WO2016052118A1 - 分析装置及び分析方法 - Google Patents

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pulse
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detection signal
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雅之 小野
柳生　慎悟
糸長　誠
祐一 長谷川
辻田　公二
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株式会社Ｊｖｃケンウッド
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
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    • G01N21/47—Scattering, i.e. diffuse reflection
    • G01N2021/4704—Angular selective
    • G01N2021/4709—Backscatter

Definitions

  • the present disclosure relates to an analysis apparatus and an analysis method for analyzing biological materials such as antibodies and antigens.
  • An immunoassay is known in which a specific antigen or antibody associated with a disease is detected as a biomarker to quantitatively analyze the effect of disease discovery or treatment.
  • An ELISA method Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay
  • an enzyme reaction and the like is one of immunoassays, and is widely used because of merit such as cost.
  • the total time of pretreatment, antigen-antibody reaction, B / F (bond / free) separation, enzyme reaction and the like is about several hours to one day, and requires a long time.
  • the antibody fixed on the optical disk is bound to the antigen in the sample, the antigen and the particle having the antibody are bound, and the particles captured on the optical disk are scanned in a short time by scanning with an optical head.
  • a technique for counting has been proposed (Patent Document 1). Further, a technique has been proposed in which a biological sample or particles are attached to the surface on which the tracking structure of an optical disk is formed, and a change in signal is detected by an optical pickup (Patent Document 2).
  • an antigen-antibody reaction is performed on the surface of the substrate of the optical disc, so noise is generated due to the reaction.
  • residues and residues in the steps of immobilization of antibodies on the surface of the substrate, blocking treatment with a solution such as skim milk or bovine serum albumin, and an assay performed using a buffer solution containing salt are not removed after washing. It becomes a noise component by remaining.
  • the noise level due to residues and residues is one digit or more larger than the noise level due to minute scratches on the surface of the substrate, which is a major factor that degrades the biomarker detection accuracy.
  • Embodiments are intended to provide an analysis apparatus and an analysis method that suppress the influence of noise components and improve the detection accuracy of a detection target using fine particles.
  • the optical scanning unit that optically scans the substrate on which the detection target combined with the fine particles is fixed on the surface and acquires the detection signal from the substrate
  • the optical scanning unit A pulse waveform analysis unit that analyzes the acquired pulse waveform of the detection signal, and the pulse waveform analysis unit includes: an amplitude determination unit that determines whether a peak value of the pulse waveform is within a predetermined range; And an pulse width determination unit that determines whether or not the pulse width of the pulse waveform is within a predetermined range.
  • the analysis apparatus and the analysis method of the embodiment it is possible to suppress the influence of noise components and improve the detection accuracy of the detection target by the fine particles.
  • FIG. 1 is a block diagram illustrating an analyzer according to an embodiment.
  • FIG. 2 is a schematic diagram for explaining an example of a method for detecting and detecting an antigen as a biomarker sandwiched between a bead and a substrate by an antigen-antibody reaction.
  • FIG. 3 is an example of pulse waveform data of the detection signal.
  • FIG. 4 is a flowchart illustrating the analysis method according to the embodiment.
  • FIG. 5 is a schematic diagram showing the relationship between the pulse waveform and each parameter.
  • FIG. 6 is a pulse waveform diagram for explaining a method of setting each reference value.
  • FIG. 7 is a pulse waveform diagram for explaining a reference value setting method.
  • FIG. 8 is a correlation diagram showing the relationship between the bead count number and the biomarker amount.
  • the analysis apparatus 1 includes a substrate 2, a drive unit 3 including a motor that rotates the substrate 2, an optical scanning unit 4 that optically scans the surface of the substrate 2, a drive unit 3, And a control unit 5 that controls the optical scanning unit 4 and analyzes a pulse waveform of a detection signal detected by the optical scanning unit 4.
  • the control unit 5 can be configured by a microprocessor or a microcomputer.
  • the substrate 2 has a disk shape having the same dimensions as an optical disk such as a compact disk (CD), DVD, or Blu-ray disk (BD).
  • the substrate 2 is made of, for example, a resin material having hydrophobicity such as polycarbonate resin or cycloolefin polymer generally used for optical disks.
  • the substrate 2 has a track structure that can be scanned by the optical scanning unit 4 on the surface.
  • the track structure is composed of grooves, lands, pits, etc., and is formed in a spiral shape from the inner peripheral side to the outer peripheral side. If necessary, the surface of the substrate 2 may be subjected to surface treatment with a thin film formation or a silane coupling agent.
  • an antibody 11 that specifically binds to an antigen 12 that is a biological material to be detected is fixed on the surface of the substrate 2.
  • the antigen 12 specifically binds to the antibody 15 immobilized on the surface of the beads 16 that are fine particles and the antibody 11 of the substrate 2.
  • the antigen 12 sandwiched between the beads 16 and the substrate 2 is labeled on the substrate 2.
  • Antigen 12 is used as a biomarker that serves as an indicator of disease or the like by specifically binding to antibody 11 and antibody 15.
  • the antibody 11 is immobilized on the surface of the substrate 2 in advance.
  • the antibody 11 is bound to the surface of the substrate 2 by a hydrophobic bond or a covalent bond.
  • the antibody 11 may be fixed to the surface of the substrate 2 through a substance having a strong binding force such as avidin.
  • the sample solution 13 containing the antigen 12 is dropped on the surface of the substrate 2.
  • the antigen 12 moves through the sample solution 13 by Brownian motion, contacts the antibody 11, and specifically binds to the antibody 11 by an antigen-antibody reaction.
  • the sample liquid 13 dropped onto the substrate 2 is washed with pure water or the like, so that the sample liquid 13 containing the surplus antigen 12 that does not bind to the antibody 11 is removed from the substrate 2. Removed.
