WO2015044923A2 - Nucleic acids binding specifically to human factor ix/ixa, and uses thereof - Google Patents

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WO2015044923A2
WO2015044923A2 PCT/IB2014/064929 IB2014064929W WO2015044923A2 WO 2015044923 A2 WO2015044923 A2 WO 2015044923A2 IB 2014064929 W IB2014064929 W IB 2014064929W WO 2015044923 A2 WO2015044923 A2 WO 2015044923A2
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seq
nucleic acid
ixa
human factor
factor
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Gérald PERRET
Mohamed OUHAMMOUCH
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Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies
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Publication of WO2015044923A9 publication Critical patent/WO2015044923A9/en

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/16—Aptamers

Definitions

  • the present invention relates to the field of the identification of ligands specific for human LX / TXa factor, these ligands being intended in particular for the purification and detection of this protein, as well as their use in the medical field.
  • FIX Factor IX
  • FLXa activated form
  • thromboplastogen coagulation factor VIII
  • thromboplastin an enzyme essential for blood clotting.
  • FIX is secreted as a unique peptide chain of 415 amino acid residues, which has a molecular weight of about 57 to 68 kDa.
  • FIXa therefore plays an important role in the mechanisms of coagulation, resulting in the formation of blood clots.
  • FIX is used in the treatment of hemophilia patients with LX factor deficiency (type B hemophilia or Christmas disease).
  • hemophilia B is a hereditary deficiency in factor IX coagulation, linked to sex, and is characterized by hemorrhages in the joints, muscles, internal organs, these hemorrhages can be spontaneous, accidental or related to a surgical intervention.
  • the substitution treatment makes it possible to increase the plasma levels of factor IX, temporarily palliating the deficit and correcting the hemorrhagic tendencies.
  • Such a production method makes it possible to obtain proteins that are secure in terms of contamination by viruses or other pathogens.
  • such a method makes it possible to obtain proteins whose primary sequence, that is to say an identical sequence between the different amino acids, is identical to the human primary sequence.
  • the methods used generate compositions enriched in human factor IX / IXa comprising contaminating substances.
  • For methods of purification of Factor IX / TXa from human plasma it would be very advantageous to have a final product that is free, or virtually free of residual thrombogenic activity.
  • For methods for obtaining purified recombinant human factor IX / IXa it is essential to have a final product that is free, or virtually free, of unwanted cellular proteins.
  • compositions of human factor IX / IXa purified from biological fluids from transgenic mammals it is important to have a free, or substantially free, end product of the ⁇ / IXa factor otherwise produced naturally by these transgenic mammals, likely to be immunogenic in humans.
  • single-stranded nucleic acids specifically binding to human factor IX / IXa are provided.
  • the present invention also relates to various compounds specifically binding to human factor IX / IXa, which comprise in their structure at least one nucleic acid defined above.
  • This invention also relates to a support for the immobilization of human factor IX / IXa, characterized in that it comprises a solid support material on which are grafted a plurality of nucleic acids or compounds as defined above.
  • the invention also relates to a method for the immobilization of human factor IX / IXa on a support, comprising a step during which a sample comprising human factor IX / IXa is brought into contact with a support as defined. above.
  • the invention also relates to a method for the purification of human factor IX / IXa comprising the following steps:
  • step b) releasing Human Factor IX / IXa from the complex formed in step a) and recovering purified human Factor IX / IXa.
  • the invention also relates to a method for detecting the presence of human factor IX / IXa in a sample comprising the following steps:
  • the present invention also relates to preventive or curative medical uses of the nucleic acids as defined above.
  • Figure 1 illustrates the consensus sequences of the various nucleic aptamers specifically binding to human Factor IX / IXa identified by the inventors.
  • the sequences shown in FIG. 1 are, from the top to the bottom of the figure, respectively the sequences SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 8 and SEQ ID No. 144 to SEQ ID No. 148, relating, respectively, to families of aptamers designated by "Nonapta 1" to "Nonapta 13".
  • Figure 2 illustrates an alignment of various nucleic aptamers specifically binding to human Factor IX / IXa and resulting from the implementation of two separate SELEX in vitro selection series, designated SELEX 5 and SELEX 6.
  • the sequences shown in FIG. FIG. 2 are, from the top to the bottom of the figure, respectively the sequences SEQ ID No. 9 to SEQ ID No. 20, relating to the family of aptamers designated "Nonapta 1". ".
  • the sequences represented in lowercase letters in SEQ ID No. 20 correspond to the complementary sequences of the "primers" (or “primers") (ie S EQ ID No. 21 1 and SEQ JD No. 212) used for the amplification of the aptamer of SEQ ID No.
  • Figure 3 illustrates an alignment of various nucleic aptamers specifically binding to the selected human IX / IXa Factor at the end of the SELEX process implementation, designated SELEX 6.
  • the sequences shown in Figure 3 are from the top to the right. the bottom of the figure, respectively the sequences SEQ ID No. 21 and SEQ ID No. 23, relating to the aptamer family designated "Nonapta 2". ".
  • the sequences represented in lowercase letters in SEQ ID No. 23 correspond to the complementary sequences of the "primers" (or “primers”) (ie SEQ ID No. 211 and SEQ ID No. 212) used for the amplification of the aptamer of SEQ ID NO: 21 by the PCR technique.
  • Figure 4 illustrates an alignment of various nucleic aptamers specifically binding to selected human Factor IX / IXa at the end of the implementation of a SELEX type process (designated SELEX 5).
  • the sequences shown in FIG. 4 are, from the top to the bottom of the figure, respectively the sequences SEQ ID No. 24 to SEQ ID No. 44, relating to the aptamer family designated "Nonapta 3".
  • Figure 5 illustrates an alignment of various nucleic aptamers specifically binding to the selected human LX / IXa Factor at the end of a run cycle of a SELEX type process (i.e. SELEX 6).
  • the sequences shown in FIG. 5 are, from the top to the bottom of the figure, respectively the sequences SEQ ID No. 45 to SEQ ID No. 67, relating to the aptamer family designated "Nonapta 3".
  • the sequences represented in lowercase letters in SEQ ID No. 67 correspond to the complementary sequences of the "primers" (or “primers") (ie SEQ ID No. 211 and SEQ ID No. 212) used for the amplification of the aptamer of SEQ ID NO: 45 by the PCR technique.
  • Figure 6 illustrates an alignment of various nucleic aptamers specifically binding to the selected human LX / IXa Factor at the end of a run cycle of a SELEX type process (i.e. SELEX 5).
  • the sequences shown in FIG. 6 are, from the top to the bottom of the figure, respectively the sequences SEQ ID No. 68 to SEQ ID No. 104, relating to the aptamer family designated "Nonapta 4".
  • Figure 7 illustrates an alignment of various nucleic aptamers specifically binding to the selected human LX / IXa Factor at the end of a run cycle of a SELEX type process (ie SELEX 6).
  • the sequences shown in FIG. 7 are, from the top to the bottom of the figure, respectively the sequences SEQ ID No. 105 to SEQ No. 131, relating to the aptamer family designated "Nonapta 4".
  • the sequences represented in lowercase letters in SEQ ID No. 131 correspond to the complementary sequences of the "primers" (ie, SEQ ID No. 211 and SEQ ID No. 212) used for the amplification of the aptamer of SEQ ID No. 105 by the PCR technique.
  • Figure 8 illustrates an alignment of various nucleic aptamers specifically binding to the selected human ⁇ IXa Factor at the end of a run cycle of a SELEX type process (ie SELEX 6).
  • the sequences shown in FIG. 8 are, from the top to the bottom of the figure, respectively the sequences SEQ ID No. 132 to SEQ H ) No. 134, relating to the family of aptamers designated "Nonapta 5".
  • the sequences represented in lowercase letters in SEQ ID No. 132 correspond to the complementary sequences of the "primers" (ie, SEQ ID No. 211 and SEQ ID No. 212) used for the amplification of the aptamer of SEQ ID NO: 133 by the PCR technique.
  • Figure 9 illustrates an alignment of various nucleic aptamers specifically binding to the selected human LX / LXa Factor at the end of a run cycle of a SELEX type process.
  • the sequences represented in FIG. 9 are, from the top to the bottom of the figure, respectively the sequences SEQ ID Nos. 135 to 138 relating to the family of aptamers "Nonapta 6", the sequences SEQ ID Nos. 139 to 141 relating to to the family of "Nonapta 7" aptamers and the sequences SEQ ID Nos. 142 and 143 relating to the family of "Nonapta 8" aptamers.
  • sequences shown in lower case letters in SEQ) N 0 135, 136, 137, 139 and 142 correspond to the sequences complementary to the "primers" (or “primers”) (ie SEQ ID NO: 211 and / or SEQ ID NO: 212) used for the amplification of aptamers, respectively, of SEQ ID No. 138 in whole or in part, 140 and 143 by the PCR technique.
  • Figure 10 illustrates the binding curves of a nucleic acid, belonging to the Nonapta family 1 (ie SEQ ID No. 20 in Figure 2) and immobilized on a support, to human plasma Factor IX, in a test according to the technique of Plasmomic surface resonance.
  • the abscissa the time, expressed in seconds; ordinate, resonance signal, expressed in arbitrary resonance units.
  • the curves represent, from the top to the bottom of the figure, curve 1: Nonapta 1 with purified human plasma FIX at a concentration of 500 nM; Curve 2: Nonapta 1 with purified human plasma FIX at a concentration of 250 nM.
  • FIG. 11 illustrates the binding curves of a nucleic acid, belonging to the Nonapta 2 family (ie SEQ ID No. 23 in FIG. 3) and immobilized on a support, to the plasma human factor IX, in a test according to the technique of Plasmomic surface resonance.
  • the abscissa the time, expressed in seconds; ordinate, resonance signal, expressed in arbitrary resonance units.
  • the curves represent, from the top to the bottom of the figure, curve 1: Nonapta 2 with purified human plasma FIX at a concentration of 500 nM; Curve 2: Nonapta 2 with purified human plasma FIX at a concentration of 250 nM.
  • Figure 12 illustrates the binding curves of a nucleic acid, belonging to the Nonapta family 3 (ie SEQ ID No. 67 in Figure 5) and immobilized on a support, to human plasma Factor IX, in a test according to the technique of surface plasmon resonance.
  • the abscissa the time, expressed in seconds; ordinate, resonance signal, expressed in arbitrary resonance units.
  • the curves represent, from the top to the bottom of the figure, curve 1: Nonapta 3.1 with purified plasma human FIX at a concentration of 500 nM; Curve 2: Nonapta 3.1 with purified human plasma FIX at a concentration of 250 nM.
  • Figure 13 illustrates the binding curves of a nucleic acid belonging to the Nonapta family (ie, SEQ ID No. 132 in Figure 8) and immobilized on a carrier to human plasma Factor IX in a test according to the method of surface plasmon resonance.
  • abscissa the time, expressed in seconds; ordinate, resonance signal, expressed in arbitrary resonance units.
  • curves represent, from the top to the bottom of the figure, curve 1: Nonapta 5 with purified human plasma FIX at a concentration of 1000 nM; Curve 2: Nonapta 5 with purified human plasma FIX at the concentration of 500 nM; Curve 3: Nonapta 5 with purified human plasma FIX at the concentration of 250 nM; Curve: 4 Nonapta 5 with purified plasma human FIX at the concentration of 100 nM.
  • Figure 14 illustrates the binding curves of a nucleic acid, derived from Nonapta aptamer 5 (ie, Nonapta 5.1, SEQ ID NO: 133 in Figure 8) and immobilized on a carrier, to human plasma factor IX, in an assay. according to the surface plasmon resonance technique.
  • a nucleic acid derived from Nonapta aptamer 5 (ie, Nonapta 5.1, SEQ ID NO: 133 in Figure 8) and immobilized on a carrier, to human plasma factor IX, in an assay.
  • the surface plasmon resonance technique On the abscissa: the time, expressed in seconds; ordinate, resonance signal, expressed in arbitrary resonance units.
  • the curves represent, from the top to the bottom of the figure, curve 1 Nonapta 5.1 with purified human plasma FIX at a concentration of 1000 nM; Curve 2 Nonapta 5.1 with purified human plasma FIX at the concentration of 500 nM; Curve 3 Nonapta 5.1 with purified human plasma FIX at a concentration of 250 nM; Curve 4 Nonapta 5.1 with purified human plasma FIX at the concentration of 100 nM.
  • Figure 15 illustrates the binding curves of a nucleic acid derived from Nonapta aptamer 5 (ie Nonapta 5.7, SEQ ID NO: 134, Figure 8) and immobilized on a carrier, to human plasma Factor IX, in a test according to the surface plasmon resonance technique.
  • a nucleic acid derived from Nonapta aptamer 5 ie Nonapta 5.7, SEQ ID NO: 134, Figure 8
  • the time expressed in seconds
  • ordinate resonance signal
  • the curves represent, from the top to the bottom of the figure, curve 1 Nonapta 5.7 with purified human plasma FIX at a concentration of 1000 nM; Curve 2 Nonapta 5.7 with purified plasma human FIX at a concentration of 500 nM; Curve 3 Nonapta 5.7 with human plasma FIX purified at concentration of 250 nM; Curve 4 Nonapta 5.7 with purified human plasma FIX at the concentration of 100 nM.
  • FIG. 16 illustrates the binding curves of a nucleic acid, belonging to the Nonapta 6 family (ie SEQ ID No. 135 in FIG. 9) and immobilized on a support, to human plasma Factor IX in a test according to the technique of Plasmomic surface resonance.
  • the abscissa the time, expressed in seconds; ordinate, resonance signal, expressed in arbitrary resonance units.
  • the curves represent, from the top to the bottom of the figure, curve 1 Nonapta 6 with purified human plasma FIX at a concentration of 1000 nM; Curve 2 Nonapta 6 with purified human plasma FLX at a concentration of 500 nM; Curve 3 Nonapta 6 with purified human plasma FLX at a concentration of 200 nM; Curve 4 Nonapta 6 with purified human plasma FIX at the concentration of 100 nM.
  • Figure 17 illustrates the binding curves of nucleic acid derived from Nonapta 6 aptamer (ie Nonapta 6.3, SEQ ID No. 136, Figure 9) and immobilized on a carrier, to human plasma Factor IX, in a test according to the surface plasmon resonance technique.
  • the abscissa the time, expressed in seconds; ordinate, resonance signal, expressed in arbitrary resonance units.
  • the curves represent, from the top to the bottom of the figure, Curve 1 Nonapta 6.3 with purified human plasma FIX at a concentration of 1000 nM; Curve 2 Nonapta 6.3 with purified plasma human FIX at 500 nM concentration; Curve 3 Nonapta 6.3 with purified human plasma FIX at a concentration of 250 nM; Curve 4 Nonapta 6.3 with purified plasma human FIX at the concentration of 100 nM.
  • Figure 18 illustrates the binding curves of a nucleic acid derived from Nonapta 6 aptamer (ie, Nonapta 6.4, SEQ ID NO: 137, Figure 9) and immobilized on a carrier, to human plasma Factor IX, in a test according to the surface plasmon resonance technique.
  • a nucleic acid derived from Nonapta 6 aptamer ie, Nonapta 6.4, SEQ ID NO: 137, Figure 9
  • the time expressed in seconds
  • ordinate resonance signal
  • the curves represent, from the top to the bottom of the figure, curve 1 Nonapta 6.4 with purified human plasma FIX at a concentration of 1000 nM; curve 2 Nonapta 6.4 with purified human plasma FIX at a concentration of 500 nM; curve 3 Nonapta 6.4 with purified plasma human FIX at a concentration of 250 nM; Curve 4 Nonapta 6.4 with purified human plasma FLX at the concentration of 100 nM.
  • FIG. 19 illustrates the binding curves of a nucleic acid, belonging to the Nonapta 7 (ie SEQ ) No. 139, FIG. 9) family and immobilized on a support, to human plasma Factor IX, in a test according to the method of FIG. surface plasmon resonance.
  • abscissa the time, expressed in seconds; ordinate, resonance signal, expressed in arbitrary resonance units.
  • the curves represent, from the top to the bottom of the figure, Curve 1 Nonapta 7 with purified human plasma FIX at a concentration of 1000 nM; Curve 2 Nonapta 7 with purified human plasma FIX at a concentration of 500 nM; Curve 3 Nonapta 7 with purified human plasma FIX at a concentration of 250 nM; Curve 4 Nonapta 7 with purified human plasma FIX at the concentration of 100 nM.
  • FIG. 20 illustrates the binding curves of a nucleic acid, belonging to the Nonapta 8 family (ie SEQ JD No. 142, FIG. 9) and immobilized on a support, to human plasma Factor IX, in a test according to the technique of surface plasmon resonance.
  • the abscissa the time, expressed in seconds; ordinate, resonance signal, expressed in arbitrary resonance units.
  • the curves represent, from the top to the bottom of the figure, Curve 1 Nonapta 8 with purified human plasma FIX at a concentration of 500 nM; Curve 2 Nonapta 8 with purified human plasma FIX at a concentration of 250 nM.
  • Figure 21 represents a purification profile by affinity chromatography of a composition of human factor IX (Betafact® product marketed by LFB, France).
  • "1" corresponds to the fraction not retained
  • "2” corresponds to the non-specifically bound fraction and eliminated during the washing step
  • "3" corresponds to the peak of the elution fraction.
  • FIG. 22 represents the image of an SDS PAGE electrophoresis gel in which lanes # 1 and # correspond to the Betafact® Factor IX starting material, lanes # 2 and 2 'correspond to the fraction of the product of departure which was not retained on the column and tracks 3 and 3 'correspond to the elution fraction.
  • Figure 23 illustrates an alignment of various nucleic aptamers specifically binding to the selected human ⁇ IXa Factor at the end of a run cycle of a SELEX type process.
  • the sequences shown in FIG. 23 are, from the top to the bottom of the figure, respectively the sequences SEQ ID No. 149 to SEQ No. 161 and SEQ ID No. 199 to SEQ ID No. 200, relating to the family. aptamere designated "Nonapta 9".
  • the sequences represented in lowercase letters in sequences SEQ ID No. 199 and SEQ ID No. 200 correspond to the complementary sequences of the "primers" (or “primers") (ie SEQ JD No. 213 and SEQ ID No. 214) used for the first time.
  • Figure 24 illustrates an alignment of various nucleic aptamers specifically binding to the selected Human IXa Factor at the end of a run cycle of a SELEX type process.
  • the sequences shown in FIG. 24 are, from the top to the bottom of the figure, respectively the sequences SEQ ID No. 162 to SEQ ID No. 167 and SEQ ID No. 201, relating to the aptamer family designated "Nonapta 10. ".
  • the sequences represented in lowercase letters in sequence SEQ ID No. 201 correspond to the complementary sequences of the "primers" (e.e. SEQ ID No. 213 and SEQ ID No. 214) used for the amplification of aptamer SEQ ID No. 163 by the PCR technique.
  • Figure 25 illustrates an alignment of various nucleic aptamers specifically binding to the selected human LX / LXa Factor at the end of a run cycle of a SELEX type process.
  • the sequences shown in FIG. 25 are, from the top to the bottom of the figure, the sequences SEQ ID No. 168 to SEQ ID No. 172 and SEQ ID No. 202 to SEQ ID No. 206 respectively, relating to the family. aptamere designated "Nonapta 1 1".
  • the sequences represented in lowercase letters in sequences SEQ ID No. 202 to SEQ ID No. 206 correspond to the complementary sequences of the "primers" (or “primers") (SEQ JD No. 213 and SEQ ID No. 214). used for the amplification of aptamers, respectively, of SEQ ID No. 168, SEQ ID No. 169, SEQ ID No. 172, SEQ ID No. 170, and SEQ ID No. 171 by the PCR technique.
  • Figure 26 illustrates an alignment of various nucleic aptamers specifically binding to the selected human JX / JXa factor at the end of a run cycle of a SELEX type process.
  • the sequences shown in FIG. 26 are, from top to bottom of the figure, respectively the sequences SEQ ID No. 173 to SEQ K) N 0 186 and SEQ ) N 0 215, relating to the aptamer family designated "Nonapta". 12 ".
  • the sequences represented in lowercase letters in sequence SEQ ID No. 215 correspond to the complementary sequences of the "primers" (or “primers") (ie SEQ ID No. 213 and SEQ ID No. 214) used for the amplification of the aptamer SEQ ID No. 173 by the PCR technique.
  • Figure 27 illustrates an alignment of various nucleic aptamers specifically binding to the selected human JX / JXa Factor at the end of a run cycle of a SELEX type process.
  • the sequences shown in Figure 27 are, from top to bottom of the figure, respectively the sequences SEQ ID N ° 187 to SEQ) NO 0188 and SEQ ID NO: 207, for the aptamer family designated "Nonapta 13 ".
  • the sequences represented in lowercase letters in sequence SEQ ID No. 207 correspond to the complementary sequences of the "primers" (or “primers") (ie SEQ ID No. 213 and SEQ ID No. 214) used for the amplification of the aptamer of SEQ ID No. 187 by the PCR technique.
  • Figure 28 illustrates an alignment of various nucleic aptamers specifically binding to the selected human ⁇ IXa Factor at the end of a run cycle of a SELEX type process.
  • the sequences shown in Figure 28 are, from top to bottom of the figure, respectively the sequences SEQ ID N ° 189 to SEQ) NO 0198 and SEQ JD No. 208 to SEQ H) No. 210.
  • the sequences shown in lower case letters SEQ K) No. 208 to SEQ) No. 210 correspond to the complementary sequences of the "primers" (ie, SEQ ID NO: 213 and SEQ ID NO: 214) used for the amplification of aptamers, respectively, of SEQ ID No. 197, SEQ ID No. 198 and SEQ ID No. 196 by the PCR technique.
  • Figure 29 illustrates the nucleic acid binding curves implemented at a concentration of 1 ⁇ to the purified human Factor IX human immobilized on a support, in a test according to the surface plasmomic resonance technique.
  • abscissa the time, expressed in seconds; ordinate, resonance signal, expressed in arbitrary resonance units.
  • Figure 30 illustrates the binding curves of human Factor IX used at different nucleic acid concentrations of sequence SEQ ID No. 215 immobilized on a support, in a test according to the technique of surface plasmon resonance.
  • the abscissa the time, expressed in seconds; ordinate, resonance signal, expressed in arbitrary resonance units.
  • the curves represent, from the top to the bottom of the figure, curve 1 SEQ ID No. 215 with purified human FIX at a concentration of 2000 nM; curve 2 SEQ ID No. 215 with purified human FIX at a concentration of 1000 nM; curve 3 SEQ ID No. 215 with purified human FIX at a concentration of 500 nM; curve 4 SEQ ID No. 215 with purified human FIX at the concentration of 250 nM.
  • Figure 31 illustrates the binding curves of human Factor IX used at different nucleic acid concentrations of sequence SEQ ID NO: 202 immobilized on a support, in a test according to the technique of surface plasmon resonance.
  • the abscissa the time, expressed in seconds; ordinate, resonance signal, expressed in arbitrary resonance units.
  • the curves represent, from the top to the bottom of the figure, curve 1 SEQ ID No. 202 with purified human FIX at a concentration of 2000 nM; curve 2 SEQ ID No. 202 with purified human FIX at a concentration of 1000 nM; curve 3 SEQ) ⁇ 202 with purified human FIX at a concentration of 500 nM; curve 4 SEQ ID No. 202 with purified human FIX at a concentration of 250 nM.
  • Figure 32 illustrates the binding curves of human Factor IX implemented at a concentration of 2000 nM to the nucleic acid of sequence SEQ ID No. 202 immobilized on a support, in a test according to the technique of surface plasmon resonance.
  • abscissa the time, expressed in seconds; ordinate, resonance signal, expressed in arbitrary resonance units.
  • the curves represent, from the top to the bottom of the figure, curve 1 with the recombinant factor IX, curve 2 with the plasma factor IX and curve 3 with the M5SB control.
  • Figure 33 illustrates the binding curves of human Factor IX implemented at a concentration of 2000 nM to the nucleic acid of sequence SEQ ID No. 203 immobilized on a support, in a test according to the technique of surface plasmon resonance.
  • abscissa the time, expressed in seconds; ordinate, resonance signal, expressed in arbitrary resonance units.
  • the curves represent, from the top to the bottom of the figure, curve 1 with the recombinant factor IX, curve 2 with the plasma factor IX and curve 3 with the M5SB control.
  • Figure 34 illustrates the binding curves of human Factor IX implemented at a concentration of 2000 nM to the nucleic acid of sequence SEQ ID No. 206 immobilized on a support, in a test according to the surface plasmon resonance technique.
  • abscissa the time, expressed in seconds; ordinate, resonance signal, expressed in arbitrary resonance units.
  • the curves represent, from the top to the bottom of the figure, curve 1 with the recombinant factor IX, curve 2 with the plasma factor IX and curve 3 with the M5SB control.
  • Figure 35 is a schematic of an electrophoretic gel migration of different fractions from chromatography with a streptavidin gel.
  • Lanes 1 and 8 correspond to Markl2 TM Standard marker (between 0.78 and lmg / ml)
  • lane 2 corresponds to Betafact® Factor IX starting material
  • lanes 3 to 7 correspond to purification results.
  • Figure 36 is a schematic of an electrophoretic gel migration of different fractions from chromatography performed with an activated HS-Sepharose gel.
  • Tracks 1 and 5 correspond to the Markl2 TM Standard marker (between 0.78 and 1 mg / ml)
  • the lane 2 corresponds to the starting product of Factor IX Betafact®
  • lane No. 3 corresponds to the fraction of the starting product which was not retained on the column
  • lane No. 4 corresponds to the result of purification of factor IX from the starting product (ie Betafact®) obtained with the nucleic acid sequence SEQ JD No. 202.
  • the Applicant has obtained a collection of single-stranded nucleic acids capable of binding specifically to the human factor IX / IXa, which nucleic acids are described later in the present description.
  • nucleic acids of the invention which are able to bind specifically to human factor IX / IXa, consist of single-stranded nucleic acids, preferably of the DNA type, that the applicant thinks to be able to adopt conformations in space which contribute to confer to them their Factor IX / IXa binding properties mentioned above.
  • nucleic acids of the invention may also be called "aptamers" nucleotides, with reference to a term commonly used by those skilled in the art to designate this type of molecules.
  • Nucleic aptamers capable of binding to various proteins involved in the blood coagulation pathway are already known in the art.
  • aptamers binding alpha-thrombin European Patent Application No. EP 1,972,693 or thrombin (Zhao et al., 2008, Anal Chem, Vol 80 (19): 7586-7593)
  • aptamers binding the factor IX / IXa Subash et al., 2006, Thromb Haemost, Vol 95: 767-771, Howard et al., 2007, Athenoscl Thromb Biol Vase, Vol 27: 722-727, PCT Application No.
  • the present invention relates to a nucleic acid specifically binding to human factor IX / IXa.
  • a single-stranded nucleic acid specifically binding to human Factor ⁇ IXa can also be referred to as "nucleic aptamer", “aptamer”, “Human Factor IX / IXa binding aptamer” or "anti-FIX aptamer”.
  • FIXa human ".
  • human ⁇ IXa factor a natural human factor IX / IXa (i.e. of plasma origin) and a recombinant human factor IX / IXa are included.
  • a human factor IX / IXa is considered with reference to its amino acid sequence, that is to say regardless of whether the protein is glycosylated or non-glycosylated, and, if the protein is glycosylated , regardless of the type of glycosylation.
  • the Applicant has isolated families of nucleic aptamers specifically binding to human factor IX / IXa, the existence of which has been shown to exist between (1) the common structural features and (11) the common functional characteristic (s).
  • nucleic acid of formula (I) a nucleic acid of formula (I) below:
  • [5'-TER1] m represents a nucleic acid comprising between 1 and 50 nucleotides, preferably between 1 and 32 nucleotides,
  • n represents a nucleic acid comprising between 1 and 50 nucleotides, preferably between 1 and 40 nucleotides,
  • n is an integer equal to 0 or 1
  • n is an integer equal to 0 or 1
  • [SEQ ID NO: X] is a nucleic acid having at least 80% nucleotide identity with a nucleic acid selected from the group consisting of nucleic acids of sequences SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 5 , SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 147 and SEQ ID NO: 148; and
  • the nucleic acid of SEQ ID NO: X is 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 in length. , 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 nucleotides.
  • the nucleic acid of sequence SEQ ID No. X is 12 to 24 nucleotides in length, preferably 15 or 16 nucleotides in length.
  • nucleic acid of formula (I) is a nucleic acid of the following formula (IA):
  • the integer m is 1 and the integer n is 0, and the nucleic acid of formula (I) is a nucleic acid of the following formula (IB):
  • the integer m is 0 and the integer n is 1, and the nucleic acid of formula (I) is a nucleic acid of the following formula (IC):
  • the "5'-TER1" nucleic acid when present, has a length of 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 , 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 or 50 nucleotides, which includes nucleic acids having exactly each of the specified lengths.
  • the nucleic acid "3 '-TER1" when present, has a length of 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 , 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 or 50 nucleotides, which includes nucleic acids having exactly each of the specified lengths.
  • the nucleic acid of formula (I) has at least 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 12 , 13, 114, 115, 116, 117, 40, 41,
  • nucleic acid or nucleic aptamer according to the invention, specifically binding to human factor IX / IXa may be chosen from a nucleic acid of formula (II) below:
  • [5'-TER2] 0 represents a nucleic acid comprising between 1 and 30 nucleotides, preferably between 1 and 25 nucleotides,
  • nucleic acid comprising between 1 and 30 nucleotides, preferably between 1 and 25 nucleotides,
  • o is an integer equal to 0 or 1
  • p is an integer equal to 0 or 1
  • [SEQ ID NO: Y] is a nucleic acid having at least 80% nucleotide identity with a nucleic acid selected from the group consisting of nucleic acids of SEQ ID NO: 9 to 19, 21, 22 , 24 to 66, 68 to 130, 133, 134, 138, 140, 143, 149 to 198, preferably SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 105. , SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO.
  • sequence SEQ ID No. 168 SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 171, and SEQ ID NO: 187, and best of all. sequence SEQ ID No. 168.
  • the nucleic acid of sequence SEQ ID NO: Y is 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45 nucleotides in length.
  • the nucleic acid of sequence SEQ ID No. Y has a length of 37 to 42 nucleotides in length, preferably 39 or 40 nucleotides in length.
  • nucleic acid of formula (II) is a nucleic acid of the following formula (IIA):
  • the integer “o” is 1 and the integer “p” is 0, and the nucleic acid of formula (II) is a nucleic acid of the following formula ( ⁇ ):
  • nucleic acid of formula ( ⁇ ) is a nucleic acid of formula (IIC) as follows:
  • the "5'-TER2" nucleic acid when present, has a length of 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 or 30 nucleotides, which includes nucleic acids having exactly each of the lengths specified.
  • the nucleic acid "3 '-TER2" when present, has a length of 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 or 30 nucleotides, which includes nucleic acids having exactly each of the lengths specified.
  • the nucleic acid of formula (II) has at least 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104 or 105 nucleotides in length, which includes nucleic acids having exactly each of the specified lengths.
  • nucleic acid comprising at most 50 nucleotides, preferably at most 32 nucleotides, said nucleic acid having at its end at least 80%, preferably at least 90%, of nucleotide identity with a nucleic acid of sequence SEQ ID NO: 211 or SEQ ID NO: 213;
  • nucleic acid comprising at most 50 nucleotides, preferably at most 32 nucleotides, said nucleic acid having at its 3 'end at least 80%, preferably at least 90%, nucleotide identity with a nucleic acid of sequence SEQ ID NO: 212 or SEQ ID NO: 214;
  • nucleic acid having at least 80%, preferably at least 90%, nucleotide identity with a nucleic acid sequence SEQ ID NO: 211 or SEQ ID NO: 213 ;
  • [3 '-TER2] may consist of a nucleic acid having at least 80%, preferably at least 90%, nucleotide identity with a nucleic acid of sequence SEQ ID No. 212 or SEQ K) No. 214.
  • the collection of anti-FIX / FIXa nucleic aptamers according to the invention comprises a plurality of families of nucleic aptamers, each family of nucleic aptamers being characterized by common structural characteristics, in particular by a common nucleic acid sequence.
  • nucleic aptamers belonging to a given family of anti-FIX / FIXa nucleic aptamers according to the invention have between them a common consensus sequence, and in particular a common sequence which is designated "SEQ K) N °. X "in the present description.
  • the collection of anti-FIX / FIXa nucleic aptamers according to the invention includes, in particular, thirteen families of nucleic aptamers, designated respectively "Nonapta 1", “Nonapta 2", “Nonapta 3", “Nonapta 4", “Nonapta 5" , “Nonapta 6", “Nonapta 7", “Nonapta 8", “Nonapta 9", “Nonapta 10", “Nonapta 11", “Nonapta 12", “Nonapta 13”, each family of nucleic aptamers comprising a sequence consensus nucleic acid, and in particular a consensus nucleic sequence designated "SEQ ID No. X", which is common to all aptamers of said family.
  • sequence SEQ K) No. X consist of a nucleic acid having at least 80% nucleotide identity with a nucleic acid selected from the group consisting of nucleic acids.
  • nucleic acid of sequence SEQ ID No. X having at least
  • nucleotide identity with a reference nucleic sequence has at least
  • nucleic acid of sequence SEQ ID No. Y having at least 80% nucleotide identity with a reference nucleic sequence possesses at least 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%. %, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% nucleotide identity with said nucleic acid sequence. reference.
  • the nucleic acid of formula (I) can then be represented by a nucleic acid of sequence SEQ ID No. 146, SEQ ID No. 168 to SEQ ID No. 172 or SEQ ID No. 202 to SEQ ID No. 206, preferably of sequence SEQ ID No. 202, SEQ ID No. 203, SEQ ID No. 204, SEQ ID No. 205 or SEQ ID No. 206, and better a nucleic acid of sequence SEQ ID N 202.
  • nucleic acid of formula (I) of the invention has at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, %, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% nucleotide identity with a nucleic acid of SEQ ID No. 146, SEQ ID No. 168 to SEQ ID No. 172 or SEQ ID No. 202 to SEQ ID No. 206, preferably SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO. 204, SEQ ID No. 205 or SEQ ID No. 206.
  • nucleic acid of formula (I) of the invention has at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, %, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% nucleotide identity with a nucleic acid of SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 133 or SEQ ID No. 134.
  • nucleic acid of formula (I) may then be represented by a nucleic acid of sequence SEQ ID No. 6 or SEQ ID No. 135 to
  • nucleic acid of formula (I) of the invention the sequence of said nucleic acid has at least 80%, 81%, 82%, 83%,
  • nucleic acid of sequence is N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N
  • nucleic acid of formula (I) may then be represented by a nucleic acid of SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 139, SEQ ID No. 140 or
  • nucleic acid of formula (I) of the invention the sequence of said nucleic acid has at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, %, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% nucleotide identity with a nucleic acid of SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140 or SEQ ID NO: 141.
  • the nucleic acid of formula (I) can then be represented by a nucleic acid of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 21, SEQ ID No. 22 or SEQ IO N 0 23.
  • nucleic acid of formula (I) of the invention has at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, %, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% nucleotide identity with a nucleic acid of SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 22 or SEQ ID No. 23.
  • the nucleic acid of formula (I) can then be represented by a nucleic acid of SEQ K ) No. 3 or SEQ ID No. 24 to SEQ ID No. 67.
  • nucleic acid of formula (I) of the invention the sequence of said nucleic acid has at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, %, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% nucleotide identity with a nucleic acid of SEQ ID No. 3 or SEQ ID No. 24 to SEQ ID No. 67.
  • the nucleic acid of formula (I) can then be represented by a nucleic acid of SEQ K) No. 1 or SEQ ID No. 9 to SEQ ID No. 20.
  • nucleic acid of formula (I) of the invention the sequence of said nucleic acid has at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, %, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% nucleotide identity with a nucleic acid of SEQ ID No. 1 or SEQ ID No. 9 to SEQ ID No. 20.
  • the nucleic acid of formula (I) can then be represented by a nucleic acid of SEQ ID No. 4 or SEQ ID No. 68 to SEQ ID No. 131.
  • nucleic acid of formula (I) of the invention the sequence of said nucleic acid has at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, %, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% nucleotide identity with a nucleic acid of SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO : 68 to SEQ ID NO: 131.
  • the nucleic acid of formula (I) can then be represented by a nucleic acid of SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 142 or SEQ ID No. 143.
  • nucleic acid of formula (I) of the invention the sequence of said nucleic acid has at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% nucleotide identity with a nucleic acid of SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 142 or SEQ ID NO: 143.
  • the nucleic acid of formula (I) can then be represented by a nucleic acid of SEQ ID No. 144, SEQ ID No. 149 to SEQ ID No. 161, SEQ ID No. 199 or SEQ ID NO: 200.
  • nucleic acid of formula (I) of the invention the sequence of said nucleic acid has at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, %, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%>, 99% or 100% nucleotide identity with a nucleic acid of SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 149 to SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 199 or SEQ ID NO: 200.
  • the nucleic acid of formula (I) can then be represented by a nucleic acid of SEQ ID No. 145, SEQ ID No. 162 to SEQ ID No. 167 or SEQ ID No. 201.
  • nucleic acid of formula (I) of the invention the sequence of said nucleic acid has at least 80%>, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% nucleotide identity with a nucleic acid from SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 162 to SEQ ID NO: 167 or SEQ ID NO: 201.
  • nucleic acid of formula (I) of the invention the sequence of said nucleic acid has at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, %, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% nucleotide identity with a nucleic acid of SEQ ID No. 147 or SEQ ID No. 173 to SEQ ID No. 186 or SEQ ID No. 215.
  • the nucleic acid of formula (I) can then be represented by a nucleic acid of SEQ ID No. 148, SEQ ID No. 187 to SEQ ID No. 188 or SEQ ID No. 207.
  • nucleic acid of formula (I) of the invention the sequence of said nucleic acid has at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, %, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% nucleotide identity with a nucleic acid of SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 187 to SEQ ID NO: 188 or SEQ ID NO: 207.
  • the nucleic acid of formula (I) may be represented by a nucleic acid having at least 80% identity with a nucleic acid of SEQ ID No. 189 to SEQ ID No. 198 or SEQ ID No. 208 to SEQ ID No. 210.
