WO2015142218A1 - Bicyclic pyrimidines and use thereof as antioxidants and cytoprotectors - Google Patents

Bicyclic pyrimidines and use thereof as antioxidants and cytoprotectors Download PDF

Info

Publication number
WO2015142218A1
WO2015142218A1 PCT/RU2015/000122 RU2015000122W WO2015142218A1 WO 2015142218 A1 WO2015142218 A1 WO 2015142218A1 RU 2015000122 W RU2015000122 W RU 2015000122W WO 2015142218 A1 WO2015142218 A1 WO 2015142218A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
compound
compounds
nrf2
stroke
formula
Prior art date
Application number
PCT/RU2015/000122
Other languages
French (fr)
Russian (ru)
Inventor
Александр Александрович ШУЛЬЖЕНКО
Original Assignee
Общество с ограниченной ответственностью "Алион"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Общество с ограниченной ответственностью "Алион" filed Critical Общество с ограниченной ответственностью "Алион"
Publication of WO2015142218A1 publication Critical patent/WO2015142218A1/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D487/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00
    • C07D487/02—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00 in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D487/04—Ortho-condensed systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/06—Free radical scavengers or antioxidants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D495/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D495/02—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D495/04—Ortho-condensed systems

Definitions

  • the invention relates to medicine, specifically to neurology, cardiology, as well as surgery and traumatology, namely, drugs with cytoprotective activity in conditions of ischemia-reperfusion, chronic oxidative stress and chemical intoxication.
  • Stroke is a clinical syndrome characterized by sudden onset of clinical symptoms, indicating focal and / or cerebral neurological deficiency, developing as a result of cerebral ischemia or hemorrhage. Every year in highly developed countries among every 10,000 people, 25-30 cases of stroke occur. The economic loss from a stroke in the United States is about $ 30 billion a year. Over 400 thousand strokes occur in Russia, which is equal in number to the population of the average regional city. Among the survivors, the majority have various functional disorders: by the end of the acute period, almost 80% of patients have motor disorders (most often these are paresis of varying severity), more than a third of patients have speech disorders.
  • ischemic cerebral infarction, softening of the brain
  • hemorrhagic cerebral hemorrhage, intracerebral hematoma
  • ischemic strokes account for 80% of all strokes, intracerebral hemorrhages - 17%, subarachnoid hemorrhages - 3%.
  • ischemic penumbra penumbra
  • the formation of 50% of the final volume of a heart attack occurs within the first 90 minutes from the moment of the development of a stroke, 70-80% - within 360 minutes, in connection with which the first 3-6 hours of the disease are called the “therapeutic window”, inside which therapeutic measures can to be most effective by saving the penumbra zone.
  • oxidative damage (changes in glutamate and calcium metabolism, free radical reactions, lipid peroxidation, excessive formation of nitric oxide, etc.) continues further, leading to "long-term consequences of ischemia.” Delayed damage to cerebral tissue is realized through the mechanisms of programmed cell death - apoptosis and aponecrosis. “Long-term consequences of ischemia” cause “deformation” of cerebral infarction due to the spread of damage from the peri-infarction zone to the periphery of the penumbra. The time of "deformation” of heart attacks in each case is individual, ranging from 3 to 7 days after cerebrovascular accident.
  • ischemic stroke The basis of specific therapy for ischemic stroke are two strategic directions: reperfusion and neuroprotection, aimed at protecting weakly or almost non-functioning, but still viable neurons located around the hearth site (ischemic penumbra).
  • the main cerebral thrombolytics are recognized as urokinase, streptokinase and their derivatives, as well as tissue plasminogen activator (tPA). The latter is used only in 4% of cases, due to the possible threat of cerebral hemorrhage.
  • Neuroprotective properties have: postsynaptic glutamate receptor antagonists (not yet available in clinical practice); presynaptic glutamate inhibitors (lubeluzole); antioxidants (alpha-tocopherol, carnosine, mexidol, mildronate, vitamin E, ascorbic acid); calcium channel blockers (nimodipine); drugs of predominantly neurotrophic action (piracetam, cerebrolysin, glycine, picamilon) and others.
  • Nrf2 nuclear factor (erythroid-derived 2) -like 2) is the main regulator of the antioxidant response at the cellular level. Nrf2 binds to the so-called an antioxidant response element (ARE) in the promoter region of the genes of the antioxidant response program responsible for the detoxification of xenobiotics and the neutralization of reactive oxygen species (ROS).
  • ARE antioxidant response element
  • ROS reactive oxygen species
  • Nrf2 s the most active thiols of the Keapl dimer
  • the complex decomposes, Nrf2 stabilizes and is sent to the nucleus, where it interacts with ARE-containing promoters and thereby includes protein synthesis with antioxidant protection.
  • the beneficial effects of Nrf2 activation have been demonstrated in various pathologies such as diabetes [Zheng N., Whitman S. A., Wu W. et al. / Therapeutic potential of Nrf2 activators in streptozotocin-induced diabetic nephropathy // Diabetes.
  • Nrf2 activation protects brain ischemia-reperfusion [Wang B., Cao W., Biswal S., Dore S. .. / Carbon monoxide-activated Nrf2 pathway leads to protection against permanent focal cerebral ischemia. // Stroke.
  • Nrf2 activation has been recently shown [Shen X. D., Ke B., Ji N. et al. / Disruption of type-l I FN pathway ameliorates preservation damage in mouse orthotopic liver transplantation via HO-1 dependent mechanism // The American Journal of Transplantation. -2012, -v.12, -N.7, - p.1730-1739; Mohammadzadeh M., Halabian R., Gharehbaghian A. et al. / Nrf-2 overexpression in mesenchymal stem cells reduces oxidative stress-induced apoptosis and cytotoxicity // Cell Stress and Chaperones.
  • Nrf2 Liver from old donors has a lower level of Nrf2, which worsens the clinical performance of a liver transplant [Zaman M.V., Leonard M.O., Ryan EJ, Nolan NP, Hoti E., Maguire D., et al. / Lower expression of Nrf2 mRNA in older donor livers: a possible contributor to increased ischemia-reperfusion injury? // Transplantation. -2007, -84, -p.1272-1278].
  • Nrf2 The activation of Nrf2, as it has been found out relatively recently, antagonizes the inflammatory cascades initiated by TGF i [Oh C. J., Kim J. Y., Min A. K. et al. / Sulforaphane attenuates hepatic fibrosis via NF-E2-related factor 2-mediated inhibition of transforming growth factor-p / Smad signaling. // Free Radical Biology and Medicine, -2012, -v.52, - N.3, -p.671-682) and NF- ⁇ (Jiang J., Mo Z. C, Yin K. et al.
  • Nrf2 activators both compounds have a pronounced ability to alkylate (covalent modification of active thiol groups in proteins).
  • dimethyl fumarate developed by BioGen for the treatment of multiple sclerosis, BG-12
  • bardoxolone developed by Reata Pharmaceuticals and sold by Abbott Laboratories
  • patent application EP1813269 (A1) - 2007-08-01 describing pharmaceutical agents capable of activating the Nrf2 transcription factor for use in the treatment, prevention, or alleviation of a disease or condition that can be treated, prevented, or improve upon activation of Nrf2 transcription factors (e.g., atherosclerosis, hypertension, diabetes, nervous degenerative diseases, skin diseases, eye diseases, asthma and cancer). Agents increase the potential for protection against oxidative stress.
  • the objective of the present invention is to develop new agents that activate the antioxidant program and that can be used as effective cytoprotectors in a variety of adverse effects on body cells.
  • Ri is a substituent: methoxy, ethoxy, linear or branched alkyl (C G C), halogen, mono-, di-, tri- (C 4 ) alkylamino;
  • R 2 represents a halogen
  • Halogen can be selected from chlorine, bromine, iodine, fluorine. Most preferably represents chlorine.
  • EFFECT absence of suppression of activation of the antioxidant program induced by compounds of formula (1) with the addition of thiol reducing agents such as glutathione and cysteine, and the possibility of combining the drug with stoichiometric antioxidants without compromising the main effect.
  • the compounds of general formula I are stabilizers of the transcription factor Nrf2 and thus activators of the antioxidant program, the trigger of which is Nrf2.
  • the compounds of formula I induce the synthesis of proteins and phase II antioxidant defense enzymes such as hemoxygenase-1 and NADPH: XHHOH oxidoreductase and the rest, leading to a strong increase in the content of reduced glutathione in the tissues.
  • Compounds I have the ability to increase tissue viability in conditions of ischemia-reperfusion (transplantation of organs, stem cells, stroke, heart attack), chronic degeneration associated with oxidative stress (neurodegenerative diseases, renal failure); chemical intoxication of various nature, including the protection of normal cells during chemotherapy for cancer and thereby reducing the side effects of chemotherapy (for example, doxirubicin on the heart).
  • Compounds I can be used proactively to increase the body's defenses before working with toxic chemicals and high doses of radiation.
  • the compounds of formula I are commercially available (for example, from Alfa Aesar, Oakwood, http://www.alfa.com/en/catalog/H50537) or can be obtained by the following methods.
  • 4-chloro-3- (4-methoxyphenyl) -1 H-pyrazolo [3,4-c1] pyrimidine or 4-chloro-3-phenyl-1 H-pyrazolo [3,4-c1 can be mentioned ] pyrimidine.
  • 4-chloro-5- (4-methoxyphenyl) -7H-pyrrolo [2,3-!] Pyrimidine or 4-chloro-5-phenyl-7H-pyrrolo [2,3-c1] pyrimidine can be mentioned .
  • Another object is a cytoprotective and antioxidant pharmaceutical composition containing, as an active principle, an activator of the transcription factor Nrf2, which is a derivative of bicyclic pyrimidines of the general formula (I), or a pharmaceutically acceptable salt thereof in an effective amount and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • pharmaceutically acceptable salt is intended to indicate salts that are not harmful to the patient.
  • Such salts include salts of pharmaceutically acceptable acids, for example, salts of inorganic and organic acids, and amino acids. Examples of inorganic acids include acids such as hydrochloric, hydrobromic, phosphoric, sulfuric, nitric.
  • a representative of suitable organic acids include acetic, trichloroacetic, benzoic, cinnamon, citric, fumaric, glycolic, lactic, maleic, malic, salicylic succinic, and glutathione, cysteine or its derivatives, and the like can be used.
  • an excipient or substances are selected depending on the appropriate form of administration (tablets, injections, solutions, emulsions, suppositories, capsules): water, lactose, sugar alcohols, cellulose derivatives, phosphates, stearates, talc, surfactant, PEG, PVP, alcohols, etc.
  • Fig. 1 Activation of the ARE-luciferase reporter by Compounds of formula (1).
  • Fig. 2 Increased level of messenger RNA genes when treated with 0.5 ⁇ M compounds of the formula 1: chloro-5- (4-methoxyphenyl) thieno [2,3-c1] pyrimidine (X1) and 4-chloro-5- (4-phenyl) thieno [2,3- C.] pyrimidine (X2).
  • Fig. 3 Antioxidant and hepatoprotective activity of Compound X2 in the model of acute toxic liver damage, a) a significant concentration-dependent decrease in the area of liver necrosis during administration of the compound of formula 1; b) a concentration-dependent decrease in lipid peroxidation in the presence of a compound of formula 1; C) - concentration-dependent restoration of the level of superoxide dismutase to normal during administration of the compounds of formula 1.
  • Fig. 4 The increase in cell viability when treated with a compound of formula (1) against the toxic effects of the main lipid peroxidation product, HNE: a) control pretreatment, 20 ⁇ M HNE; b) pretreatment control, 30 ⁇ m HNE;
  • Fig.5. The effect of compound X (X1) on apoptosis of cardiomyocytes in rats treated with doxorubicin.
  • the apoptotic index is expressed as the ratio of TUNEL-positive cardiomyocyte nuclei to their total number. Data are presented as mean (n> 10), * p ⁇ 0.01 of the control group, ** p ⁇ 0.01 DOX of the group.
  • Fig. 6 Normalization of the level of apoptotic (AP-1) and inflammatory (NF-KB) transcription factors during the treatment of X1 (Compound X) in case of kidney damage with cisplatin. Immunoblots (above) and their quantitative processing on a densitometer (below).
  • FIG. 7 A reliable concentration-dependent decrease in the area of myocardial infarction during ischemic stroke during administration of the Compound of formula (1) - Compound X1.
  • Fig. 8 Comparison of the neuroprotective activity of compounds X1 and X2 in a model of ischemic stroke at a dose of administration of 1 mg / kg: a decrease in the activation of NF-KB transcription factor, a trigger of the inflammatory response of the body.
  • ARE-luciferase reporter was reproduced according to the protocol [Wang XJ, Hayes JD, Wolf CRI Generation of a Stable Antioxidant Response Element-Driven Reporter Gene Cell Line and Its Use to Show Redox-Dependent Activation of Nrf2 by Cancer Chemotherapeutic Agents // Cancer Res - 2006; - 66: p. 10983-10994].
  • the pGL3 vector of the company Promega (Great Britain) containing the SV40 promoter in front of the firefly luciferase gene was used. Before the luciferase promoter, an insert was made at the Nhel and Xhol restriction sites of eight mouse ARE sequences:
  • a linker with the sequence 5-CCC-3 and 5-GGG-3 on the opposite chain was placed between the individual cis-elements.
  • the MCF7 cell line (human breast carcinoma) was transformed with the obtained construct in the presence of an orderly lower concentration of plasmid pcDNA3.1 containing a neomycin selection marker (antibiotic geneticin) using lipofectamine.
  • Transformed cells were selected on DMEM-glutamax medium with 10% FBS and antibiotics (including 0.8 mg / ml geneticin). Cells were cultured at 37 ° C in an incubator (95% air and 5% C0 2 ), reseeding every 3-4 days.
  • Compound X1 is the best activator (Fig. 1 A, 1 B), the main structural requirement is the presence of an aromatic substituent at position 5 of the bicycle, while the presence of a phenyl ring at position 7 of the bicycle (R3 in pyrrolopyrimidines) leads to a suppression of activation in the submicromolar range.
  • the combination of compounds of formula (I) with non-specific intracellular thiol reducing agents such as cysteine, acetylcysteine, or glutathione does not affect the activation parameters (Fig. 1 B), which is explained by the inability of the Compounds of formula (I) to alkylate these thiols in aqueous solutions of in vitro.
  • the compounds of formula 1 are activators of the ARE-luciferase reporter and therefore activators of the antioxidant genetic program on molecular level.
  • Example 2 we measured the activation effect of the best compounds on the content of messenger RNA of the two most significant genes regulated by Nrf2, namely hemoxygenase-1 and NADPH: XHHOH oxidoreductase-1.
  • NADPH XHHOH oxidoreductase 1 (NQ01, 5'-AGCGTTCGGTATTACGATCC-3 'and 5'-AGTAC AATCAGG G CTCTTCTCG-3') using Fast SYBR_ Green Master Mix (Invitrogen, USA).
  • PCR cycle parameters 10 sec at 95 ° C, then 1 min at 60 ° C. The values obtained were normalized to the level of beta-actin expression (primers for amplification of beta-actin: 5'-CTAAGGCCAACCGTGAAAAG-3 'and 5'-ACCAGAGGCATACAGGGACA-3').
  • the compounds of formula 1 activate the synthesis of hemoxygenase-1 and NADPH: XHHOH oxidoreductase-1, the main targets of Nrf2.
  • the degree of activation corresponds to the activity of the compounds in the reporter analysis (Fig. 1), namely, compound X1 shows better reporter activation than compound X2 (Example 1). In further experiments, these two compounds were used.
  • Antioxidant activity was tested in an in vivo experiment on a model of acute toxic liver damage with carbon tetrachloride (SSC).
  • SSC carbon tetrachloride
  • the experiment was conducted on 50 outbred male rats with an initial weight of 190-200 g contained in a standard diet of vivarium. There were 10 animals in each group.
  • Liver damage (experimental hepatitis) in animals was caused by the administration of SCC intragastrically as a 50% solution in liquid paraffin in a volume of 0.25 ml per 100 g of body weight for 3 days [Vengerovsky A. I., Chuchalin BC, Pauls O. V., Saratikov A.S. / Effect of hepatoprotectors on lipid metabolism in SSC - hepatitis. // Bull.
  • liver homogenates were homogenized in 50 mM sodium phosphate buffer containing 0.15 M sodium chloride, pH 7.4. The supernatant was separated by centrifugation at 15,000 g for 20 min, at 4 ° C. The level of lipid peroxidation in liver homogenates was determined according to the test with thiobarbituric acid (TAC) [Steel ID, Garishvili TG / Method for determination of malondialdehyde using thiobarbituric acid. // In: Modern methods in biochemistry. -M. -The medicine. -1977. -from. 66-69], conducting preliminary extraction of lipids according to Folch [Cates M. Technique of lipidology.- M.- Mir.- 1975.- p.
  • TAC thiobarbituric acid
  • Superoxide dismutase (SOD) activity was determined at 438 nm by reducing the absorption of the formazan product of the WST-1 oxidation by the superoxide radical generated by the xanthine / xanthine oxidase system in accordance with the protocol of BioLabs (USA). Protein in homogenates was determined by the Bradford method. The experimental results were processed statistically using Student's t-criterion [E. Gubler. Computational methods of analysis and recognition of pathological processes. -M. -The science. -1978. -from. 365]. Hepatoprotectonic activity was determined as follows. Liver samples were placed in plastic cassettes and filled with 4% paraformaldehyde for 48 hours.
  • liver damage was evaluated by measuring the area of necrosis section by section when stained with hematoxylin and eosin under a microscope. (Olympus BX51, Japan). Necrotic zones were determined visually and the percentage of necrosis was calculated using the Cell F v3.1 program, Olympus Soft Imaging Solutions, Munster, Germany.
  • Compound X2 has a hepatoprotective effect, which manifests itself in a significant decrease in the area of necrotic damage to the liver during acute carbon tetrachloride poisoning.
  • Fig. 36 The results presented in Fig. 36 indicate that administration of SSC to rats led to the accumulation of LPO products in the liver. In animals of the experimental groups, which were administered one of the studied compounds, a significant decrease in the content of primary lipid peroxidation products in the liver was noted.
  • Fig. Sv indicate that administration of SSC to rats led to a drop in the level of superoxide dismutase. In animals of the experimental groups, which were injected with one of the studied compounds, a significant increase in enzyme activity was noted up to the normal level.
  • the compound of general formula (1) has a pronounced antioxidant effect in the model of acute toxic liver damage.
  • ROS Active oxygen species
  • Neonatal ventricular myocytes from 1-2 day old outbred male rats were subjected to gradient centrifugation and differential seeding to enrich the culture with cardiomyocytes.
  • Cell viability was determined using a commercial kit (LIVE / DEAD Viability / Cytotoxicity Assay Kit, LifeTechnologies Corp., USA), the principle of which is based on the simultaneous determination of living and dead cells using calcein AM and ethidium homodimer-1, specific for intracellular esterase activity and membrane integrity, respectively. Fluorescence micrographs (living cells are stained green and dead cell nuclei are red) were obtained with a BZ-9000 fluorescence microscope (Keuepse, Japan).
  • cardiomyocytes were treated with 0.25 ⁇ M of compound X1 and a control that did not contain this substance, incubated for 14 hours and then treated with a cytotoxic concentration of HNE for 24 hours.
  • the viability of the control cardiomyocytes was 24.6% ⁇ 4.3% for 20 ⁇ M HNE and 15.4% ⁇ 1.8% for 30 ⁇ M HNE.
  • Pretreatment with compound X1 (0.25 ⁇ M) significantly increased cardiomyocyte viability to 72.0% ⁇ 5.5% (20 ⁇ M HNE) and 38.6% ⁇ 4.1% (30 ⁇ M HNE), respectively (Fig. 4a, b )
  • the Compound of general formula (1) has cardioprotective properties: pretreatment with it significantly increases the survival of cardiomyocytes during subsequent treatment with 4-oxinonenal, the main damage factor in ischemia-reperfusion.
  • DOX Doxorubicin
  • an anthracycline antibiotic widely used in chemotherapy of tumors and malignant blood diseases has significant limitations due to cumulative dose-dependent cardiotoxicity.
  • the mechanism of DOX cardiotoxicity is still unclear, but the induction of DOXOM apoptosis in cardiomyocytes has been reliably established.
  • no counterparties have been developed that could have a preventive effect and prevent high cardiotoxicity of DOXa during joint administration.
  • Outbred male rats 220-240 g were kept in cages with a controlled temperature (25 ° C) and a day-night cycle (12/12) and free access to water and food.
  • the males were randomly divided into 4 groups of 10 rats: control group, X group, DOX group, and DOX + X group.
  • the rats of groups X and DOX + X were given one of the test compounds (namely, X1) intragastrically at a dose of 1 mg / kg for 3 days, the animals of the first two groups received oral saline in an equivalent amount.
  • mice received every second day (7 times, 14 days) intraperitoneally: saline (control group), DOX 2.5 mg per kg in the DOX group; 1 mg / kg of compound X1 intragastrically one hour before DOX injection group DOX + X; 1 mg / kg of compound X1 intragastrically in the X group.
  • echocardiographic measurements (17.5-Hz RMV 707 nozzle) were performed in rats under anesthesia with sodium pentabarbital.
  • Left ventricular (LV) end diastolic and systolic diameters were determined in the M-modal mode.
  • Left ventricular end diastolic volume (LVEDV), stroke volume (SV), and LV global contractility (ejection fraction) (EF) were calculated according to the program. Data were averaged over three consecutive cardiac cycles.
  • LVEDV left ventricular end diastolic volume
  • SV stroke volume
  • the Compound of formula (1) increases the life expectancy of the graft from 10 to 13 or more days.
  • the compound of formula (1) has the ability to increase the viability of the transplants.
  • Kidney damage was caused by a single intraperitoneal injection of cisplatin (Sigma Chemical Co., USA) (7 mg / kg).
  • 30 outbred male rats were divided into 4 groups: 1 group control (physiological saline), group 2 1 mg / kg Compounds X1 daily for 12 days, starting 2 days before cisplatin injection, Group 3 one injection of cisplatin, Group 4 injection cisplatin and administration of Compound X1 according to the same scheme as group 2.
  • rats were decapitated. Blood samples were taken for analysis and kidneys were taken for histological studies.
  • Biochemical analysis blood samples were centrifuged at 3000 g for 10 min to obtain serum. Serum nitrogen (urea- ⁇ ) and creatinine were measured on a Flexor Junior biochemistry analyzer (Vital Scientific BV, Netherlands). The protein was extracted by homogenization of rat kidneys in 1 ml of ice-cold hypotonic buffer A containing 10 mM HEPES (pH 7.8), 10 mM KCI, 2 mM MgCI2, 1 mM dithiothreitol (DTT), 0.1 mM ethylene diaminetetraacetic acid (EDTA), and 0.1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF).
  • NP-40 Nonidet P-40
  • the pellet was washed with 500 ⁇ l of buffer A, in which was added 40 ⁇ l of 10% NP-40, centrifuged, resuspended in 200 ⁇ l of buffer C (50 mm HEPES (pH 7.8), 50 mm KCI, 300 mm NaCI, 0.1 mm EDTA, 1 mm DTT, 0.1 mM PMSF, 20% glycerol), centrifuged for 5 min at 14800 d. The supernatant was collected for immunoblotting. Protein was determined by Lowry kit company Sigma (St. Louis, Missouri, USA).
  • Blots were washed and incubated with HRP (horseradish root peroxidase) -conjugated anti-mouse goat antibodies (Abeam, UK). Staining was performed with hydrogen peroxide and diaminobenzidine. Monoclonal antibodies against ⁇ -actin were used as a control of protein content (A5316; Sigma). The staining intensity was measured on a densitometer.
  • HRP horseradish root peroxidase
  • the compound of formula (1) has the ability to reduce the nephrotoxicity of cisplatin as follows from the data in table 4, namely it reduces the levels of nitrogen (3 times) and creatinine (2 times), which show a strong increase in kidney damage with cisplatin, and significantly reduce the level of transcription factors , activation of which is characteristic of the inflammatory process (NF- ⁇ ) and apoptosis (AR-1).
  • the compound was administered intraperitoneally immediately after a stroke.
  • the volume of a heart attack was measured 24 hours after a stroke.
  • Immunohistochemistry and biochemical analyzes were performed as described in the Example (see above).
  • CMA middle cerebral artery
  • CMA occlusion was performed by introducing a nylon-coated monofilament into the internal carotid artery up to the onset of CMA (Kuge Y., Minematsu K., Yamaguchi T., Miyake Y. Nylon monofilament for intraluminal middle cerebral artery occlusion in rats. // Stroke.- 1995. - 26.— P. 1655—1658), in which the blood flow was recorded during the entire experiment on a moorVMS-LDF monitor from Moor Instruments Ltd, (Great Britain), using an optical fiber attached to the skull in the region of the MCA (6 mm laterally and 2 mm behind Bregma) before and after clamping the right SMA.
  • Rats in which blood flow through the MCA decreased by less than 70% was excluded from the experiment. Rectal temperature was controlled at 37 +/- 0.5 ° ⁇ . In the control group without a heart attack, the same surgery was performed with the exception of the introduction of a filament.
  • the area of infarction after MCA occlusion was determined using 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TFC) 24 hours after occlusion.
  • TFC 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride
  • the animals were decapitated and the brains were quickly isolated and cut into 5 sections of 3 mm each, stained with a 2% TPC solution at 37 ° C for 20 minutes, and fixed with 4% paraformaldehyde. Normal tissue was stained dark red, and the infarct area was pale gray. Sections were photographed and the image was processed using Image-ProPlus 5.1. The damage area was calculated by multiplying the infarct area by the thickness of the section.
  • Volume of damage,% ⁇ [total volume of a heart attack - (difference between the volumes of the intact ipsilateral and contralateral hemisphere) / volume of the contralateral hemisphere ⁇ x100% (Tatlisumak T., Carano RA, Takano K. , Opgenorth TJ, Sotak S.N., Fisher M. / A novel endothelin antagonist, A-127722, attenuates ischemic lesion size in rats with temporary middle cerebral artery occlusion: a diffusion and perfusion MRI study. // Stroke. -1998, -N29, -p.850-857).
  • the compounds of formula (1) possess neuroprotective properties in ischemic stroke, reducing the volume of stroke (Fig. 7) and inflammation (level of activation of NF- ⁇ . FIG. 8), as well as reducing the level of lipid peroxidation products and increasing the level of superoxide dismutase (table 4 )
  • the animals were divided into several groups: falsely operated rats, which were anesthetized and who then underwent trepanation of the skull, but did not destroy the brain tissue; animals with hemorrhagic stroke; animals with hemorrhagic stroke, which were administered Compound X1 at a dose of 1 mg / kg orally (intragastrically, using a special probe) 30 minutes after operations, then once a day for 7 days. Control animals were injected with saline in an equivalent volume intragastrically.
  • Table 5 The effect of Compound X1 (1 mg / kg, by mouth) on neurological deficit (McGrow scale) in rats after hemorrhagic stroke. The number of animals with various neurological symptoms (%) on the 1st day after surgery is given.
  • the compound of formula (1) has neuroprotective properties in hemorrhagic stroke - it reduces mortality (Table 6) and neurological deficiency (Table 5).
  • lymphocytes from the spleen of 6-8 week old BALB / c male mice were carried out as follows.
  • the spleen was aseptically excised and placed in a sterile dish containing RPMI 1640 medium.
  • a single cell suspension was obtained by gently rubbing the spleen on a sterile nylon mesh in the same container.
  • Splenocytes were centrifuged and red blood cells were lysed with short-term hypotonic shock.
  • cells were pretreated with Compound X1 (0.05-0.5 ⁇ M) 2 hours before irradiation.
  • DMSO was used as an in vitro control.
  • Lymphocytes were suspended in the medium and irradiated with a 60 Co ⁇ -source at a dose of 2.93 Gray / min.
  • a Live / Dead Cell Assay kit (LifeTechnologies Corp., USA) was used to count living and dead cells.
  • Compound X1 has radioprotective properties, pre-treatment of cells significantly increases their viability, and this effect has a clear concentration dependence on the added Compound X1 (Fig. 9).
  • the compound of formula (1) protects against neurodegeneration in the toxic Parkinson model
  • the control group instead of Compound X received 3% DMSO in oil according to the same scheme.
  • MPTP at a dose of 10 mg / kg (30 mg / kg cumulative dose) was administered 3 times every 2 hours. Animals were decapitated on the 7th day after the administration of MPTP. Mice were divided into 4 groups (control, X, MPTP, X + MPTP).
  • Compound X1 did not cause any visible changes in the behavior of mice.
  • the level of dopamine and its metabolites - dopamine turns into 3.4- Dioxyphenylacetic acid (DOPUK) and further into homovanillinic acid (HVA) —measured in the striatum using HPLC and electrochemical detection.
  • DOPUK Dioxyphenylacetic acid
  • HVA homovanillinic acid
  • the Compound of formula (1) at 1 mg / kg / day protects against neurodegeneration caused by the administration of MPTP.
  • Compound X1 has neuroprotective properties in the Parkinson's toxic model, practically returning the level of dopamine and its main metabolites to normal (table 7).
  • the compounds of general formula (1) are activators of the transcription factor Nrf2 (Examples 1 and 2), which launches a genetic program of antioxidant response, which can significantly reduce toxic effects and damage in a number of diseases (Examples 3-11).
  • Nrf2 transcription factor 2
  • examples 3-11 a genetic program of antioxidant response, which can significantly reduce toxic effects and damage in a number of diseases.
  • Dosage forms of a number of compounds of the general formula (I) are prepared by a well-known method.
  • Nrf2 - a transcription factor encoded by the NFE2L2 gene (Nuclear factor (erythroid-derived 2) -like 2)
  • Keapl - a protein encoded by the Keapl gene (Kelch-like ECH-associated protein 1)
  • NF-KB - transcription factor NF- ⁇ (nuclear factor "Kappa-bi")