  • a buffer solution 14 including beads 16 is dropped on the surface of the substrate 2.
  • the buffer solution 14 may be dropped on the substrate 2 with the sample solution 13 remaining.
  • the antigen 12 as a biomarker specifically binds to the antibody 15 of the bead 16 by the antigen-antibody reaction, and specifically binds to the antibody 11 of the substrate 2, whereby the sandwich capture is performed between the bead 16 and the substrate 2. Labeled on the substrate 2.
  • the beads 16 are formed in a substantially spherical shape by a synthetic resin such as polystyrene containing a magnetic material such as ferrite.
  • the diameter of the beads 16 is about several tens of nm to 200 nm.
  • the beads 16 can be quickly collected on the surface of the substrate 2 by placing a magnet on the opposite side of the substrate 2 when the buffer solution 14 is dropped. Thereby, the reaction between the beads 16 and the antigen 12 is promoted. Further, by simultaneously loading the antigen 12 and the beads 16, the time required for labeling the antigen 12 fixed on the substrate 2 can be shortened to about several minutes.
  • the antibody 11 and the antibody 15 may be any specific biological substance that specifically binds to the antigen 12, and a combination in which each binds to another site can also be selected.
  • the target of detection is a membrane vesicle such as an exosome in which a plurality of types of antigens 12 are expressed on the surface
  • a living body having two types of antigens 12 is obtained by using different types of antibodies 11 and 15.
  • the sample can be analyzed.
  • exosomes and the like are different from normal antigens, and a plurality of antigens that are the same kind of proteins exist on the surface. Therefore, the antibodies 11 and 15 may be of the same type.
  • the buffer solution 14 containing excess beads 16 that do not bind to the antigen 12 is removed by washing the buffer solution 14 dropped onto the substrate 2 with pure water or the like. .
  • the substrate 2 is optically scanned by the optical scanning unit 4 and the beads 16 are detected, whereby the antigen 12 (biomarker) labeled on the beads 16 can be analyzed. it can. For example, the amount (concentration) of the biomarker can be quantified.
  • the optical scanning unit 4 includes a laser oscillator 21, a collimator lens 22, a beam splitter 23, an actuator 24, an objective lens 25, a condenser lens 26, and a light detection unit 27. .
  • the optical scanning unit 4 is an optical pickup that optically scans the substrate 2.
  • the laser oscillator 21 emits laser light toward the collimator lens 22 under the control of the control unit 5.
  • the laser oscillator 21 is, for example, a semiconductor laser oscillator that emits a laser beam having a wavelength of 405 nm, which is the same as the BD reproduction wavelength, and an output of about 1 mW.
  • the collimator lens 22 collimates the laser light emitted from the laser oscillator 21.
  • the beam splitter 23 reflects the laser beam collimated by the collimator lens 22 toward the objective lens 25.
  • the objective lens 25 focuses the laser light that has passed through the beam splitter 23 on the surface of the substrate 2 on which the antibody 11 is fixed, and forms an image of the spot S by driving the actuator 24 according to the control of the control unit 5. .
  • the objective lens 25 has a numerical aperture of 0.85, for example.
  • the condensed laser light is reflected by the substrate 2 and enters the beam splitter 23.
  • the laser light incident on the beam splitter 23 passes through the beam splitter 23 and enters the light detection unit 27 via the condenser lens 26.
  • the condensing lens 26 condenses the laser light reflected on the substrate 2 on the light detection unit 27.
  • the light detection unit 27 includes, for example, a photodiode, and outputs a detection signal corresponding to the amount of laser light reflected on the substrate 2 to the control unit 5.
  • the control unit 5 analyzes the pulse waveform of the detection signal output from the drive system control unit 28 that controls the drive unit 3, the optical system control unit 29 that controls the laser oscillator 21 and the actuator 24, and the light detection unit 27, respectively. And a pulse waveform analysis unit 30 for performing the above operation.
  • the driving unit 3 rotates the substrate 2 by a constant linear velocity (CLV) system under the control of the driving system control unit 28.
  • CLV constant linear velocity
  • the actuator 24 moves the optical scanning unit 4 in the radial direction of the substrate 2 so as to scan the surface of the rotating substrate 2 in a spiral shape under the control of the optical system control unit 29.
  • the optical system control unit 29 detects errors such as a focus error (FE) and a tracking error (TE) from the detection signal output from the light detection unit 27.
  • the optical system control unit 29 controls the actuator 24 and the like so as to appropriately scan the surface of the substrate 2 according to the detected error.
  • the pulse waveform analysis unit 30 includes a pulse detection unit 31, an amplitude determination unit 32, and a pulse width determination unit 33.
  • the amplitude determination unit 32 can be configured by an amplitude filter.
  • the drive system control unit 28 controls the drive unit 3 to rotate the substrate 2 at a predetermined linear velocity, for example, 4.92 m / sec. Further, the optical system control unit 29 controls the optical scanning unit 4 to focus the laser light on the surface of the substrate 2 and form an image of the spot S.
  • the substrate 2 on which the antigen 12 and the beads 16 are fixed on the surface by the antigen-antibody reaction is rotated at a constant linear velocity by the driving unit 3 and optically scanned by the optical scanning unit 4.
  • the optical scanning unit 4 detects the laser light emitted from the laser oscillator 21 and reflected from the surface of the substrate 2 by the light detection unit 27.
  • the light detection unit 27 outputs a detection signal corresponding to the detected amount of laser light to the pulse detection unit 31.
  • a pulse waveform (detection signal) shown in FIG. 3 is detected from the light detection unit 27.
  • the horizontal axis in FIG. 3 is time, and the vertical axis is voltage.
  • FIG. 3 shows four pulse waveforms having a peak on the lower side.
