.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
A estrutura e operação da presente invenção, juntamente com vantagens adicionais da mesma poderão ser melhor entendidas mediante referência aos desenhos em anexo e às seguintes descrições:
As Figuras de 1 a 17 apresentam os gráficos da taxa de mortalidade de C. flavipes ao longo dos cinco dias de avaliação, quando foram inoculadas massas cinza (ponto de eclosão ;
As Figuras de 18 a 47 apresentam os gráficos da taxa de mortalidade de C. flavipes ao longo dos cinco dias de avaliação, quando foram inoculadas com as diferentes dosagens em massa branca, massa cinza e massa eclodida, respectivamente dos isolados IBCB 215 e BBIO 195;
As Figuras de 48 a 50 apresentam os gráficos da taxa de mortalidade de C. flavipes ao longo dos cinco dias de avaliação quando foram inoculadas massas brancas, massas cinzas e massas eclodidas, respectivamente;
A Figura 51 mostra os dados da porcentagem de mortalidade nos diferentes estágios do desenvolvimento de C. flavipes; A figura 52 apresenta a média da porcentagem de indivíduos parasitados por B. bassiana;
A figura 53 mostra um gráfico com a média de colónias formadas na composição (vespa + fungo) e no controle (só vespa) .
A figura 54 mostra um gráfico da porcentagem de parasitismo entre a composição (fungo + vespa) e C. flavipes .
A figura 55 mostra um gráfico da porcentagem de parasitismo da composição fungo entomopatogênico e C. flavipes nos diferentes métodos de inoculação.
A figura 56 mostra um gráfico com a porcentagem de mortalidade de indivíduos da composição fungo entomopatogênico após o terceiro dia em que foram preparados nos diferentes métodos de inoculação.
A figura 57 mostra um gráfico com a média de colónias formadas na composição fungo entomopatogênico nos diferentes métodos de inoculação.
A figura 58 mostra um gráfico com a quantidade de conídios transportados pelos indivíduos de C. flavipes machos e fêmeas na composição fungo entomopatogênico quando preparados nos diferentes métodos de inoculação. A figura 59 mostra um gráfico da média de esporos germinados por dia;
A figura 60 mostra um gráfico com a porcentagem de mortalidade de indivíduos da composição fungo entomopatogênico após o terceiro dia em que foram preparados com diferentes quantidades de indivíduos de C. flavipes .
A figura 61 mostra um gráfico com a média de colónias formadas na composição fungo entomopatogênico com diferentes quantidades de C. flavipes . A figura 62 mostra um gráfico com a quantidade de conidios transportados pelos indivíduos de C. flavipes machos e fêmeas na composição fungo entomopatogênico quando preparados em diferentes quantidades de C. flavipes.
A figura 63 mostra um gráfico da porcentagem de parasitismo da composição fungo entomopatogênico e C. flavipes, onde a composição fungo entomopatogênico foi preparada com diferentes quantidades de C. flavipes. A Figura 64 mostra um gráfico da média da mortalidade de C. flavipes inoculada com o isolado Ml nos dias após a inoculação em laboratório;
A Figura 65 mostra um gráfico da média da mortalidade de C. flavipes inoculada com o isolado M2 nos dias após a inoculação em laboratório;
A Figura 66 mostra um gráfico da média da mortalidade de C. flavipes inoculada com o isolado M3 nos dias após a inoculação em laboratório;
A Figura 67 mostra um gráfico da média da mortalidade de C. flavipes inoculada com o isolado M4 nos dias após a inoculação em laboratório;
A Figura 68 mostra um gráfico da média da mortalidade de C. flavipes inoculada com o isolado M5 nos dias após a inoculação em laboratório.
A Figura 69 mostra um gráfico da média da mortalidade de C. flavipes inoculada com o isolado M6 nos dias após a inoculação em laboratório;
A Figura 70 mostra um gráfico da média da mortalidade de C. flavipes inoculada com o isolado M7 nos dias após a inoculação em laboratório;
A Figura 71 mostra um gráfico da média da mortalidade de C. flavipes inoculada com o isolado M8 nos dias após a inoculação em laboratório;
A Figura 72 mostra um gráfico da média mortalidade de C. flavipes inoculada com o isolado M9 nos dias após a inoculação em laboratório.
A Figura 73 mostra um gráfico da média da mortalidade de C. flavipes inoculada com o isolado M 10 nos dias após a inoculação em laboratório;
A Figura 74 mostra um gráfico da média da mortalidade de C. flavipes inoculada com o isolado M 11 nos dias após a inoculação em laboratório;
A Figura 75 mostra um gráfico da média da mortalidade de C. flavipes inoculada com o isolado M 12 nos dias após a inoculação em laboratório;
A Figura 76 mostra um gráfico da média da mortalidade de C. flavipes inoculada com o isolado M13 nos dias após a inoculação em laboratório;
A Figura 77 mostra um gráfico da média da mortalidade de C. flavipes inoculada com o isolado M 14 nos dias após a inoculação em laboratório;
A Figura 78 mostra um gráfico da média da mortalidade de C. flavipes inoculada com o isolado M 15 nos dias após a inoculação em laboratório;
A Figura 79 mostra um gráfico da média da mortalidade de C. flavipes inoculada com o isolado M 16 nos dias após a inoculação em laboratório;
A Figura 80 mostra um gráfico da média da mortalidade de C. flavipes inoculada com o isolado M 17 nos dias após a inoculação em laboratório;
A Figura 81 mostra um gráfico da média mortalidade de C. flavipes inoculadas com o isolado M 18 nos dias após a inoculação em laboratório. A Figura 82 mostra um gráfico da média da mortalidade de C. flavipes inoculada com o isolado M 19 nos dias após a inoculação em laboratório.
A Figura 83 mostra um gráfico da média da mortalidade de C. flavipes inoculada com o isolado M 20 nos dias após a inoculação em laboratório;
As Figuras de 84 a 98 apresentam os gráficos da taxa de mortalidade de C. flavipes ao longo dos cinco dias de avaliação quando foi inoculada com as diferentes dosagens em massa branca, massa cinza e massa eclodida, respectivamente do isolado IBCB 425;
As figuras 99 a 113, mostra que o isolado MBIO 104 atingiu alta taxa de mortalidade nas dosagens de 15 e 18 mg em todas as fases do desenvolvimento de C. flavipes;
As Figuras 114 a 116 apresentam os gráficos da taxa de mortalidade de C. flavipes ao longo dos cinco dias de avaliação quando foram inoculadas massas brancas, massas cinzas e massas eclodidas, respectivamente;
A Figura 117 mostra um gráfico com a taxa de mortalidade ocasionada por de Metarhizium spp no decorrer de cinco dias, nos diferentes estágios do desenvolvimento de C. flavipes.
A figura 118 mostra um gráfico da porcentagem de parasitismo da composição fungo entomopatogênico e C. flavipes, onde a composição foi preparada com diferentes métodos de inoculação de Metarhizium spp.
A figura 119 mostra um gráfico com a porcentagem de mortalidade de indivíduos da composição após o terceiro dia em que foram preparados com diferentes métodos de inoculação com Metarhizium spp.
A figura 120 mostra um gráfico com a média de colónias formadas na composição fungo entomopatogênico e C. flavipes preparada em diferentes métodos de inoculação com Metarhizium spp.
A figura 121 mostra um gráfico com a quantidade de conidios transportados pelos indivíduos de C. flavipes machos e fêmeas na composição quando preparados em diferentes métodos de inoculação de Metarhizium spp.
A figura 122 mostra indivíduos de Diatraea saccharalis parasitados por C. flavipes e Metarhizium spp.
A figura 123 mostra os indivíduos de C. flavipes em placas de petri (A) com meio de cultura BDA para avaliação da formação de colónias (B) de fungos entomopatogênicos .
DESCRIÇÃO DETALHADA DA PRESENTE INVENÇÃO
Embora a presente invenção possa ser suscetível a diferentes modalidades, são mostradas na seguinte descrição detalhada, modalidades preferidas com o entendimento de que as presentes modalidades devem ser consideradas exemplificações dos princípios da invenção e não se pretende limitar a presente invenção ao que foi ilustrado e descrito aqui.
A presente invenção se refere a um novo método de controle biológico compreendendo pelo menos uma população de inseto predador ou parasitoide e pelo menos uma população de fungo entomopatogênico, que pode ser empregada para criação de um agente de controle biológico a ser liberada em uma safra agrícola.
De acordo com os aspectos adicionais, a invenção se refere a um novo método de vetorização e/ou disseminação de fungos entomopatogênicos para serem direcionados especificamente ao corpo das pragas alvo pelo inseto parasitoide ou predador. A presente invenção compreende também um método para controle biológico de pragas em uma safra agrícola empregando a composição de pelo menos uma população de inseto predador ou parasitoide e pelo menos uma população de fungo entomopatogênico e os sistemas de vetorização e/ou disseminação de acordo com a invenção.
A presente invenção, de acordo com um primeiro de seus aspectos, se refere a um novo método de controle biológico compreendendo pelo menos uma população de inseto predador ou parasitoide e pelo menos uma população de fungo entomopatogênico .
De acordo com o segundo aspecto, a presente invenção se refere ao um novo método para disseminação de pelo menos uma população de fungo entomopatogênico .
De acordo com o terceiro aspecto, a presente invenção se refere a uma composição de pelo menos uma população de inseto predador ou parasitoide e pelo menos uma população de fungo entomopatogênico ou ao sistema de disseminação para controle de pragas em safras agrícolas.
De acordo com o quarto aspecto, a presente invenção se refere ao uso de uma composição de pelo menos uma população de inseto predador ou parasitoide e pelo menos uma população de fungo entomopatogênico ou ao sistema de disseminação para controle de pragas em safras agrícolas.
Para fins de melhor esclarecer a matéria a ser protegida foi usado o termo COMPOSIÇÃO para denominar uma composição de insetos parasitoides e fungos entomopatogênicos para o controle biológico de pragas agrícolas .
Em uma concretização da presente invenção, é preparada uma composição compreendendo uma população de inseto predador ou parasitoide e pelo menos uma população de fungo entomopatogênico , na qual o fungo entomopatogênico permanecerá associado ao inseto predador ou parasitoide não o matando. Desta forma, o inseto predador ou parasitoide direciona o fungo entomopatogênico para a praga agrícola alvo .
Com a aplicação da composição de uma população de inseto predador ou parasitoide e uma população de fungo entomopatogênico serão obtidos excelentes resultados, devido ao fato de os insetos predadores ou parasitoides irem diretamente ao alvo (praga) transportando em seu corpo esporos de fungo entomopatogênico, tendo assim uma maior eficiência e eficácia no controle de pragas nas safras agrícolas com um menor custo de aplicação.
Abaixo na tabela 1 encontra-se os principais predadores/parasitoides, fungos entomopatogênicos , pragas, bem como as culturas, respectivamente, utilizadas com a presente invenção.
Tabela 1: Principais predadores/parasitoides, fungos entomopatogênicos, pragas, bem como as culturas, respectivamente, utilizadas com a presente invenção.
Predadores/Parasitoides
Família Género
Apanteles
Braconidae
Cotesia
Cryptolaemus
Cycloneda
Coccinellidae
Eriopis
Hyppodamia Syrphidae Salpingogaster
Tri chogrammatidae Tri chogramma
Fungo Entomopatogênico
Família Género
Batkoa
Entomophthoraceae
Massospora
Nectriaceae Metarhi zi um
Beauveria
Clavicipitaceae
Nomuraea
Trichocomaceae Paecilomyces
Pragas
Agrotis sp
Alabama argillacea
Anagasta kuehniella
Anticarsia gemmatalis
Aphis gossypii
Bemisia tabassi
Deois flavopicta
Diatraea saccaralis
Diatraea flavipennella
Helicoverpa spp .
Heliothis virescens
Mahanarva fimbriolata
Mahanarva posticata Mythimna unipuncta
Myzus persicae
Neoleucinodes elegantalis
Sacadodes pyralis
Spodoptera frugiperda
Tuta absoluta
Zulia entreariana
Culturas
Nome Vulgar Nome Cientifico
Cana-de-Açúcar Saccharum officinarum
Sorgo Sorghum bicolor
Arroz Oryza sativa
Milho Zea mays
Trigo Triticum aestivum
Cevada Hordeum vulgare
Tomate Solanum lycopersicum
Soja Glycine max
Algodão Gossypium hirsutum
Feijão Phaseolus vulgaris
Brachiaria spp .
Panicum maximum
Pastagens
Andropogon gayanus
Cynodon dactylon
Café Coffea arábica I I coffea canephora |
Beauveria bassiana em Cotesia flavipes
Em uma concretização preferencial da presente invenção, é preparada uma composição compreendendo o fungo Beauveria bassianae a vespa Cotesia flavipes, na qual o fungo permanece associado à vespa, sendo que a vespa atua como vetor do fungo para pragas agrícolas.
I - Avaliação da Toxidade de Diferentes Isolados de Beauveria bassiana em Cotesia flavipes
Para avaliar se é possível fazer uma composição utilizando um inseto como vetor e disseminador de fungos entomopatogênicos é necessário avaliar a compatibilidade destes agentes, bem como, a patogenicidade do fungo ao inseto, pois fungos entomopatogênicos são aqueles com capacidade de causar doenças em certos insetos, levando-os até a morte.
0 objetivo deste experimento foi avaliar a toxicidade dos isolados de Beauveria bassiana sobre o parasitoide Cotesia flavipes, permitindo assim a seleção de isolados menos tóxicos, otimizando a composição.
0 experimento foi realizado no Biofábrica de Agentes de Controle Biológicos da Bioenergia do Brasil/SA-Lucélia, SP.