Abstract

The invention relates to medicine, particularly to neurology and cardiology, and also to surgery and traumatology, and specifically relates to medicinal agents exhibiting cytoprotective activity in the presence of ischemia-reperfusion, chronic oxidative stress and chemical intoxication. A compound which is a derivative of bicyclic pyrimidines is used as an activator of the transcription factor Nrf2. The compounds I can be used preventively for enhancing the defensive capabilities of the body prior to working with toxic chemicals and high doses of radiation.

Description

БИЦИКЛИЧЕСКИЕ ПИРИМИДИНЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ В КАЧЕСТВЕ АНТИОКСИДАНТОВ И ЦИТОПРОТЕКТОРОВ  Bicyclic pyrimidines and their use as antioxidants and cytoprotectors
Область техники Technical field
Изобретение относится к медицине, конкретно к неврологии, кардиологии, а также хирургии и травматологии, а именно лекарственным средствам, обладающим цитопротекторной активностью в условиях ишемии-реперфузии, хронического окислительного стресса и химической интоксикации.  The invention relates to medicine, specifically to neurology, cardiology, as well as surgery and traumatology, namely, drugs with cytoprotective activity in conditions of ischemia-reperfusion, chronic oxidative stress and chemical intoxication.
Уровень техники State of the art
Инсульт - клинический синдром, характеризующийся внезапно возникшими клиническими симптомами, свидетельствующими об очаговом и/или общемозговом неврологическом дефиците, развивающемся в результате церебральной ишемии или геморрагии. Ежегодно в высокоразвитых странах среди каждых 10000 населения происходит 25-30 случаев инсульта. Экономические потери от инсульта в США составляют около 30 млрд. долл. в год. В России происходит свыше 400 тыс. инсультов, что по численности равно населению среднего областного города. Среди выживших у большинства наблюдаются различные функциональные нарушения: к концу острого периода почти у 80% больных имеются двигательные нарушения (чаще всего это парезы различной степени выраженности), более чем у трети больных - речевые нарушения.  Stroke is a clinical syndrome characterized by sudden onset of clinical symptoms, indicating focal and / or cerebral neurological deficiency, developing as a result of cerebral ischemia or hemorrhage. Every year in highly developed countries among every 10,000 people, 25-30 cases of stroke occur. The economic loss from a stroke in the United States is about $ 30 billion a year. Over 400 thousand strokes occur in Russia, which is equal in number to the population of the average regional city. Among the survivors, the majority have various functional disorders: by the end of the acute period, almost 80% of patients have motor disorders (most often these are paresis of varying severity), more than a third of patients have speech disorders.
По механизму развития выделяют три вида инсульта: ишемический (синонимы: инфаркт мозга, размягчение мозга), когда в результате закупорки мозгового сосуда или по другой причине развивается острый дефицит кровоснабжения (ишемия) определенного участка мозга; геморрагический (синонимы: кровоизлияние в мозг, внутримозговая гематома), когда вследствие разрыва мозгового сосуда в мозг изливается кровь, нарушая нормальное кровообращение мозговой ткани; субарахноидальное кровоизлияние - кровоизлияние в подпаутинное пространство мозга. На долю ишемических инсультов в среднем приходится 80% всех инсультов, на долю внутримозговых кровоизлияний - 17%, на долю субарахноидальных кровоизлияний - 3%.  According to the development mechanism, three types of stroke are distinguished: ischemic (synonyms: cerebral infarction, softening of the brain), when as a result of blockage of the cerebral vessel or for another reason, an acute deficiency of blood supply (ischemia) of a certain part of the brain develops; hemorrhagic (synonyms: cerebral hemorrhage, intracerebral hematoma), when blood is poured into the brain due to rupture of the cerebral vessel, disrupting normal blood circulation of the brain tissue; subarachnoid hemorrhage - hemorrhage in the subarachnoid space of the brain. On average, ischemic strokes account for 80% of all strokes, intracerebral hemorrhages - 17%, subarachnoid hemorrhages - 3%.
Смертность при внутримозговых кровоизлияниях составляет до 52% в течение 30 дней после инсульта и в настоящее время не существует медикаментозной терапии или хирургии, которые бы уменьшили смертность. Комплекс лечебных мероприятий при инсульте условно делится на два блока: базисная терапия, направленная на поддержание всех жизненно важных функций организма, и нейропротекция в случае ишемического инсульта. Повреждение ткани происходит в первые минуты и часы после инсульта по быстрым механизмам некротической смерти клеток. Формирование ядерной зоны («сердцевины» инфаркта) завершается через 5-8 минут с момента острого нарушения мозгового кровообращения. Данная область мозга окружена потенциально жизнеспособной зоной «ишемической полутени» (пенумбра), в которой снижен уровень кровотока, однако, в целом сохранен энергетический метаболизм и присутствуют функциональные, но не структурные изменения. Формирование 50% от окончательного объема инфаркта происходит в течение первых 90 минут с момента развития инсульта, 70-80% - в течение 360 минут, в связи с чем первые 3-6 часов заболевания получили название «терапевтического окна», внутри которого лечебные мероприятия могут быть наиболее эффективными за счет спасения зоны пенумбры. В то же время окислительное повреждение (изменения метаболизма глутамата и кальция, свободнорадикальные реакции, перекисное окисление липидов, избыточное образование оксида азота и др.) продолжается и далее, приводя к «отдаленным последствиям ишемии». Отсроченное повреждение церебральной ткани реализуется через механизмы программированной клеточной смерти - апоптоза и апонекроза. «Отдаленные последствия ишемии» обусловливают «деформирование» инфаркта мозга за счет распространения повреждения от периинфарктной зоны к периферии пенумбры. Время «деформирования» инфарктных изменений в каждом случае индивидуально, составляя от 3 до 7 суток после нарушения мозгового кровообращения. Доказательства отсроченности необратимых повреждений мозга от момента острого нарушения мозгового кровообращения и появления первых симптомов заболевания укоренили отношение к инсульту как к неотложному состоянию, требующему быстрой и патогенетически обоснованной медицинской помощи, желательно в течение 3 ч с момента его развития. Экспериментальные исследования показали, что возвращение крови в ишемизированную зону через реваскуляризированный участок артерии не всегда приводит к полной нормализации локального мозгового кровотока. Чем длительнее дореперфузионный период, тем меньше шанс быстро нормализовать микроциркуляцию в ишемизированной зоне. Как ни парадоксально, но применение антиоксидантов при реперфузии позволяет значительно уменьшить зону повреждения, по-видимому, за счет подавления оксидантного механизма повреждения при реперфузии, обусловленного включением кислорода в процессы свободнорадикального окисления. Mortality due to intracerebral hemorrhage is up to 52% within 30 days after a stroke, and there is currently no drug therapy or surgery that would reduce mortality. The complex of therapeutic measures for stroke is conditionally divided into two blocks: basic therapy aimed at maintaining all the vital functions of the body, and neuroprotection in case of ischemic stroke. Tissue damage occurs in the first minutes and hours after a stroke by the rapid mechanisms of necrotic cell death. The formation of the nuclear zone (the "core" of a heart attack) is completed in 5-8 minutes from the moment of acute cerebrovascular accident. This area of the brain is surrounded by a potentially viable zone of “ischemic penumbra” (penumbra), in which the level of blood flow is reduced, however, energy metabolism is generally preserved and there are functional, but not structural changes. The formation of 50% of the final volume of a heart attack occurs within the first 90 minutes from the moment of the development of a stroke, 70-80% - within 360 minutes, in connection with which the first 3-6 hours of the disease are called the “therapeutic window”, inside which therapeutic measures can to be most effective by saving the penumbra zone. At the same time, oxidative damage (changes in glutamate and calcium metabolism, free radical reactions, lipid peroxidation, excessive formation of nitric oxide, etc.) continues further, leading to "long-term consequences of ischemia." Delayed damage to cerebral tissue is realized through the mechanisms of programmed cell death - apoptosis and aponecrosis. “Long-term consequences of ischemia” cause “deformation” of cerebral infarction due to the spread of damage from the peri-infarction zone to the periphery of the penumbra. The time of "deformation" of heart attacks in each case is individual, ranging from 3 to 7 days after cerebrovascular accident. Evidence of the delayed irreversible damage to the brain from the moment of acute cerebrovascular accident and the onset of the first symptoms of the disease rooted the attitude to stroke as an emergency requiring quick and pathogenetically based medical care, preferably within 3 hours from the moment of its development. Experimental studies have shown that the return of blood to the ischemic zone through the revascularized section of the artery does not always lead to the complete normalization of local cerebral blood flow. The longer the pre-reperfusion period, the less is the chance to quickly normalize microcirculation in the ischemic zone. Paradoxically, the use of antioxidants during reperfusion can significantly reduce the damage zone, apparently due to the suppression of the oxidative damage mechanism during reperfusion due to the inclusion of oxygen in the processes of free radical oxidation.
Основой специфической терапии при ишемическом инсульте являются два стратегических направления: реперфузия и нейропротекция, направленная на предохранение слабо или почти не функционирующих, однако все еще жизнеспособных нейронов, располагающихся вокруг очага инфаркта (зона "ишемической полутени"). Основными церебральными тромболитиками признаны урокиназа, стрептокиназа и их производные, а также тканевой активатор плазминогена (tPA). Последний применяется лишь в 4% случаев, в связи с возможной угрозой мозгового кровотечения. Нейропротекторными свойствами обладают: постсинаптические антагонисты глутаматных рецепторов (пока недоступные в клинической практике); пресинаптические ингибиторы глутамата (лубелузол); антиоксиданты (альфа-токоферол, карнозин, мексидол, милдронат, витамин Е, аскорбиновая кислота); блокаторы кальциевых каналов (нимодипин); препараты преимущественно нейротрофического действия (пирацетам, церебролизин, глицин, пикамилон) и другие. The basis of specific therapy for ischemic stroke are two strategic directions: reperfusion and neuroprotection, aimed at protecting weakly or almost non-functioning, but still viable neurons located around the hearth site (ischemic penumbra). The main cerebral thrombolytics are recognized as urokinase, streptokinase and their derivatives, as well as tissue plasminogen activator (tPA). The latter is used only in 4% of cases, due to the possible threat of cerebral hemorrhage. Neuroprotective properties have: postsynaptic glutamate receptor antagonists (not yet available in clinical practice); presynaptic glutamate inhibitors (lubeluzole); antioxidants (alpha-tocopherol, carnosine, mexidol, mildronate, vitamin E, ascorbic acid); calcium channel blockers (nimodipine); drugs of predominantly neurotrophic action (piracetam, cerebrolysin, glycine, picamilon) and others.
Ишемическая болезнь сердца (ИБС), сердечная недостаточность и мозговой инсульт занимают в настоящее время лидирующее положение среди причин инвалидизации и смертности населения. Ожидается, что инфаркт миокарда к 2020 году станет первой причиной смертности [Lopez A.D., Murray С. С. / The global burden disease, 1990-2020 // Nat. Med. - 1998; - N4, - p. 124-133].  Coronary heart disease (CHD), heart failure and cerebral stroke currently occupy a leading position among the causes of disability and mortality. It is expected that myocardial infarction by 2020 will be the first cause of death [Lopez A.D., Murray S. C. / The global burden disease, 1990-2020 // Nat. Med. - 1998; - N4, - p. 124-133].
От болезней сердца и сосудов умирают 57 процентов россиян. Такого показателя нет ни в одной развитой стране мира. Статистика по России выглядит пессимистично: из каждых 100 тысяч человек только от инфаркта миокарда мы ежегодно теряем 330 мужчин и 154 женщин, от инсультов - 204 мужчины и 151 женщину. Всего же от сердечно-сосудистых заболеваний каждый год умирает 1 миллион 300 тысяч человек в год - население крупного областного центра.  57 percent of Russians die from heart and vascular diseases. There is no such indicator in any developed country in the world. The statistics for Russia looks pessimistic: out of every 100 thousand people, only from myocardial infarction we lose 330 men and 154 women every year, from strokes - 204 men and 151 women. In total, 1 million 300 thousand people a year die from cardiovascular diseases every year - the population of a large regional center.
Корреляция между окислительным стрессом, воспалительным повреждением и ишемическим инсультом направляет интерес на изыскание новых препаратов, которые запускали бы генетически заложенную программу антиоксидантной защиты на клеточном уровне [DuY., ZhangX., JiH.,LiuH., LiS., LiL. / Probucol and atorvastatin in combination protect rat brains in MCAO model: upregulating Peroxiredoxin2, Foxo3a and Nrf2 expression. // Neurosci. Lett. -2012. -N509, -p. 110-115].  The correlation between oxidative stress, inflammatory damage and ischemic stroke directs interest in finding new drugs that would launch a genetically-based antioxidant defense program at the cellular level [DuY., ZhangX., JiH., LiuH., LiS., LiL. / Probucol and atorvastatin in combination protect rat brains in MCAO model: upregulating Peroxiredoxin2, Foxo3a and Nrf2 expression. // Neurosci. Lett. 2012. -N509, -p. 110-115].
Транскрипционный фактор "Nrf2" (NFE2L2, Nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2) является главным регулятором антиоксидантного ответа на клеточном уровне. Nrf2 связывается с т.н. элементом антиоксидантного ответа (antioxidant response element, ARE) в промоторной области генов программы антиоксидантного ответа, отвечающей за детоксификацию ксенобиотиков и нейтрализацию активных форм кислорода (reactive oxygen species, ROS). В отсутствие стресса, приводящего к окислительной модификации активных тиолов в белках, Nrf2 входит в состав комплекса с убиквитинлигазой, взаимодействие с которой опосредовано через димерный белок Кеар1 , имеющий в своем составе более 20 активных тиолов, легко подвергающихся алкилированию. Nrf2 убиквитинируется и направляется таким образом на протеасомную деградацию. При ковалентной модификации  The transcription factor "Nrf2" (NFE2L2, Nuclear factor (erythroid-derived 2) -like 2) is the main regulator of the antioxidant response at the cellular level. Nrf2 binds to the so-called an antioxidant response element (ARE) in the promoter region of the genes of the antioxidant response program responsible for the detoxification of xenobiotics and the neutralization of reactive oxygen species (ROS). In the absence of stress leading to the oxidative modification of active thiols in proteins, Nrf2 is a part of the complex with ubiquitin ligase, the interaction with which is mediated through the dimeric protein Kear1, which contains more than 20 active thiols that are easily alkylated. Nrf2 is ubiquitinated and thus directed to proteasome degradation. With covalent modification
з наиболее активных тиолов Keapl-димера комплекс распадается, Nrf2 стабилизируется и направляется в ядро, где взаимодействует с ARE-содержащими промоторами и тем самым включает синтез белков антиоксидантой защиты. Полезные эффекты активации Nrf2 были продемонстрированы при различных патологиях, таких как диабет [Zheng Н., Whitman S. А., Wu W. et al. / Therapeutic potential of Nrf2 activators in streptozotocin-induced diabetic nephropathy // Diabetes. -201 1 , -v.60, -N.11 , -p.3055-3066], химическаяинтоксикация [Kwak M. K. and Kensler T.W. / Targeting NRF2 signaling for cancer chemoprevention // Toxicology and Applied Pharmacology. -2010, -v.244, -N.1 , -p.66-76], кардиоваскулярные [Mann G. E., Bonacasa В., Ishii Т., and Siow R. C. / Targeting the redox sensitive Nrf2-Keap1 defense pathway in cardiovascular disease: protection afforded by dietary isoflavones // Current Opinion in Pharmacology. -2009, -v.9, -N.2, -p.139-145] и нейрологические заболевания [Zhang M., An С, Gao Y., Leak R. К., Chen J., and Zhang F. / Emerging roles of Nrf2 and phase II antioxidant enzymes in neuroprotection // Progress in Neurobiology. -2013, -v.100, -N.1 , -p.30-47]. Активация Nrf2 защищает при ишемии-реперфузии мозга [Wang В., Cao W., Biswal S., Dore S.. / Carbon monoxide-activated Nrf2 pathway leads to protection against permanent focal cerebral ischemia. // Stroke. -201 1 , -N42, -p.2605-2610], глазного дна [Wei Y., Gong J., Yoshida Т., Eberhart C.G., Xu Z., Kombairaju P., et al. / Nrf2 has a protective role against neuronal and capillary degeneration in retinal ischemia-reperfusion injury. // Free RadicBiol Med. -2011 , -N51 , -p.216-224], сердца [Calvert J.W., Jha S., Gundewar S., Elrod J.W., Ramachandran A., Pattillo C.B., et al. / Hydrogen sulfide mediates cardioprotection through Nrf2 signaling. // Circ Res. -2009, -N105, -p.365-374] икишечника [Zhao H.D., Zhang F., Shen G., Li Y.B., Li Y.H., Jing H.R., et al. / Sulforaphane protects liver injury induced by intestinal ischemia reperfusion through Nrf2-ARE pathway. // World J. Gastroenterol. -2010, -N16, -p.3002-3010]. s the most active thiols of the Keapl dimer, the complex decomposes, Nrf2 stabilizes and is sent to the nucleus, where it interacts with ARE-containing promoters and thereby includes protein synthesis with antioxidant protection. The beneficial effects of Nrf2 activation have been demonstrated in various pathologies such as diabetes [Zheng N., Whitman S. A., Wu W. et al. / Therapeutic potential of Nrf2 activators in streptozotocin-induced diabetic nephropathy // Diabetes. -201 1, -v.60, -N.11, -p.3055-3066], chemical intoxication [Kwak MK and Kensler TW / Targeting NRF2 signaling for cancer chemoprevention // Toxicology and Applied Pharmacology. -2010, -v.244, -N.1, -p.66-76], cardiovascular [Mann GE, Bonacasa B., Ishii T., and Siow RC / Targeting the redox sensitive Nrf2-Keap1 defense pathway in cardiovascular disease : protection afforded by dietary isoflavones // Current Opinion in Pharmacology. -2009, -v.9, -N.2, -p.139-145] and neurological diseases [Zhang M., An C, Gao Y., Leak R. K., Chen J., and Zhang F. / Emerging roles of Nrf2 and phase II antioxidant enzymes in neuroprotection // Progress in Neurobiology. -2013, -v.100, -N.1, -p.30-47]. Nrf2 activation protects brain ischemia-reperfusion [Wang B., Cao W., Biswal S., Dore S. .. / Carbon monoxide-activated Nrf2 pathway leads to protection against permanent focal cerebral ischemia. // Stroke. -201 1, -N42, -p.2605-2610], the fundus [Wei Y., Gong J., Yoshida T., Eberhart CG, Xu Z., Kombairaju P., et al. / Nrf2 has a protective role against neuronal and capillary degeneration in retinal ischemia-reperfusion injury. // Free RadicBiol Med. -2011, -N51, -p.216-224], hearts [Calvert JW, Jha S., Gundewar S., Elrod JW, Ramachandran A., Pattillo CB, et al. / Hydrogen sulfide mediates cardioprotection through Nrf2 signaling. // Circ Res. -2009, -N105, -p.365-374] of the intestine [Zhao HD, Zhang F., Shen G., Li YB, Li YH, Jing HR, et al. / Sulforaphane protects liver injury induced by intestinal ischemia reperfusion through Nrf2-ARE pathway. // World J. Gastroenterol. -2010, -N16, -p.3002-3010].
Влияние активации Nrf2 на жизнеспособность донорных трансплантатов (стволовых клеток печени и сердца) было показано недавно [Shen X. D., Ке В., Ji Н. et al. / Disruption of type-l I FN pathway ameliorates preservation damage in mouse orthotopic liver transplantation via HO-1 dependent mechanism // The American Journal of Transplantation. -2012, -v.12, -N.7, - p.1730-1739; Mohammadzadeh M., Halabian R., Gharehbaghian A. et al. / Nrf-2 overexpression in mesenchymal stem cells reduces oxidative stress-induced apoptosis and cytotoxicity // Cell Stress and Chaperones. -2012, -v.17, -N.5, -p. 553-565; Gorbunov N., Petrovski G., Gurusamy N., Ray D., Kim D. H., and Das D. K. / Regeneration of infarcted myocardium with resveratrol-modified cardiac stem cells // Journal of Cellular and Molecular Medicine. -2012, -v.16, -N.1 , -p.174-184].  The effect of Nrf2 activation on the viability of donor transplants (liver and heart stem cells) has been recently shown [Shen X. D., Ke B., Ji N. et al. / Disruption of type-l I FN pathway ameliorates preservation damage in mouse orthotopic liver transplantation via HO-1 dependent mechanism // The American Journal of Transplantation. -2012, -v.12, -N.7, - p.1730-1739; Mohammadzadeh M., Halabian R., Gharehbaghian A. et al. / Nrf-2 overexpression in mesenchymal stem cells reduces oxidative stress-induced apoptosis and cytotoxicity // Cell Stress and Chaperones. -2012, -v.17, -N.5, -p. 553-565; Gorbunov N., Petrovski G., Gurusamy N., Ray D., Kim D. H., and Das D. K. / Regeneration of infarcted myocardium with resveratrol-modified cardiac stem cells // Journal of Cellular and Molecular Medicine. -2012, -v.16, -N.1, -p.174-184].
Печень от старых доноров имеет более низкий уровень Nrf2, что ухудшает клинические показатели при пересадке печени [Zaman М.В., Leonard М.О., Ryan E.J., Nolan N.P., Hoti E., Maguire D., et al. / Lower expression of Nrf2 mRNA in older donor livers: a possible contributor to increased ischemia-reperfusion injury? // Transplantation. -2007, -84, -p.1272-1278]. Liver from old donors has a lower level of Nrf2, which worsens the clinical performance of a liver transplant [Zaman M.V., Leonard M.O., Ryan EJ, Nolan NP, Hoti E., Maguire D., et al. / Lower expression of Nrf2 mRNA in older donor livers: a possible contributor to increased ischemia-reperfusion injury? // Transplantation. -2007, -84, -p.1272-1278].