  • the pulse detection unit 31 acquires the detection signal output from the light detection unit 27, and detects the falling edge of the pulse waveform of the acquired detection signal.
  • the pulse detector 31 detects a time point that falls below a preset threshold level (voltage) Vth as the falling edge of the pulse waveform.
  • an average value of the half width of the pulse waveform of the beads 16 detected by the light detection unit 27 is calculated in advance, and a voltage corresponding to the average value of the half width is preset as the threshold level Vth.
  • step S2 the pulse detection unit 31 proceeds to step S3 when a falling edge is detected (YES), and ends the processing when a falling edge is not detected (NO).
  • step S3 the pulse detection unit 31 obtains a time t1 when the pulse waveform falls below the threshold level Vth, the counter flag C1, the flag L1 of the first reference level (voltage) V1, and the second reference level (voltage).
  • the flag L2 of V2 is reset (Low; 0), and the process proceeds to step S4.
  • step S4 the amplitude determination unit 32 detects the peak value (bottom voltage) Vp of the pulse waveform, and determines whether or not the detected peak value Vp is smaller than the first reference level V1 set in advance. .
  • the amplitude determination unit 32 proceeds to step S5 when the detected peak value Vp is smaller than the first reference level V1 (YES), and proceeds to step S8 when larger (NO).
  • step S5 the amplitude determination unit 32 sets the flag L1 to High; 1 and proceeds to step S6.
  • step S6 the amplitude determination unit 32 determines whether or not the peak value Vp of the pulse waveform is smaller than a preset second reference level V2. If the peak value Vp is smaller than the second reference level V2 (YES), the amplitude determination unit 32 proceeds to step S7, and if larger (NO), proceeds to step S8.
  • step S7 the amplitude determination unit 32 sets the flag L2 to High; 1 and proceeds to step S8.
  • step S8 the amplitude determination unit 32 determines that the detection signal in which the flag L1 is High; 1 and the flag L2 is Low; 0 is a valid detection signal (YES), and proceeds to step S9. If the amplitude determination unit 32 does not determine that the signal is a valid detection signal (NO), the process ends.
  • step S9 the pulse width determination unit 33 detects the rising edge of the pulse waveform.
  • the pulse width determination unit 33 detects a time point exceeding the threshold level Vth used in the falling detection as the rising edge of the pulse waveform.
  • step S10 the pulse width determination unit 33 advances the process to step S11 when the rising edge is detected (YES), and ends the process when it is not detected (NO).
  • step S11 the pulse width determination unit 33 acquires the time t2 when the pulse waveform exceeds the threshold level Vth, and the pulse width T of the pulse waveform from the acquired time t2 and the falling time t1 acquired in step S3. (Corresponding to approximately half-value width) is acquired, and the process proceeds to step S12.
  • the threshold level Vth, the first reference level V1, and the second reference level V2 have a relationship of Vth>V1> V2.
  • the pulse waveform of the detection signal shown in FIG. 5 has a peak value Vp in the range from the first reference level V1 to the second reference level V2. Therefore, the detection signal shown in FIG. 5 is determined as a valid detection signal in step S8.
  • the detection signal of the pulse waveform whose peak value Vp does not exist in the range from the first reference level V1 to the second reference level V2 is a noise component due to protein aggregation other than the detection target such as a blocking agent used for suppressing non-specific adsorption. It is determined.
  • the three detection signals on the left side are effective detection signals because the peak value Vp of the pulse waveform is in the range from the first reference level V1 to the second reference level V2. Determined.
  • the detection signal at the right end is determined as a noise component because the peak value Vp of the pulse waveform does not exist in the range from the first reference level V1 to the second reference level V2.
  • a calibration disk is prepared in which measurement beads are dispersed and dried on the base plate of the optical disk without performing the substrate antibody formation, blocking process, and dropping of a salt-containing buffer solution described with reference to FIG. To do.
  • the calibration disk is optically scanned by the optical scanning unit 4 of the analyzer 1 shown in FIG. 1, and the peak value (bottom voltage) of the pulse waveform is measured while observing the pulse waveform of the detection signal with an oscilloscope or the like.
  • the variance is calculated with respect to the measured peak value, and for example, the first reference level V1 and the second reference level V2 are set with 3 ⁇ as a range.
  • the first reference level V1 and the second reference level V2 are set based on the detection signal of the beads actually used by using the analyzer 1 that actually performs the analysis, The first reference level V1 and the second reference level V2 can be appropriately set.
  • the variation in the signal intensity of the detection signal of the beads is considered to be 10% or less, that is, the peak value (bottom voltage) in the range of 0.55 to 0.45. Therefore, the detection signal removed by the amplitude determination unit 32 is considered as a noise component. Thereby, the detection accuracy of the biomarker can be improved by about 2%.
  • step S ⁇ b> 12 the pulse width determination unit 33 determines whether or not the acquired pulse width T is larger than a preset first reference width T ⁇ b> 1.
  • the pulse width determination unit 33 proceeds to step S13 when the pulse width T is larger than the first reference width T1 (YES), and ends the process when it is smaller (NO).
  • step S13 the pulse width determination unit 33 determines whether or not the pulse width T is smaller than a preset second reference width T2 (T2> T1).
  • the pulse width determination unit 33 outputs the pulse signal S when the pulse width T is smaller than the second reference width T2 (YES) (step S15), and when larger (NO), the process proceeds to step S14.
  • step S14 the pulse width determination unit 33 determines whether or not the pulse width T is smaller than a preset third reference width T3 (T3> T2).
  • the pulse width determination unit 33 outputs the pulse signal L when the pulse width T is smaller than the third reference width T3 (YES) (step S16), and ends the process when larger (NO).
  • the pulse waveform analyzer 30 detects and detects a pulse waveform whose peak value (bottom voltage) is smaller than the first reference level and larger than the second reference level and whose pulse width is within a predetermined range. If it is, the pulse signal S or the pulse signal L is output.
