WO2014154615A1

WO2014154615A1 - Lanthanoid-complex-based spectroscopic hemoglobin determination in a liquid biological medium

Info

Publication number: WO2014154615A1
Application number: PCT/EP2014/055805
Authority: WO
Inventors: Frank Morgner
Original assignee: Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V.
Priority date: 2013-03-26
Filing date: 2014-03-24
Publication date: 2014-10-02
Also published as: DE102013205346A1

Abstract

The invention relates to a method for the quantitative determination of hemoglobin in a liquid biological medium outside of the body and the use of at least one luminescent lanthanoid complex for the quantitative determination of hemoglobin in a liquid biological medium outside of the body.

Description

Lanthanoidkomplexbasierte spektroskopische Hämoglobinbestimmung in einem flüssigen biologischen Medium Lanthanoid complex-based spectroscopic hemoglobin determination in a liquid biological medium

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Hämoglobin in einem flüssigen biologischen Medium außerhalb des Körpers sowie die Verwendung mindestens eines lumineszenten Lanthanoidkomplexes zur quantitativen Bestimmung von Hämoglobin in einem flüssigen biologischen Medium außerhalb des Körpers. The present invention relates to a method for the quantitative determination of hemoglobin in a liquid biological medium outside the body as well as the use of at least one luminescent lanthanide complex for the quantitative determination of hemoglobin in a liquid biological medium outside the body.

Das eisenhaltige Sauerstofftransportprotein Hämoglobin (Hb) kommt normalerweise in den roten Blutkörperchen (Erythrozyten) von Menschen und Tieren und nur zu einem äußerst geringen Anteil als freies Protein in den Körperflüssigkeiten vor. Die beispielsweise in Blutplasma vorhandene Hämoglobinkonzentration beträgt bei gesunden Menschen zwischen 10 und 30 mg/1. Abnorme Konzentrationen in den Körperfiüssigkeiten weisen daher auf pathologischen Erythrozytenabbau in vivo (durch Krankheiten, Gifte u.ä.) oder in vitro (beispielsweise durch unsachgemäße Abnahme von Blut eines Patienten) hin. Hb ist daher ein klinisch sehr nützlicher Parameter zur Beurteilung sowohl der Qualität von Blutproben als auch der The iron-containing oxygen transport protein hemoglobin (Hb) is normally found in the red blood cells (erythrocytes) of humans and animals and only to a very small extent as a free protein in the body fluids. The hemoglobin concentration present in blood plasma, for example, is between 10 and 30 mg / l in healthy humans. Abnormal concentrations in the body fluids therefore indicate pathological erythrocyte degradation in vivo (due to diseases, poisons, etc.) or in vitro (for example, by improper removal of a patient's blood). Hb is therefore a clinically very useful parameter for assessing both the quality of blood samples and the quality of blood

Krankheitserkennung. Ersteres ist von großer Bedeutung, da Hb Messungen verschiedenster Biomarker in Plasma und Serum verfälscht und so die Analysen im schlimmsten Fall unbrauchbar macht. Letzteres ist wichtig, da viele Krankheiten wie Malaria, Sichelzellenanämie oder immunologische Störungen aber auch Gifte beispielsweise zum Anstieg der Konzentration freien Hämoglobins in Blutplasma und -serum führen. Die Konzentration freien Hämoglobins in Körperflüssigkeiten möglichst genau zu kennen ist daher von großer Bedeutung. Die Bestimmung freien Hämoglobins ist aus diesem Grund eine der am häufigsten durchgeführten Disease detection. The former is of great importance because Hb falsifies measurements of a wide variety of biomarkers in plasma and serum, making analysis in the worst case useless. The latter is important because many diseases such as malaria, sickle cell anemia or immunological disorders as well as toxins, for example, lead to an increase in the concentration of free hemoglobin in blood plasma and serum. Knowing the concentration of free hemoglobin in body fluids as precisely as possible is therefore of great importance. The determination of free hemoglobin is therefore one of the most commonly performed

Messungen sowohl in der klinischen Diagnostik als auch der Laboranalytik und der Veterinärmedizin. Verschiedenste Verfahren zur Bestimmung von Hämoglobin sind bekannt, wobei diese Verfahren hauptsächlich auf photometrischen Messungen basieren. Hier existieren verschiedene Methoden (Fairbanks et. al., Clinical Chemistry, 1992, vol. 38, 132-140, Tsuda et. al, Laboratory Hematology, 1998, vol. 4, 276-280). Zu nennen sind insbesondere: die Cyanmethode (Standardbestimmungsmethode), die Laurylsulfat-Methode und die Tetramethylbenzidin-Methode (TMB). Gemein ist all diesen Verfahren, dass die Bildung eines Komplexes in Abhängigkeit von der Hämoglobinkonzentration zu einer Farbänderung der Probe führt, die über Measurements in clinical diagnostics as well as laboratory analysis and veterinary medicine. Various methods for the determination of hemoglobin are known, these methods being based mainly on photometric measurements. Various methods exist here (Fairbanks et al., Clinical Chemistry, 1992, Vol. 38, 132-140, Tsuda et al., Laboratory Hematology, 1998, vol., 4, 276-280). Particularly noteworthy are: the cyan method (standard determination method), the lauryl sulfate method and the tetramethylbenzidine method (TMB). Common to all these methods is that the formation of a complex as a function of the hemoglobin concentration leads to a change in the color of the sample that over

Absorption bestimmt wird. Absorption is determined.

Diese Verfahren sind jedoch zeitaufwendig und mit der Verwendung hoher Mengen verschiedenster Chemikalien verbunden, die ferner zu einem hohen These methods, however, are time consuming and involve the use of high levels of various chemicals, which are also of high value

Entsorgungsaufwand führen. Darüber hinaus ist die Probenvorbereitung aufwendig und führt zu einer Vielzahl möglicher Fehlerquellen. Disposal work lead. In addition, the sample preparation is complex and leads to a variety of possible sources of error.

Weitere Verfahren basieren auf der rein spektroskopischen Bestimmung von Further methods are based on the purely spectroscopic determination of

Hämoglobin. Zu nennen sind hier insbesondere die Methode nach Harboe sowie die Methode nach Kahn. Bei diesen Verfahren wird die Absorption der Probe bei verschiedenen Wellenlängen bestimmt und daraus dann die Hemoglobin. Particularly noteworthy here are the Harboe method and the Kahn method. In these methods, the absorption of the sample at different wavelengths is determined and then the

Hämoglobinkonzentration in der Probe ermittelt. Die Methode nach Harboe arbeitet mit verdünnten Lösungen, bei der Methode nach Kahn erfolgen die Messungen in unverdünnten Proben. Hemoglobin concentration determined in the sample. The method according to Harboe works with dilute solutions, with the method according to Kahn the measurements are carried out in undiluted samples.

Diese Verfahren haben jedoch den Nachteil, dass bereits kleine Abweichungen in der Zusammensetzung der Proben (beispielsweise zu wenig Wasser im Blut oder ein vom Durchschnitt abweichender Metabolismus) zur Unbrauchbarkeit der However, these methods have the disadvantage that even small deviations in the composition of the samples (for example, too little water in the blood or an off-average metabolism) to the uselessness of the

Messergebnisse führen können. Ferner können verschiedene Bestandteile in der Probe das Messergebnis verfälschen, wobei das Ausmaß dieser Störung nicht feststellbar ist. Die möglichen Abweichungen können daher sehr groß sein. Can lead to measurement results. Furthermore, different ingredients in the Sample falsify the measurement result, the extent of this disorder is not detectable. The possible deviations can therefore be very large.

Neben diesen etablierten Verfahren, werden in den JP 57059151A, JP 57133350A, WO 96/23223A, US 2010/267538A, JP 62000838A, US 5,149,503A und JP Besides these established methods, JP 57059151A, JP 57133350A, WO 96/23223A, US 2010 / 267538A, JP 62000838A, US 5,149,503A and JP

2122267 A, weitere Verfahren beschrieben. 2122267 A, further methods described.

Alle vorgenannten Verfahren beschreiben Lösungswege, die mit dem der All the above methods describe approaches that with the

vorliegenden Erfindung keine Übereinstimmung aufweisen. present invention have no match.

Daher besteht nach wie vor Bedarf an Verfahren zur Bestimmung von Hämoglobin in einem flüssigen biologischen Medium, die auf einfache Weise, d.h. ohne aufwendige Probenvorbereitung, ohne chemische Veränderung der Probe, und unter geringem Einsatz von Chemikalien durchführbar sind und die gleichzeitig eine geringe Anfälligkeit für Störungen aufweisen. Therefore, there is still a need for methods for the determination of hemoglobin in a liquid biological medium which can be easily, i. can be carried out without complex sample preparation, without chemical modification of the sample, and with little use of chemicals and at the same time have a low susceptibility to disturbances.

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher, ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Hämoglobin in einem flüssigen biologischen Medium bereit zu stellen, das außerhalb des Körpers durchgeführt werden kann. Eine weitere Aufgabe besteht darin, dass das Verfahren ohne aufwendige Probenvorbereitung und ohne chemische Veränderung der Probe durchgeführt werden kann. Weiterhin besteht eine Aufgabe darin, ein Verfahren bereit zu stellen, dass eine geringe Störungsanfälligkeit durch in der Probe enthaltene Verbindungen aufweist. Eine zusätzliche Aufgabe besteht darin, dass das Verfahren ohne Verwendung großer Mengen An object of the present invention is therefore to provide a method for the quantitative determination of hemoglobin in a liquid biological medium that can be performed outside the body. Another object is that the method can be carried out without expensive sample preparation and without chemical modification of the sample. Furthermore, it is an object to provide a method that has a low susceptibility to interference by compounds contained in the sample. An additional task is that the method without using large amounts

unterschiedlichster Chemikalien durchgeführt werden kann und somit gleichzeitig ein geringer Entsorgungsaufwand bestehen soll. Die Lösung der genannten und weiterer Aufgaben ergibt sich aus den Gegenständen der unabhängigen Ansprüche. Vorteilhafte Ausführungsformen ergeben sich durch deren Kombination mit den Merkmalen der abhängigen Ansprüche. different chemicals can be performed and thus at the same time a low disposal costs should exist. The solution of the above and other objects arises from the subjects of the independent claims. Advantageous embodiments result from their combination with the features of the dependent claims.

Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Hämoglobin in einem flüssigen biologischen Medium außerhalb des Körpers bereitgestellt, umfassend die Schritte: According to one aspect of the present invention, there is provided a method for quantitatively determining hemoglobin in a fluid biological medium outside the body, comprising the steps of:

a) die Bereitstellung eines flüssigen biologischen Mediums enthaltend eine zu bestimmende Menge an Hämoglobin, a) the provision of a liquid biological medium containing an amount of hemoglobin to be determined,

b) die Bereitstellung mindestens eines lumineszenten Lanthanoidkomplexes, c) Inkontaktbringen des flüssigen biologischen Mediums aus Schritt a) mit dem mindestens einen lumineszenten Lanthanoidkomplex aus Schritt b) zur Ermöglichung einer Wechselwirkung zwischen dem mindestens einen lumineszenten Lanthanoidkomplex aus Schritt b) und dem in dem flüssigen biologischen Medium aus Schritt a) enthaltenen Hämoglobin, und d) Bestimmung der emittierten Lumineszenz von dem Hämoglobin interagierenden Lanthanoidkomplex in dem flüssigen biologischen Medium aus Schritt c). Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht eine quantitative Bestimmung von Hämoglobin in einem flüssigen biologischen Medium außerhalb des Körpers. b) providing at least one luminescent lanthanoid complex, c) contacting the liquid biological medium from step a) with the at least one luminescent lanthanide complex from step b) to allow interaction between the at least one luminescent lanthanide complex from step b) and that in the biological liquid Medium from step a) contained hemoglobin, and d) determination of the emitted luminescence from the hemoglobin interacting lanthanide complex in the liquid biological medium from step c). The method according to the invention enables a quantitative determination of hemoglobin in a liquid biological medium outside the body.

Zusätzlich kann das Verfahren ohne aufwendige Probenvorbereitung und chemische Veränderung der Probe durchgeführt werden. Zusätzlich kann der Verbrauch an Chemikalien deutlich reduziert werden, wodurch Kosten, Arbeitsaufwand und Entsorgungsaufwand minimiert werden können. Des Weiteren weist das Verfahren eine geringe Störungsanfälligkeit durch in der Probe enthaltene Verbindungen auf. In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung mindestens eines lumineszenten Lanthanoidkomplexes zur quantitativen In addition, the process can be carried out without expensive sample preparation and chemical modification of the sample. In addition, the consumption of chemicals can be significantly reduced, whereby costs, workload and disposal costs can be minimized. Furthermore, the method has a low susceptibility to interference by compounds contained in the sample. In a further aspect of the present invention, the use of at least one luminescent lanthanide complex for quantitative

Bestimmung von Hämoglobin in einem flüssigen biologischen Medium außerhalb des Körpers bereitgestellt. Determination of hemoglobin provided in a liquid biological medium outside the body.

In einer beispielhaften Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, ist das flüssige biologische Medium aus Schritt a) ausgewählt aus der Gruppe umfassend Vollblut, Serum, Plasma, Speichel, Urin, Fruchtwasser, Liquor und Gemische von diesen. In einer beispielhaften Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, umfasst das flüssige biologische Medium aus Schritt a) eine zu bestimmende Menge an In an exemplary embodiment of the present invention, the liquid biological medium of step a) is selected from the group comprising whole blood, serum, plasma, saliva, urine, amniotic fluid, cerebrospinal fluid and mixtures thereof. In an exemplary embodiment of the present invention, the liquid biological medium from step a) comprises an amount to be determined

Hämoglobin in einem Bereich von 1 bis 5000 mg/1, bevorzugt in einem Bereich von 5 bis 4000 mg/1 und weiter bevorzugt in einem Bereich von 10 bis 2000 mg/1. In einer beispielhaften Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, ist der mindestens eine lumineszente Lanthanoidkomplex aus Schritt b) a) wasserlöslich, und/oder b) wird in einer Menge von 1 ng/1 bis 1000 mg/1, bevorzugt in einem Bereich von 10 ng/1 bis 500 mg/1 und weiter bevorzugt in einem Bereich von 10 ng/1 bis 100 mg/1, basierend auf der Menge des flüssigen biologischen Mediums aus Schritt a), bereitgestellt. Hemoglobin in a range of 1 to 5000 mg / l, preferably in a range of 5 to 4000 mg / l, and more preferably in a range of 10 to 2000 mg / l. In an exemplary embodiment of the present invention, the at least one luminescent lanthanide complex from step b) a) is water-soluble, and / or b) is used in an amount of 1 ng / 1 to 1000 mg / l, preferably in a range of 10 ng / 1 to 500 mg / l and more preferably in a range of 10 ng / l to 100 mg / l, based on the amount of the liquid biological medium of step a).

In einer beispielhaften Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, umfasst der mindestens eine lumineszente Lanthanoidkomplex aus Schritt b) mindestens ein Lanthanoid(III)-Ion. In an exemplary embodiment of the present invention, the at least one luminescent lanthanide complex from step b) comprises at least one lanthanide (III) ion.

In einer beispielhaften Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, ist das mindestens eine Lanthanoid(III)-Ion ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Ytterbium(III)-Ion (Yb³⁺), Terbium(III)-Ion (Tb³⁺), Europium(III)-Ion (Eu³⁺), Erbium(III)-Ion (Er³⁺), Samarium(III)-Ion (Sm³⁺), Dysprosium(III)-Ion (Dy³⁺), Neodymium(III)-Ion (Nd³⁺) und Gemische von diesen, und bevorzugt aus der Gruppe umfassend Terbium(III)-Ion (Tb³⁺), Europium(III)-Ion (Eu³⁺), In an exemplary embodiment of the present invention, the at least one lanthanide (III) ion is selected from the group comprising ytterbium (III) ion (Yb ³⁺ ), terbium (III) ion (Tb ³⁺ ), europium ( III) ion (Eu ³⁺ ), Erbium (III) ion (Er ³⁺ ), samarium (III) ion (Sm ³⁺ ), dysprosium (III) ion (Dy ³⁺ ), neodymium (III) ion (Nd ³⁺ ) and mixtures of these, and preferably from the group comprising terbium (III) ion (Tb ³⁺ ), europium (III) ion (Eu ³⁺ ),

Samarium(III)-Ion (Sm³⁺), Dysprosium(III)-Ion (Dy³⁺) und Gemische von diesen. Samarium (III) ion (Sm ³⁺ ), dysprosium (III) ion (Dy ³⁺ ) and mixtures of these.

In einer beispielhaften Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, umfasst der mindestens eine lumineszente Lanthanoidkomplex aus Schritt b) mindestens einen mit dem Lanthanoid(III)-Ion komplexbildenden Liganden. In einer beispielhaften Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, umfasst der mindestens eine komplexbildende Ligand mindestens ein mit dem Lanthanoid(III)- Ion komplexbildendes Element ausgewählt aus der Gruppe umfassend Stickstoff, Sauerstoff, Schwefel, Phosphor und Gemische von diesen. In einer beispielhaften Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, wird die Bestimmung der emittierten Lumineszenz in Schritt d) in einem In an exemplary embodiment of the present invention, the at least one luminescent lanthanide complex from step b) comprises at least one ligand complexing with the lanthanide (III) ion. In an exemplary embodiment of the present invention, the at least one complexing ligand comprises at least one lanthanide (III) ion complexing element selected from the group consisting of nitrogen, oxygen, sulfur, phosphorus and mixtures thereof. In an exemplary embodiment of the present invention, the determination of the emitted luminescence in step d) in a

Wellenlängenbereich größer 400 nm, bevorzugt in einem Wellenlängenbereich von 400 bis 1000 nm, durchgeführt. In einer beispielhaften Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, erfolgt die Bestimmung der emittierten Lumineszenz in Schritt d) durch Bestimmung der Lumineszenzabklingzeit und/oder Lumineszenzintensität. Wavelength range greater than 400 nm, preferably in a wavelength range of 400 to 1000 nm performed. In an exemplary embodiment of the present invention, the determination of the emitted luminescence in step d) is carried out by determining the luminescence decay time and / or luminescence intensity.

In einer beispielhaften Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, umfasst das Verfahren ferner Schritt e), in dem die quantitative Bestimmung des Hämoglobins in dem flüssigen biologischen Medium aus Schritt a) durch Vergleich der in Schritt d) bestimmten emittierten Lumineszenz mit einer Kalibrierkurve erfolgt. In einer beispielhaften Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Kalibrierkurve durch Bestimmung der emittierten Lumineszenz von definierten Mengen an Hämoglobin in einem flüssigen Kalibriermedium erhalten und das flüssige Kalibriermedium entspricht dem flüssigen biologischen Medium aus Schritt a) oder das flüssige Kalibriermedium stellt eine mit Zusätzen versehene Pufferlösung dar, die in ihrer Zusammensetzung dem flüssigen biologischen Medium aus Schritt a) im Wesentlichen entspricht. In an exemplary embodiment of the present invention, the method further comprises step e), in which the quantitative determination of the hemoglobin in the liquid biological medium from step a) is carried out by comparing the emitted luminescence determined in step d) with a calibration curve. In an exemplary embodiment of the present invention, the calibration curve is obtained by determining the emitted luminescence of defined amounts of hemoglobin in a liquid calibration medium, and the liquid calibration medium corresponds to the liquid biological medium of step a) or the liquid calibration medium is an added buffer solution. which substantially corresponds in composition to the liquid biological medium from step a).

In einer beispielhaften Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, erfolgt Schritt c) und/oder Schritt d) und/oder Schritt e) bei einer Temperatur in einem Bereich von 15 °C bis 50 °C, bevorzugt in einem Bereich von 20 °C bis 40 °C. In an exemplary embodiment of the present invention, step c) and / or step d) and / or step e) takes place at a temperature in a range of 15 ° C to 50 ° C, preferably in a range of 20 ° C to 40 ° C.