Активация Nrf2, как выяснилось относительно недавно, антагонизирует воспалительные каскады, инициируемые TGF i [Oh С. J., Kim J. Y., Min А. К. et al. / Sulforaphane attenuates hepatic fibrosis via NF-E2-related factor 2-mediated inhibition of transforming growth factor-p/Smad signaling. // Free Radical Biology and Medicine, -2012, -v.52, - N.3, -p.671-682) and NF-κΒ (Jiang J., Mo Z. C, Yin K. et al. / Epigallocatechin-3-gallate prevents TNF-a-induced NF-κΒ activation thereby up regulating ABCA1 via the Nrf2/Keap1 pathway in macrophage foam cells // International Journal of Molecular Medicine. -2012, v.29, -N.5, -p.946- 956], и это дополнительно подогревает интерес к разработке лекарственных препаратов, активирующих Nrf2.  The activation of Nrf2, as it has been found out relatively recently, antagonizes the inflammatory cascades initiated by TGF i [Oh C. J., Kim J. Y., Min A. K. et al. / Sulforaphane attenuates hepatic fibrosis via NF-E2-related factor 2-mediated inhibition of transforming growth factor-p / Smad signaling. // Free Radical Biology and Medicine, -2012, -v.52, - N.3, -p.671-682) and NF-κΒ (Jiang J., Mo Z. C, Yin K. et al. / Epigallocatechin -3-gallate prevents TNF-a-induced NF-κΒ activation thereby up regulating ABCA1 via the Nrf2 / Keap1 pathway in macrophage foam cells // International Journal of Molecular Medicine. -2012, v.29, -N.5, -p .946-956], and this further fuels interest in the development of drugs that activate Nrf2.
Большинство экспериментальных работ использует сульфорафан или куркумин как активаторы Nrf2: оба соединения обладают ярко-выраженной способностью к алкилированию (ковалентной модификации активных тиоловых групп в белках). Недавно утвержденный к применению в США диметилфумарат (разработанный фирмой BioGen для лечения рассеянного склероза, препарат BG-12) также обладает способностью к алкилированию белков, и основным побочным эффектом является 30% падение уровня белых кровяных телец. Клинические испытания мощного активатора Nrf2 - бардоксолона (разработанного фирмой Reata Pharmaceuticals и проданного фирме Abbott Laboratories) были приостановлены из-за смерти пациента. Таким образом, в настоящий момент неалкилирующие активаторы Nrf2 неизвестны.  Most experimental studies use sulforaphane or curcumin as Nrf2 activators: both compounds have a pronounced ability to alkylate (covalent modification of active thiol groups in proteins). Recently approved for use in the United States, dimethyl fumarate (developed by BioGen for the treatment of multiple sclerosis, BG-12) also has the ability to alkylate proteins, and the main side effect is a 30% drop in white blood cell counts. Clinical trials of the potent Nrf2 activator, bardoxolone (developed by Reata Pharmaceuticals and sold by Abbott Laboratories) were suspended due to the death of the patient. Thus, Nrf2 non-alkylating activators are currently unknown.
В качестве ближайшего аналога может быть указана заявка на патент ЕР1813269 (А1) — 2007-08-01 , описывающая фармацевтические агенты, способные активировать фактор транскрипции Nrf2 для использования в лечении, профилактике, или облегчения заболевания или состояния, которые можно лечить, предотвратить, или улучшать от активации транскрипционных факторов Nrf2 (например, атеросклероз, гипертонию, диабет, нервные дегенеративные заболевания, кожные заболевания, заболевания глаз, астма и рак). Агенты повышают потенциал в защите от окислительного стресса.  As the closest analogue, patent application EP1813269 (A1) - 2007-08-01 describing pharmaceutical agents capable of activating the Nrf2 transcription factor for use in the treatment, prevention, or alleviation of a disease or condition that can be treated, prevented, or improve upon activation of Nrf2 transcription factors (e.g., atherosclerosis, hypertension, diabetes, nervous degenerative diseases, skin diseases, eye diseases, asthma and cancer). Agents increase the potential for protection against oxidative stress.
Раскрытие изобретения Disclosure of invention
Задачей настоящего изобретения является разработка новых средств активирующих антиоксидантную программу и, которые могут быть использованы как эффективные цитопротекторы при самых различных неблагоприятных воздействиях на клетки организма.  The objective of the present invention is to develop new agents that activate the antioxidant program and that can be used as effective cytoprotectors in a variety of adverse effects on body cells.
Задача решается применением соединения, представляющего собой производное бицикл ических пиримидинов общей формулы I: The problem is solved by the use of a compound representing a derivative of bicyclic pyrimidines of the general formula I:
Figure imgf000007_0001
или его фармацевтически приемлемой соли, где
Figure imgf000007_0001
or its pharmaceutically acceptable salt, where
Ri -пара-заместитель: метоксигруппа, этоксигруппа, алкил линейный или разветвленный (СГС ), галоген, моно-, ди-, три- (С С4)алкиламиногруппа; Ri is a substituent: methoxy, ethoxy, linear or branched alkyl (C G C), halogen, mono-, di-, tri- (C 4 ) alkylamino;
Y= СН, если X=S, и Y= СН или Ν, если Χ=Ν; Y = CH if X = S, and Y = CH or Ν if Χ = Ν;
R2 представляет собой галоген, R 2 represents a halogen,
R3 отсутствует если X=S, и если X=N, то R3 представляет собой атом водорода, алкил С С3, гидроксил, карбоксил, который может быть этерифицирован, или аминогруппу; в качестве активаторов транскрипционного фактора Nrf2. R 3 is absent if X = S, and if X = N, then R 3 represents a hydrogen atom, C 3 alkyl, hydroxyl, carboxyl, which can be esterified, or an amino group; as activators of the transcription factor Nrf2.
Галоген может быть выбран из хлора, брома, иода, фтора. Наиболее предпочтительно представляет собой хлор.  Halogen can be selected from chlorine, bromine, iodine, fluorine. Most preferably represents chlorine.
Технический результат: отсутствие тушения активации антиоксидантной программы, индуцируемой соединениями формулы (1 ), при добавлении тиоловых восстановителей типа глутатиона и цистеина, и возможность комбинирования препарата со стехиометрическими антиоксидантами без компрометирования основного эффекта.  EFFECT: absence of suppression of activation of the antioxidant program induced by compounds of formula (1) with the addition of thiol reducing agents such as glutathione and cysteine, and the possibility of combining the drug with stoichiometric antioxidants without compromising the main effect.
Соединения общей формулы I являются стабилизаторами транскрипционного фактора Nrf2 и таким образом активаторами антиоксидантной программы, триггером которой является Nrf2. Соединения формулы I индуцируют синтез белков и ферментов антиоксидантной защиты фазы II таких как гемоксигеназа-1 и NADPH :XHHOH оксидоредуктаза и остальных, приводя к сильному увеличению содержания восстановленного глутатиона в тканях. The compounds of general formula I are stabilizers of the transcription factor Nrf2 and thus activators of the antioxidant program, the trigger of which is Nrf2. The compounds of formula I induce the synthesis of proteins and phase II antioxidant defense enzymes such as hemoxygenase-1 and NADPH: XHHOH oxidoreductase and the rest, leading to a strong increase in the content of reduced glutathione in the tissues.
Соединения I обладают способностью повышать жизнеспособность тканей в условиях ишемии-реперфузии (пересадка органов, стволовых клеток, инсульт, инфаркт), хронической дегенерации связанной с окислительным стрессом (нейродегенеративные заболевания, почечная недостаточность); химической интоксикации различной природы, включая защиту нормальных клеток при химиотерапии раковых заболеваний и тем самым уменьшая побочные эффекты химиотерапии (например, доксирубицина на сердце). Соединения I могут использоваться превентивно для повышения защитных сил организма перед работой с токсичными химикатами и высокими дозами радиации.  Compounds I have the ability to increase tissue viability in conditions of ischemia-reperfusion (transplantation of organs, stem cells, stroke, heart attack), chronic degeneration associated with oxidative stress (neurodegenerative diseases, renal failure); chemical intoxication of various nature, including the protection of normal cells during chemotherapy for cancer and thereby reducing the side effects of chemotherapy (for example, doxirubicin on the heart). Compounds I can be used proactively to increase the body's defenses before working with toxic chemicals and high doses of radiation.
Соединения формулы I использовались исключительно как исходные компоненты для синтеза тиенопиримидиновых киназных ингибиторов. Ни в одном из известных источников не описаны свойства согласно изобретению.  The compounds of formula I were used solely as starting materials for the synthesis of thienopyrimidine kinase inhibitors. None of the known sources describe the properties of the invention.
Соединения формулы I доступны коммерчески (например, от фирмы Alfa Aesar, Oakwood, http://www.alfa.com/ru/catalog/H50537) или и могут быть получены следующими методами.  The compounds of formula I are commercially available (for example, from Alfa Aesar, Oakwood, http://www.alfa.com/en/catalog/H50537) or can be obtained by the following methods.
Например, для получения тиенопиридинов формулы (I) может быть использована следующая последовательность реакций, где в качестве палладиевого катализатора может выст пать CI2Pd(PPh3 в присутствии карбоната натрия и диметилового эфира: For example, to obtain the thienopyridines of formula (I), the following reaction sequence can be used, where CI 2 Pd (PPh 3 in the presence of sodium carbonate and dimethyl ether can be used as a palladium catalyst:
Figure imgf000008_0001
Figure imgf000008_0001
В качестве предпочтительных соединений могут быть указаны 4-хлоро-5-(4- метоксифенил)тиено[2,3-с1]пиримидин (соединение Х1), 4-хлоро-5-(4-фенил)тиено[2,3- с!]пиримидин (соединение Х2), 4-хлоро-5-(2,3-дигидробензо[Ь][1 ,4]диоксин-2-ил)тиено[2,3- с!]пиримидин (соединение ХЗ) и 4-хлоро-5,6,7,8-тетрагидробензо[4,5]тиено[2,3-с1]пиримидин (соединение Х4). As preferred compounds, 4-chloro-5- (4-methoxyphenyl) thieno [2,3-s1] pyrimidine (compound X1), 4-chloro-5- (4-phenyl) thieno [2,3-s !] pyrimidine (compound X2), 4-chloro-5- (2,3-dihydrobenzo [b] [1, 4] dioxin-2-yl) thieno [2,3- c!] pyrimidine (compound ChZ) and 4-chloro-5,6,7,8-tetrahydrobenzo [4,5] thieno [2,3-c1] pyrimidine (compound X4).
Для получения пиразолопиримидинов может быть использована следующая схема реакций:  To obtain pyrazolopyrimidines, the following reaction scheme can be used:
Figure imgf000009_0001
Figure imgf000009_0001
В качестве предпочтительных соединений могут быть указаны 4-хлоро-3-(4- метоксифенил)-1 Н-пиразоло[3,4-с1]пиримидин или 4-хлоро-3-фенил-1 Н-пиразоло[3,4- с1]пиримидин. As preferred compounds, 4-chloro-3- (4-methoxyphenyl) -1 H-pyrazolo [3,4-c1] pyrimidine or 4-chloro-3-phenyl-1 H-pyrazolo [3,4-c1 can be mentioned ] pyrimidine.
Для получения пирролопиримидинов может быть использована следующая схема реакций:  To obtain pyrrolopyrimidines, the following reaction scheme can be used:
Figure imgf000009_0002
Figure imgf000009_0002
В качестве предпочтительных соединений могут быть указаны 4-хлоро-5-(4- метоксифенил)-7Н-пирроло[2,3- !]пиримидин или 4-хлоро-5-фенил-7Н-пирроло[2,3- с1]пиримидин. As preferred compounds, 4-chloro-5- (4-methoxyphenyl) -7H-pyrrolo [2,3-!] Pyrimidine or 4-chloro-5-phenyl-7H-pyrrolo [2,3-c1] pyrimidine can be mentioned .
Еще одним объектом является цитопротекторная и антиоксидантная фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного начала активатор транскрипционного фактора Nrf2, представляющий собой производное бициклических пиримидинов общей формулы (I), или его фармацевтически приемлемую соль в эффективном количестве и фармацевтически приемлемый носитель. Термин "фармацевтически приемлемая соль" предназначен для индикации солей, которые не опасны для пациента. Такие соли включают соли фармацевтически приемлемых кислот, например, соли неорганических и органических кислот, и аминокислот. Примеры неорганических кислот включают кислоты, такие как соляная, бромистоводородная, фосфорная, серная, азотная. Представитель подходящих органических кислот включают уксусную, трихлоруксусную, бензойную, коричную, лимонную, фумаровую, гликолевую, молочную, малеиновую, яблочную, салициловую янтарную, а в качестве аминокислот может использоваться глутатион, цистеин или его производные, и т.п. Another object is a cytoprotective and antioxidant pharmaceutical composition containing, as an active principle, an activator of the transcription factor Nrf2, which is a derivative of bicyclic pyrimidines of the general formula (I), or a pharmaceutically acceptable salt thereof in an effective amount and a pharmaceutically acceptable carrier. The term "pharmaceutically acceptable salt" is intended to indicate salts that are not harmful to the patient. Such salts include salts of pharmaceutically acceptable acids, for example, salts of inorganic and organic acids, and amino acids. Examples of inorganic acids include acids such as hydrochloric, hydrobromic, phosphoric, sulfuric, nitric. A representative of suitable organic acids include acetic, trichloroacetic, benzoic, cinnamon, citric, fumaric, glycolic, lactic, maleic, malic, salicylic succinic, and glutathione, cysteine or its derivatives, and the like can be used.
В качестве фармацевтически приемлемого носителя выбираются вспомогательное вещество или вещества в зависимости от подходящей формы введения (таблетки, инъекции, растворы, эмульсии, свечи, капсулы): вода, лактоза, сахарные спирты, производные целлюлозы, фосфаты, стеараты, тальк, ПАВ, ПЭГ, ПВП, спирты и т.д.  As a pharmaceutically acceptable carrier, an excipient or substances are selected depending on the appropriate form of administration (tablets, injections, solutions, emulsions, suppositories, capsules): water, lactose, sugar alcohols, cellulose derivatives, phosphates, stearates, talc, surfactant, PEG, PVP, alcohols, etc.
Краткое описание чертежей Brief Description of the Drawings
Рис. 1. Активация ARE-люциферазного репортера Соединениями формулы (1). А - сравнение активности 4-хлоро-5-(4-метоксифенил)тиено[2,3-с1]пиримидина (Х1), 4-хлоро-5- (2,3-дигидробензо[Ь][1 ,4]диоксин-2-ил)тиено[2,3- ]пиримидина (ХЗ), 4-хлоро-5, 6,7,8- тетрагидробензо[4,5]тиено[2,3-с!]пиримидина (Х4) и 4-хлоро-5,6-диметил-7-фенил-7Н- пиррорло[2,3-с1]пиримидина (Х5). Соединения ХЗ, Х4 и Х5 были приобретены у компании ChemDiv (каталожные номера 8012-8614, 8010-1918 и С660-1503, соответственно). Б - сравнение активности Х1 и 4-хлоро-5-(4-фенил)тиено[2,3-с!]пиримидина (Х2); В - отсутствие тушения 2 мМ Ν-ацетилцистеином (NAC) или глутатионом (GSH) активации репортера, индуцированной соединением Х1.  Fig. 1. Activation of the ARE-luciferase reporter by Compounds of formula (1). A - comparison of the activity of 4-chloro-5- (4-methoxyphenyl) thieno [2,3-c1] pyrimidine (X1), 4-chloro-5- (2,3-dihydrobenzo [b] [1, 4] dioxin- 2-yl) thieno [2,3-] pyrimidine (ChZ), 4-chloro-5, 6,7,8-tetrahydrobenzo [4,5] thieno [2,3-c!] Pyrimidine (X4) and 4- chloro-5,6-dimethyl-7-phenyl-7H-pyrrorlo [2,3-c1] pyrimidine (X5). Compounds X3, X4 and X5 were purchased from ChemDiv (catalog numbers 8012-8614, 8010-1918 and C660-1503, respectively). B - comparison of the activity of X1 and 4-chloro-5- (4-phenyl) thieno [2,3-s!] Pyrimidine (X2); B - the absence of quenching with 2 mM Ν-acetylcysteine (NAC) or glutathione (GSH) reporter activation induced by compound X1.
Рис.2. Повышение уровня матричной РНК
Figure imgf000010_0001
генов при обработке 0,5 мкМ соединениями формулы 1 :хлоро-5-(4-метоксифенил)тиено[2,3-с1]пиримидин (Х1) и 4- хлоро-5-(4-фенил)тиено[2,3-с.]пиримидин (Х2). Fig. 2. Increased level of messenger RNA
Figure imgf000010_0001
genes when treated with 0.5 μM compounds of the formula 1: chloro-5- (4-methoxyphenyl) thieno [2,3-c1] pyrimidine (X1) and 4-chloro-5- (4-phenyl) thieno [2,3- C.] pyrimidine (X2).
Рис. 3. Антиоксидантная и гепатопротекторная активность Соединения Х2 в модели острого токсического поражения печени, а) - достоверное концентрационно-зависимое уменьшение области некроза печени при администрации соединения формулы 1 ; б) - концентрационно-зависимое уменьшение перекисного окисления липидов в присутствии соединения формулы 1 ; в) - концентрационно-зависимое восстановление уровня супероксиддисмутазы до нормального при администрации соединения формулы 1.  Fig. 3. Antioxidant and hepatoprotective activity of Compound X2 in the model of acute toxic liver damage, a) a significant concentration-dependent decrease in the area of liver necrosis during administration of the compound of formula 1; b) a concentration-dependent decrease in lipid peroxidation in the presence of a compound of formula 1; C) - concentration-dependent restoration of the level of superoxide dismutase to normal during administration of the compounds of formula 1.
Рис. 4. Увеличение жизнеспособности клеток при обработке соединением формулы (1) против токсического действия основного продукта перекисного окисления липидов, HNE: а) предобработка контролем, 20 мкМ HNE; б) предобработка контролем, 30 мкМ HNE; Fig. 4. The increase in cell viability when treated with a compound of formula (1) against the toxic effects of the main lipid peroxidation product, HNE: a) control pretreatment, 20 μM HNE; b) pretreatment control, 30 μm HNE;
в) предобработка Х1 (0,25 мкМ), 20 мкМ HNE;  c) pretreatment X1 (0.25 μM), 20 μM HNE;
г) предобработка Х1 (0,25 мкМ), 30 мкМ HNE;  g) pretreatment X1 (0.25 μm), 30 μm HNE;
Рис.5. Влияние соединения X (Х1) на апоптоз кардиомицитов у крыс обработанных доксорубицином. Апоптотический индекс выражен как отношение TUNEL-позитивных ядер кардиомицитов к их общему числу. Данные представлены как среднее (п > 10), *р<0.01 контрольной группы, **р<0.01 DOX группы.  Fig.5. The effect of compound X (X1) on apoptosis of cardiomyocytes in rats treated with doxorubicin. The apoptotic index is expressed as the ratio of TUNEL-positive cardiomyocyte nuclei to their total number. Data are presented as mean (n> 10), * p <0.01 of the control group, ** p <0.01 DOX of the group.
Рис. 6. Нормализация уровня апоптотического (АР-1) и воспалительного (NF-KB) транскрипционных факторов при обработке Х1 (Соединение X) при повреждении почек цисплатином. Иммуноблоты (вверху) и их количественная обработка на денситометре (внизу).  Fig. 6. Normalization of the level of apoptotic (AP-1) and inflammatory (NF-KB) transcription factors during the treatment of X1 (Compound X) in case of kidney damage with cisplatin. Immunoblots (above) and their quantitative processing on a densitometer (below).
Рис. 7. Достоверное концентрационно-зависимое уменьшение области инфаркта при ишемическом инсульте при администрации Соединения формулы (1) - Соединение Х1.  Fig. 7. A reliable concentration-dependent decrease in the area of myocardial infarction during ischemic stroke during administration of the Compound of formula (1) - Compound X1.
Рис. 8. Сравнение нейропротекторной активности соединений Х1 и Х2 в модели ишемического инсульта при дозе администрации 1 мг/кг: уменьшение активации NF-KB транскрипционного фактора - триггера воспалительной реакции организма.  Fig. 8. Comparison of the neuroprotective activity of compounds X1 and X2 in a model of ischemic stroke at a dose of administration of 1 mg / kg: a decrease in the activation of NF-KB transcription factor, a trigger of the inflammatory response of the body.
Рис. 9. Концентрационно-зависимая радиопротекция при обработке Соединением Х1  Fig. 9. Concentration-dependent radioprotection during treatment with Compound X1
Пример 1. Example 1
Совместное добавление глутатиона или ацетилцистеина не влияет на активацию антиоксидантной программы соединениями формулы (1) The combined addition of glutathione or acetylcysteine does not affect the activation of the antioxidant program by the compounds of formula (1)
Получение репортерной клеточной линии: ARE-люциферазный репортер был воспроизведен по протоколу [Wang X.J., Hayes J.D., Wolf C.R.I Generation of a Stable Antioxidant Response Element-Driven Reporter Gene Cell Line and Its Use to Show Redox- Dependent Activation of Nrf2 by Cancer Chemotherapeutic Agents // Cancer Res - 2006; - 66: p. 10983-10994]. А именно, был использован pGL3 вектор фирмы Promega (Великобритания) содержащий SV40 промотор перед геном люциферазы светляков. Перед промотором люциферазы была сделана вставка по сайтам рестрикции Nhel и Xhol восьми ARE- последовательностей мыши:  Production of a reporter cell line: ARE-luciferase reporter was reproduced according to the protocol [Wang XJ, Hayes JD, Wolf CRI Generation of a Stable Antioxidant Response Element-Driven Reporter Gene Cell Line and Its Use to Show Redox-Dependent Activation of Nrf2 by Cancer Chemotherapeutic Agents // Cancer Res - 2006; - 66: p. 10983-10994]. Namely, the pGL3 vector of the company Promega (Great Britain) containing the SV40 promoter in front of the firefly luciferase gene was used. Before the luciferase promoter, an insert was made at the Nhel and Xhol restriction sites of eight mouse ARE sequences:
5-GTGACAAAGCACCCGTGACAAAGCACCCGTGACAAAGCACCCGTGACAAAGCACCC GTGACAAAGCACCCGTGACAAAGCACCCGTGACAAAGCACCCGTGACAAAGCA-ЗЦ  5-GTGACAAAGCACCCGTGACAAAGCACCCGTGACAAAGCACCCGTGACAAAGCACCC GTGACAAAGCACCCGTGACAAAGCACCCGTGACAAAGCACCCGTGACAAAGCA-ZZ
Линкер с последовательностью 5-ССС-З и 5-GGG-3 на противоположной цепи был помещен между индивидуальными cis-элементами.  A linker with the sequence 5-CCC-3 and 5-GGG-3 on the opposite chain was placed between the individual cis-elements.