  • the counting unit may be configured as a part of the control unit 5 or may be configured at a subsequent stage of the control unit 5.
  • the pulse signal S and the pulse signal L are counted separately, and the aggregated state of the beads can be found by comparing them. For example, it can be seen that if the ratio of the pulse signal S to the pulse signal L is large, the beads are in an aggregated state, and if the ratio is small, the beads are in a dispersed state.
  • the horizontal axis represents the spot position
  • the vertical axis represents the signal intensity (amplitude modulation degree).
  • the pulse waveform D1 in a state where one bead is isolated is indicated by a solid line
  • the pulse waveform D2 in a state where two beads are adjacent is indicated by a one-dot chain line
  • the pulse waveform D3 in a state where three beads are adjacent is indicated by a broken line.
  • FIG. 7 shows only the pulse waveform D1 of FIG. 6 for easy understanding.
  • the half width of the pulse waveform D2 and the half width of the pulse waveform D3 are substantially equal, the half width of the pulse waveform having a plurality of beads adjacent to each other is set as the first reference width T1.
  • the second reference width T2 is set to a value obtained by adding ⁇ to the first reference width T1.
  • ⁇ is set in view of the jitter value of the analyzer.
  • the third reference width T3 is set to a value obtained by adding ⁇ to the half width of the pulse waveform D1.
  • ⁇ is set in view of the jitter value of the analyzer.
  • the peak value (bottom voltage) of the detection signal is analyzed by the amplitude determination unit 32 to remove the noise component, and the pulse width of the detection signal is analyzed by the pulse width determination unit 33.
  • the horizontal axis in FIG. 8 is the amount (concentration) of the biomarker, and the vertical axis is the bead count number.
  • the broken line in FIG. 8 is the background and corresponds to the noise component.
  • the slope of the bead count number with respect to the biomarker amount is almost the same in both the example and the comparative example.
  • the background is significantly lower in Examples than in Comparative Examples. That is, the noise component is removed from the embodiment as compared with the comparative example. As a result, the detection accuracy of the detection target biomarker is improved, and a trace amount of biomarker can be detected.
  • each unit in the control unit 5 may be at least partially configured by a circuit, and the use of hardware and software is arbitrary.
  • the present invention can be used when analyzing biological substances such as antibodies and antigens.