Im Folgenden wird die vorliegende Erfindung genauer beschrieben: Das Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Hämoglobin in einem flüssigen biologischen Medium außerhalb des Körpers der vorliegenden Erfindung umfasst mindestens die Schritte: In the following, the present invention is described in more detail: The method for the quantitative determination of hemoglobin in a liquid biological medium outside the body of the present invention comprises at least the steps:

b) die Bereitstellung mindestens eines lumineszenten Lanthanoidkomplexes, c) Inkontaktbringen des flüssigen biologischen Mediums aus Schritt a) mit dem lumineszenten Lanthanoidkomplex aus Schritt b) zur Ermöglichung einer Wechselwirkung zwischen dem lumineszenten Lanthanoidkomplex aus Schritt b) und dem in dem flüssigen biologischen Medium aus Schritt a) enthaltenen Hämoglobin, und b) providing at least one luminescent lanthanide complex, c) contacting the liquid biological medium from step a) with the luminescent lanthanide complex from step b) to allow interaction between the luminescent lanthanide complex from step b) and the liquid biological medium from step a ) contained hemoglobin, and

d) Bestimmung der emittierten Lumineszenz von dem Hämoglobin interagierenden Lanthanoidkomplex in dem flüssigen biologischen Medium aus Schritt c). Gemäß Schritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens, wird ein flüssiges biologisches Medium enthaltend eine zu bestimmende Menge an Hämoglobin bereitgestellt. Der Begriff "flüssiges Medium" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung in seiner üblichen, dem Fachmann geläufigen Bedeutung verstanden. Insbesondere bezieht sich dieser Begriff auf ein biologisches Medium, dass bei einer Temperatur in einem Bereich von 15 °C bis 50 °C, bevorzugt in einem Bereich von 20 °C bis 40 °C flüssig ist. Unter dem Begriff "biologisches Medium" wird im Sinne dieser Erfindung eine menschliche oder tierische Körperflüssigkeit verstanden. d) Determining the emitted luminescence from the hemoglobin-interacting lanthanide complex in the liquid biological medium from step c). According to step a) of the method according to the invention, a liquid biological medium containing an amount of hemoglobin to be determined is provided. The term "liquid medium" is understood in the context of the present invention in its usual meaning familiar to the person skilled in the art. In particular, this term refers to a biological medium that is liquid at a temperature in a range of 15 ° C to 50 ° C, preferably in a range of 20 ° C to 40 ° C. The term "biological medium" for the purposes of this invention means a human or animal body fluid.

Insbesondere bezieht sich dieser Begriff auf extrazelluläre Körperflüssigkeiten, wie Körperflüssigkeiten, die in Kreisläufen zirkulieren, Verdauungssäfte, Sekrete und Exkrete. Unter dem Begriff "Körper" wird im Sinne dieser Erfindung ein In particular, this term refers to extracellular body fluids, such as circulating body fluids, digestive juices, secretions, and excretions. The term "body" is used in the context of this invention

menschlicher oder tierischer Körper verstanden. Insbesondere bezieht sich dieser Begriff auf einen menschlichen Körper. understood human or animal body. In particular, this term refers to a human body.

In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das flüssige biologische Medium aus Schritt a) ausgewählt aus der Gruppe umfassend Vollblut, Serum, Plasma, Speichel, Urin, Fruchtwasser, Liquor und Gemische von diesen. In one embodiment of the present invention, the liquid biological medium of step a) is selected from the group comprising whole blood, serum, plasma, saliva, urine, amniotic fluid, cerebrospinal fluid and mixtures thereof.

Beispielsweise ist das flüssige biologische Medium aus Schritt a) ausgewählt aus der Gruppe umfassend Vollblut, Serum, Plasma, Speichel, Urin, Fruchtwasser oder Liquor. Insbesondere ist das flüssige biologische Medium aus Schritt a) ausgewählt aus der Gruppe umfassend Vollblut, Serum, Plasma, Speichel oder Urin. Alternativ ist das flüssige biologische Medium aus Schritt a) ausgewählt aus der Gruppe umfassend Vollblut, Serum oder Plasma. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das flüssige biologische Medium aus Schritt a) Serum oder Plasma. For example, the liquid biological medium from step a) is selected from the group comprising whole blood, serum, plasma, saliva, urine, amniotic fluid or cerebrospinal fluid. In particular, the liquid biological medium from step a) is selected from the group comprising whole blood, serum, plasma, saliva or urine. Alternatively, the liquid biological medium of step a) is selected from the group comprising Whole blood, serum or plasma. In one embodiment of the present invention, the liquid biological medium of step a) is serum or plasma.

Der Begriff "Hämoglobin" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung in seiner üblichen, dem Fachmann geläufigen Bedeutung verstanden. Insbesondere bezieht sich dieser Begriff auf Hämoglobin AI (HbAl oder HbA) Hämoglobin A2 (HbA2), sowie die fetalen Hämoglobine HbF und Gower-2 The term "hemoglobin" is understood in the context of the present invention in its usual meaning familiar to the person skilled in the art. In particular, this term refers to hemoglobin AI (HbAl or HbA) hemoglobin A2 (HbA2), as well as the fetal hemoglobin HbF and Gower-2

Die zu bestimmende Menge an Hämoglobin in dem flüssigen biologischen Medium aus Schritt a) kann in einem weiten Bereich variieren. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das flüssige biologische Medium aus Schritt a) eine zu bestimmende Menge an Hämoglobin in einem Bereich von 1 bis 5000 mg/1. Beispielsweise umfasst das flüssige biologische Medium eine zu bestimmende Menge an Hämoglobin in einem Bereich von 5 bis 4000 mg/1 oder in einem Bereich von 10 bis 2000 mg/1. The amount of hemoglobin to be determined in the liquid biological medium from step a) can vary within a wide range. In one embodiment of the present invention, the liquid biological medium from step a) comprises an amount of hemoglobin to be determined in a range from 1 to 5000 mg / l. For example, the liquid biological medium comprises an amount of hemoglobin to be determined in a range of 5 to 4000 mg / l or in a range of 10 to 2000 mg / l.

Insbesondere umfasst das flüssige biologische Medium eine zu bestimmende Menge an Hämoglobin in einem Bereich von 10 bis 1000 mg/1 oder in einem Bereich von 10 bis 500 mg/1. Alternativ umfasst das flüssige biologische Medium eine zu bestimmende Menge an Hämoglobin in einem Bereich von 10 bis 100 mg/1. In particular, the liquid biological medium comprises an amount of hemoglobin to be determined in a range of 10 to 1000 mg / l or in a range of 10 to 500 mg / l. Alternatively, the liquid biological medium comprises an amount of hemoglobin to be determined in a range of 10 to 100 mg / l.

Beispielsweise umfasst das flüssige biologische Medium eine zu bestimmende Menge an Hämoglobin in einem Bereich von 10 bis 50 mg/1 oder in einem Bereich von 10 bis 30 mg/1. For example, the liquid biological medium comprises an amount of hemoglobin to be determined in a range of 10 to 50 mg / l or in a range of 10 to 30 mg / l.

In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das flüssige biologische Medium Blutplasma und umfasst eine zu bestimmende Menge an Hämoglobin in einem Bereich von 10 bis 1000 mg/1. Alternativ ist das flüssige biologische Medium Blutserum und umfasst eine zu bestimmende Menge an Hämoglobin in einem Bereich von 10 bis 1000 mg/1. In one embodiment of the present invention, the liquid biological medium is blood plasma and comprises an amount of hemoglobin to be determined ranging from 10 to 1000 mg / l. Alternatively, it is the liquid biological medium Blood serum and comprises an amount of hemoglobin to be determined ranging from 10 to 1000 mg / l.

Das flüssige biologische Medium kann das flüssige biologische Medium als solches oder verdünnt sein. Beispielsweise ist das flüssige biologische Medium das flüssige biologische Medium als solches. The liquid biological medium may be the liquid biological medium as such or diluted. For example, the liquid biological medium is the liquid biological medium as such.

Gemäß Schritt b) des erfindungsgemäßen Verfahrens, wird mindestens ein lumineszenter Lanthanoidkomplex bereitgestellt. According to step b) of the method according to the invention, at least one luminescent lanthanide complex is provided.

Der Begriff "lumineszent" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung in seiner üblichen, dem Fachmann geläufigen Bedeutung verstanden. Insbesondere umfasst dieser Begriff Lanthanoidkomplexe, die nach entsprechender Anregung The term "luminescent" is understood in the context of the present invention in its usual meaning familiar to the person skilled in the art. In particular, this term includes lanthanide complexes which, after appropriate stimulation

elektromagnetische Strahlung im UV-/VIS-/NIR-Bereich emittieren. emit electromagnetic radiation in the UV / VIS / NIR range.

Lumineszente Lanthanoidkomplexe, die in Wechselwirkung mit Hämoglobin eine lange Lebensdauer aufweisen, sind Komplexe mit einer Lebensdauer von mehr als 100 μβ. Lumineszente Lanthanoidkomplexe, die in Wechselwirkung mit Hämoglobin eine kurze Lebensdauer aufweisen, sind Komplexe mit einer Lebensdauer von weniger als 100 μβ. Luminescent lanthanide complexes, which have a long lifetime in interaction with hemoglobin, are complexes with a lifetime of more than 100 μβ. Luminescent lanthanide complexes that interact with hemoglobin for a short lifetime are complexes with lifetimes of less than 100 μβ.

Beispielsweise hat der mindestens eine lumineszente Lanthanoidkomplex aus Schritt b), in Wechselwirkung mit Hämoglobin, eine lange Lebensdauer. Alternativ hat der mindestens eine lumineszente Lanthanoidkomplex aus Schritt b), in Wechselwirkung mit Hämoglobin, eine kurze Lebensdauer. For example, the at least one luminescent lanthanide complex from step b), in interaction with hemoglobin, has a long lifetime. Alternatively, the at least one luminescent lanthanide complex from step b), in interaction with hemoglobin, has a short lifespan.

