WO2015151838A1 - 誘導放射抑制顕微鏡装置 - Google Patents

Abstract

　ＳＴＥＤ顕微鏡装置１Ａは、ＳＴＥＤ光ＬＳ_１を出力するＳＴＥＤ光源１１と、励起光ＬＥ_１を出力する励起光源１２と、位相変調によりＳＴＥＤ光ＬＳ_１を円環状に成形するための位相パターンが呈示される位相変調型のＳＬＭ１３と、観察対象領域に励起光ＬＥ_２及び位相変調後のＳＴＥＤ光ＬＳ_２を照射するための光学系１５Ａと、観察対象領域から発生する蛍光ＰＬを検出する検出器１６と、位相パターンを制御する制御部１７ａとを備える。制御部１７ａは、位相変調後のＳＴＥＤ光ＬＳ_２の円環の内径を制御するために、位相パターンを設定する。これにより、解像度及び所要時間に関して使用者の利便性を向上することができるＳＴＥＤ顕微鏡装置が実現される。

Description

誘導放射抑制顕微鏡装置

　本発明の一側面は、誘導放射抑制顕微鏡装置に関するものである。

　非特許文献１には、誘導放射抑制（Stimulated Emission Depletion：ＳＴＥＤ）顕微鏡に関する技術が記載されている。この文献に記載されたＳＴＥＤ顕微鏡では、位相変調型の空間光変調器を用いて環状のＳＴＥＤビームを生成している。

特開２０１３－９２６８７号公報

Travis J. Gould et al., "Adaptive optics enables 3D STED microscopy in aberrating specimens", OPTICS EXPRESS Vol.20 No.19, pp.20998-21009 (2012)

　現在、光学的な回折限界以下の解像度により画像を取得する、いわゆる超解像顕微鏡が開発されている。この超解像顕微鏡に用いられる超解像技術として様々な手法が提案されているが、その一つにＳＴＥＤ顕微鏡が挙げられる。ＳＴＥＤ顕微鏡は、観察用励起光（以下、励起ビームと称する）としてのレーザ光と、誘導放出用の短パルスレーザ光（以下、ＳＴＥＤビームと称する）とを観察対象物にほぼ同時に照射することによって、観察対象物からの蛍光を局所的に発生させることを可能にしている。

　ＳＴＥＤ顕微鏡の原理を以下に示す。図１８（ａ）及び図１８（ｂ）は、蛍光の発生原理を示す図である。図１８（ａ）に示されるように、励起波長を有する励起光ＬＥが観察対象物に照射されると、基底状態から励起状態に電子が励起される（図中の矢印Ａ１）。その後、数マイクロ秒の間に励起状態から基底状態へ電子が遷移し（図中の矢印Ａ２）、このとき、基底状態と励起状態との間のエネルギー差に相当する波長の蛍光ＰＬが発生する。

　一方、図１８（ｂ）に示されるＳＴＥＤ光ＬＳは、上述した励起光ＬＥが照射されてから所定の時間差をもって、観察対象物に照射される。励起光ＬＥにより励起状態とされていた電子は、ＳＴＥＤ光ＬＳにより誘発され、基底状態に遷移する（図中の矢印Ａ３）。このとき、ＳＴＥＤ光ＬＳの波長に相当するエネルギーだけ遷移するので、発生する光ＬＡの波長は、ＳＴＥＤ光ＬＳの波長と等しくなる。このような作用により、励起光ＬＥが照射された後にＳＴＥＤ光ＬＳが照射された領域では、蛍光ＰＬとは波長が異なる光ＬＡが蛍光ＰＬに代えて発生することとなる。また、上記所定の時間差をナノオーダーとすることによって、蛍光ＰＬの発生タイミングと光ＬＡの発生タイミングとの間に時間差を与えることができる。

　図１９は、（ａ）励起光ＬＥ、（ｂ）ＳＴＥＤ光ＬＳ、及び（ｃ）蛍光ＰＬそれぞれの形状の一例を示す図である。ＳＴＥＤ顕微鏡では、図１９（ａ）に示されるように、或る観察対象領域に先ず円形状の励起光ＬＥが照射される。その後、図１９（ｂ）に示されるように、その円形状の領域に重ねて円環形状のＳＴＥＤ光ＬＳが照射される。これにより、円環形状の領域では蛍光ＰＬの発生が抑制されるので、図１９（ｃ）に示されるように、該円環形状の中心付近（該円環形状に囲まれた領域）といった極めて小さな領域のみから蛍光ＰＬを発生させることができ、回折限界以下の解像度による画像取得が可能となる。

　上述したＳＴＥＤ顕微鏡において、解像度は、図１９（ｃ）に示される蛍光ＰＬの直径Ｄ_２によって定まる。解像度を向上させるためには、直径Ｄ_２を小さくすれば良いが、そうすると観察対象領域の全体を走査（スキャン）する為に必要な時間が長くなってしまう。また、観察対象領域の全体を走査（スキャン）する為に必要な時間を短くするために直径Ｄ_２を大きくすると、解像度が低下してしまう。このため、従来のＳＴＥＤ顕微鏡では、解像度の向上と、所要時間の短縮とのうち、何れか一方しか実現することができず、利便性を欠くという問題がある。

　本発明は、このような問題点に鑑みてなされたものであり、その一側面は、解像度及び所要時間に関して使用者の利便性を向上することができるＳＴＥＤ顕微鏡装置を提供することを目的とする。

　上述した課題を解決するために、本発明の一側面によるＳＴＥＤ顕微鏡（microscope）装置は、観察対象物にＳＴＥＤ光と励起光とを照射し、蛍光を検出する装置であって、ＳＴＥＤ光を出力するＳＴＥＤ光源と、励起光を出力する励起光源と、位相変調によりＳＴＥＤ光を円環状に成形するための第１の位相パターンが呈示される位相変調型の第１の空間光変調器と、観察対象領域に励起光及び位相変調後のＳＴＥＤ光を照射するための光学系と、観察対象領域から発生する蛍光を検出する検出器と、第１の位相パターンを制御する制御部と、を備え、制御部は、位相変調後のＳＴＥＤ光の円環の内径を制御するために第１の位相パターンを設定する。

　また、本発明の一側面によるＳＴＥＤ顕微（microscopy）方法は、観察対象物にＳＴＥＤ光と励起光とを照射し、蛍光を検出する方法であって、ＳＴＥＤ光源により、ＳＴＥＤ光を出力するステップ（ＳＴＥＤ光出力ステップ）と、励起光源により、励起光を出力するステップ（励起光出力ステップ）と、ＳＴＥＤ光を円環状に成形するための第１の位相パターンが呈示される位相変調型の第１の空間光変調器により、ＳＴＥＤ光を位相変調するステップ（変調ステップ、第１の変調ステップ）と、光学系により、観察対象領域に励起光及び位相変調後のＳＴＥＤ光を照射するステップ（照射ステップ）と、検出器により、観察対象領域から発生する蛍光を検出するステップ（検出ステップ）と、位相変調後のＳＴＥＤ光の円環の内径を制御するために第１の位相パターンを設定するステップ（設定ステップ）と、を備える。

　上記のＳＴＥＤ顕微鏡装置及びＳＴＥＤ顕微方法では、ＳＴＥＤ光源から出力されたＳＴＥＤ光が、第１の空間光変調器での位相変調により円環状に成形される。この円環状のＳＴＥＤ光は、観察対象領域に励起光が照射された後、該観察対象領域に照射される。これにより、円環状の領域では蛍光の発生が抑制され、円環状のＳＴＥＤ光に囲まれた領域のみから蛍光が発生する。従って、上記のＳＴＥＤ顕微鏡装置及びＳＴＥＤ顕微方法によれば、回折限界以下の解像度による画像取得が可能となる。

　また、上記のＳＴＥＤ顕微鏡装置及びＳＴＥＤ顕微方法では、制御部が位相パターンを変更することによって、位相変調後のＳＴＥＤ光の円環の内径が変更可能とされている。これにより、解像度の向上が必要なときには円環の内径を小さくし、観察対象領域の全体を走査（スキャン）する為に必要な時間を短くしたいときには円環の内径を大きくすることができる。このように、上記のＳＴＥＤ顕微鏡装置及びＳＴＥＤ顕微方法によれば、解像度及び所要時間に関し、使用者の利便性を向上することができる。

