WO2015156264A1 - 新規なグルコース誘導体、および該誘導体を用いた細胞イメージング方法およびイメージング剤 - Google Patents
新規なグルコース誘導体、および該誘導体を用いた細胞イメージング方法およびイメージング剤 Download PDFInfo
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Definitions
- the present invention relates to a novel glucose derivative.
- the present invention also relates to a cell imaging method and an imaging agent using a novel glucose derivative.
- the present invention also relates to a method for detecting and / or imaging cancer cells using a novel glucose derivative and an imaging agent therefor.
- Visualization imaging of living cells, or visualization imaging targeting molecules in living bodies reveals molecular dynamics, intermolecular interactions, and molecular position information, elucidation of life science mechanisms and drug discovery screening Molecular imaging is being actively conducted to connect to. In particular, research for visualizing abnormal cells such as cancer cells and detecting cancer cells and cancer sites has been actively conducted.
- N- (7-nitrobenz) is a fluorescent chromophore at the 2-position of D-deoxyglucose.
- 2- [N- (7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl) having a green fluorescence with a -2-oxa-1,3-diazol-4-yl) amino group attached ) Amino] -2-deoxy-D-glucose (2-NBDG) was proposed and its usefulness was demonstrated using various mammalian cells (Non-patent Document 1).
- This method utilizes the property that 2-NBDG is selectively taken up into living cells, and the dynamic activity of D-glucose uptake by cells is monitored by tracking changes in fluorescence intensity due to uptake. Since it can be quantitatively known, it has been evaluated by researchers all over the world as an innovative method for studying how organisms take D-glucose into cells and uses it. It is positioned as a standard protocol indispensable in this research field (Non-patent Document 2).
- 2-DBDG 2- [N-7- (N ′, NBD), which binds DBD, which is an analog of NBD, to D-glucose.
- D-glucose derivatives bound to various fluorescent molecules other than NBD have been proposed so far.
- the development of molecules that have a probe having a fluorescence maximum in the near-infrared region with higher tissue transmission, a molecule that is suitable for excitation using a two-photon microscope, a molecule that emits fluorescence stronger than 2-NBDG, etc. has been unfolded.
- these D-glucose derivative molecules have a molecular size much larger than that of 2-NBDG, their uptake mechanism into cells is GLUT, such as being taken up by phagocytosis or by internalization while bound to proteins. It is presumed to be taken up into cells via a route other than (Non-patent Document 6).
- An object of the present invention is to provide a new glucose derivative that is taken into a cell via a membrane transport system of sugar. Another object of the present invention is to provide a cell imaging method and an imaging agent using such a glucose derivative. It is another object of the present invention to provide a method for accurately detecting cancer cells by imaging, and an imaging agent used in the method.
- the present inventors have found that a novel glucose derivative having a specific structure is taken into cells via a membrane transport system of sugar, and completed.
- the inventors have also found that cells can be imaged with high accuracy by using a novel glucose derivative, and the present invention has been completed.
- R 1 and R 2 are each independently hydrogen, halogen, C 1 -C 5 alkyl, C 2 -C 5 alkenyl, C 2 -C 5 alkynyl, C 1 -C 5 haloalkyl, C 1 -C 5 alkylamino ,
- a group selected from the group consisting of cycloalkyl, phenyl, pyridyl, thiophenyl, pyrrolyl, and furanyl, G represents the following formulas (G1) to (G4):
- X is O, NH, or NR 3 , where R 3 is C 1 -C 5 alkyl, R 1 and R 2 are each independently hydrogen, halogen, C 1 -C 5 alkyl, C 2 -C 5 alkenyl, C 2 -C 5 alkynyl, C 1 -C 5 haloalkyl, C 1 -C 5 alkylamino , Cycloalkyl, phenyl, pyridyl, thiophenyl, pyrrolyl, and furanyl.
- the glucose derivative according to 1 above which is a compound represented by the formula: 3.
- R 1 and R 2 are each independently hydrogen, halogen, C 1 -C 5 alkyl, C 2 -C 5 alkenyl, C 2 -C 5 alkynyl, C 1 -C 5 haloalkyl, C 1- A group selected from the group consisting of C 5 alkylamino, cycloalkyl, phenyl, pyridyl, thiophenyl, pyrrolyl, and furanyl, and R 4 is C 1 -C 5 alkyl) 2.
- the glucose derivative according to 1 above which is a compound represented by the formula: 5. Following formula (4):
- X is O, NH, or NR 3 , where R 3 is C 1 -C 5 alkyl, R 1 and R 2 are each independently hydrogen, halogen, C 1 -C 5 alkyl, C 2 -C 5 alkenyl, C 2 -C 5 alkynyl, C 1 -C 5 haloalkyl, C 1 -C 5 alkylamino , Cycloalkyl, phenyl, pyridyl, thiophenyl, pyrrolyl, and furanyl.
- the glucose derivative according to 1 above which is a compound represented by the formula: 6). 6.
- R 1 and R 2 are each independently hydrogen, halogen, C 1 -C 5 alkyl, C 2 -C 5 alkenyl, C 2 -C 5 alkynyl, C 1 -C 5 haloalkyl, C 1- A group selected from the group consisting of C 5 alkylamino, cycloalkyl, phenyl, pyridyl, thiophenyl, pyrrolyl, and furanyl, and R 4 is C 1 -C 5 alkyl)
- the glucose derivative according to 1 above which is a compound represented by the formula:
- the glucose derivative according to 1 above which is selected from the group consisting of 10.2-Deoxy-2- (2-oxo-2H-chromen-7-yl) amino-D-glucose (CDG), 2-deoxy-2- (2-oxo-1,2-dihydroquinoline-7- Yl) amino-D-glucose (QDG), 2-deoxy-2- (2-oxo-2H-chromen-7-yl) amino-L-glucose (CLG), or 2-deoxy-2- (2-oxo) 10.
- CDG CDG
- QDG 2-deoxy-2- (2-oxo-2H-chromen-7-yl) amino-L-glucose
- CDG 1,2-dihydroquinolin-7-yl) amino-L-glucose
- QLG 1,2-dihydroquinolin-7-yl) amino-L-glucose
- any one of the hydroxyl group or fluorine group at the 2-position, 4-position or 6-position of glucose is substituted with 18 F (preferably 2,4-dideoxy-2 -(2-oxo-2H-chromen-7-yl) amino-4- [ 18 F] fluoro-D-glucose (4 18 F-CDG), 2,4-dideoxy-2- (2-oxo-2H - chromen-7-yl) amino -4- [18 F] fluoro -L- glucose (4- 18 F-CLG), 2,6- dideoxy-2- (2-oxo -2H- chromen-7-yl) Amino-6- [ 18 F] fluoro-D-glucose (6- 18 F-CDG), or 2,6-dideoxy-2- (2-oxo-2H-chromen-7-yl) amino-6- [ 18 F] fluoro -L- glucose (6- 18 F- LG) in which) radiolabeled glucose derivative.
- 18 F preferably 2,4-dideoxy-2 -(2-o
- R 1 or R 2 is 11 CH 3 or CF 2 18 F (preferably 2-deoxy-2- (2-oxo-2H-3- [ 11 C ] Methyl-chromen-7-yl) amino-D-glucose (3- [ 11 C] MCDG), 2-deoxy-2- (2-oxo-2H-4- [ 11 C] methyl-chromen-7-yl ) Amino-D-glucose (4- [ 11 C] MCDG), 2-deoxy-2- (2-oxo-2H-3- [ 18 F] fluorodifluoromethyl-chromen-7-yl) amino-D-glucose (3- [ 18 F] TFMCDG), 2-deoxy-2- (2-oxo-2H-4- [ 18 F] fluorodifluoromethyl-chromen-7-yl) amino-D-glucose (4- [ 18 F ] TFMCDG), 2-deoxy-2- (2-oxo) -1,2-dihydro-3
- a composition for imaging a target cell comprising the glucose derivative according to any one of 1 to 12 above.
- 14 5. A composition for imaging a target cell, comprising the glucose derivative according to 3 or 4 above.
- 15. 8. A composition for imaging a target cell, comprising the glucose derivative according to 6 or 7 above.
- 16. A composition for imaging a target cell, comprising the glucose derivative according to 9 above.
- 17. A composition for imaging a target cell, comprising the glucose derivative according to 10 above.
- the glucose derivative is 2-deoxy-2- (2-oxo-2H-chromen-7-yl) amino-D-glucose (CDG) or 2-deoxy-2- (2-oxo-2H-chromen-7-yl).
- the composition according to 17 above which is amino-L-glucose (CLG).
- the glucose derivative is 2-deoxy-2- (2-oxo-1,2-dihydroquinolin-7-yl) amino-D-glucose (QDG) or 2-deoxy-2- (2-oxo-1,2- 18.
- QDG 2-deoxy-2-(2-oxo-1,2-) amino-D-glucose
- QLG 2-deoxy-2-(2-oxo-1,2- 18.
- QLG dihydroquinolin-7-yl) amino-L-glucose
- a method for imaging a target cell comprising the following steps: a. Contacting the target cell with the glucose derivative according to any one of 1 to 12 above, and b. Detecting fluorescence emitted by a glucose derivative present in the target cell; A method for imaging a cell comprising: 22.
- the glucose derivative is 2-deoxy-2- (2-oxo-2H-chromen-7-yl) amino-D-glucose (CDG) or 2-deoxy-2- (2-oxo-2H-chromen-7-yl).
- CDG 2-deoxy-2- (2-oxo-2H-chromen-7-yl) amino-D-glucose
- CDG 2-deoxy-2- (2-oxo-2H-chromen-7-yl
- the glucose derivative is 2-deoxy-2- (2-oxo-1,2-dihydroquinolin-7-yl) amino-D-glucose (QDG) or 2-deoxy-2- (2-oxo-1,2- 22.
- the imaging method according to 21 above which is dihydroquinolin-7-yl) amino-L-glucose (QLG). 24. Any one of the above 21 to 23, wherein the composition in the step a further contains another fluorescently labeled glucose derivative, and the step b is a step of detecting at least one glucose derivative present in the target cell.
- the imaging method as described in one. 25.
- Said another fluorescently labeled glucose derivative is 2- [N- (7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl) amino] -2-deoxy-D-glucose (2-NBDG), 2 -[N- (7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl) amino] -2-deoxy-L-glucose (2-NBDLG), 2-deoxy-2- [N-7- (N ′, N′-dimethylaminosulfonyl) benz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl) amino] -D-glucose (2-DBDG), 2-deoxy-2- [N-7- (N ′, N′-dimethylaminosulfonyl) benz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl) amino] -L-glucose (2-DBDLG), and sulforhodamine (preferably Sulfodami 25.
- a method for detecting cancer or cancer cells comprising the following steps: a. Contacting a target cell with a composition comprising the glucose derivative according to 3 or 4 above, and b. Detecting the glucose derivative present in the target cell; A detection method comprising: 29. 29. The detection method according to 28, wherein the glucose derivative is CDG, QDG, 3-TFMCDG, 4-TFMCDG, 3-TFMQDG, or 4-TFMQDG. 30. 30. The detection method according to 29 above, wherein the glucose derivative is CDG. 31.
- a method for detecting cancer or cancer cells comprising the following steps: a. Contacting a target cell with a composition containing the glucose derivative according to 6 or 7 above, and b.
- a detection method comprising: 32. 30.
- the composition in the step a further comprises another fluorescently labeled glucose derivative
- the step b is a step of detecting at least one glucose derivative present in the target cell.
- Said another fluorescently labeled glucose derivative is 2- [N- (7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl) amino] -2-deoxy-D-glucose (2-NBDG), 2- [N- (7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl) amino] -2-deoxy-L-glucose (2-NBDLG), 2-deoxy-2- [N-7 -(N ', N'-dimethylaminosulfonyl) benz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl) amino] -D-glucose (2-DBDG), 2-deoxy-2- [N-7 -(N ', N'-dimethylaminosulfonyl) benz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl) amino] -L-glucose (2-DBDLG), and sulforhodamine (preferably , Sulfoda 36.
- the detection method according to the above item 35 which is at least one glucose derivative selected from the group consisting of 2-amino-2-deoxy-L-glucose in which Minol 101 and sulfodamine B) are bonded with sulfonamide.
- An imaging agent for imaging target cancer cells comprising the glucose derivative according to 3 or 4 above.
- the glucose derivative is CDG, QDG, 4-F-CDG, 6-F-CDG, 4-F-QDG, 6-F-QDG, 3-TFMCDG, 4-TFMCDG, 3-TFMQDD, or 4-TFMQDG. 40.
- An imaging agent for imaging a target cancer cell comprising the glucose derivative according to 6 or 7 above. 43.
- the glucose derivative is CLG, QLG, 4-F-CLG, 6-F-CLG, 4-F-QLG, 6-F-QLG, 3-TFMCLG, 4-TFMCLG, 3-TFMQLD, or 4-TFMQLG. 43.
- a new glucose derivative taken into a cell via a membrane transport system of sugar is provided, and further, an imaging method and an imaging agent capable of identifying a cell or a molecule in the cell with high contrast are provided.
- the present invention also provides a method capable of identifying cancer cells with high contrast and an imaging agent therefor.
- a comparison of the fluorescence spectra of CDG, QDG and 2-NBDLG is shown. It is the result of having confirmed the influence of the glucose transport inhibitor with respect to the uptake
- A is the result of confirming the influence of CDG uptake and the inhibitor cytochalasin B (CB)
- B is the result of confirming the influence of CDG uptake and the inhibitor phloretin (PHT)
- C is the result of confirming the uptake of CDG or CLG and the influence of the inhibitor phloretin (PHT).
- FIG. 6 shows a fluorescence microscopic image 6 minutes after the mixed solution of CDG + 2-NBDLG + 2-TRLG was administered to the spheroid-formed MIN6 cell mass for 3 minutes and then the washing of the mixed solution was started.
- A, B, and C show the state of incorporation of CDG that emits blue fluorescence, 2-NBDLG that emits green fluorescence, and 2-TRLG that emits red fluorescence, respectively.
- D is a differential interference contrast (DIC) image.
- 6B is an overwritten image of FIGS. 6A and 6B. However, to make it easy to see the localization of CDG and 2-NBDLG, the uptake of CDG is expressed in red instead of blue.
- FIG. 6 shows a fluorescence microscopic image 6 minutes after the mixed solution of CLG + 2-NBDLG + 2-TRLG was administered to the spheroid-formed MIN6 cell mass for 3 minutes and then the washing of the mixed solution was started.
- A, B, and C show how CLG that emits blue fluorescence, 2-NBDLG that emits green fluorescence, and 2-TRLG that emits red fluorescence, respectively, are taken into cells.
- D is a differential interference contrast (DIC) image.
- DIC differential interference contrast
- A is an autofluorescence image before administration of the mixed solution, an arrow indicates two normal neurons, and * indicates a dead cell fragment.
- B is obtained by superimposing a differential interference contrast (DIC) image on A for easy understanding of the cell position.
- C is a blue fluorescent image at 8 minutes after the start of washing of the mixed solution, and D is an image obtained by superimposing a DIC image on C.
- 10 is a fluorescence microscopic image obtained by observing changes in fluorescence intensity of cells before and after administration of a CLG + 2-TRLG mixed solution in FIG. 9 in a red fluorescence wavelength region suitable for 2-TRLG observation.
- A indicates autofluorescence before administration of the mixed solution.
- B is obtained by superimposing a differential interference contrast (DIC) image on A for easy understanding of the cell position.
- DIC differential interference contrast
- FIG. 11 shows the change in fluorescence intensity of cells when a mixed solution of CDG + 2-TRLG is administered for 3 minutes to acutely isolated normal neurons (arrows) before and after administration, and the wavelength region of blue fluorescence emitted by CDG It is the result observed by (Blue channel).
- FIG. 12 shows the result of simultaneously observing the change in fluorescence before and after administration of the mixed solution in FIG. 11 in the wavelength region (Red channel) of red fluorescence emitted by 2-TRLG.
- the “target cell” is used to include the target cell itself and various organs and molecules present in the cell. Therefore, in the present specification, when “imaging a (target) cell” is used, it means imaging any one or more of the target cell itself and various organs and molecules existing in the cell. Used to mean including.
- Imaging targets include, for example, Cytosol, which is a target cell membrane and / or intracellular region, and an intracellular organelle (so-called Organelle, for example, nucleus, endoplasmic reticulum, Golgi apparatus, endosome , Lysosomes, mitochondria, peroxisomes, autophagosomes, glycosomes, proteasomes, vacuoles, chloroplasts, glyoxisomes, and / or biological membranes surrounding these structures
- Intra / or surface structures of intracellular organelles eg, can include nucleolus, ribosomes, etc.
- target intracellular molecules eg, cell interior, ie, cytoplasm or Molecules in the nucleus, molecules in the cell membrane of the target cell, molecules on the cell membrane of the target cell
- It can gel, glucose derivative of the present invention can be used for imaging at least one or more of these.
- the object of imaging is preferably a cell membrane and / or a region within the cell, Cytosol, an organelle in the cell, a structure inside and / or on the surface of the organelle, particularly preferably Cytosol, in the nucleus is there.
- glucose derivative of the present invention has the following formula (1):
- XYZ is O—C ⁇ O, NH—C ⁇ O, NR 3 —C ⁇ O, or N ⁇ C—OR 4 , where R 3 Is C 1 -C 5 alkyl and R 4 is C 1 -C 5 alkyl.
- R 1 and R 2 are each independently hydrogen, halogen, C 1 -C 5 alkyl, C 2 -C 5 alkenyl, C 2 -C 5 alkynyl, C 1 -C 5 haloalkyl, C 1 -C 5 It is selected from the group consisting of alkylamino, cycloalkyl, phenyl, pyridyl, thiophenyl, pyrrolyl, and furanyl.
- the glucose derivative of the present invention has a fluorescent chromophore in its molecule.
- G is D-amino-glucose or L-amino-glucose
- the glucose derivative of the present invention has a fluorescent chromophore at the 2- or 6-position of glucose via an amino group.
- it preferably has a fluorescent chromophore at the 2-position via an amino group.
- G has a structure of any one of the following formulas (G1) to (G4).
- Ra and Rb are hydroxy or fluorine, but when one is fluorine, the other is hydroxy.
- Ra and Rb are both hydroxy.