  • sequence SEQ ID No. X of a nucleic acid according to the invention may be chosen from the group consisting of nucleic acids having at least 80% nucleotide identity, better still at least 90% of nucleic acids. nucleotide identity, with at least one of SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6, preferably SEQ ID NO: 1
  • a nucleic acid according to the invention may have at least 80% nucleotide identity, more preferably at least 90% nucleotide identity, with a nucleic acid selected from the group consisting of nucleic acid sequences. SEQ ID No. 1 to 210, preferably SEQ ID No. 1 to 143.
  • a nucleic acid according to the invention may have at least 80% nucleotide identity, more preferably at least 90% identity. nucleotides, with a nucleic acid of SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 133 (nonapta 5.1) or SEQ ID NO: 134 (nonapta 5.7), preferably SEQ ID NO: 202 or SEQ ID No. 134, and better the sequence SEQ ID No. 202.
  • the "percent identity" between two nucleic acid sequences in the sense of the present invention is determined by comparing the two optimally aligned sequences through a comparison window.
  • the part of the nucleotide sequence in the comparison window may comprise additions or deletions (for example "gaps") with respect to the reference sequence (which does not include these additions or deletions) so as to obtain an alignment optimal between the two sequences.
  • the percent identity is calculated by determining the number of positions at which an identical nucleotide base is observed for the two compared sequences, and then dividing the number of positions at which there is identity between the two nucleobases by the total number of positions in the comparison window, then multiplying the result by one hundred in order to obtain the percentage of nucleotide identity of the two sequences between them.
  • the optimal alignment of the sequences for the comparison can be performed in a computer manner using known algorithms.
  • nucleic acid On the basis of a nucleic acid according to the invention, as represented in FIGS. 1 to 9 and 23 to 28, the person skilled in the art can easily determine the possible specific sequences for the sequence SEQ ID No. X, within the whole of the finite number of possible nucleotide sequences. Those skilled in the art can verify its binding properties to the human factor IX / TXa, for example according to one of the methods specified in the present description, in particular in the examples.
  • a human factor IX / IXa binding nucleic acid is a single-stranded nucleic acid capable of forming a complex with human factor IX / IXa when contacted with the human factor IX / IXa.
  • Nucleic acids binding to human factor IX / IXa therefore include those for which complexes can be detected with human factor IX / IXa after a prior step of contacting said respective nucleic and protein partners.
  • the detection of complexes formed between a human factor IX / IXa binding nucleic acid can be easily performed by those skilled in the art, for example by implementing a surface plasmon resonance detection technique, including the Biacore ® technique. as illustrated in the examples.
  • Those skilled in the art can also easily detect the formation of complexes between a nucleic acid of interest and the human factor IX / IXa by conventional techniques of the ELISA type, or by any other laboratory technique capable of highlighting an interaction between a nucleic acid and a protein.
  • a nucleic acid of formula (I) or ( ⁇ ) according to the invention has a strong capacity for binding to any type of human factor IX / IXa. Moreover, the binding of a nucleic acid of formula (I) or (II) according to the invention to the natural human factor IX / IXa is specific. Indeed, a nucleic acid of formula (I) or ( ⁇ ) according to the invention has a very weak capacity for binding to Factor VII VIIa, or even a zero capacity.
  • nucleic acid of formula (I) or (II) according to the invention has a high capacity to bind to IX factors.
  • IXa humans with distinct types of glycosylation.
  • the Applicant believes that a nucleic acid of formula (I) or (II) according to the invention is capable of binding efficiently, not only to Factor IX / IXa from natural sources, including plasma.
  • a nucleic acid "specifically" binding to human Factor IX / IXa consists of a nucleic acid having an ability to bind human Factor IX / IXa greater than its ability to bind to any other protein, and particular to Factors VII / VIIa.
  • a first nucleic acid has the ability to bind human Factor IX / IXa, which is greater than that of a second nucleic acid, when, using any of the binding detection techniques described above, above, and under the same test conditions, a statistically significant upper binding signal value is obtained with the first nucleic acid, relative to that obtained with the second nucleic acids.
  • a first nucleic acid has an ability to bind to Factor IX / IXa human, greater than that of a second nucleic acid, when the resonance signal value for the first nucleic acid, regardless of the expressed resonance unit of measure, is statistically greater than the measured resonance signal value for the second nucleic acid.
  • Two distinct "statistically" measured values encompass two values which have a greater difference than the measurement error of the link detection technique used.
  • nucleic acids of the invention As illustrated in the examples, the ability of the nucleic acids of the invention to bind specifically to human factor IX / IXa was tested.
  • nucleic acids of formula (I) or (II) according to the invention are further advantageous in that they have an ability to bind human Factor IX / IXa which is significantly greater than their binding capacity. to any other factor.
  • a nucleic acid of formula (I) or (II) according to the invention has a strong ability to bind to any type of human factor IX / IXa, including natural or recombinant, it has a low capacity , and even zero, to bind to a factor VII / VIIa encoded by the genome of a non-human mammal.
  • these characteristics of specificity of the binding of a nucleic acid of formula (I) or (II) according to the invention to human factor IX / IXa illustrate that the aptamer nucleic acids of the invention can be advantageously used to discriminate between a human factor IX / IXa and a human factor VII / VIIa or, in addition, discriminate between a human factor IX / IXa and a non-human factor IX / IXa.
  • a nucleic acid of formula (I) or (II) according to the invention can be advantageously used in a means for purifying a human factor IX / IXa, including from a complex starting medium likely to contain a factor IX / TXa in combination with other types of coagulation factors, such as for example the factor VILVIIa.
  • a nucleic acid of formula (I) or (II) according to the invention may be used in a recombinant factor IX / IXa purification means in a biological fluid of a transgenic animal for human factor IX / IXa, said biological fluid being likely to contain other coagulation factors, and particularly being likely to contain a factor IX / TXa naturally produced by the transgenic animal.
  • nucleic acid of formula (I) or (II) is its ability, in a complex with the human factor IX / IXa, to release the factor IX / Human IXa by incubation of said complex with a metal cation chelating agent such as EDTA (ethylene diamine tetraacetic acid) or EGTA (ethylene glycol-bis (2-aminoethylether) -N, N, N ', N'- tetraacetic acid).
  • EDTA ethylene diamine tetraacetic acid
  • EGTA ethylene glycol-bis (2-aminoethylether
  • Factor IX / IXa molecules complexed with a nucleic acid of formula (I) or (II) according to the invention are released from said complexes by contact with a metal cation chelating agent such as EDTA. .
  • the binding of a nucleic acid of formula (I) or ( ⁇ ) according to the invention to human factor IX / IXa can be dissociated by contacting with a metal cation chelating agent, including included by contact with EDTA or EGTA.
  • the metal cation chelating agent is EDTA, preferably associated with NaCl.
  • the inventors have observed further improved results in terms of dissociation between a nucleic acid of formula (I) or (II) according to the invention and human factor IX / IXa when EDTA is combined with NaCl.
  • nucleic acid of formula (I) or ( ⁇ ) according to the invention is particularly advantageous for the use of said nucleic acid in a means for purifying human factor IX / IXa. Indeed, in such an application for purification, human factor IX / IXa, immobilized in a complex with a nucleic acid of formula (I) or (II) according to the invention, can then be recovered in purified form by simple application. in contact or incubation with a metal cation chelating agent, so without requiring the use of substances known to denature, at least partially, the human factor ⁇ / TXa, such as acidic conditions or urea.
  • a nucleic acid of formula (I) or (II) according to the invention is preferentially immobilized on a solid support.
  • Said solid support includes solid particles, chromatography media, etc. Techniques for immobilizing nucleic acids of interest on a wide variety of types of solid supports are well known to those skilled in the art.
  • the solid support may be an affinity chromatography column composed of a gel derived from agarose, cellulose or a synthetic gel such as an acrylamide, methacrylate or polystyrene derivative, a chip such as a chip adapted to the surface plasmon resonance, a membrane such as a polyamide, polyacrylonitrile or polyester membrane or a magnetic or paramagnetic ball.
  • a nucleic acid of formula (I) or ( ⁇ ) according to the invention is preferably included in a chemical structure also comprising a spacer means and, if appropriate, a means of immobilization on a solid support.
  • the present invention also relates to a compound that binds specifically to the human ⁇ / LXa factor, characterized in that it has the following formula (III):
  • [NUCL] means a nucleic acid specifically binding to human Factor IX / TXa of formula (I) or (II).
  • the above compound is a particular embodiment of a human ⁇ / IXa Factor purification means.
  • the "spacer chain” designated [SPAC] in the compound of formula (III) can be of any known type.
  • Said spacer chain has the function of physically moving the nucleic acid [NUCL] away from the surface of the solid support on which said compound can be immobilized and to allow a relative mobility of the nucleic acid [NUCL], relative to the surface solid support on which it can be immobilized.
  • the spacer chain limits or avoids that steric hindrances, due to an excessive proximity of the solid support with the nucleic acid of formula (I) or (II), interfere with the binding events between said nucleic acid and Factor IX molecules. / IXa human likely to be brought into contact therewith.
  • the spacer chain is preferably bonded to the 5 'end or the 3' end of [NUCL] nucleic acid.
  • the spacer chain is bonded to both an end of the aptamer and the solid support.
  • This spacer construction has the advantage of not directly immobilizing the aptamer on the solid support.
  • the spacer chain is a nonspecific oligonucleotide or polyethylene glycol (PEG).
  • PEG polyethylene glycol
  • said oligonucleotide advantageously comprises at least 5 nucleotides in length, preferably between 5 and 15 nucleotides in length.
  • said spacer chain includes PEG (C18) type polyethylene glycol.
  • the [NUCL] nucleic acid can be chemically modified with different chemical groups such as groups that make it possible to immobilize said nucleic acid in a covalent manner, such as thiols, amines or any other group capable of reacting with chemical groups present on the solid support.
  • the spacer chain is itself capable of being immobilized on the solid support, where appropriate after modification of said spacer chain with one or more appropriate chemical groups.
  • the spacer chain is linked to a compound for immobilizing the compound of interest comprising the nucleic aptamer on the mobile support.
  • the present invention also relates to a compound that binds specifically to human LX / LXa factor, characterized in that it has the following formula (IV):
  • FIX means an immobilization compound on a support
  • [NUCL] means a nucleic acid specifically binding to human Factor IX / IXa of formula (I) or (II).
  • the compound of formula (IV) above constitutes an embodiment of a human ⁇ / IXa factor purification means.
  • the compound [FIX] consists of a compound selected from (i) a compound capable of forming one or more covalent bonds with the surface material of a solid support and (ii) a compound capable of Specifically bind to the solid support via weak non-covalent bonds, including hydrogen bonds, electrostatic forces or Van der Waals forces.
  • the first type of compound [FIX] includes the bifunctional coupling agents, such as glutaraldehyde, SIAB or SMCC.
  • the compound SIAB comprises two reactive groups, respectively a lodoacetate group and a Sulfo-NHS ester group, these groups reacting respectively on amino and sulfhydryl groups.
  • the SMCC compound which is described by Samoszuk M.K. et al. (1989, Antibody, Immunoconjugates Radiopharm., 2 ( ⁇ ): 37-46), is the compound of formula (XI) below:
  • the SMCC compound comprises two reactive groups, respectively a sulfo-NHS ester group and a maleimide group, which react respectively with an amino group and a sulfhydryl group.
  • the second type of compound [FIX] includes biotin, which is capable of specifically non-covalently binding to avidin or streptavidin molecules present on the solid support.
  • the aptamer when immobilized on the solid support via the spacer chain, is advantageously modified at its free end (non-free end). linked to the spacer) by virtue of, and not limited to, a chemically modified nucleotide (such as 2'-O-methyl or 2'-fluoropyrimidine, 2'-ribopurine, phosphoramidite), an inverted nucleotide or a chemical group (PEG, polycations, cholesterol).
  • a chemically modified nucleotide such as 2'-O-methyl or 2'-fluoropyrimidine, 2'-ribopurine, phosphoramidite
  • PEG polycations, cholesterol
  • the immobilization of an anti-FLX / IXa nucleic acid according to the invention on a support can be carried out according to the process described in the PCT application published under the name of LFB Biotechnologies WO 2012/090183 dated July 5, 2012. This immobilization process is carried out by grafting nucleic acids comprising a primary amine on a solid support having activated carboxylic acid groups, said process comprising a covalent coupling step of said nucleic acids on said solid support at a pH below 6.
  • -NH- (SPAC) n -NUCL represents a nucleic aptamer in which:
  • ⁇ n is index of 0 or 1
  • ⁇ SPAC represents a spacer chain
  • ⁇ NUCL is a nucleic acid specifically binding to Factor IX / human LXa of formula (I) or (II).
  • a "nucleic aptamer” used for grafting to the pre-activated solid support may comprise, by definition, a non-nucleotide portion. or nucleotide, for example a non-nucleotide spacer chain, which connects one of the 5 'or 3' ends of the nucleic portion of said aptamer and the reactive amine function used for the chemical grafting of said pre-activated support.
  • a nucleic aptamer may have the following formula (V): - [SPAC] "- [NUCL] (V), wherein
  • n is an index of 1 or 0, where 0 means that the aptamer does not comprise a free spacer chain and 1 signifies that the aptamer comprises a spacer chain.
  • NH 2 means the reactive amine function used for grafting onto the solid support pre-activated with NHS groups
  • [NUCL] means a nucleic acid specifically binding to human Factor IX / IXa of formula (I) or (II).
  • the solid support may be an affinity chromatography column composed of a gel derived from agarose, cellulose or a synthetic gel such as an acrylamide, methacrylate or polystyrene derivative, a chip such as a chip adapted to the surface plasmon resonance, a membrane such as a polyamide, polyacrylomtrile or polyester membrane, a magnetic or paramagnetic ball.
  • the present invention also relates to a complex between:
  • the present invention also relates to a support for the immobilization of the
  • Human IX / IXa factor characterized in that it comprises a solid support material on which are grafted a plurality of molecules each consisting of or each comprising a nucleic aptamer, said molecules being chosen from (a) a nucleic acid of formula (I) or (II), (b) a compound of formula ( ⁇ ) and (c) a compound of formula (RV).
  • the above support can be used in virtually any application for which human Factor IX / IXa is to be immobilized, including applications for the Purification of Factor IX / IXa and applications for the detection of Factor IX / IXa.
  • Human factor ⁇ / IXa Human factor ⁇ / IXa.
  • the present invention therefore also relates to a method for the immobilization of human factor IXa IXa on a support, comprising a step during which a sample comprising human factor IX / IXa is brought into contact with a solid support on which was previously immobilized a substance selected from a nucleic acid of formula (I) or (II), a compound of formula (III) and a compound of formula ( ⁇ ).
  • Said method may comprise, according to the technical objectives pursued, an additional step of recovering immobilized human IX / IXa molecules complexed with the nucleic acid molecules of formula (I) or (II).
  • the additional step of recovering the ⁇ / IXa Factor preferably consists of a step of contacting the Factor ⁇ lXa complexes with the nucleic acids of formula (I) or (II) with a metal cation chelating agent, such as EDTA or EGTA.
  • the present invention also relates to a process for the purification of human IXa IXa Factor comprising the following steps:
  • step b) releasing the human ⁇ / IXa Factor from the complex formed in step a) and recovering the purified human factor X / IXa.
  • the method comprises a step a '), step a' following step a) and preceding step b), which consists of a step of washing the affinity support with a buffer washing.
  • the process comprises a step a ') of washing the affinity support during which the ionic strength is increased, that is to say that a washing buffer is used whose ionic strength is increased relative to the ionic strength of the buffer used in step a).
  • the ionic strength of the washing buffer used in step a ') is greater by 2 to 500 times with respect to the ionic strength of the buffer used in step a).
  • the ionic strength of the washing buffer is greater by 100 to 500 times, preferably 200 to 500 times, relative to the ionic strength of the buffer used in step a).
  • a wash buffer having a high ionic strength, particularly a buffer having a high concentration of NaCl effectively removes non-specific affinity-bound substances without simultaneously affecting Factor IX binding in a detectable manner. to the affinity support.
  • a wash buffer having a final NaCl concentration of at least 0.5M is preferably used.
  • a wash buffer having a final NaCl concentration of at least 0.5 M includes wash buffers having a final NaCl concentration of at least 1 M, 1.5 M, 2 M, 2 , 5 M or at least 3 M.
  • a washing buffer used in step a ') of the process has a final NaCl concentration of at most 3.5 M.
  • a washing buffer used in step a') of the process has a concentration of Final NaCl between 0.5 and 3.5, preferably between 1.5 and 3.5, preferably between 2 and 3.5, for example preferably between 2.5 and 3.5.
  • the washing buffer used in step a ') contains both NaCl and propylene glycol.
  • step b) is performed by contacting the affinity support with an elution buffer containing a divalent ion chelating agent, preferably EDTA or EGTA.
  • a divalent ion chelating agent preferably EDTA or EGTA.
  • the elution buffer may contain a final concentration of EDTA of at least 1 mM and at most 300 mM.
  • At least 1 mM includes at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 mM.
  • not more than 300 mM includes not more than 290, 280, 270, 260, 250, 240, 230, 220, 210, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120 or 110 mM .
  • an affinity support comprising a nucleic aptamer of the invention and the realization of a method of purifying human Factor Malawi with said affinity support is illustrated in the examples.
  • the solid supports on which the aptamers of the invention can be immobilized include any type of support having the structure and composition commonly found for filter supports, silicon support for chips, membranes, etc.
  • Solid supports include resins, resins for affinity chromatography columns, polymer beads, magnetic beads, and the like.
  • Solid supports also include glass or metal-based materials such as steel, gold, silver, aluminum, copper, silicon, glass and ceramics.
  • Media solids also include, in particular, polymeric materials, such as polyethylene, polypropylene, polyamide, polyvinylidene fluoride, and combinations thereof.
  • the solid support may be coated with a material facilitating attachment, fixation, complex formation, immobilization or interaction with aptamers.
  • the solid support is a glass slide whose surface is coated with a gold layer, a carboxymethylation-treated layer, a layer of dextran, collagen, avidin, streptavidin, etc.
  • the aptamers according to the invention can be immobilized on the solid support via an attachment coating, as for example described above, either by chemical reaction with creation of covalent bonds, or by association with non-covalent bonds such as hydrogen bonds, electrostatic forces, Van der Waals forces, etc.
  • affinity support generally means a support formed of a solid material on which nucleic aptamers as defined in the present description have been immobilized.
  • a solid support consisting of a glass slide coated with a layer of streptavidin molecules, and aptamers of the invention conjugated to a biotin molecule which are immobilized on the support by non-covalent association biotin / streptavidin.
  • the aptamers of the invention can be immobilized on a solid support suitable for affinity chromatography, electrochromatography and capillary electrophoresis, as described for example by Ravel et al. (2006, J Chromatogr A, Vol 117 (1): 1-10), Connor et al. (2006, J Chromatogr A, Vol 111 (2): 115-119), Cho et al. (2004, Electrophoresis, Vol 25 (21-22): 3730-3739) or Zhao et al. (2008, Anal Chem, Vol 80 (10): 3915-3920).
  • An aptamer of formula (I) or (II) according to the invention and specifically binding to the human factor ⁇ / LXa, a compound of formula (III), or a compound of formula (IV) may also be advantageously used as an agent. capture of human FIX / IXa in detection or diagnostic methods and devices.
  • the present invention also relates to a method for detecting the presence of human ⁇ IXa Factor in a sample comprising the following steps: a) contacting (1) a nucleic acid of formula (I) or (II), a compound of formula (III) or a compound of formula (IV) or a solid support on which are immobilized a plurality of molecules of said acid nucleic acid or said compound, with (ii) said sample; and
  • the solid support used may be a solid support chosen from the solid supports described above in connection with the method for purifying human factor IX / IXa.
  • step b) of detecting complex formation between (i) said nucleic acid or said solid support and (ii) human factor IX / IXa can be performed by measuring the plasmonic resonance signal of surface, as described in the examples.
  • the step b) of detecting the formation of complexes between (i) said nucleic acid or said solid support and (ii) the human factor IX / IXa can be carried out by bringing said complexes into contact with each other.
  • a human Factor IX / IXa ligand optionally formed with a human Factor IX / IXa ligand, said ligand being detectable.
  • the detectable ligand for human factor IX / IXa mention may be made of monoclonal or polyclonal anti-human IX / IXa antibodies, labeled with an enzyme, in this case horseradish peroxidase, as conventionally used in ELISA type tests. .
  • the sample comprising or capable of comprising human factor IX / IXa consists of a liquid sample which contains the human factor IX / IXa, including a liquid sample comprising the human factor IX / IXa and which is capable of containing also factor IX / IXa molecules of a non-human mammal.
  • said sample consists of a biological solution, such as a body fluid, a cell, a cell crushed material, a tissue, a tissue mill, an organ or an entire organism.
  • said sample consists of a liquid biological solution from an animal such as blood, a blood derivative (blood derivative), mammalian milk or a mammalian milk derivative.
  • Said sample may consist of plasma, plasma cryoprecipitate, clarified milk or their derivatives.
  • said sample is derived from a transgenic animal for human factor IX / IXa.
  • the solution is mammalian milk or a transgenic mammalian milk derivative for human factor IX / IXa.
  • the transgenic animals include (i) non-human mammals such as cows, goats, rabbits, pigs, monkeys, rats or mice, (ii) birds or (iii) ) insects such as mosquitoes, flies or silkworms.
  • the human factor IX / IXa transgene animal is a non-human transgenic mammal, most preferably a transgenic rabbit for human factor IXIXa.
  • the transgenic mammal produces the recombinant factor IX / IXa in its mammary glands, because of the insertion into its genome of an expression cassette comprising a nucleic acid encoding human factor IX / IXa which is under control. a specific promoter allowing the expression of the transgene protein in the milk of said transgenic mammal.
  • One method of producing human factor IX / IXa in the milk of a transgenic animal may comprise the following steps: a DNA molecule comprising a gene encoding human factor IX / IXa, said gene being under the control of a promoter of a naturally secreted protein in the milk (such as the casein, beta-casein, lactalbumin, beta-lactoglobulin promoter or the WAP promoter) is integrated into an embryo of a non-human mammal. The embryo is then placed in a female mammal of the same species. Once the mammal from the embryo has grown sufficiently, the lactation of the mammal is induced, then the milk collected. The milk then contains human factor IX / IXa.
  • a promoter of a naturally secreted protein in the milk such as the casein, beta-casein, lactalbumin, beta-lactoglobulin promoter or the WAP promoter
  • a plasmid containing the WAP (Whey Acidic Protein) promoter is made by introducing a sequence comprising the promoter of the WAP gene, this plasmid being made so as to be able to receive a foreign gene placed under the control of the WAP promoter.
  • the plasmid containing the promoter and the gene coding for the protein of the invention are used to obtain transgenic rabbits by microinjection into the male pronucleus of rabbit embryos. The embryos are then transferred into the oviduct of hormonally prepared females. The presence of the transgenes is revealed by the Southern Blot technique from the DNA extracted from the transgenic rabbits obtained.
  • the concentrations of the transgene protein in animal milk are evaluated using specific radioimmunoassays.
  • a nucleic acid according to the invention and specifically binding to human Factor IX / IXa can be used in vivo, in physiological situations requiring the inhibition of Factor X activation by Factor LXa, for example by inhibiting the formation of a functional complex Factor IXaFactor VHIa.
  • an aptamer nucleic acid as defined in the present description can also be used, as a preventive or curative, as anticoagulant active ingredient of a drug.
  • an aptamer nucleic acid as defined in the present description may be used as a preventive or curative anticoagulant active ingredient, in particular for the treatment of coagulation disorders including venous thromboses, arterial thromboses, post-surgical thromboses, coronary artery bypass (CABG) disorders, stroke, percutaneous transdermal coronary angioplasty (PTCA), tumor metastasis, non-severe or severe inflammatory reactions, septic shock, hypotension, acute respiratory distress syndrome (ARDS), pulmonary embolisms, disseminated intravascular coagulation (DIC), vascular restenosis, platelet deposition, myocardial infarction, angiogenesis, and any prohylactic treatment of men or women at risk of developing thrombosis.
  • coagulation disorders including venous thromboses, arterial thromboses, post-surgical thromboses, coronary artery bypass (CABG) disorders, stroke, percutaneous transdermal coronary angioplasty (PTCA), tumor metastasis, non
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a nucleic acid specifically binding to human LX / LXa factor as defined in the present description, in combination with one or more pharmaceutically acceptable excipients.
  • the amount of human anti-FIX / FIXa aptamer nucleic acid according to the invention, in a pharmaceutical composition, is adapted to allow the administration of an effective amount of this active ingredient to patients.
  • the dosage ranges of human anti-FIX / FIXa aptamer of the invention may be readily determined by the physician or pharmacist.
  • the amount of active ingredient to be administered varies with the patient's age, medical condition, and sex, as well as with the degree of spread of the disease or degree of risk of developing the disease, and may be easily determined by those skilled in the art.
  • a pharmaceutical composition comprises an amount of a human anti-FIX FIXa aptamer ranging from 1 nanogram to 100 milligrams per unit dose, more preferably from 100 nanograms to 10 milligrams per unit dose.
  • a pharmaceutical composition according to the invention comprises from 0.01% to 99.9% by weight of an anti-FIX / FIXa aptamer, or a combination of several anti-FLX / FIXa aptamers, and from 99% to 99.9% by weight of an anti-FIX / FIXa aptamer. , 9% to 0.01% by weight of an excipient, or a combination of excipients, relative to the total weight of said composition.
  • said pharmaceutical composition comprises 1, 2, 3, 4, 5 or 6 distinct anti-FIX / FIXa aptamers.
  • the pharmaceutical composition according to the invention can be used prophylactically and / or therapeutically.
  • the administration of a pharmaceutical composition according to the invention can be carried out in several ways, including but not limited to, locally and mucocutaneously, enterally or parenterally.
  • local and mucocutaneous route is intended in particular to designate the topical, intravenous, intravaginal, intrauterine, inhalation, transdermal, ocular, or m-vesical route.
  • enteral route is meant in particular the route, intrarectal, sublingual, oral, nasal, intrastagmal or intrajejunal.
  • parenteral route is meant in particular the intradermal, subcutaneous, intramuscular, intracardiac, intravascular, intravenous, intraocular, meta-arterial, epidural, mastrarachidian, extracorporeal, mtrathecal, intraperitoneal, intrapleural, mtraluminal, intravitreal, intracavemous, intraventricular, intraosseous, palatal, intra-articular, intracellular, pulmonary or intrafoetal.
  • the administration of a pharmaceutical composition according to the invention can be made intravenously.
  • a human anti-FIX / FIXA aptamer according to the present invention is prepared in a form adapted to the chosen type of administration, for example in liquid form or in freeze-dried form.
  • the pharmaceutical compositions of human anti-FIX / FIXA aptamers according to the present invention may contain an excipient and / or a pharmaceutically acceptable vehicle, preferably an aqueous vehicle.
  • compositions for example, water, buffered water, saline solution, glycine solution and their derivatives as well as agents necessary to reproduce physiological conditions such as buffering agents and pH adjusters, surfactants such as sodium acetate, sodium lactate, sodium chloride, potassium chloride, calcium chloride, this list not being limiting.
  • the pharmaceutical composition can be sterilized by sterilization techniques well known to those skilled in the art.
  • the human anti-FIX / FIXa aptamer active ingredient (s) may be used alone or in combination with one or more other pharmaceutically acceptable molecules.
  • active agents including one or more other anticoagulant active ingredients.
  • the invention also relates to a nucleic acid specifically binding to human factor IX / IXa, as defined in this specification, for use as a medicament.
  • the invention also relates to the use of a nucleic acid specifically binding to human factor IXa IXa, as defined in the present description, for the manufacture of a medicament for the treatment of coagulation disorders, in particular including those mentioned above, preferably type B hemophilia.
  • the invention also relates to the use of a nucleic acid specifically binding to human factor IX / IXa, as defined in the present description, for the treatment of coagulation disorders, in particular including those mentioned above, preferably haemophilia type B.
  • the invention also relates to a method for preventing or treating a coagulation disorder, comprising a step in which a patient requiring a preventive or curative treatment of a coagulation disorder is administered a anti-FIXa human FIXa aptamer pharmaceutical composition as defined in the present description.
  • a daily dose of a human anti-FIX / FIXa aptamer as defined in the present description ranging from 1 nanogram to 100 milligrams, more preferably from 100 nanograms to 10 milligrams, is administered for a patient of 80 kgs.
  • a solid support having immobilized nucleic aptamer molecules according to the invention was prepared. Prior to their attachment to the solid support, the 5 'end of the aptamers considered was chemically coupled to a biotin molecule.
  • a solid support containing immobilized streptavidin molecules is available (S sensor chip SA series, GE)
  • the solid support above was contacted with the aptamer compounds below to immobilize the nucleic acids, by non-covalent association between the streptavidin molecules of the support and the biotin molecules of the aptamer compounds.
  • the aptamers considered are those represented by the sequences SEQ ID No. 20, SEQ K) No. 23, SEQ K) No. 67, SEQ ID No. 132, SEQ ID No. 133, SEQ ID No. 134, SEQ K) No. 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 203 and SEQ ID NO. 206.
  • the aptaptin Nonapta 1 is thus immobilized with an immobilization rate of approximately 1830 RU (1 RU corresponds approximately to 1 ⁇ g of immobilized product per mm 2 ).
  • the aptamers Nonapta 2 and Nonapta 3 are thus immobilized with an immobilization rate of approximately 1,950 RU.
  • Nonapta aptamer 3.1 (ie an aptamer of sequence SEQ ID No. 67 for which the 3 'end was chemically coupled to a biotin molecule) is thus immobilized with an immobilization level of about 2050 RU.
  • Nonapta aptamers 5, 5.1 and 5.7 are thus immobilized with an immobilization rate of, respectively, about 2 190 RU, 3 080 RU and 1 760 RU.
  • Nonapta aptamers 6, 6.3 and 6.4 are thus immobilized with an immobilization rate of approximately 2 270 RU, 1 720 RU and 2 150 RU, respectively.
  • the aptaptor Nonapta 7 is thus immobilized with an immobilization rate of approximately 2 220 RU.
  • the Nonapta aptamer 8 is thus immobilized with an immobilization rate of approximately 2,260 RU.
  • Purified human FIX was diluted in running buffer (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2 , pH 7.4) to obtain 100 and 250 nM samples. in FIX, or for some of the above aptamers of concentration 500 and 1000 nM in FIX.
  • Nonapta 6 the same purified human FIX was diluted in running buffer (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2 , pH 7.4). to obtain 100, 200, 500 and 1000 nM samples in FIX.
  • running buffer 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2 , pH 7.4
  • the aptamer of sequence SEQ ID No. 215 is immobilized with an immobilization rate of about 1646 RU.
  • the aptamer of sequence SEQ ID No. 202 is immobilized with an immobilization level of about 1752 RU.
  • Several supports were made, each comprising a single specific aptamer from those indicated above.
  • the binding curves of the immobilized aptamers described above in the human FIX were calculated with the dedicated module of the Biacore® T-200 Evaluation Software (Version 1.0).
  • the au-factor binding is particularly significant for Nonapta aptamers 5, 5.1, 5.7, 6, 6.3 and 6.4, and more particularly the Nonapta aptamer 5.7.
  • the affinity support was made of a solid carrier material consisting of a matrix having grafted streptavidin (streptavidin-agarose - Novagen ®).
  • a volume of 1 ml of gel was introduced into a container consisting of a column (ID 11mm).
  • the gel was washed with purified water to remove the storage solvent.
  • the characteristics of the gel are:
  • biotinylated human anti-FIX nucleic aptamers according to the invention are solubilized in purified water at the final concentration of 0.5 mg / 0.187 ml, ie a final molar concentration. 0.1 mM.
  • the nucleic aptamer solution was activated at 95 ° C according to the standard cycle, for aptamer immobilization on the solid support material.
  • the nucleic aptamer solution was previously diluted with 4.8 ml of purified water and then 1.5 ml of Me ++ buffer (5 ⁇ concentrated).
  • the absorbance detector is adjusted to 1 AUFS (Absorbance Unit Full Scale) and the OD at 254 nm of this solution is recorded at 0.575 UA254.
  • the solution of biotinylated nucleic aptamers is injected onto the prepackaged streptavidin-agarose gel ("prepackaged") and recirculated with a peristaltic pump at a flow rate of 2.5 ml / minute, ie a contact time on the gel. 24 seconds (input / output I / O). Under these conditions, the OD at 254 nm stabilizes rapidly at 0.05 AU254, a value of 91% theoretical coupling, that is to say 0.455 mg of nucleic aptamers per milliliter of gel.
  • the starting material of Factor IX is Betafact 94 IU / mL - 1 mL.
  • Betafact 1 ml of Betafact is injected with a flow rate of 0.4 ml / mm in equilibration buffer.
  • Protein peaks are detected by measuring the absorbance value at the wavelength of 280 nanometers.
  • Figure 21 shows the curve of measured values of absorbance at 280 nm versus time.
  • peak # 1 is the fraction of the starting material that was not retained on the column.
  • Peak No. 2 corresponds to the elution fraction.
  • the starting product as well as the eluted product was analyzed in SDS PAGE with silver nitrate staining.
  • Tracks 1 to 3 are obtained under non-reducing conditions.
  • FIGS. 21 and 22 show that the aptamer with sequence SEQ K) N 0 133 (ie Nonapta 5.1) is capable of binding human FIX and eluting it specifically in the presence of EDTA.
  • the band corresponding to tracks 2 and 2 ' is particularly clear or non-existent, which reflects the capacity of said aptamer to bind effectively to human FIX.
  • a solid support was made on which human factor IX was immobilized.
  • a solid support containing immobilized streptavidin molecules is available (S sensor chip SA series, GE)
  • Factor IX is immobilized with an immobilization rate of about 7055 RU.
  • No. 196 and SEQ ID NO: 187 were diluted in running buffer (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 5 mM MgCl, pH 7.4) to obtain 1 ⁇ concentration samples.
  • the binding to factor IX is particularly significant for aptamers of sequences SEQ ID No. 173, SEQ ID No. 186, and SEQ ID No. 180.
  • affinity gels on which the aptamers of sequences SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 206, SEQ ID NO: 207 and SEQ ID are prepared independently of one another are independently prepared.
  • No. 134 coupled directly to biotin, without spacer chain between aptamer and biotin.
  • the aptamers are immobilized on a streptavidin gel (Novagen supplier) using a 5 'terminal biotin with a theoretical ligand density of 0.4 mg / ml: 1 ml volume packaged in an XK16 (GE) column.
  • an affinity gel is prepared on which the aptamer of sequence SEQ ID No. 202 coupled directly to biotin, without a spacer chain between the aptamer and biotin, is immobilized.
  • the aptamer is immobilized on an NHS-activated Sepharose gel using a 5 'terminal biotin with a theoretical ligand density of 0.4 mg / ml: 1 ml volume packaged in an XK16 (GE) column.
  • the starting material of Factor IX is Betafact 94 IU / mL - 1 mL.
  • Equilibration gel 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 5 mM MgCl 2 , pH 7.4, Wash: TSP buffer containing 0.5 M NaCl-2.5 mL,
  • Betafact 1 ml of Betafact is injected with a flow rate of 0.4 ml / min in equilibration buffer.
  • Protein peaks are detected by measuring the absorbance value at the wavelength of 280 nanometers.
  • Figure 35 is a picture of an electrophoretic gel migration of different fractions from the first chromatography described in item A above, namely that carried out with the streptavidin gel.
  • Lanes 1 and 8 correspond to the Markl2 TM Standard marker
  • lane 2 corresponds to the Betafact® Factor IX starting material
  • lane 9 corresponds to the control, represented by plasma factor IX.
  • Figure 36 is a picture of an electrophoretic gel migration of different fractions from the second chromatography described in item A above, namely that carried out with the activated NHS-Sepharose gel.
  • Lanes 1 and 5 correspond to the Mark 12 TM Standard marker
  • lane 2 corresponds to the Betafact® Factor IX starting material
  • lane 3 corresponds to the fraction of the starting material that was not retained on the column
  • lane No. 4 corresponds to the purification result of factor IX from the starting material (ie Betafact®) obtained with the nucleic acid of sequence SEQ ID No. 202.
  • FIGS. 35 and 36 show that the aptamers of sequences SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 206, SEQ ID NO: 207 and SEQ ID NO: 134 are capable of binding human FIX.

Abstract

The invention concerns a nucleic acid that binds specifically to human factor IX/IXa.

Description

ACIDES NUCLEIQUES SE LIANT SPECIFIQUEMENT AU FACTEUR IX/IXA HUMAIN, ET LEURS UTILISATIONS  NUCLEIC ACIDS BINDING SPECIFICALLY TO HUMAN IX / IXA FACTOR AND USES THEREOF
DOMAINE DE L'INVENTION FIELD OF THE INVENTION
La présente invention se rapporte au domaine de l'identification de ligands spécifiques du Facteur LX/TXa humain, ces ligands étant destinés notamment à la purification et à la détection de cette protéine, ainsi qu'à leur utilisation dans le domaine médical.  The present invention relates to the field of the identification of ligands specific for human LX / TXa factor, these ligands being intended in particular for the purification and detection of this protein, as well as their use in the medical field.
ART ANTERIEUR PRIOR ART
Le facteur IX (FIX), également appelé facteur anti-hémophilique B, est une glycoprotéine vitamine K-dépendante qui, sous sa forme activée (FLXa), participe au processus de coagulation en interagissant avec le thromboplastmogène (facteur VIII de la coagulation) pour former la thromboplastine, une enzyme indispensable à la coagulation du sang. Le FIX est sécrété sous la forme d'une chaîne peptidique unique de 415 résidus d'acides aminés, dont la masse moléculaire est d'environ 57 à 68 kDa.  Factor IX (FIX), also known as anti-hemophilic factor B, is a vitamin K-dependent glycoprotein that, in its activated form (FLXa), participates in the coagulation process by interacting with thromboplastogen (coagulation factor VIII) to form thromboplastin, an enzyme essential for blood clotting. FIX is secreted as a unique peptide chain of 415 amino acid residues, which has a molecular weight of about 57 to 68 kDa.