ю Для получения стабильной клеточной линии, экспрессирующей сконструированный репортер, трансформировали клеточную линию MCF7 (карцинома груди человека) полученной конструкцией в присутствии на порядок более низкой концентрации плазмиды pcDNA3.1 , содержащей неомициновый маркер для селекции (антибиотик генетицин) с помощью липофектамина. Трансформированные клетки селектировали на DMEM-glutamax среде с 10% FBS и антибиотиках (включая 0,8 мг/мл генетицина). Клетки культивировали при 37°С, в инкубаторе (95% воздух и 5% С02), пересевая каждые 3-4 дня. Генетицин- резистетные клоны анализировали на индукцию люциферазной активности в присутствии 20 мкМ трет-бутилгидрохинона (t-BHQ) при инкубации в течение 8 часов, и положительные клоны отбирали для последующих пассажей. Стабильная линия, полученная через 4 недели после трансформации, была использована для скрининга тиенопиримидинов и пирролопиримидиновых структурных аналогов. Клетки засевали в белые 96-луночные планшеты с плотностью 12 тысяч клеток на лунку (100 мкл среды), инкубировали ночь, и затем добавляли по 2 мкл раствора соединения в DMSO (диметилсульфоксид), до конечной концентрации 2, 1 , 0.5; 0,25; и 0.125 мкМ в присутствии или отсутствие 2 мМ глутатиона или Ν-ацетилцистеина . Через 8 часов инкубации, клетки солюбилизировали раствором NP-40 в течение 10 минут и люциферазную активность (люминесценцию) измеряли с помощью люциферазного реагента фирмы Биолюкс (Россия) на приборе фирмы Molecular Devices (500 мсек интеграция сигнала). В качестве контроля использовали DMSO, уровень люциферазной активности принимали за базальный. Активацию рассчитывали делением сигнала в присутствии соединения на базальный уровень. Yu To obtain a stable cell line expressing the constructed reporter, the MCF7 cell line (human breast carcinoma) was transformed with the obtained construct in the presence of an orderly lower concentration of plasmid pcDNA3.1 containing a neomycin selection marker (antibiotic geneticin) using lipofectamine. Transformed cells were selected on DMEM-glutamax medium with 10% FBS and antibiotics (including 0.8 mg / ml geneticin). Cells were cultured at 37 ° C in an incubator (95% air and 5% C0 2 ), reseeding every 3-4 days. Geneticin-resistant clones were analyzed for the induction of luciferase activity in the presence of 20 μM tert-butylhydroquinone (t-BHQ) upon incubation for 8 hours, and positive clones were selected for subsequent passages. The stable line obtained 4 weeks after transformation was used to screen thienopyrimidines and pyrrolopyrimidine structural analogues. Cells were seeded in white 96-well plates with a density of 12 thousand cells per well (100 μl of medium), incubated overnight, and then 2 μl of a solution of the compound in DMSO (dimethyl sulfoxide) was added, to a final concentration of 2, 1, 0.5; 0.25; and 0.125 μM in the presence or absence of 2 mM glutathione or Ν-acetylcysteine. After 8 hours of incubation, the cells were solubilized with an NP-40 solution for 10 minutes and luciferase activity (luminescence) was measured using a biolux reagent (Biolux, Russia) on a Molecular Devices instrument (500 ms signal integration). DMSO was used as a control; the level of luciferase activity was taken as basal. Activation was calculated by dividing the signal in the presence of the compound at the basal level.
Соединение Х1 является наилучшим активатором (Рис.1 А, 1 Б), главное структурное требование - наличие ароматического заместителя в положении 5 бицикла, в то время наличие фенильного кольца в положении 7 бицикла (R3 у пирролопиримидинов) приводит к подавлению активации в субмикромолярном диапазоне. Комбинация соединений формулы (I) с неспецифическими внутриклеточными тиоловыми восстановителями типа цистеина, ацетилцистеина, или глутатиона не влияет на параметры активации (Рис.1 В), что объясняется неспособностью Соединений формулы (I) к алкилированию указанных тиолов в водных растворах in vitro. Механизм активации репортера соединениями формулы (I) (Рис.1) в настоящий момент достоверно не установлен, но предполагается, что соединения формулы I в субмикромолярном диапазоне алкилируют Кеар1 (ингибитор Nrf2) исключительно по активным цистеинам, поскольку, как указано выше, неспецифические тиолы не модифицируют.  Compound X1 is the best activator (Fig. 1 A, 1 B), the main structural requirement is the presence of an aromatic substituent at position 5 of the bicycle, while the presence of a phenyl ring at position 7 of the bicycle (R3 in pyrrolopyrimidines) leads to a suppression of activation in the submicromolar range. The combination of compounds of formula (I) with non-specific intracellular thiol reducing agents such as cysteine, acetylcysteine, or glutathione does not affect the activation parameters (Fig. 1 B), which is explained by the inability of the Compounds of formula (I) to alkylate these thiols in aqueous solutions of in vitro. The mechanism of activation of the reporter by compounds of formula (I) (Fig. 1) has not been reliably established at the moment, but it is assumed that the compounds of formula I in the submicromolar range alkylate Kear1 (Nrf2 inhibitor) exclusively for active cysteines, since, as indicated above, non-specific thiols are not modify.
Таким образом, соединения формулы 1 являются активаторами ARE-люциферазного репортера и следовательно активаторами антиоксидантной генетической программы на молекулярном уровне. Для подтверждения этого в примере 2 проведено измерение активационного эффекта лучших соединений на содержание матричной РНК двух наиболее значимых генов, регулируемых Nrf2, а именно гемоксигеназа-1 и NADPH:XHHOH оксидоредуктаза-1. Thus, the compounds of formula 1 are activators of the ARE-luciferase reporter and therefore activators of the antioxidant genetic program on molecular level. To confirm this, in Example 2, we measured the activation effect of the best compounds on the content of messenger RNA of the two most significant genes regulated by Nrf2, namely hemoxygenase-1 and NADPH: XHHOH oxidoreductase-1.
Пример 2. Example 2
Индукция синтеза генов, контролируемых Nrf2, под действием соединений формулы 1  Induction of the synthesis of genes controlled by Nrf2 under the action of compounds of formula 1
Эмбриональные мышиные фибробласты обрабатывали Соединениями Х1 и-Х2 (0,5 мкМ) в течение 8 часов. РНК выделяли, используя Тризол-реагент фирмы Invitrogen в соответствии с методикой производителя. Один микрограмм выделенной РНК обрабатывали обратной транскриптазой используя набор "High-Capacityc DNA Reverse Transcription Kit" фирмы Invitrogen (США), полученную кДНК разбавляли, и 100 нанограмм использовали для амплификации на приборе фирмы Applied Biosystems (ABI prism 7900HT Real-time PCR system) для получения транскриптов Мгт2-зависимых генов: гемоксигеназы-1 (НО-1 , 5'- GGGTGATAGAAGAGGCCAAGA-3' и 5'-AGCTCCTGCAACTCCTCAAA-3') и Embryonic murine fibroblasts were treated with Compounds X1 and X2 (0.5 μM) for 8 hours. RNA was isolated using Invitrogen Trizol reagent in accordance with the manufacturer's procedure. One microgram of the isolated RNA was processed by reverse transcriptase using the Invitrogen High-Capacityc DNA Reverse Transcription Kit (USA), the cDNA was diluted, and 100 nanograms were used for amplification using an Applied Biosystems instrument (ABI prism 7900HT Real-time PCR system) for for obtaining transcripts of Mgt2-dependent genes: hemoxygenase-1 (HO-1, 5'-GGGTGATAGAAGAGGCCAAGA-3 'and 5'-AGCTCCTGCAACTCCTCAAA-3') and
NADPH:XHHOH оксидоредуктазы 1 (NQ01 , 5'-AGCGTTCGGTATTACGATCC-3' и 5'- AGTAC AATCAGG G CTCTTCTCG-3') используя Fast SYBR_ Green Master Mix (Invitrogen, США). Параметры цикла PCR: 10 сек при 95°С , затем 1 мин при 60°С. Полученные значения нормализовали на уровень экспрессии бета-актина (праймеры для амплификации бета- актина: 5'-CTAAGGCCAACCGTGAAAAG-3' и 5'-ACCAGAGGCATACAGGGACA-3'). NADPH: XHHOH oxidoreductase 1 (NQ01, 5'-AGCGTTCGGTATTACGATCC-3 'and 5'-AGTAC AATCAGG G CTCTTCTCG-3') using Fast SYBR_ Green Master Mix (Invitrogen, USA). PCR cycle parameters: 10 sec at 95 ° C, then 1 min at 60 ° C. The values obtained were normalized to the level of beta-actin expression (primers for amplification of beta-actin: 5'-CTAAGGCCAACCGTGAAAAG-3 'and 5'-ACCAGAGGCATACAGGGACA-3').
Как следует из Рис.2, соединения формулы 1 активируют синтез гемоксигеназы-1 и NADPH:XHHOH оксидоредуктазы-1 , главных мишеней Nrf2. При этом степень активации (уровень мРНК) соответствует активности соединений в репортерном анализе (Рис.1), а именно, соединение Х1 показывает лучшую активацию репортера чем соединение Х2 (Пример 1). В дальнейших экспериментах использованы эти два соединения.  As follows from Fig. 2, the compounds of formula 1 activate the synthesis of hemoxygenase-1 and NADPH: XHHOH oxidoreductase-1, the main targets of Nrf2. Moreover, the degree of activation (mRNA level) corresponds to the activity of the compounds in the reporter analysis (Fig. 1), namely, compound X1 shows better reporter activation than compound X2 (Example 1). In further experiments, these two compounds were used.
Примеры разнообразных видов биологической активности, проявляемых соединениями общей формулы (I) in vitro и in vivo, приведены ниже.  Examples of various types of biological activity exhibited by compounds of the general formula (I) in vitro and in vivo are given below.
Пример 3. Example 3
Антиоксидантная и гепатопротекторная активности одного из соединений общей формулы (I) в опыте invivo  Antioxidant and hepatoprotective activity of one of the compounds of the general formula (I) in an invivo experiment
Антиоксидантная активность тестировалась в опыте in vivo на модели острого токсического поражения печени четыреххлористым углеродом (ССЦ). Эксперимент проведен на 50 беспородных крысах-самцах с исходной массой 190-200 г, содержавшихся на стандартном рационе вивария. В каждой группе было по 10 животных. Поражение печени (экспериментальный гепатит) у животных вызывали введением ССЦвнутрижелудочно в виде 50% раствора в вазелиновом масле в объеме 0,25 мл на 100 г массы тела в течение 3 дней [Венгеровский А. И., Чучалин B.C., Паульс О. В., Саратиков А. С. / Влияние гепатопротекторов на метаболизм липидов при ССЦ - гепатите.// Бюлл. экспер. биол. -1987. -N 4. -с. 430-432] . Одно из исследуемых соединений (Х2) вводили животным внутрижелудочно в дозах 0,25, 0,5 и 1 мг/кг в течение трех суток в дни введения ССЦ (3, 4 и 5 группы). Животным контрольной группы вводили ССЦ как описано выше (2 группа). Интактные животные получали перорально физиологический раствор в эквивалентном количестве (1 группа). Через 24 часа после последнего введения препаратов животных декапитировали. Печень выделяли, промывали в солевом растворе, подсушивали и делили на образцы. Ткани замораживали в жидком азоте, если не использовали сразу. В образцах печени определяли антиоксидантный статус и содержание белка, часть образцов консервировали в 4% параформальдегиде для последующей гистологии. Antioxidant activity was tested in an in vivo experiment on a model of acute toxic liver damage with carbon tetrachloride (SSC). The experiment was conducted on 50 outbred male rats with an initial weight of 190-200 g contained in a standard diet of vivarium. There were 10 animals in each group. Liver damage (experimental hepatitis) in animals was caused by the administration of SCC intragastrically as a 50% solution in liquid paraffin in a volume of 0.25 ml per 100 g of body weight for 3 days [Vengerovsky A. I., Chuchalin BC, Pauls O. V., Saratikov A.S. / Effect of hepatoprotectors on lipid metabolism in SSC - hepatitis. // Bull. an expert. biol. -1987. -N 4.-s. 430-432]. One of the tested compounds (X2) was administered to animals intragastrically at doses of 0.25, 0.5, and 1 mg / kg for three days on the days of the introduction of SCS (groups 3, 4, and 5). The animals of the control group were injected with SSC as described above (group 2). Intact animals received oral saline in an equivalent amount (group 1). 24 hours after the last administration of the preparations, the animals were decapitated. The liver was isolated, washed in saline, dried and divided into samples. Tissues were frozen in liquid nitrogen if not used immediately. Antioxidant status and protein content were determined in liver samples; some of the samples were preserved in 4% paraformaldehyde for subsequent histology.
Биохимические тесты: Печень гомогенизировали в 50 мМ натрий-фосфатном буфере содержащем 0,15 М хлорида натрия, рН 7,4. Супернатант отделяли центрифугированием при 15000 g в течение 20 мин, при 4°С. Уровень перекисного окисления липидов в гомогенатах печени определяли по тесту с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) [Стальная И.Д., Гаришвили Т. Г. / Метод определения малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты.// В кн: Современные методы в биохимии. -М. -Медицина. -1977. -с. 66-69], проводя предварительную экстракцию липидов по Фолчу [Кейтс М. Техника липидологии.- М.- Мир.- 1975.- с. 74-76] [Коробейникова Э.Н. / Модификация определения продуктов перекисного окисления липидов в реакции с тиобарбитуровой кислотой. // Лаб. дело. -1989. -N7. -с. 8-10]. Образцы инкубировали с 8,1% SDS и 20% уксусной кислотой. Затем супернатанты смешивали с 0.8% ТХУ (трихлоруксусной кислотой) и нагревали при 95°С в течение 1 часа. Образовавшийся хромоген экстрагировали смесью 1-бутанол/пиридин (15:1 , о/о) и измеряли поглощение на 532 нм. Концентрацию ТБК-активных продуктов в наномолях малонового диальдегида на мг белка рассчитывали с помощью уравнения регрессии. Активность супероксиддисмутазы (СОД) определяли на 438 нм по уменьшению поглощения формазанового продукта окисления WST-1 супероксид-радикалом, генерируемым системой ксантин/ксантинокисдаза в соответствии с протоколом фирмы BioLabs (США). Белок в гомогенатах определяли методом Бредфорд. Результаты эксперимента обрабатывались статистически с применением t-критерия Стьюдента [Гублер Е. В. Вычислительные методы анализа и распознавание патологических процессов. -М. -Наука. -1978. -с. 365]. Гепатопротектоная активность определялась следующим образом. Образцы печени помещали в пластиковые кассеты и заливали 4% параформальдегидом на 48 часов. После фиксации степень повреждения печени оценивалась по измерению области некроза посекционно при окрашивании гематоксилином и эозином под микроскопом. (Olympus ВХ51 , Япония). Некротические зоны определялись визуально и процент некроза рассчитывали в программе Cell F v3.1 , Olympus Soft Imaging Solutions, Мюнстер, Германия. Biochemical tests: The liver was homogenized in 50 mM sodium phosphate buffer containing 0.15 M sodium chloride, pH 7.4. The supernatant was separated by centrifugation at 15,000 g for 20 min, at 4 ° C. The level of lipid peroxidation in liver homogenates was determined according to the test with thiobarbituric acid (TAC) [Steel ID, Garishvili TG / Method for determination of malondialdehyde using thiobarbituric acid. // In: Modern methods in biochemistry. -M. -The medicine. -1977. -from. 66-69], conducting preliminary extraction of lipids according to Folch [Cates M. Technique of lipidology.- M.- Mir.- 1975.- p. 74-76] [Korobeinikova E.N. Modification of the determination of lipid peroxidation products in reaction with thiobarbituric acid. // Lab. a business. -1989. -N7. -from. 8-10]. Samples were incubated with 8.1% SDS and 20% acetic acid. Then the supernatants were mixed with 0.8% TCA (trichloroacetic acid) and heated at 95 ° C for 1 hour. The resulting chromogen was extracted with 1-butanol / pyridine (15: 1, v / v) and the absorbance was measured at 532 nm. The concentration of TBA-active products in nanomoles of malondialdehyde per mg of protein was calculated using the regression equation. Superoxide dismutase (SOD) activity was determined at 438 nm by reducing the absorption of the formazan product of the WST-1 oxidation by the superoxide radical generated by the xanthine / xanthine oxidase system in accordance with the protocol of BioLabs (USA). Protein in homogenates was determined by the Bradford method. The experimental results were processed statistically using Student's t-criterion [E. Gubler. Computational methods of analysis and recognition of pathological processes. -M. -The science. -1978. -from. 365]. Hepatoprotectonic activity was determined as follows. Liver samples were placed in plastic cassettes and filled with 4% paraformaldehyde for 48 hours. After fixation, the degree of liver damage was evaluated by measuring the area of necrosis section by section when stained with hematoxylin and eosin under a microscope. (Olympus BX51, Japan). Necrotic zones were determined visually and the percentage of necrosis was calculated using the Cell F v3.1 program, Olympus Soft Imaging Solutions, Munster, Germany.
Как следует из Рис. За соединение Х2 обладает гепатопротекторным действием, выражающимся в существенном уменьшении области некротического повреждения печени при остром отравлении четыреххлористым углеродом.  As follows from Fig. Compound X2 has a hepatoprotective effect, which manifests itself in a significant decrease in the area of necrotic damage to the liver during acute carbon tetrachloride poisoning.
Результаты, представленные на Рис. 36, свидетельствуют, что введение крысам ССЦ приводило к накоплению продуктов ПОЛ в печени. У животных экспериментальных групп, которым вводили одно из исследуемых соединений, отмечалось достоверное снижение содержания первичных продуктов ПОЛ в печени. Результаты, представленные на Рис.Зв свидетельствуют, что введение крысам ССЦ приводило к падению уровня супероксиддисмутазы. У животных экспериментальных групп, которым вводили одно из исследуемых соединений, отмечалось достоверное повышение активности фермента вплоть до нормального уровня.  The results presented in Fig. 36 indicate that administration of SSC to rats led to the accumulation of LPO products in the liver. In animals of the experimental groups, which were administered one of the studied compounds, a significant decrease in the content of primary lipid peroxidation products in the liver was noted. The results presented in Fig. Sv indicate that administration of SSC to rats led to a drop in the level of superoxide dismutase. In animals of the experimental groups, which were injected with one of the studied compounds, a significant increase in enzyme activity was noted up to the normal level.
Таким образом, соединение общей формулы (1) обладает выраженным антиоксидантным действием в модели острого токсического поражения печени.  Thus, the compound of general formula (1) has a pronounced antioxidant effect in the model of acute toxic liver damage.
Пример 4. Example 4
Защитное действие Соединения формулы (1) от повреждающего действия 4- оксиноненаля, основного продукта перекисного окисления липидов при ишемии- реперфузии  Protective effect of the Compounds of formula (1) from the damaging effect of 4-oxinonenal, the main product of lipid peroxidation in ischemia-reperfusion
Активные формы кислорода (ROS) атакуют ненасыщенные жирные кислоты мембран и запускают реакцию перекисного окисления липидов, которая приводит к образованию α,β- ненасыщенных альдегидов, таких как 4-окси-2-ноненаль (ΗΝΕ). Высокие концентрации ненасыщенных альдегидов являются главным повреждающим фактором при ишемии- реперфузии сердечной ткани. Данный пример показывает что предварительная обработка соединением формулы 1 (Х1) защищает кардиомицеты от летальных доз 4-окси-2-ноненаля.  Active oxygen species (ROS) attack membrane unsaturated fatty acids and initiate lipid peroxidation, which leads to the formation of α, β-unsaturated aldehydes, such as 4-hydroxy-2-nonenal (ΗΝΕ). High concentrations of unsaturated aldehydes are the main damaging factor in ischemia-reperfusion of heart tissue. This example shows that pretreatment with a compound of formula 1 (X1) protects cardiomycetes from lethal doses of 4-hydroxy-2-nonenal.
Неонатальные вентрикулярные миоциты из 1-2-дневных беспородных крыс-самцов подвергались градиентному центрифугированию и дифференциальному высеванию с целью обогащения культуры кардиомиоцитами. Жизнеспособность клеток определяли с помощью коммерческого набора (LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Assay Kit, LifeTechnologies Corp., США), принцип действия которого основан на одновременном определении живых и мертвых клеток с помощью кальцеина AM и этидиум гомодимера-1 , специфичных к внутриклеточной эстеразной активности и целостности мембраны соответственно. Флуоресцентные микрографии (живые клетки окрашены зеленым, а ядра мертвых клеток красным) были получены на флуоресцентном микроскопе BZ-9000 (Кеуепсе, Япония). Neonatal ventricular myocytes from 1-2 day old outbred male rats were subjected to gradient centrifugation and differential seeding to enrich the culture with cardiomyocytes. Cell viability was determined using a commercial kit (LIVE / DEAD Viability / Cytotoxicity Assay Kit, LifeTechnologies Corp., USA), the principle of which is based on the simultaneous determination of living and dead cells using calcein AM and ethidium homodimer-1, specific for intracellular esterase activity and membrane integrity, respectively. Fluorescence micrographs (living cells are stained green and dead cell nuclei are red) were obtained with a BZ-9000 fluorescence microscope (Keuepse, Japan).
Для изучения влияния соединения формулы 1 , кардиомиоциты были обработаны 0,25 мкМ соединения Х1 и контролем, не содержащим данного вещества, инкубированы в течение 14 ч и затем обработаны цитотоксической концентрацией HNE в течение 24 часов. Жизнеспособность контрольных кардиомиоцитов составила 24,6%±4,3% для 20 мкМ HNE и 15,4%±1 ,8% для 30 мкМ HNE. Предобработка соединением Х1 (0,25 мкМ) значительно увеличила жизнеспособность кардиомиоцитов до 72,0%±5,5% (20 мкМ HNE) и 38,6%±4,1 % (30 мкМ HNE) соответственно (Рис. 4а, б).  To study the effect of a compound of formula 1, cardiomyocytes were treated with 0.25 μM of compound X1 and a control that did not contain this substance, incubated for 14 hours and then treated with a cytotoxic concentration of HNE for 24 hours. The viability of the control cardiomyocytes was 24.6% ± 4.3% for 20 μM HNE and 15.4% ± 1.8% for 30 μM HNE. Pretreatment with compound X1 (0.25 μM) significantly increased cardiomyocyte viability to 72.0% ± 5.5% (20 μM HNE) and 38.6% ± 4.1% (30 μM HNE), respectively (Fig. 4a, b )