- XYZ represents O—C ⁇ O, NH—C ⁇ O, NR 3 —C ⁇ O, or N ⁇ C—OR 4 (where , R 3 is C 1 -C 5 alkyl and R 4 is C 1 -C 5 alkyl), but preferably O—C ⁇ O, NH—C ⁇ O, N (CH 3 ) — C ⁇ O, particularly preferably O—C ⁇ O or NH—C ⁇ O.
- R 1 and R 2 are each independently hydrogen, halogen, C 1 -C 5 alkyl, C 2 -C 5 alkenyl, C 2 -C 5 alkynyl, Selected from the group consisting of C 1 -C 5 haloalkyl, C 1 -C 5 alkylamino, cycloalkyl, phenyl, pyridyl, thiophenyl, pyrrolyl, and furanyl, but preferably R 1 and R 2 are each independently hydrogen , Halogen, C 1 -C 5 alkyl, C 2 -C 5 alkenyl, C 2 -C 5 alkynyl or C 1 -C 5 haloalkyl, more preferably R 1 and R 2 are each independently hydrogen, C 1 -C 5 alkyl or C 1 -C 5 haloalkyl, more preferably R 1 and R 2 are each independently hydrogen, methyl, fluoromethyl, particularly preferably
- the feature of the glucose derivative of the present invention is that the fluorescent chromophore is directly bonded to the 2nd or 6th position of glucose via NH.
- the glucose derivative of the present invention is taken into cells via a sugar membrane transport system such as GLUT.
- Preferred embodiments of the glucose derivative of the present invention are the following compounds.
- CDG 2-deoxy-2- (2-oxo-2H-chromen-7-yl) amino-D-glucose
- CLG 2-deoxy-2- (2-oxo-2H-chromene) -7-yl) amino-L-glucose
- Em max maximum excitation wavelength
- Em max maximum fluorescence wavelength
- Another preferred embodiment of the glucose derivative of the present invention is the following compound.
- QDG 2-deoxy-2- (2-oxo-1,2-dihydroquinolin-7-yl) amino-D-glucose
- QLG 2-deoxy-2- (2-oxo- 1,2-Dihydroquinolin-7-yl) amino-L-glucose
- Ex max maximum excitation wavelength
- Em max maximum fluorescence wavelength
- a compound having a substituent at the 3-position or 4-position of the coumarin skeleton or quinoline skeleton in the above CDG, CLG, QDG or QLG can be mentioned.
- substituents include halogen, acetyl, formyl, allyl, ethynyl, propenyl, methyl, fluoromethyl, cycloalkyl, phenyl, pyridyl, thiophenyl, pyrrolyl, and furanyl, and particularly preferably methyl, fluoro Methyl.
- glucose derivative of the present invention for example, the following compounds can be mentioned.
- the glucose derivative of the present invention is particularly preferably selected from CDG, CLG, QDG or QLG.
- the glucose derivative of the present invention can be used by dissolving it in an arbitrary solution, for example, a solvent such as water or hydrous dimethyl sulfoxide, and is also used in a solvent or solution used for imaging cells or intracellular molecules, particularly a buffer solution. Above all, it is stable and suitable as an imaging agent.
- a solvent such as water or hydrous dimethyl sulfoxide
- the method for synthesizing the D-glucose derivative of the present invention will be mainly described.
- the L-glucose derivative of the present invention can be synthesized by using L-form sugar as a raw material.
- the binding position of the fluorescent molecular group having a coumarin skeleton or a quinoline skeleton to glucose is either the 2-position or the 6-position of glucose, but is preferably the 2-position.
- the synthesis can be performed using glucosamine for the derivative at the 2-position and a 6-deoxy-6-amino-glucose derivative for the 6-position derivative.
- glucosamine D-glucosamine or L-glucosamine can be used.
- D-glucosamine synthesized D-glucosamine or commercially available D-glucosamine can be used.
- L-glucosamine can be synthesized by the method described in WO2010 / 16587 (Patent Document 2) or the method described in WO2012 / 133688 (Patent Document 4) (of these publications or application specifications). The description is hereby incorporated by reference).
- the method for synthesizing L-glucosamine described in WO2012 / 133688 is as follows.
- 6-deoxy-6-amino-glucose derivative is not limited to this, but can be synthesized from glucose through seven steps as follows, for example.
- Glucose 1-hydroxyl group is methylglycoside
- 4- and 6-position are protected with benzylidene group
- 2- and 3-position are protected with isopropylidene group
- benzylidene group is deprotected
- 6-position is toluenesulfonyl group to azide group
- glucose commercially available D-glucose or commercially available L-glucose can be used.
- the D-glucose derivative of the present invention is not limited thereto, but can be synthesized, for example, as follows.
- a compound (A) in which the 7-position of a compound having a coumarin skeleton which is a fluorescent chromophore is substituted with an active group is synthesized.
- Compound A is synthesized by bonding a trifluoromethanesulfonyl group to the 7-position hydroxyl group.
- a compound (B) in which the 7-position of a compound having a quinolinone skeleton, which is a fluorescent chromophore, is substituted with an active group is synthesized. It is synthesized in two steps from an aniline derivative in which the 3-position is substituted with iodine.
- D-glucosamine in which the 1st, 4th and 6th OHs are protected is synthesized, for example, as follows.
- Compound A and D-glucosamine in which the 1-position and 6-position OH are protected are condensed by, for example, a CN cross-coupling reaction using palladium. Can be synthesized by binding to
- the D-glucose derivative of the present invention having a coumarin skeleton or a quinoline skeleton at the 6-position of glucose comprises a compound A and a 6-deoxy-6-amino-D-glucose derivative in which the 1-position, 2-position and 3-position OH are protected.
- the compound A can be synthesized by condensing by a CN cross-coupling reaction using palladium, and bonding the compound A to D-glucose via —NH—.
- the L-glucose derivative of the present invention can be synthesized in the same manner by using L-glucosamine instead of D-glucosamine.
- the glucose derivative having a coumarin skeleton or a quinoline skeleton having a substituent at the 3-position or the 4-position is not limited thereto, but for example, Suzuki using CDG, CLG, QDG, QLG synthesized according to the method disclosed in this specification.
- a compound (A) having a coumarin skeleton or a quinoline skeleton having a substituent at the 3-position or 4-position by a coupling method or reacting with glucosamine using a direct introduction method by CH activation. Can be synthesized.
- the glucose derivative of the present invention can be added with a radiolabel, whereby imaging based on radioactivity, for example, imaging with PET or the like can be performed. Such compounds are also capable of dual mode imaging by fluorescence and radioactivity.
- Examples of the method of adding a radiolabel to the glucose derivative of the present invention include a method of substituting the hydroxyl group of glucose with 18 F and a method of radiolabeling a substituent of the coumarin skeleton or quinoline skeleton.
- the position of the hydroxy group substituted with 18 F in the former case is the 4th or 6th position when it has a coumarin skeleton or quinoline skeleton at the 2-position of glucose, and the coumarin skeleton or quinoline skeleton at the 6th position of glucose. In case it is 2nd or 4th.
- 4- 18 F-CDG, 4- 18 F-CLG, 6- 18 F-CDG, 6- 18 F-CLG, 4- 18 F-QDG, 4- 18 F-QLG, 6- 18 F-QDG , or 6- 18 F-QLG can be mentioned.
- a compound in which one of the fluorine atoms of the fluoromethyl group is substituted with 18 F can be mentioned.
- 3- [ 11 C] MCDG, 4- [ 11 C] MCDG, 3- [ 18 F] TFMCDG, 4- [ 18 F] TFMCDG, 3- [ 11 C] MQDG, 4- [ 11 C] MQDG, 3- [ 18 F] TFMQDG, 4- [ 18 F] TFMQDG, 3- [ 11 C] MCLG, 4- [ 11 C] MCLG, 3- [ 18 F] TFMCLG, 4- [ 18 F] TFMCLG, 3- [ 11 C] MQLG, 4- [ 11 C] MQLG, 3- [ 18 F] TFMQLG, or 4- [ 18 F] TFMQLG can be mentioned.
- Such a radiolabeled glucose derivative is not limited to this, but can be synthesized, for example, as follows.
- a derivative containing the radioactive isotope 18 F in the quinoline skeleton can be synthesized.
- Vi Method for synthesizing derivatives containing radioisotope 18 F in the coumarin skeleton
- a derivative containing 11 C of the radioisotope in the quinoline skeleton can be synthesized.
- Method for synthesizing derivatives containing radioisotope 11 C in the coumarin skeleton (2) For example, the following compound ( 11 C-4- [ 11 C] MCDG) can be synthesized, for example, by the following steps.
- the fluorescent chromophore contained in the glucose derivative of the present invention uses a chromophore having a coumarin skeleton or a quinoline skeleton, which is a fluorescent chromophore that emits blue fluorescence, and therefore has a fluorescent maximum in the green, red, or near infrared region. Since the molecular size is generally smaller than the molecule it has, it is considered that the steric hindrance that the fluorescent group gives to the passage through the membrane transport system of sugars such as GLUT is small.
- the glucose derivative of the present invention is characterized in that the coumarin skeleton or quinoline skeleton constituting the fluorescent chromophore is directly bonded to the glucose skeleton via NH. Thereby, it is considered that there is an advantage that the steric hindrance to the passage through the membrane transport system of sugar such as GLUT is reduced.
- the present inventors have confirmed that the above-mentioned blue fluorescent D-glucose derivatives named CDG and QDG are taken into cancer cells via GLUT as a result of pharmacological tests applied to cells. Furthermore, the present inventors have developed CLG and QLG, which are blue fluorescent L-glucose derivatives, which are enantiomers of CDG and QDG, as control compounds. These four compounds, CDG, CLG, QDG, and QLG, have a stereoselectivity of D / L-glucose for uptake into cells, and it is quantitative that D-type is taken up into cells via GLUT.
- the D-glucose derivative (eg, CDG, QDG), which is a glucose derivative of the present invention, can emit blue fluorescence together with its reference compound, an L-glucose derivative (eg, CLG, QLG). It is equivalent to or better than the green D-glucose derivative 2-NBDG and the green L-glucose derivative 2-NBDLG (Patent Document 2) already reported by the present inventors in elucidating the glucose uptake mechanism of Can be used in combination.
- an L-glucose derivative eg, CLG, QLG
- D-glucose-like intracellular uptake via GLUT and not via GLUT D-glucose-like intracellular uptake via GLUT and not via GLUT It can be used to elucidate the stereoselective transport mechanism of glucose, such as by comparing the occurrence of intracellular uptake in the same cell using various cells, and also to understand the influence on the transport mechanism of fluorescent groups You can get valuable information.
- the blue D-glucose derivative CDG or QDG of the present invention and the blue L-glucose derivative CLG or QLG were confirmed. D-dominant uptake similar to that of the derivative 2-NBDLG was shown. Further, the blue L-glucose derivative CLG of the present invention was not taken up by normal cells. That is, similar to the detection of cancer cells using 2-NBDLG that has already been reported by the present inventors (Patent Document 4), the blue L-glucose derivative of the present invention, for example, CLG or QLG is used for cancer. Cells can be detected in the same way.
- One embodiment of the present invention is a method for imaging a cell or a molecule in the cell using the glucose derivative of the present invention.
- Another aspect of the present invention is an imaging agent for imaging a cell or a molecule in the cell, comprising the glucose derivative of the present invention. Since the glucose derivative of the present invention is taken into a cell via a cell membrane transport system of a cell, not only can the cell be imaged, but also an intracellular molecule or organ such as a cytoplasm or nucleus can be imaged. be able to.
- Another aspect of the present invention is an imaging agent for detecting cancer cells using the glucose derivative of the present invention, preferably an L-glucose derivative, particularly preferably CLG or QLG.
- Another aspect of the present invention is a method for detecting cancer cells using a composition comprising the glucose derivative of the present invention, preferably an L-glucose derivative, particularly preferably CLG or QLG.
- Another embodiment of the present invention is a radiolabeled glucose derivative, preferably a radiolabeled L-glucose derivative, particularly preferably a radiolabeled 4-F-CLG, 6-F-CLG, which is one of the present invention.
- a composition containing the glucose derivative of the present invention (hereinafter sometimes referred to as “the composition of the present invention” or “the imaging agent of the present invention”) as a reagent is brought into contact with a target cell.
- Target cells can be imaged at the individual cell level.
- the cells in the tissue can also be imaged at the individual cell level by performing imaging by bringing the composition of the present invention into contact with the tissue containing the target cells.
- the glucose derivative of the present invention includes both a D-glucose derivative and an L-glucose derivative.
- the target is imaged at the cellular level based on the configuration of glucose DL.
- it is also possible to distinguish between normal and abnormal cells.
- cells using the glucose derivatives of the present invention of D-type or L-type The function can be elucidated by imaging at the level.
- a composition containing the glucose derivative of the present invention preferably an L-glucose derivative (hereinafter sometimes referred to as “the composition of the present invention” or “the imaging agent of the present invention”) as a reagent.
- the composition of the present invention preferably an L-glucose derivative
- the imaging agent of the present invention By contacting the target cell, it can be determined whether the target cell is a cancer cell.
- cancer cells in a tissue can be detected by contacting the composition containing the target cell with the composition of the present invention and performing imaging.
- cancer cells or tissues containing these cells can be detected by administering the composition of the present invention to a living body and performing imaging, and this method is useful as a method for detecting cancer. It is.
- radioactively labeled glucose derivative of the present invention preferably a composition containing the L-glucose derivative of the present invention
- cancer can be imaged by PET.
- the radioactively labeled glucose derivative of the present invention include 4-F-CLG, 6-F-CLG, 4-F-QLG, 6-F-QLG, TFMCDG, TMFCLG, TMFQDG, or TMFQLG.
- 4-F-CLG, 4-F-QLG, TMFCLG or TMFQLG can be used.
- the composition of the present invention includes any form of composition that can be applied to cells containing the glucose derivative of the present invention, and is not particularly limited as long as it can be applied to a solution, gel, or other cells.
- the component in a composition can be contained without a restriction
- the glucose derivative of the present invention can be dissolved in a buffer solution or a cell culture medium and applied to cells.
- the target cells to be imaged using the glucose derivatives of the present invention are not particularly limited, and include mammalian cells, microorganisms such as E. coli and yeast. Cells, plant cells, fertilized eggs, etc. can be targeted, and cells isolated from living organisms, cells present in tissues isolated from living organisms, cells existing in tissues of living organisms, and cells isolated from living organisms. Any form of cells such as primary cultured cells after separation or established cells may be used. Furthermore, the target cell may be a normal cell or an abnormal cell (for example, a cancer cell).
- the glucose derivative of the present invention incorporated into the cell can be detected by a commonly used method of detecting fluorescence.
- a commonly used method of detecting fluorescence For example, it can be performed as follows.
- the detection of the glucose derivative present in the cell is carried out by measuring the fluorescence of the target cell in advance, then bringing the glucose derivative into contact with the target cell for a certain period of time, then washing it off, Measurement can be performed and evaluated with an increase in the fluorescence intensity relative to the fluorescence intensity of the target cell before contact.
- the cells may be imaged using an appropriate apparatus capable of discriminating the inside, the cell membrane, and the outside of the cell such as a confocal microscope.
- a cell having the glucose derivative of the present invention in the cell can be imaged to detect the cell. Furthermore, evaluation may be performed using the sum of the fluorescence intensities exhibited by a large number of cells or the distribution of the fluorescence intensities using a fluorescence plate reader, flow cytometry, or the like.
- the glucose derivative of the present invention is a glucose derivative having another fluorescent chromophore, such as 2- [N- (7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl) amino] which emits green fluorescence.
- 2-NBDG 2-deoxy-D-glucose
- 2-TRLG 2- [N- (7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl) amino] -2-deoxy-L-glucose (2 -NBDLG), and / or 2-texa red-2-amino-2-deoxy-L-glucose (2-TRLG) that emits red fluorescence.
- 2-NBDG, 2-NBDLG and 2-TRLG are described in WO2010 / 16587 (Patent Document 2) (part of which is incorporated herein by reference). Thereby, evaluation with two colors or three colors becomes possible.
- 2-NBDLG has the property of being taken up specifically by cancer and can be used for detection of cancer.
- the D-glucose derivatives of the present invention (for example, CDG and QDG) can be used for 2-NBDLG and 2 It can be used simultaneously with -TRLG, whereby it is possible to evaluate the state of cancer cells and the whole tumor cell mass including cancer cells. That is, in imaging of cancer cells and the like, the use of the green fluorescent L-glucose derivative 2-NBDLG that is specifically taken up by cancer cells together with the red fluorescent 2-TRLG, which is impermeable to the cell membrane, causes membrane damage.
- L-glucose derivative of the present invention a specific fluorescent coloring molecule having a coumarin skeleton or a quinoline skeleton is not taken into normal cells.
- a compound bound to L-glucose having The incorporation of the blue D-glucose derivative CDG or QDG of the present invention into the cancer cell into the blue L-glucose derivative CLG or QLG is related to the relationship between the green D-glucose derivative 2-NBDG and the green L-glucose derivative 2-NBDLG. It showed similar D-type uptake.
- specific uptake into cancer cells could be confirmed by experiments using the blue L-glucose derivative of the present invention, such as CLG. Therefore, the L-glucose derivative of the present invention can also be used for specific detection of cancer cells.
- cancers in the ophthalmic region such as the eyelids and lacrimal glands, ear cancers such as the outer ear and middle ear, and nasal lesions such as the nasal cavity and sinuses.
- gynecological cancer genital cancer, kidney cancer, bladder cancer, prostate cancer, anal cancer, skin cancer, bone cancer, muscle cancer (sarcoma), leukemia, etc.
- Cancer cells such as cancer, malignant lymphoma, peripheral and central nerve cancer, and glial cancer can be mentioned.
- the L-glucose derivative of the present invention may be another fluorescently labeled glucose derivative, for example, 2-NBDG, 2-NBDLG, or 2-TRLG, Or it can be used simultaneously with those combinations, and it is also possible to evaluate the state of the whole tumor cell mass containing a cancer cell and a cancer cell collectively.
- the method for detecting cancer of the present invention and the imaging agent therefor include tissues excised at the time of surgery, digestive tumors using oral tumors and endoscopes, gynecological tumors such as cervical cancer, other lungs and various other It can be used for biopsy specimens obtained at the time of biopsy diagnosis of various organs, etc., for the presence of tumor cells, evaluation of the state, and differentiation from normal cells. This makes it possible to quickly perform detailed cell evaluation on a cell-by-cell basis with a simple device equipped with fluorescence, guideline for selection of treatment method, determination of therapeutic effect of drugs, etc., appropriate operation after exposure of affected area This is effective for determining the range.
