WO2015144608A1 - Vorrichtung und in-vitro verfahren zur markierungsfreien darstellung und analyse von zellen und kristallen in einer biologischen probe - Google Patents

Vorrichtung und in-vitro verfahren zur markierungsfreien darstellung und analyse von zellen und kristallen in einer biologischen probe Download PDF

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WO2015144608A1
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crystal
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cells
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Andreas Kappel
Oliver Schmidt
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Siemens Aktiengesellschaft
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    • G01N2015/1497—Particle shape

Definitions

  • the invention relates to an apparatus and in-vitro Ver ⁇ drive to the label-free presentation and analysis of cell topographies and cell types using a
  • cytology In particular, the determination of cells and their assignment to a cell type is of great importance in cytology.
  • cellular blood components such as erythrocytes, platelets and white blood cells are determined and quantified.
  • the white blood cells become granular cells, such as
  • Neutrophils eosinophils and basophils, and differentiated into non-granular cells, for example lymphocytes or monocytes. Red blood cells are classified into reticulocytes and mature erythrocytes depending on maturity.
  • a staining is used for the differentiation of granular cells, in particular of eosinophils and basophils.
  • the evaluation of the cell populations is usually ⁇ way by fully automated hematology analyzers or microscopy.
  • the analysis in fully automated Analy ⁇ catalysts is carried out according to established algorithms. However, this leads to error messages being displayed in samples with pathological populations. Therefore, in the next
  • Step usually microscope images of the cells evaluated as Vali ⁇ d istsmethode. This step is laborious and costly, as it involves sample preparation, microscopy and further processing steps manual review erfor ⁇ changed.
  • the urine sediment analysis is a etab ⁇ profiled in vitro diagnostic method for the determination of renal ⁇ disorders and disorders of the urogenital tract.
  • the urine sample is typically centrifuged, the supernatant discarded and the sediment resuspended. Subsequently, the sample is examined by means of a phase-contrast microscope.
  • Wei ⁇ furthermore possible to be represented by means of the cellular elements Sternheimer Malvin staining. With polarized light, it is possible to detect birefringent elements such as uric acid crystals, lipid droplets or oval fat granules.
  • the sample preparation, micro ⁇ spectroscopy and other operations, including the evaluation must be done manually. This is expensive and expensive.
  • a hematology analyzer can be dispensed with and instead every single cell can be microscopically examined. Then it is possible that blood be quantitatively agree regardless of fixed algorithms ⁇ .
  • the disadvantage is that the sample through ⁇ rate is significantly lower than in a hematology analyzer. Furthermore, the effort remains to immobilize the cells on reträ ⁇ like and continue to dye.
  • the object on which the invention is based is therefore to provide an efficient and time-saving process for the preparation of cells and crystals in biological samples .
  • the invention in vitro method for the preparation of cells, especially of cell topography, or of Cristal ⁇ len in a biological sample is performed in several Schrit ⁇ th.
  • a biological sample solution with at least one cell and / or at least one crystal is in a microfluidic ⁇ led channel.
  • the cell and / or the crystal is rotated in the microfluidic channel by means of a first device.
  • Two temporally successive images of the same cell and / or of the crystal are then produced by means of a microscope device.
  • the invention further comprises a Zelldarwolfsvorrich ⁇ processing for the analysis of cells and / or crystals in a bio ⁇ logical sample.
  • These cell display device comprises a microfluidic channel for receiving the biological sample, a first device to initiate a rotation of a biological cell and / or a crystal in the microfluidic channel, and a microscope apparatus for Ab ⁇ form the cell and / or the crystal.
  • Microscopy apparatus is designed such that it can generate we ⁇ alterations two images of the same cell and / or the same Kris ⁇ talls.
  • Megakariozyten can be from different angles represent ⁇ , the microscope is fixed. The cells or crystals remain in their native environment ⁇ Conversely, thereby advantageously prevents artifacts, for example, Trock ⁇ drying and staining. This allows a quick and inexpensive sample preparation, which is ideally ⁇ used for point-of-care applications. For the analysis of urine no sedimentation analysis is necessary. Already with a small sample volume cells and / or crystals in the urine can be analy ⁇ Siert in their native environment because they are imaged from different directions.
  • the three-dimensional model of the cell made light ⁇ ⁇ a CLASSIFICA tion in, for example, pathological and non-pathological cell types.
  • the distinction mature Erythrozy ⁇ th and reticulocytes is possible.
  • the rotation of the cell is initiated by means of a hydrodynamically focused flow.
  • this targeted flow is a swirling flow that rotates the cell relative to the microscopy device, such that the microscopy device can pick up the cell or crystal from different perspectives without changing their own position.
  • the cells or, in the case of urinalysis, analysis, the crystals are non-contact and can thus advantageously manipulated in their native environment verblei ⁇ ben.
  • the rotation is adjusted in particular by the Strömungsge ⁇ speed of the biological sample through the microfluidic channel regard. It will continue to be advantageous
  • Zentrifugationaggregate especially of crystals, avoided in the Urinsedimentationsanalysis.
  • the analysis can advantageously last until a minimum number of particulate components of the urine or blood is analyzed.
  • the flow rate can then be deduced in particular the erythrocyte number for classification.
  • the flow is generated by means of at least one flow obstacle ⁇ nisse in the microfluidic channel.
  • the flow by using the supply of a carrier liquid can be generated to the longitudinal axis of the microfluidic Ka ⁇ Nals at a certain angle. This angle is in particular a right ⁇ ter angle.
