WO2015114817A1 - 環状ペプチドを有効成分とする骨吸収関連疾患の治療又は予防剤 - Google Patents

環状ペプチドを有効成分とする骨吸収関連疾患の治療又は予防剤 Download PDF

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森田　博史
利夫 金田
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サントリーホールディングス株式会社
学校法人 星薬科大学
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    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/64—Cyclic peptides containing only normal peptide links

Definitions

  • the present invention relates to an osteoclast differentiation inhibitor containing a cyclic peptide as an active ingredient, or a preventive and therapeutic agent for bone resorption-related diseases.
  • Bone is an important organ that supports the body, protects internal organs, stores calcium, and the like. Bone is a tissue in which calcium phosphate is deposited on a bone matrix protein mainly composed of type I collagen produced by osteoblasts. Bone-forming osteoblasts and resorbing osteoclasts play an important role in maintaining the growth, development, structure and strength of bone tissue.
  • Osteoblasts and osteoclasts are responsible for bone formation and bone resorption, respectively, and the bone tissue is maintained by repetition of both.
  • remodeling osteoblasts are guided to bone resorption sites and repair bone tissue absorbed by osteoclasts. This remodeling cycle is necessary not only for bone stretching and repair, but also for the formation of a layered structure of bone tissue to resist external forces.
  • Osteoblasts are derived from mesenchymal stem cells, while osteoclasts are differentiated cells from hematopoietic cells via monocyte / macrophage cells. These bone-related cells are affected by various factors such as hormones, inflammatory cytokines, and growth factors.
  • osteoclast progenitor cells are mainly M-CSF-dependent myeloid cells derived from blood stem cells. These progenitor cells are in physical contact with osteoblasts, and stimulated by a receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand (RANKL) expressed on the cell membrane of osteoblasts, and differentiate into osteoclasts.
  • RTKL nuclear factor kappa-B ligand
  • osteoclast differentiation is controlled by RANKL expression in osteoblasts
  • PGE 2 , activated VD 3 , IL-6, PTH, etc. are known as substances that promote RANKL expression in osteoblasts. ing.
  • marble bone disease is a rare disease, it is usually a problem in the field of bone metabolism when bone resorption activity exceeds bone formation activity, that is, osteoporosis. It is said that osteoporosis currently affects about 10 million patients in Japan. Periodontal disease and arthritis are also closely related to abnormal bone destruction, and bone resorption-related diseases are familiar diseases.
  • Aging is one of the factors that cause bone mass changes. During growth, bone formation exceeds bone resorption and bone mass increases, but after 40 years of age, bone resorption exceeds bone formation. Particularly in women, rapid bone loss occurs after menopause, and high-rotation osteoporosis is frequently observed.
  • osteoporosis As a therapeutic agent for osteoporosis that inhibits bone resorption, ie, osteoclasts, bisphosphonate, estrogen analog, calcitonin, activated VD 3 , vitamin K, ipriflavone and the like are known.
  • bisphosphonate has long been known to act on bones, and the first generation that does not contain N (nitrogen) in its structure, and the second and third generation compounds that contain N in its structure have been developed as pharmaceuticals for clinical use.
  • N nitrogen
  • osteonecrosis of the jaw caused by long-term administration has been regarded as a problem.
  • a therapeutic drug for osteoporosis containing a plant or an extract thereof as an active ingredient has been reported.
  • a preventive or therapeutic agent for postmenopausal osteoporosis using a herb plant such as the genus Petrocerinum Patent Document 1
  • An object of the present invention is to provide an osteoclast differentiation inhibitor that is effective from natural products and can be administered for a long period of time.
  • an object of the present invention is to provide a prophylactic and therapeutic agent for bone resorption-related diseases that can be administered for a long time from a natural product and is highly effective.
  • the present inventors searched for a natural substance that is free from side effects as a candidate substance.
  • the cyclic peptide derived from flax suppresses the RANKL signal necessary for osteoclast differentiation, and the bone marrow myeloid system It was found that the differentiation from cells to osteoclasts was suppressed. Moreover, it became clear that those components have low toxicity and can be applied to foods and pharmaceuticals. From these findings, we found that by using flax peptides derived from flax as an active ingredient, we can provide foods and beverages and pharmaceuticals for the prevention and treatment of conditions and diseases related to bone resorption such as osteoporosis, The present invention has been completed.
  • the active ingredient is cyclo (-Pro-Pro-Phe-Phe-Leu-Ile-Ile-Leu-Val-), cyclo (-Pro-Pro-Phe-Phe-Val-Ile-Met-Leu-Ile-), cyclo (-Pro-Pro-Phe-Phe-Val-Ile-Mso-Leu-Ile-), cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Ile-Mso-Leu-Leu-), cyclo (-Pro-Leu-Phe-Ile-Mso-Leu-Val-Phe-), cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Val-Mso-Leu-Mso-), cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Val-Mso-Leu-Mso-), cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Ile-Mso-Leu-Mso-), cyclo (-Pro
  • osteoclast differentiation inhibitor according to [4], wherein the active ingredient is cyclo- (Pro-Leu-Phe-Ile-Msn-Leu-Val-Phe).
  • a prophylactic or therapeutic agent for bone resorption-related diseases comprising an ama-derived cyclic peptide as an active ingredient.
  • a preventive or therapeutic agent for bone resorption-related diseases comprising one or more cyclic peptides consisting of 8 or 9 amino acids as an active ingredient.
  • the active ingredient is cyclo (-Pro-Pro-Phe-Phe-Leu-Ile-Ile-Leu-Val-), cyclo (-Pro-Pro-Phe-Phe-Val-Ile-Met-Leu-Ile-), cyclo (-Pro-Pro-Phe-Phe-Val-Ile-Mso-Leu-Ile-), cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Ile-Mso-Leu-Leu-), cyclo (-Pro-Leu-Phe-Ile-Mso-Leu-Val-Phe-), cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Val-Mso-Leu-Mso-), cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Val-Mso-Leu-Mso-), cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Ile-Mso-Leu-Mso-), cyclo (-Pro
  • the preventive or therapeutic agent for bone resorption-related diseases according to [9], wherein the active ingredient is cyclo- (Pro-Leu-Phe-Ile-Msn-Leu-Val-Phe).
  • the agent according to any one of [1] to [11] which is in the form of a food and drink.
  • the agent according to any one of [1] to [11] which is in the form of a pharmaceutical composition.
  • osteoclast differentiation inhibitory effect is exhibited.
  • osteoclast differentiation is effectively suppressed by inhibiting signals from c-fos expression to osteoclast master transcription factor NFATc1 expression.
  • the osteoclast differentiation inhibitor of the present invention can provide a composition useful for the prevention or treatment of bone resorption diseases, mainly osteoporosis and femoral neck fractures.
  • bone loss and bone strength decrease due to abnormalities of phosphorus metabolism such as rheumatoid arthritis, diabetes and chronic renal failure, which are bone resorption-related diseases, as well as multiple myeloma, malignant lymphoma, familial bone Paget's disease Alternatively, a therapeutic effect on periodontal disease is expected.
  • the osteoclast differentiation inhibitor of the present invention has a high safety and is useful because it contains a natural ingredient as an active ingredient.
  • the present invention relates to an osteoclast formation inhibitor containing a cyclic peptide contained in flax (flax, scientific name: Linumusitatissimum) as an active ingredient.
  • flax scientific name: Linumusitatissimum
  • the present invention also relates to a preventive and therapeutic agent for bone resorption-related diseases containing a cyclic peptide contained in flax as an active ingredient.
  • An active ingredient cyclic peptide has various physiological activities such as antitumor activity, antibacterial activity, and immunosuppressive action, and is a compound that has attracted attention in drug development. Many of these cyclic peptides are derived from marine organisms or secondary metabolites of fungi, whereas those derived from higher plants are rarely reported.
  • cyclic peptide contained in flax but it does not matter if it is a cyclic peptide having the same or similar structure.
  • cyclic peptides can also be obtained by solvent extraction from natural materials such as flax, or by chemical or enzymatic synthesis.
  • flax extract can be used as an osteoclast formation inhibitor or a preventive or therapeutic agent for bone resorption-related diseases.
  • the cyclic peptide which is an active ingredient is a cyclic peptide consisting of 8 or 9 amino acids.
  • the kind of constituent amino acid is not ask
  • cyclo- (Pro-Pro-Phe-Phe-Leu-Ile-Ile-Leu-Val), cyclo- (Pro-Phe-Phe-Trp-Ile-Mso-Leu-Leu), cyclo- (Pro-Phe-Phe -Trp-Val-Mso-Leu-Mso), cyclo- (Pro-Phe-Phe-Trp-Val-Met-Leu-Mso), or cyclo- (Pro-Leu-Phe-Ile-Msn-Leu-Val-Phe).
  • These can be used alone or in combination.
  • derivatives of these cyclic peptides having a desired activity can also be used as active ingredients.
  • Ama (flax, scientific name: Linumusitatissimum) is an annual plant of the flax family and is cultivated in relatively cold regions.
  • the stem fiber is a linen product. Flax is sometimes mistaken for flax, but it is woven into high-grade clothing because it is softer, tougher, breathable and hygroscopic, and soft to the flesh. This plant is native to Central Asia and is cultivated around the world.
