WO2015072507A1 - ポリユビキチン化基質の同定方法 - Google Patents

ポリユビキチン化基質の同定方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2015072507A1
WO2015072507A1 PCT/JP2014/080053 JP2014080053W WO2015072507A1 WO 2015072507 A1 WO2015072507 A1 WO 2015072507A1 JP 2014080053 W JP2014080053 W JP 2014080053W WO 2015072507 A1 WO2015072507 A1 WO 2015072507A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
identifying
cell
trypsin
ubiquitin
polyubiquitinated
Prior art date
Application number
PCT/JP2014/080053
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
雪子 吉田
泰 佐伯
土屋　光
有沙 村上
啓二 田中
Original Assignee
公益財団法人東京都医学総合研究所
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 公益財団法人東京都医学総合研究所 filed Critical 公益財団法人東京都医学総合研究所
Priority to EP14863005.6A priority Critical patent/EP3070176B1/en
Priority to US15/035,357 priority patent/US10634684B2/en
Priority to JP2015547782A priority patent/JP6502854B2/ja
Publication of WO2015072507A1 publication Critical patent/WO2015072507A1/ja

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6842—Proteomic analysis of subsets of protein mixtures with reduced complexity, e.g. membrane proteins, phosphoproteins, organelle proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/25—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving enzymes not classifiable in groups C12Q1/26 - C12Q1/66
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/527—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving lyase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6818—Sequencing of polypeptides
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2440/00—Post-translational modifications [PTMs] in chemical analysis of biological material
    • G01N2440/36—Post-translational modifications [PTMs] in chemical analysis of biological material addition of addition of other proteins or peptides, e.g. SUMOylation, ubiquitination