Как следует из Рис.4, Соединение общей формулы (1) обладает кардиопротекторными свойствами: предобработка им существенно повышает выживаемость кардиомиоцитов при последующей обработке 4-оксиноненалем, основным фактором повреждения при ишемии-реперфузии.  As follows from Fig. 4, the Compound of general formula (1) has cardioprotective properties: pretreatment with it significantly increases the survival of cardiomyocytes during subsequent treatment with 4-oxinonenal, the main damage factor in ischemia-reperfusion.
Пример 5. Example 5
Уменьшение кардиотоксичности доксорубицина при одновременной администрации Соединения формулы (1)  Decreased cardiotoxicity of doxorubicin with simultaneous administration of the Compound of formula (1)
Доксорубицин (DOX), антрациклиновый антибиотик, широко используемый в химиотерапии опухолей и злокачественных заболеваний крови, имеет существенные ограничения применения в связи с кумулятивной дозо-зависимой кардиотоксичностью. Механизм кардиотоксичности DOX непонятен до сих пор, но индукция апоптоза DOXOM у кардиомицитов достоверно установлена. До настоящего времени не разработано контрагентов, которые могли бы оказывать превентивное действие и предотвращать высокую кардиотоксичность DOXa при совместной администрации.  Doxorubicin (DOX), an anthracycline antibiotic widely used in chemotherapy of tumors and malignant blood diseases, has significant limitations due to cumulative dose-dependent cardiotoxicity. The mechanism of DOX cardiotoxicity is still unclear, but the induction of DOXOM apoptosis in cardiomyocytes has been reliably established. To date, no counterparties have been developed that could have a preventive effect and prevent high cardiotoxicity of DOXa during joint administration.
Беспородные крысы-самцы 220-240 г содержались в клетках с контролируемой температурой (25°С) и циклом день-ночь (12/12) и свободным доступом к воде и пище. Самцы были разделены случайным образом на 4 группы по 10 крыс: контрольная группа, X группа, DOX группа, и DOX+X группа. Крысам групп X и DOX+X вводили одно из исследуемых соединений (а именно Х1) внутрижелудочно в дозе 1 мг/кг в течение 3 дней, животные двух первых групп получали перорально физиологический раствор в эквивалентном количестве. Начиная с четвертого дня животные получали каждый второй день (7 раз, 14 дней) внутрибрюшинно: физиологический раствор (контрольная группа), DOX 2.5 мг на кг в DOX группе; 1 мг/кг соединения Х1 внутрижелудочно за час до инъекции DOX в группе DOX+X; 1 мг/кг соединения Х1 внутрижелудочно в X группе. Через 24 часа после последней дозы DOX, эхокардиографические измерения (17.5- Гц RMV 707 насадка) проводились у крыс под анестезией пентабарбиталом натрия. Левый вентрикулярный (LV) конечный диастолический и систолический диаметры определялись в М-модальном режиме. Левый вентрикулярный конечный диастолический объем (LVEDV), ударный объем (SV), и LV глобальная сократимость (фракция выброса) (EF) рассчитывались по программе. Данные усреднялись по трем последовательным сердечным циклам. Outbred male rats 220-240 g were kept in cages with a controlled temperature (25 ° C) and a day-night cycle (12/12) and free access to water and food. The males were randomly divided into 4 groups of 10 rats: control group, X group, DOX group, and DOX + X group. The rats of groups X and DOX + X were given one of the test compounds (namely, X1) intragastrically at a dose of 1 mg / kg for 3 days, the animals of the first two groups received oral saline in an equivalent amount. Starting from the fourth day, animals received every second day (7 times, 14 days) intraperitoneally: saline (control group), DOX 2.5 mg per kg in the DOX group; 1 mg / kg of compound X1 intragastrically one hour before DOX injection group DOX + X; 1 mg / kg of compound X1 intragastrically in the X group. 24 hours after the last dose of DOX, echocardiographic measurements (17.5-Hz RMV 707 nozzle) were performed in rats under anesthesia with sodium pentabarbital. Left ventricular (LV) end diastolic and systolic diameters were determined in the M-modal mode. Left ventricular end diastolic volume (LVEDV), stroke volume (SV), and LV global contractility (ejection fraction) (EF) were calculated according to the program. Data were averaged over three consecutive cardiac cycles.
Таблица 1. Влияние соединения Х1 на сердечный насосTable 1. The effect of compound X1 on the heart pump
Группа п LVEDV (мл) SV (мл) EF (%) Group p LVEDV (ml) SV (ml) EF (%)
Контроль 10 207,6 +18,2 145,3 +16,3 72,3 +6,5  Control 10 207.6 +18.2 145.3 +16.3 72.3 +6.5
X 10 213,2 +20,8 152,2 +17,3 74,3 +6,9  X 10 213.2 +20.8 152.2 +17.3 74.3 +6.9
DOX 10 148,4 +10,8* 90,6 +8,6* 48,2 +4,1 *  DOX 10 148.4 + 10.8 * 90.6 + 8.6 * 48.2 + 4.1 *
DOX-X 10 189,2 +16,2** 128,6 +1 1 ,0** 64,9 +5,6**  DOX-X 10 189.2 + 16.2 ** 128.6 +1 1, 0 ** 64.9 + 5.6 **
LVEDV, левый вентрикулярный конечный диастолический объем; SV, ударный объем;  LVEDV, left ventricular end diastolic volume; SV, stroke volume;
EF, фракция выброса. *Р<0,05 для контрольной группы. **Р<0,05 для DOX группы.  EF, ejection fraction. * P <0.05 for the control group. ** P <0.05 for the DOX group.
Как следует из приведенных данных Соединение Х1 улучшает кардиологическую функцию крыс, подвергнутых действию доксорубицина. В конце эксперимента все крысы были живы, однако крысы в группах подвергнутых действию доксорубицина были довольно слабы. Эхокардиографические исследования (Таблица 1) показывают, что DOX значительно уменьшает параметры LVEDV, SV, EF, на 25-30%, а Соединение Х1 позволяет избежать такого сильного ухудшения - наблюдается 10-15% падение. As follows from the above data, Compound X1 improves the cardiological function of rats exposed to doxorubicin. At the end of the experiment, all rats were alive, but the rats in the groups exposed to doxorubicin were rather weak. Echocardiographic studies (Table 1) show that DOX significantly reduces the parameters of LVEDV, SV, EF by 25-30%, and Compound X1 avoids such a strong deterioration - a 10-15% drop is observed.
Выводы таблицы 1 совпадают с результатами гистопатологии (Рис.5). Образцы сердечной ткани были фиксированы 10% формалином (забуференным ацетатом) и затем заключены в парафин. Парафиновые блоки были нарезаны по 5мм и окрашены гематоксилином и эозином. Апопотоз миокарда определяли с помощью TUNEL анализа (terminaldeoxynucleotidyltransferase-mediateddUTP-biotinnickendlabelingassay) используя набор АрорТад фирмы Roche Applied Science (Г ермания). После обработки протеиназой К и инактивации эндогенной пероксидазы 0.3% раствором Н202, парафиновые слайды инкубировали в реакционной среде, содержащей рабочий раствор TdT и дигоксигенин- коньюгированного dUTP в течение 1 часа при 37°С. Затем меченая ДНК определялась анти- дигоксин-антителами мечеными пероксидазой. Пероксидазу прокрашивали тетрахлоридом 3,3'-диаминобензидина. Апоптотический индекс рассчитывали как процентное отношение количества клеток в стадии апоптоза к общему числу клеток. Таким образом, Соединение формулы (1) при совместной администрации с доксорубицином уменьшает кардиотоксичность последнего как на уровне поражения клеток (апоптоза), так и на функциональном уровне (параметры сердечных сокращений). The conclusions of table 1 coincide with the results of histopathology (Fig. 5). Cardiac tissue samples were fixed with 10% formalin (buffered acetate) and then embedded in paraffin. Paraffin blocks were cut into 5 mm and stained with hematoxylin and eosin. Myocardial apoptosis was determined using TUNEL analysis (terminaldeoxynucleotidyltransferase-mediateddTP-biotinnickendlabelingassay) using the ArorTad kit from Roche Applied Science (Germany). After treatment with proteinase K and inactivation of endogenous peroxidase with 0.3% H 2 0 2 solution, paraffin slides were incubated in a reaction medium containing a working solution of TdT and digoxigenin-conjugated dUTP for 1 hour at 37 ° C. Labeled DNA was then detected by peroxidase labeled anti-digoxin antibodies. Peroxidase was stained with 3,3'-diaminobenzidine tetrachloride. The apoptotic index was calculated as the percentage of the number of cells in the apoptosis stage to the total number of cells. Thus, the Compound of formula (1), when co-administered with doxorubicin, reduces the cardiotoxicity of the latter both at the level of cell damage (apoptosis) and at the functional level (heart rate parameters).
Пример 6. Example 6
Повышение жизнеспособности транспланта сердца при администрации Соединения формулы (1) реципиенту  Improving the viability of a heart transplant during administration of a Compound of formula (1) to a recipient
Две группы C57BL/6 Мыши 8-12 недельного возраста - контрольная и получающая предобработку Соединением Х1 были использованы для трансплантации. Две группы по шесть 8-месячных мышей Balb/c mice были использованы как доноры для трансплантации. Все животные получали воду и пищу adlibitum. Животным группы X ежедневно внутримышечно вводили соединение Х1 (1 мг/кг) начиная за день до шеечной гетеротопической аллотрансплантации (контрольной группе вводили физиологический раствор). Гетеротопическая аллотрансплантация сердца является удобной моделью для дальнейших изысканий оптимальных способов создания толерантности организма к аллотрансплантатам. По сравнению с ортотопической пересадкой эта модель трансплантации имеет определенные преимущества. Во-первых, она значительно упрощает технику операции, так как требует наложения только двух сосудистых анастомозов. Во- вторых, определение жизнеспособности трансплантата не представляет труда, поскольку с началом процесса отторжения сокращения сердца прекращаются. Мониторинг жизнеспособности графта проводился ежедневно и как только графт переставал биться, животных декапитировали.  Two groups of C57BL / 6 mice of 8-12 week olds, control and pretreated with Compound X1, were used for transplantation. Two groups of six 8-month-old Balb / c mice mice were used as donors for transplantation. All animals received water and adlibitum food. Group X animals were daily injected intramuscularly with compound X1 (1 mg / kg) starting the day before the cervical heterotopic allotransplantation (physiological saline was administered to the control group). Heterotopic allotransplantation of the heart is a convenient model for further research on the best ways to create tolerance of the body to allografts. Compared with orthotopic transplantation, this transplantation model has certain advantages. Firstly, it greatly simplifies the technique of surgery, since it requires the application of only two vascular anastomoses. Secondly, determining the viability of a transplant is not difficult, since with the onset of rejection, heart contractions cease. Graft viability was monitored daily and as soon as the graft ceased to beat, the animals were decapitated.
Таблица 2. Выживаемость трансплантированных сердец Table 2. Survival of transplanted hearts
Реципиент Контроль Соединение Х1  Recipient Control Compound X1
9.6 17  9.6 17
10.6 15.6  10.6 15.6
Время 9.8 13.8  Time 9.8 13.8
дни  days
жизни 9.3 13.3  life 9.3 13.3
9 12.3  9 12.3
9.7 13.7 Как следует из данных таблицы 2, Соединение формулы (1) увеличивает продолжительность жизни графта с 10 до 13 и больше дней. Таким образом, Соединение формулы (1) обладает способностью увеличения жизнеспособности трансплантов. 9.7 13.7 As follows from the data of table 2, the Compound of formula (1) increases the life expectancy of the graft from 10 to 13 or more days. Thus, the compound of formula (1) has the ability to increase the viability of the transplants.
Пример 7 Example 7
Уменьшение нефротоксичности цисплатина при администрации Соединения формулы (1)  Decreased nephrotoxicity of cisplatin during administration of a Compound of formula (1)
Повреждение почек вызывали одной внутрибрюшинной инъекцией цисплатина (Sigma Chemical Со, США) (7 мг/кг). 30 беспородных крыс-самцов разбили на 4 группы: 1 группа контрольная (физиологический раствор), группа 2 1 мг/кг Соединения Х1 ежедневно в течение 12 дней, начиная за 2 дня до инъекции цисплатина, Группа 3 одна инъекция цисплатина, Группа 4 - инъекция цисплатина и администрация Соединения Х1 по той же схеме что и группа 2. На 12-й день крыс декапитировали. Образцы крови были взяты на анализ и почки были взяты для гистологических исследований.  Kidney damage was caused by a single intraperitoneal injection of cisplatin (Sigma Chemical Co., USA) (7 mg / kg). 30 outbred male rats were divided into 4 groups: 1 group control (physiological saline), group 2 1 mg / kg Compounds X1 daily for 12 days, starting 2 days before cisplatin injection, Group 3 one injection of cisplatin, Group 4 injection cisplatin and administration of Compound X1 according to the same scheme as group 2. On day 12, rats were decapitated. Blood samples were taken for analysis and kidneys were taken for histological studies.
Таблица 3. Влияние администрации Соединения Х1 на уровень азота и креатинина у экспериментальных крыс (п=10) Table 3. The effect of administration of Compound X1 on the level of nitrogen and creatinine in experimental rats (n = 10)
Г руппы  R groups
Показатель  Indicator
Контроль Х1 Цисплатин Х1 +Цисплатин Control X1 Cisplatin X1 + Cisplatin
Мочевина-Ν Urea-Ν
32,0 ±3,5 31 ,0 ±2,0 456,8 ±63,5 150,0 ±30,0  32.0 ± 3.5 31.0 ± 2.0 456.8 ± 63.5 150.0 ± 30.0
( г/дл)  (g / dl)
Креатинин Creatinine
0,70 ±0,20 0,70 ±0,15 3,85 ±0,50 1 ,73 ±0,46  0.70 ± 0.20 0.70 ± 0.15 3.85 ± 0.50 1, 73 ± 0.46
( л/дл)  (l / dl)
Среднее значение ± SE для 10 крыс в каждой группе. Р<0.05  Mean ± SE for 10 rats in each group. P <0.05
Биохимический анализ: образцы крови центрифугировали при 3000 g в течение 10 мин, для получения сыворотки. Сывороточный азот (мочевина-Ν) и креатинин были измерены на биохимическом анализаторе Flexor Junior (Vital Scientific B.V., Нидерланды). Белок экстрагировали при гомогенизации почек крыс в 1 мл ледяного гипотонического буфера А содержащего 10 мМ HEPES (рН 7,8), 10 мМ KCI, 2 мМ MgCI2, 1 мМ дитиотрейтол (DTT), 0,1 мМ этилен диаминтетрауксусной кислоты (EDTA), и 0,1 мМ фенилметилсульфонилфторид (PMSF). К гомогенату добавляли 80 мкл 10% раствор Nonidet Р-40 (NP-40), и центрифугировали в течение 2 мин при 14000 д. Осадок содержал ядерную фракцию и использовался далее для иммуноблоттинга - определения транскрипционных факторов NFKB (воспаление) и АР-1 (апоптоз). Осадок промывали 500 мкл буфера А, в который добавляли 40 мкл 10% NP-40, центрифугировали, ресуспендировали в 200 мкл буфера С (50 мМ HEPES (рН 7,8), 50 мМ KCI, 300 мМ NaCI, 0,1 мМ EDTA, 1 мМ DTT, 0,1 мМ PMSF, 20% глицерин), центрифугировали 5 мин при 14800 д. Надосадочную жидкость собирали для иммуноблоттинга. Белок определяли по Лоури набором фирмы Sigma (St. Louis, Миссури, США). SDS-PAGE проводили в присутствии 2% 2-меркаптоэтанола в образцах, которые во всех случаях содержали одинаковое количество белка (50 мкг), и затем проводили перенос на нитроцеллюлозную мембрану (Schleicherand Schuell Inc., США). Мембрану затем промывали дважды по 5 мин PBS (фосфатным буфером с NaCI), а затем инкубировали 1 час в 1 % BSA в PBS (для уменьшения неспецифического связывания антител). Антитела против NFKB (р65) и АР-1 были куплены у Abeam (Великобритания). Первичные антитела разводили (1 :1000) в том же буфере содержащем 0,05% Tween-20. Нитроцеллюлозную мембрану инкубировали ночь при 4°С с первичными антителами. Блоты промывали и инкубировали с HRP (пероксидаза из корней хрена)-коньюгированными противомышиными козьими антителами (Abeam, Великобритания). Окрашивание проводили пероксидом водорода и диаминобензидином. Моноклональные антитела против β-актина использовали в качестве контроля содержания белка (А5316; фирмы Sigma). Интенсивность окрашивания измеряли на денситометре. Biochemical analysis: blood samples were centrifuged at 3000 g for 10 min to obtain serum. Serum nitrogen (urea-Ν) and creatinine were measured on a Flexor Junior biochemistry analyzer (Vital Scientific BV, Netherlands). The protein was extracted by homogenization of rat kidneys in 1 ml of ice-cold hypotonic buffer A containing 10 mM HEPES (pH 7.8), 10 mM KCI, 2 mM MgCI2, 1 mM dithiothreitol (DTT), 0.1 mM ethylene diaminetetraacetic acid (EDTA), and 0.1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF). 80 μl of a 10% Nonidet P-40 (NP-40) solution was added to the homogenate, and centrifuged for 2 min at 14000 d. The precipitate contained a nuclear fraction and was then used for immunoblotting to determine the transcription factors NFKB (inflammation) and AP-1 ( apoptosis). The pellet was washed with 500 μl of buffer A, in which was added 40 μl of 10% NP-40, centrifuged, resuspended in 200 μl of buffer C (50 mm HEPES (pH 7.8), 50 mm KCI, 300 mm NaCI, 0.1 mm EDTA, 1 mm DTT, 0.1 mM PMSF, 20% glycerol), centrifuged for 5 min at 14800 d. The supernatant was collected for immunoblotting. Protein was determined by Lowry kit company Sigma (St. Louis, Missouri, USA). SDS-PAGE was performed in the presence of 2% 2-mercaptoethanol in samples, which in all cases contained the same amount of protein (50 μg), and then transferred to a nitrocellulose membrane (Schleicherand Schuell Inc., USA). The membrane was then washed twice with 5 min PBS (phosphate buffer with NaCI), and then incubated for 1 hour in 1% BSA in PBS (to reduce non-specific binding of antibodies). Antibodies against NFKB (p65) and AP-1 were purchased from Abeam (UK). Primary antibodies were diluted (1: 1000) in the same buffer containing 0.05% Tween-20. The nitrocellulose membrane was incubated overnight at 4 ° C with primary antibodies. Blots were washed and incubated with HRP (horseradish root peroxidase) -conjugated anti-mouse goat antibodies (Abeam, UK). Staining was performed with hydrogen peroxide and diaminobenzidine. Monoclonal antibodies against β-actin were used as a control of protein content (A5316; Sigma). The staining intensity was measured on a densitometer.
Соединение формулы (1) обладает способностью уменьшать нефротоксичность цисплатина как следует из данных таблицы 4, а именно понижает уровень азота (в 3 раза) и креатинина (в 2 раза), которые показывают сильное увеличение при поражении почек цисплатином, и значительно понижают уровень транскрипционных факторов, активация которых характерна для воспалительного процесса (NF-κΒ) И апоптоза (АР-1).  The compound of formula (1) has the ability to reduce the nephrotoxicity of cisplatin as follows from the data in table 4, namely it reduces the levels of nitrogen (3 times) and creatinine (2 times), which show a strong increase in kidney damage with cisplatin, and significantly reduce the level of transcription factors , activation of which is characteristic of the inflammatory process (NF-κΒ) and apoptosis (AR-1).
Пример 8 Example 8
Нейропротекторные свойства соединения формулы (1) при ишемическом инсульте  Neuroprotective properties of the compounds of formula (1) in ischemic stroke
Крыс-самцов Спрег-Доули подвергали модельному инсульту (зажим средней мозговой артерии) и случайным образом делили на 4 группы. Контроль (0.9% физиологический раствор), низкая доза (0,25 мг/кг) и высокая доза (1 мг/кг) Соединения Х1.  Male Sprague-Dawley rats underwent a model stroke (clamp of the middle cerebral artery) and were randomly divided into 4 groups. Control (0.9% saline), low dose (0.25 mg / kg) and high dose (1 mg / kg) of Compound X1.
Соединение вводили внутрибрюшинно непосредственно после инсульта. Объем инфаркта измеряли через 24 часа после инсульта. Иммуногистохимию и биохимические анализы проводили как описано в Примере (см выше).  The compound was administered intraperitoneally immediately after a stroke. The volume of a heart attack was measured 24 hours after a stroke. Immunohistochemistry and biochemical analyzes were performed as described in the Example (see above).
Стандартная модель окклюзии средней мозговой артерии (СМА) была использована для создания постоянной очаговой (фокальной) ишемии как описано в литературе (Longa E.Z., Weinstein P.R., Carlson S., Cummins R. / Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.// Stroke. -1989, -20, -p. 84-91). А именно, крыс подвергали анестезии внутрибрюшинной инъекцией пентобарбитала натрия (50 мг/кг). Под анестезией, правосторонняя общая сонная артерия была изолирована. Окклюзию СМА проводили введением монофиламента с нейлоновым покрытием во внутреннюю сонную артерию вплоть до начала СМА (Kuge Y., Minematsu К., Yamaguchi Т., Miyake Y. Nylon monofilament for intraluminal middle cerebral artery occlusion in rats. //Stroke.— 1995.— 26.— P. 1655— 1658), в которой поток крови регистрировали в течение всего эксперимента на мониторе moorVMS- LDF фирмы Moor Instruments Ltd, (Великобритания), с помощью оптического волокна прикрепленного к черепу в районе СМА (6 мм латерально и 2 мм позади от брегмы) до и после зажима правой СМА. Крыс, у которых кровопоток через СМА уменьшался менее чем на 70% исключали из эксперимента. Ректальная температура контролировалась на уровне 37+/- 0.5 °С. У контрольной группы без инфаркта группы проводилась та же хирургия за исключением введения филамента. The standard model of occlusion of the middle cerebral artery (CMA) was used to create permanent focal (focal) ischemia as described in the literature (Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S., Cummins R. / Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.// Stroke. -1989, -20, -p. 84-91). Namely, the rats were anesthetized with an intraperitoneal injection of sodium pentobarbital (50 mg / kg). Under anesthesia, the right-sided common carotid artery was isolated. CMA occlusion was performed by introducing a nylon-coated monofilament into the internal carotid artery up to the onset of CMA (Kuge Y., Minematsu K., Yamaguchi T., Miyake Y. Nylon monofilament for intraluminal middle cerebral artery occlusion in rats. // Stroke.- 1995. - 26.— P. 1655—1658), in which the blood flow was recorded during the entire experiment on a moorVMS-LDF monitor from Moor Instruments Ltd, (Great Britain), using an optical fiber attached to the skull in the region of the MCA (6 mm laterally and 2 mm behind Bregma) before and after clamping the right SMA. Rats in which blood flow through the MCA decreased by less than 70% was excluded from the experiment. Rectal temperature was controlled at 37 +/- 0.5 ° С. In the control group without a heart attack, the same surgery was performed with the exception of the introduction of a filament.
