WO2016056596A1 - Ｈｓｐ７０由来のペプチド、これを用いた癌の治療又は予防のための医薬組成物、免疫誘導剤、及び抗原提示細胞の製造方法 - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to a peptide derived from HSP70, more specifically, an immunogenic peptide that presents an antigen to T cells through binding to a human leukocyte antigen, and a pharmaceutical composition for treating or preventing cancer using the same Product, immunity-inducing agent, and method for producing antigen-presenting cells.
  • cancer cells In vivo, it is thought that cancer cells always occur accidentally, but usually a specific cancer antigen-exclusion reaction due to innate immunity occurs, and then a specific immune response is induced and lymphatic It is assumed that cancer cells are eliminated by spheres.
  • HLA human leukocyte antigen
  • lymphocytes In order for cancer cell-derived antigens to be recognized, human leukocyte antigen (HLA) present on the cell surface and lymphocytes must form a complex. HLA molecules that are major histocompatibility antigens are roughly classified into class I molecules (HLA-A type, B type, C type) and class II molecules (HLA-DP type, DQ type, DR type).
  • CTLs cytotoxic T cells
  • CTL epitopes cancer antigens consisting of 8 to 11 amino acids presented on HLA class I molecules on the surface of cancer cells receive T cell antigens on CTLs. It is induced by being specifically recognized by the body (TCR).
  • JP-A-8-151396 discloses an oligopeptide comprising a specific amino acid sequence. Is described as having HLA binding properties.
  • HLA binding properties Many peptides having HLA binding properties are known, but there is a further demand for peptides that can be used for the treatment or prevention of various cancers. Moreover, since HLA is a gene rich in polymorphism, there is also a demand for a multitype immunogenic peptide corresponding to a plurality of HLA types.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and is an immunogenic peptide that binds to an HLA class I molecule, particularly a peptide capable of inducing CTL, and a pharmaceutical composition for treating or preventing cancer using the same.
  • An object of the present invention is to provide an immune inducer, a method for producing antigen-presenting cells, and the like.
  • the present invention includes the following inventions.
  • a peptide comprising 8 or more consecutive amino acid residues in the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to 15 and consisting of 11 or less amino acid residues.
  • the peptide according to (1) wherein one or several amino acids are substituted, inserted, deleted or added in the amino acid sequence and have immunogenicity.
  • the second amino acid is substituted with tyrosine, phenylalanine, methionine, tryptophan, valine, leucine or glutamine, and / or the C-terminal amino acid is substituted with phenylalanine, leucine, isoleucine, tryptophan, methionine or valine.
  • a pharmaceutical composition for treating or preventing cancer comprising the peptide according to any one of (1) to (3).
  • the pharmaceutical composition according to (4) which is in the form of a vaccine.
  • An immunity-inducing agent comprising the peptide according to any one of (1) to (3).
  • the immunity-inducing agent according to (7) which induces cytotoxic T cells.
  • a method for producing an antigen-presenting cell having CTL-inducing activity comprising a step of contacting the peptide according to any one of (1) to (3) and an antigen-presenting cell in vitro.
  • the peptide of the present invention has a high HLA binding property and a high CTL inducing ability, it is highly expected to be useful as a cancer vaccine.
  • Application to various immunotherapy, especially dendritic cell therapy is also envisaged.
  • HSP heat shock protein
  • HSPs are classified into eight families of HSP110, HSP90, HSP70, HSP60, HSP40, HSP28, HSP27 and HSP25 based on their molecular size.
  • HSP has been known to be involved in cell death (apoptosis)
  • it is roughly classified into two groups: a group that inhibits apoptosis and a group that induces apoptosis.
  • HSP70 is a heat shock protein that inhibits apoptosis, and it has been revealed that high expression of HSP70 is involved in cell survival under various circumstances such as canceration of cells. In fact, it has been reported that the HSP70 protein from which the peptide of the present invention is derived is expressed in various cancers.
  • Kaur J and Ralhan R Differential expression of 70-kDa heatshock protein in human oral tumorigenesis.
  • Corenford PA Dodson AR, Parsons KF, Desmond AD, Woolfenden A, Fordham M, Neoptolemos JP, Ke Y and Foster C: Heat-shock protein expression independently predicts clinical outcome in prostate cancer.Cancer Res 60: 7099-7105, 2000 6.
  • a specific peptide of the present invention can bind to a plurality of HLA types. Therefore, according to the peptide of the present invention, it is possible to provide a cancer vaccine, a dendritic cell therapy, etc. that cover a very wide range of cancer patients.
  • FIG. 1 shows the results of an ELISPOT assay when a sample from a liver cancer patient who received HSP70 dendritic cell therapy (HLA type: 02: 01/24: 02) was stimulated with the peptide of SEQ ID NO: 7, 9 or 15. The number of IFN- ⁇ producing cells).
  • FIG. 2 shows the results of an ELISPOT assay when a sample from a liver cancer patient who received HSP70 dendritic cell therapy (HLA type: 02: 01/33: 03) was stimulated with the peptide of SEQ ID NO: 7, 9 or 15. The number of IFN- ⁇ producing cells).
  • FIG. 1 shows the results of an ELISPOT assay when a sample from a liver cancer patient who received HSP70 dendritic cell therapy (HLA type: 02: 01/33: 03) was stimulated with the peptide of SEQ ID NO: 7, 9 or 15. The number of IFN- ⁇ producing cells).
  • FIG. 3 shows the results of an ELISPOT assay when a sample from a liver cancer patient who received HSP70 dendritic cell therapy (HLA type: 02: 06/24: 02) was stimulated with the peptide of SEQ ID NO: 7, 9 or 15. The number of IFN- ⁇ producing cells).
  • FIG. 4 shows the results of an ELISA assay when a sample from a liver cancer patient who received HSP70 dendritic cell therapy (HLA type: 24: 02/26: 01) was stimulated with the peptide of SEQ ID NO: 7, 9 or 15. The number of IFN- ⁇ producing cells).
  • FIG. 4 shows the results of an ELISA assay when a sample from a liver cancer patient who received HSP70 dendritic cell therapy (HLA type: 24: 02/26: 01) was stimulated with the peptide of SEQ ID NO: 7, 9 or 15. The number of IFN- ⁇ producing cells).
  • FIG. 5 shows a case where a sample from a liver cancer patient (HLA type: 24: 02/26: 01) who received HSP70 dendritic cell therapy was stimulated with the peptide of SEQ ID NO: 5, 6, 7, 9, 10 or 15 Results of ELISA assay (number of IFN- ⁇ producing cells) are shown.
  • FIG. 6 shows an ELISA when a sample from a liver cancer patient (HLA type: 24: 02/24: 02) receiving HSP70 dendritic cell therapy was stimulated with the peptide of SEQ ID NO: 5, 6, 7, 9 or 10. The results of the assay (number of IFN- ⁇ producing cells) are shown.
  • the peptide according to the present invention comprises 8 or more consecutive amino acid residues in the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to 15, and a total of 11 or less, preferably 10 or less, more preferably 9 It is a peptide consisting of the following amino acid residues.
  • the peptide of the present invention may consist of the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to 15.
  • the peptide of the present invention is derived from HSP70, which is one of heat shock proteins. Based on the amino acid sequence constituting HSP70, the binding to the HLA molecule predicted by the hypothesis obtained by using the active learning experiment method (Japanese Patent Laid-Open No. 8-151396) is 3 or more in terms of the -logKd value. The amino acid sequence was selected.
  • amino acid sequences constituting the peptides of the present invention and their HLA binding prediction scores are shown in Table 1 below.
  • the peptide of the present invention has an HLA-binding property and is immunogenic (hereinafter sometimes simply referred to as “HLA peptide” or “immunogenic peptide”).
  • immunogenic means that an immune response can be induced, for example, having CTL inducing activity and thus having cytotoxic activity against cancer cells. To do.
  • the peptide of the present invention is a multi-HLA peptide capable of binding to a plurality of allelic forms of HLA-A gene A.
  • the peptide of SEQ ID NO: 7 comprises the product of the HLA-A * 24: 02 gene (HLA-A * 24: 02 molecule), the product of the HLA-A * 0201 gene (HLA-A * 02: 01 molecule) and the HLA -A * 02: 06 gene product (HLA-A * 02: 06 molecule) binds strongly and has high immunogenicity.
  • the HLA subtype to which the peptide of the present invention can bind is not limited to HLA-A * 24: 02, HLA-A * 02: 01, and HLA-A * 02: 06.
  • these HLA subtypes cover about 85% of Orientals including Japanese and about 55% of Westerners, the multi-HLA peptide of the present invention has a wide patient coverage in immunotherapy and the like. It is thought to have.
  • the amino acid residues constituting the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 15 or a part thereof may be modified.