Le FIXa joue donc un rôle important dans les mécanismes de la coagulation, aboutissant à la formation de caillot sanguin.  FIXa therefore plays an important role in the mechanisms of coagulation, resulting in the formation of blood clots.
Le FIX est utilisé dans le traitement des patients atteints d'hémophilie présentant un déficit en facteur LX (hémophilie de type B ou maladie de Christmas). En effet, l'hémophilie B est un déficit héréditaire en facteur IX de coagulation, lié au sexe, et qui se caractérise par des hémorragies au niveau des articulations, des muscles, des organes internes, ces hémorragies pouvant être spontanées, accidentelles ou liées à une intervention chirurgicale. Le traitement de substitution permet d'augmenter les taux plasmatiques de facteur IX, palliant temporairement le déficit et corrigeant les tendances hémorragiques.  FIX is used in the treatment of hemophilia patients with LX factor deficiency (type B hemophilia or Christmas disease). Indeed, hemophilia B is a hereditary deficiency in factor IX coagulation, linked to sex, and is characterized by hemorrhages in the joints, muscles, internal organs, these hemorrhages can be spontaneous, accidental or related to a surgical intervention. The substitution treatment makes it possible to increase the plasma levels of factor IX, temporarily palliating the deficit and correcting the hemorrhagic tendencies.
II est donc nécessaire de disposer de concentrés de FIXa injectables. It is therefore necessary to have injectable FIXa concentrates.
La méthode la plus ancienne d'obtention de concentrés de FIXa a consisté en la purification du FIXa à partir de protéines plasmatiques issues du fractionnement. Le document EP 0 346 241 décrit à cet effet la préparation d'une fraction enrichie en FLXa, obtenue après adsorption puis élution d'un sous-produit du fractionnement de protéines plasmatiques contenant le FIX et le FIXa et d'autres protéines telles les facteurs VU (FVII), X (FX) et II (FII), notamment le prééluat du PPSB (P = prothrombine ou Fil, P = proconvertine ou FVII, S = facteur de Stuart ou FX et B = facteur antihémophilique B ou FLX). L'inconvénient de ce procédé est que le FIX obtenu contient encore quelques traces d'autres facteurs de coagulation. La demande de brevet WO 2002/077161 décrit la production de FIXa dans un animal transgénique. The oldest method of obtaining FIXa concentrates consisted in the purification of FIXa from plasma proteins resulting from the fractionation. For this purpose, the document EP 0 346 241 describes the preparation of a fraction enriched in FLXa, obtained after adsorption then eluting a by-product of the fractionation of plasma proteins containing FIX and FIXa and other proteins such as the factors VU (FVII), X (FX) and II (FII), including the PPSB preeluat (P = prothrombin or Fil, P = proconvertin or FVII, S = Stuart factor or FX and B = antihemophilic factor B or FLX). The disadvantage of this method is that the FIX obtained still contains some traces of other coagulation factors. Patent application WO 2002/077161 describes the production of FIXa in a transgenic animal.
Une telle méthode de production permet d'obtenir des protéines sécurisées en terme de contamination par des virus ou d'autres agents pathogènes. De plus, une telle méthode permet d'obtenir des protéines dont la séquence primaire, c'est-à-dire un enchaînement identique entre les différents acides aminés, est identique à la séquence primaire humaine.  Such a production method makes it possible to obtain proteins that are secure in terms of contamination by viruses or other pathogens. In addition, such a method makes it possible to obtain proteins whose primary sequence, that is to say an identical sequence between the different amino acids, is identical to the human primary sequence.
Toutefois, quelle que soit la source initiale de Facteur ΓΧ/IXa, les procédés mis en œuvre génèrent des compositions enrichies en Facteur IX/IXa humain comprenant des substances contaminantes. Pour les procédés de purification du Facteur IX/TXa à partir de plasma humain, il serait très avantageux de disposer d'un produit final notamment exempt, ou quasi-exempt d'activité thrombogénique résiduelle. Pour les procédés d'obtention de Facteur IX/IXa humain recombinant purifié, il est essentiel de disposer d'un produit final notamment exempt, ou quasi-exempt, de protéines cellulaires indésirables. En particulier, pour les compositions de Facteur IX/IXa humain purifié à partir de fluides biologiques provenant de mammifères transgéniques, il est important de disposer d'un produit final exempt, ou quasi- exempt, de Facteur ΓΧ/IXa produit par ailleurs naturellement par ces mammifères transgéniques, susceptible d'être immunogène chez l'homme.  However, irrespective of the initial source of the ΓΧ / IXa factor, the methods used generate compositions enriched in human factor IX / IXa comprising contaminating substances. For methods of purification of Factor IX / TXa from human plasma, it would be very advantageous to have a final product that is free, or virtually free of residual thrombogenic activity. For methods for obtaining purified recombinant human factor IX / IXa, it is essential to have a final product that is free, or virtually free, of unwanted cellular proteins. In particular, for compositions of human factor IX / IXa purified from biological fluids from transgenic mammals, it is important to have a free, or substantially free, end product of the ΓΧ / IXa factor otherwise produced naturally by these transgenic mammals, likely to be immunogenic in humans.
Pour atteindre cet objectif, il est nécessaire de disposer d'outils efficaces et spécifiques permettant la purification du Facteur IX/IXa humain à partir d'un échantillon comprenant ledit Facteur IX/IXa, et pouvant être produits facilement et de manière reproductible.  To achieve this objective, it is necessary to have efficient and specific tools for the purification of human factor IX / IXa from a sample comprising said factor IX / IXa, and which can be produced easily and in a reproducible manner.
RESUME DE L'INVENTION SUMMARY OF THE INVENTION
Il est fourni selon l'invention des acides nucléiques monobrin se liant spécifiquement au facteur IX/IXa humain.  According to the invention, single-stranded nucleic acids specifically binding to human factor IX / IXa are provided.
La présente invention concerne aussi divers composés se liant spécifiquement au facteur IX/IXa humain, qui comprennent dans leur structure au moins un acide nucléique défini ci-dessus.  The present invention also relates to various compounds specifically binding to human factor IX / IXa, which comprise in their structure at least one nucleic acid defined above.
Elle est également relative à des complexes entre (i) un acide nucléique ou un composé tels que définis ci-dessus et (ii) un facteur IX/IXa humain.  It also relates to complexes between (i) a nucleic acid or a compound as defined above and (ii) a human factor IX / IXa.
Cette invention a également trait à un support pour l'immobilisation du Facteur IX/IXa humain, caractérisé en ce qu'il comprend un matériau support solide sur lequel sont greffés une pluralité d'acides nucléiques ou de composés tels que définis ci-dessus. L'invention a aussi pour obj et un procédé pour l'immobilisation du facteur IX/IXa humain sur un support, comprenant une étape au cours de laquelle on met en contact un échantillon comprenant du Facteur IX/IXa humain avec un support tel que défini ci-dessus. This invention also relates to a support for the immobilization of human factor IX / IXa, characterized in that it comprises a solid support material on which are grafted a plurality of nucleic acids or compounds as defined above. The invention also relates to a method for the immobilization of human factor IX / IXa on a support, comprising a step during which a sample comprising human factor IX / IXa is brought into contact with a support as defined. above.
L'invention est aussi relative à un procédé pour la purification du Facteur IX/IXa humain comprenant les étapes suivantes :  The invention also relates to a method for the purification of human factor IX / IXa comprising the following steps:
a) mettre en contact un échantillon comprenant du Facteur IX IXa humain avec un acide nucléique ou avec un support tel que défini ci-dessus, afin de former un complexe entre (i) ledit acide nucléique ou ledit support et (îi) le Facteur IX/IXa humain, et  a) contacting a sample comprising human IXa Factor IXa with a nucleic acid or with a support as defined above, to form a complex between (i) said nucleic acid or said support and (ii) Factor IX / IXa human, and
b) libérer le Facteur IX/IXa humain à partir du complexe formé à l'étape a) et récupérer le Facteur IX/IXa humain purifié.  b) releasing Human Factor IX / IXa from the complex formed in step a) and recovering purified human Factor IX / IXa.
L'invention concerne aussi un procédé pour détecter la présence de Facteur IX/IXa humain dans un échantillon comprenant les étapes suivantes :  The invention also relates to a method for detecting the presence of human factor IX / IXa in a sample comprising the following steps:
a) mettre en contact un acide nucléique ou un support tel que défini ci-dessus avec ledit échantillon; et  a) contacting a nucleic acid or a support as defined above with said sample; and
b) détecter la formation de complexes entre (i) ledit acide nucléique ou ledit support et (ii) le Facteur IX/IXa.  b) detecting the formation of complexes between (i) said nucleic acid or said support and (ii) Factor IX / IXa.
La présente invention a également trait à des utilisations médicales préventives ou curatives des acides nucléiques tels que définis ci-dessus.  The present invention also relates to preventive or curative medical uses of the nucleic acids as defined above.
DESCRIPTION DES FIGURES DESCRIPTION OF THE FIGURES
La Figure 1 illustre les séquences consensus des divers aptamères nucléiques se liant spécifiquement au Facteur IX/IXa humain identifiés par les inventeurs. Les séquences représentées sur la figure 1 sont, du haut vers le bas de la figure, respectivement les séquences SEQ JD N° 1 à SEQ JD N° 8 et SEQ ID N°144 à SEQ ID N° 148, relatives, respectivement, aux familles d'aptamères désignés par « Nonapta 1 » à « Nonapta 13 ».  Figure 1 illustrates the consensus sequences of the various nucleic aptamers specifically binding to human Factor IX / IXa identified by the inventors. The sequences shown in FIG. 1 are, from the top to the bottom of the figure, respectively the sequences SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 8 and SEQ ID No. 144 to SEQ ID No. 148, relating, respectively, to families of aptamers designated by "Nonapta 1" to "Nonapta 13".
La Figure 2 illustre un alignement de divers aptamères nucléiques se liant spécifiquement au Facteur IX/IXa humain et résultant de la mise en œuvre de deux séries distinctes de sélection in vitro de type SELEX, désignées SELEX 5 et SELEX 6. Les séquences représentées sur la figure 2 sont, du haut vers le bas de la figure, respectivement les séquences SEQ JD N° 9 à SEQ JD N° 20, relatives à la famille d'aptamères désignée « Nonapta 1 ». ». Les séquences représentées en lettres minuscules en SEQ ID N° 20 correspondent aux séquences complémentaires des « amorces » (ou « primers ») (i.e. S EQ ID N°21 1 et SEQ JD N°212) utilisées pour l' amplification de l'aptamère de SEQ ID N° 9 par la technique de PCR (Polymerase Chain Reaction). La Figure 3 illustre un alignement de divers aptamères nucléiques se liant spécifiquement au Facteur IX/IXa humain sélectionnés à la fin de la mise en œuvre du procédé de type SELEX, désigné SELEX 6. Les séquences représentées sur la figure 3 sont, du haut vers le bas de la figure, respectivement les séquences SEQ ID N° 21 et SEQ ID N° 23, relatives à la famille d'aptamères désignée « Nonapta 2 ». ». Les séquences représentées en lettres minuscules en SEQ ID N° 23 correspondent aux séquences complémentaires des « amorces » (ou « primers ») (i.e. SEQ ID N°211 et SEQ ID N°212) utilisées pour l'amplification de l'aptamère de SEQ ID N° 21 par la technique de PCR. Figure 2 illustrates an alignment of various nucleic aptamers specifically binding to human Factor IX / IXa and resulting from the implementation of two separate SELEX in vitro selection series, designated SELEX 5 and SELEX 6. The sequences shown in FIG. FIG. 2 are, from the top to the bottom of the figure, respectively the sequences SEQ ID No. 9 to SEQ ID No. 20, relating to the family of aptamers designated "Nonapta 1". ". The sequences represented in lowercase letters in SEQ ID No. 20 correspond to the complementary sequences of the "primers" (or "primers") (ie S EQ ID No. 21 1 and SEQ JD No. 212) used for the amplification of the aptamer of SEQ ID No. 9 by the PCR (Polymerase Chain Reaction) technique. Figure 3 illustrates an alignment of various nucleic aptamers specifically binding to the selected human IX / IXa Factor at the end of the SELEX process implementation, designated SELEX 6. The sequences shown in Figure 3 are from the top to the right. the bottom of the figure, respectively the sequences SEQ ID No. 21 and SEQ ID No. 23, relating to the aptamer family designated "Nonapta 2". ". The sequences represented in lowercase letters in SEQ ID No. 23 correspond to the complementary sequences of the "primers" (or "primers") (ie SEQ ID No. 211 and SEQ ID No. 212) used for the amplification of the aptamer of SEQ ID NO: 21 by the PCR technique.
La Figure 4 illustre un alignement de divers aptamères nucléiques se liant spécifiquement au Facteur IX/IXa humain sélectionnés à la fin de la mise en œuvre d'un procédé de type SELEX (désigné SELEX 5). Les séquences représentées sur la figure 4 sont, du haut vers le bas de la figure, respectivement les séquences SEQ ID N° 24 à SEQ ID N° 44, relatives à la famille d'aptamères désignée « Nonapta 3 ».  Figure 4 illustrates an alignment of various nucleic aptamers specifically binding to selected human Factor IX / IXa at the end of the implementation of a SELEX type process (designated SELEX 5). The sequences shown in FIG. 4 are, from the top to the bottom of the figure, respectively the sequences SEQ ID No. 24 to SEQ ID No. 44, relating to the aptamer family designated "Nonapta 3".
La Figure 5 illustre un alignement de divers aptamères nucléiques se liant spécifiquement au Facteur LX/IXa humain sélectionnés à la fin d'un cycle de mise en œuvre d'un procédé de type SELEX (i.e. SELEX 6). Les séquences représentées sur la figure 5 sont, du haut vers le bas de la figure, respectivement les séquences SEQ ID N° 45 à SEQ ID N° 67, relatives à la famille d'aptamères désignée « Nonapta 3 ». Les séquences représentées en lettres minuscules en SEQ ID N° 67 correspondent aux séquences complémentaires des « amorces » (ou « primers ») (i.e. SEQ ID N°211 et SEQ ID N°212) utilisées pour l'amplification de l'aptamère de SEQ ID N° 45 par la technique de PCR.  Figure 5 illustrates an alignment of various nucleic aptamers specifically binding to the selected human LX / IXa Factor at the end of a run cycle of a SELEX type process (i.e. SELEX 6). The sequences shown in FIG. 5 are, from the top to the bottom of the figure, respectively the sequences SEQ ID No. 45 to SEQ ID No. 67, relating to the aptamer family designated "Nonapta 3". The sequences represented in lowercase letters in SEQ ID No. 67 correspond to the complementary sequences of the "primers" (or "primers") (ie SEQ ID No. 211 and SEQ ID No. 212) used for the amplification of the aptamer of SEQ ID NO: 45 by the PCR technique.
La Figure 6 illustre un alignement de divers aptamères nucléiques se liant spécifiquement au Facteur LX/IXa humain sélectionnés à la fin d'un cycle de mise en œuvre d'un procédé de type SELEX (i.e. SELEX 5). Les séquences représentées sur la figure 6 sont, du haut vers le bas de la figure, respectivement les séquences SEQ ID N° 68 à SEQ ID N° 104, relatives à la famille d'aptamères désignée « Nonapta 4 ».  Figure 6 illustrates an alignment of various nucleic aptamers specifically binding to the selected human LX / IXa Factor at the end of a run cycle of a SELEX type process (i.e. SELEX 5). The sequences shown in FIG. 6 are, from the top to the bottom of the figure, respectively the sequences SEQ ID No. 68 to SEQ ID No. 104, relating to the aptamer family designated "Nonapta 4".
La Figure 7 illustre un alignement de divers aptamères nucléiques se liant spécifiquement au Facteur LX/IXa humain sélectionnés à la fin d'un cycle de mise en œuvre d'un procédé de type SELEX (i.e. SELEX 6). Les séquences représentées sur la figure 7 sont, du haut vers le bas de la figure, respectivement les séquences SEQ ID N° 105 à SEQ ) N° 131, relatives à la famille d'aptamères désignée « Nonapta 4 ». Les séquences représentées en lettres minuscules en SEQ ID N° 131 correspondent aux séquences complémentaires des « amorces » (ou « primers ») (i.e. SEQ ID N°211 et SEQ ID N°212) utilisées pour l'amplification de l'aptamère de SEQ ID N° 105 par la technique de PCR. La Figure 8 illustre un alignement de divers aptamères nucléiques se liant spécifiquement au Facteur ΓΧ IXa humain sélectionnés à la fin d'un cycle de mise en œuvre d'un procédé de type SELEX (i.e. SELEX 6). Les séquences représentées sur la figure 8 sont, du haut vers le bas de la figure, respectivement les séquences SEQ ID N° 132 à SEQ H) N° 134, relatives à la famille d' aptamères désignée « Nonapta 5 ». Les séquences représentées en lettres minuscules en SEQ ID N° 132 correspondent aux séquences complémentaires des « amorces » (ou « primers ») (i.e. SEQ ID N°211 et SEQ ID N°212) utilisées pour l'amplification de l'aptamère de SEQ ID N° 133 par la technique de PCR. Figure 7 illustrates an alignment of various nucleic aptamers specifically binding to the selected human LX / IXa Factor at the end of a run cycle of a SELEX type process (ie SELEX 6). The sequences shown in FIG. 7 are, from the top to the bottom of the figure, respectively the sequences SEQ ID No. 105 to SEQ No. 131, relating to the aptamer family designated "Nonapta 4". The sequences represented in lowercase letters in SEQ ID No. 131 correspond to the complementary sequences of the "primers" (ie, SEQ ID No. 211 and SEQ ID No. 212) used for the amplification of the aptamer of SEQ ID No. 105 by the PCR technique. Figure 8 illustrates an alignment of various nucleic aptamers specifically binding to the selected human ΓΧ IXa Factor at the end of a run cycle of a SELEX type process (ie SELEX 6). The sequences shown in FIG. 8 are, from the top to the bottom of the figure, respectively the sequences SEQ ID No. 132 to SEQ H ) No. 134, relating to the family of aptamers designated "Nonapta 5". The sequences represented in lowercase letters in SEQ ID No. 132 correspond to the complementary sequences of the "primers" (ie, SEQ ID No. 211 and SEQ ID No. 212) used for the amplification of the aptamer of SEQ ID NO: 133 by the PCR technique.
La Figure 9 illustre un alignement de divers aptamères nucléiques se liant spécifiquement au Facteur LX/LXa humain sélectionnés à la fin d'un cycle de mise en œuvre d'un procédé de type SELEX. Les séquences représentées sur la figure 9 sont, du haut vers le bas de la figure, respectivement les séquences SEQ ID N° 135 à 138 relatives à la famille d' aptamères « Nonapta 6 », les séquences SEQ ID N° 139 à 141 relatives à la famille d' aptamères « Nonapta 7 »et les séquences SEQ ID N° 142 et 143 relatives à la famille d' aptamères « Nonapta 8 ». Les séquences représentées en lettres minuscules en SEQ ) N0 135, 136, 137, 139 et 142 correspondent aux séquences complémentaires des « amorces » (ou « primers ») (i.e. SEQ ID N°211 et/ou SEQ ID N°212) utilisées pour l'amplification des aptamères, respectivement, de SEQ ID N° 138 en tout ou partie, 140 et 143 par la technique de PCR. Figure 9 illustrates an alignment of various nucleic aptamers specifically binding to the selected human LX / LXa Factor at the end of a run cycle of a SELEX type process. The sequences represented in FIG. 9 are, from the top to the bottom of the figure, respectively the sequences SEQ ID Nos. 135 to 138 relating to the family of aptamers "Nonapta 6", the sequences SEQ ID Nos. 139 to 141 relating to to the family of "Nonapta 7" aptamers and the sequences SEQ ID Nos. 142 and 143 relating to the family of "Nonapta 8" aptamers. The sequences shown in lower case letters in SEQ) N 0 135, 136, 137, 139 and 142 correspond to the sequences complementary to the "primers" (or "primers") (ie SEQ ID NO: 211 and / or SEQ ID NO: 212) used for the amplification of aptamers, respectively, of SEQ ID No. 138 in whole or in part, 140 and 143 by the PCR technique.
La Figure 10 illustre les courbes de liaison d'un acide nucléique, appartenant à la famille Nonapta 1 (i.e. SEQ ID N° 20 en figure 2) et immobilisé sur un support, au Facteur IX humain plasmatique, dans un essai selon la technique de résonnance plasmomque de surface. En abscisse : le temps, exprimé en secondes; en ordonnées, signal de résonance, exprimé en Unités de résonance arbitraires. Les courbes représentent, du haut vers le bas de la figure, courbe 1 : Nonapta 1 avec FIX humain plasmatique purifié à la concentration de 500 nM ; courbe 2: Nonapta 1 avec FIX humain plasmatique purifié à la concentration de 250 nM.  Figure 10 illustrates the binding curves of a nucleic acid, belonging to the Nonapta family 1 (ie SEQ ID No. 20 in Figure 2) and immobilized on a support, to human plasma Factor IX, in a test according to the technique of Plasmomic surface resonance. On the abscissa: the time, expressed in seconds; ordinate, resonance signal, expressed in arbitrary resonance units. The curves represent, from the top to the bottom of the figure, curve 1: Nonapta 1 with purified human plasma FIX at a concentration of 500 nM; Curve 2: Nonapta 1 with purified human plasma FIX at a concentration of 250 nM.
La Figure 11 illustre les courbes de liaison d'un acide nucléique, appartenant à la famille Nonapta 2 (i.e. SEQ ID N° 23 en figure 3) et immobilisé sur un support, au Facteur IX humain plasmatique, dans un essai selon la technique de résonnance plasmomque de surface. En abscisse : le temps, exprimé en secondes; en ordonnées, signal de résonance, exprimé en Unités de résonance arbitraires. Les courbes représentent, du haut vers le bas de la figure, courbe 1 : Nonapta 2 avec FIX humain plasmatique purifié à la concentration de 500 nM ; courbe 2: Nonapta 2 avec FIX humain plasmatique purifié à la concentration de 250 nM. La Figure 12 illustre les courbes de liaison d'un acide nucléique, appartenant à la famille Nonapta 3 (i.e. SEQ ID N° 67 en figure 5) et immobilisé sur un support, au Facteur IX humain plasmatique, dans un essai selon la technique de résonnance plasmonique de surface. En abscisse : le temps, exprimé en secondes; en ordonnées, signal de résonance, exprimé en Unités de résonance arbitraires. Les courbes représentent, du haut vers le bas de la figure, courbe 1 : Nonapta 3.1 avec FIX humain plasmatique purifié à la concentration de 500 nM ; courbe 2: Nonapta 3.1 avec FIX humain plasmatique purifié à la concentration de 250 nM. FIG. 11 illustrates the binding curves of a nucleic acid, belonging to the Nonapta 2 family (ie SEQ ID No. 23 in FIG. 3) and immobilized on a support, to the plasma human factor IX, in a test according to the technique of Plasmomic surface resonance. On the abscissa: the time, expressed in seconds; ordinate, resonance signal, expressed in arbitrary resonance units. The curves represent, from the top to the bottom of the figure, curve 1: Nonapta 2 with purified human plasma FIX at a concentration of 500 nM; Curve 2: Nonapta 2 with purified human plasma FIX at a concentration of 250 nM. Figure 12 illustrates the binding curves of a nucleic acid, belonging to the Nonapta family 3 (ie SEQ ID No. 67 in Figure 5) and immobilized on a support, to human plasma Factor IX, in a test according to the technique of surface plasmon resonance. On the abscissa: the time, expressed in seconds; ordinate, resonance signal, expressed in arbitrary resonance units. The curves represent, from the top to the bottom of the figure, curve 1: Nonapta 3.1 with purified plasma human FIX at a concentration of 500 nM; Curve 2: Nonapta 3.1 with purified human plasma FIX at a concentration of 250 nM.
La Figure 13 illustre les courbes de liaison d'un acide nucléique, appartenant à la famille Nonapta 5 (i.e. SEQ ID N° 132 en figure 8) et immobilisé sur un support, au Facteur IX humain plasmatique, dans un essai selon la technique de résonnance plasmonique de surface. En abscisse : le temps, exprimé en secondes; en ordonnées, signal de résonance, exprimé en Unités de résonance arbitraires. Les courbes représentent, du haut vers le bas de la figure, courbe 1 : Nonapta 5 avec FIX humain plasmatique purifié à la concentration de 1 000 nM ; courbe 2: Nonapta 5 avec FIX humain plasmatique purifié à la concentration de 500 nM ; courbe 3 : Nonapta 5 avec FIX humain plasmatique purifié à la concentration de 250 nM ; courbe: 4 Nonapta 5 avec FIX humain plasmatique purifié à la concentration de 100 nM.  Figure 13 illustrates the binding curves of a nucleic acid belonging to the Nonapta family (ie, SEQ ID No. 132 in Figure 8) and immobilized on a carrier to human plasma Factor IX in a test according to the method of surface plasmon resonance. On the abscissa: the time, expressed in seconds; ordinate, resonance signal, expressed in arbitrary resonance units. The curves represent, from the top to the bottom of the figure, curve 1: Nonapta 5 with purified human plasma FIX at a concentration of 1000 nM; Curve 2: Nonapta 5 with purified human plasma FIX at the concentration of 500 nM; Curve 3: Nonapta 5 with purified human plasma FIX at the concentration of 250 nM; Curve: 4 Nonapta 5 with purified plasma human FIX at the concentration of 100 nM.
La Figure 14 illustre les courbes de liaison d'un acide nucléique, dérivé de l'aptamère Nonapta 5 (i.e. Nonapta 5.1, SEQ ID N° 133 en figure 8) et immobilisé sur un support, au Facteur IX humain plasmatique, dans un essai selon la technique de résonnance plasmonique de surface. En abscisse : le temps, exprimé en secondes; en ordonnées, signal de résonance, exprimé en Unités de résonance arbitraires. Les courbes représentent, du haut vers le bas de la figure, courbe 1 Nonapta 5.1 avec FIX humain plasmatique purifié à la concentration de 1 000 nM ; courbe 2 Nonapta 5.1 avec FIX humain plasmatique purifié à la concentration de 500 nM ; courbe 3 Nonapta 5.1 avec FIX humain plasmatique purifié à la concentration de 250 nM ; courbe 4 Nonapta 5.1 avec FIX humain plasmatique purifié à la concentration de 100 nM.  Figure 14 illustrates the binding curves of a nucleic acid, derived from Nonapta aptamer 5 (ie, Nonapta 5.1, SEQ ID NO: 133 in Figure 8) and immobilized on a carrier, to human plasma factor IX, in an assay. according to the surface plasmon resonance technique. On the abscissa: the time, expressed in seconds; ordinate, resonance signal, expressed in arbitrary resonance units. The curves represent, from the top to the bottom of the figure, curve 1 Nonapta 5.1 with purified human plasma FIX at a concentration of 1000 nM; Curve 2 Nonapta 5.1 with purified human plasma FIX at the concentration of 500 nM; Curve 3 Nonapta 5.1 with purified human plasma FIX at a concentration of 250 nM; Curve 4 Nonapta 5.1 with purified human plasma FIX at the concentration of 100 nM.
La Figure 15 illustre les courbes de liaison d'un acide nucléique dérivé de l'aptamère Nonapta 5 (i.e. Nonapta 5.7, SEQ ID N° 134, figure 8) et immobilisé sur un support, au Facteur IX humain plasmatique, dans un essai selon la technique de résonnance plasmonique de surface. En abscisse : le temps, exprimé en secondes; en ordonnées, signal de résonance, exprimé en Unités de résonance arbitraires. Les courbes représentent, du haut vers le bas de la figure, courbe 1 Nonapta 5.7 avec FIX humain plasmatique purifié à la concentration de 1 000 nM ; courbe 2 Nonapta 5.7 avec FIX humain plasmatique purifié à la concentration de 500 nM ; courbe 3 Nonapta 5.7 avec FIX humain plasmatique purifié à la concentration de 250 nM ; courbe 4 Nonapta 5.7 avec FIX humain plasmatique purifié à la concentration de 100 nM. Figure 15 illustrates the binding curves of a nucleic acid derived from Nonapta aptamer 5 (ie Nonapta 5.7, SEQ ID NO: 134, Figure 8) and immobilized on a carrier, to human plasma Factor IX, in a test according to the surface plasmon resonance technique. On the abscissa: the time, expressed in seconds; ordinate, resonance signal, expressed in arbitrary resonance units. The curves represent, from the top to the bottom of the figure, curve 1 Nonapta 5.7 with purified human plasma FIX at a concentration of 1000 nM; Curve 2 Nonapta 5.7 with purified plasma human FIX at a concentration of 500 nM; Curve 3 Nonapta 5.7 with human plasma FIX purified at concentration of 250 nM; Curve 4 Nonapta 5.7 with purified human plasma FIX at the concentration of 100 nM.
La Figure 16 illustre les courbes de liaison d'un acide nucléique, appartenant à la famille Nonapta 6 (i.e. SEQ ID N° 135 en figure 9) et immobilisé sur un support, au Facteur IX humain plasmatique, dans un essai selon la technique de résonnance plasmomque de surface. En abscisse : le temps, exprimé en secondes; en ordonnées, signal de résonance, exprimé en Unités de résonance arbitraires. Les courbes représentent, du haut vers le bas de la figure, courbe 1 Nonapta 6 avec FIX humain plasmatique purifié à la concentration de 1 000 nM ; courbe 2 Nonapta 6 avec FLX humain plasmatique purifié à la concentration de 500 nM ; courbe 3 Nonapta 6 avec FLX humain plasmatique purifié à la concentration de 200 nM ; courbe 4 Nonapta 6 avec FIX humain plasmatique purifié à la concentration de 100 nM.  FIG. 16 illustrates the binding curves of a nucleic acid, belonging to the Nonapta 6 family (ie SEQ ID No. 135 in FIG. 9) and immobilized on a support, to human plasma Factor IX in a test according to the technique of Plasmomic surface resonance. On the abscissa: the time, expressed in seconds; ordinate, resonance signal, expressed in arbitrary resonance units. The curves represent, from the top to the bottom of the figure, curve 1 Nonapta 6 with purified human plasma FIX at a concentration of 1000 nM; Curve 2 Nonapta 6 with purified human plasma FLX at a concentration of 500 nM; Curve 3 Nonapta 6 with purified human plasma FLX at a concentration of 200 nM; Curve 4 Nonapta 6 with purified human plasma FIX at the concentration of 100 nM.
La Figure 17 illustre les courbes de liaison d'un acide nucléique dérivé de l'aptamère Nonapta 6 (i.e. Nonapta 6.3, SEQ ID N° 136, figure 9) et immobilisé sur un support, au Facteur IX humain plasmatique, dans un essai selon la technique de résonnance plasmonique de surface. En abscisse : le temps, exprimé en secondes; en ordonnées, signal de résonance, exprimé en Unités de résonance arbitraires. Les courbes représentent, du haut vers le bas de la figure, courbe 1 Nonapta 6.3 avec FIX humain plasmatique purifié à la concentration de 1000 nM ; courbe 2 Nonapta 6.3 avec FIX humain plasmatique purifié à la concentration de 500 nM ; courbe 3 Nonapta 6.3 avec FIX humain plasmatique purifié à la concentration de 250 nM ; courbe 4 Nonapta 6.3 avec FIX humain plasmatique purifié à la concentration de 100 nM.  Figure 17 illustrates the binding curves of nucleic acid derived from Nonapta 6 aptamer (ie Nonapta 6.3, SEQ ID No. 136, Figure 9) and immobilized on a carrier, to human plasma Factor IX, in a test according to the surface plasmon resonance technique. On the abscissa: the time, expressed in seconds; ordinate, resonance signal, expressed in arbitrary resonance units. The curves represent, from the top to the bottom of the figure, Curve 1 Nonapta 6.3 with purified human plasma FIX at a concentration of 1000 nM; Curve 2 Nonapta 6.3 with purified plasma human FIX at 500 nM concentration; Curve 3 Nonapta 6.3 with purified human plasma FIX at a concentration of 250 nM; Curve 4 Nonapta 6.3 with purified plasma human FIX at the concentration of 100 nM.
La Figure 18 illustre les courbes de liaison d'un acide nucléique dérivé de l'aptamère Nonapta 6 (i.e. Nonapta 6.4, SEQ ID N° 137, figure 9) et immobilisé sur un support, au Facteur IX humain plasmatique, dans un essai selon la technique de résonnance plasmonique de surface. En abscisse : le temps, exprimé en secondes; en ordonnées, signal de résonance, exprimé en Unités de résonance arbitraires. Les courbes représentent, du haut vers le bas de la figure, courbe 1 Nonapta 6.4 avec FIX humain plasmatique purifié à la concentration de 1 000 nM ; courbe 2 Nonapta 6.4 avec FIX humain plasmatique purifié à la concentration de 500 nM ; courbe 3 Nonapta 6.4 avec FIX humain plasmatique purifié à la concentration de 250 nM ; courbe 4 Nonapta 6.4 avec FLX humain plasmatique purifié à la concentration de 100 nM.  Figure 18 illustrates the binding curves of a nucleic acid derived from Nonapta 6 aptamer (ie, Nonapta 6.4, SEQ ID NO: 137, Figure 9) and immobilized on a carrier, to human plasma Factor IX, in a test according to the surface plasmon resonance technique. On the abscissa: the time, expressed in seconds; ordinate, resonance signal, expressed in arbitrary resonance units. The curves represent, from the top to the bottom of the figure, curve 1 Nonapta 6.4 with purified human plasma FIX at a concentration of 1000 nM; curve 2 Nonapta 6.4 with purified human plasma FIX at a concentration of 500 nM; curve 3 Nonapta 6.4 with purified plasma human FIX at a concentration of 250 nM; Curve 4 Nonapta 6.4 with purified human plasma FLX at the concentration of 100 nM.
La Figure 19 illustre les courbes de liaison d'un acide nucléique, appartenant à la famille Nonapta 7 (i.e. SEQ ) N° 139, figure 9) et immobilisé sur un support, au Facteur IX humain plasmatique, dans un essai selon la technique de résonnance plasmonique de surface. En abscisse : le temps, exprimé en secondes; en ordonnées, signal de résonance, exprimé en Unités de résonance arbitraires. Les courbes représentent, du haut vers le bas de la figure, courbe 1 Nonapta 7 avec FIX humain plasmatique purifié à la concentration de 1 000 nM ; courbe 2 Nonapta 7 avec FIX humain plasmatique purifié à la concentration de 500 nM ; courbe 3 Nonapta 7 avec FIX humain plasmatique purifié à la concentration de 250 nM ; courbe 4 Nonapta 7 avec FIX humain plasmatique purifié à la concentration de 100 nM. FIG. 19 illustrates the binding curves of a nucleic acid, belonging to the Nonapta 7 (ie SEQ ) No. 139, FIG. 9) family and immobilized on a support, to human plasma Factor IX, in a test according to the method of FIG. surface plasmon resonance. On the abscissa: the time, expressed in seconds; ordinate, resonance signal, expressed in arbitrary resonance units. The curves represent, from the top to the bottom of the figure, Curve 1 Nonapta 7 with purified human plasma FIX at a concentration of 1000 nM; Curve 2 Nonapta 7 with purified human plasma FIX at a concentration of 500 nM; Curve 3 Nonapta 7 with purified human plasma FIX at a concentration of 250 nM; Curve 4 Nonapta 7 with purified human plasma FIX at the concentration of 100 nM.
La Figure 20 illustre les courbes de liaison d'un acide nucléique, appartenant à la famille Nonapta 8 (i.e. SEQ JD N° 142, figure 9) et immobilisé sur un support, au Facteur IX humain plasmatique, dans un essai selon la technique de résonnance plasmonique de surface. En abscisse : le temps, exprimé en secondes; en ordonnées, signal de résonance, exprimé en Unités de résonance arbitraires. Les courbes représentent, du haut vers le bas de la figure, courbe 1 Nonapta 8 avec FIX humain plasmatique purifié à la concentration de 500 nM ; courbe 2 Nonapta 8 avec FIX humain plasmatique purifié à la concentration de 250 nM.  FIG. 20 illustrates the binding curves of a nucleic acid, belonging to the Nonapta 8 family (ie SEQ JD No. 142, FIG. 9) and immobilized on a support, to human plasma Factor IX, in a test according to the technique of surface plasmon resonance. On the abscissa: the time, expressed in seconds; ordinate, resonance signal, expressed in arbitrary resonance units. The curves represent, from the top to the bottom of the figure, Curve 1 Nonapta 8 with purified human plasma FIX at a concentration of 500 nM; Curve 2 Nonapta 8 with purified human plasma FIX at a concentration of 250 nM.
La Figure 21 représente un profil de purification par chromatographie d'affinité d'une composition de Facteur IX humain (produit Betafact® commercialisé par la société LFB, France). En abscisse : le temps, exprimé en minutes. En ordonnées: les valeurs de mesure de l'absorbance à 280 nm, exprimées en Unités Arbitraires (mAU). Sur la courbe, l'inj ection du Facteur IX humain est réalisée au temps 0. Sur la courbe, « 1 » correspond à la fraction non retenue, « 2 » correspond à la fraction liée de manière non-spécifique et éliminée au cours de l'étape de lavage, « 3 » correspond au pic de la fraction d'élution.  Figure 21 represents a purification profile by affinity chromatography of a composition of human factor IX (Betafact® product marketed by LFB, France). On the abscissa: the time, expressed in minutes. On the ordinate: the measurement values of the absorbance at 280 nm, expressed in Arbitrary Units (mAU). On the curve, the injection of human factor IX is performed at time 0. On the curve, "1" corresponds to the fraction not retained, "2" corresponds to the non-specifically bound fraction and eliminated during the washing step, "3" corresponds to the peak of the elution fraction.
La Figure 22 représente le cliché d'un gel d'électrophorèse SDS PAGE dans lequel les pistes n° l et Γ correspondent au produit de départ de Facteur IX Betafact®, les pistes n°2 et 2' correspondent à la fraction du produit de départ qui n'a pas été retenue sur la colonne et les pistes n°3 et 3 ' correspondent à la fraction d'élution.  FIG. 22 represents the image of an SDS PAGE electrophoresis gel in which lanes # 1 and # correspond to the Betafact® Factor IX starting material, lanes # 2 and 2 'correspond to the fraction of the product of departure which was not retained on the column and tracks 3 and 3 'correspond to the elution fraction.