Definitions

  • the present invention relates to a method for efficiently identifying a polyubiquitinated substrate.
  • Ubiquitin is a protein consisting of 76 amino acids present in all eukaryotes.
  • E1 ubiquitin activating enzyme
  • E2 ubiquitin conjugating enzyme
  • E3 ubiquitin ligase
  • the glycine residue at the C-terminal of ubiquitin is mainly isolated to the lysine residue of the substrate protein. Peptide bond.
  • a polyubiquitin chain in which ubiquitin is further linked to ubiquitin is formed and functions as various post-translational modifiers (see, for example, Non-Patent Document 1 or 2).
  • ubiquitin-proteasome system The most well known example of the in vivo function of a polyubiquitin chain is a selective degradation system “ubiquitin-proteasome system” using a proteasome with the polyubiquitin chain as a landmark. What is important in this system is the selectivity of the substrate as to which protein is decomposed at which timing. Ubiquitin ligase is responsible for this selectivity.
  • approaches to identify ubiquitinated proteins include (1) a method of overexpressing epitope-tagged ubiquitin in cultured cells and performing a comprehensive analysis by mass spectrometry of the protein immunoprecipitated with the tag antibody, (2) ubiquitin Methods such as a method of expressing a mutant ubiquitin ligase having no ligase activity and exhaustively analyzing binding proteins have been used.
  • the ubiquitinated proteins identified were very limited. This is presumably because there is a problem with overexpression of ubiquitin.
  • many binding proteins that are not substrates are also identified, which is not efficient as a substrate identification method.
  • Tandem ubiquitin binding entities TUBE in which four ubiquitin-associated (UBA) domains are fused has been reported (for example, see Non-Patent Document 3).
  • an anti-diGly antibody has been developed, and is effective in identifying ubiquitinated proteins (for example, see Non-Patent Document 4).
  • a general method for performing proteome analysis there is a method for mass spectrometry of a peptide obtained by trypsin digesting a sample protein. Trypsin cleaves the C-terminal of lysine and arginine, but when trypsin digests a ubiquitinated protein, a sequence (ubiquitin signature) in which two glycine residues (diGly) are isopeptide-linked to a lysine residue that is a ubiquitination site. A unique peptide is produced. An antibody that recognizes this ubiquitin signature is an anti-diGly antibody.
  • polyubiquitinated proteins are rapidly degraded by the proteasome, so that it is generally difficult to identify polyubiquitinated proteins.
  • polyubiquitin chain is quickly removed by the deubiquitinase (deubiquitination reaction), it is difficult to isolate by immunoprecipitation even if it is not proteolytically decomposed. For these reasons, it has been difficult to identify ubiquitinated substrates by conventional methods.
  • An object of the present invention is to provide a method for efficiently identifying a polyubiquitinated substrate that is generally difficult to identify.
  • the present inventors expressed a trypsin-resistant polyubiquitin chain binding protein (trypsin-resistant polyubiquitin chain probe) in the cell, thereby allowing the polyubiquitination state of the substrate protein.
  • trypsin-resistant polyubiquitin chain probe trypsin-resistant polyubiquitin chain binding protein
  • by co-expressing a trypsin-resistant polyubiquitin chain probe and ubiquitin ligase in the cell it was found that the substrate that is polyubiquitinated by the ubiquitin ligase can be efficiently separated and identified from the cell.
  • the present invention has been completed.
  • the method for identifying a polyubiquitinated substrate according to the present invention is the following [1] to [8].
  • a method for identifying a polyubiquitination substrate comprising: identifying a peptide containing a ubiquitination site from the digested product.
  • the trypsin resistant polyubiquitin chain binding protein has a tag portion in addition to the binding site with the polyubiquitin chain.
  • the complex is converted into the trypsin resistant polyubiquitin chain.
  • step (4) is a step of selectively separating and recovering a peptide containing a ubiquitination site from the digest obtained in the digestion step and then identifying it.
  • the identification method of the polyubiquitination substrate in any one of.
  • [8] The method for identifying a polyubiquitination substrate according to [7] above, wherein a peptide containing a ubiquitination site is selectively separated and recovered using an anti-diGly antibody.
  • polyubiquitination which is generally difficult to be stably separated from the inside of a cell by degradation by a proteasome, etc.
  • the substrate can be stably separated in a state where it is bound to the polyubiquitin chain.
  • FIG. 3 shows the amino acid sequence of Flag-TR-PUBP1 (SEQ ID NO: 1) used in Reference Example 1 and the DNA sequence (SEQ ID NO: 2) encoding it.
  • SEQ ID NO: 1 the whole cell extract of each sample (“WCL” in the figure) and the anti-Flag antibody immunoprecipitate solution (“IP: ⁇ Flag” in the figure) were westernized with an anti-Flag antibody or an anti-ubiquitin antibody. It is a figure which shows the result of having blotted.
  • Example 2 the results of Western blotting with an anti-p53 antibody of an anti-Flag antibody immunoprecipitate solution of a co-expression product of TR-PUBP and MDM2 are shown.
  • Example 1 it is the figure which showed the quantitative analysis result of the peptide containing the diGly sequence of CDT1.
  • Example 1 it is the figure which showed the quantitative analysis result of the peptide containing the diGly sequence of CDKN1B.
  • Example 1 it is the figure which showed the quantitative analysis result of the peptide containing the diGly sequence of CDKN1A.
  • Example 2 it is the figure which showed the quantitative analysis result of the peptide containing the diGly sequence of TARS and EID1.
  • the method for identifying a polyubiquitination substrate according to the present invention is polyubiquitination by a specific ubiquitin ligase (hereinafter sometimes referred to as “target ubiquitin ligase”).
  • target ubiquitin ligase a specific ubiquitin ligase
  • TR-PUBP trypsin resistant polyubiquitin chain probe
  • the polyubiquitinated protein of the target ubiquitin ligase expressed Identified as a polyubiquitinated substrate.
  • the target ubiquitin ligase which is a target for identifying the substrate
  • polyubiquitination of the substrate protein of the ubiquitin ligase is promoted, Since a larger amount of the polyubiquitinated substrate / TR-PUBP complex can be separated and recovered, the polyubiquitinated substrate can be efficiently identified.
  • a substrate that has been polyubiquitinated by the ubiquitin ligase is stably separated from cells or cell extracts expressing the target ubiquitin ligase while maintaining the polyubiquitination state. can do.
  • the identification method according to the present invention includes the following steps (1) to (4): (1) a step of expressing TR-PUBP and ubiquitin ligase in a cell or in a cell extract; (2) separating the complex containing TR-PUBP from the cell or the cell extract after the step (1); (3) Trypsin digesting the complex separated in the step (2); and (4) Identifying a peptide containing a ubiquitination site from the digest obtained in the step (3).
  • a target ubiquitin ligase to be identified is co-expressed in a cell or in a cell extract together with TR-PUBP.
  • the target ubiquitin ligase may be a protein that has been confirmed to have ubiquitin ligase activity, and whether or not it has ubiquitin ligase activity has not been confirmed, but may have ubiquitin ligase activity from the amino acid sequence, etc. It may be an estimated protein.
  • the TR-PUBP used in the present invention may be any protein containing at least one trypsin-resistant ubiquitin binding domain (TR-UBD). TR-UBD is subjected to trypsin digestion while retaining its ubiquitin binding ability. A domain in which basic amino acids such as arginine and lysine are deleted or substituted with other amino acids.
  • TR-PUBP used in the present invention preferably contains 2 or more TR-UBDs, more preferably contains 4 or more TR-UBDs, and more preferably contains 4 to 8 TR-UBDs. When two or more TR-UBDs are included, all TR-UBDs may be of the same type (the same amino acid sequence) or may have a plurality of TR-UBDs.
  • TR-UBD possessed by TR-PUBP is not particularly limited as long as it has a binding ability to ubiquitin.
  • UBA Ubiquitin Associated
  • UIM Ubiquitin Interacting Motif
  • MIU Motif Interacting with Ubiquitin
  • DUIM double-sided ubiquitin-interacting motiv
  • CUE coupled of ubiquitin conjugation to ER degradation
  • NZF Np14zinFinc
  • each TR-UBD may be directly connected, but is preferably connected by a flexible linker.
  • the amino acid sequences of all the linkers may be the same or different from each other.
  • the amino acid sequence of the linker for example, a polyglycine sequence, a polyserine sequence, a sequence in which one or several glycine residues in the polyglycine sequence are substituted with serine, threonine, alanine, proline, valine, glutamic acid, etc.
  • Examples include sequences in which one or several serine residues in the polyserine sequence are substituted with glycine, threonine, alanine, proline, valine, glutamic acid, or the like.
  • the amino acid residue length of the linker may be 2 or more, preferably 5 or more, more preferably 5 to 40, and even more preferably 5 to 20.
  • the TR-PUBP used in the present invention may consist only of a binding site (region consisting of TR-UBD and linker) with a polyubiquitin chain, but preferably further has a tag portion. .
  • the tag portion may be on the N-terminal side of the binding site with the polyubiquitin chain or on the C-terminal side.
  • the binding site between the tag portion and the polyubiquitin chain may be directly linked or may be linked by an appropriate linker.
  • TR-PUBP has a tag portion, a complex of polyubiquitinated substrate and TR-PUBP can be further obtained by using an immune reaction using an antibody or a ligand that specifically binds to the tag portion. It can be easily separated from other components of the cell and recovered.
  • the tag portion can be appropriately selected from tags generally provided on proteins.
  • tags include Flag tags, HA (hemagglutinin) tags, polypeptide tags such as His tags, Myc tags, biotin, glutathione, DNP (dinitrophenol), digoxigenin, digoxin, GST (glutathione-S-transferase), MBP. (Maltose binding protein), avidin, streptavidin, and the like, but are not limited thereto.
  • the cell in which the target ubiquitin ligase and TR-PUBP are co-expressed is a cell in which a ubiquitin capable of synthesizing a polyubiquitin chain is expressed by the target ubiquitin ligase and a unique expression system functions.
  • Prokaryotic cells such as colon_bacillus
  • eukaryotic cells such as yeast, a filamentous fungus, an insect cell, and a mammalian cell
  • it may be a cell collected from a living organism and cultured, or may be an artificially prepared cell such as a cultured cell line.
  • a synthetic system derived from wheat germ, E. coli, rabbit reticulocyte, or insect cell can be used as a cell extract for co-expressing the target ubiquitin ligase and TR-PUBP in step (1).
  • Co-expression of the target ubiquitin ligase and TR-PUBP in the cell or in the cell extract can be performed by introducing an expression vector containing a DNA sequence encoding each protein into the cell.
  • expression vectors plasmid vectors, virus vectors, cosmid vectors, BAC vectors, ⁇ phage vectors, and the like are known.
  • the vector can be appropriately selected from vectors known in the art. Can be used. Further, a known vector may be modified by a gene recombination technique or the like. Incorporation of the DNA sequence encoding each protein into the expression vector can be performed by a conventional method using a known gene recombination technique.
  • the method of introducing an expression vector into a cell can also be appropriately selected from methods known in the art in consideration of the type of expression vector, the type of cell, and the like.
  • examples of the method for introducing a plasmid vector into a cell include an electroporation method, a calcium phosphate method, a liposome method, and a DEAE dextran method.
  • Commercially available vector introduction reagents may also be used.
  • step (2) a complex containing TR-PUBP is separated from the cell or cell extract in which the target ubiquitin ligase and TR-PUBP are co-expressed in step (1).
  • the cell extract obtained by solubilizing the cells or the cell extract after step (1) is applied to a solid phase carrier having a site that specifically binds to TR-PUBP.
  • the solid-liquid separation treatment can be performed to separate the TR-PUBP-containing complex from other cell-derived components in a state of being bound to the solid phase carrier.
  • TR-PUBP When TR-PUBP has the tag part, after adding and incubating to the cell extract a solid phase carrier directly or indirectly bound with an antibody or a ligand that specifically binds to the tag part
  • the solid-liquid separation process can be performed by a centrifugal separation process or the like.
  • the solid phase carrier include magnetic beads, nonmagnetic beads, and membrane filters.
  • the antibody that specifically binds to the tag portion may be any antibody that binds preferentially to the tag portion over binding to another substance having physical or chemical properties similar to the tag portion. It is not necessary for the substance to not bind to any substance other than the tag part.
  • the complex separated in the step (2) is digested with trypsin.
  • the polyubiquitin chain bound to TR-UBD is not degraded by trypsin digestion, the substrate to which the polyubiquitin chain is bound is fragmented.
  • a polypeptide having a ubiquitin signature sequence having diGly at a lysine residue (where ubiquitin was added), which is a ubiquitination site is produced. That is, the ubiquitination site becomes a lysine residue to which diGly is bound by a trypsin digest.
  • a peptide containing a ubiquitination site (lysine residue bound with diGly) is identified from the digest obtained in step (3).
  • the method for identifying the peptide is not particularly limited, and can be appropriately selected from methods generally used for identifying peptide amino acid sequences such as mass spectrometry.
  • peptides that do not contain ubiquitination sites in trypsin digests There are many peptides that do not contain ubiquitination sites in trypsin digests. Therefore, before identifying each peptide by mass spectrometry or other proteome analysis, it is more efficient to selectively separate and recover peptides containing ubiquitination sites from trypsin digests to identify peptides containing ubiquitination sites. can do.
  • the separation and recovery of the peptide containing the ubiquitination site is preferably performed using, for example, an immune reaction using an anti-diGly antibody.
  • FIGS. 1A to 1D show an outline of one aspect of the identification method according to the present invention, including a process of selectively separating and recovering a peptide containing a ubiquitination site from a trypsin digest using an anti-diGly antibody.
  • ubiquitin ligase 2 and Flag-tagged TR-PUBP3 are coexpressed in cell 1 (FIG. 1A, step 1).
  • Substrate 4 is polyubiquitinated by ubiquitin ligase 2. Since the flag-tagged TR-PUBP3 binds to the formed polyubiquitin chain, the polyubiquitin chain is not degraded by deubiquitinase (DUB) 5 or 26S proteasome 6 and is stably present.
  • DRB deubiquitinase
  • the anti-Flag antibody 7 bound to the beads 8 is added to the cell extract prepared by solubilizing the cells, and the ubiquitinated substrate is separated by immunoprecipitation reaction with the anti-Flag antibody (FIG. 1B, step 2). ). Thereafter, trypsin digestion produces peptide 9 containing a ubiquitination site (lysine residue containing diGly) (FIG. 1C, step 3). Using the anti-diGly antibody 11, the peptide 9 containing this ubiquitination site is separated and recovered from the peptide 10 not containing the ubiquitination site (FIG. 1D, step 4). Peptide 9 containing this purified (concentrated) ubiquitination site is identified by LC-MS (liquid chromatography mass spectrometry) (FIG. 1D, step 5).
  • endogenous ubiquitin ligase is also contained in the cell.
  • the peptide containing the ubiquitination site identified in step (4) is large. The portion is derived from the polyubiquitinated substrate of the target ubiquitin ligase.
  • the peptide containing the ubiquitination site identified in step (4) is derived from a polyubiquitination substrate of an endogenous ubiquitin ligase other than the target ubiquitin ligase.
  • the target ubiquitin ligase By expressing a dominant negative mutant of the target ubiquitin ligase, the activity of the endogenous target ubiquitin ligase originally expressed in the cells can be suppressed.
  • the polyubiquitination substrate of the target ubiquitin ligase of the target overexpressed can be more efficiently identified by effectively eliminating the influence of the endogenous ubiquitin ligase corresponding to the target ubiquitin ligase. That is, the polyubiquitination substrate of the target ubiquitin ligase is contained in a protein in which the amount of immunoprecipitation is significantly increased in the wild type expression compared to the dominant negative mutant expression.
  • the polyubiquitinated protein is identified. Separately, a polyubiquitinated protein-TR-PUBP complex was isolated and recovered from cells co-expressed with a dominant negative mutant of the target ubiquitin ligase and TR-PUBP, and then the Identify ubiquitinated proteins. Complexes isolated from cells co-expressing the dominant negative mutant include substrate proteins that are polyubiquitinated by endogenous ubiquitin ligases other than the target ubiquitin ligase.
  • a peptide contained in the polyubiquitination substrate of the target ubiquitin ligase is the polymorph of the target ubiquitin ligase. It is a peptide contained in a ubiquitinated substrate.
  • the following steps (1 ′) to (4 ′) and (5) are performed: (1 ′) Expressing the trypsin resistant polyubiquitin chain binding protein and a dominant negative form of the ubiquitin ligase in a separate cell of the same type as the cell or a cell extract prepared separately from the cell extract The step of causing; (2 ′) separating the complex containing the trypsin-resistant polyubiquitin chain binding protein from the cell or the cell extract after the step (1 ′); (3 ′) a step of digesting the complex separated in the step (2 ′) with trypsin; (4 ′) a step of identifying a peptide containing a ubiquitination site from the digest obtained in the step (3 ′); and (5) the peptide identified in the step (4), and the step A step of judging that the peptide not identified in (4 ′) is a peptide contained in the polyubiquitination substrate.
  • a peptide containing a ubiquitination site was identified by the same method, and the results were compared with the results of the cells that co-expressed the target ubiquitin ligase and TR-PUBP. It can also be compared. Peptides containing ubiquitination sites identified in cells that expressed only TR-PUBP are likely to be peptide fragments of endogenous ubiquitin ligase substrates.
  • a peptide containing a ubiquitination site that was identified from a cell that co-expressed the target ubiquitin ligase and TR-PUBP but was not identified from a cell that expressed only TR-PUBP was overexpressed in the cell. It can be identified as a peptide fragment of the substrate of the target ubiquitin ligase of interest.
  • TR-PUBP is also useful for screening for polyubiquitinated substrates.
  • a polyubiquitinated substrate can be screened from inside the cell.
  • the identification method according to the present invention itself can also be used for screening a polyubiquitinated substrate, and thus for screening a candidate compound for a therapeutic drug for a ubiquitin-related disease.
  • a polyubiquitinated substrate can be identified in the same manner using ubiquitin ligase and TR-PUBP.
  • a cell extract containing ubiquitin, etc., a ubiquitin ligase or dominant negative mutant thereof, and TR-PUBP are added to the reaction solution and incubated to cause polyubiquitination of the substrate.
  • a complex of the formed substrate and TR-PUBP is formed.
  • FIG. 2 The amino acid sequence of the Flag-TR-PUBP1 (SEQ ID NO: 1) and the DNA sequence (SEQ ID NO: 2) encoding it are shown in FIG. In FIG. 2, a region surrounded by a solid line square indicates a TR-UBA domain, and a region surrounded by a two-dot chain line square indicates a Flag tag (DYKDDDDK) (SEQ ID NO: 3).
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 a region consisting of the 18th to 71st amino acid residues, a region consisting of the 80th to 133rd amino acid residues, a region consisting of the 142th to 195th amino acid residues, And the region consisting of amino acid residues 204 to 257 is TR-UBD, the region consisting of amino acid residues 72 to 79, the region consisting of amino acid residues 134 to 141, and the amino acids 196 to 203
  • a region consisting of residues is a linker moiety.
  • the TR-PUBP used in the present invention is preferably TR-PUBP in which two or more UBDs consisting of amino acid residues 18 to 71 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 are linked via a linker. Further, TR-PUBP having a tag linked to the N-terminus or C-terminus directly or via a linker is more preferred.
  • a DNA fragment consisting of a DNA sequence encoding Flag-TR-PUBP1 was inserted into a mammalian cell expression vector pcDNA3 to prepare a Flag-TR-PUBP1 expression vector.
  • Flag-Ub expression vector A DNA fragment consisting of a DNA sequence encoding a protein (Flag-Ub) in which a Flag tag is linked to the N-terminus of the UBA domain of UBQLN1 (NCBI accession number: Q9UMX0) is inserted into a mammalian cell expression vector pcDNA3, and Flag- A Ub expression vector was prepared.
  • HA-Skp2 expression vector A DNA fragment comprising a DNA sequence in which a DNA sequence encoding an HA tag is linked to the N-terminus of a DNA sequence encoding ubiquitin ligase Skp2 (NCBI accession number: Q9Z0Z3) is inserted into a mammalian cell expression vector pcDNA3, and HA- A Skp2 expression vector was prepared.
  • ⁇ Transfection of Flag-TR-PUBP1 expression vector into cultured mammalian cells > 1.3 ⁇ 10 6 293T cells or HeLa cells were cultured in a 10 cm ⁇ dish for 24 hours in a CO 2 incubator at 37 ° C. using Dulbecco's Eagle medium (DMEM) supplemented with 10% by volume fetal bovine serum. 293T cells were prepared by using 3.5 ⁇ g of Flag-TR-PUBP1 expression vector and 3.5 ⁇ g of HA-Skp2 expression vector in 21 ⁇ L of PEI solution [1 mg / mL Polyethyleneimine, linear (manufactured by Polysciences), pH 7.4]. And transfected for 48 hours.
  • DMEM Dulbecco's Eagle medium
  • HeLa cells were transfected with 2.5 ⁇ g of Flag-TR-PUBP1 expression vector and 2.5 ⁇ g of HA-Skp2 expression vector using 30 ⁇ L of Lipofectamine and 21 ⁇ L of plus reagent (Life Technologies), Cultured for 24 hours.
  • a 293T cell or HeLa cell was similarly transfected using an HA-empty vector in which only a DNA fragment consisting of a DNA sequence encoding the HA tag was inserted into pcDNA3. Cultured.
  • the transfection was performed in 3 dishes for each sample, and for 2 of the 3 sheets, the proteasome inhibitor MG132 was added to a final concentration of 20 ⁇ M for the final 4 hours of culture and cultured.
  • the deubiquitinase inhibitor N-ethylmaleimide NEM was added to the WCL prepared from one of the two dishes to which the proteasome inhibitor MG132 was added.
  • the beads to which the immunoprecipitate from the anti-Flag antibody was bound were washed 3 times with 1 mL of TBS-N (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl), and then twice with 1 mL of 50 mM ammonium bicarbonate. . After completely removing the supernatant, 20 ⁇ L of 200 ⁇ g / mL Flag peptide (manufactured by Sigma) was added, and the beads were suspended and allowed to stand for 10 minutes. At this time, it was suspended by tapping every 2 minutes.
  • FIG. 3A shows the results of Western blotting using DDDK antibody or anti-ubiquitin antibody.
  • the left side of FIG. 3A shows the results using the whole cell extract, and the right side of FIG. 3A shows the results using the anti-Flag antibody immunoprecipitate solution.
  • the results of Western blotting using an antibody against Skp2 substrate CDKN1B are shown in FIG. 3B.
  • the left side of FIG. 3B shows the results using the whole cell extract, and the right side of FIG. 3B shows the results using the anti-Flag antibody immunoprecipitate solution.
  • “Ubiquitin” of “Flag-tagged” is the result of cells transfected with a vector for expression of Flag-Ub
  • “TR-PUBP” is transfected with a vector for expression of Flag-TR-PUBP1.
  • “HA-tagged” “empty” indicates the result of the cell transfected with the HA-empty vector
  • “Skp2” indicates the result of the cell transfected with the HA-Skp2 expression vector.
  • “+” indicates the result of the sample to which each reagent is added
  • “ ⁇ ” indicates the result of the sample to which no reagent is added.
  • the antibody name below the blot indicates the antibody used for Western blotting
  • “(Ub) n-CDKN1B” indicates a band of polyubiquitinated CDKN1B.
  • polyubiquitinated CDKN1B was hardly detected in the immunoprecipitates obtained by overexpressing ubiquitin (lanes 1 to 6 in the right panel of FIG. 3B).
  • the immunoprecipitates of Flag-TR-PUBP1 even when Skp2 is not overexpressed (HA-tagged is empty), there is no inhibitor (both MG132 and NEM are “-”).
  • the expressed Flag-TR-PUBP1 binds to CDKN1B that has been ubiquitinated by the endogenous Skp2 and inhibits degradation and deubiquitination.
  • TR-PUBP can efficiently accumulate polyubiquitinated proteins in cells. For this reason, ubiquitinated proteins by endogenous ubiquitin ligase are also concentrated in the immunoprecipitate of Flag-TR-PUBP1 (FIG. 3B). When ubiquitin ligase was co-expressed, the substrate protein was more strongly polyubiquitinated. Therefore, conversely, it was analyzed whether polyubiquitination of the substrate can be suppressed by expressing a dominant negative mutant of ubiquitin ligase.
  • HA-Skp2 ⁇ F expression vector The DNA sequence encoding the HA tag was linked to the N-terminus of the DNA sequence encoding the dominant negative mutant Skp2 ⁇ F (SEQ ID NO: 4) from which the ubiquitin ligase active region of the ubiquitin ligase Skp2 (NCBI accession number: NM — 013787) was deleted. A DNA fragment comprising the DNA sequence was inserted into a mammalian cell expression vector pcDNA3 to prepare a HA-Skp2 ⁇ F expression vector.
  • HA-Fbw7 expression vector and HA-Fbw1 expression vector A DNA fragment comprising a DNA sequence in which a DNA sequence encoding an HA tag is linked to the N-terminus of a DNA sequence encoding ubiquitin ligase Fbw7 (NCBI accession number: NM — 033632) or ubiquitin ligase Fbw1 (NCBI accession number: NM — 033637)
  • ubiquitin ligase Fbw7 NCBI accession number: NM — 033632
  • ubiquitin ligase Fbw1 NCBI accession number: NM — 033637
  • HA-Fbw7 ⁇ F expression vector and HA-Fbw1 ⁇ F expression vector Dominant negative mutant Fbw7 ⁇ F (SEQ ID NO: 5), mutant Fbw1 ⁇ F (SEQ ID NO: 5) lacking the ubiquitin ligase active region of ubiquitin ligase Fbw7 (NCBI accession number: Q969H0) or ubiquitin ligase Fbw1 (NCBI accession number: NM — 033637)
  • a DNA fragment comprising a DNA sequence in which a DNA sequence encoding an HA tag is linked to the N-terminus of the DNA sequence encoding No. 11) is inserted into an expression vector pcDNA3 for mammalian cells, and HA-Fbw7 ⁇ F expression vector and HA-Fbw1 ⁇ F, respectively.
  • An expression vector was prepared.
  • HA-MDM2 expression vector A DNA fragment comprising a DNA sequence in which a DNA sequence encoding an HA tag is linked to the N-terminus of a DNA sequence encoding ubiquitin ligase (NCBI accession number: XM — 0052688872) is inserted into mammalian cell expression vector pcDNA3, and HA-MDM2 An expression vector was prepared.
  • an immunoprecipitate of Flag-TR-PUBP1 was obtained using a DDDK antibody, and the immunoprecipitate was electrophoresed to obtain an anti-CDKN1B antibody, an anti-CDT1 antibody, an anti-CDK2 antibody, an anti-HA.
  • Western blotting was performed using an antibody, anti-cMyc antibody, anti-NFKBIA antibody, anti-PDCD4 antibody, or anti-p53 antibody. (Experiment using anti-NFKBIA antibody, anti-PDCD4 antibody, and anti-p53 antibody uses only 293T cells. Experiment).
  • Anti-CDT1 antibody, anti-CDK2 antibody, anti-cMyc antibody, anti-NFKBIA antibody, anti-PDCD4 antibody, and anti-p53 antibody are all antibodies against a substrate of ubiquitin ligase. These results are shown in FIGS. 4A to 4E. In these figures, “empty” of “HA-tagged” indicates the result of the cell transfected with the HA-empty vector, “Skp2” indicates the result of the cell transfected with the HA-Skp2 expression vector, “ ⁇ F”.
  • polyubiquitinated CDKN1B was detected in the immunoprecipitates of cells expressing only Flag-TR-PUBP1 even when the proteasome inhibitor (MG132) was not treated (first lane in FIG. 4A). ).
  • the amount of polyubiquitinated CDKN1B in the immunoprecipitates of cells co-expressed with HA-Skp2 and Flag-TR-PUBP1 significantly increased.
  • polyubiquitinated CDKN1B was hardly detected in cells co-expressed with a dominant negative body (“ ⁇ F” in the figure). Similar results were obtained with CDT1 (NCBI accession number: Q9H211), another known substrate for Skp2.
  • CDK2 (NCBI accession number: P24941) is a kinase protein known to bind directly to CDKN1B and Skp2. This protein behaved similarly to CDKN1B, but was detected as a single band and was not detected in a polyubiquitinated state. Thus, it was found that the immunoprecipitate contained not only polyubiquitinated but also complexed with it.
  • c-Myc NCBI accession number: NM_002467
  • NFKBIA NCBI accession number: NM_020529
  • PDCD4 NCBI's
  • Fbw7, Fbw1, and MDM2 ubiquitin ligases
  • p53 NCBI accession number: NM — 000546
  • c-Myc, NFKBIA, PDCD4, and p53 polyubiquitinated by the expression of Flag-TR-PUBP1 were easily detected (FIGS. 4B to 4E).
  • ubiquitination was detected in response to extracellular stimulation (TNF in FIG. 4C means TNF stimulation, Serum depl. In FIG. 4D means serum starvation).
  • TNF in FIG. 4C means TNF stimulation
  • FIG. 4D serum starvation
  • TR-PUBP1 that can be detected with sensitivity
  • ubiquitination was detectable without extracellular stimulation.
  • ubiquitination of the substrate was easily detected even with a single ubiquitin ligase MDM2 other than the SCF ubiquitin ligase complex. This suggests that the identification method according to the present invention can be applied to various ubiquitin ligases.
  • 293T cells co-expressed Flag-TR-PUBP1 and ubiquitin ligase, and co-expressed flag-TR-PUBP1 and ubiquitin ligase dominant negative mutants
  • the strategy of identifying polyubiquitinated substrates by comparing the proteins contained in each immunoprecipitate was considered convenient and effective.
  • the amino acid sequence of the peptide containing the diGly sequence of CDT1 is IAPPK [di-GlyGly] LAC [methylthio] R (SEQ ID NO: 6), and the amino acid sequence of the peptide containing the diGly sequence of CDKN1B is K [di-GlyGly] RPATDDSSTQNK [Di-GlyGly] R (SEQ ID NO: 7), and the amino acid sequence of the peptide containing CDGN1A diGly sequence was QTSM [Oxid] TDFYHSK [di-GlyGly] R (SEQ ID NO: 8).
  • FIG. 5A shows the quantitative analysis result of the peptide containing the diGly sequence of CDT1
  • FIG. 5B shows the quantitative analysis result of the peptide containing the diGly sequence of CDKN1B
  • FIG. 5C shows the quantitative analysis result of the peptide containing the diGly sequence of CDKN1A.
  • 5A to 5C the right panel quantifies the peak area in the left panel.
  • ⁇ Preparation of Fbxo21 expression vector> A DNA fragment comprising a DNA sequence in which a DNA sequence encoding an HA tag was linked to the N-terminus of the DNA sequence encoding the F-box protein Fbxo21 was inserted into a mammalian cell expression vector pcDNA3 to prepare a HA-Fbxo21 expression vector. .
  • HA-Fbxo21 ⁇ F expression vector A DNA fragment comprising a DNA sequence in which a DNA sequence encoding an HA tag is linked to the N-terminus of a DNA sequence encoding a dominant negative mutant Fbxo21 ⁇ F (SEQ ID NO: 9) from which a region presumed to be a ubiquitin ligase active region of Fbxo21 is deleted was inserted into a mammalian cell expression vector pcDNA3 to prepare a HA-Fbxo21 ⁇ F expression vector.
  • the anti-Flag antibody immunoprecipitate solution of each sample was trypsin-digested, and diGly peptide was purified from the obtained trypsin digest, and purified from this diGly peptide purified product using a C18 column.
  • the peptides were analyzed by mass spectrometry. As a result, several proteins were identified as polyubiquitination substrates.
  • Proteins are identified using the MASCOT search engine with Proteome Discovery software version 1.3 (Thermo Scientific), and the ones whose PSMs (peptide spectra match) values of individual proteins increase with wild type Fbxo21 and decrease with Fbxo21 ⁇ F are selected. It was. TARS (NCBI accession number: NM_152295) and EID1 (NCBI accession number: NM_014335), which were reproducible in three independent experiments, were identified as substrates.
  • FIG. 6 shows the results of quantitative analysis based on PSMs values of peptides containing TARS and EID1 diGly sequences.
  • amino acid sequence of the peptide containing the diGly sequence of TARS is ILNEK [di-GlyGly] VNTPPTTVYR (SEQ ID NO: 10), NSSTYWEKK [di-GlyGly] ADMETLQR (SEQ ID NO: 12), FQEEAK [di-GlyGly] NR (SEQ ID NO: 13) and HTGK [di-GlyGly] IK (SEQ ID NO: 14), and the amino acid sequence of the peptide containing the EID1 diGly sequence is VSAALEEADK [di-GlyGly] M [Oxid] FLR (SEQ ID NO: 15), and SGAQQLEEEGPM [Oxid] EEEEAQPM [Oxid] AAPEGK [di-GlyGly] R (SEQ ID NO: 16).
  • the peptide containing the TARS diGly sequence was less in the overexpression of Fbxo21 ⁇ F than in the case of expressing the empty vector, and increased extremely significantly due to the overexpression of Fbxo21. Since the tendency of the peptide amount ratio containing the diGly sequence of TARS is the same as that of CDT1 or the like when Skp2 is expressed, Fbxo21 is a ubiquitin ligase, and TARS is highly likely to be a polyubiquitinated substrate of Fbxo21. .
  • the peptide containing the EID1 diGly sequence was detected only by overexpression of Fbxo21, and was below the detection limit when an empty vector was expressed or when Fbxo21 ⁇ F was overexpressed. From these results, it is clear that a novel polyubiquitinated substrate can be efficiently identified by the identification method according to the present invention.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)