  • the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 15 are intended to be presented on antigen-presenting cells, but when the peptide of the present invention is directly administered into the body, depending on the administration route, the end of the peptide may be present in the digestive tract or the like. May undergo changes such as being digested. Therefore, the peptide of the present invention is used before being incorporated into the antigen-presenting cell so that the amino acid residues represented by SEQ ID NOs: 1 to 15 are retained when binding to a predetermined HLA class I molecule on the antigen-presenting cell. May exist in the form of a precursor having one or more amino acid residues added to the N-terminal and / or C-terminal.
  • amino acid is used in its broadest sense, and includes artificial amino acid variants and derivatives in addition to natural amino acids.
  • amino acids include natural proteinaceous L-amino acids; D-amino acids; chemically modified amino acids such as amino acid variants and derivatives; natural non-protein amino acids such as norleucine, ⁇ -alanine, ornithine; and amino acid characteristics.
  • unnatural amino acids include ⁇ -methyl amino acids (such as ⁇ -methylalanine), D-amino acids, histidine-like amino acids (such as ⁇ -hydroxy-histidine, homohistidine, ⁇ -fluoromethyl-histidine and ⁇ -methyl-histidine) Amino acids having an extra methylene in the side chain (“homo" amino acids) and amino acids in which the carboxylic acid functional amino acids in the side chain are replaced with sulfonic acid groups (such as cysteic acid).
  • ⁇ -methyl amino acids such as ⁇ -methylalanine
  • D-amino acids such as ⁇ -methylalanine
  • histidine-like amino acids such as ⁇ -hydroxy-histidine, homohistidine, ⁇ -fluoromethyl-histidine and ⁇ -methyl-histidine
  • Amino acids having an extra methylene in the side chain (“homo" amino acids)
  • the second amino acid constituting the peptide may be substituted with tyrosine, phenylalanine, methionine, or tryptophan and / or the C-terminus. These amino acids may be substituted with phenylalanine, leucine, isoleucine, tryptophan or methionine.
  • the second amino acid may be substituted with leucine or methionine, and / or the C-terminal amino acid may be substituted with valine or leucine. Good.
  • the amino acid at the second position may be substituted with valine or glutamine, and / or the C-terminal amino acid may be substituted with valine or leucine. Good.
  • any of the peptides of the present invention can be produced using techniques known to those skilled in the art. For example, you may synthesize
  • a desired peptide may be produced by expressing a polynucleotide encoding the peptide of the present invention or a recombinant vector containing the polynucleotide.
  • any of the peptides thus obtained can be identified using techniques known to those skilled in the art. For example, identification can be performed using Edman decomposition or mass spectrometry.
  • compositions for treating or preventing cancer according to the present invention comprises, as an active ingredient, for example, eight or more consecutive amino acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 15 A peptide comprising amino acid residues and a total of 11 or less, preferably 10 or less, more preferably 9 or less amino acid residues is included.
  • the peptide contained in the pharmaceutical composition may consist of the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1-15. The peptide is as defined above.
  • the active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention is not limited to the peptide of the present invention, but can be a component capable of directly or indirectly inducing CTL, for example, a polynucleotide encoding the peptide or a vector containing the same, or the same It may be an antigen-presenting cell that presents a complex of a peptide and an HLA molecule on the surface, an exosome secreted from the antigen-presenting cell, or a combination thereof.
  • antigen-presenting cells to be used examples include macrophages and dendritic cells, but it is preferable to use dendritic cells with high CTL inducing ability.
  • Other ingredients known to be used in cancer treatment such as chemokines, cytokines, tumor necrosis factors, chemotherapeutic agents, etc. may be included in the pharmaceutical composition of the present invention.
  • the dose of peptide may be, for example, about 1-10 mg per day when the patient is an adult. However, since the dose varies depending on the age, weight, administration method, etc. of the patient, it is appropriately determined by those skilled in the art.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is useful for killing cancer cells and the like by the following mechanism of action.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is administered to a specific cancer patient, the peptide in the pharmaceutical composition is presented in the state of being bound to the HLA molecule on the surface of the antigen-presenting cell.
  • CTL recognizes a peptide on such an antigen-presenting cell, it is activated and proliferates to the systemic circulation.
  • a peptide-specific CTL enters cancer tissue, it recognizes the same peptide derived from a specific cancer antigen that is naturally bound to the HLA molecule on the surface of the cancer cell, and kills the cancer cell. This function can contribute to the treatment of cancer.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be used for the prevention of cancer.
  • the pharmaceutical composition of the present invention when the pharmaceutical composition of the present invention is administered to a healthy human body, CTL is induced, and the induced cytotoxic T cells remain in the body. Can be injured. Similarly, recurrence of cancer may be prevented by administering to the human body after cancer treatment.
  • any cancer that expresses HSP70 is assumed.
  • pancreatic cancer, hepatocellular carcinoma, prostate cancer, lung cancer, breast cancer, colon cancer, blood cancer, brain tumor, kidney cancer, skin cancer and the like can be mentioned as subjects.
  • HSP70 derived from the peptide of the present invention is overexpressed in hepatocellular carcinoma, it is considered that the peptide of the present invention is particularly effective for the treatment or prevention of hepatocellular carcinoma.
  • a plurality of types of active ingredients such as immunogenic peptides can be contained in the pharmaceutical composition of the present invention.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be dissolved in a water-soluble solvent, formulated as a pharmaceutically acceptable salt, and administered to a patient.
  • a water-soluble solvent formulated as a pharmaceutically acceptable salt
  • Such pharmaceutically acceptable salt forms include physiologically acceptable water-soluble salts, such as sodium, potassium, magnesium, calcium, and the like, buffered at physiological pH. Can be mentioned.
  • a water-insoluble solvent can also be used. Examples of such a water-insoluble solvent include alcohols such as ethanol and propylene glycol.
  • the preparation containing the pharmaceutical composition of the present embodiment may contain drugs for various purposes.
  • drugs include preservatives and buffering agents.
  • Preservatives include sodium bisulfite, sodium bisulfate, sodium thiosulfate benzalkonium chloride, chlorobutanol, thimerosal, phenylmercuric acetate, phenylmercuric nitrate, methylparaben, polyvinyl alcohol, phenylethyl alcohol, ammonia, dithiothreitol, beta
  • Examples of the buffer include sodium carbonate, sodium borate, sodium phosphate, sodium acetate, sodium bicarbonate and the like. These agents can be present in an amount that can maintain the pH of the system between 2 and 9, preferably between 4 and 8.
  • the dosage form of the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited, but when used as a vaccine form, the dosage form is exemplified by injection (muscular, subcutaneous, intradermal), oral preparation, nasal preparation and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be a mixed cocktail vaccine containing a plurality of types of active ingredients.
  • such a vaccine may contain a plurality of active ingredients in combination with any two or more of the peptides represented by SEQ ID NOs: 1 to 15, or other active ingredients.
  • the vaccine of the present invention is a component other than the pharmaceutical composition, and is an inactive component-containing vaccine that contains a component that is not active in itself and has the effect of further enhancing the effect of the pharmaceutical composition as a vaccine.
  • inactive ingredients include adjuvants and toxoids.
  • adjuvants include, but are not intended to be limited, those of sedimentary type such as aluminum hydroxide, aluminum phosphate, calcium phosphate, and oily types such as Freund's complete adjuvant and Freund's incomplete adjuvant. It is done.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is preferably injected or infused by intradermal, subcutaneous, intravenous, intramuscular administration or the like, or transdermally or inhaled from mucous membranes such as nasal and pharynx, etc.
  • the single dose can be set between an amount that can significantly induce cytotoxic T cells and an amount that does not significantly damage non-cancer cells.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is intended not only for administration to the human body but also for use outside the body. More specifically, the pharmaceutical composition of the present invention may be used to stimulate CTL inducing activity by stimulating antigen-presenting cells in vitro or ex vivo.
  • the pharmaceutical composition of the present invention when used for cancer dendritic cell therapy as an example, is preliminarily contacted with antigen-presenting cells such as dendritic cells derived from patients in need of cancer treatment or prevention. Then, the antigen-presenting cells can be administered to the patient by returning them to the patient.
  • the peptide contained in the pharmaceutical composition can be introduced into the antigen-presenting cell by, for example, the lipofection method or the injection method.
  • the polynucleotide can be introduced into an antigen-presenting cell by a technique known in the art.
  • a patient-derived antigen-presenting cell is transformed in vitro with a target polynucleotide or a vector encoding the polynucleotide by lipofection, electroporation, microinjection, cell fusion, DEAE dextran, calcium phosphate, etc. It may be converted.
  • the immune inducer according to the present invention contains, as an active ingredient, for example, eight or more consecutive amino acid residues in one or more amino acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 15, and A peptide comprising a total of 11 or less, preferably 10 or less, more preferably 9 or less amino acid residues is included.
