WO2014205531A1

WO2014205531A1 - Ração enriquecida para aquicultura

Info

Publication number: WO2014205531A1
Application number: PCT/BR2014/000175
Authority: WO
Inventors: Marili Villa Nova Rodrigues RODRIGUES; Renata Antunes Estaiano DE REZENDE; Felix Guillermo Reyes REYES; Rodney Alexandre Ferreira RODRIGUES
Original assignee: Universidade Estadual De Campinas - Unicamp
Priority date: 2013-06-27
Filing date: 2014-05-26
Publication date: 2014-12-31
Also published as: BR102013016609A2

Abstract

A presente invenção descreve uma ração enriquecida com ativos e com revestimento polimérico para aquicultura, capaz de reduzir a taxa de lixiviação do ativo na água. Além de ser utilizada no controle de doenças que acometem os animais na aquicultura, incluindo a piscicultura, ranicultura e carcinicultura, também pode ser empregada, em baixas concentrações, como agente profilático durante o manejo desses animais.

Description

RAÇÃO ENRIQUECIDA PARA AQUICULTURA

Campo da Invenção

A presente invenção se refere a uma ração enriquecida para aquicultura. Mais especificamente, o presente invento trata de uma ração enriquecida com substância biologicamente ativa e revestida com polímero para redução da taxa de lixiviação do ativo para água.

Essa ração pode ser utilizada no controle de doenças que acometem os animais na aquicultura, incluindo a piscicultura, ranicultura e carcinicultura e também ser utilizada, em baixas concentrações, como agente profilático durante o manejo desses animais.

Fundamentos da Invenção

Dados recentes do Ministério da Pesca e Aquicultura (MPA) mostram que a piscicultura é um dos sistemas de criação intensiva que mais cresce no mundo, atingindo valores de 142 e 146 milhões de toneladas nos anos de 2008 e 2009, respectivamente. O Brasil, país que apresenta grande potencial para atender a demanda por produtos advindos da aquicultura, representou em 2009, apenas 0,86 % da produção mundial de pescado, produzindo 1 .240.813 toneladas durante todo o período de 2009, subindo quatro posições se comparado ao ano anterior (MPA, 2010).

No Brasil, diversas são as estruturas utilizadas nos sistemas intensivos de produção aquícola As principais estruturas de criação utilizadas na piscicultura, segundo o Censo Aquícola Nacional realizado durante o ano de 2008, são os açudes, seguidos dos viveiros escavados, tanques rede (este apresentou crescimento apenas nos últimos anos), tanques de alvenaria, caixas sem circulação de água, dentre outros.

Na piscicultura intensiva, a criação dos animais se dá a partir da possibilidade de se criar num volume pequeno de água uma alta densidade de peixes, em regime de confinamento (kg peixe/ m³) Nesse tipo de sistema de produção, os animais quase que inevitavelmente vivem em constante condição de estresse, sendo necessária a adoção das boas práticas de manejo para evitar o aparecimento de surtos infecciosos e/ ou parasitários entre os animais.

Para combater este desequilíbrio ocasionado pelo estresse, várias estratégias podem ser adotadas, sendo aquelas relacionadas ao manejo preventivo as mais adequadas. As boas práticas de manejo quando utilizadas de forma racional dentro da atividade aquícola intensiva pode promover queda na taxa de mortalidade com consequente aumento de sua produtividade.

A doença infecciosa causada por bactérias e outros patógenos é considerada um problema sério na piscicultura por representar potencial risco na produção, já que estão normalmente presentes nos ambientes e nos peixes (Martins et al., 2000). Essas infecções quando não controladas apresentam consequências graves como, por exemplo, lesões que inviabilizam sua comercialização ou elevada mortalidade causando grandes prejuízos económicos.

Para um correto tratamento das bacterioses, por exemplo, é exigido um prévio conhecimento do agente causador da enfermidade em questão. Muitas vezes, para controlar uma determinada doença faz-se necessário o uso de antibióticos que, se utilizados de forma incorreta, além de não serem efetivos durante o tratamento, podem também provocar danos como, por exemplo, o aumento da resistência bacteriana nesses animais e nos meios de produção onde eles se encontram, além de maiores taxas de resíduos no ambiente. A presença de resíduos medicamentosos, disponíveis tanto no pescado quanto no meio de produção, representa riscos à saúde humana devido à sua toxicidade, assim como potencial impacto ambiental e constitui entrave à exportação.