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Abstract

　分析装置（１）は光走査部（４）とパルス波形分析部（３０）とを備えている。光走査部（４）は微粒子（１６）と結合された検出対象（１２）が表面に固定された基板（２）を光学的に走査し、基板（２）から検出信号を取得する。パルス波形分析部（３０）は、検出信号のパルス波形のピーク値が所定の範囲内に存在するか否かを判定する振幅判定部（３２）と、パルス波形のパルス幅が所定の範囲内か否かを判定するパルス幅判定部（３３）とを有し、検出信号のパルス波形を分析する。

Description

分析装置及び分析方法
　本開示は、抗体、抗原等の生体物質を分析するための分析装置及び分析方法に関する。
　疾病に関連付けられた特定の抗原または抗体をバイオマーカーとして検出することで、疾病の発見や治療の効果等を定量的に分析する免疫検定法（immunoassay）が知られている。酵素により標識された抗原または抗体を検出するＥＬＩＳＡ法（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay）は免疫検定法の一つであり、コスト等のメリットから広く普及している。ＥＬＩＳＡ法は、前処理、抗原抗体反応、Ｂ／Ｆ（bond/free）分離、酵素反応等を合計した時間が数時間から１日程度であり、長時間を要する。
　これに対して、光ディスクに固定された抗体と試料中の抗原を結合させ、抗原と抗体を有する粒子とを結合させ、光ヘッドで走査することにより、光ディスク上に捕捉された粒子を短時間に計数する技術が提案されている（特許文献１）。また、光ディスクのトラッキング構造が形成される面に生体試料や粒子を付着させ、光ピックアップで信号の変化を検出する技術が提案されている（特許文献２）。
特開平５－５７４１号公報 特表２００２－５３０７８６号公報
　光ディスクを用いた分析装置では、検出対象であるバイオマーカーを検出するときに、光ディスクの基板の表面の微細な傷がノイズ成分となる。
　また、光ディスクを用いた分析装置では、光ディスクの基板の表面上で抗原抗体反応が行われるため、反応に起因するノイズが発生する。具体的には、基板の表面への抗体の固定、スキムミルクや牛血清アルブミン等の溶液によるブロッキング処理、及び塩を含んだ緩衝液を用いて行うアッセイ等の工程における残渣や残留物が、洗浄後に残ってしまうことでノイズ成分となる。残渣や残留物に起因するノイズレベルは、基板の表面の微細な傷に起因するノイズレベルと比較して１桁以上大きく、バイオマーカーの検出精度を悪化させる大きな要因となる。
　実施形態は、ノイズ成分の影響を抑制し、微粒子による検出対象の検出精度を向上させる分析装置及び分析方法を提供することを目的とする。
　実施形態の第１の態様によれば、微粒子と結合された検出対象が表面に固定された基板を光学的に走査し、前記基板から検出信号を取得する光走査部と、前記光走査部が取得した前記検出信号のパルス波形を分析するパルス波形分析部とを備え、前記パルス波形分析部は、前記パルス波形のピーク値が所定の範囲内に存在するか否かを判定する振幅判定部と、前記パルス波形のパルス幅が所定の範囲内か否かを判定するパルス幅判定部とを有することを特徴とする分析装置が提供される。
　実施形態の第２の態様によれば、微粒子と結合された検出対象が表面に固定された基板を光学的に走査し、前記基板から検出信号を取得する検出信号取得ステップと、前記検出信号のパルス波形のピーク値が所定の範囲内か否かを判定する振幅判定ステップと、前記パルス波形のパルス幅が所定の範囲内に存在するか否かを判定するパルス幅判定ステップとを含むことを特徴とする分析方法が提供される。
　実施形態の分析装置及び分析方法によれば、ノイズ成分の影響を抑制し、微粒子による検出対象の検出精度を向上させることができる。
図１は、実施形態の分析装置を示すブロック図である。 図２は、抗原抗体反応によりバイオマーカーである抗原をビーズと基板とでサンドイッチ捕獲して標識させ、これを検出する方法の一例を説明するための模式図である。 図３は、検出信号のパルス波形データの一例である。 図４は、実施形態の分析方法を示すフローチャートである。 図５は、パルス波形と各パラメータとの関係を示す模式図である。 図６は、各基準値の設定方法を説明するためのパルス波形図である。 図７は、基準値の設定方法を説明するためのパルス波形図である。 図８は、ビーズカウント数とバイオマーカー量との関係を示す相関図である。
　図１を用いて、本実施形態の分析装置を説明する。
　図１に示すように、分析装置１は、基板２と、基板２を回転させるモータ等からなる駆動部３と、基板２の表面を光学的に走査する光走査部４と、駆動部３及び光走査部４を制御し、光走査部４によって検出された検出信号のパルス波形を分析する制御部５とを備えている。制御部５は、マイクロプロセッサまたはマイクロコンピュータで構成することができる。
　基板２は、例えば、コンパクトディスク（ＣＤ）、ＤＶＤ、ブルーレイディスク（ＢＤ）等の光ディスクと同等の寸法を有する円盤状である。基板２は、例えば、一般的に光ディスクに用いられるポリカーボネート樹脂やシクロオレフィンポリマー等の疎水性を有する樹脂材料からなる。
　基板２は、表面に光走査部４が走査可能なトラック構造を有する。トラック構造は、グルーブ、ランド、ピット等からなり、内周側から外周側にスパイラル状に形成されている。基板２の表面には必要に応じて、薄膜形成やシランカップリング剤などによる表面処理を施すこともできる。
　図２に示すように、基板２の表面には、検出対象の生体物質である抗原１２と特異的に結合する抗体１１が固定されている。後述するように、抗原１２は、微粒子であるビーズ１６の表面に固定された抗体１５、及び基板２の抗体１１と特異的に結合する。ビーズ１６と基板２とでサンドイッチ捕獲された抗原１２は、基板２上で標識される。抗原１２は、抗体１１及び抗体１５と特異的に結合することにより、疾病等の指標となるバイオマーカーとして用いられる。