Abstract

本発明は、一般的に同定が困難なポリユビキチン化基質を、効率よく同定するための方法を提供する。本発明のポリユビキチン化基質の同定方法は、（１）細胞内において、トリプシン耐性ポリユビキチン鎖結合タンパク質とユビキチンリガーゼを発現させる工程と、（２）前記工程（１）後の前記細胞から、前記トリプシン耐性ポリユビキチン鎖結合タンパク質を含有する複合体を分離する工程と、（３）前記工程（２）により分離された複合体を、トリプシン消化する工程と、（４）前記工程（３）により得られた消化物中から、ユビキチン化サイトを含むペプチドを同定する工程と、を有する。

Description

ポリユビキチン化基質の同定方法
　本発明は、ポリユビキチン化基質を効率よく同定するための方法に関する。
　ユビキチンは全ての真核生物に存在する７６アミノ酸からなるタンパク質である。Ｅ１（ユビキチン活性化酵素）／Ｅ２（ユビキチン結合酵素）／Ｅ３（ユビキチンリガーゼ）の３種類の酵素群の働きにより、ユビキチンのＣ末端のグリシン残基が、基質タンパク質の主にリジン残基にイソペプチド結合する。多くの場合、ユビキチンにさらにユビキチンが連結したポリユビキチン鎖が形成され、様々な翻訳後修飾因子として機能する（例えば、非特許文献１又は２参照）。ポリユビキチン鎖の生体内機能として最も良く知られている例としては、ポリユビキチン鎖を目印としたプロテアソームによる選択的分解系「ユビキチンープロテアソームシステム」がある。この系において重要なのは、どのタンパク質をどのタイミングで分解するかという基質の選択性であるが、その選択性を担っているのがユビキチンリガーゼである。
　ヒトの遺伝子には約６００種類のユビキチンリガーゼがコードされているにもかかわらず、基質が判明しているものはごくわずかである。また、基質が判明しているユビキチンリガーゼであっても、新たな基質が見つかる可能性も十分に考えられる。ユビキチンリガーゼの基質を網羅的かつ高感度に探索できる技術の開発は、広範な生命現象の制御に関わるユビキチン化を理解する上でも重要である。
　これまでユビキチン化タンパク質を同定するアプローチとしては、（１）エピトープタグを付けたユビキチンを培養細胞に過剰発現させタグ抗体で免疫沈降したタンパク質を質量分析により網羅的解析を行う方法、（２）ユビキチンリガーゼ活性を持たない変異型ユビキチンリガーゼを発現させ、結合タンパク質の網羅的解析を行う方法、などの方法がとられてきた。前記（１）の方法では、同定されたユビキチン化タンパク質は非常に限られたものであった。これは、ユビキチンの過剰発現に問題があるためと推察される。また、前記（２）の方法では、基質ではない結合タンパク質も多く同定されてしまうため、基質の同定法として効率がよくない。その他、ポリユビキチン鎖に対するアフィニティープローブとして、ユビキチン会合（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ、ＵＢＡ）ドメインが４つ融合したＴａｎｄｅｍ　ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｅｎｔｉｔｉｅｓ（ＴＵＢＥ）が報告されている（例えば、非特許文献３参照）。
　一方で、最近、抗ｄｉＧｌｙ抗体が開発され、ユビキチン化タンパク質の同定に威力を発揮している（例えば、非特許文献４参照）。プロテオーム解析を行う際に一般的な方法としては、サンプルのタンパク質をトリプシン消化したペプチドを質量分析する方法が挙げられる。トリプシンは、リジンとアルギニンのＣ末端を切断するが、ユビキチン化タンパク質をトリプシン消化すると、ユビキチン化サイトであるリジン残基に２つのグリシン残基（ｄｉＧｌｙ）がイソペプチド結合した配列（ユビキチンシグニチャー）をもつユニークなペプチドが生じる。このユビキチンシグニチャーを認識する抗体が抗ｄｉＧｌｙ抗体である。
Komander and Rape，Annual review of biochemistry，2012，vol.81，p.203－229. Grabbe, et al.，Nature reviews. Molecular cell biology，2011，vol.12，p.295－307. Hjerpe，et al.，EMBO reports，2009，vol.10，p.1250－1258. Kim, et al. Molecular Cell，2011，vol.44，p.325－340. Frescas and Pagano，Nature Reviews Cancer，2008，vol.8，p.438－449.
　生体内において、ポリユビキチン化されたタンパク質は、プロテアソームにより速やかに分解されるため、一般的にポリユビキチン化蛋白質の同定は困難である。また、ポリユビキチン鎖は脱ユビキチン化酵素により速やかに取り除かれてしまうため（脱ユビキチン化反応）、たとえタンパク質分解を受けないとしても、免疫沈降などでは単離しにくい。これらの理由により、従来の方法では、ユビキチン化基質の同定は困難であった。
　本発明は、一般的に同定が困難なポリユビキチン化基質を、効率よく同定するための方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、トリプシン抵抗性ポリユビキチン鎖結合タンパク質（トリプシン抵抗性ポリユビキチン鎖プローブ）を細胞内に発現させることにより、基質タンパク質のポリユビキチン化状態を安定化させることが可能であることを見出した。さらに、トリプシン抵抗性ポリユビキチン鎖プローブとユビキチンリガーゼを細胞内に共発現させることにより、当該ユビキチンリガーゼによりポリユビキチン化される基質を、当該細胞内から効率よく分離して同定可能であることを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明に係るポリユビキチン化基質の同定方法は、下記［１］～［８］である。
［１］（１）細胞内、又は細胞抽出液中において、トリプシン耐性ポリユビキチン鎖結合タンパク質とユビキチンリガーゼを発現させる工程；（２）前記工程（１）後の前記細胞又は前記細胞抽出液から、前記トリプシン耐性ポリユビキチン鎖結合タンパク質を含有する複合体を分離する工程；（３）前記工程（２）により分離された複合体を、トリプシン消化する工程；及び（４）前記工程（３）により得られた消化物中から、ユビキチン化サイトを含むペプチドを同定する工程；を有する、ポリユビキチン化基質の同定方法。
［２］さらに、（１’）前記細胞と同種の別個の細胞内、又は前記細胞抽出液と同種で別個に調製した細胞抽出液において、前記トリプシン耐性ポリユビキチン鎖結合タンパク質；前記ユビキチンリガーゼのドミナントネガティブ体を発現させる工程；（２’）前記工程（１’）後の前記細胞又は前記細胞抽出液から、前記トリプシン耐性ポリユビキチン鎖結合タンパク質を含有する複合体を分離する工程；（３’）前記工程（２’）により分離された複合体を、トリプシン消化する工程；（４’）前記工程（３’）により得られた消化物中から、ユビキチン化サイトを含むペプチドを同定する工程；及び（５）前記工程（４）において同定されたペプチドであり、かつ前記工程（４’）において同定されなかったペプチドを、ポリユビキチン化基質に含まれるペプチドであると判断する工程；を有する、前記［１］のポリユビキチン化基質の同定方法。
［３］前記トリプシン耐性ポリユビキチン鎖結合タンパク質が、リンカーにより連結されている２以上のユビキチン結合ドメインを含む、前記［１］又は［２］のポリユビキチン化基質の同定方法。
［４］前記トリプシン耐性ポリユビキチン鎖結合タンパク質が、４～８のユビキチン結合ドメインを含む、前記［３］のポリユビキチン化基質の同定方法。
［５］前記ユビキチン結合ドメインが、配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち、１８～７１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる、前記［３］又は［４］のポリユビキチン化基質の同定方法。
［６］前記トリプシン耐性ポリユビキチン鎖結合タンパク質が、ポリユビキチン鎖との結合部位に加えて、タグ部分を有しており、前記工程（２）において、前記複合体を、前記トリプシン耐性ポリユビキチン鎖結合タンパク質中の前記タグ部分と特異的に結合する抗体又はリガンドを用いた免疫反応を利用して分離する、前記［１］～［５］のいずれかのポリユビキチン化基質の同定方法。
［７］前記工程（４）が、前記消化工程により得られた消化物中から、ユビキチン化サイトを含むペプチドを選択的に分離回収した後、同定する工程である、前記［１］～［６］のいずれかのポリユビキチン化基質の同定方法。
［８］抗ｄｉＧｌｙ抗体を用いて、ユビキチン化サイトを含むペプチドを選択的に分離回収する、前記［７］のポリユビキチン化基質の同定方法。
　本発明に係るポリユビキチン化基質の同定方法においては、トリプシン抵抗性ポリユビキチン鎖プローブを用いることにより、プロテアソームによる分解等によって一般的には細胞内から安定して分離することが困難なポリユビキチン化基質を、ポリユビキチン鎖と結合した状態で安定して分離することができる。この安定して分離したポリユビキチン化基質のアミノ酸配列を調べることにより、ポリユビキチン化基質を従来法よりもはるかに効率的に同定することができる。
ユビキチンリガーゼとトリプシン抵抗性ポリユビキチン鎖プローブとを細胞内で共発現させたときに、ポリユビキチン化蛋白質が、トリプシン抵抗性ポリユビキチン鎖プローブ（ＴＲ-ＰＵＢＰ）により保護されて、脱ユビキチン酵素（ＤＵＢ）及び２６Ｓプロテアソームによる分解から守られる態様を模式的に示した図である。 図１ＡのＴＲ-ＰＵＢＰが結合したポリユビキチン化蛋白質を、抗ＦＬＡＧ抗体による免疫沈降によって分離する態様を模式的に示す図である。 図１Ｂの免疫沈降によって分離したポリユビキチン化蛋白質をトリプシン消化にかけた状態を示す模式図である。 図１Ｃでトリプシン消化にかけたポリユビキチン化蛋白質消化物から、ＬＣ-ＭＳにより、ユビキチン化サイトを含むペプチドを選択的に分離回収する工程を模式的に示した図である。 参考例１で用いたＦｌａｇ－ＴＲ－ＰＵＢＰ１のアミノ酸配列（配列番号１）及びこれをコードするＤＮＡ配列（配列番号２）を示した図である。 参考例１において、各サンプルの全細胞抽出液（図中、「ＷＣＬ」）及び抗Ｆｌａｇ抗体免疫沈降物溶液（図中、「ＩＰ：αＦｌａｇ」）について、抗Flag抗体、又は抗ユビキチン抗体でウエスタンブロッティングを行った結果を示す図である。 参考例１において、各サンプルの全細胞抽出液（図中、「ＷＣＬ」）及び抗Ｆｌａｇ抗体免疫沈降物溶液（図中、「ＩＰ：αＦｌａｇ」）について、抗ＣＤＫＮ１Ｂ抗体でウエスタンブロッティングを行った結果を示す図である。 参考例２において、ＴＲ-ＰＵＢＰとＳｋｐ２又はそのドミナントネガティブ変異体との共発現物の、抗Ｆｌａｇ抗体免疫沈降物溶液について、抗ＣＤＫＮ１Ｂ抗体、抗ＣＤＴ１抗体、抗ＣＤＫ２抗体、及び抗ＨＡ抗体でウエスタンブロッティングを行った結果を示す。 参考例２において、ＴＲ-ＰＵＢＰとＦｂｗ７又はそのドミナントネガティブ変異体との共発現物の、抗Ｆｌａｇ抗体免疫沈降物溶液について、抗Ｍｙｃ抗体、及び抗ＨＡ抗体でウエスタンブロッティングを行った結果を示す。 参考例２において、ＴＲ-ＰＵＢＰとＦｂｗ1又はそのドミナントネガティブ変異体との共発現物の、抗Ｆｌａｇ抗体免疫沈降物溶液について、抗ＮＦＫＢＩＡ抗体でウエスタンブロッティングを行った結果を示す。 参考例２において、ＴＲ-ＰＵＢＰとＦｂｗ1又はそのドミナントネガティブ変異体との共発現物の、抗Ｆｌａｇ抗体免疫沈降物溶液について、抗ＰＤＣＤ４抗体でウエスタンブロッティングを行った結果を示す。 参考例２において、ＴＲ-ＰＵＢＰとＭＤＭ２との共発現物の、抗Ｆｌａｇ抗体免疫沈降物溶液について、抗ｐ５３抗体でウエスタンブロッティングを行った結果を示す。 実施例１において、ＣＤＴ１のｄｉＧｌｙ配列を含むペプチドの定量解析結果を示した図である。 実施例１において、ＣＤＫＮ１ＢのｄｉＧｌｙ配列を含むペプチドの定量解析結果を示した図である。 実施例１において、ＣＤＫＮ１ＡのｄｉＧｌｙ配列を含むペプチドの定量解析結果を示した図である。 実施例２において、ＴＡＲＳ及びＥＩＤ１のｄｉＧｌｙ配列を含むペプチドの定量解析結果を示した図である。
　本発明に係るポリユビキチン化基質の同定方法（以下、「本発明に係る同定方法」ということがある）は、特定のユビキチンリガーゼ（以下、「標的ユビキチンリガーゼ」ということがある）によりポリユビキチン化される基質を同定する方法であって、細胞内、又は細胞抽出液中において標的ユビキチンリガーゼとトリプシン耐性ポリユビキチン鎖結合タンパク質（トリプシン抵抗性ポリユビキチン鎖プローブ、ＴＲ－ＰＵＢＰ）を共発現させることを特徴とする。両タンパク質を共発現させた細胞又は細胞抽出液から、ポリユビキチン化されたタンパク質とＴＲ－ＰＵＢＰとの複合体を分離回収した後、当該ポリユビキチン化されたタンパク質を、発現させた標的ユビキチンリガーゼのポリユビキチン化基質として同定する。本発明に係る同定方法においては、細胞内又は細胞抽出液中に、基質を同定する対象である標的ユビキチンリガーゼを発現させることにより、当該ユビキチンリガーゼの基質タンパク質のポリユビキチン化が促進される結果、より多量のポリユビキチン化基質／ＴＲ－ＰＵＢＰ複合体を分離回収することができるため、効率よくポリユビキチン化基質を同定できる。また、ＴＲ－ＰＵＢＰも共発現させることにより、標的ユビキチンリガーゼを発現させた細胞又は細胞抽出液から、当該ユビキチンリガーゼによりポリユビキチン化された基質を、ポリユビキチン化状態を保持したまま安定して分離することができる。
　具体的には、本発明に係る同定方法は、下記工程（１）～（４）を有する：
（１）細胞内、又は細胞抽出液中において、ＴＲ－ＰＵＢＰとユビキチンリガーゼを発現させる工程；
（２）前記工程（１）後の前記細胞又は前記細胞抽出液から、前記ＴＲ－ＰＵＢＰを含有する複合体を分離する工程；
（３）前記工程（２）により分離された複合体を、トリプシン消化する工程；及び
（４）前記工程（３）により得られた消化物中から、ユビキチン化サイトを含むペプチドを同定する工程。
　本発明に係る同定方法は、まず、工程（１）において、基質を同定する対象の標的ユビキチンリガーゼを、ＴＲ－ＰＵＢＰと共に細胞内又は細胞抽出液中に共発現させる。標的ユビキチンリガーゼとしては、ユビキチンリガーゼ活性を有することが確認されているタンパク質であってもよく、ユビキチンリガーゼ活性を有するか否かは確認されていないが、アミノ酸配列等からユビキチンリガーゼ活性を有することが推定されるタンパク質であってもよい。
　本発明において用いられるＴＲ－ＰＵＢＰとしては、少なくとも１のトリプシン抵抗性ユビキチン結合ドメイン（ＴＲ－ＵＢＤ）を含有するタンパク質であればよいＴＲ－ＵＢＤは、ユビキチン結合能を保持したまま、トリプシン消化を受けるアルギニンやリジンといった塩基性アミノ酸を欠失又はその他のアミノ酸に置換させたドメインである。本発明において用いられるＴＲ－ＰＵＢＰとしては、２以上のＴＲ－ＵＢＤを含むものが好ましく、４以上のＴＲ－ＵＢＤを含むものがより好ましく、４～８のＴＲ－ＵＢＤを含むものがさらに好ましい。また、２以上のＴＲ－ＵＢＤを有する場合、全てのＴＲ－ＵＢＤが同種（同一のアミノ酸配列）であってもよく、複数のＴＲ－ＵＢＤを有していてもよい。