- the detection of the L-glucose derivative present in the cancer cell is performed, for example, by measuring the fluorescence of the target cell in advance, and then bringing the L-glucose derivative into contact with the target cell for a certain period of time, Thereafter, this is washed away, the fluorescence of the target cell is measured again, and evaluation can be performed with an increase in the fluorescence intensity with respect to the fluorescence intensity of the target cell before contact.
- a cell having an L-glucose derivative in the cell can be imaged to detect a cancer cell or a cell likely to be a cancer cell.
- the evaluation may be performed using the total of the fluorescence intensities exhibited by a large number of cells or the distribution of the fluorescence intensities using a fluorescence plate reader or flow cytometry.
- the L-glucose derivative of the present invention is administered to a blood vessel such as a vein, it is possible to perform whole body imaging, and it is also possible to perform cell imaging by administering to a tissue local to be observed.
- cancer can be detected by PET.
- the glucose derivative of the present invention is useful for detecting cancer cells and is also useful as an active ingredient of an imaging agent for visualizing cancer cells, for example.
- the L-glucose derivative may be provided in the form of a solution dissolved in a solvent (such as physiological saline for injection) for dissolving the L-glucose derivative, or dissolved in use in combination with a solvent for dissolving the L-glucose derivative. And may be provided in the form of a kit for preparing a solution.
- the concentration of the fluorescent L-glucose derivative in the solution may be adjusted in the range of 1 nM to 100 mM, for example.
- the method using the L-glucose derivative of the present invention may be used in combination with a method known per se to further improve the determination accuracy.
- D-glucosamine hydrochloride (10 g, 46.4 mmol) was dissolved in water (100 mL), and NaHCO 3 (10 g, 119 mmol) was added at room temperature. Thereafter, 2,2,2-trichloroethyl chloroformate (7.7 mL, 55.7 mmol) was added dropwise at 0 ° C. The mixture was stirred at 0 ° C. for 20 minutes, gradually warmed to room temperature and stirred overnight. The precipitated crystals were collected by filtration and washed with water and ether. After drying overnight, the resulting white crystals were recrystallized from warm methanol, and the resulting crystals were collected by filtration to obtain the compound (6.0 g, 36%).
- reaction mixture was neutralized by adding saturated sodium bicarbonate water.
- Acetonitrile was distilled off under reduced pressure to 0.5 L, extracted with ethyl acetate, washed with saturated aqueous sodium hydrogen carbonate, and then washed with saturated brine.
- the organic layer was dried over sodium sulfate and the solvent was distilled off. Purification was performed on a silica gel column (SiO 2 , 75 g) to obtain a compound (1.0 g, 12%) as white crystals.
- Example 2 Synthesis of CLG CLG was synthesized in the same manner as CDG using L-glucosamine hydrochloride instead of D-glucosamine hydrochloride. The yield was 13.2 mg, and the yield was 32%. Moreover, the analysis result of the obtained compound is as follows.
- 4-MCLG can be synthesized by the same method as 4-MCDG using L-glucosamine.
- Trifluoromethanesulfonic anhydride (115 ⁇ L, 687 ⁇ mol) was added dropwise. Thereafter, the mixture was stirred at room temperature for 1 hour. After completion of the reaction, the mixture was extracted with ethyl acetate and washed with saturated brine. The organic layer was dried over anhydrous sodium sulfate and the solvent was distilled off. Purification was performed using a silica gel column (SiO 2 , 20 g) to obtain a compound (120 mg, 62%) as a white solid.
- 3-MCLG can be synthesized by the same method as 3-MCDG using L-glucosamine.
- 2-Oxo-2H-chromen-7-yl trifluoromethanesulfonate 500 mg, 1.71 mmol
- sodium trifluoromethanesulfinate 400 mg, 2.56 mmol
- manganese (III) acetate dihydrate 914 mg, 3.41 mmol
- acetic acid 17.5 mL
- sodium trifluoromethanesulfinate 400 mg, 2.56 mmol
- manganese (III) acetate dihydrate 914 mg, 3.41 mmol
- sodium trifluoromethanesulfinate (400 mg, 2.56 mmol) and manganese (III) acetate dihydrate 914 mg, 3.41 mmol
- sodium trifluoromethanesulfinate 400 mg, 2.56 mmol
- water was added to stop the reaction.
- Triphenylmethylchloride is dissolved in Methyl 2-deoxy-2- (2-oxo-2H-chromen-7-yl) amino- ⁇ -D-glucopyranoside (50 mg, 148 ⁇ mol) by adding pyridine (1.5 mL) under an argon atmosphere. (206 mg, 740 ⁇ mol) was added and heated to 60 ° C. After 2 hours, the mixture was allowed to cool, neutralized with saturated aqueous sodium hydrogen carbonate, extracted with ethyl acetate, and washed with saturated aqueous sodium hydrogen carbonate and saturated brine. The organic layer was dried over anhydrous sodium sulfate and the solvent was distilled off.
- Methyl 2-deoxy-2- (2-oxo-2H-chromen-7-yl) amino- ⁇ -D-glucopyranoside (220 mg, 403 ⁇ mol) was dissolved in dichloromethane (10 mL) at -17 ° C Then, N, N-diethylaminosulfur trifluoride (320 ⁇ L, 2.42 mmol) was added dropwise and the temperature was raised to room temperature. After 2 hours, the mixture was cooled to -17 ° C., and N, N-diethylaminosulfur trifluoride (320 ⁇ L, 2.42 mmol) was added dropwise, and the temperature was raised to room temperature.
- Example 11 Effect of Cytochalasin B (CB) on increase in fluorescence intensity by CDG administration to mouse insulinoma cells (MIN6)
- CB Cytochalasin B
- MIN6 cells the increase in fluorescence intensity when CDG was administered, and the effect of the glucose transporter (GLUT) inhibitor CB on it were confirmed.
- MIN6 cells 96-well clear bottom plate ( ⁇ Clear-PLATE, Greiner bio-one, BLACK) with 8 rows of vertical AH and 12 columns of horizontal 1-12 columns was used. Using.
- KRB solution for data acquisition Volume composition used for data acquisition by fluorescence microplate reader NaCl 129.0 mM, KCl 4.75 mM, KH 2 PO 4 1.19 mM MgSO 4 ⁇ 7H 2 O 1.19 mM, CaCl 2 ⁇ 2H 2 O 1.0 mM, NaHCO 3 5.02 mM, D-Glucose 5.6 mM, HEPES 10 mM (adjusted to pH 7.35 with 1M NaOH).
- 0.1 mM Carbenoxolone SIGMA # C4790 was added for the purpose of inhibiting the entrance and exit of fluorescently labeled glucose via gap junction / hemichannel.
- the KRB solution for data acquisition was used as a solution for preparing a CDG solution and other fluorescent sugar derivative solutions.
- Fluorescence measurement CDG and 2-NBDG were independently administered to the wells in the third and fifth rows, respectively, using an 8 pipette so as to be alternately arranged on the same plate.
- autofluorescence in each well was measured in advance with a fluorescence microplate reader (Flex Station, Molecular Device).
- the measurement conditions were Ex 367 nm, Em 455 nm, Cut off 420 nm on the CDG detector side (blue channel), and Ex 470 nm, Em 540 nm, Cut off 495 nm on the 2-NBDG detector side (green channel).
- the measurement was performed at Bottom Read, Averaging 3, and Photomultiplier sensitivity high, and Well Scan Mode was used as the measurement method.
- each well is divided into nine observation areas (diameter 1.5 mm) and each is measured independently. Subsequently, CB (final concentration 10 ⁇ M) was pre-administered from 2 minutes before CDG administration to wells for measuring the effect of the glucose transport inhibitor Cytochalasin B (CB), and KRB was added to the other wells.
- CDG and 2-NBDG were administered at 37 ° C. for 5 minutes. After completion of the administration, the operation of diluting the fluorescent solution in the well with 300 ⁇ L of the KRB solution was repeated for a predetermined number of times for 30 seconds.
- the number of repetitions was determined based on the fact that the fluorescence intensity of the wells in the 3rd row A and 5th row H set as the control group was the same level as that of the blank well without cells, and was washed away completely. It was confirmed in every experiment. In the case of CDG and 2-NBDG, since this washing process took 8 minutes, fluorescence measurement after administration was performed 9 minutes later. In addition, according to this method, even if cells that have collapsed the cell membrane state contact CDG and 2-NBDG and then take these compounds into the cells, they have already flowed out of cells and washed away at the time of measurement. Therefore, it was judged that the contribution to the increase in the fluorescence intensity of the entire observation area was negligible.
- Example 12 Effect of Phloretin (PHT) on increase in fluorescence intensity by administration of CDG to MIN6 cells Increase in fluorescence intensity by administration of CDG to MIN6 cells on day 13 of culture, and as a GLUT inhibitor and water channel inhibitor thereto The effect of functioning PHT was confirmed as in Example 11. The result is shown in FIG. 2B.
- PHT final concentration 150 ⁇ M
- KRB was added to the other wells.
- CDG and 2-NBDG were administered at 37 ° C. for 5 minutes. In the presence of PHT, the fluorescence intensity is significantly reduced compared to the absence.
- Example 13 Effect of Phloretin (PHT) on increase in fluorescence intensity by administration of CDG or CLG to MIN6 cells Increase in fluorescence intensity upon administration of CDG or CLG to MIN6 cells on day 15 of culture, and inhibitory effect by PHT on it Were compared on the same dish.
- PHT Phloretin
- Comparative Example Effect of Cytochalasin B (CB) or Phloretin (PHT) on the increase in fluorescence intensity by administration of green fluorescent D-glucose derivative 2-NBDG to MIN6 cells Increase in fluorescence intensity by administration of green fluorescent D-glucose derivative 2-NBDG
- CB Cytochalasin B
- PHT Phloretin
- a KRB solution containing 200 ⁇ M 2-NBDG was administered to the cells, allowed to stand for 5 minutes and then washed away, and the increase in fluorescence intensity of the cells before and after administration was measured. Average values measured three times in each observation region at an excitation light wavelength of 470 nm, a fluorescence acquisition wavelength of 540 nm, and a cutoff filter of 495 nm were tabulated. The results are shown in FIG. The uptake of 2-NBDG into MIN6 cells was significantly inhibited by CB and further strongly inhibited by PHT, as in the previous report of the inventors (WO2012 / 133688, Patent Document 4).
- Example 14 Effect of excess D-glucose or excess L-glucose on increase in fluorescence intensity by administration of CDG to MIN6 cells Blue fluorescent D-glucose derivative CDG (100 ⁇ M) on mouse insulinoma cells MIN6 on day 13 of culture It was investigated whether the increase in fluorescence intensity by administration was inhibited by a large excess of D-glucose or L-glucose. As a control, the blue fluorescent L-glucose derivative CLG was similarly analyzed. The results are shown in FIG. However, the following conditions were changed.
- the CDG solution (or CLG solution) prepared using each dedicated KRB solution was administered using an eight-pipe pipette (37 ° C., 5 minutes). Prior to administration, each KRB solution was replaced in advance, and the autofluorescence of each well was measured with a fluorescence microplate reader. The time from the start of replacement to just before administration is approximately 28 minutes. After completion of the administration, the diluted solution was first diluted once with 200 ⁇ L of a dedicated KRB solution, and then the fluorescent solution in the well was diluted with 300 ⁇ L of a normal KRB solution.
- D-glucose When D-glucose is taken into cells via GLUT present in the cell membrane, it is necessary that D-glucose binds to the D-glucose binding site in the GLUT protein. Specifically, D-glucose binds to the D-glucose binding site in the GLUT protein that is initially open to the outside of the cell membrane, and as a result of this binding, the three-dimensional structure of GLUT changes to a shape that opens inside the cell. Then, when D-glucose moves away from the binding site in GLUT, the facing side is inside the cell, and as a result, a mechanism is considered that it is transported from outside the cell into the cell.
- Example 15 Effect of Cytochalasin B (CB) or Phloretin (PHT) on the increase in fluorescence intensity by QDG administration to MIN6 cells
- CB Cytochalasin B
- PHT Phloretin
- Example 16 Imaging of tumor cell mass composed of mouse insulinoma cells (MIN6) using CDG / 2-NBDLG / 2-TRLG
- CDG was 100 ⁇ M
- 2 A fluorescent mixed solution (CDG / 2-NBDLG / 2-TRLG) containing -NBDLG 100 ⁇ M and 2-TRLG 20 ⁇ M was administered at 37 degrees for 3 minutes, and fluorescence imaging was performed.
- the KRB solution for image acquisition was warmed in advance in an aluminum syringe heater and supplied to the perfusion chamber by hydrostatic pressure.
- the perfusion rate was adjusted to 1.3 ⁇ 0.2 mL / min using a flow controller.
- the solution was reheated via an in-line heater immediately before being introduced into the perfusion chamber, and adjusted so that the measured temperature of the perfusate was 36 ⁇ 1 ° C. in the observation region in the chamber.
- the CDG / 2-NBDLG / 2-TRLG mixed solution can be supplied in the same manner, and switching to the image acquisition KRB solution was performed using an electromagnetic valve capable of controlling the opening and closing of the flow path. Removal of the solution was performed using a vacuum pump capable of controlling the suction pressure.
- FIG. 6 and FIG. 7 show the results of administering a mixed solution of 100 ⁇ M CDG + 100 ⁇ M 2-NBDLG + 20 ⁇ M 2-TRLG to the spheroid-formed MIN6 cell mass for 3 minutes.
- FIG. 6 shows a fluorescence microscopic image 6 minutes after starting to wash out the mixed solution.
- FIGS. 6A, B, and C show the state of uptake of CDG that emits blue fluorescence, 2-NBDLG that emits green fluorescence, and 2-TRLG that emits red fluorescence, respectively.
- FIG. 6D is a differential interference contrast (DIC) image.
- DIC differential interference contrast
- FIG. 7 is an overwritten image of FIG. 6A and FIG.
- CDG uptake is expressed in red instead of blue in order to make it easy to see the localization of CDG and 2-NBDLG.
- the above results indicate the possibility of detecting the presence of cells that take up CDG with little uptake of 2-NBDLG by simultaneously administering CDG and 2-NBDLG to the cell mass.
- Example 17 Imaging of tumor cell mass composed of mouse insulinoma cells (MIN6) using CLG / 2-NBDLG / 2-TRLG As in Example 16, except for MIN6 cell mass on the 15th day of culture Fluorescence imaging was performed using a CLG / 2-NBDLG / 2-TRLG mixed solution instead of the CDG / 2-NBDLG / 2-TRLG mixed solution. The results are shown in FIG. After the mixed solution of 100 ⁇ M CLG + 100 ⁇ M 2-NBDLG + 20 ⁇ M 2-TRLG is administered to the spheroid-formed MIN6 cell mass for 3 minutes, the mixture solution starts to be washed out, and a fluorescence microscopic image 6 minutes after is shown. ing. FIGS.
- FIG. 8A, B, and C show the state of incorporation of CLG emitting blue fluorescence, 2-NBDLG emitting green fluorescence, and 2-TRLG emitting red fluorescence into cancer cells, respectively.
- FIG. 8D is a differential interference contrast (DIC) image. Unlike CDG, all cells that strongly uptake CLG also showed uptake of 2-NBDLG. Also, like CDG, CLG was strongly incorporated not only in the cytoplasm but also in the nucleus.
- DIC differential interference contrast
- Example 18 Application of CLG to acutely isolated normal nerve cells (Experimental method) (1) Preparation of mixed solution with CLG solution and other fluorescent sugar derivatives Preparation of CLG solution The whole amount of 0.5 mg CLG vial was collected using 0.73 mL of 10% DMSO, and dissolved in a method according to Non-Patent Document 2 to 14.79 ml of HEPES solution for image acquisition (100 ⁇ M). Preparation of 100 ⁇ M CLG + 20 ⁇ M 2-TRLG mixed solution Collect the entire 0.2 mg 2-TRLG vial using 130 ⁇ L of DMSO. CLG solution was dissolved in 13 mL by a method according to Non-Patent Document 2 (final concentration 100 ⁇ M CLG + 20 ⁇ M 2-TRLG mixed solution).
- HEPES solution for image acquisition A solution having the following composition was used for fluorescent image acquisition. Adjusted to pH 7.4 with NaCl 150 mM, KCl 5 mM, MgCl 2 1 mM, CaCl 2 2 mM, HEPES 10 mM, 1M Tris (2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol). Glucose concentration was 10 mM. In addition, 0.1 mM Carbenoxolone (SIGMA # C4790) was added for the purpose of inhibiting the entrance and exit of fluorescently labeled glucose via gap junction / hemichannel. This HEPES solution for image acquisition was used to prepare a mixed solution with a CLG solution and other fluorescent sugar derivatives.
- mice 21 days after birth were previously reported by the inventors (WO2010 / 16587, Patent Document 2) and ( According to the method described in WO2012 / 133688 and Patent Document 4), the sample was acutely isolated, attached to a glass cover slip coated with poly-L-Lysine, and then placed in a perfusion chamber set on the stage of a fluorescence microscope. The glass coverslip was transferred into the HEPES solution for image acquisition and observed.
- FIG. 9 shows changes in fluorescence intensity of cells after administration of a mixed solution of CLG + 2-TRLG for 3 minutes to acutely isolated normal neurons (arrows), and changes in blue fluorescence emitted by CLG. This is an example observed in the wavelength region (Blue channel). Background subtraction was performed both before and after administration.
- A is an observation of autofluorescence exhibited by normal nerve cells (arrows) before administration of the mixed solution.
- A is a superposition of a differential interference contrast (DIC) image on B. It can be seen that normal neurons emit a slight amount of autofluorescence before administration of the mixed solution. * Dead cell debris. The left-hand debris shows relatively strong autofluorescence.
- DIC differential interference contrast
- FIG. 10 shows the changes in fluorescence before and after administration of the mixed solution in FIG. 9 observed simultaneously in the wavelength region (Red channel) of red fluorescence emitted by 2-TRLG.
- A is an autofluorescence image before administration of the mixed solution
- B is a superposition of a differential interference contrast (DIC) image on A for easy understanding of the cell position. In the red fluorescence wavelength region, the autofluorescence of the cells is extremely small.
- Example 19 Application of CDG to acutely isolated normal nerve cells The experiment was carried out in the same manner as in the experimental method described in Example 18. However, a final concentration of 100 ⁇ M CDG + 20 ⁇ M 2-TRLG mixed solution was prepared using CDG instead of CLG, and midbrain nigroreticular neurons were prepared from 14-day-old mice.
