WO2014147280A1 - Microorganismo capaz de convertir ácido elágico y elagitaninos en urolitinas y uso del mismo - Google Patents

Microorganismo capaz de convertir ácido elágico y elagitaninos en urolitinas y uso del mismo Download PDF

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WO2014147280A1
WO2014147280A1 PCT/ES2014/070207 ES2014070207W WO2014147280A1 WO 2014147280 A1 WO2014147280 A1 WO 2014147280A1 ES 2014070207 W ES2014070207 W ES 2014070207W WO 2014147280 A1 WO2014147280 A1 WO 2014147280A1
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WO
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urolithin
urolithins
microorganisms
producing
microorganism
Prior art date
Application number
PCT/ES2014/070207
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English (en)
French (fr)
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Francisco TOMÁS BARBERÁN
María Victoria SELMA GARCÍA
David BELTRÁN RIQUELME
Juan Carlos ESPÍN DE GEA
Rocío GARCÍA VILLALBA
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Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic)
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/06—Oxygen as only ring hetero atoms containing a six-membered hetero ring, e.g. fluorescein

Definitions

  • the present invention belongs to the field of biotechnology and refers to a microorganism that belongs to a new bacterial species, which can produce urolithins, to a method for said compounds to be produced and to a method of isolation, detection and quantification of microorganisms producing urolithins based on the use of a DNA fragment capable of specifically isolating, detecting and quantifying the urolithin producing microorganism mentioned.
  • the present invention would allow for the first time to develop food compositions for humans or animals, beverages, dietary supplements, cosmetics or pharmaceutical compositions rich in urolithins, in probiotics containing said microorganism or both.
  • Urolithins are compounds that can be absorbed in the intestine and have biological activity in humans and other mammals (estrogen modulator, anti-inflammatory and anticancer activity, prebiotic effects, cardiovascular prevention, etc.). Urolithins are produced by the gut microbiota from elagitannins and ellagic acid from the diet (Cerdá et al., Agrie. Food Chem., 2005, 53, 5571-5576) that cannot be absorbed unlike urolithins. Among the individuals there is a great variability in urolithin production, being some high, medium, low or null individuals producing these compounds (Cerdá et al., Agrie. Food Chem. 2005, 53, 227-235).
  • urolithins A, B, C, D, M6, M5, M7, isourolithin A
  • urolithins A, B, C, D, M6, M5, M7, isourolithin A
  • biological fluids urine and blood
  • human and animal organs rumen of cows, human prostate, mouse prostate, cardiac tissue .
  • Nawwar et al. (Nawwar et al., 1984, Phytochemistry, 23, 2966-2967) describe some plants (Tamarix and Punic species) that contain urolithins, however their use is limited and the extraction process generates complex extracts with numerous constituents , in which urolithins are a minor component and have a low degree of purity.
  • the present invention is confronted first of all with the problem of ignorance of the microbial groups and bacterial strains of the intestine of humans or other mammals, involved in the transformation of ellagic acid and other phenolic compounds of the diet, into urolithins.
  • the present invention relates to microorganisms capable of producing urolithins.
  • One of which has been isolated from the intestine of healthy humans and is a new bacterial species that belongs to the Gordonibacter genus called Gordonibacter sp. BAITS 1 / 15P.
  • Said microorganism has 97% similarity to the Gordonibacter type strain pamelaeae DSM 19378 T which is the only strain and species described within the Gordonibacter genus (Würdemann et al., 2009. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 59, 1405-1415).
  • the ability of G. pamelaeae DSM 19378 T to produce urolithins had not been described so far, so that the production of urolithins by this other microorganism also constitutes an aspect of the present invention.
  • a specific aspect of the present invention consists of species of the genus Gordonibacter capable of growing in growth media, liquids and solids and in the presence of phenolic compounds in the diet.
  • microorganisms for the development of procedures for the production of urolithins constitutes another aspect of the present invention.
  • These procedures consist of the transformation of elagitannins, ellagic acid and derivatives, which are phenolic compounds present in the diet that cannot be absorbed, in different absorbable urolithins in the intestine (urolithin A, B, C, D, E, M6, M5, M7 and related metabolites) using either the microorganism object of the present invention (Gordonibacter sp. CEBAS 1 / 15P) or G. pamelaeae DSM 19378 T.