　ＴＲ－ＰＵＢＰが有するＴＲ－ＵＢＤとしては、ユビキチンとの結合能を有するドメインであれば特に限定されるものではなく、例えば、ＵＢＡ（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）ドメイン、ＵＩＭ（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ　Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ　Ｍｏｔｉｆ）、ＭＩＵ（Ｍｏｔｉｆ　Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ　ｗｉｔｈ　Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）ドメイン、ＤＵＩＭ　（ｄｏｕｂｌｅ－ｓｉｄｅｄ　ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ　ｍｏｔｉｆ）、ＣＵＥ（ｃｏｕｐｌｉｎｇｏｆ　ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ　ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ　ｔｏ　ＥＲ　ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）ドメイン、ＮＺＦ（Ｎｐ１４　ｚｉｎｃ　ｆｉｎｇｅｒ）、Ａ２０　ＺｎＦ（ｚｉｎｃ　ｆｉｎｇｅｒ）、ＵＢＰ　ＺｎＦ（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｚｉｎｃ　ｆｉｎｇｅｒ）、ＵＢＺ（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ　ｚｉｎｃ　ｆｉｎｇｅｒ）、ＵＥＶ（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ　ｅｎｚｙｍｅ　Ｅ２　ｖａｒｉａｎｔ）、ＰＦＵ（ＰＬＡＡ　ｆａｍｉｌｙ　ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ　ｂｉｎｄｉｎｇ）、ＧＬＵＥ（ＧＲＡＭ－ｌｉｋｅ　ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｉｎ　ＥＡＰ４５）、ＧＡＴ（Ｇｏｌｇｉ－ｌｏｃａｌｉｚｅｄ，Ｇａｍｍａ－ｅａｒ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ，Ａｒｆ－ｂｉｎｄｉｎｇ）、Ｊａｂ／ＭＰＮ（Ｊｕｎ　ｋｉｎａｓｅ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｄｏｍａｉｎ　ｂｉｎｄｉｎｇ／Ｍｐｒ１ｐ　ａｎｄ　Ｐａｄ１ｐ　Ｎ－ｔｅｒｍｉｎｉ）、ＵＢＭ　（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｍｏｔｉｆ）、及びＵｂｃ（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ　ｅｎｚｙｍｅ）等のＵＢＤについて、塩基性アミノ酸を欠失若しくは置換したものを用いることができる。
　ＴＲ－ＰＵＢＰが２以上のＴＲ－ＵＢＤを有する場合、各ＴＲ－ＵＢＤは、直接連結されていてもよいが、フレキシブルなリンカーによって連結されているほうが好ましい。また、ＴＲ－ＰＵＢＰが３以上のＴＲ－ＵＢＤを有し、２以上のリンカーを有する場合、全てのリンカーのアミノ酸配列が同一であってもよく、互いに異なっていてもよい。当該リンカーのアミノ酸配列としては、例えば、ポリグリシン配列やポリセリン配列、ポリグリシン配列中の１又は数個のグリシン残基がセリン、スレオニン、アラニン、プロリン、バリン、グルタミン酸等により置換されている配列、ポリセリン配列中の１又は数個のセリン残基がグリシン、スレオニン、アラニン、プロリン、バリン、グルタミン酸等により置換されている配列等が挙げられる。また、当該リンカーのアミノ酸残基長としては、２以上であればよいが、５以上が好ましく、５～４０がより好ましく、５～２０がよりさらに好ましい。
　本発明において用いられるＴＲ－ＰＵＢＰとしては、ポリユビキチン鎖との結合部位（ＴＲ－ＵＢＤ及びリンカーからなる領域）のみからなるものであってもよいが、さらにタグ部分を有していることが好ましい。タグ部分は、ポリユビキチン鎖との結合部位のＮ末端側にあってもよく、Ｃ末端側にあってもよい。タグ部分とポリユビキチン鎖との結合部位は、直接連結していてもよく、適当なリンカーにより連結されていてもよい。ＴＲ－ＰＵＢＰがタグ部分を有している場合、当該タグ部分と特異的に結合する抗体又はリガンドを用いた免疫反応を利用することにより、ポリユビキチン化基質とＴＲ－ＰＵＢＰとの複合体をより簡便に細胞のその他の成分から分離して回収することができる。
　当該タグ部分としては、一般的にタンパク質に設けられるタグの中から、適宜選択して用いることができる。当該タグとしては、例えば、Ｆｌａｇタグ、ＨＡ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）タグ、Ｈｉｓタグ、Ｍｙｃタグ等のポリペプチドタグ、ビオチン、グルタチオン、ＤＮＰ（ｄｉｎｉｔｏｒｏｐｈｅｎｏｌ）、ジゴキシゲニン、ジゴキシン、ＧＳＴ（グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ)、ＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）、アビジン、ストレプトアビジン等が挙げられるが、これらには限定されない。
　工程（１）において、標的ユビキチンリガーゼとＴＲ－ＰＵＢＰを共発現させる細胞としては、当該標的ユビキチンリガーゼによりポリユビキチン鎖が合成され得るユビキチンが発現しており、独自の発現系が機能している細胞であれば特に限定されるものではなく、大腸菌、枯草菌等の原核細胞（細菌）であってもよく、酵母、糸状菌、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞であってもよい。また、生物から採取して培養した細胞であってもよく、培養細胞株等の人工的に調製された細胞であってもよい。また、工程（１）において標的ユビキチンリガーゼとＴＲ－ＰＵＢＰを共発現させる細胞抽出液としては、コムギ胚芽由来、大腸菌由来、ウサギ網状赤血球由来、昆虫細胞由来の合成系等を用いることができる。
　細胞内、細胞抽出液中における標的ユビキチンリガーゼとＴＲ－ＰＵＢＰの共発現は、各タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む発現用ベクターを細胞内へ導入することにより行うことができる。発現用ベクターとしては、プラスミドベクター、ウィルスベクター、コスミドベクター、ＢＡＣベクター、λファージベクター等が知られており、導入する細胞種に応じて、当該技術分野において公知のベクターの中から適宜選択して用いることができる。また、公知のベクターを遺伝子組換え技術等により改変したものであってもよい。発現用ベクターへの各タンパク質をコードするＤＮＡ配列の組み込みは、公知の遺伝子組換え技術を用いて、常法により行うことができる。
　発現用ベクターを細胞内へ導入する方法も、当該技術分野において公知の方法の中から、発現用ベクターの種類や細胞の種類等を考慮して適宜選択して行うことができる。具体的には、プラスミドベクターを細胞に導入する方法としては、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等が挙げられる。また、市販のベクター導入試薬を用いてもよい。
　次いで、工程（２）として、工程（１）において標的ユビキチンリガーゼとＴＲ－ＰＵＢＰを共発現させた細胞又は細胞抽出液から、ＴＲ－ＰＵＢＰを含有する複合体を分離する。具体的には、例えば、当該細胞を可溶化して得られた細胞抽出液、又は工程（１）後の当該細胞抽出液を、ＴＲ－ＰＵＢＰと特異的に結合する部位を有する固相担体に接触させた後、固液分離処理を行うことにより、ＴＲ－ＰＵＢＰを含有する複合体を固相担体と結合させた状態で、その他の細胞由来成分と分離することができる。ＴＲ－ＰＵＢＰが前記タグ部分を有している場合には、当該タグ部分と特異的に結合する抗体又はリガンドが直接若しくは間接的に結合した固相担体を細胞抽出液に添加してインキュベートした後、遠心分離処理等により固液分離処理を行うことができる。当該固相担体としては、磁性ビーズ、非磁性ビーズ、メンブレンフィルター等が挙げられる。なお、タグ部分と特異的に結合する抗体等としては、物理的又は化学的性質が当該タグ部分と類似した他の物質に対する結合よりも、当該タグ部分と優先的に結合するものであればよく、当該タグ部分以外の物質と全く結合しないものである必要はない。
　その後、工程（３）として、前記工程（２）により分離された複合体をトリプシン消化する。トリプシン消化により、ＴＲ－ＵＢＤに結合しているポリユビキチン鎖は分解されないが、ポリユビキチン鎖が結合していた基質は断片化される。これにより、ユビキチン化サイトであるリジン残基（ユビキチンが付加していた場所）にｄｉＧｌｙを有するユビキチンシグニチャー配列を有するポリペプチドが産生される。つまり、ユビキチン化サイトは、トリプシン消化物によりｄｉＧｌｙが結合したリジン残基となる。
　最後に、工程（４）として、工程（３）により得られた消化物中から、ユビキチン化サイト（ｄｉＧｌｙが結合したリジン残基）を含むペプチドを同定する。当該ペプチドの同定方法としては、特に限定されるものではなく、質量分析法等のペプチドのアミノ酸配列を同定する際に一般的に用いられる方法の中から適宜選択して用いることができる。
　トリプシン消化物には、ユビキチン化サイトを含まないペプチドも多数存在している。このため、各ペプチドを質量分析等のプロテオーム解析により同定する前に、トリプシン消化物中からユビキチン化サイトを含むペプチドを選択的に分離回収しておくほうが、効率よくユビキチン化サイトを含むペプチドを同定することができる。ユビキチン化サイトを含むペプチドの分離回収は、例えば、抗ｄｉＧｌｙ抗体を用いた免疫反応を利用して行うことが好ましい。
　図１Ａ～図１Ｄに、本発明に係る同定方法のうち、抗ｄｉＧｌｙ抗体を用いてトリプシン消化物からユビキチン化サイトを含むペプチドを選択的に分離回収する処理を含む一態様の概略を示す。まず、細胞１内に、ユビキチンリガーゼ２とＦｌａｇタグ付ＴＲ－ＰＵＢＰ３を共発現させる（図１Ａ　工程１）。ユビキチンリガーゼ２により基質４がポリユビキチン化する。形成されたポリユビキチン鎖にＦｌａｇタグ付ＴＲ－ＰＵＢＰ３が結合するため、当該ポリユビキチン鎖は脱ユビキチン化酵素（ＤＵＢ）５や２６Ｓプロテアソーム６による分解を受けず、安定して存在する。次いで、当該細胞を可溶化して調製された細胞抽出液に、ビーズ８と結合した抗Ｆｌａｇ抗体７を添加し、抗Ｆｌａｇ抗体による免疫沈降反応により、ユビキチン化基質を分離する（図１Ｂ　工程２）。その後、トリプシン消化を行うことにより、ユビキチン化サイト（ｄｉＧｌｙを含むリジン残基）を含むペプチド９が産生される（図１Ｃ　工程３）。抗ｄｉＧｌｙ抗体１１を用いて、このユビキチン化サイトを含むペプチド９を、ユビキチン化サイトを含まないペプチド１０から分離して回収する（図１Ｄ　工程４）。この精製（濃縮）されたユビキチン化サイトを含むペプチド９を、ＬＣ－ＭＳ（液体クロマトグラフィー質量分析法）により同定する（図１Ｄ　工程５）。
　一般的には、細胞内には内在性のユビキチンリガーゼも含まれている。標的ユビキチンリガーゼとＴＲ－ＰＵＢＰを共発現させた細胞において、内在性のユビキチンリガーゼの活性が、標的ユビキチンリガーゼに比べて極めて小さい場合、工程（４）において同定されたユビキチン化サイトを含むペプチドの大部分は、標的ユビキチンリガーゼのポリユビキチン化基質由来のものである。一方で、内在性のユビキチンリガーゼが充分な活性を示す場合、工程（４）において同定されたユビキチン化サイトを含むペプチドには、標的ユビキチンリガーゼ以外の、内在性のユビキチンリガーゼのポリユビキチン化基質由来のものも含まれている。標的ユビキチンリガーゼのドミナントネガティブ変異体を発現させることにより、細胞に元々発現している内在性の標的ユビキチンリガーゼの活性を抑えることができる。この原理を利用して、野生型標的ユビキチンリガーゼとＴＲ－ＰＵＢＰを共発現させた場合と、当該標的ユビキチンリガーゼのドミナントネガティブ変異体とＴＲ－ＰＵＢＰを共発現させた場合とを比較することにより、当該標的ユビキチンリガーゼに対応した、内在性のユビキチンリガーゼによる影響を効果的に排除して、過剰発現させた対象の標的ユビキチンリガーゼのポリユビキチン化基質をさらに効率よく同定することができる。すなわち、ドミナントネガティブ変異体発現時に比べて野生型発現時のほうが有意に免疫沈降される量が増加するタンパク質中に、当該標的ユビキチンリガーゼのポリユビキチン化基質が含まれる。
　標的ユビキチンリガーゼとＴＲ－ＰＵＢＰを共発現させた細胞から、ポリユビキチン化されたタンパク質とＴＲ－ＰＵＢＰとの複合体を分離回収した後、当該ポリユビキチン化されたタンパク質を同定する。また、これとは別個に、標的ユビキチンリガーゼのドミナントネガティブ変異体とＴＲ－ＰＵＢＰを共発現させた細胞から、ポリユビキチン化されたタンパク質とＴＲ－ＰＵＢＰとの複合体を分離回収した後、当該ポリユビキチン化されたタンパク質を同定する。該ドミナントネガティブ変異体を共発現させた細胞から分離された複合体には、該標的ユビキチンリガーゼ以外の内在性のユビキチンリガーゼによりポリユビキチン化される基質タンパク質が含まれる。このため、標的ユビキチンリガーゼを発現させた細胞から回収した複合体から同定されたペプチドのうち、該標的ユビキチンリガーゼのドミナントネガティブ体を発現させた細胞から回収した複合体からは同定されなかったペプチドが、該標的ユビキチンリガーゼのポリユビキチン化基質に含まれるペプチドである。すなわち、標的ユビキチンリガーゼを共発現させた細胞から同定されたペプチド群から、該ドミナントネガティブ変異体を共発現させた細胞から同定されたペプチド群を除いた残りのペプチドが、該標的ユビキチンリガーゼのポリユビキチン化基質に含まれるペプチドである。
　具体的には、前記工程（１）～（４）に加えてさらに、下記工程（１’）～（４’）、及び（５）を行う：
（１’）前記細胞と同種の別個の細胞内、又は前記細胞抽出液と同種で別個に調製した細胞抽出液において、前記トリプシン耐性ポリユビキチン鎖結合タンパク質と、前記ユビキチンリガーゼのドミナントネガティブ体を発現させる工程；
（２’）前記工程（１’）後の前記細胞又は前記細胞抽出液から、前記トリプシン耐性ポリユビキチン鎖結合タンパク質を含有する複合体を分離する工程；
（３’）前記工程（２’）により分離された複合体を、トリプシン消化する工程；
（４’）前記工程（３’）により得られた消化物中から、ユビキチン化サイトを含むペプチドを同定する工程；及び
（５）前記工程（４）において同定されたペプチドであり、かつ前記工程（４’）において同定されなかったペプチドを、ポリユビキチン化基質に含まれるペプチドであると判断する工程。
　標的ユビキチンリガーゼを発現させず、ＴＲ－ＰＵＢＰのみを発現させた細胞についても同様の手法によりユビキチン化サイトを含むペプチドを同定し、結果を標的ユビキチンリガーゼとＴＲ－ＰＵＢＰを共発現した細胞の結果と比較することもできる。ＴＲ－ＰＵＢＰのみを発現させた細胞において同定されたユビキチン化サイトを含むペプチドは、内在性のユビキチンリガーゼの基質のペプチド断片である可能性が高い。そこで、標的ユビキチンリガーゼとＴＲ－ＰＵＢＰを共発現した細胞からは同定されたが、ＴＲ－ＰＵＢＰのみを発現させた細胞からは同定されなかったユビキチン化サイトを含むペプチドを、当該細胞に過剰発現させた対象の標的ユビキチンリガーゼの基質のペプチド断片であると同定することができる。
　また、前記で述べたように、ＴＲ－ＰＵＢＰと複合体を形成させることにより、ポリユビキチン化基質を、ポリユビキチン化状態を保持したまま安定して分離・回収することができる。このため、ＴＲ－ＰＵＢＰは、ポリユビキチン化基質のスクリーニングにも有用である。例えば、本発明に係る同定方法のうち、前記工程（１）及び（２）を行うことによって、細胞内からポリユビキチン化基質をスクリーニングすることができる。また、本発明に係る同定方法自体を、ポリユビキチン化基質のスクリーニングに、ひいてはユビキチン関連疾患の治療薬の候補化合物のスクリーニングに用いることもできる。
