WO2015174441A1 - 糖尿病の予防または治療剤のスクリーニング方法 - Google Patents

糖尿病の予防または治療剤のスクリーニング方法 Download PDF

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WO2015174441A1
WO2015174441A1 PCT/JP2015/063724 JP2015063724W WO2015174441A1 WO 2015174441 A1 WO2015174441 A1 WO 2015174441A1 JP 2015063724 W JP2015063724 W JP 2015063724W WO 2015174441 A1 WO2015174441 A1 WO 2015174441A1
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mafg
mice
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PCT/JP2015/063724
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山本　雅之
晃 宇留野
祐樹 古澤
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持田製薬株式会社
国立大学法人東北大学
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Definitions

  • the present invention relates to a preventive or therapeutic agent for diabetes and a screening method thereof.
  • Diabetes is a chronic metabolic disease characterized by a persistent hyperglycemic state caused by insufficient insulin action.
  • insulin secretion failure is due to dysfunction of the pancreatic ⁇ -cells that secrete insulin.
  • ⁇ cells are destroyed by autoimmunity, resulting in insulin secretion failure.
  • Insulin resistance is a state in which insulin secretion is sufficient but blood glucose level does not decrease, and it means that insulin does not work well in the main tissues where insulin acts, such as skeletal muscle, adipose tissue and liver .
  • Insulin acts to promote sugar uptake and glycogen synthesis in skeletal muscle, sugar uptake and fat synthesis in adipose tissue, and suppression of gluconeogenesis in the liver. If there is insulin resistance, these responses in each tissue are blunted. In type 2 diabetes, both insulin secretion failure and insulin resistance are involved. Environmental factors such as obesity, overeating, lack of exercise, and stress cause insulin resistance and lead to a hyperglycemic state. Hyperglycemia promotes excessive insulin secretion from ⁇ cells, exhausting ⁇ cells. In addition, glucose toxicity due to hyperglycemia damages ⁇ cells and worsens insulin resistance. As the disease progresses, insulin secretion decreases due to ⁇ -cell dysfunction, which in combination with insulin resistance leads to a further hyperglycemic state.
  • diabetes In the treatment of diabetes, the goal is to lower the blood glucose level to the normal range.
  • the mechanism of action is roughly divided into insulin secretion promotion, insulin resistance improvement, and sugar absorption suppression.
  • Existing diabetes treatments include insulin, ⁇ -glycosidase inhibitors (voglibose, acarbose, etc.), fast-acting insulin secretagogues (nateglinide, mitiglinide, etc.), sulfonylureas (glimepiride, gliclazide, etc.), GLP-1 receptor Agonists (such as liraglutide and exenatide), DPP-4 inhibitors (such as sitagliptin and vildagliptin), biguanides (such as metformin), thiazolidine drugs (such as pioglitazone), SGLT2 inhibitors (such as ipragliflozin) are used .
  • ⁇ -glycosidase inhibitors voglibose,
  • ⁇ -Glycosidase inhibitors delay postprandial hyperglycemia by delaying sugar absorption from the intestines.
  • Fast-acting insulin secretagogues, sulfonylureas and GLP-1 receptor agonists stimulate ⁇ cells and promote insulin secretion.
  • DPP-4 inhibitors promote insulin secretion by inhibiting the degradation of incretins (GLP-1 and GIP). Biguanides mainly inhibit gluconeogenesis in the liver and improve insulin resistance.
  • Thiazolidine drugs promote glucose uptake, glycogen synthesis, and fat synthesis in skeletal muscle and adipose tissue, suppress sugar release from the liver, and improve insulin resistance.
  • CNC cap-'n'-collar family transcription factors including NF-E2p45, Nrf1 (NF-E2-related factor 1), Nrf2, Nrf3, Bach1 and Bach2 have multiple cellular functions. These factors commonly bind to an antioxidant / electrophile response element (ARE / EpRE) and activate or repress transcription.
  • Nrf2 has been found to play a pivotal role in cellular responses to oxidative and electrophilic stress. Nrf2 also contributes to glucose metabolism in cancer cells. Importantly, Nrf2 also regulates glucose metabolism levels and body weight levels in obese and diabetic model mice.
  • GWAS genome-wide association analysis
  • Nrf3 has been found to be associated with lipid distribution in human obesity.
  • Nrf1 another CNC family factor, also binds to ARE / EpRE and exerts transactivation activity (Non-patent Document 1).
  • the phenotype of the Nrf1 knockout mouse (Non-patent document 2; Non-patent document 3; Non-patent document 4; Non-patent document 5; and Patent document 1) is completely different from the phenotype of the Nrf2 knockout mouse.
  • Nrf1 knockout mice are embryonic lethal due to insufficient red blood cell production (Non-patent Document 2). This is thought to be important because Nrf1 and Nrf2 use the same consensus sequence ARE / EpRE for specific transcriptional regulation but have different cellular functions.
  • Nrf1 regulates lipid metabolism-related genes
  • Patent Document 5 Patent Document 1
  • This finding led to the thought that Nrf1 could also play an important role in the metabolism of various cells.
  • An interesting problem that arises here is the difference in the contribution of Nrf1 and Nrf2 to cellular metabolic regulation.
  • embryonic lethal mortality in Nrf1 global knockout mice (Non-Patent Document 2) and severe liver dysfunction in Nrf1 liver-specific conditional knockout mice (Non-Patent Document 5) elucidate the extremely important role Nrf1 plays in metabolism. Is hindering. Differences in the contribution of Nrf1 and Nrf2 to the pathophysiology and molecular basis of the cells that make the difference remain unclear.
  • Nrf1 body mass index
  • rs3764400 a single nucleotide polymorphism (SNP)
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • Nrf1 function In order to address the contribution of Nrf1 to metabolic regulation, we investigated Nrf1 function using Nrf1 gene mutant mice with different expression levels. For this purpose, three Nrfl overexpressing transgenic mouse lines were established by using the MafG gene regulatory domain (MGRD). An Nrf1 knockout mouse strain was also used (Non-patent Document 1). Analysis on these mice clearly demonstrated that Nrf1 attenuates glucose metabolism and concomitantly decreases body weight levels. Therefore, Nrf1 was found to be a strong metabolic regulator. Furthermore, the present inventors have found that Nrf1 is a target in the prevention or treatment of diabetes because mice develop diabetes due to overexpression of Nrf1, and the present invention has been completed. That is, the present invention provides the following preventive or therapeutic agents for diabetes, screening methods for preventive or therapeutic agents for diabetes, transgenic non-human animals, and the like.
  • a preventive or therapeutic agent for diabetes comprising an Nrf1 inhibitor.
  • the Nrf1 inhibitor is (a) a siRNA or shRNA against a polynucleotide encoding Nrf1, and (b) a nucleotide sequence complementary or substantially complementary to the nucleotide sequence of the polynucleotide encoding Nrf1 An antisense polynucleotide containing a part, (c) a low molecular or high molecular compound that inhibits Nrf1 activity, (d) a ribozyme for a polynucleotide encoding Nrf1, and (e) acting as a dominant negative for Nrf1
  • the prophylactic or therapeutic agent according to the above [1-1] which is one or more selected from the group consisting of a mutant of Nrf1 or a polynucleotide encoding the same, and (f) an aptamer to Nrf1.
  • Nrf1 inhibitor is an siRNA comprising a sense strand consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 33 and an antisense strand consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 34
  • siRNA comprising a sense strand consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 33 and an antisense strand consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 34
  • Diabetes prevention or treatment [2-1] A method for preventing or treating diabetes, comprising administering a therapeutically effective amount of an Nrf1 inhibitor to a subject in need of prevention or treatment of diabetes.
  • the Nrf1 inhibitor is (a) a siRNA or shRNA against the polynucleotide encoding Nrf1, and (b) a nucleotide sequence complementary or substantially complementary to the nucleotide sequence of the polynucleotide encoding Nrf1
  • An antisense polynucleotide containing a part (c) a low molecular or high molecular compound that inhibits Nrf1 activity, (d) a ribozyme for a polynucleotide encoding Nrf1, and (e) acting as a dominant negative for Nrf1 Any one of [2-1] to [2-3] above, which is one or more selected from the group consisting of a mutant of Nrf1 or a polynucleotide encoding the same, and (f) an aptamer to Nrf1 The method according to item.
  • Nrf1 inhibitor is an siRNA comprising a sense strand consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 33 and an antisense strand consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 34 4.
  • siRNA comprising a sense strand consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 33 and an antisense strand consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 34 4.
  • [3-1] A screening method for a prophylactic or therapeutic agent for diabetes using inhibition of Nrf1 activity as an index.
  • (i) Measure the amount of binding between Nrf1 and MafG when Nrf1 and MafG are contacted in the presence of the test compound, and (ii) Nrf1 and MafG in the absence of the test compound. Measuring the binding amount of Nrf1 and MafG when contacted with (iii) and comparing the binding amount of Nrf1 and MafG in the case of (i) and (ii), The method according to [3-1] or [3-2] above.
  • a test compound in which the binding amount of Nrf1 and MafG in the case of (i) is lower than the binding amount of Nrf1 and MafG in the case of (ii) is selected as a compound that inhibits Nrf1 activity
  • the amount of Nrf1-labeled fusion protein in the cell when not contacted with (iii) and comparing the amount of Nrf1-labeled fusion protein in the case of (i) and (ii) above [ The method according to [3-1] or [3-7]. [3-9] A test compound in which the amount of Nrf1-labeled fusion protein in the case of (i) is lower than the amount of Nrf1-labeled fusion protein in the case of (ii) is selected as a compound that inhibits Nrf1 activity. The method according to [3-8] above.
  • Transgenic non-human animals [4-1] A transgenic non-human animal having at least one copy of a recombinant DNA containing a gene encoding Nrf1 and a MafG regulatory domain and being a diet-induced obesity (DIO) model. [4-2] The non-human animal according to [4-1], wherein the recombinant DNA has 4 copies. [4-3] The non-human animal according to [4-1] or [4-2] above, wherein the non-human animal is a mouse or a rat. [4-4] Use of the non-human animal according to any one of [4-1] to [4-3] as a diabetes model mouse.
  • An agent for preventing or treating diabetes comprising contacting a test compound with the non-human animal according to any one of [4-1] to [4-3] above, which has developed diabetes. Screening method.
  • the blood glucose level of the non-human animal according to any one of [4-1] to [4-3] above in contact with the test compound is measured, and the measured blood glucose level is the test compound.
  • a method for screening a prophylactic or therapeutic agent for diabetes comprising selecting the test compound as a candidate compound for the prophylactic or therapeutic agent for diabetes when the blood glucose level in the non-human animal that does not contact is lowered.
  • the present invention can provide a method for screening a prophylactic or therapeutic agent effective against diabetes using inhibition of Nrf1 activity as an index.
  • the present invention can provide a prophylactic or therapeutic agent effective for diabetes obtained by the screening method.
  • FIG. 1 It is a figure which shows regulatory SNP in a human NRF1 gene.
  • A Schematic diagram of a reporter construct of a chimeric DNA of 5′-flanking region of human NRF1 gene and luciferase cDNA. SNP rs3764400 with the T allele and the risk C allele for obesity is 1.8 kb upstream of the transcription start site (TSS) of the NRF1 gene.
  • TSS transcription start site
  • B It is a figure which shows the transcriptional activity of the NRF1 gene in a human liver cancer cell line. Data are relative firefly luciferase activity normalized by Renilla luciferase activity and represent mean ⁇ SEM.
  • A Schematic diagram of construction for systemic expression of Nrf1-FLAG under the control of MafG regulatory domain (MGRD).
  • B shows the expression levels of Nrf1 mRNA in the liver, skeletal muscle (SkM), white adipose tissue (WAT), brown adipose tissue (BAT), and brain of three strains of Nrf1-Tg mice. Data represent mean ⁇ SEM.
  • Nrf1 proliferating cell nuclear antigen
  • Tub ⁇ -tubulin proteins in WT and Nrf1-Tg mouse liver nuclei (Nrf1 and PCNA) or cytosol (Nrf1 and Tub) It is a figure which shows an expression level.
  • D Transgenic rescue from embryonic lethality of Nrf1-deficient mice by MGRD-Nrf1 transgene.
  • FIG. 2 shows a mating strategy for creating transgenic rescue mice (left panel).
  • ND normal diet
  • HFD high fat diet
  • FIG. 5 shows that Nrf1 induces insulin resistance in non-obese mice.
  • FIG. 5 shows that Nrf1 exacerbates insulin signals in the liver and SkM.
  • A Immunoblot analysis of liver and SkM phosphorylated Akt (Ser-473) and total Akt. After overnight fasting, WT mice and Nrf1-Tg (strain 1) mice that received HFD were administered insulin (Ins) or saline as vehicle (Veh).
  • p-Akt phosphorylated Akt (Ser-473);
  • t-Akt total Akt.
  • a to E Metabolomic analysis of the liver of a WT mouse and the liver of an Nrf1-Tg mouse subjected to HFD.
  • FIG. 6 shows plasma ⁇ -hydroxybutyric acid levels and plasma ammonia levels.
  • FIG. 3 shows that Nrf1 heterozygous knockout improves glucose metabolism in diet-induced obesity model mice and diabetes model mice.
  • Data are expressed as mean ⁇ SEM (for A) or as a scatter plot for each mouse (black or white dots) and the median for each group (black line) (for B and C).
  • Nrf1, MafG, Lipin1 and PGC-1 ⁇ 1.1.
  • Nrf1 “Nrf1” nuclear factor erythroid 2-related factor 1
  • CNC cap'n'collar
  • Nrf1 is regarded as an important regulator for various biological processes including metabolism. Nrf1 moves from the cytoplasm into the nucleus and forms a heterodimer with the Maf protein, thereby binding to the ARE (Antioxidant response element) sequence and activating the target gene.
  • the target gene of Nrf1 is, for example, a gene such as Lipin1 and PGC-1 ⁇ .
  • Nrf1 is not particularly limited, and examples thereof include those derived from humans and those derived from mice.
  • the gene and amino acid sequence of human Nrf1 are registered in GenBank as Accession No. NM_003204 (gene) (SEQ ID NO: 1) and Accession No. NP_003195 (protein) (SEQ ID NO: 2), respectively.
  • the gene and amino acid sequence of mouse Nrf1 are registered in GenBank as Accession No. NM_008686 (gene) (SEQ ID NO: 3) and Accession No. NP_032712 (protein) (SEQ ID NO: 4), respectively.
  • Nrf1 is used in the meaning of including mutants thereof as long as they have substantially the same activity as them.
  • the mutant include one or more of the amino acid sequences of Nrf1 (for example, 1 to 30, 1 to 29, 1 to 28, 1 to 27, 1 to 26, 1 to 25).
  • Pieces, 1-24 pieces, 1-23 pieces, 1-22 pieces, 1-21 pieces, 1-20 pieces, 1-19 pieces, 1-18 pieces, 1-17 pieces, 1-16 pieces, 1-15 pieces 1 to 14, 1 to 13, 1 to 12, 1 to 11, 1 to 10, 1 to 10 (1 to several), 1 to 8, 1 to 7, 1 to (6, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, or 1) amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added.
  • the smaller the number of amino acids deleted, substituted, inserted or added the better.
  • Two or more of the amino acid residue deletions, substitutions, insertions and additions may occur simultaneously.
  • Nrf1 target gene transcriptional activity indicates that their activities are qualitatively (eg, physiologically or pharmacologically) equivalent. Therefore, Nrf1 target gene transcriptional activity, ARE binding activity, heterodimer forming ability with Maf protein, etc. are equivalent (eg, about 0.01 to 100 times, preferably about 0.1 to 10 times, more preferably 0.5 to 2 times). However, the quantitative factors such as the degree of activity and the molecular weight of the protein may be different.
  • Nrf1 generally refers to the Nrf1 protein, but may refer to the Nrf1 gene depending on the context.
  • MafG is one of the small Maf group factors. It is a transcription factor with a basic leucine zipper (bZip) structure consisting of a basic region involved in DNA recognition and a leucine zipper necessary to form heterodimers. is there. MafG forms a heterodimer with Nrf1 and binds to the ARE sequence of the target gene.
  • bZip basic leucine zipper
  • MafG is not particularly limited, and examples thereof include those derived from humans and those derived from mice.
  • the gene and amino acid sequence of human MafG are registered in GenBank as Accession No. NM_002359 (gene) (SEQ ID NO: 13) and Accession No. NP_002350 (protein) (SEQ ID NO: 14), respectively.
  • the gene and amino acid sequence of mouse MafG are registered in GenBank as Accession No. NM_010756 (gene) (SEQ ID NO: 15) and Accession No. NP_034886 (protein) (SEQ ID NO: 16), respectively.
  • MafG is used in the meaning of including mutants thereof as long as they have substantially the same activity as them.
  • the mutant include one or more of the amino acid sequences of Nrf1 (for example, 1 to 30, 1 to 29, 1 to 28, 1 to 27, 1 to 26, 1 to 25).
  • Pieces, 1-24 pieces, 1-23 pieces, 1-22 pieces, 1-21 pieces, 1-20 pieces, 1-19 pieces, 1-18 pieces, 1-17 pieces, 1-16 pieces, 1-15 pieces 1 to 14, 1 to 13, 1 to 12, 1 to 11, 1 to 10, 1 to 10 (1 to several), 1 to 8, 1 to 7, 1 to (6, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, or 1) amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added.
  • the smaller the number of amino acids deleted, substituted, inserted or added the better.
  • Two or more of the amino acid residue deletions, substitutions, insertions and additions may occur simultaneously.
  • substantially the same quality of activity examples include transcription promotion activity of target genes, MARE (Maf recognition sequence) binding activity, ARE binding activity, homodimer formation ability, heterodimer formation ability with CNC family transcription factors, and the like.
  • MARE Micro recognition sequence
  • ARE binding activity homodimer formation ability, heterodimer formation ability with CNC family transcription factors, and the like.
  • transcriptional activity of target gene, MARE binding activity, ARE binding activity, homodimer formation ability, heterodimer formation ability with CNC family transcription factors, etc. are equivalent (eg, about 0.01 to 100 times, preferably about 0.1 to 10 times) More preferably, it is 0.5 to 2 times), but quantitative factors such as the degree of activity and the molecular weight of the protein may be different.
  • MafG generally refers to a MafG protein, but may refer to a MafG gene depending on the context.
  • Lipin1 is a protein belonging to the Lipin family together with Lipin2, Lipin3, and the like. Lipin1 is known to have two functions of regulating lipid metabolism due to differences in subcellular localization. First, Lupin1 has phosphatidate phosphatase activity on the endoplasmic reticulum membrane. Second, Lipin1 also acts as a coactivator of the PPAR ⁇ / PGC-1 ⁇ regulatory pathway in the nucleus, positively regulating the oxidative metabolism of fatty acids.
  • Lipin1 is not particularly limited, and examples thereof include those derived from humans and those derived from mice.
  • the gene and amino acid sequence of human Lipin1 are registered in GenBank as Accession No. NM_145693 (gene) (SEQ ID NO: 5) and Accession No. NP_663731 (protein) (SEQ ID NO: 6), respectively.
  • the gene and amino acid sequence of mouse Lipin1 are registered in GenBank as Accession No. NM_172950 (gene) (SEQ ID NO: 7) and Accession No. NP_766538 (protein) (SEQ ID NO: 8), respectively.
  • Lipin1 is used in the meaning of including mutants thereof as long as they have substantially the same activity as them.
  • the mutant include one to a plurality (for example, 1 to 30, 1 to 29, 1 to 28, 1 to 27, 1 to 26, 1 to 25) in the amino acid sequence of Lipin1.
  • Pieces, 1-24 pieces, 1-23 pieces, 1-22 pieces, 1-21 pieces, 1-20 pieces, 1-19 pieces, 1-18 pieces, 1-17 pieces, 1-16 pieces, 1-15 pieces 1 to 14, 1 to 13, 1 to 12, 1 to 11, 1 to 10, 1 to 10 (1 to several), 1 to 8, 1 to 7, 1 to (6, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, or 1) amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added.
  • the smaller the number of amino acids deleted, substituted, inserted or added the better. Two or more of the amino acid residue deletions, substitutions, insertions and additions may occur simultaneously.
  • substantially the same activity examples include phosphatidic acid phosphatase activity, coactivator activity of PPAR ⁇ / PGC-1 ⁇ regulatory pathway, and the like.
  • Substantially homogeneous indicates that their activities are qualitatively (eg, physiologically or pharmacologically) equivalent. Therefore, the phosphatidic acid phosphatase activity and the coactivator activity of the PPAR ⁇ / PGC-1 ⁇ regulatory pathway are equivalent (eg, about 0.01 to 100 times, preferably about 0.1 to 10 times, more preferably 0.5 to 2 times). However, quantitative factors such as the degree of these activities and the molecular weight of the protein may be different.
  • Lipin1 generally means Lipin1 protein, but it may mean Lipin1 gene depending on the context.
  • PGC-1 ⁇ peroxisome proliferator-activated receptor ⁇ coactivator 1 ⁇
  • ERR ⁇ estrogen-related receptor ⁇
  • nuclear respiratory factor 1 peroxisome proliferator-activated receptor ⁇ coactivator 1 ⁇
  • PGC-1 ⁇ knockout mice show altered expression of mitochondrial oxidative metabolic genes and high-fat diet-induced fatty liver.
  • PGC-1 ⁇ is not particularly limited, and examples thereof include those derived from humans and those derived from mice.
  • the gene and amino acid sequence of human PGC-1 ⁇ are registered in GenBank as Accession No. NM_133263 (gene) (SEQ ID NO: 9) and Accession No. NP_573570 (protein) (SEQ ID NO: 10), respectively.
  • the gene and amino acid sequence of mouse PGC-1 ⁇ are registered in GenBank as Accession No. NM_133249 (gene) (SEQ ID NO: 11) and Accession No. NP_573512 (protein) (SEQ ID NO: 12), respectively.
  • PGC-1 ⁇ has substantially the same activity as that of the PGC-1 ⁇ , it is used in a meaning including its mutants.
  • the mutant include one to a plurality (for example, 1 to 30, 1 to 29, 1 to 28, 1 to 27, 1 to 26, 1 to 1) in the amino acid sequence of the above PGC-1 ⁇ . ⁇ 25, 1-24, 1-23, 1-22, 1-21, 1-20, 1-19, 1-18, 1-17, 1-16, 1 ⁇ 15, 1-14, 1-13, 1-12, 1-11, 1-10, 1-9 (1 to several), 1-8, 1-7, (1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, or 1) amino acids deleted, substituted, inserted and / or added proteins It is done. In general, the smaller the number of amino acids deleted, substituted, inserted or added, the better. Two or more of the amino acid residue deletions, substitutions, insertions and additions may occur simultaneously.
  • Examples of the activity of substantially the same quality include co-activation activity of ERR ⁇ and nuclear respiratory factor 1 and the like. Substantially homogeneous indicates that their activities are qualitatively (eg, physiologically or pharmacologically) equivalent. Therefore, it is preferable that the co-activation activity of ERR ⁇ and nuclear respiratory factor 1 is equivalent (eg, about 0.01 to 100 times, preferably about 0.1 to 10 times, more preferably 0.5 to 2 times). Quantitative factors such as the degree of activity and the molecular weight of the protein may be different.
  • PGC-1 ⁇ generally means a PGC-1 ⁇ protein, but it may mean a PGC-1 ⁇ gene depending on the context.
  • the present invention provides a preventive or therapeutic agent for diabetes containing Nrf1 inhibitor.
  • the present invention also provides a method for preventing or treating diabetes, comprising administering a therapeutically effective amount of an Nrf1 inhibitor to a subject in need of prevention or treatment of diabetes.
  • the preventive or therapeutic agent comprising the Nrf1 inhibitor of the present invention is characterized by having an insulin resistance improving action.
  • the preventive or therapeutic agent comprising the Nrf1 inhibitor of the present invention is characterized by having both an insulin resistance improving action and a ⁇ cell protecting action.
  • Nrf1 is a strong metabolic regulator by analysis of mice genetically overexpressing Nrf1, and found that mice develop diabetes due to overexpression of Nrf1.
  • analysis of diabetic model mice and the like that genetically suppressed Nrf1 expression revealed that suppression of Nrf1 resulted in improved glucose metabolism, and found that the onset of diabetes was suppressed.
  • the present invention provides an Nrf1 inhibitor as an insulin resistance improving agent.
  • a pharmaceutical composition containing an Nrf1 inhibitor is used as a pharmaceutical composition for improving insulin resistance.
  • an Nrf1 inhibitor is used in the production of a pharmaceutical composition for improving insulin resistance.
  • the present invention provides a method for improving insulin resistance comprising administering to a subject in need of improvement of insulin resistance a therapeutically effective amount of an Nrfl inhibitor.
  • the improvement in insulin resistance can be confirmed by, for example, a decrease in blood glucose level and a decrease in HOMA-IR in an insulin resistance test described in Example 1 (method 1.4.) Described later.
  • the present invention provides an Nrf1 inhibitor as a ⁇ -cell protective agent.
  • a pharmaceutical composition containing an Nrf1 inhibitor is used as a pharmaceutical composition for protecting ⁇ cells.
  • an Nrf1 inhibitor is used in the production of a pharmaceutical composition for protecting ⁇ cells.
  • the present invention provides a ⁇ -cell protection method comprising administering to a subject in need of ⁇ -cell protection a therapeutically effective amount of an Nrf1 inhibitor.
  • [Beta] cell protective action refers to inhibiting the decrease in the amount and / or activity of ⁇ cells.
  • the amount of ⁇ -cells can be confirmed by the method described in Example 1 (Method 1.7., Result 2.5.) described later (insulin staining of pancreatic slices) and the like.
  • the activity of ⁇ cells is confirmed, for example, by the method described in Example 1 (Method 1.4.) described later, that sugar-stimulated insulin secretion (GSIS) is maintained.
  • Nrf1 inhibitor or the ⁇ -cell protecting pharmaceutical composition containing the same exerts an effect on suppression of the onset of type 2 diabetes, that is, prevention, when used in the stage of impaired glucose tolerance, which can be said to be a pre-diabetic stage.
  • Nrf1 inhibitor used in the present invention refers to a substance that inhibits Nrf1 activity.
  • Nrf1 activity includes, for example, the above-described transcription promoting activity of Nrf1 target gene, ARE binding activity of Nrf1, Nrf1-Maf heterodimer forming ability and the like.
  • siRNA, shRNA, antisense polynucleotide, peptide, protein, enzyme and the like can be used in addition to a low molecular compound or a high molecular compound.
  • Nrf1 inhibitor refers to a substance having an activity of inhibiting at least one of the Nrf1 activities. Inhibition of Nrf1 activity includes, for example, (1) inhibiting Nrf1 expression, (2) inhibiting Nrf1 translocation from the cytoplasm to the nucleus, (3) inhibiting Nrf1-Maf heterodimer formation, ( 4) Inhibiting the binding of Nrf1 to ARE, and (5) Promoting the transition of Nrf1 from the nucleus to the cytoplasm.
  • “Inhibiting Nrf1 expression” means any event in a series of events (for example, transcription (production of mRNA), translation (production of protein)) from the Nrf1 gene until protein is produced. Inhibiting the expression means inhibiting the production of the protein.
  • “Inhibiting Nrf1 translocation from the cytoplasm to the nucleus” refers to inhibiting Nrf1 degradation by regulating Nrf1 degradation, and inhibiting Nrf1 phosphorylation to inhibit nuclear translocation. And so on.
  • Nrf1-Maf heterodimer formation means inhibiting Nrf1-Maf heterodimer formation by inhibiting Nrf1 translocated into the nucleus from binding to Maf, and Maf homodimer formation. By promoting, it means inhibiting the formation of Nrf1-Maf heterodimer, and the like.
  • Nrf1 transferred into the nucleus inhibits formation of a heterodimer with Maf and inhibits Nrf1 from binding to the ARE sequence
  • Nrf1-Maf It means inhibiting the binding of the heterodimer to the ARE sequence, inhibiting the binding of the Nrf1-Maf heterodimer to the ARE sequence by promoting Maf homodimer formation, and the like.
  • Nrf1 “Promoting the transition of Nrf1 from the nucleus to the cytoplasm” means that Nrf1 that has migrated into the nucleus returns to the cytoplasm, thereby inhibiting Nrf1 from continuing to exert transcription-promoting activity in the nucleus. , Etc.
  • Nrf1 inhibitors specifically include (a) siRNA or shRNA against a polynucleotide encoding Nrf1, (b) an antisense polynucleotide containing a base sequence complementary to or substantially complementary to the base sequence of the polynucleotide encoding Nrf1, or a part thereof, (c) a low molecular weight compound or a high molecular weight compound that inhibits Nrf1 activity, (d) a ribozyme against a polynucleotide encoding Nrf1, (e) a mutant of Nrf1 that acts dominantly negatively on Nrf1 or a polynucleotide encoding the same, and (f) One or two or more substances selected from the group consisting of aptamers to Nrf1.