Para o tratamento de um animal doente na aquicultura, é necessário administrar o medicamento para toda a população que compartilha o mesmo ambiente. Nesse caso, durante a terapia, o fármaco fica disponível aos animais que apresentam dificuldades de se alimentar da ração por um determinado período de tempo, determinando assim uma maior predisposição as linhagens dos microorganismos resistentes. Somente a utilização de antibióticos não é suficiente, devendo ser associada às boas práticas de manejo (Klesius, 1995).

A grande maioria dos produtos farmacêuticos utilizados na aquicultura são bioacumulativos, podendo persistir no ambiente depois de longos períodos após a administração (Boyd & Queiroz, 2004). No caso dos antibióticos, eles podem causar variados efeitos tóxicos nos organismos alvo e não alvo devido ao acúmulo e persistência desses compostos influenciados pelos fatores físico químicos da água (pH, temperatura, salinidade) ou ambientais (temperatura e luz), (Ferreira, 2007).

Uma grande porcentagem de medicamentos administrados aos animais nos mais diversos meios de produção chega ao ambiente através da ração medicada não consumida e, dessa forma, ocorre o acúmulo e a persistência desses compostos no ambiente. Daí a importância dos testes de lixiviação que servem para calcular a taxa percentual de medicamento que foi perdido no ambiente após seu desprendimento na ração.

Encontram-se na literatura diversos documentos relacionados aos tipos de ração medicada e os mais relevantes estão citados a seguir.

O Aquaflor®, um premix 50 % tendo o Florfenicol como princípio ativo, muito comumente utilizado em tilápias para combater septicemia hemorrágica causada por Aeromonas móveis e estreptococose causada pelo Streptococcus agalactiae, é incorporado com óleo de pescado ou vegetal na proporção de 0,5 - 1 ,0 % da quantidade de ração a ser ofertada aos peixes. Essa mistura é adicionada a ração, produzindo assim os grânulos medicados. Porém, o emprego de óleo vegetal na ração medicada pode causar graves danos hepáticos aos peixes, além da contaminação da água. O presente invento não emprega esse material devido ao seu efeito hepatotóxico e também dispensa a extrusão do ativo junto com os constituintes da ração, de modo a prevenir uma possível degradação térmica.

Em estudos de Carrachi, 2010, foram utilizados em ensaios de ecotoxicidade e eficácia, rações medicadas com oxitetraciclina (OTC). Para cada quilo de ração utilizada nesses ensaios foram acrescidas, de forma homogénea, quantidades distintas de OTC dissolvidas em 2 % de óleo vegetal. Em seguida a ração foi mantida em temperatura ambiente por quatro dias, seguida de ensaios biológicos sem prévia quantificação do fármaco na ração.

Os lipídeos são elementos importantes e necessários na dieta de qualquer animal, pois fornecem energia necessária ao organismo. Porém, em elevadas concentrações podem influenciar no bom funcionamento do organismo animal (Ribeiro et al., 2008). O excesso de ácidos graxos administrados aos animais durante o tratamento com rações medicadas pode ocasionar esteatose hepática com redução da velocidade máxima das reações enzimáticas, assim como o acúmulo indesejável de gordura devido à ressíntese lipídica da carcaça, alterando a composição química do filé.

Menotta, 2012, descreve um premix para ser empregado na ração de suínos contendo um antibiótico (amoxicilina) revestido com material hidrofóbico, empregado para melhorar a palatabilidade da ração medicada. Na presente invenção, um revestimento hidrofílico é realizado na ração enriquecida como um todo, não na forma de microencapsulado do princípio ativo, o que permitiu a redução da taxa de lixiviação do ativo para o ambiente aquático.

Alam, 2000, avalia os níveis necessários de aminoácidos na ração para peixe, principalmente a metionina (aminoácido limitante), visando o ganho de peso para peixes de água morna. Os autores citam um procedimento utilizando carboximetil celulose (CMC) para evitar a lixiviação dos aminoácidos para água, porém não é demonstrada a eficiência dessa técnica de revestimento em termos de lixiviação, apenas é focado no ganho de peso dos peixes com a ração produzida. A vantagem do presente invento é que a ração não precisa passar por um processo de peletização e a ração empregada é pronta para consumo, com características nutricionais balanceadas, incluindo a facilidade de digestão desses componentes. Além disso, o revestimento da ração foi desenvolvido na presença de polímero e ausência de óleo, o que garante a homogeneidade da dosagem do ativo em todos os grânulos, além de evitar os banhos de óleo devido ao dano hepático causado nos peixes. Langdon, 2003, discute várias formulações (cápsulas com parede lipídica, cápsulas com parede protéica, lipossomas, partículas lipídicas) para preparo de ração microparticulada para alimentação de larvas e a taxa de lixiviação de nutrientes. Diferentemente da ração apresentada no presente

5 invento, que é aplicada para alimentação de peixes, as formulações descritas são direcionadas para larvas e, portanto, requerem uma ração microparticulada, o que facilita a lixiviação dos compostos devido sua maior área superficial. Para a produção dessas formulações torna-se necessária a utilização de técnicas mais elaboradas o que eleva o custo do produto final.