- FIG. 11 shows changes in the fluorescence intensity of cells after administration of a mixed solution of CDG + 2-TRLG for 3 minutes to acutely isolated normal neurons (arrows), with respect to the blue fluorescence emitted by CDG. This is an example observed in the wavelength region (Blue channel). Background subtraction was performed both before and after administration.
- A is an observation of autofluorescence exhibited by normal nerve cells (arrows) before administration of the mixed solution.
- A is a superposition of a differential interference contrast (DIC) image on B. * Debris of dead cells.
- C is a fluorescent microscopic image 8 minutes after starting to wash out the mixed solution
- D is a superposition of DIC image on C.
- DIC differential interference contrast
- FIG. 12 shows the changes in fluorescence before and after administration of the mixed solution in FIG. 11 observed simultaneously in the wavelength region (Red channel) of red fluorescence emitted by 2-TRLG.
- A is an autofluorescence image before administration of the mixed solution
- B is a superposition of a differential interference contrast (DIC) image on A for easy understanding of the cell position.
- DIC differential interference contrast
- the present invention provides a novel glucose derivative.
- the present invention also provides a cell imaging agent and an imaging method using the glucose derivative.
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Abstract
Description
1.下記式(1):
R1およびR2は、各々独立に、水素、ハロゲン、C1-C5アルキル、C2-C5アルケニル、C2-C5アルキニル、C1-C5ハロアルキル、C1-C5アルキルアミノ、シクロアルキル、フェニル、ピリジル、チオフェニル、ピロリル、およびフラニルからなる群より選ばれる基であり、
Gは、下記式(G1)~(G4):
R1およびR2は、各々独立に、水素、ハロゲン、C1-C5アルキル、C2-C5アルケニル、C2-C5アルキニル、C1-C5ハロアルキル、C1-C5アルキルアミノ、シクロアルキル、フェニル、ピリジル、チオフェニル、ピロリル、およびフラニルからなる群より選ばれる基である。)
で表される化合物またはその塩である、上記1に記載のグルコース誘導体。
3.前記式(2)において、XがOである、上記2に記載のグルコース誘導体。
4.下記式(3):
で表される化合またはその塩である上記1に記載のグルコース誘導体。
5.下記式(4):
R1およびR2は、各々独立に、水素、ハロゲン、C1-C5アルキル、C2-C5アルケニル、C2-C5アルキニル、C1-C5ハロアルキル、C1-C5アルキルアミノ、シクロアルキル、フェニル、ピリジル、チオフェニル、ピロリル、およびフラニルからなる群より選ばれる基である。)
で表される化合物またはその塩である、上記1に記載のグルコース誘導体。
6.前記式(4)において、XがOである、上記5に記載のグルコース誘導体。
7.下記式(5):
で表される化合物またはその塩である上記1に記載のグルコース誘導体。
2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-クロメン-7-イル)アミノ-D-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-3-メチル-クロメン-7-イル)アミノ-D-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-3-トリフルオロメチル-クロメン-7-イル)アミノ-D-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-4-メチル-クロメン-7-イル)アミノ-D-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-4-トリフルオロメチル-クロメン-7-イル)アミノ-D-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-3-フェニル-クロメン-7-イル)アミノ-D-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-3-(ピリジン-2-イル)-クロメン-7-イル)アミノ-D-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-3-(ピリジン-4-イル)-クロメン-7-イル)アミノ-D-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-3-(チオフェン-2-イル)-クロメン-7-イル)アミノ-D-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-3-(フラン-2-イル)-クロメン-7-イル)アミノ-D-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-3-(ピロール-2-イル)-クロメン-7-イル)アミノ-D-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-3-フェニル-4-メチル-クロメン-7-イル)アミノ-D-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-3-(ピリジン-2-イル)-4-メチル-クロメン-7-イル)アミノ-D-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-3-(ピリジン-4-イル)-4-メチル-クロメン-7-イル)アミノ-D-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-3-(チオフェン-2-イル)-4-メチル-クロメン-7-イル)アミノ-D-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-3-(フラン-2-イル)-4-メチル-クロメン-7-イル)アミノ-D-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-3-(ピロール-2-イル)-4-メチル-クロメン-7-イル)アミノ-D-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-3-フェニル-4-トリフルオロメチル-クロメン-7-イル)アミノ-D-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-3-(ピリジン-2-イル)-4-トリフルオロメチル-クロメン-7-イル)アミノ-D-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-3-(ピリジン-4-イル)-4-トリフルオロメチル-クロメン-7-イル)アミノ-D-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-3-(チオフェン-2-イル)-4-トリフルオロメチル-クロメン-7-イル)アミノ-D-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-3-(フラン-2-イル)-4-トリフルオロメチル-クロメン-7-イル)アミノ-D-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-3-(ピロール-2-イル)-4-トリフルオロメチル-クロメン-7-イル)アミノ-D-グルコース、
2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-3-ヨード-クロメン-7-イル)アミノ-D-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-4-ヨード-クロメン-7-イル)アミノ-D-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-3-ホルミル-クロメン-7-イル)アミノ-D-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-4-ホルミル-クロメン-7-イル)アミノ-D-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-3-エテニル-クロメン-7-イル)アミノ-D-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-4-エテニル-クロメン-7-イル)アミノ-D-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-3-エチニル-クロメン-7-イル)アミノ-D-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-4-エチニル-クロメン-7-イル)アミノ-D-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-3,4-ジメチル-クロメン-7-イル)アミノ-D-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-3-アセチル-クロメン-7-イル)アミノ-D-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-4-アセチル-クロメン-7-イル)アミノ-D-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-3-シクロプロパニル-クロメン-7-イル)アミノ-D-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-4-シクロプロパニル-クロメン-7-イル)アミノ-D-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-3-メチル-4-アセチル-クロメン-7-イル)アミノ-D-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-3-アセチル-4-メチル-クロメン-7-イル)アミノ-D-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-3-プロペニル-クロメン-7-イル)アミノ-D-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-4-プロペニル-クロメン-7-イル)アミノ-D-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-キノリン-7-イル)アミノ-D-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-3-メチル-キノリン-7-イル)アミノ-D-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-3-トリフルオロメチル-キノリン-7-イル)アミノ-D-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-4-メチル-キノリン-7-イル)アミノ-D-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-4-トリフルオロメチル-キノリン-7-イル)アミノ-D-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-3-フェニル-キノリン-7-イル)アミノ-D-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-3-(ピリジン-2-イル)-キノリン-7-イル)アミノ-D-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-3-(ピリジン-4-イル)-キノリン-7-イル)アミノ-D-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-3-(チオフェン-2-イル)-キノリン-7-イル)アミノ-D-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-3-(フラン-2-イル)-キノリン-7-イル)アミノ-D-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-3-(ピロール-2-イル)-キノリン-7-イル)アミノ-D-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-3-フェニル-4-メチル-キノリン-7-イル)アミノ-D-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-3-(ピリジン-2-イル)-4-メチル-キノリン-7-イル)アミノ-D-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-3-(ピリジン-4-イル)-4-メチル-キノリン-7-イル)アミノ-D-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-3-(チオフェン-2-イル)-4-メチル-キノリン-7-イル)アミノ-D-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-3-(フラン-2-イル)-4-メチル-キノリン-7-イル)アミノ-D-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-3-(ピロール-2-イル)-4-メチル-キノリン-7-イル)アミノ-D-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-3-フェニル-4-トリフルオロメチル-キノリン-7-イル)アミノ-D-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-3-(ピリジン-2-イル)-4-トリフルオロメチル-キノリン-7-イル)アミノ-D-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-3-(ピリジン-4-イル)-4-トリフルオロメチル-キノリン-7-イル)アミノ-D-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-3-(チオフェン-2-イル)-4-トリフルオロメチル-キノリン-7-イル)アミノ-D-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-3-(フラン-2-イル)-4-トリフルオロメチル-キノリン-7-イル)アミノ-D-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-3-(ピロール-2-イル)-4-トリフルオロメチル-キノリン-7-イル)アミノ-D-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-3-ヨード-キノリン-7-イル)アミノ-D-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-4-ヨード-キノリン-7-イル)アミノ-D-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-3-ホルミル-キノリン-7-イル)アミノ-D-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-4-ホルミル-キノリン-7-イル)アミノ-D-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-3-エテニル-キノリン-7-イル)アミノ-D-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-4-エテニル-キノリン-7-イル)アミノ-D-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-3-エチニル-キノリン-7-イル)アミノ-D-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-4-エチニル-キノリン-7-イル)アミノ-D-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-3,4-ジメチル-キノリン-7-イル)アミノ-D-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-3-アセチル-キノリン-7-イル)アミノ-D-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-4-アセチル-キノリン-7-イル)アミノ-D-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-3-シクロプロパニル-キノリン-7-イル)アミノ-D-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-4-シクロプロパニル-キノリン-7-イル)アミノ-D-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-3-アセチル-4-メチル-キノリン-7-イル)アミノ-D-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-3-メチル-4-アセチル-キノリン-7-イル)アミノ-D-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-3-プロペニル-キノリン-7-イル)アミノ-D-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-4-プロペニル-キノリン-7-イル)アミノ-D-グルコース、2-デオキシ-2-(1-メチル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-キノリン-7-イル)アミノ-D-グルコース、2-デオキシ-2-(2-メトキシキノリン-7-イル)アミノ-D-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-クロメン-7-イル)アミノ-L-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-3-メチル-クロメン-7-イル)アミノ-L-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-3-トリフルオロメチル-クロメン-7-イル)アミノ-L-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-4-メチル-クロメン-7-イル)アミノ-L-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-4-トリフルオロメチル-クロメン-7-イル)アミノ-L-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-3-フェニル-クロメン-7-イル)アミノ-L-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-3-(ピリジン-2-イル)-クロメン-7-イル)アミノ-L-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-3-(ピリジン-4-イル)-クロメン-7-イル)アミノ-L-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-3-(チオフェン-2-イル)-クロメン-7-イル)アミノ-L-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-3-(フラン-2-イル)-クロメン-7-イル)アミノ-L-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-3-(ピロール-2-イル)-クロメン-7-イル)アミノ-L-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-3-フェニル-4-メチル-クロメン-7-イル)アミノ-L-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-3-(ピリジン-2-イル)-4-メチル-クロメン-7-イル)アミノ-L-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-3-(ピリジン-4-イル)-4-メチル-クロメン-7-イル)アミノ-L-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-3-(チオフェン-2-イル)-4-メチル-クロメン-7-イル)アミノ-L-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-3-(フラン-2-イル)-4-メチル-クロメン-7-イル)アミノ-L-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-3-(ピロール-2-イル)-4-メチル-クロメン-7-イル)アミノ-L-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-3-フェニル-4-トリフルオロメチル-クロメン-7-イル)アミノ-L-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-3-(ピリジン-2-イル)-4-トリフルオロメチル-クロメン-7-イル)アミノ-L-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-3-(ピリジン-4-イル)-4-トリフルオロメチル-クロメン-7-イル)アミノ-L-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-3-(チオフェン-2-イル)-4-トリフルオロメチル-クロメン-7-イル)アミノ-L-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-3-(フラン-2-イル)-4-トリフルオロメチル-クロメン-7-イル)アミノ-L-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-3-(ピロール-2-イル)-4-トリフルオロメチル-クロメン-7-イル)アミノ-L-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-3-ヨード-クロメン-7-イル)アミノ-L-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-4-ヨード-クロメン-7-イル)アミノ-L-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-3-ホルミル-クロメン-7-イル)アミノ-L-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-4-ホルミル-クロメン-7-イル)アミノ-L-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-3-エテニル-クロメン-7-イル)アミノ-L-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-4-エテニル-クロメン-7-イル)アミノ-L-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-3-エチニル-クロメン-7-イル)アミノ-L-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-4-エチニル-クロメン-7-イル)アミノ-L-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-3,4-ジメチル-クロメン-7-イル)アミノ-L-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-3-アセチル-クロメン-7-イル)アミノ-L-グルコー
ス、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-4-アセチル-クロメン-7-イル)アミノ-L-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-3-シクロプロパニル-クロメン-7-イル)アミノ-L-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-4-シクロプロパニル-クロメン-7-イル)アミノ-L-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-3-メチル-4-アセチル-クロメン-7-イル)アミノ-L-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-3-アセチル-4-メチル-クロメン-7-イル)アミノ-L-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-3-プロペニル-クロメン-7-イル)アミノ-L-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-4-プロペニル-クロメン-7-イル)アミノ-L-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-キノリン-7-イル)アミノ-L-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-3-メチル-キノリン-7-イル)アミノ-L-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-3-トリフルオロメチル-キノリン-7-イル)アミノ-L-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-4-メチル-キノリン-7-イル)アミノ-L-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-4-トリフルオロメチル-キノリン-7-イル)アミノ-L-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-3-フェニル-キノリン-7-イル)アミノ-L-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-3-(ピリジン-2-イル)-キノリン-7-イル)アミノ-L-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-3-(ピリジン-4-イル)-キノリン-7-イル)アミノ-L-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-3-(チオフェン-2-イル)-キノリン-7-イル)アミノ-L-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-3-(フラン-2-イル)-キノリン-7-イル)アミノ-L-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-3-(ピロール-2-イル)-キノリン-7-イル)アミノ-L-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-3-フェニル-4-メチル-キノリン-7-イル)アミノ-L-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-3-(ピリジン-2-イル)-4-メチル-キノリン-7-イル)アミノ-L-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-3-(ピリジン-4-イル)-4-メチル-キノリン-7-イル)アミノ-L-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-3-(チオフェン-2-イル)-4-メチル-キノリン-7-イル)アミノ-L-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-3-(フラン-2-イル)-4-メチル-キノリン-7-イル)アミノ-L-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-3-(ピロール-2-イル)-4-メチル-キノリン-7-イル)アミノ-L-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-3-フェニル-4-トリフルオロメチル-キノリン-7-イル)アミノ-L-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-3-(ピリジン-2-イル)-4-トリフルオロメチル-キノリン-7-イル)アミノ-L-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-3-(ピリジン-4-イル)-4-トリフルオロメチル-キノリン-7-イル)アミノ-L-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-3-(チオフェン-2-イル)-4-トリフルオロメチル-キノリン-7-イル)アミノ-L-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-3-(フラン-2-イル)-4-トリフルオロメチル-キノリン-7-イル)アミノ-L-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-3-(ピロール-2-イル)-4-トリフルオロメチル-キノリン-7-イル)アミノ-L-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-3-ヨード-キノリン-7-イル)アミノ-L-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-4-ヨード-キノリン-7-イル)アミノ-L-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-3-ホルミル-キノリン-7-イル)アミノ-L-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-4-ホルミル-キノリン-7-イル)アミノ-L-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-3-エテニル-キノリン-7-イル)アミノ-L-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-4-エテニル-キノリン-7-イル)アミノ-L-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-3-エチニル-キノリン-7-イル)アミノ-L-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-4-エチニル-キノリン-7-イル)アミノ-L-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-3,4-ジメチル-キノリン-7-イル)アミノ-L-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-3-アセチル-キノリン-7-イル)アミノ-L-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-4-アセチル-キノリン-7-イル)アミノ-L-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-3-シクロプロパニル-キノリン-7-イル)アミノ-L-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-4-シクロプロパニル-キノリン-7-イル)アミノ-L-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-3-アセチル-4-メチル-キノリン-7-イル)アミノ-L-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-3-メチル-4-アセチル-キノリン-7-イル)アミノ-L-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-3-プロペニル-キノリン-7-イル)アミノ-D-グルコース、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-4-プロペニル-キノリン-7-イル)アミノ-L-グルコース、