  • the “low molecular weight compound” means an organic or inorganic substance having a molecular weight of 10,000 or less (preferably a molecular weight of 5,000 or less, more preferably a molecular weight of 2,000 or less, particularly preferably a molecular weight of 700 or less).
  • the “polymer compound” means an organic substance having a molecular weight exceeding 10,000 (preferably a molecular weight of 50,000 or more, more preferably a molecular weight of 100,000 or more).
  • Nrf1 activity can be measured by a known method or a method analogous thereto.
  • the transcription promoting activity of the Nrf1 target gene among the Nrf1 activities is determined by, for example, isolating the promoter region of the target gene of Nrf1 according to a conventional method by observing the transcriptional activation ability of Nrf1, and a reporter gene (for example, Luminescence, fluorescence, chromogenic genes (such as luciferase, GFP, galactosidase, etc.) are linked, and the activity of the reporter gene can be observed for measurement.
  • Nrf1 activity can be taken as an indicator of stabilization of Nrf1 protein.
  • Nrf1 activity can be measured by expressing a fusion protein of Nrf1 and a reporter gene and observing the activity of the reporter gene (for example, Patent Document 1, Example 3 described later, and the like).
  • Nrf1-Maf heterodimer formation ability can be determined by examining the ability of Nrf1 and Maf to form heterodimer, for example, by using Biacore or ELISA as described in the method of Example 2 described later. It can be measured by an assay system that evaluates the interaction.
  • ITC isothermal titration calorimetry
  • DELFIA dissociation enhanced lanthanide fluorescence immunoassay
  • APHA chemically amplified luminescence proximity homogeneous assay
  • SPA scintillation proximity assay
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • TR-FRET fluorescence resonance energy transfer
  • FP fluorescence polarization
  • EFC enzyme fragment complementation
  • the ARE binding activity of Nrf1 can be measured by observing the binding of Nrf1 to ARE by a ChIP assay or the like.
  • the measurement by ChIP assay can be performed by a known method or a method analogous thereto (for example, Cell Vol.103 pp843-852 (2000)).
  • it can be measured by an assay system that evaluates the binding of the Nrf1-MafG heterodimer to the ARE sequence by Biacore or ELISA, as in the method of Example 2 described later.
  • ITC isothermal titration calorimetry
  • DELFIA dissociation enhanced lanthanide fluorescence immunoassay
  • APHA chemically amplified luminescence proximity homogeneous assay
  • SPA scintillation proximity assay
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • TR-FRET fluorescence resonance energy transfer
  • FP fluorescence polarization
  • EFC enzyme fragment complementation
  • siRNA or shRNA against a polynucleotide encoding Nrf1 Double-stranded RNA that has RNAi action on the Nrf1-encoding polynucleotide has low toxicity and suppresses translation of the Nrf1-encoding gene And can suppress the expression of Nrf1, and therefore can be suitably used as a substance that inhibits the expression of Nrf1.
  • double-stranded RNA having RNAi action on a polynucleotide encoding Nrf double-stranded RNA containing a part of RNA encoding Nrf1 (eg, siRNA for a polynucleotide encoding Nrf1) (Small (short) interfering RNA), shRNA (small (short) hairpin RNA) and the like.
  • Such double-stranded RNA can be obtained by known methods (eg, Nature, 411, 494, 2001; Special Tables 2002-516062; U.S. Patent Application Publication No. 2002/086356; Nature Genetics, 24 Volume, 180-183, 2000; Genesis, 26, 240-244, 2000; Nature, 407, 319-320, 2002; Genes & Dev., 16, 948-958, 2002 Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 99, 5515-5520, 2002; Science, 296, 550-553, 2002; Proc. Natl. Acad. Sci.
  • the length of the double-stranded RNA having RNAi action used in the present invention is usually 17 to 30 bases, preferably 19 to 27 bases, more preferably 20 to 22 bases.
  • dTdT may be added to each C-terminus of the sense strand and antisense strand of siRNA.
  • it may have an overhang arrangement suitable from a functional viewpoint with reference to known information.
  • siRNA that is an Nrf1 inhibitor examples include Nrf1 siRNA described in Example 3 (Mol. Cell. Biol., 31, 4500-4512, 2011) described later. Further, as known siRNA, for example, “Nrf1 siRNA (h): sc-43575 (Santa Cruz)”, “Nrf1 siRNA (m): sc-43576 (Santa Cruz)” (J. Biol. Chem., 282, 22052-22061 (2007), “NFE2L1 Trilencer-27 Human siRNA: SR303155 (OriGene)”, “Nfe2l1 Trilencer-27 Mouse siRNA: SR419737 (OriGene)”.
  • Known shRNAs include, for example, ⁇ Nrf1 shRNA Plasmid (h): sc-43575-SH (Santa Cruz) '', ⁇ Nrf1 shRNA Plasmid (m): sc-43576-SH (Santa Cruz) '', ⁇ NFE2L1 Human shRNA: TR311195 (OriGene) ”and“ NFE2L1 Mouse shRNA: TR501459 (OriGene) ”.
  • an antisense polynucleotide containing a nucleotide sequence complementary to or substantially complementary to the nucleotide sequence of a polynucleotide encoding Nrf1 or a part thereof, preferably a polynucleotide (preferably DNA) encoding Nrf1 (hereinafter referred to as an anti-antibody)
  • these DNAs have a base sequence complementary to or substantially complementary to the base sequence of “sometimes abbreviated as“ DNA used in the present invention ”” or a part thereof.
  • the antisense polynucleotide has a base sequence complementary to or substantially complementary to the base sequence of the DNA used in the present invention or a part thereof, and has an action capable of suppressing the expression of the DNA. As long as it is any antisense polynucleotide, antisense DNA is preferred.
  • the base sequence substantially complementary to the DNA used in the present invention is, for example, the entire base sequence of the base sequence complementary to the DNA used in the present invention (that is, the complementary strand of the DNA used in the present invention) or Examples include base sequences having homology of about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more with a partial base sequence.
  • the nucleotide sequence of the portion encoding the N-terminal site of Nrf1 for example, the start codon
  • an antisense polynucleotide directed to RNA degradation by RNaseH it is about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90%, with the complementary strand of the entire base sequence of DNA used in the present invention including introns.
  • Each of the antisense polynucleotides having a homology of at least%, most preferably at least about 95% is preferred.
  • the antisense polynucleotide is usually composed of 10 to 40 bases, preferably 15 to 30 bases.
  • phosphate residues (phosphates) of each nucleotide that constitutes antisense DNA are converted to chemically modified phosphate residues such as phosphorothioate, methylphosphonate, and phosphorodithionate. May be substituted.
  • the sugar (deoxyribose) of each nucleotide may be substituted with a chemically modified sugar structure such as 2′-O-methylation, and the base part (pyrimidine, purine) is also chemically modified. Any one may be used as long as it hybridizes to the DNA used in the present invention.
  • These antisense polynucleotides can be produced using a known DNA synthesizer or the like.
  • the antisense polynucleotide of the present invention may be altered or contain modified sugars, bases and bonds, and may be provided in special forms such as liposomes, microspheres, or applied by gene therapy. Can be provided in an added form.
  • the additional form includes polycationic substances such as polylysine that acts to neutralize the charge of the phosphate group skeleton, lipids that enhance interaction with cell membranes and increase nucleic acid uptake ( Examples include hydrophobic ones such as phospholipid and cholesterol.
  • Preferred lipids for addition include cholesterol and derivatives thereof (eg, cholesteryl chloroformate, cholic acid, etc.).
  • nucleic acids can be attached via bases, sugars, intramolecular nucleoside linkages.
  • examples of the other group include a cap group specifically arranged at the 3 'end or 5' end of a nucleic acid, which prevents degradation by nucleases such as exonuclease and RNase.
  • capping groups include, but are not limited to, hydroxyl protecting groups known in the art, including glycols such as polyethylene glycol and tetraethylene glycol.
  • the compound (including salt form) that inhibits Nrf1 activity is not particularly limited as long as it can inhibit Nrf1 activity as described above. , (1) a compound that inhibits Nrf1 expression, (2) a compound that inhibits Nrf1 translocation from the cytoplasm to the nucleus, (3) a compound that inhibits Nrf1-Maf heterodimer formation, (4) Nrf1 to ARE Compounds that inhibit binding, and (5) compounds that promote the transition of Nrf1 from the nucleus to the cytoplasm.
  • the compound that inhibits the expression of Nrf1 is not particularly limited as long as it can inhibit the expression of Nrf1, but, for example, (i) an mRNA encoding Nrf1 from a gene (DNA) encoding Nrf1 And (ii) a compound that inhibits the translation of mRNA encoding Nrf1 into Nrf1. (i) Any compound that inhibits transcription from Nrf1-encoding gene (DNA) to Nrf1-encoding mRNA may be used as long as it inhibits transcription from Nrf1-encoding gene (DNA) to mRNA. For example, a compound that binds to a factor involved in transcription from a gene (DNA) encoding Nrf1 to mRNA and inhibits transcription can be mentioned.
  • the compound that inhibits the translation of Nrf1-encoding mRNA into Nrf1 is not particularly limited as long as it inhibits the translation of Nrf1-encoding mRNA into Nrf1, but for example, encodes Nrf1 Examples thereof include compounds that bind to factors involved in translation from mRNA to Nrf1 and inhibit translation.
  • the compound that inhibits the transfer of Nrf1 from the cytoplasm to the nucleus is not particularly limited as long as it can inhibit the transfer of Nrf1 from the cytoplasm to the nucleus, but for example, (i) degradation of Nrf1 And (ii) compounds that change the phosphorylation state of Nrf1. (i) The compound that regulates Nrf1 degradation is not particularly limited as long as it inhibits the transfer to the nucleus by regulating Nrf1 degradation. And compounds that act and promote the decomposition of Nrf1.
  • the compound that changes the phosphorylation state of Nrf1 is not particularly limited as long as it inhibits translocation to the nucleus by changing the phosphorylation state of Nrf1, but for example, phosphorylation of Nrf1 Examples include compounds that act on the factors involved and change the phosphorylation state of Nrf1.
  • Nrf1-Maf heterodimer formation is not particularly limited as long as it can inhibit Nrf1-Maf heterodimer formation.
  • Nrf1 binds to Maf.
  • compounds that inhibit (ii) compounds that inhibit Nrf1-Maf heterodimer formation by promoting Maf homodimer formation, and the like.
  • the compound that inhibits the binding of Nrf1 to Maf is not particularly limited as long as it inhibits the binding of Nrf1 to Maf.For example, it binds to the binding region of Nrf1 and Maf, Examples thereof include compounds that inhibit Nrf1 from binding to Maf, and compounds that cause Nrf1 structural change by binding to Nrf1 and inhibit Nrf1 from binding to Maf.
  • a compound that inhibits Nrf1-Maf heterodimer formation by promoting Maf homodimer formation is not particularly limited as long as it inhibits Nrf1-Maf heterodimer formation by promoting Maf homodimer formation. However, for example, compounds that promote the formation of Maf homodimer by increasing the expression of Maf can be mentioned.
  • the compound that inhibits the binding of Nrf1 to ARE is not particularly limited as long as it can inhibit the binding of Nrf1 to ARE.
  • Nrf1-Maf heterodimer formation is inhibited.
  • a compound that inhibits Nrf1-Maf heterodimer from binding to the ARE sequence (iii) a compound that promotes the formation of Maf homodimer, and the like.
  • Examples of (i) a compound that inhibits Nrf1-Maf heterodimer formation include (3) the compound that inhibits Nrf1-Maf heterodimer formation.
  • the compound that inhibits the binding of the Nrf1-Maf heterodimer to the ARE sequence is not particularly limited as long as it inhibits the binding of the Nrf1-Maf heterodimer to the ARE sequence.
  • the compound that promotes the formation of Maf homodimer is not particularly limited as long as it promotes the formation of Maf homodimer, and examples thereof include compounds that promote the formation of Maf homodimer by increasing the expression of Maf. It is done.
  • the compound that promotes the transfer of Nrf1 from the nucleus to the cytoplasm is not particularly limited as long as it can promote the transfer of Nrf1 from the nucleus to the cytoplasm, but for example, (i) degradation of Nrf1 And (ii) compounds that change the phosphorylation state of Nrf1. (i) The compound that regulates the degradation of Nrf1 is not particularly limited as long as it promotes the transition to the cytoplasm by regulating the degradation of Nrf1, but for example, it is a factor involved in the regulation of Nrf1 degradation. And compounds that act and promote the decomposition of Nrf1.
  • the compound that changes the phosphorylation state of Nrf1 is not particularly limited as long as it promotes the transition to the cytoplasm by changing the phosphorylation state of Nrf1, but for example, phosphorylation of Nrf1 Examples include compounds that act on the factors involved and change the phosphorylation state of Nrf1.
  • Ribozyme against a polynucleotide encoding Nrf1 A polynucleotide having ribozyme activity against a polynucleotide encoding Nrf1 can suppress the expression of Nrf1, and therefore is preferably used as a substance that inhibits the expression of Nrf1. can do.
  • Such ribozymes can be obtained by known methods (eg, TRENDS in Molecular Medicine, 7, 221, 2001; FEBS Lett., 228, 228, 1988; FEBS Lett., 239, 285, 1988). Nucl. Acids. Res., 17, 7059, 1989; Nature, 323, 349, 1986; Nucl. Acids. Res., 19, 6751, 1991; Protein Eng.
  • RNA encoding Nrf1 examples include a portion (RNA fragment) adjacent to the cleavage site on the RNA encoding Nrf1 that can be cleaved by a known ribozyme.
  • the ribozymes include large ribozymes such as M1 RNA contained in Group I introns and RNaseP, and small ribozymes such as hammerhead and hairpin types (Protein Nucleic Acid Enzyme, 35, 2191, 1990).
  • hammerhead ribozymes include FEBS Lett., 228, 228, 1988; FEBS Lett., 239, 285, 1988; Protein Nucleic Acid Enzyme, 35, 2191, 1990; Nucl. Acids Res., 17, 7059, 1989, etc. can be referred to.
  • hairpin ribozymes see, for example, Nature, 323, 349, 1986; Nucl. Acids Res., 19, 6751, 1991; Chemistry and Biology, 30, 112, 1992, etc. You can refer to it.
  • Nrf1 mutants acting on dominant negative against Nrf1 or polynucleotides encoding the same Nrf1 mutants acting on dominant negative against Nrf1 or polynucleotides encoding the same inhibit Nrf1 activity Therefore, it can be suitably used as a substance that inhibits Nrf1 activity.
  • the term “mutant of a protein that acts dominantly negatively on Nrf1” means a protein having an action of inhibiting (disappearing or reducing) Nrf1 activity by its expression (Yoshikazu Multiratio) (See Seiko, Gene Function Inhibition Experiments, Yodosha, pp. 26-32, 2001).
  • aptamer against Nrf1 can inhibit Nrf1 activity and function, and therefore can be suitably used as a substance that inhibits Nrf1 activity.
  • Aptamers are obtained using a known method, for example, the SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment) method (Annual Review of Medicine 56, 555-583, 2005).
  • the structure of an aptamer can be determined using a known method, and an aptamer is produced according to a known method based on the structure.
  • a medicament comprising the above-mentioned Nrf1 inhibitor is used as a prophylactic or therapeutic agent for diabetes.
  • a medicament comprising the above-described Nrf1 inhibitor is used for a method for preventing or treating diabetes. Since the medicament of the present invention has a preventive or therapeutic effect on diabetes, it may be applied to a subject of diabetes (type 1 diabetes, type 2 diabetes, gestational diabetes, etc.) for treatment purposes, and considering prevention or recurrence of diabetes. It can also be applied for preventive purposes to those who must. Preferably applied for therapeutic purposes.
  • the “subject” is a human, non-human mammal (eg, rat, mouse, hamster, rabbit, sheep, pig, cow, cat, dog and monkey), and preferably a human.
  • glucose level glucose concentration in venous plasma
  • 75 g oral glucose tolerance test 75 gOGTT 2 hour value (venous plasma)
  • Glucose concentration at 200 mg / dl or higher Glucose concentration at any time is 200 mg / dl or higher.
  • the at least one symptom of diabetes can be prevented or treated by the preventive or therapeutic agent of the present invention and the preventive or therapeutic method of the present invention (“the preventive or therapeutic agent of the present invention”).
  • an Nrf1 inhibitor can be formulated according to conventional means and used as a pharmaceutical composition for preventing or treating diabetes.
  • an Nrf1 inhibitor can be formulated according to conventional means and used for a method for preventing or treating diabetes.
  • compositions for oral administration include solid or liquid dosage forms, specifically tablets (including dragees and film-coated tablets), pills, granules, powders, capsules (including soft capsules). Syrup, emulsion, suspension and the like.
  • Such a composition is produced by a method known per se, and contains a carrier, diluent or excipient usually used in the pharmaceutical field.
  • a carrier diluent or excipient usually used in the pharmaceutical field.
  • lactose, starch, sucrose, magnesium stearate and the like are used as carriers and excipients for tablets.
  • injections for example, injections, suppositories and the like are used, and injections are intravenous injections, subcutaneous injections, intradermal injections, intramuscular injections, intravenous injections, intraarticular injections. Includes dosage forms such as agents.
  • Such an injection is prepared according to a method known per se, for example, by dissolving, suspending or emulsifying the active ingredient in a sterile aqueous or oily liquid usually used for injections.
  • aqueous solution for injection for example, isotonic solutions containing physiological saline, glucose and other adjuvants are used, and suitable solubilizers such as alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, Propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactants (eg, polysorbate 80, HCO-50 (polyoxyethylene (50 mol) adduct of hydrogenated castor oil)) and the like may be used in combination.
  • alcohol eg, ethanol
  • polyalcohol eg, Propylene glycol, polyethylene glycol
  • nonionic surfactants eg, polysorbate 80, HCO-50 (polyoxyethylene (50 mol) adduct of hydrogenated castor oil)
  • oily liquid for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and benzyl benzoate, benzyl alcohol and the like may be used in combination as a solubilizing agent.
  • the prepared injection solution is usually filled in a suitable amp
  • compositions may contain other active ingredients (for example, other antidiabetic agents, etc.) as long as an undesirable interaction is not caused by blending with the above active ingredients. Moreover, you may use together with another active ingredient (for example, other antidiabetic agents etc.).
  • active ingredients for example, other antidiabetic agents, etc.
  • the dose of the active ingredient varies depending on its action, target disease, administration subject, symptom, administration route, etc., but for example, when administered orally, generally in adults (weight 60 kg)
  • the active ingredient is administered at about 0.1-100 mg, preferably about 1.0-50 mg, more preferably about 1.0-20 mg per day.
  • the dosage of the active ingredient varies depending on the target disease, administration subject, symptom, administration route, etc., but when administered in the form of an injection, it is generally an adult (with a body weight of 60 kg).
  • the antisense polynucleotide can be formulated and administered according to a method known per se.
  • an appropriate vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adenovirus associated virus vector, etc., a human or non-human mammal (eg, Rats, mice, hamsters, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, etc.) orally or parenterally.
  • the antisense polynucleotide can be formulated as it is or with a physiologically recognized carrier such as an adjuvant for promoting intake, and can be administered by a gene gun or a catheter such as a hydrogel catheter. Alternatively, it can be aerosolized and locally administered into the trachea as an inhalant. Furthermore, for the purpose of improving pharmacokinetics, prolonging the half-life, and improving cellular uptake efficiency, the above-mentioned antisense polynucleotides are formulated (injection) alone or with a carrier such as liposome, and are administered intravenously, subcutaneously, joint space Of these, it may be administered to cancerous lesions.
  • a physiologically recognized carrier such as an adjuvant for promoting intake
  • RNA, ribozyme, mutant of the protein used in the present invention that acts dominant negatively on the protein used in the present invention or a polynucleotide encoding the same are the same as the above antisense polynucleotide.
  • the above antibodies, aptamers and the like can be administered per se or as an appropriate pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition used for the administration comprises the antibody or a salt thereof and a pharmacologically acceptable carrier, diluent or excipient.
  • Such compositions are provided as dosage forms suitable for oral or parenteral administration (eg, intravenous injection). Preferably it is provided as an inhalant.
  • Screening method for preventive or therapeutic agent for diabetes provides a method for screening the preventive or therapeutic agent for diabetes described above using inhibition of Nrf1 activity as an index.
  • the screening method of the present invention is a method comprising evaluating the inhibition of Nrf1 activity by a test compound and selecting a compound that inhibits Nrf1 activity.
  • the compound that inhibits Nrf1 activity selected by the screening method of the present invention is a candidate compound for the preventive or therapeutic agent for diabetes described in the present specification.
  • test compound examples include peptides, proteins, antibodies, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, plasma and the like, and these compounds are novel.
  • a compound may be sufficient and a well-known compound may be sufficient.
  • the test compound may form a salt, and as the salt of the test compound, physiologically acceptable metal salts, ammonium salts, salts with organic bases, salts with inorganic acids, salts with organic acids, bases And salts with acidic or acidic amino acids.
  • the metal salt include alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt; alkaline earth metal salts such as calcium salt, magnesium salt and barium salt; aluminum salt and the like.
  • Preferable examples of the salt with an organic base include, for example, trimethylamine, triethylamine, pyridine, picoline, 2,6-lutidine, ethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, cyclohexylamine, dicyclohexylamine, N, N′-dibenzylethylenediamine. And the like.
  • Preferable examples of the salt with inorganic acid include salts with hydrochloric acid, hydrobromic acid, nitric acid, sulfuric acid, phosphoric acid and the like.
  • salts with organic acids include formic acid, acetic acid, trifluoroacetic acid, propionic acid, phthalic acid, fumaric acid, oxalic acid, tartaric acid, maleic acid, citric acid, succinic acid, malic acid, methanesulfonic acid And salts with benzoic acid, benzenesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid and the like.
  • salts with basic amino acids include salts with arginine, lysine, ornithine and the like
  • salts with acidic amino acids include salts with aspartic acid and glutamic acid, for example. It is done.
  • Nrf1 a method for screening an agent for preventing or treating diabetes, which comprises using Nrf1.
  • a method for screening for a prophylactic or therapeutic agent for diabetes comprising using Nrf1 to select a compound that inhibits Nrf1 activity.
  • Nrf1 the amount of binding between Nrf1 and MafG when Nrf1 and MafG are contacted in the presence of the test compound is measured, and (ii) Nrf1 is not present in the absence of the test compound.
  • the amount of binding between Nrf1 and MafG when MafG is brought into contact is measured, and the amount of binding between Nrf1 and MafG is compared between (iii) and (ii). Then, a test compound in which the binding amount between Nrf1 and MafG in the case (i) is lower than the binding amount between Nrf1 and MafG in the case (ii) is selected as a compound that inhibits Nrf1 activity.
  • Contact means that Nrf1 and MafG are present in the same culture system or reaction system.
  • Culture conditions or reaction conditions can be performed under conditions that are usually used or conditions similar thereto.
  • the amount of binding can be measured by a known method or a method analogous thereto.
  • SPR surface plasmon resonance
  • ITC isothermal titration calorimetry
  • TRF time-resolved fluorescence
  • DELFIA DELFIA
  • ELISA ELISA
  • FCS fluorescence correlation spectroscopy
  • FCCS fluorescence cross correlation spectroscopy
  • APHA chemically amplified luminescence proximity homogenous assay
  • SPA scintillation proximity assay
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • LANCE LANCE
  • the amount of binding can be measured using homogeneous assays such as time-resolved fluorescence resonance energy transfer (TR-FRET), fluorescence polarization (FP) or enzyme fragment complementation (EFC).
  • TR-FRET time-resolved fluorescence resonance energy transfer
  • FP fluorescence polarization
  • EFC enzyme fragment complementation
  • HTS High-throughput screening
  • the amount of binding is measured, for example, by immobilizing Nrf1 on a sensor chip and using MafG as an analyte.
  • the amount of binding may be measured, for example, by immobilizing MafG on a sensor chip and using Nrf1 as an analyte.
  • the amount of binding is measured by, for example, immobilizing Nrf1 on the bottom of a multi-well plate, adding MafG thereto, washing the well, and then using an antibody against MafG, using MafG against Nrf1 on the bottom of the well. This is done by confirming the binding of Alternatively, the amount of binding can be measured by, for example, immobilizing MafG on the bottom of a multi-well plate, adding Nrf1 to it, washing the well, and then confirming the binding of Nrf1 to MafG on the bottom of the well using an antibody against Nrf1 It may be done by doing.
  • the binding amount of Nrf1 and MafG in the case of (i) is 10% or more, 20% or more, 30% than the binding amount of Nrf1 and MafG in the case of (ii) (100%).
  • the test compound that decreases by 40% or more or 50% or more is selected as a compound that inhibits Nrf1 activity.
  • Nrf1 and MafG when contacting Nrf1 and MafG with an ARE sequence in an intron of Lipin1 and / or PGC-1 ⁇ in the presence of a test compound, (Ii) Measure the amount of Nrf1 and MafG binding to the ARE sequence when Nrf1 and MafG are contacted with the ARE sequence in the absence of the test compound; (iii) The amount of binding between Nrf1 and MafG and the ARE sequence in the cases (i) and (ii) is compared.
  • a test compound in which the amount of binding between Nrf1 and MafG and the ARE sequence in the case of (i) is lower than the amount of binding between Nrf1 and MafG and the ARE sequence in the case of (ii) is a test compound having Nrf1 activity. Select as a compound to inhibit.
  • Contact means that Nrf1, MafG and ARE sequences are present in the same culture system or reaction system.
  • Culture conditions or reaction conditions can be performed under conditions that are usually used or conditions similar thereto.
  • the ARE sequence in the intron of Lipin1 and / or PGC-1 ⁇ is preferably a base sequence described in the Examples below.
  • the amount of binding can be measured by a known method or a method equivalent thereto.
  • SPR surface plasmon resonance
  • ITC isothermal titration calorimetry
  • TRF time-resolved fluorescence
  • FCS fluorescence correlation spectroscopy
  • FCCS fluorescence cross correlation spectroscopy
  • APHA chemically amplified luminescence proximity homogenous assay
  • SPA scintillation proximity assay
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • the amount of binding can be measured using homogeneous assays such as time-resolved fluorescence resonance energy transfer (TR-FRET), fluorescence polarization (FP) or enzyme fragment complementation (EFC). High-throughput screening (HTS) can be performed using these binding amount measurement techniques.
  • TR-FRET time-resolved fluorescence resonance energy transfer
  • FP fluorescence polarization
  • EFC enzyme fragment complementation
  • the amount of binding is measured by, for example, immobilizing an ARE sequence on a sensor chip and mixing Nrf1 and MafG as an analyte in equal amounts.
  • the amount of binding is measured by, for example, immobilizing an ARE sequence on the bottom of a multiwell plate, adding Nrf1 and MafG in an equal amount thereto, washing the well, and then antibody against Nrf1 or MafG. Is used to confirm the binding of the Nrf1-MafG heterodimer to the ARE sequence on the bottom surface of the well.
  • the amount of binding between Nrf1 and MafG and the ARE sequence in the case of (i) is 10% or more and 20% from the amount of binding between Nrf1 and MafG and the ARE sequence in the case of (ii) (100%).
  • a test compound that decreases by 30% or more, 40% or more, or 50% or more is selected as a compound that inhibits Nrf1 activity.
  • the compound that inhibits Nrf1 activity thus selected can be a candidate compound for a prophylactic or therapeutic agent for diabetes.
  • the method of screening for a compound that inhibits Nrf1 activity as described above is a method of screening for a compound that inhibits the ability to form Nrf1-MafG heterodimer or a compound that inhibits the ARE binding activity of Nrf1,
  • This is a screening method based on the function as a transcription factor.
  • Nrf1 inhibitor can be easily screened by such a screening method, and the present invention also provides such a method.
  • the method for screening a compound that inhibits the ability to form Nrf1-MafG heterodimer can be a more specific screening method that can be differentiated from other transcription factors that bind to ARE.
  • Nrf1-labeled fusion protein-expressing cells there is provided a method for screening a prophylactic or therapeutic agent for diabetes, comprising using Nrf1-labeled fusion protein-expressing cells.
  • a method for screening an agent for preventing or treating diabetes which comprises using a Nrf1-labeled fusion protein-expressing cell to select a compound that inhibits Nrf1 activity.
  • the amount of Nrf1-labeled fusion protein in the cell when not in contact with the cell is measured, and (iii) the amount of Nrf1-labeled fusion protein in the cases (i) and (ii) is compared.