  • the peptide contained in the immunity-inducing agent may consist of the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1-15. The peptide is as defined above.
  • the active ingredient of the immunity-inducing agent of the present invention is not limited to the peptide of the present invention, but a component capable of directly or indirectly inducing immunity, for example, a polynucleotide encoding the peptide of the present invention or an expression vector comprising the same Alternatively, it may be an antigen-presenting cell that presents a complex of the peptide and HLA molecule on the surface, an exosome secreted from the antigen-presenting cell, or a combination thereof.
  • antigen-presenting cells to be used include macrophages and dendritic cells, but it is preferable to use dendritic cells with high CTL inducing ability.
  • the immunity-inducing agent of the present invention is intended not only for administration to the human body but also for use outside the body. More specifically, the immunity-inducing agent of the present invention may be used for stimulating antigen-presenting cells in vitro or ex vivo to increase CTL-inducing activity.
  • the immunity-inducing agent of the present invention is pre-contacted with antigen-presenting cells such as dendritic cells derived from a patient in need of immunity induction, This antigen-presenting cell can be administered to the patient by returning it to the patient.
  • the peptide contained in the immunity-inducing agent can be introduced into antigen-presenting cells by, for example, transfection via a liposome (lipofection method), injection method or the like.
  • a polynucleotide encoding the peptide of the present invention is used in such an application, the polynucleotide can be introduced into an antigen-presenting cell by a technique known in the art.
  • a patient-derived antigen-presenting cell can be transformed in vitro with a target polynucleotide or a vector expressing the polynucleotide by lipofection, electroporation, microinjection, cell fusion, DEAE dextran, calcium phosphate, etc. It may be converted.
  • immune induction means to induce an immune response, for example, to increase the CTL-inducing activity of antigen-presenting cells and further to increase the cytotoxic activity of CTLs against cancer cells.
  • CTL induction refers to CTL that specifically recognizes an antigen in vitro or in vivo when the peptide of the present invention is presented on the surface of an antigen-presenting cell. Means to induce or proliferate, to differentiate naive T cells into effector cells with the ability to kill target cells such as cancer cells (cytotoxic activity) and / or to increase the cytotoxic activity of CTLs .
  • the CTL inducing activity can be measured by evaluating the production of cytokine (eg, interferon (IFN) - ⁇ ) by CTL.
  • cytokine eg, interferon (IFN) - ⁇
  • the increase of cytokine-producing cells induced from progenitor cells by antigen-presenting cells such as peripheral blood mononuclear cells stimulated with the peptide of the present invention is measured using a known highly sensitive immunoassay such as ELISPOT (Enzyme-Linked ImmunoSpot).
  • CTL-inducing activity may be measured by evaluation.
  • the cytotoxic activity can also be measured by a known method such as a 51 Cr release method. When the activity is significantly increased as compared with the control, for example, when it is increased by 5% or more, 10% or more, 20% or more, preferably 50% or more, it is evaluated that immunity or CTL is induced. can do.
  • Method for producing antigen-presenting cell comprises, for example, 8 or more consecutive amino acid residues in one or more amino acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 15,
  • the method includes a step of contacting a peptide consisting of amino acid residues of 11 or less in total, preferably 10 or less, more preferably 9 or less and an antigen-presenting cell in vitro.
  • the peptide used in the production method of the present invention may be composed of the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to 15. The peptide is as defined above.
  • the peptide used in the production method of the present invention is considered to bind to an HLA class I molecule on the surface of an antigen-presenting cell and is presented to the CTL as an antigen peptide, thereby inducing CTL activity of the antigen-presenting cell. Therefore, the contact with the antigen-presenting cell is not limited to the peptide of the present invention, and a component capable of directly or indirectly inducing CTL, for example, a polynucleotide encoding the peptide, a vector containing the same, or the peptide It may be an antigen-presenting cell that presents a complex with an HLA molecule on the surface, an exosome secreted from the antigen-presenting cell, or a combination thereof. Examples of antigen-presenting cells to be used include macrophages and dendritic cells, but it is preferable to use dendritic cells with high CTL inducing ability.
  • the antigen-presenting cells produced by the production method of the present invention are intended not only to be used as an active ingredient of the above pharmaceutical composition or immunity-inducing agent, but also to be used for immunotherapy and the like.
  • the antigen-presenting cells to be produced are antigen-presenting cells such as dendritic cells with low CTL-inducing ability derived from patients who require immunity induction. After being previously contacted, the antigen-presenting cells can be administered to the patient by returning them to the patient.
  • the peptide of the present invention can be introduced into antigen-presenting cells by, for example, transfection via a liposome (lipofection method), injection method or the like.
  • the polynucleotide can be introduced into an antigen-presenting cell by a technique known in the art.
  • a patient-derived antigen-presenting cell is transformed in vitro with a target polynucleotide or a vector encoding the polynucleotide by lipofection, electroporation, microinjection, cell fusion, DEAE dextran, calcium phosphate, etc. It may be converted.
  • the prediction / experiment / evaluation procedure in this example was performed based on the active learning experiment plan described in the pamphlet of International Publication No. 2006/004182, and rules were constructed by repeating the following steps as a whole.
  • the peptide at the selected question point is manufactured by the synthesis / purification method described later, and the actual binding ability is measured by an experiment described later and added to the accumulated data.
  • amino acid sequences shown in SEQ ID Nos: 1 to 15 were extracted according to the rules described above.
  • Peptides having the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 15 were manually synthesized using the Mmofield solid phase method using Fmoc amino acids. After deprotection, reverse phase HPLC purification was performed using a C18 column to a purity of 95% or higher. Peptide identification and purity were confirmed by MALDI-TOF mass spectrometry (AB SCIEX MALDI-TOF / TOF5800). The peptide was quantified by Micro BCA assay (Thermo Scientific) using BSA as a standard protein.
  • C1R-A24 cells are exposed to acidic conditions of pH 3.3 for 30 seconds, and are associated with endogenous peptides that are originally bound to HLA-A * 24: 02 molecules and HLA class I molecules in common.
  • the light chain ⁇ 2m was dissociated and removed.
  • purified ⁇ 2m was added to C1R-A24 cells, added to a dilution series of peptides, and incubated on ice for 4 hours. During this period, staining was performed using a fluorescent-labeled monoclonal antibody 17A12 that recognizes a three-membered aggregate (MHC-pep) of HLA-A * 24: 02 molecule, peptide, and ⁇ 2m that reassociates.
  • MHC-pep three-membered aggregate
  • the number of MHC-pep per C1R-A24 cell was quantitatively measured using a fluorescence cell analyzer FACScan (Becton-Dickinson). Based on the average fluorescence intensity per cell, the binding between HLA-A * 24: 02 molecule and peptide was performed by the method of the present inventor published in a paper (Udakaket al., Immunogenetics, 51, 816-828, 2000). The dissociation constant Kd value was calculated.
  • T2 cells and purified ⁇ 2m were added to the serial dilution series of the peptide whose binding ability was to be measured, and then incubated at 37 ° C. for 4 hours.
  • the HLA-A * 02: 01 molecule whose expression level increased depending on the concentration of the peptide was stained with an association-type specific fluorescent labeled monoclonal antibody BB7.2.
  • RA2.6 cells were cultured overnight at 26 ° C., and a dilution series of peptides was added to the place where HLA-A * 02: 06 molecules not bound to the peptide were accumulated on the cell surface, and bound at 26 ° C. for 60 minutes. It was.
  • amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 15 are derived from the full-length sequence of a predetermined genomic protein of HSP70 shown in SEQ ID NO: 16.
  • HSP70-dendritic cells HSP70 mRNA-introduced dendritic cells
  • HSP70 dendritic cell therapy Intradermal administration of HSP70-dendritic cells made in the same manner was repeated every 3 weeks.
  • peripheral blood monocytes obtained by pheresis from a liver cancer patient treated twice or more with HSP70 dendritic cell therapy the cell fraction adhered to the culture flask was cultured in AIM-CM medium (Gibco) for 10 days. And cultured at 37 ° C.
  • GM-CSF granulocyte monocyte colony stimulating factor
  • Dendritic cells derived from monocytes were newly collected in the AIM-CM medium, and the peptide of the present invention (SEQ ID NOs: 5, 6, 7, 9, 10, 15) was added to a concentration of 20 ⁇ g / ml. Thereafter, the medium containing dendritic cells was cultured at 37 ° C. for 2 hours. The following peptides were used as positive and negative controls.