Unter dem Begriff "Lanthanoidkomplex" wird im Sinne dieser Erfindung eine Verbindung verstanden, die ein oder mehrere Lanthanoidionen als Zentralion und einen oder mehrere Liganden umfasst. Beispielsweise umfasst, vorzugsweise enthält, der mindestens eine lumineszente Lanthanoidkomplex ein Lanthanoidion als Zentralion und einen oder mehrere Liganden. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, umfasst, vorzugsweise enthält, der mindestens eine lumineszente Lanthanoidkomplex ein Lanthanoidion als Zentralion und einen Liganden. For the purposes of this invention, the term "lanthanide complex" is understood as meaning a compound which contains one or more lanthanide ions as central ion and comprises one or more ligands. For example, preferably, the at least one luminescent lanthanide complex comprises a lanthanide ion as the central ion and one or more ligands. In one embodiment of the present invention, preferably, the at least one luminescent lanthanide complex comprises a lanthanide ion as a central ion and a ligand.

An den mindestens einen lumineszenten Lanthanoidkomplex werden keine besonderen Anforderungen gestellt, vorausgesetzt es handelt sich um einen hämoglobin-sensitiven lumineszenten Lanthanoidkomplex. Unter dem Begriff "hämoglobin-sensitiver" lumineszenter Lanthanoidkomplex wird im Sinne dieser Erfindung eine Verbindung verstanden, die in Wechselwirkung mit Hämoglobin veränderte lumineszente Eigenschaften aufweist. In anderen Worten, das No specific requirements are placed on the at least one luminescent lanthanoid complex, provided it is a hemoglobin-sensitive luminescent lanthanoid complex. For the purposes of this invention, the term "hemoglobin-sensitive" luminescent lanthanoid complex is understood as meaning a compound which has luminescent properties modified in interaction with hemoglobin. In other words, that

Emissionsspektrum des lumineszenten Lanthanoidkomplexes muss zumindest teilweise mit dem Absorptionsspektrum des Hämoglobins überlappen, so dass der Energietransfer zwischen lumineszentem Lanthanoidkomplex und Hämoglobin zumindest eine Lumineszenzeigenschaft des lumineszenten Lanthanoidkomplexes meßbar ändert. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, wird in Schritt b) ein lumineszenter Lanthanoidkomplex bereitgestellt. Alternativ werden in Schritt b) mehrere lumineszente Lanthanoidkomplexe bereitgestellt. Emission spectrum of the luminescent lanthanoid complex must at least partially overlap with the absorption spectrum of hemoglobin, so that the energy transfer between luminescent lanthanide complex and hemoglobin measurably changes at least one luminescence property of the luminescent lanthanoid complex. In one embodiment of the present invention, a luminescent lanthanide complex is provided in step b). Alternatively, several luminescent lanthanide complexes are provided in step b).

Der Begriff "Lanthanoid"komplex wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung in seiner üblichen, dem Fachmann geläufigen Bedeutung verstanden. Insbesondere umfasst dieser Begriff Lanthanoidionen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Cer, Praseodym, Neodym, Promethium, Samarium, Europium, Gadolinium, Terbium, Dysprosium, Holmium, Erbium, Thulium, Ytterbium, Yttrium und Gemische von diesen. The term "lanthanoid" complex is understood in the context of the present invention in its usual meaning familiar to the expert. In particular, this term includes lanthanide ions selected from the group consisting of cerium, praseodymium, neodymium, promethium, samarium, europium, gadolinium, Terbium, dysprosium, holmium, erbium, thulium, ytterbium, yttrium and mixtures of these.

Beispielsweise umfasst der mindestens eine lumineszente Lanthanoidkomplex aus Schritt b) mindestens ein Lanthanoid(III)-Ion. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, umfasst der mindestens eine lumineszente For example, the at least one luminescent lanthanide complex from step b) comprises at least one lanthanide (III) ion. In one embodiment of the present invention, the at least one luminescent

Lanthanoidkomplex aus Schritt b) ein Lanthanoid(III)-Ion. Alternativ umfasst der mindestens eine lumineszente Lanthanoidkomplex aus Schritt b) zwei oder drei Lanthanoid(III)-Ionen. Lanthanoid complex from step b) a lanthanide (III) ion. Alternatively, the at least one luminescent lanthanide complex from step b) comprises two or three lanthanide (III) ions.

In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, ist das mindestens eine Lanthanoid(III)-Ion ausgewählt aus der Gruppe umfassend Ytterbium(III)-Ion (Yb³⁺), Terbium(III)-Ion (Tb³⁺), Europium(III)-Ion (Eu³⁺), Erbium(III)-Ion (Er³⁺), Samarium(III)-Ion (Sm³⁺), Dysprosium(III)-Ion (Dy³⁺), Neodymium(III)-Ion (Nd³⁺) und Gemische von diesen. In one embodiment of the present invention, the at least one lanthanide (III) ion is selected from the group comprising ytterbium (III) ion (Yb ³⁺ ), terbium (III) ion (Tb ³⁺ ), europium (III) Ion (Eu ³⁺ ), erbium (III) ion (Er ³⁺ ), samarium (III) ion (Sm ³⁺ ), dysprosium (III) ion (Dy ³⁺ ), neodymium (III) ion (Nd ³⁺ ) and mixtures of these.

Beispielsweise ist das mindestens eine Lanthanoid(III)-Ion ausgewählt aus der Gruppe umfassend Terbium(III)-Ion (Tb³⁺), Europium(III)-Ion (Eu³⁺), For example, the at least one lanthanide (III) ion is selected from the group comprising terbium (III) ion (Tb ³⁺ ), europium (III) ion (Eu ³⁺ ),

Vorzugsweise ist das mindestens eine Lanthanoid(III)-Ion ein Terbium(III)-Ion (Tb³⁺), Europium(III)-Ion (Eu³⁺), Samarium(III)-Ion (Sm³⁺) oder ein Preferably, the at least one lanthanide (III) ion is a terbium (III) ion (Tb ³⁺ ), europium (III) ion (Eu ³⁺ ), samarium (III) ion (Sm ³⁺ ), or a

Dysprosium(III)-Ion (Dy³⁺). In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, umfasst der mindestens eine lumineszente Lanthanoidkomplex aus Schritt b) mindestens einen mit dem Dysprosium (III) ion (Dy ³⁺ ). In one embodiment of the present invention, the at least one luminescent lanthanide complex from step b) comprises at least one with the

Lanthanoid(III)-Ion komplexbildenden Liganden. Beispielsweise umfasst der mindestens eine lumineszente Lanthanoidkomplex aus Schritt b) einen mit dem Lanthanoid(III)-Ion komplexbildenden Liganden. Alternativ umfasst der mindestens eine lumineszente Lanthanoidkomplex aus Schritt b) mehrere mit dem Lanthanoid (III) ion complexing ligands. For example, the at least one luminescent lanthanide complex from step b) comprises one with the Lanthanoid (III) ion complexing ligands. Alternatively, the at least one luminescent lanthanide complex from step b) comprises several with the

Lanthanoid(III)-Ion komplexbildende Liganden. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, umfasst der mindestens eine komplexbildende Ligand mindestens ein mit dem Lanthanoid(III)-Ion Lanthanoid (III) ion complexing ligands. In one embodiment of the present invention, the at least one complexing ligand comprises at least one with the lanthanide (III) ion

komplexbildendes Element ausgewählt aus der Gruppe umfassend Stickstoff, Sauerstoff, Schwefel, Phosphor und Gemische von diesen. Beispielsweise umfasst der mindestens eine komplexbildende Ligand mindestens ein mit dem complexing element selected from the group comprising nitrogen, oxygen, sulfur, phosphorus and mixtures of these. For example, the at least one complex-forming ligand comprises at least one with the

Lanthanoid(III)-Ion komplexbildendes Element ausgewählt aus der Gruppe umfassend Stickstoff, Sauerstoff und Gemische von diesen. Vorzugsweise umfasst der mindestens eine komplexbildende Ligand ein Gemisch aus Stickstoff und Sauerstoff als mit dem Lanthanoid(III)-Ion komplexbildendes Element. Alternativ umfasst der mindestens eine komplexbildende Ligand mindestens ein mit dem Lanthanoid(III)-Ion komplexbildendes Element ausgewählt aus der Gruppe umfassend Schwefel oder Phosphor. Lanthanoid (III) ion complexing element selected from the group comprising nitrogen, oxygen and mixtures of these. Preferably, the at least one complexing ligand comprises a mixture of nitrogen and oxygen as the lanthanide (III) ion complexing element. Alternatively, the at least one complexing ligand comprises at least one lanthanide (III) ion complexing element selected from the group comprising sulfur or phosphorus.

In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, wird der kommerziell erhältliche Lanthanoidkomplex Lumi4Tb-NHS (Lumiphore Inc., Kalifornien, USA) als der mindestens eine lumineszente Lanthanoidkomplex in Schritt b) bereitgestellt. Alternativ wird der kommerziell erhältliche Luminophor Europium Tris(bipryridin (Eu-TBP; Cisbio Bioassays, Frankreich, Europa) als der mindestens eine In one embodiment of the present invention, the commercially available lanthanide complex Lumi4Tb-NHS (Lumiphore Inc., California, USA) is provided as the at least one luminescent lanthanide complex in step b). Alternatively, the commercially available luminophore Europium Tris (bipridein (Eu-TBP; Cisbio Bioassays, France, Europe) is considered to be the at least one

lumineszente Lanthanoidkomplex in Schritt b) bereitgestellt. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, wird die folgende Struktur I als der mindestens eine lumineszente Lanthanoidkomplex in Schritt b) bereitgestellt: luminescent lanthanide complex in step b). In one embodiment of the present invention, the following structure I is provided as the at least one luminescent lanthanide complex in step b):

tru tur tru tur

In der Struktur I ist das Lanthanoid(III)-Ion vorzugsweise Europium oder Terbium. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, ist das Lanthanoid(III)-Ion in der Struktur I vorzugsweise Europium oder Terbium. In structure I, the lanthanide (III) ion is preferably europium or terbium. In one embodiment of the present invention, the lanthanide (III) ion in structure I is preferably europium or terbium.

In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, ist der mindestens eine lumineszente Lanthanoidkomplex wasserlöslich. In one embodiment of the present invention, the at least one luminescent lanthanide complex is water-soluble.