  • a test compound in which the amount of Nrf1-labeled fusion protein in the case (i) is lower than the amount of Nrf1-labeled fusion protein in the case (ii) is selected as a compound that inhibits Nrf1 activity.
  • Contact means that the test compound and Nrf1-labeled fusion protein-expressing cells are present in the same culture system. Culture conditions can be performed under conditions that are usually used or conditions similar thereto.
  • Nrf1-labeled fusion protein refers to a fusion protein of Nrf1 and a labeled protein (eg, luminescent, fluorescent, chromogenic protein such as luciferase, GFP, galactosidase, etc.). Nrf1 in the fusion protein is preferably one lacking the CNC-bZip domain.
  • a labeled protein eg, luminescent, fluorescent, chromogenic protein such as luciferase, GFP, galactosidase, etc.
  • Nrf1-labeled fusion protein-expressing cells first, a test compound is brought into contact with Nrf1-labeled fusion protein-expressing cells.
  • the cells to be used are not particularly limited, but mammal-derived cells are preferable, and hepatocytes, liver cancer-derived cell lines, and the like are preferable.
  • the “Nrf1-labeled fusion protein cell” used in the screening method of the present invention can be prepared by a general genetic engineering technique.
  • the amount of Nrf1-labeled fusion protein is measured.
  • the cells are cultured, and the amount of Nrf1-labeled fusion protein in each case is measured.
  • the amount of Nrf1-labeled fusion protein can be measured by a known method or a method analogous thereto.
  • the activity of a labeled protein of the fusion protein is measured.
  • a compound that reduces the amount of Nrf1-labeled fusion protein is selected compared to the case where the test compound is not contacted (control).
  • a compound that decreases by 30% or more, 40% or more, or 50% or more is selected as a compound that inhibits Nrf1 activity.
  • the compound that inhibits Nrf1 activity thus selected can be a candidate compound for a prophylactic or therapeutic agent for diabetes.
  • a compound that inhibits the selected Nrf1 activity is administered to a non-human experimental animal (mouse, rat, etc.), and the compound that inhibits the selected Nrf1 activity is administered. Confirm anti-diabetic effect. Then, a compound that has been confirmed to have an antidiabetic effect is selected as a candidate compound for a prophylactic or therapeutic agent for diabetes.
  • the non-human experimental animal is preferably a diabetes model non-human experimental animal (for example, a diabetes model mouse). Diabetes model non-human experimental animals can be prepared or obtained by a known method or a method analogous thereto.
  • an index value of a substance having a correlation with a target disease in a non-human experimental animal contacted with a compound that inhibits Nrf1 activity is measured,
  • a candidate compound for the prevention or treatment of diabetes can be screened by confirming whether to diminish or eliminate the symptoms of diabetes based on the comparison result compared to the control.
  • a control is, for example, a non-human experimental animal that is not contacted with a compound that inhibits Nrf1 activity.
  • Examples of the contact method include administration, more specifically oral administration, intravenous injection, application, subcutaneous administration, intradermal administration, intraperitoneal administration, etc., depending on the symptoms of the non-human animal, the nature of the test compound, etc. In addition, it can be appropriately selected.
  • the dosage of the test compound can be appropriately selected according to the administration method, the properties of the test compound, and the like.
  • the blood glucose level of a non-human experimental animal contacted with a compound that inhibits Nrf1 activity is measured, and the measured blood glucose level is higher than the blood glucose level in a non-human experimental animal that does not contact a compound that inhibits Nrf1 activity.
  • the compound can be selected as a candidate compound for a prophylactic or therapeutic agent for diabetes.
  • the blood glucose level and plasma insulin concentration of a non-human experimental animal contacted with a compound that inhibits Nrf1 activity are measured, and the measured blood glucose level and plasma insulin concentration contact the compound that inhibits Nrf1 activity.
  • the compound can be selected as a candidate compound for a prophylactic or therapeutic agent for diabetes having an insulin resistance improving action.
  • a compound in which a certain amount of insulin is intraperitoneally administered to a non-human experimental animal contacted with a compound that inhibits Nrf1 activity, blood glucose level is measured after a certain time, and the measured blood glucose level inhibits Nrf1 activity can be selected as a candidate compound for a prophylactic or therapeutic agent for diabetes having an action to improve insulin resistance.
  • the jugular vein of a non-human experimental animal contacted with a compound that inhibits Nrf1 activity is cannulated, and a constant amount of insulin is continuously infused, and a glucose solution is continuously infused so that the blood glucose level is kept constant.
  • the compound When the measured infusion rate of the glucose solution is higher than the infusion rate in a non-human experimental animal not in contact with a compound that inhibits Nrf1 activity, the compound is used as a prophylactic or therapeutic agent for diabetes having an action to improve insulin resistance. Can be selected as a candidate compound.
  • the insulin positive area of the pancreatic islet in a pancreatic tissue section of a non-human experimental animal contacted with a compound that inhibits Nrf1 activity is measured, and the measured insulin positive area does not contact a compound that inhibits Nrf1 activity
  • the compound can be selected as a candidate compound for a prophylactic or therapeutic agent for diabetes having a ⁇ -cell protective action.
  • the ratio of TUNEL staining positive cells in pancreatic islets in a pancreatic tissue section of a non-human experimental animal contacted with a compound that inhibits Nrf1 activity is measured, and the ratio of the measured TUNEL staining positive cells inhibits Nrf1 activity Can be selected as a candidate compound for the prevention or treatment of diabetes having a ⁇ -cell protective action.
  • the blood glucose level, plasma insulin concentration, and insulin positive area of the islet in the pancreatic tissue section of a non-human experimental animal contacted with a compound that inhibits Nrf1 activity are measured, and the measured blood glucose level and plasma insulin are measured.
  • the compound can be selected as a candidate compound for a prophylactic or therapeutic agent for diabetes having an insulin resistance improving action and a ⁇ -cell protecting action.
  • any one of the above-mentioned methods for selecting as a candidate compound for the prevention or treatment of diabetes having an insulin resistance-improving action, and the selection as a candidate compound for the prevention or treatment of diabetes having the aforementioned ⁇ -cell protective action A compound selected by combining any of the methods described above can be selected as a candidate compound for a prophylactic or therapeutic agent for diabetes having an insulin resistance improving action and a ⁇ -cell protecting action.
  • Transgenic non-human animal The present invention relates to a transgenic non-human animal that has at least one copy of a recombinant DNA containing a gene encoding Nrf1 and a MafG regulatory domain and is a diet-induced obesity (DIO) model. provide.
  • DIO diet-induced obesity
  • Recombinant DNA containing a gene encoding Nrf1 and a MafG regulatory domain can be prepared, for example, by the method described in Examples below or a method analogous thereto.
  • the transgenic non-human animal of the present invention possesses at least 1 copy, preferably 1 to 5 copies, more preferably 4 copies of this recombinant DNA.
  • the transgenic non-human animal of the present invention can be obtained by introducing the recombinant DNA into the genome of a non-human animal using a gene recombination technique.
  • the non-human animals used in the present invention are experimental animals such as mice and rats, preferably mice.
  • a transgenic non-human animal can be produced by using a standard method, for example, a microinjection method using an initial fertilized egg, or an introduction method using ES cells.
  • the transgene can be confirmed by a known method or a method analogous thereto.
  • the “diet-induced obesity (DIO) model” is a non-human animal that has induced obesity by giving a high-fat diet or a high-fat and high-sucrose diet for a certain period of time.
  • the transgenic non-human animal of a preferred embodiment of the present invention induces insulin resistance and develops diabetes, it can be used as a diabetes model.
  • the present invention provides a method for screening a prophylactic or therapeutic agent for diabetes, which comprises contacting a test compound with a transgenic non-human animal that has developed diabetes.
  • an index value for example, blood glucose level, or insulin concentration in blood or other tissues
  • a candidate compound for a prophylactic or therapeutic agent for diabetes can be screened.
  • the blood glucose level of a non-human animal contacted with a test compound is measured, and when the measured blood glucose level is lower than the blood glucose level in a transgenic non-human animal that does not contact the test compound, the test The compound can be selected as a candidate compound for the prevention or treatment of diabetes.
  • Examples of the contact method include administration, more specifically oral administration, intravenous injection, application, subcutaneous administration, intradermal administration, intraperitoneal administration, etc., depending on the symptoms of the non-human animal, the nature of the test compound, etc. In addition, it can be appropriately selected.
  • the dosage of the test compound can be appropriately selected according to the administration method, the properties of the test compound, and the like.
  • test compound used can be selected as a candidate compound for the prevention or treatment of diabetes It is.
  • MGRD-Nrf1-FLAG is a cDNA of the mouse Nrf1 amplified by PCR from the MGRD vector (Yamazaki et al., (2012) Mol Cell Biol, 32, 808-816) and the pcDNA3.1 / V5-HisB mNrf1 vector (University of Built by Dundee, professor John Hayes).
  • Nrf1-Tg mice were backcrossed to C57BL / 6J mice, and the mice that were backcrossed for 3 to 4 generations were analyzed.
  • mice were subjected to HFD (HFD-60, 5.06 kcal / g, containing 62.2% calories from fat; OrientalOrYeast) for 10 weeks, starting from 6 weeks of age. All animal experiments were performed in accordance with “Rules on Animal Experiments at Tohoku University”.
  • HFD HFD-60, 5.06 kcal / g, containing 62.2% calories from fat; OrientalOrYeast
  • Plasma insulin levels were measured using a Mouse Insulin ELISA kit (Morinaga Institute of Science, Inc.) according to the manufacturer's instructions.
  • Plasma ⁇ -hydroxybutyric acid levels were measured by using ⁇ -Hydroxybutyrate (Ketone Body) Fluorometric Assay Kit (Cayman) according to the manufacturer's instructions.
  • GTT glucose tolerance test
  • ITT insulin tolerance test
  • Humulin-R Eli-Lilly; 0.75 or 1.5 U per kg of BW
  • mice were treated with human regular insulin (Humulin-R, Eli-Lilly; 1 kg per 1 kg of BW). 5 mU) was continuously infused per minute. Mice were also infused with 50% glucose at varying rates to maintain blood glucose levels at 120 mg / dL. Insulin resistance levels were determined by the glucose infusion rate when the blood glucose level was clamped.
  • RNA purification and mRNA quantification Extraction of total RNA using ISOGEN reagent (Nippon Gene Co., Ltd.) and reverse transcription (RT) reaction using PrimeScript RT Master Mix (Takara Bio Inc.) according to the manufacturer's instructions I went to.
  • the gene expression level was determined by quantitative real-time PCR using qPCR Mastermix (Eurogentec) or THUNDERBIRD qPCR Mix (Toyobo Co., Ltd.) with the ABI 7300 system using the primers described in the appendix.
  • the expression level of Gapdh was measured by qPCR method using Rodent GAPDH Control Reagents kit (Applied Biosystems).
  • the gene expression level was normalized by the gene expression level of Hprt (encoding hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase).
  • CE-TOF / MS analysis A liver sample (about 50 mg) was immersed in 500 ⁇ L of methanol containing methionine sulfone and CSA (50 ⁇ mol / L each) as internal standards. Samples were homogenized twice with Precellys-24 (Bertin Technologies) at 5,000 rpm for 30 seconds each. Then 500 ⁇ L of chloroform and 200 ⁇ L of H 2 O were added. After thoroughly mixing the sample and centrifuging at 2,300 ⁇ g for 5 minutes, the upper aqueous layer was filtered through a 5 kDa filter (Human Metabolome Technologies) to remove the protein. The filtered sample was dried under reduced pressure and the pellet was suspended in 25 ⁇ L H 2 O.
  • Extracted metabolites are measured by CE-TOF / MS (Agilent G7100 Series; Agilent Technologies) system with electrophoresis buffer (Human Metabolome Technologies), and Mass Spectrometer (Agilent G6200 Series TOF; Agilent Technologies) It carried out by. Metabolite content levels were quantified by using MasterHands software produced by Keio University.
  • liver organelle fractionation was performed. Freshly removed liver (approximately 1.0 g) is chopped into small clumps and placed in a glass round bottom homogenizer (Wheaton) with 0.25 mol / L sucrose and Complete-mini protease inhibitor cocktail (EDTA- free; Roche) in 1.5 mL ice cold Tris-HCl buffer (25 mmol / L; PH 8.0) and homogenized for 3-4 strokes. The homogenate was filtered through a 100 ⁇ m cell strainer (BD Falcon) to remove connective tissue.
  • Wheaton glass round bottom homogenizer
  • EDTA- free Complete-mini protease inhibitor cocktail
  • nuclei are removed from the filtered lysate by low speed centrifugation (4 ° C, 1,000 xg for 10 min). Prepared as a pellet. Thereafter, 1,000 ⁇ g supernatant was collected and mitochondria were prepared as pellets by high speed centrifugation (4 ° C., 8,000 ⁇ g for 10 minutes). Finally, 8,000 ⁇ g supernatant was collected and ER protein was collected as a pellet by ultra-high speed centrifugation (4 ° C., 105,000 ⁇ g for 60 minutes). The supernatant fraction was used as cytosolic protein. All organelle pellets were lysed with RIPA buffer. For immunoblot analysis for Akt, whole liver lysates were prepared as previously described (Hirotsu et al., (2012) Mol Cell Biol, 32, 2760-2770).
  • SNP rs3764400 regulates gene expression of NRF1 SNP rs3764400 has been shown to be associated with BMI with P values within 5 ⁇ 10 ⁇ 6 (Speliotes et al., (2010) Nat Genet, 42 , 937-948). Since rs3764400 is present 1.8 kb upstream of the NRF1 gene transcription start site (TSS) (FIG. 1A), it was first determined whether this SNP affects the transcriptional activity of the NRF1 gene.
  • TSS NRF1 gene transcription start site
  • the Luc activity of NRF1-C-luc is greatly increased compared to the Luc activity of NRF1-T-luc, being 2.2-fold in Hep3B cells and 4.0-fold in HepG2 cells ( Figure 1B).
  • rs3764400 associated with obesity is a regulatory SNP of the NRF1 gene and the expression level of the gene from the risk C allele is much higher than the expression level of the gene from the control T allele.
  • Nrf1 transgenic mice Since the risk C allele of rs3764400 increased the transcriptional activity of the NRF1 gene, it was hypothesized that increased Nrf1 expression affects metabolism and induces obesity. In this respect, loss-of-function analysis of Nrf1 does not provide interpretable information, although liver-specific Nrf1 conditioned knockout mice using albumin promoter-driven Cre recombinase exhibit severe liver dysfunction. Therefore, it was decided to create a transgenic mouse strain that overexpresses Nrf1, and to evaluate the contribution of Nrf1 to metabolic regulation through gain-of-function analysis.
  • MafG one of the small Maf (sMaf) proteins, is a key partner molecule for the CNC family of transcription factors and is widely expressed in mouse tissues, so it is a MafG regulatory domain (MGRD) (Yamazaki et al. (2012) Mol Cell Biol, 32, 808-816), Nrf1 tagged with 3XFLAG at the C-terminus was expressed in transgenic mice (FIG. 2A).
  • MGRD MafG regulatory domain
  • Nrf1-Tg Three Nrf1 transgenic (Nrf1-Tg) mouse strains were created that carry one copy (low copy number strain 5) and four copies (high copy number strains 1 and 6) transgene (data) Is not shown).
  • Nrf1 mRNA is expressed in all tissues examined, with the exception of high copy number lines 1 and 6 (high expression line), except in the case of BAT, low copy number line 5 (low expression line). ) Tended to be more advanced (FIG. 2B).
  • Nrf1 protein expression in the liver of Nrf1-Tg mice was also examined.
  • Strain 1 high expressing strain mice were used for this purpose. Immunoblot analysis revealed that Nrf1 is accumulated in much higher amounts in the nuclei of Nrf1-Tg mice than in WT mice (FIG. 2C).
  • Nrf1 protein expression in the cytosol was comparable between WT and Nrf1-Tg mice (FIG. 2C).
  • Nrf1 transgenic mouse strain 6 was crossed with Nrf1 knockout mice (Hirotsu et al., (2012) Mol Cell Biol, 32, 2760-2770).
  • Nrf1 knockout mice showed embryonic lethality
  • transgenic rescue mice (Nrf1 ⁇ / ⁇ :: Nrf1-Tg) were viable and breedable (data not shown).
  • these rescue mice show ALT levels comparable to WT mice ( Figure 2D), which is the result of liver-specific Nrf1 conditioned knockout mice (Hirotsu et al., (2012) Mol Cell Biol, 32, 2760-2770).
  • Nrf1 reduces body weight levels in mice
  • Nrf1-Tg mice fed with a high fat diet (HFD) started at 6 weeks of age and body weight levels were measured over 10 weeks. Feeding with HFD increased the body weight level of WT mice compared to feeding with normal diet (ND). In contrast, the body weight levels of Nrf1-Tg mice (both strains 1 and 6) that received HFD were significantly lower than those of WT mice that received HFD (FIG. 3B). The low copy number line 5 body weight levels were comparable to WT mice in both ND and HFD conditions (data not shown). These data indicate that increasing Nrf1 levels reduce the weight of mice in both ND and HFD conditions.
  • Nrf1 causes diabetes in diet-induced obese model mice
  • Nrf1 improves glucose tolerance in DIO model mice.
  • Fig. 3C blood glucose levels in the two strains of Nrf1-Tg mice increased strongly after feeding with HFD and reached approximately 400 mg / dL (FIG. 3C).
  • Nrf1-Tg mice Blood glucose levels in low copy number Nrf1-Tg mice (strain 5) after 10 weeks of HFD were slightly elevated compared to WT mice (compared to 183 ⁇ 11 mg / dL in WT littermates) , 240 ⁇ 20 in Nrf1-Tg).
  • Nrf1-Tg mice high copy number strains 1 and 6
  • Nrf1 is shown to induce insulin resistance. Therefore, these results demonstrate that increased expression of Nrf1 causes diabetes in DIO model mice.
  • Nrf1 induces insulin resistance in non-obese mice.
  • Nrf1 The effect of induction on glucose metabolism was examined.
  • a normoglycemic hyperinsulin clamp test was performed on Nrf1-Tg mice (high copy number strain 1) that received ND. It should be noted that in the Nrf1-Tg mice, the glucose infusion rate was greatly reduced compared to the WT mice (FIG. 4A, left panel). Clamped glucose levels were comparable between WT and Nrf1-Tg mice (FIG. 4A, right panel). Pancreatic sections revealed that the islets of Nrf1-Tg mice were much larger than those of WT mice (FIG. 4B, upper panel).
  • Nrf1-Tg mice the insulin-positive area quantified in pancreas sections was also increased compared to WT mice ( Figure 4B, lower panel), indicating that systemic insulin resistance was increased in Nrf1-Tg mice. It is suggested that insulin secretion is constitutively activated in response to sex.
  • Nrf1 expression level was evaluated in high copy number Nrf1-Tg mice (lines 1 and 6).
  • both blood glucose levels (FIG. 4C) and plasma insulin levels (FIG. 4D) were elevated compared to WT mice.
  • the blood glucose level in line 5 of the low copy number strain was comparable to the blood glucose level in WT mice, whereas the plasma insulin level in line 5 was clearly compared to the plasma insulin levels in WT mice. Rose.
  • Nrf1-Tg mice lines 1 and 6 were significantly higher than blood glucose levels in WT mice ( Figure 4E).
  • low copy number Nrf1-Tg mice line 5
  • AUC results were consistent with blood glucose results.
  • Nrf1 reduces expression levels of glycolytic genes in the liver
  • Nrf1-induced insulin resistance is the hypothesis that Nrf1 disrupts insulin signaling.
  • Insulin administration increased Akt phosphorylation (Ser-473) in the liver and SkM of WT mice given HFD ( Figure 5A), whereas in Nrf1-Tg mice, both in liver and SkM We found that phosphorylation of Akt worsens.
  • Slc2a2 expression is positively regulated by high glucose (Thorens et al., (1990) Proc Natl Acad Sci USA, 87, 6492-6496; and Asano et al., (1992) Diabetes, 41, 22-25) or negatively regulated by insulin (Postic et al., (1993) Biochem J 293 (Pt 1), 119-124), but in the liver of Nrf1-Tg, Slc2a2 Expression was reduced compared to WT liver (FIG. 5B). Therefore, these data indicate that Nrf1 suppresses the expression of insulin-regulated glycolysis-related genes and glucose transporter genes in the liver.
  • Nrf1-Tg mouse liver despite impaired insulin signaling (FIG. 5C). This indicates that Nrf1 suppresses the expression of gluconeogenesis-related genes regardless of the apparent insulin resistance conditions.
  • Nrf1 inhibits glycolytic pathway influx but increases TCA cycle influx as Nrf1-Tg mice have demonstrated downregulation of expression levels of both glycolysis-related genes and gluconeogenesis-related genes
  • capillary electrophoresis time-of-flight mass spectrometry CE-TOF / MS was used to examine glucose metabolite levels. Since suppression of Slc2a2 and Gck genes is predicted to reduce G6P in the liver of Nrf1-Tg, we first evaluated glucose-6-phosphate (G6P) levels. The results showed that the G6P level was significantly reduced in the liver of Nrf1-Tg mice given HFD compared to the liver of WT mice (FIG. 6A). In addition, fructose-6-phosphate (F6P) levels were also reduced (FIG. 6A). These data indicate that Nrf1 actually suppresses glucose entry into the glycolytic pathway through suppression of Slc2a2 gene expression and Gck gene expression.
  • fructose-1,6-diphosphate (F1,6P) levels were comparable between WT and Nrf1-Tg mice (FIG. 6A).
  • DHAP dihydroxyacetone phosphate
  • 3PG 3-phosphoglycerate
  • 2PG 2-phosphoglycerate
  • Phosphoenolpyruvate (PEP) levels were comparable between WT and Nrf1-Tg mice (FIG. 6A).
  • Nrf1 inhibited glycolytic pathway flux.
  • pyruvate levels are rather increased in the liver of Nrf1-Tg (FIG. 6A), and in the liver of Nrf1-Tg mice given HFD, the lactate level is lower than in the liver of WT mice Was found (FIG. 6B).
  • Nrf1-Tg mice the ratio of lactic acid to pyruvate in the liver was significantly reduced compared to the ratio of lactic acid to pyruvate in the liver of WT mice (FIG. 6B). At present, there is no definitive explanation of how these changes in pyruvate and lactate levels are induced.
  • Nrf1 increases the pyruvate level in the liver
  • the metabolites of the TCA cycle in the liver of Nrf1-Tg were also examined.
  • acetyl coenzyme A (CoA) levels and citrate levels were significantly increased, and isocitrate levels were also increased.
  • succinic acid levels, fumaric acid levels, and malic acid levels did not change significantly (FIG. 6C).
  • Nrf1 regulates ATP production and energy sufficiency In the livers of Nrf1-Tg mice, ATP levels and ADP levels were higher than those of WT mice (FIG. 6D). In contrast, AMP levels decreased slightly.
  • Nrf1 decreases the influx of glucose into the glycolytic pathway but increases the influx of the TCA cycle and in fact increases the cellular energy sufficiency.
  • Nrf1 changes metabolic parameters other than glucose metabolism
  • ⁇ -hydroxybutyric acid and ammonia are plasma metabolic parameters. investigated. Plasma ⁇ -hydroxybutyrate levels were measured to confirm excess acetyl-CoA in metabolic regulation. Plasma ⁇ -hydroxybutyrate levels in Nrf1-Tg mice treated with HFD are significantly higher than plasma ⁇ -hydroxybutyrate levels in WT mice treated with HFD. (FIG. 7A). To evaluate amino acid catabolism, plasma ammonia levels were also measured.
  • Nrf1-Tg mice Plasma ammonia levels were reduced in both ND-treated and HFD-treated Nrf1-Tg mice compared to WT mice, with the exception of high levels of amino acid catabolism (FIG. 7B). .
  • Nrf1 has been demonstrated to inhibit glucose entry into the glycolytic pathway, these data indicate that Nrf1 increases the use of acetyl-CoA from other nutrients, but glucose and amino acids. Supports the idea that the use of acetyl-CoA derived from catabolism does not increase.
  • Nrf1 +/ ⁇ mice are embryonic lethal, heterozygous Nrf1 knockout (Nrf1 +/ ⁇ ) mice were utilized for this purpose.
  • the body weight level of Nrf1 +/ ⁇ mice subjected to HFD was equivalent to that of Nrf1 + / + mice subjected to HFD (FIG. 8A).
  • Nrf1 +/- mice Blood glucose levels (Figure 8B) and plasma insulin levels (Figure 8C) in Nrf1 +/- mice that were fed HFD with constant feeding were compared to blood glucose levels and plasma insulin in Nrf1 + / + mice that were fed HFD. Slightly lower than the level.
  • Nrf1 is a risk factor for obesity.
  • three new lines of Nrf1-Tg mice that show increased expression of Nrf1 were established. In contrast to the situation inferred from human genomics, these Nrf1-Tg mice rather improved obesity in the mice.
  • closer examination of these Nrf1-Tg mice revealed that Nrf1 impairs insulin action and glucose utilization in the liver and SkM. These changes correlate well with the expression level of the transgenic Nrf1 protein, demonstrating that Nrf1 induction suppresses glucose metabolism and causes diabetes in mice. Therefore, Nrf1 was found to be a strong metabolic regulator.
  • Nrf1 Transgenic expression / induction of Nrf1 suppresses G6P and F6P levels in mouse liver. Since Nrf1 suppresses the expression levels of the Slc2a2 gene and the Gck gene, it is assumed that suppression of these enzyme levels results in suppression of the glycolytic pathway. However, in the livers of Nrf1-Tg and WT mice, the levels of other metabolites of the glycolytic pathway including F1,6P, DHAP, 3PG, 2PG, and PEP are all comparable.
  • Nrf1 induction represses other insulin regulatory genes and glycolysis-related enzyme genes Aldob, Pgk1, and Pklr, resulting in suppression of aldolase activity, phosphoglycerate kinase activity, and pyruvate kinase activity
  • Aldob, Pgk1, and Pklr a glycolysis-related enzyme gene that influences the rate of oxidation of the enzyme.
  • Nrf1 induction represses other insulin regulatory genes and glycolysis-related enzyme genes Aldob, Pgk1, and Pklr, resulting in suppression of aldolase activity, phosphoglycerate kinase activity, and pyruvate kinase activity
  • Nrf1 increases pyruvate levels and decreases lactate levels in the liver, but there is no reasonable explanation for this phenomenon.
  • Pyruvate and lactate levels are complexly regulated by multiple factors including the activity of the pyruvate dehydrogenase complex and lactate dehydrogenase, the entry of lactate from other tissues, the supply of pyruvate by amino acid catabolism (Sugden et al., (2003) Am J Physiol Endocrinol Metab, 284, E855-862; Gladden, (2008) Med Sci Sports Exerc, 40, 477-485; and Sookoian et al., (2012) World J Gastroenterol, 18, 3775-3781), elucidation of this phenomenon must be a challenge through the use of modern methods such as metabolic flux analysis using 13 C (Zamboni et al., (2009) Nat Protoc 4, 878- 892).
  • Nrf1 induces insulin resistance in mice. Overexpression of Nrf1 suppressed Akt phosphorylation after insulin administration to the liver and SkM. We have therefore found that insulin resistance in Nrf1-Tg mice is caused by impaired insulin signaling in the liver and SkM (FIG. 9). However, in our microarray gene expression analysis for the liver and SkM of Nrf1-Tg mice, we could not detect changes in the expression levels of the major components of the insulin signaling pathway (data not shown). These results suggest that Nrf1 induces insulin resistance in the liver and SkM via a pathway that is distinct from transcriptional repression of components of the insulin signaling pathway.
  • Nrf1 function may be perturbation of specific metabolic regulator levels. Indeed, in this study, we found that both plasma ⁇ -hydroxybutyrate levels and liver acetyl-CoA levels were elevated in Nrf1-Tg mice given HFD. Since ⁇ -hydroxybutyric acid is created by metabolism of acetyl-CoA in the liver, an increase in plasma ⁇ -hydroxybutyrate level that is dependent on the expression level of Nrf1 is thought to reflect an excess of acetyl-CoA in the liver ( McGarry et al., (1980) Annu Rev Biochem, 49, 395-420). Since fatty acid oxidation creates abundant acetyl-CoA, we speculate that Nrf1 overexpression enhances the accumulation of acetyl-CoA in the liver by increasing its utilization as a nutrient.
  • Nrf1 overexpression In contrast to Nrf1 overexpression, reducing Nrf1 expression improves glucose metabolism in DIO diabetic model mice. Indeed, Nrf1 heterozygous knockout mice in the DIO model showed reduced plasma insulin levels by lowering blood glucose levels.