　本発明の一側面によるＳＴＥＤ顕微鏡装置によれば、解像度及び所要時間に関して使用者の利便性を向上することができる。

図１は、第１実施形態に係るＳＴＥＤ顕微鏡装置の構成を示すブロック図である。 図２は、（ａ）ＳＬＭに入力されるＳＴＥＤ光の光軸に垂直な断面形状を示す図、及び（ｂ）ＳＬＭから出力されるＳＴＥＤ光の光軸に垂直な断面形状を示す図である。 図３は、（ａ）～（ｄ）ＳＬＭに呈示されるＳＴＥＤ光成形用位相パターンに含まれる、ＳＴＥＤ光を円環形状に成形するためのパターンを概念的に示す図である。 図４は、（ａ）～（ｄ）図３に示されるパターンの各画素における位相値を色の濃淡により表した図である。 図５は、（ａ）～（ｄ）図３に示されるパターンそれぞれがＳＬＭに呈示されることにより得られるＳＴＥＤ光の形状を示す図である。 図６は、ＳＴＥＤ顕微鏡装置の動作を示すフローチャートである。 図７は、制御部の処理を示すフローチャートである。 図８は、制御部の処理を示すフローチャートである。 図９は、比較例としてのＳＴＥＤ顕微鏡装置の構成を示すブロック図である。 図１０は、ＳＬＭに呈示されるＳＴＥＤ光成形用位相パターンに含まれる、ＳＴＥＤ光を円環形状に成形するためのパターンを概念的に示す図である。 図１１は、（ａ），（ｂ）ＳＬＭに呈示されるＳＴＥＤ光成形用位相パターンに含まれる、ＳＴＥＤ光を円環形状に成形するためのパターンを概念的に示す図、及び（ｃ）比較例としてのパターンを示す図である。 図１２は、（ａ）～（ｃ）ｍ＝２π、２π＜ｍ＜４π、及びｍ＝４πの場合におけるＳＴＥＤ光の円環形状を模式的に示す図である。 図１３は、（ａ）励起光が分割されることにより生成された複数の励起光を示す図、（ｂ）ＳＴＥＤ光が分割されることにより生成された複数のＳＴＥＤ光を示す図、及び（ｃ）複数の蛍光を示す図である。 図１４は、ＳＴＥＤ光を分割して複数のＳＴＥＤ光を生成するためのパターンの一例を示す図である。 図１５は、第４変形例として、ＳＴＥＤ顕微鏡装置の構成を示すブロック図である。 図１６は、（ａ）第４変形例の二次元撮像装置の受光面において、蛍光の結像点が走査される様子を模式的に示す図、及び（ｂ）励起光及びＳＴＥＤ光の照射タイミングを示すグラフである。 図１７は、第５変形例として、ＳＴＥＤ顕微鏡装置の構成を示すブロック図である。 図１８は、（ａ），（ｂ）蛍光の発生原理を示す図である。 図１９は、（ａ）励起光、（ｂ）ＳＴＥＤ光、及び（ｃ）蛍光それぞれの形状の一例を示す図である。

　以下、添付図面を参照しながら本発明による誘導放射抑制（ＳＴＥＤ）顕微鏡装置の実施の形態を詳細に説明する。なお、図面の説明において同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省略する。

　図１は、本発明の第１実施形態に係るＳＴＥＤ顕微鏡装置１Ａの構成を示すブロック図である。ＳＴＥＤ顕微鏡装置１Ａは、例えば細胞標本といった観察対象物Ｂの蛍光画像を得るための装置である。図１に示されるように、本実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡装置１Ａは、ＳＴＥＤ光源１１、励起光源１２、空間光変調器（Spatial Light Modulator：ＳＬＭ）１３及び１４、光学系１５Ａ、検出器１６、並びに演算制御装置１７を備える。

　ＳＴＥＤ光源１１は、ＳＴＥＤ光ＬＳ_１を発生、出力する光源である。ＳＴＥＤ光源１１は、例えば、レーザ光などの高いコヒーレント性を有する光を出力するパルス光源である。ＳＴＥＤ光源１１としては、例えば、ランプ系光源、レーザダイオードなどのレーザ光源、又はＬＥＤ等が挙げられる。ＳＴＥＤ光ＬＳ_１の波長は、観察対象物Ｂにおいて発生する蛍光ＰＬのピーク波長と重ならず、且つ該蛍光ＰＬの波長帯域内に含まれる任意の波長である。なお、ＳＴＥＤ光源１１はパルス光源でなくてもよく、例えば連続光（ＣＷ光）を出力する光源と、光シャッタ又はパルス変調用ＡＯＭ（Acousto-Optic Modulator）との組合せにより構成されてもよい。

　励起光源１２は、励起光ＬＥ_１を発生、出力する光源である。励起光源１２は、例えば、レーザ光などの高いコヒーレント性を有する光を出力するパルス光源である。励起光源１２としては、例えば、レーザダイオードなどのレーザ光源、又はＬＥＤ等が挙げられる。励起光ＬＥ_１の波長は、後述する観察対象物Ｂに含まれる蛍光物質の励起波長を含む波長である。なお、励起光源１２はパルス光源でなくてもよく、例えば連続光（ＣＷ光）を出力する光源と、光シャッタ又はパルス変調用ＡＯＭとの組合せにより構成されてもよい。

　ＳＬＭ１３は、位相変調型ＳＬＭであり、二次元の変調面の各部において入力光の位相を変調し、位相変調後の光を出力する。ＳＬＭ１３は、本実施形態における第１の空間光変調器である。ＳＬＭ１３は、ＳＴＥＤ光源１１と光学的に結合されている。ＳＬＭ１３は、ＳＴＥＤ光源１１からＳＴＥＤ光ＬＳ_１を受け、変調後のＳＴＥＤ光ＬＳ_２を出力する。ＳＬＭ１３は、数値計算により求められた位相パターン（キノフォーム）を変調面に呈示することによって、ＳＴＥＤ光ＬＳ_２の集光位置、集光強度、集光形状などの集光照射条件を制御する。

　図２（ａ）は、ＳＬＭ１３に入力されるＳＴＥＤ光ＬＳ_１の光軸に垂直な断面形状を示す図である。また、図２（ｂ）は、ＳＬＭ１３から出力されるＳＴＥＤ光ＬＳ_２の光軸に垂直な断面形状を示す図である。本実施形態では、図２（ａ）に示されるような円形状のＳＴＥＤ光ＬＳ_１がＳＬＭ１３に入力され、ＳＬＭ１３において、位相変調によりＳＴＥＤ光ＬＳ_２を図２（ｂ）に示されるような内径Ｄ_１を有する円環状とするためのＳＴＥＤ光成形用位相パターン（第１の位相パターン）が呈示される。このＳＴＥＤ光成形用位相パターンは、演算制御装置１７の制御部１７ａから送られるパターン信号ＳＰ_１によって制御される。

　なお、ＳＬＭ１３は、反射型及び透過型の何れであってもよい。また、ＳＬＭ１３としては、例えば屈折率変化材料型ＳＬＭが好適に用いられる。屈折率変化材料型等のＳＬＭとしては、例えばＬＣＯＳ（Liquid Crystal on Silicon）型ＳＬＭ、ＬＣＤ（Liquid Crystal Display）、電気アドレス型液晶素子、光アドレス型液晶素子、及び可変鏡型ＳＬＭ（Segment Mirror型ＳＬＭ、Continuous Deformable Mirror型ＳＬＭ）などが挙げられる。

　再び図１を参照する。ＳＬＭ１４は、本実施形態における第２の空間光変調器である。ＳＬＭ１４は、励起光源１２と光学的に結合されている。ＳＬＭ１４は、励起光源１２から励起光ＬＥ_１を受け、変調後の励起光ＬＥ_２を出力する。ＳＬＭ１４は、数値計算により求められた位相パターン（キノフォーム）を変調面に呈示することによって、励起光ＬＥ_２の集光位置、集光強度、集光形状などの集光照射条件を制御する。本実施形態では、ＳＬＭ１４において、位相変調により励起光ＬＥ_２を円形状（図１９（ａ）を参照）に成形するための励起光成形用位相パターン（第２の位相パターン）が呈示される。この励起光成形用位相パターンは、制御部１７ａから送られるパターン信号ＳＰ_２によって制御される。

　なお、ＳＬＭ１４は、位相変調型であってもよく、強度変調（振幅変調）型であってもよい。位相変調型のＳＬＭとしては、上述したＳＬＭ１３と同様のものが挙げられる。また、ＳＬＭ１４は、反射型及び透過型の何れであってもよい。また、ＳＬＭ１４に代えて、ＤＯＥ（Diffractive Optical Element）が設けられてもよい。以下の説明では、ＳＬＭ１４が位相変調型である場合について主に説明する。