　図２（ａ）に示すように、基板２の表面には抗体１１が予め固定されている。抗体１１は疎水結合や共有結合により基板２の表面に結合される。抗体１１はアビジン等の結合力の強い物質を介して基板２の表面に固定されてもよい。
　図２（ｂ）に示すように、抗原１２を含む試料液１３が基板２の表面に滴下される。抗原１２は、ブラウン運動により試料液１３中を移動して抗体１１と接触し、抗原抗体反応によって抗体１１と特異的に結合する。
　図２（ｃ）に示すように、基板２に滴下された試料液１３を、純水等を用いて洗浄することにより、抗体１１と結合しない余剰の抗原１２を含む試料液１３は基板２から除去される。
　図２（ｄ）に示すように、ビーズ１６を含む緩衝液１４が基板２の表面に滴下される。緩衝液１４は試料液１３が残存する状態で基板２に滴下されてもよい。
　バイオマーカーである抗原１２は、抗原抗体反応により、ビーズ１６の抗体１５と特異的に結合し、基板２の抗体１１と特異的に結合することで、ビーズ１６と基板２とでサンドイッチ捕獲され、基板２上で標識される。
　ビーズ１６は、例えば、フェライト等の磁性体を内包するポリスチレン等の合成樹脂により略球形に形成されている。ビーズ１６の直径は、数十ｎｍ～２００ｎｍ程度である。ビーズ１６は、緩衝液１４が滴下される際に基板２の反対側に磁石が配置されることによって迅速に基板２の表面に集めることもできる。それにより、ビーズ１６と抗原１２との反応が促進される。また、抗原１２とビーズ１６とが同時に投入されることにより、基板２に固定された抗原１２を標識するまでの時間を数分程度に短縮することができる。
　抗体１１及び抗体１５は、抗原１２と特異的に結合する特異性生体物質であればよく、それぞれが別の部位と結合する組み合わせを選択することもできる。
　例えば、複数の種類の抗原１２が表面に発現しているエキソソーム等の膜小胞を検出対象とする場合は、抗体１１及び抗体１５は異なる種類とすることにより、２種類の抗原１２を有する生体試料を分析することができる。これに限らず、エキソソーム等は通常の抗原とは異なり、表面に同種のたんぱく質である抗原が複数存在していることから、抗体１１及び抗体１５は、同じ種類としてもよい。
　図２（ｅ）に示すように、基板２に滴下された緩衝液１４を、純水等を用いて洗浄することにより、抗原１２と結合しない余剰のビーズ１６を含む緩衝液１４が除去される。
　図２（ｆ）に示すように、基板２が光走査部４により光学的に走査され、ビーズ１６が検出されることにより、ビーズ１６に標識された抗原１２（バイオマーカー）を分析することができる。例えば、バイオマーカーの量（濃度）を定量することができる。
　図１に戻り、光走査部４は、レーザ発振器２１と、コリメータレンズ２２と、ビームスプリッタ２３と、アクチュエータ２４と、対物レンズ２５と、集光レンズ２６と、光検出部２７とを備えている。光走査部４は、基板２を光学的に走査する光ピックアップである。
　レーザ発振器２１は、制御部５の制御に応じて、コリメータレンズ２２に向けてレーザ光を射出する。レーザ発振器２１は、例えば、波長がＢＤの再生用波長と同一の４０５ｎｍであり出力が１ｍＷ程度のレーザ光を射出する半導体レーザ発振器である。
　コリメータレンズ２２は、レーザ発振器２１から射出されたレーザ光を平行にする。
　ビームスプリッタ２３は、コリメータレンズ２２により平行にされたレーザ光を対物レンズ２５に向けて反射する。
　対物レンズ２５は、制御部５の制御に応じたアクチュエータ２４の駆動により、ビームスプリッタ２３を経由したレーザ光を、抗体１１が固定された基板２の表面に集光してスポットＳを結像させる。対物レンズ２５は例えば開口数が０．８５である。集光されたレーザ光は、基板２において反射し、ビームスプリッタ２３に入射する。
　ビームスプリッタ２３に入射したレーザ光は、ビームスプリッタ２３を透過し、集光レンズ２６を介して光検出部２７に入射する。集光レンズ２６は、基板２において反射したレーザ光を光検出部２７に集光させる。光検出部２７は、例えばフォトダイオードからなり、基板２において反射したレーザ光の光量に対応する検出信号を制御部５に出力する。
　制御部５は、駆動部３を制御する駆動系制御部２８と、レーザ発振器２１及びアクチュエータ２４をそれぞれ制御する光学系制御部２９と、光検出部２７から出力された検出信号のパルス波形を分析するパルス波形分析部３０とを備えている。
　駆動部３は、駆動系制御部２８の制御により、線速度一定（ＣＬＶ）方式で基板２を回転させる。
　アクチュエータ２４は、光学系制御部２９の制御により、回転する基板２の表面をスパイラル状に走査するように、光走査部４を基板２の半径方向に移動させる。光学系制御部２９は、光検出部２７から出力された検出信号から、フォーカスエラー（ＦＥ）やトラッキングエラー（ＴＥ）等のエラーを検出する。光学系制御部２９は、検出したエラーに応じて、基板２の表面を適正に走査するようにアクチュエータ２４等を制御する。
　パルス波形分析部３０は、パルス検出部３１と、振幅判定部３２と、パルス幅判定部３３とを備えている。振幅判定部３２は振幅フィルタで構成することができる。
　図３～図８を用いて、光検出部２７から出力された検出信号のパルス波形をパルス波形分析部３０で分析する方法を説明する。
　オペレータの操作により、駆動系制御部２８が駆動部３を制御して基板２を所定の線速度、例えば４．９２ｍ／秒で回転させる。また、光学系制御部２９が光走査部４を制御して、レーザ光を基板２の表面に集光してスポットＳを結像させる。
　抗原抗体反応により抗原１２及びビーズ１６が表面に固定された基板２は、駆動部３により線速度一定に回転され、光走査部４により光学的に走査される。
　光走査部４は、レーザ発振器２１から射出され基板２の表面で反射したレーザ光を、光検出部２７で検出する。光検出部２７は、検出したレーザ光の光量に応じた検出信号をパルス検出部３１へ出力する。
　光検出部２７からは、例えば図３に示すパルス波形（検出信号）が検出される。図３の横軸は時間であり、縦軸は電圧である。図３には下側にピークを有する４つのパルス波形が表れている。
　図４のステップＳ１において、パルス検出部３１は、光検出部２７から出力された検出信号を取得し、取得した検出信号のパルス波形の立ち下がりを検出する。パルス検出部３１は、予め設定されている閾値レベル（電圧）Ｖｔｈを下回る時点をパルス波形の立ち下がりとして検出する。