Область инфаркта после окклюзии СМА определяли с помощью 2,3,5- трифенилтетразолий-хлорида (ТФТХ) через 24 часа после окклюзии. Животных декапитировали и мозги быстро выделяли и нарезали на 5 секций по 3 мм, прокрашивали 2% раствором ТФТХ при 37°С в течение 20 мин, и фиксировали 4% параформальдегидом. Нормальная ткань при этом окрашивалась в темно-красный цвет, а область инфаркта была бледно-серого цвета. Секции фотографировали и изображение обрабатывали с помощью программы Image-ProPlus 5.1. Область повреждения рассчитывалась умножением области инфаркта на толщину секции. Для учета эффекта эдемы мозга при расчете объема повреждения применяли формулу: Объем повреждения, % = {[общий объем инфаркта - (разница объемов интактной ипсилатерального и контралатерального полушария)/объем контралатерального полушария}х100% (Tatlisumak Т., Carano R.A., Takano К., Opgenorth T.J., Sotak С.Н., Fisher М. / А novel endothelin antagonist, A-127722, attenuates ischemic lesion size in rats with temporary middle cerebral artery occlusion: a diffusion and perfusion MRI study. // Stroke. -1998, -N29, -p.850-857).  The area of infarction after MCA occlusion was determined using 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TFC) 24 hours after occlusion. The animals were decapitated and the brains were quickly isolated and cut into 5 sections of 3 mm each, stained with a 2% TPC solution at 37 ° C for 20 minutes, and fixed with 4% paraformaldehyde. Normal tissue was stained dark red, and the infarct area was pale gray. Sections were photographed and the image was processed using Image-ProPlus 5.1. The damage area was calculated by multiplying the infarct area by the thickness of the section. To take into account the effect of brain edema in calculating the volume of damage, the following formula was used: Volume of damage,% = {[total volume of a heart attack - (difference between the volumes of the intact ipsilateral and contralateral hemisphere) / volume of the contralateral hemisphere} x100% (Tatlisumak T., Carano RA, Takano K. , Opgenorth TJ, Sotak S.N., Fisher M. / A novel endothelin antagonist, A-127722, attenuates ischemic lesion size in rats with temporary middle cerebral artery occlusion: a diffusion and perfusion MRI study. // Stroke. -1998, -N29, -p.850-857).
Иммуногистохимия и биохимия проводились по тем же методикам, что в примере 7 и 3 соответственно. Таблица 4.Нейропротекторные свойства Соединений формулы (1): повышение уровня суперооксиддисмутазы и уменьшение продуктов перекисного окисления липидов. Immunohistochemistry and biochemistry were carried out according to the same methods as in example 7 and 3, respectively. Table 4. Neuroprotective properties of the Compounds of formula (1): increase in superoxide dismutase level and decrease in lipid peroxidation products.
Соединение Соединение Compound Compound
Параметр Ед. измер. Контроль Инфаркт Х2 Х1 Unit parameter meas. Heart attack control X2 X1
1 мг/кг 1 мг/кг сод Е/мг белка 15 20 25 32  1 mg / kg 1 mg / kg soda E / mg protein 15 20 25 32
ТБК нмоль/мг 2,3 4,0 3,0 2,5  TAC nmol / mg 2.3 4.0 3.0 2.5
Соединения формулы (1) обладают нейропротекторными свойствами при ишемическом инсульте, уменьшая объем инсульта (Рис.7) и воспаление (уровень активации NF-κΒ. РИС.8), а также уменьшая уровень продуктов перекисного окисления липидов, и повышая уровень супероксиддисмутазы (таблица 4). The compounds of formula (1) possess neuroprotective properties in ischemic stroke, reducing the volume of stroke (Fig. 7) and inflammation (level of activation of NF-κΒ. FIG. 8), as well as reducing the level of lipid peroxidation products and increasing the level of superoxide dismutase (table 4 )
Пример 9 Example 9
Противоинсультное действие Соединения формулы (1) на модели  The anti-stroke effect of the Compounds of formula (1) on the model
геморрагического инсульта (интрацеребральная посттравматическая гематома) у крысhemorrhagic stroke (intracerebral post-traumatic hematoma) in rats
Моделирование локального кровоизлияния в головном мозге - создание геморрагического инсульта (интрацеребральной посттравматической гематомы) проводилось согласно методике А.Н. Макаренко и соавт. (Макаренко А.Н. и др. А. с. N° 1767518 от 03.1 1.1990) . Опыты проводили на белых беспородных крысах-самцах массой 200-250 г. Крысы содержались в условиях вивария при свободном доступе к пище и воде. С целью создания инсульта у крыс, наркотизированных хлоралгидратом (400 мг/кг, в/м), проводилась трепанация черепа и затем при помощи специального устройства (мандрен- нож) и стереотаксиса осуществлялась деструкция мозговой ткани в области внутренней капсулы с последующим (через 2-3 мин) введением в место повреждения крови, взятой из- под языка животного (0,02-0,03 мл). Таким способом достигается локальный аутогеморрагический билатеральный инсульт в области внутренней капсулы (диаметр - 2 мм, глубина -3 мм) без существенных повреждений вышерасположенных образований мозга и неокортекса. Животные были поделены на несколько групп: ложно оперированные крысы, которых наркотизировали и которым затем проводили трепанацию черепа, но не осуществляли разрушения мозговой ткани; животные с геморрагическим инсультом; животные с геморрагическим инсультом, которым вводили Соединение Х1 в дозе 1 мг/кг внутрь (интрагастрально, с использованием специального зонда) через 30 мин после операции, затем - ежедневно однократно в течение 7 дней. Контрольным животным вводили физиологический раствор в эквивалентном объеме интрагастрально. Modeling of local hemorrhage in the brain - the creation of a hemorrhagic stroke (intracerebral post-traumatic hematoma) was carried out according to the method of A.N. Makarenko et al. (Makarenko A.N. et al. A. p. N ° 1767518 dated 03.1.1990). The experiments were carried out on white outbred male rats weighing 200-250 g. Rats were kept in vivarium conditions with free access to food and water. In order to create a stroke in rats anesthetized with chloral hydrate (400 mg / kg, i / m), craniotomy was performed and then using a special device (mandren knife) and stereotaxis, brain tissue was destroyed in the area of the internal capsule, followed by (2- 3 min) by introducing blood taken from under the tongue of the animal (0.02-0.03 ml) into the site of damage. In this way, a local autohemorrhagic bilateral stroke in the area of the inner capsule (diameter - 2 mm, depth -3 mm) is achieved without significant damage to the superior formations of the brain and neocortex. The animals were divided into several groups: falsely operated rats, which were anesthetized and who then underwent trepanation of the skull, but did not destroy the brain tissue; animals with hemorrhagic stroke; animals with hemorrhagic stroke, which were administered Compound X1 at a dose of 1 mg / kg orally (intragastrically, using a special probe) 30 minutes after operations, then once a day for 7 days. Control animals were injected with saline in an equivalent volume intragastrically.
Таблица 5. Влияние Соединения Х1 (1 мг/кг, внутрь) на неврологический дефицит (по шкале McGrow) у крыс после геморрагического инсульта. Приведено количество животных с различной неврологической симптоматикой (%) в 1-е сутки после операции. Table 5. The effect of Compound X1 (1 mg / kg, by mouth) on neurological deficit (McGrow scale) in rats after hemorrhagic stroke. The number of animals with various neurological symptoms (%) on the 1st day after surgery is given.
Г руппы животных  R groups of animals
инсульт + Х1.  stroke + X1.
Неврологический симптом  Neurological symptom
ложнооперированные инсульт  falsely operated stroke
Вялость, замедленность Lethargy, slowness
40 100 60  40 100 60
движений movements
Слабость конечностей  Limb weakness
30 90 50*  30 90 50 *
(начальная) (initial)
Манежные движения 0 40 0*  Maneuvering movements 0 40 0 *
Парез 1 -4 конечностей 0 30 30  Paresis of 1 to 4 limbs 0 30 30
Паралич 1 -4 конечностей 0 30 0*  Paralysis of 1 to 4 limbs 0 30 0 *
* Достоверность отличий от инсультных крыс при р< 0,05 (х2). * Significance of differences from stroke rats at p <0.05 (x 2 ).
Таблица 6. Влияние Соединения Х1 на выживаемость животных после ГИ Table 6. The effect of Compound X1 on animal survival after GI
Количество погибших животных в течение 14 сут после The number of dead animals within 14 days after
Группа геморрагического инсульта (n/N, %)  Hemorrhagic stroke group (n / N,%)
животных 1 -е сутки 3-й сутки 7-е сутки 14-е сутки animals 1st day 3rd day 7th day 14th day
n/N % n/N % n/N % n/N % n / N% n / N% n / N% n / N%
Ложно Falsely
0/10 0 0/10 0 0/10 0 1/10 10 оперированные  0/10 0 0/10 0 0/10 0 1/10 10 operated
Инсульт 7/30 23* 5/23 22* 5/18 28* 2/13 15* Stroke 7/30 23 * 5/23 22 * 5/18 28 * 2/13 15 *
Инсульт + Stroke +
0/12 0** 0/12 0** 0/12 0** 0/12 0** Х1 0/12 0 ** 0/12 0 ** 0/12 0 ** 0/12 0 * * X1
Обозначения: n/N - количество погибших животных (п) из общего количества (N). * Достоверность отличий по сравнению с группой ложно оперированных крыс при р< 0,05 (х2). Designations: n / N - the number of dead animals (p) of the total number (N). * Significance of differences compared with the group of falsely operated rats at p <0.05 (x 2 ).
Достоверность отличий по сравнению с инсультными крысами при р< 0,05 (х2). Соединение формулы (1) обладает нейропротекторными свойствами при геморрагическом инсульте - уменьшает смертность (Таблица 6) и неврологический дефицит (Таблица 5). Significance of differences compared with stroke rats at p <0.05 (x 2 ). The compound of formula (1) has neuroprotective properties in hemorrhagic stroke - it reduces mortality (Table 6) and neurological deficiency (Table 5).
Пример 10 Example 10
Радиопротекция  Radioprotection
Получение лимфоцитов из селезенки 6-8 недельных BALB/c самцов-мышей (весом 20-25 г) проводили следующим образом. Селезенку асептически вырезали и помещали в стерильную посуду, содержащую RPMI 1640 среду. Одноклеточную суспензию получали аккуратно натирая селезенку о стерильную нейлоновую сетку в той же посуде. Спленоциты центрифугировали и красные кровяные тельца лизировали кратковременным гипотоническим шоком. В экспериментах in vitro клетки предварительно обрабатывали Соединением Х1 (0,05-0,5 мкМ) за 2 часа перед облучением. DMSO использовали как контроль in vitro. Лимфоциты суспендировали в среде и подвергали облучению 60Со γ- источником дозой 2,93 Грей/мин. Для подсчета живых и мертвых клеток использовали Live/Dead Cell Assay kit (LifeTechnologies Corp., США). Obtaining lymphocytes from the spleen of 6-8 week old BALB / c male mice (weighing 20-25 g) was carried out as follows. The spleen was aseptically excised and placed in a sterile dish containing RPMI 1640 medium. A single cell suspension was obtained by gently rubbing the spleen on a sterile nylon mesh in the same container. Splenocytes were centrifuged and red blood cells were lysed with short-term hypotonic shock. In in vitro experiments, cells were pretreated with Compound X1 (0.05-0.5 μM) 2 hours before irradiation. DMSO was used as an in vitro control. Lymphocytes were suspended in the medium and irradiated with a 60 Co γ-source at a dose of 2.93 Gray / min. A Live / Dead Cell Assay kit (LifeTechnologies Corp., USA) was used to count living and dead cells.
Соединение X1 обладает радиопротекторными свойствами, предварительная обработка клеток существенно повышает их жизнеспособность, причем этот эффект имеет четкую концентрационную зависимость от добавленного Соединения Х1 (Рис.9).  Compound X1 has radioprotective properties, pre-treatment of cells significantly increases their viability, and this effect has a clear concentration dependence on the added Compound X1 (Fig. 9).
Пример 11 Example 11
Соединение формулы (1) защищает от нейродегенерации в токсической модели Паркинсона  The compound of formula (1) protects against neurodegeneration in the toxic Parkinson model
Использовалась токсическая модель на основе МФТП (1-метил-4-фенил-1 , 2,3,6- тетрагилропиридин), предшественника нейротоксина метилфенилпиридиния, который вызывает постоянную симптоматику болезни Паркинсона, разрушая дофаминергичные нейроны в substantia nigra. Нейропротекторные свойства Соединения X (Х1) изучали на BALB/c самцах-мышах (весом 20-25 г) в дозе 1 мг/кг/день (растворяли в 3% DMSO в масле). Соединение X вводили интрагастрально раз в день за 4 дня до и 3 дня после администрации МФТП, причем в день администрации МФТП Соединение X давали за 2 часа до МФТП. Контрольная группа вместо Соединения X получала 3% DMSO в масле по той же схеме. МФТП в дозе 10 мг/кг (30 мг/кг кумулятивная доза) вводили 3 раза через каждые 2 часа. Животных декапитировали на 7-й день после введения МФТП. Мышей разбили на 4 группы (контроль, X, МФТП, Х+МФТП). Соединение Х1 никаких видимых изменений в поведении мышей не вызывало. Уровень дофамина и его метаболитов - дофамин превращается в 3,4- диоксифенилуксусную кислоту (ДОФУК) и далее в гомованиллиновую кислоту (ГВК) - измеряли в полосатом теле с помощью HPLC и электрохимического детектирования. We used a toxic model based on MPTP (1-methyl-4-phenyl-1, 2,3,6-tetragylopyridine), a precursor of the neurotoxin methylphenylpyridinium, which causes persistent symptoms of Parkinson's disease, destroying dopaminergic neurons in the substantia nigra. The neuroprotective properties of Compound X (X1) were studied on BALB / c male mice (weighing 20-25 g) at a dose of 1 mg / kg / day (dissolved in 3% DMSO in oil). Compound X was administered intragastrically once a day 4 days before and 3 days after administration of MPTP, and on the day of administration of MPTP, Compound X was given 2 hours before MPTP. The control group instead of Compound X received 3% DMSO in oil according to the same scheme. MPTP at a dose of 10 mg / kg (30 mg / kg cumulative dose) was administered 3 times every 2 hours. Animals were decapitated on the 7th day after the administration of MPTP. Mice were divided into 4 groups (control, X, MPTP, X + MPTP). Compound X1 did not cause any visible changes in the behavior of mice. The level of dopamine and its metabolites - dopamine turns into 3.4- Dioxyphenylacetic acid (DOPUK) and further into homovanillinic acid (HVA) —measured in the striatum using HPLC and electrochemical detection.
Таблица 7. Концентрация дофамина и его основных метаболитов при администрации соединения Х1 в токсической модели болезни Паркинсона. Table 7. The concentration of dopamine and its main metabolites during the administration of compound X1 in the toxic model of Parkinson's disease.
Figure imgf000025_0001
Figure imgf000025_0001
Данные таблицы представлены как среднее ± SEM. Количество метаболитов указано в нг на мг белка. *р<0.05 по сравнению с контролем и *р<0.05 по сравнению с МФТП.  The data in the table are presented as mean ± SEM. The number of metabolites is indicated in ng per mg of protein. * p <0.05 compared to control and * p <0.05 compared to MPTP.
Как видно из представленных данных Соединение формулы (1) при 1 мг/кг/день защищает от нейродегенерации вызванной администрацией МФТП. Соединение Х1 обладает нейропротекторными свойствами в токсической модели Паркинсона, практически возвращая уровень дофамина и его основных метаболитов в норму (таблица 7). As can be seen from the data presented, the Compound of formula (1) at 1 mg / kg / day protects against neurodegeneration caused by the administration of MPTP. Compound X1 has neuroprotective properties in the Parkinson's toxic model, practically returning the level of dopamine and its main metabolites to normal (table 7).
Как следует из представленных данных, соединения общей формулы (1) являются активаторами транскрипционного фактора Nrf2 (Примеры 1 и 2), который запускает генетическую программу антиоксидантного ответа, которая позволяет значительно уменьшить токсические эффекты и повреждения при целом ряде заболеваний (Примеры 3- 11). Для ряда соединений, соответствующих общей формуле (I), не выявлено отрицательных побочных действий и не обнаружено противопоказаний к применению. Готовят лекарственные формы ряда соединений общей формулы (I) общеизвестным методом.  As follows from the data presented, the compounds of general formula (1) are activators of the transcription factor Nrf2 (Examples 1 and 2), which launches a genetic program of antioxidant response, which can significantly reduce toxic effects and damage in a number of diseases (Examples 3-11). For a number of compounds corresponding to the general formula (I), no adverse side effects were detected and no contraindications were found for use. Dosage forms of a number of compounds of the general formula (I) are prepared by a well-known method.
На основании результатов проведенных исследований предлагается использование соединений общей формулы (I) для лечения и профилактики следующих состояний:  Based on the results of the studies, the use of compounds of the general formula (I) is proposed for the treatment and prevention of the following conditions:
1. Интоксикации, включая токсические поражения печени (Пример 3) и поражения при перекисном окисление липидов при ишемии-реперфузии (Пример 4)  1. Intoxications, including toxic liver damage (Example 3) and lesions during lipid peroxidation during ischemia-reperfusion (Example 4)
2. Уменьшение токсичности препаратов химиотерапии при совместной  2. Reducing the toxicity of chemotherapy drugs when combined
администрации (уменьшение кардиотоксичности доксорубицина, см. Пример 5, и administration (reduction of cardiotoxicity of doxorubicin, see Example 5, and
нефротоксичности цисплатина, Пример 7) 3. Увеличение жизнеспособности графта при трансплантации (Пример 6, трансплантация сердца) cisplatin nephrotoxicity Example 7) 3. Increased graft viability during transplantation (Example 6, heart transplantation)
4. Ишемический инсульт (Пример 8);  4. Ischemic stroke (Example 8);
5. Геморрагический инсульт (Пример 9)  5. Hemorrhagic stroke (Example 9)
6. Радиационное поражение, профилактика радиотерапии (Пример 10);  6. Radiation damage, prevention of radiotherapy (Example 10);
7. Заболевания нервной системы (болезнь Паркинсона, Пример 11).  7. Diseases of the nervous system (Parkinson's disease, Example 11).
Список сокращений. List of abbreviations.
NADPH - никотинамидадениндинуклеотидфосфат  NADPH - Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate
Nrf2 - транскрипционный фактор кодируемый геном NFE2L2 (Nuclear factor (erythroid- derived 2)-like 2)  Nrf2 - a transcription factor encoded by the NFE2L2 gene (Nuclear factor (erythroid-derived 2) -like 2)
tPA - тканевой активатор плазминогена  tPA - tissue plasminogen activator
ARE - элемент антиоксидантного ответа  ARE - an element of the antioxidant response
ROS - активные формы кислорода (reactive oxygen species)  ROS - reactive oxygen species
Keapl - белок кодируемый геном Keapl (Kelch-like ECH-associated protein 1)  Keapl - a protein encoded by the Keapl gene (Kelch-like ECH-associated protein 1)
TGF/M - трансформирующий ростовой фактор, бета-1  TGF / M - transforming growth factor, beta-1
NF-KB - транскрипционный фактор NF-κΒ (ядерный фактор «каппа-би»)  NF-KB - transcription factor NF-κΒ (nuclear factor "Kappa-bi")
BG-12 - диметиловый эфир фумаровой кислоты (диметилфумарат)  BG-12 - fumaric acid dimethyl ether (dimethyl fumarate)
FBS - фетальная бычья сыворотка  FBS - Fetal Bovine Serum
DMSO - диметилсульфоксид  DMSO - dimethyl sulfoxide
PCR - полимеразная цепная реакция  PCR - polymerase chain reaction
НО-1 - гемоксигеназа-1  HO-1 - hemoxygenase-1
NQ01 - МАОРН:хиноноксидоредуктаза 1  NQ01 - MAOPH: Quinone Oxidoreductase 1
ТБК - тиобарбитуровая кислота  TBA - thiobarbituric acid
SDS -лаурилсульфат натрия (додецилсульфат натрия)  SDS-sodium lauryl sulfate (sodium dodecyl sulfate)
ТХУ - трихлоруксусная кислота  TCA - trichloroacetic acid
ПОЛ - перекисное окисление липидов  LPO - lipid peroxidation
HNE - 4-окси-2-ноненаль  HNE - 4-hydroxy-2-nonenal
DOX - доксорубицин  DOX - doxorubicin
LVEDV - левый вентрикулярный конечный диастолический объем  LVEDV - left ventricular end diastolic volume
SV - ударный объем  SV - stroke volume
EF - фракция выброса (LV глобальная сократимость)  EF - ejection fraction (LV global contractility)
TdT - ДНК нуклеотидилэкзотрансфераза  TdT - DNA nucleotidylexotransferase
dUTP - дэзоксиуридинтрифосфат  dUTP - desoxyuridine triphosphate
DTT - дитиотрейтол HEPES - (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоноваяDTT - Dithiothreitol HEPES - (4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic
EDTA - этилендиаминтетрауксусная кислота EDTA - Ethylenediaminetetraacetic Acid
PMSF - фенилметилсульфонилфторид  PMSF - Phenylmethylsulfonyl Fluoride
BSA - бычий сывороточный альбумин  BSA - Bovine Serum Albumin
PBS - фосфатный буфер, содержащий хлорид натрия PBS - Sodium Chloride Phosphate Buffer
HRP - пероксидаза из корней хрена HRP - horseradish root peroxidase
Tween-20 - Полисорбат 20  Tween-20 - Polysorbate 20
СМА - средняя мозговая артерия SMA - middle cerebral artery
ФТП - 1-метил-4-фенил-1 ,2,3,6-тетрагилропиридин FTP - 1-methyl-4-phenyl-1, 2,3,6-tetrahydropyridine
ДОФУК - 3,4-диоксифенилуксусная кислота DOPUK - 3,4-dioxiphenylacetic acid
ГВК - гомованиллиновая кислота  GVA - homovanillinic acid
HPLC - высокоэффективная жидкостная хроматография HPLC - High Performance Liquid Chromatography
ЛД - летальная доза LD - lethal dose
МДА - малоновый диальдегид  MDA - malondialdehyde
ТБК - тиобарбитуровая кислота  TBA - thiobarbituric acid
ХЛ - хемилюминесценция  CL - chemiluminescence
DMF— Ν,Ν'-диметилформамид  DMF— Ν, Ν'-dimethylformamide
EtOAc - этилацетат  EtOAc - Ethyl Acetate
OEt - этокси- OEt - ethoxy
ОМе - метокси-OMe - methoxy
Ме - метил-Me - methyl
NAC - Ν-ацетилцистеин NAC - Ν-Acetylcysteine
GSK - глутатион  GSK - Glutathione