　光学系１５Ａは、観察対象物Ｂの観察対象領域に励起光ＬＥ_２及びＳＴＥＤ光ＬＳ_２を照射するために設けられる。光学系１５Ａは、少なくともＳＬＭ１３及び励起光源１２と光学的に結合された対物レンズ１５ｄを有する。また、ＳＴＥＤ顕微鏡装置１Ａにおいては、光学系１５Ａは、ダイクロイックミラー１５ａ及び１５ｂ、光スキャナ１５ｃ、対物レンズ１５ｄ、及び結像光学系１５ｅを有する。

　ダイクロイックミラー１５ａは、ＳＴＥＤ光ＬＳ_２の波長を含む波長帯域の光を反射し、観察対象物Ｂにおいて生じる蛍光ＰＬの波長を含む波長帯域の光を透過する。ダイクロイックミラー１５ａは、対物レンズ１５ｄと結像光学系１５ｅとを結ぶ光軸上に配置される。ダイクロイックミラー１５ａは、ＳＬＭ１３からＳＴＥＤ光ＬＳ_２を受けて、該ＳＴＥＤ光ＬＳ_２を観察対象物Ｂに向けて反射する。また、ダイクロイックミラー１５ａは、観察対象物Ｂからの蛍光ＰＬを透過する。

　ダイクロイックミラー１５ｂは、励起光ＬＥ_２の波長を含む波長帯域の光を反射し、ＳＴＥＤ光ＬＳ_２、及び観察対象物Ｂにおいて生じる蛍光ＰＬの各波長を含む波長帯域の光を透過する。ダイクロイックミラー１５ｂは、対物レンズ１５ｄとダイクロイックミラー１５ａとを結ぶ光軸上に配置される。ダイクロイックミラー１５ｂは、ＳＬＭ１４から励起光ＬＥ_２を受けて、該励起光ＬＥ_２を観察対象物Ｂに向けて反射する。また、ダイクロイックミラー１５ｂは、ダイクロイックミラー１５ａからのＳＴＥＤ光ＬＳ_２及び観察対象物Ｂからの蛍光ＰＬを透過する。

　光スキャナ１５ｃは、観察対象物Ｂ上において、ＳＴＥＤ光ＬＳ_２および励起光ＬＥ_２の集光位置を走査するための装置である。光スキャナ１５ｃは、ＳＬＭ１３、励起光源１２、及び対物レンズ１５ｄと光学的に結合されている。光スキャナ１５ｃは、対物レンズ１５ｄとダイクロイックミラー１５ｂとを結ぶ光軸上に配置される。光スキャナ１５ｃとしては、例えばガルバノ、レゾナント、ポリゴンミラー、ＭＥＭＳ（Micro Electro Mechanical System）ミラー、又は音響光学素子（ＡＯＭ若しくはＡＯＤ（Acousto-Optic Deflector））等が好適に用いられる。

　対物レンズ１５ｄは、ＳＬＭ１３及び励起光源１２と光学的に結合されている。対物レンズ１５ｄは、観察対象物Ｂと対峙するように、例えばその上方に配置され、ＳＴＥＤ光ＬＳ_２および励起光ＬＥ_２を集光しつつ観察対象物Ｂに照射する。このとき、ＳＴＥＤ光ＬＳ_２および励起光ＬＥ_２の各光軸が互いに一致するように、ＳＬＭ１３及び１４によってこれらの光軸が制御される。また、対物レンズ１５ｄは、励起光ＬＥ_２の照射により観察対象物Ｂにおいて発生した蛍光ＰＬをコリメートする。

　結像光学系１５ｅは、対物レンズ１５ｄと光学的に結合されている。結像光学系１５ｅは、ダイクロイックミラー１５ａと検出器１６との間の光軸上に配置されている。結像光学系１５ｅは、対物レンズ１５ｄによりコリメートされダイクロイックミラー１５ａ，１５ｂを通過した蛍光ＰＬを受け、該蛍光ＰＬを検出器１６の検出面において結像する。

　検出器１６は、結像光学系１５ｅにより結像された蛍光ＰＬの光強度を検出する。検出器１６としては、例えば、光電子増倍管、フォトダイオード、若しくはアバランシェフォトダイオードといった一点の光強度を検出する光センサ、ＣＣＤイメージセンサ若しくはＣＭＯＳイメージセンサといったエリアイメージセンサ、ラインセンサなどの一次元検出器、又はマルチアノード光電子増倍管が好適に用いられる。検出器１６は、光スキャナ１５ｃと光学的に結合されており、光スキャナ１５ｃによってデスキャンされた、観察対象物Ｂにおいて発生した蛍光ＰＬを検出する。

　検出器１６は、蛍光ＰＬの光強度を示す光強度信号ＳＤ_１を、演算制御装置１７に提供する。特に、マルチアノード光電子増倍管やエリアイメージセンサを用いる場合、後述する第４変形例のように、ＳＬＭ１３及びＳＬＭ１４により多点を生成する構成にすれば、スキャンによる影響が低減された固定多点蛍光ＰＬを検出器１６において検出することができ、走査時間を低減することができる。なお、マルチアノード光電子増倍管を用いる場合、各検出部毎にゲイン調整が可能な構成とされることが好ましい。

　演算制御装置１７は、例えばＣＰＵ及びメモリを有するコンピュータによって構成される。演算制御装置１７は、制御部１７ａ及び画像処理部１７ｂを含む。制御部１７ａは、ＳＬＭ１３及びＳＬＭ１４と電気的に結合されている。制御部１７ａは、ＳＬＭ１３に呈示される第１の位相パターン、及びＳＬＭ１４に呈示される第２の位相パターンを制御する。すなわち、制御部１７ａは、ＳＴＥＤ光ＬＳ_１の波長やＳＴＥＤ光ＬＳ_２の円環形状の所望の内径及び外径に基づいて、ＳＬＭ１３に呈示されるＳＴＥＤ光成形用位相パターンを決定する。また、制御部１７ａは、励起光ＬＥ_１の波長や励起光ＬＥ_２の円形状の所望の径に基づいて、ＳＬＭ１４に呈示される励起光成形用位相パターンを決定する。

　なお、ＳＴＥＤ光ＬＳ_１及び励起光ＬＥ_１は、互いに波長が異なるので、それぞれの波長に応じて位相パターンが設計されている。詳述すると、ＳＬＭ１３に呈示されるＳＴＥＤ光成形用位相パターンは、ＳＴＥＤ光ＬＳ_１の波長に基づいて設計され、ＳＬＭ１４に呈示される励起光成形用位相パターンは、励起光ＬＥ_１の波長に基づいて設計されている。

　より詳細には、制御部１７ａは、ＳＴＥＤ光ＬＳ_２を所定の位置に集光させる位相分布を与えるように設計されたキノフォームの位相パターンφ_kinoformと、ＳＴＥＤ光ＬＳ_２を円環形状に成形させるための集光制御パターンφ_patとの和φ_SLM＝φ_kinoform＋φ_patを、ＳＴＥＤ光成形用位相パターンとしてＳＬＭ１３に呈示させる。同様に、制御部１７ａは、励起光ＬＥ_２を所定の位置に集光させる位相分布を与えるように設計されたキノフォームの位相パターンφ_kinoformと、励起光ＬＥ_２を円形状に成形させるための集光制御パターンφ_patとの和φ_SLM＝φ_kinoform＋φ_patを励起光成形用位相パターンとしてＳＬＭ１４に呈示させる。なお、位相型ＳＬＭに入力される光の位相をφ_in、位相型ＳＬＭにおいて付与される位相値をφ_SLMとすると、出力される変調光の位相φ_outは、φ_out＝φ_SLM＋φ_inとなる。

　また、ＳＴＥＤ顕微鏡では、観察対象物Ｂに対し、励起光ＬＥ_２を照射してから所定の時間差をもってＳＴＥＤ光ＬＳ_２を照射する必要がある。その為に、制御部１７ａは、励起光源１２がパルス状の励起光ＬＥ_１を照射した後、上記所定の時間が経過した後に、ＳＴＥＤ光源１１がパルス状のＳＴＥＤ光ＬＳ_１を照射するように、ＳＴＥＤ光源１１及び励起光源１２の光出射タイミングを制御する。また、制御部１７ａは、光スキャナ１５ｃを制御することにより、観察対象物Ｂ上において励起光ＬＥ_２及びＳＴＥＤ光ＬＳ_２の集光位置を走査させる。