  • the cells are analyzed undyed. They can thus be advantageously analyzed in their native environment without artefacts of drying and staining. Therefore, a continuous analysis of sample solution in the microfluidic channel is advantageously possible.
  • the microscope apparatus is a digi tal- ⁇ holographic microscope.
  • the use of a digitalho ⁇ lographischen microscope makes it possible to detect the phase information of the object quantitatively.
  • This microscopy method enables a particularly high axial resolution.
  • Axi ⁇ al means in the direction of the optical axis of the microscope ⁇ .
  • Digital holographic microscopy enables a resolution of up to one nanometer in the z-direction. This corresponds to a precision which is higher by a factor of 100 to 1000 than with other known light microscopic methods.
  • the surrounding medium here is in particular the carrier liquid in the microfluidic channel.
  • the use of digital holographic microscope is white ⁇ terhin particularly for focusing in rotation be ⁇ -sensitive objects of great advantage. Since the position of the cell or of the crystal in the z-direction, ie, is not known exactly along the op ⁇ tables axis of the microscope, the cell can be subsequently focused by computer reconstruction of the withdrawn on ⁇ hologram. This is an expensive autofocus as he would be required in a conventional micro ⁇ microscope avoided.
  • Microscope for the reconstruction of the cells is thus avoided ⁇ the.
  • the use of a polarizer is advantageously avoided.
  • the digital holographic microscope can optionally with
  • LEDs Light emitting diodes
  • laser diodes of different Wellenlän ⁇ ge be equipped. Then the parameters refractive index and physical thickness of the objects, in particular the cells, can be separated from each other.
  • the digital holographic microscope is a microscope lens-free.
  • an analysis unit such as a chip
  • microfluidic channels on an analysis unit are evaluated.
  • a high throughput of biological samples for analysis is possible.
  • These multiple microfluidic channels may, for example, be arranged in parallel on a chip.
  • the cell presentation device comprises a second device for detecting Mie and / or Rayleigh scattering. These data can be pulled zoom ⁇ advantageous in addition to the differentiation of objects, in particular of the cells.
  • the cell and / or the crystal are colored with a dye.
  • Microscopy device can be designed to image the dye, in particular the fluorescent dye.
  • Al ternatively ⁇ cell presentation device comprises a second microscope device as a fluorescence microscope.
  • the Einfär ⁇ ben, or labeling with specific markings insbeson ⁇ particular fluorophore or light scattering labels, particularly gold, followed by analyzing the cells allows addition a differentiating beyond pure morphology. Ren the marking is carried out in particular by means of antibodies which bind to spe ⁇ -specific epitopes of the cell. These epitopes in turn correlate with cell functionality.
  • the cell presentation ⁇ apparatus with precisely one first microscope for imaging dyes can depict a dye in a cell from various sides.
  • FIG. 1 shows a schematic representation of the microfluidic channel with microscope device and two sectional images of the microfluidic channel
  • Figure 2 is another schematic image of the fluidic
  • Figure 5 shows two microscope images at the times tl and t2.
  • a biological sample may therefore comprise, for example, a sample of animal or plant cells, bacterial cells and / or unicellular organisms.
  • the biological sample may include animal or human urine samples.
  • the blood analysis is preferably whole blood samples comprising, for example, blood cells such as leukocytes, eosinophilic granulocytes or basophilic granulocytes.
  • the biological sample 1 comprises, in this case blood, a first mature erythrocytes 2, a dysmorphic erythrocytes 3, a 4 and a two leukocytes ⁇ th erythrocytes 5.
  • the biological specimen 1 is guided into the Mik ⁇ rofluidkanal. 7
  • the cell display device 18 of this example further comprises a digital holographic microscope 6.
  • the image field 8 of the digital holographic microscope ⁇ 6 show the figures 3 to 5.
  • the biological sample 1 is guided past the digital holographic microscope 6 by means of the microfluidic channel 7.
  • the supply of the biological sample 1 thus takes place continuously into the microfluidic channel 7.
  • FIGS. 1 and 2 respectively show devices 10, 11, 19, 20 which set the cells in rotation.
  • Figure 1 shows a first flow obstacle 10, and a two ⁇ tes flow obstacle 11. These are arranged in a defined distance to the image field 8 of the microscope. 6 The distance is such that the rotation of the cells is 2,3,4,5 in
  • Image field 8 takes place.
  • the sectional images AA x and BB x show two typical flow obstacles 10 and 11 in the Mikrofluidka ⁇ nal 7. They are staggered to each other in the microfluidic channel 7 to ⁇ ordered to produce a vortex flow of the biological sample 1.
  • the first flow obstacle 10, the second flow obstacle 11 and the microfluidic channel 7 are prepared ⁇ typi cally made of the same material.
  • the obstacles 10, 11 and the microfluidic channel 7 are produced in the same process step. Making it ⁇ follows by means of hot-stamping (English, “not embossing") or al ⁇ ternatively by injection molding.
  • materials transpa ⁇ pension polymers are typically polymethyl methacrylate (PMMA), polyethylene, polyethylene glycol, polydimethylsiloxane, polycarbonates, Polyethylene terephthalate (PET), polystyrene or glass.
  • the dimension of the flow obstacles 10, 11 is selected such that they fill 20% -50% of the cross section of the microfluidic channel 7.
  • the width 21 and height 22 of the individual Strö ⁇ mung barriers 10, 11 is typically at least 10% of the microfluidic channel width 23.
  • the typical Mikrofluidkanal- width 23 is 50 to 500 pm. In this example, the microfluidic channel width 23 is 100 pm.