　なお、前記工程（１）及び（１’）をin vitroの系において行った場合でも、ユビキチンリガーゼとＴＲ－ＰＵＢＰを用いて同様にしてポリユビキチン化基質を同定することができる。例えば、反応溶液中に、ユビキチン等を含む細胞抽出液と、ユビキチンリガーゼ又はそのドミナントネガティブ変異体と、ＴＲ－ＰＵＢＰとを添加してインキュベートすることにより、基質のポリユビキチン化をさせ、ポリユビキチン化された基質とＴＲ－ＰＵＢＰの複合体を形成させる。該複合体を含む反応溶液に対して前記工程（２）～（４）、又は、前記工程（２）～（４）及び前記工程（２’）～（４’）を行うことにより、該ユビキチンリガーゼのポリユビキチン化基質を同定することができる。
　次に実施例及び参考例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例等に限定されるものではない。
［参考例１］
＜Ｆｌａｇ－ＴＲ－ＰＵＢＰ１発現ベクターの作製＞
　ＵＢＱＬＮ１（ＮＣＢＩのアクセッション番号：Ｑ９ＵＭＸ０）のＵＢＡドメインには３つのアルギニン残基が存在し、トリプシンによる消化を受ける。そこで、当該ＵＢＡドメインのアルギニン残基を全てアラニン残基に置換した変異ＵＢＡドメインを、トリプシン耐性ＵＢＡ（ＴＲ－ＵＢＡ）ドメイン（ＴＲ-ＵＢＤ）として設計した。当該ＴＲ－ＵＢＡドメイン４つを互いに７アミノ酸からなるフレキシブルリンカー配列（Ｎ－ＧＧＧＳＧＧＧ－Ｃ）で連結し、さらにそのＮ末端にＦｌａｇタグを連結したタンパク質をＦｌａｇ－ＴＲ－ＰＵＢＰ１とした。当該Ｆｌａｇ－ＴＲ－ＰＵＢＰ１のアミノ酸配列（配列番号１）及びこれをコードするＤＮＡ配列（配列番号２）を図２に示す。図２中、実線四角で囲まれた領域がＴＲ－ＵＢＡドメインを示し、二点鎖線四角で囲まれた領域がＦｌａｇタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）（配列番号３）を示す。
　なお、配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち、１８～７１番目のアミノ酸残基からなる領域、８０～１３３番目のアミノ酸残基からなる領域、１４２～１９５番目のアミノ酸残基からなる領域、及び２０４～２５７番目のアミノ酸残基からなる領域がＴＲ－ＵＢＤであり、７２～７９番目のアミノ酸残基からなる領域、１３４～１４１番目のアミノ酸残基からなる領域、及び１９６～２０３番目のアミノ酸残基からなる領域がリンカー部分である。本発明において用いられるＴＲ－ＰＵＢＰとしては、配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち１８～７１番目のアミノ酸残基からなるＵＢＤが２個以上リンカーを介して連結しているＴＲ－ＰＵＢＰが好ましく、さらにそのＮ末端又はＣ末端に、直接又はリンカーを介してタグが連結されたＴＲ－ＰＵＢＰがより好ましい。
　Ｆｌａｇ－ＴＲ－ＰＵＢＰ１をコードするＤＮＡ配列からなるＤＮＡフラグメントを哺乳類細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３に挿入し、Ｆｌａｇ－ＴＲ－ＰＵＢＰ１発現用ベクターを作製した。
＜Ｆｌａｇ－Ｕｂ発現ベクターの作製＞
　ＵＢＱＬＮ１（ＮＣＢＩのアクセッション番号：Ｑ９ＵＭＸ０）のＵＢＡドメインのＮ末端にＦｌａｇタグを連結したタンパク質（Ｆｌａｇ－Ｕｂ）をコードするＤＮＡ配列からなるＤＮＡフラグメントを哺乳類細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３に挿入し、Ｆｌａｇ－Ｕｂ発現用ベクターを作製した。
＜ＨＡ－Ｓｋｐ２発現ベクターの作製＞
　ユビキチンリガーゼＳｋｐ２（ＮＣＢＩのアクセッション番号：Ｑ９Ｚ０Ｚ３）をコードするＤＮＡ配列のＮ末端にＨＡタグをコードするＤＮＡ配列を連結したＤＮＡ配列からなるＤＮＡフラグメントを哺乳類細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３に挿入し、ＨＡ－Ｓｋｐ２発現用ベクターを作製した。
＜哺乳類培養細胞へのＦｌａｇ－ＴＲ－ＰＵＢＰ１発現用ベクターのトランスフェクション＞
　１０ｃｍφディッシュに１．３ｘ１０６個の２９３Ｔ細胞又はＨｅＬａ細胞を、１０容量％ウシ胎児血清を添加したダルベッコ－イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いて、３７℃のＣＯ２インキュベーター内で２４時間培養した。２９３Ｔ細胞は、３．５μｇのＦｌａｇ－ＴＲ－ＰＵＢＰ１発現用ベクターと３．５μｇのＨＡ－Ｓｋｐ２発現用ベクターを、２１μＬのＰＥＩ溶液〔１ｍｇ／ｍＬ　Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎ、ｌｉｎｅａｒ(Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社製)、ｐＨ７．４〕を用いてトランスフェクションし、４８時間培養した。ＨｅＬａ細胞は、２．５μｇのＦｌａｇ－ＴＲ－ＰＵＢＰ１発現ベクターと２．５μｇのＨＡ－Ｓｋｐ２発現用ベクターを３０μＬのリポフェクトアミン、２１μＬのプラス試薬（ライフテクノロジーズ社製）を用いてトランスフェクションし、２４時間培養した。
　対照として、ＨＡ－Ｓｋｐ２発現用ベクターに代えて、ＨＡタグをコードするＤＮＡ配列からなるＤＮＡフラグメントのみをｐｃＤＮＡ３に挿入したＨＡ－空ベクターを用いて、同様に２９３Ｔ細胞又はＨｅＬａ細胞にトランスフェクションし、培養した。
　なお、トランスフェクションは、各サンプルについて３ディッシュずつ行い、３枚の内の２枚については、プロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２を、培養の最後の４時間に終濃度２０μＭとなるように添加して培養した。
＜哺乳類培養細胞へのＦｌａｇ－Ｕｂ発現用ベクターのトランスフェクション＞
　Ｆｌａｇ－ＴＲ－ＰＵＢＰ１発現用ベクターに代えて、Ｆｌａｇ－Ｕｂ発現用ベクターを用いた以外は、前記と同様にして、２９３Ｔ細胞又はＨｅＬａ細胞にトランスフェクションし、培養した。
＜ポリユビキチン化タンパク質の分離＞
　トランスフェクション後、培養した細胞の培養上清を除去し、セルスクレーパーを用いて細胞を掻き取り、１．５ｍＬ容サンプルチューブに移した後、２，０００ｒｐｍ、３分間の遠心分離処理によって細胞を集め、培地を除去した。培地除去後の細胞に１ｍＬのＰＢＳを加えて細胞を懸濁した後、２，０００ｒｐｍ、３分間の遠心分離処理によって細胞を集めて上清を除去した。回収した細胞に対して、氷冷したタンパク質抽出バッファー（２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．５％ＮＰ－４０、ｃｏｍｐｌｅｔｅ－ＥＤＴＡ　ｆｒｅｅ（Ｒｏｃｈｅ社製））１ｍＬを添加し、ボルテックスミキサーにより激しく撹拌した後、１０分間氷上に置いた。次いで、１５，０００ｒｐｍ、２０分間の遠心分離処理を行い、上清（全細胞抽出液、ＷＣＬ）を新しい１．５ｍＬ容サンプルチューブに回収した。回収した上清の一部をＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動及び銀染色用サンプルとして分取した後、残りに、６μｇのＤＤＤＫ抗体（抗Ｆｌａｇ抗体）（ＦＬＡ－１、ＭＢＬ社製）を結合させたＤｙｎａｂｅａｄｓ－ＰｒｏｔｅｉｎＧ（Ｖｅｒｉｔａｓ社製）を添加し、４℃で３０分間ローテーターを用いて穏やかに混和することにより、Ｆｌａｇタグタンパク質及びこれと結合するタンパク質を免疫沈降させた。
　各サンプルのうち、プロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２を添加した２枚のディッシュのうちの１枚から調製されたＷＣＬには、ＤＤＤＫ抗体と共に脱ユビキチン化酵素阻害剤Ｎ－エチルマレイミド（ＮＥＭ）を添加した。
　その後、抗Ｆｌａｇ抗体による免疫沈降物が結合したビーズを、１ｍＬのＴＢＳ－Ｎ（２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ）で３回、続いて１ｍＬの５０ｍＭ　重炭酸アンモニウムで２回洗浄した。上清を完全に除いた後、２０μＬの２００μｇ／ｍＬ　Ｆｌａｇペプチド（Ｓｉｇｍａ社製）を加え、ビーズを懸濁後１０分間静置した。この際、２分おきにタッピングにより懸濁した。続いて、上清を新しい１．５ｍＬ容サンプルチューブに移した後、同様の溶出操作をさらに２回繰り返し、６０μＬの抗Ｆｌａｇ抗体免疫沈降物溶液を集めた。当該溶液のうちの１０μＬについて、分取しておいたＷＣＬサンプルと共に、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動を行い、銀染色、ＤＤＤＫ抗体又は抗ユビキチン抗体を用いてウエスタンブロッティング、及びＳｋｐ２の基質ＣＤＫＮ１Ｂ（ＮＣＢＩのアクセッション番号：Ｐ４６５２７）に対する抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った。
　ＤＤＤＫ抗体又は抗ユビキチン抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った結果を図３Ａに示す。図３Ａの左側は、全細胞抽出液を使用した結果を、図３Ａの右側は、抗Ｆｌａｇ抗体免疫沈降物溶液を使用した結果を示す。同様に、Ｓｋｐ２の基質ＣＤＫＮ１Ｂに対する抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った結果を図３Ｂに示す。図３Ｂの左側は、全細胞抽出液を使用した結果を、図３Ｂの右側は、抗Ｆｌａｇ抗体免疫沈降物溶液を使用した結果を示す。図３Ａ及び図３Ｂ中、「Ｆｌａｇ－ｔａｇｇｅｄ」の「Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ」はＦｌａｇ－Ｕｂ発現用ベクターをトランスフェクションした細胞の結果を、「ＴＲ－ＰＵＢＰ」はＦｌａｇ－ＴＲ－ＰＵＢＰ１発現用ベクターをトランスフェクションした細胞の結果をそれぞれ示し、「ＨＡ－ｔａｇｇｅｄ」の「ｅｍｐｔｙ」はＨＡ－空ベクターをトランスフェクションした細胞の結果を、「Ｓｋｐ２」はＨＡ－Ｓｋｐ２発現用ベクターをトランスフェクションした細胞の結果をそれぞれ示す。また、「ＭＧ１３２」欄及び「ＮＥＭ」欄については、「＋」が各試薬を添加したサンプルの結果を、「－」は添加しなかったサンプルの結果を示す。さらに、ブロットの下の抗体名は、ウエスタンブロッティングに用いた抗体を示し、「（Ｕｂ）ｎ－ＣＤＫＮ１Ｂ」は、ポリユビキチン化ＣＤＫＮ１Ｂのバンドを示す。
　２９３Ｔ細胞を用いて、Ｆｌａｇ－ｔａｇを付加したユビキチン（Ｆｌａｇ－Ｕｂ）を過剰発現させる従来法と、Ｆｌａｇ－ＴＲ－ＰＵＢＰ１を発現させる方法とについて、細胞内に蓄積するユビキチン化タンパク質の量を比較した（図３Ａ）。プロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２や脱ユビキチン化酵素阻害剤ＮＥＭを添加することにより、細胞内によりポリユビキチン化タンパク質量の増加がみられた（図３Ａの左パネル））。これらのポリユビキチン化タンパク質は、過剰発現させたＦｌａｇ－ＵｂやＦｌａｇ－ＴＲ－ＰＵＢＰ１の免疫沈降により濃縮することができた（図３Ａの右パネル）。
　ユビキチンリガーゼＳｋｐ２がＣＤＫ阻害タンパク質ＣＤＫＮ１Ｂをポリユビキチン化することはよく知られている（例えば、非特許文献５参照）。そこで、本発明に係る同定方法の有効性を検討するため、Ｓｋｐ２：ＣＤＫＮ１Ｂをモデルケースとして以下の解析を行なった。まず、Ｓｋｐ２を共発現させた際に、Ｆｌａｇ－Ｕｂ又はＦｌａｇ－ＴＲ－ＰＵＢＰ１の免疫沈降物の中にポリユビキチン化されたＣＤＫＮ１Ｂが検出されるかどうかを、２９３Ｔ細胞を用いて解析した（図３Ｂの右パネル）。その結果、ユビキチンを過剰発現させて免疫沈降させたものの中には、ポリユビキチン化されたＣＤＫＮ１Ｂはほとんど検出されなかった（図３Ｂの右パネルの１～６番目のレーン）。一方、Ｆｌａｇ－ＴＲ－ＰＵＢＰ１の免疫沈降物の中には、Ｓｋｐ２を過剰発現していない状態でも（ＨＡ-ｔａｇｇｅｄがｅｍｐｔｙのもの）、さらに阻害剤が無い状態（ＭＧ132、ＮＥＭがともに「-」のもの）でもポリユビキチン化したＣＤＫＮ１Ｂが検出された（図３Ｂの右パネルの７番目のレーン）。これは、内在するＳｋｐ２によりユビキチン化を受けたＣＤＫＮ１Ｂに対して、発現しているＦｌａｇ－ＴＲ－ＰＵＢＰ１が結合し、分解や脱ユビキチン化を阻害しているためと考えられる。さらにＳｋｐ２を共発現させた場合には、ポリユビキチン化ＣＤＫＮ１Ｂ量が増加していた（図３Ｂの右パネルの７番目と１０番目のレーン比較）。また、細胞全抽出液（ＷＣＬ）からも、Ｓｋｐ２とＦｌａｇ－ＴＲ－ＰＵＢＰ１を共発現させたものでは、ポリユビキチン化ＣＤＫＮ１Ｂの蓄積がみられた（図３Ｂの左パネルの10番目～13番目）。これらの結果より、Ｆｌａｇ－ＴＲ－ＰＵＢＰ１と様々なユビキチンリガーゼを共発現させることにより、各ユビキチンリガーゼの基質をポリユビキチン化した状態で効率よく蓄積させることが可能なことがわかった。
［参考例２］
　参考例１で示したように、ＴＲ－ＰＵＢＰはポリユビキチン化タンパク質を効率よく細胞内に蓄積させることができる。このため、Ｆｌａｇ－ＴＲ－ＰＵＢＰ１の免疫沈降物の中には内在性のユビキチンリガーゼによるユビキチン化タンパク質も濃縮されてしまう（図３Ｂ）。ユビキチンリガーゼを共発現させた場合には、より強く基質タンパク質のポリユビキチン化は進行した。
　そこで、逆にユビキチンリガーゼのドミナントネガティブ変異体を発現させることにより、基質のポリユビキチン化を抑制できるかを解析した。
＜ＨＡ－Ｓｋｐ２ΔＦ発現ベクターの作製＞
　ユビキチンリガーゼＳｋｐ２（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＮＭ＿０１３７８７）のユビキチンリガーゼ活性領域を欠損させたドミナントネガティブ変異体Ｓｋｐ２ΔＦ（配列番号４）をコードするＤＮＡ配列のＮ末端にＨＡタグをコードするＤＮＡ配列を連結したＤＮＡ配列からなるＤＮＡフラグメントを哺乳類細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３に挿入し、ＨＡ－Ｓｋｐ２ΔＦ発現用ベクターを作製した。
＜ＨＡ－Ｆｂｗ７発現ベクター及びＨＡ-Ｆｂｗ１発現ベクターの作製＞
　ユビキチンリガーゼＦｂｗ７（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＮＭ＿０３３６３２）又はユビキチンリガーゼＦｂｗ１（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＮＭ＿０３３６３７）をコードするＤＮＡ配列のＮ末端にＨＡタグをコードするＤＮＡ配列を連結したＤＮＡ配列からなるＤＮＡフラグメントを哺乳類細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３に挿入し、それぞれＨＡ－Ｆｂｗ７発現用ベクター、ＨＡ-Ｆｂｗ１発現用ベクターを作製した。
＜ＨＡ－Ｆｂｗ７ΔＦ発現ベクター及びＨＡ－Ｆｂｗ１ΔＦ発現ベクターの作製＞
　ユビキチンリガーゼＦｂｗ７（ＮＣＢＩのアクセッション番号：Ｑ９６９Ｈ０）又はユビキチンリガーゼＦｂｗ１（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＮＭ＿０３３６３７）のユビキチンリガーゼ活性領域を欠損させたドミナントネガティブ変異体Ｆｂｗ７ΔＦ（配列番号５）、変異体Ｆｂｗ１ΔF（配列番号１１）をコードするＤＮＡ配列のＮ末端にＨＡタグをコードするＤＮＡ配列を連結したＤＮＡ配列からなるＤＮＡフラグメントを哺乳類細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３に挿入し、それぞれＨＡ－Ｆｂｗ７ΔＦ発現用ベクター、ＨＡ－Ｆｂｗ１ΔＦ発現用ベクターを作製した。
＜ＨＡ-ＭＤＭ２発現ベクターの作製＞