Criação de Cotesia flavipes.
A criação foi realizada utilizando como hospedeiro padrão lagartas de D. saccharalis no terceiro instar. Adultos do parasitoide com 24 h de idade foram confinados em copos plásticos (50 ml), contendo na tampa de cada copo um pequeno orifício para a saída dos adultos. Em seguida, as lagartas foram colocadas próximas ao orifício, visando à deposição dos ovos do parasitoide no seu interior. Após o parasitismo, as lagartas foram transferidas para caixinhas de polietileno, contendo dieta artificial, onde permaneceram até a formação das pupas do parasitoide. As massas de casulos (pupas) foram retiradas e transferidas para copos plásticos (150 ml), onde permaneceram até a emergência dos adultos.
Produção de Esporos de Beauveria spp.
Foram utilizados os isolados de Beauveria spp. e padrão IBCB 215 e os da Bioenergia do Brasil S.A. BBI01, BBI02, BBI03, BBI04, BBI05, BBI06, BBI07, BBI08, BBI09, BBIO10, BBI011, BBI012, BBI013, BBI014, BBI015, BBI016, BBI017, obtidos da micoteca do Laboratório da Biofábrica de agentes de Controle Biológico. Os isolados foram revigorados em lagartas de 3o instar de D. saccharalis . Para o bioensaio, os fungos foram repicados em BDA (batata- dextrose-ágar ) e, após sete dias, os isolados de Beauveria spp. foram novamente repicados em BDA, incubados em câmara climatizada a 26 ± 1°C e fotofase de 12 horas, onde permaneceram por dez dias. Os esporos produzidos em placa foram inoculados em tubos contendo arroz autoclavado, mantidos em sala climatizada a 26± 1°C, umidade relativa de ±40 % e fotofase de 12 horas, pelo período de 10 dias. Prontos, os tubos foram transferidos para sacos de arroz autoclavados contendo 500g cada um. Após 3 dias na sala de incubação, depois da formação de micélio, os sacos foram selecionados em relação a contaminação, somente os sacos não contaminados foram abertos e seu conteúdo despejado em bandejas que foram levadas para a "Sala de Secagem" a uma temperatura de 21 a 28°C e fotofase de pelo menos 16 horas. Após 12 a 15 dias, ou seja, quando a esporulação do fungo tenha se completado, o material foi ser seco para obtenção dos esporos.
A avaliação da viabilidade do isolado foi determinada pela contagem dos conidios germinados e não germinados em microscópio óptico, 16 horas após o plaqueamento em BDA, sendo tomados 100 conidios por placa para obtenção da porcentagem de germinação.
0 delineamento experimental foi composto de 22 tratamentos (incluindo a testemunha) com 04 repetições cada tratamento. Para a testemunha foram utilizados copos com massa de Cotesia flavipes (ponto eclosão) sem fungo. Os conidios do isolado IBCB 215 de Beauveria bassiana foram pesados e armazenados em tubos plásticos e utilizados como padrão .
Para a montagem do experimento, os esporos foram pesados com o auxilio de uma balança analítica de maneira a se obter uma quantidade de 0,012g (medida pré-determinada padrão) que foram armazenados em um tubo plástico. Essa quantidade de esporos foi utilizada para inocular os copos em média 1500 indivíduos de C. flavipes. Após inoculação, os copos foram separados em bandejas plásticas e classificados em tratamentos.
Tabela 1: Isolados de Beauveria spp . utilizados no experimento .
Tratamentos Isolados Beauveria spp.
Testemunha
T2 IBCB 215
T3 BBI01
T4 BBI02
T5 BBI03
T6 BBI04
T7 BBI05 T8 BBI06
T9 BBI07
TIO BBI08
Til BBI09
T12 BBIO10
T13 BBIOll
T14 BBI012
T15 BBI013
T16 BBI014
T17 BBI015
T18 BBI016
T19 BBI017
Cada tratamento continha 20 copos, quatro para cada um dos cinco dias de avaliação, totalizando 380 copos no experimento. Os copos com os insetos foram mantidos em sala climatizada na temperatura de ±26 °C, umidade relativa de 70±10 % e fotofase de 12 horas.
As amostras eram destrutivas, sendo avaliada a mortalidade diariamente, durante 05 dias após a aplicação dos fungos. Os indivíduos permanecidos vivos nos copos durante os dias de avaliação eram liberados em área aberta durante 2 horas. Os copos com indivíduos mortos eram fechados e guardados para posterior contagem dos indivíduos de C. flavipes mortos por copo. A variável avaliada foi a mortalidade do parasitoide C. flavipes em porcentagem (%) . Foi utilizado o software de contagem de Cotesia flavipes, considerando que em cada copo foram colocados inicialmente 1.500 indivíduos do parasitoide.
As Figuras de 1 a 17 apresentam os gráficos da taxa de mortalidade de C. flavipes ao longo dos cinco dias de avaliação, quando foram inoculadas massas cinzas (ponto de eclosão) . De acordo com os dados obtidos, os isolados BBI04, BBI05, BBI09, BBIO10, BBI012, BBI013, BBI017 (Figuras 4, 5, 9,10, 12, 13 e 17) foram os que apresentaram menor toxicidade, sendo estes, portanto, os isolados mais indicados para inoculação dos copos durante o processo de fabricação da composição. Nos tratamentos BBI01, BBI02, BBI03, BBI06, BBI07, BBI08, BBI011, BBI014, BBI015, BBI016, a taxa de mortalidade no decorrer dos dias foi alta, sendo estes isolados mais tóxicos para o parasitoide e, portanto, devem ser evitados na composição do produto (Figuras 2 a 17) . Caso esses isolados sejam utilizados, o método de inoculação deverá proporcionar o menor contato possível entre fungo e Cotesia flavipes.
Os resultados deste experimento irão implicar nas diversas etapas do projeto de biofabricação da composição, juntamente com a agressividade dos isolados para a Diatraea saccharalis e a adaptação ao sistema de produção industrial .
II — Determinação da Dosagem de Esporos de Beauveria spp. e Momento Ideal para a Inoculação de Parasitoide Cotesia flavipes para o Desenvolvimento do Composição.
Para o desenvolvimento da Composição, é imprescindível determinar a dosagem de esporos do fungo entomopatogênico Beauveria spp. para a inoculação dos indivíduos de Cotesia flavipes. Por este motivo, foram realizados experimentos utilizando diferentes dosagens e estágios de desenvolvimento da Cotesia flavipes: pupa encasulada (massa branca) , inseto ainda no casulo (massa cinza) e inseto adulto recém eclodido (copo eclodido. Com esse experimento fatorial (dosagens X estágios de desenvolvimento) foi possível determinar qual a melhor dosagem para o produto composição .
Criação de Cotesia flavipes
A criação foi realizada utilizando como hospedeiro padrão lagartas de Diatraea saccharalis no terceiro instar para a criação de Cotesia flavipes. Adultos do parasitoide com 24 horas de idade foram confinados em recipientes plásticos (5 cm x 7cm) , contendo na tampa de cada recipiente um pequeno orifício para a saída dos adultos. Em seguida, as lagartas foram colocadas próximas ao orifício, visando à deposição dos ovos do parasitoide no seu interior. Após o parasitismo, as lagartas foram transferidas para caixas plásticas com 19 divisórias (30 x 18 x 04 cm), contendo dieta artificial, onde permaneceram até a formação das pupas do parasitoide. As massas de casulos (pupas) do parasitoide foram retiradas e transferidas novamente para a gaiola de inoculação, onde permaneceram até a emergência dos adultos.
Produção de Esporos de Beauveria spp .
Para a obtenção e produção de Beauveria spp. foi utilizado o isolado padrão de Beauveria spp. IBCB 215 obtido da micoteca do Laboratório da Biofábrica de agentes de Controle Biológico. 0 isolado foi revigorado em lagartas de 3o instar de D. saccharalis . Para o bioensaio, o fungo foi repicado em BDA+A ( batata-dextrose-ágar + sulfato de streptomicina ) e após sete dias foi repicado em meio completo (MC), incubado em sala climatizada a 26 ± 1°C e fotofase de 12 horas, onde permaneceu por dez dias. Os esporos produzidos em placa foram inoculados em tubos contendo arroz autoclavado e mantido em sala climatizada a 26± 1°C, umidade relativa de ±40 % e fotofase de 12 horas, pelo período de 10 dias. Prontos, os tubos foram transferidos para sacos de arroz autoclavados contendo 500g cada um. Após 3 dias na sala de incubação, depois da formação de micélio, os sacos foram selecionados em relação a contaminação, somente os sacos não contaminados foram abertos e seu conteúdo despejado em bandejas que foram levadas para a "Sala de Secagem" a uma temperatura de 21 a 28°C e fotofase de pelo menos 16 horas. Após 12 a 15 dias, ou seja, quando a esporulação do fungo tenha se completado, o material foi ser seco para obtenção dos esporos. Em seguida, os esporos foram armazenados em saquinhos plásticos. A avaliação da viabilidade do isolado foi determinada pela contagem dos conidios germinados e não germinados em microscópio óptico, 16 horas após o plaqueamento em BDA + A, sendo tomados 100 conidios por placa para obtenção da porcentagem de germinação.
0 delineamento experimental foi fatorial: 6 dosagens X 3 estágios de Cotesia flavipes X 2 isolados de Beauveria spp . Para cada tratamento foram utilizadas 4 repetições, sendo a unidade amostrai representada por um copo contendo 30 massas de C. flavipes.
Para a montagem do experimento, os esporos dos isolados IBCB 215 e BBIO 195 de Beauveria spp. foram pesados com o auxilio de uma balança analítica de maneira a se obter uma quantidade nas dosagens de 6 mg, 9 mg, 12 mg, 15 mg e 18 mg por tubo plástico. Os tubos de cada tratamento foram armazenados em tubos plásticos. As 5 dosagens de esporos de cada isolado foram utilizadas para inocular os copos com adultos de C. flavipes, nos seguintes estágios: massa branca, massa cinza e massa eclodida. 0 tratamento testemunha não recebeu inoculação do fungo. Após a inoculação, os copos foram separados em bandejas plásticas e classificados nos seguintes tratamento conforme a tabela 4.
Tabela 1. Tratamentos utilizados no presen experimento .
MASSA BRANCA
(IBCB 215 e BBIO 195)
TRATAMENTOS DOSAGEM
Tl Testemunha
T2 6mg
T3 9mg
T4 12mg
T5 15mg
T6 18mg
MASSA CINZA
(IBCB 215 e BBIO 195)
TRATAMENTOS DOSAGEM
Tl Testemunha
T2 6mg
T3 9mg
T4 12mg
T5 15mg
T6 18mg
MASSA ECLODIDA
(IBCB 215 e BBIO 195)
TRATAMENTOS DOSAGEM
Tl Testemunha
T2 6mg
T3 9mg T4 12mg
T5 15mg
Τ6 18mg
Todos os tratamentos continham 60 copos cada, totalizando 360 copos para o isolado IBCB 215 e a mesma quantidade para o isolado BBIO 195. As bandejas com os copos contendo os insetos foram mantidas em prateleiras, em sala climatizada à temperatura de ±26 °C, umidade relativa de 70±10 % e fotofase de 12 horas.
Após 24 horas da inoculação do fungo, foram retirados 4 copos de massa eclodida por tratamento para avaliação da mortalidade, onde os insetos vivos foram liberados em área aberta por 4 horas e os mortos foram fechados e guardados para posterior contagem. Esse procedimento foi repetido diariamente, até o quinto dia.
As Figuras de 18 a 32 apresentam os gráficos da taxa de mortalidade de C. flavipes ao longo dos cinco dias de avaliação, quando foram inoculadas com as diferentes dosagens em massa branca, massa cinza e massa eclodida, respectivamente do isolado IBCB 215. De acordo com os dados obtidos, o isolado atingiu alta taxa de mortalidade nas dosagens de 15 e 18 mg, em todas as fases do desenvolvimento de C. flavipes. Na dosagem de 6 mg, no estágio de massa cinza, os insetos atingiram uma porcentagem de mortalidade de 50% entre o segundo e terceiro dia, mantendo-se igual à testemunha. Dentre as dosagens de 9 e 12 mg, no estágio de massa branca, não houve diferença significativa na porcentagem de mortalidade entre os mesmos e a testemunha.
De maneira similar, de acordo com as figuras 33 a 47, o isolado BBIO 195 também atingiu alta taxa de mortalidade nas dosagens de 15 e 18 mg, em todas as fases do desenvolvimento de C. flavipes. Nas dosagens de 6, 9 e 12 mg, no estágio de massa branca, os insetos atingiram mais de 60% de mortalidade no terceiro dia após a inoculação, mantendo-se igual à testemunha.
Nas condições em que foi conduzido o experimento, pode-se concluir que a melhor dosagem para a inoculação do fungo no inseto vetor é de 12 mg de esporos de Beauveria spp . no estágio inicial (massa branca) de desenvolvimento da C. flavipes ou durante o inicio da eclosão, devido não apresentarem diferenças significativas com a testemunha, sendo assim, a metodologia ideal para a composição do fungo entomopatogênico com o inseto vetor para o desenvolvimento da composição. Portanto, o presente estudo definiu o momento e a dosagem de Beauveria spp. na composição.
0 desenvolvimento da composição deve ainda considerar essa alta toxicidade e colocar, pelo menos 10% a mais de indivíduos dentro dos copos. Isso pode ser compensado pela escolha de um isolado menos tóxico (outra atividade do presente projeto selecionou 4 isolados menos tóxicos que o padrão IBCB 215) .