  • the distance between the two flow obstacles 10, 11 to one another depends on the microfluidic channel width 23 and is typically in a range of half to double microfluidic channel width 23.
  • the number of flow obstacles can vary, but is at least one.
  • FIG. 2 shows a second exemplary embodiment for the initiation of the rotation of the cells 2, 3, 4, 5.
  • a first carrier liquid 14 by means of the first inlet channel 19 and a second carrier fluid 15 are guided by means of the second inlet channel 20 in the Mikrofluidka- nal. 7
  • the inflow channels are arranged orthogonal to the longitudinal axis of the microfluidic channel 7.
  • the sectional view CC 'of the fluid channel 7 shows that the first carrier liquid is supplied below the second carrier liquid.
  • ⁇ by a turbulence of the biological sample 1 in Mik ⁇ rofluidkanal 7 is generated.
  • this device for rotating the cells is arranged in the microfluidic channel 7 in such a way that the cells rotate, particularly in the image field 8. Again, the supply of the biological sample 1 is carried out continuously.
  • the carrier liquid typically used is isotonic salinity water.
  • the ratio of the volume of the first or second carrier fluid 14, 15 to the volume of the biological sample is at least one.
  • the biological sample itself can act as a carrier fluid 14, 15.
  • the process is carried out under physiological conditions, that is the temperature is 37 ° C.
  • temperatures in the range from 1 ° C. to 99 ° C., in particular from 20 ° C. to 40 ° C., for the analysis of the cells.
  • the flow rates of the carrier liquids 14, 15 and the biological sample 1 in this example are 100 pm / s.
  • the flow rates are at least 0.1 pm / s and, in particular, in a range between 10 pm/s to 1000pm / s.
  • Figures 3 and 4 show, respectively, the image field 8 of the digi ⁇ talholographischen microscope 6.
  • a first image plane 9 is intended here as an example for analyzing a first mature erythrocyte 2.
  • Any image plane is freely selectable by digital focusing with the digital holographic microscope 6. This means in particular that a cell 2, 3, 4, 5 need not remain in the same image plane. It can be positioned in differing ⁇ chen image planes 9 by the rotie--saving movement at different times.
  • different cells can be analyzed 2,3,4,5 ⁇ ⁇ where the same image.
  • the exposure time of the individual images is typically very short to avoid motion blur.
  • the spacing of two images should be selected such that at least two images are captured while cell 2,3,4,5 passes through image field 8.
  • the flow rate is 100pm / s, which is frame size
  • the exposure time is in particular shorter than 1 ms, so that the motion blur is less than 1 pm.
  • the temporal distance between two images is less than 100 ms, in particular ⁇ sondere less than 10ms, more than two images, ie,
  • Figure 4 shows the position of the mature red blood cell 2 at the time t2 in the frame 8.
  • Figure 5 shows an example of a first and a second micrograph 16, 17 at the time ⁇ points tl and t2 of the mature erythrocytes 2.
  • the image plane 9 is here therefore to the Mature RBCs 2 focused.
  • a further image plane in this example also the dysmorphic erythrocyte 3 and the leukocyte 4

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein in-vitro-Verfahren und eine Zelldarstellungsvorrichtung zur Darstellung von Zellen, insbesondere von Zelltopographien, oder von Kristallen in einer biologischen Probe. Eine biologische Probelösung mit wenigstens einer Zelle oder wenigstens einem Kristall wird in einen mikrofluidischen Kanal geführt. Die Zelle oder der Kristall wird im mikrofluidischen Kanal zum Rotieren gebracht. Es werden dann zwei zeitlich aufeinander folgende Bilder derselben Zelle oder desselben Kristalls aus unterschiedlichen Orientierungen mittels einer Mikroskopiervorrichtung erzeugt.

Description

Beschreibung
Vorrichtung und in-vitro Verfahren zur markierungsfreien Dar¬ stellung und Analyse von Zellen und Kristallen in einer bio- logischen Probe
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein in-vitro Ver¬ fahren zur markierungsfreien Darstellung und Analyse von Zelltopographien und Zelltypen unter Verwendung einer
Mikroskopiervorrichtung.
Die Darstellung von biologischen Proben, insbesondere von Zellen, Bakterien oder Partikeln in Suspension ist von beson¬ derer Bedeutung, wenn diese Proben identifiziert, klassifi- ziert und ggf. sortiert werden müssen.
Insbesondere das Bestimmen von Zellen und deren Zuordnung zu einem Zelltyp ist in der Zytologie von großer Bedeutung. In hamatologischen Untersuchungen werden beispielsweise zellulä- re Blutkomponenten, wie Erythrozyten, Thrombozyten und weiße Blutzellen bestimmt und quantifiziert. Die weißen Blutzellen werden nach granulären Zellen, wie beispielsweise
Neutrophile, Eosinophile und Basophile, und nach nicht granulären Zellen, beispielsweise Lymphozyten oder Monozyten differenziert. Rote Blutkörperchen werden je nach Reife in Reticulozyten und reife Erythrozyten eingeteilt.
Für die Differenzierung von granulären Zellen, insbesondere von Eosinophilen und Basophilen, wird eine Färbung einge- setzt. Die Auswertung der Zellpopulationen erfolgt üblicher¬ weise durch vollautomatisierte Hämatologie-Analysatoren oder durch Mikroskopie. Die Analyse in vollautomatisierten Analy¬ satoren erfolgt nach festgesetzten Algorithmen. Dies führt jedoch dazu, dass in Proben mit pathologischen Populationen Fehlermeldungen angezeigt werden. Daher werden im nächsten
Schritt üblicherweise Mikroskopaufnahmen der Zellen als Vali¬ dierungsmethode ausgewertet. Dieser Schritt ist aufwendig und kostenintensiv, da er in der Probenvorbereitung, Mikroskopie und weiteren Bearbeitungsschritten manuelle Bewertung erfor¬ dert .