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ CLAIM
1. Применение соединения, представляющего собой производное бициклических пиримидинов общей формулы I:  1. The use of compounds representing a derivative of bicyclic pyrimidines of General formula I:
Figure imgf000028_0001
или его фармацевтически приемлемой соли, где
Figure imgf000028_0001
or its pharmaceutically acceptable salt, where
R! -пара-заместитель: метоксигруппа, этоксигруппа, алкил линейный или разветвленный (С С ), галоген, моно-, ди-, три- (С С4)алкиламиногруппа; R ! α-substituent: methoxy group, ethoxy group, linear or branched alkyl (C C), halogen, mono-, di-, tri- (C 4 ) alkylamino group;
Y= СН, если X=S, и Y= СН или Ν, если Χ=Ν; Y = CH if X = S, and Y = CH or Ν if Χ = Ν;
R2 представляет собой галоген R 2 is halogen
R3 отсутствует если X=S, и если X=N, то R3 представляет собой атом водорода, алкил С С3, гидроксил, карбоксил, который может быть этерифицирован, или аминогруппу; в качестве активаторов транскрипционного фактора Nrf2. R 3 is absent if X = S, and if X = N, then R 3 represents a hydrogen atom, C 3 alkyl, hydroxyl, carboxyl, which can be esterified, or an amino group; as activators of the transcription factor Nrf2.
2. Применение соединения по п.1 , в котором производное бициклических пиримидинов общей формулы I представляет собой 5-(4-метоксифенил)тиено[2,3- с1]пиримидин-4-хлорид.  2. The use of a compound according to claim 1, wherein the bicyclic pyrimidine derivative of the general formula I is 5- (4-methoxyphenyl) thieno [2,3-c1] pyrimidine-4-chloride.
3. Цитопротекторная и антиоксидантная фармацевтическая композиция, характеризующаяся тем, что содержит в качестве активного начала активатор транскрипционного фактора Nrf2, представляющий собой производное бициклических пиримидинов общей формулы (I) по п.1 или п.2, или его фармацевтически приемлемую соль в эффективном количестве и фармацевтически приемлемый носитель.  3. A cytoprotective and antioxidant pharmaceutical composition, characterized in that it contains as an active principle an activator of the transcription factor Nrf2, which is a derivative of the bicyclic pyrimidines of the general formula (I) according to claim 1 or claim 2, or a pharmaceutically acceptable salt thereof in an effective amount and a pharmaceutically acceptable carrier.
PCT/RU2015/000122 2014-03-20 2015-02-27 Bicyclic pyrimidines and use thereof as antioxidants and cytoprotectors WO2015142218A1 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2014110647/15A RU2545758C1 (en) 2014-03-20 2014-03-20 Bicyclic pyrimides or their pharmaceutically acceptable salts - antioxidant programme activators and using them as cytoprotectors
RU2014110647 2014-03-20