  • Linseed oil (linseed oil / flaxseed oil) obtained by squeezing or crushing the seeds and extracting with a solvent is called linseed oil, which includes ⁇ -3 fatty acids such as ⁇ -linolenic acid. It is rich in unsaturated fatty acids and is sold as an edible and supplement. Flaxseed oil is a yellowish dry oil (oil that hardens when exposed to air), and boiled linseed oil is polymerized and oxidized, and used as an “oil finish varnish” for finishing oil paint binders and wood products. *
  • the natural material as the extraction raw material may be used as it is, or may be used after pulverization.
  • a solvent used for extraction an organic solvent, water, or a mixture thereof can be used.
  • the obtained extract can be separated and purified using an appropriate separation carrier.
  • the carrier for separation any carrier can be used as long as it can adsorb the above-mentioned cyclic peptide and can be separated by an appropriate solvent for separation.
  • separation and purification can be performed using a styrene-based or dextran-based synthetic adsorbent. After loading the above extract on such a carrier for separation, the above cyclic peptide is separated using an appropriate solvent.
  • the above-mentioned cyclic peptide used for the osteoclast formation inhibitor or the preventive and therapeutic agent for bone resorption-related diseases of the present invention can be obtained.
  • said cyclic peptide is contained also in a linseed oil, and can be obtained similarly.
  • the cyclic peptide thus obtained may be used after being concentrated, or may be used as a powder by a method such as lyophilization.
  • Osteoclast Formation Inhibitor The osteoclast formation inhibitor of the present invention has a strong osteoclast formation inhibitory action.
  • the measurement of osteoclast formation inhibitory activity can be evaluated by methods known to those skilled in the art. For example, the evaluation can be performed based on the action of suppressing the differentiation from bone marrow myeloid cells to osteoclasts. As a reference, the methods described in Examples of the present application can be given.
  • the cyclic peptide as the active ingredient can be used alone as a purified product or a crude product as an osteoclast formation inhibitor, or can be used as an osteoclast formation inhibitor together with a solvent or a carrier. is there.
  • the solvent or carrier is preferably one that can be safely used as a food or as a pharmaceutical in consideration of use as the following food and drink and / or pharmaceutical.
  • the osteoclast formation inhibitor of the present invention has various uses, and examples thereof include use for testing and research, food and drink for suppressing osteoclast formation, and pharmaceutical compositions.
  • the content of the active ingredient in the osteoclast formation inhibitor of the present invention is not particularly limited, but for example, it is contained so as to be 0.0001% to 1%, preferably 0.001% to 0.1% based on the total weight. %. However, since the active ingredient used in the osteoclast formation inhibitor of the present invention is derived from food, the safety is very high and there is no substantial upper limit on the content.
  • Preventive or therapeutic agent for bone resorption-related diseases The above active ingredient has an osteoclast differentiation inhibitory action and can be used for the prevention or treatment of bone resorption diseases, mainly osteoporosis and femoral neck fractures.
  • bone loss and bone strength decrease due to abnormalities of phosphorus metabolism such as rheumatoid arthritis, diabetes, chronic renal failure, and other bone resorption diseases, as well as multiple myeloma, malignant lymphoma, familial bone Paget's disease or periodontal disease Expected to be effective for treatment.
  • the above-mentioned cyclic peptide as an active ingredient can be used alone as a purified or crude product as a preventive or therapeutic agent for bone resorption-related diseases, or as a preventive or therapeutic agent for bone resorption-related diseases together with a solvent or a carrier. It is possible to use.
  • the solvent or carrier is preferably one that can be safely used as a food or as a pharmaceutical in consideration of use as the following food and drink and / or pharmaceutical.
  • the preventive or therapeutic agent for bone resorption-related diseases of the present invention has various uses, and examples thereof include use for test research, food and drink for suppressing osteoclast formation, and pharmaceutical compositions.
  • the content of the active ingredient in the preventive or therapeutic agent for bone resorption-related diseases of the present invention is not particularly limited, but includes, for example, 0.0001% to 1% based on the total weight, preferably 0.001% to 0.1%.
  • the active ingredient used in the preventive or therapeutic agent for bone resorption-related diseases of the present invention is derived from food, the safety is very high and there is no substantial upper limit on the content.
  • the osteoclast formation inhibitor of the present invention or the preventive or therapeutic agent for bone resorption-related diseases can be in the form of a food / beverage having these desired effects.
  • the food and drink are food and drink taken on a daily basis, for example, green tea, barley tea, oolong tea, tea, coffee, sports drink, drinking water, seasoning, and dressing.
  • foods and drinks may be anything you normally eat, including soft drinks, cocktails, beer, whiskey, shochu, wine, sake, seasoned rice, processed foods, instant foods, retort foods, chocolate, fresh cream, pastry, dairy products, It may be a health food, a supplement or the like.
  • the active ingredient is included such that the intake amount of the active ingredient is, for example, 0.1 mg to 10 g, but a range of 0.5 mg to 5 g is preferable.
  • the active ingredient used for the osteoclast formation inhibitor of the present invention is derived from food, the safety is very high and there is no substantial upper limit on the content.
  • the osteoclast formation inhibitor of the present invention or the preventive or therapeutic agent for bone resorption-related diseases can also be used as a pharmaceutical composition having a desired effect.
  • Preferred drugs are drugs that are administered orally, and examples thereof include drinks, tablets, capsules, granules, powders, candy, and drop agents.
  • the medicament contains the active ingredient in an amount of 0.1 mg to 10 g, preferably 0.5 mg to 5 g per dose.
  • the active ingredient used is derived from food, the safety is very high, and it is safe to take for a long time. Therefore, it can be taken on a daily basis to prevent or eliminate osteoporosis.
  • Flaxseed has reported a cyclic peptide named Cyclolinopeptide A by Kaufmann et al. In 1959. Until now, synthesis of analogs, conformational analysis using computational methods, X-ray crystal structure analysis, etc. Research is being conducted from various angles. As for physiological activity, cytoprotective action, ionophore action, etc. have been reported, but in recent years it has also been revealed to have immunosuppressive action. Therefore, we thought that there might be a cyclic peptide that has not yet been reported for flaxseed, which is a herbal herbal medicine.
  • Example 1 Extraction / isolation / structural analysis samples, pressure-extracted flaxseed meal (30kg) purchased from Nikka Yushi Co., Ltd. was heated and extracted with Hexane, and then further extracted with MeOH. Two fractions of the transferred fraction were obtained.
  • the MeOH-transferred fraction obtained here was separated with the solvent system H 2 O-MeOH using Diaion HP-20, and the 100% MeOH-eluted fraction was subsequently subjected to silica gel column chromatography (CHCl 3 -MeOH).
  • amino acid analysis was performed after hydrolysis to determine the composition of the contained amino acid.
  • the amino acid analysis was performed according to the following procedure. *
  • Determination of the absolute configuration of amino acids by the Marfey method was performed according to the following procedure. 1 mg each of isolated and purified A (1) -K (11) was hydrolyzed with 6N HCl (4% thioglycolic acid added) at 110 ° C for 24 hours, the solvent was distilled off, and the resulting residue was purified. Dissolved in 100 ml of water. To this were added Marfey's reagent (1-fluoro-2,4-dinitrophenyl-5-L-alanineamide) 1.0 mg / acetone 100 ml and 1M NaHCO3 17 ml and incubated at 30-40 ° C. for 1 hour.
  • the retention time (min) of standard amino acids derivatized with Marfey's reagent is as follows. L-Pro (42.5), D-Pro (47.7), L-Met (51.4), D-Met (63.5), L-Val (52.9), D-Val (65.6), L-Trp (56.3), D -Trp (64.4), L-Phe (58.8), D-Phe (69.7), L-Ile (60.3), D-Ile (72.6), L-Leu (61.7), D-Leu (73.3).
  • the retention time (min) of the hydrolyzate of A (1) derivatized with Marfey's reagent is as follows.
  • the retention time (min) of the hydrolyzate of B (2) derivatized with Marfey's reagent is as follows.
  • the retention time (min) of the hydrolyzate of C (3) derivatized with Marfey's reagent is as follows.
  • the retention time (min) of D (4) hydrolyzate derivatized with Marfey's reagent is as follows.
  • the retention time (min) of the hydrolyzate of E (5) derivatized with Marfey's reagent is as follows.
  • the retention time (min) of the hydrolyzate of F (6) derivatized with Marfey's reagent is as follows.
  • the retention time (min) of the hydrolyzate of G (7) derivatized with Marfey's reagent is as follows.
  • the retention time (min) of the hydrolyzate of H (8) derivatized with Marfey's reagent is as follows.
  • the retention time (min) of the hydrolyzate of I (9) derivatized with Marfey's reagent is as follows.
  • the retention time (min.) Of the hydrolyzate of J (10) derivatized with Marfey's reagent is as follows.
  • the retention time (min.) Of K (11) hydrolyzate derivatized with Marfey's reagent is as follows.
  • Table 1 shows the structure of the cyclic peptide “Cyclolinopeptide” A (1) -11K (11) whose structure was isolated from flaxseed.