Eine Analyse von unterschiedlichen Zelltypen ist ebenfalls in der Urinanalyse nötig. Die Urinsedimentanalyse ist eine etab¬ lierte in-vitro Diagnostikmethode zur Bestimmung von Nieren¬ störungen und Störungen des Urogenitaltraktes. Die Urinprobe wird typischerweise zentrifugiert , der Überstand verworfen und das Sediment wieder resuspendiert. Anschließend wird die Probe mittels eines Phasenkontrastmikroskops untersucht. Wei¬ terhin können zelluläre Elemente mittels der Sternheimer- Malvin-Färbung dargestellt werden. Mit polarisiertem Licht ist es möglich, doppelbrechende Elemente, wie beispielsweise Harnsäurekristalle, Lipidtröpfchen oder ovale Fettkörnchen nachzuweisen. Auch hier müssen die Probenvorbereitung, Mikro¬ skopie und weitere Arbeitsschritte inklusive der Auswertung manuell erfolgen. Dies ist aufwendig und kostenintensiv.
Auch in der quantitativen Blut zelldiagnostik kann auf ein Hä- matologie-Analysator verzichtet werden und stattdessen jede Einzelzelle mikroskopiert werden. Dann ist es möglich, das Blutbild unabhängig von festen Algorithmen quantitativ zu be¬ stimmen. Von Nachteil ist allerdings, dass der Probendurch¬ satz deutlich geringer als bei einem Hämatologie-Analysator ist. Weiterhin bleibt der Aufwand, die Zellen auf Objektträ¬ gern zu immobilisieren und zu färben weiterhin bestehen.
Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe ist folglich das Bereitstellen eines effizienten und zeitsparenden Verfahrens zum Darstellen von Zellen und Kristallen in biologischen Pro¬ ben .
Diese Aufgabe wird von dem erfindungsgemäßen Verfahren und der erfindungsgemäßen Zelldarstellungsvorrichtung gemäß den unabhängigen Patentansprüchen gelöst. Vorteilhafte Weiterbil¬ dungen der Erfindung sind durch die Unteransprüche gegeben. Das erfindungsgemäße in-vitro-Verfahren zur Darstellung von Zellen, insbesondere von Zelltopographien, oder von Kristal¬ len in einer biologischen Probe erfolgt in mehreren Schrit¬ ten. Eine biologische Probelösung mit wenigstens einer Zelle und/oder wenigstens einem Kristall wird in einen mikrofluid¬ ischen Kanal geführt. Die Zelle und/oder der Kristall wird im mikrofluidischen Kanal mittels einer ersten Vorrichtung zum Rotieren gebracht. Es werden dann zwei zeitlich aufeinander folgende Bilder derselben Zelle und/oder des Kristalls mit- tels einer Mikroskopiervorrichtung erzeugt.
Die Erfindung umfasst weiterhin eine Zelldarstellungsvorrich¬ tung zur Analyse von Zellen und/oder Kristallen in einer bio¬ logischen Probe. Diese Zelldarstellungsvorrichtung umfasst einen mikrofluidischen Kanal zum Aufnehmen der biologischen Probe, eine erste Vorrichtung zur Initiierung einer Rotation einer biologischen Zelle und/oder eines Kristalls im mikro- fluidischen Kanal, und eine Mikroskopiervorrichtung zum Ab¬ bilden der Zelle und/oder des Kristalls. Die
Mikroskopiervorrichtung ist derart ausgebildet, dass sie we¬ nigstens zwei Bilder derselben Zelle und/oder desselben Kris¬ talls erzeugen kann.
Vorteilhaft ist es mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens und der Zelldarstellungsvorrichtung möglich, die Zelle und/oder Kristalle aus unterschiedlichen Perspektiven darzu¬ stellen, insbesondere zu fotografieren. Somit können Kristal¬ le und Zellen, insbesondere pathologisch veränderte Zellen, analysiert und klassifiziert werden. Urinproben umfassen ty- pischerweise Kristalle. Es ist bei Urinproben ebenso möglich, dass sowohl Zellen, wie beispielsweise rote oder weiße Blut¬ körperchen, als auch Kristalle in einer biologischen Probe auftreten. In Blutproben sind typischerweise ausschließlich Zellen unterschiedlicher Zelltypen enthalten, welche analy- siert werden. Ein Zell- oder Kristallnachweis ist ausschlie߬ lich aufgrund der morphologischen Beschaffenheit der Zelle oder des Kristalls möglich. Die Rotation insbesondere der Zelle in Kombination mit einer Mikroskopiervorrichtung ermög- licht das Abbilden der Zelle mit dem optischen System aus verschiedenen Orientierungen. Die Zellen sind somit gut dif¬ ferenzierbar, insbesondere nach einer Rekonstruktion. Insbe¬ sondere Zellen mit optisch auffälligen dreidimensionalen Strukturen, wie beispielsweise ausgeprägten Organellen, Granulae oder spezielle Zellformen wie Erythrozyten und
Megakariozyten, lassen sich aus verschiedenen Winkeln dar¬ stellen, wobei die Mikroskopiervorrichtung fixiert ist. Die Zellen oder Kristalle verbleiben in ihrer nativen Umge¬ bung, wodurch vorteilhaft Artefakte von beispielsweise Trock¬ nung und Färbung verhindert werden. Dies ermöglicht eine schnelle und wenig aufwendige Probenpräparation, die idealer¬ weise für Point-of-Care-Anwendungen einsetzbar ist. Für die Analyse von Urin ist keine Sedimentationsanalyse notwendig. Bereits mit einem geringen Probenvolumen können Zellen und/oder Kristalle im Urin in ihrer nativen Umgebung analy¬ siert werden, da sie aus verschiedenen Richtungen abgebildet werden .