  • HLA-A24 02 (EBV LMP2, 419-427: TYGPVFMCL (SEQ ID NO: 17))
  • Negative control for HLA-A24: 02 (HIV env gp160, 584-592: RYLRDQQLL (SEQ ID NO: 18))
  • Positive control for HLA-A02: 01 Flu A MP, 58-66: GILGFVFTL (SEQ ID NO: 19)
  • Negative control for HLA-A02: 01 01 (HIV gap p17, 77-85: SLYNTVATL (SEQ ID NO: 20)
  • Positive control for HLA-A02: 06 (EBV LMP2 453-461: LTAGFLIFL (SEQ ID NO: 21))
  • Negative control for HLA-A02: 06 (HIV gap p24 341-349: ATLEEMMTA (SEQ ID NO: 22))
  • Dendritic cells were collected, washed 3 times or more with a sufficient amount of AIM-CM medium, and then counted.
  • CD8 T cells were separated from the medium and counted.
  • ELISPOT assay Day 17 The CD8T cells were added to a 96 well plate for ELISPOT (manufactured by Millipore) coated with an anti-IFN- ⁇ monoclonal antibody (manufactured by MABTECH) at 2 ⁇ 10 4 cells / well. Three or more wells were used for each sample. 100 ⁇ l of AIM-V (Gibco) was added to each well. The 96-well plate for ELISPOT was cultured at 37 ° C.
  • FIG. 1 shows a patient with HLA type 02: 01/24: 02
  • FIG. 2 shows a patient with 02: 01/33: 03
  • 02: The one for the 06/24: 02 patient is shown in FIG. In each figure, the average value of assay results of 5 times is displayed.

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Abstract

　本発明は、配列番号１～１５のいずれかで表されるアミノ酸配列における連続した８以上のアミノ酸残基を含み、且つ１１以下のアミノ酸残基から成るペプチド、を提供する。

Description

ＨＳＰ７０由来のペプチド、これを用いた癌の治療又は予防のための医薬組成物、免疫誘導剤、及び抗原提示細胞の製造方法
　本発明は、ＨＳＰ７０由来のペプチド、より具体的には、ヒト白血球抗原との結合を介してＴ細胞に抗原を提示する免疫原性ペプチド、これを用いた癌の治療又は予防のための医薬組成物、免疫誘導剤及び抗原提示細胞の製造方法等に関する。
　生体内では、常時偶発的に癌細胞が発生すると考えられているが、通常は自然免疫による癌細胞由来の特異的な癌抗原の排除反応が起こり、次いで、特異的免疫応答が誘導され、リンパ球等による癌細胞の排除反応が起こると想定されている。
　癌細胞由来の抗原が認識されるためには、細胞表面上に存在するヒト白血球抗原（ＨＬＡ）とリンパ球が複合体を形成する必要がある。主要組織適合性抗原であるＨＬＡ分子は、クラスＩ分子（ＨＬＡ－Ａ型、Ｂ型、Ｃ型）と、クラスＩＩ分子（ＨＬＡ－ＤＰ型、ＤＱ型、ＤＲ型）に大別される。細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）による癌細胞の排除反応は、癌細胞表面のＨＬＡクラスＩ分子に提示された、８～１１のアミノ酸からなる癌抗原（ＣＴＬエピトープ）がＣＴＬ上のＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）により特異的に認識されることで誘導される。
　現在、様々な免疫関連疾患の治療又は予防への応用を期待して免疫原性ペプチドの探索が行われており、例えば、特開平８－１５１３９６号公報には、特定のアミノ酸配列から成るオリゴペプチドがＨＬＡ結合性を有する旨記載されている。
特開平８－１５１３９６号公報
　ＨＬＡ結合性を有するペプチドは多数知られているが、各種の癌の治療又は予防に用いることのできるペプチドがさらに求められている。また、ＨＬＡは多型性に富む遺伝子であるため、複数のＨＬＡ型に対応したマルチタイプの免疫原性ペプチドについての要求もある。
　本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、ＨＬＡクラスＩ分子に結合する免疫原性ペプチド、特に、ＣＴＬを誘導し得るペプチド、これを用いた癌の治療又は予防のための医薬組成物、免疫誘導剤、及び抗原提示細胞の製造方法等を提供することを目的とする。
　即ち、本発明は、以下の発明を包含する。
（１）配列番号１～１５のいずれかで表されるアミノ酸配列における連続した８以上のアミノ酸残基を含み、且つ１１以下のアミノ酸残基から成るペプチド。
（２）前記アミノ酸配列中、1又は数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失又は付加しており、且つ免疫原性を有する、（１）に記載のペプチド。
（３）前記アミノ酸配列中、第２位のアミノ酸がチロシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、バリン、ロイシン又はグルタミンで、そして／あるいはＣ末端のアミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、メチオニン又はバリンで置換されている、（２）に記載のペプチド。
（４）（１）～（３）のいずれかに記載のペプチドを含む、癌の治療又は予防のための医薬組成物。
（５）ワクチンの形態である、（４）に記載の医薬組成物。
（６）前記ペプチドが１又は複数の型のＨＬＡ分子と結合することができる、（４）又は（５）に記載の医薬組成物。
（７）（１）～（３）のいずれかに記載のペプチドを含む免疫誘導剤。
（８）細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するための、（７）に記載の免疫誘導剤。
（９）前記ペプチドが１又は複数の型のＨＬＡ分子と結合することができる、（７）又は（８）に記載の免疫誘導剤。
（１０）（１）～（３）のいずれかに記載のペプチドと抗原提示細胞とをin vitroで接触させる工程を含む、ＣＴＬ誘導活性を有する抗原提示細胞の製造方法。
　近年、癌の治療法として免疫療法が注目されている。本発明のペプチドはＨＬＡ結合性が高く、且つＣＴＬ誘導能も高いため、がんワクチンとしての有用性が強く期待される。また、種々の免疫療法、特に樹状細胞療法への応用も想定される。
　ヒートショックプロテイン（ＨＳＰ）ファミリーは、分子シャペロンとして、蛋白質のフォールディング、輸送、修飾や保護など、多様な細胞機能に関わっている（Zugel U and Kaufmann SH: Role of heat-shock proteins in protection from and pathogenesis of infectious diseases. Clin Microbiol Rev 12: 19-39, 1999.）。ＨＳＰは、その分子サイズの大きさから、ＨＳＰ１１０、ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ６０、ＨＳＰ４０、ＨＳＰ２８、ＨＳＰ２７そしてＨＳＰ２５の８つのファミリーに分類される。さらに、ＨＳＰは細胞死（アポトーシス）に関わることが知られてきたが、アポトーシスを阻害するグループと、アポトーシスを誘導するグループの大きく２つに分類される。
　ＨＳＰ７０はアポトーシスを阻害するヒートショックプロテインであり、ＨＳＰ７０が高発現することにより、例えば細胞のがん化など、様々な状況下で細胞の生存に関与することが明らかとなっている。実際、本発明のペプチドの由来であるＨＳＰ７０タンパク質は種々の癌で発現していることが報告されている。
（例えば、
1. Yoshida et al., Anticancer Res. 2009 Feb;29(2):539-44
2. Ciocca DR, Clark GM, Tandon AK, Fuqua SA, Welch WJ and McGuire WL: Heat-shock protein hsp70 in patients with axillary lymph node-negative breast cancer: prognostic implications. J Natl Cancer Inst 85: 570-574, 1993 
3. Kaur J and Ralhan R: Differential expression of 70-kDa heatshock protein in human oral tumorigenesis. Int J Cancer 63: 774-779, 1995
4. Park CS, Joo IS, Song SY, Kim DS, Bae DS and Lee JH: An immunohistochemical analysis of heat-shock protein 70, p53, and estrogen receptor status in carcinoma of the uterine cervix. Gynecol Oncol 74: 53-60, 1999