  • Nrf1 and Nrf2 bind similarly to the same cis-acting regulatory element (ARE), it is not possible to elucidate how these two CNC family factors exert differential biological functions. interesting. Taken together, this study provides strong evidence that Nrf1 acts as a vital metabolic regulator.
  • Nrf1 and MafG purified protein were analyzed by ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) using Biacore 3000 (GE Healthcare) and MafG antibody (abcam).
  • ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay
  • Biacore 3000 GE Healthcare
  • MafG antibody abcam
  • ARE antioxidant response element
  • Lipin1 intron ARE sequence sense: CGCGGAGGCACACTTGCTGAGTCAGCACCCCGGGAGT (SEQ ID NO: 19) antisense: CTAGACTCCCGGGGTGCTGACTCAGCAAGTGTGCCTC (SEQ ID NO: 20)
  • PGC-1 ⁇ intron ARE sequence sense: CGCGGAGGGGAACATGCTGACTCAGCAGCTCCGAATA (SEQ ID NO: 21) antisense: CTAGTATTCGGAGCTGCTGAGTCAGCATGTTCCCCTC (SEQ ID NO: 22)
  • Nrf1 protein was immobilized as a ligand on Sensor Chip CM5 (GE Healthcare), and MafG protein was used as an analyte. As a result, a dose-dependent binding response of MafG was observed. Similarly, when MafG protein was immobilized as a ligand and Nrf1 protein was used as an analyte, a dose-dependent binding response of Nrf1 was observed.
  • the Lipin1 intron ARE sequence or the PGC-1 ⁇ intron ARE sequence is immobilized on the Sensor Chip SA (GE Healthcare), and equal amounts of Nrf1 and MafG proteins are mixed as ligands to provide an analyte. As a result, a dose-dependent binding response of Nrf1-MafG heterodimer is observed.
  • the binding response to the immobilized DNA probe is attenuated.
  • Nrf1 protein is immobilized on a 96-well plate and the amount of MafG protein bound is analyzed by ELISA using a MafG antibody, an increase in signal when Nrf1 is immobilized is observed.
  • the ARE sequence of Lipin1 intron or the ARE sequence of PGC-1 ⁇ intron is immobilized and equal amounts of Nrf1 and MafG proteins are added, an increase in the dose-dependent signal of Nrf1-MafG heterodimer is confirmed.
  • Nrf1 forms a heterodimer with MafG, binds to the ARE sequence of the target gene, and causes transcriptional activation. Nrf1 is also involved in gene expression related to lipid metabolism such as Lipin1 and PGC-1 ⁇ (Hirotsu et al., MCB, 32; 2760-2770), suggesting an effect on glycolipid metabolism.
  • an assay system that evaluates the direct interaction between Nrf1 and MafG and the binding of Nrf1-MafG heterodimer to the ARE sequence. This assay system reflects the function of endogenous Nrf1-MafG. By using this assay system, it is possible to screen for compounds that inhibit the transcriptional activity of Nrf1.
  • Primer 1.1 5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3 '(SEQ ID NO: 23)
  • Primer 1.2 5'-CTT TAT GTT TTT GGC GTC TTC CTT CCT CCG GTC CTT TG-3 '(SEQ ID NO: 24)
  • Primer 2.2 5'-GAC TCT AGA ATT ACA CGG CG-3 '(SEQ ID NO: 26)
  • sequence amplified by the following primers 3.1 and 3.2 using the mouse Nrf1 cDNA sequence as a template and the sequence amplified by the following primers 4.1 and 4.2 using pGL3-basic vector (Promega) as a template were joined together, and pcDNA3.1
  • a mouse Nrf1 and luciferase fusion protein (mNrf1 ⁇ CNC-bZip-Luc) expression vector lacking the CNC-bZip domain was generated.
  • Primer 3.1 5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3 '(SEQ ID NO: 27)
  • Primer 3.2 5'-CTT TAT GTT TTT GGC GTC TTC CAT CTG CTT GTC CAG GAA-3 '(SEQ ID NO: 28)
  • Primer 4.1 5'-TTC CTG GAC AAG CAG ATG GAA GAC GCC AAA AAC ATA AAG -3 '(SEQ ID NO: 29)
  • Primer 4.2 5'-GAC TCT AGA ATT ACA CGG CG-3 '(SEQ ID NO: 30)
  • the mouse liver cancer cell line Hepa1c1c7 was cultured in Dulbecco's modified Eagle medium (Wako) supplemented with 10% fetal bovine serum and 1% penicillin-streptomycin (Gibco).
  • Wako Dulbecco's modified Eagle medium
  • Gibco penicillin-streptomycin
  • mNrf1-Luc expression vector or mNrf1 ⁇ CNC-bZip-Luc expression vector was linearized with restriction enzyme PvuI
  • Hepa1 cells were transfected using Lipofectamine 2000 transfection reagent (Invitrogen). The cells were cultured in a medium containing 1 mg / mL G-418 to select stably expressing cells, and a plurality of clonal cell lines were established.
  • Each cell line was seeded in a 24-well plate at a density of 5 ⁇ 10 4 cells / well per well, and after overnight culture, the following Control siRNA or Nrf1 siRNA (Tsuchiya et al., Mol Cell Biol. 31: 4500 -4512. (2011)) is transfected with Lipofectaminse2000 transfection reagent (Invitrogen) and incubated overnight.
  • Control siRNA or Nrf1 siRNA (Tsuchiya et al., Mol Cell Biol. 31: 4500 -4512. (2011)) is transfected with Lipofectaminse2000 transfection reagent (Invitrogen) and incubated overnight.
  • Nrf1 siRNA is transfected into a stable expression cell line into which an mNrf1-Luc expression vector or mNrf1 ⁇ CNC-bZip-Luc expression vector has been introduced, a significant decrease in luciferase activity is observed compared to the case where a control siRNA is introduced. It is done.
  • Nrf1 is degraded by the proteasome in the steady state, and it is thought that Nrf1 is released from its degradation system by activation stimulation, and the Nrf1 protein is stabilized, thereby activating transcription of the target gene. ing.
  • the endogenous stimuli and ligands that activate Nrf1 have not been clarified, but it has been reported that the addition of proteasome inhibitors stabilizes the Nrf1 protein and exhibits transcriptional activation (Zhang, Y. et al. al., (2006) Biochem. J. 399, 373-385).
  • RNA is prepared according to the Kit protocol. After measuring the body weight of the animal, RNA is administered at 3 mg / kg / 10 ml from the tail vein. Body weight, blood glucose level and plasma insulin concentration are measured 24 and 72 hours after RNA administration. The blood glucose level is measured using a glucose CII test Wako (Wako), and the plasma insulin concentration is measured using a mouse insulin measurement kit (Morinaga).
  • the Nrf1 siRNA administration group shows a decrease in blood glucose level 24 and 72 hours after RNA administration. A decrease in plasma insulin is also confirmed in the Nrf1 siRNA administration group. There is no difference in body weight between the control siRNA and Nrf1 siRNA administration groups.
  • Nrf1 knockdown confirmed a decrease in blood glucose and plasma insulin.
  • acquired inhibition of Nrf1 can improve insulin resistance, and inhibition of expression by a specific inhibitor of Nrf1 or siRNA or oligoDNA can be an effective means for improving the pathology of diabetes.
  • [SEQ ID NO: 1] This shows the base sequence of cDNA encoding human Nrf1 (Accession No. NM_003204).
  • [SEQ ID NO: 2] This shows the amino acid sequence of human Nrf1 (Accession No. NP_003195).
  • [SEQ ID NO: 3] This shows the base sequence of cDNA encoding mouse Nrf1 (Accession No. NM_008686).
  • [SEQ ID NO: 4] This shows the amino acid sequence of mouse Nrf1 (Accession No. NP_032712).
  • [SEQ ID NO: 5] This shows the base sequence of cDNA encoding human Lipin1 (Accession No. NM_145693).
  • [SEQ ID NO: 6] This shows the amino acid sequence of human Lipin1 (Accession No. NP_663731).
  • [SEQ ID NO: 7] This shows the base sequence of cDNA encoding mouse Lipin1 (Accession No. NM_172950).
  • [SEQ ID NO: 8] This shows the amino acid sequence of mouse Lipin1 (Accession No. NP_766538).
  • [SEQ ID NO: 9] This shows the base sequence of cDNA encoding human PGC-1 ⁇ (Accession No. NM_133263).
  • [SEQ ID NO: 10] This shows the amino acid sequence of human PGC-1 ⁇ (Accession No. NP_573570).
  • [SEQ ID NO: 11] This shows the base sequence of cDNA encoding mouse PGC-1 ⁇ (Accession No. NM_133249).
  • [SEQ ID NO: 12] This shows the amino acid sequence of mouse PGC-1 ⁇ (Accession No. NP_573512).
  • [SEQ ID NO: 13] This shows the base sequence of cDNA encoding human MafG (Accession No. NM_002359).
  • [SEQ ID NO: 14] This shows the amino acid sequence of human MafG (Accession No. NP_002350).
  • [SEQ ID NO: 15] This shows the base sequence of cDNA encoding mouse MafG (Accession No. NM_010756).
  • [SEQ ID NO: 16] This shows the amino acid sequence of mouse MafG (Accession No. NP_034886).
  • [SEQ ID NO: 17] This shows the base sequence of the primer used in EXAMPLE 1.
  • [SEQ ID NO: 18] This shows the base sequence of the primer used in EXAMPLE 1.
  • [SEQ ID NO: 19] This shows the base sequence of the sense strand of the ARE region in Lipin1 intron (Example 2).
  • [SEQ ID NO: 20] This shows the base sequence of the antisense strand of the ARE region in Lipin1 intron (Example 2).
  • [SEQ ID NO: 21] This shows the base sequence of the sense strand of the ARE region in PGC-1 ⁇ intron (Example 2).
  • [SEQ ID NO: 22] This shows the base sequence of the antisense strand of the ARE region in the PGC-1 ⁇ intron (Example 2).
  • [SEQ ID NO: 23] This shows the base sequence of the primer (primer 1.1) used in EXAMPLE 3.
  • [SEQ ID NO: 24] This shows the base sequence of the primer (primer 1.2) used in EXAMPLE 3.
  • [SEQ ID NO: 25] This shows the base sequence of the primer (primer 2.1) used in EXAMPLE 3.
  • [SEQ ID NO: 26] This shows the base sequence of the primer (primer 2.2) used in EXAMPLE 3.
  • [SEQ ID NO: 27] This shows the base sequence of the primer (primer 3.1) used in EXAMPLE 3.
  • [SEQ ID NO: 28] This shows the base sequence of the primer (primer 3.2) used in EXAMPLE 3.
  • SEQ ID NO: 29 This shows the base sequence of the primer (primer 4.1) used in EXAMPLE 3.
  • [SEQ ID NO: 30] This shows the base sequence of the primer (primer 4.2) used in EXAMPLE 3.
  • SEQ ID NO: 31 This shows the base sequence of the sense strand of Control siRNA used in EXAMPLE 3.
  • [SEQ ID NO: 32] This shows the base sequence of the antisense strand of Control siRNA used in EXAMPLE 3.
  • SEQ ID NO: 33 This shows the base sequence of the sense strand of Nrf1 siRNA used in EXAMPLE 3.
  • [SEQ ID NO: 34] This shows the base sequence of the antisense strand of Nrf1 siRNA used in EXAMPLE 3.

Abstract

　本発明は、Nrf1阻害剤を含有してなる、糖尿病の予防または治療剤、Nrf1を用いることを含む、糖尿病の予防または治療剤のスクリーニング方法、およびNrf1-標識融合タンパク質発現細胞を用いることを含む、糖尿病の予防または治療剤のスクリーニング方法を提供する。本発明により、新たな作用機序を有する糖尿病の予防または治療剤が提供される。

Description

糖尿病の予防または治療剤のスクリーニング方法
　本発明は、糖尿病の予防または治療剤およびそのスクリーニング方法などに関する。
　糖尿病は、インスリン作用不足によってもたらされる、持続的な高血糖状態を特徴とする慢性的な代謝性疾患である。インスリン作用不足の原因には、インスリン分泌不全と、インスリン抵抗性の２つがある。インスリン分泌不全は、インスリン分泌を行う膵臓のβ細胞の機能不全に起因する。１型糖尿病では、自己免疫によりβ細胞が破壊され、インスリン分泌不全となる。インスリン抵抗性とは、インスリン分泌は十分であるのに血糖値が下がらない状態であり、骨格筋、脂肪組織および肝臓といったインスリンが作用する主要な組織において、インスリンが十分に作用しないことを意味する。インスリンは、骨格筋においては糖取り込みおよびグリコーゲン合成促進、脂肪組織においては糖取り込みおよび脂肪の合成促進、肝臓においては糖新生の抑制などに働く。インスリン抵抗性がある場合は、各組織におけるこれらの反応が鈍化する。２型糖尿病では、インスリン分泌不全と、インスリン抵抗性の両者が関与する。肥満、過食、運動不足、ストレスといった環境因子は、インスリン抵抗性を惹起し高血糖状態をもたらす。高血糖はβ細胞からの過剰なインスリン分泌を促し、β細胞を疲弊させる。また、高血糖による糖毒性は、β細胞を障害するとともに、インスリン抵抗性を増悪する。病状が進むとβ細胞の機能不全によりインスリン分泌が低下し、インスリン抵抗性とあいまって更なる高血糖状態となる。
　糖尿病の治療においては、血糖値を正常域に低下させることが目標とされている。その作用機序は、大きくはインスリン分泌促進、インスリン抵抗性改善、および糖吸収抑制に分けられる。既存の糖尿病治療薬としては、インスリン、α‐グリコシダーゼ阻害薬（ボグリボース、アカルボースなど）、速効性インスリン分泌促進薬（ナテグリニド、ミチグリニドなど）、スルホニル尿素薬（グリメピリド、グリクラジドなど）、ＧＬＰ－１受容体作動薬（リラグルチド、エキセナチドなど）、ＤＰＰ－４阻害薬（シタグリプチン、ビルダグリプチンなど）、ビグアナイド薬（メトホルミンなど）、チアゾリジン薬（ピオグリタゾンなど）、ＳＧＬＴ２阻害薬（イプラグリフロジンなど）などが用いられている。α‐グリコシダーゼ阻害薬は、腸官からの糖の吸収を遅らせて食後高血糖を抑制する。速効性インスリン分泌促進薬、スルホニル尿素薬およびＧＬＰ－１受容体作動薬は、β細胞を刺激しインスリン分泌を促進する。ＤＰＰ－４阻害薬は、インクレチン（ＧＬＰ－１およびＧＩＰ）の分解を抑制することでインスリン分泌を促進する。ビグアナイド薬は主に肝臓での糖新生を抑制し、インスリン抵抗性を改善する。チアゾリジン薬は、骨格筋と脂肪組織における糖取り込み、グリコーゲン合成、脂肪合成を促進し、肝臓からの糖放出を抑制して、インスリン抵抗性を改善する。
　糖尿病については、様々な治療薬が上市されているが、既存の治療薬に抵抗性を示す患者や難治性の患者が存在し、新たな糖尿病の治療方法へのニーズが依然として存在する。
　NF-E2 p45、Nrf1 (NF-E2関連因子1)、Nrf2、Nrf3、Bach1およびBach2を含めたCNC(cap-‘n’-collar)ファミリーの転写因子は、複数の細胞機能を有する。これらの因子は、共通して抗酸化剤/親電子性物質応答配列(ARE/EpRE)に結合し、転写を活性化または抑制する。CNCファミリー因子のうちの1つであるNrf2は、酸化ストレスおよび求電子性ストレスに対する細胞の応答において極めて重要な役割を果たすことが見出されている。Nrf2はまた、癌細胞におけるグルコース代謝にも寄与する。重要なことに、Nrf2はまた、肥満モデルマウスおよび糖尿病モデルマウスにおけるグルコース代謝レベルおよび体重レベルも調節する。ゲノムワイド関連解析(GWAS)では、Nrf2に加えて、Nrf3も、ヒトの肥満における脂質分布と関連することが見出されている。
　別のCNCファミリー因子であるNrf1もまた、ARE/EpREに結合し、トランス活性化活性を及ぼす(非特許文献1)。しかし、Nrf1ノックアウトマウスの表現型(非特許文献2； 非特許文献3；非特許文献4；非特許文献5；および特許文献1)は、Nrf2ノックアウトマウスの表現型と全く異なる。Nrf1ノックアウトマウスは、赤血球産生が不十分であることに起因して胚性致死である(非特許文献2)。これは、Nrf1とNrf2は、特定の転写調節に同じコンセンサス配列であるARE/EpREを使用するが、異なる細胞機能を有することが重要であると考えられる。発現アレイ研究は、Nrf1が脂質代謝関連遺伝子を調節することを明らかにした(非特許文献5、特許文献1)。この知見により、Nrf1はまた、多様な細胞の代謝においても重要な役割を果たし得ると考えるに至った。ここで生じる興味深い問題は、Nrf1およびNrf2の細胞の代謝調節に対する寄与の差違である。しかし、Nrf1グローバルノックアウトマウスの胚性致死 (非特許文献2)およびNrf1肝臓特異的コンディショナルノックアウトマウスの重度の肝機能障害(非特許文献5)は、Nrf1が代謝において果たす極めて重要な役割の解明を妨げている。差違を生み出す細胞の病態生理ならびに分子的基盤に対する、Nrf1とNrf2の寄与の違いは、明らかにされないままである。
　ヒトGWAS研究は、NRF1遺伝子が肥満と関連することを示す。GWASでは、32の遺伝子座がボディマス指数(BMI)と5×10-8以内のP値で強く関連し、NRF1遺伝子座の近傍(また、CBX1遺伝子座の近傍でもある)に局在化する、rs3764400を含めた他の10の遺伝子座も、5×10-6以内のP値で比較的弱く関連する(非特許文献6)。一塩基多型(SNP)であるrs3764400はNRF1の5’-隣接領域に位置することから、NRF1遺伝子の発現が肥満における代謝調節および発症機序に寄与するのかどうかということが、強い注目の的である。
　ここで、特許文献1には、Nrf1調節剤のスクリーニング方法が記載されている。しかしながら、Nrf1と糖尿病との関係は従来、知られていなかった。
WO2013/111909
Ohtsuji et al., (2008) J Biol Chem, 283, 33554-33562 Chan et al, (1998) EMBO J, 17, 1779-1787 Kobayashi et al., (2011) Genes Cells, 16, 692-703 Lee et al., (2011) Proc Natl Acad Sci U S A, 108, 8408-8413 Hirotsu et al., (2012) Mol Cell Biol, 32, 2760-2770 Speliotes et al., (2010) Nat Genet, 42, 937-948
　近年、様々な種類の糖尿病の治療剤が上市されているが、既存の治療薬に抵抗性を示す患者や難治性の患者が存在する。また、糖尿病の病態は複雑であり、単独の薬剤では血糖値のコントロールが困難な症例が多く、異なる作用機序を持つ薬剤を組み合わせて用いることが多く行われている。このような状況下、既存の薬剤とは異なる新たな作用機序を有する糖尿病の予防または治療剤が切望されている。
　本発明者らは、代謝調節に対するNrf1の寄与に取り組むため、異なる発現レベルを有するNrf1遺伝子突然変異体マウスを使用して、Nrf1の機能について検討した。この目的で、MafG遺伝子調節ドメイン(MGRD)を用いることにより、3つのNrf1過剰発現トランスジェニックマウス系統を確立した。また、Nrf1ノックアウトマウス系統も利用した(非特許文献1)。これらのマウスについての解析は、Nrf1が、グルコース代謝を減弱させ、それに伴い体重レベルが低下することを明確に実証した。したがって、Nrf1は、強力な 代謝調節因子であることが明らかとなった。さらに、本発明者らは、Nrf1の過剰発現によりマウスが糖尿病を発症することから、Nrf1が糖尿病の予防または治療におけるターゲットとなることなどを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、以下に示す、糖尿病の予防または治療剤、糖尿病の予防または治療剤のスクリーニング方法、トランスジェニック非ヒト動物などを提供する。
1. 糖尿病の予防または治療剤
[1-1]　Nrf1阻害剤を含有してなる、糖尿病の予防または治療剤。
[1-2]　Nrf1阻害剤が、（a）Nrf1をコードするポリヌクレオチドに対するsiRNAまたはshRNA、（b）Nrf1をコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチド、(c)Nrf1活性を阻害する低分子化合物若しくは高分子化合物、（d）Nrf1をコードするポリヌクレオチドに対するリボザイム、（e）Nrf1に対してドミナントネガティブに作用するNrf1の変異体もしくはそれをコードするポリヌクレオチド、および（f）Nrf1に対するアプタマーからなる群から選択される1種または2種以上である上記[1-1]に記載の予防または治療剤。
[1-3]　Nrf1阻害剤が、配列番号：33のヌクレオチド配列からなるセンス鎖および配列番号：34のヌクレオチド配列からなるアンチセンス鎖を含むsiRNAである、上記[1-1]または[1-2]に記載の予防または治療剤。
2. 糖尿病の予防または治療方法
[2-1]　 治療的有効量のNrf1阻害剤を、糖尿病の予防または治療が必要な対象に投与することを含む、糖尿病の予防または治療方法。
[2-2]　インスリン抵抗性改善を必要とする対象に、治療的有効量のNrf1阻害剤を投与することを含む、インスリン抵抗性改善方法。
[2-3]　β細胞保護を必要とする対象に、治療的有効量のNrf1阻害剤を投与することを含む、β細胞保護方法。
[2-4]　Nrf1阻害剤が、（a）Nrf1をコードするポリヌクレオチドに対するsiRNAまたはshRNA、（b）Nrf1をコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチド、(c)Nrf1活性を阻害する低分子化合物若しくは高分子化合物、（d）Nrf1をコードするポリヌクレオチドに対するリボザイム、（e）Nrf1に対してドミナントネガティブに作用するNrf1の変異体もしくはそれをコードするポリヌクレオチド、および（f）Nrf1に対するアプタマーからなる群から選択される1種または2種以上である上記[2-1]～[2-3]のいずれか1項に記載の方法。