10 López-Alvarado, 1994, trata do efeito do revestimento e encapsulação de aminoácidos cristalinos na alimentação de larvas de peixes marinhos e sua lixiviação. Foram avaliados três tipos de dieta microparticulada com o propósito de aumentar a retenção dos aminoácidos e os melhores resultados foram obtidos com a encapsulação dos aminoácidos com material

L5 lipídico, obtendo-se uma taxa de lixiviação de 1 ,4% quando as cápsulas foram suspensas por 2 min em tampão 8,5. Diferentemente do descrito por López- Alvarado, na presente invenção o ativo é incorporado em uma ração pronta, esta que já apresenta todas as exigências alimentares ideais para os peixes. A incorporação do ativo é realizada preservando a estrutura física do grânulo, o

10 balanço nutricional em sua composição e ainda, garantindo a aceitabilidade dessa ração. O revestimento da ração enriquecida com polímero levou a uma perda de apenas 1 ,78% do ativo, quando suspensa em água a 22 °C por 5 minutos. No trabalho citado nesse documento, por se tratar de alimentação de larvas, é necessário à obtenção de ração microparticulada, onde o uso de

!5 paredes lipídicas mostrou ser promissor. Já no presente invento, a granulometria da ração é bem diferente por se tratar da alimentação de peixes e o revestimento com polímero hidrofílico levou à diminuição da taxa de lixiviação_^

Rigos, 1999, estuda a taxa de lixiviação de antibióticos lo (oxitetraciclina e ácido oxolínico) através da incorporação dos mesmos na ração comercial e do revestimento com óleo. As taxas menores de lixiviação foram obtidas com a incorporação dos antibióticos na ração, porém o que chama a atenção é o curto tempo de permanência da ração medicada na água (1 , 2 e 3 min). Adicionalmente a falta de homogeneidade do produto quando se emprega o revestimento com óleo, outra grande desvantagem é com relação ao problema de hepatotoxicidade que este óleo pode provocar nos peixes, o que não é encontrado na presente invenção.

Os documentos WO2009023013 e WO2009023014 descrevem uma composição compreendendo vários núcleos granulares contendo o ativo e polímeros para formação de um hidrogel para mascarar o sabor. Desvantajosamente, nenhum deles se refere ao sério problema de lixiviação tampouco realiza estudos para reduzi-la. Além disso, a presente invenção promove a incorporação do ativo e do polímero em uma ração balanceada que terá papel nutricional e medicamentoso, visto a dificuldade de alimentar e medicar via orais, os animais acometidos por bacterioses, ou qualquer outra doença.

O pedido de patente US2008031999 de 06/08/2007 descreve um grânulo para alimentação de peixes que compreende uma enzima, íon cobre e polímeros de revestimento, entre eles o PVP. Entretanto, duas diferenças básicas podem ser citadas. A primeira diferença refere-se ausência de estudos para verificar as taxas de lixiviação, este que vantajosamente permite o controle da perda do medicamento no meio de produção. Já a segunda e principal diferença é que a ração da presente invenção já é previamente preparada, ou seja, de origem comercial, balanceada de acordo com as necessidades de cada espécie animal.

Outro documento, US2008317825, trata de uma composição farmacêutica oral para o tratamento de peixes que contém pelo menos um agente farmacêutico, um aditivo de base e um de suporte (polímero), e se destina a desintegrar-se, pelo menos parcialmente, em um ambiente ácido. A principal diferença é que na presente ração o ativo é incorporado de maneira homogénea diretamente à ração animal, ou seja, ao se alimentar o peixe estará sendo medicado na dosagem correta, concomitantemente. O revestimento gastro-resistente tem a função de evitar a degradação gástrica do ativo a fim de melhorar sua biodisponibilidade. Portanto, o objetivo desse revestimento difere completamente uma vez que visa melhor absorção do fármaco no organismo do peixe e em nosso trabalho o revestimento tem papel de reduzir a lixiviação para o ambiente aquático.