La Figure 23 illustre un alignement de divers aptamères nucléiques se liant spécifiquement au Facteur ΓΧ IXa humain sélectionnés à la fin d'un cycle de mise en œuvre d'un procédé de type SELEX. Les séquences représentées sur la figure 23 sont, du haut vers le bas de la figure, respectivement les séquences SEQ ID N° 149 à SEQ ) N° 161 et SEQ JD N° 199 à SEQ JD N° 200, relatives à la famille d' aptamères désignée « Nonapta 9 ». Les séquences représentées en lettres minuscules en séquences SEQ JD N° 199 et SEQ JD N° 200 correspondent aux séquences complémentaires des « amorces » (ou « primers ») (i.e. SEQ JD N°213 et SEQ ID N°214) utilisées pour l'amplification des aptamères, respectivement, de séquences SEQ ID N° 152 et de SEQ ID N° 157 par la technique de PCR. La Figure 24 illustre un alignement de divers aptamères nucléiques se liant spécifiquement au Facteur ΓΧ IXa humain sélectionnés à la fin d'un cycle de mise en œuvre d'un procédé de type SELEX. Les séquences représentées sur la figure 24 sont, du haut vers le bas de la figure, respectivement les séquences SEQ ID N° 162 à SEQ JD N° 167 et SEQ ID N° 201 , relatives à la famille d'aptamères désignée « Nonapta 10 ». Les séquences représentées en lettres minuscules en séquence SEQ ID N° 201 correspondent aux séquences complémentaires des « amorces » (ou « primers ») (î.e. SEQ ID N°213 et SEQ ID N°214) utilisées pour l'amplification de l'aptamère SEQ ID N° 163 par la technique de PCR. Figure 23 illustrates an alignment of various nucleic aptamers specifically binding to the selected human ΓΧ IXa Factor at the end of a run cycle of a SELEX type process. The sequences shown in FIG. 23 are, from the top to the bottom of the figure, respectively the sequences SEQ ID No. 149 to SEQ No. 161 and SEQ ID No. 199 to SEQ ID No. 200, relating to the family. aptamere designated "Nonapta 9". The sequences represented in lowercase letters in sequences SEQ ID No. 199 and SEQ ID No. 200 correspond to the complementary sequences of the "primers" (or "primers") (ie SEQ JD No. 213 and SEQ ID No. 214) used for the first time. amplification of aptamers, respectively, of SEQ ID No. 152 and SEQ ID No. 157 by the PCR technique. Figure 24 illustrates an alignment of various nucleic aptamers specifically binding to the selected Human IXa Factor at the end of a run cycle of a SELEX type process. The sequences shown in FIG. 24 are, from the top to the bottom of the figure, respectively the sequences SEQ ID No. 162 to SEQ ID No. 167 and SEQ ID No. 201, relating to the aptamer family designated "Nonapta 10. ". The sequences represented in lowercase letters in sequence SEQ ID No. 201 correspond to the complementary sequences of the "primers" (e.e. SEQ ID No. 213 and SEQ ID No. 214) used for the amplification of aptamer SEQ ID No. 163 by the PCR technique.
La Figure 25 illustre un alignement de divers aptamères nucléiques se liant spécifiquement au Facteur LX/LXa humain sélectionnés à la fin d'un cycle de mise en œuvre d'un procédé de type SELEX. Les séquences représentées sur la figure 25 sont, du haut vers le bas de la figure, respectivement les séquences SEQ ID N° 168 à SEQ ) N° 172 et SEQ ID N° 202 à SEQ JD N° 206, relatives à la famille d'aptamères désignée « Nonapta 1 1 ». Les séquences représentées en lettres minuscules en séquences SEQ ID N° 202 à SEQ JD N° 206 correspondent aux séquences complémentaires des « amorces » (ou « primers ») (î.e. SEQ JD N°213 et SEQ ID N°214) utilisées pour l'amplification des aptamères, respectivement, de SEQ JD N°168, SEQ ID N° 169, SEQ ID N° 172, SEQ ID N° 170, et SEQ ID N° 171 par la technique de PCR.  Figure 25 illustrates an alignment of various nucleic aptamers specifically binding to the selected human LX / LXa Factor at the end of a run cycle of a SELEX type process. The sequences shown in FIG. 25 are, from the top to the bottom of the figure, the sequences SEQ ID No. 168 to SEQ ID No. 172 and SEQ ID No. 202 to SEQ ID No. 206 respectively, relating to the family. aptamere designated "Nonapta 1 1". The sequences represented in lowercase letters in sequences SEQ ID No. 202 to SEQ ID No. 206 correspond to the complementary sequences of the "primers" (or "primers") (SEQ JD No. 213 and SEQ ID No. 214). used for the amplification of aptamers, respectively, of SEQ ID No. 168, SEQ ID No. 169, SEQ ID No. 172, SEQ ID No. 170, and SEQ ID No. 171 by the PCR technique.
La Figure 26 illustre un alignement de divers aptamères nucléiques se liant spécifiquement au Facteur JX/JXa humain sélectionnés à la fin d'un cycle de mise en œuvre d'un procédé de type SELEX. Les séquences représentées sur la figure 26 sont, du haut vers le bas de la figure, respectivement les séquences SEQ ID N° 173 à SEQ K) N0 186 et SEQ ) N0 215, relatives à la famille d'aptamères désignée « Nonapta 12 ». Les séquences représentées en lettres minuscules en séquence SEQ ID N° 215 correspondent aux séquences complémentaires des « amorces » (ou « primers ») (i.e. SEQ ID N°213 et SEQ ID N°214) utilisées pour l'amplification de l'aptamère SEQ ID N° 173 par la technique de PCR. Figure 26 illustrates an alignment of various nucleic aptamers specifically binding to the selected human JX / JXa factor at the end of a run cycle of a SELEX type process. The sequences shown in FIG. 26 are, from top to bottom of the figure, respectively the sequences SEQ ID No. 173 to SEQ K) N 0 186 and SEQ ) N 0 215, relating to the aptamer family designated "Nonapta". 12 ". The sequences represented in lowercase letters in sequence SEQ ID No. 215 correspond to the complementary sequences of the "primers" (or "primers") (ie SEQ ID No. 213 and SEQ ID No. 214) used for the amplification of the aptamer SEQ ID No. 173 by the PCR technique.
La Figure 27 illustre un alignement de divers aptamères nucléiques se liant spécifiquement au Facteur JX/JXa humain sélectionnés à la fin d'un cycle de mise en œuvre d'un procédé de type SELEX. Les séquences représentées sur la figure 27 sont, du haut vers le bas de la figure, respectivement les séquences SEQ ID N° 187 à SEQ ) N0 188 et SEQ ID N°207, relatives à la famille d'aptamères désignée « Nonapta 13 ». Les séquences représentées en lettres minuscules en séquence SEQ ID N°207 correspondent aux séquences complémentaires des « amorces » (ou « primers ») (i.e. SEQ ID N°213 et SEQ ID N°214) utilisées pour l'amplification de l'aptamère de SEQ ID N° 187 par la technique de PCR. La Figure 28 illustre un alignement de divers aptamères nucléiques se liant spécifiquement au Facteur ΓΧ IXa humain sélectionnés à la fin d'un cycle de mise en œuvre d'un procédé de type SELEX. Les séquences représentées sur la figure 28 sont, du haut vers le bas de la figure, respectivement les séquences SEQ ID N° 189 à SEQ ) N0 198 et SEQ JD N°208 à SEQ H) N° 210. Les séquences représentées en lettres minuscules en séquences SEQ K) N°208 à SEQ ) N° 210 correspondent aux séquences complémentaires des « amorces » (ou « primers ») (i.e. SEQ ID N°213 et SEQ ID N°214) utilisées pour l'amplification des aptamères, respectivement, de SEQ ID N°197, SEQ ID N°198 et SEQ JD N° 196 par la technique de PCR. Figure 27 illustrates an alignment of various nucleic aptamers specifically binding to the selected human JX / JXa Factor at the end of a run cycle of a SELEX type process. The sequences shown in Figure 27 are, from top to bottom of the figure, respectively the sequences SEQ ID N ° 187 to SEQ) NO 0188 and SEQ ID NO: 207, for the aptamer family designated "Nonapta 13 ". The sequences represented in lowercase letters in sequence SEQ ID No. 207 correspond to the complementary sequences of the "primers" (or "primers") (ie SEQ ID No. 213 and SEQ ID No. 214) used for the amplification of the aptamer of SEQ ID No. 187 by the PCR technique. Figure 28 illustrates an alignment of various nucleic aptamers specifically binding to the selected human ΓΧ IXa Factor at the end of a run cycle of a SELEX type process. The sequences shown in Figure 28 are, from top to bottom of the figure, respectively the sequences SEQ ID N ° 189 to SEQ) NO 0198 and SEQ JD No. 208 to SEQ H) No. 210. The sequences shown in lower case letters SEQ K) No. 208 to SEQ) No. 210 correspond to the complementary sequences of the "primers" (ie, SEQ ID NO: 213 and SEQ ID NO: 214) used for the amplification of aptamers, respectively, of SEQ ID No. 197, SEQ ID No. 198 and SEQ ID No. 196 by the PCR technique.
La Figure 29 illustre les courbes de liaison d'acides nucléiques mises en œuvre à une concentration de 1 μΜ au Facteur IX humain purifié immobilisé sur un support, dans un essai selon la technique de résonnance plasmomque de surface. En abscisse : le temps, exprimé en secondes; en ordonnées, signal de résonance, exprimé en Unités de résonance arbitraires. Les courbes représentent, du haut vers le bas de la figure, les résultats obtenus avec les acides nucléiques de séquences SEQ ID N° 173 (=courbe 1), SEQ ID N° 186 (=courbe 2), SEQ ID N° 168 (=courbe 3), SEQ JD N°180 (=courbe 4), SEQ ID N° 152 (=courbe 5), SEQ ID N°181 (=courbe 6), SEQ ID N° 196 (=courbe 7) et SEQ ID N° 187 (=courbe 8).  Figure 29 illustrates the nucleic acid binding curves implemented at a concentration of 1 μΜ to the purified human Factor IX human immobilized on a support, in a test according to the surface plasmomic resonance technique. On the abscissa: the time, expressed in seconds; ordinate, resonance signal, expressed in arbitrary resonance units. The curves represent, from the top to the bottom of the figure, the results obtained with the nucleic acids of sequences SEQ ID No. 173 (= curve 1), SEQ ID No. 186 (= curve 2), SEQ ID No. 168 ( = curve 3), SEQ ID No. 180 (= curve 4), SEQ ID No. 152 (= curve 5), SEQ ID No. 181 (= curve 6), SEQ ID No. 196 (= curve 7) and SEQ ID NO: 187 (= curve 8).
La Figure 30 illustre les courbes de liaison du Facteur IX humain mis en œuvre à différentes concentrations à l'acide nucléique de séquence SEQ ID N° 215 immobilisé sur un support, dans un essai selon la technique de résonnance plasmonique de surface. En abscisse : le temps, exprimé en secondes; en ordonnées, signal de résonance, exprimé en Unités de résonance arbitraires. Les courbes représentent, du haut vers le bas de la figure, courbe 1 SEQ JD N° 215 avec FIX humain purifié à la concentration de 2000 nM ; courbe 2 SEQ JD N° 215 avec FIX humain purifié à la concentration de 1000 nM ; courbe 3 SEQ JD N° 215 avec FIX humain purifié à la concentration de 500 nM ; courbe 4 SEQ ID N° 215 avec FIX humain purifié à la concentration de 250 nM.  Figure 30 illustrates the binding curves of human Factor IX used at different nucleic acid concentrations of sequence SEQ ID No. 215 immobilized on a support, in a test according to the technique of surface plasmon resonance. On the abscissa: the time, expressed in seconds; ordinate, resonance signal, expressed in arbitrary resonance units. The curves represent, from the top to the bottom of the figure, curve 1 SEQ ID No. 215 with purified human FIX at a concentration of 2000 nM; curve 2 SEQ ID No. 215 with purified human FIX at a concentration of 1000 nM; curve 3 SEQ ID No. 215 with purified human FIX at a concentration of 500 nM; curve 4 SEQ ID No. 215 with purified human FIX at the concentration of 250 nM.
La Figure 31 illustre les courbes de liaison du Facteur IX humain mis en œuvre à différentes concentrations à l'acide nucléique de séquence SEQ ID N° 202 immobilisé sur un support, dans un essai selon la technique de résonnance plasmonique de surface. En abscisse : le temps, exprimé en secondes; en ordonnées, signal de résonance, exprimé en Unités de résonance arbitraires. Les courbes représentent, du haut vers le bas de la figure, courbe 1 SEQ JD N° 202 avec FIX humain purifié à la concentration de 2000 nM ; courbe 2 SEQ JD N° 202 avec FIX humain purifié à la concentration de 1000 nM ; courbe 3 SEQ ) Ν° 202 avec FIX humain purifié à la concentration de 500 nM ; courbe 4 SEQ ID N° 202 avec FIX humain purifié à la concentration de 250 nM. Figure 31 illustrates the binding curves of human Factor IX used at different nucleic acid concentrations of sequence SEQ ID NO: 202 immobilized on a support, in a test according to the technique of surface plasmon resonance. On the abscissa: the time, expressed in seconds; ordinate, resonance signal, expressed in arbitrary resonance units. The curves represent, from the top to the bottom of the figure, curve 1 SEQ ID No. 202 with purified human FIX at a concentration of 2000 nM; curve 2 SEQ ID No. 202 with purified human FIX at a concentration of 1000 nM; curve 3 SEQ) Ν 202 with purified human FIX at a concentration of 500 nM; curve 4 SEQ ID No. 202 with purified human FIX at a concentration of 250 nM.
La Figure 32 illustre les courbes de liaison du Facteur IX humain mis en œuvre à une concentration de 2000 nM à l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°202 immobilisé sur un support, dans un essai selon la technique de résonance plasmonique de surface. En abscisse : le temps, exprimé en secondes; en ordonnées, signal de résonance, exprimé en Unités de résonance arbitraires. Les courbes représentent, du haut vers le bas de la figure, courbe 1 avec le facteur IX recombinant, courbe 2 avec le facteur IX plasmatique et courbe 3 avec le contrôle M5SB.  Figure 32 illustrates the binding curves of human Factor IX implemented at a concentration of 2000 nM to the nucleic acid of sequence SEQ ID No. 202 immobilized on a support, in a test according to the technique of surface plasmon resonance. On the abscissa: the time, expressed in seconds; ordinate, resonance signal, expressed in arbitrary resonance units. The curves represent, from the top to the bottom of the figure, curve 1 with the recombinant factor IX, curve 2 with the plasma factor IX and curve 3 with the M5SB control.
La Figure 33 illustre les courbes de liaison du Facteur IX humain mis en œuvre à une concentration de 2000 nM à l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°203 immobilisé sur un support, dans un essai selon la technique de résonance plasmonique de surface. En abscisse : le temps, exprimé en secondes; en ordonnées, signal de résonance, exprimé en Unités de résonance arbitraires. Les courbes représentent, du haut vers le bas de la figure, courbe 1 avec le facteur IX recombinant, courbe 2 avec le facteur IX plasmatique et courbe 3 avec le contrôle M5SB.  Figure 33 illustrates the binding curves of human Factor IX implemented at a concentration of 2000 nM to the nucleic acid of sequence SEQ ID No. 203 immobilized on a support, in a test according to the technique of surface plasmon resonance. On the abscissa: the time, expressed in seconds; ordinate, resonance signal, expressed in arbitrary resonance units. The curves represent, from the top to the bottom of the figure, curve 1 with the recombinant factor IX, curve 2 with the plasma factor IX and curve 3 with the M5SB control.
La Figure 34 illustre les courbes de liaison du Facteur IX humain mis en œuvre à une concentration de 2000 nM à l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°206 immobilisé sur un support, dans un essai selon la technique de résonance plasmonique de surface. En abscisse : le temps, exprimé en secondes; en ordonnées, signal de résonance, exprimé en Unités de résonance arbitraires. Les courbes représentent, du haut vers le bas de la figure, courbe 1 avec le facteur IX recombinant, courbe 2 avec le facteur IX plasmatique et courbe 3 avec le contrôle M5SB.  Figure 34 illustrates the binding curves of human Factor IX implemented at a concentration of 2000 nM to the nucleic acid of sequence SEQ ID No. 206 immobilized on a support, in a test according to the surface plasmon resonance technique. On the abscissa: the time, expressed in seconds; ordinate, resonance signal, expressed in arbitrary resonance units. The curves represent, from the top to the bottom of the figure, curve 1 with the recombinant factor IX, curve 2 with the plasma factor IX and curve 3 with the M5SB control.
La Figure 35 représente un cliché d'une migration sur gel d'électrophorèse de différentes fractions issues d'une chromatographie réalisée avec un gel streptavidine. Les pistes n°l et 8 correspondent au marqueur Markl2™ Standard (entre 0,78 et lmg/ml), la piste 2 correspond au produit de départ de Facteur IX Betafact®, les pistes n°3 à 7 correspondent aux résultats de purification du facteur IX à partir du produit de départ (i.e. Betafact®) obtenus avec les acides nucléiques, respectivement, de séquences SEQ ID N°202 (=piste n°3), SEQ ID N°204 (=piste n°4), SEQ ID N°206 (=piste n°5), SEQ ID N°207 (=piste n°6) et SEQ ID N° 134 (=piste n°7), et la piste n°9 correspond au témoin, figuré par du facteur LX plasmatique.  Figure 35 is a schematic of an electrophoretic gel migration of different fractions from chromatography with a streptavidin gel. Lanes 1 and 8 correspond to Markl2 ™ Standard marker (between 0.78 and lmg / ml), lane 2 corresponds to Betafact® Factor IX starting material, lanes 3 to 7 correspond to purification results. factor IX from the starting material (ie Betafact®) obtained with nucleic acids, respectively, of SEQ ID NO: 202 (= lane no. 3), SEQ ID NO: 204 (= lane no. 4), SEQ ID No. 206 (= Track No. 5), SEQ ID No. 207 (= Track No. 6) and SEQ ID No. 134 (= Track No. 7), and Track No. 9 corresponds to the witness, figured by plasma factor LX.
La Figure 36 représente un cliché d'une migration sur gel d'électrophorèse de différentes fractions issues d'une chromatographie réalisée avec un gel HS-sépharose activée. Les pistes n°l et 5 correspondent au marqueur Markl2™ Standard (entre 0,78 et lmg/ml), la piste 2 correspond au produit de départ de Facteur IX Betafact®, la piste n°3 correspond à la fraction du produit de départ qui n'a pas été retenue sur la colonne et la piste n°4 correspond au résultat de purification du facteur IX à partir du produit de départ (i.e. Betafact®) obtenus avec l'acide nucléiques de séquence SEQ JD N°202. Figure 36 is a schematic of an electrophoretic gel migration of different fractions from chromatography performed with an activated HS-Sepharose gel. Tracks 1 and 5 correspond to the Markl2 ™ Standard marker (between 0.78 and 1 mg / ml), the lane 2 corresponds to the starting product of Factor IX Betafact®, lane No. 3 corresponds to the fraction of the starting product which was not retained on the column and lane No. 4 corresponds to the result of purification of factor IX from the starting product (ie Betafact®) obtained with the nucleic acid sequence SEQ JD No. 202.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION  DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Il est fourni selon l'invention de nouveaux outils aptes à se lier de manière spécifique au Facteur ΓΧ/IXa humain, de taille réduite, faciles et peu onéreux à synthétiser, et qui peuvent être employés dans tous les domaines d'application dans lesquels de tels outils sont utiles, y compris pour la purification du Facteur IX/IXa humain, pour la détection du Facteur IX/IXa humain et pour l'utilisation en tant que principe actif de médicaments destinés à la prévention ou au traitement des troubles de la coagulation.  It is provided according to the invention new tools able to bind specifically to human factor ΓΧ / IXa, reduced in size, easy and inexpensive to synthesize, and which can be used in all areas of application in which such tools are useful, including for the purification of human factor IX / IXa, for the detection of human factor IX / IXa and for the use as an active ingredient of medicaments for the prevention or treatment of coagulation disorders .
Plus précisément, la demanderesse a obtenu une collection d'acides nucléiques monobrins aptes à se lier de manière spécifique au Facteur IX/IXa humain, lesquels acides nucléiques sont décrits plus loin dans la présente description.  More specifically, the Applicant has obtained a collection of single-stranded nucleic acids capable of binding specifically to the human factor IX / IXa, which nucleic acids are described later in the present description.
Comme cela sera détaillé plus loin, la famille d'acides nucléiques de l'invention, qui sont aptes à se lier de manière spécifique au Facteur IX/IXa humain, consistent en des acides nucléiques simple brin, préférentiellement de type ADN, que le demandeur pense être capables d'adopter des conformations dans l'espace qui contribuent à leur conférer leurs propriétés de liaison au Facteur IX/IXa précitées. De manière générique, les acides nucléiques de l'invention peuvent aussi être appelés « aptamères » nucléotidiques, en référence à un terme couramment utilisé par l'homme du métier pour désigner ce type de molécules.  As will be detailed below, the family of nucleic acids of the invention, which are able to bind specifically to human factor IX / IXa, consist of single-stranded nucleic acids, preferably of the DNA type, that the applicant thinks to be able to adopt conformations in space which contribute to confer to them their Factor IX / IXa binding properties mentioned above. Generically, the nucleic acids of the invention may also be called "aptamers" nucleotides, with reference to a term commonly used by those skilled in the art to designate this type of molecules.
On connaît déjà dans l'état de la technique des aptamères nucléiques capables de se lier à diverses protéines impliquées dans la voie de la coagulation sanguine, y compris des aptamères liant le Facteur de Willebrand (Demande PCT n° WO 2008/150495), des aptamères liant l'alpha-thrombine (demande de brevet euopéen n° EP 1 972 693) ou la thrombine (Zhao et al., 2008, Anal Chem, Vol. 80(19) : 7586-7593), des aptamères liant le Facteur IX/IXa (Subash et al., 2006, Thromb Haemost, Vol. 95 : 767-771; Howard et al , 2007, Athenoscl Thromb Vase Biol, Vol. 27 : 722-727; Demande PCT n° WO 2002/096926; Brevet aux Etats- Unis n° US 7,312,325), des aptamères liant le Facteur X/Xa (Demande PCT n° WO 2002/096926; Brevet aux Etats-Unis n° US 7,312,325), des aptamères nucléiques se liant au facteur VII/VIIa humain (Rusconi et al., 2000, Thromb Haemost, Vol. 84(5) : 841-848; Layzer et al., 2007, Spring, Vol. 17 : 1-11).  Nucleic aptamers capable of binding to various proteins involved in the blood coagulation pathway, including Willebrand factor binding aptamers (PCT Application No. WO 2008/150495), are already known in the art. aptamers binding alpha-thrombin (European Patent Application No. EP 1,972,693) or thrombin (Zhao et al., 2008, Anal Chem, Vol 80 (19): 7586-7593), aptamers binding the factor IX / IXa (Subash et al., 2006, Thromb Haemost, Vol 95: 767-771, Howard et al., 2007, Athenoscl Thromb Biol Vase, Vol 27: 722-727, PCT Application No. WO 2002/096926; U.S. Patent No. 7,312,325), Factor X / Xa-binding aptamers (PCT Application No. WO 2002/096926, US Patent No. US 7,312,325), Factor VII / VIIa-binding nucleic aptamers. Human (Rusconi et al., 2000, Thromb Haemost, Vol 84 (5): 841-848, Layzer et al., 2007, Spring, Vol 17: 1-11).
La présente invention a pour objet un acide nucléique se liant spécifiquement au Facteur IX/IXa humain. Dans la présente description, un acide nucléique simple brin se liant spécifiquement au Facteur ΓΧ IXa humain peut aussi être désigné « aptamère nucléique », « aptamère », « aptamère se liant au Facteur IX/IXa humain » ou encore « aptamère anti- FIX/FIXa humain ». The present invention relates to a nucleic acid specifically binding to human factor IX / IXa. In the present disclosure, a single-stranded nucleic acid specifically binding to human Factor ΓΧ IXa can also be referred to as "nucleic aptamer", "aptamer", "Human Factor IX / IXa binding aptamer" or "anti-FIX aptamer". FIXa human ".
Par Facteur ΓΧ IXa humain, on englobe un Facteur IX/IXa humain naturel (i.e. d'origine plasmatique) et un Facteur IX/IXa humain recombinant. Au sens de la présente description, un Facteur IX/IXa humain est considéré en référence à sa séquence en acides aminés, c'est-à-dire indépendamment du fait que la protéine soit glycosylée ou non glycosylée, et, si la protéine est glycosylée, quel que soit le type de glycosylation.  By human ΓΧ IXa factor, a natural human factor IX / IXa (i.e. of plasma origin) and a recombinant human factor IX / IXa are included. For the purposes of the present description, a human factor IX / IXa is considered with reference to its amino acid sequence, that is to say regardless of whether the protein is glycosylated or non-glycosylated, and, if the protein is glycosylated , regardless of the type of glycosylation.
La demanderesse a isolé des familles d'aptamères nucléiques se liant spécifiquement au Facteur IX/IXa humain dont elle a pu montrer l'existence de relations entre (1) les caractéristiques structurelles communes et (11) la ou les caractéristiques fonctionnelles communes.  The Applicant has isolated families of nucleic aptamers specifically binding to human factor IX / IXa, the existence of which has been shown to exist between (1) the common structural features and (11) the common functional characteristic (s).
Ainsi, un acide nucléique, ou aptamère nucléique selon l'invention, se liant spécifiquement au Facteur IX/IXa humain peut être choisi parmi :  Thus, a nucleic acid, or nucleic aptamer according to the invention, specifically binding to human factor IX / IXa may be chosen from:
- un acide nucléique de formule (I) suivante :  a nucleic acid of formula (I) below:
[5'-TERl]m - [SEQ ID N°X] - [3'-TERl]„ (I), [5'-TER1] m - [SEQ ID NO: X] - [3'-TER1] "(I),
dans laquelle :  in which :
- « [5'-TERl]m » représente un acide nucléique comprenant entre 1 et 50 nucléotides, de préférence entre 1 et 32 nucléotides, "[5'-TER1] m " represents a nucleic acid comprising between 1 and 50 nucleotides, preferably between 1 and 32 nucleotides,
- « [3 '-TERl]n » représente un acide nucléique comprenant entre 1 et 50 nucléotides, de préférence entre 1 et 40 nucléotides, "[3'-TER1] n " represents a nucleic acid comprising between 1 and 50 nucleotides, preferably between 1 and 40 nucleotides,
- m est un entier égal à 0 ou 1 ,  m is an integer equal to 0 or 1,
- n est un entier égal à 0 ou 1, et  n is an integer equal to 0 or 1, and
- « [SEQ ID N° X] » consiste en un acide nucléique possédant au moins 80 % d'identité en nucléotides avec un acide nucléique choisi dans le groupe constitué des acides nucléiques de séquences SEQ ID N° 146, SEQ ID N° 5, SEQ ID N° 6, SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2, SEQ ID N0 3, SEQ K) N° 4, SEQ ID N° 7, SEQ ID N° 8, SEQ ID N° 144, SEQ ID N° 145, SEQ ID N° 147 et SEQ K) N° 148 ; et "[SEQ ID NO: X]" is a nucleic acid having at least 80% nucleotide identity with a nucleic acid selected from the group consisting of nucleic acids of sequences SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 5 , SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 147 and SEQ ID NO: 148; and
- un acide nucléique possédant au moins 80 % d'identité en nucléotides avec un acide nucléique choisi dans le groupe constitué des acides nucléiques de séquences SEQ ID N°189, SEQ K) N°190, SEQ ID N°191, SEQ ID N°192, SEQ ID N°193, SEQ ID N°194, SEQ K) N°195, SEQ ID N°196, SEQ ID N°197, SEQ ID N°198, SEQ ID N°208, SEQ ID N°209 et SEQ ID N°210. Dans certains modes de réalisation, l'acide nucléique de séquence SEQ ID N° X a une longueur de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 nucléotides. a nucleic acid having at least 80% nucleotide identity with a nucleic acid selected from the group consisting of the nucleic acids of sequences SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 191, SEQ ID N # 192, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO. 209 and SEQ ID No. 210. In some embodiments, the nucleic acid of SEQ ID NO: X is 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 in length. , 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 nucleotides.
Selon un mode de réalisation préféré, l'acide nucléique de séquence SEQ ID N° X a une longueur de 12 à 24 nucléotides de longueur, de préférence de 15 ou 16 nucléotides de longueur.  According to a preferred embodiment, the nucleic acid of sequence SEQ ID No. X is 12 to 24 nucleotides in length, preferably 15 or 16 nucleotides in length.
Dans certains modes de réalisation, les entiers « m » et « n » sont tous les deux égaux à 0, et l'acide nucléique de formule (I) est un acide nucléique de formule (IA) suivante :  In some embodiments, the "m" and "n" integers are both 0, and the nucleic acid of formula (I) is a nucleic acid of the following formula (IA):
[SEQ ID N° X] (IA),  [SEQ ID NO: X] (IA),
dans laquelle [SEQ Π N° X] a la même signification que pour l'acide nucléique de formule (I).  wherein [SEQ Π NO X] has the same meaning as for the nucleic acid of formula (I).
Dans certains modes de réalisation, l'entier m est égal à 1 et l'entier n est égal à 0, et l'acide nucléique de formule (I) est un acide nucléique de formule (IB) suivante :  In some embodiments, the integer m is 1 and the integer n is 0, and the nucleic acid of formula (I) is a nucleic acid of the following formula (IB):
[5'-TERl]m - [SEQ ID N° X] (IB), [5'-TER1] m - [SEQ ID NO: X] (IB),
dans laquelle [5'-TERl] et [SEQ ID N° X] ont la même signification que pour l'acide nucléique de formule (I).  in which [5'-TERl] and [SEQ ID No. X] have the same meaning as for the nucleic acid of formula (I).
Dans certains modes de réalisation, l'entier m est égal à 0 et l'entier n est égal à 1 , et l'acide nucléique de formule (I) est un acide nucléique de formule (IC) suivante :  In some embodiments, the integer m is 0 and the integer n is 1, and the nucleic acid of formula (I) is a nucleic acid of the following formula (IC):
[SEQ ID N° X] - [3'-TERl]n (IB), [SEQ ID NO: X] - [3'-TER1] n (IB),
dans laquelle [3 '-TERl] et [SEQ ID N° X] ont la même signification que pour l'acide nucléique de formule (I).  in which [3 '-TER1] and [SEQ ID No. X] have the same meaning as for the nucleic acid of formula (I).
Dans certains modes de réalisation, l'acide nucléique « 5'-TERl », lorsqu'il est présent, a une longueur de 0, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 nucléotides, ce qui englobe les acides nucléiques possédant exactement chacune des longueurs spécifiées.  In some embodiments, the "5'-TER1" nucleic acid, when present, has a length of 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 , 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 or 50 nucleotides, which includes nucleic acids having exactly each of the specified lengths.
Dans certains modes de réalisation, l'acide nucléique « 3 '-TERl », lorsqu'il est présent, a une longueur de 0, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 nucléotides, ce qui englobe les acides nucléiques possédant exactement chacune des longueurs spécifiées.  In some embodiments, the nucleic acid "3 '-TER1", when present, has a length of 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 , 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 or 50 nucleotides, which includes nucleic acids having exactly each of the specified lengths.
Dans certains modes de réalisation, l'acide nucléique de formule (I) a au moins 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 , 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101 , 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 1 12, 1 13, 114, 115, 116, 117, 1 18, 1 19, 120, 121 , 122, 123 , 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139 ou 140 nucléotides de longueur, ce qui englobe les acides nucléiques possédant exactement chacune des longueurs spécifiées. In some embodiments, the nucleic acid of formula (I) has at least 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 12 , 13, 114, 115, 116, 117, 18, 19, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139 or 140 nucleotides in length, which includes nucleic acids having exactly each of the specified lengths.
Egalement, un acide nucléique, ou aptamère nucléique selon l'invention, se liant spécifiquement au Facteur IX/IXa humain peut être choisi parmi un acide nucléique de formule (II) suivante :  Also, a nucleic acid, or nucleic aptamer according to the invention, specifically binding to human factor IX / IXa may be chosen from a nucleic acid of formula (II) below:
[5 '-TER2]0 - [SEQ ID N°Y] - [3 '-TER2]p (II), [5 '-TER2] 0 - [SEQ ID NO Y] - [3' -TER2] p (II),
dans laquelle :  in which :
- « [5 '-TER2]0 » représente un acide nucléique comprenant entre 1 et 30 nucléotides, de préférence entre 1 et 25 nucléotides, "[5'-TER2] 0 " represents a nucleic acid comprising between 1 and 30 nucleotides, preferably between 1 and 25 nucleotides,
- « [3 '-TER2]p » représente un acide nucléique comprenant entre 1 et 30 nucléotides, de préférence entre 1 et 25 nucléotides, "[3 '-TER2] p " represents a nucleic acid comprising between 1 and 30 nucleotides, preferably between 1 and 25 nucleotides,
- o est un entier égal à 0 ou 1,  o is an integer equal to 0 or 1,
- p est un entier égal à 0 ou 1, et  p is an integer equal to 0 or 1, and
- « [SEQ ID N° Y] » consiste en un acide nucléique possédant au moins 80 % d'identité en nucléotides avec un acide nucléique choisi dans le groupe constitué des acides nucléiques de séquences SEQ ID N° 9 à 19, 21, 22, 24 à 66, 68 à 130, 133, 134, 138, 140, 143 , 149 à 198, de préférence de séquences SEQ ID N° 9, SEQ ID N° 21 , SEQ ID N° 45, SEQ ID N° 105, SEQ ID N° 133, SEQ ID N° 138, SEQ ID N° 140, SEQ ID N° 143, SEQ ID N°152, SEQ JD N°157, SEQ JD N° 163, SEQ ID N° 196, SEQ ID N° 168, SEQ ID N° 196, SEQ JD N° 172, SEQ ID N° 197, SEQ ID N° 198, SEQ JD N° 170, SEQ ID N° 171 et SEQ ID N° 187, et mieux de séquence SEQ ID N°168.  "[SEQ ID NO: Y]" is a nucleic acid having at least 80% nucleotide identity with a nucleic acid selected from the group consisting of nucleic acids of SEQ ID NO: 9 to 19, 21, 22 , 24 to 66, 68 to 130, 133, 134, 138, 140, 143, 149 to 198, preferably SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 105. , SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO. ID NO: 168, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 171, and SEQ ID NO: 187, and best of all. sequence SEQ ID No. 168.
Dans certains modes de réalisation, l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°Y a une longueur de 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45 nucléotides.  In some embodiments, the nucleic acid of sequence SEQ ID NO: Y is 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45 nucleotides in length.
Selon un mode de réalisation préféré, l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°Y a une longueur de 37 à 42 nucléotides de longueur, de préférence de 39 ou 40 nucléotides de longueur.  According to a preferred embodiment, the nucleic acid of sequence SEQ ID No. Y has a length of 37 to 42 nucleotides in length, preferably 39 or 40 nucleotides in length.
Dans certains modes de réalisation, les entiers « o » et « p » sont tous les deux égaux à 0, et l'acide nucléique de formule (II) est un acide nucléique de formule (IIA) suivante :  In some embodiments, the "o" and "p" integers are both 0, and the nucleic acid of formula (II) is a nucleic acid of the following formula (IIA):
[SEQ ID N°Y] (IIA), dans laquelle [SEQ ID N°Y] a la même signification que pour l'acide nucléique de formule (Π). [SEQ ID No. Y] (IIA), in which [SEQ ID No. Y] has the same meaning as for the nucleic acid of formula (Π).
Dans certains modes de réalisation, l'entier « o » est égal à 1 et l'entier « p » est égal à 0, et l'acide nucléique de formule (II) est un acide nucléique de formule (ΠΒ) suivante :  In some embodiments, the integer "o" is 1 and the integer "p" is 0, and the nucleic acid of formula (II) is a nucleic acid of the following formula (ΠΒ):
[5'-TER2]0 - [SEQ ID N°Y] (IIB), [5'-TER2] 0 - [SEQ ID No. Y] (IIB),
dans laquelle [5'-TER2]0 et [SEQ ID N°Y] ont la même signification que pour l'acide nucléique de formule (II). in which [5'-TER2] 0 and [SEQ ID No. Y] have the same meaning as for the nucleic acid of formula (II).
Dans certains modes de réalisation, l'entier « o » est égal à 0 et l'entier « p » est égal à 1, et l'acide nucléique de formule (Π) est un acide nucléique de formule (IIC) suivante :  In certain embodiments, the integer "o" is equal to 0 and the integer "p" is equal to 1, and the nucleic acid of formula (Π) is a nucleic acid of formula (IIC) as follows:
[SEQ ID N°Y] - [3 '-TER2]p (IIC), [SEQ ID NO Y] - [3 '-TER2] p (IIC),
dans laquelle [3 '-TER2]p et [SEQ ID N°Y] ont la même signification que pour l'acide nucléique de formule (II). wherein [3 '-TER2] p and [SEQ ID No. Y] have the same meaning as for the nucleic acid of formula (II).
Dans certains modes de réalisation, l'acide nucléique « 5'-TER2 », lorsqu'il est présent, a une longueur de 0, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucléotides, ce qui englobe les acides nucléiques possédant exactement chacune des longueurs spécifiées.  In some embodiments, the "5'-TER2" nucleic acid, when present, has a length of 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 or 30 nucleotides, which includes nucleic acids having exactly each of the lengths specified.
Dans certains modes de réalisation, l'acide nucléique « 3 '-TER2 », lorsqu'il est présent, a une longueur de 0, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucléotides, ce qui englobe les acides nucléiques possédant exactement chacune des longueurs spécifiées.  In some embodiments, the nucleic acid "3 '-TER2", when present, has a length of 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 or 30 nucleotides, which includes nucleic acids having exactly each of the lengths specified.