  • the isolated cyclic peptide had Met residues other than Cyclolinopeptide A, and in particular compounds 10 and 11 had Met residues as Msn.
  • Met oxidized state
  • other Met -containing compounds exist in an oxidized state (Mso) except for compound 2, and the higher the Met residue oxidation state, the higher the yield. I think that the fresher the relationship, the different aspects. That is, as natural products, these exist as Met, and the Mso and Msn residues may be compounds generated by an oxidation reaction.
  • Cyclolinopeptide F (6) (5 mg) was dissolved in TFA (900 ⁇ L), cooled to 0 ° C., and 10 ⁇ L 6N hydrochloric acid and 100 ⁇ L Et 2 S were added. After 1 hour, the reaction was quenched with 10 mL saturated NaHCO 3 and partitioned three times with 20 mL CHCl 3 . The obtained CHCl 3 fraction was dehydrated with Na 2 SO 4 , and then the CHCl 3 fraction was concentrated to obtain a reaction product.
  • the resulting product was obtained by reverse-phase HPLC (Shiseido Capcell Pak C 18 MGIII 10 mm id x 250 mm, solvent system: H 2 O-MeCN gradient from 60:40 to 30:70 in 60 minutes, flow rate 4 mL / As a result of separation and purification using min, UV / vis detection (210 nm), compounds 13 (0.8 mg), 14 (1.0 mg) and cyclolinopeptide I (0.9 mg) were obtained.
  • Cyclolinopeptide G (5 mg)
  • Compound 15 (1.3 mg), 16 (1.3 mg) and cyclolinopeptide H (0.9 mg) were obtained using the same reaction conditions and purification method.
  • Example 3 Activity evaluation Preparation of bone marrow cells
  • Femur and tibia were extracted from male ICR mice (4-8 weeks old). Bone marrow cells were flushed out into 10 mL of modified essential medium- ⁇ (MEM ⁇ ) supplemented with 10% fetal bovine serum and 100 U / mL penicillin G, 100 ⁇ g / mL streptomycin using a syringe and a 21G needle.
  • MEM ⁇ modified essential medium- ⁇
  • ACK lysing buffer [0.15 M NH 4 Cl, 1.0 mM KHCO 3 , 0.1 mM Na 2 EDTA (pH 7.3)] was added, Hemolysis treatment was performed for 5 minutes. 15 mL of MEM ⁇ was added, and cell debris was removed using a cell strainer. After centrifugation at 1200 rpm and room temperature for 5 minutes and removing the supernatant, the cells were suspended in 10 mL of MEM ⁇ .
  • the bone marrow cells used in each experiment are cells excluding cell-debris after hemolysis as described above.
  • Isolated bone marrow cells are seeded on a 96-well plate under conditions of 1.5x10 5 cells / 100 ⁇ L / well, and macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) is adjusted to a final concentration of 40 ng / mL. added.
  • various amapeptides and control drugs positive control: curcumin, negative control: DMSO
  • RANKL was added as a differentiation factor to a final concentration of 40 ng / mL.
  • the total amount of the culture solution becomes 200 ⁇ l by adding RANKL and the sample, and the final concentration of M-CSF added on the previous day becomes 20 ng / mL.
  • the cells subjected to osteoclast differentiation induction operation were ice-cooled with phosphate-buffered saline (PBS) (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8.1 mM Na 2 HPO 4 ⁇ 12H 2 O, 1.5 mM KH 2 PO 4 ) 3
  • PBS phosphate-buffered saline
  • TRAP staining solution [0.01% Naphthol AS-BI phosphate, 0.06% Fast red ITR salt, 50 mM sodium tartrate dihydrate, 0.1 M sodium acetate (pH 5.4)] at 37 ° C, Incubation for 20 minutes allowed TRAP positive cells to develop color.
  • osteoclast differentiation induction system In analyzing the action of the cultured amapeptide of bone marrow macrophages, an osteoclast differentiation induction system using bone marrow cells containing various cells is unsuitable. Therefore, only bone marrow macrophages that become osteoclast progenitor cells were isolated and used to examine various gene expression, protein expression and protein phosphorylation.
  • Bone marrow cells (8 ⁇ 10 7 cells) prepared from the mouse femur were seeded in a 100 mm Petri dish, added with 100 ng / mL M-CSF, and cultured in an environment of 37 ° C. and 5% CO 2 for 3 days. Cells attached to the bottom of the dish were treated with 0.1% trypsin containing 1 mM EDTA, and the obtained cells were used as bone marrow macrophages for various experiments.
  • bone marrow macrophages were cultured at a density of 2 ⁇ 10 4 cells / cm 2 in the presence of 20 ng / mL M-CSF, and RANKL was added at 40 ng / mL.
  • Evaluation results Osteoclast differentiation-inhibiting action of amapeptides Cyclic peptides cyclolinopeptides isolated from flax-A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, K and CL-F and G A total of 16 kinds of peptides, ie, 5 kinds of reductants, were compared in their osteoclast differentiation inhibitory activity. The results are shown in Table 3. As described above, curcumin was used as a positive control and DMSO was used as a negative control. There was no inhibitory activity in the system using DMSO.
  • cyclolinopeptide-J Activity was observed for all 11 and 5 derivatives of the natural product compared to the control. Of the 11 types of cyclolinopeptide-A to K isolated from nature, cyclolinopeptide-J had the strongest inhibitory activity, and its IC 50 was 10 nM. Regarding the cytotoxicity of cyclolinopeptide-J, no significant growth inhibition was observed even at 10 ⁇ M, which is 1000 times the IC 50 .
  • Mechanism of inhibition of osteoclast differentiation by cyclolinopeptide-J RT-PCR examined the expression of various osteoclast marker genes. As a result, the addition of 20 nM cyclolinopeptide-J suppressed the expression of RANKL-induced marker genes. It was done. Moreover, as a result of confirming the protein expression of NFAFc1 which is a master transcription factor of osteoclast by Western blotting, the expression of NFAFc1 observed 48 hours after the addition of RANKL was suppressed. These results suggested that the action of cyclolinopeptide-J acts in the early stage of osteoclast differentiation signal by RANKL.
  • cyclolinopeptide-J selectively suppresses c-fos mediated signals among intracellular signals activated by RANKL.
  • the osteoclast differentiation inhibitor of the present invention can provide a composition useful for the prevention or treatment of bone resorption diseases, mainly osteoporosis and femoral neck fractures.
  • bone loss and bone strength decrease due to abnormalities of phosphorus metabolism such as rheumatoid arthritis, diabetes and chronic renal failure, which are bone resorption-related diseases, as well as multiple myeloma, malignant lymphoma, familial bone Paget's disease Alternatively, a therapeutic effect on periodontal disease is expected.
  • the osteoclast differentiation inhibitor of the present invention is a component derived from flax, it is highly safe and useful.