In einer vorteilhaften Ausgestaltung und Weiterbildung der Erfindung wird eine dreidimensionale Abbildung einer Zell¬ oberfläche, d. h. der Zelltopographie der Zelle, oder eine Kristalloberfläche aus den wenigstens zwei Bildern der Zelle mittels einer Prozessoreinheit berechnet. Vorteilhaft ermög¬ licht das dreidimensionale Modell der Zelle eine Klassifizie¬ rung in beispielsweise pathologische und nicht-pathologische Zelltypen. Weiterhin ist die Unterscheidung reifer Erythrozy¬ ten und Reticulozyten möglich.
In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung und Weiterbil¬ dung der Erfindung wird die Rotation der Zelle hydrodynamisch mittels einer gezielten Strömung initiiert. Diese gezielte Strömung ist insbesondere eine Wirbelströmung, die die Zelle in Relation zur Mikroskopiervorrichtung rotiert, derart, dass die Mikroskopiervorrichtung die Zelle oder den Kristall aus unterschiedlichen Perspektiven aufnehmen kann ohne ihre eigen Position zu verändern. Die Zellen oder im Fall der Urinana- lyse auch die Kristalle, werden berührungslos manipuliert und können somit vorteilhaft in ihrer nativen Umgebung verblei¬ ben. Die Rotation ist insbesondere durch die Strömungsge¬ schwindigkeit der biologischen Probe durch den mikrofluid- ischen Kanal einzustellen. Vorteilhaft werden weiterhin
Zentrifugationsaggregate, insbesondere von Kristallen, bei der Urinsedimentationsanalyse vermieden. Durch das kontinu¬ ierliche Führen von biologischer Probe durch den mikrofluid- ischen Kanal, kann die Analyse vorteilhafterweise solange dauern, bis eine minimale Anzahl von partikulären Komponenten des Urins oder Bluts analysiert ist. In Abhängigkeit der Durchflussgeschwindigkeit kann anschließend auf insbesondere die Erythrozytenzahl zur Klassifizierung zurückgeschlossen werden .
In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird die Strömung mittels wenigstens eines Strömungshinder¬ nisses im mikrofluidischen Kanal erzeugt. Ebenso kann die Strömung mithilfe der Zufuhr einer Trägerflüssigkeit in einem bestimmten Winkel zu der Längsachse des mikrofluidischen Ka¬ nals erzeugt werden. Dieser Winkel ist insbesondere ein rech¬ ter Winkel.
In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung und Weiterbil- dung der Erfindung werden die Zellen ungefärbt analysiert. Sie können somit vorteilhaft in ihrer nativen Umgebung ohne Artefakte von Trocknung und Färbung analysiert werden. Daher ist vorteilhaft eine kontinuierliche Analyse von Probelösung im mikrofluidischen Kanal möglich.
In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung und Weiterbil¬ dung der Erfindung ist die Mikroskopiervorrichtung ein digi¬ tal-holographisches Mikroskop. Der Einsatz eines digitalho¬ lographischen Mikroskops erlaubt es, die Phaseninformation des Objekts quantitativ zu erfassen. Diese Mikroskopie- Methode ermöglicht eine besonders hohe axiale Auflösung. Axi¬ al bedeutet in der Richtung der optischen Achse des Mikro¬ skops. Eine digital-holographische Mikroskopie ermöglicht ei- ne Auflösung von bis zu einem Nanometer in z-Richtung. Dies entspricht einer Präzision, die um einen Faktor 100 bis 1000 höher liegt als mit anderen bekannten lichtmikroskopischen Verfahren. Aufgrund der präzisen Ermittlung eines Dickenpro- fils der Zelle gegenüber dem umgebenden Medium ist eine ge¬ nauere Bestimmung des Zelltyps möglich. Als umgebendes Medium wird hier insbesondere die Trägerflüssigkeit im mikrofluid- ischen Kanal bezeichnet. Der Einsatz des digital-holographischen Mikroskops ist wei¬ terhin besonders für das Fokussieren von sich in Rotation be¬ findlichen Objekten von großem Vorteil. Da die Position der Zelle oder des Kristalls in z-Richtung, d.h. entlang der op¬ tischen Achse des Mikroskops, nicht genau bekannt ist, kann die Zelle nachträglich durch Computer-Rekonstruktion des auf¬ genommenen Hologramms fokussiert werden. Dadurch wird ein aufwändiger Autofokus wie er bei einem herkömmlichen Mikro¬ skop nötig wäre, vermieden. Weiterhin ermöglicht das nach¬ trägliche, digitale Fokussieren das Berechnen unterschiedli- eher Foki für unterschiedliche laterale Positionen im Bild¬ feld. Das bedeutet, es können sich mehrere Zellen und/oder Kristalle gleichzeitig im Bildfeld des Mikroskops befinden und zeitgleich abgebildet werden. Insbesondere können sie auch dann abgebildet werden, wenn sich die Zellen nicht in einer Fokusebene befinden. Der Einsatz eines Konfokal-
Mikroskops zur Rekonstruktion der Zellen wird somit vermie¬ den. Ebenso wird vorteilhaft der Einsatz eines Polarisierers vermieden . Das digital-holographische Mikroskop kann optional mit
Leuchtdioden (LEDs) oder Laserdioden verschiedener Wellenlän¬ ge ausgerüstet sein. Dann können die Parameter Brechungsindex und physikalische Dicke der Objekte, insbesondere der Zellen, voneinander getrennt werden.