5. Cornford PA, Dodson AR, Parsons KF, Desmond AD, Woolfenden A, Fordham M, Neoptolemos JP, Ke Y and Foster C: Heat-shock protein expression independently predicts clinical outcome in prostate cancer. Cancer Res 60: 7099-7105, 2000
6. Malusecka E, Zborek A, Krzyzowska-Gruca S and Krawczyk Z: Expression of heat-shock proteins HSP70 and HSP27 in primary non-small cell lung carcinomas. An immunohistochemical study. Anticancer Res 21: 1015-1021, 2001
7. Chuma M, Sakamoto M, Yamazaki K, Ohta T, Ohki M, Asaka M and Hirohashi S: Expression profiling in multistage hepatocarcinogenesis: identification of HSP70 as a molecular marker of early hepatocellular carcinoma. Hepatology 37: 198-207, 2003
8. Castle PE, Ashfaq R, Ansari F and Muller CY: Immunohistochemical evaluation of heat-shock proteins in normal and preinvasive lesions of the cervix. Cancer Lett 229: 245-252, 2005
9. Kurahashi T, Miyake H, Hara I and Fujisawa M: Expression of major heat-shock proteins in prostate cancer: correlation with clinicopathological outcomes in patients undergoing radical prostatectomy. J Urol 177: 757-761, 2007.）
　また、本発明のペプチドのうち特定のものについては複数のＨＬＡ型に結合することができる。よって、本発明のペプチドによれば、極めて広範な癌患者群をカバーする癌ワクチン、樹状細胞療法の提供等が可能になる。
図１は、ＨＳＰ７０樹状細胞療法を受けた肝臓癌患者（ＨＬＡ型：０２：０１／２４：０２）由来のサンプルを配列番号７、９又は１５のペプチドで刺激した場合のＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果（ＩＦＮ－γ産生細胞数）を示す。 図２は、ＨＳＰ７０樹状細胞療法を受けた肝臓癌患者（ＨＬＡ型：０２：０１／３３：０３）由来のサンプルを配列番号７、９又は１５のペプチドで刺激した場合のＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果（ＩＦＮ－γ産生細胞数）を示す。 図３は、ＨＳＰ７０樹状細胞療法を受けた肝臓癌患者（ＨＬＡ型：０２：０６／２４：０２）由来のサンプルを配列番号７、９又は１５のペプチドで刺激した場合のＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果（ＩＦＮ－γ産生細胞数）を示す。 図４は、ＨＳＰ７０樹状細胞療法を受けた肝臓癌患者（ＨＬＡ型：２４：０２／２６：０１）由来のサンプルを配列番号７、９又は１５のペプチドで刺激した場合のＥＬＩＳＡアッセイの結果（ＩＦＮ－γ産生細胞数）を示す。 図５は、ＨＳＰ７０樹状細胞療法を受けた肝臓癌患者（ＨＬＡ型：２４：０２／２６：０１）由来のサンプルを配列番号５、６、７、９、１０又は１５のペプチドで刺激した場合のＥＬＩＳＡアッセイの結果（ＩＦＮ－γ産生細胞数）を示す。 図６は、ＨＳＰ７０樹状細胞療法を受けた肝臓癌患者（ＨＬＡ型：２４：０２／２４：０２）由来のサンプルを配列番号５、６、７、９又は１０のペプチドで刺激した場合のＥＬＩＳＡアッセイの結果（ＩＦＮ－γ産生細胞数）を示す。
１．免疫原性ペプチド
　本発明に係るペプチドは配列番号１～１５のいずれかで表されるアミノ酸配列における連続した８以上のアミノ酸残基を含み、且つ合計１１以下、好ましくは１０以下、より好ましくは９以下のアミノ酸残基から成るペプチドである。本発明のペプチドは配列番号１～１５のいずれかで表されるアミノ酸配列から成るものであってもよい。本発明のペプチドは熱ショックタンパク質（Ｈｅａｔ　Ｓｈｏｃｋ　Ｐｒｏｔｅｉｎ）の一つであるＨＳＰ７０に由来する。ＨＳＰ７０を構成するアミノ酸配列に基づき、能動学習実験法（特開平８－１５１３９６号）を用いて得られる仮説により予測された、ＨＬＡ分子との結合性が－ｌｏｇＫｄ値に換算して３以上であるアミノ酸配列が選択された。
　本発明のペプチドを構成するアミノ酸配列とそのＨＬＡ結合予測スコアについて以下の表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　本発明のペプチドはＨＬＡ結合性があり、且つ免疫原性を有する（以降、単に「ＨＬＡペプチド」又は「免疫原性ペプチド」と称する場合もある）。本明細書で使用する場合、「免疫原性」とは免疫反応を誘導することができることを意味し、例えば、ＣＴＬ誘導活性を有し、延いては癌細胞に対する細胞傷害活性を有することを意味する。
　好ましい態様において、本発明のペプチドはＨＬＡ－Ａ遺伝子Ａの対立遺伝子型の複数と結合することができるマルチＨＬＡペプチドである。例えば、配列番号７のペプチドは、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２遺伝子の産物（ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２分子）、ＨＬＡ－Ａ＊０２０１遺伝子の産物（ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１分子）及びＨＬＡ－Ａ＊０２：０６遺伝子の産物（ＨＬＡ－Ａ＊０２：０６分子）と強く結合するとともに、高い免疫原性を有するものである。
　本発明のペプチドが結合し得るＨＬＡサブタイプはＨＬＡ－Ａ＊２４：０２、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１及びＨＬＡ－Ａ＊０２：０６に限定されるものではない。しかしながら、これらのＨＬＡサブタイプは日本人を含む東洋人の８５％程度、また西洋人の５５％程度を網羅するものであるため、本発明のマルチＨＬＡペプチドは免疫療法等において広い患者カバー率を有すると考えられる。
　本発明のペプチドは、免疫原性を保持する限り、配列番号１～１５のアミノ酸配列を構成するアミノ酸残基又はその一部が修飾されていてもよい。配列番号１～１５で表されるアミノ酸配列は抗原提示細胞上で提示される状態を意図しているが、本発明のペプチドを直接体内に投与した場合、投与経路によっては消化器官などでその末端が消化されるなどの変化を受けることがある。よって、本発明のペプチドは、抗原提示細胞上で所定のＨＬＡクラスＩ分子と結合する際に配列番号１～１５で示されるアミノ酸残基が保持されているように、抗原提示細胞に取り込まれる前はＮ末端及び／又はＣ末端に１又は複数のアミノ酸残基等が付加された前駆体の状態で存在していてもよい。
　更に、本発明のペプチドは所望の免疫原性を有する限り、本発明のペプチドを構成する１個又は数個のアミノ酸残基が置換、挿入、欠失又は付加されているか、そして／あるいは糖鎖付加、側鎖酸化、及び／又はリン酸化などの修飾がされていてもよい。本明細書において「アミノ酸」は、その最も広い意味で用いられ、天然アミノ酸に加え、人工のアミノ酸変異体、誘導体を含む。本明細書においてアミノ酸は、天然タンパク性L-アミノ酸；D-アミノ酸；アミノ酸変異体及び誘導体などの化学修飾されたアミノ酸；ノルロイシン、β-アラニン、オルニチンなどの天然非タンパク性アミノ酸；及びアミノ酸の特徴である当業界で公知の特性を有する化学的に合成された化合物などが挙げられる。非天然アミノ酸の例として、α－メチルアミノ酸（α－メチルアラニンなど）、D-アミノ酸、ヒスチジン様アミノ酸（β-ヒドロキシ-ヒスチジン、ホモヒスチジン、α-フルオロメチル-ヒスチジン及びα-メチル-ヒスチジンなど)、側鎖に余分のメチレンを有するアミノ酸（「ホモ」アミノ酸）及び側鎖中のカルボン酸官能基アミノ酸がスルホン酸基で置換されるアミノ酸（システイン酸など）が挙げられる。
　アミノ酸残基の置換等に関して、ＨＬＡに結合性を示すペプチド配列の規則性を考慮して(J. Immunol., 152: p3913, 1994; Immunogenetics, 41: p178, 1995; J. Immunol., 155: p4307, 1994)、当業者は適宜本発明のペプチドを構成するアミノ酸残基を置換することができる。