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Abstract

　本発明の目的は、天然物起源で長期投与であり、効果の高い破骨細胞分化抑制剤を提供することである。また天然物起源で長期投与であり、効果の高い骨吸収関連疾患の予防および治療剤を提供することである。　アマ由来の環状ペプチドが破骨細胞の分化に必要なＲＡＮＫＬシグナルを抑制し、骨髄ミエロイド系細胞から破骨細胞への分化を抑制することを見出した。それらの環状ペプチドを有効成分とすることで、骨粗鬆症などの骨吸収に関連した状態や疾患の予防や治療を目的とした飲食品や医薬品を提供することができる。

Description

環状ペプチドを有効成分とする骨吸収関連疾患の治療又は予防剤
　本発明は、環状ペプチドを有効成分とする破骨細胞分化抑制剤、または骨吸収関連疾患の予防および治療剤に関する。
　骨は身体の支持や内臓の保護、カルシウムの貯蔵などを担う重要な器官である。骨は骨芽細胞が産生するタイプＩコラーゲンを主とする骨基質タンパクにリン酸カルシウムが沈着した組織である。骨組織の成長・発達・構造や強度の維持には、骨を形成する骨芽細胞と吸収する破骨細胞とが重要な役割を果たしている。
　骨芽細胞と破骨細胞はそれぞれ骨形成と骨吸収を担い、両者の繰り返しによって骨組織は維持されている。このようなリモデリングと呼ばれる相互調節機構において、骨芽細胞は骨吸収部位に誘導され、破骨細胞によって吸収された骨組織の修復を行う。このリモデリングサイクルは骨の伸張や修復に加えて、外力に抗う為の骨組織の層板構造の形成にも必要である。
　骨芽細胞は間葉系幹細胞を由来とし、一方の破骨細胞は造血細胞から単球/マクロファージ系細胞を経て分化した細胞である。これら骨関連細胞はホルモンや炎症性サイトカイン、増殖因子などさまざまな因子の影響を受けている。
　これまでの知見から、破骨細胞の前駆細胞は血液幹細胞由来のM-CSF依存的なミエロイド系細胞が主である。この前駆細胞は骨芽細胞と物理的に接触し、骨芽細胞の細胞膜上に発現するreceptor activator of nuclear factor kappa-B ligand (RANKL)による刺激を受け、破骨細胞へと分化する。つまり、破骨細胞への分化は骨芽細胞のRANKL発現によって制御されており、骨芽細胞にRANKL発現を促す物質としては、PGE２、 活性型VD３、IL-6、PTHなどが知られている。
　破骨細胞と骨芽細胞のバランスが破綻すると骨量に変化が生じ、その結果として大理石骨病や骨粗鬆症が引き起こされる。大理石骨病は稀な疾患であることから、通常、骨代謝分野において問題となるのは、骨吸収の活性が骨形成活性を上回る場合、すなわち骨粗鬆症である。骨粗鬆症は、現在国内で約1000万人の患者が罹患していると言われている。また歯周病や関節炎なども異常な骨の破壊と密接に関連しており、骨吸収関連疾患は身近な疾患である。
　加齢は骨量変化を起こす因子の一つである。成長期には骨形成が骨吸収を上回り骨量は増加するが、４０歳以後には骨形成より骨吸収が上回る。特に女性では閉経後に急激な骨量減少が起こり、高回転型の骨粗鬆症が高頻度に認められる。
　近年高齢化社会が問題となっている中、高齢者のＱＯＬを維持・改善するために、さらなる骨粗鬆症の病態解析や新規治療法の確立が期待されている。　
　骨粗鬆症を予防あるいは治療する薬剤として、各種の化合物が研究され臨床使用されている。骨吸収の阻害、すなわち破骨細胞を阻害する骨粗鬆症治療薬としては、ビスホスホネート、エストロゲンアナログ、カルシトニン、活性型VD3、ビタミンＫ、イプリフラボンなどが知られている。例えば、ビスホスホネートは骨に対する作用が古くから知られ、その構造中にN（窒素）を含まない第1世代、構造中にNを含む第2、第3世代の化合物が医薬品として開発され、臨床使用されている。しかしながら、最近では長期投与による顎骨壊死などが問題視されている。
　一方で、植物やその抽出物を有効成分とする骨粗鬆症の治療薬が報告されている。例えば、セリ科ペトロセリヌム属などのハーブ植物を用いた閉経後骨粗鬆症の予防又は治療剤（特許文献１）、ケルセチンまたはケルセチン誘導体を有効成分とする、破骨細胞分化抑制因子産生促進用組成物（特許文献２）などである。
特許第３４７９２２４号公報 特開２００７－１３７７７５号公報
　本発明の目的は、天然物起源で長期投与が可能であり、効果の高い破骨細胞分化抑制剤を提供することである。　
　また本発明の目的は、天然物起源で長期投与が可能であり、効果の高い骨吸収関連疾患の予防および治療剤を提供することである。　
　上記課題を解決すべく、本発明者らは副作用の心配がない天然物質を候補物質として探索した結果、アマ由来の環状ペプチドが破骨細胞の分化に必要なRANKLシグナルを抑制し、骨髄ミエロイド系細胞から破骨細胞への分化を抑制することを見出した。また、それらの成分は毒性が低く、食品や医薬品への応用も可能であることが明らかとなった。これらの知見から、アマ由来の環状ペプチドを有効成分とすることで、骨粗鬆症などの骨吸収に関連した状態や疾患の予防や治療を目的とした飲食品や医薬品を提供することができることを見いだし、本発明を完成した。
　すなわち本発明を例示すれば、次の［１］～［１３］である。　
[１]　 アマ由来の環状ペプチドを有効成分として含む破骨細胞分化抑制剤。
[２]　８または９アミノ酸からなる環状ペプチドの一種以上をとして含む破骨細胞分化抑制剤。
[３]　有効成分が、
cyclo (-Pro-Pro-Phe-Phe-Leu-Ile-Ile-Leu-Val-)、
cyclo (-Pro-Pro-Phe-Phe-Val-Ile-Met-Leu-Ile-)、  
cyclo (-Pro-Pro-Phe-Phe-Val-Ile-Mso-Leu-Ile-)、
cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Ile-Mso-Leu-Leu-)、      
cyclo (-Pro-Leu-Phe-Ile-Mso-Leu-Val-Phe-)、      
cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Val-Mso-Leu-Mso-)、      
cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Ile-Mso-Leu-Mso-)、      
cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Ile-Mso-Leu-Met-)、      
cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Val-Met-Leu-Mso-)、      
cyclo (-Pro-Leu-Phe-Ile-Msn-Leu-Val-Phe-)、      
cyclo (-Pro-Pro-Phe-Phe-Val-Ile-Msn-Leu-Ile-)、       
cyclo (-Pro-Leu-Phe-Ile-Met-Leu-Val-Phe-)、      
cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Val-Met-Leu-Met-)、      
cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Val-Mso-Leu-Met-)、      
cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Ile-Met-Leu-Met-)、および
cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Ile-Met-Leu-Mso-)
からなる群から選択される環状ペプチドの一種以上である、[２]記載の破骨細胞分化抑制剤。
[４]　有効成分が
cyclo-(Pro-Pro-Phe-Phe-Leu-Ile-Ile-Leu-Val)、
cyclo-(Pro-Phe-Phe-Trp-Ile-Mso-Leu-Leu)、
cyclo-(Pro-Phe-Phe-Trp-Val-Mso-Leu-Mso)、
cyclo-(Pro-Phe-Phe-Trp-Val-Met-Leu-Mso)、および
cyclo-(Pro-Leu-Phe-Ile-Msn-Leu-Val-Phe)からなる群から選択される環状ペプチドの一種以上である、[３]記載の破骨細胞分化抑制剤。
[５]　有効成分がcyclo-(Pro-Leu-Phe-Ile-Msn-Leu-Val-Phe)である、[４]記載の破骨細胞分化抑制剤。
[６]　アマ由来の環状ペプチドを有効成分として含む骨吸収関連疾患の予防または治療剤。
[７]　８または９アミノ酸からなる環状ペプチドの一種以上を有効成分として含む骨吸収関連疾患の予防または治療剤。
[８]　有効成分が、cyclo (-Pro-Pro-Phe-Phe-Leu-Ile-Ile-Leu-Val-)、
cyclo (-Pro-Pro-Phe-Phe-Val-Ile-Met-Leu-Ile-)、       
cyclo (-Pro-Pro-Phe-Phe-Val-Ile-Mso-Leu-Ile-)、
cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Ile-Mso-Leu-Leu-)、      
cyclo (-Pro-Leu-Phe-Ile-Mso-Leu-Val-Phe-)、      
cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Val-Mso-Leu-Mso-)、      
cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Ile-Mso-Leu-Mso-)、      
cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Ile-Mso-Leu-Met-)、      
cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Val-Met-Leu-Mso-)、      
cyclo (-Pro-Leu-Phe-Ile-Msn-Leu-Val-Phe-)、      
cyclo (-Pro-Pro-Phe-Phe-Val-Ile-Msn-Leu-Ile-)、       
cyclo (-Pro-Leu-Phe-Ile-Met-Leu-Val-Phe-)、      
cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Val-Met-Leu-Met-)、      
cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Val-Mso-Leu-Met-)、      
cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Ile-Met-Leu-Met-)、および
cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Ile-Met-Leu-Mso-)
からなる群から選択される環状ペプチドの一種以上である、[７]記載の骨吸収関連疾患の予防または治療剤。
[９]　有効成分が