Dans certains modes de réalisation, l'acide nucléique de formule (II) a au moins 35, 36, 37, 38, 39, 40,41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104 ou 105 nucléotides de longueur, ce qui englobe les acides nucléiques possédant exactement chacune des longueurs spécifiées.  In some embodiments, the nucleic acid of formula (II) has at least 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104 or 105 nucleotides in length, which includes nucleic acids having exactly each of the specified lengths.
Selon un mode de réalisation particulier :  According to a particular embodiment:
- « [5'-TERl] » peut consister en un acide nucléique comprenant au plus 50 nucléotides, de préférence au plus 32 nucléotides, ledit acide nucléique possédant à son extrémité 5'au moins 80 %, de préférence au moins 90 %, d'identité en nucléotides avec un acide nucléique de séquence SEQ ID N°211 ou SEQ ID N°213 ;  "[5'-TER1]" can consist of a nucleic acid comprising at most 50 nucleotides, preferably at most 32 nucleotides, said nucleic acid having at its end at least 80%, preferably at least 90%, of nucleotide identity with a nucleic acid of sequence SEQ ID NO: 211 or SEQ ID NO: 213;
- « [3 '-TERl] » peut consister en un acide nucléique comprenant au plus 50 nucléotides, de préférence au plus 32 nucléotides, ledit acide nucléique possédant à son extrémité 3 ' au moins 80 %, de préférence au moins 90 %, d'identité en nucléotides avec un acide nucléique de séquence SEQ ID N°212 ou SEQ ID N°214 ; "[3'-TER1]" can consist of a nucleic acid comprising at most 50 nucleotides, preferably at most 32 nucleotides, said nucleic acid having at its 3 'end at least 80%, preferably at least 90%, nucleotide identity with a nucleic acid of sequence SEQ ID NO: 212 or SEQ ID NO: 214;
- « [5'-TER2] » peut consister en un acide nucléique possédant au moins 80 %, de préférence au moins 90 %, d'identité en nucléotides avec un acide nucléique de séquence SEQ ID N°211 ou SEQ ID N°213 ; et  - "[5'-TER2]" may consist of a nucleic acid having at least 80%, preferably at least 90%, nucleotide identity with a nucleic acid sequence SEQ ID NO: 211 or SEQ ID NO: 213 ; and
- « [3 '-TER2] » peut consister en un acide nucléique possédant au moins 80 %, de préférence au moins 90 %, d'identité en nucléotides avec un acide nucléique de séquence SEQ ID N°212 ou SEQ K) N°214. La collection d'aptamères nucléiques anti-FIX/FIXa selon l'invention comprend une pluralité de familles d'aptamères nucléiques, chaque famille d'aptamères nucléiques étant caractérisée par des caractéristiques structurelles communes, en particulier par une séquence d'acide nucléique commune. En d'autres termes, deux aptamères nucléiques appartenant à une famille donnée d'aptamères nucléiques anti-FIX/FIXa selon l'invention possèdent entre eux une séquence consensus commune, et en particulier une séquence commune qui est désignée « SEQ K) N° X » dans la présente description. La collection d'aptamères nucléiques anti- FIX/FIXa selon l'invention englobe en particulier treize familles d'aptamères nucléiques, désignées respectivement « Nonapta 1 », « Nonapta 2 », « Nonapta 3 », Nonapta 4 », « Nonapta 5 », « Nonapta 6 », « Nonapta 7 », « Nonapta 8 », « Nonapta 9 », « Nonapta 10 », « Nonapta 11 », « Nonapta 12 », « Nonapta 13 », chaque famille d'aptamères nucléiques comprenant une séquence nucléique consensus, et en particulier une séquence nucléique consensus désignée « SEQ ID N° X », qui est commune à tous les aptamères de ladite famille.  "[3 '-TER2]" may consist of a nucleic acid having at least 80%, preferably at least 90%, nucleotide identity with a nucleic acid of sequence SEQ ID No. 212 or SEQ K) No. 214. The collection of anti-FIX / FIXa nucleic aptamers according to the invention comprises a plurality of families of nucleic aptamers, each family of nucleic aptamers being characterized by common structural characteristics, in particular by a common nucleic acid sequence. In other words, two nucleic aptamers belonging to a given family of anti-FIX / FIXa nucleic aptamers according to the invention have between them a common consensus sequence, and in particular a common sequence which is designated "SEQ K) N °. X "in the present description. The collection of anti-FIX / FIXa nucleic aptamers according to the invention includes, in particular, thirteen families of nucleic aptamers, designated respectively "Nonapta 1", "Nonapta 2", "Nonapta 3", "Nonapta 4", "Nonapta 5" , "Nonapta 6", "Nonapta 7", "Nonapta 8", "Nonapta 9", "Nonapta 10", "Nonapta 11", "Nonapta 12", "Nonapta 13", each family of nucleic aptamers comprising a sequence consensus nucleic acid, and in particular a consensus nucleic sequence designated "SEQ ID No. X", which is common to all aptamers of said family.
Dans la collection d'aptamères nucléiques de l'invention, l'ensemble des séquences SEQ K) N°X consiste en un acide nucléique ayant au moins 80 % d'identité en nucléotides avec un acide nucléique choisi dans le groupe constitué des acides nucléiques de séquences SEQ ID N° 1 (= Nonapta 1), SEQ K) N° 2 (= Nonapta 2), SEQ ID N° 3 (= Nonapta 3), SEQ K) N° 4 (= Nonapta 4), SEQ ID N° 5 (= Nonapta 5), SEQ ID N° 6 (= Nonapta 6), SEQ K) N° 7 (= Nonapta 7), SEQ K) N° 8 (= Nonapta 8), SEQ ID N°144 (= Nonapta 9), SEQ H) N°145 (= Nonapta 10), SEQ ID N°146 (= Nonapta 11), SEQ ID N°147 (= Nonapta 12) et SEQ ID N°148 (= Nonapta 13).  In the nucleic aptamer collection of the invention, all the sequences SEQ K) No. X consist of a nucleic acid having at least 80% nucleotide identity with a nucleic acid selected from the group consisting of nucleic acids. sequence SEQ ID No. 1 (= Nonapta 1), SEQ K) No. 2 (= Nonapta 2), SEQ ID No. 3 (= Nonapta 3), SEQ K) No. 4 (= Nonapta 4), SEQ ID No. 5 (= Nonapta 5), SEQ ID No. 6 (= Nonapta 6), SEQ K) No. 7 (= Nonapta 7), SEQ K) No. 8 (= Nonapta 8), SEQ ID No. 144 ( = Nonapta 9), SEQ H) No. 145 (= Nonapta 10), SEQ ID No. 146 (= Nonapta 11), SEQ ID No. 147 (= Nonapta 12) and SEQ ID No. 148 (= Nonapta 13).
De manière générale, un acide nucléique de séquence SEQ ID N°X ayant au moins In general, a nucleic acid of sequence SEQ ID No. X having at least
80 % d'identité en nucléotides avec une séquence nucléique de référence possède au moins80% nucleotide identity with a reference nucleic sequence has at least
81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % d'identité en nucléotides avec ladite séquence nucléique de référence. 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% nucleotide identity with said reference nucleic sequence.
Egalement, un acide nucléique de séquence SEQ ID N°Y ayant au moins 80 % d'identité en nucléotides avec une séquence nucléique de référence possède au moins 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % d'identité en nucléotides avec ladite séquence nucléique de référence.  Also, a nucleic acid of sequence SEQ ID No. Y having at least 80% nucleotide identity with a reference nucleic sequence possesses at least 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%. %, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% nucleotide identity with said nucleic acid sequence. reference.
Selon une première variante de réalisation, l'acide nucléique de séquence SEQ JD N° X peut être figuré par un acide nucléique ayant au moins 80% d'identité avec un acide nucléique de séquence SEQ ID N° 146 (= Nonapta 11)  According to a first variant embodiment, the nucleic acid of sequence SEQ ID No. X may be represented by a nucleic acid having at least 80% identity with a nucleic acid of sequence SEQ ID No. 146 (= Nonapta 11)
Selon cette première variante de réalisation, l' acide nucléique de formule (I) peut alors être figuré par un acide nucléique de séquence SEQ ID N° 146, SEQ ID N° 168 à SEQ ID N° 172 ou SEQ ID N°202 à SEQ ID N°206, de préférence de séquence SEQ ID N°202, SEQ JD N°203, SEQ JD N°204, SEQ ID N°205 ou SEQ ID N°206, et mieux un acide nucléique de séquence SEQ JD N° 202.  According to this first variant embodiment, the nucleic acid of formula (I) can then be represented by a nucleic acid of sequence SEQ ID No. 146, SEQ ID No. 168 to SEQ ID No. 172 or SEQ ID No. 202 to SEQ ID No. 206, preferably of sequence SEQ ID No. 202, SEQ ID No. 203, SEQ ID No. 204, SEQ ID No. 205 or SEQ ID No. 206, and better a nucleic acid of sequence SEQ ID N 202.
Dans certains modes de réalisation d'un acide nucléique de formule (I) de l'invention, la séquence dudit acide nucléique possède au moins 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % d'identité en nucléotides avec un acide nucléique de SEQ ID N°146, SEQ JD N° 168 à SEQ JD N° 172 ou SEQ ID N°202 à SEQ ID N°206, de préférence de séquence SEQ ID N°202, SEQ JD N°203, SEQ ID N°204, SEQ ID N°205 ou SEQ ID N°206.  In certain embodiments of a nucleic acid of formula (I) of the invention, the sequence of said nucleic acid has at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, %, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% nucleotide identity with a nucleic acid of SEQ ID No. 146, SEQ ID No. 168 to SEQ ID No. 172 or SEQ ID No. 202 to SEQ ID No. 206, preferably SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO. 204, SEQ ID No. 205 or SEQ ID No. 206.
Selon une seconde variante de réalisation, l'acide nucléique de séquence SEQ JD N° X peut être figuré par un acide nucléique ayant au moins 80% d'identité avec un acide nucléique de séquence SEQ ID N° 5 (= Nonapta 5).  According to a second variant embodiment, the nucleic acid of sequence SEQ ID No. X may be represented by a nucleic acid having at least 80% identity with a nucleic acid of sequence SEQ ID No. 5 (= Nonapta 5).
Selon cette seconde variante de réalisation, l'acide nucléique de formule (I) peut alors être figuré par un acide nucléique de séquence SEQ ID N° 5, SEQ Π) Ν° 133 (= Nonapta 5.1) ou SEQ K) N° 134 (=Nonapta 5. 7), de préférence un acide nucléique de séquence SEQ JD N° 134.  According to this second embodiment variant, the nucleic acid of formula (I) may then be represented by a nucleic acid of SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 133 (= Nonapta 5.1) or SEQ ID NO: 134 (= Nonapta 5.7), preferably a nucleic acid of sequence SEQ JD No. 134.
Dans certains modes de réalisation d'un acide nucléique de formule (I) de l'invention, la séquence dudit acide nucléique possède au moins 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % d'identité en nucléotides avec un acide nucléique de SEQ ID N° 5, SEQ ID N° 133 ou SEQ ID N° 134. Selon une troisième variante de réalisation, l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°In certain embodiments of a nucleic acid of formula (I) of the invention, the sequence of said nucleic acid has at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, %, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% nucleotide identity with a nucleic acid of SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 133 or SEQ ID No. 134. According to a third variant embodiment, the nucleic acid of sequence SEQ ID No.
X peut être figuré par un acide nucléique ayant au moins 80 % d'identité avec un acide nucléique de SEQ ID N° 6 (= N napta 6). X may be represented by a nucleic acid having at least 80% identity with a nucleic acid of SEQ ID No. 6 (= N napta 6).
Selon cette troisième variante de réalisation, l'acide nucléique de formule (I) peut alors être figuré par un acide nucléique de séquence SEQ ID N° 6 ou SEQ ID N° 135 à According to this third variant embodiment, the nucleic acid of formula (I) may then be represented by a nucleic acid of sequence SEQ ID No. 6 or SEQ ID No. 135 to
SEQ ID N° 138. SEQ ID NO: 138.
Dans certains modes de réalisation d'un acide nucléique de formule (I) de l'invention, la séquence dudit acide nucléique possède au moins 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, In certain embodiments of a nucleic acid of formula (I) of the invention, the sequence of said nucleic acid has at least 80%, 81%, 82%, 83%,
84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % d'identité en nucléotides avec un acide nucléique de SEQ ID N° 6 ou84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% nucleotide identity with a nucleic acid of SEQ ID NO: 6 or
SEQ ID N° 135 à SEQ ID N° 138. SEQ ID NO: 135 to SEQ ID NO: 138.
Selon une quatrième variante de réalisation, l'acide nucléique de séquence According to a fourth variant embodiment, the nucleic acid of sequence
SEQ ID N° X peut être figuré par un acide nucléique ayant au moins 80% d'identité avec un acide nucléique de SEQ ID N° 7 (= Nonapta 7). SEQ ID No. X may be represented by a nucleic acid having at least 80% identity with a nucleic acid of SEQ ID No. 7 (= Nonapta 7).
Selon cette quatrième variante de réalisation, l'acide nucléique de formule (I) peut alors être figuré par un acide nucléique de SEQ ID N° 7, SEQ ID N° 139, SEQ ID N° 140 ou According to this fourth variant embodiment, the nucleic acid of formula (I) may then be represented by a nucleic acid of SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 139, SEQ ID No. 140 or
SEQ ID N° 141. SEQ ID No. 141.
Dans certains modes de réalisation d'un acide nucléique de formule (I) de l'invention, la séquence dudit acide nucléique possède au moins 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % d'identité en nucléotides avec un acide nucléique de SEQ ID N° 7, SEQ ID N° 139, SEQ ID N° 140 ou SEQ ID N° 141.  In certain embodiments of a nucleic acid of formula (I) of the invention, the sequence of said nucleic acid has at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, %, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% nucleotide identity with a nucleic acid of SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140 or SEQ ID NO: 141.
Selon une cinquième variante de réalisation, l'acide nucléique de séquence SEQ K) N° X peut être figuré par un acide nucléique ayant au moins 80% d'identité avec un acide nucléique de SEQ ID N° 2 (= Nonapta 2).  According to a fifth embodiment variant, the nucleic acid of sequence SEQ K) No. X may be represented by a nucleic acid having at least 80% identity with a nucleic acid of SEQ ID No. 2 (= Nonapta 2).
Selon cette cinquième variante de réalisation, l'acide nucléique de formule (I) peut alors être figuré par un acide nucléique de SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 21, SEQ ID N° 22 ou SEQ IO N0 23. According to this fifth embodiment, the nucleic acid of formula (I) can then be represented by a nucleic acid of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 21, SEQ ID No. 22 or SEQ IO N 0 23.
Dans certains modes de réalisation d'un acide nucléique de formule (I) de l'invention, la séquence dudit acide nucléique possède au moins 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % d'identité en nucléotides avec un acide nucléique de SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 21, SEQ ID N° 22 ou SEQ ID N° 23. Selon une sixième variante de réalisation, l'acide nucléique de séquence SEQ JD N° X peut être figuré par un acide nucléique ayant au moins 80 % d'identité avec un acide nucléique de SEQ ID N° 3 (= Nonapta 3). In certain embodiments of a nucleic acid of formula (I) of the invention, the sequence of said nucleic acid has at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, %, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% nucleotide identity with a nucleic acid of SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 22 or SEQ ID No. 23. According to a sixth variant embodiment, the nucleic acid of sequence SEQ ID No. X may be represented by a nucleic acid having at least 80% identity with a nucleic acid of SEQ ID No. 3 (= Nonapta 3).
Selon cette sixième variante de réalisation, l'acide nucléique de formule (I) peut alors être figuré par un acide nucléique de SEQ K) N° 3 ou SEQ ID N° 24 à SEQ ID N° 67. According to this sixth embodiment, the nucleic acid of formula (I) can then be represented by a nucleic acid of SEQ K ) No. 3 or SEQ ID No. 24 to SEQ ID No. 67.
Dans certains modes de réalisation d'un acide nucléique de formule (I) de l'invention, la séquence dudit acide nucléique possède au moins 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % d'identité en nucléotides avec un acide nucléique de SEQ ID N° 3 ou SEQ ID N° 24 à SEQ ID N° 67.  In certain embodiments of a nucleic acid of formula (I) of the invention, the sequence of said nucleic acid has at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, %, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% nucleotide identity with a nucleic acid of SEQ ID No. 3 or SEQ ID No. 24 to SEQ ID No. 67.
Selon une septième variante de réalisation, l'acide nucléique de séquence SEQ JD N° X peut être figuré par un acide nucléique ayant au moins 80 % d'identité avec un acide nucléique de SEQ ID N° 1 (= Nonapta 1).  According to a seventh embodiment variant, the nucleic acid of sequence SEQ ID No. X may be represented by a nucleic acid having at least 80% identity with a nucleic acid of SEQ ID No. 1 (= Nonapta 1).
Selon cette septième variante de réalisation, l'acide nucléique de formule (I) peut alors être figuré par un acide nucléique de SEQ K) N° 1 ou SEQ ID N° 9 à SEQ ID N° 20.  According to this seventh embodiment variant, the nucleic acid of formula (I) can then be represented by a nucleic acid of SEQ K) No. 1 or SEQ ID No. 9 to SEQ ID No. 20.
Dans certains modes de réalisation d'un acide nucléique de formule (I) de l'invention, la séquence dudit acide nucléique possède au moins 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % d'identité en nucléotides avec un acide nucléique de SEQ ID N° 1 ou SEQ ID N° 9 à SEQ ID N° 20.  In certain embodiments of a nucleic acid of formula (I) of the invention, the sequence of said nucleic acid has at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, %, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% nucleotide identity with a nucleic acid of SEQ ID No. 1 or SEQ ID No. 9 to SEQ ID No. 20.
Selon une huitième variante de réalisation, l'acide nucléique de séquence SEQ ) N° X peut être figuré par un acide nucléique ayant au moins 80 % d'identité avec un acide nucléique de SEQ ID N° 4 (= Nonapta 4).  According to an eighth variant embodiment, the nucleic acid of sequence SEQ) No. X may be represented by a nucleic acid having at least 80% identity with a nucleic acid of SEQ ID No. 4 (= Nonapta 4).
Selon cette huitième variante de réalisation, l'acide nucléique de formule (I) peut alors être figuré par un acide nucléique de SEQ JD N° 4 ou SEQ ID N° 68 à SEQ ID N° 131.  According to this eighth variant embodiment, the nucleic acid of formula (I) can then be represented by a nucleic acid of SEQ ID No. 4 or SEQ ID No. 68 to SEQ ID No. 131.
Dans certains modes de réalisation d'un acide nucléique de formule (I) de l'invention, la séquence dudit acide nucléique possède au moins 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % d'identité en nucléotides avec un acide nucléique de SEQ ID N° 4 ou SEQ ID N0 68 à SEQ ID N° 131. In certain embodiments of a nucleic acid of formula (I) of the invention, the sequence of said nucleic acid has at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, %, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% nucleotide identity with a nucleic acid of SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO : 68 to SEQ ID NO: 131.
Selon une neuvième variante de réalisation, l'acide nucléique de séquence SEQ ) N° X peut être figuré par un acide nucléique ayant au moins 80 % d'identité avec un acide nucléique de SEQ ID N° 8 (= Nonapta 8). Selon cette neuvième variante de réalisation, l'acide nucléique de formule (I) peut alors être figuré par un acide nucléique de SEQ JD N° 8, SEQ ID N° 142 ou SEQ ID N° 143. According to a ninth variant embodiment, the nucleic acid of sequence SEQ) No. X may be represented by a nucleic acid having at least 80% identity with a nucleic acid of SEQ ID No. 8 (= Nonapta 8). According to this ninth embodiment, the nucleic acid of formula (I) can then be represented by a nucleic acid of SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 142 or SEQ ID No. 143.
Dans certains modes de réalisation d'un acide nucléique de formule (I) de l'invention, la séquence dudit acide nucléique possède au moins 80 %, 81 %, 82 %, 83 %>, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % d'identité en nucléotides avec un acide nucléique de SEQ ID N° 8, SEQ ID N° 142 ou SEQ ID N° 143.  In certain embodiments of a nucleic acid of formula (I) of the invention, the sequence of said nucleic acid has at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% nucleotide identity with a nucleic acid of SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 142 or SEQ ID NO: 143.
Selon une dixième variante de réalisation, l'acide nucléique de séquence SEQ K) N° X peut être figuré par un acide nucléique ayant au moins 80 % d'identité avec un acide nucléique de SEQ ID N°144 (= Nonapta 9).  According to a tenth embodiment variant, the nucleic acid of sequence SEQ K) No. X may be represented by a nucleic acid having at least 80% identity with a nucleic acid of SEQ ID No. 144 (= Nonapta 9).
Selon cette dixième variante de réalisation, l'acide nucléique de formule (I) peut alors être figuré par un acide nucléique de SEQ ID N°144, SEQ ID N°149 à SEQ ID N°161, SEQ ID N°199 ou SEQ ID N°200.  According to this tenth embodiment variant, the nucleic acid of formula (I) can then be represented by a nucleic acid of SEQ ID No. 144, SEQ ID No. 149 to SEQ ID No. 161, SEQ ID No. 199 or SEQ ID NO: 200.
Dans certains modes de réalisation d'un acide nucléique de formule (I) de l'invention, la séquence dudit acide nucléique possède au moins 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %>, 99 % ou 100 % d'identité en nucléotides avec un acide nucléique de SEQ ID N°144, SEQ ID N°149 à SEQ ID N°161, SEQ ID N°199 ou SEQ ID N°200.  In certain embodiments of a nucleic acid of formula (I) of the invention, the sequence of said nucleic acid has at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, %, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%>, 99% or 100% nucleotide identity with a nucleic acid of SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 149 to SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 199 or SEQ ID NO: 200.
Selon une onzième variante de réalisation, l'acide nucléique de séquence SEQ K) N° X peut être figuré par un acide nucléique ayant au moins 80 % d'identité avec un acide nucléique de SEQ ID N°145 (= Nonapta 10). According to an eleventh embodiment, the nucleic acid of sequence SEQ K ) No. X may be represented by a nucleic acid having at least 80% identity with a nucleic acid of SEQ ID No. 145 (= Nonapta 10).
Selon cette onzième variante de réalisation, l'acide nucléique de formule (I) peut alors être figuré par un acide nucléique de SEQ ID N°145, SEQ ID N°162 à SEQ ID N°167 ou SEQ ID N°201.  According to this eleventh embodiment, the nucleic acid of formula (I) can then be represented by a nucleic acid of SEQ ID No. 145, SEQ ID No. 162 to SEQ ID No. 167 or SEQ ID No. 201.
Dans certains modes de réalisation d'un acide nucléique de formule (I) de l'invention, la séquence dudit acide nucléique possède au moins 80 %>, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % d'identité en nucléotides avec un acide nucléique de SEQ ID N°145, SEQ ID N°162 à SEQ ID N° 167 ou SEQ ID N°201.  In certain embodiments of a nucleic acid of formula (I) of the invention, the sequence of said nucleic acid has at least 80%>, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% nucleotide identity with a nucleic acid from SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 162 to SEQ ID NO: 167 or SEQ ID NO: 201.
Selon une douzième variante de réalisation, l'acide nucléique de séquence According to a twelfth embodiment, the nucleic acid of sequence
SEQ K) N° X peut être figuré par un acide nucléique ayant au moins 80 % d'identité avec un acide nucléique de SEQ ID N°147 (= Nonapta 12). Selon cette douzième variante de réalisation, l'acide nucléique de formule (I) peut alors être figuré par un acide nucléique de SEQ ID N°147 ou SEQ ID N° 173 à SEQ ID N°186 ou SEQ ID N°215. SEQ. K) No. X may be represented by a nucleic acid having at least 80% identity with a nucleic acid of SEQ ID No. 147 (= Nonapta 12). According to this twelfth embodiment, the nucleic acid of formula (I) can then be represented by a nucleic acid of SEQ ID No. 147 or SEQ ID No. 173 to SEQ ID No. 186 or SEQ ID No. 215.
Dans certains modes de réalisation d'un acide nucléique de formule (I) de l'invention, la séquence dudit acide nucléique possède au moins 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % d'identité en nucléotides avec un acide nucléique de SEQ ID N°147 ou SEQ ID N°173 à SEQ ID N° 186 ou SEQ JD N°215.  In certain embodiments of a nucleic acid of formula (I) of the invention, the sequence of said nucleic acid has at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, %, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% nucleotide identity with a nucleic acid of SEQ ID No. 147 or SEQ ID No. 173 to SEQ ID No. 186 or SEQ ID No. 215.
Selon une treizième variante de réalisation, l'acide nucléique de séquence SEQ JD N° X peut être figuré par un acide nucléique ayant au moins 80 % d'identité avec un acide nucléique de SEQ ID N°148 (= Nonapta 13).  According to a thirteenth embodiment, the nucleic acid of sequence SEQ ID No. X may be represented by a nucleic acid having at least 80% identity with a nucleic acid of SEQ ID No. 148 (= Nonapta 13).
Selon cette treizième variante de réalisation, l'acide nucléique de formule (I) peut alors être figuré par un acide nucléique de SEQ ID N°148, SEQ ID N°187 à SEQ ID N°188 ou SEQ ID N°207.  According to this thirteenth embodiment, the nucleic acid of formula (I) can then be represented by a nucleic acid of SEQ ID No. 148, SEQ ID No. 187 to SEQ ID No. 188 or SEQ ID No. 207.
Dans certains modes de réalisation d'un acide nucléique de formule (I) de l'invention, la séquence dudit acide nucléique possède au moins 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % d'identité en nucléotides avec un acide nucléique de SEQ ID N°148, SEQ ID N° 187 à SEQ ID N° 188 ou SEQ ID N°207.  In certain embodiments of a nucleic acid of formula (I) of the invention, the sequence of said nucleic acid has at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, %, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% nucleotide identity with a nucleic acid of SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 187 to SEQ ID NO: 188 or SEQ ID NO: 207.
Enfin, selon encore un autre mode de réalisation, l'acide nucléique de formule (I) peut être figuré par un acide nucléique ayant au moins 80 % d'identité avec un acide nucléique de SEQ ID N°189 à SEQ ID N°198 ou SEQ ID N°208 à SEQ ID N°210.  Finally, according to yet another embodiment, the nucleic acid of formula (I) may be represented by a nucleic acid having at least 80% identity with a nucleic acid of SEQ ID No. 189 to SEQ ID No. 198 or SEQ ID No. 208 to SEQ ID No. 210.
Dans certains modes de réalisation, la séquence SEQ ID N° X d'un acide nucléique selon l'invention peut être choisie dans le groupe constitué des acides nucléiques possédant au moins 80 % d'identité en nucléotides, mieux au moins 90 % d'identité en nucléotides, avec au moins l'une des séquences SEQ ID N° 146, SEQ ID N° 5 ou SEQ ID N° 6, de préférence la SEQ ID N° 1 In certain embodiments, the sequence SEQ ID No. X of a nucleic acid according to the invention may be chosen from the group consisting of nucleic acids having at least 80% nucleotide identity, better still at least 90% of nucleic acids. nucleotide identity, with at least one of SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6, preferably SEQ ID NO: 1
Dans certains modes de réalisation, un acide nucléique selon l'invention peut présenter au moins 80% d'identité en nucléotides, mieux au moins 90 % d'identité en nucléotides, avec un acide nucléique choisi dans le groupe constitué des acides nucléiques de séquences SEQ ID N°l à 210, de préférence SEQ ID N°l à 143.  In some embodiments, a nucleic acid according to the invention may have at least 80% nucleotide identity, more preferably at least 90% nucleotide identity, with a nucleic acid selected from the group consisting of nucleic acid sequences. SEQ ID No. 1 to 210, preferably SEQ ID No. 1 to 143.
Dans certains modes de réalisation, un acide nucléique selon l'invention peut présenter au moins 80% d'identité en nucléotides, mieux au moins 90 % d'identité en nucléotides, avec un acide nucléique de séquences SEQ ID N°202, SEQ ID N°133 (le. Nonapta 5.1) ou SEQ ID N° 134 (le. Nonapta 5. 7), de préférence la séquence SEQ ID N°202 ou SEQ ID N° 134, et mieux la séquence SEQ ID N°202. In some embodiments, a nucleic acid according to the invention may have at least 80% nucleotide identity, more preferably at least 90% identity. nucleotides, with a nucleic acid of SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 133 (nonapta 5.1) or SEQ ID NO: 134 (nonapta 5.7), preferably SEQ ID NO: 202 or SEQ ID No. 134, and better the sequence SEQ ID No. 202.
Le « pourcentage d'identité » entre deux séquences d'acides nucléiques, au sens de la présente invention, est déterminé en comparant les deux séquences alignées de manière optimale, à travers une fenêtre de comparaison. The "percent identity" between two nucleic acid sequences in the sense of the present invention is determined by comparing the two optimally aligned sequences through a comparison window.
La partie de la séquence nucléotidique dans la fenêtre de comparaison peut comprendre des additions ou des délétions (par exemple des « gaps ») par rapport à la séquence de référence (qui ne comprend pas ces additions ou ces délétions) de manière à obtenir un alignement optimal entre les deux séquences.  The part of the nucleotide sequence in the comparison window may comprise additions or deletions (for example "gaps") with respect to the reference sequence (which does not include these additions or deletions) so as to obtain an alignment optimal between the two sequences.
Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions auxquelles une base nucléique identique est observé pour les deux séquences comparées, puis en divisant le nombre de positions auxquelles il y a identité entre les deux bases nucléiques par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison, puis en multipliant le résultat par cent afin d'obtenir le pourcentage d'identité en nucléotides des deux séquences entre elles.  The percent identity is calculated by determining the number of positions at which an identical nucleotide base is observed for the two compared sequences, and then dividing the number of positions at which there is identity between the two nucleobases by the total number of positions in the comparison window, then multiplying the result by one hundred in order to obtain the percentage of nucleotide identity of the two sequences between them.
L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé de manière informatique à l'aide d'algorithmes connus.  The optimal alignment of the sequences for the comparison can be performed in a computer manner using known algorithms.
De manière tout à fait préférée, le pourcentage d'identité de séquence est déterminé à l'aide du logiciel CLUSTAL W (version 1.82) les paramètres étant fixés comme suit : (1) CPU MODE = ClustalW mp ; (2) ALIGNMENT = « full » ; (3) OUTPUT FORMAT = « aln w/numbers » ; (4) OUTPUT ORDER = « aligned » ; (5) COLOR ALIGNMENT = « no » ; (6) KTUP (word size) = « default » ; (7) WINDOW LENGTH = « default » ; (8) SCORE TYPE = « percent » ; (9) TOPDIAG = « default » ; (10) PAIRGAP = « default » ; (11) PHYLOGENETIC TREE/TREE TYPE = « none » ; (12) MATRIX = « default » ; (13) GAP OPEN = « default » ; (14) END GAPS = « default » ; (15) GAP EXTENSION = « default » ; (16) GAP DISTANCES = « default » ; (17) TREE TYPE = « cladogram » et (18) TREE GRAP DISTANCES = « hide ».  Most preferably, the percentage of sequence identity is determined using the CLUSTAL W software (version 1.82) with the parameters set as follows: (1) CPU MODE = ClustalW mp; (2) ALIGNMENT = "full"; (3) OUTPUT FORMAT = "aln w / numbers"; (4) OUTPUT ORDER = "aligned"; (5) COLOR ALIGNMENT = "no"; (6) KTUP (word size) = "default"; (7) WINDOW LENGTH = "default"; (8) SCORE TYPE = "percent"; (9) TOPDIAG = "default"; (10) PAIRGAP = "default"; (11) PHYLOGENETIC TREE / TREE TYPE = "none"; (12) MATRIX = "default"; (13) GAP OPEN = "default"; (14) END GAPS = "default"; (15) GAP EXTENSION = "default"; (16) GAP DISTANCES = "default"; (17) TREE TYPE = "cladogram" and (18) TREE GRAP DISTANCES = "hide".
Sur la base d'un acide nucléique selon l'invention, tel que représenté en figures 1 à 9 et 23 à 28, l'homme du métier peut aisément déterminer les séquences spécifiques possibles pour la séquence SEQ ID N° X, au sein de l'ensemble du nombre fini des enchaînements de nucléotides possibles. L'homme du métier peut vérifier ses propriétés de liaison au Facteur IX/TXa humain, par exemple selon l'une des méthodes spécifiées dans la présente description, en particulier dans les exemples. On the basis of a nucleic acid according to the invention, as represented in FIGS. 1 to 9 and 23 to 28, the person skilled in the art can easily determine the possible specific sequences for the sequence SEQ ID No. X, within the whole of the finite number of possible nucleotide sequences. Those skilled in the art can verify its binding properties to the human factor IX / TXa, for example according to one of the methods specified in the present description, in particular in the examples.
Selon l'invention, un acide nucléique se liant au Facteur IX/IXa humain consiste en un acide nucléique monobrin capable de former un complexe avec le Facteur IX/IXa humain, lorsqu'il est mis en contact avec ce dernier.  According to the invention, a human factor IX / IXa binding nucleic acid is a single-stranded nucleic acid capable of forming a complex with human factor IX / IXa when contacted with the human factor IX / IXa.
Les acides nucléiques se liant au Facteur IX/IXa humain englobent donc ceux pour lesquels on peut détecter des complexes avec le Facteur IX/IXa humain après une étape préalable de mise en contact desdits partenaires respectivement nucléique et protéique.  Nucleic acids binding to human factor IX / IXa therefore include those for which complexes can be detected with human factor IX / IXa after a prior step of contacting said respective nucleic and protein partners.
La détection de complexes formés entre un acide nucléique se liant au Facteur IX/IXa humain peut être aisément réalisée par l'homme du métier, par exemple en mettant en œuvre une technique de détection par résonance plasmonique de surface, y compris la technique Biacore®, comme cela est illustré dans les exemples. L'homme du métier peut aussi aisément détecter la formation de complexes entre un acide nucléique d'intérêt et le Facteur IX/IXa humain par des techniques classiques du type ELISA, ou par toute autre technique de laboratoire capable de mettre en évidence une interaction entre un acide nucléique et une protéine. The detection of complexes formed between a human factor IX / IXa binding nucleic acid can be easily performed by those skilled in the art, for example by implementing a surface plasmon resonance detection technique, including the Biacore ® technique. as illustrated in the examples. Those skilled in the art can also easily detect the formation of complexes between a nucleic acid of interest and the human factor IX / IXa by conventional techniques of the ELISA type, or by any other laboratory technique capable of highlighting an interaction between a nucleic acid and a protein.
Comme cela est illustré dans les exemples, un acide nucléique de formule (I) ou (Π) selon l'invention possède une forte capacité de liaison à tout type de Facteur IX/IXa humain. Qui plus est, la liaison d'un acide nucléique de formule (I) ou (II) selon l'invention au Facteur IX/IXa humain naturel est spécifique. En effet, un acide nucléique de formule (I) ou (Π) selon l'invention possède une très faible capacité de liaison au Facteur VII VIIa, voire même une capacité nulle.  As illustrated in the examples, a nucleic acid of formula (I) or (Π) according to the invention has a strong capacity for binding to any type of human factor IX / IXa. Moreover, the binding of a nucleic acid of formula (I) or (II) according to the invention to the natural human factor IX / IXa is specific. Indeed, a nucleic acid of formula (I) or (Π) according to the invention has a very weak capacity for binding to Factor VII VIIa, or even a zero capacity.
Sans vouloir être lié par une quelconque théorie, le demandeur pense que les résultats présentés dans les exemples montrent qu'un acide nucléique de formule (I) ou (II) selon l'invention possède une forte capacité à se lier à des facteurs IX/IXa humains ayant des types distincts de glycosylation. En d'autres termes, le demandeur pense qu'un acide nucléique de formule (I) ou (II) selon l'invention est capable de se lier efficacement, non seulement au Facteur IX/IXa provenant de sources naturelles, y compris le plasma humain, mais également à un Facteur IX/IXa humain recombinant produit en culture cellulaire in vitro, ou dans un animal transgénique, préférentiellement un mammifère transgénique, de différentes espèces, y compris le lapin, dont les types de glycosylation peuvent différer, même légèrement du type de glycosylation du Facteur ΓΧ IXa humain produit naturellement dans le plasma sanguin. Selon l'invention, un acide nucléique se liant « spécifiquement » au Facteur IX/IXa humain consiste en un acide nucléique possédant une capacité à se lier au Facteur IX/IXa humain supérieure à sa capacité à se lier à toute autre protéine, et en particulier aux Facteurs VII/VIIa. Without wishing to be bound by any theory, the applicant thinks that the results presented in the examples show that a nucleic acid of formula (I) or (II) according to the invention has a high capacity to bind to IX factors. IXa humans with distinct types of glycosylation. In other words, the Applicant believes that a nucleic acid of formula (I) or (II) according to the invention is capable of binding efficiently, not only to Factor IX / IXa from natural sources, including plasma. human, but also to a recombinant human factor IX / IXa produced in cell culture in vitro, or in a transgenic animal, preferably a transgenic mammal, of different species, including rabbit, the types of glycosylation may differ, even slightly from the type of human acteur IXa factor glycosylation produced naturally in blood plasma. According to the invention, a nucleic acid "specifically" binding to human Factor IX / IXa consists of a nucleic acid having an ability to bind human Factor IX / IXa greater than its ability to bind to any other protein, and particular to Factors VII / VIIa.