A patente US7556802 descreve uma ração revestida por um polímero (PVP) que contém uma enzima. Na presente invenção não há a necessidade de elevadas temperaturas durante o preparo da ração, sendo este adequado também para incorporação de moléculas termolábeis. Adicionalmente, por ser de rápido e fácil preparo, as taxas de contaminação cruzada durante o preparo de revestimento e incorporação do medicamento nas rações são reduzidas.

O documento WO2004039172, de 31/10/2002, apresenta resultados do estudo de lixiviação para alimentação de trutas, que requer uma baixa temperatura da água. Nesse estudo, a temperatura da água foi de 15°C, o que resultou em perdas inferiores a 2% mesmo após 60 min de exposição na água. Nesta invenção foi constatado que a temperatura da água e o tempo de permanência da ração no ambiente aquático contribuem significativamente para a lixiviação de compostos, ou seja, quanto maior a temperatura e/ou o tempo maior será a lixiviação. O documento citado indica uma vasta gama de solventes a serem empregados no processo, incluindo solventes clorados, colocando a limitação no ponto de ebulição do solvente que deve ser inferior a 120°C para facilitar a evaporação, porém não foi dada a atenção necessária à toxicidade destes solventes que mesmo após evaporação podem permanecer a níveis residuais no peixe. Além disso, para reduzir a lixiviação do ativo, os inventores sugerem o uso de agentes lipofílicos. Já a presente invenção emprega eficientemente polímeros que apesar de sua hidrossolubilidade consegue reduzir eficientemente a lixiviação do ativo testado.

Diante do exposto, a presente invenção apresenta vantagens sob vários aspectos. Primeiro porque propõe uma nova ração enriquecida com substância biologicamente ativa e um revestimento polimérico apropriado. O presente invento emprega vantajosamente um revestimento polimérico que proporciona a redução da taxa de lixiviação do ativo para o ambiente aquático. Além disso, esse revestimento desenvolvido na presença de polímero dispensa a presença de óleo na composição, garantindo a homogeneidade da dosagem do ativo em todos os grânulos, além de evitar o uso de banhos de óleo que tem ação hepatotóxica aos peixes. Essa ração também apresenta facilidade de processamento, sem a necessidade de equipamentos sofisticados e sem o emprego de temperaturas elevadas, podendo ser empregada para ativos termolábeis. Outro ponto crucial é a garantia de permanência das características de flutuabilidade e valor nutricional da ração.

Dentre as diversas aplicações que essa nova ração apresenta, destaca-se seu emprego no controle de doenças que acometem os animais na aquicultura, incluindo a piscicultura, ranicultura e carcinicultura, e também, em baixas concentrações, como agente profilático durante o manejo desses animais.

Breve Descrição da Invenção

A presente invenção se refere a uma ração enriquecida composta por um carreador nutricional ou carreador balanceado nutricionalmente para as varias espécies aquáticas, substância biologicamente ativa e polímero de revestimento.

O carreador nutricional pode ser selecionado dentre o grupo dos pellets, grânulos extrusados e peletizados e outras formas de alimento seco, com diâmetros diversos de acordo com as exigências das espécies em questão. As classes de antibióticos, imunoestimulantes e antiparasitários podem ser empregadas como a substância biologicamente ativa da ração do presente invento e o valor de dosagem pode variar de acordo com a molécula, espécie e doença. O terceiro principal componente é o polímero de revestimento que pode ser selecionado dentre os polímeros formados por cadeias de múltiplas vinilpirrolidonas, preferencialmente o PVP-K30.

Outro objeto de proteção da presente invenção é uma ração enriquecida composta por um carreador nutricional extrusado, apresentando 28% de proteína bruta e diâmetro variando entre 4 e 6 mm; 1 ,2 g de enrofloxacina por kg de ração e de polivinilpirrolidona como polímero de revestimento, podendo variar de 0,5 a 2,0%.

É objeto adicional o uso da referida ração no controle de doenças que acometem os animais na aquicultura, incluindo a piscicultura, ranicultura e carcinicultura e também, em baixas concentrações, como agente profilático durante o manejo desses animais.

Breve Descrição das Figuras

A estrutura da presente invenção, juntamente com vantagens adicionais da mesma podem ser melhor entendidas mediante referência aos anexos e à seguinte descrição:

- A Figura 1 apresenta os cromatogramas obtidos por HPLC a 280 nm da (A) ração branco e (B) ração enriquecida.

- A Figura 2 mostra a curva analítica da enrofloxacina. - A Figura 3 apresenta na forma de gráfico, a taxa de lixiviação da enrofloxacina (ENR) contida na ração com e sem a adição de PVP nas condições do planejamento experimental.