　ユビキチンリガーゼ（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＸＭ＿００５２６８８７２）をコードするＤＮＡ配列のＮ末端にＨＡタグをコードするＤＮＡ配列を連結したＤＮＡ配列からなるＤＮＡフラグメントを哺乳類細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３に挿入し、ＨＡ‐ＭＤＭ２発現用ベクターを作製した。
　参考例１と同様にして、２９３Ｔ細胞、ＨｅＬａ細胞に、Ｆｌａｇ－ＴＲ－ＰＵＢＰ１発現用ベクターと、ＨＡ－空ベクター、ＨＡ－Ｓｋｐ２発現ベクター、ＨＡ－Ｓｋｐ２ΔＦ発現ベクター、ＨＡ－Ｆｂｗ７発現ベクター、ＨＡ－Ｆｂｗ７ΔＦ発現ベクター、ＨＡ－Ｆｂｗ１発現ベクター、ＨＡ－Ｆｂｗ１ΔＦ発現ベクター、又はＨＡ-ＭＤＭ２発現ベクターとを共発現させた。プロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２は、培養の最後の４時間、終濃度２０μＭとなるように添加した。その後、参考例１と同様にして、ＤＤＤＫ抗体を用いてＦｌａｇ－ＴＲ－ＰＵＢＰ１の免疫沈降物を得、この免疫沈降物を電気泳動し、抗ＣＤＫＮ１Ｂ抗体、抗ＣＤＴ１抗体、抗ＣＤＫ２抗体、抗ＨＡ抗体、抗ｃＭｙｃ抗体、抗ＮＦＫＢＩＡ抗体、抗ＰＤＣＤ４抗体、又は抗ｐ５３抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った（抗ＮＦＫＢＩＡ抗体、抗ＰＤＣＤ４抗体、及び抗ｐ５３抗体を使った実験は、２９３Ｔ細胞のみを使った実験とした）。抗ＣＤＴ１抗体、抗ＣＤＫ２抗体、抗ｃＭｙｃ抗体、抗ＮＦＫＢＩＡ抗体、抗ＰＤＣＤ４抗体、及び抗ｐ５３抗体は何れも、ユビキチンリガーゼの基質に対する抗体である。これらの結果を図４Ａ～図４Ｅに示す。これらの図中、「ＨＡ－ｔａｇｇｅｄ」の「ｅｍｐｔｙ」はＨＡ－空ベクターをトランスフェクションした細胞の結果を、「Ｓｋｐ２」はＨＡ－Ｓｋｐ２発現用ベクターをトランスフェクションした細胞の結果を、「ΔＦ」はＨＡ－Ｓｋｐ２ΔＦ発現用ベクター、ＨＡ-Ｆｂｗ７ΔＦ発現用ベクター、又はＨＡ-Ｆｂｗ１ΔＦ発現用ベクターをトランスフェクションした細胞の結果を、「Ｆｂｗ７」はＨＡ-Ｆｂｗ７発現用ベクターをトランスフェクションした細胞の結果を、それぞれ示す。また、「ＭＧ１３２」欄については、「＋」が各試薬を添加したサンプルの結果を、「－」は添加しなかったサンプルの結果を示す。さらに、図４Ａ及び図４Ｂのブロットの左欄の抗体名、及び図４Ｃ～図４Ｅのブロットの下欄の抗体名は、ウエスタンブロッティングに用いた抗体を示す。図４Ｃ～図４Ｅの結果は、２９３Ｔ細胞を用いた実験の結果である。
　２９３Ｔ細胞において、Ｆｌａｇ－ＴＲ－ＰＵＢＰ１単独発現細胞の免疫沈降物の中には、プロテアソーム阻害剤（ＭＧ１３２）未処理時においてもポリユビキチン化されたＣＤＫＮ１Ｂが検出された（図４Ａの１番目のレーン）。一方、ＨＡ－Ｓｋｐ２とＦｌａｇ－ＴＲ－ＰＵＢＰ１の共発現させた細胞の免疫沈降物中のポリユビキチン化ＣＤＫＮ１Ｂの量は著しく増加した。しかし、ドミナントネガティブ体（図中、「ΔＦ」）を共発現させた細胞では、ポリユビキチン化ＣＤＫＮ１Ｂはほぼ検出されなかった。同様の結果は、Ｓｋｐ２のもう一つの既知の基質であるＣＤＴ１(ＮＣＢＩのアクセッション番号：Ｑ９Ｈ２１１)でも得られた。一方で、ＭＧ１３２を添加した場合は、ドミナントネガティブ体（ΔＦ）の発現下でもＣＤＫＮ１ＢやＣＤＴ１が免疫沈降物の中に認められてしまうため、ＭＧ１３２未処理時の方が、ユビキチンリガーゼやその変異体の明確な差がみられるものと考えられた。
　また、ＣＤＫ２（ＮＣＢＩのアクセッション番号：Ｐ２４９４１）は、ＣＤＫＮ１ＢやＳｋｐ２と直接結合することが知られているキナーゼタンパク質である。このタンパク質はＣＤＫＮ１Ｂと同様の挙動を示すが、単一のバンドとして検出され、ポリユビキチン化された状態で検出されなかった。このように、免疫沈降物の中にはポリユビキチン化されたもののみならずそれと複合体を形成するものまで含まれてしまうことがわかった。
　次に、別のユビキチンリガーゼＦｂｗ７、Ｆｂｗ１、ＭＤＭ２について、それぞれの既知の基質である、ｃ－Ｍｙｃ（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＮＭ＿００２４６７）；ＮＦＫＢＩＡ（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＮＭ＿０２０５２９）及びＰＤＣＤ４（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＮＭ＿０１４４５６）；及びｐ５３（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＮＭ＿０００５４６）のポリユビキチン化について、同様の解析を行なった。その結果、Ｆｌａｇ－ＴＲ－ＰＵＢＰ１の発現によりポリユビキチン化された、ｃ－Ｍｙｃ、ＮＦＫＢＩＡ，ＰＤＣＤ４、及びｐ５３が容易に検出された（図４Ｂ～図４Ｅ）。Ｆｂｗ１の基質については細胞外刺激（図４C中のTNFはTNF刺激を、図４D中のSerum depl.は血清飢餓を意味する）に応じてユビキチン化が検出されるものとされていたが、高感度に検出可能なＴＲ‐ＰＵＢＰ１を用いた系においては細胞外刺激なしでもユビキチン化が検出可能であった。また、ＳＣＦ型ユビキチンリガーゼ複合体以外の単独型ユビキチンリガーゼＭＤＭ２でも基質のユビキチン化が容易に検出された。このことは、本発明に係る同定方法が様々なユビキチンリガーゼに応用可能であることを示唆している。
　また、以上より、基質同定のスクリーニング法として、２９３Ｔ細胞にＦｌａｇ－ＴＲ－ＰＵＢＰ１とユビキチンリガーゼを共発現させたものと、Ｆｌａｇ－ＴＲ－ＰＵＢＰ１とユビキチンリガーゼのドミナントネガティブ変異体を共発現させたものについて、各々の免疫沈降物に含まれるタンパク質を比較することにより、ポリユビキチン化基質を同定するというストラテジーが簡便かつ有効と考えられた。
［実施例１］
　これまでの結果を踏まえ、Ｆｌａｇ－ＴＲ－ＰＵＢＰ１を発現させた細胞から抗Ｆｌａｇ抗体を用いて免疫沈降したものをトリプシン分解したものについて、質量分析を行い、ユビキチン化サイトを含むペプチドを同定した。
＜トリプシン消化＞
　参考例１において調製された各サンプルの抗Ｆｌａｇ抗体免疫沈降物溶液のうちの残りの５０μＬに、５μＬの５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（２－ｃａｒｂｏｘｙ－ｅｔｈｙｌ）ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（Ｓｉｇｍａ社製）を添加し、６０℃で３０分間処理した後、２．５μＬの２００　ｍＭ　Ｍｅｔｈｙｌ　Ｍｅｔｈａｎｅｔｈｉｏｓｕｌｐｈｏａｔｅ（和光純薬社製）を添加し、室温で１０分置いた。その後、当該溶液に５０μｇのＴｒｙｐｓｉｎ　Ｇｏｌｄ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し、３７℃で１６時間反応させ、トリプシン消化物を得た。
＜ｄｉＧｌｙペプチドの精製＞
　前記トリプシン消化物に、２０μＬの２５ｘｃｏｍｐｌｅｔｅ－ＥＤＴＡ　ｆｒｅｅと１０２．５μＬの純水を添加した。ＰＴＭＳｃａｎ　Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ　Ｒｅｍｎａｎｔ　Ｍｏｔｉｆ（Ｋ－ε－ＧＧ）ｋｉｔ（Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）に付属の１０ｘＩＡＰ　Ｂｕｆｆｅｒを２０μＬ添加した２００μＬの溶液に、予めＰＢＳで洗浄した１５μＬのＰＴＭＳｃａｎ　Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ　Ｒｅｍｎａｎｔ　Ｍｏｔｉｆ（Ｋ－ε－ＧＧ）　ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｂｅａｄ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（抗ｄｉＧｌｙ抗体結合ビーズ）を添加し、ローテーターを用いて４℃で２時間穏やかに混和した。その後、ビーズを１ｘＩＡＰ　Ｂｕｆｆｅｒで２回洗浄し、続いて純水で３回洗浄した。上清を完全に除いた後、当該ビーズから２０μＬの０．１５％　トリフルオロ酢酸で３回抽出した。
＜質量分析＞
　得られた抽出物（ｄｉＧｌｙペプチド精製物）から、ＺｉｐＴｉｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）やＳｔａｇｅＴｉｐｓ（Ｔｈｅｒｍｏ社製）などのＣ１８カラムを用いて精製したペプチドを質量分析により解析した。質量分析は、質量分析計（ｎａｎｏ－ＬＣ－ＨＲＭＳ：Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｑ－ｅｘａｃｔｉｖｅ）を用いて行った。更に、ＭＡＳＣＯＴサーチエンジンによるProteome Discovere software version 1.3（Thermo Scientific社製）を用いて、ｄｉＧｌｙペプチドを含んでいた、ポリユビキチン化基質蛋白質の同定を行った。２９３Ｔ細胞にＦｌａｇ－ＴＲ－ＰＵＢＰ１とＨＡ－Ｓｋｐ２を発現させた細胞からは、最終的に９３２個の確実性の高いペプチドが同定され、そのうち９０２個がユビキチンシグニチャーであるｄｉＧｌｙを有していた。これらは３３２個のタンパク質に帰属された。このうち、Ｓｋｐ２のドミナントネガティブ体（ΔＦ）を発現させた場合にはみられなかったものは１５個有り、その中には、ＣＤＴ１、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＣＤＫＮ１Ａの３つの既知の基質が含まれており、これらはウエスタンブロッティングでもユビキチン化が確認できた。ＣＤＴ１のｄｉＧｌｙ配列を含むペプチドのアミノ酸配列は、ＩＡＰＰＫ［ｄｉ－ＧｌｙＧｌｙ］ＬＡＣ［ｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏ］Ｒ（配列番号６）であり、ＣＤＫＮ１ＢのｄｉＧｌｙ配列を含むペプチドのアミノ酸配列は、Ｋ［ｄｉ－ＧｌｙＧｌｙ］ＲＰＡＴＤＤＳＳＴＱＮＫ［ｄｉ－ＧｌｙＧｌｙ］Ｒ（配列番号７）であり、ＣＤＫＮ１ＡのｄｉＧｌｙ配列を含むペプチドのアミノ酸配列は、ＱＴＳＭ［Ｏｘｉｄ］ＴＤＦＹＨＳＫ［ｄｉ－ＧｌｙＧｌｙ］Ｒ（配列番号８）であった。
　これらの既知基質の同定されたｄｉＧｌｙ配列を含むペプチドの量比を、ＰｉｎＰｏｉｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて定量解析を行った。図５ＡがＣＤＴ１のｄｉＧｌｙ配列を含むペプチドの定量解析結果を、図５ＢがＣＤＫＮ１ＢのｄｉＧｌｙ配列を含むペプチドの定量解析結果を、図５ＣがＣＤＫＮ１ＡのｄｉＧｌｙ配列を含むペプチドの定量解析結果を、それぞれ示す。また、図５Ａ～図５Ｃにおいて、右パネルは、左パネル中のピーク面積を定量したものである。これら３種の既知基質は、ウエスタンブロッティングの結果を反映し、Ｓｋｐ２の過剰発現により極めて有意に増加していることが分かった。他の候補タンパク質についても、それらに対する抗体を入手しウエスタンブロッティングによりポリユビキチン化を確認することができる。
［実施例２］
　また、Ｓｋｐ２に代えて、機能未知であり、多くの臓器や細胞で発現がみられるＦ－ｂｏｘタンパク質Ｆｂｘｏ２１（ＮＣＢＩのアクセッション番号：Ｏ９４９５２）を用いて、実施例１と同様にして、新たなポリユビキチン化基質の探索を行った。
＜Ｆｂｘｏ２１発現ベクターの作製＞
　Ｆ－ｂｏｘタンパク質Ｆｂｘｏ２１をコードするＤＮＡ配列のＮ末端にＨＡタグをコードするＤＮＡ配列を連結したＤＮＡ配列からなるＤＮＡフラグメントを哺乳類細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３に挿入し、ＨＡ－Ｆｂｘｏ２１発現用ベクターを作製した。
＜ＨＡ－Ｆｂｘｏ２１ΔＦ発現ベクターの作製＞
　Ｆｂｘｏ２１のユビキチンリガーゼ活性領域と推定される領域を欠損させたドミナントネガティブ変異体Ｆｂｘｏ２１ΔＦ（配列番号９）をコードするＤＮＡ配列のＮ末端にＨＡタグをコードするＤＮＡ配列を連結したＤＮＡ配列からなるＤＮＡフラグメントを哺乳類細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３に挿入し、ＨＡ－Ｆｂｘｏ２１ΔＦ発現用ベクターを作製した。
　参考例１と同様にして、２９３Ｔ細胞にＦｌａｇ－ＴＲ－ＰＵＢＰ１発現用ベクターと、ＨＡ－空ベクター、ＨＡ－Ｆｂｘｏ２１発現ベクター、又はＨＡ－Ｆｂｘｏ２１ΔＦ発現ベクターとを共発現させた。プロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２は、培養の最後の４時間、終濃度２０μＭとなるように添加した。その後、参考例１と同様にして、ＤＤＤＫ抗体を用いて抗Ｆｌａｇ抗体免疫沈降物溶液を得た。
　次いで、実施例１と同様にして、各サンプルの抗Ｆｌａｇ抗体免疫沈降物溶液をトリプシン消化し、得られたトリプシン消化物からｄｉＧｌｙペプチドを精製し、このｄｉＧｌｙペプチド精製物からＣ１８カラムを用いて精製したペプチドを質量分析により解析した。その結果、いくつかのタンパク質がポリユビキチン化基質として同定された。
　ＭＡＳＣＯＴサーチエンジンによるProteome Discovere software version 1.3（Thermo Scientific社製）を用いて蛋白質の同定を行い、個々の蛋白質のＰＳＭs（peptide spectrum matches）の値が野生型Fbxo21で増加しＦｂｘｏ２１ΔＦで減少するものを選び出した。３度の独立した実験で再現性があったＴＡＲＳ（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＮＭ＿１５２２９５）、及びＥＩＤ１（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＮＭ＿０１４３３５）を基質として同定した。図６に、ＴＡＲＳ及びＥＩＤ１のｄｉＧｌｙ配列を含むペプチドのＰＳＭｓ値に基づく定量解析結果を示す。なお、ＴＡＲＳのｄｉＧｌｙ配列を含むペプチドのアミノ酸配列は、ＩＬＮＥＫ［ｄｉ－ＧｌｙＧｌｙ］ＶＮＴＰＴＴＴＶＹＲ（配列番号１０）、ＮＳＳＴＹＷＥＧＫ[ｄｉ-ＧｌｙＧｌｙ]ＡＤＭＥＴＬＱＲ（配列番号１２）、ＦＱＥＥＡＫ[ｄｉ-ＧｌｙＧｌｙ]ＮＲ（配列番号１３）、及びＨＴＧＫ[ｄｉ-ＧｌｙＧｌｙ]ＩＫ（配列番号１４）であり、ＥＩＤ１のｄｉＧｌｙ配列を含むペプチドのアミノ酸配列は、ＶＳＡＡＬＥＥＡＤＫ[ｄｉ-ＧｌｙＧｌｙ]Ｍ[Ｏｘｉｄ]ＦＬＲ（配列番号１５）、及びＳＧＡＱＱＬＥＥＥＧＰＭ[Ｏｘｉｄ]ＥＥＥＥＡＱＰＭ[Ｏｘｉｄ]ＡＡＰＥＧＫ[ｄｉ-ＧｌｙＧｌｙ]Ｒ（配列番号１６）であった。ＴＡＲＳのｄｉＧｌｙ配列を含むペプチドは、Ｆｂｘｏ２１ΔＦの過剰発現では空ベクターを発現させた場合よりも少なく、Ｆｂｘｏ２１の過剰発現により極めて有意に増加していることが分かった。ＴＡＲＳのｄｉＧｌｙ配列を含むペプチド量比の傾向は、Ｓｋｐ２を発現させた場合のＣＤＴ１等と同様であることから、Ｆｂｘｏ２１はユビキチンリガーゼであり、ＴＡＲＳがＦｂｘｏ２１のポリユビキチン化基質である可能性が高い。ＥＩＤ１のｄｉＧｌｙ配列を含むペプチドは、Ｆｂｘｏ２１の過剰発現によってのみ検出され、空ベクターを発現させた場合やＦｂｘｏ２１ΔＦの過剰発現させた場合には検出限界以下であった。これらの結果から、本発明に係る同定方法により、新規のポリユビキチン化基質を効率よく同定できることが明らかである。
１…細胞、２…ユビキチンリガーゼ、Ｕｂ…ユビキチン、３…Ｆｌａｇタグ付ＴＲ－ＰＵＢＰ、４…基質、５…ＤＵＢ、６…２６Ｓプロテアソーム、７…抗Ｆｌａｇ抗体、８…ビーズ、９…ユビキチン化サイトを含むペプチド、１０…ユビキチン化サイトを含まないペプチド、１１…抗ｄｉＧｌｙ抗体。