　画像処理部１７ｂは、検出器１６からの光強度信号ＳＤ_１を入力する。画像処理部１７ｂは、検出器１６において検出された蛍光ＰＬの光強度、及び光スキャナ１５ｃによる集光位置に基づいて、蛍光画像を作成する。画像処理部１７ｂにより作成された蛍光画像は、表示装置１９に表示される。表示装置１９は、画像処理部１７ｂと電気的に結合されている。

　ここで、本実施形態では、ＳＬＭ１３に呈示されるＳＴＥＤ光成形用位相パターンを制御部１７ａが設定または変更することにより、ＳＴＥＤ光ＬＳ_２の円環の内径Ｄ_１（図２（ｂ）を参照）が設定または変更可能とされている。この点について、以下に説明する。

　図３（ａ）～図３（ｄ）は、ＳＬＭ１３に呈示されるＳＴＥＤ光成形用位相パターンに含まれる、ＳＴＥＤ光ＬＳ_２を円環形状に成形するためのパターンＰ_１１～Ｐ_１４を概念的に示す図である。また、図４（ａ）～図４（ｄ）それぞれは、図３（ａ）～図３（ｄ）それぞれに示されるパターンＰ_１１～Ｐ_１４の各画素における位相値を色の濃淡により表した図であって、色が淡いほど位相値が０（ｒａｄ）に近く、色が濃いほど位相値が２π（ｒａｄ）に近い。

　図３及び図４に示されるように、これらのパターンＰ_１１～Ｐ_１４は、或る点Ａを中心としてらせん状に０（ｒａｄ）から２π（ｒａｄ）までの位相の増加をｎ回（ｎは１以上の整数）繰り返すパターンである。図３（ａ）及び図４（ａ）はｎ＝１の場合を、図３（ｂ）及び図４（ｂ）はｎ＝２の場合を、図３（ｃ）及び図４（ｃ）はｎ＝３の場合を、図３（ｄ）及び図４（ｄ）はｎ＝４の場合を、それぞれ示している。

　なお、パターンＰ_１１～Ｐ_１４は、いわゆるラゲールガウシアン（ＬＧ）ビームの位相パターンである。このようなパターンＰ_１１～Ｐ_１４は、ラゲール多項式を用いても表現することができる。また、ＳＴＥＤ光成形用位相パターンにおいて０（ｒａｄ）から２π（ｒａｄ）に達するまでの階調幅は、ＳＴＥＤ光ＬＳ_１の波長に応じて設定される。

　図５（ａ）～図５（ｄ）それぞれは、上述したパターンＰ_１１～Ｐ_１４それぞれがＳＬＭ１３に呈示されることにより得られるＳＴＥＤ光ＬＳ_２の形状を示す図である。なお、図５（ａ）～図５（ｄ）において、光強度が色の濃淡で示されており、光強度が大きいほど淡く、光強度が小さいほど濃くなっている。図５（ａ）～図５（ｄ）を参照すると、繰り返し数ｎが大きくなるほど、ＳＴＥＤ光ＬＳ_２の円環の内径が大きくなっていることがわかる。すなわち、制御部１７ａが繰り返し数ｎを設定または変更することによって、図２（ｂ）に示される円環の内径Ｄ_１を制御することが可能となる。

　制御部１７ａは、例えば円環の複数の内径Ｄ_１にそれぞれ対応する繰り返し数の複数のパターンを予め記憶する記憶部１７ｃ（図１を参照）を有してもよい。その場合、制御部１７ａは、制御部１７ａと電気的に結合されている入力装置１８（入力部、図１を参照）から入力される所望の内径Ｄ_１に応じて、該内径Ｄ_１に対応するパターンを選択し、ＳＴＥＤ光成形用位相パターンに重畳させる。或いは、制御部１７ａは、制御部１７ａと電気的に結合されている入力装置１８から入力される所望の内径Ｄ_１に応じて、該内径Ｄ_１を実現可能な繰り返し数ｎを算出し、該繰り返し数ｎに基づくパターンをＳＴＥＤ光成形用位相パターンに重畳させてもよい。なお、記憶部１７ｃは、演算制御装置１７に電気的に結合された外部装置によって構成されてもよい。

　以上に説明した本実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡装置１Ａの動作について説明する。図６は、ＳＴＥＤ顕微鏡装置１Ａの動作を示すフローチャートである。図６に示されるように、まず、ＳＴＥＤ光ＬＳ_１及び励起光ＬＥ_１に関する情報が、入力装置１８を介して演算制御装置１７に入力される（ステップＳ１）。次に、演算制御装置１７の制御部１７ａが、ＳＴＥＤ光成形用位相パターン及び励起光成形用位相パターンを決定する（ステップＳ２：設定ステップ）。

　そして、制御部１７ａからの指示により、励起光源１２が励起光ＬＥ_１を出力する（ステップＳ３１：励起光出力ステップ）。励起光ＬＥ_１の出力から所定時間だけ遅れて、制御部１７ａからの指示により、ＳＴＥＤ光源１１がＳＴＥＤ光ＬＳ_１を出力する（ステップＳ４１：ＳＴＥＤ光出力ステップ）。励起光ＬＥ_１はＳＬＭ１４によって円形状に成形され（ステップＳ３２：第２の変調ステップ）、ＳＴＥＤ光ＬＳ_１はＳＬＭ１３によって円環形状に成形される（ステップＳ４２：変調ステップ、第１の変調ステップ）。

　成形後の励起光ＬＥ_２はダイクロイックミラー１５ｂ、光スキャナ１５ｃ及び対物レンズ１５ｄを経て、観察対象物Ｂの観察対象領域に照射される（ステップＳ３３）。その後、上記所定時間ののちに、成形後のＳＴＥＤ光ＬＳ_２がダイクロイックミラー１５ａ、光スキャナ１５ｃ及び対物レンズ１５ｄを経て、観察対象物Ｂの観察対象領域に重ねて照射される（ステップＳ４３：照射ステップ）。これにより、円環形状の領域では蛍光ＰＬの発生が抑制され、該円環形状に囲まれた領域のみから蛍光ＰＬが発生する（図１９（ｃ）を参照）。続いて、検出器１６において蛍光ＰＬの光強度を検出する（ステップＳ５：検出ステップ）。蛍光ＰＬの光強度に関する光強度信号ＳＤ_１は、検出器１６から演算制御装置１７に送られる。

　ステップＳ５が終了した後、観察対象物Ｂ上におけるＳＴＥＤ光ＬＳ_２及び励起光ＬＥ_２の集光位置が、光スキャナ１５ｃにより移動する。そして、上記ステップＳ２～Ｓ５が再び行われる。このように、集光位置の移動と上記ステップＳ２～Ｓ５とを交互に繰り返すことによって、観察対象物Ｂの広い領域における蛍光ＰＬの強度が検出される。続いて、演算制御装置１７の画像処理部１７ｂにおいて蛍光画像が作成される（ステップＳ６）。この蛍光画像は、表示装置１９により表示される（ステップＳ７）。

　なお、三次元の蛍光画像を取得する為には、上記ステップＳ１～Ｓ６ののち、対物レンズ１５ｄと観察対象物Ｂとの距離を変更し、再び上記ステップＳ１～Ｓ６を行うとよい。このような動作を複数回繰り返すことによって、平面的な断層画像が蓄積される。その後、画像処理部１７ｂが、その蓄積データを基に、三次元画像再構成処理を行うとよい。なお、複数回の画像取得をカウンタなどを用いて計測し、観察対象物Ｂを光軸方向に移動させて観察深さを変更する動作を複数回繰り返すことによって、連続的に深さを変えた画像群を取得し、各画像間を補間（線形補間、スプラインなど）することにより、三次元画像を再構成してもよい。

　また、制御部１７ａは、円環の複数の内径Ｄ_１にそれぞれ対応する複数のパターンＰ_１１～Ｐ_１４を予め記憶しておき、入力装置１８からの入力に応じて、これらのパターンＰ_１１～Ｐ_１４から適切なパターンを選択してもよい。図７は、このような制御部１７ａの処理を示すフローチャートである。図７に示されるように、まず、複数の走査時間又は複数の解像度に応じた複数の動作モード（スキャンモード）の中から、所望の動作モードが使用者によって選択される（ステップＳ１１）。次に、制御部１７ａは、パターンＰ_１１～Ｐ_１４の中から、選択された動作モードに対応するパターンを選択する（ステップＳ１２）。続いて、制御部１７ａは、選択したパターンを含むＳＴＥＤ光成形用位相パターンを作成し、そのＳＴＥＤ光成形用位相パターンをＳＬＭ１３に呈示させる（ステップＳ１３）。