Descrição Detalhada da Invenção

A presente invenção descreve uma ração enriquecida com substância biologicamente ativa e revestida com polímero destinada à aquicultura, estável e capaz de reduzir as taxas de lixiviação para o ambiente aquático, garantindo a homogeneidade da dosagem do ativo administrado.

A ração da presente invenção compreende os seguintes componentes principais: carreador nutricional, substância biologicamente ativa e polímero de revestimento.

O carreador é um alimento formulado e nutricionalmente balanceado para as várias espécies aquáticas que pode ser selecionado dentre o grupo dos pellets, grânulos extrusados e peletizados e outras formas de alimento seco, de acordo com as exigências das espécies em questão. Os carreadores podem apresentar diâmetros diversos e porcentagem de proteína, de acordo com a espécie e fase de crescimento do animal que fará uso desse produto. O diâmetro está intimamente relacionado ao revestimento e pode variar de 1 ,7mm para aievinos, até 2-4mm, 4-6 mm, 6-8 mm, 8-10 mm e 14-20 mm para as fases finais de crescimento e terminação de peixes cultivados em viveiros de escavados.

A substância biologicamente ativa empregada, tanto de origem sintética como natural, pode ser selecionada dentre as classes de antibióticos, imunoestimulantes, antiparasitários e suas associações, permitidas na aquicultura. Dentre os antibióticos que podem ser utilizados estão a classe dos macrolídeos (eritromicina, josamicina, espiramicina, neoespiramicina, josamicina, tilmicosina), das quinolonas (sarafloxacina, enrofloxacina, norfloxacina, ofloxacina, difloxacina, danofloxacina, ácido oxolínico e flumequina), das tetraciclinas (oxitetraciclina, tetraciclina e clortetraciclina), dos anfenicóis (florfenicol, cloranfenicol, tianfenicol) das sulfonamidas (sulfatiazol, sulfametazina e sulfadimetoxina), das pirimidinas (trimetropin) e suas respectivas associações. Dentre os antiparasitários, podem se incluir a classe dos fosforados (triclorfon), levamisol e suas associações. Dentre os imunoestimulantes estão a classe dos glicanos (beta glucano), as vitaminas (C e E), os polissacarídeos (mananoligossacarídeos, zimozana, escleroglucana), e o levamisol. O valor de dosagem aplicado varia de acordo com a molécula, espécie e enfermidade a ser tratada.

O terceiro principal componente é o polímero de revestimento que pode ser selecionado dentre aqueles que promovem a redução da taxa de lixiviação dos ingredientes da formulação, tanto o ingrediente ativo como os demais constituintes, evitando danos ambientais e à saúde. Por apresentar todas as características citadas anteriormente, os polímeros formados por cadeias de múltiplas vinilpirrolidonas, mostram-se excelentes materiais de escolha para a formação do revestimento, principalmente o PVP-K30. Além destes componentes, a ração da presente invenção ainda pode compreender componentes opcionais para proporcionar alguma característica desejável não alcançada com os componentes já citados. Alguns destes compostos que podem ser adicionados são os seguintes: aromas e essências naturais e sintéticas com a finalidade de aumentar a palatabilidade do produto, como exemplo a essência de milho.

Exemplo 1 : Produção da ração

No processo de revestimento utilizou-se uma betoneira de bancada, equipamento simples, de baixo custo e de fácil operação, tornando acessível o processo de obtenção da ração medicada no sistema de produção aquícola.

As condições operacionais, ou seja, velocidade de rotação da betoneira, tempo de pulverização e temperatura de secagem dos grânulos, foram otimizadas com o objetivo de obter um material homogéneo e estável. Dessa forma, a rotação do equipamento deve ser suficiente para permitir a molhabilidade de toda a superfície da ração, sem que haja quebra do material. O tempo de pulverização deve permitir a umidificação homogénea dos grânulos,-com a solução de revestimento evitando o excesso e, consequente, acúmulo de líquidos no equipamento. A temperatura de secagem deve ser branda de modo a permitir a evaporação da solução hidroalcoólica sem degradar o ativo deve ser aplicada concomitantemente com a etapa de pulverizaçãOT

Diante do exposto, estabeleceu-se o tempo de 2 min para pulverização, rotação do equipamento de 80 rpm e temperatura máxima de secagem de 50 °C, durante 10 min.

Um lote inicial da ração medicada contendo 0,5 % e 2,0 % de PVP foi produzido utilizando-se as condições otimizadas do processo. O material contendo 0,5 % de PVP também foi empregado na etapa de desenvolvimento e validação analítica.