[2-5]　Nrf1阻害剤が、配列番号：33のヌクレオチド配列からなるセンス鎖および配列番号：34のヌクレオチド配列からなるアンチセンス鎖を含むsiRNAである、上記[2-1]～[2-4]のいずれか1項に記載の方法。
3. 糖尿病の予防または治療剤のスクリーニング方法
[3-1]　Nrf1活性の阻害を指標とした、糖尿病の予防または治療剤のスクリーニング方法。
[3-2]　Nrf1を用いることを含む、上記[3-1]に記載の方法。
[3-3]　(i)試験化合物の存在下で、Nrf1とMafGとを接触させた場合のNrf1とMafGとの結合量を測定し、(ii) 試験化合物の非存在下で、Nrf1とMafGとを接触させた場合のNrf1とMafGとの結合量を測定し、(iii) 前記(i)の場合と(ii)の場合の、Nrf1とMafGとの結合量の比較を行うことを含む、上記[3-1]または[3-2]に記載の方法。
[3-4]　前記(i)の場合におけるNrf1とMafGとの結合量が、前記(ii)の場合のNrf1とMafGとの結合量より低くなる試験化合物を、Nrf1活性を阻害する化合物として選択する、上記[3-3]に記載の方法。
[3-5]　(i)試験化合物の存在下で、Nrf1およびMafGとLipin1および／またはPGC－1βのイントロン中のARE配列とを接触させた場合のNrf1およびMafGと前記ARE配列との結合量を測定し、(ii) 試験化合物の非存在下で、Nrf1およびMafGと前記ARE配列とを接触させた場合のNrf1およびMafGと前記ARE配列との結合量を測定し、(iii) 前記(i)の場合と(ii)の場合の、Nrf1およびMafGと前記ARE配列との結合量の比較を行うことを含む、上記[3-1]または[3-2]に記載の方法。
[3-6]　前記(i)の場合におけるNrf1およびMafGと前記ARE配列との結合量が、前記(ii)の場合のNrf1およびMafGと前記ARE配列との結合量より低くなる試験化合物を、Nrf1活性を阻害する化合物として選択する、上記[3-5]に記載の方法。
[3-7]　Nrf1-標識融合タンパク質発現細胞を用いることを含む、上記[3-1]に記載の方法。
[3-8]　(i)試験化合物をNrf1-標識融合タンパク質発現細胞と接触させた場合の該細胞におけるNrf1-標識融合タンパク質量を測定し、(ii)試験化合物をNrf1-標識融合タンパク質発現細胞に接触させない場合の該細胞におけるNrf1-標識融合タンパク質量を測定し、(iii)前記(i)の場合と(ii)の場合のNrf1-標識融合タンパク質量の比較を行うことを含む、上記[3-1]または[3-7]に記載の方法。
[3-9]　前記(i)の場合におけるNrf1-標識融合タンパク質量が、前記(ii)の場合のNrf1-標識融合タンパク質量より低くなる試験化合物を、Nrf1活性を阻害する化合物として選択する、上記[3-8]に記載の方法。
4. トランスジェニック非ヒト動物
[4-1]　Nrf1をコードする遺伝子及びMafG調節ドメインを含む組換体DNAを少なくとも1コピー保有し、かつ食事誘発性肥満（DIO）モデルである、トランスジェニック非ヒト動物。
[4-2]　前記組換体DNAを4コピー保有する、上記[4-1]に記載の非ヒト動物。
[4-3]　前記非ヒト動物がマウス又はラットである、上記[4-1]または[4-2]に記載の非ヒト動物。
[4-4]　上記[4-1]～[4-3]のいずれか1項に記載の非ヒト動物の、糖尿病モデルマウスとしての使用。
[4-5]　糖尿病を発症した上記[4-1]～[4-3]のいずれか1項に記載の非ヒト動物に、試験化合物を接触することを含む、糖尿病の予防または治療剤のスクリーニング方法。
[4-6]　試験化合物を接触させた上記[4-1]～[4-3]のいずれか1項に記載の非ヒト動物の血糖値を測定し、当該測定された血糖値が試験化合物を接触しない前記非ヒト動物における血糖値よりも低下したときに、前記試験化合物を、糖尿病の予防または治療剤の候補化合物として選択することを含む、糖尿病の予防または治療剤のスクリーニング方法。
　本発明は、Nrf1活性の阻害を指標として、糖尿病に対して有効な予防または治療剤をスクリーニングする方法を提供することができる。また、本発明は、当該スクリーニング方法によって得られた、糖尿病に対して有効な予防または治療剤を提供することができる。
ヒトNRF1遺伝子における調節SNPを示す図である。(A)ヒトNRF1遺伝子の5’-隣接領域とルシフェラーゼcDNAとのキメラDNAのレポーター構築物についての概略図である。T対立遺伝子および肥満についてのリスクC対立遺伝子を伴うSNP rs3764400は、NRF1遺伝子の転写開始部位(TSS)の1.8kb上流に存在する。(B)ヒト肝癌細胞株におけるNRF1遺伝子の転写活性を示す図である。データは、ウミシイタケルシフェラーゼ活性で標準化された相対ホタルルシフェラーゼ活性であり、平均±SEMを表す。各細胞株における対照のpGL4.22ベクターによる転写活性を、1とした(n=3)。†pGL4.22ベクターと対比したP<0.05。***NRF1-T-lucと対比したP<0.001。 Nrf1トランスジェニックマウスの創出を示す図である。(A)MafG調節ドメイン(MGRD)の制御下においてNrf1-FLAGを全身発現させるための構築についての概略図である。(B)Nrf1-Tgマウスの3つの系統の、肝臓、骨格筋(SkM)、白色脂肪組織(WAT)、褐色脂肪組織(BAT)、および脳におけるNrf1 mRNAの発現レベルを示す図である。データは、平均±SEMを表す。WTマウスの各組織における発現レベルを、1とした(n=3)。(C)WTマウスの肝臓およびNrf1-Tgマウスの肝臓の核(Nrf1およびPCNA)または細胞質ゾル(Nrf1およびTub)における、Nrf1、増殖細胞核抗原(PCNA)、およびα-チューブリン(Tub)のタンパク質発現レベルを示す図である。(D)MGRD-Nrf1導入遺伝子による、Nrf1欠損マウスの、胚性致死からのトランスジェニックレスキューを示す図である。トランスジェニックレスキューマウスを創出するための交配戦略を示す図である(左パネル)。WT(Nrf1+/+)マウスおよびレスキュー(Nrf1-/-::Nrf1-Tg)マウスにおける血清アラニントランスアミナーゼ(ALT)レベルを示す図である(n=6～9)(右パネル)。 Nrf1の過剰発現が、食餌誘発性肥満モデルマウスにおいて、糖尿病を発症させることを示す図である。(A、B)通常食餌(ND)(または高脂肪食餌(HFD))を施されたWTマウスおよびNrf1-Tgマウスの体重レベルを示す図である(n=8～22)。HFDは、週齢が6週齢のときに開始した。ND(A)またはHFD(B)を施されたWTと対比した*P<0.05、**P<0.01、および***P<0.001。(C)不断給餌を施されたWTマウスまたはNDもしくはHFDを施されたNrf1-Tgマウスの血中グルコースレベルを示す図である(n=9～24)。HFDは、週齢が6週齢のときに開始した。HFDを施されたWTと対比した*P<0.05および***P<0.001。†NDを施されたWTと対比したP<0.05。(D)HFDを施されたWTマウスまたはNrf1-TgマウスのITTにおける血中グルコースレベルを示す図である(n=7～19)。4時間にわたる絶食の後、レギュラーインスリン(BW 1kg当たり、1.5U)を腹腔内投与した。WTと対比した**P<0.01および***P<0.001。 Nrf1が、非肥満マウスにおけるインスリン抵抗性を誘導することを示す図である。(A)NDを施されたWTマウスおよびNrf1-Tg(系統1)マウスについての正常血糖高インスリンクランプ試験を示す図である。データは、グルコースレベルをクランプしたとき(右パネル)のグルコース注入速度(左パネル)である(n=5～6)。WTと対比した***P<0.001。(B)NDを施されたWTマウスおよびNrf1-Tg(系統1)マウスの膵臓切片のインスリンについての免疫組織化学(上パネル)およびインスリン陽性面積の定量化(下パネル)を示す図である(n=5～8)。グラフは、各マウスの全膵臓切片中のインスリン陽性面積の百分率を示す。WTと対比した***P<0.001。(C、D)不断給餌でNDを施されたWTマウスおよびNrf1-Tgマウス(系統5、1および6)の血中グルコースレベル(C)(WTはn=33、Nrf1-Tgはn=5～6)および血漿インスリンレベル(D)(WTのn=26、Nrf1-Tgのn=5～6)を示す図である。WTと対比した***P<0.001。(E)WTマウスまたはNrf1-Tg(系統5、1および6)マウスのITTにおける血中グルコースレベル(左パネル)およびAUC(右パネル)を示す図である(n=6～14)。4時間にわたる絶食の後、レギュラーインスリン(BW 1kg当たり、0.75U)を腹腔内投与した。WTと対比した**P<0.01および***P<0.001。データは、平均±SEMを表す。 Nrf1が、肝臓およびSkMにおけるインスリンシグナルを悪化させることを示す図である。(A)肝臓およびSkMのリン酸化Akt(Ser-473)および全Aktについての免疫ブロット解析を示す図である。一晩にわたる絶食の後、HFDを施されたWTマウスおよびNrf1-Tg(系統1)マウスに、インスリン(Ins)または媒体(Veh)としての生理食塩水を投与した。p-Akt:リン酸化Akt (Ser-473); t-Akt:全Akt。グラフは、t-Aktで標準化されたp-Aktの濃度測定単位を示し、インスリンで処置されたWTマウスのデータを1とした(n=3)。インスリンで処置されたWTマウスと対比した†P<0.01。(B、C)HFDを施されたWTマウスおよびNrf1-Tg(系統1)マウスの肝臓における解糖関連遺伝子およびグルコース輸送体遺伝子(B)または糖新生関連遺伝子(C)の発現レベルを示す図である。データは、Hprt発現レベルで標準化する。WTマウスのデータを1とした(各群内のn=6)。WTと対比した*P<0.05および**P<0.01。データは、平均±SEMを表す。 Nrf1が、解糖経路の流れを抑制することを示す図である。(A～E)HFDを施されたWTマウスの肝臓およびNrf1-Tgマウスの肝臓についてのメタボロミクス解析を示す図である。解糖経路(A)、乳酸および乳酸の対ピルビン酸比(L/P比)(B)、TCAサイクル(C)、アデノシンリン酸(D)、およびAMPの対ATP比(AMP/ATP比)により評価されるエネルギー充足の計算値(E)を示す図である。高発現系統である系統1のNrf1-Tgマウスを使用した。G6PおよびF6Pの劇的な減少から、解糖経路への流入の減少が示されることに注意されたい。データは、肝臓1グラム当たりの物質量のデータを表す(各群内のn=3)。L/P比およびAMP/ATP比については、データを、ピルビン酸含有量当たりの乳酸含有量およびATP含有量当たりのAMP含有量(物質量比)として表す。WTと対比した*P<0.05、**P<0.01、および***P<0.001。データは、平均±SEMを表す。 血漿β-ヒドロキシ酪酸レベルおよび血漿アンモニアレベルを示す図である。(A)NDまたはHFDを施されたWTマウスおよびNrf1-Tg(系統1)マウス(n=8～19)の血漿β-ヒドロキシ酪酸レベルを示す図である。HFDを施されたWTマウスと対比した**P<0.01。(E)NDまたはHFDを施されたWTマウスおよびNrf1-Tg(系統1)マウス(NDのn=6～7、HFDのn=12～20)の血漿アンモニアレベルを示す図である。各食餌においてWTマウスと対比した*P<0.05および**P<0.01。データは、平均±SEMを表す。 Nrf1のヘテロ接合性ノックアウトが、食餌誘発性肥満モデルマウスおよび糖尿病モデルマウスにおけるグルコース代謝を改善することを示す図である。(A)NDまたはHFDを施されたNrf1+/+マウスおよびNrf1+/-マウス(NDのためn=6、各HFDのためn=14)の体重レベルを示す図である。(BおよびC)不断給餌でHFDを施されたNrf1+/+マウスおよびNrf1+/-マウス(n=16～22)の血中グルコースレベル(B)および血漿インスリンレベル(C)を示す図である。データは、平均±SEM(Aについて)、または各マウス(黒色または白色のドット)の散布図および各群の中央値(黒色の直線) (BおよびCについて)として表す。Nrf1+/-マウスと対比した*P<0.05および***P<0.001。 Nrf1の過剰発現が、どのようにして糖尿病を発症させるのかという機構についてのモデルを示す図である。Nrf1発現の誘導は、肝臓およびSkMにおけるインスリンシグナルを減弱させる。Nrf1はその後、インスリン抵抗性を悪化させ、グルコースの利用を阻害することから、糖尿病の発症をもたらす。
　以下、本発明について詳細に説明する。
 
1. Nrf1、MafG、Lipin1およびPGC－1β
1.1. Nrf1
　「Nrf1」（nuclear factor erythroid 2-related factor 1）は、cap‘n’collar (CNC) 転写因子ファミリーのメンバーである。Nrf1は、代謝を含む様々な生物学的プロセスにとって重要な調節因子と見なされている。Nrf1は細胞質から核内に移行してMafタンパク質とヘテロダイマーを形成することでARE(Antioxidant response element)配列に結合し、標的遺伝子を活性化する。Nrf1の標的遺伝子は、例えば、Lipin1、PGC－1β等の遺伝子である。
　本発明において、Nrf1は、特に限定されないが、例えば、ヒト由来のもの、マウス由来のものなどが挙げられる。ヒトNrf1の遺伝子およびアミノ酸配列は、それぞれ、Accession No. NM_003204 (gene)（配列番号:1）およびAccession No. NP_003195 (protein) （配列番号:2）としてGenBankに登録されている。マウスNrf1の遺伝子およびアミノ酸配列は、それぞれ、Accession No. NM_008686 (gene)（配列番号: 3）およびAccession No. NP_032712 (protein)（配列番号:4）としてGenBankに登録されている。
　本明細書中では、Nrf1は、それらと実質的に同質の活性を有する限り、その変異体をも包含する意味で用いられる。該変異体としては、例えば、上記Nrf1のアミノ酸配列中の1～複数個(例えば、1～30個、1～29個、1～28個、1～27個、1～26個、1～25個、1～24個、1～23個、1～22個、1～21個、1～20個、1～19個、1～18個、1～17個、1～16個、1～15個、1～14個、1～13個、1～12個、1～11個、1～10個、1～9個(1～数個)、1～8個、1～7個、1～6個、1～5個、1～4個、1～3個、1～2個、または1個)のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。欠失、置換、挿入もしくは付加したアミノ酸の数は、一般的に少ないほど好ましい。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入および付加のうち2種以上が同時に生じてもよい。
　実質的に同質の活性としては、例えば、Nrf1標的遺伝子の転写促進活性、ARE結合活性、Mafタンパク質とのヘテロダイマー形成能等が挙げられる。実質的に同質とは、それらの活性が性質的に(例、生理学的に、または薬理学的に)同等であることを示す。したがって、Nrf1標的遺伝子の転写促進活性、ARE結合活性、Mafタンパク質とのヘテロダイマー形成能等が同等（例、約0.01～100倍、好ましくは約0.1～10倍、より好ましくは0.5～2倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度、タンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
　なお、本明細書中、「Nrf1」は一般的にNrf1タンパク質のことを意味するが、その文脈に応じて、Nrf1遺伝子のことを意味する場合もある。
1.2. MafG
　「MafG」は、小Maf群因子の１つであり、DNA認識に関わる塩基性領域と、ヘテロダイマーを形成するのに必要なロイシンジッパーからなる塩基性ロイシンジッパー（bZip）構造を持つ転写因子である。MafGは、Nrf1とヘテロダイマーを形成し、標的遺伝子のARE配列に結合する。
　本発明において、MafGは、特に限定されないが、例えば、ヒト由来のもの、マウス由来のものなどが挙げられる。ヒトMafGの遺伝子およびアミノ酸配列は、それぞれ、Accession No. NM_002359 (gene)（配列番号:13）およびAccession No. NP_002350 (protein) （配列番号:14）としてGenBankに登録されている。マウスMafGの遺伝子およびアミノ酸配列は、それぞれ、Accession No. NM_010756 (gene)（配列番号:15）およびAccession No. NP_034886 (protein)（配列番号:16）としてGenBankに登録されている。
　本明細書中では、MafGは、それらと実質的に同質の活性を有する限り、その変異体をも包含する意味で用いられる。該変異体としては、例えば、上記Nrf1のアミノ酸配列中の1～複数個(例えば、1～30個、1～29個、1～28個、1～27個、1～26個、1～25個、1～24個、1～23個、1～22個、1～21個、1～20個、1～19個、1～18個、1～17個、1～16個、1～15個、1～14個、1～13個、1～12個、1～11個、1～10個、1～9個(1～数個)、1～8個、1～7個、1～6個、1～5個、1～4個、1～3個、1～2個、または1個)のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。欠失、置換、挿入もしくは付加したアミノ酸の数は、一般的に少ないほど好ましい。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入および付加のうち2種以上が同時に生じてもよい。
　実質的に同質の活性としては、例えば、標的遺伝子の転写促進活性、MARE（Maf認識配列）結合活性、ARE結合活性、ホモダイマー形成能、CNCファミリー転写因子とのヘテロダイマー形成能等が挙げられる。実質的に同質とは、それらの活性が性質的に(例、生理学的に、または薬理学的に)同等であることを示す。したがって、標的遺伝子の転写促進活性、MARE結合活性、ARE結合活性、ホモダイマー形成能、CNCファミリー転写因子とのヘテロダイマー形成能等が同等（例、約0.01～100倍、好ましくは約0.1～10倍、より好ましくは0.5～2倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度、タンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
　なお、本明細書中、「MafG」は一般的にMafGタンパク質のことを意味するが、その文脈に応じて、MafG遺伝子のことを意味する場合もある。
1.3. Lipin1
　「Lipin1」は、Lipin 2、Lipin3等とともにLipinファミリーに属するタンパク質である。Lipin1は細胞内局在の違いによる2つの脂質代謝調節機能が知られている。1つ目として、Lupin1は、小胞体膜上においてホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有する。2つ目として、Lipin1は、核内においてPPARα／PGC－1α調節経路のコアクチベーターとしても作用し、脂肪酸の酸化的代謝を正方向に調節する。
　本発明において、Lipin1は、特に限定されないが、例えば、ヒト由来のもの、マウス由来のものなどが挙げられる。ヒトLipin1の遺伝子およびアミノ酸配列は、それぞれ、Accession No. NM_145693 (gene)（配列番号:5）およびAccession No. NP_663731 (protein) （配列番号:6）としてGenBankに登録されている。マウスLipin1の遺伝子およびアミノ酸配列は、それぞれ、Accession No. NM_172950 (gene)（配列番号:7）およびAccession No. NP_766538 (protein)（配列番号:8）としてGenBankに登録されている。
　本明細書中では、Lipin1は、それらと実質的に同質の活性を有する限り、その変異体をも包含する意味で用いられる。該変異体としては、例えば、上記Lipin1のアミノ酸配列中の1～複数個(例えば、1～30個、1～29個、1～28個、1～27個、1～26個、1～25個、1～24個、1～23個、1～22個、1～21個、1～20個、1～19個、1～18個、1～17個、1～16個、1～15個、1～14個、1～13個、1～12個、1～11個、1～10個、1～9個(1～数個)、1～8個、1～7個、1～6個、1～5個、1～4個、1～3個、1～2個、または1個)のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。欠失、置換、挿入もしくは付加したアミノ酸の数は、一般的に少ないほど好ましい。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入および付加のうち2種以上が同時に生じてもよい。
　実質的に同質の活性としては、例えば、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性、PPARα／PGC－1α調節経路のコアクチベーター活性等が挙げられる。実質的に同質とは、それらの活性が性質的に(例、生理学的に、または薬理学的に)同等であることを示す。したがって、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性、PPARα／PGC－1α調節経路のコアクチベーター活性等が同等（例、約0.01～100倍、好ましくは約0.1～10倍、より好ましくは0.5～2倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度、タンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
　なお、本明細書中、「Lipin1」は一般的にLipin1タンパク質のことを意味するが、その文脈に応じて、Lipin1遺伝子のことを意味する場合もある。
1.4. PGC－1β
　「PGC－1β」（peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator 1β）は、 ERRα（estrogen-related receptor α）およびnuclear respiratory factor 1の共活性化に必要なタンパク質である。PGC－1βノックアウトマウスは、ミトコンドリアの酸化的代謝遺伝子の発現の変化および高脂肪飼料誘発性の脂肪肝を示す。
　本発明において、PGC－1βは、特に限定されないが、例えば、ヒト由来のもの、マウス由来のものなどが挙げられる。ヒトPGC－1βの遺伝子およびアミノ酸配列は、それぞれ、Accession No. NM_133263 (gene)（配列番号:9）およびAccession No. NP_573570 (protein) （配列番号:10）としてGenBankに登録されている。マウスPGC－1βの遺伝子およびアミノ酸配列は、それぞれ、Accession No. NM_133249 (gene)（配列番号:11）およびAccession No. NP_573512 (protein)（配列番号:12）としてGenBankに登録されている。
　本明細書中では、PGC－1βは、それらと実質的に同質の活性を有する限り、その変異体をも包含する意味で用いられる。該変異体としては、例えば、上記PGC－1βのアミノ酸配列中の1～複数個(例えば、1～30個、1～29個、1～28個、1～27個、1～26個、1～25個、1～24個、1～23個、1～22個、1～21個、1～20個、1～19個、1～18個、1～17個、1～16個、1～15個、1～14個、1～13個、1～12個、1～11個、1～10個、1～9個(1～数個)、1～8個、1～7個、1～6個、1～5個、1～4個、1～3個、1～2個、または1個)のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。欠失、置換、挿入もしくは付加したアミノ酸の数は、一般的に少ないほど好ましい。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入および付加のうち2種以上が同時に生じてもよい。
　実質的に同質の活性としては、例えば、ERRαおよびnuclear respiratory factor 1の共活性化活性等が挙げられる。実質的に同質とは、それらの活性が性質的に(例、生理学的に、または薬理学的に)同等であることを示す。したがって、ERRαおよびnuclear respiratory factor 1の共活性化活性等が同等（例、約0.01～100倍、好ましくは約0.1～10倍、より好ましくは0.5～2倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度、タンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
　なお、本明細書中、「PGC－1β」は一般的にPGC－1βタンパク質のことを意味するが、その文脈に応じて、PGC－1β遺伝子のことを意味する場合もある。
2. Nrf1阻害剤を含有してなる糖尿病の予防または治療剤
　本発明は、Nrf1阻害剤を含有してなる糖尿病の予防または治療剤を提供する。また、本発明は、治療的有効量のNrf1阻害剤を、糖尿病の予防または治療が必要な対象に投与することを含む、糖尿病の予防または治療方法を提供する。本発明のNrf1阻害剤を含有してなる予防または治療剤は、インスリン抵抗性改善作用を併せもつことを特徴とする。また、本発明のNrf1阻害剤を含有してなる予防または治療剤は、インスリン抵抗性改善作用とβ細胞保護作用を併せもつことを特徴とする。
　本発明者らは、遺伝学的にNrf1を過剰発現したマウスの解析により、Nrf1が強力な代謝調節因子であることを明らかとし、Nrf1の過剰発現によりマウスが糖尿病を発症することを見出した。また、遺伝学的にNrf1の発現を抑制した糖尿病モデルマウス等の解析により、Nrf1の抑制がグルコース代謝の改善をもたらすことを明らかとし、糖尿病の発症が抑制されることを見出した。
　本発明は、インスリン抵抗性改善剤として、Nrf1阻害剤を提供する。本発明においては、Nrf1阻害剤を含有してなる医薬組成物を、インスリン抵抗性改善用医薬組成物として用いる。また、本発明においては、インスリン抵抗性改善用医薬組成物の製造においてNrf1阻害剤を使用する。さらに、本発明は、インスリン抵抗性改善を必要とする対象に、治療的有効量のNrf1阻害剤を投与することを含む、インスリン抵抗性改善方法を提供する。
　インスリン抵抗性改善は、例えば、後述する実施例1（方法1.4.）に記載のインスリン耐性試験での血糖値の低下、HOMA-IRの低下などにより確認することができる。
　本発明は、β細胞保護剤として、Nrf1阻害剤を提供する。本発明においては、Nrf1阻害剤を含有してなる医薬組成物を、β細胞保護用医薬組成物として用いる。また、本発明においては、β細胞保護用医薬組成物の製造においてNrf1阻害剤を使用する。さらに、本発明は、β細胞保護を必要とする対象に、治療的有効量のNrf1阻害剤を投与することを含む、β細胞保護方法を提供する。
　β細胞保護作用とは、β細胞の量および／または活性の減少を抑制することをいう。β細胞の量は、後述する実施例1（方法1.7.、結果2.5.）に記載の方法（膵臓切片のインスリン染色）等で確認することができる。β細胞の活性は、例えば、糖刺激性インスリン分泌（ＧＳＩＳ）が維持されていることを、後述する実施例1（方法1.4.）に記載の方法等で確認する。
　Nrf1阻害剤またはそれを含有するβ細胞保護用医薬組成物は、前糖尿病段階ともいえる耐糖能異常の段階で用いると、２型糖尿病の発症抑制、すなわち予防に効果を発揮する。
2.1. 本発明で用いられるNrf1阻害剤
　本発明で用いられる「Nrf1阻害剤」は、Nrf1活性を阻害する物質をいう。「Nrf1活性」は、例えば、上記したNrf1標的遺伝子の転写促進活性、Nrf1のARE結合活性、Nrf1-Mafヘテロダイマー形成能等が挙げられる。かかる物質としては、低分子化合物もしくは高分子化合物のほか、siRNA、shRNA、アンチセンスポリヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、酵素などを用いることができる。
　「Nrf1阻害剤」は、より具体的には、前記Nrf1活性の少なくとも1つを阻害する活性を有する物質をいう。Nrf1活性の阻害は、例えば、(1)Nrf1の発現を阻害すること、(2)Nrf1の細胞質から核への移行を阻害すること、(3)Nrf1-Mafヘテロダイマー形成を阻害すること、(4)Nrf1のAREへの結合を阻害すること、(5)Nrf1の核から細胞質への移行を促進することなどによりもたらすことができる。
　「Nrf1の発現を阻害する」とは、Nrf1遺伝子からタンパク質が生成されるまでの一連の事象（例えば、転写(mRNAの生成)、翻訳(タンパク質の生成)を含む）のうちのいずれかの事象を阻害することによって、当該タンパク質の生成を阻害することを意味する。
　「Nrf1の細胞質から核への移行を阻害する」とは、Nrf1の分解を調節することで核への移行を阻害すること、Nrf1のリン酸化状態を変化させることで核への移行を阻害すること、などによりもたらすことができる。
　「Nrf1-Mafヘテロダイマー形成を阻害する」とは、核内に移行したNrf1がMafと結合することを阻害することによって、Nrf1-Mafヘテロダイマーを形成するのを阻害すること、Mafホモダイマー形成を促進することによって、Nrf1-Mafヘテロダイマーを形成するのを阻害すること、などを意味する。
　「Nrf1のAREへの結合を阻害する」とは、核内に移行したNrf1がMafとヘテロダイマーを形成するのを阻害して該Nrf1がARE配列に結合するのを阻害すること、Nrf1-MafヘテロダイマーがARE配列に結合するのを阻害すること、Mafホモダイマー形成を促進することによって、Nrf1-MafヘテロダイマーがARE配列に結合するのを阻害すること、などを意味する。
　「Nrf1の核から細胞質への移行を促進する」とは、核内に移行したNrf1が細胞質へ戻ることを促進することで、Nrf1が核内で転写促進活性を発揮し続けることを阻害すること、などを意味する。
　Nrf1阻害剤は、具体的には、
(a)Nrf1をコードするポリヌクレオチドに対するsiRNAまたはshRNA、
(b)Nrf1をコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチド、
(c)Nrf1活性を阻害する低分子化合物若しくは高分子化合物、
(d)Nrf1をコードするポリヌクレオチドに対するリボザイム、
(e)Nrf1に対してドミナントネガティブに作用するNrf1の変異体もしくはそれをコードするポリヌクレオチド、および
(f)Nrf1に対するアプタマー
からなる群から選択される1種または2種以上の物質等が挙げられる。
　ここで、「低分子化合物」とは、分子量10,000以下(好ましくは分子量5,000以下、より好ましくは分子量2,000以下、特に好ましくは分子量700以下)の有機または無機物質を意味する。「高分子化合物」とは、分子量10,000超(好ましくは分子量50,000以上、より好ましくは分子量100,000以上)の有機物質を意味する。
　Nrf1活性は、公知の方法、あるいはそれに準ずる方法にて測定することができる。
　例えば、Nrf1活性のうちNrf1標的遺伝子の転写促進活性は、Nrf1の転写活性化能を見ることにより、例えば、Nrf1の標的遺伝子のプロモーター領域を常法に従って単離し、その下流にレポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ、GFP、ガラクトシダーゼ等の発光、蛍光、発色遺伝子）を連結し、そのレポーター遺伝子の活性を見ることにより、測定することができる。あるいは、Nrf1活性をNrf1タンパク質の安定化を指標として捉える事も可能であり、例えば、Nrf1とレポーター遺伝子の融合タンパク質を発現させ、そのレポーター遺伝子の活性を見ることにより、測定することができる（例えば、特許文献1、後述する実施例3など）。
　Nrf1活性のうちNrf1-Mafヘテロダイマー形成能は、Nrf1とMafのヘテロダイマー形成能を見ることにより、例えば、後述する実施例2の方法のように、BiacoreまたはELISAなどによりNrf1とMafGの直接的な相互作用を評価するアッセイ系により、測定することができる。あるいは、等温滴定型熱量測定（ITC）、解離増強ランタニド蛍光イムノアッセイ（DELFIA）、化学増幅型ルミネッセンスプロキシミティホモジニアスアッセイ（ALPHA）、シンチレーションプロキシミティアッセイ（SPA）、蛍光共鳴エネルギー転移（FRET）、時間分解蛍光共鳴エネルギー転移（TR-FRET）、蛍光偏光（FP）または酵素断片コンプリメンテーション（EFC）等を用いた結合アッセイによって、Nrf1-Mafヘテロダイマー形成能を測定することができる。