2-デオキシ-2-(1-メチル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-キノリン-7-イル)アミノ-L-グルコース、および、2-デオキシ-2-(2-メトキシキノリン-7-イル)アミノ-L-グルコースからなる群より選ばれる上記1に記載のグルコース誘導体。
2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-クロメン-7-イル)アミノ-D-グルコース(本明細書では、CDGともいう。)、2,4-ジデオキシ-2-(2-オキソ-2H-クロメン-7-イル)アミノ-4-フルオロ-D-グルコース(4-F-CDG)、2,6-ジデオキシ-2-(2-オキソ-2H-クロメン-7-イル)アミノ-6-フルオロ-D-グルコース(6-F-CDG)、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-7-イル)アミノ-D-グルコース(QDG)、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-3-メチル-クロメン-7-イル)アミノ-D-グルコース(3-MCDG)、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-4-メチル-クロメン-7-イル)アミノ-D-グルコース(4-MCDG)、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-3-トリフルオロメチル-クロメン-7-イル)アミノ-D-グルコース(3-TFMCDG)、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-4-トリフルオロメチル-クロメン-7-イル)アミノ-D-グルコース(4-TFMCDG)、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-3-メチル-キノリン-7-イル)アミノ-D-グルコース(3-MQDG)、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-4-メチル-キノリン-7-イル)アミノ-D-グルコース(4-MQDG)、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-3-トロフルオロメチル-キノリン-7-イル)アミノ-D-グルコース(3-TFMQDG)、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-4-トロフルオロメチル-キノリン-7-イル)アミノ-D-グルコース(4-TFMQDG)、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-クロメン-7-イル)アミノ-L-グルコース(CLG)、2,4-ジデオキシ-2-(2-オキソ-2H-クロメン-7-イル)アミノ-4-フルオロ-L-グルコース(4-F-CLG)、2,6-ジデオキシ-2-(2-オキソ-2H-クロメン-7-イル)アミノ-6-フルオロ-L-グルコース(6-F-CLG)、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-7-イル)アミノ-L-グルコース(QLG)、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-3-メチル-クロメン-7-イル)アミノ-L-グルコース(3-MCLG)、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-4-メチル-クロメン-7-イル)アミノ-L-グルコース(4-MCLG)、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-3-トリフルオロメチル-クロメン-7-イル)アミノ-L-グルコース(3-TFMCLG)、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-4-トリフルオロメチル-クロメン-7-イル)アミノ-L-グルコース(4-TFMCLG)、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-3-メチル-キノリン-7-イル)アミノ-L-グルコース(3-MQLG)、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-4-メチル-キノリン-7-イル)アミノ-L-グルコース(4-MQLG)、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-3-トロフルオロメチル-キノリン-7-イル)アミノ-L-グルコース(3-TFMQLG)、および、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-4-トロフルオロメチル-キノリン-7-イル)アミノ-L-グルコース(4-TFMQLG)
からなる群より選ばれる上記1に記載のグルコース誘導体。
10.2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-クロメン-7-イル)アミノ-D-グルコース(CDG)、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-7-イル)アミノ-D-グルコース(QDG)、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-クロメン-7-イル)アミノ-L-グルコース(CLG)、または2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-7-イル)アミノ-L-グルコース(QLG)である上記9に記載のグルコース誘導体。
11.上記1~10に記載のグルコース誘導体において、グルコースの2位、4位または6位のいずれか一つのヒドロキシ基またはフッ素基が、18Fに置換された(好ましくは、2,4-ジデオキシ-2-(2-オキソ-2H-クロメン-7-イル)アミノ-4-[18F]フルオロ-D-グルコース(4-18F-CDG)、2,4-ジデオキシ-2-(2-オキソ-2H-クロメン-7-イル)アミノ-4-[18F]フルオロ-L-グルコース(4-18F-CLG)、2,6-ジデオキシ-2-(2-オキソ-2H-クロメン-7-イル)アミノ-6-[18F]フルオロ-D-グルコース(6-18F-CDG)、または2,6-ジデオキシ-2-(2-オキソ-2H-クロメン-7-イル)アミノ-6-[18F]フルオロ-L-グルコース(6-18F-CLG)である)放射性標識されたグルコース誘導体。
12.上記1~9に記載のグルコース誘導体において、R1またはR2が、11CH3またはCF2 18Fである(好ましくは、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-3-[11C]メチル-クロメン-7-イル)アミノ-D-グルコース(3-[11C]MCDG)、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-4-[11C]メチル-クロメン-7-イル)アミノ-D-グルコース(4-[11C]MCDG)、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-3-[18F]フルオロジフルオロメチル-クロメン-7-イル)アミノ-D-グルコース(3-[18F]TFMCDG)、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-4-[18F]フルオロジフルオロメチル-クロメン-7-イル)アミノ-D-グルコース(4-[18F]TFMCDG)、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-3-[11C]メチル-キノリン-7-イル)アミノ-D-グルコース(3-[11C]MQDG)、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-4-[11C]メチル-キノリン-7-イル)アミノ-D-グルコース(4-[11C]MQDG)、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-3-[18F]フルオロジフルオロメチル-キノリン-7-イル)アミノ-D-グルコース(3-[18F]TFMQDG)、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-4-[18F]フルオロジフルオロメチル-キノリン-7-イル)アミノ-D-グルコース(4-[18F]TFMQDG)、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-3-[11C]メチル-クロメン-7-イル)アミノ-L-グルコース(3-[11C]MCLG)、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-4-[11C]メチル-クロメン-7-イル)アミノ-L-グルコース(4-[11C]MCLG)、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-3-[18F]フルオロジフルオロメチル-クロメン-7-イル)アミノ-L-グルコース(3-[18F]TFMCLG)、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-4-[18F]フルオロジフルオロメチル-クロメン-7-イル)アミノ-L-グルコース(4-[18F]TFMCLG)、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-3-[11C]メチル-キノリン-7-イル)アミノ-L-グルコース(3-[11C]MQLG)、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-4-[11C]メチル-キノリン-7-イル)アミノ-L-グルコース(4-[11C]MQLG)、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-3-[18F]フルオロジフルオロメチル-キノリン-7-イル)アミノ-L-グルコース(3-[18F]TFMQLG)、または2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-4-[18F]フルオロジフルオロメチル-キノリン-7-イル)アミノ-L-グルコース(4-[18F]TFMQLG)である)放射性標識されたグルコース誘導体。
14.上記3または4に記載のグルコース誘導体を含む、標的細胞をイメージングするための組成物。
15.上記6または7に記載のグルコース誘導体を含む、標的細胞をイメージングするための組成物。
16.上記9に記載のグルコース誘導体を含む、標的細胞をイメージングするための組成物。
17.上記10に記載のグルコース誘導体を含む、標的細胞をイメージングするための組成物。
18.前記グルコース誘導体が2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-クロメン-7-イル)アミノ-D-グルコース(CDG)または2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-クロメン-7-イル)アミノ-L-グルコース(CLG)である、上記17に記載の組成物。
19.前記グルコース誘導体が2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-7-イル)アミノ-D-グルコース(QDG)または2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-7-イル)アミノ-L-グルコース(QLG)である、上記17に記載の組成物。
20.上記11または12に記載の放射性標識されたグルコース誘導体を含む、標的細胞をイメージングするための組成物。
a.標的細胞に、上記1~12のいずれか一つに記載のグルコース誘導体を接触させる工程、および
b.該標的細胞内に存在するグルコース誘導体が発する蛍光を検出する工程、
を含む細胞のイメージング方法。
22.前記グルコース誘導体が2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-クロメン-7-イル)アミノ-D-グルコース(CDG)または2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-クロメン-7-イル)アミノ-L-グルコース(CLG)である、上記21に記載のイメージング方法。
23.前記グルコース誘導体が2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-7-イル)アミノ-D-グルコース(QDG)または2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-7-イル)アミノ-L-グルコース(QLG)である、上記21に記載のイメージング方法。
24.前記工程aにおける組成物が、さらに別の蛍光標識グルコース誘導体を含み、かつ前記工程bが、標的細胞内に存在する少なくとも一つのグルコース誘導体を検出する工程である、上記21~23のいずれか一つに記載のイメージング方法。
25.前記別の蛍光標識グルコース誘導体が、2-[N-(7-ニトロベンズ-2-オキサ-1,3-ジアゾール-4-イル)アミノ]-2-デオキシ-D-グルコース(2-NBDG)、2-[N-(7-ニトロベンズ-2-オキサ-1,3-ジアゾール-4-イル)アミノ]-2-デオキシ-L-グルコース(2-NBDLG)、2-デオキシ-2-[N-7-(N’,N’-ジメチルアミノスルホニル)ベンズ-2-オキサ-1,3-ジアゾール-4-イル)アミノ]-D-グルコース(2-DBDG)、2-デオキシ-2-[N-7-(N’,N’-ジメチルアミノスルホニル)ベンズ-2-オキサ-1,3-ジアゾール-4-イル)アミノ]-L-グルコース(2-DBDLG)、および、2位にスルホローダミン(好ましくは、スルホーダミン101、スルホーダミンB)をスルホンアミド結合せしめた2-アミノ-2-デオキシ-L-グルコースからなる群より選ばれる少なくとも一つのグルコース誘導体である、上記24に記載のイメージング方法。
26.前記グルコース誘導体の組合せが、蛍光として青色、緑色および赤色から選ばれる2色の色をそれぞれ発する2つのグルコース誘導体の組合せである、上記25に記載のイメージング方法。
27.前記グルコース誘導体の組合せが、蛍光として青色を発するグルコース誘導体と緑色を発するグルコース誘導体と赤色を発するグルコース誘導体の組合せである、上記25に記載のイメージング方法。
a.標的細胞に、上記3または4に記載のグルコース誘導体を含有する組成物を接触させる工程、および
b.該標的細胞内に存在する該グルコース誘導体を検出する工程、
を含む検出方法。
29.前記グルコース誘導体が、CDG、QDG、3-TFMCDG、4-TFMCDG、3-TFMQDG、または4-TFMQDGである上記28に記載の検出方法。
30.前記グルコース誘導体がCDGである上記29に記載の検出方法。
31.癌または癌細胞を検出するための方法であって、以下の工程、
a.標的細胞に、上記6または7に記載のグルコース誘導体を含有する組成物を接触させる工程、および
b.該標的細胞内に存在する該グルコース誘導体を検出する工程、
を含む検出方法。
32.前記グルコース誘導体が、CLG、QLG、3-TFMCLG、4-TFMCLG、3-TFMQLG、または4-TFMQLGである上記29に記載の検出方法。
33.前記グルコース誘導体がCLGである上記32に記載の検出方法。
34.前記工程bにおける検出が標的細胞をイメージングすることにより行う上記28~33のいずれか一つに記載の検出方法。
35.前記工程aにおける組成物が、さらに別の蛍光標識グルコース誘導体を含み、かつ前記工程bが、標的細胞内に存在する少なくとも一つのグルコース誘導体を検出する工程である、上記28~34のいずれか一つに記載の検出方法。
36.前記、別の蛍光標識グルコース誘導体が、2-[N-(7-ニトロベンズ-2-オキサ-1,3-ジアゾール-4-イル)アミノ]-2-デオキシ-D-グルコース(2-NBDG)、2-[N-(7-ニトロベンズ-2-オキサ-1,3-ジアゾール-4-イル)アミノ]-2-デオキシ-L-グルコース(2-NBDLG)、2-デオキシ-2-[N-7-(N’,N’-ジメチルアミノスルホニル)ベンズ-2-オキサ-1,3-ジアゾール-4-イル)アミノ]-D-グルコース(2-DBDG)、2-デオキシ-2-[N-7-(N’,N’-ジメチルアミノスルホニル)ベンズ-2-オキサ-1,3-ジアゾール-4-イル)アミノ]-L-グルコース(2-DBDLG)、および、2位にスルホローダミン(好ましくは、スルホーダミン101、スルホーダミンB)をスルホンアミド結合せしめた2-アミノ-2-デオキシ-L-グルコースからなる群より選ばれる少なくとも一つのグルコース誘導体である、上記35に記載の検出方法。
37.前記グルコース誘導体の組合せが、蛍光として青色、緑色および赤色から選ばれる2色の色をそれぞれ発する2つのグルコース誘導体の組合せである、上記36に記載の検出方法。
38.前記グルコース誘導体の組合せが、蛍光として青色を発するグルコース誘導体と緑色を発するグルコース誘導体と赤色を発するグルコース誘導体の組合せである、上記36に記載の検出方法。
39.標的がん細胞をイメージングするためのイメージング剤であって、上記3または4に記載のグルコース誘導体を含むがん細胞のイメージング剤。
40.前記グルコース誘導体が、CDG、QDG、4-F-CDG、6-F-CDG、4-F-QDG、6-F-QDG、3-TFMCDG、4-TFMCDG、3-TFMQDD、または4-TFMQDGである上記39に記載のイメージング剤。
41.前記グルコース誘導体がCDGである上記40に記載のイメージング剤。
42.標的がん細胞をイメージングするためのイメージング剤であって、上記6または7に記載のグルコース誘導体を含むがん細胞のイメージング剤。
43.前記グルコース誘導体が、CLG、QLG、4-F-CLG、6-F-CLG、4-F-QLG、6-F-QLG、3-TFMCLG、4-TFMCLG、3-TFMQLD、または4-TFMQLGである上記42に記載のイメージング剤。
44.前記グルコース誘導体がCLGである上記43に記載のイメージング剤。
45.上記11または12に記載の放射性標識されたグルコース誘導体を含む、がんのPET検査用イメージング剤。
イメージングの対象としては、例えば、標的となる、細胞膜および/または細胞内の領域であるCytosol、細胞内の小器官(いわゆるオルガネラ(Organelle)であって、例えば、核、小胞体、ゴルジ体、エンドソーム、ライソソーム、ミトコンドリア、ペルオキシソーム、オートファゴソーム(autophagosome)、グライコソーム(glycosome)、プロテアソーム、空胞(vacuole)、葉緑体、グリオキシソーム等の構造体内部および/またはこれらの構造体を囲む生体膜をあげることができる)、細胞内小器官の内部および/または表面の構造体(例えば、核小体、リボソーム等をあげることができる)、標的細胞内分子(例えば、細胞の内側、すなわち細胞質または核内に存在する分子、および標的細胞の細胞膜中に存在する分子、標的細胞の細胞膜上に存在する分子)をあげることができ、本発明のグルコース誘導体は、これらのうち少なくとも1以上をイメージングするために用いることができる。イメージングの対象は、好ましくは、細胞膜および/または細胞内の領域であるCytosol、細胞内の小器官、細胞内小器官の内部および/または表面の構造体であり、特に好ましくは、Cytosol、核である。
本発明のグルコース誘導体は、下記式(1):
ここで、式(1)中、X-Y-Zは、O-C=O,NH-C=O、NR3-C=O、またはN=C-OR4であり、ここで、R3はC1-C5アルキルであり、R4はC1-C5アルキルである。
また、R1およびR2は、各々独立に、水素、ハロゲン、C1-C5アルキル、C2-C5アルケニル、C2-C5アルキニル、C1-C5ハロアルキル、C1-C5アルキルアミノ、シクロアルキル、フェニル、ピリジル、チオフェニル、ピロリル、およびフラニルからなる群より選ばれる。
このような構造を取ることにより、本発明のグルコース誘導体は、その分子内に、蛍光発色団を有する。
グルコサミンは、D-グルコサミンまたはL-グルコサミンを用いることができる。D-グルコサミンは、合成したD-グルコサミンまたは市販のD-グルコサミンを用いることができる。L―グルコサミンは、WO2010/16587号公報(特許文献2)に記載の方法、またはWO2012/133688号公報(特許文献4)に記載の方法により合成することができる(これらの公報または出願明細書の記載は引用することにより本明細書の一部である)。なお、WO2012/133688号公報に記載のL-グルコサミンの合成方法は以下の通りである。
蛍光発色団であるクマリン骨格をもつ化合物の7位を活性基に置換した化合物(A)を合成する。化合物Aはトリフルオロメタンスルホニル基を7位水酸基に結合させて合成する。
(i)鈴木カップリング法:
本発明のグルコース誘導体に放射性標識を付加する方法としては、例えば、グルコースのヒドロキシ基を18Fに置換する方法、クマリン骨格またはキノリン骨格の置換基を放射性標識する方法をあげることができる。
前者の場合における18Fに置換されるヒドロキシ基の位置は、グルコースの2位にクマリン骨格またはキノリン骨格を有する場合は4位または6位であり、グルコースの6位にクマリン骨格またはキノリン骨格を有する場合は2位または4位である。例えば、4-18F-CDG,4-18F-CLG,6-18F-CDG,6-18F-CLG,4-18F-QDG,4-18F-QLG,6-18F-QDG,または6-18F-QLGをあげることができる。
後者の場合は、例えば、クマリン骨格またはキノリン骨格の3位または4位に結合したメチル基の炭素原子が11Cに置換された化合物、クマリン骨格またはキノリン骨格の3位または4位に結合したトリフロロメチル基のフッ素原子の一つが18Fに置換された化合物をあげることができる。例えば、3-[11C]MCDG,4-[11C]MCDG,3-[18F]TFMCDG,4-[18F]TFMCDG,3-[11C]MQDG,4-[11C]MQDG,3-[18F]TFMQDG,4-[18F]TFMQDG,3-[11C]MCLG,4-[11C]MCLG,3-[18F]TFMCLG,4-[18F]TFMCLG,3-[11C]MQLG,4-[11C]MQLG,3-[18F]TFMQLG,または4-[18F]TFMQLGをあげることができる。
このような放射性標識グルコース誘導体は、これに限定されないが、例えば、以下のようにして合成できる。
例えば、以下の化合物(6-18F-CLG)は、例えば、以下の工程により合成することができる。
例えば、以下の化合物(4-18F-CLG)は、例えば、以下の工程により合成することができる。
例えば、以下の化合物(4-18F-6-CDG)は、例えば、以下の工程により合成することができる。
例えば、以下の化合物(2-18F-6-CDG)は、例えば、以下の工程により合成することができる。
例えば、以下の化合物(18F-3-[18F]TFMCDG)は、例えば、以下の工程により合成することができる。
(vi)クマリン骨格に放射性同位体の18Fを含む誘導体の合成法(2)
例えば、以下の化合物(18F-4-[18F]TFMCDG)は、例えば、以下の工程により合成することができる。
(vii)クマリン骨格に放射性同位体の11Cを含む誘導体の合成法(1)
例えば、以下の化合物(11C-3-[11C]MCDG)は、例えば、以下の工程により合成することができる。
(viii)クマリン骨格に放射性同位体の11Cを含む誘導体の合成法(2)
例えば、以下の化合物(11C-4-[11C]MCDG)は、例えば、以下の工程により合成することができる。
すなわち、これに限定されないが、例えば、CDGまたはQDGと2-NBDLG、あるいはCLGまたはQLGと2-NBDGを組み合わせて用いることで、GLUTを介するD-グルコース様の細胞内取り込みと、GLUTを介さない細胞内取り込みの発生を様々な細胞を用いて同一細胞において同時に比較できる等、グルコースの立体選択的な輸送機構の解明に用いることができるとともに、蛍光基の輸送機構への影響を理解する上でも、貴重な情報を得ることできる。
本発明の別の態様は、本発明のグルコース誘導体を含む、細胞または細胞内の分子をイメージングするためのイメージング剤である。
本発明のグルコース誘導体は、細胞の糖の膜輸送系を介して細胞内に取り込まれるので、細胞をイメージングすることができるばかりでなく、細胞内の分子や器官、例えば、細胞質や核をイメージングすることができる。
本発明の別の態様は、本発明のグルコース誘導体、好ましくはL-グルコース誘導体、特に好ましくはCLGまたはQLGを含む組成物を用いてがん細胞を検出する方法である。
さらに、D型およびL型の立体配置に関係するグルコースの認識、輸送、代謝において哺乳動物細胞とは異なった性質をもつ微生物についても、D型またはL型の本発明のグルコース誘導体を用いて細胞レベルでイメージングすることにより、その機能の解明も可能である。
本発明によれば、標的細胞を含む組織に、本発明の組成物を接触させイメージングを行うことにより、組織中のがん細胞を検出することができる。
本発明によれば、本発明の組成物を生体に投与しイメージングを行うことで、がん細胞またはそれらの細胞を含む組織を検出することができ、この方法はがんを検出する方法として有用である。
また、放射性標識をした本発明のグルコース誘導体、好ましくは本発明のL-グルコース誘導体を含む組成物を用いれば、PETによりがんのイメージングを行うことができる。放射性標識をした本発明のグルコース誘導体としては、例えば、4-F-CLG、6-F-CLG、4-F-QLG、6-F-QLG、TFMCDG、TMFCLG、TMFQDG、またはTMFQLGをあげることができ、好ましくは、4-F-CLG、4-F-QLG、TMFCLGまたはTMFQLGをあげることができる。
本発明のグルコース誘導体を用いたイメージングの対象である標的細胞は、特に限定されず、哺乳動物由来の細胞、大腸菌や酵母などの微生物の細胞、植物の細胞、受精卵などを対象とすることができ、また、生体から単離した細胞、生体から単離した組織中に存在する細胞、生体の組織中に存在する細胞、生体から単離後の初代培養細胞、または株化した細胞など、どのような形態の細胞であってもよい。さらには、対象とする細胞は、正常細胞であっても、異常細胞(例えば、がん細胞)であってもよい。
すなわち、がん細胞等のイメージングにあたって、がん細胞に特異的に取り込まれる緑色の蛍光L-グルコース誘導体2-NBDLGを、細胞膜不透過性で赤色の蛍光2-TRLGと同時に使用することが膜損傷や炎症などに起因する非特異的取り込みを調べる上で有効である(本発明者らによる出願WO2012/133688号公報、特許文献4を参照)が、これに加えて、もしがん周辺部に存在する正常細胞や、がんには至らないまでも前がん状態にあるような非がん細胞を可視化できる方法があれば、がんの性質に関してより正確で信頼性の高い情報が得られる。このような候補化合物として、青色蛍光を発し、GLUTを介して細胞内に取り込まれるD-グルコース誘導体が考えられ、本発明のD-グルコース誘導体(例えば、CDGやQDG)がこれに該当する。
本発明のL-グルコース誘導体の一態様は、クマリン骨格またはキノリン骨格を有する特定蛍光発色分子を、正常細胞には取り込まれない性質を有するL-グルコースに結合した化合物である。
本発明の青色D-グルコース誘導体CDGまたはQDGと青色L-グルコース誘導体CLGまたはQLGのがん細胞内への取り込みは、緑色D-グルコース誘導体2-NBDGと緑色L-グルコース誘導体2-NBDLGの関係に似たD型優位の取り込みを示した。さらに、本発明の青色L-グルコース誘導体、例えばCLGを用いた実験によりがん細胞への特異的な取り込みが確認できた。従って、本発明のL-グルコース誘導体は、がん細胞の特異的な検出にも用いることができる。
また、本発明のL-グルコース誘導体は、静脈などの血管に投与した場合は、全身イメージングを行うことも可能であるほか、観察したい組織局所に投与することにより細胞イメージングを行うことも可能である。
加えて、放射性標識した本発明のL-グルコース誘導体を用いた場合は、PETによりがんを検出することも可能となる。
実施例1:CDGの合成
CDGは以下のようにしてD-グルコサミン塩酸塩から合成した。
収量は9.6 mg、収率は47%であった。また、得られた化合物の分析結果は以下の通りである。
1H NMR(D2O, 400 MHz): δ7.75(dd, J = 1.37 Hz, 9.61 Hz, 1H, Coumarin-4H),δ7.30(d, J = 8.69 Hz, 0.7H, Coumarin-5Hα)δ7.29(d, J = 8.69 Hz, 0.3H, Coumarin-5Hβ), δ6,69-6.65(m, 1H, Coumarin-6H), δ6.59(s, 1H, Coumarin-8H), δ6.01(d, J = 9.60 Hz, 0.7H, Coumarin-3Hα), δ6.01(d, J = 9.61 Hz, 0.3H, Coumarin-3Hβ), δ5.20(d, J = 3.55 Hz, 0.7H, H-1α), δ3.78-3.21(m, 6H, H-2, H-3, H-4, H-5, H-6, H-6’); ESI-MS : C15H18NO7 [M+H]+ 計算値 : 324.1, 実測値 : 324.0.最大励起波長(Ex max)366.5nm, 最大蛍光波長(Em max)454.5nm.