Vorzugsweise weist der lumineszente Lanthanoidkomplex aus Schritt b) eine Löslichkeit in Wasser bei 20 °C (± 2 °C) von mehr als 1 g/1. Beispielsweise weist der lumineszente Lanthanoidkomplex aus Schritt b) eine Löslichkeit in Wasser bei 20 °C (± 2 °C) von 1 bis 50 g/1, bevorzugt von 1 bis 40g/l, weiter bevorzugt von 1 bis 30 g/1 und noch weiter bevorzugt von 1 bis 20 g/1 auf. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, wird der mindestens eine lumineszente Lanthanoidkomplex aus Schritt b) in einer Menge von 1 ng/1 bis 1000 mg/1, bevorzugt in einem Bereich von 10 ng/1 bis 500 mg/1 und weiter bevorzugt in einem Bereich von 10 ng/1 bis 100 mg/1, basierend auf der Menge des flüssigen biologischen Mediums aus Schritt a), bereitgestellt. Preferably, the luminescent lanthanide complex of step b) has a solubility in water at 20 ° C (± 2 ° C) of greater than 1 g / l. For example, the luminescent lanthanide complex of step b) has a solubility in water at 20 ° C (± 2 ° C) of 1 to 50 g / l, preferably 1 to 40 g / l, more preferably 1 to 30 g / l and still more preferably from 1 to 20 g / l. In one embodiment of the present invention, the at least one luminescent lanthanide complex from step b) is used in an amount of 1 ng / 1 to 1000 mg / l, preferably in a range of 10 ng / 1 to 500 mg / l and more preferably in one Range from 10 ng / 1 to 100 mg / l, based on the amount of the liquid biological medium from step a).

Gemäß Schritt c) der vorliegenden Erfindung wird das flüssige biologische Medium aus Schritt a) mit dem lumineszenten Lanthanoidkomplex aus Schritt b) in Kontakt gebracht. Das Inkontaktbringen ermöglicht eine Wechselwirkung zwischen dem lumineszenten Lanthanoidkomplex aus Schritt b) und dem in dem flüssigen biologischen Medium aus Schritt a) enthaltenen Hämoglobin. According to step c) of the present invention, the liquid biological medium from step a) is brought into contact with the luminescent lanthanide complex from step b). The contacting allows an interaction between the luminescent lanthanide complex from step b) and the hemoglobin contained in the liquid biological medium from step a).

Das Inkontaktbringen des flüssigen biologischen Mediums aus Schritt a) mit dem lumineszenten Lanthanoidkomplex aus Schritt b) erfolgt beispielsweise durch Diffusion in der Probe oder unter Rühren. In einer Ausführungsform der The contacting of the liquid biological medium from step a) with the luminescent lanthanoid complex from step b) takes place, for example, by diffusion in the sample or with stirring. In one embodiment of the

vorliegenden Erfindung erfolgt das Inkontaktbringen des flüssigen biologischen Mediums aus Schritt a) mit dem lumineszenten Lanthanoidkomplex aus Schritt b) unter Rühren vorzugsweise unter Rühren. The present invention involves contacting the liquid biological medium from step a) with the luminescent lanthanide complex from step b) with stirring, preferably with stirring.

Unter dem Begriff "Rühren" wird im Sinne dieser Erfindung jegliche For the purposes of this invention, the term "stirring" means any

Durchmischung des erhaltenen Gemisches verstanden, die zu einer ausreichenden räumlichen Nähe zwischen Hämoglobin und dem lumineszenten Lanthanoidkomplex führt, um eine Emission von Lumineszenz zu erzielen. Understood mixing of the resulting mixture, which leads to a sufficient spatial proximity between hemoglobin and the luminescent lanthanoid complex to achieve emission of luminescence.

Dementsprechend kann das Rühren durch Schütteln des Gemisches oder durch ein mechanisches Gerät, wie ein Rührfisch oder ein Rührstab, erfolgen. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, umfasst das in Schritt c) erhaltene flüssige biologische Medium den mindestens einen lumineszenten Accordingly, the stirring may be carried out by shaking the mixture or by a mechanical device such as a stir bar or a stir bar. In one embodiment of the present invention, the liquid biological medium obtained in step c) comprises the at least one luminescent one

Lanthanoidkomplex aus Schritt b) in einer Menge von 1 ng/1 bis 1000 mg/1, bevorzugt in einem Bereich von 10 ng/1 bis 500 mg/1 und weiter bevorzugt in einem Bereich von 10 ng/1 bis 100 mg/1, basierend auf der Menge des flüssigen Lanthanoid complex from step b) in an amount of 1 ng / 1 to 1000 mg / l, preferably in a range of 10 ng / 1 to 500 mg / l and more preferably in a range of 10 ng / 1 to 100 mg / l, based on the amount of liquid

biologischen Mediums aus Schritt a). biological medium from step a).

In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, erfolgt Schritt c) bei einer Temperatur in einem Bereich von 15 °C bis 50 °C. Beispielsweise erfolgt Schritt c) bei einer Temperatur in einem Bereich von 20 °C bis 40 °C. In one embodiment of the present invention, step c) is carried out at a temperature in a range of 15 ° C to 50 ° C. For example, step c) is carried out at a temperature in a range of 20 ° C to 40 ° C.

Gemäß Schritt d) der vorliegenden Erfindung erfolgt die Bestimmung der emittierten Lumineszenz von dem mit Hämoglobin interagierenden Lanthanoidkomplex in dem flüssigen biologischen Medium aus Schritt c). According to step d) of the present invention, the determination of the emitted luminescence from the hemoglobin-interacting lanthanide complex in the liquid biological medium from step c).

In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, erfolgt die Bestimmung der emittierten Lumineszenz in Schritt d) in einem Wellenlängenbereich größer 400 nm. In one embodiment of the present invention, the determination of the emitted luminescence in step d) takes place in a wavelength range greater than 400 nm.

Beispielsweise erfolgt die Bestimmung der emittierten Lumineszenz in Schritt d) in einem Wellenlängenbereich von 400 bis 1000 nm. For example, the determination of the emitted luminescence in step d) takes place in a wavelength range of 400 to 1000 nm.

Der strahlungslose Energietransfer zwischen Hämoglobin und dem mindestens einen lumineszenten Lanthanoidkomplex hängt von der räumlichen Nähe beider Radiationless energy transfer between hemoglobin and the at least one luminescent lanthanide complex depends on the spatial proximity of both

Verbindungen ab. Daher ändern sich die bestimmbaren Lumineszenzwerte wie Lumineszenzintensität und Lumineszenzabklingzeit des lumineszenten Connections. Therefore, the detectable luminescence values such as luminescence intensity and luminescence decay time of the luminescent change

Lanthanoidkomplexes besonders effizient, wenn eine substantielle Anzahl von Molekülen beider Verbindungen in engen räumlichen Kontakt gebracht wird. Ferner ist bevorzugt, dass die Menge an dem mindestens einen lumineszenten Lanthanoidkomplex nicht zu hoch ist. Beispielsweise umfasst das in Schritt c) erhaltene flüssige biologische Medium den mindestens einen lumineszenten Lanthanoid complex particularly efficient when a substantial number of molecules of both compounds are brought into close spatial contact. Furthermore, it is preferred that the amount of the at least one luminescent Lanthanoid complex is not too high. For example, the liquid biological medium obtained in step c) comprises the at least one luminescent

Lanthanoidkomplex in einer Menge von 1 ng/1 bis 1000 mg/1, bevorzugt in einem Bereich von 10 ng/1 bis 500 mg/1 und weiter bevorzugt in einem Bereich von 10 ng/1 bis 100 mg/1, basierend auf der Menge des flüssigen biologischen Mediums aus Schritt a). Lanthanide complex in an amount of 1 ng / 1 to 1000 mg / 1, preferably in a range of 10 ng / 1 to 500 mg / 1, and more preferably in a range of 10 ng / 1 to 100 mg / 1, based on the amount the liquid biological medium from step a).

Daher erfolgt die Bestimmung der emittierten Lumineszenz in Schritt d) Therefore, the determination of the emitted luminescence in step d)

vorzugsweise durch Bestimmung der Lumineszenzabklingzeit und/oder preferably by determining the luminescence decay time and / or

Lumineszenzintensität. Luminescence intensity.

In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, erfolgt die Bestimmung der emittierten Lumineszenz in Schritt d) durch Bestimmung der In one embodiment of the present invention, the determination of the emitted luminescence in step d) is carried out by determining the

Lumineszenzabklingzeit und Lumineszenzintensität. Alternativ erfolgt die Luminescence decay time and luminescence intensity. Alternatively, the

Bestimmung der emittierten Lumineszenz in Schritt d) durch Bestimmung der Lumineszenzabklingzeit oder Lumineszenzintensität. Determining the emitted luminescence in step d) by determining the luminescence decay time or luminescence intensity.

Beispielsweise erfolgt die Bestimmung der emittierten Lumineszenz in Schritt d) durch Bestimmung der Lumineszenzabklingzeit. For example, the determination of the emitted luminescence in step d) is carried out by determining the luminescence decay time.

In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, erfolgt Schritt d) bei einer Temperatur in einem Bereich von 15 °C bis 50 °C. Beispielsweise erfolgt Schritt d) bei einer Temperatur in einem Bereich von 20 °C bis 40 °C. In one embodiment of the present invention, step d) is carried out at a temperature in a range of 15 ° C to 50 ° C. For example, step d) is carried out at a temperature in a range of 20 ° C to 40 ° C.

In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, umfasst das erfinderische Verfahren ferner Schritt e), in dem die quantitative Bestimmung des Hämoglobins in dem flüssigen biologischen Medium aus Schritt a) durch Vergleich der in Schritt d) bestimmten emittierten Lumineszenz mit einer Kalibrierkurve erfolgt. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, wird die Kalibrierkurve durch Bestimmung der emittierten Lumineszenz von definierten Mengen an Hämoglobin in einem flüssigen Kalibriermedium erhalten. Das Kalibriermedium entspricht dabei in seiner Zusammensetzung dem fiüssigen biologischen Medium aus Schritt a), mit der Maßgabe, dass kein Hämoglobin enthalten ist oder nur eine bekannte Menge an Hämoglobin enthalten ist. Alternativ stellt das flüssige Kalibriermedium eine mit Zusätzen versehene Pufferlösung dar, die in ihrer Zusammensetzung dem fiüssigen biologischen Medium aus Schritt a) im Wesentlichen entspricht. In one embodiment of the present invention, the inventive method further comprises step e), in which the quantitative determination of the hemoglobin in the liquid biological medium from step a) is carried out by comparing the emitted luminescence determined in step d) with a calibration curve. In one embodiment of the present invention, the calibration curve is obtained by determining the emitted luminescence of defined amounts of hemoglobin in a liquid calibration medium. The calibration medium corresponds in its composition to the liquid biological medium from step a), with the proviso that no hemoglobin is contained or only a known amount of hemoglobin is contained. Alternatively, the liquid calibration medium is an adjunct buffer solution having substantially the same composition as the liquid biological medium of step a).