cyclo-(Pro-Pro-Phe-Phe-Leu-Ile-Ile-Leu-Val)、
cyclo-(Pro-Phe-Phe-Trp-Ile-Mso-Leu-Leu)、
cyclo-(Pro-Phe-Phe-Trp-Val-Mso-Leu-Mso)、
cyclo-(Pro-Phe-Phe-Trp-Val-Met-Leu-Mso)、および
cyclo-(Pro-Leu-Phe-Ile-Msn-Leu-Val-Phe)からなる群から選択される環状ペプチドの一種以上である、[８]記載の骨吸収関連疾患の予防または治療剤。
[１０]　有効成分がcyclo-(Pro-Leu-Phe-Ile-Msn-Leu-Val-Phe)である、[９]記載の骨吸収関連疾患の予防または治療剤。
[１１]　骨吸収関連疾患が骨粗鬆症である、[６]～[１０]のいずれかに記載の骨吸収関連疾患の予防または治療剤。
[１２]　飲食料の形態である、[１]～[１１]のいずれかに記載の剤。
[１３]　医薬組成物の形態である、[１]～[１１]のいずれかに記載の剤。
　環状ペプチドを有効成分として含有させることにより、破骨細胞分化抑制効果を発揮する。そして、RANKLよって誘導される破骨細胞分化過程においてc-fosの発現から破骨細胞のマスター転写因子NFATc1の発現に至るシグナルを阻害することにより、破骨細胞分化を効果的に抑制する。
　本発明の破骨細胞分化抑制剤により、骨吸収疾患、主に骨粗鬆症や大腿頸部骨折の予防または治療に有用な組成物を提供することが可能となる。また、本発明により、骨吸収関連疾患である関節リウマチ、糖尿病、慢性腎不全などのリン代謝異常における骨量減少や骨強度低下、さらには多発性骨髄腫、悪性リンパ腫、家族性骨ページェット病あるいは歯周病への治療効果が期待される。
　また、本発明の破骨細胞分化抑制剤は、天然成分を有効成分とするため、安全性が高く、有用である。
　以下、本発明の実施の形態について、詳細に説明する。
　本発明は、アマ（亜麻、学名：Linum usitatissimum）に含まれる環状ペプチドを有効成分として含有する破骨細胞形成抑制剤に関する。また、本発明は、アマに含まれる環状ペプチドを有効成分として含有する骨吸収関連疾患の予防および治療剤に関する。
　有効成分
　環状ペプチドは抗腫瘍活性、抗菌活性、免疫抑制作用など多様な生理活性を有し、医薬品開発において注目されている化合物である。これら環状ペプチドは海洋生物由来、あるいは菌類の二次代謝産物由来のものが多いのに対し、高等植物由来のものは報告例が少ない。
　本発明では、アマに含まれる環状ペプチドを用いて完成させたが、同一または類似の構造を有する環状ペプチドであれば、その由来は問わない。これらの環状ペプチドは、アマ等の天然材料から溶媒抽出によって、または化学合成もしくは酵素合成によっても得ることができる。
　アマに含まれる環状ペプチドが有効成分であることから、アマ抽出物を破骨細胞形成抑制剤や骨吸収関連疾患の予防または治療剤として用いることができる。
　有効成分である環状ペプチドは、８または９アミノ酸からなる環状ペプチドである。構成アミノ酸の種類は問わないが、好ましい例としては以下を挙げることができる：
cyclo (-Pro-Pro-Phe-Phe-Leu-Ile-Ile-Leu-Val-)、
cyclo (-Pro-Pro-Phe-Phe-Val-Ile-Met-Leu-Ile-)、       
cyclo (-Pro-Pro-Phe-Phe-Val-Ile-Mso-Leu-Ile-)、
cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Ile-Mso-Leu-Leu-)、      
cyclo (-Pro-Leu-Phe-Ile-Mso-Leu-Val-Phe-)、      
cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Val-Mso-Leu-Mso-)、      
cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Ile-Mso-Leu-Mso-)、      
cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Ile-Mso-Leu-Met-)、      
cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Val-Met-Leu-Mso-)、      
cyclo (-Pro-Leu-Phe-Ile-Msn-Leu-Val-Phe-)、      
cyclo (-Pro-Pro-Phe-Phe-Val-Ile-Msn-Leu-Ile-)、       
cyclo (-Pro-Leu-Phe-Ile-Met-Leu-Val-Phe-)、      
cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Val-Met-Leu-Met-)、      
cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Val-Mso-Leu-Met-)、      
cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Ile-Met-Leu-Met-)、および
cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Ile-Met-Leu-Mso-)。
特に好ましくは以下である：
cyclo-(Pro-Pro-Phe-Phe-Leu-Ile-Ile-Leu-Val)、cyclo-(Pro-Phe-Phe-Trp-Ile-Mso-Leu-Leu)、cyclo-(Pro-Phe-Phe-Trp-Val-Mso-Leu-Mso)、cyclo-(Pro-Phe-Phe-Trp-Val-Met-Leu-Mso)、または
cyclo-(Pro-Leu-Phe-Ile-Msn-Leu-Val-Phe)。
これらは、単独でも組み合わせても用いることができる。また、これら環状ペプチドの誘導体であって、所望の活性を有するものも有効成分として用いることができる。
　アマ（亜麻、学名：Linum usitatissimum）は、アマ科の一年草で比較的寒い地方で栽培される。茎の繊維はリンネル（リネン）製品となる。アマはアサと間違えられることがあるが、アサよりも柔らかくかつ強靭で通気性・吸湿性に優れて肌触りが良いことから織られて高級な衣類などになる。本植物は中央アジア原産で、世界各地で栽培されている。
　成熟種子を乾燥したものを亜麻仁といい、種子を圧搾、またはつぶして溶媒で抽出することで得られる亜麻仁油（linseed oil / flaxseed oil）は、ω－３脂肪酸であるα-リノレン酸をはじめとする不飽和脂肪酸に富み、食用、サプリメントとして販売されている。亜麻仁油は、黄色っぽい乾性油（空気に触れると固まる油）であり、沸騰させたアマニ油は重合、酸化し、油絵具のバインダーや木製品の仕上げなどに「オイルフィニッシュワニス」として用いられる。　
　抽出原料としての天然材料は、種子をそのまま用いてもよいし、粉砕して用いてもよい。抽出に用いる溶媒は、有機溶媒、水、またはこれらの混合物などを用いることができる。得られた抽出液は、適切な分離用担体を用いて、分離・精製することができる。分離用担体としては、上記の環状ペプチドを吸着し、適切な分離用溶媒によって分離することができるものであれば、いずれをも用いることができる。例えば、スチレン系やデキストラン系の合成吸着剤を用いて分離・精製することができる。このような分離用担体に上記の抽出液を負荷したのち、適切な溶媒を用いて、上記の環状ペプチドを分離する。より具体的には、本明細書の実施例１の記載に従って、本発明の破骨細胞形成抑制剤または骨吸収関連疾患の予防および治療剤に用いる上記の環状ペプチドを得ることができる。また、上記の環状ペプチドは、亜麻仁油にも含有され、同様に得ることができる。このようにして得られた上記の環状ペプチドは、濃縮して用いてもよく、また、凍結乾燥等の方法によって粉末として用いてもよい。　
破骨細胞形成抑制剤
　本発明の破骨細胞形成抑制剤は、強い破骨細胞形成抑制作用を有する。破骨細胞形成抑制活性の測定は、当業者に公知の方法で評価することができる。例えば、骨髄ミエロイド系細胞から破骨細胞への分化を抑制する作用に基づいて評価をすることができる。参考として、本願実施例に記載した方法をあげることができる。
　上記の有効成分である環状ペプチドは、精製品または粗精製品として単独で破骨細胞形成抑制剤として使用することもでき、または溶媒や担体とともに破骨細胞形成抑制剤として使用することが可能である。溶媒または担体は、下記飲食料および／または医薬品としての使用を考えて、食品としてまたは医薬品として安全に使用できるものであることが好ましい。本発明の破骨細胞形成抑制剤は種々の用途を有し、例えば試験研究用、破骨細胞形成を抑制するための飲食料、医薬組成物としての使用が例示される。
　本発明の破骨細胞形成抑制剤における有効成分の含量には特に制限はないが、例えば全重量基準で０．０００１％～１％となるように含み、好ましくは０．００１％～０．１％である。ただし、本発明の破骨細胞形成抑制剤に用いる有効成分は食品に由来するため、安全性が非常に高く、含有量に実質的上限はない。
骨吸収関連疾患の予防または治療剤
　上記有効成分は破骨細胞分化抑制作用を有し、骨吸収疾患、主に骨粗鬆症や大腿頸部骨折の予防または治療に用いることができる。また、骨吸収関連疾患である関節リウマチ、糖尿病、慢性腎不全などのリン代謝異常における骨量減少や骨強度低下、さらには多発性骨髄腫、悪性リンパ腫、家族性骨ページェット病あるいは歯周病への治療効果も期待される。
　上記の有効成分である環状ペプチドは、精製品または粗精製品として単独で骨吸収関連疾患の予防または治療剤として使用することもでき、または溶媒や担体とともに骨吸収関連疾患の予防または治療剤として使用することが可能である。溶媒または担体は、下記飲食料および／または医薬品としての使用を考えて、食品としてまたは医薬品として安全に使用できるものであることが好ましい。本発明の骨吸収関連疾患の予防または治療剤は種々の用途を有し、例えば試験研究用、破骨細胞形成を抑制するための飲食料、医薬組成物としての使用が例示される。
　本発明の骨吸収関連疾患の予防または治療剤における有効成分の含量には特に制限はないが、例えば全重量基準で０．０００１％～１％となるように含み、好ましくは０．００１％～０．１％である。ただし、本発明の骨吸収関連疾患の予防または治療剤に用いる有効成分は食品に由来するため、安全性が非常に高く、含有量に実質的上限はない。
飲食料
　本発明の破骨細胞形成抑制剤、または骨吸収関連疾患の予防または治療剤は、それら所望の効果を有する飲食料の形態とすることができる。飲食料の好ましい例は、日常的に摂取する飲食料、例えば、緑茶、麦茶、ウーロン茶、紅茶、コーヒー、スポーツドリンク、飲料水、調味料、ドレッシングである。しかし飲食料は通常食するものであればよく、清涼飲料、カクテル、ビール、ウイスキー、焼酎、ワイン、清酒、味付け米、加工食品、インスタント食品、レトルト食品、チョコレート、生クリーム、洋菓子、乳製品、健康食品、サプリメント等であってもよい。
　飲食料の形態においては、有効成分の摂取量が１食あたり例えば０．１ｍｇ～１０ｇとなるように含まれるが、０．５ｍｇ～５ｇの範囲が好ましい。ただし、本発明の破骨細胞形成抑制剤等に用いる有効成分は食品に由来するため、安全性が非常に高く、含有量に実質的上限はない。