III — Avaliação da Toxicidade de Beauveria bassiana a Diferentes Estágios de Cotesia flavipes
Os fungos utilizados na composição devem apresentar a menor toxicidade possível a C. flavipes. Por este motivo, além da seleção de isolados e determinação da dosagem ideal, o momento ideal para a inoculação, quando a toxicidade é mínima, deve ser determinado. Por este motivo, foi conduzido o presente experimento para avaliar a toxicidade de Beauveria spp. a diferentes estágios de C. flavipes, determinado o melhor momento de inoculação do fungo Beauveria spp. em copos contendo C. flavipes, visando menor toxicidade ao parasitoide na composição.
Criação de C. flavipes
Foi utilizado como hospedeiro padrão lagartas de Diatraea saccharalis no terceiro instar para a criação de C. flavipes. Adultos do parasitoide com 24 horas de idade foram confinados em recipientes plásticos (5 cm x 7cm) contendo na tampa de cada recipiente um pequeno orifício para a saída dos adultos. Em seguida, as lagartas foram colocadas próximas ao orifício, visando à deposição dos ovos do parasitoide no seu interior. Após o parasitismo, as lagartas foram transferidas para caixas plásticas com 19 divisórias (30 x 18 x 04 cm), contendo dieta artificial, onde permaneceram até a formação das pupas do parasitoide. As massas de casulos (pupas) do parasitoide foram retiradas e transferidas novamente para a gaiola de inoculação, onde permaneceram até a emergência dos adultos.
Produção de Beauveria spp.
Para a obtenção e produção de Beauveria spp., foi utilizado o isolado padrão de Beauveria spp. IBCB 215 obtido da micoteca do Laboratório da Biofábrica de agentes de Controle Biológico. 0 isolado foi revigorado em lagartas de 3o instar de D. saccharalis. Para o bioensaio, o fungo foi repicado em BDA+A ( batata-dextrose-ágar + sulfato de streptomicina ) e após sete dias foi repicado em meio completo (MC), incubado em sala climatizada a 26 ± 1°C e fotofase de 12 horas, onde permaneceu por dez dias. Os esporos produzidos em placa foram inoculados em tubos contendo arroz autoclavado e mantidos em sala climatizada a 26± 1°C, umidade relativa de ±40 % e fotofase de 12 horas, pelo período de 10 dias. Prontos, os tubos foram transferidos para sacos de arroz autoclavados contendo 500g cada um. Após 3 dias na sala de incubação, depois da formação de micélio, os sacos foram selecionados em relação a contaminação, somente os sacos não contaminados foram abertos e seu conteúdo despejado em bandejas que foram levadas para a "Sala de Secagem" a uma temperatura de 21 a 28°C e fotofase de pelo menos 16 horas. Após 12 a 15 dias, ou seja, quando a esporulação do fungo tenha se completado, o material foi ser seco para obtenção dos esporos. Em seguida, os esporos foram armazenados em saquinhos plásticos. A avaliação da viabilidade do isolado foi determinada pela contagem dos conidios germinados e não germinados em microscópio óptico, 16 horas após o plaqueamento em BDA + A, sendo tomados 100 conidios por placa para obtenção da porcentagem de germinação.
0 delineamento experimental foi composto de 06 tratamentos (incluindo já os estágios com testemunha) com 04 repetições cada. Os conidios do isolado IBCB 215 de Beauveria spp . foram pesados e armazenados em tubos plásticos .
Para a montagem do experimento, os esporos foram pesados com o auxilio de uma balança analítica de maneira a se obter uma quantidade de 0,012g (medida pré-determinada padrão) que foram armazenados em um tubo plástico. Essa quantidade de esporos foi utilizada para inocular os copos com adultos de C. flavipes . Após a inoculação, os copos foram separados em bandejas plásticas e classificados em tratamentos: Tl = massa recém-eclodida inoculada; T2 = massa cinza inoculada; T3 = massa branca inoculada. Os copos das testemunhas que não foram inoculados com o fungo constituíram os tratamentos: T4= massa recém eclodida testemunha; T5= massa branca testemunha; T6=massa cinza testemunha. Cada tratamento continha 20 copos, totalizando 120 copos por experimento. Os copos com os insetos foram mantidos em sala climatizada a temperatura de ±26 °C, umidade relativa de 70±10 % e fotofase de 12 horas. Avaliou-se a mortalidade diariamente, durante 05 dias após a aplicação dos fungos. Os indivíduos permanecidos vivos nos copos durante os dias de avaliação foram liberados em área aberta durante 2 horas. Os copos com indivíduos mortos foram fechados e guardados para posterior contagem dos indivíduos de C. flavipes mortos por copo. A variável avaliada foi a mortalidade do parasitoide C. flavipes em porcentagem (%), em seus diferentes estágios de desenvolvimento. Foi utilizado o software de contagem de C. flavipes, considerando que cada copo possuía inicialmente 1500 indivíduos do parasitoide.
As Figuras de 48 a 50 apresentam os gráficos da taxa de mortalidade de C. flavipes ao longo dos cinco dias de avaliação quando foram inoculadas massas brancas, massas cinzas e massas eclodidas, respectivamente. De acordo com os dados obtidos, a massa branca (Figura 48) e massa eclodida (Figura 50) foram as que apresentaram menor toxicidade ao fungo de Beauveria spp . IBCB 215, sendo estes, portanto, os momentos mais indicados para inoculação dos copos durante o processo de fabricação da comosição. No tratamento com a massa cinza, a taxa de mortalidade já atinge 100% no segundo dia com a massa inoculada com o fungo, sendo esta a fase mais sensível do parasitoide e, portanto, deve ser evitada como momento de inoculação (Figura 49) .
Considerando os dados apresentados na Figura 51, observa-se que mesmo nas massas brancas e nas massas eclodidas inoculadas com o fungo houve maior mortalidade que nas massas que não receberam o fungo. Portanto, além de promover a seleção de isolados menos tóxicos a C. flavipes, a composição precisa considerar um método de inoculação com o menor contato possível entre esporos do fungo e os adultos do parasitoide.
Nas condições em que foi conduzido o experimento, pode-se concluir que o melhor momento de inoculação de Beauveria spp.no parasitoide C. flavipes foi no estágio de massa eclodida.
IV - Avaliação da porcentagem de Cotesia flavipes que transporta conidios de Beauveria spp. quando utilizados na composição .
0 presente experimento avaliou, em condições de laboratório, a porcentagem de indivíduos de Cotesia flavipes que carregam em seu corpo esporos de Beauveria spp, sendo observadas as colónias formadas em placas de petri com meio de cultura BDA. Comparando os dados obtidos na parcela utilizando Cotesia flavipes + Beauveria spp com os dados do Controle, que é a utilização de somente Cotesia flavipes .
Obtenção e produção de Beauveria spp:
Para a obtenção e produção de Beauveria spp, foi utilizado o isolado IBCB 215, obtido da micoteca do Laboratório da Biofábrica de agentes de Controle Biológico. 0 isolado foi escolhido devido à sua utilização em cana-de- açúcar para o controle da praga Diatraea saccharalis, e com base em testes preliminares. 0 isolado foi revigorado em lagartas de 3o instar de D. saccharalis . Para o bioensaio, o fungo foi repicado em meio de cultura a base de levedura, incubados em câmara climatizada tipo B.O.D. a 26 ± 1°C e fotofase de 12 horas, onde permaneceram por 21 dias. 0 pó produzido em placa foi aplicado em tubos contendo arroz e mantido em sala climatizada a 26± 1°C pelo período de 10 dias. Prontos, os tubos foram transferidos para sacos de arroz autoclavados contendo 500g cada um. Após 3 dias na sala de incubação, depois da formação de micélio, os sacos foram selecionados em relação a contaminação, somente os sacos não contaminados foram abertos e seu conteúdo despejado em bandejas que foram levadas para a "Sala de Secagem" a uma temperatura de 21 a 28°C e fotofase de pelo menos 16 horas. Após 12 a 15 dias, ou seja, quando a esporulação do fungo tenha se completado, o material foi ser seco para obtenção dos esporos. Depois do período, seco e esporulado, separou-se o arroz do pó de fungo em um processo de escovação e armazenou-se o pó em saquinhos plásticos. A avaliação da viabilidade do isolado foi determinada pela contagem dos conídios germinados e não germinados em microscópio óptico, 16 horas após o plaqueamento em BDA + A, sendo tomados 100 conídios por placa para obtenção da porcentagem de germinação.
Obtenção da Cotesia flavipes:
Foi utilizado como hospedeiro padrão lagartas de Diatraea saccharalis no terceiro instar para a criação de Cotesia flavipes. Adultos do parasitoide com 24 horas de idade foram confinados em recipientes plásticos (5 cm x 7cm) , contendo na tampa de cada recipiente um pequeno orifício para a saída dos adultos. Em seguida, as lagartas foram colocadas próximas ao orifício, visando à deposição dos ovos do parasitoide no seu interior. Após o parasitismo, as lagartas foram transferidas para caixas plásticas com (2 x 6cm) , contendo dieta artificial, onde permaneceram até a formação das pupas do parasitoide. As massas de casulos (pupas) foram retiradas e transferidas novamente para o recipiente plástico, onde permaneceram até a emergência dos adultos
Obtenção da Diatrea saccharalis
As lagartas da espécie Diatraea saccharalis foram obtidas através de criação artificial realizado no Laboratório da Biofabrica de Agentes de controle Biológico da Empresa Bioenergia do Brasil S/A da cidade de Lucélia - SP.
Preparo das placas de Petri com meio de cultura
0 meio de Cultura BDA (Batata + Dextrose + Agar) foi o utilizado no trabalho, onde foi pesado 39 gramas do mesmo para cada litro de água, sendo autoclavado a 120oC por 30 minutos e logo em seguida adicionando aproximadamente 15 ml de meio de cultura em cada placa de Petri de 9 cm x 1,5 cm, até somar um total de 200 placas de meio de cultura.
Preparo das Cotesia flavipes
Foram pegos 100 copos (recipientes plásticos de 5 cm x 7cm) contendo 30 massas em cada copo, aproximadamente 1500 indivíduos /copo , eclodidos e acasalados.
Foram pesadas 50 doses de Beauveria spp contendo 0,012 gramas de esporos puros e adicionou-se uma dose em cada copo de Cotesia flavipes deixando uma parcela de 50 copos de Cotesia flavipes com esporos de Beauveria spp (composição) e um controle de 50 copos somente com Cotesia flavipes .
Transferência das Cotesia flavipes para as placas de
Petri
Após 24 horas os esporos de Beauveria spp serem adicionados nos copos de Cotesia flavipes, foi feito um furo na tampa dos copos com o auxilio de uma haste de madeira, por onde foram coletados 10 indivíduos de Cotesia flavipes de cada copo com o auxílio de uma pinça metálica, flambando-a a cada indivíduo coletado.
Os indivíduos coletados foram inseridos nas placas de Petri com meio de cultura BDA sendo 5 indivíduos em cada placa de Petri, tendo assim 2 placas para cada copo de Cotesia flavipes .
Logo após os indivíduos de Cotesia flavipes serem adicionados nas placas, as mesmas foram incubadas em sala climatizada a 26 ± Io C por 4 dias, onde após este período foi realizado a contagem das colónias de Beauveria spp formadas nas placas de petri.
Após essa contagem, foi elaborado um gráfico no programa "Microsoft Excel" comparando as quantidades de colónias formadas na parcela (composição) e no controle.
Resultados
Como se pode observar no Anexo 1, houve crescimento de colónias de Beauveria spp nas placas de Petri referentes à composição tendo ausência de colónias nas placas do Controle, que foram livres de esporos.
0 anexo 1 mostra uma fotografia A) da Placa de Petri com meio de cultura BDA e colónias de Beauveria spp (composição); B) da Placa de Petri com meio de cultura BDA e indivíduos de Cotesia flavipes sem crescimento de colónias (Controle) .
A variação da porcentagem de colónias formadas nas placas de Petri da composição pode ser observada na figura 52, onde teve uma porcentagem mínima de 70% e uma porcentagem máxima de 100%. E na figura 53 temos a média de colónias formadas na composição e no controle, demonstrando que aproximadamente 91 % dos indivíduos de Cotesia flavipes podem estar parasitando Diatraea saccharalis .
0 experimento demonstrou que uma grande porcentagem de indivíduos de Cotesia flavipes carregam em seu corpo os esporos de Beauveria spp na composição, dando assim uma grande vantagem à quando comparado com Cotesia flavipes somente, onde um copo com 1500 indivíduos de Cotesia flavipes tem aproximadamente 750 indivíduos (fêmeas) capazes de realizar o parasitismo da praga, enquanto que na composição, com os mesmos 1500 indivíduos, aproximadamente 1365 indivíduos tem potencial para realizar o parasitismo, e ainda um parasitismo duplo, com a colaboração da vespa e do fungo simultaneamente.
V - Parasitismo da Composição "Cotesia flavipes + fungo Beauveria spp." à Diatraea saccharalis em Condições de Gaiola
A composição deve apresentar alta capacidade de parasitismo da praga alvo e não deve afetar o comportamento e performance e nem o comportamento do parasitoide Cotesia flavipes . Por este motivo, foi conduzido o presente experimento para avaliar o comportamento e parasitismo da composição Cotesia flavipes + fungo Beauveria spp., em comparação com a testemunha (apenas Cotesia flavipes) .
0 presente experimento avaliou determinar o parasitismo da composição a lagartas de Diatraea saccharalis, em condições de gaiola, sendo avaliada a composição Cotésia flavipes + fungo Beauveria spp.