　なお、光検出部２７で検出されたビーズ１６のパルス波形の半値幅の平均値が事前に算出されており、半値幅の平均値に対応する電圧が閾値レベルＶｔｈとして予め設定されている。
　ステップＳ２において、パルス検出部３１は、立ち下がりが検出された場合（ＹＥＳ）にはステップＳ３へ処理を進め、立ち下がりが検出されなかった場合（ＮＯ）には処理を終了する。
　ステップＳ３において、パルス検出部３１は、パルス波形が閾値レベルＶｔｈを下回る時点の時刻ｔ１を取得し、カウンタフラグＣ１、第１基準レベル（電圧）Ｖ１のフラグＬ１、及び第２基準レベル（電圧）Ｖ２のフラグＬ２をリセット（Ｌｏｗ；０）して、ステップＳ４へ処理を進める。
　ステップＳ４において、振幅判定部３２は、パルス波形のピーク値（ボトム電圧）Ｖｐを検出し、検出したピーク値Ｖｐが、予め設定されている第１基準レベルＶ１よりも小さいか否かを判定する。
　振幅判定部３２は、検出したピーク値Ｖｐが第１基準レベルＶ１よりも小さい場合（ＹＥＳ）にはステップＳ５へ処理を進め、大きい場合（ＮＯ）にはステップＳ８へ処理を進める。
　ステップＳ５において、振幅判定部３２はフラグＬ１をＨｉｇｈ；１にセットして、ステップＳ６へ処理を進める。
　ステップＳ６において、振幅判定部３２はパルス波形のピーク値Ｖｐが、予め設定されている第２基準レベルＶ２よりも小さいか否かを判定する。
　振幅判定部３２は、ピーク値Ｖｐが第２基準レベルＶ２よりも小さい場合（ＹＥＳ）にはステップＳ７へ処理を進め、大きい場合（ＮＯ）にはステップＳ８へ処理を進める。
　ステップＳ７において、振幅判定部３２はフラグＬ２をＨｉｇｈ；１にセットして、ステップＳ８へ処理を進める。
　ステップＳ８において、振幅判定部３２は、フラグＬ１がＨｉｇｈ；１、かつ、フラグＬ２がＬｏｗ；０である検出信号を有効な検出信号と判定（ＹＥＳ）し、ステップＳ９へ処理を進める。また、振幅判定部３２は、有効な検出信号と判定しなかった（ＮＯ）場合には処理を終了する。
　ステップＳ９において、パルス幅判定部３３は、パルス波形の立ち上がりを検出する。パルス幅判定部３３は、立ち下がり検出で用いた閾値レベルＶｔｈを上回る時点をパルス波形の立ち上がりとして検出する。
　ステップＳ１０において、パルス幅判定部３３は、立ち上がりが検出された場合（ＹＥＳ）にはステップＳ１１へ処理を進め、検出されなかった場合（ＮＯ）には処理を終了する。
　ステップＳ１１において、パルス幅判定部３３は、パルス波形が閾値レベルＶｔｈを上回る時点の時刻ｔ２を取得し、取得した時刻ｔ２とステップＳ３で取得した立ち下りの時刻ｔ１とからパルス波形のパルス幅Ｔ（略半値幅に相当する）を取得し、ステップＳ１２へ処理を進める。
　ここで、パルス波形のピーク値（ボトム電圧）Ｖｐと第１基準レベルＶ１及び第２基準レベルＶ２との関係、並びに、パルス波形のパルス幅Ｔと閾値レベルＶｔｈ、立ち下りの時刻ｔ１及び立ち上りの時刻ｔ２との関係を図５に示す。
　図５に示すように、閾値レベルＶｔｈ、第１基準レベルＶ１、及び第２基準レベルＶ２は、Ｖｔｈ＞Ｖ１＞Ｖ２の関係を有している。
　図５に示す検出信号のパルス波形は、ピーク値Ｖｐが第１基準レベルＶ１から第２基準レベルＶ２までの範囲に存在する。従って、図５に示す検出信号は、ステップＳ８において有効な検出信号と判定される。
　ピーク値Ｖｐが第１基準レベルＶ１から第２基準レベルＶ２までの範囲に存在しないパルス波形の検出信号は、非特異吸着を抑制するために用いるブロッキング剤等、検出対象以外のたんぱく質凝集によるノイズ成分と判定される。
　例えば図３に示す４つの検出信号のうち、左側の３つの検出信号はパルス波形のピーク値Ｖｐが第１基準レベルＶ１から第２基準レベルＶ２までの範囲に存在したので、有効な検出信号と判定される。一方、右端の検出信号はパルス波形のピーク値Ｖｐが第１基準レベルＶ１から第２基準レベルＶ２までの範囲に存在しなかったので、ノイズ成分と判定される。
　ここで、第１基準レベルＶ１及び第２基準レベルＶ２の設定方法について説明する。
　まず、図２を用いて説明した基板抗体形成、ブロッキング処理、塩を含んだ緩衝液の滴下等の処理を行わずに、光ディスクの素板に測定ビーズを分散、乾燥させた校正用ディスクを準備する。
　次に、図１に示す分析装置１の光走査部４で校正用ディスクを光学的に走査し、検出信号のパルス波形をオシロスコープ等で観察しながら、パルス波形のピーク値（ボトム電圧）を測定する。
　測定したピーク値に対して分散を計算し、例えば３σをレンジとして第１基準レベルＶ１及び第２基準レベルＶ２を設定する。
　本設定方法によれば、実際に分析を行う分析装置１を用いて、実際に使用するビーズの検出信号に基づいて第１基準レベルＶ１及び第２基準レベルＶ２を設定するため、容易に、かつ、適切に第１基準レベルＶ１及び第２基準レベルＶ２を設定することができる。
［実験結果１］
　信号強度（振幅変調度）の平均値が０．５の特性を有するビーズの検出信号に対して、Ｖｔｈ＝０．７５、Ｖ１＝０．６、Ｖ２＝０．３に設定して振幅判定部３２により検出信号のフィルタ処理を実施した。その結果、約２％の検出信号が除去された。ビーズの検出信号の信号強度のばらつきは１０％以下、即ちピーク値（ボトム電圧）で０．５５～０．４５の範囲と考えられる。従って、振幅判定部３２によって除去された検出信号はノイズ成分と考えられる。これにより、バイオマーカーの検出精度を約２％向上させることができる。
［実験結果２］
　検出対象の抗原（バイオマーカー）を含む試料液を滴下せずにアッセイを行い、ノイズ成分のみが固定された光ディスクを準備した。この光ディスクに対して、Ｖ１＝０．６５、Ｖ２＝０．３５に設定して振幅判定部３２により検出信号のフィルタ処理を実施した。その結果、振幅判定部３２を用いない場合に対して、約５０％のノイズ成分を除去することができた。
［実験結果３］