医薬組成物
　本発明の破骨細胞形成抑制剤、または骨吸収関連疾患の予防または治療剤は、所望の効果を有する医薬組成物としても使用できる。好ましい薬剤は、経口投与される薬剤であり、その例として、ドリンク剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、キャンデー、ドロップ剤等があげられる。薬剤には、有効成分を、１回服用量当たり０．１ｍｇ～１０ｇ、好ましくは０．５ｍｇ～５ｇの量で含む。
　本発明の医薬組成物は、用いる有効成分は食品に由来するため、安全性が非常に高く、長期間にわたって服用しても安全である。したがって、骨粗鬆症の防止または解消のために、日常的に服用することも可能である。
　本発明を以下の実施例により、さらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
　亜麻仁からは 1959 年に Kaufmann らによって Cyclolinopeptide A と命名された環状ペプチドが報告されており、現在に至るまでアナログ体の合成、計算学的手法を用いたコンホメーション解析、X 線結晶構造解析など様々な角度から研究が行われている。また生理活性に関しても、細胞保護作用、イオノフォア作用なども報告されているが、近年免疫抑制作用を有することも明らかとされた。そこでこのアマ科の漢方生薬である亜麻仁について未だ報告されていない環状ペプチドがあるのではないかと考えた。
実施例１．抽出・単離・構造解析
　試料として日華油脂株式会社より購入した飼料用圧抽亜麻仁粕 (30kg) を Hexane で加温抽出した後、MeOH にてさらに加温抽出し、Hexane 移行画分と MeOH 移行画分の 2 つの画分を得た。
　まず、ここで得られたMeOH 移行画分を Diaion HP-20 を用いて、溶媒系 H2O-MeOH で分離し、100% MeOH 溶出画分を、引き続きシリカゲルカラムクロマトグラフィー（CHCl3-MeOH）、ODS カラム（H2O-MeCN、40-60％ MeCN）を用いた逆相系 HPLC で順次分離・精製を行った結果、9 種類のペプチド性化合物 Cyclolinopeptide A (1, 691.2 mg, 0.0023%)、B (2, 52.7 mg, 0.00018%)、C (3, 1106.2 mg, 0.0037%)、D (4, 456.4 mg, 0.0015%)、E (5, 1747.2 mg, 0.0058%)、F (6, 245.0 mg, 0.00082%)、G (7, 729.0 mg, 0.0024%)、H (8, 50.3 mg, 0.00017%)、I (9, 21.9 mg, 0.00007%) を得た。また、Hexane 移行画分に関しても同様の操作を行い、Cyclolinopeptide A (1, 226.0 mg, 0.0075%)、J (10, 806.0 mg, 0.0027%)、K (11, 214.0 mg, 0.00071%) を得た。
　各化合物は機器分析データを基にペプチド性化合物であることが示唆されたことから、加水分解後にアミノ酸分析を行い、含有アミノ酸の組成を決定した。アミノ酸分析は、以下の手順で行った。　
　単離・精製したA(1)-K(11)それぞれ1mg を 6N HCl （4% チオグリコール酸添加)、110 ℃で 24 時間加水分解した後溶媒を留去し、得られた残査を0.02N HCl 1 ml に溶解し、アミノ酸分析装置 (Hitachi L-8500 Amino Acid analyzer) を用いて分析した。
　Marfey 法によるアミノ酸の絶対立体配置の決定は、以下の手順で行った。単離、精製したA(1)-K(11)それぞれ1mg を 6N HCl（4% チオグリコール酸添加)、110 ℃で 24 時間加水分解した後溶媒を留去し、得られた残査を精製水 100 ml に溶解した。これにMarfey 試薬(1-fluoro-2,4-dinitrophenyl-5-L-alanineamide)  1.0 mg / acetone 100 ml と 1M NaHCO3 17 ml を加え、30-40 ℃で 1 時間インキュベーションした。反応混合物を室温まで冷却した後、2M HCl を 15 ml 加えた。これを濃縮し、 DMSO 0.5 ml に溶解しサンプルとした。調製したサンプルをHPLC にて分析し、上記の方法で誘導化した標準アミノ酸サンプルとの保持時間を比較することにより、アミノ酸の絶対配置を決定した。
HPLC 条件---- 溶媒 10-80% MeOH (80 分間、グラジュエント) / 50mM TEAP (triethylammonium phosphate) buffer (pH 3.2)、流速 : 1 ml/min、測定波長 : 340 nm。
　Marfey 試薬により誘導化した標準アミノ酸の保持時間(min) は次の通りである。
L-Pro (42.5), D-Pro (47.7), L-Met (51.4), D-Met (63.5), L-Val (52.9), D-Val (65.6), L-Trp (56.3), D-Trp (64.4), L-Phe (58.8), D-Phe (69.7), L-Ile (60.3), D-Ile (72.6), L-Leu (61.7), D-Leu (73.3)。 　
　Marfey 試薬により誘導化した A(1)の加水分解物の保持時間(min) は次の通りである。
L-Pro (42.4), L-Val (52.8), L-Phe (58.7), L-Ile (60.2), L-Leu (61.6)
　Marfey 試薬により誘導化したB(2)の加水分解物の保持時間 (min) は次の通りである。
L-Pro (42.5), L-Met (51.5), L-Val (53.0), L-Phe (58.7), L-Ile (60.2), L-Leu (61.6) 
Marfey 試薬により誘導化したC(3)の加水分解物の保持時間(min) は次の通りである。
L-Pro (42.3), L-Met (51.2), L-Val (52.9), L-Phe (59.0), L-Ile (60.5), L-Leu (61.8)
　Marfey 試薬により誘導化した D(4)の加水分解物の保持時間 (min) は次の通りである。
L-Pro (42.6), L-Met (51.5), L-Trp (56.4), L-Phe (58.1), L-Ile (60.5), L-Leu (61.8)
　Marfey 試薬により誘導化した E(5)の加水分解物の保持時間 (min) は次の通りである。
L-Pro (42.5), L-Met (51.5), L-Val (52.9), L-Phe (58.9), L-Ile (60.4), L-Leu (61.7)
　Marfey 試薬により誘導化した F(6)の加水分解物の保持時間 (min) は次の通りである。
L-Pro (42.5), L-Met (51.5), L-Val (52.9), L-Trp (56.2), L-Phe (58.7), L-Leu (61.8)
　Marfey 試薬により誘導化したG(7)の加水分解物の保持時間 (min) は次の通りである。
L-Pro (42.3), L-Met (51.6), L-Trp (56.3), L-Phe (58.8), L-Ile (60.4), L-Leu (61.8)
　Marfey 試薬により誘導化したH(8)の加水分解物の保持時間 (min) は次の通りである。
L-Pro (42.5), L-Met (51.5), L-Trp (56.4), L-Phe (58.8), L-Ile (60.4), L-Leu (61.8)
　Marfey 試薬により誘導化したI(9)の加水分解物の保持時間 (min) は次の通りである。
L-Pro (42.4), L-Met (51.6), L-Trp (56.3), L-Phe (58.7), L-Val (53.0), L-Leu (61.9)
　Marfey 試薬により誘導化したJ(10)の加水分解物の保持時間 (min.) は次の通りである。
L-Pro (42.3), L-Met (51.4), L-Val (52.9), L-Phe (58.9), L-Ile (60.2), L-Leu (61.7)
　Marfey 試薬により誘導化したK(11)の加水分解物の保持時間 (min.) は次の通りである。
L-Pro (42.5), L-Val (52.8), L-Phe (58.7), L-Ile (60.3), L-Leu (61.8), L-Met (51.5)
　2 次元 NMR を用い各々のアミノ酸を帰属した後、HMBC によるロングレンジ相関およびNOE 相関から、その構造を決定した。化合物 J (11) についてNMR により構造解析した例および各化合物の物性値を下に示す。
Cyclolinopeptide A (1)
無色針状結晶、mp. 243℃、[α] D -111.1゜(c 0.23, MeOH)、IR (KBr) νmax  3332 (NH) and 1668 (amide C=O) cm-1、UV (MeOH) λmax　275 (ε209) and 218 (ε10050) nm。FAB MS m/z 1039.7 (M+H)+、HR-FABMS m/z  1040.6562 [(M+H) +, calcd for C57H86N9O9  1040.6549]。
Cyclolinopeptide B (2)
白色粉末、[α]D -104.1゜(c 0.20, MeOH)、IR (KBr) νmax   3436 (NH) and 1659 (amide C=O)  cm-1、UV (MeOH) λmax 267 (ε243.3) and 218 (ε10578) nm。FAB MS m/z 1057.5 (M+H)+、HR-FABMS m/z  1058.6031 [(M+H)+, calcd for C56H84N9O9S  1058.6113]。
Cyclolinopeptide C (3)
白色粉末、[α] D -109.7゜(c 0.21, MeOH)、IR (KBr) νmax  3329 (NH), 1663 (amide C=O) and 1029 (sulfoxide) cm-1、UV (MeOH) λmax 268 (ε245) and 218 (ε11000) nm。FAB MS m/z 1073.8 (M+H)+、HR-FABMS m/z  1074.6039 [(M+H)+, calcd for C56H84N9O10S  1074.6062]。
Cyclolinopeptide D (4)
白色粉末、[α] D -75.0゜(c 0.20, MeOH)、IR (KBr) νmax  3332 (NH), 1657 (amide C=O) and 1029 (sulfoxide) cm-1、UV (MeOH) λmax  280 (ε4631.0) and 229 (ε10072) nm。FAB MS m/z 1063.8 (M+H)+、HR-FABMS m/z  1064.5682 [(M+H)+, calcd for C57H78N9O9S  1064.5643]。
Cyclolinopeptide E (5)