Claims (8)

  1. 　（１）細胞内、又は細胞抽出液中において、トリプシン耐性ポリユビキチン鎖結合タンパク質とユビキチンリガーゼを発現させる工程；
    （２）前記工程（１）後の前記細胞又は前記細胞抽出液から、前記トリプシン耐性ポリユビキチン鎖結合タンパク質を含有する複合体を分離する工程；
    （３）前記工程（２）により分離された複合体を、トリプシン消化する工程；及び
    （４）前記工程（３）により得られた消化物中から、ユビキチン化サイトを含むペプチドを同定する工程；
    を有する、ポリユビキチン化基質の同定方法。
  2. 　さらに、
    （１’）前記細胞と同種の別個の細胞内、又は前記細胞抽出液と同種で別個に調製した細胞抽出液中において、前記トリプシン耐性ポリユビキチン鎖結合タンパク質と、前記ユビキチンリガーゼのドミナントネガティブ体を発現させる工程；
    （２’）前記工程（１’）後の前記細胞又は前記細胞抽出液から、前記トリプシン耐性ポリユビキチン鎖結合タンパク質を含有する複合体を分離する工程；
    （３’）前記工程（２’）により分離された複合体を、トリプシン消化する工程；
    （４’）前記工程（３’）により得られた消化物中から、ユビキチン化サイトを含むペプチドを同定する工程；及び
    （５）前記工程（４）において同定されたペプチドであり、かつ前記工程（４’）において同定されなかったペプチドを、ポリユビキチン化基質に含まれるペプチドであると判断する工程；
    を有する、請求項１に記載のポリユビキチン化基質の同定方法。
  3. 　前記トリプシン耐性ポリユビキチン鎖結合タンパク質が、リンカーにより連結されている２以上のユビキチン結合ドメインを含む、請求項１又は２に記載のポリユビキチン化基質の同定方法。
  4. 　前記トリプシン耐性ポリユビキチン鎖結合タンパク質が、４～８のユビキチン結合ドメインを含む、請求項３に記載のポリユビキチン化基質の同定方法。
  5. 　前記ユビキチン結合ドメインが、配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち、１８～７１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる、請求項３又は４に記載のポリユビキチン化基質の同定方法。
  6. 　前記トリプシン耐性ポリユビキチン鎖結合タンパク質が、ポリユビキチン鎖との結合部位に加えて、タグ部分を有しており、
    　前記工程（２）において、前記複合体を、前記トリプシン耐性ポリユビキチン鎖結合タンパク質中の前記タグ部分と特異的に結合する抗体又はリガンドを用いた免疫反応を利用して分離する、請求項１～５のいずれか一項に記載のポリユビキチン化基質の同定方法。
  7. 　前記工程（４）が、前記消化工程により得られた消化物中から、ユビキチン化サイトを含むペプチドを選択的に分離回収した後、同定する工程である、請求項１～６のいずれか一項に記載のポリユビキチン化基質の同定方法。
  8. 　抗ｄｉＧｌｙ抗体を用いて、ユビキチン化サイトを含むペプチドを選択的に分離回収する、請求項７に記載のポリユビキチン化基質の同定方法。
PCT/JP2014/080053 2013-11-15 2014-11-13 ポリユビキチン化基質の同定方法 WO2015072507A1 (ja)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP14863005.6A EP3070176B1 (en) 2013-11-15 2014-11-13 Method for identifying polyubiquitinated substrate
US15/035,357 US10634684B2 (en) 2013-11-15 2014-11-13 Method for identifying polyubiquitinated substrate
JP2015547782A JP6502854B2 (ja) 2013-11-15 2014-11-13 ポリユビキチン化基質の同定方法