　或いは、制御部１７ａは、次のような処理によってＳＴＥＤ光成形用位相パターンを作成してもよい。図８は、制御部１７ａの処理を示すフローチャートである。図８に示されるように、まず、使用者によって所望の内径Ｄ_１が入力される（ステップＳ２１）。次に、制御部１７ａは、所望の内径Ｄ_１に応じて、該内径Ｄ_１を実現可能な繰り返し数ｎを算出する（ステップＳ２２）。そして、制御部１７ａは、算出した繰り返し数ｎに基づくパターンを作成し（ステップＳ２３）、該パターンを含むＳＴＥＤ光成形用位相パターンを作成し、そのＳＴＥＤ光成形用位相パターンをＳＬＭ１３に呈示させる（ステップＳ２４）。

　以上に説明した本実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡装置１Ａによって得られる効果について説明する。ＳＴＥＤ顕微鏡装置１Ａでは、ＳＴＥＤ光源１１から出力されたＳＴＥＤ光ＬＳ_１が、ＳＬＭ１３での位相変調により円環状に成形される。円環状のＳＴＥＤ光ＬＳ_２は、観察対象領域に励起光ＬＥ_２が照射された後、該観察対象領域に重ねて照射される。これにより、円環状の領域では蛍光ＰＬの発生が抑制され、円環状のＳＴＥＤ光ＬＳ_２に囲まれた領域のみから蛍光ＰＬが発生する。従って、本実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡装置１Ａによれば、回折限界以下の解像度による画像取得が可能となる。

　また、図９は、比較例としてのＳＴＥＤ顕微鏡装置１００の構成を示すブロック図である。このＳＴＥＤ顕微鏡装置１００は、ＳＬＭ１３，１４を備えておらず、ＳＴＥＤ光ＬＳ_２を円環状に成形するための位相板１０２を備えている。このような構成では、ＳＴＥＤ光ＬＳ_２の円環形状の内径Ｄ_１を変更する為には、位相板１０２を別の位相板に交換する必要がある。

　これに対し、本実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡装置１Ａでは、制御部１７ａが位相パターンを設定または変更することによって、位相変調後のＳＴＥＤ光ＬＳ_２の円環の内径Ｄ_１が設定または変更可能とされている。これにより、解像度の向上が必要なときには円環の内径Ｄ_１を小さくし、観察対象領域の全体を走査（スキャン）する為に必要な時間を短くしたいときには円環の内径Ｄ_１を大きくすることができる。このように、本実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡装置１Ａによれば、解像度及び所要時間に関し、使用者の利便性を向上することができる。

　また、本実施形態のように、ＳＴＥＤ顕微鏡装置１Ａは、位相変調により励起光ＬＥ_２を円形状に成形するためのＳＬＭ１４を備え、制御部１７ａが、ＳＬＭ１４に呈示される励起光成形用位相パターンを制御してもよい。これにより、励起光ＬＥ_２の形状を任意に且つ容易に制御することができる。

　また、図３及び図４に示されたように、ＳＴＥＤ光成形用位相パターンは、或る点Ａを中心としてらせん状に０（ｒａｄ）～２π（ｒａｄ）までの位相の増加をｎ回繰り返すパターンＰ_１１～Ｐ_１４のいずれかを含み、制御部１７ａが整数ｎを設定または変更することによって、円環の内径Ｄ_１を制御してもよい。例えばこのようなＳＴＥＤ光成形用位相パターンによって、位相変調後のＳＴＥＤ光ＬＳ_２の円環の内径Ｄ_１を好適に制御することができる。

　また、本実施形態のように、制御部１７ａは、ＳＴＥＤ光ＬＳ_２の円環の複数の内径Ｄ_１にそれぞれ対応する複数のパターンを記憶する記憶部１７ｃを有し、選択されたパターンをＳＴＥＤ光成形用位相パターンに含めてもよい。これにより、所望の解像度や所要時間に応じて使用者がＳＴＥＤ光成形用位相パターンを容易に設定または変更することができる。

　また、本実施形態のように、光スキャナ１５ｃを介した光を検出器１６が検出してもよい。これにより、一般的な共焦点顕微鏡装置のようにコンフォーカルピンホールを用いなくても、共焦点像を取得することができる。

　（第１の変形例）

　図１０は、ＳＬＭ１３に呈示されるＳＴＥＤ光成形用位相パターンに含まれる、ＳＴＥＤ光ＬＳ_２を円環形状に成形するためのパターンＰ_１５を概念的に示す図である。上記実施形態において、制御部１７ａは、図３に示されたパターンＰ_１１～Ｐ_１４に代えて、図１０に示されるパターンＰ_１５を、ＳＬＭ１３に呈示されるＳＴＥＤ光成形用位相パターンに重畳させてもよい。

　図１０に示されるように、このパターンＰ_１５は、或る点Ａを中心としてらせん状に０（ｒａｄ）から２π×ｎ（ｒａｄ）（ｎは１以上の整数）まで位相が増加するパターンである。例えば、ｎ＝２の場合、パターンＰ_１５は、点Ａを中心としてらせん状に０（ｒａｄ）から４π（ｒａｄ）まで位相が増加するパターンとなるが、このようなパターンによって実現される円環の内径Ｄ_１は、らせん状に０（ｒａｄ）から２π（ｒａｄ）までの位相の増加を２回繰り返すパターン（図３（ｂ）を参照）によって実現される円環の内径Ｄ_１と等しい。なお、パターンＰ_１５は、いわゆるラゲールガウシアン（ＬＧ）ビームの位相パターンである。このようなパターンＰ_１５は、ラゲール多項式を用いても表現することができる。

　本変形例のように、ＳＴＥＤ光成形用位相パターンは、或る点Ａを中心としてらせん状に０（ｒａｄ）～２π×ｎ（ｒａｄ）まで位相が増加するパターンＰ_１５を含み、制御部１７ａが整数ｎを設定または変更することによって、円環の内径Ｄ_１を制御してもよい。例えばこのようなＳＴＥＤ光成形用位相パターンによって、位相変調後のＳＴＥＤ光ＬＳ_２の円環の内径Ｄ_１を好適に制御することができる。なお、ＳＬＭ１３の位相変調幅が０～２π（ｒａｄ）である場合には、図３に示されたパターンＰ_１１～Ｐ_１４のように、らせん状に０（ｒａｄ）から２π（ｒａｄ）までの位相の増加をｎ回繰り返す（すなわち、位相２πで折り返された）パターンを用いるとよい。

　（第２の変形例）

　図１１（ａ）は、ＳＬＭ１３に呈示されるＳＴＥＤ光成形用位相パターンに含まれる、ＳＴＥＤ光ＬＳ_２を円環形状に成形するためのパターンＰ_１６を概念的に示す図である。上記実施形態において、制御部１７ａは、図３に示されたパターンＰ_１１～Ｐ_１４に代えて、図１１（ａ）に示されるパターンＰ_１６を、ＳＬＭ１３に呈示されるＳＴＥＤ光成形用位相パターンに重畳させてもよい。

　図１１（ａ）に示されるように、このパターンＰ_１６は、或る点Ａを中心としてらせん状に０（ｒａｄ）からｍ（ｒａｄ）（ｍは２π以上の実数）まで位相が増加するパターンである。例えば、ｍ＝３πの場合、パターンＰ_１６は、点Ａを中心としてらせん状に０（ｒａｄ）から３π（ｒａｄ）まで位相が増加するパターンとなる。ＳＴＥＤ光成形用位相パターンがこのようなパターンＰ_１６を含み、制御部１７ａが実数ｍを設定または変更することによっても、円環の内径Ｄ_１を好適に制御することができる。本変形例において、制御部１７ａは、入力装置１８から入力される所望の内径Ｄ_１に応じて、該内径Ｄ_１を実現可能な実数ｍを算出し、実数ｍに基づくパターンをＳＴＥＤ光成形用位相パターンに重畳させる。