　あるいは、Nrf1活性のうちNrf1のARE結合活性は、ChIPアッセイなどによりNrf1のAREへの結合を見ることにより測定することができる。ChIPアッセイによる測定は、公知の方法またはそれに準ずる方法により行うことができる（例えば、Cell Vol.103 pp843-852 (2000)など）。または、後述する実施例2の方法のように、BiacoreまたはELISAなどによりNrf1-MafGヘテロダイマーのARE配列への結合を評価するアッセイ系により、測定することができる。あるいは、等温滴定型熱量測定（ITC）、解離増強ランタニド蛍光イムノアッセイ（DELFIA）、化学増幅型ルミネッセンスプロキシミティホモジニアスアッセイ（ALPHA）、シンチレーションプロキシミティアッセイ（SPA）、蛍光共鳴エネルギー転移（FRET）、時間分解蛍光共鳴エネルギー転移（TR-FRET）、蛍光偏光（FP）または酵素断片コンプリメンテーション（EFC）等を用いた結合アッセイによって、Nrf1のARE結合活性を測定することができる。
(a)Nrf1をコードするポリヌクレオチドに対するsiRNAまたはshRNA
　Nrf1をコードするポリヌクレオチドに対してRNAi作用を有する二重鎖RNA（例、Nrf1をコードするポリヌクレオチドに対するsiRNA、shRNAなど）は、低毒性であり、Nrf1をコードする遺伝子の翻訳を抑制することができ、Nrf1の発現を抑制することができるので、Nrf1の発現を阻害する物質として好適に使用することができる。このような、Nrf1をコードするポリヌクレオチドに対してRNAi作用を有する二重鎖RNAとしては、Nrf1をコードするRNAの一部を含有する二重鎖RNA（例、Nrf1をコードするポリヌクレオチドに対するsiRNA（small (short) interfering RNA）、shRNA（small (short) hairpin RNA）など）などが挙げられる。
　このような二重鎖RNAは、公知の方法（例、Nature, 411巻, 494頁, 2001年; 特表2002-516062号公報; 米国特許出願公開第2002/086356号明細書; Nature Genetics, 24巻, 180-183頁, 2000年; Genesis, 26巻, 240-244頁, 2000年； Nature, 407巻, 319-320頁, 2002年; Genes & Dev.,16巻, 948-958頁, 2002年; Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 99巻, 5515-5520頁, 2002年; Science, 296巻, 550-553頁, 2002年; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99巻, 6047-6052頁, 2002年; Nature Biotechnology, 20巻, 497-500頁, 2002年; Nature Biotechnology, 20巻, 500-505頁, 2002年; Nucleic Acids Res., 30巻, e46, 2002年）に準じて、Nrf1をコードするポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。
　本発明で用いられるRNAi作用を有する二重鎖RNAの長さは、通常、17～30塩基、好ましくは19～27塩基、より好ましくは20～22塩基である。
　ヌクレアーゼによる分解を防ぐために、siRNAのC末端にオーバーハング配列を有してもよく、例えばdTdTをsiRNAのsense鎖およびantisense鎖の各C末端に付加させてもよい。その他、公知の情報を参考に、機能的な観点から適するオーバーハング配列を有してもよい。
　Nrf1阻害剤であるsiRNAの例として、後述する実施例3に記載のNrf1 siRNA（Mol. Cell. Biol., 31巻, 4500-4512頁, 2011年）が挙げられる。また、公知のsiRNAとして、例えば「Nrf1 siRNA(h):sc-43575(Santa Cruz)」、「Nrf1 siRNA(m):sc-43576(Santa Cruz)」（J. Biol. Chem., 282巻, 22052-22061頁, 2007年）、「NFE2L1 Trilencer-27 Human siRNA:SR303155(OriGene)」、「Nfe2l1 Trilencer-27 Mouse siRNA:SR419737(OriGene)」が挙げられる。公知のshRNAとしては、例えば「Nrf1 shRNA Plasmid(h):sc-43575-SH(Santa Cruz)」「Nrf1 shRNA Plasmid(m):sc-43576-SH(Santa Cruz)」、「NFE2L1 Human shRNA:TR311195(OriGene)」、「NFE2L1 Mouse shRNA:TR501459(OriGene)」が挙げられる。
(b)Nrf1をコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチド
　Nrf1をコードするポリヌクレオチド（好ましくはDNA）（以下、アンチセンスポリヌクレオチドの説明においては、これらのDNAを「本発明で用いられるDNA」と略記する場合がある）の塩基配列に相補的な、または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有するアンチセンスポリヌクレオチドとしては、本発明で用いられるDNAの塩基配列に相補的な、または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有し、該DNAの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、いずれのアンチセンスポリヌクレオチドであってもよいが、アンチセンスDNAが好ましい。
　本発明で用いられるDNAに実質的に相補的な塩基配列とは、例えば、本発明で用いられるDNAに相補的な塩基配列（すなわち、本発明で用いられるDNAの相補鎖）の全塩基配列あるいは部分塩基配列と約70%以上、好ましくは約80%以上、より好ましくは約90%以上、最も好ましくは約95%以上の相同性を有する塩基配列などが挙げられる。特に、本発明で用いられるDNAの相補鎖の全塩基配列うち、(i)翻訳阻害を指向したアンチセンスポリヌクレオチドの場合は、Nrf1のN末端部位をコードする部分の塩基配列（例えば、開始コドン付近の塩基配列など）の相補鎖と約70％以上、好ましくは約80％以上、より好ましくは約90％以上、最も好ましくは約95％以上の相同性を有するアンチセンスポリヌクレオチドが、(ii)RNaseHによるRNA分解を指向するアンチセンスポリヌクレオチドの場合は、イントロンを含む本発明で用いられるDNAの全塩基配列の相補鎖と約70％以上、好ましくは約80％以上、より好ましくは約90％以上、最も好ましくは約95％以上の相同性を有するアンチセンスポリヌクレオチドがそれぞれ好適である。
　アンチセンスポリヌクレオチドは通常、10～40個、好ましくは15～30個の塩基から構成される。
　ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、アンチセンスDNAを構成する各ヌクレオチドのりん酸残基（ホスフェート）は、例えば、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオネートなどの化学修飾りん酸残基に置換されていてもよい。また、各ヌクレオチドの糖（デオキシリボース）は、2’－O－メチル化などの化学修飾糖構造に置換されていてもよいし、塩基部分（ピリミジン、プリン）も化学修飾を受けたものであってもよく、本発明で用いられるDNAにハイブリダイズするものであればいずれのものでもよい。これらのアンチセンスポリヌクレオチドは、公知のDNA合成装置などを用いて製造することができる。
　本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、変化せしめられたり、修飾された糖、塩基、結合を含有していて良く、リポゾーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療により適用されたり、付加された形態で与えられることができうる。こうして付加形態で用いられるものとしては、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質（例、ホスホリピド、コレステロールなど）などの疎水性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体（例、コレステリルクロロホルメート、コール酸など）が挙げられる。こうしたものは、核酸の3’端または5’端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。その他の基としては、核酸の3’端または5’端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、RNaseなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。
(c)Nrf1活性を阻害する低分子化合物もしくは高分子化合物
　Nrf1活性を阻害する化合物(塩形態を含む)としては、上記したNrf1活性を阻害しうるものであればよく特に制限はないが、例えば、(1)Nrf1の発現を阻害する化合物、(2)Nrf1の細胞質から核への移行を阻害する化合物、(3)Nrf1-Mafヘテロダイマー形成を阻害する化合物、(4)Nrf1のAREへの結合を阻害する化合物、(5)Nrf1の核から細胞質への移行を促進する化合物などが挙げられる。
　(1)Nrf1の発現を阻害する化合物としては、Nrf1の発現を阻害しうるものであればよく特に制限はないが、例えば、(i)Nrf1をコードする遺伝子(DNA)からNrf1をコードするmRNAへの転写を阻害する化合物、(ii)Nrf1をコードするmRNAからNrf1への翻訳を阻害する化合物などが挙げられる。(i)Nrf1をコードする遺伝子(DNA)からNrf1をコードするmRNAへの転写を阻害する化合物としては、Nrf1をコードする遺伝子(DNA)からmRNAへの転写を阻害するものであればよく特に制限はないが、例えば、Nrf1をコードする遺伝子(DNA)からmRNAへの転写に関与する因子に結合し、転写を阻害する化合物などが挙げられる。(ii)Nrf1をコードするmRNAからNrf1への翻訳を阻害する化合物としては、Nrf1をコードするmRNAからNrf1への翻訳を阻害するものであればよく特に制限はないが、例えば、Nrf1をコードするmRNAからNrf1への翻訳に関与する因子に結合し、翻訳を阻害する化合物などが挙げられる。
　(2)Nrf1の細胞質から核への移行を阻害する化合物としては、Nrf1の細胞質から核への移行を阻害しうるものであればよく特に制限はないが、例えば、(i)Nrf1の分解を調節する化合物、(ii)Nrf1のリン酸化状態を変化させる化合物などが挙げられる。(i)Nrf1の分解を調節する化合物としては、Nrf1の分解を調節することで核への移行を阻害するものであればよく特に制限はないが、例えば、Nrf1の分解制御に関与する因子に作用し、Nrf1の分解を促進する化合物などが挙げられる。(ii)Nrf1のリン酸化状態を変化させる化合物としては、Nrf1のリン酸化状態を変化させることで核への移行を阻害するものであればよく特に制限はないが、例えば、Nrf1のリン酸化に関与する因子に作用し、Nrf1のリン酸化状態を変化させる化合物などが挙げられる。
　(3)Nrf1-Mafヘテロダイマー形成を阻害する化合物としては、Nrf1-Mafヘテロダイマー形成を阻害しうるものであればよく特に制限はないが、例えば、(i)Nrf1がMafと結合することを阻害する化合物、(ii)Mafホモダイマー形成を促進させることで、Nrf1-Mafヘテロダイマー形成を阻害する化合物などが挙げられる。(i)Nrf1がMafと結合することを阻害する化合物としては、Nrf1がMafと結合することを阻害するものであればよく特に制限はないが、例えば、Nrf1とMafの結合領域に結合し、Nrf1がMafと結合することを阻害する化合物、Nrf1に結合することでNrf1の構造変化をもたらし、Nrf1がMafと結合することを阻害する化合物などが挙げられる。(ii)Mafホモダイマー形成を促進させることで、Nrf1-Mafヘテロダイマー形成を阻害する化合物としては、Mafホモダイマー形成を促進させることで、Nrf1-Mafヘテロダイマー形成を阻害するものであればよく特に制限はないが、例えば、Mafの発現を増大させることでMafホモダイマー形成を促進させる化合物などが挙げられる。
　(4)Nrf1のAREへの結合を阻害する化合物としては、Nrf1のAREへの結合を阻害しうるものであればよく特に制限はないが、例えば、(i)Nrf1-Mafヘテロダイマー形成を阻害する化合物、(ii)Nrf1-MafヘテロダイマーがARE配列に結合するのを阻害する化合物、(iii)Mafホモダイマー形成を促進する化合物などが挙げられる。(i)Nrf1-Mafヘテロダイマー形成を阻害する化合物としては、上記の(3)Nrf1-Mafヘテロダイマー形成を阻害する化合物が挙げられる。(ii)Nrf1-MafヘテロダイマーがARE配列に結合するのを阻害する化合物としては、Nrf1-MafヘテロダイマーがARE配列に結合するのを阻害するものであればよく特に制限はないが、例えば、Nrf1-MafヘテロダイマーのARE配列結合領域に結合し、Nrf1-MafヘテロダイマーがARE配列と結合することを阻害する化合物、Nrf1-Mafヘテロダイマーに結合することで構造変化をもたらし、Nrf1-MafヘテロダイマーがARE配列と結合することを阻害する化合物などが挙げられる。(iii)Mafホモダイマー形成を促進する化合物としては、Mafホモダイマー形成を促進するものであればよく特に制限はないが、例えば、Mafの発現を増大させることでMafホモダイマー形成を促進させる化合物などが挙げられる。
　(5)Nrf1の核から細胞質への移行を促進する化合物としては、Nrf1の核から細胞質への移行を促進しうるものであればよく特に制限はないが、例えば、(i)Nrf1の分解を調節する化合物、(ii)Nrf1のリン酸化状態を変化させる化合物などが挙げられる。(i)Nrf1の分解を調節する化合物としては、Nrf1の分解を調節することで細胞質への移行を促進するものであればよく特に制限はないが、例えば、Nrf1の分解制御に関与する因子に作用し、Nrf1の分解を促進する化合物などが挙げられる。(ii)Nrf1のリン酸化状態を変化させる化合物としては、Nrf1のリン酸化状態を変化させることで細胞質への移行を促進するものであればよく特に制限はないが、例えば、Nrf1のリン酸化に関与する因子に作用し、Nrf1のリン酸化状態を変化させる化合物などが挙げられる。
(d)Nrf1をコードするポリヌクレオチドに対するリボザイム
　Nrf1をコードするポリヌクレオチドに対してリボザイム活性を有するポリヌクレオチドは、Nrf1の発現を抑制することができるので、Nrf1の発現を阻害する物質として好適に使用することができる。このようなリボザイムは、公知の方法（例、TRENDS in Molecular Medicine, 7巻, 221頁, 2001年; FEBS Lett., 228巻, 228頁, 1988年； FEBS Lett., 239巻, 285頁, 1988年; Nucl. Acids. Res., 17巻, 7059頁, 1989年; Nature, 323巻, 349頁, 1986年; Nucl. Acids. Res., 19巻, 6751頁, 1991年; Protein Eng. 3巻, 733頁, 1990年; Nucl. Acids Res., 19巻, 3875頁, 1991年; Nucl. Acids Res., 19巻, 5125頁, 1991年; Biochem. Biophys. Res. Commun., 186巻, 1271頁, 1992年など参照）に準じて、本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。例えば、Nrf1をコードするRNAの一部に公知のリボザイムを連結することによって製造することができる。Nrf1をコードするRNAの一部としては、公知のリボザイムによって切断され得るNrf1をコードするRNA上の切断部位に近接した部分（RNA断片）が挙げられる。上記リボザイムには、グループIイントロン型やRNasePに含まれるM1 RNAなどのラージリボザイム、ハンマーヘッド型やヘアピン型などのスモールリボザイムなどが含まれる（タンパク質核酸酵素， 35巻， 2191頁, 1990年）。ハンマーヘッド型リボザイムについては、例えば、FEBS Lett., 228巻, 228頁,  1988年; FEBS Lett., 239巻, 285頁, 1988年; タンパク質核酸酵素, 35巻, 2191頁, 1990年; Nucl. Acids Res., 17巻, 7059頁, 1989年などを参照することができる。また、ヘアピン型リボザイムについては、例えば、Nature, 323巻, 349頁, 1986年; Nucl. Acids Res., 19巻,  6751頁, 1991年; 化学と生物, 30巻, 112頁, 1992年などを参照することができる。
(e)Nrf1に対してドミナントネガティブに作用するNrf1の変異体もしくはそれをコードするポリヌクレオチド
　Nrf1に対してドミナントネガティブに作用するNrf1の変異体もしくはそれをコードするポリヌクレオチドは、Nrf1活性を阻害することができるので、Nrf1活性を阻害する物質として好適に使用することができる。本明細書において、「Nrf1に対してドミナントネガティブに作用するタンパク質の変異体」とは、それが発現することによって、Nrf1活性を阻害（消失もしくは低下）させる作用を有するタンパク質を意味する（多比良和誠編, 遺伝子の機能阻害実験法, 羊土社, 26－32頁, 2001年など参照）。
(f)Nrf1に対するアプタマー
　Nrf1に対するアプタマーは、Nrf1活性や機能を阻害することができるので、Nrf1活性を阻害する物質として好適に使用することができる。アプタマーは、公知の方法、例えばSELEX（systematic evolution of ligands by exponential enrichment）法（Annual Review of Medicine 56巻，555-583頁，2005年）を用いて取得する。アプタマーの構造は、公知の方法を用いて決定することができ、その構造を基に公知の方法に従いアプタマーを製造する。
2.2. 本発明が対象とする疾患
　本発明においては、上述したNrf1阻害剤を含有してなる医薬を、糖尿病の予防または治療剤として用いる。あるいは、本発明においては、上述したNrf1阻害剤を含有してなる医薬を、糖尿病の予防または治療方法に用いる。本発明の医薬は糖尿病に対する予防または治療効果を有するので、糖尿病（１型糖尿病、２型糖尿病、妊娠糖尿病等）の対象に治療目的で適用してもよく、また糖尿病の予防や再発を考慮しなければならない対象に予防目的で適用することもできる。好ましくは治療目的で適用される。「対象」は、ヒト、非ヒト哺乳動物(例えば、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌおよびサル)などであり、好ましくは、ヒトである。
　ここで、「糖尿病」は、日本糖尿病学会の診断基準によるものであり、空腹時血糖値（静脈血漿におけるグルコース濃度）が１２６ｍｇ／ｄｌ以上、７５ｇ経口ブドウ糖負荷試験（７５ｇＯＧＴＴ）２時間値（静脈血漿におけるグルコース濃度）が２００ｍｇ／ｄｌ以上、随時血糖値（静脈血漿におけるグルコース濃度）が２００ｍｇ／ｄｌ以上のいずれかを示す状態である。
　本発明の予防または治療剤および本発明の予防または治療方法(「本発明の予防または治療剤等」)により、糖尿病の少なくとも1つの症状を予防または治療することができる。
2.3.Nrf1阻害剤を含有する本発明の予防・治療剤等
　本発明においては、Nrf1阻害剤を常套手段に従って、製剤化し、糖尿病の予防または治療のための医薬組成物として用いることができる。あるいは、本発明においては、Nrf1阻害剤を常套手段に従って、製剤化し、糖尿病の予防または治療方法のために用いることができる。
　例えば、経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などがあげられる。かかる組成物は自体公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムなどが用いられる。
　非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤などが用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤、関節内注射剤などの剤形を包含する。かかる注射剤は、自体公知の方法に従って、例えば、上記活性成分を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート80、HCO－50（polyoxyethylene(50mol)adduct of hydrogenated castor oil）〕などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。直腸投与に用いられる坐剤は、上記物質を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製される。
　なお前記した各組成物は、上記活性成分との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分（例えば、他の抗糖尿病剤など）を含有してもよい。また、他の活性成分（例えば、他の抗糖尿病剤など）と併用してもよい。
　活性成分(Nrf1阻害剤)の投与量は、その作用、対象疾患、投与対象、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば経口投与する場合、一般的に成人(体重60kgとして)においては、一日につき該活性成分を、約0.1～100mg、好ましくは約1.0～50mg、より好ましくは約1.0～20mg投与する。非経口的に投与する場合は、該活性成分の投与量は、対象疾患、投与対象、症状、投与ルートなどによっても異なるが、注射剤の形で投与する場合、一般的に成人(体重60kgとして)においては、一日につき該活性成分を、約0.01～30mg、好ましくは約0.1～20mg、より好ましくは約0.1～10mgを静脈注射により投与するのが好都合である。人以外の動物の場合も、体重60kg当たりに換算した量を投与することができる。
　上記アンチセンスポリヌクレオチドは、自体公知の方法に従って製剤化し、投与することができる。また、例えば、前記のアンチセンスポリヌクレオチドを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って、ヒトまたは非ヒト哺乳動物（例、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的に投与することができる。該アンチセンスポリヌクレオチドは、そのままで、あるいは摂取促進のために補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。あるいは、エアロゾル化して吸入剤として気管内に局所投与することもできる。さらに、体内動態の改良、半減期の長期化、細胞内取り込み効率の改善を目的に、前記のアンチセンスポリヌクレオチドを単独またはリポゾームなどの担体とともに製剤（注射剤）化し、静脈、皮下、関節腔内、癌病変部等に投与してもよい。上記二重鎖RNA、リボザイム、上記本発明で用いられるタンパク質に対してドミナントネガティブに作用する本発明で用いられるタンパク質の変異体もしくはそれをコードするポリヌクレオチドなどは、上記アンチセンスポリヌクレオチドと同様にして製剤化し、投与することができる。
　上記抗体、アプタマーなどは、それ自体または適当な医薬組成物として投与することができる。上記投与に用いられる医薬組成物は、上記抗体またはその塩と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。かかる組成物は、経口または非経口投与（例、静脈注射）に適する剤形として提供される。好ましくは吸入剤として提供される。
3.糖尿病の予防または治療剤のスクリーニング方法
　本発明は、Nrf1活性の阻害を指標として、上記した糖尿病の予防または治療剤をスクリーニングする方法を提供する。
　本発明のスクリーニング方法は、試験化合物によるNrf1活性の阻害を評価し、Nrf1活性を阻害する化合物を選択することを含む方法である。本発明のスクリーニング方法により選択されたNrf1活性を阻害する化合物は、本明細書に記載の糖尿病の予防または治療剤のための候補化合物となる。
　試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などが挙げられ、これらの化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。試験化合物は塩を形成していてもよく、試験化合物の塩としては、生理学的に許容される金属塩、アンモニウム塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などが挙げられる。金属塩の好適な例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩などのアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩などが挙げられる。有機塩基との塩の好適な例としては、例えばトリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、2，6－ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミン、N，N'－ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩が挙げられる。無機酸との塩の好適な例としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸などとの塩が挙げられる。有機酸との塩の好適な例としては、例えばギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、フタル酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、安息香酸、ベンゼンスルホン酸、p－トルエンスルホン酸などとの塩が挙げられる。塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアルギニン、リジン、オルニチンなどとの塩が挙げられ、酸性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩が挙げられる。
3.1. Nrf1を用いる方法
　本発明の好ましい態様では、Nrf1を用いることを含む、糖尿病の予防または治療剤のスクリーニング方法が提供される。より好ましい態様として、Nrf1活性を阻害する化合物を選択するためにNrf1を用いることを含む、糖尿病の予防または治療剤のスクリーニング方法が提供される。
　いくつかの態様では、(i)試験化合物の存在下で、Nrf1とMafGとを接触させた場合のNrf1とMafGとの結合量を測定し、(ii) 試験化合物の非存在下で、Nrf1とMafGとを接触させた場合のNrf1とMafGとの結合量を測定し、(iii) 前記(i)の場合と(ii)の場合の、Nrf1とMafGとの結合量の比較を行う。そして、前記(i)の場合におけるNrf1とMafGとの結合量が、前記(ii)の場合のNrf1とMafGとの結合量より低くなる試験化合物を、Nrf1活性を阻害する化合物として選択する。
　「接触」とは、Nrf1とMafGとを同一の培養系または反応系に存在させることを意味する。培養条件または反応条件としては、通常用いられる条件またはそれに準じた条件で行うことができる。
　結合量の測定は、公知の方法またはそれに準ずる方法で行うことができる。結合量の測定は、例えば、Biacoreシステム（GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社）等の表面プラズモン共鳴（SPR）、等温滴定型熱量測定（ITC）、DELFIA等の時間分解蛍光（TRF）またはELISAを用いて行うことができる。また、蛍光相関分光法（FCS）／蛍光相互相関分光法（FCCS）、化学増幅型ルミネッセンスプロキシミティホモジニアスアッセイ（ALPHA）、シンチレーションプロキシミティアッセイ（SPA）、蛍光共鳴エネルギー転移（FRET）、LANCE等の時間分解蛍光共鳴エネルギー転移（TR-FRET）、蛍光偏光（FP）または酵素断片コンプリメンテーション（EFC）のようなホモジニアスアッセイ法を用いて、結合量を測定することができる。これらの結合量の測定技術を用いて、ハイスループットスクリーニング（HTS）を行うことができる。
　Biacoreシステムを用いる方法では、結合量の測定を、例えば、センサーチップ上にNrf1を固定化し、MafGをアナライトとして供することにより行う。あるいは、結合量の測定を、例えば、センサーチップ上にMafGを固定化し、Nrf1をアナライトとして供することにより行ってもよい。
　ELISAを用いる方法では、結合量の測定を、例えば、マルチウェルプレートの底面にNrf1を固定化し、そこにMafGを添加し、ウェルを洗浄後、MafGに対する抗体を用いて、ウェル底面のNrf1に対するMafGの結合を確認することにより行う。あるいは、結合量の測定を、例えば、マルチウェルプレートの底面にMafGを固定化し、そこにNrf1を添加し、ウェルを洗浄後、Nrf1に対する抗体を用いて、ウェル底面のMafGに対するNrf1の結合を確認することにより行ってもよい。
　そして、好ましくは、上記(i)の場合におけるNrf1とMafGとの結合量が、上記(ii)の場合のNrf1とMafGの結合量(100%)より、10％以上、20％以上、30％以上、40％以上、50％以上低くなる試験化合物を、Nrf1活性を阻害する化合物として選択する。
　別のいくつかの態様では、(i)試験化合物の存在下で、Nrf1およびMafGとLipin1および／またはPGC－1βのイントロン中のARE配列とを接触させた場合のNrf1およびMafGと前記ARE配列との結合量を測定し、(ii) 試験化合物の非存在下で、Nrf1およびMafGと前記ARE配列とを接触させた場合のNrf1およびMafGと前記ARE配列との結合量を測定し、(iii) 前記(i)の場合と(ii)の場合の、Nrf1およびMafGと前記ARE配列との結合量の比較を行う。そして、前記(i)の場合におけるNrf1およびMafGと前記ARE配列との結合量が、前記(ii)の場合のNrf1およびMafGと前記ARE配列との結合量より低くなる試験化合物を、Nrf1活性を阻害する化合物として選択する。
　「接触」とは、Nrf1およびMafGとARE配列とを同一の培養系または反応系に存在させることを意味する。培養条件または反応条件としては、通常用いられる条件またはそれに準じた条件で行うことができる。
　Lipin1および／またはPGC－1βのイントロン中のARE配列は、好ましくは、後述の実施例に記載の塩基配列である。
　結合量の測定は、公知の方法またはそれに準ずる方法で行うことができる。結合量の測定は、例えば、Biacoreシステム（GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社）等の表面プラズモン共鳴（SPR）、等温滴定型熱量測定（ITC）、DELFIA等の時間分解蛍光（TRF）またはELISAを用いて行うことができる。また、蛍光相関分光法（FCS）／蛍光相互相関分光法（FCCS）、化学増幅型ルミネッセンスプロキシミティホモジニアスアッセイ（ALPHA）、シンチレーションプロキシミティアッセイ（SPA）、蛍光共鳴エネルギー転移（FRET）、LANCE等の時間分解蛍光共鳴エネルギー転移（TR-FRET）、蛍光偏光（FP）または酵素断片コンプリメンテーション（EFC）のようなホモジニアスアッセイ法を用いて、結合量を測定することができる。これらの結合量の測定技術を用いて、ハイスループットスクリーニング（HTS）を行うことができる。
　Biacoreシステムを用いる方法では、結合量の測定を、例えば、センサーチップ上にARE配列を固定化し、Nrf1およびMafGをアナライトとして等量混合して供することにより行う。
　ELISAを用いる方法では、結合量の測定を、例えば、マルチウェルプレートの底面にARE配列を固定化し、そこにNrf1およびMafGを等量混合して添加し、ウェルを洗浄後、Nrf1またはMafGに対する抗体を用いて、ウェル底面のARE配列に対するNrf1-MafGヘテロダイマーの結合を確認することにより行う。
　そして、上記(i)の場合におけるNrf1およびMafGとARE配列との結合量が、上記(ii)の場合のNrf1およびMafGとARE配列との結合量(100%)より、10％以上、20％以上、30％以上、40％以上、50％以上低くなる試験化合物を、Nrf1活性を阻害する化合物として選択する。