　より具体的には、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２分子に結合するペプチドの場合、ペプチドを構成する第２位のアミノ酸がチロシン、フェニルアラニン、メチオニン又はトリプトファンで置換されてもよく、そして／あるいはＣ末端のアミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン又はメチオニンで置換されていてもよい。また、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１分子に結合するペプチドの場合、第２位のアミノ酸がロイシン又はメチオニンで置換されてもよく、そして／あるいはＣ末端のアミノ酸がバリン又はロイシンで置換されていてもよい。更に、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０６分子に結合するペプチドの場合、第２位のアミノ酸がバリン又はグルタミンに置換されてもよく、そして／あるいはＣ末端のアミノ酸がバリン又はロイシンで置換されていてもよい。
　本発明のペプチドは、いずれも当業者に公知の手法を用いて製造可能である。例えば、Ｆｍｏｃ法やｔＢｏｃ法等の固相法または液相法により人工合成してもよい。また、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチド又は当該ポリヌクレオチドを含む組み換えベクターを発現させることにより所望のペプチドを製造してもよい。また、こうして得られたペプチドは、いずれも当業者に公知の手法を用いて同定可能である。例えば、エドマン分解法や質量分析法などを用いて同定可能である。
２．医薬組成物
　本発明に係る癌の治療又は予防のための医薬組成物は、有効成分として、例えば、配列番号１～１５から成る群から選択される１種以上のアミノ酸配列における連続した８以上のアミノ酸残基を含み、且つ、合計１１以下、好ましくは１０以下、より好ましくは９以下のアミノ酸残基からなるペプチドを含む。医薬組成物に含まれるペプチドは配列番号１～１５のいずれかで表されるアミノ酸配列から成るものであってもよい。当該ペプチドは上文で定義したとおりである。
　本発明のペプチドは抗原提示細胞上で提示されることによりＣＴＬを誘導し、この誘導されたＣＴＬが癌細胞を傷害する。そのため、本発明の医薬組成物の有効成分は本発明のペプチドに限定されず、ＣＴＬを直接的又は間接的に誘導し得る成分、例えば同ペプチドをコードするポリヌクレオチド又はそれを含むベクター、あるいは同ペプチドとＨＬＡ分子との複合体を表面に提示する抗原提示細胞又は抗原提示細胞から分泌されるエキソソーム、あるいはそれらの組み合わせであってもよい。使用する抗原提示細胞としてマクロファージ、樹状細胞等が挙げられるが、ＣＴＬ誘導能が高い樹状細胞を使用することが好ましい。癌治療に使用されることが知られているその他の成分、例えばケモカイン、サイトカイン、腫瘍壊死因子、化学療法剤等を本発明の医薬組成物に含めてもよい。ペプチドの用量は、例えば患者が成人の場合１日当たり約１～１０mgであってもよい。しかしながら、用量は患者の年齢、体重、投与方法等に応じて変動するため、当業者により適宜決定される。
　限定されることを意図するものではないが、本発明の医薬組成物は以下の作用機序により癌細胞の殺傷等に有用であると考えられる。本発明の医薬組成物が特定の癌患者に投与されることにより、医薬組成物中のペプチドは抗原提示細胞表面にＨＬＡ分子と結合した状態で提示される。ＣＴＬはこのような抗原提示細胞上のペプチドを認識すると活性化し、増殖して全身循環に回る。ペプチドに特異的なＣＴＬが癌組織に侵入すると、癌細胞の表面にあるＨＬＡ分子に自然に結合している特異的癌抗原由来の同一ペプチドを認識して、その癌細胞を殺傷する。この働きにより癌の治療に寄与することができる。
　癌の治療のみならず、本発明の医薬組成物は癌の予防に使用することができる。例えば、本発明の医薬組成物を健康な人体に投与することにより、ＣＴＬが誘導され、誘導された細胞傷害性Ｔ細胞が体内で留まるため、特定の癌細胞が発生したときに、この癌細胞を傷害することができる。同様に、癌治療後の人体に投与することにより、癌の再発を予防してもよい。
　治療又は予防される癌としては、ＨＳＰ７０を発現するあらゆる癌が想定される。限定することを意図するものではないが、より具体的には膵臓癌、肝細胞癌、前立腺癌、肺癌、乳癌、大腸癌、血液癌、脳腫瘍、腎臓癌、皮膚癌等が対象として挙げられる。例えば、本発明のペプチドの由来であるＨＳＰ７０は肝細胞癌で過剰発現しているため、本発明のペプチドは特に肝細胞癌の治療又は予防に有効であると考えられる。治療又は予防されるべき癌が複数種類存在している場合、免疫原性ペプチド等の有効成分を複数種類本発明の医薬組成物に含有させることができる。
　本発明の医薬組成物は、水溶性溶剤に溶かして、製薬上許容される塩の形態で製剤にして、患者に投与することができる。このような製薬上許容される塩の形態としては、生理的に受け入れられる水溶性の塩、例えばナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、などの塩の形で生理的なｐＨにて緩衝させた形態が挙げられる。また、水溶性溶剤の他に、非水溶性溶剤を用いることもでき、このような非水溶性溶剤としては、例えば、エタノール、プロピレングリコールなどのアルコールが挙げられる。
　また、本実施形態の医薬組成物を含む製剤には、様々な目的に対する薬剤を含めてもよく、このような薬剤としては、例えば保存剤、緩衝剤などが挙げられる。保存剤としては、ナトリウム重亜硫酸、ナトリウム重硫酸、ナトリウムチオ硫酸塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、チメロサール、酢酸フェニル水銀、硝酸フェニル水銀、メチルパラベン、ポリビニルアルコール、フェニルエチルアルコール、アンモニア、ジチオスレイトール、ベータメルカプトエタノールなどが挙げられる。また、緩衝剤としては、炭酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、重炭酸ナトリウムなどが挙げられる。これら薬剤は、系のｐＨを２～９、好ましくは４～８の間で維持することができる量で存在することができる。
　本発明の医薬組成物の剤型も特に限定されないが、ワクチンの形態として使用される場合、その剤型は注射剤（筋肉、皮下、皮内）、経口製剤、点鼻製剤等が例示される。本発明の医薬組成物がワクチンの形態である場合、複数種類の有効成分を含む混合カクテルワクチンであってもよい。例えば、このようなワクチンは配列番号１～１５で表されるペプチドのうちのいずれか２つ以上、又は他の有効成分との組み合わせで複数種類有効成分を含有し得る。
　また、本発明のワクチンは、医薬組成物以外の成分であり、それ自身には活性がなく、医薬組成物のワクチンとしての効果をより一層高める効果のある成分を含んだ不活性成分含有ワクチンであってもよい。不活性成分としては、アジュバント、トキソイドなどが挙げられる。アジュバントの例としては、限定することを意図するものではないが、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸カルシウム等の沈降性タイプのもの、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント等の油性タイプのものが挙げられる。
　本発明の医薬組成物は、ワクチンの形態で存在する場合、好ましくは皮内、皮下、静脈内、筋肉内投与などによる注射または注入、あるいは経皮、又は鼻、咽頭などの粘膜からの吸入などにより、体内に投与される。その一回投与量は、細胞傷害性Ｔ細胞を有意に誘導できる量から有意な数の非癌細胞が傷害を受けない量の間にて設定することができる。
　本発明の医薬組成物は、人体への投与のみならず、体外での使用も意図される。より具体的には、本発明の医薬組成物は、抗原提示細胞をin vitro又はex vivoで刺激してＣＴＬ誘導活性を増大するために使用されてもよい。例えば、癌樹状細胞療法に使用される場合を例に説明すると、本発明の医薬組成物は、癌の治療又は予防を必要とする患者に由来する樹状細胞等の抗原提示細胞に予め接触された後、この抗原提示細胞を患者の体内に戻すことで患者に投与され得る。医薬組成物に含まれるペプチドは、例えばリポフェクション法、インジェクション法等により抗原提示細胞内に導入することができる。このような用途において本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドが使用される場合、ポリヌクレオチドは当業界で公知の手法により抗原提示細胞に導入され得る。例えば、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、細胞融合法、ＤＥＡＥデキストラン法、リン酸カルシウム法等により、対象のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドをコードするベクターで患者由来の抗原提示細胞をin vitroで形質転換等してもよい。
３．免疫誘導剤
　本発明に係る免疫誘導剤は、有効成分として、例えば、配列番号１～１５から成る群から選択される１種以上のアミノ酸配列における連続した８以上のアミノ酸残基を含み、且つ、合計１１以下、好ましくは１０以下、より好ましくは９以下のアミノ酸残基からなるペプチドを含む。免疫誘導剤に含まれるペプチドは配列番号１～１５のいずれかで表されるアミノ酸配列から成るものであってもよい。当該ペプチドは上文で定義したとおりである。
　本発明のペプチドは抗原提示細胞上で提示されることにより免疫を誘導すると考えられる。そのため、本発明の免疫誘導剤の有効成分は本発明のペプチドに限定されず、免疫を直接的又は間接的に誘導し得る成分、例えば本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチド又はそれを含む発現ベクター、あるいは同ペプチドとＨＬＡ分子との複合体を表面に提示する抗原提示細胞又は抗原提示細胞から分泌されるエキソソーム、あるいはこれらの組み合わせであってもよい。使用する抗原提示細胞としてマクロファージ、樹状細胞等が挙げられるが、ＣＴＬ誘導能が高い樹状細胞を使用することが好ましい。