0 experimento foi realizado no Laboratório da Biofabrica de Agentes de controle Biológico da Bioenergia do Brasil S/A, no município de Lucélia - SP. 0 delineamento experimental com Beauveria spp . foi inteiramente casualizado com 2 tratamentos: Tl = C. flavipes + Beauveria spp.; e T2 = testemunha = C. flavipes sem Beauveria spp. Cada repetição foi representada por uma unidade amostrai de 90 caixinhas com 5 repetições
Para a obtenção e produção de Beauveria bassiana, foi utilizado o isolado padrão Beauveria spp IBCB 215 obtido da micoteca do Laboratório da Biofábrica de agentes de Controle Biológico. 0 isolado foi revigorado em lagartas de 3o instar de D. saccharalis . Para o bioensaio, o fungo foi repicado em BDA+A ( batata-dextrose-ágar + sulfato de streptomicina ) e após sete dias foi repicado em meio completo (MC), incubado em sala climatizada a 26 ± 1°C e fotofase de 12 horas, onde permaneceu por dez dias. Os esporos produzidos em placa foram inoculados em tubos contendo arroz autoclavado e mantidos em sala climatizada a 26± 1°C, umidade relativa de ±40 % e fotofase de 12 horas, pelo período de 10 dias. Prontos, os tubos foram transferidos para sacos de arroz autoclavados contendo 500g cada um. Após 3 dias na sala de incubação, depois da formação de micélio, os sacos foram selecionados em relação a contaminação, somente os sacos não contaminados foram abertos e seu conteúdo despejado em bandejas que foram levadas para a "Sala de Secagem" a uma temperatura de 21 a 28°C e fotofase de pelo menos 16 horas. Após 12 a 15 dias, ou seja, quando a esporulação do fungo tenha se completado, o material foi ser seco para obtenção dos esporos. Depois desse período, separou-se o arroz dos esporos do fungo com uso de escovas e peneiras. Em seguida, os esporos foram armazenados em saquinhos plásticos. A avaliação da viabilidade do isolado foi determinada pela contagem dos conídios germinados e não germinados em microscópio óptico, 16 horas após o plaqueamento em BDA + A, sendo tomados 100 conídios por placa para obtenção da porcentagem de germinação .
Obtenção da Cotesia flavipes
Foi utilizado como hospedeiro padrão lagartas de Diatraea saccharalis no terceiro instar para a criação de Cotesia flavipes. Adultos do parasitoide com 24 horas de idade foram confinados em recipientes plásticos (5 cm x 7cm) , contendo na tampa de cada recipiente um pequeno orifício para a saída dos adultos. Em seguida, as lagartas foram colocadas próximas ao orifício, visando à deposição dos ovos do parasitoide no seu interior. Após o parasitismo, as lagartas foram transferidas para caixas plásticas com (2 x 6cm) , contendo dieta artificial, onde permaneceram até a formação das pupas do parasitoide. As massas de casulos (pupas) foram retiradas e transferidas novamente para o recipiente plástico, onde permaneceram até a emergência dos adultos.
Obtenção da Diatraea saccharalis
As lagartas da espécie Diatraea saccharalis foram obtidas através de criação artificial realizado no Laboratório da Biofabrica de Agentes de controle Biológico da Empresa Bioenergia do Brasil S/A da cidade de Lucélia - SP.
Construção da Gaiola
As estruturas foram montadas com um dimensionamento de 2,5m x 2,5m com armações de ferro. Montado os esqueletos das gaiolas, utilizou para o revestimento tecido TNT na cor branca para evitar que as C. flavipes escapassem. Em seguida foi feito uma porta vedada com velcro para entrada e coletas dos insetos. Também foram feitas aberturas no TNT em forma de retângulos vedados com plástico em cada gaiola, para assim poder ter visibilidade de fora para dentro da gaiola, evitando interferência no desenvolvimento do experimento .
Elaboração do experimento
Antes de cada uma das cinco repetições do experimento, com o auxilio de um borrifador, cada gaiola foi esterilizada com álcool 70% e, em seguida, colocadas 5 placas de Petri com BDA abertas em cada gaiola e deixadas por 30 minutos para garantir que não havia o fungo de Beauveria spp . no ambiente interno. Após esse período para detectar a presença do fungo, as placas foram vedadas e incubadas em uma sala climatizada 26 ± 1°C, durante 10 dias. Comprovado não haver contaminação do ambiente com o fungo, as gaiolas novamente esterilizadas e deu-se início ao experimento.
Cento e oitenta lagartas de terceiro instar, 14 dias de vida, foram separadas e distribuídas em bandejas previamente esterilizadas com álcool 70%. Foram colocadas 15 lagartas em cada bandeja, totalizando 12 bandejas, sendo seis para cada tratamento: a gaiola da testemunha (Cotesia flavipes) e a gaiola da composição (Composição Cotesia flavipes Beauveria spp.), totalizando 90 lagartas por tratamento. Em seguida foram colocados colmos de cana-de- açúcar cortados ao meio para servir de atrativo para que as lagartas não saíssem das bandejas.
Foram utilizadas 4 caixinhas de polipropileno (5 cm x 7cm) contendo 2 massas em cada uma, correspondendo a aproximadamente 70 indivíduos eclodidos e acasalados por caixinha. Duas caixinhas de plásticos com as cotesia flavipes já eclodias foram inoculadas com 12 mg de esporo de Beauveria spp . (composição) e as outras duas caixinhas foram mantidas sem fungo como testemunhas (Cotesia flavipes) . Foram colocadas e abertas duas caixinhas contendo a composição C. flavipes + Beauveria spp. (composição) em uma gaiola e na outra apenas 2 caixinhas contendo apenas C. flavipes (Testemunha), por um período de cinco horas para ação da C. flavipes e do composição. Dessa forma, considerando uma proporção de 60% de fêmea, foi colocada uma fêmea de C. flavipes para cada lagarta de D. saccharalis . Durante este período, foram esterilizadas 180 caixinhas de polietileno de 3,5cm de diâmetro, e também foram cortados cubos de cana-de-açúcar de 1,5 cm de lado para servir de alimento para as lagartas. Tanto as caixinhas como os cubos de colmo de cana-de-açúcar foram esterilizados com álcool 70%, sendo identificados 90 caixinhas da composição e 90 caixinhas de Testemunha (só vespa) . Passado 5 horas retirou às lagartas da gaiola, primeiro a Testemunha e depois a composição, com o auxílio de uma pinça. Para evitar contaminação e canibalismo, após cada a coleta de cada lagarta, a pinça foi esterilizada e as lagartas foram individualizadas nas caixinhas. Os cubos de cana-de-açúcar para alimentação forma colocados nas caixinhas e estas foram avaliadas diariamente, durante 30 dias. Este procedimento foi repetido uma vez por semana durante 5 semanas, constituindo cinco repetições em blocos ao acaso.
Após 10 dias foram analisadas as placas de Petri contendo meio de BDA que foram abertas nas gaiolas, não sendo constatada nenhuma ocorrência do fungo Beauveria spp em nenhuma das placas de Petri, comprovando que o mesmo não contaminava o ambiente interno da gaiola.
Como pode ser observado na Figura 54, a composição com a composição C. flavipes + Beauveria spp . , proporcionou um aumento significativo no parasitismo de D. saccharalis, com uma média de 52,6% contra apenas 19,3% da testemunha com C. flavipes sozinha, ou seja, foi 2,7 vezes mais eficiente.
Analisando as repetições, a composição foi mais eficaz em todas elas se destacando em algumas com mais de 20% no parasitismo que a Testemunha, em algumas tendo aparição do fungo completa em 5 dias, enquanto na Testemunha as massas começaram a aparecer com 10 dias. Portanto, além de aumentar o parasitismo, a composição proporcionou uma morte mais rápida da praga. Com quatro dias, as lagartas parasitadas pelo fungo já se encontravam imóveis e sem alimentação .
A composição em todas as repetições apresentou uma maior eficiência no controle, concluindo que a C. flavipes transporta o fungo entomopatogênico Beauveria spp até a lagarta Diatraea saccharalis, sendo uma nova alternativa para o controle mais eficiente de broca. Além disso, a morte é mais rápida, podendo os esporos do fungo contaminarem outros indivíduos na mesma geração da praga. Um dos fatores que pode explicar a maior eficiência da composição é o fato da C. flavipes macho também agir com disseminador e vetor do fungo e a fêmea pousar em mais de uma lagarta levando o fungo para mais indivíduos.
VI - Avaliação de Diferentes Métodos de Inoculação em Cotesia flavipes com Beauveria bassiana
Este experimento objetivou avaliar as diferentes metodologias de inoculação do fungo Beauveria bassiana em Cotesia flavipes para concluir qual o melhor método para produção em escala da composição objeto da presente invenção .
Foi utilizado como hospedeiro padrão lagartas de Diatraea saccharalis no terceiro instar para a criação de Cotesia flavipes. Adultos do parasitóide com 24 horas de idade foram confinados em recipientes plásticos (5 cm x 7cm) , contendo na tampa de cada recipiente um pequeno orifício para a saída dos adultos. Em seguida, as lagartas foram colocadas próximas ao orifício, visando à deposição dos ovos do parasitóide no seu interior. Após o parasitismo, as lagartas foram transferidas para caixas plásticas com 19 divisórias (30 cm x 18 cm x 04 cm) , contendo dieta artificial, onde permaneceram durante 14 diaspara a formação das pupas do parasitóide. As massas de casulos (pupas) foram retiradas e transferidas novamente para a gaiola de inoculação, onde permaneceram durante seis dias até a completa emergência dos adultos.
Para a obtenção e produção de Beauveria bassiana, foi utilizado o isolado IBCB 66, fornecido pelo Laboratório de Controle Biológico do Instituto Biológico de Campinas. 0 isolado foi revigorado em lagartas de 3o instar de D. saccharalis. Para o bioensaio, o fungo foi repicado em meio de cultura a base de levedura, incubado em sala climatizada a 26 ± 1°C e fotofase de 12 horas, onde permaneceu por 21 dias. 0 pó produzido em placa foi aplicado em tubos contendo arroz e mantido em sala climatizada a 26± 1°C pelo período de 10 dias. Prontos, os tubos foram transferidos para sacos de arroz autoclavados contendo 500g cada um. Após 3 dias na sala de incubação, depois da formação de micélio, os sacos foram selecionados em relação a contaminação, somente os sacos não contaminados foram abertos e seu conteúdo despejado em bandejas que foram levadas para a "Sala de Secagem" a uma temperatura de 21 a 28°C e fotofase de pelo menos 16 horas. Após 12 a 15 dias, ou seja, quando a esporulação do fungo tenha se completado, o material foi ser seco para obtenção dos esporos. Depois desse período de esporulação e secagem, separou-se o arroz do pó de fungo em um processo de escovação e armazenou-se o pó em saquinhos plásticos. A avaliação da viabilidade do isolado foi determinada pela contagem dos conídios germinados e não germinados em microscópio óptico, 16 horas após o plaqueamento em BDA + A, sendo tomados 100 conídios por placa para obtenção da porcentagem de germinação.
0 experimento foi realizado na Biofábrica de Agentes de Controle Biológico da empresa Bioenergia do Brasil S/A. 0 delineamento experimental foi inteiramente casualizado contendo sete tratamentos com cincorepetições cada. A parcela foi representada por umcopo contendo 30 massas cinzas de C. flavipes.
Para a montagem do experimento, o isolado IBCB 66 de Beauveria bassiana foi pesado com o auxílio de uma balança analítica na concentração de 50 mg por tubo plástico. Os copos com adultos de C. flavipes foram expostos ao fungo em diferentes métodos, separados em bandejas plásticas e classificados em tratamentos: Tl - copos sem o fungo (Testemunha); T2 - polvilhamento dos copos com 50 mg de esporos com auxílio de um cachimbo de; T3 - copos borrifados com uma solução de 25 mL de água autoclavada + 7,5 mL de melaço + 50 mg de esporos puros; T4 - copos inoculados com uma cápsula furada nas duas extremidades contendo 50 mg de esporos puros e os copos não foram agitados; T5 - copos inoculados com uma cápsula furada nas duas extremidades contendo 50 mg de esporos puros e os copos foram agitados após inoculados; T6 - copos inoculados com uma cápsula furada nas duas extremidades contendo 50 mg de esporos puros, os copos não foram agitados no mesmo dia e sim no dia seguinte após a eclosão dos indivíduos e T7 - foi fixada uma fita dupla face contendo 50 mg de esporos puros de B. bassiana na parte interna da tampa do copo, sendo os copos tampados em seguida. Todos os tratamentos continham 5 copos cada, totalizando 35 copos. As bandejas com os copos de Cotesia flavipes foram mantidas nas prateleiras em sala climatizada a temperatura de ±26°C, umidade relativa de 70±10 % e fotofase de 12 horas.
Após 24 horas da inoculação do fungo foram inoculadas 20 lagartas por copo de cada tratamento e diariamente foi avaliado o parasitismo.
Aguardou-se 72 horas da inoculação do fungo e os 35 copos foram avaliados. Para tanto, 72 horas após a inoculação do fungo, os indivíduos vivos foram transferidos para copos vazios para posterior avaliação de indivíduos mortos, vivos e casulos não eclodidos.
Após inocular as lagartas, 10 indivíduos restantes de cada copo foram plaqueados em placas de petri com meio de BDA para avaliação do crescimento de colónias e também foram separados 20 indivíduos de cada copo em tubos plásticos, sendo 10 machos e 10 fêmeas em cada tubo para a contagem em câmara de Neubauer de conídios por indivíduo.