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2013-237362 2013-11-15
JP2013237362 2013-11-15

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2015072507A1 true WO2015072507A1 (ja) 2015-05-21

Family

ID=53057441

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2014/080053 WO2015072507A1 (ja) 2013-11-15 2014-11-13 ポリユビキチン化基質の同定方法

Country Status (4)

Country Link
US (1) US10634684B2 (ja)
EP (1) EP3070176B1 (ja)
JP (1) JP6502854B2 (ja)
WO (1) WO2015072507A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023068278A1 (ja) * 2021-10-18 2023-04-27 国立大学法人北海道大学 標的タンパク質分解誘導剤を介してユビキチン化されるタンパク質の同定方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003102172A1 (en) * 2002-05-31 2003-12-11 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for a ubiquitin map

Non-Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FRESCAS; PAGANO, NATURE REVIEWS CANCER, vol. 8, 2008, pages 438 - 449
GRABBE ET AL., NATURE REVIEWS. MOLECULAR CELL BIOLOGY, vol. 12, 2011, pages 295 - 307
HJERPE ET AL., EMBO REPORTS, vol. 10, 2009, pages 1250 - 1258
HJERPE, R. ET AL.: "Efficient protection and isolation of ubiquitylated proteins using tandem ubiquitin-binding entities", EMBO REPORTS, vol. 10, no. 11, 2009, pages 1250 - 1258, XP055341878 *
KIM ET AL., MOLECULAR CELL, vol. 44, 2011, pages 325 - 340
KIYOTAKA OSHIKAWA ET AL.: "Comprehensive study of protein ubiquitylation sites by conjugation of engineered lysine-less ubiquitin", JOURNAL OF JAPANESE BIOCHEMICAL SOCIETY, vol. 84, no. 6, 2012, pages 479 - 487, XP008183673 *
KOMANDER; RAPE, ANNUAL REVIEW OF BIOCHEMISTRY, vol. 81, 2012, pages 203 - 229
LOPITZ-OTSOA, F. ET AL.: "Integrative analysis of the ubiquitin proteome isolated using Tandem Ubiquitin Binding Entities (TUBEs", J. PROTEOMICS, vol. 75, 2012, pages 2998 - 3014, XP028923452 *
SHI, Y. ET AL.: "A Data Set of Human Endogenous Protein Ubiquitination Sites", MOLECULAR & CELLULAR PROTEOMICS, vol. 10, no. 5, 2011, XP055341879 *
YUKIKO YOSHIDA ET AL.: "Polyubiquitin Ketsugo Tanpakushitsu o Riyo shita Polyubiquitin-ka Kishitsu no Koritsuteki Doteiho no Kakuritsu", ANNUAL MEETING OF THE MOLECULAR BIOLOGY SOCIETY OF JAPAN PROGRAM YOSHISHU, 20 November 2013 (2013-11-20), XP008183998 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023068278A1 (ja) * 2021-10-18 2023-04-27 国立大学法人北海道大学 標的タンパク質分解誘導剤を介してユビキチン化されるタンパク質の同定方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP3070176A4 (en) 2017-05-03
JPWO2015072507A1 (ja) 2017-03-16
EP3070176A1 (en) 2016-09-21
US10634684B2 (en) 2020-04-28
US20180267052A1 (en) 2018-09-20
JP6502854B2 (ja) 2019-04-17
EP3070176B1 (en) 2018-07-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Mahajan et al. Molecular characterization of the SUMO-1 modification of RanGAP1 and its role in nuclear envelope association
Matsumoto et al. Engineering and structural characterization of a linear polyubiquitin-specific antibody
US20190151456A1 (en) Compositions of Engineered Exosomes and Methods of Loading Luminal Exosome Payloads
Wang et al. Identifying dynamic interactors of protein complexes by quantitative mass spectrometry
JP5954808B2 (ja) 内在性ｄｎａ配列特異的結合分子を用いる特定ゲノム領域の単離方法
US20210311059A1 (en) Methods of isolating barrel-like proteases and identifying peptides processed thereby
CA3122647A1 (en) Methods for peptide analysis employing multi-component detection agent and related kits
KR100916651B1 (ko) 단백질 타이로신 탈인산화 효소의 양적 감시에 의한 질환의 진단 방법
WO2015030585A2 (en) Methods for detecting post-translationally modified lysines in a polypeptide
Hristova et al. Proteomic analysis of degradation ubiquitin signaling by ubiquitin occupancy changes responding to 26S proteasome inhibition
Steger et al. Ubiquitinomics: History, methods, and applications in basic research and drug discovery
Rao et al. Identification by mass spectrometry of a new α-tubulin isotype expressed in human breast and lung carcinoma cell lines
Polge et al. Deciphering the ubiquitin proteome: limits and advantages of high throughput global affinity purification-mass spectrometry approaches
Rose et al. Exploring the rampant expansion of ubiquitin proteomics
WO2015072507A1 (ja) ポリユビキチン化基質の同定方法
JP2005098830A (ja) 質量分析法によるタンパク質相互作用物質のスクリーニング方法
WO2003066834A2 (en) Composition and method for modulating an inflammatory response
Gan et al. USP16 is an ISG15 cross-reactive deubiquitinase targeting a subset of metabolic pathway-related proteins
Zhang et al. A versatile new ubiquitin detection and purification tool derived from a bacterial deubiquitylase
KR100630658B1 (ko) 돌연변이된 ｓｕｍｏ-1 단백질
CA2535860A1 (en) Method for detecting transient protein interactions and drug discovery
US20210262006A1 (en) Parallel Enzyme Digestion for Protein Biomarker Detection
Liu et al. Identifying a TFIID interactome via integrated biochemical and high-throughput proteomic studies
Singh et al. Mass spectrometry analysis of affinity-purified cytoplasmic translation initiation complexes from human and fly cells
JP2020106356A (ja) クッシング病治療剤のスクリーニング方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 14863005

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2015547782

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

REEP Request for entry into the european phase

Ref document number: 2014863005

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2014863005

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 15035357

Country of ref document: US