　このようにして選択されたNrf1活性を阻害する化合物は、糖尿病の予防または治療剤のための候補化合物となり得る。
　また、上記のようにしてNrf1活性を阻害する化合物をスクリーニングする方法は、Nrf1-MafGヘテロダイマー形成能を阻害する化合物、あるいはNrf1のARE結合活性を阻害する化合物をスクリーニングする方法であり、Nrf1の転写因子としての機能に基づいたスクリーニング方法である。このようなスクリーニング方法によって、Nrf1阻害剤を簡便にスクリーニングすることができ、本発明はそのような方法をも提供する。特に、Nrf1-MafGヘテロダイマー形成能を阻害する化合物のスクリーニング方法は、AREに結合する他の転写因子と差別化し得るより特異的なスクリーニング方法となり得る。
3.2. Nrf1-標識融合タンパク質発現細胞を用いることを含む方法
　本発明の別の好ましい態様では、Nrf1-標識融合タンパク質発現細胞を用いることを含む、糖尿病の予防または治療剤のスクリーニング方法を提供する。より好ましい態様として、Nrf1活性を阻害する化合物を選択するためにNrf1-標識融合タンパク質発現細胞を用いることを含む、糖尿病の予防または治療剤のスクリーニング方法が提供される。
　いくつかの態様では、(i)試験化合物をNrf1-標識融合タンパク質発現細胞と接触させた場合の該細胞におけるNrf1-標識融合タンパク質量を測定し、(ii)試験化合物をNrf1-標識融合タンパク質発現細胞に接触させない場合の該細胞におけるNrf1-標識融合タンパク質量を測定し、(iii)前記(i)の場合と(ii)の場合のNrf1-標識融合タンパク質量の比較を行う。そして、前記(i)の場合におけるNrf1-標識融合タンパク質量が、前記(ii)の場合のNrf1-標識融合タンパク質量より低くなる試験化合物を、Nrf1活性を阻害する化合物として選択する。
　「接触」とは、試験化合物とNrf1-標識融合タンパク質発現細胞とを同一の培養系に存在させることを意味する。培養条件としては、通常用いられる条件またはそれに準じた条件で行うことができる。
　「Nrf1－標識融合タンパク質」は、Nrf1と標識タンパク質(例えば、ルシフェラーゼ、GFP、ガラクトシダーゼ等の発光、蛍光、発色タンパク質)との融合タンパク質のことを指す。融合タンパク質におけるNrf1は、CNC-bZipドメインを欠失したものであるのが好ましい。
　本方法においては、まず、Nrf1-標識融合タンパク質発現細胞に、試験化合物を接触させる。用いる細胞は特に限定はされないが、哺乳動物由来細胞が好ましく、肝細胞、肝癌由来細胞株などが好適である。本発明のスクリーニング方法で用いられる「Nrf1-標識融合タンパク質細胞」は、一般的な遺伝子工学技術によって作製することができる。
　次に、Nrf1-標識融合タンパク質量を測定する。具体的には、例えば、上記(i)と(ii)の場合において、上記細胞を培養し、それぞれの場合のNrf1-標識融合タンパク質量を測定する。Nrf1-標識融合タンパク質量の測定は、公知の方法、あるいはそれに準ずる方法にて測定することができる。具体的には、融合タンパク質の標識タンパク質(例えば、ルシフェラーゼ、GFP、ガラクトシダーゼ等の発光、蛍光、発色タンパク質)の活性を測定する。
　次いで、試験化合物を接触させない場合(コントロール)と比較して、Nrf1-標識融合タンパク質量が低くなる化合物を選択する。好ましくは、上記(i)の場合におけるNrf1-標識融合タンパク質量が、上記(ii)の場合のNrf1-標識融合タンパク質量(100%)より低くなる化合物、特には、10％以上、20％以上、30％以上、40％以上、50％以上低くなる化合物を、Nrf1活性を阻害する化合物として選択する。
　このようにして選択されたNrf1活性を阻害する化合物は、糖尿病の予防または治療剤のための候補化合物となり得る。
3.3. 抗糖尿病効果の確認
　本発明のさらに好ましい態様では、選択されたNrf1活性を阻害する化合物を非ヒト実験動物(マウス、ラットなど)に投与して、選択されたNrf1活性を阻害する化合物の抗糖尿病効果を確認する。そして、抗糖尿病効果を確認できた化合物を、糖尿病の予防または治療薬の候補化合物として選択する。非ヒト実験動物は、好ましくは、糖尿病モデル非ヒト実験動物（例えば、糖尿病モデルマウス）である。糖尿病モデル非ヒト実験動物は、公知の方法またはそれに準ずる方法で作製し、あるいは、入手することができる。
　好ましくは、Nrf1活性を阻害する化合物を接触させた非ヒト実験動物において標的とする疾患と相関関係を有する物質の指標値（例えば血糖値、あるいは血中又は他組織のインスリン濃度）を測定し、対照と比較し、この比較結果に基づいて、糖尿病の症状を軽減または消滅させるか否かを確認することで、糖尿病の予防または治療剤の候補化合物をスクリーニングすることができる。対照は、例えば、Nrf1活性を阻害する化合物を接触しない非ヒト実験動物である。
　接触させる方法としては、例えば、投与、より具体的には、経口投与、静脈注射、塗布、皮下投与、皮内投与、腹腔投与などが用いられ、非ヒト動物の症状、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。また、試験化合物の投与量は、投与方法、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。
　より好ましくは、Nrf1活性を阻害する化合物を接触させた非ヒト実験動物の血糖値を測定し、当該測定された血糖値がNrf1活性を阻害する化合物を接触しない非ヒト実験動物における血糖値よりも低下したときは、前記化合物を、糖尿病の予防または治療剤の候補化合物として選択することができる。
　さらに好ましくは、Nrf1活性を阻害する化合物を接触させた非ヒト実験動物の血糖値および血漿中インスリン濃度を測定し、当該測定された血糖値および血漿中インスリン濃度がNrf1活性を阻害する化合物を接触しない非ヒト実験動物における血糖値および血漿中インスリン濃度よりも低下したときは、前記化合物を、インスリン抵抗性改善作用を有する糖尿病の予防または治療剤の候補化合物として選択することができる。もしくは、Nrf1活性を阻害する化合物を接触させた非ヒト実験動物に一定量のインスリンを腹腔内投与し、一定時間後の血糖値を測定し、当該測定された血糖値がNrf1活性を阻害する化合物を接触しない非ヒト実験動物における血糖値よりも低下したときは、前記化合物を、インスリン抵抗性改善作用を有する糖尿病の予防または治療剤の候補化合物として選択することができる。もしくは、Nrf1活性を阻害する化合物を接触させた非ヒト実験動物の頸静脈にカニューレ挿入し一定量のインスリンを持続注入し、血糖値が一定に保たれるようにグルコース溶液を持続注入し、当該測定されたグルコース溶液の注入率がNrf1活性を阻害する化合物を接触しない非ヒト実験動物における注入率よりも増加したときは、前記化合物を、インスリン抵抗性改善作用を有する糖尿病の予防または治療剤の候補化合物として選択することができる。
　また、Nrf1活性を阻害する化合物を接触させた非ヒト実験動物の膵臓組織切片における膵島のインスリン陽性面積を測定し、当該測定されたインスリン陽性面積がNrf1活性を阻害する化合物を接触しない非ヒト実験動物におけるインスリン陽性面積よりも増大したときは、前記化合物を、β細胞保護作用を有する糖尿病の予防または治療剤の候補化合物として選択することができる。もしくは、Nrf1活性を阻害する化合物を接触させた非ヒト実験動物の膵臓組織切片における膵島のTUNEL染色陽性細胞の比率を測定し、当該測定されたTUNEL染色陽性細胞の比率がNrf1活性を阻害する化合物を接触しない非ヒト実験動物におけるTUNEL染色陽性細胞の比率よりも減少したときは、前記化合物を、β細胞保護作用を有する糖尿病の予防または治療剤の候補化合物として選択することができる。
　特に好ましくは、Nrf1活性を阻害する化合物を接触させた非ヒト実験動物の血糖値、血漿中インスリン濃度および膵臓組織切片における膵島のインスリン陽性面積を測定し、当該測定された血糖値および血漿中インスリン濃度がNrf1活性を阻害する化合物を接触しない非ヒト実験動物における血糖値および血漿中インスリン濃度よりも低下し、当該測定されたインスリン陽性面積がNrf1活性を阻害する化合物を接触しない非ヒト実験動物におけるインスリン陽性面積よりも増大したときは、前記化合物を、インスリン抵抗性改善作用およびβ細胞保護作用を有する糖尿病の予防または治療剤の候補化合物として選択することができる。もしくは、前記のインスリン抵抗性改善作用を有する糖尿病の予防または治療剤の候補化合物として選択する方法の何れかの方法と、前記のβ細胞保護作用を有する糖尿病の予防または治療剤の候補化合物として選択する方法の何れかの方法を組合わせることで選択された化合物を、インスリン抵抗性改善作用およびβ細胞保護作用を有する糖尿病の予防または治療剤の候補化合物として選択することができる。
4. トランスジェニック非ヒト動物
　本発明は、Nrf1をコードする遺伝子及びMafG調節ドメインを含む組換体DNAを少なくとも1コピー保有し、かつ食事誘発性肥満（DIO）モデルである、トランスジェニック非ヒト動物を提供する。
　Nrf1をコードする遺伝子及びMafG調節ドメインを含む組換体DNAは、例えば、後述の実施例に記載の方法またはそれに準ずる方法で作製することができる。本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、この組換体DNAを少なくとも1コピー、好ましくは、1～5コピー、より好ましくは、4コピー保有する。
　本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、遺伝子組換え技術を用いて上記組換体DNAを非ヒト動物のゲノムに導入することによって得ることができる。本発明に用いられる非ヒト動物は、マウス、ラットなどの実験動物であり、好ましくはマウスである。
　トランスジェニック非ヒト動物の作製は、標準的な方法、例えば、初期受精卵を用いたマイクロインジェクション法、またはES細胞による導入法を用いることで行うことができる。導入遺伝子の確認は、公知の方法またはそれに準ずる方法で行うことができる。
　「食餌誘発性肥満(DIO)モデル」とは、一定期間高脂肪食餌、または高脂肪および高スクロース食餌を与えることで肥満を誘発した非ヒト動物である。
　本発明の好ましい態様のトランスジェニック非ヒト動物は、インスリン抵抗性を誘発し、糖尿病を発症していることから、糖尿病モデルとして使用することができる。
　さらに、本発明は、糖尿病を発症したトランスジェニック非ヒト動物に、試験化合物を接触することを含む、糖尿病の予防または治療剤のスクリーニング方法を提供する。
　具体的には、前記試験化合物を接触させた非ヒト動物において標的とする疾患と相関関係を有する物質の指標値（例えば血糖値、あるいは血中又は他組織のインスリン濃度）を測定し、対照と比較し、この比較結果に基づいて、糖尿病の症状を軽減または消滅させるか否かを確認することで、糖尿病の予防または治療剤の候補化合物をスクリーニングすることができる。
　具体的には、試験化合物を接触させた非ヒト動物の血糖値を測定し、当該測定された血糖値が試験化合物を接触しないトランスジェニック非ヒト動物における血糖値よりも低下したときは、前記試験化合物を、糖尿病の予防または治療剤の候補化合物として選択することができる。
　接触させる方法としては、例えば、投与、より具体的には、経口投与、静脈注射、塗布、皮下投与、皮内投与、腹腔投与などが用いられ、非ヒト動物の症状、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。また、試験化合物の投与量は、投与方法、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。
　例えば、ある試験化合物を投与した場合に、糖尿病の症状が緩和もしくは消失したことが確認できる結果が得られれば、用いた試験化合物を、糖尿病の予防または治療剤の候補化合物として選択することが可能である。
　なお、本明細書に記載した全ての文献及び刊行物は、その目的にかかわらず参照によりその全体を本明細書に組み込むものとする。
　以下、本発明を実施例を用いて具体的に説明するが、本発明は、実施例に限定されるものではない。
1. 材料および方法
1.1. マウス
　Nrf1ノックアウトマウス(Ohtsujiら、2008)は、5世代超にわたり、C57BL/6Jのバックグラウンドへと戻し交配させた。MGRD-Nrf1-FLAGは、MGRDベクター(Yamazaki et al., (2012) Mol Cell Biol, 32, 808-816)およびpcDNA3.1/V5-HisB mNrf1ベクターからPCRにより増幅したマウスNrf1のcDNA(University of DundeeのJohn Hayes教授によるご恵与)を使用して構築した。直鎖化の後、標準的なトランスジェニックマウス手順(Ainoya et al., (2012) Mol Cell Biol, 32, 2312-2322)に従い、構築物を、BDF1×BDF1受精卵へと注射した。以下のプライマーを用いるPCRにより、6匹の導入遺伝子陽性樹立系統マウスを同定した。
　フォワードプライマー：5’-GCTCACTGTGTCCCCCTCGAG-3’（配列番号：17）
　リバースプライマー：5’-ATCCACGTCCACCCGAACCC-3’ （配列番号：18）
　得られたNrf1-Tgマウスを、C57BL/6Jマウスへと戻し交配させ、3～4世代の間にわたり戻し交配を施されたマウスについて解析した。
　DIOモデル研究のため、10週間にわたり、マウスにHFD(HFD-60、5.06kcal/gで、62.2%の脂肪によるカロリーを含有する;Oriental Yeast)を施し、6週齢から開始した。全ての動物実験は、「国立大学法人東北大学における動物実験等に関する規定」に従い実行した。
1.2. 血中グルコースおよび血漿インスリンの測定
　血液試料を、尾から採取した。One-touch-ultra view血中グルコース解析器(LifeScan)により、血中グルコースレベルを決定した。血漿インスリンレベルは、製造元の指示書に従い、Mouse Insulin ELISAキット(株式会社森永生科学研究所)を用いることにより測定した。
1.3. 血液生化学試験の測定
　血液生化学試験のために、イソフルランで麻酔をかけた後、血液試料を、下大静脈から採取した。血清ALTレベルおよび血漿アンモニアレベルは、DRI-CHEM7000(富士フィルム株式会社)により測定した。血漿β-ヒドロキシ酪酸レベルは、製造元の指示書に従い、β-Hydroxybutyrate(Ketone Body) Fluorometric Assay Kit(Cayman)を使用することにより測定した。
1.4. 耐糖試験およびインスリン耐性試験
　耐糖試験(GTT)のために、一晩にわたる絶食の後、グルコース(体重(BW)1kg当たり1.5g)を、マウスへと腹腔内投与した。インスリン耐性試験(ITT)のために、4時間にわたる絶食の後、レギュラーインスリン(Humulin-R、Eli-Lilly; BW 1kg当たり、0.75または1.5U)を、マウスへと腹腔内投与した。
1.5. 正常血糖高インスリンクランプ試験
　頸静脈へのカニューレ挿入後、シリンジポンプ(Pump 11 Elite、Harvard apparatus)を用いて、マウスに、ヒトレギュラーインスリン(Humulin-R、Eli-Lilly; BW 1kg当たり、1分間当たり、5mU)を持続的に注入した。マウスにはまた、50%のグルコースも、速度を変化させながら注入して、血中グルコースレベルを、120mg/dLに維持した。インスリン抵抗性レベルは、血中グルコースレベルをクランプしたときのグルコース注入速度により決定した。
1.6. RNAの精製およびmRNAの定量化
　ISOGEN試薬(株式会社ニッポンジーン)を使用して全RNAを抽出し、製造元の指示書に従いPrimeScript RT Master Mix(タカラバイオ株式会社)を用いる逆転写(RT)反応にかけた。補遺表で記載されるプライマーを用いるABI 7300システムと共に、qPCR Mastermix(Eurogentec)またはTHUNDERBIRD qPCR Mix(東洋紡株式会社)を用いる定量的リアルタイムPCR法により、遺伝子の発現レベルを決定した。Gapdhの発現レベルは、Rodent GAPDH Control Reagentsキット(Applied Biosystems)を用いるqPCR法により測定した。遺伝子の発現レベルは、Hprt(ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼをコードする)の遺伝子の発現レベルで標準化した。
1.7. 免疫組織化学
　免疫組織化学は、既に記載されている(Uruno et al., (2013) Mol Cell Biol, 33, 2996-3010.; Yagishita et al., (2014) Diabetes, 63,605-618)通りに実施した。略述すると、マウスにイソフルランで麻酔をかけた後、膵臓を新鮮なまま摘出し、Mildform(和光純薬工業株式会社)中で固定し、その後、パラフィン中に包埋した。
1.8. CE-TOF/MS解析
　肝臓試料(約50mg)を、内部標準であるメチオニンスルホンおよびCSA(各50マイクロモル/Lずつ)を含有する500μLのメタノール中に浸漬した。試料を、Precellys-24 (Bertin Technologies)により、5,000rpmで、30秒間ずつ2回にわたりホモジナイズした。次いで、500μLのクロロホルムおよび200μLのH2Oを添加した。試料を十分に混合し、2,300×gで5分間にわたり遠心分離した後、上部の水性層を、カットオフが5kDaのフィルター(Human Metabolome Technologies)で濾過して、タンパク質を除去した。濾過された試料を減圧下で乾燥させ、ペレットを、25μLのH2O中に懸濁させた。抽出された代謝物の測定は、電気泳動用緩衝液(Human Metabolome Technologies)を伴うCE-TOF/MS(Agilent G7100シリーズ; Agilent Technologies)システム、および質量分析システム(Agilent G6200シリーズTOF用; Agilent Technologies)により実施した。代謝物の含有量レベルは、慶應義塾大学により作製されたMasterHandsソフトウェアを使用することにより定量化した。
1.9. タンパク質調製および免疫ブロット解析
　Nrf1の免疫ブロット解析のために、肝臓の細胞小器官の分画を実施した。新鮮なまま摘出された肝臓(約1.0g)を、小塊へと切り刻み、ガラス製の丸底型ホモジナイザー(Wheaton)内の、0.25モル/LのスクロースおよびComplete-miniプロテアーゼ阻害剤カクテル(EDTA-free; Roche)を含有する1.5mLの氷冷トリス-HCl緩衝液(25ミリモル/L;PH8.0)中で、3～4ストロークにわたりホモジナイズした。ホモジネートを、100μmの細胞ストレーナー(BD Falcon)を介して濾過して、結合組織を除去した。
　核タンパク質、ミトコンドリアタンパク質、小胞体(ER) タンパク質、および細胞質ゾルタンパク質を個別に検討するため、核を、低速遠心分離(4℃、1,000×gで10分間にわたる)により、濾過された溶解物からペレットとして調製した。その後、1,000×gの上清を回収し、ミトコンドリアを、高速遠心分離(4℃、8,000×gで10分間にわたる)によりペレットとして調製した。最後に、8,000×gの上清を回収し、ERタンパク質を、超高速遠心分離(4℃、105,000×gで60分間にわたる)によるペレットとして回収した。上清画分を、細胞質ゾルタンパク質として用いた。全ての細胞小器官ペレットは、RIPA緩衝液で溶解させた。Aktについての免疫ブロット解析のためには、肝臓の全溶解物を既に記載されている通りに調製した(Hirotsu et al., (2012) Mol Cell Biol, 32, 2760-2770)。
　試料は、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、Immobilon membrane(Millipore)へと転写した。免疫ブロット解析は、以下の抗体:ウサギ抗Nrf1ポリクローナル抗体(1:5,000、辻田忠志博士(東北大学)によるご恵与)、マウス抗α-チューブリンモノクローナル抗体(Sigma T9026、1:5,000)、マウス抗増殖細胞核抗原(PCNA) モノクローナル抗体(1;500、Philip Coates博士(University of Dundee)によるご恵与)、ウサギ抗リン酸化Akt(Ser-473) ポリクローナル抗体(Cell Signaling Technology:#9271;1:1,000)およびウサギ抗全Aktポリクローナル抗体(Cell Signaling Technology:#9272;1:1,000)( Uruno et al., (2004) Hypertens Res, 27, 887-895；およびUruno et al., (2005) Circulation, 112, 727-736)を用いて実施した。
1.10. 統計学的解析
　全てのデータは、平均±平均の標準誤差(SEM)として示す。統計学的解析は、スチューデントのt検定、マン-ホイットニーのU検定、または分散分析(ANOVA)の後、多重比較のためのフィッシャーの最小有意差(LSD)による事後検定を実施した。
2. 結果
2.1. SNP rs3764400は、NRF1の遺伝子発現を調節する
　SNP rs3764400は、5×10-6以内のP値でBMIと関連することが示されている(Speliotes et al., (2010) Nat Genet, 42, 937-948)。rs3764400は、NRF1の遺伝子転写開始部位(TSS)の1.8kb上流に存在することから(図1A)、まず、このSNPが、NRF1遺伝子の転写活性に影響を及ぼすのかどうかを決定した。対照T対立遺伝子またはリスクC対立遺伝子を伴うrs3764400を包含する、NRF1調節エレメントの2.1kbゲノムDNAを、レポーターベクターであるpGL4.22へとクローニングした(それぞれ、NRF1-T-lucおよびNRF1-C-luc)(図1A)。これらの構築物の、ヒト培養肝癌細胞株であるHep3BおよびHepG2におけるルシフェラーゼ(Luc)活性について検討した。NRF1-T-lucのLuc活性は、Hep3B細胞では、対照のpGL4.22ベクターのLuc活性と比較して増大したが、HepG2 細胞では増大しなかった(図1B)。重要なことは、NRF1-C-lucのLuc活性が、NRF1-T-lucのLuc活性と比較して大きく増大し、Hep3B細胞では2.2倍となり、HepG2細胞では4.0倍となったことである(図1B)。これらのデータは、肥満に関連するrs3764400が、NRF1遺伝子の調節SNPであり、リスクC対立遺伝子からの遺伝子の発現レベルが、対照T対立遺伝子からの遺伝子の発現レベルよりはるかに高いことを示す。
2.2. Nrf1トランスジェニックマウスの創出
　rs3764400のリスクC対立遺伝子が、NRF1遺伝子の転写活性を増大させたので、Nrf1発現の増大が、代謝に影響を及ぼし、肥満を誘導すると仮定した。この点では、アルブミンプロモーター駆動型Creレコンビナーゼを使用する肝臓特異的Nrf1条件付けノックアウトマウスが、重度の肝機能障害を示すものの、Nrf1の機能喪失解析は、解釈可能な情報をもたらさない。したがって、Nrf1を過剰発現させるトランスジェニックマウス系統を創出して、機能獲得解析を介して、Nrf1の代謝調節への寄与について評価することにした。小Maf(sMaf)タンパク質のうちの1つであるMafGは、CNCファミリーの転写因子の鍵となるパートナー分子であり、マウス組織において広範に発現するので、MafG調節ドメイン(MGRD)( Yamazaki et al., (2012) Mol Cell Biol, 32, 808-816)を利用して、C末端において3XFLAGでタグ付けされたNrf1を、トランスジェニックマウスにおいて発現させた(図2A)。
　1コピー(低コピー数の系統5)の導入遺伝子および4コピー(高コピー数の系統1および6)の導入遺伝子を保有する、3つのNrf1トランスジェニック(Nrf1-Tg)マウス系統を創出した(データは示さない)。肝臓、白色脂肪組織(WAT)、骨格筋(SkM)、脳、および褐色脂肪組織(BAT)におけるトランスジェニックNrf1 mRNAの発現について検討し、発現レベルを、mRNAレベルの、野生型(WT)マウスにおける内因性のNrf1 mRNAの発現からの上昇として評価した。トランスジェニックNrf1 mRNAは、検討された全ての組織において発現し、上昇は、BATの場合を除き、高コピー数の系統1および6(高発現系統)において、低コピー数の系統5(低発現系統)におけるより高度となる傾向があった(図2B)。
　また、Nrf1-Tgマウスの肝臓におけるNrf1タンパク質の発現レベルについても検討した。系統1の高発現系統マウスを、この目的で用いた。免疫ブロット解析は、Nrf1が、Nrf1-Tgマウスの核において、WTマウスの核におけるよりはるかに高量で蓄積されることを明らかにした(図2C)。これに対し、Nrf1タンパク質の細胞質ゾルにおける発現は、WTマウスとNrf1-Tgマウスとの間で同等であった(図2C)。
　トランスジェニックNrf1が、正常な機能を果たすかどうかを検証するため、トランスジェニックレスキューモデルを創出した。この目的で、Nrf1トランスジェニックマウスの系統6を、Nrf1ノックアウトマウスと交雑させた(Hirotsu et al., (2012) Mol Cell Biol, 32, 2760-2770)。ホモ接合性のNrf1ノックアウトマウスは、胚性致死を示すが、トランスジェニックレスキューマウス(Nrf1-/-::Nrf1-Tg)は、生存可能であり、繁殖可能であった(データは示さない)。重要なことは、これらのレスキューマウスが、WTマウスと同等のALTレベルを示し(図2D)、これは、肝臓特異的Nrf1条件付けノックアウトマウスの結果(Hirotsu et al., (2012) Mol Cell Biol, 32, 2760-2770)と明らかに対照的なことである。これらの結果は、本研究で創出されたNrf1-Tgマウスが、in vivoにおける生理学的機能を果たすNrf1を発現させることを実証する。
2.3. Nrf1は、マウスの体重レベルを低下させる
　Nrf1発現の増大が、GWASの結果と合致して、肥満を誘導するのかどうかに取り組むため、まず、Nrf1-Tgマウスの体重レベルについて検討した。予測とは対照的に、高コピー数のNrf1-Tgマウス(系統1および6)は、WTマウスより低い体重レベルを示した(図3A)。体重増加の差は、7週齢までに明らかなものとなり、統計学的に有意となった。体重増加の差は、観察期間(16週間)にわたり存続した。
　次いで、Nrf1が代謝ストレスのかかった状態において果たす役割を検討するため、食餌誘発性肥満(DIO)モデルマウスの体重レベルを評価した。WTマウスおよびNrf1-Tgマウスへの高脂肪食餌(HFD)による給餌を、6週齢から開始し、体重レベルを10週間にわたり測定した。HFDによる給餌は、WTマウスの体重レベルを、通常食餌(ND)による給餌と比較して増大させた。これに対し、HFDを施されたNrf1-Tgマウス(系統1および6の両方)の体重レベルは、HFDを施されたWTマウスの体重レベルより有意に低かった(図3B)。低コピー数の系統5の体重レベルは、NDを施される条件およびHFDを施される条件のいずれにおいても、WTマウスと同等であった(データは示さない)。これらのデータは、Nrf1レベルの上昇が、NDを施される条件およびHFDを施される条件のいずれにおいても、マウスの体重を低下させることを示す。
2.4. Nrf1は、食餌誘発性肥満モデルマウスにおいて、糖尿病を発症させる
　次に、Nrf1が、DIOモデルマウスの耐糖能を改善するのかどうかに取り組んだ。DIOモデルのNrf1-Tgマウスの高コピー数の系統における血中グルコースレベルについて検討し、HFDを施されたWTマウスの血中グルコースレベルが、NDを施されたWTマウスの血中グルコースレベルと比較してやや上昇することを見出した(図3C)。驚くべきことに、Nrf1-Tgマウスの2つの系統の血中グルコースレベルは、HFDによる給餌の後で強く上昇し、約400mg/dLに達した(図3C)。10週間にわたりHFDを施された後の低コピー数のNrf1-Tgマウス(系統5)における血中グルコースレベルは、WTマウスと比較してやや上昇した(WT同腹マウスにおける183±11mg/dLと対比した、Nrf1-Tgにおける240±20)。
　次に、インスリン耐性試験(ITT)を実行した。インスリン注射後における、HFDを施されたNrf1-Tgマウス(高コピー数の系統1および6)の血中グルコースレベルが、WTマウスの血中グルコースレベルより顕著に高かった(図3D)ことから、Nrf1が、インスリン抵抗性を誘発することが示される。したがって、これらの結果は、Nrf1の発現の上昇は、DIOモデルマウスにおいて、糖尿病を発症させることを実証する。
2.5. Nrf1は、非肥満マウスにおいて、インスリン抵抗性を誘導する
　次いで、Nrf1が、どのようにして糖尿病を発症させるのかという機構を検討するため、NDを施されたマウスを用いることにより、Nrf1の誘導の、グルコース代謝に対する影響について検討した。インスリン抵抗性を評価するために、NDを施されたNrf1-Tgマウス(高コピー数の系統1)の正常血糖高インスリンクランプ試験を実行した。注目すべきは、Nrf1-Tgマウスでは、WTマウスと比較して、グルコースの注入速度が大きく低下したことである(図4A、左パネル)。クランプされたグルコースレベルは、WTマウスとNrf1-Tgマウスとの間で同等であった(図4A、右パネル)。膵臓切片は、Nrf1-Tgマウスの膵島が、WTマウスの膵島よりはるかに大きいことを明らかにした(図4B、上パネル)。加えて、Nrf1-Tgマウスでは、膵臓切片において定量化されたインスリン陽性面積も、WTマウスと比較して増大した(図4B、下パネル)ことから、Nrf1-Tgマウスでは、全身性のインスリン抵抗性に応答して、インスリン分泌が構成的に活性化することが示唆される。これらのデータは、Nrf1が、ND給餌の条件下においてもなお、インスリン抵抗性を強く誘導するという主張を裏付ける。
　また、Nrf1の発現レベルとインスリン抵抗性との間の関係も評価した。高コピー数のNrf1-Tgマウス(系統1および6)では、血中グルコースレベル(図4C)および血漿インスリンレベル(図4D)のいずれもが、WTマウスと比較して上昇した。低コピー数の系統5の血中グルコースレベルが、WTマウスの血中グルコースレベルと同等であったのに対し、系統5の血漿インスリンレベルは、WTマウスの血漿インスリンレベルと比較して、明確に上昇した。これらの結果は、Nrf1-Tgマウスにおけるインスリン抵抗性の存在を明確に示す。
　ITTの結果はこれまでの結果との極めて良好な一致を示し、Nrf1-Tgマウス(系統1および6)の血中グルコースレベルが、WTマウスの血中グルコースレベルより有意に高いことを実証した(図4E)。ITTにおいて、低コピー数のNrf1-Tgマウス(系統5)は、系統1および6と比較して、インスリンに対する応答の障害が比較的軽度であることを示した(図4E)。AUCの結果は、血中グルコースの結果と符合した。これらのデータは、Nrf1レベルの上昇が実際に、インスリン抵抗性を誘導し、インスリン抵抗性の大きさが、Nrf1の発現レベルと良好に相関することを実証する。
2.6. Nrf1は、肝臓における解糖関連遺伝子の発現レベルを低下させる
　Nrf1誘導型インスリン抵抗性についての1つの妥当な説明は、Nrf1によりインスリンシグナルが破綻するという仮説である。この可能性に取り組むために、Aktのリン酸化についての免疫ブロット解析により、肝臓およびSkMにおけるインスリンシグナルについて検討した。インスリン投与が、HFDを施されたWTマウスの肝臓およびSkMにおけるAktのリン酸化(Ser-473)を増大させた(図5A)のに対し、Nrf1-Tgマウスでは、肝臓およびSkMのいずれにおいても、Aktのリン酸化が悪化することを見出した。これらのデータは、Nrf1が、肝臓およびSkMにおけるインスリンシグナルを抑制するという考えを強く裏付ける。
　肝臓におけるグルコース代謝に焦点を当て、インスリンシグナルの悪化が、インスリン調節解糖関連遺伝子(O'Brien et al., (1996) Physiol Rev, 76, 1109-1161；および O'Brien et al., (2001) Biochem Soc Trans, 29, 552-558)、例えば、Gck(グルコキナーゼをコードする; Magnuson et al., (1989) Proc Natl Acad Sci U S A, 86, 4838-4842)、Aldob(アルドラーゼB; Simon et al, (1983) J Biol Chem, 258, 14576-14584；および Gomez et al., (1994) Arch Biochem Biophys, 314, 307-314)、Pgk1(ホスホグリセリン酸キナーゼ1; Yim et al., (2003) J Biol Chem, 278, 38260-38268)、Pklr(ピルビン酸キナーゼ; Matsuda et al., (1990) J Biochem 108, 778-784)、およびGapdh(グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ; Alexander-Bridges et al., (1992) Adv Enzyme Regul, 32,