As Figuras de 55 a 58 apresentam os gráficos de resultados dos experimentos da eficiência do parasitismo em lagartas, longevidade dos indivíduos, crescimento de colónias e contagem de conídios por indivíduo de C. flavipes, respectivamente. De acordo com os dados obtidos na eficiência do parasitismo (Figura 55), os métodos de cápsula agitada na hora e fita dupla face atingiram percentual de parasitismo total igual 100%, sendo que o de cápsula agitada na hora apresentou 97,00% de parasitismo por Beauveria bassiana . Os dados obtidos para longevidade de C. flavipes (Figura 56) proporcionaram mortalidade de 46,84% de indivíduos no método de cápsula agitada na hora, indicando menor mortalidade comparada até mesmo com o método atual de inoculação, que foi de 52,01%.
O crescimento de colónias (Figura 57) não apresentou variação considerável entre os tratamentos de cápsulas não agitada (32 colónias), cápsula agitada na hora (36 colónias) e cápsula agitada após a eclosão (31 colónias).
Os dados observados no gráfico de contagem de conídios por indivíduo (Figura 58) demonstra que os machos de Cotesia carregam maior quantidade de esporos do que fêmeas na maioria dos tratamentos, mostrando que machos e fêmeas são eficazes para a disseminação e vetorização de fungos entomopatogênicos .
Nas condições em que foi conduzido o experimento, pode-se concluir que o melhor método para a inoculação de Beauveria bassiana no parasitóide Cotesia flavipes foi o de cápsula agitada na hora, devido apresentar resultados mais satisfatórios em todas as avaliações : eficiência de parasitismo em lagartas, longevidade dos indivíduos, crescimento de colónias e contagem de conídios por indivíduo, sendo assim o ideal para o processo de fabricação da composição objeto da presente invenção.
VII - Viabilidade de Esporos da Composição
O objetivo desse experimento foi avaliar a viabilidade de esporos de Beauveria bassiana que se encontram na composição através de germinações.
Procedimento 1:
Com o auxílio de uma proveta colocar água até atingir um litro, depois transferir para um Erlenmeyer e acrescentar 14g de Agar-Agar, tampar com algodão e colocar dentro da autoclave ligando e deixando por 30 minutos a 120°C até completar o ciclo. Após completar o ciclo desligue, e espere sair a preção e esfrie o meio até atingir uma temperatura de 37°C.Após atingir a temperatura de 37°C o meio foi vertido em placas de Petri em uma cama de fluxo com uma lamparina, totalizando 100 placas de Petri com o meio de Agar-Agar. As placas foram fechadas com papel filme .
Procedimento 2:
Foram pegos 25 copos de cotesia flavipes do laboratório da Biofabrica recém eclodidos e colocados esporos de Beauveria bassiana para produção da Composição.
Procedimento 3:
No primeiro dia após serem colocados os esporos nos copos foram pegos 10 indivíduos de cotesia flavipes e colocado em eppendorf com 1 ml de água cada copo um eppendorf, agitá-los no agitador de tubos por 2 minutos em seguida com o auxílio de uma pipeta de ΙΟΟμΙ pipetar em uma placa de Petri. Realizando este procedimento até o quarto dia .
Como pode ser observado no gráfico da figura 59, o pico de maior eficiência da composição é no primeiro dia, nos demais dias ocorre uma queda satisfatória na viabilidade do produto, pois sabemos que mesmo armazenada a composição não haverá perdas significativas, pois sua queda de viabilidade é de apenas 11% até o quatro dia, um resultado satisfatório por se tratar de organismo vivo.
VIII Diferentes quantidades de Cotesia flavipes para realização da Composição de Parasitoides e Fungos Entomopatogênicos O objetivo deste experimento foi demonstrar que a composição de parasitoides e fungos entomopatogênico pode ser desenvolvida em uma ampla gama de quantidades de indivíduos e em dispositivos de diferentes volumes.
Para a obtenção da Cotesia flavipes, foi utilizado como hospedeiro padrão lagartas de Diatraea saccharalis no terceiro instar. Adultos do parasitoide com 24 h de idade foram confinados em copos plásticos (50 ml), contendo na tampa de cada copo um pequeno orifício para a saída dos adultos. Em seguida, as lagartas foram colocadas próximas ao orifício, visando à deposição dos ovos do parasitoide no seu interior. Após o parasitismo, as lagartas foram transferidas para caixinhas de polietileno, contendo dieta artificial, onde permaneceram até a formação das pupas do parasitoide. As massas de casulos (pupas) foram retiradas e transferidas para os dispositivos utilizados no experimento, onde permaneceram até a emergência dos adultos. Os volumes dos recipientes utilizados foram 0,15Lt, 0,5Lt, 5Lt, 15Lt, 25Lt e 38 Lt, tendo, respectivamente, 1.500, 5.000, 50.000, 150.000, 250.000 e 380.000 indivíduos de Cotesia flavipes em cada dispositivo.
Para a obtenção e produção de Beauveria bassiana, foi utilizado o isolado padrão de B. bassiana IBCB 66 obtido do Laboratório de Controle Biológico do Instituto Biológico de Campinas. O isolado foi revigorado em lagartas de 3o instar de D. saccharalis . Para o bioensaio, o fungo foi repicado em BDA+A (batata-dextrose-ágar + sulfato de estreptomicina) e, após sete dias, foi repicado em meio completo (MC), incubado em sala climatizada a 26 ± 1°C e fotofase de 12 horas, onde permaneceu por 10 dias. Os esporos produzidos em placa foram inoculados em tubos contendo arroz autoclavado e mantido em sala climatizada a 26± 1°C, umidade relativa de ±40 % e fotofase de 12 horas, pelo período de 10 dias. Prontos, os tubos foram transferidos para sacos de arroz autoclavados contendo 500g cada um. Após 3 dias na sala de incubação, depois da formação de micélio, os sacos foram selecionados em relação a contaminação, somente os sacos não contaminados foram abertos e seu conteúdo despejado em bandejas que foram levadas para a "Sala de Secagem" a uma temperatura de 21 a 28°C e fotofase de pelo menos 16 horas. Após 12 a 15 dias, ou seja, quando a esporulação do fungo tenha se completado, o material foi ser seco para obtenção dos esporos por escovação. Em seguida, os esporos foram armazenados em saquinhos plásticos. A avaliação da viabilidade do isolado foi determinada pela contagem dos conidios germinados e não germinados em microscópio óptico, 16 horas após o plaqueamento em BDA + A, sendo tomados 100 conidios por placa para obtenção da porcentagem de germinação .
O experimento foi realizado no laboratório Biofábrica de agentes de controle biológico da empresa Bioenergia do Brasil S/A. O delineamento experimental foi composto de seis tratamentos (incluindo já os estágios com testemunha) com quatro repetições cada. Os conidios do isolado IBCB 66 de Beauveria bassiana foram pesados e armazenados em tubos plásticos.
Para a montagem do experimento, os esporos foram pesados com o auxilio de uma balança analítica de maneira a se obter as seguintes quantidades: 0,012g (recipiente de 0,15 Lt ) , 0,04g (recipiente de 0,5Lt), 0,4g (recipiente de 5Lt), l,2g (recipiente de 15Lt), 2g (recipiente de 25Lt) e 3,04g (recipiente de 38Lt) que foram armazenados em um tubo plástico. Essa quantidade de esporos foi utilizada para inocular os recipientes com adultos de C. flavipes .
Após a inoculação, os recipientes foram separados e classificados em tratamentos: Tl = 1.500 indivíduos; T2 = 5.000 indivíduos; T3 = 50.000 indivíduos; T4= 150.000 indivíduos; T5= 250.000 indivíduos; T6=380.000 indivíduos. Os recipientes com os insetos foram mantidos em sala climatizada a temperatura de ±26°C, umidade relativa de 70±10% e fotofase de 12 horas.
Para o experimento, foram avaliados os seguintes parâmetros: Longevidade dos indivíduos de Cotesia flavipes, número de indivíduos de Cotesia flavipes capazes de formar colónias de Beauveria bassiana, quantidade de conídios de Beauveria bassiana em cada indivíduo de Cotesia flavipes e eficiência do parasitismo provocado pela composição Cotesia flavipes + Beauveria bassiana.
Após 24 horas da inoculação do fungo foram inoculadas 20 lagartas por repetição de cada tratamento e diariamente foi avaliado o parasitismo.
Após inocular as lagartas, foram escolhidos ao acaso 10 indivíduos daqueles que sobraram em cada dispositivo e transferidos para placas de Petri com meio de BDA, para avaliação do crescimento de colónias. Também foram transferidos 20 indivíduos de cada dispositivo para tubos plásticos, sendo 10 machos e 10 fêmeas em cada tubo, totalizando dois tubos, para a contagem em câmara de Neubauer de conídios por indivíduo.
Após 72 horas da inoculação, os recipientes foram avaliados, onde os indivíduos vivos foram transferidos para recipiente vazios para posterior avaliação de indivíduos mortos, vivos e casulos não eclodidos .
As Figuras de 60 a 63 apresentam os gráficos de resultados das avaliações da eficiência do parasitismo em lagartas, longevidade dos indivíduos, crescimento de colónias e contagem de conídios por indivíduo de C. flavipes, respectivamente. De acordo com os dados obtidos na eficiência do parasitismo (Figura 60) as diferentes quantidades de indivíduos e diferentes recipientes, apresentaram uma alta eficiência em todos os tratamentos. Os dados obtidos da longevidade (Figura 61) não apresentaram diferença significativa da mortalidade dos indivíduos, não reduzindo assim a vida útil da composição.
O crescimento de colónias (Figura 62) mostra que os indivíduos de Cotesia flavipes continuam carregando conídios capazes de formar colónias de Beauveria bassiana em composições com grandes quantidades de indivíduos. Os dados observados no gráfico de contagem de conídios por indivíduo demonstram que os machos também carregam quantidades consideráveis de esporos, portanto machos e fêmeas são eficazes para a composição.
Metarhizium anisopliae em Cotesia flavipes
Em outra concretização preferencial da presente invenção, é preparada uma composição compreendendo o fungo Metarhizium anisopliae e a vespa Cotesia flavipes, na qual o fungo permanece associado a vespa, sendo que a vespa atua como vetor do fungo para pragas agrícolas.
IX - Análise de Parasitismo e Toxidade de diferentes isolados de Metarhizium anisopliae em Cotesia flavipes.
0 objetivo deste experimento foi avaliar o efeito dos isolados de Metarhizum anisopliae sobre o parasitoide Cotesia flavipes, obtendo, assim, um isolado menos tóxico na associação com a Cotesia tornando, assim, possível a composição .
0 experimento foi realizado no Laboratório de Criação Massal da Biofábrica de Agentes Biológicos-Bioenergia do Brasil/SA-Lucélia, SP, no período do mês de março do ano 2013.
Criação de Cotesia flavipes .
A criação foi realizada utilizando como hospedeiro padrão lagartas de D. saccharalis no terceiro instar. Adultos do parasitoide com 24 h de idade foram confinados em copos plásticos (50 ml), contendo na tampa de cada copo um pequeno orifício para a saída dos adultos. Em seguida, as lagartas foram colocadas próximas ao orifício, visando à deposição dos ovos do parasitoide no seu interior. Após o parasitismo, as lagartas foram transferidas para caixinhas de polietileno, contendo dieta artificial, onde permaneceram até a formação das pupas do parasitoide. As massas de casulos (pupas) foram retiradas e transferidas para copos plásticos (150 ml), onde permaneceram até a emergência dos adultos.
Obtenção de Metarhizium anisopliae
Para a obtenção de Metarhizium anisopliae foram utilizados o isolado padrão de M. anisopliae IBCB 425, MBI01, MBI02, MBI03, MBI04, MBI05, MBI06, MBI07, MBI08, MBI09, MBIO10, MBI011, MBI012, MBI013, MBI014, MBI015, MBI016, MBI017, MBI018, MBI019, MBIO20 obtidos da micoteca do Laboratório da Biofábrica de agentes de Controle Biológico. Os isolados foram revigorados em lagartas de 3o instar de D. saccharalis . Para o bioensaio, os fungos foram repicados em BDA ( batata-dextrose-ágar ) e após sete dias, os isolados de M. anisopliae foram novamente repicados em BDA, incubados em câmara climatizada a 26 ± 1°C e fotofase de 12 horas, onde permaneceram por dez dias. Os esporos produzidos em placa foram inoculados em tubos contendo arroz autoclavado, mantidos em sala climatizada a 26± 1°C, umidade relativa de ± 40 % e fotofase de 12 horas, pelo período de 10 dias. Prontos, os tubos foram transferidos para sacos de arroz autoclavados contendo 500g cada um. Após 3 dias na sala de incubação, depois da formação de micélio, os sacos foram selecionados em relação a contaminação, somente os sacos não contaminados foram abertos e seu conteúdo despejado em bandejas que foram levadas para a "Sala de Secagem" a uma temperatura de 21 a 28°C e fotofase de pelo menos 16 horas. Após 12 a 15 dias, ou seja, quando a esporulação do fungo tenha se completado, o material foi ser seco para obtenção dos esporos. Depois desse período, separou-se o arroz dos esporos do fungo por escovação. Em seguida, os esporos foram armazenados em saquinhos plásticos. A avaliação da viabilidade do isolado foi determinada pela contagem dos conidios germinados e não germinados em microscópio óptico, 16 horas após o plaqueamento em BDA + A, sendo tomados 100 conidios por placa para obtenção da porcentagem de germinação.