白色粉末、[α] D -75.5゜(c 0.20, MeOH)、IR (KBr) νmax  3314 (NH), 1657 (amide C=O) and 1028 (sulfoxide) cm-1、UV (MeOH) λmax  267 (ε303) and 218 (ε8690) nm。FAB MS m/z 976.9 (M+H)+、HR-FABMS m/z  977.5491 [(M+H)+, calcd for C51H77N8O9S  977.5534]。
Cyclolinopeptide F (6)
白色粉末、[α] D -71.4゜(c 0.21, MeOH)、IR (KBr) νmax  3375 (NH), 1657 (amide C=O) and 1016  (sulfoxide) cm-1、UV (MeOH) λmax  280 (ε4467.6) and 228 (ε10648) nm。FAB MS m/z 1084.6 (M+H)+、HR-FABMS m/z  1084.5018 [(M+H)+, calcd for C55H74N9O10S2  1084.5000]。
Cyclolinopeptide G (7)
白色粉末、[α]D -66.6 ゜(c 0.20, MeOH)、IR (KBr) νmax  3364 (NH), 1657 (amide C=O) and 1015 (sulfoxide) cm-1、UV (MeOH) λmax  281 (ε4497.0) and 228 (ε9156) nm。FAB MS m/z 1097.6 (M+H)+、HR-FABMS m/z  1098.5138 [(M+H)+, calcd for C56H76N9O10S2  1098.5157]。
Cyclolinopeptide H (8)
白色粉末、[α] D -87.7゜(c 0.15, MeOH)、IR (KBr) νmax  3422 (NH), 1653 (amide C=O) and 1029 (sulfoxide) cm-1、UV (MeOH) λmax 281 (ε4211.6) and 229 (ε8786) nm。FAB MS m/z 1081.6 (M+H)+、HR-FABMS m/z  1082.5201 [(M+H)+, calcd for C56H76N9O9S2  1082.5207]。
Cyclolinopeptide I (9)
白色粉末、[α]D -60.6゜(c 0.20, MeOH)、IR (KBr) νmax 3383 (NH), 1657 (amide C=O) and 1027 (sulfoxide) cm-1、UV (MeOH) λmax  281 (ε4518.4) and 228 (ε10110) nm。FAB MS m/z 1068.2 (M+H)+、HR-FABMS m/z  1068.5110 [(M+H)+, calcd for C55H74N9O9S2  1068.5051]。
Cyclolinopeptide J (10)
白色粉末、[α]D -49.3゜(c 0.15, CHCl3)、IR (NaCl) νmax  3298 (NH), 1653 (amide C=O) and 1134  (sulfone) cm-1、UV (MeOH) λmax  264 (ε1612.9) and 219 (ε11419) nm。FAB MS m/z 993.5 (M+H)+、HR-FABMS m/z  993.5536 [(M+H)+, calcd for C51H77N8O10S  993.5483]。
Cyclolinopeptide K (11)
白色粉末、[α]D -71.4゜(c 0.03, MeOH)、IR (NaCl) νmax  3427 (NH), 1648 (amide C=O) and 1135  (sulfone) cm-1、UV (MeOH) λmax  265 (ε664.0) and 213 (ε16480) nm。FAB MS m/z 1090.6 (M+H)+、HR-FABMS m/z  1090.5962 [(M+H)+, calcd for C56H84N9O11S  1090.6011]。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　各アミノ酸の絶対配置の決定には Marfey 法を適用し、その結果から構成アミノ酸は全て L 体であることが明らかとなった。また、直鎖ペプチドへの変換後に、エドマン分解法を用いたプロテインシークエンサーの配列解析を行い、その構造を確認した。さらに、化合物１、２の配座解析を行い結晶中と溶液中のコンホメーションを明らかにした。　
　亜麻仁より単離構造決定した環状ペプチド Cyclolinopeptide A(1) - K(11)の構造を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
下に、化合物Cyclolinopeptide J(10) とCyclolinopeptide E(5)の構造式を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
　単離した環状ペプチドはCyclolinopeptide A以外は Met 残基を有しており、特に化合物 10 と 11 は Met 残基が Msn として存在していた。また、他の Met 含有化合物も化合物 2 を除いて全て酸化された状態（Mso）で存在しており、Met 残基の酸化状態が進行しているものほど高収量であったことから、生薬として新鮮なものほどこの関係は異なった様相を示すと考える。すなわち、天然物として、これらはMetとして存在しており、Mso, Msn 残基は、酸化反応によって生成した化合物である可能性がある。
実施例２．誘導体の合成
　Cyclolinopeptide E(5) (5 mg)をTFA（400μL）で溶かし、0°Cまで冷やした後、50μL ６N塩酸および50μL Et2Sを加えた。1時間後に10 ｍL 飽和NaHCO3で反応を停止し、10 ｍL CHCl3で３回分配した。得られたCHCl3画分をNa2SO4で脱水した後、CHCl3画分を濃縮し、化合物１２（5 ｍｇ）を得た。
　Cyclolinopeptide Ｆ(6) (5 mg)をTFA（900μL）で溶かし、0°Cまで冷やした後、10μL ６N塩酸および100μL Et2Sを加えた。1時間後に10 ｍL 飽和NaHCO3で反応を停止し20 ｍL CHCl3で３回分配した。得られたCHCl3画分をNa2SO4で脱水した後、CHCl3画分を濃縮し、反応生成物を得た。得られた生成物は逆相系HPLC（Shiseido Capcell Pak C18 MGIII 10 mm i.d. x 250 mm, 溶媒系: H2O-MeCN 60分で60:40 から 30:70 までのグラジエント、流速 4 mL/min, UV/vis 検出 210 nm）を用いて分離・精製を行った結果、化合物１３（0.8 mg）、１４ （1.0 mg）およびcyclolinopeptide Ｉ（0.9 mg）を得た。Cyclolinopeptide G (5 mg）に関しても同様の反応条件および精製法を用いて、化合物１５（1.3 mg）、１６ （1.3 mg）およびcyclolinopeptide H（0.9 mg）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
実施例３．活性評価
骨髄細胞の調製
　雄性ICRマウス(4-8週齢)から大腿骨・脛骨を摘出した。10% ウシ胎児血清および100 U/mL penicillin G、100 μg/mL streptomycinを加えたmodified essential medium-α (MEM α) 10 mL中に、シリンジおよび21G注射針を用いて骨髄細胞をフラッシュアウトした。1200 rpm、室温にて、5分間遠心分離し、上清を除去した後、ACK lysing buffer [0.15 M NH4Cl、1.0 mM KHCO3、0.1 mM Na2EDTA (pH 7.3)]を5 mL加え、5分間の溶血処理を行った。15 mLのMEMαを加え、セルストレイナーを用いてcell debrisを除去した。1200rpm、室温にて、5分間遠心分離し、上清を除去した後、10 mLのMEMαで細胞を懸濁した。
　各実験で用いた骨髄細胞とは、上記のように溶血処理後にcell debrisを除いた細胞を示す。
ＴＲＡＰ活性の測定
　単離した骨髄細胞を1.5x105cells/100 μL/wellの条件で96 well plateに播種し、macrophage colony-stimulating factor (M-CSF)を最終濃度40 ng/mLとなるように加えた。播種後24時間で、各種アマペプチドおよび対照薬物（ポジティブコントロール：curcumin、ネガティブコントロール：DMSO)を各種濃度で添加し、その後、分化因子としてRANKLを最終濃度40 ng/mLとなるように添加した。この際、培養液の全体量はRANKLとサンプルの添加により200μlとなり、前日に加えたM-CSFの最終濃度は20 ng/mLとなる。
　RANKLを誘導3日後に培養液を捨て、0.5%Triton-X100を含む酒石酸緩衝液[50 mM sodium tartrate dihydrate、0.1 M sodium acetate (pH 5.4)]を125 mL加えて細胞を溶解させた後、20 mM AS-BIリン酸を15 μL加えて撹拌後、37℃でインキュベートした。保温1時間後にEx 405 nm/Em 505-520 nmの条件でAS-BI の蛍光を測定し、蛍光値をTRAP活性とした（参考文献：J Bone Miner Res. 2001: 788-793.Naphthol-ASBI phosphate as a preferred substrate for tartrate-resistant acid phosphatase isoform 5b. Janckila AJ, Takahashi K, Sun SZ, Yam LT.) 。
　破骨細胞分化誘導操作を行った細胞を氷冷したphosphate-buffered saline (PBS) (137 mM NaCl、2.7 mM KCl、8.1 mM Na2HPO4・12H2O、1.5 mM KH2PO4) で3回洗浄し、0.9% NaClを含む10% ホルマリンで20分間固定した。細胞を精製水で3回洗浄し、TRAP染色液　[0.01% Naphthol AS-BI phosphate、0.06% Fast red ITR salt、50 mM sodium tartrate dihydrate、0.1 M sodium acetate (pH 5.4)]を用いて37℃、20分間インキュベートすることでTRAP陽性細胞を発色させた。
骨髄マクロファージの培養
　アマペプチドの作用を解析する上では、多種の細胞が含まれる骨髄細胞を用いた破骨細胞分化誘導系は不向きである。そこで破骨細胞の前駆細胞となる骨髄マクロファージのみを単離し、各種の遺伝子発現、タンパク発現およびタンパク質リン酸化の検討に用いた。
　マウス大腿骨より調製した骨髄細胞(8x107cells)を100 mmペトリディッシュに播種し、100 ng/mL M-CSFを加え、37℃、5% CO2の環境下で3日間培養した。ディッシュ底面に付着した細胞を1 mM EDTAを含む0.1% trypsinで処理し、得られた細胞を骨髄マクロファージとして各種実験に用いた。