Exemplo 2: Determinação de enrofloxacina

Conformidade do sistema analítico

A determinação do teor de enrofloxacina na ração medicada foi realizada por cromatografia líquida de alta eficiência acoplada ao detector de arranjo de díodos (HPLC-DAD). A separação cromatográfica foi realizada numa coluna analítica RP 18 monolítica de 100 x 3 mm (Merck® Darmstadt, Alemanha) operando a 40^Q C, utilizando como eluente uma mistura de 0,1 % de ácido fórmico e acetonitrila na proporção de 92:8 (v/v) a 1 ,5 mL min^"1. O volume de injeção foi de 20 μΐ_; e a detecção em 280 nm.

Preparo de amostra

Foi utilizada 1 ,0 g da ração, equivalente a 15 grânulos, inicialmente extraída com 10,0 mL de uma mistura contendo solução de ácido fórmico 1 % e acetonitrila na proporção 70:30 v/v (solução extratora) em tubo falcon de 20,0 mL. O rompimento e homogeneização dos péletes se deu através da utilização do dispersor ultraturrax por 1 min, após o que a amostra foi colocada em banho de ultrassom por 5 min. Sequencialmente, a amostra foi centrifugada a 2800 g durante 5 min. Para garantir a extração exaustiva da amostra, esse procedimento foi repetido por mais uma vez e os sobrenadantes agrupados em balão volumétrico de 25 mL, completando o volume com a solução extratora. Essa solução foi diluída numa proporção 1 :10 v/v em água Milli Q, e filtrada em membrana de 0,22 μιη antes da injeção no cromatógrafo a líquido.

Validação do método analítico

O método analítico desenvolvido para a determinação de ENR na ração medicada foi validado seguindo as recomendações do Guia para Validação de Métodos Analíticos e Bioanalíticos (ANVISA, 2003) e o Guia de Validação de Procedimentos Analíticos e Controle de Qualidade - Medicamentos Veterinários, Farmoquímicos, Fármacos e outras Substâncias em Produtos para Alimentação Animal e Matrizes de Origem Biológica (MAPA, 2010).

Os parâmetros avaliados foram: seletividade, linearidade, faixa linear, precisão (intra-corrida e inter-corridas) e exatidão.

A seletividade do método foi comprovada pela ausência de pico interferente na ração branco (n=10) no tempo de retenção da ENR. A Figura 1 apresenta os cromatogramas do branco e amostra contendo ENR. A linearidade do método foi avaliada através do cálculo do coeficiente de correlação (r) da curva analítica construída com 6 pontos de concentração, no intervalo de 1 ,13 e 1 1 ,29 ml_^"1 (Figura 2). O valor obtido foi de r = 0,9997, o qual atende o critério mínimo aceitável recomendado pela ANVISA (r = 0,99).

A precisão do método representa a dispersão dos resultados entre ensaios independentes e repetidos de uma mesma amostra e foi avaliada em condições de repetibilidade, ou seja, análise realizada no mesmo dia, pelo mesmo analista e mesmo equipamento (precisão intracorrida) e de reprodutibilidade, ou seja, análise realizada em 3 dias consecutivos pelo mesmo analista e mesmo equipamento (precisão intercorridas). Os resultados da precisão foram expressos através do coeficiente de variação (CV, %) dos resultados obtidos com 7 replicatas utilizando-se a ração medicada. O guia de validação da ANVISA (2003) recomenda que em condições de precisão intra e intercorridas o valor de CV não deva exceder 5,0 %.

O resultado obtido na determinação da precisão intra-corrida apresentou coeficiente de variação (CV) de 2,98 % e a precisão inter-corridas, avaliada em três dias consecutivos, apresentou CV de 2,26 %, os quais atendem o Guia de Validação da ANVISA (2003)r

A exatidão do método foi avaliada mediante o ensaio de recuperação utilizando-se rações fortificadas com ENR em 3 níveis de concentração correspondentes a 50, 100 e 150 % do valor esperado, o que correspondeu à concentrações de 600, 1200 e 1800 mg kg^"1 de ENR. Os resultados foram expressos como a porcentagem de recuperação utilizando-se a seguinte equação:

~ ~ ENR.

% recuperação =-

ENR_

Onde,

ENR_enc = concentração de ENR determinada na ração fortificada (μς g^"1); ENR_adá = concentração de ENR adicionada na ração branco, ou seja, a fortificação da ração expressa em μς g^"1 ;

Os resultados obtidos para os três níveis de concentração: foram de 98,8 %, 101 ,1 % e 102,4 % de recuperação, respectivamente. Cabe mencionar que o Guia da ANVISA não recomenda valores de porcentagem de recuperação. Todavia, os resultados obtidos estão dentro da faixa de aceitação preconizada pelo Guia de Validação do MAPA (2010), que é de 97 a 103 % para analitos em concentrações de 1000 μ9 g^~1.