0 delineamento experimental foi composto de 22 tratamentos (incluindo a testemunha) com 04 repetições cada tratamento. Para a testemunha foram utilizados copos com massa de Cotesia flavipes (ponto eclosão) sem fungo. Os conidios do isolado IBCB 425 de Metarhizium anisopliae foram pesados e armazenados em tubos plásticos e utilizados como padrão.
Para a montagem do experimento, os esporos foram pesados com o auxilio de uma balança analítica de maneira a se obter uma quantidade de 0,012g (medida pré-determinada padrão) que foram armazenados em um tubo plástico. Essa quantidade de esporos foi utilizada para inocular os copos em média 1500 indivíduos de C. flavipes. Após inoculação, os copos foram separados em bandejas plásticas e classificados em tratamentos:
Tabela 1: Isolados Metarhizium anisopliae utilizados no experimento.
Tratamentos Isolados Metarhizium anisopliae
Testemunha
T2 IBCB 425
T3 MBI01
T4 MBI02
T5 MBI03
T6 MBI04
T7 MBI05
T8 MBI06 T9 MBI07
TIO MBI08
Til MBI09
T12 MBIO10
T13 MBIOll
T14 MBI012
T15 MBI013
T16 MBI014
T17 MBI015
T18 MBI016
T19 MBI017
T20 MBI018
T21 MBI019
T22 MBIO20
Todos os tratamentos contendo 20 copos cada um totalizando 440 copos o experimento. Os copos com os insetos foram mantidos em sala climatizada a temperatura de ±26°C, umidade relativa de 70±10 % e fotofase de 12 horas.
As amostras eram destrutivas, sendo avaliada a mortalidade diariamente, durante 05 dias após a aplicação dos fungos. Os indivíduos permanecidos vivos nos copos durante os dias de avaliação eram liberados em área aberta durante 2 horas. Os copos com indivíduos mortos eram fechados e guardados para posterior contagem dos indivíduos de C. flavipes mortos por copo. A variável avaliada foi a mortalidade do parasitoide C. flavipes em porcentagem (%) . Foi utilizado o software de contagem de Cotesia flavipes, considerando que cada copo possuía em média inicialmente 1500 indivíduos do parasitoide.
As Figuras de 64 a 83 apresentam os gráficos da taxa de mortalidade de C. flavipes ao longo dos cinco dias de avaliação quando foram inoculadas massas cinzas (quase eclodindo) . De acordo com os dados obtidos, os isolados MBI01, MBI011 e MBI016 (Figuras 64, 74 e 79) foram as que apresentaram menor toxicidade, sendo estes, portanto, os isolados mais indicados para inoculação dos copos durante o processo de fabricação da composição. Nos tratamentos MBI02, MBI03, MBI04, MBI05, MBI06, MBI07, MBI08, MBI09, MBIO10, MBI012, MBI013, MBI014, MBI015, MBI017, MBI018, MBI019, MBIO20, a taxa de mortalidade no decorrer dos dias foi alta , sendo estes isolados tóxicos para o do parasitoide e, portanto, deve ser evitados na composição do produto (Figura 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 75, 76, 77, 78, 80, 81, 82, 83) .
Os resultados deste experimento irão implicar nas diversas etapas do projeto de biofabricação da composição, juntamente com agressividade dos isolados para a Diatraea saccharalis .
Portanto, nas condições que foi conduzido o experimento, pode-se concluir que os isolados MBI01, MBI011 e MBI016 são os indicados para a composição.
X - Determinação da Dosagem de Esporos de Metarhizium spp e Momento Ideal para a Inoculação de Parasitoide Cotesia flavipes para o Desenvolvimento da Composição.
0 objetivo desse experimento foi utilizar diferentes concentrações de esporos de Metarhizium spp. em diferentes estágios de desenvolvimento da Cotesia flavipes para determinar qual a melhor dosagem e com menor toxidade para fabricação da composição.
Criação de Cotesia flavipes
A criação foi realizada utilizando como hospedeiro padrão lagartas de Diatraea saccharalis no terceiro instar para a criação de Cotesia flavipes . Adultos do parasitoide com 24 horas de idade foram confinados em recipientes plásticos (5 cm x 7cm) , contendo na tampa de cada recipiente um pequeno orifício para a saída dos adultos. Em seguida, as lagartas foram colocadas próximas ao orifício, visando à deposição dos ovos do parasitoide no seu interior. Após o parasitismo, as lagartas foram transferidas para caixas plásticas com 19 divisórias (30 x 18 x 04 cm), contendo dieta artificial, onde permaneceram até a formação das pupas do parasitoide. As massas de casulos (pupas) foram retiradas e transferidas novamente para a gaiola de inoculação, onde permaneceram até a emergência dos adultos.
Produção de Esporos de Metarhizium spp.
Para a obtenção e produção de Metarhizium spp. foram utilizados os isolados IBCB 425 e MBIO 104, obtido da micoteca do Laboratório da Biofábrica de agentes de Controle Biológico. Os isolados foram escolhidos devido à sua utilização em cana-de-açúcar para o controle da praga Mahanarva posticata, com base em testes preliminares. Os isolados foram revigorados em lagartas de 3o instar de D. saccharalis . Para o bioensaio, os fungos foram repicados em meio de cultura a base de aveia e incubados em câmara climatizada tipo B.O.D. a 26 ± 1°C e fotofase de 12 horas, onde permaneceram por 15 dias. 0 pó produzido em placa foi aplicado em tubos contendo arroz e mantido em sala climatizada a 26± 1°C pelo período de 10 dias. Prontos, os tubos foram transferidos para sacos de arroz autoclavados contendo 500g cada um. Após 3 dias na sala de incubação, depois da formação de micélio, os sacos foram selecionados em relação a contaminação, somente os sacos não contaminados foram abertos e seu conteúdo despejado em bandejas que foram levadas para a "Sala de Secagem" a uma temperatura de 21 a 28°C e fotofase de pelo menos 16 horas. Após 12 a 15 dias, ou seja, quando a esporulação do fungo tenha se completado, o material foi ser seco para obtenção dos esporos. Depois do período, seco e esporulado, separou-se o arroz do pó de fungo em um processo de escovação e armazenou-se o pó em saquinhos plásticos. A avaliação da viabilidade dos isolados foram determinadas pela contagem dos conídios germinados e não germinados em microscópio óptico, 16 horas após o plaqueamento em BDA + A, sendo tomados 100 conídios por placa para obtenção da porcentagem de germinação.
0 delineamento experimental foi fatorial: 6 dosagens X 3 estágios de Cotesia flavipes X 2 isolados de Metarhizium spp . Para cada tratamento foram utilizadas 4 repetições, sendo a unidade amostrai representada por um copo contendo 30 massas de Cotesia flavipes.
Para a montagem do experimento, os esporos dos isolados IBCB 425 e MBIO 104 de Metarhizium spp. foram pesados com o auxílio de uma balança analítica de maneira a se obter uma quantidade nas dosagens de 6 mg, 9 mg, 12 mg, 15 mg e 18 mg por tubo plástico. Os tubos de cada tratamento foram armazenados em tubos plásticos. As 5 dosagens de esporos foram utilizadas para inocular os copos com adultos de C. flavipes nos seguintes estágios: massa branca, massa cinza e massa eclodida. 0 tratamento testemunha não recebeu inoculação do fungo. Após a inoculação os copos foram separados em bandejas plásticas e classificados nos seguintes tratamentos:
Tabela 3. Tratamentos utilizados no presente experimento .
MASSA BRANCA
(IBCB 425 e MBIO 104)
TRATAMENTOS DOSAGEM
Tl Testemunha
T2 6mg
T3 9mg
T4 12mg
T5 15mg
T6 18mg
MASSA CINZA
(IBCB 425 e MBIO 104)
TRATAMENTOS DOSAGEM
Tl Testemunha
T2 6mg
T3 9mg
T4 12mg
T5 15mg
T6 18mg
MASSA ECLODIDA
(IBCB 425 e MBIO 104)
TRATAMENTOS DOSAGEM
Tl Testemunha
T2 6mg
T3 9mg
T4 12mg T5 15mg
T6 18mg
Todos os tratamentos continham 60 copos cada, totalizando 360 copos para o isolado IBCB 425 e a mesma quantidade para o isolado MBIO 104. As bandejas com os copos contendo os insetos foram mantidas em prateleiras em sala climatizada à temperatura de ±26 °C, umidade relativa de 70±10 % e fotofase de 12 horas.
Após 24 horas da inoculação do fungo foram retirados 4 copos de massa eclodida por tratamento para avaliação da mortalidade, onde os insetos vivos foram liberados em área aberta por 4 horas e os mortos foram fechados e guardados para posterior contagem. Esse procedimento foi repetido diariamente, até o quinto dia.
As Figuras de 84 a 98 apresentam os gráficos da taxa de mortalidade de C. flavipes ao longo dos cinco dias de avaliação quando foram inoculadas com as diferentes dosagens em massa branca, massa cinza e massa eclodida, respectivamente do isolado IBCB 425. De acordo com os dados obtidos, o isolado atingiu alta taxa de mortalidade nas dosagens de 15 e 18 mg em todas as fases do desenvolvimento de Cotesia flavipes. Na dosagem de 12 mg no estágio de massa branca, os insetos atingiram uma porcentagem de mortalidade acima de 50% entre o segundo e terceiro dia, mantendo-se igual a testemunha. De acordo com as figuras 99 a 113, o isolado MBIO 104 atingiu alta taxa de mortalidade nas dosagens de 15 e 18 mg em todas as fases do desenvolvimento de Cotesia flavipes. Na dosagem de 6 mg nos estágios de massas branca e cinza os insetos atingiram uma porcentagem de mortalidade de 60% entre o segundo e o terceiro dia. A dosagem de 9 mg no estágio de massa branca e massa cinza apresentaram 70% de mortalidade no terceiro dia, respectivamente. Na dosagem de 12 mg a porcentagem de mortalidade atingiu 80% tanto para massa branca e cinza no terceiro dia.
Portanto, nas condições em que foi conduzido o experimento, pode-se concluir que a melhor dosagem para a inoculação do fungo no inseto vetor para o isoladao IBCB 425 é de 12mg de esporos de Metarhizium spp . na Cotesia flavipes foram no estágio inicial (massa branca) de desenvolvimento de Cotesia flavipes, devido não apresentarem diferenças significativas com a testemunha. Para o isolado MBIO 104 pode-se concluir que a melhor dosagem para a inoculação do fungo no inseto vetor é de 9 mg de esporos de Metarhizium spp. no estágio inicial (massa branca) e adultos encasulados (massa cinza) , devido não apresentarem diferenças significativas com a testemunha, sendo assim, a metodologia ideal para a composição do fungo entomopatogênico com o inseto vetor para o desenvolvimento da composição objeto da presente invenção. Portanto, o presente experimento definiu o momento e a dosagem de Metarhizium spp. na composição. 0 desenvolvimento da composição deve ainda considerar essa alta toxicidade e colocar, pelo menos 10% a mais de indivíduos dentro dos copos. Isso pode ser compensado pela escolha de um isolado menos tóxico (outra atividade do presente projeto selecionou 4 isolados menos tóxicos que o padrão IBCB 425) .
XI - Avaliação da Toxicidade de Metarhizium anisopliae a Diferentes Estágios de Cotesia flavipes.
0 objetivo deste experimento é determinar o melhor momento de inoculação do fungo Metarhizium anisopliae em copos de Cotesia flavipes, visando menor toxicidade ao parasitoide na composição.
Foi utilizado como hospedeiro padrão lagartas de Diatraea saccharalis no terceiro instar para a criação de Cotesia flavipes. Adultos do parasitoide com 24 horas de idade foram confinados em recipientes plásticos (5 cm x 7cm) , contendo na tampa de cada recipiente um pequeno orifício para a saída dos adultos. Em seguida, as lagartas foram colocadas próximas ao orifício, visando à deposição dos ovos do parasitoide no seu interior. Após o parasitismo, as lagartas foram transferidas para caixas plásticas com 19 divisórias (30 x 18 x 04 cm), contendo dieta artificial, onde permaneceram até a formação das pupas do parasitoide. As massas de casulos (pupas) do parasitoide foram retiradas e transferidas novamente para a gaiola de inoculação, onde permaneceram até a emergência dos adultos.
Para a obtenção e produção de Metarhizium anisopliae, foi utilizado o isolado padrão de M. anisopliae IBCB 245 obtido da micoteca do Laboratório da Biofábrica de agentes de Controle Biológico. 0 isolado foi revigorado em lagartas de 3o instar de D. saccharalis. Para o bioensaio, o fungo foi repicado em BDA+A ( batata-dextrose-ágar + sulfato de streptomicina ) e após sete dias, o isolado de M. anisopliae foi novamente repicado em BDA + A, incubado em câmara climatizada a 26 ± 1°C e fotofase de 12 horas, onde permaneceu por dez dias. Os esporos produzidos em placa foram inoculados em tubos contendo arroz autoclavado, mantidos em sala climatizada a 26± 1°C, umidade relativa de ±40 % e fotofase de 12 horas, pelo período de 10 dias. Prontos, os tubos foram transferidos para sacos de arroz autoclavados contendo 500g cada um. Após 3 dias na sala de incubação, depois da formação de micélio, os sacos foram selecionados em relação a contaminação, somente os sacos não contaminados foram abertos e seu conteúdo despejado em bandejas que foram levadas para a "Sala de Secagem" a uma temperatura de 21 a 28°C e fotofase de pelo menos 16 horas. Após 12 a 15 dias, ou seja, quando a esporulação do fungo tenha se completado, o material foi ser seco para obtenção dos esporos por processo de escovação. Em seguida, os esporos foram armazenados em saquinhos plásticos. A avaliação da viabilidade do isolado foi determinada pela contagem dos conidios germinados e não germinados em microscópio óptico, 16 horas após o plaqueamento em BDA + A, sendo tomados 100 conidios por placa para obtenção da porcentagem de germinação.