149-159)の肝臓における発現を実際に低下させるのかどうかについて検討した。Gapdhを除くこれらの遺伝子全ての発現レベルが、HFDを施されたNrf1-Tgの肝臓では、WTの肝臓と比較して低下することを見出した(図5B)。
　インスリン調節解糖関連遺伝子に加えて、また、グルコース輸送体2(GLUT2)遺伝子をコードするSlc2a2の発現レベルについても検討した。Slc2a2の発現は、高グルコースにより正に調節される(Thorens et al., (1990) Proc Natl Acad Sci U S A, 87, 6492-6496；および Asano et al., (1992) 
Diabetes, 41, 22-25)か、またはインスリンにより負に調節される(Postic et al., (1993) Biochem J 293 (Pt 1), 119-124)が、Nrf1-Tgの肝臓では、Slc2a2の発現が、WTの肝臓と比較して低下した(図5B)。したがって、これらのデータは、Nrf1が、肝臓におけるインスリン調節解糖関連遺伝子およびグルコース輸送体遺伝子の発現を抑制することを示す。
　また、それらの発現レベルがインスリンにより負に調節される糖新生関連遺伝子についても検討した(Jitrapakdee (2012) Int J Biochem Cell Biol, 44, 33-45)。予測に反して、Nrf1-Tgマウスの肝臓では、インスリンシグナルの障害にもかかわらず、糖新生酵素をコードする2つの重要な遺伝子であるFbp1およびPck1の発現レベルがむしろ抑制された(図5C)ことから、Nrf1が、見かけのインスリン抵抗性の条件にも関わらず糖新生関連遺伝子の発現を抑制することが示される。まとめると、これらの結果は、Nrf1が、解糖関連遺伝子および糖新生関連遺伝子の両方の発現を抑制することにより、肝臓におけるグルコースの使用および産生の両方を減弱させることを示唆する。
2.7. Nrf1は、解糖経路の流入は抑制するが、TCAサイクルの流入は増大させる
　Nrf1-Tgマウスにより、解糖関連遺伝子および糖新生関連遺伝子の両方の発現レベルの下方調節が実証されたので、次に、キャピラリー電気泳動飛行時間質量分析(CE-TOF/MS)を使用して、グルコース代謝物レベルについて検討した。Slc2a2遺伝子およびGck遺伝子の抑制が、Nrf1-Tgの肝臓におけるG6Pを減少させると予測されるため、まず、グルコース-6-リン酸(G6P)レベルについて評価した。結果は、HFDを施されたNrf1-Tgマウスの肝臓では、WTマウスの肝臓と比較して、G6Pレベルが大きく低下することを示した(図6A)。加えてまた、フルクトース-6-リン酸 (F6P)レベルも低減された(図6A)。これらのデータは、Nrf1が実際に、Slc2a2遺伝子の発現およびGck遺伝子の発現の抑制を介して、グルコースの解糖経路への流入を抑制することを示す。
　これに対し、フルクトース-1,6-二リン酸(F1,6P)レベル、ジヒドロキシアセトンリン酸(DHAP)レベル、3-ホスホグリセリン酸(3PG)レベル、2-ホスホグリセリン酸(2PG)レベル、およびホスホエノールピルビン酸(PEP)レベルは、WTマウスとNrf1-Tgマウスとの間で同等であった(図6A)。これらのメタボロミクスデータは、Nrf1が、解糖経路のフラックスを抑制したことを示す。しかし、奇妙なことに、Nrf1-Tgの肝臓では、ピルビン酸レベルがむしろ増大し(図6A)、HFDを施されたNrf1-Tgマウスの肝臓では、乳酸レベルが、WTマウスの肝臓におけるより低いことが見出された(図6B)。したがって、Nrf1-Tgマウスでは、肝臓における乳酸のピルビン酸に対する比が、WTマウスの肝臓における乳酸のピルビン酸に対する比と比較して有意に低下した(図6B)。現在のところ、どのようにして、ピルビン酸レベルおよび乳酸レベルにおけるこれらの変化が誘発されるのかについての確かな説明を有さない。
　Nrf1は、肝臓のピルビン酸レベルを上昇させることから、また、Nrf1-Tgの肝臓におけるTCAサイクルの代謝物についても検討した。HFDを施されたNrf1-Tgマウスの肝臓では、アセチル補酵素A(CoA)レベルおよびクエン酸レベルが顕著に上昇し、イソクエン酸レベルも上昇した。しかし、コハク酸レベル、フマル酸レベル、およびリンゴ酸レベルが有意に変化することはなかった(図6C)。また、Nrf1が、ATPの産生およびエネルギーの充足をどのようにして調節するのかについても検討した。Nrf1-Tgマウスの肝臓では、ATPレベルおよびADPレベルが、WTマウスの肝臓より高かった(図6D)。これに対し、AMPレベルは、わずかに低下した。細胞におけるエネルギー充足を評価するために、AMPのATPに対する比を計算し(Hardie et al., (2001) Bioessays, 23, 1112-1119)、Nrf1-Tgマウスの肝臓における比が、WTマウスの肝臓における比と比較して低減されることを見出した(図6E)。これらのデータは、Nrf1が、グルコースの解糖経路への流入を減少させるが、TCAサイクルの流入を増大させ、実際に、細胞のエネルギー充足を増大させることを示す。
2.8. Nrf1は、グルコース代謝以外の代謝パラメータを変化させる
　次に、Nrf1の、グルコース異化以外の一般的な代謝調節に対する影響を明らかにするために、血漿代謝パラメータであるβ-ヒドロキシ酪酸およびアンモニアについて検討した。血漿β-ヒドロキシ酪酸レベルを測定して、代謝調節におけるアセチルCoAの過剰を確認した。HFDを施されたNrf1-Tgマウスの血漿β-ヒドロキシ酪酸レベルが、HFDを施されたWTマウスの血漿β-ヒドロキシ酪酸レベルより有意に高いが、NDを施される条件では、これらが同等レベルであることを見出した(図7A)。アミノ酸の異化を評価するために、また、血漿アンモニアレベルも測定した。血漿アンモニアレベルは、高レベルのアミノ酸の異化を除き、NDを施されたNrf1-TgマウスおよびHFDを施されたNrf1-Tgマウスのいずれにおいても、WTマウスと比較して低下した(図7B)。Nrf1が、グルコースの解糖経路への流入を抑制することが実証されたのと同様に、これらのデータは、Nrf1が、他の栄養分に由来するアセチルCoAの使用は増大させるが、グルコースおよびアミノ酸の異化に由来するアセチルCoAの使用は増大させないという考えを裏付ける。
2.9. Nrf1の発現を低下させると、グルコース代謝の障害が改善される
　ここまでで、Nrf1発現の上昇が、血中グルコースレベルを増大させることを示した。したがって、Nrf1発現の低減が、マウスのグルコース代謝にどのようにして影響を及ぼすのかについて最後に検討した。Nrf1-/-マウスは胚性致死であることから、この目的で、ヘテロ接合性Nrf1ノックアウト(Nrf1+/-)マウスを利用した。HFDを施されたNrf1+/-マウスの体重レベルは、HFDを施されたNrf1+/+マウスの体重レベルと同等であった(図8A)。不断給餌でHFDを施されたNrf1+/-マウスの血中グルコースレベル(図8B)および血漿インスリンレベル(図8C)は、HFDを施されたNrf1+/+マウスの血中グルコースレベルおよび血漿インスリンレベルと比較してやや低下した。これらの結果は、Nrf1発現の低下が、DIOモデルにおけるNrf1-Tgマウスのグルコース調節を改善することを示唆する。
3. 考察
　本研究で、ヒトNRF1遺伝子の5’-隣接領域におけるSNP rs3764400が、転写活性に影響を及ぼすことを見出した。rs3764400は、肥満と関連することが報告されているので、Nrf1が、肥満についての危険性因子であると仮定した。したがって、Nrf1が、どのようにしてマウスの代謝調節に影響を及ぼすのかに取り組むために、Nrf1の発現の増大を示すNrf1-Tgマウスの3つの系統を新たに確立した。ヒトゲノミクスから推論される状況とは対照的に、これらのNrf1-Tgマウスはむしろ、マウスの肥満を改善した。図9にまとめた通り、これらのNrf1-Tgマウスについてより緊密に検討することにより、Nrf1は、肝臓およびSkMにおけるインスリンの作用およびグルコースの利用を損なうことが明らかになった。これらの変化は、トランスジェニックNrf1タンパク質の発現レベルと良好に相関することから、Nrf1の誘導は、グルコース代謝を抑制し、マウスの糖尿病を発症させることが実証された。したがって、Nrf1は、強力な代謝調節因子であることが明らかとなった。
　Nrf1のトランスジェニック発現/誘導は、マウスの肝臓のG6PレベルおよびF6Pレベルを抑制する。Nrf1は、Slc2a2遺伝子およびGck遺伝子の発現レベルを抑制するので、これらの酵素レベルの抑制により、解糖経路の抑制がもたらされると仮定する。しかし、Nrf1-TgマウスおよびWTマウスの肝臓では、F1,6P、DHAP、3PG、2PG、およびPEPを含めた解糖経路の他の代謝物のレベルが全て同等である。Nrf1の誘導が、他のインスリン調節遺伝子および解糖関連酵素遺伝子であるAldob、Pgk1、およびPklrを抑制することから、アルドラーゼ活性、ホスホグリセリン酸キナーゼ活性、およびピルビン酸キナーゼ活性の抑制に起因して、これらの代謝物が肝臓に部分的に蓄積されると推定する。したがって、この結果は、Nrf1の誘導が、肝臓における解糖経路のフラックスの障害を介して、マウスの糖尿病を少なくとも部分的に誘発することを示唆する。
　メタボロミクス解析は、Nrf1が、肝臓におけるピルビン酸レベルを上昇させ、乳酸レベルを低下させることを明らかにしたが、この現象についての妥当な説明を有さない。ピルビン酸および乳酸のレベルは、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体および乳酸デヒドロゲナーゼの活性、他の組織からの乳酸の参入、アミノ酸の異化によるピルビン酸の供給などを含めた複数の因子により複雑に調節され(Sugden et al., (2003) Am J Physiol Endocrinol Metab, 284, E855-862； Gladden, (2008) Med Sci Sports Exerc, 40, 477-485；およびSookoian et al., (2012) World J Gastroenterol, 18, 3775-3781)、この現象の解明は、13Cを用いる代謝のフラックス解析など、最新の方法の使用を介する難題とならざるを得ない(Zamboni et al., (2009) Nat Protoc 4, 878-892)。この点で、Nrf1-Tgマウスの肝臓では、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体E2およびE3の遺伝子であるDlatおよびDldならびに乳酸デヒドロゲナーゼであるLdhaの発現レベルが低下するという以下の観察が関係しているかもしれない(データは示さない)。
　Nrf1がマウスのインスリン抵抗性を誘導することを見出した。Nrf1の過剰発現は、肝臓およびSkMへのインスリン投与後におけるAktのリン酸化を抑制した。したがって、我々は、Nrf1-Tgマウスにおけるインスリン抵抗性が、肝臓およびSkMにおけるインスリンシグナルの障害により引き起こされることを発見した(図9)。しかし、Nrf1-Tgマウスの肝臓およびSkMについての我々のマイクロアレイによる遺伝子発現解析において、インスリンシグナル伝達経路の主要な構成要素の発現レベルの変化を検出することができなかった(データは示さない)。これらの結果は、Nrf1が、インスリンシグナル伝達経路の構成要素の転写抑制と異なる経路を介して、肝臓およびSkMにおけるインスリン抵抗性を誘導することを示唆する。
　Nrf1の機能を媒介する1つの妥当な候補は、特定の代謝調節因子レベルの撹乱でありうる。実際に、本研究において、HFDを施されたNrf1-Tgマウスにおける血漿β-ヒドロキシ酪酸レベルおよび肝臓のアセチルCoAレベルの両方が上昇することを見出した。β-ヒドロキシ酪酸は、肝臓におけるアセチルCoAの代謝により創出されることから、Nrf1の発現レベルに依存する血漿β-ヒドロキシ酪酸レベルの上昇の増大は、肝臓におけるアセチルCoAの過剰を反映すると考えられる(McGarry et al., (1980) Annu Rev Biochem, 49, 395-420)。脂肪酸の酸化は、アセチルCoAを豊富に創出することから、我々は、Nrf1の過剰発現が、脂肪酸の栄養分としての利用を増大させることにより、肝臓におけるアセチルCoAの蓄積を増強すると推定する。
　Nrf1の過剰発現とは対照的に、Nrf1の発現の低減は、DIO糖尿病モデルマウスにおけるグルコース代謝を改善する。実際に、DIOモデルのNrf1ヘテロ接合性ノックアウトマウスは、血中グルコースレベルを低下させて、血漿インスリンレベルの低減を示した。
　Nrf1が代謝調節において果たす役割(本研究)を、Nrf2が果たす役割(Uruno et al., (2013) Mol Cell Biol, 33, 2996-3010)と比較することにより、Nrf1とNrf2とは、グルコース代謝を異なる形で調節することが明確に実証された。最も際立つのは、我々が、本研究において、Nrf1の機能獲得が、血中グルコースレベルを増大させるのに対し、Nrf2の機能獲得は、血中グルコースレベルを低下させると見出したことである(Uruno et al., (2013) Mol Cell Biol, 33, 2996-3010；およびYagishita et al., (2014) Diabetes, 63, 605-618.)。Nrf1とNrf2とは同じシス作用型調節エレメント(ARE)に同様に結合するので、これらの2つのCNCファミリーの因子が、どのようにして示差的な生物学的機能を及ぼすのかを解明することは興味深い。総合すれば、本研究は、Nrf1が極めて重要な代謝調節因子として作用する有力な証拠を提供する。
1. 材料および方法
　BiacoreまたはELISAによるスクリーニング
　ヒトNrf1およびMafGタンパク質のCNC-bZipドメインのDNAは、それぞれ人工的に合成した。合成したDNAは大腸菌用発現ベクターのEcoRI/BamHIサイトにクローニングすることで、それぞれN末端にHis-tagを付加したNrf1およびMafGタンパク質の発現ベクターを生じさせた。大腸菌Escherichia coli BL21 Codon Plus(DE3)－RIL(Stratagene)を、Nrf1またはMafG発現ベクターで形質転換し、誘導されたタンパク質を、Ni－NTAアガロース(Qiagen)を用いて精製した。得られたNrf1とMafG精製タンパク質の相互作用は、Biacore 3000 (GE Healthcare) およびMafG抗体 (abcam)を用いたELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)法により解析した。また、Nrf1-MafGのヘテロダイマーとDNAのAntioxidant Response Element (ARE)配列との相互作用解析のため、5’末端をビオチン標識したLipin1 intronのARE配列またはPGC-1βintronのARE配列を作成した。下記にARE配列の例を示す。
Lipin1 intronのARE配列
sense : CGCGGAGGCACACTTGCTGAGTCAGCACCCCGGGAGT (配列番号：19)
antisense : CTAGACTCCCGGGGTGCTGACTCAGCAAGTGTGCCTC (配列番号：20)
PGC-1β intronのARE配列
sense : CGCGGAGGGGAACATGCTGACTCAGCAGCTCCGAATA (配列番号：21)
antisense : CTAGTATTCGGAGCTGCTGAGTCAGCATGTTCCCCTC (配列番号：22)
2. 結果
　Sensor Chip CM5 (GE Healthcare)上に、リガンドとしてNrf1タンパク質を固定化し、MafGタンパク質をアナライトとして供した。その結果、MafGの用量依存的な結合レスポンスが観察された。同様に、リガンドとしてMafGタンパク質を固定化し、Nrf1タンパク質をアナライトとして供した場合も、Nrf1の用量依存的な結合レスポンスが観察された。
　もしくは、Sensor Chip SA (GE Healthcare)上に、リガンドとしてLipin1 intronのARE配列またはPGC-1β intronのARE配列を固定化し、リガンドとしてNrf1およびMafGタンパク質を等量混合してアナライトとして供する。その結果、Nrf1-MafGヘテロダイマーの用量依存的な結合レスポンスが観察される。また、アナライト中に未標識のLipin1 intron ARE配列またはPGC-1β intron ARE配列を共存させた結果、固定化したDNAプローブへの結合レスポンスは減弱する。
　また、Nrf1タンパク質を96 well plateに固相化し、MafGタンパク質の結合量をMafG抗体によるELISA法により解析すると、Nrf1固相化時のシグナルの増大が観察される。Lipin1 intronのARE配列またはPGC-1β intronのARE配列を固相化し、Nrf1およびMafGタンパク質を等量混合して添加する場合、Nrf1-MafGヘテロダイマーの用量依存的なシグナルの増大が確認される。
3. 考察
　Nrf1はMafGとヘテロダイマーを形成し、標的遺伝子のARE配列に結合し、転写活性化を引き起こす。Nrf1はLipin1やPGC-1βなど脂質代謝に関する遺伝子発現にも関与しており(Hirotsuら、MCB, 32; 2760-2770)、糖脂質代謝への影響が示唆される。今回、Nrf1とMafGの直接的な相互作用およびNrf1-MafGヘテロダイマーのARE配列への結合を評価するアッセイ系を提供する。本アッセイ系は内在性のNrf1-MafGの機能を反映したアッセイ系であり、本アッセイ系を用いることで、Nrf1の転写活性を阻害する化合物のスクリーニングが可能となる。
1. 材料および方法
　マウスNrf1 cDNAのクローニングは、公知の手法を用いて行った(Zhangら、Biochem. J. 399:373-385.(2006))。このマウスNrf1 cDNA配列を鋳型に以下のプライマー1.1および1.2により増幅される配列と、pGL3-basic vector (Promega)を鋳型に以下のプライマー2.1および2.2により増幅される配列をつなぎ合わせ、pcDNA3.1/V5His B plasmid (Invitrogen)のKpnI/XbaIサイトにクローニングすることで、マウスNrf1全長とルシフェラーゼの融合タンパク質 (mNrf1-Luc)発現ベクターを作製した。
プライマー1.1：5’-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3’ (配列番号：23)
プライマー1.2：5’-CTT TAT GTT TTT GGC GTC TTC CTT CCT CCG GTC CTT TG-3’ (配列番号：24)
プライマー2.1：5’-CAA AGG ACC GGA GGA AGG AAG ACG CCA AAA ACA TAA AG-3’ (配列番号：25)
プライマー2.2：5’-GAC TCT AGA ATT ACA CGG CG-3’ (配列番号：26)
　また、マウスNrf1 cDNA配列を鋳型に以下のプライマー3.1および3.2により増幅される配列と、pGL3-basic vector (Promega)を鋳型に以下のプライマー4.1および4.2により増幅される配列をつなぎ合わせ、pcDNA3.1/V5His B plasmid (Invitrogen)のKpnI/XbaIサイトにクローニングすることで、CNC-bZipドメインを欠失したマウスNrf1とルシフェラーゼ融合タンパク質 (mNrf1ΔCNC-bZip-Luc)発現ベクターを生じさせた。
プライマー3.1：5’-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3’ (配列番号：27)
プライマー3.2：5’-CTT TAT GTT TTT GGC GTC TTC CAT CTG CTT GTC CAG GAA-3’ (配列番号：28)
プライマー4.1：5’-TTC CTG GAC AAG CAG ATG GAA GAC GCC AAA AAC ATA AAG -3’ (配列番号：29)
プライマー4.2：5’-GAC TCT AGA ATT ACA CGG CG-3’ (配列番号：30)
　CNC-bZipドメインを欠失したほうが、Nrf1が発現しやすくなる可能性が考えられた。
　マウス肝癌細胞系Hepa1c1c7(Hepa1)を、10％ウシ胎児血清、1％ペニシリン－ストレプトマイシン(Gibco)を補った、ダルベッコ変法イーグル培地(Wako)内で培養した。マウスNrf1-ルシフェラーゼ融合タンパク質またはCNC-bZipドメイン欠失マウスNrf1-ルシフェラーゼ融合タンパク質の発現細胞株を得るため、mNrf1-Luc発現ベクターまたはmNrf1ΔCNC-bZip-Luc発現ベクターを制限酵素PvuIにより直線化した後、Lipofectamine2000トランスフェクション試薬(Invitrogen)を用いHepa1細胞内にトランスフェクトした。この細胞を、1 mg/mL G-418を含む培地中で培養することで安定発現細胞を選別し、複数のクローン細胞系を確立した。
　各細胞株を、24ウェルプレート内に、ウェル当たり5×104cells/wellの密度で播種し、一晩培養した後、以下のControl siRNAまたはNrf1 siRNA(Tsuchiyaら、Mol Cell Biol. 31:4500-4512.(2011))をLipofectaminse2000トランスフェクション試薬(Invitrogen)を用いトランスフェクトし、１晩培養する。
Control siRNA(sense): 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3’ (配列番号：31)
Control siRNA(antisense): 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3’ (配列番号：32)
Nrf1 siRNA(sense): 5’-GGGAUUCGGUGAAGAUUUGdTdT-3’ (配列番号：33)
Nrf1 siRNA(antisense): 5’-CAAAUCUUCACCGAAUCCCdTdT-3’ (配列番号：34)
　その後、ホタルルシフェラーゼ活性をルミノメーター(Berthold)を用いて測定する。
2. 結果
　mNrf1-Luc発現ベクターまたはmNrf1ΔCNC-bZip-Luc発現ベクターを導入した安定発現細胞株に対し、Nrf1 siRNAをトランスフェクトすると、control siRNAを導入する場合と比べ、ルシフェラーゼ活性の大幅な減少が認められる。
3. 考察
　Nrf1はNrf2と同様、定常状態ではプロテアソームにより分解されており、活性化刺激によりその分解系から脱し、Nrf1のタンパク質が安定化することで、標的遺伝子の転写活性化を行なうと考えられている。Nrf1を活性化する内在性の刺激およびリガンドは明らかになっていないが、プロテアソーム阻害剤の添加によりNrf1のタンパク質が安定化し、転写活性化能を示すことが報告されている(Zhang, Y. et al., (2006) Biochem. J. 399, 373-385)。今回、Nrf1とルシフェラーゼの融合タンパク質を発現させることで、ルシフェラーゼ活性を指標にNrf1タンパク質の活性を評価するアッセイ系の構築を行なった。本アッセイ系を用いることで、Nrf1活性を阻害する化合物のスクリーニングが可能となる。
1. 材料および方法
　雄C57BL/6Jマウスは日本チャールスリバーより購入する。実施例3に記載のsiRNAおよびinvivofectamine2.0 Kit (Life Technologies)を用いてin vivo トランスフェクションを行い、RNAの調製をKitのプロトコルに準じて実施する。動物の体重を測定した後、尾静脈より 3mg/kg/10mlでRNAを投与する。RNAの投与24時間、72時間後に体重、血糖値および血漿中インスリンの濃度を測定する。血糖値の測定はグルコースCIIテストワコー (Wako)、血漿中インスリン濃度はマウスインスリン測定キット (Morinaga) をそれぞれ使用して測定する。
2. 結果
　Control siRNA投与群に比べ、Nrf1 siRNA投与群ではRNAの投与後24時間、72時間後に血糖値の低下が見られる。また、Nrf1 siRNA投与群では血漿中インスリンの低下も確認される。体重はcontrol siRNAとNrf1 siRNA投与群で差は見られない。
3. 考察
　HFD負荷したNrf1 +/-マウスにおいて血糖値および血漿中インスリン濃度の低下が見られるのと同様に、後天的なNrf1のノックダウンによっても、血糖値および血漿中インスリンの低下が確認される。このことから、後天的なNrf1の阻害はインスリン抵抗性を改善し、Nrf1の特異的な阻害剤またはsiRNAやオリゴDNAによる発現阻害は糖尿病の病態を改善する有効な手段となりうる。
[配列番号：1]ヒトNrf1をコードするcDNAの塩基配列を示す(Accession No. NM_003204)。
[配列番号：2]ヒトNrf1のアミノ酸配列を示す (Accession No. NP_003195)。
[配列番号：3]マウスNrf1をコードするcDNAの塩基配列を示す(Accession No. NM_008686)。
[配列番号：4]マウスNrf1のアミノ酸配列を示す(Accession No. NP_032712)。 
[配列番号：5]ヒトLipin1をコードするcDNAの塩基配列を示す(Accession No. NM_145693)。
[配列番号：6]ヒトLipin1のアミノ酸配列を示す(Accession No. NP_663731)。 
[配列番号：7]マウスLipin1をコードするcDNAの塩基配列を示す(Accession No. NM_172950)。
[配列番号：8]マウスLipin1のアミノ酸配列を示す(Accession No. NP_766538)。
[配列番号：9]ヒトPGC－1βをコードするcDNAの塩基配列を示す(Accession No. NM_133263)。
[配列番号：10]ヒトPGC－1βのアミノ酸配列を示す(Accession No. NP_573570)。
[配列番号：11]マウスPGC－1βをコードするcDNAの塩基配列を示す(Accession No. NM_133249)。
[配列番号：12]マウスPGC－1βのアミノ酸配列を示す(Accession No. NP_573512)。
[配列番号：13]ヒトMafGをコードするcDNAの塩基配列を示す(Accession No. NM_002359)。
[配列番号：14]ヒトMafGのアミノ酸配列を示す(Accession No. NP_002350)。
[配列番号：15]マウスMafGをコードするcDNAの塩基配列を示す(Accession No. NM_010756)。
[配列番号：16]マウスMafGのアミノ酸配列を示す(Accession No. NP_034886)。
[配列番号：17]実施例1で使用したプライマーの塩基配列を示す。
[配列番号：18]実施例1で使用したプライマーの塩基配列を示す。
[配列番号：19]Lipin1イントロン中のARE領域のセンス鎖の塩基配列を示す(実施例2)。
[配列番号：20]Lipin1イントロン中のARE領域のアンチセンス鎖の塩基配列を示す(実施例2)。
[配列番号：21]PGC－1βイントロン中のARE領域のセンス鎖の塩基配列を示す(実施例2)。
[配列番号：22]PGC－1βイントロン中のARE領域のアンチセンス鎖の塩基配列を示す(実施例2)。
[配列番号：23]実施例3で使用したプライマー(プライマー1.1)の塩基配列を示す。
[配列番号：24]実施例3で使用したプライマー(プライマー1.2)の塩基配列を示す。
[配列番号：25]実施例3で使用したプライマー(プライマー2.1)の塩基配列を示す。
[配列番号：26]実施例3で使用したプライマー(プライマー2.2)の塩基配列を示す。
[配列番号：27]実施例3で使用したプライマー(プライマー3.1)の塩基配列を示す。
[配列番号：28]実施例3で使用したプライマー(プライマー3.2)の塩基配列を示す。
[配列番号：29]実施例3で使用したプライマー(プライマー4.1)の塩基配列を示す。
[配列番号：30]実施例3で使用したプライマー(プライマー4.2)の塩基配列を示す。
[配列番号：31]実施例3で使用したControl siRNAのセンス鎖の塩基配列を示す。
[配列番号：32]実施例3で使用したControl siRNAのアンチセンス鎖の塩基配列を示す。
[配列番号：33]実施例3で使用したNrf1 siRNAのセンス鎖の塩基配列を示す。
[配列番号：34]実施例3で使用したNrf1 siRNAのアンチセンス鎖の塩基配列を示す。

Claims (14)

  1. 　Nrf1阻害剤を含有してなる、糖尿病の予防または治療剤。
  2. 　Nrf1阻害剤が、（a）Nrf1をコードするポリヌクレオチドに対するsiRNAまたはshRNA、（b）Nrf1をコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチド、(c)Nrf1活性を阻害する低分子化合物若しくは高分子化合物、（d）Nrf1をコードするポリヌクレオチドに対するリボザイム、（e）Nrf1に対してドミナントネガティブに作用するNrf1の変異体もしくはそれをコードするポリヌクレオチド、および（f）Nrf1に対するアプタマーからなる群から選択される1種または2種以上である請求項1に記載の予防または治療剤。
  3. 　Nrf1阻害剤が、配列番号：33のヌクレオチド配列からなるセンス鎖および配列番号：34のヌクレオチド配列からなるアンチセンス鎖を含むsiRNAである、請求項1または2に記載の予防または治療剤。
  4. 　Nrf1活性の阻害を指標とした、糖尿病の予防または治療剤のスクリーニング方法。
  5. 　Nrf1を用いることを含む、請求項4に記載の方法。
  6. 　(i)試験化合物の存在下で、Nrf1とMafGとを接触させた場合のNrf1とMafGとの結合量を測定し、(ii) 試験化合物の非存在下で、Nrf1とMafGとを接触させた場合のNrf1とMafGとの結合量を測定し、(iii) 前記(i)の場合と(ii)の場合の、Nrf1とMafGとの結合量の比較を行うことを含む、請求項4または5に記載の方法。
  7. 　前記(i)の場合におけるNrf1とMafGとの結合量が、前記(ii)の場合のNrf1とMafGとの結合量より低くなる試験化合物を、Nrf1活性を阻害する化合物として選択する、請求項6に記載の方法。
  8. 　(i)試験化合物の存在下で、Nrf1およびMafGとLipin1および／またはPGC－1βのイントロン中のARE配列とを接触させた場合のNrf1およびMafGと前記ARE配列との結合量を測定し、(ii) 試験化合物の非存在下で、Nrf1およびMafGと前記ARE配列とを接触させた場合のNrf1およびMafGと前記ARE配列との結合量を測定し、(iii) 前記(i)の場合と(ii)の場合の、Nrf1およびMafGと前記ARE配列との結合量の比較を行うことを含む、請求項4または5に記載の方法。
  9. 　前記(i)の場合におけるNrf1およびMafGと前記ARE配列との結合量が、前記(ii)の場合のNrf1およびMafGと前記ARE配列との結合量より低くなる試験化合物を、Nrf1活性を阻害する化合物として選択する、請求項8に記載の方法。
  10. 　Nrf1-標識融合タンパク質発現細胞を用いることを含む、請求項4に記載の方法。
  11. 　(i)試験化合物をNrf1-標識融合タンパク質発現細胞と接触させた場合の該細胞におけるNrf1-標識融合タンパク質量を測定し、(ii)試験化合物をNrf1-標識融合タンパク質発現細胞に接触させない場合の該細胞におけるNrf1-標識融合タンパク質量を測定し、(iii)前記(i)の場合と(ii)の場合のNrf1-標識融合タンパク質量の比較を行うことを含む、請求項4または10に記載の方法。
  12. 　前記(i)の場合におけるNrf1-標識融合タンパク質量が、前記(ii)の場合のNrf1-標識融合タンパク質量より低くなる試験化合物を、Nrf1活性を阻害する化合物として選択する、請求項11に記載の方法。
  13. 　治療的有効量のNrf1阻害剤を、糖尿病の予防または治療が必要な対象に投与することを含む、糖尿病の予防または治療方法。
  14. 　Nrf1をコードする遺伝子及びMafG調節ドメインを含む組換体DNAを少なくとも1コピー保有し、かつ食事誘発性肥満（DIO）モデルである、トランスジェニック非ヒト動物。
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