In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, erfolgt Schritt e) bei einer Temperatur in einem Bereich von 15 °C bis 50 °C. Beispielsweise erfolgt Schritt e) bei einer Temperatur in einem Bereich von 20 °C bis 40 °C. Unter dem Begriff "quantitative Bestimmungen von Hämoglobin" im Sinne der vorliegenden Erfindung wird die Bestimmung der Konzentration des in dem fiüssigen biologischen Mediums enthaltenden Hämoglobins verstanden. In one embodiment of the present invention, step e) is carried out at a temperature in a range of 15 ° C to 50 ° C. For example, step e) takes place at a temperature in a range of 20 ° C to 40 ° C. The term "quantitative determinations of hemoglobin" within the meaning of the present invention is understood to mean the determination of the concentration of hemoglobin contained in the liquid biological medium.

In anderen Worten, die quantitative Bestimmung von Hämoglobin in dem fiüssigen biologischen Medium erfolgt durch Bestimmung der emittierten Lumineszenz in Schritt d), wie durch die Bestimmung der Lumineszenzabklingzeit und/oder In other words, the quantitative determination of hemoglobin in the liquid biological medium is made by determining the emitted luminescence in step d), such as by determining the luminescence decay time and / or

Lumineszenzintensität. Beispielsweise erfolgt die quantitative Bestimmung von Hämoglobin in dem fiüssigen biologischen Medium durch Bestimmung der Luminescence intensity. For example, the quantitative determination of hemoglobin in the liquid biological medium by determining the

Lumineszenzabklingzeit oder Lumineszenzintensität. Vorzugsweise erfolgt die quantitative Bestimmung von Hämoglobin in dem fiüssigen biologischen Medium durch Bestimmung der Lumineszenzabklingzeit. Das dargestellte Verfahren bietet insbesondere den Vorteil, dass es eine quantitative Bestimmung von Hämoglobin in einem flüssigen biologischen Medium außerhalb des Körpers ermöglicht und das Verfahren ohne aufwendige Probenvorbereitung und chemische Veränderung der Probe durchgeführt werden. Zusätzlich kann der Verbrauch an Chemikalien deutlich reduziert werden, wodurch Kosten, Luminescence decay time or luminescence intensity. Preferably, the quantitative determination of hemoglobin in the liquid biological medium is made by determining the luminescence decay time. The illustrated method offers the particular advantage that it allows a quantitative determination of hemoglobin in a liquid biological medium outside the body and the method without elaborate sample preparation and chemical modification of the sample are performed. In addition, the consumption of chemicals can be significantly reduced, reducing costs,

Arbeitsaufwand und Entsorgungsaufwand minimiert werden können. Des Weiteren weist das Verfahren eine geringe Störungsanfälligkeit durch in der Probe enthaltene Verbindungen auf. Insgesamt resultiert daraus, dass bei vergleichbarer Sensitivität der Messungen, auch eine Zeit-, als auch eine Verbrauchsmaterialienersparnis im Vergleich zu gebräuchlichen Verfahren auftritt. Es ist weiterhin möglich, dieselbe Probe zur Bestimmung weiterer Biomarker zu nutzen. Dies kann beispielsweise auf der Basis von Försterresonanzenergietransfer (FRET) in FRET-Immunoassays geschehen, bei dem der in Schritt b) bereitgestellte lumineszente Labor and disposal costs can be minimized. Furthermore, the method has a low susceptibility to interference by compounds contained in the sample. Overall, the result is that with comparable sensitivity of the measurements, there is also a saving of time and consumables compared to conventional methods. It is also possible to use the same sample to determine additional biomarkers. This can be done for example on the basis of Försterresonanzenergietransfer (FRET) in FRET immunoassays, in which provided in step b) luminescent

Lanthanoidkomplexe als Donor fungiert. Dies macht die gleichzeitige Bestimmung mehrerer Biomarker mit einer Messung (Multiplexing) möglich. Lanthanoidkomplexe acts as a donor. This makes possible the simultaneous determination of several biomarkers with one measurement (multiplexing).

Aufgrund der vorteilhaften Eigenschaften, kann der mindestens eine lumineszente Lanthanoidkomplex in einem weiteren Aspekt zur quantitativen Bestimmung von Hämoglobin in einem flüssigen biologischen Medium außerhalb des Körpers verwendet werden. Due to the advantageous properties, the at least one luminescent lanthanide complex can be used in a further aspect for the quantitative determination of hemoglobin in a liquid biological medium outside the body.

Die Ausgestaltungen des flüssigen biologischen Mediums und des mindestens einen lumineszenten Lanthanoidkomplexes gemäß dem erfinderischen Verfahren gelten auch für die Verwendung und umgekehrt. Kurze Beschreibung der Figuren The embodiments of the liquid biological medium and of the at least one luminescent lanthanoid complex according to the inventive method also apply to the use and vice versa. Brief description of the figures

Fig.l : Abhängigkeit der Lumineszenzabklingzeit von Lumi4Tb von der Fig.l: Dependence of the Lumineszenzabblingzeit of Lumi4Tb of the

Hämoglobinkonzentration in Wasser. Hemoglobin concentration in water.

Fig. 2: Bestimmung von Hämoglobin in Wasser nach dem erfinderischen Verfahren und gebräuchlichen Bestimmungsmethoden im Vergleich zu der tatsächlichen (erwarteten) Hb-Konzentration der Probe (durchgehende Linie). Fig. 3: Abhängigkeit der Lumineszenzabklingzeit von Lumi4Tb von der Fig. 2: Determination of hemoglobin in water according to the inventive method and conventional determination methods compared to the actual (expected) Hb concentration of the sample (solid line). FIG. 3: Dependence of the luminescence decay time of Lumi4Tb on the

Hämoglobinkonzentration in Blutserum. Hemoglobin concentration in blood serum.

Fig. 4: Vergleich der experimentell durch Lumi4Tb bestimmten Fig. 4: Comparison of experimentally determined by Lumi4Tb

Hämoglobinkonzentration verschiedener Proben von Blutserum mit den erwarteten Konzentrationen (gestrichelte Linie). Hemoglobin concentration of various samples of blood serum at the expected concentrations (dashed line).

Fig. 5: Vergleich der experimentell durch Lumi4Tb bestimmten Fig. 5: Comparison of experimentally determined by Lumi4Tb

Hämoglobinkonzentration verschiedener Proben von Blutplasma und Blutserum mit den erwarteten Konzentrationen (durchgehende Linie). Hemoglobin concentration of various blood plasma and blood serum samples at the expected concentrations (solid line).

Fig. 6: Bestimmung von Hämoglobin in Plasma und Vergleich der mit verschiedenen Bestimmungsmethoden ermittelten Hb-Konzentration in der Probe. FIG. 6: Determination of hemoglobin in plasma and comparison of the Hb concentration in the sample determined with different determination methods.

Fig. 7: Abhängigkeit der Lumineszenzabklingzeit von Lumi4Tb von der FIG. 7: Dependence of the luminescence decay time of Lumi4Tb on the

Hämoglobinkonzentration in Urin und Speichel. Beispiele Hemoglobin concentration in urine and saliva. Examples

Zum Nachweis der quantitativen Bestimmung von Hämoglobin (Hb) in einem flüssigen biologischen Medium außerhalb des Körpers sind u.a. die nachfolgend dargestellten Versuche durchgeführt worden. Es haben sich reproduzierbare Ergebnisse gezeigt, die mit der tatsächlichen Hämoglobinkonzentration besser übereinstimmen wie die die durch gebräuchliche Verfahren bestimmt wurden. To demonstrate the quantitative determination of hemoglobin (Hb) in a liquid biological medium outside the body, i.a. the experiments described below have been carried out. There have been reproducible results that are more consistent with the actual hemoglobin concentration than those determined by conventional methods.

Ein hämoglobinsensitives Luminophor wurde zur Bestimmung der A hemoglobin-sensitive luminophore was used to determine the

Hämoglobinkonzentration in einer Probe untersucht. Lanthanoidkomplexe stellten sich im Verlauf der Untersuchungen als geeignete Luminophore heraus. Ihre Lumineszenz hängt sowohl in Intensität als auch Abklingzeit von der Konzentration an Hämoglobin in der zu untersuchenden Probe ab (siehe Fig 1), wobei die Veränderung der Lumineszenzabklingzeit als Parameter eindeutiger ist. Die Untersuchungen wurden sowohl mit dem Mikrotiterplattenlesegerät KryptorHemoglobin concentration in a sample examined. Lanthanoid complexes turned out to be suitable luminophores in the course of the investigations. Their luminescence depends on the concentration of hemoglobin in the sample to be examined, both in terms of their intensity and their decay time (see FIG. 1), the change in the luminescence decay time as a parameter being more unambiguous. The investigations were carried out both with the microplate reader Kryptor

(BRAHMS, Hennigsdorf, Deutschland), dem Mikrotiterplattenlesegerät Nanoscan LF500 (IOM, Berlin, Deutschland) als auch dem Spektrometer FLS920 (Edinburgh Instruments, Edinburgh, UK) durchgeführt. Ein Vergleich der mit Hilfe des kommerziell erhältlichen Lanthanoidkomplexes Lumi4Tb-NHS (Lumiphore Inc. Kalifornien, USA) ermittelten Hämoglobinkonzentrationen in Wasser im Vergleich zu verschiedenen bisher gebräuchlichen Verfahren zeigt, dass das erfinderische Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Hämoglobin mittels (BRAHMS, Hennigsdorf, Germany), the microtiter plate reader Nanoscan LF500 (IOM, Berlin, Germany) and the spectrometer FLS920 (Edinburgh Instruments, Edinburgh, UK). A comparison of the hemoglobin concentrations in water determined with the aid of the commercially available lanthanide complex Lumi4Tb-NHS (Lumiphore Inc. California, USA) in comparison to various previously used methods shows that the inventive method for the quantitative determination of hemoglobin by means of