In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung und Weiterbil¬ dung der Erfindung ist das digital-holographische Mikroskop ein linsenfreies Mikroskop. Auf vorteilhafte Weise können dann mehrere mikrofluidische Kanäle auf einer Analyseeinheit, beispielsweise einem Chip, ausgewertet werden. Somit ist ein hoher Durchsatz von biologischen Proben zur Analyse möglich. Diese mehreren Mikrofluid-Kanäle können beispielsweise paral- lel auf einem Chip angeordnet sein.
In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung und Weiterbil¬ dung der Erfindung umfasst die Zelldarstellungsvorrichtung eine zweite Vorrichtung zum Erfassen von Mie- und/oder Ray- leigh-Streuung . Diese Daten können vorteilhaft zusätzlich zur Differenzierung der Objekte, insbesondere der Zellen, heran¬ gezogen werden.
In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung und Weiterbil- dung der Erfindung sind die Zelle und/oder der Kristall mit einem Farbstoff eingefärbt. Bereits die erste
Mikroskopiereinrichtung kann zur Abbildung des Farbstoffs, insbesondere des Fluoreszenzfarbstoffs ausgebildet sein. Al¬ ternativ umfasst die Zelldarstellungsvorrichtung eine zweite Mikroskopiervorrichtung als Fluoreszenzmikroskop. Das Einfär¬ ben, bzw. Markieren mit spezifischen Markierungen, insbeson¬ dere mit Fluorophor oder Streulichtmarkern, insbesondere Gold, und anschließende Analysieren der Zellen ermöglicht ein Differenzieren über die reine Morphologie hinaus. Das Markie- ren erfolgt insbesondere mittels Antikörpern, welche an spe¬ zifische Epitope der Zelle binden. Diese Epitope korrelieren wiederum mit einer Zellfunktionalität. Die Zelldarstellungs¬ vorrichtung mit genau einem ersten Mikroskop zur Abbildung von Farbstoffen kann einen Farbstoff in einer Zelle von ver- schiedenen Seiten abbilden. Eine Zelldarstellungsvorrichtung mit der ersten und der zweiten Mikroskopiervorrichtung kann insbesondere die Morphologie einer Zelle mit hoher Auflösung in z-Richtung bestimmen und den Farbstoff nachweisen. Die Erfindung wird nachfolgend anhand eines Ausführungsbei¬ spiels unter Bezugnahme auf die Zeichnungen noch weiter er¬ läutert. Es zeigen schematisch: Figur 1 eine schematische Darstellung des mikrofluid- ischen Kanals mit Mikroskopiervorrichtung und zwei Schnittbilder des mikrofluidischen Kanals,
Figur 2 ein weiteres schematisches Bild des fluidischen
Kanals mit Mikroskopiervorrichtung und einen zweiten Querschnitt des Fluidkanals,
Figur 3 einen Querschnitt durch den mikrofluidischen Ka¬ nal im Bildfeld der mikroskopischen Vorrichtung zum Zeitpunkt tl,
Figur 4 einen Querschnitt durch den mikrofluidischen Ka¬ nal im Bildfeld der Mikroskopiervorrichtung zum Zeitpunkt t2,
Figur 5 zwei Mikroskopaufnahmen zu den Zeitpunkten tl und t2.
Mithilfe des in-vitro-Verfahrens und der
Zelldarstellungsvorrichutng zur Analyse von Zellen und Kris¬ tallen kann ein markierungsfreies Bestimmen der biologischen Probe erfolgen. Markierungsfrei bedeutet hier, dass die Zel¬ len nicht durch beispielsweise Fluoreszenzfarbstoffe oder ra¬ dioaktive Partikel markiert werden müssen. Eine biologische Probe kann daher beispielsweise eine Probe tierischer oder pflanzlicher Zellen, bakterieller Zellen und/oder Einzeller umfassen. Weiterhin kann die biologische Probe tierische oder menschliche Urinproben umfassen. In der Blutanalyse handelt es sich vorzugsweise um Vollblutproben, die beispielsweise Blutzellen wie Leukozyten, eosinophile Granulozyten oder basophile Granulozyten umfasst.
In diesen Ausführungsbeispielen umfasst die biologische Probe 1, hier Blut, einen ersten reifen Erythrozyten 2, einen dysmorphen Erythrozyten 3, einen Leukozyten 4 und einen zwei¬ ten Erythrozyten 5. Die biologische Probe 1 wird in den Mik¬ rofluidkanal 7 geführt. Die Zelldarstellungsvorrichtung 18 dieses Beispiels umfasst weiterhin ein digitalholographisches Mikroskop 6. Das Bildfeld 8 des digitalholographischen Mikro¬ skops 6 zeigen die Figuren 3 bis 5. In allen Ausführungsbeispielen wird die biologische Probe 1 mittels des Mikrofluidkanals 7 an dem digitalholographischen Mikroskop 6 vorbeigeführt. Die Zufuhr der biologischen Probe 1 erfolgt somit kontinuierlich in den Mikrofluidkanal 7. Die Figuren 1 und 2 zeigen jeweils Vorrichtungen 10, 11, 19, 20, welche die Zellen in Rotation versetzen.