　本発明の免疫誘導剤は、人体への投与のみならず、体外での使用も意図される。より具体的には、本発明の免疫誘導剤は、抗原提示細胞をin vitro又はex vivoで刺激してＣＴＬ誘導活性を増大するために使用されてもよい。例えば、樹状細胞療法に使用される場合を例に説明すると、本発明の免疫誘導剤は、免疫誘導を必要とする患者に由来する樹状細胞等の抗原提示細胞に予め接触された後、この抗原提示細胞を患者の体内に戻すことで患者に投与され得る。免疫誘導剤に含まれるペプチドは、例えば、リポソームを介したトランスフェクション（リポフェクション法）、インジェクション法等により抗原提示細胞内に導入することができる。このような用途において本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドが使用される場合、ポリヌクレオチドは当業界で公知の手法により抗原提示細胞に導入され得る。例えば、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、細胞融合法、ＤＥＡＥデキストラン法、リン酸カルシウム法等により、対象のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドを発現するベクターで患者由来の抗原提示細胞をin vitroで形質転換等してもよい。
　本明細書で使用する場合、「免疫誘導」とは免疫反応を誘導し、例えば、抗原提示細胞のＣＴＬ誘導活性を増大させ、更にはＣＴＬの癌細胞に対する細胞傷害活性を増大させることを意味する。また、本明細書で使用する場合、「ＣＴＬ誘導」とは、in vitro又はin vivoにおいて、本発明のペプチドが抗原提示細胞表面上に提示されることによりある抗原を特異的に認識するＣＴＬを誘導又は増殖するか、ナイーブＴ細胞を、癌細胞等の標的細胞を殺傷する能力（細胞傷害活性）を持つエフェクター細胞へ分化させるか、そして／あるいはＣＴＬの細胞傷害活性を増大させることを意味する。ＣＴＬ誘導活性は、ＣＴＬによるサイトカイン（例えばインターフェロン（ＩＦＮ）－γ）産生を評価することで測定することができる。例えば、本発明のペプチドで刺激された末梢血単核細胞等の抗原提示細胞により前駆細胞から誘導されたサイトカイン産生細胞の増大を、ＥＬＩＳＰＯＴ（Enzyme-Linked ImmunoSpot）等の公知の高感度イムノアッセイを用いて評価することによりＣＴＬ誘導活性を測定してもよい。細胞傷害活性も51Ｃｒ遊離法等の公知の手法により測定できる。上記活性がコントロールと比較して有意に増大している場合、例えば５％以上、１０％以上、２０％以上、好ましくは５０％以上増大している場合、免疫又はＣＴＬが誘導されていると評価することができる。
４．抗原提示細胞の製造方法
　本発明に係る抗原提示細胞の製造方法は、例えば、配列番号１～１５から成る群から選択される１種以上のアミノ酸配列における連続した８以上のアミノ酸残基を含み、且つ、合計１１以下、好ましくは１０以下、より好ましくは９以下のアミノ酸残基からなるペプチドと抗原提示細胞とをin vitroで接触させる工程を含む。本発明の製造方法で使用されるペプチドは配列番号１～１５のいずれかで表されるアミノ酸配列から成るものであってもよい。当該ペプチドは上文で定義したとおりである。
　本発明の製造方法で使用されるペプチドは、抗原提示細胞表面のＨＬＡクラスＩ分子に結合し、抗原ペプチドとしてＣＴＬに提示され、それにより抗原提示細胞のＣＴＬ活性を誘導すると考えられる。そのため、抗原提示細胞と接触させるのは本発明のペプチドに限定されず、ＣＴＬを直接的又は間接的に誘導し得る成分、例えば同ペプチドをコードするポリヌクレオチド又はそれを含むベクター、あるいは同ペプチドとＨＬＡ分子との複合体を表面に提示する抗原提示細胞又は抗原提示細胞から分泌されるエキソソーム、あるいはそれらの組み合わせであってもよい。使用する抗原提示細胞としてマクロファージ、樹状細胞等が挙げられるが、ＣＴＬ誘導能が高い樹状細胞を使用することが好ましい。
　本発明の製造方法で製造される抗原提示細胞は、上記医薬組成物又は免疫誘導剤の有効成分として使用されるだけではなく、免疫療法等のために使用されることが意図される。例えば、癌樹状細胞療法に使用される場合を例に説明すると、製造される抗原提示細胞は、免疫誘導を必要とする患者に由来する、ＣＴＬ誘導能の低い樹状細胞等の抗原提示細胞に予め接触させた後、この抗原提示細胞を患者の体内に戻すことで患者に投与され得る。本発明のペプチドは、例えば、リポソームを介したトランスフェクション（リポフェクション法）、インジェクション法等により抗原提示細胞内に導入することができる。このような用途において本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドが使用される場合、ポリヌクレオチドは当業界で公知の手法により抗原提示細胞に導入され得る。例えば、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、細胞融合法、ＤＥＡＥデキストラン法、リン酸カルシウム法等により、対象のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドをコードするベクターで患者由来の抗原提示細胞をin vitroで形質転換等してもよい。
　以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
　具体的に、本実施例における予測・実験・評価の手順は、国際公開２００６／００４１８２号パンフレットに記載された能動学習実験計画に基づいて行い、全体として次のステップを繰り返してルールを構築した。
　（１）後述する下位学習アルゴリズムの試行１回分を行う。すなわち、蓄積データのランダムリサンプリングから複数の仮説を発現し、ランダムに発現された質問候補点（ペプチド）に対する予測値の分散が最も大きい点を、実験すべき質問点として選ぶ。
　（２）選ばれた質問点のペプチドを、後述する合成・精製法により製造し、実際の結合能を後述する実験により測定して蓄積データに加える。
　このような能動学習法を行うことにより、本来ならば、９アミノ酸残基からなるペプチドについて、ＨＬＡ結合性ペプチドの全候補物質５０００億（＝２０9）通り以上について行う必要のある結合実験の数を削減できた。
　以上説明したようなルールにより、配列番号１～１５に示したアミノ酸配列を抽出した。
<ペプチド合成と精製>
　配列番号１～１５のアミノ酸配列を有するペプチドは、Ｆｍｏｃアミノ酸を用い、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄの固相法にて、マニュアル合成をした。脱保護の後、Ｃ１８カラムを用いて逆相ＨＰＬＣ精製をし、９５％以上の純度にした。ペプチドの同定と純度の確認は、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析にて行った（ＡＢ　ＳＣＩＥＸ　ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＴＯＦ５８００）。ペプチドの定量は、ＢＳＡを標準蛋白質としてＭｉｃｒｏ ＢＣＡアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｆｔｉｆｉｃ社）にて行った。
<ペプチドのＨＬＡ－Ａ＊２４：０２分子への結合実験>
　ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２遺伝子の産物であるＨＬＡ－Ａ＊２４：０２分子へのペプチドの結合能の測定は、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２分子を発現するＣ１Ｒ－Ａ２４細胞（熊本大学、滝口雅文教授作成のものを、許可を得て愛媛大学、安川正貴助教授から供与いただいた。）を用いて行った。
　まず、Ｃ１Ｒ－Ａ２４細胞をｐＨ３．３の酸性条件に３０秒曝し、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２分子に元来結合している内因性ペプチドと、ＨＬＡクラスＩ分子に共通して会合している軽鎖β２ｍを解離、除去した。中和後、Ｃ１Ｒ－Ａ２４細胞に精製β２ｍを添加し、ペプチドの希釈列に加えて、氷上４時間インキュベートした。この間に再会合したＨＬＡ－Ａ＊２４：０２分子、ペプチド、β２ｍの３者の会合体（ＭＨＣ－ｐｅｐ）を認識する蛍光標識モノクローナル抗体１７Ａ１２を用いて染色した。
　その後、個々のＣ１Ｒ－Ａ２４細胞当たりのＭＨＣ－ｐｅｐ数（上記蛍光抗体の蛍光強度に比例する）を、蛍光細胞解析装置ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ－Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を用いて定量測定した。１細胞当たりの平均蛍光強度から、本発明者が論文（Ｕｄａｋａ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ， ５１， ８１６－８２８， ２０００）に発表した方法にて、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２分子とペプチド間の結合解離定数Ｋｄ値を算出した。
<ペプチドのＨＬＡ－Ａ＊０２：０１分子への結合実験>
　ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１遺伝子の産物であるＨＬＡ－Ａ＊０２：０１分子へのペプチドの結合能の測定は、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１分子を発現する細胞株Ｔ２（ＡＴＣＣより購入）を用いて行った。
　結合能を測定したいペプチドの段階希釈列にＴ２細胞と精製β２ｍを加えたのち、３７℃で４時間インキュベートした。この時点までにペプチドの濃度依存性に発現量が増加したＨＬＡ－Ａ＊０２：０１分子を、会合型特異的な蛍光標識モノクローナル抗体ＢＢ７．２を用いて染色した。