Lanthanoidlumineszenz mindestens vergleichbare, im Mittel sogar exaktere Messergebnisse liefert als die bisher gebräuchlichen Verfahren (siehe Fig. 2). Die mit dem erfinderischen Verfahren und den gebräuchlichen Verfahren bestimmten Hämoglobinkonzentrationen sind im Vergleich zur tatsächlichen Hb-Konzentration der Probe dargestellt. Bei Messungen in anderen Medien als Wasser sind Wechselwirkungen mit weiteren in dem Medium enthaltenen Probenbestandteilen generell möglich, die die zu emittierende Lumineszenz der Lanthanoidkomplexe beeinflussen können. Dies ist vor allem bei Messungen in Blutplasma und -serum zu berücksichtigen, da diese einen hohen Anteil an verschiedensten Proteinen aufweisen. Zu nennen sind hier insbesondere Albumin und verschiedene Globuline, deren Konzentrationen üblicherweise 38 - 52 g/1 (Albumin), 3,9 - 9,4 g/1 (a-Globuline), 5 - 9 g/1 (ß- Globuline) bzw. 7 - 15 g/1 (γ-Globuline) betragen. Trotz dieser Vielzahl möglicher Wechselwirkungspartner, zeigt das erfinderische Verfahren nur eine sehr geringe Anfälligkeit für Störungen. Insbesondere ist festzustellen, dass die Lumineszenzlebenszeit von Lanthanoidkomplexen in verschiedenen Proben von Plasma und Serum nur wenig schwankt. Die Abhängigkeit der Lumineszenzabklingzeit von Lumi4Tb von der Hämoglobinkonzentration in Blutserum ist in Fig. 3 dargestellt. Aufgrund dieser geringen Schwankungen derLanthanoid luminescence at least comparable, on average even more accurate results than the previously used methods (see Fig. 2). The hemoglobin concentrations determined by the inventive method and the conventional methods are shown in comparison with the actual Hb concentration of the sample. For measurements in media other than water, interactions with other sample constituents contained in the medium are generally possible which may affect the luminescence of the lanthanoid complexes to be emitted. This should be taken into account, especially when taking measurements in blood plasma and serum, since they have a high proportion of different proteins. Particularly noteworthy here are albumin and various globulins whose concentrations are usually 38-52 g / l (albumin), 3.9-9.4 g / l (α-globulins), 5-9 g / l (β-globulins). or 7 to 15 g / l (γ-globulins). Despite this multitude of possible interaction partners, the inventive method shows only a very low susceptibility to disturbances. In particular, it should be noted that the luminescence lifetime of lanthanide complexes in various samples of plasma and serum varies only slightly. The dependence of the luminescence decay time of Lumi4Tb on hemoglobin concentration in blood serum is shown in FIG. Because of these small fluctuations in the

Lumineszenzabklingzeit kann davon ausgegangen werden, dass eine Kalibrierkurve für Blutplasma und -serum Gültigkeit für alle Messungen in diesen Luminescence decay time can be assumed to be a calibration curve for blood plasma and serum validity for all measurements in these

Körperflüssigkeiten besitzt. Diese Kalibrierkurve kann daher als Kalibrierkurve für alle durchgeführten Messungen in Blutplasma und Blutserum verwendet werden. Possesses body fluids. This calibration curve can therefore be used as a calibration curve for all measurements made in blood plasma and blood serum.

Die vorherige Annahme wird durch Bestimmungen der Hämoglobin-Konzentration mit Hilfe dieser Kalibrierkurve in Plasma und Serum verschiedener Personen gestützt (siehe Fig. 4 und 5), da die erzielten Ergebnisse, insbesondere für Blutserum, sehr gut mit den Erwartungen übereinstimmen. The previous assumption is supported by determinations of the hemoglobin concentration using this calibration curve in plasma and serum of different persons (see FIGS. 4 and 5), since the results achieved, in particular for blood serum, agree very well with the expectations.

Dazu wurden zu einer Plasma- oder Serumprobe zunehmende Konzentrationen an Hämoglobin pipettiert und anschließend die Hb-Konzentration in den Proben bestimmt. Im Idealfall sollte die ermittelte Konzentration mit der zugegebenen identisch sein. Im Gegensatz zum Blutserum wiesen alle Plasmaproben eine For this purpose, increasing concentrations of hemoglobin were pipetted into a plasma or serum sample and then the Hb concentration in the samples was determined. Ideally, the determined concentration should be with the added be identical. In contrast to the blood serum, all plasma samples had one

Initialkonzentration zwischen 0.3 und 0.5 g/1 Hämoglobin auf. Diese wurde zum besseren Vergleich der erwarteten mit den ermittelten Hb-Konzentrationen von den experimentell ermittelten Hb-Gesamtkonzentrationen in der Probe abgezogen. Initial concentration between 0.3 and 0.5 g / 1 hemoglobin. This was subtracted from the experimentally determined Hb total concentrations in the sample to better compare the expected with the determined Hb concentrations.

Dadurch kam es zu größeren Schwankungen der Ergebnisse in Blutplasma (siehe Fig. 5), verglichen mit denen in Blutserum (siehe Fig. 4). As a result, there were larger fluctuations in the results in blood plasma (see FIG. 5) compared with those in blood serum (see FIG. 4).

Ein Vergleich der über die Lanthanoidlumineszenz ermittelten Hb-Konzentrationen einer Plasmaprobe mit den Ergebnissen, die durch andere gebräuchliche A comparison of the Hb concentrations of a plasma sample determined via the lanthanide luminescence with the results obtained by other conventional methods

Bestimmungsmethoden gewonnen wurden, zeigt eine gute Übereinstimmung der ermittelten Konzentrationen aller Methoden (siehe Fig. 6). Die Determination methods showed a good agreement of the determined concentrations of all methods (see Fig. 6). The

Konzentrationsbestimmung erfolgte für die Methode nach Kahn direkt, für TMB und Lumi4Tb durch Vergleich der Ergebnisse der Plasmamessung mit der jeweiligen Kalibrierkurve. Der Hämoglobingehalt des genutzten Plasmas ohne Zugabe von Hämoglobin wurde zu etwa 0.23 g/1 bestimmt. Concentration was determined for the method according to Kahn direct, for TMB and Lumi4Tb by comparing the results of the plasma measurement with the respective calibration curve. The hemoglobin content of the plasma used without addition of hemoglobin was determined to be about 0.23 g / l.

Dies verdeutlicht eindrucksvoll die Anwendbarkeit des erfinderischen Verfahrens zur quantitativen Bestimmung der Hb-Konzentration mit Lanthanoidkomplexen in einem flüssigen biologischen Medium, wie z.B. Blutplasma oder Serum. Die Sensitivität ist damit ausreichend, um untypische Hämoglobinkonzentrationen nachzuweisen. This impressively illustrates the applicability of the inventive method for the quantitative determination of Hb concentration with lanthanide complexes in a liquid biological medium, such as e.g. Blood plasma or serum. The sensitivity is therefore sufficient to detect atypical hemoglobin concentrations.

Auch die quantitative Bestimmung von Hämoglobin in einem flüssigen biologischen Medium wie Urin oder Speichel ist möglich. Bei diesen Körperflüssigkeiten ist zu erwarten, dass der Einfluss des pH- Werte in den Vordergrund tritt, da bei sauren pH- Werten die Lumineszenz des verwendeten Lanthanoidkomplexes stark verändert sein kann. Es konnte aber gezeigt werden, dass auch bei Messungen in Urin und Speichel eine konzentrationsabhängige Änderung der Lumineszenzlebenszeit auftritt (siehe Fig. 7). Da bereits bei Konzentrationen von wenigen mg/1 zum Teil deutliche Änderungen der Lumineszenzlebenszeit auftreten, sind ähnlich sensitive Messungen wie in Blutplasma und -serum möglich. Also, the quantitative determination of hemoglobin in a liquid biological medium such as urine or saliva is possible. With these body fluids, it is to be expected that the influence of the pH values comes to the fore, since at acidic pH values, the luminescence of the lanthanoid complex used can be greatly altered. However, it could be shown that a concentration-dependent change in the luminescence lifetime also occurs in measurements in urine and saliva (see FIG. 7). Since even at concentrations of a few mg / 1 sometimes clear Changes in Lumineszenzlebenszeit occur, similar sensitive measurements as in blood plasma and serum are possible.

Der Ablauf der Messung der Hämoglobinkonzentration mit Lanthanoidkomplexen ist für alle Messungen wie folgt: The procedure for measuring the hemoglobin concentration with lanthanide complexes is as follows for all measurements:

Zu einer zu untersuchenden Probe wird ein Lanthanoidkomplex zugegeben. Dessen Konzentration kann relativ frei gewählt werden. Es sind Lanthanoid-Konzentrationen bis in den fM-Bereich möglich, was im Sinne einer Kosten- und Materialienersparnis wünschenswert ist. Direkt anschließend kann, ohne eine Inkubationszeit beachten zu müssen, die Messung der Lumineszenz des Lanthanoidkomplexes erfolgen. Dieser wird dabei im spektralen Bereich seiner Absorption mit einer gepulsten To a sample to be examined, a lanthanide complex is added. Its concentration can be chosen relatively freely. Lanthanide concentrations up to the fM range are possible, which is desirable in terms of cost and material savings. Immediately thereafter, without having to observe an incubation period, the luminescence of the lanthanoid complex can be measured. This is pulsed in the spectral range of its absorption

Anregungslichtquelle (Laser, Blitzlichtlampe, LED, LD) bestrahlt, sofern die Messung zeitaufgelöst und/oder steady-state erfolgen soll bzw. mit einer Excited light source (laser, flash lamp, LED, LD) irradiated, if the measurement should be time-resolved and / or steady-state or with a

kontinuierlichen Lichtquelle (Xe-Lampe, LED) falls die Messung nur steady-state erfolgt. Die Messung der Lumineszenzintensität (steady-state oder zeitaufgelöst) oder der Lumineszenzabklingzeit erfolgt im Bereich eines oder aller Continuous light source (Xe lamp, LED) if the measurement is only steady-state. The measurement of the luminescence intensity (steady-state or time-resolved) or luminescence decay time is in the range of one or all