Figur 1 zeigt ein erstes Strömungshindernis 10 und ein zwei¬ tes Strömungshindernis 11. Diese sind in einem definierten Abstand zum Bildfeld 8 des Mikroskops 6 angeordnet. Der Ab- stand ist derart, dass die Rotation der Zellen 2,3,4,5 im
Bildfeld 8 erfolgt. Die Schnittbilder AA x und BB x zeigen zwei typische Strömungshindernisse 10 und 11 in dem Mikrofluidka¬ nal 7. Sie sind versetzt zueinander im Mikrofluidkanal 7 an¬ geordnet, um die eine Wirbelströmung der biologischen Probe 1 zu erzeugen.
Das erste Strömungshindernis 10, das zweite Strömungs- hinderniss 11 und der mikrofluidische Kanal 7 werden typi¬ scherweise aus demselben Material hergestellt. Insbesondere werden die Hindernisse 10, 11 und der mikrofluidische Kanal 7 in demselben Prozessschritt hergestellt. Die Herstellung er¬ folgt mittels Heiß-Stempeln ( engl, „not embossing") oder al¬ ternativ mittels Spritzgießen. Als Materialen werden transpa¬ rente Polymere verwendet. Diese Polymere sind typischerweise Polymethylmethacrylat (PMMA) , Polyethylen, Polyethylenglycol , Polydimethylsiloxan, Polycarbonate, Polyetylenterephthalat (PET), Polystyrol oder Glas.
Die Dimension der Strömungshindernisse 10, 11 wird derart ge- wählt, dass sie 20%-50% des Querschnitts des Mikrofluidkanals 7 ausfüllen. Die Breite 21 und Höhe 22 der einzelnen Strö¬ mungshindernisse 10, 11 beträgt typischerweise wenigstens 10% der Mikrofluidkanalbreite 23. Die typische Mikrofluidkanal- breite 23 beträgt 50 bis 500 pm. In diesem Beispiel beträgt die Mikrofluidkanalbreite 23 100 pm. Der Abstand der beiden Strömungshindernisse 10, 11 zueinander ist abhängig von der Mikrofluidkanalbreite 23 und liegt typischerweise in einem Bereich von halber bis doppelter Mikrofluidkanalbreite 23. Die Anzahl der Strömungshindernisse kann variieren, beträgt aber wenigstens eins.
Figur 2 zeigt ein zweites Ausführungsbeispiel für die Ini- tiierung der Rotation der Zellen 2,3,4,5. In diesem Ausfüh¬ rungsbeispiel werden eine erste Trägerflüssigkeit 14 mittels des ersten Zuflusskanals 19 und eine zweite Trägerflüssigkeit 15 mittels des zweiten Zuflusskanals 20 in den Mikrofluidka- nal 7 geführt. Die Zuflusskanäle sind dabei orthogonal zur Längsachse des Mikrofluidkanals 7 angeordnet. Das Schnittbild CC ' des Fluidkanals 7 zeigt, dass die erste Trägerflüssigkeit unterhalb der zweiten Trägerflüssigkeit zugeführt wird. Hier¬ durch wird eine Verwirbelung der biologischen Probe 1 im Mik¬ rofluidkanal 7 erzeugt. Wiederum ist diese Vorrichtung zur Rotation der Zellen derart im Mikrofluidkanal 7 angeordnet, dass die Zellen besonders im Bildfeld 8 rotieren. Auch hier erfolgt die Zufuhr der biologischen Probe 1 kontinuierlich.
Als Trägerflüssigkeit wird typischerweise Wasser mit isotoni- schem Salzgehalt verwendet. Das Verhältnis vom Volumen der ersten oder zweiten Trägerflüssigkeit 14, 15 zu dem Volumen der biologischen Probe beträgt wenigstens eins. Alternativ kann auch die biologische Probe selber als Trägerflüssigkeit 14, 15 fungieren. Typischerweise erfolgt das Verfahren unter physiologischen Bedingungen, das heißt die Temperatur beträgt 37 °C. Es können aber ebenso Temperaturen in einem Bereich von 1°C bis 99°C, insbesondere von 20°C bis 40°C, für die Analyse der Zellen gewählt werden. Die Strömungsgeschwindigkeiten der Trägerflüssigkeiten 14, 15 und der biologischen Probe 1 be- tragen in diesem Beispiel 100 pm/ s . Typischerweise betragen die Strömungsgeschwindigkeiten wenigsten 0,1 pm/ s und liegen insbesondere in einem Bereich zwischen 10pm/s bis 1000pm/s. Die Figuren 3 und 4 zeigen jeweils das Bildfeld 8 des digi¬ talholographischen Mikroskops 6. Es sind beispielhaft vier Bildebenen 9 des digitalholographischen Mikroskops 6 darge¬ stellt. Eine erste Bildebene 9 soll hier als Beispiel für das Analysieren eines ersten reifen Erythrozyten 2 dienen. Jede beliebige Bildebene ist durch das digitale Fokussieren mit dem digital-holographischen Mikroskop 6 frei wählbar. Dies bedeutet insbesondere, dass eine Zelle 2, 3, 4, 5 nicht in derselben Bildebene bleiben muss. Sie kann durch die rotie- rende Bewegung zu unterschiedlichen Zeiten in unterschiedli¬ chen Bildebenen 9 positioniert sein. Weiterhin können in dem¬ selben Bild unterschiedliche Zellen 2,3,4,5 analysiert wer¬ den . Die Belichtungszeit der einzelnen Bilder ist typischerweise sehr kurz, um Bewegungsunschärfe zu vermeiden. Der Abstand zweier Bilder sollte derart gewählt sein, dass wenigstens zwei Bilder aufgenommen werden, während die Zelle 2,3,4,5 das Bildfeld 8 passiert. In diesem Beispiel beträgt die Strö- mungsgeschwindigkeit 100pm/s, die Bildfeldgröße beträgt
200pm, typisch für ein 40fach Objektiv.