Au sens de la présente description, un premier acide nucléique possède une capacité à se lier au Facteur IX/IXa humain, supérieure à celle d'un second acide nucléique, lorsque, en utilisant l'une quelconque des techniques de détection de liaison ci-dessus, et dans les mêmes conditions d'essai, une valeur de signal de liaison supérieure statistiquement significative est obtenue avec le premier acide nucléique, par rapport à celle obtenue avec les seconds acides nucléiques. De manière illustrative, lorsque la technique de détection de liaison utilisée est la technique Biacore®, comme dans les exemples, un premier acide nucléique possède une capacité à se lier au Facteur IX/IXa humain, supérieure à celle d'un second acide nucléique, lorsque la valeur de signal de résonance pour le premier acide nucléique, quelle que soit l'unité de mesure de résonance exprimée, est statistiquement supérieure à la valeur de signal de résonance mesurée pour le second acide nucléique. Deux valeurs de mesure « statistiquement » distinctes englobent deux valeurs qui ont entre elles un écart supérieur à l'erreur de mesure de la technique de détection de liaison utilisée. As used herein, a first nucleic acid has the ability to bind human Factor IX / IXa, which is greater than that of a second nucleic acid, when, using any of the binding detection techniques described above, above, and under the same test conditions, a statistically significant upper binding signal value is obtained with the first nucleic acid, relative to that obtained with the second nucleic acids. Illustratively, when the used link detection technique is the Biacore ® technique, as in the examples, a first nucleic acid has an ability to bind to Factor IX / IXa human, greater than that of a second nucleic acid, when the resonance signal value for the first nucleic acid, regardless of the expressed resonance unit of measure, is statistically greater than the measured resonance signal value for the second nucleic acid. Two distinct "statistically" measured values encompass two values which have a greater difference than the measurement error of the link detection technique used.
Comme cela est illustré dans les exemples, on a testé la capacité des acides nucléiques de l'invention à se lier spécifiquement au Facteur IX/IXa humain.  As illustrated in the examples, the ability of the nucleic acids of the invention to bind specifically to human factor IX / IXa was tested.
Qui plus est, les acides nucléiques de formule (I) ou (II) selon l'invention sont en outre avantageux en ce qu'ils ont une capacité à se lier au Facteur IX/IXa humain qui est significativement supérieure à leur capacité de liaison à n'importe quel autre Facteur. En particulier, alors qu'un acide nucléique de formule (I) ou (II) selon l'invention possède une forte capacité à se lier à tout type de Facteur IX/IXa humain, y compris naturel ou recombinant, il a une capacité faible, et même nulle, à se lier à un Facteur VII/VIIa codé par le génome d'un mammifère non humain.  Moreover, the nucleic acids of formula (I) or (II) according to the invention are further advantageous in that they have an ability to bind human Factor IX / IXa which is significantly greater than their binding capacity. to any other factor. In particular, while a nucleic acid of formula (I) or (II) according to the invention has a strong ability to bind to any type of human factor IX / IXa, including natural or recombinant, it has a low capacity , and even zero, to bind to a factor VII / VIIa encoded by the genome of a non-human mammal.
Sans vouloir être lié par une quelconque théorie, ces caractéristiques de spécificité de la liaison d'un acide nucléique de formule (I) ou (II) selon l'invention au Facteur IX/IXa humain illustrent que les acides nucléiques aptamères de l'invention peuvent être avantageusement utilisés pour discriminer entre un Facteur IX/IXa humain et un Facteur VII/VIIa humain voire, en outre, discriminer entre un Facteur IX/IXa humain et un Facteur IX/IXa non humain.  Without wishing to be bound by any theory, these characteristics of specificity of the binding of a nucleic acid of formula (I) or (II) according to the invention to human factor IX / IXa illustrate that the aptamer nucleic acids of the invention can be advantageously used to discriminate between a human factor IX / IXa and a human factor VII / VIIa or, in addition, discriminate between a human factor IX / IXa and a non-human factor IX / IXa.
En particulier, un acide nucléique de formule (I) ou (II) selon l'invention peut être avantageusement utilisé dans un moyen de purification d'un Facteur IX/IXa humain, y compris à partir d'un milieu de départ complexe susceptible de contenir un Facteur IX/TXa en association avec d'autres types de facteurs de la coagulation, tel que par exemple le Facteur VILVIIa. Notamment, un acide nucléique de formule (I) ou (II) selon l'invention peut être utilisé dans un moyen de purification du Facteur IX/IXa recombinant dans un fluide biologique d'un animal transgénique pour le Facteur IX/IXa humain, ledit fluide biologique étant susceptible de contenir d'autres facteurs de la coagulation, et tout particulièrement étant susceptible de contenir un Facteur IX/TXa produit naturellement par l'animal transgénique. In particular, a nucleic acid of formula (I) or (II) according to the invention can be advantageously used in a means for purifying a human factor IX / IXa, including from a complex starting medium likely to contain a factor IX / TXa in combination with other types of coagulation factors, such as for example the factor VILVIIa. In particular, a nucleic acid of formula (I) or (II) according to the invention may be used in a recombinant factor IX / IXa purification means in a biological fluid of a transgenic animal for human factor IX / IXa, said biological fluid being likely to contain other coagulation factors, and particularly being likely to contain a factor IX / TXa naturally produced by the transgenic animal.
Comme cela est illustré dans les exemples, une autre caractéristique d'un acide nucléique de formule (I) ou (II) selon l'invention est son aptitude, dans un complexe avec le Facteur IX/IXa humain, à libérer le Facteur IX/IXa humain par incubation dudit complexe avec un agent chélateur de cations métalliques tels que l'EDTA (acide éthylène diamine tétraacétique) ou l'EGTA (acide éthylène glycol-bis(2-aminoéthyléther)-N,N,N',N'- tétraacétique). On a notamment montré que les molécules de Facteur IX/IXa complexées avec un acide nucléique de formule (I) ou (II) selon l'invention sont libérées desdits complexes par mise en contact avec un agent chélateur de cations métalliques tel que l'EDTA.  As illustrated in the examples, another characteristic of a nucleic acid of formula (I) or (II) according to the invention is its ability, in a complex with the human factor IX / IXa, to release the factor IX / Human IXa by incubation of said complex with a metal cation chelating agent such as EDTA (ethylene diamine tetraacetic acid) or EGTA (ethylene glycol-bis (2-aminoethylether) -N, N, N ', N'- tetraacetic acid). In particular, it has been shown that Factor IX / IXa molecules complexed with a nucleic acid of formula (I) or (II) according to the invention are released from said complexes by contact with a metal cation chelating agent such as EDTA. .
Ainsi, selon encore un autre aspect, la liaison d'un acide nucléique de formule (I) ou (Π) selon l'invention au facteur IX/IXa humain peut être dissociée par mise en contact avec un agent chélateur des cations métalliques, y compris par mise en contact avec de l'EDTA ou de l'EGTA.  Thus, according to yet another aspect, the binding of a nucleic acid of formula (I) or (Π) according to the invention to human factor IX / IXa can be dissociated by contacting with a metal cation chelating agent, including included by contact with EDTA or EGTA.
Selon un mode de réalisation avantageux, l'agent chélateur des cations métalliques est l'EDTA, de préférence associé à du NaCl. En effet, les inventeurs ont observé des résultats encore améliorés en termes de dissociation entre un acide nucléique de formule (I) ou (II) selon l'invention et le facteur IX/IXa humain lorsque l'EDTA est combiné à du NaCl.  According to an advantageous embodiment, the metal cation chelating agent is EDTA, preferably associated with NaCl. Indeed, the inventors have observed further improved results in terms of dissociation between a nucleic acid of formula (I) or (II) according to the invention and human factor IX / IXa when EDTA is combined with NaCl.
A titre illustratif, des combinaisons EDTA/ aCl particulièrement intéressantes sont :  By way of illustration, particularly interesting combinations of EDTA / aCl are:
1) EDTA (0,2 M) + NaCl (2M) à pH 7,5 ; et  1) EDTA (0.2 M) + NaCl (2M) at pH 7.5; and
2) EDTA (0,2 M) + NaCl (2M) à pH 6.  2) EDTA (0.2 M) + NaCl (2M) at pH 6.
Cette caractéristique additionnelle d'un acide nucléique de formule (I) ou (Π) selon l'invention est particulièrement avantageuse pour l'utilisation dudit acide nucléique dans un moyen de purification du Facteur IX/IXa humain. En effet, dans un telle application pour la purification, le Facteur IX/IXa humain, immobilisé dans un complexe avec un acide nucléique de formule (I) ou (II) selon l'invention, peut ensuite être récupéré sous forme purifiée par simple mise en contact ou incubation avec un agent chélateur des cations métalliques, donc sans nécessiter l'emploi de substances connues pour dénaturer, au moins partiellement, le Facteur ΓΧ/TXa humain, comme les conditions acides ou l'urée. This additional characteristic of a nucleic acid of formula (I) or (Π) according to the invention is particularly advantageous for the use of said nucleic acid in a means for purifying human factor IX / IXa. Indeed, in such an application for purification, human factor IX / IXa, immobilized in a complex with a nucleic acid of formula (I) or (II) according to the invention, can then be recovered in purified form by simple application. in contact or incubation with a metal cation chelating agent, so without requiring the use of substances known to denature, at least partially, the human factor ΓΧ / TXa, such as acidic conditions or urea.
Pour son utilisation dans un moyen de purification du Facteur IX/TXa humain, un acide nucléique de formule (I) ou (II) selon l'invention est préférentiellement immobilisé sur un support solide. Ledit support solide englobe des particules solides, des supports de chromatographie, etc. Les techniques d'immobilisation d'acides nucléiques d'intérêt sur des types très variés de supports solides sont bien connues par l'homme du métier.  For use in a human factor IX / TXa purification means, a nucleic acid of formula (I) or (II) according to the invention is preferentially immobilized on a solid support. Said solid support includes solid particles, chromatography media, etc. Techniques for immobilizing nucleic acids of interest on a wide variety of types of solid supports are well known to those skilled in the art.
Le support solide peut être une colonne de chromatographie d'affinité composée d'un gel dérivé de l'agarose, de la cellulose ou d'un gel synthétique tel qu'un dérivé acrylamide, méthacrylate ou polystyrène, une puce telle qu'une puce adaptée à la résonance plasmonique de surface, une membrane telle qu'une membrane polyamide, polyacrylonitrile ou polyester ou encore une bille magnétique ou paramagnétique.  The solid support may be an affinity chromatography column composed of a gel derived from agarose, cellulose or a synthetic gel such as an acrylamide, methacrylate or polystyrene derivative, a chip such as a chip adapted to the surface plasmon resonance, a membrane such as a polyamide, polyacrylonitrile or polyester membrane or a magnetic or paramagnetic ball.
Pour son utilisation dans un moyen de purification du Facteur IX/IXa humain, un acide nucléique de formule (I) ou (Π) selon l'invention est préférentiellement inclus dans une structure chimique comprenant également un moyen espaceur et, le cas échéant, un moyen d'immobilisation sur un support solide.  For use in a human factor IX / IXa purification means, a nucleic acid of formula (I) or (Π) according to the invention is preferably included in a chemical structure also comprising a spacer means and, if appropriate, a means of immobilization on a solid support.
Ainsi, la présente invention est également relative à un composé se liant spécifiquement au facteur ΓΧ/LXa humain, caractérisé en ce qu'il est de formule (III) suivante :  Thus, the present invention also relates to a compound that binds specifically to the human ΓΧ / LXa factor, characterized in that it has the following formula (III):
[SPAC]- [NUCL] (III), dans laquelle :  [SPAC] - [NUCL] (III), wherein:
- [SPAC] signifie une chaîne espaceur, et  - [SPAC] means a spacer chain, and
- [NUCL] signifie un acide nucléique se liant spécifiquement au Facteur IX/TXa humain de formule (I) ou (II).  [NUCL] means a nucleic acid specifically binding to human Factor IX / TXa of formula (I) or (II).
Le composé ci-dessus constitue un mode de réalisation particulier d'un moyen de purification du Facteur ΓΧ/IXa humain.  The above compound is a particular embodiment of a human ΓΧ / IXa Factor purification means.
La « chaîne espaceur » désignée [SPAC] dans le composé de formule (III) peut être de tout type connu. Ladite chaîne espaceur a pour fonction d'éloigner physiquement l'acide nucléique [NUCL] de la surface du support solide sur lequel ledit composé peut être immobilisé et de permettre une mobilité relative de l'acide nucléique [NUCL], par rapport à la surface du support solide sur lequel il peut être immobilisé. La chaîne espaceur limite ou évite que des encombrements stériques, dus à une trop grande proximité du support solide avec l'acide nucléique de formule (I) ou (II), gênent les événements de liaison entre ledit acide nucléique et des molécules de Facteur IX/IXa humain susceptibles d'être mises en contact avec celui-ci. Dans le composé de formule (III), la chaîne espaceur est liée préférentiellement à l'extrémité 5' ou à l'extrémité 3' de l'acide nucléique [NUCL]. The "spacer chain" designated [SPAC] in the compound of formula (III) can be of any known type. Said spacer chain has the function of physically moving the nucleic acid [NUCL] away from the surface of the solid support on which said compound can be immobilized and to allow a relative mobility of the nucleic acid [NUCL], relative to the surface solid support on which it can be immobilized. The spacer chain limits or avoids that steric hindrances, due to an excessive proximity of the solid support with the nucleic acid of formula (I) or (II), interfere with the binding events between said nucleic acid and Factor IX molecules. / IXa human likely to be brought into contact therewith. In the compound of formula (III), the spacer chain is preferably bonded to the 5 'end or the 3' end of [NUCL] nucleic acid.
Avantageusement la chaîne espaceur est liée à la fois à une extrémité de l'aptamère et au support solide. Cette construction avec espaceur a pour avantage de ne pas immobiliser directement l'aptamère sur le support solide. De préférence, la chaîne espaceur est un oligonucléotide non spécifique ou du Polyéthylène Glycol (PEG). Lorsque la chaîne espaceur consiste en un oligonucléotide non spécifique, ledit oligonucléotide comprend avantageusement au moins 5 nucléotides de longueur, de préférence entre 5 et 15 nucléotides de longueur.  Advantageously, the spacer chain is bonded to both an end of the aptamer and the solid support. This spacer construction has the advantage of not directly immobilizing the aptamer on the solid support. Preferably, the spacer chain is a nonspecific oligonucleotide or polyethylene glycol (PEG). When the spacer chain consists of a nonspecific oligonucleotide, said oligonucleotide advantageously comprises at least 5 nucleotides in length, preferably between 5 and 15 nucleotides in length.
Dans les modes de réalisation d'un composé de formule (III) dans lesquels la chaîne espaceur consiste en un Polyéthylène Glycol, ladite chaîne espaceur englobe un polyéthylène glycol de type PEG(C18).  In embodiments of a compound of formula (III) in which the spacer chain consists of a polyethylene glycol, said spacer chain includes PEG (C18) type polyethylene glycol.
Pour immobiliser l'aptamère directement sur le support solide, ou sur la chaîne espaceur, l'acide nucléique [NUCL] peut être modifié chimiquement avec différents groupements chimiques tels que des groupements permettant d'immobiliser ledit acide nucléique de façon covalente, tels que des thiols, des aminés ou tout autre groupement capable de réagir avec des groupements chimiques présents sur le support solide. Dans certains modes de réalisation, la chaîne espaceur est-elle-même apte à être immobilisée sur le support solide, le cas échéant après modification de ladite chaîne espaceur avec un ou plusieurs groupements chimiques appropriés. Dans encore d'autres modes de réalisation, la chaîne espaceur est liée à un composé permettant l'immobilisation du composé d'intérêt comprenant l'aptamère nucléique sur le support mobile.  To immobilize the aptamer directly on the solid support, or on the spacer chain, the [NUCL] nucleic acid can be chemically modified with different chemical groups such as groups that make it possible to immobilize said nucleic acid in a covalent manner, such as thiols, amines or any other group capable of reacting with chemical groups present on the solid support. In some embodiments, the spacer chain is itself capable of being immobilized on the solid support, where appropriate after modification of said spacer chain with one or more appropriate chemical groups. In yet other embodiments, the spacer chain is linked to a compound for immobilizing the compound of interest comprising the nucleic aptamer on the mobile support.
Ainsi, la présente invention est également relative à un composé se liant spécifiquement au facteur LX/LXa humain, caractérisé en ce qu'il est de formule (IV) suivante :  Thus, the present invention also relates to a compound that binds specifically to human LX / LXa factor, characterized in that it has the following formula (IV):
[FIX]-[SPAC]- [NUCL] (IV), dans laquelle :  [FIX] - [SPAC] - [NUCL] (IV), wherein:
- [FIX] signifie un composé d'immobilisation sur un support,  - [FIX] means an immobilization compound on a support,
- [SPAC] signifie une chaîne espaceur, et  - [SPAC] means a spacer chain, and
- [NUCL] signifie un acide nucléique se liant spécifiquement au Facteur IX/IXa humain de formule (I) ou (II).  [NUCL] means a nucleic acid specifically binding to human Factor IX / IXa of formula (I) or (II).
Le composé de formule (IV) ci-dessus constitue un mode de réalisation d'un moyen de purification du Facteur ΓΧ/IXa humain.  The compound of formula (IV) above constitutes an embodiment of a human ΓΧ / IXa factor purification means.
Ledit moyen de purification du Facteur IX/IXa humain de formule (III) ou de formule (IV) se présente préférentiellement sous une forme liée à un support solide. Dans le composé de formule (IV) le composé [FIX] consiste en un composé choisi parmi (i) un composé capable de former une ou plusieurs liaisons covalente avec le matériau de surface d'un support solide et (ii) un composé capable de se lier spécifiquement sur le support solide par l'intermédiaire de liaison faibles non covalentes, y compris des liaisons hydrogènes, des forces électrostatiques ou des forces de Van der Waals. Said means for purifying human Factor IX / IXa of formula (III) or of formula (IV) is preferentially in a form bound to a solid support. In the compound of formula (IV) the compound [FIX] consists of a compound selected from (i) a compound capable of forming one or more covalent bonds with the surface material of a solid support and (ii) a compound capable of Specifically bind to the solid support via weak non-covalent bonds, including hydrogen bonds, electrostatic forces or Van der Waals forces.
Le premier type de composé [FIX] englobe les agents de couplage bifonctionnels, comme le glutaraldéhyde, le SIAB ou encore le SMCC.  The first type of compound [FIX] includes the bifunctional coupling agents, such as glutaraldehyde, SIAB or SMCC.
Le composé SIAB, décrit par Hermanson G.T. (1996, Bioconjugate techniques, San Diego : Académie Press, pp 239-242), est le composé de formule (X) suivante :  The SIAB compound, described by Hermanson G.T. (1996, Bioconjugate Techniques, San Diego: Academic Press, pp 239-242), is the compound of formula (X) below:
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(X)  (X)
Le composé SIAB comprend deux groupes réactifs, respectivement un groupe lodoacétate et un groupe ester Sulfo-NHS, ces groupes réagissant respectivement sur des groupes amino et sulfhydryl.  The compound SIAB comprises two reactive groups, respectively a lodoacetate group and a Sulfo-NHS ester group, these groups reacting respectively on amino and sulfhydryl groups.
Le composé SMCC, qui est décrit par Samoszuk M.K. et al. (1989, Antibody, Immunoconjugates Radiopharm., 2(\) : 37-46), est le composé de formule (XI) suivante :  The SMCC compound, which is described by Samoszuk M.K. et al. (1989, Antibody, Immunoconjugates Radiopharm., 2 (\): 37-46), is the compound of formula (XI) below:
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Le composé SMCC comprend deux groupes réactifs, respectivement un groupe ester Sulfo-NHS et un groupe maléimide, qui réagissent respectivement avec un groupe amino et un groupe sulfhydryl.  The SMCC compound comprises two reactive groups, respectively a sulfo-NHS ester group and a maleimide group, which react respectively with an amino group and a sulfhydryl group.
Le second type de composé [FIX] englobe la biotine, qui est capable de se lier de manière spécifique non covalente à des molécules d'avidine ou de streptavidine présentes sur le support solide.  The second type of compound [FIX] includes biotin, which is capable of specifically non-covalently binding to avidin or streptavidin molecules present on the solid support.
Dans certains modes de réalisation, une fois immobilisé sur le support solide via la chaîne espaceur, l'aptamère est avantageusement modifié à son extrémité libre (extrémité non liée à l'espaceur) grâce à, et sans s'y limiter, un nucléotide chimiquement modifié (tel que 2'- O-methyl ou 2'-fluoropyrimidine, 2'-ribopurine, phosphoramidite), un nucléotide inversé ou un groupement chimique (PEG, polycations, cholestérol). Ces modifications permettent de protéger certains aptamères des dégradations enzymatiques. In some embodiments, when immobilized on the solid support via the spacer chain, the aptamer is advantageously modified at its free end (non-free end). linked to the spacer) by virtue of, and not limited to, a chemically modified nucleotide (such as 2'-O-methyl or 2'-fluoropyrimidine, 2'-ribopurine, phosphoramidite), an inverted nucleotide or a chemical group (PEG, polycations, cholesterol). These modifications make it possible to protect certain aptamers from enzymatic degradations.
Dans encore certains autres modes de réalisation, l'immobilisation d'un acide nucléique anti-FLX/IXa selon l'invention sur un support peut être réalisé selon le procédé décrit dans la demande PCT publiée au nom de LFB Biotechnologies sous le n° WO 2012/090183 en date du 5 juillet 2012. Ce procédé d'immobilisation est réalisé par greffage d'acides nucléiques comprenant une amine primaire sur un support solide présentant des groupes acides carboxyliques activés, ledit procédé comprenant une étape de couplage covalent desdits acides nucléiques sur ledit support solide à un pH inférieur à 6.  In still some other embodiments, the immobilization of an anti-FLX / IXa nucleic acid according to the invention on a support can be carried out according to the process described in the PCT application published under the name of LFB Biotechnologies WO 2012/090183 dated July 5, 2012. This immobilization process is carried out by grafting nucleic acids comprising a primary amine on a solid support having activated carboxylic acid groups, said process comprising a covalent coupling step of said nucleic acids on said solid support at a pH below 6.
Un support d'affinité sur lequel sont immobilisées des molécules d'un acide nucléique anti-FLX/FLXa selon l'invention, et préparé selon l'enseignement de la demande PCT n° WO 2012/090183 précitée, peut être représenté par la formule suivante (VI) :  An affinity support on which are immobilized molecules of an anti-FLX / FLXa nucleic acid according to the invention, and prepared according to the teaching of PCT application No. WO 2012/090183 mentioned above, can be represented by the formula following (VI):
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dans laquelle :  in which :
- [SUP] représente le support solide du support d'affinité  - [SUP] represents the solid support of the affinity support
- [SPAC]n et [NUCL] répondent aux définitions précédemment indiquées. En d'autres termes, -NH-(SPAC)n-NUCL représente un aptamère nucléique dans lequel : - [SPAC] n and [NUCL] are as previously defined. In other words, -NH- (SPAC) n -NUCL represents a nucleic aptamer in which:
■ n est indice valant 0 ou 1, ■ n is index of 0 or 1,
■ SPAC représente une chaîne espaceur, et ■ SPAC represents a spacer chain, and
■ NUCL représente un acide nucléique se liant spécifiquement au Facteur IX/LXa humain de formule (I) ou (II). ■ NUCL is a nucleic acid specifically binding to Factor IX / human LXa of formula (I) or (II).
Dans certains modes de réalisation, un « aptamère nucléique » utilisé pour le greffage au support solide pré-activé, selon le procédé ou la méthode décrite dans la demande PCT n° WO 2012/090183, peut comprendre, par définition, une partie non nucléotidique ou nucléotidique, par exemple une chaîne espaceur non nucléotidique, qui relie l'une des extrémités 5' ou 3 ' de la partie nucléique dudit aptamère et la fonction amine réactive utilisée pour le greffage chimique dudit support pré-activé. Dans ces modes de réalisation, un aptamère nucléique peut être de formule (V) suivante : ;-[SPAC]„- [NUCL] (V), dans laquelle In some embodiments, a "nucleic aptamer" used for grafting to the pre-activated solid support, according to the method or method described in PCT Application No. WO 2012/090183, may comprise, by definition, a non-nucleotide portion. or nucleotide, for example a non-nucleotide spacer chain, which connects one of the 5 'or 3' ends of the nucleic portion of said aptamer and the reactive amine function used for the chemical grafting of said pre-activated support. In these embodiments, a nucleic aptamer may have the following formula (V): - [SPAC] "- [NUCL] (V), wherein
- n étant indice valant 1 ou 0, 0 signifiant que l'aptamère ne comprend pas une chaîne espaceur libre et 1 signifiant que l'aptamère comprend une chaîne espaceur. where n is an index of 1 or 0, where 0 means that the aptamer does not comprise a free spacer chain and 1 signifies that the aptamer comprises a spacer chain.
- NH2 signifie la fonction aminé réactive utilisée pour le greffage sur le support solide pré-activé par des groupes NHS, NH 2 means the reactive amine function used for grafting onto the solid support pre-activated with NHS groups,
- [SPAC] signifie une chaîne espaceur, et  - [SPAC] means a spacer chain, and
- [NUCL] signifie un acide nucléique se liant spécifiquement au Facteur IX/IXa humain de formule (I) ou (II).  [NUCL] means a nucleic acid specifically binding to human Factor IX / IXa of formula (I) or (II).
Le support solide peut être une colonne de chromatographie d'affinité composée d'un gel dérivé de l'agarose, de la cellulose ou d'un gel synthétique tel qu'un dérivé acrylamide, méthacrylate ou polystyrène, une puce telle qu'une puce adaptée à la résonance plasmonique de surface, une membrane telle qu'une membrane polyamide, polyacrylomtrile ou polyester, une bille magnétique ou paramagnétique.  The solid support may be an affinity chromatography column composed of a gel derived from agarose, cellulose or a synthetic gel such as an acrylamide, methacrylate or polystyrene derivative, a chip such as a chip adapted to the surface plasmon resonance, a membrane such as a polyamide, polyacrylomtrile or polyester membrane, a magnetic or paramagnetic ball.
La présente invention est également relative à un complexe entre :  The present invention also relates to a complex between:
(i) une substance choisie parmi un acide nucléique de formule (I) ou (II), un composé de formule (III) et un composé de formule (IV), et  (i) a substance selected from a nucleic acid of formula (I) or (II), a compound of formula (III) and a compound of formula (IV), and
(ii) un Facteur LX/IXa humain.  (ii) a human LX / IXa factor.
La présente invention a aussi pour objet un support pour l'immobilisation du The present invention also relates to a support for the immobilization of the
Facteur IX/IXa humain, caractérisé en ce qu'il comprend un matériau support solide sur lequel sont greffées une pluralité de molécules consistant chacune en, ou comprenant chacune, un aptamère nucléique, lesdites molécules étant choisies parmi (a) un acide nucléique de formule (I) ou (II), (b) un composé de formule (ΙΠ) et (c) un composé de formule (rV). Human IX / IXa factor, characterized in that it comprises a solid support material on which are grafted a plurality of molecules each consisting of or each comprising a nucleic aptamer, said molecules being chosen from (a) a nucleic acid of formula (I) or (II), (b) a compound of formula (ΙΠ) and (c) a compound of formula (RV).
Le support ci-dessus peut être utilisé pratiquement dans toutes les applications pour lesquelles on cherche à immobiliser le Facteur IX/IXa humain, ce qui englobe les applications à des fins de purification du Facteur IX/IXa et les applications à des fins de détection du Facteur ΓΧ/IXa humain.  The above support can be used in virtually any application for which human Factor IX / IXa is to be immobilized, including applications for the Purification of Factor IX / IXa and applications for the detection of Factor IX / IXa. Human factor ΓΧ / IXa.
La réalisation de supports sur lesquels sont immobilisés des aptamères nucléiques de l'invention se liant spécifiquement au Facteur IX/IXa humain est illustrée dans les exemples, dans lesquels les aptamères de l'invention sont utilisés notamment comme agents de capture du Facteur ΓΧ/IXa humain, utilisables pour la purification ou pour la détection du Facteur IX/IXa humain dans des échantillons. La présente invention concerne donc aussi un procédé pour l'immobilisation du facteur IX IXa humain sur un support, comprenant une étape au cours de laquelle on met en contact un échantillon comprenant du Facteur IX/IXa humain avec un support solide sur lequel a été préalablement immobilisée une substance choisie parmi un acide nucléique de formule (I) ou (II), un composé de formule (III) et un composé de formule (Γν). The production of supports on which are immobilized nucleic aptamers of the invention specifically binding to the human factor IX / IXa is illustrated in the examples, in which the aptamers of the invention are used in particular as agents for capturing the ΓΧ / IXa factor. human, usable for purification or for the detection of human factor IX / IXa in samples. The present invention therefore also relates to a method for the immobilization of human factor IXa IXa on a support, comprising a step during which a sample comprising human factor IX / IXa is brought into contact with a solid support on which was previously immobilized a substance selected from a nucleic acid of formula (I) or (II), a compound of formula (III) and a compound of formula (Γν).
Ledit procédé peut comprendre, selon les objectifs techniques poursuivis, une étape additionnelle de récupération des molécules de Facteur IX/IXa humain immobilisées, complexées avec les molécules d'acides nucléiques de formule (I) ou (II). L'étape additionnelle de récupération du Facteur ΓΧ/IXa consiste préférentiellement en une étape de mise en contact des complexes de Facteur ΓΧ lXa avec les acides nucléiques de formule (I) ou (II) avec un agent chélateur des cations métalliques, tels que l'EDTA ou l'EGTA.  Said method may comprise, according to the technical objectives pursued, an additional step of recovering immobilized human IX / IXa molecules complexed with the nucleic acid molecules of formula (I) or (II). The additional step of recovering the ΓΧ / IXa Factor preferably consists of a step of contacting the Factor ΓΧ lXa complexes with the nucleic acids of formula (I) or (II) with a metal cation chelating agent, such as EDTA or EGTA.
La présente invention a encore pour objet un procédé pour la purification du Facteur IX IXa humain comprenant les étapes suivantes :  The present invention also relates to a process for the purification of human IXa IXa Factor comprising the following steps:
a) mettre en contact un échantillon comprenant du Facteur IX/IXa humain avec un acide nucléique de formule (I) ou (II), un composé de formule (III), un composé de formule a) contacting a sample comprising human factor IX / IXa with a nucleic acid of formula (I) or (II), a compound of formula (III), a compound of formula
(IV) ou avec un support solide tel que défini dans la présente description, afin de former un complexe entre (i) ledit acide nucléique, ou ledit composé, ou ledit support et (ii) le Facteur IX/IXa humain, et (IV) or with a solid support as defined in the present description, to form a complex between (i) said nucleic acid, or said compound, or said support and (ii) human factor IX / IXa, and
b) libérer le Facteur ΓΧ/IXa humain à partir du complexe former à l'étape a) et récupérer le Facteur X/IXa humain purifié.  b) releasing the human ΓΧ / IXa Factor from the complex formed in step a) and recovering the purified human factor X / IXa.
Pour la réalisation de procédés de purification de protéine par chromatographie d'affinité en utilisant des supports solides sur lesquels sont immobilisés les aptamères d'intérêt, l'homme du métier peut se référer aux travaux décrits par Romig et al. (1999, J Chomatogr B Biomed Sci Api, Vol. 731 (2) : 275-284).  For carrying out protein purification methods by affinity chromatography using solid supports on which the aptamers of interest are immobilized, one skilled in the art can refer to the works described by Romig et al. (1999, Chomatogr B Biomed Sci Api, Vol 731 (2): 275-284).
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé comprend une étape a'), l'étape a' suivant l' étape a) et précédant l' étape b), qui consiste en une étape de lavage du support d'affinité avec un tampon de lavage.  In a particular embodiment, the method comprises a step a '), step a' following step a) and preceding step b), which consists of a step of washing the affinity support with a buffer washing.
Avantageusement, le procédé comprend une étape a') de lavage du support d'affinité au cours de laquelle on augmente la force ionique, c'est à dire qu'on utilise un tampon de lavage dont la force ionique est augmentée par rapport à la force ionique du tampon utilisé à l'étape a). Avantageusement, la force ionique du tampon de lavage utilisé à l'étape a') est supérieure de 2 à 500 fois par rapport à la force ionique du tampon utilisé à l'étape a). Avantageusement, la force ionique du tampon de lavage est supérieure de 100 à 500 fois, de préférence de 200 à 500 fois, par rapport à la force ionique du tampon utilisé à l'étape a). Un tampon de lavage ayant une force ionique élevée, en particulier un tampon ayant une concentration élevée en NaCl, permet d'éliminer efficacement les substances liées de manière non-spécifique au support d'affinité sans simultanément affecter de manière détectable la liaison du Facteur IX au support d'affinité. Advantageously, the process comprises a step a ') of washing the affinity support during which the ionic strength is increased, that is to say that a washing buffer is used whose ionic strength is increased relative to the ionic strength of the buffer used in step a). Advantageously, the ionic strength of the washing buffer used in step a ') is greater by 2 to 500 times with respect to the ionic strength of the buffer used in step a). Advantageously, the ionic strength of the washing buffer is greater by 100 to 500 times, preferably 200 to 500 times, relative to the ionic strength of the buffer used in step a). A wash buffer having a high ionic strength, particularly a buffer having a high concentration of NaCl, effectively removes non-specific affinity-bound substances without simultaneously affecting Factor IX binding in a detectable manner. to the affinity support.
A l'étape a'), on utilise ainsi de préférence un tampon de lavage ayant une concentration finale en NaCl d'au moins 0,5 M.  In step a '), a wash buffer having a final NaCl concentration of at least 0.5M is preferably used.
Selon l'invention, un tampon de lavage ayant une concentration finale en NaCl d'au moins 0,5 M englobe les tampons de lavage ayant une concentration finale en NaCl d'au moins 1 M, 1,5 M, 2 M, 2,5 M ou au moins 3 M.  According to the invention, a wash buffer having a final NaCl concentration of at least 0.5 M includes wash buffers having a final NaCl concentration of at least 1 M, 1.5 M, 2 M, 2 , 5 M or at least 3 M.
De préférence un tampon de lavage utilisé à l'étape a') du procédé a une concentration finale en NaCl d'au plus 3,5 M. Avantageusement, un tampon de lavage utilisé à l'étape a') du procédé a une concentration Finale en NaCl comprise entre 0,5 et 3,5, de préférence entre 1,5 et 3,5, y compris de préférence entre 2 et 3,5, par exemple de préférence entre 2,5 et 3,5.  Preferably, a washing buffer used in step a ') of the process has a final NaCl concentration of at most 3.5 M. Advantageously, a washing buffer used in step a') of the process has a concentration of Final NaCl between 0.5 and 3.5, preferably between 1.5 and 3.5, preferably between 2 and 3.5, for example preferably between 2.5 and 3.5.
Selon un mode de réalisation particulier, le tampon de lavage utilisé à l'étape a') contient à la fois du NaCl et du propylène glycol.  According to a particular embodiment, the washing buffer used in step a ') contains both NaCl and propylene glycol.
De plus, dans certains modes de réalisation du procédé de purification ci-dessus, l'étape b) est réalisée par la mise en contact du support d'affinité avec un tampon d'élution contenant un agent chélateur des ions divalents, de préférence l'EDTA ou l'EGTA.  In addition, in some embodiments of the above purification method, step b) is performed by contacting the affinity support with an elution buffer containing a divalent ion chelating agent, preferably EDTA or EGTA.
A titre illustratif, le tampon d'élution peut contenir une concentration finale d'EDTA d'au moins 1 mM et d'au plus 300 mM.  By way of illustration, the elution buffer may contain a final concentration of EDTA of at least 1 mM and at most 300 mM.
L'expression « au moins 1 mM » englobe au moins 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 mM. The term "at least 1 mM" includes at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 mM.
L'expression « au plus 300 mM » englobe au plus 290, 280, 270, 260, 250, 240, 230, 220, 210, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120 ou 110 mM. The term "not more than 300 mM" includes not more than 290, 280, 270, 260, 250, 240, 230, 220, 210, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120 or 110 mM .
De plus, la fabrication d'un support d'affinité comprenant un aptamère nucléique de l'invention et la réalisation d'un procédé de purification du Facteur ΓΧ humain avec ledit support d'affinité est illustrée dans les exemples.  In addition, the manufacture of an affinity support comprising a nucleic aptamer of the invention and the realization of a method of purifying human Factor avec with said affinity support is illustrated in the examples.
De manière générale, les supports solides sur lesquels peuvent être immobilisés les aptamères de l'invention englobent tout type de support ayant la structure et la composition retrouvée communément pour les supports de filtre, de support de silicium pour des puces, des membranes, etc. Les supports solides englobent notamment les résines, les résines pour colonne de chromatographie d'affinité, les billes de polymères, les billes magnétiques, etc. Les supports solides englobent aussi notamment les matériaux à base de verre ou de métal, tels que l'acier, l'or, l'argent, l'aluminium, le cuivre, le silicium, le verre, la céramique. Les supports solides englobent aussi notamment des matériaux polymères, tels qu'un polyéthylène, un polypropylène, un polyamide, un fluorure de polyvinylidène, et des combinaisons de ceux-ci. In general, the solid supports on which the aptamers of the invention can be immobilized include any type of support having the structure and composition commonly found for filter supports, silicon support for chips, membranes, etc. Solid supports include resins, resins for affinity chromatography columns, polymer beads, magnetic beads, and the like. Solid supports also include glass or metal-based materials such as steel, gold, silver, aluminum, copper, silicon, glass and ceramics. Media solids also include, in particular, polymeric materials, such as polyethylene, polypropylene, polyamide, polyvinylidene fluoride, and combinations thereof.
Le support solide peut être revêtu avec un matériau facilitant l'attachement, la fixation, la formation de complexes, l'immobilisation ou l'interaction avec les aptamères.  The solid support may be coated with a material facilitating attachment, fixation, complex formation, immobilization or interaction with aptamers.
Dans certains modes de réalisation, le support solide est une lame de verre dont la surface est revêtue d'une couche d'or, d'une couche ayant subi un traitement par carboxyméthylation, d'une couche de dextran, de collagène, d'avidine, de streptavidine, etc.  In some embodiments, the solid support is a glass slide whose surface is coated with a gold layer, a carboxymethylation-treated layer, a layer of dextran, collagen, avidin, streptavidin, etc.
De cette manière, les aptamères selon P invention peuvent être immobilisés sur le support solide par l'intermédiaire d'un revêtement d'attachement, comme par exemple décrit ci-dessus, soit par réaction chimique avec création de liaisons covalentes, soit par association par des liaisons non covalentes telles que des liaisons hydrogène, des forces électrostatiques, des forces de Van der Waals, etc.  In this way, the aptamers according to the invention can be immobilized on the solid support via an attachment coating, as for example described above, either by chemical reaction with creation of covalent bonds, or by association with non-covalent bonds such as hydrogen bonds, electrostatic forces, Van der Waals forces, etc.