Emissionsmaxima der Lanthanoidkomplexe. Die Messung kann durch verschiedene Geräte verschiedener Hersteller erfolgen, wie beispielsweise einem Emission maxima of lanthanide complexes. The measurement can be done by different devices from different manufacturers, such as a

Mikrotiterplattenlesegerät Kryptor (BRAHMS, Hennigsdorf, Deutschland), einem Mikrotiterplattenlesegerät Nanoscan LF500 (IOM, Berlin, Deutschland) als auch einem Spektrometer FLS920 (Edinburgh Instruments, Edinburgh, UK). Da die Lumineszenz der Lanthanoidkomplexe von der Hämoglobinkonzentration in der Probe abhängig ist, kann die Intensität bzw. die Abklingzeit derselben mit der einer Kalibrierkurve verglichen und so die Hämoglobinkonzentration in der zu Microplate reader Kryptor (BRAHMS, Hennigsdorf, Germany), a Nanoscan LF500 microtiter plate reader (IOM, Berlin, Germany) and a FLS920 spectrometer (Edinburgh Instruments, Edinburgh, UK). Since the luminescence of the lanthanide complexes is dependent on the hemoglobin concentration in the sample, the intensity or the decay time of the same can be compared with that of a calibration curve and thus the hemoglobin concentration in the

untersuchenden Probe bestimmt werden. Die Kalibrierkurve wird durch die Aufnahme einer Kurve von Hämoglobinstandards verschiedener Konzentration im jeweils zu untersuchenden Medium (Plasma, Serum, Urin, Speichel, u.ä. bzw. Pufferlösungen, deren Zusammensetzung der des untersuchten Mediums sehr ähnlich ist) für das jeweils zur Messung benutzte Messgerät (Spektrometer, Fluoreszenzreader) erstellt (siehe Fig. 3). be determined. The calibration curve is obtained by recording a curve of hemoglobin standards of different concentration in the medium to be examined (plasma, serum, urine, saliva, or similar or buffer solutions, the composition of which is very similar to that of the medium tested) for each of the measurements Measuring device (spectrometer, fluorescence reader) created (see Fig. 3).

Claims

Ansprüche claims

Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Hämoglobin in einem flüssigen biologischen Medium außerhalb des Körpers, umfassend: A method for the quantitative determination of hemoglobin in a liquid biological medium outside the body, comprising:

d) Bestimmung der emittierten Lumineszenz von dem Hämoglobin interagierenden Lanthanoidkomplex in dem flüssigen biologischen Medium aus Schritt c). d) Determining the emitted luminescence from the hemoglobin-interacting lanthanide complex in the liquid biological medium from step c).

Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei das flüssige biologische Medium aus Schritt a) ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Vollblut, Serum, Plasma, Speichel, Urin, Fruchtwasser, Liquor und Gemische von diesen. The method of claim 1, wherein the liquid biological medium of step a) is selected from the group comprising whole blood, serum, plasma, saliva, urine, amniotic fluid, cerebrospinal fluid and mixtures thereof.

Das Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das flüssige biologische Medium aus Schritt a) eine zu bestimmende Menge an Hämoglobin in einem Bereich von 1 bis 5000 mg/1, bevorzugt in einem Bereich von 5 bis 4000 mg/1 und weiter bevorzugt in einem Bereich von 10 bis 2000 mg/1 umfasst. The method of claim 1 or 2, wherein the liquid biological medium of step a) comprises an amount of hemoglobin to be determined in a range of 1 to 5000 mg / l, preferably in a range of 5 to 4000 mg / l and more preferably in a Range from 10 to 2000 mg / 1.

4. Das Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der 4. The method according to any one of the preceding claims, wherein the

mindestens eine lumineszente Lanthanoidkomplex aus Schritt b) at least one luminescent lanthanide complex from step b)

a) wasserlöslich ist, und/oder a) is water-soluble, and or

b) in einer Menge von 1 ng/1 bis 1000 mg/1, bevorzugt in einem Bereich von 10 ng/1 bis 500 mg/1 und weiter bevorzugt in einem Bereich von 10 ng/1 bis 100 mg/1, basierend auf der Menge des flüssigen biologischen Mediums aus Schritt a), bereitgestellt wird. b) in an amount of 1 ng / 1 to 1000 mg / l, preferably in a range of 10 ng / 1 to 500 mg / l and more preferably in a range of 10 ng / 1 to 100 mg / l, based on the Amount of the liquid biological medium from step a) is provided.

Das Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der mindestens eine lumineszente Lanthanoidkomplex aus Schritt b) mindestens ein Lanthanoid(III)-Ion umfasst. The method of any one of the preceding claims, wherein the at least one luminescent lanthanide complex of step b) comprises at least one lanthanide (III) ion.

Das Verfahren nach Anspruch 5, wobei das mindestens eine Lanthanoid(III)- Ion ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Ytterbium(III)-Ion (Yb³⁺), Terbium(III)-Ion (Tb³⁺), Europium(III)-Ion (Eu³⁺), Erbium(III)-Ion (Er³⁺), Samarium(III)-Ion (Sm³⁺), Dysprosium(III)-Ion (Dy³⁺), Neodymium(III)-Ion (Nd³⁺) und Gemische von diesen, und bevorzugt aus der Gruppe umfassend Terbium(III)-Ion (Tb³⁺), Europium(III)-Ion (Eu³⁺), Samarium(III)-Ion (Sm³⁺), Dysprosium(III)-Ion (Dy³⁺) und Gemische von diesen. The method of claim 5, wherein said at least one lanthanide (III) ion is selected from the group comprising ytterbium (III) ion (Yb ³⁺ ), terbium (III) ion (Tb ³⁺ ), europium (III) Ion (Eu ³⁺ ), erbium (III) ion (Er ³⁺ ), samarium (III) ion (Sm ³⁺ ), dysprosium (III) ion (Dy ³⁺ ), neodymium (III) ion (Nd ³⁺ ) and mixtures of these, and preferably from the group comprising terbium (III) ion (Tb ³⁺ ), europium (III) ion (Eu ³⁺ ), samarium (III) ion (Sm ³⁺ ), Dysprosium (III) ion (Dy ³⁺ ) and mixtures of these.

Das Verfahren nach einem der Ansprüche 5 oder 6, wobei der mindestens eine lumineszente Lanthanoidkomplex aus Schritt b) mindestens einen mit dem Lanthanoid(III)-Ion komplexbildenden Liganden umfasst. The method of any one of claims 5 or 6, wherein the at least one luminescent lanthanide complex of step b) comprises at least one ligand complexing with the lanthanide (III) ion.

Das Verfahren nach Anspruch 7, wobei der mindestens eine komplexbildende Ligand mindestens ein mit dem Lanthanoid(III)-Ion komplexbildendes Element ausgewählt aus der Gruppe umfassend Stickstoff, Sauerstoff, Schwefel, Phosphor und Gemische von diesen umfasst. Das Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die The method of claim 7, wherein said at least one complexing ligand comprises at least one lanthanide (III) ion complexing element selected from the group consisting of nitrogen, oxygen, sulfur, phosphorus and mixtures thereof. The method according to any one of the preceding claims, wherein the

Bestimmung der emittierten Lumineszenz in Schritt d) in einem Determination of the emitted luminescence in step d) in one

Wellenlängenbereich größer 400 nm, bevorzugt in einem Wavelength range greater than 400 nm, preferably in one

Wellenlängenbereich von 400 bis 1000 nm, durchgeführt wird. Wavelength range of 400 to 1000 nm, is performed.

Das Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die The method according to any one of the preceding claims, wherein the

Bestimmung der emittierten Lumineszenz in Schritt d) durch Bestimmung der Lumineszenzabklingzeit und/oder Lumineszenzintensität erfolgt. Determination of the emitted luminescence in step d) takes place by determining the luminescence decay time and / or luminescence intensity.

Das Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Verfahren ferner Schritt e) umfasst, indem die quantitative Bestimmung des The method of any one of the preceding claims, wherein the method further comprises step e), wherein the quantitative determination of the

Hämoglobins in dem flüssigen biologischen Medium aus Schritt a) durch Vergleich der in Schritt d) bestimmten emittierten Lumineszenz mit einer Kalibrierkurve erfolgt. Hemoglobin in the liquid biological medium from step a) by comparing the emitted luminescence determined in step d) with a calibration curve.

Das Verfahren nach Anspruch 11 , wobei die Kalibrierkurve durch The method of claim 11, wherein the calibration curve is through

Bestimmung der emittierten Lumineszenz von definierten Mengen an Hämoglobin in einem flüssigen Kalibriermedium erhalten wird und das flüssige Kalibriermedium dem flüssigen biologischen Medium aus Schritt a) entspricht oder das flüssige Kalibriermedium eine mit Zusätzen versehene Pufferlösung darstellt, die in ihrer Zusammensetzung dem flüssigen biologischen Medium aus Schritt a) im Wesentlichen entspricht. Determining the emitted luminescence of defined amounts of hemoglobin in a liquid calibration medium and the liquid calibration medium corresponds to the liquid biological medium from step a) or the liquid calibration medium is an added buffer solution having in its composition the liquid biological medium from step a ) substantially corresponds.

13. Das Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei Schritt c) und/oder Schritt d) und/oder Schritt e) bei einer Temperatur in einem Bereich von 15 °C bis 50 °C, bevorzugt in einem Bereich von 20 °C bis 40 °C erfolgt. Verwendung mindestens eines lumineszenten Lanthanoidkomplexes gemäß einem der Ansprüche 4 bis 8 zur quantitativen Bestimmung von Hämoglobin in einem flüssigen biologischen Medium gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 außerhalb des Körpers. 13. The method according to any one of the preceding claims, wherein step c) and / or step d) and / or step e) at a temperature in a range of 15 ° C to 50 ° C, preferably in a range of 20 ° C to 40 ° C takes place. Use of at least one luminescent lanthanide complex according to any one of claims 4 to 8 for the quantitative determination of hemoglobin in a liquid biological medium according to any one of claims 1 to 3 outside the body.