CLGは、D-グルコサミン塩酸塩の代わりにL-グルコサミン塩酸塩を用いて、CDGと同様の方法で合成した。収量は13.2 mg、収率は32%であった。また、得られた化合物の分析結果は以下の通りである。
1H NMR(D2O, 400 MHz): δ7.75(dd, J = 1.83 Hz, 9.15 Hz, 1H, Coumarin-4H),δ7.31(d, J = 8.69 Hz, 0.6H, Coumarin-5Hα)δ7.30(d, J = 8.69 Hz, 0.4H, Coumarin-5Hβ), δ6,69-6.65(m, 1H, Coumarin-6H), δ6.60(s, 1H, Coumarin-8H), δ6.02(d, J = 9.61 Hz, 0.6H, Coumarin-3Hα), δ6.01(d, J = 9.15 Hz, 0.4H, Coumarin-3Hβ), δ5.21(d, J = 3.20 Hz, 0.7H, H-1α), δ3.82-3.22(m, 6H, H-2, H-3, H-4, H-5, H-6, H-6’); ESI-MS : C15H18NO7 [M+H]+ 計算値 : 324.1, 実測値 : 324.1.
QDGは以下のようにしてD-グルコサミン塩酸塩から成した。
1H NMR(D2O, 400 MHz): δ7.78(d, J = 9.15 Hz, 0.6H, Quinolinone-4Hα), δ7.77(d, J = 9.61 Hz, 0.4H, Quinolinone-4Hβ), δ7.38(t, J = 8.69Hz, 1H, Quinolinone-5H), δ6.72-6.67(td, , J = 2.29Hz, J = 10.1 Hz, 1H, Quinolinone-6H), δ6.51(d, J = 2.29 Hz , 0.4H, Quinolinone-8Hβ), δ6.49(d, J = 1.83 Hz , 0.6H, Quinolinone-8Hα),δ6.24(d, J = 9.15 Hz, 0.6H, Quinolinone-3Hα), δ6.22(d, J = 9.15 Hz, 0.4H, Quinolinone-3Hβ), δ5.21(d, J = 3.20 Hz, 0.6H, H-1α),δ3.82-3.29(m, 6H, H-2, H-3, H-4, H-5, H-6, H-6’); ESI-MS : C15H18N2O6 [M+H]+ 計算値 : 323.1, 実測値 : 323.1. 最大励起波長(Ex max)353.5nm, 最大蛍光波長(Em max)423.0nm.
QLGは、D-グルコサミン塩酸塩の代わりにL-グルコサミン塩酸塩を用いて、QDGと同様の方法で合成した。収量は23.2 mg、収率は33%であった。また、得られた化合物の分析結果は以下の通りである。
1H NMR(D2O, 400 MHz): δ7.77(d, J = 9.15 Hz, 0.5H, Quinolinone-4Hα), δ7.76(d, J = 9.61 Hz, 0.5H, Quinolinone-4Hβ), δ7.40-7.35(m, 1H, Quinolinone-5H), δ6.71-6.67(td, J = 2.29 Hz, J = 7.78 Hz, 1H, Quinolinone-6H), δ6.51-6.48(m, 1H, Quinolinone-8H),δ6.25-6.20(m, 1H, Quinolinone-3H), δ5.22(d, J = 3.66 Hz, 0.5H, H-1α), δ3.83-3.29(m, 6H, H-2, H-3, H-4, H-5, H-6, H-6’); ESI-MS : C15H18N2O6 [M+H]+ 計算値 : 323.1, 実測値 : 323.1.
4-MCDGは以下のようにして合成した。
1H NMR(CD3OD, 400 MHz): δ7.46(d, J = 8.69 Hz, 0.7H, Coumarin-5Hα), δ7.46(d, J = 9.61 Hz, 0.3H, Coumarin-5Hβ), δ6.77-6.74(m, 1H, Coumarin-6H), δ6.66(d, J = 2.29 Hz, 0.3H, Coumarin-8Hβ),δ6.61(d, J = 2.29 Hz, 0.7H, Coumarin-8Hα), δ5.92(d, J = 1.37 Hz, 0.7H, Coumarin-3Hα), δ5.91(d, J = 0.92 Hz, 0.3H, Coumarin-3Hβ), δ5.18(d, J = 3.20 Hz, 0.7H, H-1α), δ4.56(d, J = 7.78 Hz, 0.3H, H-1β), δ3.90-3.33(m, 6H, H-2, H-3, H-4, H-5, H-6, H-6’) δ2.37(s, 3H, Me) ; ESI-MS : C16H19NO7 [M+H]+ 計算値 : 338.1, 実測値 : 338.1. 最大励起波長(Ex max)362.0nm, 最大蛍光波長(Em max)446.0nm.
3-MCDGは以下のようにして合成した。
収量は33.2 mg、収率は31%であった。また、得られた化合物の分析結果は以下の通りである。
1H NMR(CD3OD, 400 MHz): δ7.55(s, 1H, Coumarin-4H), δ7.23(d, J = 8.23 Hz, 0.7H, Coumarin-5Hα), δ7.20(d, J = 8.70 Hz, 0.3H, Coumarin-5Hβ),δ6,72-6.69(m, 1H, Coumarin-6H), δ6.65(d, J = 1.83 Hz, 0.3H, Coumarin-8Hβ), δ6.60(d, J = 1.83 Hz, 0.7H, Coumarin-8Hα), δ5.18(d, J = 3.20 Hz, 0.7H, H-1α), δ4.55(d, J = 8.24 Hz, 0.3H, H-1β), δ3.90-3.78(m, 3.7H, H-3α, H-5, H-6, H-6’), δ3.51-3.33(m, 2H, H-2α, H-3β, H-4), δ3.25 (dd, J = 1.37 Hz, 8.23 Hz, 0.3H, H-2β), δ2.06 (s, 3H, Me) ; ESI-MS : C16H20NO7 [M+H]+ 計算値 : 338.1, 実測値 : 338.1.最大励起波長(Ex max)361.0nm, 最大蛍光波長(Em max)460.0nm.
4-TFMCDGは以下のようにして合成した。
1H NMR(CD3OD, 400 MHz): δ7.43-7.38(m, 1H, Coumarin-5H), δ6.79(dd, J = 2.29 Hz, J = 9.15 Hz, 0.7H, Coumarin-5Hα), δ6.78(dd, J = 2.29 Hz, J = 8.69 Hz, 0.3H, Coumarin-5Hβ), δ6.72(d, J = 2.29Hz, 0.3H, Coumarin-6Hβ), δ6.69(d, J = 2.29 Hz, 0.7H, Coumarin-6Hα),δ6.37(s, 0.7H, Coumarin-8Hα), δ6.35(s, 0.3H, Coumarin-8Hβ),δ5.18(d, J = 3.20 Hz, 0.7H, H-1α), δ4.57(d, J = 8.24 Hz, 0.3H, H-1β), δ3.90-3.33(m, 6H, H-2, H-3, H-4, H-5, H-6, H-6’); ESI-MS : C16H16F3NO7 [M+H]+ 計算値 : 392.1, 実測値 : 392.1. 最大励起波長(Ex max)380.0nm, 最大蛍光波長(Em max)500.0nm.
3-TFMCDGは以下のようにして合成した。
収量は23.2 mg、収率は27%であった。また、得られた化合物の分析結果は以下の通りである。
1H NMR(CD3OD, 400 MHz): δ8.17(s, 1H, Coumarin-4H),δ7.41(d, J = 8.69 Hz, 0.7H, Coumarin-5Hα)δ7.40(d, J = 8.69 Hz, 0.3H, Coumarin-5Hβ), δ6,80-6.76(m, 1H, Coumarin-6H), δ6.66(d, J = 1.83 Hz, 0.3H, Coumarin-8Hβ), δ6.64(d, J = 2.29 Hz, 0.7H, Coumarin-8Hα),δ5.18(d, J = 3.20 Hz, 0.7H, H-1α), δ4.58(d, J = 7.78 Hz, 0.3H, H-1β),δ3.91-3.68(m, H-3, H-5α, H-6, H-6'), δ3.58 (dd, J = 10.1 Hz, 3.20 Hz, 0.7H, H-2α), δ3.49-3.34 (m, 2.6H, H-2β, H-4, H-5β); ESI-MS : C16H17F3NO7 [M+H]+ 計算値 : 392.1, 実測値 : 392.1.最大励起波長(Ex max)381.0nm, 最大蛍光波長(Em max)455.0nm.
6-F-CDGは以下のようにして合成した。
収量は10.2 mg、収率は17%であった。また、得られた化合物の分析結果は以下の通りである。1H NMR(CD3OD, 400 MHz): δ7.74(d, J = 9.15 Hz, 0.7H, Coumarin-4Hα), δ7.74(d, J = 9.15 Hz, 0.3H, Coumarin-4Hβ),δ7.30(d, J = 8.69 Hz, 0.7H, Coumarin-5Hα),δ7.27(d, J = 8.24 Hz, 0.3H, Coumarin-5Hβ), δ6.75-6.72(m, 1H, Coumarin-6H), δ6.66(d, J = 1.83 Hz, 0.3H, Coumarin-8Hβ), δ6.62(d, J = 2.29 Hz, 0.7H, Coumarin-8Hα), δ6.00(d, J = 9.15 Hz, 0.7H, Coumarin-3Hα), δ5.98(d, J = 9.15 Hz, 0.3H, Coumarin-3Hβ),δ5.19(d, J = 3.20 Hz, 0.7H, H-1α),δ4.75-4.51(m, 2.2H, H-1β, H-3β, H-5β, H-6, H-6'β),δ3.97 (dddd, J = 27.5 Hz, 10.1 Hz, 4.1 Hz, 1.3 Hz, 0.7H, H-6'α), δ3.78 (t, J = 9.61 Hz, 0.7H, H-3α), δ3.55-3.42 (m, 2.4H, H-2α, H-4, H-5α); ESI-MS : C15H17FNO6 [M+H]+ 計算値 : 326.1, 実測値 : 326.1.
4-F-CDGは以下のようにして合成した。
収量は8.4 mg、収率は8%であった。また、得られた化合物の分析結果は以下の通りである。
1H NMR(CD3OD, 400 MHz): δ7.75(d, J = 9.61 Hz, 1H, Coumarin-4H),δ7.30(d, J = 8.69 Hz, 1H, Coumarin-5H),δ6.75(dd, J = 8.24 Hz, 1.83 Hz, 1H, Coumarin-6H), δ6.67(d, J = 1.83 Hz, 0.3H, Coumarin-8Hβ), δ6.63(d, J = 2.29 Hz, 0.7H, Coumarin-8Hα), δ6.01(d, J = 9.15 Hz, 0.7H, Coumarin-3Hα), δ5.99(d, J = 9.15 Hz, 0.3H, Coumarin-3Hβ),δ5.18(t, J = 3.20 Hz, 0.7H, H-1α), δ4.61(d, J = 7.78 Hz, 0.3H, H-1β),δ4.40 (ddd, J = 51.2 Hz, 8.69 Hz, 1.37 Hz, 0.7H, H-4α), δ4.35 (ddd, J = 50.8 Hz, 8.69 Hz, 0.92 Hz, 0.3H, H-4β),δ4.06-3.98(m, 1.7H, H-3α, H-6), δ3.88-3.48 (m, 2.6H, H-2β, H-3β, H-5, H-6'), δ3.36 (d, J = 10.1 Hz, 0.7H, H-2α); ESI-MS : C15H17FNO6 [M+H]+ 計算値 : 326.1, 実測値 : 326.1.