Na Tabela 1 são apresentados os resultados obtidos na validação do método analítico.

Tabela 1 : Resultados da validação do método analítico desenvolvido

Parâmetros Enrofloxacina

Linearidade (r) 0,9997

Exemp o 3: lane amento exper menta

A partir da escolha do PVP como polímero de revestimento foi realizado um planejamento experimental do tipo fracionário 2^4'1 com o objetivo de avaliar as variáveis mais importantes no ensaio de lixiviação. As variáveis com as respectivas faixas estudadas selecionadas para o estudo foram: pH (7,0 e 7,8), temperatura da água (22 e 28 °C), tempo de permanência de ração na água (5 e 30 min) e a concentração do polímero (0,5 e 2,0 %). A resposta avaliada no planejamento experimental foi a porcentagem de lixiviação do fármaco, calculada de acordo com a equação abaixo:

„. , . . . ~ (teor ínicial-teor final) „.-. ,,

% lixiviação = 7— x

teor inicial 100,

Onde os teores iniciais e finais de ativo na ração (base seca) foram determinados pelo método analítico validado. Na Tabela 2 são apresentadas as condições experimentais dos ensaios realizados.

Tabela 2. Condições experimentais do ensaio de planejamento experimental fracionário 2^4"1.

PVP = polivinilpirrolidona.

O teor de ENR nas rações medicadas utilizadas nos ensaios do planejamento experimental, revestidas em soluções contendo 0, 0,5 e 2,0 % de PVP foram, inicialmente, quantificadas por HPLC. Os resultados são apresentados na Tabela 3.

Tabela 3. Teor de enrofloxacina (ENR) nas rações medicadas utilizadas nos ensaios do planejamento experimental antes da exposição na água.

Revestimento Umidade³ Teor médio ENR CV^C

PVP (%) (%, m/m) (%, m/m)^b (%)

0 12,66 0,097 (n=3) 1 ,3

0,5 13,30 0,1 15 (n=8) 4,3

2,0 12,89 0,109 (n=8) 4,4 a . . .· . b .

a determinada em triplicata; teor em base seca; ⁰ CV= coeficiente de variação.

Pelos resultados apresentados na Tabela 3, verifica-se uma baixa dispersão dos resultados (CV menor do que 4,5%) relativos ao teor de ENR nas rações constatando-se, assim, uma boa uniformidade no processo de aspersão da ENR durante o preparo da ração medicada. Ou seja, a obtenção de uma ração homogénea quanto ao conteúdo de ENR.

A seguir, realizou-se o teste de lixiviação de acordo com os ensaios propostos no planejamento experimental (Tabela 2). Na Tabela 4 são apresentados os resultados obtidos.

Tabela 4. Respostas do planejamento experimental fracionário 2^4"1.

01 28 2,0 30 7,8 29,97

02 28 2,0 5 7,0 26,71

03 28 0,5 30 7,0 32,52

04 28 0,5 5 7,8 20,16

05 22 2,0 30 7,0 28,42

06 22 2,0 5 7,8 1 ,78

07 22 0,5 30 7,8 20,58

08 22 0,5 5 7,0 7,95

1 .. .

PVP = polivinilpirrolidona.

As respostas obtidas nos ensaios do planejamento experimental foram processadas utilizando-se o software Statistica, versão 5.0, para determinar os efeitos das variáveis.

Na Tabela 5 são apresentados os resultados dos efeitos das variáveis sobre a taxa de lixiviação.

Tabela 5. Efeito das variáveis estudadas no planejamento fracionário sobre a taxa de lixiviação da enrofloxacina presente na ração.

Variáveis Efeitos (% lixiviação)

Temperatura (°C) 12,66^*

PVP¹ (%) 1 ,42

pH -5,78

Tempo (min) 13,72^*

PVP = polivinilpirrolidona; (^*) Significativo estatisticamente (p<0,05). Conforme os dados da Tabela 5, as variáveis estatisticamente importantes foram a temperatura e o tempo de permanência da ração na água, ambas com efeitos positivos na mesma ordem de grandeza. Isso significa que um aumento da temperatura da água de 22 para 28 °C promove um aumento na taxa de lixiviação de 12,66 %. Para o tempo de permanência na água, um aumento de 5 para 30 min promove um aumento da taxa de lixiviação de 13,72 o //o.