　なお、図１１（ｂ）に示されるように、本変形例のパターンは、らせん状に０（ｒａｄ）から２π（ｒａｄ）まで位相が増加したのち、２π（ｒａｄ）にて折り返し、再び０（ｒａｄ）からπ（ｒａｄ）まで位相が増加するようなパターンＰ_１７であってもよい。このようなパターンＰ_１７によって実現される円環の内径Ｄ_１は、らせん状に０（ｒａｄ）から３π（ｒａｄ）まで位相が増加するパターンＰ_１６によって実現される円環の内径Ｄ_１と等しい。但し、図１１（ｃ）に示されるように、らせん状に０（ｒａｄ）から１．５π（ｒａｄ）まで位相が増加したのち、１．５π（ｒａｄ）にて折り返し、再び０（ｒａｄ）から１．５π（ｒａｄ）まで位相が増加するようなパターンＰ_１８では、ＳＴＥＤ光ＬＳ_２を円環形状に成形することができない。

　図１２（ａ）～図１２（ｃ）は、それぞれｍ＝２π、２π＜ｍ＜４π、及びｍ＝４πの場合におけるＳＴＥＤ光ＬＳ_２の円環形状を模式的に示す図である。図１２に示されるように、ｍの値が小さいほど円環の内径Ｄ_１が小さくなり、ｍの値が大きいほど円環の内径Ｄ_１が大きくなる。従って、制御部１７ａが実数ｍを設定することにより、円環の内径Ｄ_１を好適に制御することができる。

　（第３の変形例）

　上記実施形態において、制御部１７ａは、励起光ＬＥ_１を分割し、分割後の励起光ＬＥ_２を複数の領域に同時に照射するためのパターンを、励起光成形用位相パターンに更に重畳させてもよい。図１３（ａ）は、励起光ＬＥ_１が分割されることにより生成された複数の励起光ＬＥ_２を示す図である。この場合、制御部１７ａは、ＳＴＥＤ光ＬＳ_１を複数に分割し、分割後のＳＴＥＤ光ＬＳ_２を観察対象物Ｂの複数の領域に同時に照射するためのパターンを、ＳＴＥＤ光成形用位相パターンに更に重畳させるとよい。

　図１３（ｂ）は、ＳＴＥＤ光ＬＳ_１が分割されることにより生成された複数のＳＴＥＤ光ＬＳ_２を示す図である。図１３（ａ）の励起光ＬＥ_２が照射された直後に図１３（ｂ）のＳＴＥＤ光ＬＳ_２が照射された場合、図１３（ｃ）に示されるように、観察対象物Ｂの複数の領域から蛍光ＰＬが同時に発生する。なお、図１３（ａ）～図１３（ｃ）において、光強度が色の濃淡で示されており、光強度が大きいほど淡く、光強度が小さいほど濃くなっている。

　図１４は、ＳＴＥＤ光ＬＳ_１を分割して複数のＳＴＥＤ光ＬＳ_２を生成するためのパターンの一例を示す図である。図１４において、各画素における位相値は色の濃淡によって表されており、色が淡いほど位相値が０（ｒａｄ）に近く、色が濃いほど位相値が２π（ｒａｄ）に近い。本変形例では、例えば図１４に示されるようなパターンが、円環状に成形するためのパターン（例えば図３に示されたパターンＰ_１１～Ｐ_１４）に重畳されることにより、円環形状の複数のＳＴＥＤ光ＬＳ_２が生成される。なお、励起光ＬＥ_１を分割して複数の励起光ＬＥ_２を生成するためのパターンもまた、励起光ＬＥ_２を円形状に成形するためのパターンに重畳される。なお、図１４に示されるパターンは、ＳＴＥＤ光ＬＳ_１の波長に基づいて設計される。

　本変形例によれば、観察対象物Ｂの複数の領域を同時に観察することが可能となる。従って、光スキャナ１５ｃによる走査時間が少なくて済むので、観察に要する時間を更に短縮することができる。

　（第４の変形例）

　図１５は、上記実施形態の第４変形例として、ＳＴＥＤ顕微鏡装置１Ｂの構成を示すブロック図である。本変形例のＳＴＥＤ顕微鏡装置１Ｂと上記実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡装置１Ａとの相違点は、蛍光ＰＬの撮像方式である。すなわち、本変形例のＳＴＥＤ顕微鏡装置１Ｂは、上記実施形態の光学系１５Ａ及び検出器１６に代えて、光学系１５Ｂ及び二次元撮像装置２０を備える。なお、ＳＴＥＤ顕微鏡装置１Ｂにおける他の構成は、上記実施形態と同様である。

　光学系１５Ｂは、観察対象物Ｂの観察対象領域に励起光ＬＥ_２及びＳＴＥＤ光ＬＳ_２を照射するために設けられる。光学系１５Ｂは、少なくともＳＬＭ１３及び励起光源１２と光学的に結合した対物レンズ１５ｄを有する。また、ＳＴＥＤ顕微鏡装置１Ｂにおいては、光学系１５Ｂは、ダイクロイックミラー１５ａ及び１５ｂ、光スキャナ１５ｃ、対物レンズ１５ｄ、ダイクロイックミラー１５ｆ、並びに結像光学系１５ｇを有する。なお、ダイクロイックミラー１５ａ及び１５ｂ、光スキャナ１５ｃ、並びに対物レンズ１５ｄの構成は、上記実施形態と同様である。

　ダイクロイックミラー１５ｆは、観察対象物Ｂにおいて生じる蛍光ＰＬの波長を含む波長帯域の光を反射し、ＳＴＥＤ光ＬＳ_２の波長及び励起光ＬＥ_２の波長を含む波長帯域の光を透過する。なお、本変形例では、ＳＴＥＤ光ＬＳ_２の波長は、蛍光ＰＬの波長と励起光ＬＥ_２の波長との間の波長に設定される。ダイクロイックミラー１５ｆは、対物レンズ１５ｄと光スキャナ１５ｃとを結ぶ光軸上に配置される。ダイクロイックミラー１５ｆは、観察対象物Ｂから蛍光ＰＬを受けて、該蛍光ＰＬを二次元撮像装置２０に向けて反射する。結像光学系１５ｇは、ダイクロイックミラー１５ｆと二次元撮像装置２０との間に配置されており、ダイクロイックミラー１５ｆにおいて反射した蛍光ＰＬを受け、該蛍光ＰＬを二次元撮像装置２０の検出面において結像する。

　二次元撮像装置２０は、結像光学系１５ｇにより結像された蛍光ＰＬの光強度を検出する。二次元撮像装置２０は、光スキャナ１５ｃとは光学的に結合されておらず、光スキャナ１５ｃを介さずに、観察対象物Ｂにおいて発生した蛍光ＰＬを検出する。二次元撮像装置２０としては、例えば、ＣＣＤイメージセンサ若しくはＣＭＯＳイメージセンサといったエリアイメージセンサが好適に用いられる。二次元撮像装置２０は、蛍光ＰＬの光像を示す光像信号ＳＤ_２を、演算制御装置１７に提供する。演算制御装置１７の画像処理部１７ｂは、二次元撮像装置２０において撮像された蛍光ＰＬの光像に基づいて、蛍光画像を作成する。画像処理部１７ｂにより作成された蛍光画像は、表示装置１９に表示される。

　図１６（ａ）は、本変形例の二次元撮像装置２０の受光面２０ａにおいて、蛍光ＰＬの結像点が走査される様子を模式的に示す図である。図１６（ａ）において、蛍光ＰＬの走査方向は実線の矢印により表されている。受光面２０ａは、Ｍ行Ｎ列（Ｍ，Ｎは２以上の整数）の二次元状に配列された複数の画素２０ｂを有する。光スキャナ１５ｃは、蛍光ＰＬが各画素２０ｂを行方向に走査され、一行の走査の完了後に次の行の走査が行われるように、励起光ＬＥ_２及びＳＴＥＤ光ＬＳ_２の照射位置を制御する。なお、二次元撮像装置２０の露光時間は、蛍光ＰＬの走査開始から走査終了までの時間に設定される。

　また、図１６（ｂ）は、励起光ＬＥ_２及びＳＴＥＤ光ＬＳ_２の照射タイミングを示すグラフであって、横軸は、図１６（ａ）に示される一行の走査時間に対応している。本変形例では、解像度を向上させる為に、一つの画素２０ｂが蛍光ＰＬを複数回受光することを避けることが望ましい。従って、励起光ＬＥ_２及びＳＴＥＤ光ＬＳ_２のパルス時間間隔Ｔは、走査方向における画素２０ｂの幅、光スキャナ１５ｃの走査速度、並びに対物レンズ１５ｄ及び結像光学系１５ｇの結像倍率に応じて設定されることが望ましい。