Die Belichtungszeit ist insbesondere kürzer als 1 ms, damit die Bewegungsunschärfe kleiner 1 pm ist. Der zeitliche Ab- stand zwischen zwei Bildern beträgt weniger als 100ms, insbe¬ sondere weniger als 10ms, um mehr als zwei Bilder, d.h.
Mikroskopieaufnahmen machen zu können.
Figur 4 zeigt die Position des reifen Erythrozyten 2 zum Zeitpunkt t2 im Bildfeld 8. Figur 5 zeigt beispielhaft eine erste und eine zweite Mikroskopieaufnahme 16, 17 zu den Zeit¬ punkten tl und t2 des reifen Erythrozyten 2. Die Bildebene 9 wurde hier also auf den reifen Erythrozyten 2 fokussiert. Mittels einer weiteren Bildebene können in diesem Beispiel auch der dysmorphen Erythrozyt 3 und der Leukozyt 4
abbgebildet werden.

Claims

Patentansprüche
1. In-vitro Verfahren zur Darstellung von Zellen (2,3,4,5) oder Kristallen in einer biologischen Probe 1 mit folgenden Schritten:
- Führen der biologischen Probe (1) mit wenigstens einer Zel¬ le (2,3,4,5) und/oder einem Kristall in einen mikrofluid- ischen Kanal (7),
- Initiieren einer Rotation der Zelle (2,3,4,5) und/oder des Kristalls im mikrofluidischen Kanal (7) mittels einer ersten Vorrichtung (10, 11, 19, 20),
- Erzeugen wenigstens zweier zeitlich aufeinander folgender Bilder (16, 17) derselben Zelle (2, 3, 4, 5) und/oder dessel- ben Kristalls mittels einer Mikroskopiervorrichtung (6).
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei eine dreidimensionale Ab¬ bildung einer Zelloberfläche der Zelle (2, 3, 4, 5) oder ei¬ ner Kristalloberfläche aus den wenigstens zwei Bildern (16, 17) der Zelle (2) mittels einer Prozessoreinheit berechnet wird .
3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei anhand der Bilder ein Zelltyp, insbesondere ein dysmorpher Zelltyp, ermittelt wird.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Rotation der Zelle (2, 3, 4, 5) oder des Kristalls hydro¬ dynamisch mittels einer gezielten Strömung, insbesondere Wir- belströmung, der biologischen Probe (1) initiiert wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Strömung mittels we¬ nigstens eines Strömungshindernisses (10, 11) im mikrofluid- ischen Kanal (7) erzeugt wird.
6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, wobei die Strömung mit Hilfe der Zufuhr einer Trägerflüssigkeit (14, 15) in einem bestimmten Winkel, insbesondere rechtwinklig, zu einer Längs¬ achse des mikrofluidischen Kanals (7) erzeugt wird.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Zelle (2, 3, 4, 5) und/oder der Kristall ungefärbt analy¬ siert werden.
8. Zelldarstellungsvorrichtung (18) zur Analyse von Zellen (2,3,4,5) und Kristallen in einer biologischen Probe (1), um- fassend:
- einen mikrofluidischen Kanal (7) zum Aufnehmen einer biolo¬ gischen Probe (1) mit wenigstens einer Zelle (2,3,4,5) und/oder einem Kristall,
- eine erste Vorrichtung zur Initiierung einer Rotation (10, 11, 19, 20) der Zelle (2,3,4,5) und/oder des Kristalls im mikrofluidischen Kanal (7),
- eine Mikroskopiervorrichtung zum Abbilden der Zelle
(2,3,4,5) und/oder des Kristalls, wobei die
Mikroskopiervorrichtung (6) derart ausgebildet ist, wenigs- tens zwei Bilder (16, 17) derselben Zelle (2) zu erzeugen.
9. Zelldarstellungsvorrichtung (18) nach Anspruch 8 mit einer Prozessoreinheit zum Berechnen einer dreidimensionalen Abbil¬ dung einer Zelloberfläche der Zelle (2, 3, 4, 5) oder einer Kristalloberfläche aus den wenigstens zwei Bildern (16, 17) der Zelle (2) .
10. Zelldarstellungsvorrichtung (18) nach Anspruch 8 oder 9, wobei die Mikroskopiervorrichtung ein digitalholographisches Mikroskop (6) ist.
11. Zelldarstellungsvorrichtung nach Anspruch 10, wobei das digitalholographisches Mikroskop (6) ein linsenfreies Mikro¬ skop ist.
12. Zelldarstellungsvorrichtung (18) nach einem der Ansprüche 8 bis 11 mit einer zweiten Vorrichtung zum Erfassen von Mie- und /oder Rayleigh-Streuung .
13. Zelldarstellungsvorrichtung (18) nach einem der Ansprüche 8 bis 12, wobei die Zelle (2,3,4,5) und/oder der Kristall mit einem Farbstoff eingefärbt ist.
14. Zelldarstellungsvorrichtung (18) nach einem der Ansprüche 8 bis 13 mit einem Fluoreszenzmikroskop als einer zweiten Mikroskopiervorrichtung .
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