Selon l'invention, par « support d'affinité », on entend de manière générale un support formé d'un matériau solide sur lequel on a immobilisé des aptamères nucléiques tels que définis dans la présente description.  According to the invention, the term "affinity support" generally means a support formed of a solid material on which nucleic aptamers as defined in the present description have been immobilized.
Les exemples ci-après décrivent un mode de réalisation de support solide sur lequel sont immobilisés, par des liaisons non covalentes, les aptamères de l'invention.  The following examples describe an embodiment of a solid support on which the aptamers of the invention are immobilized by non-covalent bonds.
Dans les exemples, on décrit notamment un support solide consistant en une lame de verre revêtue d'une couche de molécules de streptavidine, et des aptamères de l'invention conjugués à une molécule de biotine qui sont immobilisé sur le support par association non covalente biotine/streptavidine.  In the examples, there is described in particular a solid support consisting of a glass slide coated with a layer of streptavidin molecules, and aptamers of the invention conjugated to a biotin molecule which are immobilized on the support by non-covalent association biotin / streptavidin.
Dans certains modes de réalisation, les aptamères de l'invention peuvent être immobilisés sur un support solide adapté pour la chromatographie d'affinité, l'électrochromatographie et P électrophorèse capillaire, comme décrit par exemple par Ravel et et al. (2006, J Chromatogr A, Vol. 117(1) : 1-10), Connor et al. (2006, J Chromatogr A, Vol. 111(2) : 115-119), Cho et al. (2004, Electrophoresis, Vol. 25 (21-22) : 3730-3739) ou encore Zhao et al. (2008, Anal Chem, Vol. 80(10) : 3915-3920).  In some embodiments, the aptamers of the invention can be immobilized on a solid support suitable for affinity chromatography, electrochromatography and capillary electrophoresis, as described for example by Ravel et al. (2006, J Chromatogr A, Vol 117 (1): 1-10), Connor et al. (2006, J Chromatogr A, Vol 111 (2): 115-119), Cho et al. (2004, Electrophoresis, Vol 25 (21-22): 3730-3739) or Zhao et al. (2008, Anal Chem, Vol 80 (10): 3915-3920).
Un aptamère de formule (I) ou (II) selon l'invention et se liant spécifiquement au Facteur ΓΧ/LXa humain, un composé de formule (III), ou un composé de formule (IV), peuvent être aussi avantageusement utilisés comme agent de capture du FIX/IXa humain, dans des procédés et dispositifs de détection ou de diagnostic.  An aptamer of formula (I) or (II) according to the invention and specifically binding to the human factor ΓΧ / LXa, a compound of formula (III), or a compound of formula (IV) may also be advantageously used as an agent. capture of human FIX / IXa in detection or diagnostic methods and devices.
Selon encore un autre aspect, la présente invention concerne aussi un procédé pour détecter la présence de Facteur ΓΧ IXa humain dans un échantillon comprenant les étapes suivantes : a) mettre en contact (1) un acide nucléique de formule (I) ou (II), un composé de formule (III) ou un composé de formule (IV) ou un support solide sur lequel sont immobilisés une pluralité de molécules dudit acide nucléique ou dudit composé, avec (ii) ledit échantillon; et In yet another aspect, the present invention also relates to a method for detecting the presence of human ΓΧ IXa Factor in a sample comprising the following steps: a) contacting (1) a nucleic acid of formula (I) or (II), a compound of formula (III) or a compound of formula (IV) or a solid support on which are immobilized a plurality of molecules of said acid nucleic acid or said compound, with (ii) said sample; and
b) détecter la formation de complexes entre (i) ledit acide nucléique de formule (I) ou (II), ledit composé de formule (III) ou ledit composé de formule (IV) ou ledit support et (ii) le Facteur IX/IXa.  b) detecting the formation of complexes between (i) said nucleic acid of formula (I) or (II), said compound of formula (III) or said compound of formula (IV) or said support and (ii) the Factor IX / IXa.
Les exemples de la présente demande de brevet fournissent divers modes de réalisation de procédés de détection du FIX IXa humain avec des aptamères de l'invention préalablement immobilisés sur un support solide.  The examples of the present patent application provide various embodiments of methods for detecting human FIX IXa with aptamers of the invention previously immobilized on a solid support.
Pour la réalisation d'un procédé de détection selon l'invention, le support solide utilisé peut être un support solide choisi parmi les supports solides décrits précédemment en relation avec le procédé de purification du Facteur IX/IXa humain.  For carrying out a detection method according to the invention, the solid support used may be a solid support chosen from the solid supports described above in connection with the method for purifying human factor IX / IXa.
Pour la réalisation d'un procédé ou d'un dispositif de détection du Facteur IX/IXa humain, l'homme du métier peut se référer notamment aux techniques décrites dans la demande de brevet européen n° EP 1 972 693, la demande PCT n° WO 2008/038696, la demande PCT n° WO 2008/025830, ou encore la demande PCT n° WO 2007/0322359.  For the realization of a method or a device for detecting human factor IX / IXa, a person skilled in the art can refer in particular to the techniques described in European Patent Application No. EP 1 972 693, PCT Application No. WO 2008/038696, PCT Application No. WO 2008/025830, or PCT Application No. WO 2007/0322359.
Dans certains modes de réalisation, l'étape b) de détection de la formation de complexes entre (i) ledit acide nucléique ou ledit support solide et (ii) le Facteur IX/IXa humain peut être réalisé par mesure du signal de résonance plasmonique de surface, comme cela est décrit dans les exemples.  In some embodiments, step b) of detecting complex formation between (i) said nucleic acid or said solid support and (ii) human factor IX / IXa can be performed by measuring the plasmonic resonance signal of surface, as described in the examples.
Dans certains autres modes de réalisation, l'étape b) de détection de la formation de complexes entre (i) ledit acide nucléique ou ledit support solide et (ii) le Facteur IX/IXa humain peut être réalisée par la mise en contact desdits complexes éventuellement formés avec un ligand du Facteur IX/IXa humain, ledit ligand étant détectable. Comme ligand détectable du Facteur IX/IXa humain, on peut mentionner des anticorps monoclonaux ou polyclonaux anti- IX/IXa humain, marqués avec une enzyme, en l'occurrence la peroxydase de raifort, comme cela est conventionnellement utilisé dans les tests de type ELISA.  In certain other embodiments, the step b) of detecting the formation of complexes between (i) said nucleic acid or said solid support and (ii) the human factor IX / IXa can be carried out by bringing said complexes into contact with each other. optionally formed with a human Factor IX / IXa ligand, said ligand being detectable. As the detectable ligand for human factor IX / IXa, mention may be made of monoclonal or polyclonal anti-human IX / IXa antibodies, labeled with an enzyme, in this case horseradish peroxidase, as conventionally used in ELISA type tests. .
Avantageusement, l'échantillon comprenant, ou susceptible de comprendre, du Facteur IX/IXa humain consiste en un échantillon liquide qui contient le Facteur IX/IXa humain, y compris un échantillon liquide comprenant le Facteur IX/IXa humain et qui est susceptible de contenir aussi des molécules de Facteur IX/IXa d'un mammifère non humain. Dans certains modes de réalisation du procédé de purification ou du procédé de détection ci- dessus, ledit échantillon consiste en une solution biologique, tels qu'un fluide corporel, une cellule, un broyât cellulaire, un tissu, un broyât tissulaire, un organe ou un organisme entier. Advantageously, the sample comprising or capable of comprising human factor IX / IXa consists of a liquid sample which contains the human factor IX / IXa, including a liquid sample comprising the human factor IX / IXa and which is capable of containing also factor IX / IXa molecules of a non-human mammal. In some embodiments of the purification method or detection method herein, above, said sample consists of a biological solution, such as a body fluid, a cell, a cell crushed material, a tissue, a tissue mill, an organ or an entire organism.
Dans certains modes de réalisation du procédé de purification ou du procédé de détection ci-dessus, ledit échantillon consiste en une solution biologique liquide provenant d'un animal tel que du sang, un dérivé du sang (dérivé sanguin), du lait de mammifère ou un dérivé du lait de mammifère. Ledit échantillon peut consister en du plasma, du cryoprécipité du plasma, du lait clarifié ou leurs dérivés.  In some embodiments of the purification method or detection method above, said sample consists of a liquid biological solution from an animal such as blood, a blood derivative (blood derivative), mammalian milk or a mammalian milk derivative. Said sample may consist of plasma, plasma cryoprecipitate, clarified milk or their derivatives.
Dans des modes de réalisation particulièrement préférés du procédé de purification ou du procédé de détection ci-dessus, ledit échantillon provient d'un animal transgénique pour le Facteur IX/IXa humain. Avantageusement, la solution est du lait de mammifère ou un dérivé du lait de mammifère transgénique pour le Facteur IX/IXa humain. Au sens de l'invention, les animaux transgéniques englobent (î) les mammifères non humains tels que les vaches, les chèvres, les lapins, les porcs, les singes, les rats ou les souris, (ii) les oiseaux ou encore (iii) les insectes tels que les moustiques, les mouches ou les vers à soie. Dans certains modes de réalisation préférés, l'animal transgénique pour le Facteur IX/IXa humain est un mammifère transgénique non humain, de manière tout à fait préférée une lapine transgénique pour le Facteur IXIXa humain. Avantageusement, le mammifère transgénique produit le Facteur IX/IXa recombinant dans ses glandes mammaires, du fait de l'insertion dans son génome d'une cassette d'expression comprenant un acide nucléique codant le Facteur IX/IXa humain qui est placé sous le contrôle d'un promoteur spécifique permettant l'expression de la protéine transgénique dans le lait dudit mammifère transgénique.  In particularly preferred embodiments of the above purification method or detection method, said sample is derived from a transgenic animal for human factor IX / IXa. Advantageously, the solution is mammalian milk or a transgenic mammalian milk derivative for human factor IX / IXa. For the purposes of the invention, the transgenic animals include (i) non-human mammals such as cows, goats, rabbits, pigs, monkeys, rats or mice, (ii) birds or (iii) ) insects such as mosquitoes, flies or silkworms. In certain preferred embodiments, the human factor IX / IXa transgene animal is a non-human transgenic mammal, most preferably a transgenic rabbit for human factor IXIXa. Advantageously, the transgenic mammal produces the recombinant factor IX / IXa in its mammary glands, because of the insertion into its genome of an expression cassette comprising a nucleic acid encoding human factor IX / IXa which is under control. a specific promoter allowing the expression of the transgene protein in the milk of said transgenic mammal.
Une méthode de production du Facteur IX/IXa humain dans le lait d'un animal transgénique peut comporter les étapes suivantes : une molécule d'ADN comprenant un gène codant le Facteur IX/IXa humain, ledit gène étant sous le contrôle d'un promoteur d'une protéine sécrétée naturellement dans le lait (tels que le promoteur de la caséine, de la béta- caséine, de la lactalbumine, de la béta-lactoglobuline ou le promoteur WAP) est intégrée dans un embryon d'un mammifère non humain. L'embryon est ensuite placé dans une femelle de mammifère de la même espèce. Une fois que le mammifère issu de l'embryon s'est suffisamment développé, la lactation du mammifère est induite, puis le lait collecté. Le lait contient alors le Facteur IX/IXa humain.  One method of producing human factor IX / IXa in the milk of a transgenic animal may comprise the following steps: a DNA molecule comprising a gene encoding human factor IX / IXa, said gene being under the control of a promoter of a naturally secreted protein in the milk (such as the casein, beta-casein, lactalbumin, beta-lactoglobulin promoter or the WAP promoter) is integrated into an embryo of a non-human mammal. The embryo is then placed in a female mammal of the same species. Once the mammal from the embryo has grown sufficiently, the lactation of the mammal is induced, then the milk collected. The milk then contains human factor IX / IXa.
Un exemple de procédé de préparation de protéine dans le lait d'une femelle de mammifère autre que l'être humain est donné dans le document EP 0 527 063, dont l'enseignement peut être repris pour la production de la protéine de l'invention. Un plasmide contenant le promoteur WAP (Whey Acidic Protein) est fabriqué par introduction d'une séquence comportant le promoteur du gène WAP, ce plasmide étant réalisé de manière à pouvoir recevoir un gène étranger placé sous la dépendance du promoteur WAP. Le plasmide contenant le promoteur et le gène codant pour la protéine de l'invention sont utilisés pour obtenir des lapines transgéniques, par microinjection dans le pronucléus mâle d'embryons de lapines. Les embryons sont ensuite transférés dans l'oviducte de femelles hormonalement préparées. La présence des transgènes est révélée par la technique de Southern Blot à partir de l'ADN extrait des lapereaux transgéniques obtenus. Les concentrations de la protéine transgénique dans le lait des animaux sont évaluées à l'aide de tests radioimmunologiques spécifiques. An example of a process for the preparation of protein in the milk of a female mammal other than the human is given in EP 0 527 063, the teaching of which may be repeated for the production of the protein of the invention. . A plasmid containing the WAP (Whey Acidic Protein) promoter is made by introducing a sequence comprising the promoter of the WAP gene, this plasmid being made so as to be able to receive a foreign gene placed under the control of the WAP promoter. The plasmid containing the promoter and the gene coding for the protein of the invention are used to obtain transgenic rabbits by microinjection into the male pronucleus of rabbit embryos. The embryos are then transferred into the oviduct of hormonally prepared females. The presence of the transgenes is revealed by the Southern Blot technique from the DNA extracted from the transgenic rabbits obtained. The concentrations of the transgene protein in animal milk are evaluated using specific radioimmunoassays.
D'autres documents décrivent des procédés de préparation de protéines dans le lait d'une femelle de mammifère autre que l'homme. On peut citer, sans s'y limiter, les documents US 7,045,676 (souris transgénique) et EP 1 739 170 (production de facteur von Willebrand dans un mammifère transgénique).  Other documents describe methods for preparing proteins in milk of a female mammal other than man. These include, but are not limited to, US 7,045,676 (transgenic mouse) and EP 1,739,170 (production of von Willebrand factor in a transgenic mammal).
Selon d'autres aspects de la présente invention, un acide nucléique selon l'invention et se liant spécifiquement au Facteur IX/IXa humain peut être utilisé in vivo, dans des situations physiologiques nécessitant de provoquer une inhibition de l'activation du Facteur X par le Facteur LXa, par exemple en inhibant la formation d'un complexe fonctionnel Facteur IXaFacteur VHIa.  According to other aspects of the present invention, a nucleic acid according to the invention and specifically binding to human Factor IX / IXa can be used in vivo, in physiological situations requiring the inhibition of Factor X activation by Factor LXa, for example by inhibiting the formation of a functional complex Factor IXaFactor VHIa.
En d'autres termes, un acide nucléique aptamère tel que défini dans la présente description peut aussi être utilisé, à titre préventif ou curatif, en tant que principe actif anticoagulant d'un médicament.  In other words, an aptamer nucleic acid as defined in the present description can also be used, as a preventive or curative, as anticoagulant active ingredient of a drug.
En particulier, un acide nucléique aptamère tel que défini dans la présente description peut être utilisé comme principe actif préventif ou curatif anticoagulant, notamment pour le traitement de troubles de la coagulation incluant les thromboses veineuses, les thromboses artérielles, les thromboses post-chirurgicales, les troubles associés aux pontages coronariens (CABG), les accidents vasculaires cérébraux, les angioplasties coronariennes percutanées transdermiques (PTCA), les métastases tumorales, les réactions inflammatoires non-sévères ou sévères, les chocs septiques, l'hypotension, le syndrome de détresse respiratoire aigu (ARDS), les embolismes pulmonaires, la coagulation intravasculaire disséminée (DIC), les resténoses vasculaires, le dépôt de plaquettes, l'infarctus du myocarde, l'angiogénèse, et tout traitement prohylactique d'hommes ou de femmes ayant un risque de développer une thrombose.  In particular, an aptamer nucleic acid as defined in the present description may be used as a preventive or curative anticoagulant active ingredient, in particular for the treatment of coagulation disorders including venous thromboses, arterial thromboses, post-surgical thromboses, coronary artery bypass (CABG) disorders, stroke, percutaneous transdermal coronary angioplasty (PTCA), tumor metastasis, non-severe or severe inflammatory reactions, septic shock, hypotension, acute respiratory distress syndrome (ARDS), pulmonary embolisms, disseminated intravascular coagulation (DIC), vascular restenosis, platelet deposition, myocardial infarction, angiogenesis, and any prohylactic treatment of men or women at risk of developing thrombosis.
La présente invention a aussi pour objet une composition pharmaceutique comprenant un acide nucléique se liant spécifiquement au facteur LX/LXa humain tel que défini dans la présente description, en combinaison avec un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables. The present invention also relates to a pharmaceutical composition comprising a nucleic acid specifically binding to human LX / LXa factor as defined in the present description, in combination with one or more pharmaceutically acceptable excipients.
La quantité d'acide nucléique aptamère anti-FIX/FIXa humain selon l'invention, dans une composition pharmaceutique, est adaptée pour permettre l'administration d'une quantité efficace de ce principe actif aux patients.  The amount of human anti-FIX / FIXa aptamer nucleic acid according to the invention, in a pharmaceutical composition, is adapted to allow the administration of an effective amount of this active ingredient to patients.
Les gammes de doses de Γ aptamère anti-FIX/FIXa humain de l'invention peut être aisément déterminée par le médecin ou le pharmacien. En général, la quantité de principe actif à administrer varie avec l'âge, la condition médicale, et le sexe du patient, ainsi qu'avec le degré d'extension de la maladie ou du degré du risque de développer la maladie, et peut être aisément déterminée par l'homme du métier.  The dosage ranges of human anti-FIX / FIXa aptamer of the invention may be readily determined by the physician or pharmacist. In general, the amount of active ingredient to be administered varies with the patient's age, medical condition, and sex, as well as with the degree of spread of the disease or degree of risk of developing the disease, and may be easily determined by those skilled in the art.
En général, une composition pharmaceutique comprend une quantité d'un aptamère anti-FIX FIXa humain allant de 1 nanogramme à 100 milligrammes par dose unitaire, mieux allant de 100 nanogrammes à 10 milligrammes par dose unitaire.  In general, a pharmaceutical composition comprises an amount of a human anti-FIX FIXa aptamer ranging from 1 nanogram to 100 milligrams per unit dose, more preferably from 100 nanograms to 10 milligrams per unit dose.
En général, une composition pharmaceutique selon l'invention comprend de 0,01% à 99,9% en poids d'un aptamère anti-FIX/FIXa, ou d'une combinaison de plusieurs aptamères anti-FLX/FIXa, et de 99,9% à 0,01% en poids d'un excipient, ou d'une combinaison d'excipients, par rapport au poids total de ladite composition.  In general, a pharmaceutical composition according to the invention comprises from 0.01% to 99.9% by weight of an anti-FIX / FIXa aptamer, or a combination of several anti-FLX / FIXa aptamers, and from 99% to 99.9% by weight of an anti-FIX / FIXa aptamer. , 9% to 0.01% by weight of an excipient, or a combination of excipients, relative to the total weight of said composition.
Dans certains modes de réalisation, ladite composition pharmaceutique comprend 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 aptamères anti-FIX/FIXa distincts.  In some embodiments, said pharmaceutical composition comprises 1, 2, 3, 4, 5 or 6 distinct anti-FIX / FIXa aptamers.
Pour réaliser une composition pharmaceutique selon l'invention, l'homme du métier peut avantageusement se référer à l'ouvrage de Remington.  In order to produce a pharmaceutical composition according to the invention, those skilled in the art can advantageously refer to Remington's work.
La composition pharmaceutique selon l'invention peut être utilisée de manière prophylactique et/ou thérapeutique. L'administration d'une composition pharmaceutique selon l'invention peut être réalisée de plusieurs façons, y compris, mais sans s'y limiter, par voie locale et cutanéo-muqueuse, par voie entérale ou par voie parentérale.  The pharmaceutical composition according to the invention can be used prophylactically and / or therapeutically. The administration of a pharmaceutical composition according to the invention can be carried out in several ways, including but not limited to, locally and mucocutaneously, enterally or parenterally.
Par « voie locale et cutanéo-muqueuse », on entend notamment désigner la voie topique, intra-aunculaire, intravaginal, intrautérin, en inhalation, transdermique, oculaire, ou mtravésicale.  The term "local and mucocutaneous route" is intended in particular to designate the topical, intravenous, intravaginal, intrauterine, inhalation, transdermal, ocular, or m-vesical route.
Par « voie entérale », on entend notamment désigner la voie, intrarectal, sublingual, buccal, nasal, intrastomacal ou intrajéjunal.  By "enteral route" is meant in particular the route, intrarectal, sublingual, oral, nasal, intrastagmal or intrajejunal.
Par « voie parentérale », on entend notamment désigner la voie intradermique, sous-cutané, intramusculaire, intracardiaque, intravasculaire, intraveineuse, intra-oculaire, mtra-artériel, épidural, mtrarachidien, extracorporel, mtrathécal, intrapéritionéal, intrapleural, mtraluminal, intravitréal, intracavemeux, intraventriculaire, intraosseux, palatin, intra- articlaire, intracellulaire, pulmonaire ou intrafoetal. By "parenteral route" is meant in particular the intradermal, subcutaneous, intramuscular, intracardiac, intravascular, intravenous, intraocular, meta-arterial, epidural, mastrarachidian, extracorporeal, mtrathecal, intraperitoneal, intrapleural, mtraluminal, intravitreal, intracavemous, intraventricular, intraosseous, palatal, intra-articular, intracellular, pulmonary or intrafoetal.
De préférence, l'administration d'une composition pharmaceutique selon l'invention peut être faite par voie intra-veineuse.  Preferably, the administration of a pharmaceutical composition according to the invention can be made intravenously.
Ainsi, un aptamère anti-FIX/FIXa humain selon la présente invention est préparé sous une forme adaptée au type d'administration choisi, par exemple sous forme liquide ou sous forme lyophilisée. Les compositions pharmaceutiques d'aptamères anti-FIX/FIXa humain selon la présente invention peuvent contenir un excipient et/ou un véhicule pharmaceutiquement acceptable, de préférence aqueux.  Thus, a human anti-FIX / FIXA aptamer according to the present invention is prepared in a form adapted to the chosen type of administration, for example in liquid form or in freeze-dried form. The pharmaceutical compositions of human anti-FIX / FIXA aptamers according to the present invention may contain an excipient and / or a pharmaceutically acceptable vehicle, preferably an aqueous vehicle.
De nombreux excipients et/ou véhicules pharmaceutiquement acceptables peuvent être utilisés, par exemple, l'eau, l'eau tamponnée, une solution saline, une solution de glycine et leurs dérivés ainsi que des agents nécessaires pour reproduire les conditions physiologiques comme par exemple des agents tampons et ajusteurs de pH, des surfactants comme l'acétate de sodium, le lactate de sodium, le chlorure de sodium, le chlorure de potassium, le chlorure de calcium, cette liste n'étant pas limitative. De plus, la composition pharmaceutique peut être stérilisée par des techniques de stérilisation bien connues de l'homme du métier. De manière générale, pour fabriquer une composition pharmaceutique conforme à l'invention, l'homme du métier peut avantageusement se référer également à la dernière édition de la Pharmacopée Européenne, par exemple à la 5è édition de la Pharmacopée Européenne publiée en janvier 2005, ou bien encore à la 6è édition de la Pharmacopée Européenne, disponible au public en juin 2007.  Many pharmaceutically acceptable excipients and / or carriers may be used, for example, water, buffered water, saline solution, glycine solution and their derivatives as well as agents necessary to reproduce physiological conditions such as buffering agents and pH adjusters, surfactants such as sodium acetate, sodium lactate, sodium chloride, potassium chloride, calcium chloride, this list not being limiting. In addition, the pharmaceutical composition can be sterilized by sterilization techniques well known to those skilled in the art. In general, to manufacture a pharmaceutical composition according to the invention, one skilled in the art can advantageously also refer to the latest edition of the European Pharmacopoeia, for example to the 5th edition of the European Pharmacopoeia published in January 2005, or again at the 6th edition of the European Pharmacopoeia, available to the public in June 2007.
Pour la fabrication d'une composition pharmaceutique comprenant un aptamère comme principe actif, l'homme du métier peut également se référer au contenu de la demande PCT n° WO 2007/058801, de la demande PCT n° WO 2005/084412 et la demande PCT n° WO 2004/047742 ou encore dans la demande PCT n° WO 2008/150495.  For the manufacture of a pharmaceutical composition comprising an aptamer as an active ingredient, one skilled in the art may also refer to the contents of PCT Application No. WO 2007/058801, PCT Application No. WO 2005/084412 and the application PCT No. WO 2004/047742 or in PCT Application No. WO 2008/150495.
Dans certains modes de réalisation d'une composition pharmaceutique selon l'invention, le ou les principes actifs aptamères anti-FIX/FIXa humain peut (peuvent) être utilisé(s) seul(s) ou en combinaison avec une ou plusieurs autres molécules pharmaceutiquement actives, y compris avec un ou plusieurs autres principes actifs anticoagulants.  In some embodiments of a pharmaceutical composition according to the invention, the human anti-FIX / FIXa aptamer active ingredient (s) may be used alone or in combination with one or more other pharmaceutically acceptable molecules. active agents, including one or more other anticoagulant active ingredients.
L'invention est également relative à un acide nucléique se liant spécifiquement au facteur IX/IXa humain, tel que défini dans la présente description, pour son utilisation en tant que médicament. L'invention a aussi trait à l'utilisation d'un acide nucléique se liant spécifiquement au facteur IX IXa humain, tel que défini dans la présente description, pour la fabrication d'un médicament pour le traitement des troubles de la coagulation, notamment incluant ceux mentionnés ci-dessus, de préférence l'hémophilie de type B. The invention also relates to a nucleic acid specifically binding to human factor IX / IXa, as defined in this specification, for use as a medicament. The invention also relates to the use of a nucleic acid specifically binding to human factor IXa IXa, as defined in the present description, for the manufacture of a medicament for the treatment of coagulation disorders, in particular including those mentioned above, preferably type B hemophilia.
L'invention concerne aussi l'utilisation d'un acide nucléique se liant spécifiquement au facteur IX/IXa humain, tel que défini dans la présente description, pour le traitement des troubles de la coagulation, notamment incluant ceux mentionnés ci-dessus, de préférence l'hémophilie de type B.  The invention also relates to the use of a nucleic acid specifically binding to human factor IX / IXa, as defined in the present description, for the treatment of coagulation disorders, in particular including those mentioned above, preferably haemophilia type B.
L'invention a aussi pour objet une méthode de prévention ou de traitement d'un trouble de la coagulation, comprenant une étape au cours de laquelle on administre, à un patient nécessitant un traitement préventif ou curatif d'un trouble de la coagulation, une composition pharmaceutique aptamère anti-FIX FIXa humain telle que définie dans la présente description.  The invention also relates to a method for preventing or treating a coagulation disorder, comprising a step in which a patient requiring a preventive or curative treatment of a coagulation disorder is administered a anti-FIXa human FIXa aptamer pharmaceutical composition as defined in the present description.
En général, on administre une dose quotidienne d'un aptamère anti-FIX/FIXa humain tel que défini dans la présente description allant de 1 nanogramme à 100 milligrammes, mieux allant de 100 nanogrammes à 10 milligrammes, pour un patient de 80 kgs.  In general, a daily dose of a human anti-FIX / FIXa aptamer as defined in the present description ranging from 1 nanogram to 100 milligrams, more preferably from 100 nanograms to 10 milligrams, is administered for a patient of 80 kgs.
La présente invention est également illustrée ci-après, sans y être limitée, aux exemples suivants. The present invention is further illustrated hereinafter, but not limited thereto, to the following examples.
EXEMPLES EXAMPLES
Exemple 1 : Modes de réalisation spécifiques d'un protocole d'interaction du Facteur IX humain avec un aptamère sur Biacore (résistance au NaO)  EXAMPLE 1 Specific Embodiments of a Human Factor IX Interaction Protocol with an aptamer on Biacore (NaO Resistance)
Matériel et Méthodes  Material and methods
On a fabriqué un support solide sur lequel ont été immobilisées des molécules d'aptamères nucléiques selon l'invention Préalablement à leur fixation sur le support solide, l'extrémité 5' des aptaméres considérés a été chimiquement couplée à une molécule de biotine.  A solid support having immobilized nucleic aptamer molecules according to the invention was prepared. Prior to their attachment to the solid support, the 5 'end of the aptamers considered was chemically coupled to a biotin molecule.
On dispose d'un support solide contenant des molécules de streptavidine immobilisées (Série S sensor Chip SA, GE)  A solid support containing immobilized streptavidin molecules is available (S sensor chip SA series, GE)
Puis, on a mis en contact le support solide ci-dessus avec les composés aptaméres ci-dessous afin d'immobiliser les acides nucléiques, par association non covalente entre les molécules de streptavidine du support et les molécules de biotine des composés aptaméres.  Then, the solid support above was contacted with the aptamer compounds below to immobilize the nucleic acids, by non-covalent association between the streptavidin molecules of the support and the biotin molecules of the aptamer compounds.
Les aptaméres considérés sont ceux figurés par les séquences SEQ ID N° 20, SEQ K) N° 23, SEQ K) N° 67, SEQ ID N° 132, SEQ ID N° 133, SEQ ID N° 134, SEQ K) N° 135, SEQ ID N° 136, SEQ ID N° 137, SEQ ID N° 139, SEQ ID N° 142, SEQ ID N°215, SEQ ID N°202, SEQ ID N°203 et SEQ ID N°206.  The aptamers considered are those represented by the sequences SEQ ID No. 20, SEQ K) No. 23, SEQ K) No. 67, SEQ ID No. 132, SEQ ID No. 133, SEQ ID No. 134, SEQ K) No. 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 203 and SEQ ID NO. 206.
L' aptamère Nonapta 1 est ainsi immobilisé avec un taux d'immobilisation d'environ 1 830 RU (1 RU correspond approximativement à 1 pg de produit immobilisé par mm2). The aptaptin Nonapta 1 is thus immobilized with an immobilization rate of approximately 1830 RU (1 RU corresponds approximately to 1 μg of immobilized product per mm 2 ).
Les aptaméres Nonapta 2 et Nonapta 3 sont ainsi immobilisés avec un taux d'immobilisation d'environ 1 950 RU.  The aptamers Nonapta 2 and Nonapta 3 are thus immobilized with an immobilization rate of approximately 1,950 RU.
L' aptamère Nonapta 3.1 (à savoir un aptamère de séquence SEQ ID N° 67 pour lequel l'extrémité 3' a été chimiquement couplée à une molécule de biotine) est ainsi immobilisé avec un taux d'immobilisation d'environ 2 050 RU.  Nonapta aptamer 3.1 (ie an aptamer of sequence SEQ ID No. 67 for which the 3 'end was chemically coupled to a biotin molecule) is thus immobilized with an immobilization level of about 2050 RU.
Les aptaméres Nonapta 5, 5.1 et 5.7 sont ainsi immobilisés avec un taux d'immobilisation, respectivement, d'environ 2 190 RU, 3 080 RU et 1 760 RU.  Nonapta aptamers 5, 5.1 and 5.7 are thus immobilized with an immobilization rate of, respectively, about 2 190 RU, 3 080 RU and 1 760 RU.
Les aptaméres Nonapta 6, 6.3 et 6.4 sont ainsi immobilisés avec un taux d'immobilisation, respectivement, d'environ 2 270 RU, 1 720 RU et 2 150 RU.  Nonapta aptamers 6, 6.3 and 6.4 are thus immobilized with an immobilization rate of approximately 2 270 RU, 1 720 RU and 2 150 RU, respectively.
L' aptamère Nonapta 7 est ainsi immobilisé avec un taux d'immobilisation d'environ 2 220 RU.  The aptaptor Nonapta 7 is thus immobilized with an immobilization rate of approximately 2 220 RU.
L' aptamère Nonapta 8 est ainsi immobilisé avec un taux d'immobilisation d'environ 2 260 RU. Du FIX humain purifié a été dilué dans du tampon de course (Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, CaCl2 2 mM, MgCl2 1 mM, pH 7,4) de manière à obtenir des échantillons de concentration 100 et 250 nM en FIX, voire pour certains des aptamères ci-dessus de concentration 500 et 1 000 nM en FIX. The Nonapta aptamer 8 is thus immobilized with an immobilization rate of approximately 2,260 RU. Purified human FIX was diluted in running buffer (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2 , pH 7.4) to obtain 100 and 250 nM samples. in FIX, or for some of the above aptamers of concentration 500 and 1000 nM in FIX.
A noter toutefois que, pour Nonapta 6, le même FIX humain purifié a été dilué dans du tampon de course (Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, CaCl2 2 mM, MgCl2 1 mM, pH 7,4) de manière à obtenir des échantillons de concentration 100, 200, 500 et 1 000 nM en FIX. Note however that, for Nonapta 6, the same purified human FIX was diluted in running buffer (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2 , pH 7.4). to obtain 100, 200, 500 and 1000 nM samples in FIX.
L'aptamère de séquence SEQ ID N°215 est immobilisé avec un taux d'immobilisation d'environ 1646 RU.  The aptamer of sequence SEQ ID No. 215 is immobilized with an immobilization rate of about 1646 RU.
L'aptamère de séquence SEQ ID N°202 est immobilisé avec un taux d'immobilisation d'environ 1752 RU.Plusieurs supports ont été fabriqués, chacun comprenant un unique aptamère spécifique parmi ceux indiqués ci-dessus.  The aptamer of sequence SEQ ID No. 202 is immobilized with an immobilization level of about 1752 RU. Several supports were made, each comprising a single specific aptamer from those indicated above.
Toutes les injections ont été réalisées avec un débit 30μ1/ιηίη pendant 60 sec après l'injection.  All injections were performed with a flow rate of 30μ1 / ιηίη for 60 sec after the injection.
Ces analyses sont effectuées avec l'appareil de RPS Biacore® T-200 (GE), sous contrôle du logiciel Biacore® T-200 Control Software (Version 1.0).  These analyzes are carried out with the RPS Biacore® T-200 (GE) device under the control of the Biacore® T-200 Control Software (Version 1.0).
Les courbes de liaison des aptamères immobilisés et décrits ci-dessus au FIX humain ont été calculées avec le module dédié du logiciel Biacore® T-200 Evaluation Software (Version 1.0).  The binding curves of the immobilized aptamers described above in the human FIX were calculated with the dedicated module of the Biacore® T-200 Evaluation Software (Version 1.0).
Ces résultats ont permis de déterminer que: These results determined that:
- les aptamères mis en œuvre, une fois immobilisés, se lient effectivement au FIX. Ces résultats sont illustrés en figures 10 à 20 et 30 à 34.  - aptamers implemented, once immobilized, actually bind to the FIX. These results are illustrated in FIGS. 10 to 20 and 30 to 34.
- la liaison au facteur ΓΧ est particulièrement significative pour les aptamères Nonapta 5, 5.1, 5.7, 6, 6.3 et 6.4, et plus particulièrement l'aptamère Nonapta 5.7.  the au-factor binding is particularly significant for Nonapta aptamers 5, 5.1, 5.7, 6, 6.3 and 6.4, and more particularly the Nonapta aptamer 5.7.
Ces résultats sont illustrés en figures 13 à 18.  These results are illustrated in FIGS. 13 to 18.
Exemple 2 : préparation d'un support d'affinité Example 2 Preparation of an Affinity Support
Le support d'affinité a été réalisé à partir d'un matériau de support solide consistant en une matrice sur laquelle on a greffé de la streptavidine (streptavidin-agarose - Novagen®). The affinity support was made of a solid carrier material consisting of a matrix having grafted streptavidin (streptavidin-agarose - Novagen ®).
On a introduit un volume de 1 ml de gel dans un conteneur consistant en une colonne (i.d. 11mm). On a lavé le gel avec de l'eau purifiée, pour éliminer le solvant de stockage. Les caractéristiques du gel sont : A volume of 1 ml of gel was introduced into a container consisting of a column (ID 11mm). The gel was washed with purified water to remove the storage solvent. The characteristics of the gel are:
- Capacité d'adsorption de biotine : > 85 nanomole / ml de gel  - Biotin adsorption capacity:> 85 nanomole / ml of gel
- Test fonctionnel : Capture >99% de thrombine biotinylée en 30 minutes à TA - Autres tests : Protease-free , endo/exonucléase-free, RNase-free.  - Functional test: Capture> 99% biotinylated thrombin in 30 minutes at RT - Other tests: Protease-free, endo / exonuclease-free, RNase-free.
- Conservateur : 100 mM sodium phosphate pH7,5 + NaN3 0,02  - Preservative: 100 mM sodium phosphate pH7.5 + NaN3 0.02
La sortie de la colonne conditionnée (« packée ») (Hauteur de lit de gel = 1cm) est connectée à un détecteur d'absorbance équipé d'un filtre UV à 254 nm et d'un enregistreur. The conditioned column outlet ("packaged") (gel bed height = 1cm) is connected to an absorbance detector equipped with a UV filter at 254 nm and a recorder.
Les aptamères nucléiques anti-FIX humain biotinylés selon l'invention, et notamment ceux considérés en exemple 1 ci-dessus, sont solubilisés dans de l'eau purifiée à la concentration finale de 0,5 mg/0,187 ml, soit une concentration molaire finale de 0,1 mM. La solution d'aptamères nucléiques a été activée à 95°C selon le cycle standard, pour l'immobilisation des aptamères sur le matériau support solide.  The biotinylated human anti-FIX nucleic aptamers according to the invention, and in particular those considered in Example 1 above, are solubilized in purified water at the final concentration of 0.5 mg / 0.187 ml, ie a final molar concentration. 0.1 mM. The nucleic aptamer solution was activated at 95 ° C according to the standard cycle, for aptamer immobilization on the solid support material.
La solution d'aptamères nucléiques a été préalablement diluée par 4,8 ml d'eau purifiée puis 1,5 ml de tampon Me++ (5 x concentré). The nucleic aptamer solution was previously diluted with 4.8 ml of purified water and then 1.5 ml of Me ++ buffer (5 × concentrated).
Le détecteur d'absorbance est ajusté à 1 AUFS (Absorbance Unit Full Scale) et on enregistre la DO à 254 nm de cette solution à 0,575 UA254.  The absorbance detector is adjusted to 1 AUFS (Absorbance Unit Full Scale) and the OD at 254 nm of this solution is recorded at 0.575 UA254.