　各種のRT-PCRおよびウェスタンブロッティング（WB）については、骨髄マクロファージを20 ng/mLのM-CSF存在下2x104cells/cm2 の密度で培養後し、RANKLを40 ng/mLを添加した。
評価結果
1.　アマペプチドの破骨細胞分化抑制作用
　アマから単離した環状ペプチドcyclolinopeptide－A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, Kの11種およびCL-FとGの還元体5種の計16種類のペプチドについて、その破骨細胞分化抑制活性を比較した。結果を表３に示す。尚、上記の通り、ポジティブコントロールとしてcurcumin、ネガティブコントロールとしてDMSOを用いた。DMSOを用いた系では抑制活性はなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　天然体の11種および５種の誘導体全てに、コントロールと比較して活性が認められた。天然より単離したcyclolinopeptide－AからKの11種については、cyclolinopeptide-Jの抑制活性が最も強く、そのIC50は10 nMであった。cyclolinopeptide-Jの細胞毒性については、IC50の1000倍である10 μMにおいても有意な増殖抑制は認められなかった。
　天然体の11種の中では、cyclolinopeptide-B, D, F, G, H, Iに中程度の抑制活性が認められた。
　以上の結果から、環状ペプチドの作用機序については天然体の中で最も強いcyclolinopeptide－Jについて解析した。
cyclolinopeptide-Jの破骨細胞分化抑制の機序
　RT-PCRにより各種破骨細胞マーカー遺伝子の発現を検討した結果、20 nMのcyclolinopeptide-Jの添加により、RANKLで誘導されるマーカー遺伝子の発現は抑制された。
また、破骨細胞のマスター転写因子であるNFAFc1のタンパク発現をウエスタンブロッティングにより確認した結果、RANKL添加後48時間で認められるNFAFc1の発現が抑制されていた。これらの結果は、cyclolinopeptide-Jの作用がRANKLによる破骨細胞分化シグナルの初期に作用していることが示唆された。
　そこで、NFAFc1を誘導する因子のうち、c-fosの発現とNF-κBのシグナルについて検討した。c-fosの発現はRANKL添加後30分から認められ、24時間においても遺伝子発現の誘導亢進が認められたが、cyclolinopeptide-Jを添加したサンプルでは、検討したすべての時間においてc-fosの発現が抑制された。一方、NF-κB活性化の指標となるIκBのリン酸化と分解は、cyclolinopeptide-Jを添加しても全く影響を受けず、コントロール群と同様の経時変化を示した。したがって、cyclolinopeptide-JはRANKLが活性化する細胞内シグナルのうちc-fosを介したシグナルを選択的に抑制すると考えられる。
　本発明の破骨細胞分化抑制剤により、骨吸収疾患、主に骨粗鬆症や大腿頸部骨折の予防または治療に有用な組成物を提供することが可能となる。また、本発明により、骨吸収関連疾患である関節リウマチ、糖尿病、慢性腎不全などのリン代謝異常における骨量減少や骨強度低下、さらには多発性骨髄腫、悪性リンパ腫、家族性骨ページェット病あるいは歯周病への治療効果が期待される。
　また、本発明の破骨細胞分化抑制剤は、アマ由来の成分であるため、安全性が高く、有用である。

Claims (13)

  1. アマ由来の環状ペプチドを有効成分として含む破骨細胞分化抑制剤。
  2. ８または９アミノ酸からなる環状ペプチドの一種以上を有効成分として含む破骨細胞分化抑制剤。
  3. 有効成分が、
    cyclo (-Pro-Pro-Phe-Phe-Leu-Ile-Ile-Leu-Val-)、
    cyclo (-Pro-Pro-Phe-Phe-Val-Ile-Met-Leu-Ile-)、       
    cyclo (-Pro-Pro-Phe-Phe-Val-Ile-Mso-Leu-Ile-)、
    cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Ile-Mso-Leu-Leu-)、      
    cyclo (-Pro-Leu-Phe-Ile-Mso-Leu-Val-Phe-)、      
    cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Val-Mso-Leu-Mso-)、      
    cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Ile-Mso-Leu-Mso-)、      
    cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Ile-Mso-Leu-Met-)、      
    cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Val-Met-Leu-Mso-)、      
    cyclo (-Pro-Leu-Phe-Ile-Msn-Leu-Val-Phe-)、      
    cyclo (-Pro-Pro-Phe-Phe-Val-Ile-Msn-Leu-Ile-)、       
    cyclo (-Pro-Leu-Phe-Ile-Met-Leu-Val-Phe-)、      
    cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Val-Met-Leu-Met-)、      
    cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Val-Mso-Leu-Met-)、      
    cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Ile-Met-Leu-Met-)、および
    cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Ile-Met-Leu-Mso-)
    からなる群から選択される環状ペプチドの一種以上である、請求項２記載の破骨細胞分化抑制剤。
  4. 有効成分が
    cyclo-(Pro-Pro-Phe-Phe-Leu-Ile-Ile-Leu-Val)、
    cyclo-(Pro-Phe-Phe-Trp-Ile-Mso-Leu-Leu)、
    cyclo-(Pro-Phe-Phe-Trp-Val-Mso-Leu-Mso)、
    cyclo-(Pro-Phe-Phe-Trp-Val-Met-Leu-Mso)、および
    cyclo-(Pro-Leu-Phe-Ile-Msn-Leu-Val-Phe)からなる群から選択される環状ペプチドの一種以上である、請求項３記載の破骨細胞分化抑制剤。
  5. 有効成分がcyclo-(Pro-Leu-Phe-Ile-Msn-Leu-Val-Phe)である、請求項４記載の破骨細胞分化抑制剤。
  6. アマ由来の環状ペプチドを有効成分として含む骨吸収関連疾患の予防または治療剤。
  7. ８または９アミノ酸からなる環状ペプチドの一種以上を有効成分として含む骨吸収関連疾患の予防または治療剤。
  8. 有効成分が、cyclo (-Pro-Pro-Phe-Phe-Leu-Ile-Ile-Leu-Val-)、
    cyclo (-Pro-Pro-Phe-Phe-Val-Ile-Met-Leu-Ile-)、       
    cyclo (-Pro-Pro-Phe-Phe-Val-Ile-Mso-Leu-Ile-)、
    cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Ile-Mso-Leu-Leu-)、      
    cyclo (-Pro-Leu-Phe-Ile-Mso-Leu-Val-Phe-)、      
    cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Val-Mso-Leu-Mso-)、      
    cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Ile-Mso-Leu-Mso-)、      
    cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Ile-Mso-Leu-Met-)、      
    cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Val-Met-Leu-Mso-)、      
    cyclo (-Pro-Leu-Phe-Ile-Msn-Leu-Val-Phe-)、      
    cyclo (-Pro-Pro-Phe-Phe-Val-Ile-Msn-Leu-Ile-)、       
    cyclo (-Pro-Leu-Phe-Ile-Met-Leu-Val-Phe-)、      
    cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Val-Met-Leu-Met-)、      
    cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Val-Mso-Leu-Met-)、      
    cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Ile-Met-Leu-Met-)、および
    cyclo (-Pro-Phe-Phe-Trp-Ile-Met-Leu-Mso-)
    からなる群から選択される環状ペプチドの一種以上である、請求項７記載の骨吸収関連疾患の予防または治療剤。
  9. 有効成分が
    cyclo-(Pro-Pro-Phe-Phe-Leu-Ile-Ile-Leu-Val)、
    cyclo-(Pro-Phe-Phe-Trp-Ile-Mso-Leu-Leu)、
    cyclo-(Pro-Phe-Phe-Trp-Val-Mso-Leu-Mso)、
    cyclo-(Pro-Phe-Phe-Trp-Val-Met-Leu-Mso)、および
    cyclo-(Pro-Leu-Phe-Ile-Msn-Leu-Val-Phe)からなる群から選択される環状ペプチドの一種以上である、請求項８記載の骨吸収関連疾患の予防または治療剤。
  10. 有効成分がcyclo-(Pro-Leu-Phe-Ile-Msn-Leu-Val-Phe)である、請求項９記載の骨吸収関連疾患の予防または治療剤。
  11. 骨吸収関連疾患が骨粗鬆症である、請求項６～１０のいずれか一項記載の骨吸収関連疾患の予防または治療剤。
  12. 飲食料の形態である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の剤。
  13. 医薬組成物の形態である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の剤。
    　　
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