上記(1)で合成したCDG、および(2)で合成したQDGの蛍光スペクトルと、2-NBDLG(ペプチド研究所製)と比較した。結果を図1に示す。
グラフ上に記された数値は、それぞれCDGおよびQDGの蛍光極大を示す。550nm付近にある2-NBDLGの蛍光極大よりも大きく短波長側にシフトしていることがわかる。従って、CDG(あるいはCDGと同一の蛍光スペクトルを示すCLG)やQDG(あるいはQDGと同一蛍光スペクトルを示すQLG)を、2-NBDLG(あるいは2-NBDLGと同一の蛍光スペクトルを示す2-NBDG)と同時に使用しても、蛍光波長の違いにより容易に識別することが可能である。(2-NBDLGの主要スペクトルは500nm以上に存在し、500nm以下にみられるスペクトル上の小さな山と谷は、励起光による影響である)。
MIN6細胞を対象として、CDGを投与した際の蛍光強度の増加、およびそれに対するグルコーストランスポーター(GLUT) 阻害剤CBの影響を確認した。
(実験方法)
(1)マウスインスリノーマ細胞 (MIN6)の調製
測定には、縦A-Hの8行、横1-12の12列のウェルを有する96穴クリアボトムプレート (μClear-PLATE, Greiner bio-one, BLACK)を用いた。MIN6細胞を60 x 104 cells/mLの割合で懸濁させた培養液をウェル中心部に10 μL滴下した後、インキュベーター内で40分静置することで定着させ、培養液を 200 μL加えて培養した (6000 cells/well)。配置としては3列目のB-H、5列目のA-Gのウェルに蒔いた。培地交換は0-4 DIV (days in vitro)では2日に1回、5 DIV以降は毎日半量交換し、培養10-15日目 (10-15 DIV)で実験に供した。3列目Aおよび5列目Hのウェルには細胞を蒔かず、洗い流しが正確に行われたか否かをチェックするためのコントロールとして用いた。また、4列目には細胞はなく、クレブスリンガーバッファ溶液(KRB, ギャップ結合阻害剤Carbenoxolone 0.1 mM、グルコース5.6 mMを含む)のみのブランクとして使用した。
MIN6細胞は大阪大学の宮崎純一教授より供与を受けて6-10回継代した細胞を用いた。培養液は2日に一回半量を交換した。
(1-2)MIN6細胞の培養に用いた培養液の組成
高グルコース含有Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM-HG)(SIGMA #D5648) 13.4 g, NaHCO3 3.4 g, 2-Mercaptoethanol 5 μLを1 Lの超純水に溶解し、37℃のCO2インキュベーター中でpH 7.30 - 7.35となるようpHを調整した。Fetal Bovine Serum (Hyclone, Cat# SH30070.03)を終濃度10 %となるように、またペニシリン-ストレプトマイシンを終濃度0.5 %となるよう添加した。
CDG溶液の調製
0.5 mg CDGバイアル全量を合計0.73 mL の10 % dimethyl sulfoxide (DMSO) を用いて回収、7.0 mlの画像取得用KRB溶液に非特許文献2に準じた方法で加えることで溶解した。終濃度100 μMで細胞へ適用した。
2-NBDG溶液の調製
0.5 mg 2-NBDGバイアル一本全量をデータ取得用KRB溶液1.83 mLに溶解した。終濃度 200 μMで細胞へ適用した。
(2-1)データ取得用KRB溶液
蛍光マイクロプレートリーダーによるデータ取得に用いた容積の組成
NaCl 129.0 mM, KCl 4.75 mM, KH2PO4 1.19 mM MgSO4・7H2O 1.19 mM, CaCl2・2H2O 1.0 mM, NaHCO3 5.02 mM, D-Glucose 5.6 mM, HEPES 10 mM (1M NaOHにてpH 7.35に調整)。なおgap junction/hemichannelを経由する蛍光標識グルコースの出入りを阻害する目的で0.1 mM Carbenoxolone (SIGMA #C4790)を加えた。なお本データ取得用KRB溶液は、CDG溶液および他の蛍光糖誘導体溶液を作成するための溶液として使用した。
CDGおよび2-NBDGは同一プレート上に交互に配置するよう、8連ピペットを用いて、それぞれ3列目および5列目のウェルに独立に投与した。投与前には、あらかじめ各ウェルの自家蛍光を蛍光マイクロプレートリーダー (Flex Station, Molecular Device社)で計測した。測定条件はCDG検出器側 (青チャネル)はEx 367 nm, Em 455 nm, Cut off 420 nm、2-NBDG検出器側 (緑チャネル)はEx 470 nm, Em 540 nm, Cut off 495 nmとし、Bottom Read、Averaging 3、Photomultiplier感度 highにて行い、測定方法としてWell Scan Modeを用いた。Well Scan Modeは、一つのウェル中を9つの観察領域 (直径1.5 mm)に分割して、それぞれ独立に計測する。
次いで、グルコース輸送阻害剤Cytochalasin B (CB)の効果を計測するウェルには、CDG投与の2分前からCB (終濃度 10 μM)を前投与し、その他のウェルにはKRBを加えた。CDGおよび2-NBDGの投与は、37℃で5分間おこなった。
投与終了後は、300 μL のKRB溶液を用いてウェル中の蛍光溶液を希釈する操作を30秒ずつ、決められた回数繰り返した。繰り返し回数は、対照群として設定した3列目Aおよび5列目Hのウェルの示す蛍光強度が、細胞のないブランクのウェルの蛍光強度と同レベルになることを基準として決定し、完全に洗い流されていることを毎回の実験で確認した。CDGおよび2-NBDGの場合にはこの洗い流し過程に8分を要したため、投与後の蛍光計測は9分後に実施した。
なお、この方法によれば、細胞膜状態の破綻を来たした細胞がCDGおよび2-NBDGに接触後、これらの化合物をいったん細胞内に取り込んだとしても、計測時点では既に細胞外に流出し洗い流されているために、観察エリア全体の蛍光強度の増加に対する寄与は無視しうる程度と判断された。
上記の方法を用いて、培養13日目のMIN6細胞に、D-グルコース誘導体 (CDG)を適用した際の蛍光強度の変化に対するグルコース輸送阻害剤の効果を確認した。CB (10 μM)存在下および非存在下で、細胞の蛍光強度の増加を測定した。結果を図2Aに示す。
CB 存在下では、阻害剤が存在しない場合と比較して、蛍光強度が大きく減弱しており、CDGの細胞内への取り込みにGLUTを介した取り込みが少なからず寄与していることを示唆している。括弧内は、有効観察領域の数を示す。同様の実験は独立に二度行い、いずれも同様の結果が得られ、CB存在下では非存在下に対し、それぞれ平均 47.3%および 42.9%にまで減少した。
なお、統計にはunpaired t-test、またはANOVA and Bonferroni-Dunn testを用いた(以下同様)。
培養13日目のMIN6細胞に対するCDG投与による蛍光強度の増加、およびそれに対するGLUT阻害剤および水チャネル阻害剤として機能するPHTの影響を、実施例11と同様にして確認した。結果を図2Bに示す。
PHTの効果を計測するウェルには、CDG投与の1分前からPHT (終濃度 150 μM)を前投与し、その他のウェルにはKRBを加えた。CDGおよび2-NBDGの投与は、37℃で5分間おこなった。
PHT 存在下では、非存在下と比較して蛍光強度が著しく減弱している。同様の実験を独立に二度実施して、いずれも同様の結果が得られ、PHT存在下では、非存在下に対し、それぞれ平均 28.5%および 28.8%にまで減少した。このPHTによる阻害効果の程度は、図2Aで示したCBによる阻害効果より強く、CDGの細胞内への取り込みにGLUTと共に、それ以外の経路も関与している可能性が示唆された。
培養15日目のMIN6細胞に対するCDGまたはCLG投与時の蛍光強度の増加、およびそれに対するPHTによる阻害効果を、同一ディッシュ上で比較した。
同一の96 wellディッシュ上のMIN6細胞を対象として、PHTが存在するウェルと存在しないウェルのそれぞれに、CDGを投与するウェル、CLGを投与するウェルを交互に配置しておき、8連ピペットを用いることで投与液を一斉に投与した。5分間静置した後、洗い流しも一斉におこない、蛍光強度の変化を観察領域毎に計測した。結果を図2Cに示す。
実験の結果、D-グルコース誘導体であるCDGの投与による蛍光強度の増加は、実施例12の結果と同様、GLUT阻害剤ならびに水チャネル阻害剤であるPHTにより有意に阻害された。またPHTは、L-グルコース誘導体であるCLGの取り込みも有意に阻害した。
注目すべきこととして、PHT存在下でもCDG投与により蛍光強度はなお少なからず増加し、この増加の程度はCLGによる蛍光強度の増加の程度とほぼ同程度であった
これまでに、細胞内に蛍光グルコース誘導体がD/Lの立体選択性を示しながら取り込まれる様子を定量的に比較した例としては、緑色グルコース誘導体2-NBDGと2-NBDLGをMIN6細胞に投与した本発明者らの報告がある。その場合、D-グルコース誘導体である2-NBDGの細胞内への取り込みよりも、L-グルコース誘導体2-NBDLGの細胞内への取り込みが常に小さい(WO2012/133688、特許文献4参照)。本発明の青色D-グルコース誘導体CDGと青色L-グルコース誘導体CLGの組み合わせにおいても、D型優位が認められ、グルコースの立体構造の違いを反映している可能性が示唆される。
緑色蛍光D-グルコース誘導体2-NBDG投与による蛍光強度の増加に対して、CB (10 μM) あるいはPHT (150 μM)による阻害効果を確認した。実施例11の実験と同じ日に、同じ培養開始後13日目のMIN6細胞シリーズを用いて、緑色蛍光D-グルコース誘導体2-NBDGを投与し、蛍光強度の増加に対するCB (10 μM) あるいはPHT (150 μM)による阻害効果を調べた。
具体的には、2-NBDGを200 μM含むKRB溶液を細胞に投与し、5分間静置した後に洗い流し、投与前後の細胞の蛍光強度の増加を計測した。励起光波長470nm、蛍光取得波長540 nm、カットオフフィルター495 nmにて、各観察領域で3回測定した平均値を集計した。結果を図3に示す。
2-NBDGのMIN6細胞内への取り込みは、発明者らの以前の報告(WO2012/133688、特許文献4)と同様に、CBにより有意に阻害され、PHT により更に強く阻害された。独立に実施した二回の実験のいずれにおいても同様の結果が得られ、CB存在下では非存在下と比較してそれぞれ平均30.8%および36.4%にまで蛍光強度が減少し、PHT存在下では非存在下と比較してそれぞれ平均 18.6% および15.7%にまで減少した。この結果は、図2Aおよび図2Bにみられる、CDG投与による蛍光強度の増加に対するCBおよびPHTによる阻害効果と類似している。ただし、2-NBDGの取り込みは、PHTの存在により著しく減弱するのに対し、CDGの投与はPHT存在下でも少なからぬ蛍光強度の残存をもたらした。
このように、2-NBDGとCDGの両者を比較することによって、D-グルコースに結合した蛍光基の違いによる細胞内への取り込みの影響に関する情報や、輸送経路に関する重要なヒントを得ることができる。
培養13日目のマウスインスリノーマ細胞MIN6への青色蛍光D-グルコース誘導体CDG (100 μM)の投与による蛍光強度の増加が、大過剰のD-グルコースもしくはL-グルコースによって阻害されるか否かを調べた。対照として、青色蛍光L-グルコース誘導体 CLGについても同様に解析した。結果を図4に示す。但し、以下の条件を変更した。
(1)グルコース過剰投与群専用KRB溶液の調製
通常のKRB溶液にはNaCl 129 mMおよびD-グルコース 5.6 mMを含むが、本実験におけるコントロール溶液(グルコース非過剰投与群溶液)は、グルコース過剰投与用のKRB溶液と電荷と浸透圧を一致させるため、NaClの一部をcholine-Clで置換することによって浸透圧が270 mOsmとなるように調整した。また、グルコース過剰投与用のKRB溶液は、下記の組成のNaClとグルコースが含まれるようにした。その際、コントロール溶液(グルコース非過剰投与群溶液)と浸透圧が一致するように、choline-Clを添加した。
NaCl 100 mM, D-グルコース 5.6 mM (グルコース非過剰投与群溶液)
NaCl 100 mM, D-グルコース 50 mM (50mM D-グルコース過剰投与群溶液)
NaCl 100 mM, L-グルコース 50 mM, D-グルコース 5.6 mM (50mM L-グルコース過剰投与群溶液)
なお本専用KRB溶液は、本実施例におけるCDGならびにCLG溶液を作成するための溶液としても使用した。
(2)蛍光計測
CDGとCLGは異なるプレート上に配置して実験を行った。8連ピペットを用いて、それぞれの専用KRB溶液を用いて作成したCDG溶液(もしくはCLG溶液)を投与した (37℃、5分間)。投与前にはあらかじめ各専用KRB溶液へ置換し、各ウェルの自家蛍光を蛍光マイクロプレートリーダーで計測した。置換開始から投与直前までの時間はおよそ28分である。
投与終了後は、まず200 μL の専用KRB溶液を用いて一度希釈し、その後通常のKRB溶液 300 μLを用いてウェル中の蛍光溶液を希釈した。
さてここで、MIN6細胞への青色蛍光D-グルコース誘導体CDGの投与による蛍光強度の増加が、図2Aの結果から予想されるようにGLUTを介したCDGの細胞内への取り込みに起因するものであるとしたら、GLUT通過に先立ち、CDGがGLUT中のD-グルコース結合部位に結合すると考えられる。従って、その際に大過剰のD-グルコースが溶液中に存在すれば、GLUT中のD-グルコース結合サイトがD-グルコースで占有されることによりCDGが結合サイトに結合できず、CDGの細胞内への輸送も阻害(競合阻害)されると予想される。
大過剰(50 mM)のD-グルコースの存在による蛍光強度の増加への影響を評価する上で、対照として50 mMのL-グルコースの存在による影響についても検討した。
CDGの代わりにQDGを用いて、実施例11および12と同様にして、QDG投与による蛍光強度の増加、およびそれに対するCBまたはPHTの影響を確認した。結果を図5に示す。
(1)QDG溶液の調製
0.5 mg QDGバイアル全量を合計0.71 mL の10 % dimethyl sulfoxide (DMSO) を用いて回収、7.1 mlの画像取得用KRB溶液に非特許文献2に準じた方法で加えることで溶解した。終濃度100 μMで細胞へ適用した。
実験の結果、CBによりQDG投与による蛍光強度の増加は有意に阻害され(図5A)、PHT存在下では更に強く阻害された(図5B)。励起光波長354 nm、蛍光取得波長435 nm、カットオフフィルター420 nmにて3回計測し、結果の平均値を各観察領域ごとに算出した。
培養17日目のMIN6細胞塊(スフェロイド)に対して、CDGを100 μM、2-NBDLGを100 μM、2-TRLGを20 μM含む蛍光混合溶液(CDG/2-NBDLG/2-TRLG)を、37度で3分間投与し、蛍光イメージングを行った。
(実験方法)
(1)マウスインスリノーマ細胞(MIN6)スフェロイドの調製
MIN6細胞を6 x 104 cells/mLの割合で懸濁させた培養液をガラスカバースリップ上に10 μL滴下した後、インキュベーター内で40 min静置することでガラス面に定着させ、培養液を 3 mL加えて培養した (600 cells/slip)。15から17日間培養を続けることで、スフェロイドを形成させた。培養液は3日に一回半量を交換した。
MIN6細胞は大阪大学の宮崎純一教授より供与を受けて6-10回継代した細胞を用いた。培養液は2日に一回半量を交換した。
(1-2)MIN6細胞の培養に用いた培養液の組成
高グルコース含有Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM-HG)(SIGMA #D5648) 13.4 g, NaHCO3 3.4 g, 2-Mercaptoethanol 5 μLを1 Lの超純水に溶解し、37℃のCO2インキュベーター中でpH 7.30 - 7.35となるようpHを調整した。Fetal Bovine Serum (Hyclone, Cat# SH30070.03)を終濃度10 %となるように、またペニシリン-ストレプトマイシンを終濃度0.5 %となるよう添加した。
CDG溶液の調製
0.5 mg CDGバイアル全量を合計0.73 mL の10 % DMSO を用いて回収、画像取得用KRB溶液 7.0 mlに非特許文献2に準じた方法で加えることで溶解した。
2-NBDLG溶液の調製
0.5 mg 2-NBDLGバイアル一本全量を画像取得用KRB溶液7.3 mLに溶解した。
100 μM CDG + 100 μM 2-NBDLG + 20 μM 2-TRLG混合溶液の調製
上記CDG溶液ならびに2-NBDLG溶液を1:1の割合で混合した。0.2 mg 2-TRLGバイアル全量を合計130 μLのDMSOを用いて回収し、CDG + 2-NBDLG混合溶液 13 mlに非特許文献2に準じた方法で混合した(終濃度100 μM CDG + 100 μM 2-NBDLG + 20 μM 2-TRLG混合溶液)。
(2-1)画像取得用KRB溶液
画像取得用KRB溶液として、下記の組成の溶液を用いた。
NaCl 129.0 mM, KCl 4.75 mM, KH2PO4 1.19 mM MgSO4・7H2O 1.19 mM, CaCl2・2H2O 1.0 mM, NaHCO3 5.02 mM, D-Glucose 5.6 mM, HEPES 10 mM (1M NaOHにてpH 7.35に調整)。なおgap junction/hemichannelを経由する蛍光標識グルコースの出入りを阻害する目的で0.1 mM Carbenoxolone (SIGMA #C4790)を加えた。なお本データ取得用KRB溶液は、CDG溶液および他の蛍光糖誘導体との混合溶液を作成するために使用した。
蛍光顕微鏡のステージ上にセットされた灌流チャンバー内の画像取得用KRB溶液中に、MIN6細胞を培養したガラスカバースリップを移して計測した。
(3-1)灌流チャンバー
底部に対物レンズ用の丸穴(直径18 mm)のあいたアルミ製加温制御プラットフォーム(Warner Instruments)上に、流線型に穴開け加工(幅10 mm x 長さ35 mm)を施した厚さ1 mmのシリコン板をカバーガラスを介して載せ、カバーガラスと密着させた。
溶液の灌流は非特許文献2に記載の方法に準じて実施した。
画像取得用KRB溶液は、あらかじめアルミ製シリンジヒーター中で温められ、静水圧により灌流用チャンバーに供給された。灌流速度は流量調節器を用いて、1.3±0.2 mL/分となるように調節した。なお、溶液は灌流用チャンバーに導入される直前に、インラインヒーターを介して再加温し、チャンバー内の観察領域において、灌流液の実測温度が36±1℃になるように調節した。CDG/2-NBDLG/2-TRLG混合溶液も同様の方法で供給できるようにし、画像取得用KRB溶液との切り替えは、流路を開閉制御できる電磁バルブを用いて行った。溶液の除去は、吸引圧制御可能な真空ポンプを用いて行った。
蛍光顕微鏡はNIKON ECLIPS-Tiを用い、CCDカメラ Retiga 2000Rにて画像取得した。
CDGおよび2-NBDLG、2-TRLGは、それぞれ次のようなフィルターカセットを用いて検出した。
CDG(Blue channel):
Excitation 360/40 nm, Dichroic mirror 400 nm, Emission 460/50 nm.
2-NBDLG(Green channel):
Excitation 470/40 nm, Dichroic mirror 500 nm, Emission 545/55 nm.
2-TRLG(Red channel):
Excitation 567/15 nm, Dichroic mirror 593 nm, Emission 593 nm Longpass.