La solution d'aptamères nucléiques biotinylés est injectée sur le gel streptavidin- agarose pré-conditionnée (« prépackée ») et mise en recirculation avec une pompe péristaltique à un débit de 2,5 ml/minute, soit un temps de contact sur le gel de 24 secondes (entrée/sortie E/S). Dans ces conditions, la DO à 254 nm se stabilise rapidement à 0,05 UA254, soit une valeur de 91% de couplage théorique, c'est-à-dire 0,455 mg d'aptamères nucléiques par millilitre de gel.  The solution of biotinylated nucleic aptamers is injected onto the prepackaged streptavidin-agarose gel ("prepackaged") and recirculated with a peristaltic pump at a flow rate of 2.5 ml / minute, ie a contact time on the gel. 24 seconds (input / output I / O). Under these conditions, the OD at 254 nm stabilizes rapidly at 0.05 AU254, a value of 91% theoretical coupling, that is to say 0.455 mg of nucleic aptamers per milliliter of gel.
Un lavage avec un tampon 10 mM CaCl2 + 4 mM MgCl2 puis en NaCl 2M est réalisé, afin d'éliminer les aptamères nucléiques qui ne sont pas fixées spécifiquement aux molécules de streptavidine greffées sur le matériau de support solide. Exemple 3 : Procédé de purification du Facteur IX humain Washing with a 10 mM CaCl 2 + 4 mM MgCl 2 and then 2M NaCl buffer was performed to remove nucleic aptamers that were not specifically attached to streptavidin molecules grafted onto the solid support material. Example 3 Method for Purifying Human Factor IX
A. Matériel et Méthodes  A. Materials and Methods
A l. Le support de chromatographie d'affinité  A l. The affinity chromatography support
Matière Gel d'affinité sur lequel on a immobilisé l'aptamère Nonapta 5.1 de séquence SEQ ID No. l, couplé directement à la biotine, sans chaîne espaceur entre l'aptamère et la biotine. L'aptamère est immobilisé sur un gel streptavidine (Fournisseur Novagen) grâce à une biotine en 5' terminal avec une densité de ligand théorique 0,4 mg/ml : volume 1 ml packé dans une colonne XK16 (GE). Matter Affinity gel on which the nonapta aptamer 5.1 of sequence SEQ ID No. 1, immobilized directly with biotin, without a spacer chain between the aptamer, was immobilized. and biotin. The aptamer is immobilized on a streptavidin gel (Novagen supplier) using a 5 'terminal biotin with a theoretical ligand density of 0.4 mg / ml: 1 ml volume packaged in an XK16 (GE) column.
Le produit de départ de Facteur IX est du Betafact 94 UI/mL - 1 mL.  The starting material of Factor IX is Betafact 94 IU / mL - 1 mL.
A.2. Le protocole de purification A.2. The purification protocol
Equilibration gel : Tns-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, CaCl2 2 mM, MgCl2 1 mM, pH 7,4, Equilibration gel: 50 mM Tns-HCl, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2 , pH 7.4,
Lavage : Tampon TSP contenant 0,5 M de NaCl - 2,5 mL,  Washing: TSP buffer containing 0.5 M NaCl - 2.5 mL,
Elution : EDTA 200 mM, pH 8 - 2,5 mL,  Elution: 200 mM EDTA, pH 8 - 2.5 mL,
1 mL de Betafact est injecté avec un débit de 0,4 mL/mm en tampon d'équilibration. 1 ml of Betafact is injected with a flow rate of 0.4 ml / mm in equilibration buffer.
Après détection du pic de non retenu 2 volumes de colonne de tampon d'élution est injecté.  After detecting the peak of unretained 2 column volumes of elution buffer is injected.
On détecte les pics de protéines par mesure de la valeur d'absorbance à la longueur d'onde de 280 nanomètres.  Protein peaks are detected by measuring the absorbance value at the wavelength of 280 nanometers.
B. Résultats B. Results
Les résultats sont illustrés sur les figures 21 et 22.  The results are illustrated in Figures 21 and 22.
La Figure 21 représente la courbe des valeurs de mesure de l'absorbance à 280 nm en fonction du temps. Sur la Figure 21, le pic n°l correspond à la fraction du produit de départ qui n'a pas été retenue sur la colonne. Le pic n°2 correspond à la fraction d'élution.  Figure 21 shows the curve of measured values of absorbance at 280 nm versus time. In Figure 21, peak # 1 is the fraction of the starting material that was not retained on the column. Peak No. 2 corresponds to the elution fraction.
Le produit de départ ainsi que le produit élué a été analysé en SDS PAGE avec coloration au nitrate d'argent.  The starting product as well as the eluted product was analyzed in SDS PAGE with silver nitrate staining.
La Figure 22 représente ce gel :  Figure 22 shows this gel:
- les pistes n°l et 1 ' correspondent au produit de départ de Facteur IX Betafact. lanes 1 and 1 'correspond to the starting product of factor IX Betafact.
- les pistes n°2 et 2' correspondent à la fraction du produit de départ qui n'a pas été retenue sur la colonne. - Tracks 2 and 2 'correspond to the fraction of the starting product which has not been retained on the column.
- les pistes n°3 et 3 ' correspondent à la fraction d'élution.  tracks 3 and 3 'correspond to the elution fraction.
- les pistes n° 1 à 3 sont obtenues dans des conditions non réductrices.Tracks 1 to 3 are obtained under non-reducing conditions.
- les pistes n° Γ à 3 ' sont obtenues dans des conditions réductrices Les résultats des figures 21 et 22 montrent que l'aptamère de séquence SEQ K) N0 133 (i.e. Nonapta 5.1) est capable de lier le FIX humain et de l'éluer spécifiquement en présence d'EDTA. the tracks n ° Γ to 3 'are obtained under reducing conditions The results of FIGS. 21 and 22 show that the aptamer with sequence SEQ K) N 0 133 (ie Nonapta 5.1) is capable of binding human FIX and eluting it specifically in the presence of EDTA.
En effet, la bande correspondante au pistes 2 et 2' est particulièrement claire, voire inexistante, ce qui traduit la capacité dudit aptamère à se lier efficacement au FIX humain.  Indeed, the band corresponding to tracks 2 and 2 'is particularly clear or non-existent, which reflects the capacity of said aptamer to bind effectively to human FIX.
Exemple 4 : Modes de réalisation spécifiques d'un protocole d'interaction du Facteur IX humain avec un aptamère sur Biacore (résistance au NaCl) EXAMPLE 4 Specific Embodiments of a Human Factor IX Interaction Protocol with an aptamer on Biacore (NaCl Resistance)
Matériel et Méthodes  Material and methods
On a fabriqué un support solide sur lequel a été immobilisé du facteur IX humain. A solid support was made on which human factor IX was immobilized.
On dispose d'un support solide contenant des molécules de streptavidine immobilisées (Série S sensor Chip SA, GE) A solid support containing immobilized streptavidin molecules is available (S sensor chip SA series, GE)
Puis, on a mis en contact le support solide ci-dessus avec le facteur IX afin d'immobiliser ce dernier, via un couplage aminé.  Then, the solid support above was brought into contact with the factor IX in order to immobilize the latter, via an amine coupling.
Le facteur IX est immobilisé avec un taux d'immobilisation d'environ 7055 RU. Factor IX is immobilized with an immobilization rate of about 7055 RU.
Indépendamment les uns des autres, des aptamères de séquences SEQ ID N°173, SEQ K) N°186, SEQ ID N°168, SEQ ID N°180, SEQ ID N°152, SEQ ID N°181, SEQ K) N°196 et SEQ K) N°187 ont été dilués dans du tampon de course (Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, MgC¾ 5 mM, pH 7,4) de manière à obtenir des échantillons de concentration 1 μΜ. Independently of each other, aptamers of sequences SEQ ID No. 173, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 181, SEQ K). No. 196 and SEQ ID NO: 187 were diluted in running buffer (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 5 mM MgCl, pH 7.4) to obtain 1 μΜ concentration samples.
Toutes les injections ont été réalisées avec un débit 30μ1/ηύη pendant 60 sec après l'injection.  All injections were performed with a flow rate of 30μ1 / ηύη for 60 sec after the injection.
Ces analyses sont effectuées avec l'appareil de RPS Biacore® T-200 (GE), sous contrôle du logiciel Biacore® T-200 Control Software (Version 1.0).  These analyzes are carried out with the RPS Biacore® T-200 (GE) device under the control of the Biacore® T-200 Control Software (Version 1.0).
Les courbes de liaison des aptamères décrits ci-dessus au FIX humain immobilisés ont été calculées avec le module dédié du logiciel Biacore® T-200 Evaluation Software (Version 1.0).  The aptamer attachment curves described above to immobilized human FIX were calculated with the dedicated module of the Biacore® T-200 Evaluation Software (Version 1.0).
Ces résultats ont permis de déterminer que: These results determined that:
- les aptamères mis en œuvre se lient effectivement au FIX immobilisé, et the aptamers used effectively bind to the immobilized FIX, and
- la liaison au facteur IX est particulièrement significative pour les aptamères de séquences SEQ ID N°173, SEQ ID N°186, et SEQ ID N° 180. the binding to factor IX is particularly significant for aptamers of sequences SEQ ID No. 173, SEQ ID No. 186, and SEQ ID No. 180.
Ces résultats sont illustrés en figure 29. Exemple 5 : Procédé de purification du Facteur IX humain These results are illustrated in Figure 29. Example 5 Method for Purifying Human Factor IX
A. Matériel et Méthodes  A. Materials and Methods
A l . Le support de chromatographie d'affinité  A l. The affinity chromatography support
On prépare indépendamment les uns des autres plusieurs gels d'affinité sur lesquels on a immobilisé, respectivement, les aptamères de séquences SEQ ID N°202, SEQ JD N°204, SEQ JD N°206, SEQ ID N°207 et SEQ ID N° 134, couplés directement à la biotine, sans chaîne espaceur entre l'aptamère et la biotine. Les aptamères sont immobilisés sur un gel streptavidine (Fournisseur Novagen) grâce à une biotine en 5 ' terminal avec une densité de ligand théorique 0,4 mg/ml : volume 1 ml packé dans une colonne XK16 (GE).  Several affinity gels on which the aptamers of sequences SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 206, SEQ ID NO: 207 and SEQ ID are prepared independently of one another are independently prepared. No. 134, coupled directly to biotin, without spacer chain between aptamer and biotin. The aptamers are immobilized on a streptavidin gel (Novagen supplier) using a 5 'terminal biotin with a theoretical ligand density of 0.4 mg / ml: 1 ml volume packaged in an XK16 (GE) column.
En parallèle, on prépare un gel d'affinité sur lequel on a immobilisé l'aptamère de séquence SEQ ID N°202 couplé directement à la biotine, sans chaîne espaceur entre l'aptamère et la biotine. L'aptamère est immobilisé sur un gel NHS-sépharose activée grâce à une biotine en 5' terminal avec une densité de ligand théorique 0,4 mg/ml : volume 1 ml packé dans une colonne XK16 (GE).  In parallel, an affinity gel is prepared on which the aptamer of sequence SEQ ID No. 202 coupled directly to biotin, without a spacer chain between the aptamer and biotin, is immobilized. The aptamer is immobilized on an NHS-activated Sepharose gel using a 5 'terminal biotin with a theoretical ligand density of 0.4 mg / ml: 1 ml volume packaged in an XK16 (GE) column.
Le produit de départ de Facteur IX est du Betafact 94 UI/mL - 1 mL.  The starting material of Factor IX is Betafact 94 IU / mL - 1 mL.
A.2. Protocole de purification A.2. Purification protocol
Equilibration gel : Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, MgCl2 5 mM, pH 7,4, Lavage : Tampon TSP contenant 0,5 M de NaCl - 2,5 mL, Equilibration gel: 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 5 mM MgCl 2 , pH 7.4, Wash: TSP buffer containing 0.5 M NaCl-2.5 mL,
Elution : EDTA 200 mM, pH 8 - 2,5 mL,  Elution: 200 mM EDTA, pH 8 - 2.5 mL,
1 mL de Betafact est injecté avec un débit de 0,4 mL/min en tampon d'équilibration. 1 ml of Betafact is injected with a flow rate of 0.4 ml / min in equilibration buffer.
Après détection du pic de non retenu 2 volumes de colonne de tampon d'élution est injecté.  After detecting the peak of unretained 2 column volumes of elution buffer is injected.
On détecte les pics de protéines par mesure de la valeur d'absorbance à la longueur d'onde de 280 nanomètres.  Protein peaks are detected by measuring the absorbance value at the wavelength of 280 nanometers.
B. Résultats B. Results
Les résultats sont illustrés sur les figures 3 et 36.  The results are illustrated in Figures 3 and 36.
La Figure 35 représente un cliché d'une migration sur gel d'électrophorèse de différentes fractions issues de la première chromatographie décrite en item A ci-dessus, à savoir celle réalisée avec le gel streptavidine. Les pistes n°l et 8 correspondent au marqueur Markl2™ Standard, la piste 2 correspond au produit de départ de Facteur IX Betafact®, les pistes n°3 à 7 correspondent aux résultats de purification du facteur IX à partir du produit de départ (i.e. Betafact®) obtenus avec les acides nucléiques, respectivement, de séquences SEQ JD N°202 (=piste n°3), SEQ ID N°204 (=piste n°4), SEQ ID N°206 (=piste n°5), SEQ ID N°207 (=piste n°6) et SEQ ID N° 134 (=piste n°7), et la piste n°9 correspond au témoin, figuré par du facteur IX plasmatique. Figure 35 is a picture of an electrophoretic gel migration of different fractions from the first chromatography described in item A above, namely that carried out with the streptavidin gel. Lanes 1 and 8 correspond to the Markl2 ™ Standard marker, lane 2 corresponds to the Betafact® Factor IX starting material, the lanes 3 to 7 correspond to the results of purification of factor IX from the starting product (ie Betafact®) obtained with the nucleic acids, respectively, of SEQ ID No. 202 (= lane No. 3), SEQ ID No. 204 (= Track No. 4), SEQ ID No. 206 (= Track No. 5), SEQ ID No. 207 (= Track No. 6) and SEQ ID No. 134 (= Track No. 7), and lane 9 corresponds to the control, represented by plasma factor IX.
La Figure 36 représente un cliché d'une migration sur gel d'électrophorèse de différentes fractions issues de la seconde chromatographie décrite en item A ci-dessus, à savoir celle réalisée avec le gel NHS-sépharose activée. Les pistes n°l et 5 correspondent au marqueur Mark 12™ Standard, la piste 2 correspond au produit de départ de Facteur IX Betafact®, la piste n°3 correspond à la fraction du produit de départ qui n'a pas été retenue sur la colonne et la piste n°4 correspond au résultat de purification du facteur IX à partir du produit de départ (i.e. Betafact®) obtenus avec l'acide nucléiques de séquence SEQ ID N°202.  Figure 36 is a picture of an electrophoretic gel migration of different fractions from the second chromatography described in item A above, namely that carried out with the activated NHS-Sepharose gel. Lanes 1 and 5 correspond to the Mark 12 ™ Standard marker, lane 2 corresponds to the Betafact® Factor IX starting material, lane 3 corresponds to the fraction of the starting material that was not retained on the column and lane No. 4 corresponds to the purification result of factor IX from the starting material (ie Betafact®) obtained with the nucleic acid of sequence SEQ ID No. 202.
Les résultats des figures 35 et 36 montrent que les aptamères de séquences SEQ ID N°202, SEQ JD N°204, SEQ ID N°206, SEQ ID N°207 et SEQ ID N° 134 sont capables de lier le FIX humain. The results of FIGS. 35 and 36 show that the aptamers of sequences SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 206, SEQ ID NO: 207 and SEQ ID NO: 134 are capable of binding human FIX.

Claims

REVENDICATIONS
1. Acide nucléique se liant spécifiquement au Facteur IX/IXa humain, ledit acide nucléique étant choisi parmi : A nucleic acid specifically binding to human factor IX / IXa, said nucleic acid being selected from:
- un acide nucléique de formule (I) suivante :  a nucleic acid of formula (I) below:
[5 '-TERl ]m - [SEQ ID N°X] - [3 '-TERl]n (I), [5 '-TER1] m - [SEQ ID NO: X] - [3' -TER1] n (I),
dans laquelle :  in which :
- « [5 '-TERl]m » représente un acide nucléique comprenant entre 1 et 50 nucléotides, de préférence entre 1 et 32 nucléotides, "[5 '-TERI] m " represents a nucleic acid comprising between 1 and 50 nucleotides, preferably between 1 and 32 nucleotides,
- « [3 '-TERl]n » représente un acide nucléique comprenant entre 1 et 50 nucléotides, de préférence entre 1 et 40 nucléotides, "[3'-TER1] n " represents a nucleic acid comprising between 1 and 50 nucleotides, preferably between 1 and 40 nucleotides,
- m est un entier égal à 0 ou 1 ,  m is an integer equal to 0 or 1,
- n est un entier égal à 0 ou 1, et  n is an integer equal to 0 or 1, and
- « [SEQ JD N° X] » consiste en un acide nucléique possédant au moins 80 % d'identité en nucléotides avec un acide nucléique choisi dans le groupe constitué des acides nucléiques de séquences SEQ ID N° 146, SEQ ID N° 5, SEQ ID N° 6, SEQ ID N° 1 , SEQ ID N° 2, SEQ JD N° 3, SEQ JD N° 4, SEQ ID N° 7, SEQ ID N° 8, SEQ ID N° 144, SEQ ID N° 145, SEQ ID N° 147 et SEQ ID N° 148 ; et  "[SEQ ID NO: X]" is a nucleic acid having at least 80% nucleotide identity with a nucleic acid selected from the group consisting of nucleic acids of sequences SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 5 , SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO. ID NO: 145, SEQ ID NO: 147 and SEQ ID NO: 148; and
- un acide nucléique possédant au moins 80 % d'identité en nucléotides avec un acide nucléique choisi dans le groupe constitué des acides nucléiques de séquences SEQ ID N°189, SEQ JD N° 190, SEQ JD N°191 , SEQ ID N° 192, SEQ ID N° 193, SEQ ID N°194, SEQ JD N° 195, SEQ JD N°196, SEQ ID N° 197, SEQ ID N° 198, SEQ ID N°208, SEQ ID N°209 et SEQ ID N°210.  a nucleic acid having at least 80% nucleotide identity with a nucleic acid selected from the group consisting of the nucleic acids of sequences SEQ ID No. 189, SEQ ID No. 190, SEQ ID No. 191, SEQ ID No. 192, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 209 and SEQ ID No. 210.
2. Acide nucléique selon la revendication 1 , caractérisé en ce que la séquenceNucleic acid according to claim 1, characterized in that the sequence
SEQ JD N° X est un acide nucléique possédant au moins 80 % d'identité en nucléotides avec acide nucléique choisi parmi les séquences SEQ ID N° 146, SEQ ID N° 5 ou SEQ ID N° 6. SEQ ID No. X is a nucleic acid having at least 80% identity nucleotides with nucleic acid selected from the sequences SEQ ID No. 146, SEQ ID No. 5 or SEQ ID No. 6.
3. Acide nucléique selon l'une des revendications 1 et 2 de formule (II) suivante : 3. Nucleic acid according to one of claims 1 and 2 of formula (II) below:
[5 '-TER2]0 - [SEQ ID N°Y] - [3 '-TER2]p (II), [5 '-TER2] 0 - [SEQ ID NO Y] - [3' -TER2] p (II),
dans laquelle :  in which :
- « [5 '-TER2]0 » représente un acide nucléique comprenant entre 1 et 30 nucléotides, de préférence entre 1 et 25 nucléotides, - « [3 '-TER2]p » représente un acide nucléique comprenant entre 1 et 30 nucléotides, de préférence entre 1 et 25 nucléotides, "[5'-TER2] 0 " represents a nucleic acid comprising between 1 and 30 nucleotides, preferably between 1 and 25 nucleotides, "[3 '-TER2] p " represents a nucleic acid comprising between 1 and 30 nucleotides, preferably between 1 and 25 nucleotides,
- o est un entier égal à 0 ou 1,  o is an integer equal to 0 or 1,
- p est un entier égal à 0 ou 1, et  p is an integer equal to 0 or 1, and
- « [SEQ ID N° Y] » consiste en un acide nucléique possédant au moins 80 % d'identité en nucléotides avec un acide nucléique choisi dans le groupe constitué des acides nucléiques de séquences SEQ JD N°9 à SEQ ID N° 19, SEQ ID N° 21 , SEQ ID N° 22, SEQ JD N° 24 à SEQ ID N° 66, SEQ ID N° 68 à SEQ ID N° 130, SEQ ID N° 133, SEQ ID N° 134, SEQ JD N° 138, SEQ ID N° 140, SEQ ID N° 143, SEQ ID N° 149 à SEQ JD N° 198, de préférence de séquences SEQ ID N° 9, SEQ ID N° 21 , SEQ ID N° 45, SEQ ID N° 105, SEQ JD N° 133, SEQ ID N° 138, SEQ ID N° 140, SEQ ID N° 143, SEQ JD N°152, SEQ ID N°157, SEQ ID N° 163, SEQ ID N° 196, SEQ ID N° 168, SEQ ID N° 196, SEQ JD N° 172, SEQ ID N° 197, SEQ ID N° 198, SEQ ID N° 170, SEQ ID N° 171 et SEQ ID N° 187, et mieux de séquence SEQ ID N° 168.  "[SEQ ID NO: Y]" is a nucleic acid having at least 80% nucleotide identity with a nucleic acid selected from the group consisting of nucleic acids of sequences SEQ ID NO: 9 to SEQ ID NO: 19 , SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24 to SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68 to SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO. JD No. 138, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 149 to SEQ ID NO: 198, preferably sequences SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 45 , SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO. ID NO: 196, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 171, and SEQ ID NO. ° 187, and better of sequence SEQ ID No. 168.
4. Acide nucléique selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que : Nucleic acid according to one of the preceding claims, characterized in that:
- « [5 '-TERl] » consiste en un acide nucléique comprenant au plus 50 nucléotides, de préférence au plus 32 nucléotides, ledit acide nucléique possédant à son extrémité 5'au moins 80 %, de préférence au moins 90 %, d'identité en nucléotides avec un acide nucléique de séquence SEQ ID N°211 ou SEQ ID N°213 ;  "[5'-TER1]" is a nucleic acid comprising at most 50 nucleotides, preferably at most 32 nucleotides, said nucleic acid having at its end at least 80%, preferably at least 90%, of nucleotide identity with a nucleic acid of SEQ ID NO: 211 or SEQ ID NO: 213;
- « [3 '-TERl] » consiste en un acide nucléique comprenant au plus 50 nucléotides, de préférence au plus 32 nucléotides, ledit acide nucléique possédant à son extrémité 3 ' au moins 80 %, de préférence au moins 90 %, d'identité en nucléotides avec un acide nucléique de séquence SEQ ID N°212 ou SEQ ID N°214 ;  "[3'-TER1]" is a nucleic acid comprising at most 50 nucleotides, preferably at most 32 nucleotides, said nucleic acid having at its end 3 'at least 80%, preferably at least 90%, of nucleotide identity with a nucleic acid of SEQ ID NO: 212 or SEQ ID NO: 214;
- « [5 '-TER2] » consiste en un acide nucléique possédant au moins 80 %, de préférence au moins 90 %, d'identité en nucléotides avec un acide nucléique de séquence SEQ ID N°211 ou SEQ ID N°213 ; et  "[5'-TER2]" is a nucleic acid having at least 80%, preferably at least 90% nucleotide identity with a nucleic acid of SEQ ID NO: 211 or SEQ ID NO: 213; and
- « [3 '-TER2] » consiste en un acide nucléique possédant au moins 80 %, de préférence au moins 90 %, d'identité en nucléotides avec un acide nucléique de séquence "[3'-TER2]" is a nucleic acid having at least 80%, preferably at least 90%, nucleotide identity with a nucleic acid of sequence
SEQ ID N°212 ou SEQ ID N°214. SEQ ID No. 212 or SEQ ID No. 214.
5. Acide nucléique selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il possède au moins 80%, de préférence au moins 90 %, d'identité en nucléotides avec un acide nucléique choisi dans le groupe constitué des acides nucléiques de séquences SEQ ID N° l à 210, de préférence de séquences SEQ ID N° l à 143, mieux de séquences SEQ JD N° 9 à 210, plus particulièrement de séquences SEQ Π) N° 9 à 143, et plus préférentiell ement un acide nucléique de séquences SEQ ID N°202 ou SEQ ID N° 134. 5. Nucleic acid according to one of the preceding claims, characterized in that it has at least 80%, preferably at least 90%, identity nucleotides with a nucleic acid selected from the group consisting of nucleic acids of SEQ ID NO: 1 to 210, preferably SEQ ID NO: 1 to 143, more preferably SEQ ID NO: 9 to 210, more particularly SEQ (SEQ ID NO. No. 9 to 143, and more preferably a nucleic acid of sequences SEQ ID No. 202 or SEQ ID No. 134.
6. Acide nucléique selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que sa liaison au facteur IX/IXa humain peut être dissociée par mise en contact avec un agent chélateur des cations métalliques. 6. Nucleic acid according to any one of the preceding claims, characterized in that its binding to human factor IX / IXa can be dissociated by contact with a metal cation chelating agent.
7. Composé se liant spécifiquement au facteur IX/IXa humain, caractérisé en ce qu'il est de formule (III) suivante : 7. Compound binding specifically to human factor IX / IXa, characterized in that it has the following formula (III):
[SPAC]- [NUCL] (III), dans laquelle :  [SPAC] - [NUCL] (III), wherein:
- [SPAC] signifie une chaîne espaceur, et  - [SPAC] means a spacer chain, and
- [NUCL] signifie un acide nucléique se liant spécifiquement au Facteur IX/IXa humain de formule (I) ou (II) tel que défini dans l'une des revendications 1 à 6.  [NUCL] means a nucleic acid specifically binding to human Factor IX / IXa of formula (I) or (II) as defined in one of claims 1 to 6.
8. Composé se liant spécifiquement au facteur IX/IXa humain, caractérisé en ce qu'il est de formule (IV) suivante : 8. Compound binding specifically to human factor IX / IXa, characterized in that it has the following formula (IV):
[FIX]-[SPAC]- [NUCL] (IV), dans laquelle :  [FIX] - [SPAC] - [NUCL] (IV), wherein:
- [FIX] signifie un composé d'immobilisation sur un support,  - [FIX] means an immobilization compound on a support,
- [SPAC] signifie une chaîne espaceur, et  - [SPAC] means a spacer chain, and
- [NUCL] signifie un acide nucléique se liant spécifiquement au Facteur IX/IXa humain de formule (I) ou (Π) tel que défini dans l'une des revendications 1 à 6.  [NUCL] means a nucleic acid specifically binding to human Factor IX / IXa of formula (I) or (Π) as defined in one of claims 1 to 6.
9. Composé se liant spécifiquement au facteur IX/IXa humain, caractérisé en ce qu'il est de formule (V) suivante : 9. Compound binding specifically to human factor IX / IXa, characterized in that it has the following formula (V):
NH2-[SPAC]n- [NUCL] (V), dans laquelle : NH 2 - [SPAC] n - [NUCL] (V), wherein:
- n étant indice valant 1 ou 0, 0 signifiant que l' aptamère ne comprend pas une chaîne espaceur libre et 1 signifiant que l'aptamère comprend une chaîne espaceur. where n is an index of 1 or 0, where 0 means that the aptamer does not comprise a free spacer chain and 1 signifies that the aptamer comprises a spacer chain.
- NH2 signifie la fonction aminé réactive utilisée pour le greffage sur le support solide pré-activé par des groupes NHS, NH 2 means the reactive amine function used for grafting onto the solid support pre-activated with NHS groups,
- [SPAC] signifie une chaîne espaceur, et - [NUCL] signifie un acide nucléique se liant spécifiquement au Facteur IX/IXa humain de formule (I) ou (II) tel que défini dans l'une des revendications 1 à 6. - [SPAC] means a spacer chain, and [NUCL] means a nucleic acid specifically binding to human Factor IX / IXa of formula (I) or (II) as defined in one of claims 1 to 6.
10. Complexe entre (i) un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 ou un composé selon l'une quelconque des revendications 7 à 9 et (il) un facteur IX/IXa humain. 10. Complex between (i) a nucleic acid according to any one of claims 1 to 6 or a compound according to any one of claims 7 to 9 and (ii) a human factor IX / IXa.
11. Support pour l'immobilisation du Facteur IX/IXa humain, caractérisé en ce qu'il comprend un matériau support solide sur lequel sont greffés une pluralité d'acides nucléiques selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 ou de composés selon l'une quelconque des revendications 7 à 9. 11. Support for the immobilization of human factor IX / IXa, characterized in that it comprises a solid support material on which are grafted a plurality of nucleic acids according to any one of claims 1 to 6 or compounds according to claim 1. any of claims 7 to 9.
12. Procédé pour l'immobilisation du facteur IX/IXa humain sur un support, comprenant une étape au cours de laquelle on met en contact un échantillon comprenant du Facteur IX/IXa humain avec un support selon la revendication 11. A method for immobilizing human factor IX / IXa on a carrier, comprising a step of contacting a sample comprising human factor IX / IXa with a carrier according to claim 11.
13. Procédé pour la purification du Facteur IX/IXa humain comprenant les étapes suivantes : 13. A method for purifying human factor IX / IXa comprising the steps of:
a) mettre en contact un échantillon comprenant du Facteur IX/IXa humain avec un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, ou avec un composé selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, ou avec un support selon la revendication 11, afin de former un complexe entre (i) ledit acide nucléique, ou ledit composé, ou ledit support et (il) le Facteur IX/IXa humain, et  a) contacting a sample comprising human factor IX / IXa with a nucleic acid according to any one of claims 1 to 6, or with a compound according to any one of claims 7 to 9, or with a support according to claim 11, to form a complex between (i) said nucleic acid, or said compound, or said support, and (II) human Factor IX / IXa, and
b) libérer le Facteur IX/IXa humain à partir du complexe formé à l'étape a) et récupérer le Facteur IX/IXa humain purifié.  b) releasing Human Factor IX / IXa from the complex formed in step a) and recovering purified human Factor IX / IXa.
14. Procédé pour détecter la présence de Facteur IX/IXa humain dans un échantillon comprenant les étapes suivantes : A method for detecting the presence of human factor IX / IXa in a sample comprising the following steps:
a) mettre en contact un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 ou avec un composé selon l'une quelconque des revendications 7 à 9 ou avec un support selon la revendication 11 avec ledit échantillon; et  a) contacting a nucleic acid according to any one of claims 1 to 6 or with a compound according to any one of claims 7 to 9 or with a carrier according to claim 11 with said sample; and
b) détecter la formation de complexes entre (i) ledit acide nucléique, ou ledit composé, ou ledit support et (ii) le Facteur IX/IXa. b) detecting the formation of complexes between (i) said nucleic acid, or said compound, or said support, and (ii) Factor IX / IXa.
15. Composition pharmaceutique comprenant un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, en combinaison avec un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables. A pharmaceutical composition comprising a nucleic acid according to any one of claims 1 to 6, in combination with one or more pharmaceutically acceptable excipients.
16. Acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, pour son utilisation comme médicament. 16. Nucleic acid according to any one of claims 1 to 6 for its use as a medicament.
17. Utilisation d'un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, pour la fabrication d'un médicament pour le traitement des troubles de la coagulation, de préférence l'hémophilie de type B. 17. Use of a nucleic acid according to any one of claims 1 to 6 for the manufacture of a medicament for the treatment of coagulation disorders, preferably hemophilia type B.
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Citations (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0346241A1 (en) 1988-06-09 1989-12-13 Fondation Nationale De Transfusion Sanguine Process for preparing a factor VIIa fraction, and its use as a medicament
EP0527063A1 (en) 1991-06-12 1993-02-10 Institut National De La Recherche Agronomique Production of protein of interest in the milk of transgenic mammal
WO2002077161A2 (en) 2001-03-12 2002-10-03 Progenetics Llc Production of high levels of trangenic factor ix without gene rescue, and its therapeutic uses
WO2002096926A1 (en) 2001-05-25 2002-12-05 Duke University Modulators of pharmacological agents
WO2004047742A2 (en) 2002-11-21 2004-06-10 Archemix Corporation Multivalent aptamer therapeutics with improved pharmacodynamic properties and methods of making and using the same
WO2005084412A2 (en) 2004-03-05 2005-09-15 Archemix Corp. Controlled modulation of the pharmacokinetics and biodistribution of aptamer therapeutics
US7045676B1 (en) 1986-04-09 2006-05-16 Gtc Biotherapeutics, Inc. Transgenic animals secreting proteins into milk
EP1739170A2 (en) 1994-09-21 2007-01-03 American National Red Cross Transgenic animals expressing human coagulation factor VIII and von Willebrand factor
WO2007032359A1 (en) 2005-09-12 2007-03-22 National University Corporation Tokyo University Of Agriculture And Technology Method for detecting target molecule using aptamer/probe complex
WO2007058801A1 (en) 2005-11-16 2007-05-24 Idexx Laboratories Inc. Pharmaceutical compositions for the administration of aptamers
US7312325B2 (en) 2000-09-26 2007-12-25 Duke University RNA aptamers and methods for identifying the same
WO2008025830A2 (en) 2006-09-01 2008-03-06 Vib Vzw Pharmaceutical and sunscreen compositions comprising caspase-14
WO2008038696A1 (en) 2006-09-27 2008-04-03 National University Corporation Tokyo University Of Agriculture And Technology Method of assaying target substance in sample, aptamer molecule and method of constructing the same
EP1972693A1 (en) 2007-03-14 2008-09-24 Korea Institute of Science and Technology Method and kit for detecting a target protein using a DNA aptamer
WO2008150495A2 (en) 2007-06-01 2008-12-11 Archemix Corp. Vwf aptamer formulations and methods for use
WO2012090183A1 (en) 2010-12-30 2012-07-05 Lfb Biotechnologies Method for immobilising nucleic ligands

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103045601B (en) * 2004-04-22 2015-04-01 雷加多生物科学公司 Improved modulators of coagulation factors
RU2568579C2 (en) * 2006-05-26 2015-11-20 ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ "НоваМедика" Introduction of anti-coagulating system reg1

Patent Citations (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7045676B1 (en) 1986-04-09 2006-05-16 Gtc Biotherapeutics, Inc. Transgenic animals secreting proteins into milk
EP0346241A1 (en) 1988-06-09 1989-12-13 Fondation Nationale De Transfusion Sanguine Process for preparing a factor VIIa fraction, and its use as a medicament
EP0527063A1 (en) 1991-06-12 1993-02-10 Institut National De La Recherche Agronomique Production of protein of interest in the milk of transgenic mammal
EP1739170A2 (en) 1994-09-21 2007-01-03 American National Red Cross Transgenic animals expressing human coagulation factor VIII and von Willebrand factor
US7312325B2 (en) 2000-09-26 2007-12-25 Duke University RNA aptamers and methods for identifying the same
WO2002077161A2 (en) 2001-03-12 2002-10-03 Progenetics Llc Production of high levels of trangenic factor ix without gene rescue, and its therapeutic uses
WO2002096926A1 (en) 2001-05-25 2002-12-05 Duke University Modulators of pharmacological agents
WO2004047742A2 (en) 2002-11-21 2004-06-10 Archemix Corporation Multivalent aptamer therapeutics with improved pharmacodynamic properties and methods of making and using the same
WO2005084412A2 (en) 2004-03-05 2005-09-15 Archemix Corp. Controlled modulation of the pharmacokinetics and biodistribution of aptamer therapeutics
WO2007032359A1 (en) 2005-09-12 2007-03-22 National University Corporation Tokyo University Of Agriculture And Technology Method for detecting target molecule using aptamer/probe complex
WO2007058801A1 (en) 2005-11-16 2007-05-24 Idexx Laboratories Inc. Pharmaceutical compositions for the administration of aptamers
WO2008025830A2 (en) 2006-09-01 2008-03-06 Vib Vzw Pharmaceutical and sunscreen compositions comprising caspase-14
WO2008038696A1 (en) 2006-09-27 2008-04-03 National University Corporation Tokyo University Of Agriculture And Technology Method of assaying target substance in sample, aptamer molecule and method of constructing the same
EP1972693A1 (en) 2007-03-14 2008-09-24 Korea Institute of Science and Technology Method and kit for detecting a target protein using a DNA aptamer
WO2008150495A2 (en) 2007-06-01 2008-12-11 Archemix Corp. Vwf aptamer formulations and methods for use
WO2012090183A1 (en) 2010-12-30 2012-07-05 Lfb Biotechnologies Method for immobilising nucleic ligands

Non-Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHO ET AL., ELECTROPHORESIS, vol. 25, no. 21-22, 2004, pages 3730 - 3739
CONNOR ET AL., J CHROMATOGR A, vol. 111, no. 2, 2006, pages 115 - 119
HERMANSON G.T.: "Bioconjugate techniques, San Diego", 1996, ACADEMIC PRESS, pages: 239 - 242
HOWARD ET AL., ATHERIOSCL THROMB VASC BIOL, vol. 27, 2007, pages 722 - 727
LAYZER ET AL., SPRING, vol. 17, 2007, pages 1 - 11
RAVELET ET AL., J CHROMATOGR A, vol. 117, no. 1, 2006, pages 1 - 10
ROMIG ET AL., J CHOMATOGR B BIOMED SCI APL, vol. 731, no. 2, 1999, pages 275 - 284
RUSCONI ET AL., THROMB HAEMOST, vol. 84, no. 5, 2000, pages 841 - 848
SAMOSZUK M.K. ET AL., ANTIBODY, IMMUNOCONJUGATES RADIOPHARM., vol. 2 1, 1989, pages 37 - 46
SUBASH ET AL., THROMB HAEMOST, vol. 95, 2006, pages 767 - 771
ZHAO ET AL., ANAL CHEM, vol. 80, no. 10, 2008, pages 3915 - 3920
ZHAO ET AL., ANAL CHEM, vol. 80, no. 19, 2008, pages 7586 - 7593

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