0 experimento foi realizado no laboratório Biofábrica de agentes de controle biológico da empresa Bioenergia S/A. 0 delineamento experimental foi composto de 06 tratamentos (incluindo já os estágios com testemunha) com 04 repetições cada tratamento. Os conidios do isolado IBCB 245 de Metarhizium anisopliae foram pesados e armazenados em tubos plásticos .
Para a montagem do experimento, os esporos foram pesados com o auxilio de uma balança analítica de maneira a se obter uma quantidade de 0,012g (medida pré-determinada padrão) que foram armazenados em um tubo plástico. Essa quantidade de esporos foi utilizada para inocular os copos com adultos de C. flavipes . Após inoculação, os copos foram separados em bandejas plásticas e classificados em tratamentos: Tl = massa recém-eclodida inoculada; T2 = massa cinza inoculada; T3 = massa branca inoculada. Os copos de testemunhas que não foram inoculados com o fungo constituíram os tratamentos: T4= massa recém-eclodida testemunha; T5= massa branca testemunha; T6=massa cinza testemunha. Todos os tratamentos contendo 20 copos cada um totalizando 120 copos por experimento. Os copos com os insetos foram mantidos em sala climatizada a temperatura de ± 26°C, umidade relativa de 70 ± 10 % e fotofase de 12 horas .
Avaliou-se a mortalidade diariamente, durante 05 dias após a aplicação dos fungos. Os indivíduos permanecidos vivos nos copos durante os dias de avaliação eram liberados em área aberta durante 2 horas. Os copos com indivíduos mortos eram fechados e guardados para posterior contagem dos indivíduos de C. flavipes mortos por copo. A variável avaliada foi a mortalidade do parasitoide C. flavipes em porcentagem (%) em seus diferentes estágios de desenvolvimento. Foi utilizado o software de contagem de Cotesia flavipes, considerando que cada copo possuía inicialmente 1.500 indivíduos do parasitoide.
As Figuras 114 a 116 apresentam os gráficos da taxa de mortalidade de C. flavipes ao longo dos cinco dias de avaliação quando foram inoculadas massas brancas, massas cinzas e massas eclodidas, respectivamente. De acordo com os dados obtidos, a massa eclodida (Figura 116) foi a que apresentou menor toxicidade ao fungo de Metarhizium anisopliae IBCB 245, sendo este, portanto, o momento mais indicado para inoculação dos copos durante o processo de fabricação da composição. No tratamento com a massa cinza, a taxa de mortalidade atinge 100% no quarto dia com a massa inoculada com o fungo, sendo esta a fase mais sensível do parasitoide e, portanto, deve ser evitada como momento de inoculação (Figura 115) . Considerando os dados apresentados na Figura 117, observa-se que mesmo nas massas brancas e nas massas eclodidas inoculadas com o fungo houve maior mortalidade que nas massas que não receberam o fungo. Portanto, além de promover a seleção de isolados menos tóxicos a C. flavipes, o projeto de desenvolvimento da composição precisa considerar um método de inoculação com o menor contato possível entre esporos do fungo e os adultos do parasitoide. Portanto, os resultados obtidos neste experimento irão orientar atividades futuras do projeto.
Nas condições em que foi conduzido o experimento, pode-se concluir que o melhor momento de inoculação de Metarhizium anisopliae no parasitoide Cotesia flavipes foi no estágio de massa eclodida.
XII - Melhor Método de Inoculação em Cotesia flavipes com Metarhizium anisopliae
Este experimento objetivou avaliar as diferentes metodologias de inoculação do fungo Metarhizium anisopliae em Cotesia flavipes para concluir qual o melhor método para produção em escala da composição objeto da presente invenção .
Foi utilizado como hospedeiro padrão lagartas de Diatraea saccharalis no terceiro instar para a criação de Cotesia flavipes. Adultos do parasitoide com 24 horas de idade foram confinados em recipientes plásticos (5 cm x 7cm) , contendo na tampa de cada recipiente um pequeno orifício para a saída dos adultos. Em seguida, as lagartas foram colocadas próximas ao orifício, visando à deposição dos ovos do parasitoide no seu interior. Após o parasitismo, as lagartas foram transferidas para caixas plásticas com 19 divisórias (30 cm x 18 cm x 04 cm) , contendo dieta artificial, onde permaneceram durante 14 dias para a formação das pupas do parasitóide. As massas de casulos (pupas) foram retiradas e transferidas novamente para a gaiola de inoculação, onde permaneceram durante seis dias até a completa emergência dos adultos.
Para a obtenção e produção de Metarhizium anisopliae, foi utilizado o isolado IBCB 425, fornecido pelo Laboratório de Controle Biológico do Instituto Biológico de Campinas. 0 isolado foi revigorado em lagartas de 3o instar de D. saccharalis . Para o bioensaio, o fungo foi repicado em meio de cultura a base de levedura, incubado em sala climatizada a 26 ± 1°C e fotofase de 12 horas, onde permaneceu por 21 dias. 0 pó produzido em placa foi aplicado em tubos contendo arroz e mantido em sala climatizada a 26± 1°C pelo período de 10 dias. Prontos, os tubos foram transferidos para sacos de arroz autoclavados contendo 500g cada um. Depois de sete dias o arroz foi retirado dos saquinhos, permanecendo ainda na mesma sala aberto por mais sete dias. Depois de esporulado, o arroz com fungo permaneceu por sete dias na sala de secagem em sala climatizada a 26 ± 1°C e umidade relativa ± 40 %. Depois desse período esporulação e secagem, separou-se o arroz do pó de fungo em um processo de escovação e armazenou-se o pó em saquinhos plásticos. A avaliação da viabilidade do isolado foi determinada pela contagem dos conídios germinados e não germinados em microscópio óptico, 16 horas após o plaqueamento em BDA + A, sendo tomados 100 conídios por placa para obtenção da porcentagem de germinação .
0 experimento foi realizado na Biofábrica de Agentes de Controle Biológico da empresa Bioenergia do Brasil S/A. 0 delineamento experimental foi inteiramente casualizado contendo sete tratamentos com cinco repetições cada. A parcela foi representada por um copo contendo 30 massas cinzas de C. flavipes.
Para a montagem do experimento, o isolado IBCB 425 de Metarhizium anisopliae foi pesado com o auxilio de uma balança analítica na concentração de 50 mg por tubo plástico. Os copos com adultos de C. flavipes foram expostos ao fungo em diferentes métodos, separados em bandejas plásticas e classificados em tratamentos: Tl - copos sem o fungo (Testemunha); T2 - polvilhamento dos copos com 50 mg de esporos de um tubo plástico (50 mg) em cada; T3 - copos borrifados com uma solução de 25 mL de água autoclavada + 7,5 mL de melaço + 50 mg de esporos puros; T4 - copos inoculados com uma cápsula furada nas duas extremidades contendo 50 mg de esporos puros e os copos não foram agitados; T5 - copos inoculados com uma cápsula furada nas duas extremidades contendo 50 mg de esporos puros e os copos foram agitados depois de inoculados; T6 - copos inoculados com uma cápsula furada nas duas extremidades contendo 50 mg de esporos puros, os copos não foram agitados no mesmo dia e sim no dia seguinte após a eclosão dos indivíduos e T7 - foi fixada uma fita dupla face contendo 50 mg de esporos puros de M. anisopliae na parte interna da tampa do copo, sendo os copos tampados em seguida. Todos os tratamentos continham 5 copos cada, totalizando 35 copos. As bandejas com os copos de Cotesia flavipes foram mantidas nas prateleiras em sala climatizada a temperatura de ±26 °C, umidade relativa de 70±10 % e fotofase de 12 horas.
Após 24 horas da inoculação do fungo foram inoculadas 20 lagartas por copo de cada tratamento e diariamente foi avaliado o parasitismo.
Aguardou-se 72 horas da inoculação do fungo e os 35 copos foram avaliados. Para tanto, 72 horas após a inoculação do fungo, os indivíduos vivos foram transferidos para copos vazias para posterior avaliação de indivíduos mortos, vivos e casúlos não eclodidos.
Após inocular as lagartas, 10 indivíduos restantes de cada copo foram plaqueados em placas de petri com meio de BDA para avaliação do crescimento de colónias e também foram separados 20 indivíduos de cada copo em tubos plásticos, sendo 10 machos e 10 fêmeas em cada tubo para a contagem em câmara de Neubauer de conídios por indivíduo.
As Figuras de 118 a 121 apresentam os gráficos de resultados dos experimentos da eficiência do parasitismo em lagartas, longevidade dos indivíduos, crescimento de colónias e contagem de conídios por indivíduo de C. flavipes, respectivamente. De acordo com os dados obtidos na eficiência do parasitismo (Figura 118), os métodos de fita dupla face e capsula não agitada atingiram percentual de parasitismo total igual a 76,04% e 72%, sendo que o ultimo apresentou parasitismo de Cotesia flavipes e Metarhizium anisopliae no mesmo hospedeiro de 2% (Figura 122) . Os dados obtidos para longevidade de C. flavipes (Figura 119) proporcionaram mortalidade de 37,82% de indivíduos no método de fita dupla face, indicando menor mortalidade comparada até mesmo com o método atual de inoculação, que foi de 54, 70% .
O crescimento de colónias (Figura 120) mostra que não houve crescimento no tratamento de pulverização com melaço, já os tratamentos com fita dupla face (49 colónias), cápsula agitada após a eclosão (40 colónias) e método atual (39 colónias) obtiveram os maiores resultados.
Os dados observados no gráfico de contagem de conidios por individuo (Figura 121) demonstra que os machos de C. flavipes também carregam quantidades consideráveis de esporos, portanto machos e fêmeas são eficazes para a disseminação e vetorização de fungos entomopatogênicos .
Nas condições em que foi conduzido o experimento, pode-se concluir que o melhor método para a inoculação de Metarhizium anisopliae no parasitoide Cotesia flavipes foi o de fita dupla face, devido apresentar resultados mais satisfatórios em todas as avaliações : eficiência de parasitismo em lagartas, longevidade dos indivíduos, crescimento de colónias e contagem de conidios por indivíduo, sendo assim o ideal para o processo de fabricação da composição objeto da presente invenção.
XIII - COMPOSIÇÃO QUALI-QUANTITATIVA DA COMPOSIÇÃO "DOUBLE" COM E SEM DISPOSITIVO.
0 dispositivo utilizado na composição é uma cápsula destinada à veiculação dos esporos do fungo + veículo pesticidamente aceitável até a vespa. 0 invólucro é constituído de gelatina ou amido por duas partes cilíndricas abertas numa das extremidades, apresentando fundo hemisférico, com capacidade para lOOmg.
Processo de inoculação dos esporos do fungo + veiculo pesticidamente aceitável na vespa acontece por duas maneiras :
Via Polvilhamento :
Os esporos do fungo serão pesados juntamente com o veículo pesticidamente aceitável seguindo as quantidades descritas na tabela acima (sem dispositivo) e serão polvilhados sob as massas (casulos) de vespa que já estiverem prontas para eclodirem que estão acondicionadas dentro de copos plásticos.
Via Dispositivo/Cápsula:
Os esporos do fungo serão pesados juntamente com o veiculo pest icidamente aceitável seguindo as quantidades descritas na tabela acima (com dispositivo) e serão acondicionados em uma cápsula de gel ou amido com capacidade para lOOmg. Esta cápsula recebera um furo em cada extremidade para que, quando o produto for para o campo, o mesmo será agitado para que os esporos do fungo + veiculo pest icidamente aceitável saiam pelos orifícios e se espalhem sob as massas (casulos) de Cotesia. Após fazer os orifícios na cápsula, a mesma será colocada dentro de um copo plástico que contém as massas (casulos) de Cotesia.
COMPOSIÇÃO SEM DISPOSITIVO.
ANÁLISE QUALI-QUANTITATIVA DA COMPOSIÇÃO
VEÍCULO FUNGO VESPA PROPORÇÃO
PESTICIDAME
NTE
ACEITÁVEL
Quantidade Quantid N° de Quantida Razã N° de
(gramas ) ade esporo de de o Esporos/
(gramas s Indivídu Sexu indivíduo ) os/copo al
(%)
0, 005 0, 005 2,8 x 500 60 ¥- 4 a 6 x
IO8 40°" IO5 esporos :
1 vespa
0, 007 0,007 3,9 x 750 60 ¥- 4 a 6 x
IO8 40°" IO5
esporos : 1 vespa
0, 015 0, 015 8,5 x 1500 60 ¥- 4 a 6 x
IO8 40°" IO5
esporos : 1 vespa
TABELA DE VARIAÇÃO (LIMITE MÁXIMO E LIMITE MÍNIMO) DA QUANTIDADE DE
INDIVÍDUOS DE COTESIA E FUNGO/VEÍCULO PESTICIDAMENTE ACEITÁVEL .