　具体的には、図１６（ｂ）に示されるように、まず、当該行の最初の画素２０ｂに蛍光ＰＬの光軸が位置するときに、励起光ＬＥ_２及びＳＴＥＤ光ＬＳ_２が連続して照射され、そのとき発生した蛍光ＰＬが最初の画素２０ｂに入射する。続いて、当該行の次の画素２０ｂに蛍光ＰＬの光軸が位置するように、励起光ＬＥ_２及びＳＴＥＤ光ＬＳ_２の光軸が光スキャナ１５ｃによって移動されたのち、励起光ＬＥ_２及びＳＴＥＤ光ＬＳ_２が連続して照射され、そのとき発生した蛍光ＰＬが次の画素２０ｂに入射する。このような動作が当該行の複数の画素２０ｂにわたって繰り返し行われることにより、一行分の蛍光画像が得られる。そして、このような動作が複数行にわたって繰り返し行われることにより、一枚の蛍光画像が得られる。

　（第５の変形例）

　図１７は、上記実施形態の第５変形例として、ＳＴＥＤ顕微鏡装置１Ｃの構成を示すブロック図である。本変形例のＳＴＥＤ顕微鏡装置１Ｃと上記実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡装置１Ａとの相違点は、励起光源１２から励起光ＬＥ_１を受け、変調後の励起光ＬＥ_２を出力するＳＬＭ１４を用いない点である。すなわち、本変形例のＳＴＥＤ顕微鏡装置１Ｃは、ミラー２２及びダイクロイックミラー２３を備えることによって、励起光源１２からの励起光ＬＥ_１の光軸とＳＴＥＤ光源１１からのＳＴＥＤ光ＬＳ_１の光軸とを互いに一致させ、ＳＴＥＤ光ＬＳ_１及び励起光ＬＥ_１の双方をＳＬＭ１３において受ける。したがって、ＳＬＭ１３は、ＳＴＥＤ光源１１及び励起光源１２と光学的に結合されている。なお、ＳＴＥＤ顕微鏡装置１Ｃにおける他の構成は、上記実施形態と同様である。

　励起光源１２からの励起光ＬＥ_１はミラー２２において反射され、ダイクロイックミラー２３に入力される。ダイクロイックミラー２３は、ＳＴＥＤ光ＬＳ_１の波長を透過し、励起光ＬＥ_１を反射するので、励起光源１２からの励起光ＬＥ_１の光軸とＳＴＥＤ光源１１からのＳＴＥＤ光ＬＳ_１の光軸とを一致させることができ、ＳＬＭ１３は、励起光ＬＥ_１とＳＴＥＤ光ＬＳ_１とを受ける。

　ここで、ＳＬＭ１３が例えばＬＣＯＳ－ＳＬＭなどのように特定の偏光の光のみを変調する空間光変調器である場合、ＳＴＥＤ光ＬＳ_１の偏光を該特定の偏光とし、励起光ＬＥ_１の偏光を該特定の偏光と直交する偏光とすることにより、ＳＴＥＤ光ＬＳ_１のみを変調することができる。詳述すると、ＳＬＭ１３がＬＣＯＳ－ＳＬＭである場合、ＬＣＯＳ－ＳＬＭは、液晶の配向方向と同じ方向の偏光成分（例えば、水平偏光成分）に対してのみ位相変調が可能である。そのため、円環形状となるように位相変調されるべきＳＴＥＤ光ＬＳ_１を水平偏光とし、位相変調が不要である励起光ＬＥ_１を垂直偏光としてこれらを予め同軸で合波し、ＳＬＭ１３に入力すると、ＳＴＥＤ光ＬＳ_１は位相変調され、ＳＴＥＤ光ＬＳ_２として出力される。一方、励起光ＬＥ_１は変調されず、励起光ＬＥ_１のまま出力される。なお、ＳＴＥＤ顕微鏡装置１Ｃにおいて、光学系１５Ａ及び検出器１６の代わりに、ＳＴＥＤ顕微鏡装置１Ｂでの光学系１５Ｂ及び二次元撮像装置２０を用いてもよい。

　本変形例のＳＴＥＤ顕微鏡装置１Ｃのような構成によれば、ＳＴＥＤ光源１１及び励起光源１２とＳＬＭ１３との間を、例えば偏光が保存される偏光ファイバを用いて導光することも可能となり、ＳＴＥＤ光源１１及び励起光源１２と、光学系１５Ａとを物理的に分離することができる。これにより、ＳＴＥＤ光源１１や励起光源１２において発生する振動や熱による光学系１５Ａへの影響を緩和し、光学系１５Ａの小型化・安定化が図れ、また、ＳＴＥＤ光源１１や励起光源１２の変更が容易になる。

　本発明によるＳＴＥＤ顕微鏡装置は、上記した実施形態及び構成例、変形例に限られるものではなく、様々な変形が可能である。

　上記実施形態による誘導放射抑制（ＳＴＥＤ）顕微鏡装置では、誘導放射抑制光（ＳＴＥＤ光）を発生する誘導放射抑制光源（ＳＴＥＤ光源）と、励起光を発生する励起光源と、位相変調により誘導放射抑制光を円環状に成形するための第１の位相パターンが呈示される位相変調型の第１の空間光変調器と、観察対象領域に励起光及び位相変調後の誘導放射抑制光を照射するための光学系と、観察対象領域から発生する蛍光を検出する検出器と、第１の位相パターンを制御する制御部と、を備え、制御部が第１の位相パターンを変更することによって、位相変調後の誘導放射抑制光の円環の内径が変更可能とされている構成としている。

　あるいは、上記実施形態による誘導放射抑制（ＳＴＥＤ）顕微鏡装置は、誘導放射抑制光（ＳＴＥＤ光）を出力する誘導放射抑制光源（ＳＴＥＤ光源）と、励起光を出力する励起光源と、誘導放射抑制光源と光学的に結合され、位相変調により誘導放射抑制光を円環状に成形するための第１の位相パターンが呈示される位相変調型の第１の空間光変調器と、励起光源及び第１の空間光変調器と光学的に結合され、観察対象領域に励起光及び位相変調後の誘導放射抑制光を照射するための光学系と、光学系と光学的に結合され、観察対象領域から発生する蛍光を検出する検出器と、第１の空間光変調器と電気的に結合され、第１の位相パターンを制御する制御部と、を備え、制御部は、位相変調後の誘導放射抑制光の円環の内径を制御するために第１の位相パターンを設定する。

　また、上記実施形態による誘導放射抑制（ＳＴＥＤ）顕微方法は、誘導放射抑制光源（ＳＴＥＤ光源）により、誘導放射抑制光（ＳＴＥＤ光）を出力するステップ（誘導放射抑制光出力ステップ、ＳＴＥＤ光出力ステップ）と、励起光源により、励起光を出力するステップ（励起光出力ステップ）と、誘導放射抑制光源と光学的に結合され、誘導放射抑制光を円環状に成形するための第１の位相パターンが呈示される位相変調型の第１の空間光変調器により、誘導放射抑制光を位相変調するステップ（変調ステップ、第１の変調ステップ）と、励起光源及び第１の空間光変調器と光学的に結合された光学系により、観察対象領域に励起光及び位相変調後の誘導放射抑制光を照射するステップ（照射ステップ）と、光学系と光学的に結合された検出器により、観察対象領域から発生する蛍光を検出するステップ（検出ステップ）と、位相変調後の誘導放射抑制光の円環の内径を制御するために第１の位相パターンを設定するステップ（設定ステップ）と、を備える。

　また、上記のＳＴＥＤ顕微鏡装置は、励起光源と光学的に結合され、位相変調により励起光を円形状に成形するための第２の位相パターンが呈示される第２の空間光変調器を更に備え、制御部が、第２の位相パターンを更に制御する構成としてもよい。また、上記のＳＴＥＤ顕微方法は、励起光源と光学的に結合され、励起光を円形状に成形するための第２の位相パターンが呈示される第２の空間光変調器により、励起光を位相変調するステップ（第２の変調ステップ）を更に備える構成としてもよい。これにより、励起光の形状や大きさを任意に制御することができる。

　また、上記のＳＴＥＤ顕微鏡装置は、制御部が、ＳＴＥＤ光を分割して複数の領域に照射するためのパターンを第１の位相パターンに重畳させるとともに、励起光を分割して複数の領域に照射するためのパターンを第２の位相パターンに重畳させる構成としてもよい。また、上記のＳＴＥＤ顕微方法は、第１の変調ステップでは、ＳＴＥＤ光を分割して複数の領域に照射するためのパターンを第１の位相パターンに重畳させるとともに、第２の変調ステップでは、励起光を分割して複数の領域に照射するためのパターンを第２の位相パターンに重畳させる構成としてもよい。これにより、複数の領域について同時に観察することが可能となり、所要時間を更に短縮することができる。