　実験結果２で用いた光ディスクと同じ光ディスクに対して、Ｖ１＝０．５７、Ｖ２＝０．４５に設定して振幅判定部３２により検出信号のフィルタ処理を実施した。その結果、振幅判定部３２を用いない場合に対して、約８０％のノイズ成分を除去することができた。しかしながら、検出対象の抗原（バイオマーカー）を含む試料液を滴下してアッセイを行い、同じ条件でフィルタ処理を実施すると、本来カウントされるべき検出信号の一部がノイズ成分として除去された。
　実験結果１～３のようにフィルタ処理の条件を変えて実験した結果から、第１基準レベルＶ１及び第２基準レベルＶ２を設定することで、適切なフィルタ処理を行うこともできる。
　図４に戻って、ステップＳ１２において、パルス幅判定部３３は、取得したパルス幅Ｔが、予め設定されている第１基準幅Ｔ１よりも大きいか否かを判定する。
　パルス幅判定部３３は、パルス幅Ｔが第１基準幅Ｔ１よりも大きい場合（ＹＥＳ）にはステップＳ１３へ処理を進め、小さい場合（ＮＯ）には処理を終了する。
　ステップＳ１３において、パルス幅判定部３３は、パルス幅Ｔが、予め設定されている第２基準幅Ｔ２（Ｔ２＞Ｔ１）よりも小さいか否かを判定する。
　パルス幅判定部３３は、パルス幅Ｔが第２基準幅Ｔ２よりも小さい場合（ＹＥＳ）にはパルス信号Ｓを出力し（ステップＳ１５）、大きい場合（ＮＯ）にはステップＳ１４へ処理を進める。
　ステップＳ１４において、パルス幅判定部３３は、パルス幅Ｔが、予め設定されている第３基準幅Ｔ３（Ｔ３＞Ｔ２）よりも小さいか否かを判定する。
　パルス幅判定部３３は、パルス幅Ｔが第３基準幅Ｔ３よりも小さい場合（ＹＥＳ）にはパルス信号Ｌを出力し（ステップＳ１６）、大きい場合（ＮＯ）には処理を終了する。
　即ち、パルス波形分析部３０は、ピーク値（ボトム電圧）が第１基準レベルよりも小さくて第２基準レベルよりも大きく、かつ、パルス幅が所定の範囲内であるパルス波形を検出し、検出された場合にパルス信号Ｓまたはパルス信号Ｌを出力する。
　パルス幅判定部３３から出力されるパルス信号Ｓ及びパルス信号Ｌを、図示しない計数部でカウントすることにより、検出対象のバイオマーカーの量（濃度）を精度よく分析することができる。なお、計数部は制御部５の一部として構成されてもよく、制御部５の後段に構成されてもよい。
　また、パルス信号Ｓとパルス信号Ｌとを別々にカウントし、これらを比較することでビーズの凝集状態がわかる。例えば、パルス信号Ｌに対するパルス信号Ｓの比率が大きければ、ビーズは凝集された状態にあり、小さければビーズは分散された状態にあることがわかる。
　ここで、図６及び図７を用いて、第１基準幅Ｔ１、第２基準幅Ｔ２、及び第３基準幅Ｔ３の設定方法について説明する。図６及び図７の横軸はスポット位置であり、縦軸は信号強度（振幅変調度）である。図６では、１つのビーズが孤立した状態のパルス波形Ｄ１を実線で表し、２つのビーズが隣接した状態のパルス波形Ｄ２を一点鎖線で表し、３つのビーズが隣接した状態のパルス波形Ｄ３を破線で表している。図７は説明をわかりやすくするために、図６のパルス波形Ｄ１のみを示している。
　図６に示すように、パルス波形Ｄ２の半値幅とパルス波形Ｄ３の半値幅とはほぼ等しいため、複数のビーズが隣接状態のパルス波形の半値幅を第１基準幅Ｔ１としている。第２基準幅Ｔ２は第１基準幅Ｔ１にαを加算した値に設定されている。αは分析装置のジッター値等を鑑みて設定されている。
　図７に示すように、第３基準幅Ｔ３はパルス波形Ｄ１の半値幅にαを加算した値に設定されている。αは分析装置のジッター値等を鑑みて設定されている。
　上述した分析装置及び分析方法によれば、検出信号のピーク値（ボトム電圧）を振幅判定部３２で分析することでノイズ成分を除去し、さらに検出信号のパルス幅をパルス幅判定部３３で分析することで、振幅判定部３２で除去し切れなかったノイズ成分を除去することができる。従って、従来よりもノイズ成分の影響を抑制し、検出対象であるバイオマーカーの検出精度を向上させることができる。
　図８を用いて、上述した分析装置１を用いた実施例を説明する。図８の横軸はバイオマーカー量（濃度）であり、縦軸はビーズカウント数である。なお、振幅判定部による処理をせずにパルス幅の判定のみを行った場合を比較例として示している。
　図８の破線はバックグラウンドであり、ノイズ成分に相当する。図８に示すように、バイオマーカー量に対するビーズカウント数の傾きは実施例、比較例ともほぼ同じである。一方、バックグラウンドは、実施例が比較例よりも大幅に下がっている。即ち、実施例は比較例よりもノイズ成分が除去されている。その結果、検出対象であるバイオマーカーの検出精度が向上し、微量なバイオマーカーの検出も可能になる。
　なお、本発明に係る実施形態は、上述した構成に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々変更可能である。図１において、制御部５内の各部を少なくとも部分的に回路で構成してもよく、ハードウェアとソフトウェアとの使い分けは任意である。
　本発明は、抗体、抗原等の生体物質を分析する際に利用できる。

Claims (3)

  1. 　微粒子と結合された検出対象が表面に固定された基板を光学的に走査し、前記基板から検出信号を取得する光走査部と、
    　前記光走査部が取得した前記検出信号のパルス波形を分析するパルス波形分析部と、
    　を備え、
    　前記パルス波形分析部は、
    　前記パルス波形のピーク値が所定の範囲内に存在するか否かを判定する振幅判定部と、
    　前記パルス波形のパルス幅が所定の範囲内か否かを判定するパルス幅判定部と、
    　を有することを特徴とする分析装置。
  2. 　前記パルス波形分析部は、前記ピーク値が所定の範囲内に存在し、かつ、前記パルス幅が所定の範囲内であるパルス波形を検出することを特徴とする請求項１記載の分析装置。
  3. 　微粒子と結合された検出対象が表面に固定された基板を光学的に走査し、前記基板から検出信号を取得する検出信号取得ステップと、
    　前記検出信号のパルス波形のピーク値が所定の範囲内に存在するか否かを判定する振幅判定ステップと、
    　前記パルス波形のパルス幅が所定の範囲内か否かを判定するパルス幅判定ステップと、
    　を含むことを特徴とする分析方法。
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