本法における対物レンズはx60oilレンズ (Plan Fluor 60x/0.50-1.25 Oil)を使用した。1600x1200の画素数で、12 bitの深さで画像取得した。
図7は、図6Aと図6Bの重ね書き像で、CDGと2-NBDLGの局在について見やすくするため、CDGの取り込みを青色の代わりに赤色で表現したものである。CDGの細胞内への取り込みを比較的強く示す赤色に近い細胞と、2-NBDLGの細胞内への取り込みを比較的強く示す緑色に近い細胞、CDGと2-NBDLGの両者を取り込み黄色で表現される細胞などが存在している。以上の結果は、CDGと2-NBDLG を同時に細胞塊に投与することによって、2-NBDLGの取り込みは少ないがCDGを取り込む細胞の存在を検出できる可能性を示す。
加えて、2-NBDLGの場合には細胞質に強く取り込まれることにより、核が抜けたようなイメージング像が得られるのに対して、CDGの場合には、細胞質のみならず、予想外にも核にもとりこまれた。このことは、図7において、核がCDGの取り込みを反映して赤色に、また細胞質がCDGおよび2-NBDLGの取り込みを反映して黄色に染まっている細胞の存在によっても確認される。
実施例16と同様にして、ただし、培養15日目のMIN6細胞塊に対して、CDG/2-NBDLG/2-TRLG混合溶液の代わりに、CLG/2-NBDLG/2-TRLG混合溶液を用いて蛍光イメージングを行った。
結果を図8に示す。100 μM CLG + 100 μM 2-NBDLG + 20 μM 2-TRLGの混合溶液を、スフェロイド形成したMIN6細胞塊に3分間投与した後、混合溶液の洗い流しを開始して6分後の蛍光顕微鏡像を示している。図8A,B,Cは、それぞれ青色蛍光を発するCLG、緑色蛍光を発する2-NBDLG、赤色蛍光を発する2-TRLGのがん細胞内への取り込みの様子。図8Dは、微分干渉コントラスト(DIC)像。CDGの場合とは異なり、CLGを強く取り込む細胞はみな2-NBDLGの取り込みも示した。また、CDGと同様、CLGも細胞質のみならず、核にも強くとりこまれた。
(実験方法)
(1)CLG溶液及び他の蛍光糖誘導体との混合溶液の調製
CLG溶液の調製
0.5 mg CLGバイアル全量を合計0.73 mL の10 % DMSO を用いて回収、14.79 mlの画像取得用HEPES溶液に非特許文献2に準じた方法で加えることで溶解した (100 μM)。
100 μM CLG + 20 μM 2-TRLG混合溶液の調製
0.2 mg 2-TRLGバイアル全量を合計130 μLのDMSOを用いて回収。CLG溶液 13mLに非特許文献2に準じた方法で溶解した (終濃度100 μM CLG + 20 μM 2-TRLG混合溶液)。
(1-1)画像取得用HEPES溶液
蛍光画像取得用として、下記の組成の溶液を用いた。
NaCl 150mM, KCl 5mM, MgCl2 1mM, CaCl2 2mM, HEPES 10mM, 1M Tris(2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol)溶液にてpH7.4に調整。Glucose 濃度は10mMとした。なおgap junction/hemichannelを経由する蛍光標識グルコースの出入りを阻害する目的で0.1 mM Carbenoxolone (SIGMA #C4790)を加えた。本画像取得用HEPES溶液は、CLG溶液および他の蛍光糖誘導体との混合溶液を作成するために使用した。
生後21日令のマウスの中脳黒質網様部神経細胞を、発明者らの以前の報告(WO2010/16587号公報、特許文献2)および(WO2012/133688号公報、特許文献4)に記載した方法に準じて急性単離し、poly-L-Lysineコートしたガラスカバースリップに付着させた上、蛍光顕微鏡のステージ上にセットされた灌流チャンバー内の画像取得用HEPES溶液中にガラスカバースリップを移し、観察した。
(2-1)灌流チャンバー
底部に対物レンズ用の丸穴(直径18 mm)のあいたアルミ製加温制御プラットフォーム(Warner Instruments)上に、流線型に穴開け加工(幅10 mm x 長さ35 mm)を施した厚さ1 mmのシリコン板をカバーガラスを介して載せ、カバーガラスと密着させた。
溶液の灌流は非特許文献2に記載の方法に準じて実施した。
画像取得用HEPES溶液は、あらかじめアルミ製シリンジヒーター中で温められ、静水圧により灌流用チャンバーに供給された。灌流速度は流量調節器を用いて、1.3±0.2 mL/分となるように調節した。なお、溶液は灌流用チャンバーに導入される直前に、インラインヒーターを介して再加温し、チャンバー内の観察領域において、灌流液の実測温度が32.5±1℃になるように調節した。CLG/2-TRLG混合溶液も同様の方法で供給できるようにし、画像取得用HEPES溶液との切り替えは、流路を開閉制御できる電磁バルブを用いて行った。溶液の除去は、吸引圧制御可能な真空ポンプを用いて行った。
蛍光顕微鏡はNIKON ECLIPS-Tiを用い、CCDカメラ Retiga 2000Rにて画像取得した。
CLGおよび2-TRLGは、それぞれ次のようなフィルターカセットを用いて検出した。
CLG(Blue channel):
Excitation 360/40 nm, Dichroic mirror 400 nm, Emission 460/50 nm.
2-TRLG(Red channel):
Excitation 567/15 nm, Dichroic mirror 593 nm, Emission 593 nm Longpass.
本法における対物レンズはx20dryレンズ (Nikon Plan S Fluor)を使用し、1600x1200の画素数で画像取得した。
図10は、図9における混合溶液投与前後の蛍光変化を、2-TRLG の発する赤色蛍光の波長領域(Red channel)において同時に観察したものである。Aは、混合溶液投与前の自家蛍光像であり、Bは、細胞の位置をわかりやすくするために、Aに微分干渉コントラスト(DIC)像を重ねあわせたものである。赤色蛍光波長領域では、細胞の自家蛍光は極めて小さい。画像中央部の強い赤色蛍光は、微弱蛍光を検出する目的で感度を上げて撮影したため、蛍光フィルターを通過して検出器側に漏れ込んだ照射光の一部である(Red channelのDichroic mirrorおよびEmission波長参照)。ここではShading Correctionを施さずにそのまま表示している。
C、ならびにCにDIC像を重ねあわせたDに明らかなように、赤色蛍光を発する2-TRLG は、細胞の破片(*)には非特異的に取り込まれたのに対し、正常神経細胞(矢印)には取り込まれていない。すなわち、本実験の矢印で示された正常神経細胞について、2-TRLG の侵入をもたらすような細胞膜透過性の非特異的亢進が検知されず、これらの細胞の細胞膜状態(Membrane integrity)が維持されていることが示唆された。
一方、実施例17で示されたように、L型グルコース誘導体であるCLGは、がん細胞であるマウスインスリノーマ細胞(MIN6)スフェロイドへは強く取り込まれた。
実施例18に記載の実験方法と同様にしておこなった。但し、CLGの代わりにCDGを用いて終濃度100 μM CDG + 20 μM 2-TRLG混合溶液を調製し、中脳黒質網様部神経細胞は生後14日令のマウスから調製した。
図12は、図11における混合溶液投与前後の蛍光変化を、2-TRLG の発する赤色蛍光の波長領域(Red channel)において同時に観察したものである。Aは、混合溶液投与前の自家蛍光像であり、Bは、細胞の位置をわかりやすくするために、Aに微分干渉コントラスト(DIC)像を重ねあわせたものである。赤色蛍光波長領域では、細胞の自家蛍光は極めて小さい。
C、ならびにCにDIC像を重ねあわせたDに明らかなように、赤色蛍光を発する2-TRLG は、細胞の破片(*)に非特異的に取り込まれたのに対し、正常神経細胞(矢印)には取り込まれていない。すなわち、本実験の矢印で示された正常神経細胞について、2-TRLG の侵入をもたらすような細胞膜透過性の非特異的亢進が検知されず、細胞膜の状態(Membrane integrity)が維持されていることが示唆された。
Claims (44)
- 前記式(2)において、XがOである、請求項2に記載のグルコース誘導体。
- 前記式(4)において、XがOである、請求項5に記載のグルコース誘導体。
- 以下に記載の化合物:
2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-クロメン-7-イル)アミノ-D-グルコース(CDG)、2,4-ジデオキシ-2-(2-オキソ-2H-クロメン-7-イル)アミノ-4-フルオロ-D-グルコース(4-F-CDG)、2,6-ジデオキシ-2-(2-オキソ-2H-クロメン-7-イル)アミノ-6-フルオロ-D-グルコース(6-F-CDG)、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-7-イル)アミノ-D-グルコース(QDG)、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-3-メチル-クロメン-7-イル)アミノ-D-グルコース(3-MCDG)、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-4-メチル-クロメン-7-イル)アミノ-D-グルコース(4-MCDG)、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-3-トリフルオロメチル-クロメン-7-イル)アミノ-D-グルコース(3-TFMCDG)、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-4-トリフルオロメチル-クロメン-7-イル)アミノ-D-グルコース(4-TFMCDG)、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-3-メチル-キノリン-7-イル)アミノ-D-グルコース(3-MQDG)、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-4-メチル-キノリン-7-イル)アミノ-D-グルコース(4-MQDG)、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-3-トロフルオロメチル-キノリン-7-イル)アミノ-D-グルコース(3-TFMQDG)、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-4-トロフルオロメチル-キノリン-7-イル)アミノ-D-グルコース(4-TFMQDG)、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-クロメン-7-イル)アミノ-L-グルコース(CLG)、2,4-ジデオキシ-2-(2-オキソ-2H-クロメン-7-イル)アミノ-4-フルオロ-L-グルコース(4-F-CLG)、2,6-ジデオキシ-2-(2-オキソ-2H-クロメン-7-イル)アミノ-6-フルオロ-L-グルコース(6-F-CLG)、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-7-イル)アミノ-L-グルコース(QLG)、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-3-メチル-クロメン-7-イル)アミノ-L-グルコース(3-MCLG)、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-4-メチル-クロメン-7-イル)アミノ-L-グルコース(4-MCLG)、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-3-トリフルオロメチル-クロメン-7-イル)アミノ-L-グルコース(3-TFMCLG)、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-4-トリフルオロメチル-クロメン-7-イル)アミノ-L-グルコース(4-TFMCLG)、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-3-メチル-キノリン-7-イル)アミノ-L-グルコース(3-MQLG)、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-4-メチル-キノリン-7-イル)アミノ-L-グルコース(4-MQLG)、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-3-トロフルオロメチル-キノリン-7-イル)アミノ-L-グルコース(3-TFMQLG)、および2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-4-トロフルオロメチル-キノリン-7-イル)アミノ-L-グルコース(4-TFMQLG)
からなる群より選ばれる請求項1に記載のグルコース誘導体。 - 以下に記載の化合物:
2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-クロメン-7-イル)アミノ-D-グルコース(CDG)、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-7-イル)アミノ-D-グルコース(QDG)、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-クロメン-7-イル)アミノ-L-グルコース(CLG)、および2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-7-イル)アミノ-L-グルコース(QLG)、
からなる群より選ばれる請求項1に記載のグルコース誘導体。 - 2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-クロメン-7-イル)アミノ-D-グルコース(CDG)、または2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-クロメン-7-イル)アミノ-L-グルコース(CLG)である請求項9に記載のグルコース誘導体。
- 請求項1~10に記載のグルコース誘導体において、グルコースの2位、4位または6位のいずれか一つのヒドロキシ基が18Fに置換された放射性標識されたグルコース誘導体。
- 2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-3-[11C]メチル-クロメン-7-イル)アミノ-D-グルコース(3-[11C]MCDG)、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-4-[11C]メチル-クロメン-7-イル)アミノ-D-グルコース(4-[11C]MCDG)、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-3-[18F]フルオロジフルオロメチル-クロメン-7-イル)アミノ-D-グルコース(3-[18F]TFMCDG)、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-4-[18F]フルオロジフルオロメチル-クロメン-7-イル)アミノ-D-グルコース(4-[18F]TFMCDG)、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-3-[11C]メチル-キノリン-7-イル)アミノ-D-グルコース(3-[11C]MQDG)、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-4-[11C]メチル-キノリン-7-イル)アミノ-D-グルコース(4-[11C]MQDG)、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-3-[18F]フルオロジフルオロメチル-キノリン-7-イル)アミノ-D-グルコース(3-[18F]TFMQDG)、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-4-[18F]フルオロジフルオロメチル-キノリン-7-イル)アミノ-D-グルコース(4-[18F]TFMQDG)、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-3-[11C]メチル-クロメン-7-イル)アミノ-L-グルコース(3-[11C]MCLG)、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-4-[11C]メチル-クロメン-7-イル)アミノ-L-グルコース(4-[11C]MCLG)、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-3-[18F]フルオロジフルオロメチル-クロメン-7-イル)アミノ-L-グルコース(3-[18F]TFMCLG)、2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-4-[18F]フルオロジフルオロメチル-クロメン-7-イル)アミノ-L-グルコース(4-[18F]TFMCLG)、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-3-[11C]メチル-キノリン-7-イル)アミノ-L-グルコース(3-[11C]MQLG)、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-4-[11C]メチル-キノリン-7-イル)アミノ-L-グルコース(4-[11C]MQLG)、2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-3-[18F]フルオロジフルオロメチル-キノリン-7-イル)アミノ-L-グルコース(3-[18F]TFMQLG)、および2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロ-4-[18F]フルオロジフルオロメチル-キノリン-7-イル)アミノ-L-グルコース(4-[18F]TFMQLG)から選ばれる放射性標識された請求項1に記載のグルコース誘導体。
- 請求項1~10のいずれか一つに記載のグルコース誘導体を含む、標的細胞をイメージングするための組成物。
- 請求項3または4に記載のグルコース誘導体を含む、標的細胞をイメージングするための組成物。
- 請求項6または7に記載のグルコース誘導体を含む、標的細胞をイメージングするための組成物。
- 請求項8に記載のグルコース誘導体を含む、標的細胞をイメージングするための組成物。
- 請求項9に記載のグルコース誘導体を含む、標的細胞をイメージングするための組成物。
- 前記グルコース誘導体が2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-クロメン-7-イル)アミノ-D-グルコース(CDG)または2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-クロメン-7-イル)アミノ-L-グルコース(CLG)である、請求項17に記載の組成物。
- 前記グルコース誘導体が2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-7-イル)アミノ-D-グルコース(QDG)または2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-7-イル)アミノ-L-グルコース(QLG)である、請求項17に記載の組成物。
- 請求項11または12に記載のグルコース誘導体を含む、標的細胞をイメージングするための組成物。
- 標的細胞をイメージングする方法であって、以下の工程、
a.標的細胞に、請求項1~12のいずれか一つに記載のグルコース誘導体を接触させる工程、および
b.該標的細胞内に存在するグルコース誘導体が発する蛍光を検出する工程、
を含む細胞のイメージング方法。 - 前記グルコース誘導体が2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-クロメン-7-イル)アミノ-D-グルコース(CDG)または2-デオキシ-2-(2-オキソ-2H-クロメン-7-イル)アミノ-L-グルコース(CLG)である、請求項21に記載のイメージング方法。
- 前記グルコース誘導体が2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-7-イル)アミノ-D-グルコース(QDG)または2-デオキシ-2-(2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-7-イル)アミノ-L-グルコース(QLG)である、請求項21に記載のイメージング方法。
- 前記工程aにおける組成物が、さらに別の蛍光標識グルコース誘導体を含み、かつ前記工程bが、標的細胞内に存在する少なくとも一つのグルコース誘導体を検出する工程である、請求項21~23に記載のイメージング方法。
- 前記別の蛍光標識グルコース誘導体が、2-[N-(7-ニトロベンズ-2-オキサ-1,3-ジアゾール-4-イル)アミノ]-2-デオキシ-D-グルコース(2-NBDG)、2-[N-(7-ニトロベンズ-2-オキサ-1,3-ジアゾール-4-イル)アミノ]-2-デオキシ-L-グルコース(2-NBDLG)、2-デオキシ-2-[N-7-(N’,N’-ジメチルアミノスルホニル)ベンズ-2-オキサ-1,3-ジアゾール-4-イル)アミノ]-D-グルコース(2-DBDG)、2-デオキシ-2-[N-7-(N’,N’-ジメチルアミノスルホニル)ベンズ-2-オキサ-1,3-ジアゾール-4-イル)アミノ]-L-グルコース(2-DBDLG)、および、2位にスルホローダミン(好ましくは、スルホーダミン101、スルホーダミンB)をスルホンアミド結合せしめた2-アミノ-2-デオキシ-L-グルコースからなる群より選ばれる少なくとも一つのグルコース誘導体である、請求項24に記載のイメージング方法。
- 前記グルコース誘導体の組合せが、蛍光として青色、緑色および赤色から選ばれる2色の色をそれぞれ発する2つのグルコース誘導体の組合せである、請求項25に記載のイメージング方法。
- 前記グルコース誘導体の組合せが、蛍光として青色を発するグルコース誘導体と緑色を発するグルコース誘導体と赤色を発するグルコース誘導体の組合せである、請求項25に記載のイメージング方法。
- 癌または癌細胞を検出するための方法であって、以下の工程、
a.標的細胞に、請求項3または4に記載のグルコース誘導体を含有する組成物を接触させる工程、および
b.該標的細胞内に存在する該グルコース誘導体を検出する工程、
を含む検出方法。 - 前記グルコース誘導体が、CDG、QDG、3-TFMCDG、4-TFMCDG、3-TFMQDG、または4-TFMQDGである請求項28に記載の検出方法。
- 前記グルコース誘導体がCDGである請求項29に記載の検出方法。
- 癌または癌細胞を検出するための方法であって、以下の工程、
a.標的細胞に、請求項6または7に記載のグルコース誘導体を含有する組成物を接触させる工程、および
b.該標的細胞内に存在する該グルコース誘導体を検出する工程、
を含む検出方法。 - 前記グルコース誘導体が、CLG、QLG、3-TFMCLG、4-TFMCLG、3-TFMQLG、または4-TFMQLGである請求項31に記載の検出方法。
- 前記グルコース誘導体がCLGである上記32に記載の検出方法。
- 前記工程bにおける検出が標的細胞をイメージングすることにより行う請求項28~33のいずれか一つに記載の検出方法。
- 前記工程aにおける組成物が、さらに別の蛍光標識グルコース誘導体を含み、かつ前記工程bが、標的細胞内に存在する少なくとも一つのグルコース誘導体を検出する工程である、請求項28~34のいずれか一つに記載の検出方法。
- 前記、別の蛍光標識グルコース誘導体が、2-[N-(7-ニトロベンズ-2-オキサ-1,3-ジアゾール-4-イル)アミノ]-2-デオキシ-D-グルコース(2-NBDG)、2-[N-(7-ニトロベンズ-2-オキサ-1,3-ジアゾール-4-イル)アミノ]-2-デオキシ-L-グルコース(2-NBDLG)、2-デオキシ-2-[N-7-(N’,N’-ジメチルアミノスルホニル)ベンズ-2-オキサ-1,3-ジアゾール-4-イル)アミノ]-D-グルコース(2-DBDG)、2-デオキシ-2-[N-7-(N’,N’-ジメチルアミノスルホニル)ベンズ-2-オキサ-1,3-ジアゾール-4-イル)アミノ]-L-グルコース(2-DBDLG)、および、2位にスルホローダミン(好ましくは、スルホーダミン101、スルホーダミンB)をスルホンアミド結合せしめた2-アミノ-2-デオキシ-L-グルコースからなる群より選ばれる少なくとも一つのグルコース誘導体である、請求項35に記載の検出方法。
- 前記グルコース誘導体の組合せが、蛍光として青色、緑色および赤色から選ばれる2色の色をそれぞれ発する2つのグルコース誘導体の組合せである、請求項36に記載の検出方法。
- 前記グルコース誘導体の組合せが、蛍光として青色を発するグルコース誘導体と緑色を発するグルコース誘導体と赤色を発するグルコース誘導体の組合せである、請求項36に記載の検出方法。
- 標的がん細胞をイメージングするためのイメージング剤であって、請求項3または4に記載のグルコース誘導体を含むがん細胞のイメージング剤。
- 前記グルコース誘導体が、CDG、QDG、3-TFMCDG、4-TFMCDG、3-TFMQDD、または4-TFMQDGである請求項39に記載のイメージング剤。
- 前記グルコース誘導体がCDGである請求項40に記載のイメージング剤。
- 標的がん細胞をイメージングするためのイメージング剤であって、請求項6または7に記載のグルコース誘導体を含むがん細胞のイメージング剤。
- 前記グルコース誘導体が、CLG、QLG、3-TFMCLG、4-TFMCLG、3-TFMQLD、または4-TFMQLGである請求項42に記載のイメージング剤。
- 前記グルコース誘導体がCLGである請求項43に記載のイメージング剤。
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