　また、上記のＳＴＥＤ顕微鏡装置及びＳＴＥＤ顕微方法は、検出器が二次元検出器である構成としてもよい。

　また、その場合、ＳＴＥＤ顕微鏡装置は、蛍光を二次元検出器の受光面上において走査させる光スキャナを更に備え、励起光及び誘導放射抑制光の照射時間間隔は、走査方向における受光面の画素の幅及び光スキャナの走査速度に応じて、各画素が蛍光を複数回受光しないように設定されている構成としてもよい。また、ＳＴＥＤ顕微方法は、光スキャナにより、蛍光を二次元検出器の受光面上において走査させるステップ（走査ステップ）を更に備え、励起光及び誘導放射抑制光の照射時間間隔は、走査方向における受光面の画素の幅及び光スキャナの走査速度に応じて、各画素が蛍光を複数回受光しないように設定されている構成としてもよい。これにより、解像度を向上させることができる。

　また、上記のＳＴＥＤ顕微鏡装置は、第１の位相パターンが、或る点を中心としてらせん状に０（ｒａｄ）～２π×ｎ（ｒａｄ）（ｎは１以上の整数）まで位相が増加するパターンを含み、制御部は、円環の内径を制御するために整数ｎを設定する構成としてもよい。また、上記のＳＴＥＤ顕微方法は、第１の位相パターンが、或る点を中心としてらせん状に０（ｒａｄ）～２π×ｎ（ｒａｄ）（ｎは１以上の整数）まで位相が増加するパターンを含み、設定ステップでは、円環の内径を制御するために整数ｎを設定する構成としてもよい。例えばこのような第１の位相パターンによって、位相変調後のＳＴＥＤ光の円環の内径を好適に制御することができる。

　また、上記のＳＴＥＤ顕微鏡装置は、第１の位相パターンが、或る点を中心としてらせん状に０（ｒａｄ）～２π（ｒａｄ）までの位相の増加をｎ回（ｎは１以上の整数）繰り返すパターンを含み、制御部は、円環の内径を制御するために整数ｎを設定する構成としてもよい。また、上記のＳＴＥＤ顕微方法は、第１の位相パターンが、或る点を中心としてらせん状に０（ｒａｄ）～２π（ｒａｄ）までの位相の増加をｎ回（ｎは１以上の整数）繰り返すパターンを含み、設定ステップでは、円環の内径を制御するために整数ｎを設定する構成としてもよい。例えばこのような第１の位相パターンによって、位相変調後のＳＴＥＤ光の円環の内径を好適に制御することができる。

　また、上記のＳＴＥＤ顕微鏡装置は、誘導放射抑制光の円環の複数の内径にそれぞれ対応する複数のパターンを記憶する記憶部を更に備え、複数のパターンの中から選択されたパターンを第１の位相パターンに含める構成としてもよい。また、上記のＳＴＥＤ顕微方法は、設定ステップでは、記憶部に記憶された誘導放射抑制光の円環の複数の内径にそれぞれ対応する複数のパターンの中から選択されたパターンを第１の位相パターンに含める構成としてもよい。これにより、所望の解像度や所要時間に応じて使用者が第１の位相パターンを容易に設定または変更することができる。

　また、上記のＳＴＥＤ顕微鏡装置は、円環の内径の所望値を入力する入力部を更に備え、第１の位相パターンは、或る点を中心としてらせん状に０（ｒａｄ）～ｍ（ｒａｄ）（ｍは２π以上の実数）まで位相が増加するパターンを含み、制御部が、入力部から入力された円環の内径の所望値に基づいて実数ｍを設定する構成としてもよい。また、上記のＳＴＥＤ顕微方法は、第１の位相パターンが、或る点を中心としてらせん状に０（ｒａｄ）～ｍ（ｒａｄ）（ｍは２π以上の実数）まで位相が増加するパターンを含み、設定ステップでは、入力部から入力された円環の内径の所望値に基づいて実数ｍを設定する構成としてもよい。例えばこのような第１の位相パターンによって、位相変調後のＳＴＥＤ光の円環の内径を好適に制御することができる。

　本発明は、解像度及び所要時間に関して使用者の利便性を向上することができるＳＴＥＤ顕微鏡装置として利用可能である。

　１Ａ…ＳＴＥＤ顕微鏡装置、１Ｂ…ＳＴＥＤ顕微鏡装置、１１…ＳＴＥＤ光源、１２…励起光源、１３，１４…ＳＬＭ、１５Ａ，１５Ｂ…光学系、１５ａ，１５ｂ…ダイクロイックミラー、１５ｃ…光スキャナ、１５ｄ…対物レンズ、１５ｅ…結像光学系、１５ｆ…ダイクロイックミラー、１５ｇ…結像光学系、１６…検出器、１７…演算制御装置、１７ａ…制御部、１７ｂ…画像処理部、１７ｃ…記憶部、１８…入力装置、１９…表示装置、２０…二次元撮像装置、２０ａ…受光面、２０ｂ…画素、Ｂ…観察対象物、ＬＥ_１，ＬＥ_２…励起光、ＬＳ_１，ＬＳ_２…ＳＴＥＤ光、ＰＬ…蛍光。

Claims (9)

1. 　誘導放射抑制光を出力する誘導放射抑制光源と、
   　励起光を出力する励起光源と、
   　位相変調により前記誘導放射抑制光を円環状に成形するための第１の位相パターンが呈示される位相変調型の第１の空間光変調器と、
   　観察対象領域に前記励起光及び位相変調後の前記誘導放射抑制光を照射するための光学系と、
   　前記観察対象領域から発生する蛍光を検出する検出器と、
   　前記第１の位相パターンを制御する制御部と、を備え、
   　前記制御部は、位相変調後の前記誘導放射抑制光の円環の内径を制御するために前記第１の位相パターンを設定する、誘導放射抑制顕微鏡装置。
2. 　位相変調により前記励起光を円形状に成形するための第２の位相パターンが呈示される第２の空間光変調器を更に備え、
   　前記制御部は、前記第２の位相パターンを更に制御する、請求項１に記載の誘導放射抑制顕微鏡装置。
3. 　前記制御部は、前記誘導放射抑制光を分割して複数の領域に照射するためのパターンを前記第１の位相パターンに重畳させるとともに、前記励起光を分割して前記複数の領域に照射するためのパターンを前記第２の位相パターンに重畳させる、請求項２に記載の誘導放射抑制顕微鏡装置。
4. 　前記検出器が二次元検出器である、請求項３に記載の誘導放射抑制顕微鏡装置。
5. 　前記蛍光を前記二次元検出器の受光面上において走査させる光スキャナを更に備え、
   　前記励起光及び前記誘導放射抑制光の照射時間間隔は、走査方向における前記受光面の画素の幅及び前記光スキャナの走査速度に応じて、各画素が前記蛍光を複数回受光しないように設定されている、請求項４に記載の誘導放射抑制顕微鏡装置。
6. 　前記第１の位相パターンは、或る点を中心としてらせん状に０（ｒａｄ）～２π×ｎ（ｒａｄ）（ｎは１以上の整数）まで位相が増加するパターンを含み、
   　前記制御部は、前記円環の内径を制御するために整数ｎを設定する、請求項１～５のいずれか一項に記載の誘導放射抑制顕微鏡装置。
7. 　前記第１の位相パターンは、或る点を中心としてらせん状に０（ｒａｄ）～２π（ｒａｄ）までの位相の増加をｎ回（ｎは１以上の整数）繰り返すパターンを含み、
   　前記制御部は、前記円環の内径を制御するために整数ｎを設定する、請求項１～５のいずれか一項に記載の誘導放射抑制顕微鏡装置。
8. 　前記誘導放射抑制光の円環の複数の内径にそれぞれ対応する複数のパターンを記憶する記憶部を更に備え、前記複数のパターンの中から選択されたパターンを前記第１の位相パターンに含める、請求項１～７のいずれか一項に記載の誘導放射抑制顕微鏡装置。
9. 　前記円環の内径の所望値を入力する入力部を更に備え、
   　前記第１の位相パターンは、或る点を中心としてらせん状に０（ｒａｄ）～ｍ（ｒａｄ）（ｍは２π以上の実数）まで位相が増加するパターンを含み、
   　前記制御部は、前記入力部から入力された前記円環の内径の所望値に基づいて実数ｍを設定する、請求項１～５のいずれか一項に記載の誘導放射抑制顕微鏡装置。

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