MIN/ VEÍCULO FUNGO VESPA PROPOR
MAX PESTICIDAME CÃO NTE
ACEITÁVEL
Quantidade Quantid N° Quantid Razã N° de
(gramas ) ade de ade de o Esporo
(gramas espo Individ Sexu s/
) ros uos/cop al indivi o (%) duo
LIMI 0, 004 0, 004 2,2 400 20 ¥- 4 a 6
TE X 80°" x IO5
MÍNI IO8 esporo MO s : 1 vespa
LIMI 0, 020 0, 020 1, lx 2000 80 ¥- 4 a 6
TE IO9 20°" x IO5
MÁXI esporo
MO s: 1 vespa
COMPOSIÇÃO QUALI-QUANTITATIVA DA COMPOSIÇÃO "DOUBLE" COM DISPOSITIVO
ANÁLISE QUALI-QUANTITATIVA DA COMPOSIÇÃO
VEÍCULO FUNGO VESPA PROPORÇÃ
PESTICIDAME O
NTE
ACEITÁVEL
Quantidade Quantid N° Quantida Razão N° de
(gramas ) ade de de de Sexua Esporos/
(gramas espo Indivídu 1 (%) indivídu ) ros os/copo o
0, 025 0, 025 1,4 500 60 ¥- 1 a 3 x
X 40°" IO6
IO9 esporos
: 1 vespa
0, 037 0,037 2,0 750 60 ¥- 1 a 3 x
X 40°" IO6 IO9 esporos :
1 vespa
0, 075 0, 075 4,2 1500 60 ¥- 1 a 3 x
X 40°" IO6
IO9 esporos :
1 vespa
TABELA DE VARIAÇÃO (LIMITE MÁXIMO E LIMITE MÍNIMO) DA QUANTIDADE DE
INDIVÍDUOS DE COTESIA E FUNGO/VEÍCULO PESTICIDAMENTE ACEITÁVEL .
MIN/ VEÍCULO FUNGO VESPA PROPOR
MAX PESTICIDAME CÃO NTE
ACEITÁVEL
Quantidade Quantid N° Quantid Razã N° de
(gramas ) ade de ade de o Esporo
(gramas espo Individ Sexu s/
) ros uos/rec al indivi iente (%) duo
LIMI 0, 020 0, 0200 1,1 400 20 ¥- 1 a 3
TE X 80°" x IO6
MÍNI IO9 esporo
MO s : 1 vespa
LIMI 19 19 5,6 380.000 80 ¥- 1 a 3
TE X 20°" x IO6
Figure imgf000092_0001
TABELA DE VARIAÇÃO (LIMITE MÁXIMO E LIMITE MÍNIMO PREFERENCIAL) DA
QUANTIDADE DE INDIVÍDUOS DE COTESIA E FUNGO/VEÍCULO PESTICIDAMENTE
ACEITÁVEL.
MIN/ VEÍCULO FUNGO VESPA PROPOR
MAX PESTICIDAME CÃO NTE
ACEITÁVEL
Quantidade Quantid N° Quantid Razã N° de
(gramas ) ade de ade de o Esporo
(gramas espo Individ Sexu s/
) ros uos/cop al indivi o (%) duo
LIMI 0, 025 0, 025 1,1 500 20 ¥- 1 a 3
TE X 80°" x IO6
MÍNI IO9 esporo
MO s : 1 vespa
LIMI 0, 100 0, 100 5,6 2.000 80 ¥- 1 a 3
TE X 20°" x IO6
MÁXI IO9 esporo
MO s : 1
Figure imgf000093_0001
Figure imgf000093_0002
Descrição do dispositivo
O dispositivo utilizado destinada à veiculação dos esporos do fungo + veiculo pesticidamente aceitável até a vespa. 0 invólucro é constituído de gelatina ou amido por duas partes cilíndricas abertas numa das extremidades, apresentando fundo hemisférico, com capacidade para lOOmg.
Processo de inoculação dos esporos do fungo + veiculo pesticidamente aceitável na vespa
Via Polvilhamento :
Os esporos do fungo serão pesados juntamente com o veículo pesticidamente aceitável seguindo as quantidades descritas na tabela acima (sem dispositivo) e serão polvilhados sob as massas (casulos) de vespa que já estiverem prontas para eclodirem que estão acondicionadas dentro de copos plásticos.
Via Dispositivo/Cápsula:
Os esporos do fungo serão pesados juntamente com o veículo pesticidamente aceitável seguindo as quantidades descritas na tabela acima (com dispositivo) e serão acondicionados em uma cápsula de gel ou amido com capacidade para lOOmg. Esta cápsula recebera um furo em cada extremidade para que, quando o produto for para o campo, o mesmo será agitado para que os esporos do fungo + veículo pesticidamente aceitável saiam pelos orifícios e se espalhem sob as massas (casulos) de Cotesia. Após fazer os orifícios na cápsula, a mesma será colocada dentro de um copo plástico que contém as massas (casulos) de Cotesia.
VEÍCULO PESTICIDAMENTE ACEITAVELS:
Talco
Caulin
Calcário
Amido de Milho Fécula de Mandioca
Farinha de arroz
Grão de arroz
Assim, embora tenham sido mostradas apenas algumas modalidades e exemplificações da presente invenção, será entendido que várias omissões, substituições e alterações na composição de insetos parasitoides e fungos entomopatogênicos para o controle biológico de pragas agrícolas, assim como nos métodos da presente invenção podem ser feitas por um técnico versado no assunto, sem se afastar do espírito e escopo da presente invenção.
É expressamente previsto que todas as combinações dos elementos que desempenham a mesma função substancialmente da mesma forma, para alcançar os mesmos resultados, estão dentro do escopo da presente invenção. Substituições de elementos de uma modalidade descrita para outra são também totalmente pretendidas e contempladas.
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Claims

REIVINDICAÇÕES
1. Composição de agentes de controle biológico caracterizada pelo fato de que compreende
400 a 380.000 quantidade de indivíduos /recipiente de pelo menos uma população de inseto predador ou parasitoide para disseminação e vetorização de uma espécie de fungo entomopatogênico;
0,004g a 3,8 g de uma população de fungo entomopatogênico;
e 0,004g a 3,8 g de veículo pesticidamente aceitável .
2. Composição de agentes de controle biológico caracterizada pelo fato de que compreende
400 a 380.000 quantidades de indivíduos /recipiente de pelo menos uma população de inseto predador ou parasitoide para disseminação e vetorização de uma espécie de fungo entomopatogênico;
0, 020g a 19g de uma população de fungo entomopatogênico;
0,020g a 19g de veículo pesticidamente aceitável; e uma cápsula destinada à veiculação dos esporos do fungo mais o veículo até a vespa.
3. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o fungo possui de 2,2 X IO8 a 1,1 X IO8 de número de esporos.
4. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a proporção de número de esporos por vespa varia entre 4 a 6 X 105 esporos por vespa .
5. Composição, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o fungo possui de 1,1 X IO9 a 5,6 X IO9 de número de esporos.
6. Composição, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a proporção de número de esporos por vespa varia entre 1 a 3 X IO6 esporos por vespa .
7. Composição, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que quantidade de indivíduos /recipiente de pelo menos uma população de inseto predador ou parasitoide para disseminação e vetorização de uma espécie de fungo entomopatogênico está preferencialmente na faixa entre 150.000 a 300.000.
8. Composição, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que quantidade de indivíduos /recipiente de pelo menos uma população de inseto predador ou parasitoide para disseminação e vetorização de uma espécie de fungo entomopatogênico é ainda, mais preferencialmente, na faixa entre 500 a 2.000.
9. Composição, de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizada pelo fato de que o predador/parasitoide pertence à família Braconidae e géneros Apanteles, Cotesia; família Coccinellidae com os géneros Cryptolaemus, Cycloneda, Eriopis e Hyppodamia; família Syrphidae com o género Salpingogaster e família Trichogrammatidae, com o género Trichogramma .
10. Composição, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o predador/parasitoide pertence, preferencialmente, a família Braconidae com o género Cotesia.
11. Composição, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que de que a população de predador e/ou parasitoide ser uma população de disseminação e/ou vetorização.
12. Composição, de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizada pelo fato de que o fungo entopatogênico pertence à família Entomophthoraceae com géneros Batkoa e Massospora; família Nectriaceae, com género Metarhizium, família Clavicipitaceae, com géneros Beauveria e Nomuraea; família Trichocomaceae com género Paecilomyces .
13. Composição, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que o fungo entopatogênico pertence, preferencialmente, a família família Clavicipitaceae, com o género Beauveria e, preferencialmente, a família Nectriaceae, com género Metarhi zi um .
14. Composição, de acordo com as reivindicações 1 a 13, caracterizada pelo fato de que o fungo permanece associado à vespa, sendo que a vespa atua como vetor do fungo para pragas agrícolas.
15. Composição, de acordo com de acordo com as reivindicações 1 a 14, caracterizada pelo fato de que os insetos predadores ou parasitoides vão diretamente ao alvo (praga) transportando em seu corpo esporos de fungo entomopatogênico .
16. Composição, de acordo com as reivindicações 1 a 15, caracterizada pelo fato de que a dosagem para a inoculação do fungo no inseto vetor é de 12 mg de esporos de Beauveria spp . no estágio inicial (massa branca) de desenvolvimento da Cotesia flavipes ou durante o início da eclosão .
17. Composição, de acordo com as reivindicações 1 a 16, caracterizada pelo fato de que na dita composição de 1500 indivíduos, aproximadamente 1365 indivíduos têm potencial para realizar o parasitismo, e ainda um parasitismo duplo, com a colaboração da vespa e do fungo, simultaneamente .
18. Composição, de acordo com as reivindicações 1 a 17, caracterizada pelo fato de que a espécie de fungo entopatogênico apresenta no mínimo 70% de esporos viáveis.
19. Composição, de acordo com as reivindicações 1 a 18, caracterizada pelo fato de que a dita composição é mantida de 8 a 30° C, até 4 dias.
20. Composição, de acordo com as reivindicações 1 a 19, caracterizada pelo fato de que a dita composição ser mantida na forma de uma cultura tridimensional no veículo.
21. Composição, de acordo com as reivindicações 1 a 20, caracterizada pelo fato de que o veículo pesticidamente aceitável pertence ao grupo de talco; caulin; calcário; amido de milho; fécula de mandioca; farinha de arroz e grão de arroz.
22. Método de disseminação e/ou vetorização de um fungo entopatogênico caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas:
a) fornecer uma composição conforme definida pelas reivindicações 1 a 21; e
b) possibilitar a adesão dos fungos entopatogênicos nos indivíduos da população de insetos predadores e/ou parasitoides .
23. Método de disseminação e/ou vetorização de um fungo entopatogênico, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a inoculação dos esporos do fungo mais o veículo pesticidamente aceitável na vespa pode acontecer via polvilhamento ou via dispositivo/cápsula.
24. Método de disseminação e/ou vetorização de um fungo entopatogênico , de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que no processo via polvilhamento, os esporos do fungo são pesados juntamente com o veiculo pest icidamente aceitável e são polvilhados sob as massas (casulos) de vespa que já estiverem prontas para eclodirem que estão acondicionadas dentro de copos plásticos .
25. Método de disseminação e/ou vetorização de um fungo entopatogênico , de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que no processo via dispositivo/cápsula, os esporos do fungo serão pesados juntamente com o veiculo pest icidamente aceitável e serão acondicionados em uma cápsula de gel ou amido com capacidade para lOOmg, em que a dita cápsula recebe um orifício em cada extremidade para que, quando o produto for para o campo, o mesmo será agitado para que os esporos do fungo mais o veículo pest icidamente aceitável saiam pelos orifícios e se espalhem sob as massas (casulos) da vespa ( Cotesia) .
26. Método de disseminação e/ou vetorização de um fungo entopatogênico , de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que após fazer os orifícios na cápsula, a mesma será colocada dentro de um copo plástico que contém as massas (casulos) da vespa (Cotesia) .
27. Método para controle biológico de pragas agrícolas caracterizado pelo fato de que compreende aplicar uma quantidade da composição conforme definida pelas reivindicações 1 a 21 na proximidade, tal como na base, de um número de plantas da safra agrícola, preferencialmente, individualmente com relação a cada planta da safra agrícola .
28. Método para controle biológico de pragas agrícolas, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a dita quantidade da composição ser de 1 a 10 ml, preferencialmente, 2 a 5 ml.
29. Uso da composição conforme definida pelas reivindicações 1 a 21 caracterizado pelo fato de que ser no controle de uma praga de infestação em safras agrícolas.
30. Uso da composição, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que a dita praga pertencente ao grupo de Agrotis sp; Alabama argillacea; Anagasta kuehniella; Anticarsia gemmatalis; Aphis gossypii ; Bemisia tabassi ; Deois flavopicta; Diatraea saccaralis; Helicoverpa; Heliothis virescens; Mahanarva fimbriolata; Mahanarva posticata; Mythimna unipuncta; Myzus persicae; Neoleucinodes elegantalis; Sacadodes pyralis; Spodoptera frugiperda; Tuta absoluta; Zulia entreariana.
31. Uso da composição conforme definida pela reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que a dita safra agrícola pertence ao grupo de Cana-de-açúcar (Saccharum officinarum); Sorgo (Sorghum bicolor) ; Arroz (Oryza sativa) ; Milho (Zea mays) ; trigo (Triticum aestivum) ; cevada (Hordeum vulgare) ; tomate (Solanum lycopersicum) ; soja (Glycine max) ; algodão (Gossypium hirsutum) ; feijão (Phaseolus vulgaris) ; pastagens (Brachiaria spp . , Panicum maximum, Andropogon Gayanus e Cynodon dactylon) ; café (Coffea arábica e coffea canephora) .
PCT/BR2015/050182 2014-10-14 2015-10-14 Composição de insetos parasitoides e fungos entomopatogênicos, método de disseminação e/ou vetorização de fungo entomopatogênico, uso da composição e método para controle biológico de pragas agrícolas WO2016058074A1 (pt)

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CN111096319A (zh) * 2019-12-13 2020-05-05 广东新景象生物工程有限公司 一种防治草地贪夜蛾农药的药剂及其制备方法

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