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2015142218A1 true WO2015142218A1 (en) 2015-09-24

Family

ID=53295575

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2015/000122 WO2015142218A1 (en) 2014-03-20 2015-02-27 Bicyclic pyrimidines and use thereof as antioxidants and cytoprotectors

Country Status (2)

Country Link
RU (1) RU2545758C1 (en)
WO (1) WO2015142218A1 (en)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11479539B2 (en) 2017-12-22 2022-10-25 Medimmune Limited Small molecule modulators of the BTB domain of Keap1

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR4321M (en) * 1964-01-15 1966-08-01
WO2006124874A2 (en) * 2005-05-12 2006-11-23 Kalypsys, Inc. Inhibitors of b-raf kinase
WO2008128072A2 (en) * 2007-04-13 2008-10-23 Supergen, Inc. Axl kinase inhibitors useful for the treatment of cancer or hyperproliferative disorders
WO2013072694A1 (en) * 2011-11-15 2013-05-23 Xention Limited Thieno- and furo - pyrimidines and pyridines, useful as potassium channel inhibitors

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1388342A1 (en) * 2002-08-07 2004-02-11 Aventis Pharma Deutschland GmbH Acylated, heteroaryl-condensed cycloalkenylamines and their use as pharmaceuticals

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR4321M (en) * 1964-01-15 1966-08-01
WO2006124874A2 (en) * 2005-05-12 2006-11-23 Kalypsys, Inc. Inhibitors of b-raf kinase
WO2008128072A2 (en) * 2007-04-13 2008-10-23 Supergen, Inc. Axl kinase inhibitors useful for the treatment of cancer or hyperproliferative disorders
WO2013072694A1 (en) * 2011-11-15 2013-05-23 Xention Limited Thieno- and furo - pyrimidines and pyridines, useful as potassium channel inhibitors

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CALDERON, FELIX ET AL.: "An Invitation to Open Innovation in Malaria Drag Discovery: 47. Quality Starting Points from the TCAMS", MEDICINAL CHEMISTRY LETTERS, vol. 2, no. 10, 2011, pages 741 - 746, XP055039503, ISSN: 1948-5875 *
HOSSAIN M.I. ET AL.: "Synthesis and Antimicrobial Activities of Some New Thieno and Furopyrimidine Derivatives.", J. SCI. RES., vol. 1, no. 2, 2009, pages 317 - 325, XP055226922, ISSN: 2070-0237 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11479539B2 (en) 2017-12-22 2022-10-25 Medimmune Limited Small molecule modulators of the BTB domain of Keap1

Also Published As

Publication number Publication date
RU2545758C1 (en) 2015-04-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Ajoolabady et al. Targeting autophagy in ischemic stroke: From molecular mechanisms to clinical therapeutics
Ongnok et al. Doxorubicin and cisplatin induced cognitive impairment: the possible mechanisms and interventions
Ghavami et al. Airway mesenchymal cell death by mevalonate cascade inhibition: integration of autophagy, unfolded protein response and apoptosis focusing on Bcl2 family proteins
EP3244909B1 (en) Proteasome inhibitors for treating a disorder related to an accumulation of non-degraded abnormal protein or a cancer
Ayala et al. Attenuation of endoplasmic reticulum stress using the chemical chaperone 4-phenylbutyric acid prevents cardiac fibrosis induced by isoproterenol
Wu et al. Succinate-induced neuronal mitochondrial fission and hexokinase II malfunction in ischemic stroke: Therapeutical effects of kaempferol
Palliyaguru et al. Withaferin A induces Nrf2-dependent protection against liver injury: Role of Keap1-independent mechanisms
Cook et al. Regulation of bcl-2 family proteins during development and in response to oxidative stress in cardiac myocytes: association with changes in mitochondrial membrane potential
Yang et al. SIRT1 activation by curcumin pretreatment attenuates mitochondrial oxidative damage induced by myocardial ischemia reperfusion injury
Blas‐García et al. Inhibition of mitochondrial function by efavirenz increases lipid content in hepatic cells
Gomez et al. Inhibition of GSK3β by postconditioning is required to prevent opening of the mitochondrial permeability transition pore during reperfusion
Ghavami et al. Statin-triggered cell death in primary human lung mesenchymal cells involves p53-PUMA and release of Smac and Omi but not cytochrome c
Yu et al. Paeoniflorin protects human EA. hy926 endothelial cells against gamma-radiation induced oxidative injury by activating the NF-E2-related factor 2/heme oxygenase-1 pathway
Mollereau et al. Adaptive preconditioning in neurological diseases–therapeutic insights from proteostatic perturbations
Lu et al. Isoalantolactone induces apoptosis through reactive oxygen species-dependent upregulation of death receptor 5 in human esophageal cancer cells
Deng et al. Scutellarin acts on the AR-NOX axis to remediate oxidative stress injury in a mouse model of cerebral ischemia/reperfusion injury
Wang et al. A novel biscoumarin compound ameliorates cerebral ischemia reperfusion-induced mitochondrial oxidative injury via Nrf2/Keap1/ARE signaling
Sinha et al. Mahanine inhibits growth and induces apoptosis in prostate cancer cells through the deactivation of Akt and activation of caspases
Syed et al. Up-regulation of Nrf2/HO-1 and inhibition of TGF-β1/Smad2/3 signaling axis by daphnetin alleviates transverse aortic constriction-induced cardiac remodeling in mice
KR101131675B1 (en) Composition comprising ursodeoxycholic acid for preventing or treating gastric cancer
Chen et al. IL37 overexpression inhibits autophagy and apoptosis induced by hepatic ischemia reperfusion injury via modulating AMPK/mTOR/ULLK1 signalling pathways
Al-Saleh et al. Inhibition of NADPH oxidase alleviates germ cell apoptosis and ER stress during testicular ischemia reperfusion injury
Kim et al. Korean Red ginseng prevents endothelial senescence by downregulating the HO-1/NF-κB/miRNA-155-5p/eNOS pathway
Singer et al. Brain-penetrant PQR620 mTOR and PQR530 PI3K/mTOR inhibitor reduce huntingtin levels in cell models of HD
Hu et al. Carnosic acid protects against doxorubicin-induced cardiotoxicity through enhancing the Nrf2/HO-1 pathway

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 15765482

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

32PN Ep: public notification in the ep bulletin as address of the adressee cannot be established

Free format text: NOTING OF LOSS OF RIGHTS PURSUANT TO RULE 112(1) EPC (EPO FORM 1205A DATED 27/01/2017)

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 15765482

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1