　その後、１細胞あたりの蛍光量をフローサイトメーターにて測定し、本発明者が論文 （Ｕｄａｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ， ５１， ８１６－８２８， ２０００）に発表した方法にて、解離定数Ｋｄ値を算出した。
<ペプチドのＨＬＡ－Ａ＊０２：０６分子への結合実験>
　ＨＬＡ－Ａ＊０２：０６遺伝子の産物であるＨＬＡ－Ａ＊０２：０６分子へのペプチドの結合能の測定は、マウスのＴＡＰ（ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）欠損細胞株であるＲＭＡＳに、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０６遺伝子のｃＤＮＡを導入したＲＡ２．６細胞（高知大学にて新たに作成した細胞株）を用いて行った。
　まずＲＡ２．６細胞を２６℃で一晩培養し、細胞表面にペプチドを結合していないＨＬＡ－Ａ＊０２：０６分子が蓄積したところへペプチドの希釈列を加え、２６℃で６０分結合させた。
　その後３５℃で４時間培養することにより、ペプチドを結合していない空のＨＬＡ－Ａ＊０２：０６分子が変性し、立体構造が失われる。そこへ、ペプチド結合型ＨＬＡ－Ａ＊０２：０６分子を特異的に認識する蛍光標識モノクローナル抗体ＢＢ７．２を加え、氷上で２０分インキュベートし、細胞を染色した。
　その後、１細胞あたりの蛍光量をフローサイトメーターにて測定し、本発明者が論文（Ｕｄａｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ， ５１， ８１６－８２８， ２０００）に発表した方法にて、解離定数Ｋｄ値を算出した。
<結合実験の評価結果>
　その結果、以下の表に示すような各ＨＬＡ分子に対する本発明のペプチドの結合実験データが得られた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　尚、配列番号１～１５のアミノ酸配列は、配列番号１６に示すＨＳＰ７０の所定のゲノムタンパク質の全長配列に由来する。
＜ペプチド免疫誘導試験＞
（１）ペプチド刺激樹状細胞の調製
　・Ｄａｙ０～９（樹状細胞の誘導）
　Leukapheresis法に従い肝細胞癌患者から採取した末梢血より単核球を分離した。分離した単球を８００Ｕ／ｍｌのＧＭ－ＣＳＦ及び５００Ｕ／ｍｌのＩＬ－４添加下で６日間培養した。培養液に更に３００Ｕ／ｍｌのＴＮＦ－αを添加して４日間培養し、成熟樹状細胞を誘導した。その後、エレクトロポレーション法にてＨＳＰ７０　ｍＲＮＡを導入し、ＨＳＰ７０由来の抗原ペプチドを提示した樹状細胞を作製した。
　１×１０７個または２×１０７個または３×１０７個のＨＳＰ７０　ｍＲＮＡを導入した樹状細胞（ＨＳＰ７０－樹状細胞）を上記肝細胞癌患者の大腿部へ皮内注射で投与した（ＨＳＰ７０樹状細胞療法）。同じ方法で作製したＨＳＰ７０－樹状細胞の皮内投与を３週間ごとに繰り返した。ＨＳＰ７０樹状細胞療法で２回以上治療された肝臓癌患者からフェレーシスにより得られた末梢血単球のうち、培養フラスコに接着した細胞画分をＡＩＭ－ＣＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社製）中で１０日間、３７℃で培養した。培養期間中、培地に対し０日目及び３日目にＩＬ－４を１５μｌ、顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）を３０μｌそれぞれ添加し、５日目にＩＬ－４を１５μｌ、ＧＭ－ＣＳＦを３０μｌ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）-αを７５μｌ添加した。
　・Ｄａｙ１０（ペプチド刺激及び樹状細胞の回収）
　単球から誘導した樹状細胞を新たにＡＩＭ－ＣＭ培地中に回収し、本発明のペプチド（配列番号５、６、７、９、１０、１５）が２０μｇ／ｍｌとなるよう添加した。その後、樹状細胞を含む培地を２時間３７℃で培養した。ポジティブコントロール及びネガティブコントロールとして以下のペプチドを使用した。
ＨＬＡ－Ａ２４：０２用ポジティブコントロール（EBV LMP2, 419-427:TYGPVFMCL（配列番号１７））
ＨＬＡ－Ａ２４：０２用ネガティブコントロール（HIV env gp160, 584-592:RYLRDQQLL（配列番号１８））
ＨＬＡ－Ａ０２：０１用ポジティブコントロール（Flu A MP, 58-66:GILGFVFTL（配列番号１９））
ＨＬＡ－Ａ０２：０１用ネガティブコントロール（HIV gap p17, 77-85:SLYNTVATL（配列番号２０））
ＨＬＡ－Ａ０２：０６用ポジティブコントロール（EBV LMP2 453-461:LTAGFLIFL（配列番号２１））
ＨＬＡ－Ａ０２：０６用ネガティブコントロール（HIV gap p24 341-349:ATLEEMMTA（配列番号２２））
　樹状細胞を回収し十分な量のＡＩＭ－ＣＭ培地で３回以上洗浄した後セルカウントした。
（２）ＣＤ８Ｔ細胞の調製
・Ｄａｙ０～９
　ＨＳＰ７０樹状細胞療法で２回以上治療された後の上記肝臓癌患者からフェレーシスにより得られた末梢血単球のうち、培養フラスコに接着しない浮遊細胞画分（リンパ球を含む）をＡＩＭ－ＣＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社製）中で１０日間、３７℃で培養した。培養期間中、培地に対し４日目及び６日目にそれぞれＩＬ－２を４０μｌ添加した。
・Ｄａｙ１０
　ＣＤ８ネガティブセレクションキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社製）を用いて培地からＣＤ８Ｔ細胞を分離しセルカウントした。
（３）共培養
　上記（１）及び（２）で得られた樹状細胞とＣＤ８Ｔ細胞を以下の条件にてＡＩＭ培地中で３７℃で共培養した。
　　　・ＣＤ８Ｔ細胞：5×105cells/well
　　　・樹状細胞 ：2×105cells/well
・Ｄａｙ１２又は１３
　上記培地にＩＬ－２　２０Ｕ／ｍｌ を含んだＡＩＭ－ＣＭ培地０．４ｍｌ／ｗｅｌｌを添加した。
（４）ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
・Ｄａｙ１７
　抗ＩＦＮ-γモノクローナル抗体（ＭＡＢＴＥＣＨ社製）をコートしたＥＬＩＳＰＯＴ用９６穴プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に、上記ＣＤ８Ｔ細胞を１穴あたり2×104cells/wellになるように加えた。各サンプルにつき、３ウェル以上使用した。各ウェルにはＡＩＭ－Ｖ(Ｇｉｂｃｏ社製)を１００μｌ添加した。ＥＬＩＳＰＯＴ用９６穴プレートを３７℃で培養した。
・Ｄａｙ１８
　抗ＩＦＮ-γ抗体を各ウェルに加え、さらにＨＲＰ酵素標識した２次抗体を反応させて、呈色反応により、ＩＦＮ-γ産生細胞の数を測定した。代表的なＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果として、ＨＬＡ型が０２：０１／２４：０２の患者についてのものを図１に、０２：０１／３３：０３の患者についてのものを図２に、また、０２：０６／２４：０２の患者についてのものを図３に示す。各図において、5回ずつのアッセイ結果の平均値を表示する。
（５）ＥＬＩＳＡアッセイ
・Ｄａｙ１７
　Ｔ細胞と上記ペプチドでパルスした樹状細胞の共培養７日目の培養上清を、ｘ1, ｘ5, ｘ25, ｘ125の４段階に希釈し、Human IFN-γ ELISA MAX Deluxe Set (BioLegend社製)を用いて、測定限度内に収まる希釈段階を同定した。その後、同定した希釈段階にて、各サンプルにつき3回ずつ測定を行った。代表的なＥＬＩＳＡアッセイの結果として、ＨＬＡ型が２４：０２／２６：０１の患者についてのものを図４及び図５に、２４：０２／２４：０２の患者についてのものを順に図６に示す。
　以上、本発明を実施例に基づいて説明した。この実施例はあくまで例示であり、種々の変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。

Claims (10)

  1. 　配列番号１～１５のいずれかで表されるアミノ酸配列における連続した８以上のアミノ酸残基を含み、且つ１１以下のアミノ酸残基から成るペプチド。
  2. 　前記アミノ酸配列中、１又は数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失又は付加しており、且つ免疫原性を有する、請求項１に記載のペプチド。
  3. 　前記アミノ酸配列中、第２位のアミノ酸がチロシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、バリン、ロイシン又はグルタミンで、そして／あるいはＣ末端のアミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、メチオニン又はバリンで置換されている、請求項２に記載のペプチド。
  4. 　請求項１～３のいずれか１項に記載のペプチドを含む、癌の治療又は予防のための医薬組成物。
  5. 　ワクチンの形態である、請求項４に記載の医薬組成物。
  6. 　前記ペプチドが１又は複数の型のＨＬＡ分子と結合することができる、請求項４又は５に記載の医薬組成物。
  7. 　請求項１～３のいずれか１項に記載のペプチドを含む免疫誘導剤。
  8. 　細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するための、請求項７に記載の免疫誘導剤。
  9. 　前記ペプチドが１又は複数の型のＨＬＡ分子と結合することができる、請求項７又は８に記載の免疫誘導剤。
  10. 　請求項１～３のいずれか１項に記載のペプチドと抗原提示細胞とをin vitroで接触させる工程を含む、ＣＴＬ誘導活性を有する抗原提示細胞の製造方法。
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