Visto que, quando utilizado na solução de revestimento na faixa de concentração de 0,5 a 2,0 %, a PVP não teve efeito significativo na taxa de lixiviação da ENR da ração para a água, decidiu-se repetir as condições experimentais do planejamento experimental sem a presença do polímero, com o objetivo de verificar a eficiência do mesmo na redução da taxa de lixiviação. Na Figura 3 são apresentados os resultados obtidos na taxa de lixiviação da ENR, da ração com e sem o revestimento de PVP, utilizando-se solução contendo 0,5% do polímero.

Verifica-se que em todas as condições experimentais (temperatura, tempo e pH) houve redução da taxa de lixiviação da ENR quando do revestimento da ração com PVP. Os melhores resultados na redução da taxa de lixiviação foram nas condições dos ensaios 6 (2,0 % de PVP) e 8 (0,5 % de PVP), os quais foram realizados nas condições de 22 °C e 5 min de permanência da ração na água. Os dados indicam que solução de revestimento contendo 0,5 % de PVP foi suficiente para minimizar a lixiviação da ENR.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1 . Ração enriquecida caracterizada por compreender os seguintes componentes principais: carreador nutricional, substância biologicamente ativa e polímero de revestimento.

2. Ração, de acordo com a reivindicação 1 , caracterizada pelo carreador ser um alimento formulado e nutricionalmente balanceado para as várias espécies aquáticas selecionado dentre o grupo dos pellets, grânulos extrusados e peletizados e outras formas de alimento seco, de acordo com as exigências das espécies em questão.

3. Ração, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo carreador apresentar diâmetros diversos, de acordo com a espécie e fase de crescimento do animal que fará uso da ração.

4. Ração, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato do diâmetro do carreador poder variar de 1 ,7mm para alevinos, até 2-4mm, 4-6 mm, 6-8 mm, 8-10 mm e 14-20 mm para as fases finais de crescimento e terminação de peixes cultivados em viveiros de escavados.

5. Ração, de acordo com a reivindicação 1 , caracterizada pela substância biologicamente ativa ser selecionada dentre as classes de antibióticos, antiparasitários e imunoestimulantes.

6. Ração, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo antibiótico ser selecionado dentre a classe dos macrolídeos (eritromicina, josamicina, espiramicina, neoespiramicina, josamicina, tilmicosina), das quinolonas (sarafloxacina, enrofloxacina, norfloxacina, ofloxacina, difloxacina, danofloxacina, ácido oxolínico e flumequina), das tetraciclinas (oxitetraciclina, tetraciclina e clortetraciclina), dos anfenicóis (florfenicol, cloranfenicol, tianfenicol) das sulfonamidas (sulfatiazol, sulfametazina e sulfadimetoxina), das pirimidinas (trimetropin) e suas associações.

7. Ração, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo antiparasitário a ser selecionado dentre a classe dos fosforados, preferencialmente triclorfon, levamisol e suas associações.

8. Ração, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo imunoestimulante ser selecionado dentre a classe dos glicanos (beta glucano), os polissacarídeos (mananoligossacarídeos, zimozana, escleroglucana), o levamisol, as vitaminas (C e E), o levamisol e suas associações.

9. Ração, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo valor de dosagem da substância biologicamente ativa variar de acordo com a molécula, espécie e doença.

10. Ração, de acordo com a reivindicação 1 , caracterizada pelo polímero de revestimento ser selecionado dentre os polímeros formados por cadeias de múltiplas vinilpirrolidonas, preferencialmente o PVP-K30.

1 1 . Ração, de acordo com a reivindicação 1 , caracterizada por compreender componentes opcionais selecionados dentre aromas e essências naturais e sintéticas, preferencialmente essência de milho.

12. Ração enriquecida caracterizada por compreender um carreador nutricional extrusado, apresentando 28% de proteína bruta e diâmetro variando entre 4 e 6 mm; 1 ,2 g de enrofloxacina por kg de ração e uma variação de 0,5% a 2,0% de polivinilpirrolidona.

13. Ração, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada por apresentar uma taxa de lixiviação de 1 ,78% para rações revestidas com 2,0% de PVP e 7,95% de lixiviação para rações revestidas com 0,5% de PVP.

14. Uso da ração descrita nas reivindicações de 1 a 13 caracterizado por ser empregada no controle de doenças que acometem os animais na aquicultura, incluindo piscicultura, ranicultura e carcinicultura.

15. Uso da ração descrita nas reivindicações de 1 a 13 caracterizado por empregada, em baixas concentrações, como agente profilático durante o manejo de animais na aquicultura, incluindo a piscicultura, ranicultura e carcinicultura.