  • the process of production of urolithins object of the present invention in comparison with the production of urolithins by organic synthesis, leads to products with a greater chemical diversity (eg pentahydroxy urolithin, tetrahydroxy urolithin and urolithin C) and with less chemical residues per Therefore, with greater safety and safety for the consumer. Furthermore, said procedure, in comparison to the potential extraction of urolithins from certain plants, leads to urolithins with a higher degree of purity and without the rest of the constituents that accompany plant extracts and other traditional medicine preparations, which are very complexes and in which urolithins are minor constituents.
  • the present invention relates to a process for the isolation of urolithin-producing microorganisms.
  • the process object of the present invention allows to elaborate food compositions, beverages, dietary supplements, pharmaceutical compositions, probiotics and / or functional foods enriched in urolithins manufactured in a similar way as it occurs in the intestine of humans (bacterial metabolism of dietary polyphenols using a microorganism isolated from the intestinal contents of healthy individuals).
  • the urolithins thus produced, their use and the food compositions, beverages, dietary supplements, pharmaceutical compositions, probiotics and / or functional foods enriched in urolithins, constitute another aspect of the present invention.
  • urolithins can be carried out directly in the formulation and subsequently inactivate the microorganism. Meanwhile, obtaining urolithins by other procedures, (organic synthesis or extraction from natural products), only allows the addition of urolithins to the food. Therefore, in this case there is no need for urolithin extraction and purification processes or the use of organic solvents that could leave toxic residues in the food.
  • microorganisms object of the invention can also be used as probiotic bacteria in food compositions, beverages, dietary supplements, pharmaceutical compositions, probiotics and / or functional foods which constitutes Another aspect of the present invention.
  • another aspect of the present invention relates to the possibility of preparing food compositions, beverages, dietary supplements, pharmaceutical compositions, probiotics and / or functional foods with the synergistic combination (elagitannins and / or ellagic acid and / or sources thereof, together with the microorganisms capable of producing urolithins) to provide the consumer (animal or human) individual with the precursor (source of elagitannins and / or ellagic) and the ability to produce urolithin metabolites (the microorganisms).
  • synergistic combination elagitannins and / or ellagic acid and / or sources thereof, together with the microorganisms capable of producing urolithins
  • the precursor source of elagitannins and / or ellagic
  • the ability to produce urolithin metabolites the microorganisms.
  • Another aspect of the present invention relates to the preparation of food compositions, beverages, dietary supplements, pharmaceutical compositions, probiotics and / or functional foods containing the synergistic combination of the microorganisms of the present invention and urolithins, well obtained by the process object of the present invention or incorporated into the composition.
  • the present invention provides the first method of isolation, identification and quantification of urolithin producing microorganisms.
  • Said method is based on the use of oligonucleotides and / or polynucleotides and / or nucleic acid fragments, identified by the inventors, in specific isolation, detection and quantification techniques of urolithin producing microorganisms such as those described above and object of the present invention.
  • Such oligonucleotides, polynucleotides and nucleic acid fragments also constitute an aspect of the present invention.
  • the methods of isolation, detection and quantification of urolithin-producing microorganisms based on the use of said oligonucleotides, polynucleotides and nucleic acid fragments constitute another aspect of the present invention.
  • the present invention provides a microbial quantification method that makes it possible to verify the urolithin production capacity that an individual has and thus identify individuals capable of producing urolithins, which constitutes another aspect of the present invention.
  • the present invention also refers to the use of food compositions, beverages, dietary supplements, pharmaceutical compositions, probiotics and / or functional foods containing urolithins, and / or microorganisms capable of producing urolithins, and / or ellagic acid and / or elagitannins and / or sources of these for the production of urolithins in vivo preferably for the treatment, prevention or improvement of a variety of diseases and disorders such as, among others, arteriosclerosis and other cardiovascular diseases, breast cancer, prostate cancer, inflammatory bowel diseases and premenstrual syndrome or others.
  • diseases and disorders such as, among others, arteriosclerosis and other cardiovascular diseases, breast cancer, prostate cancer, inflammatory bowel diseases and premenstrual syndrome or others.
  • the present invention relates to a urolithin production system and to urolithins thus produced by any method that involves the microorganism of the present invention (Gordonibacter sp. CEBAS 1 / 15P) or the microorganism G. pamelaeae DSM 19378 T which is part of the object of the present invention, or any other microorganism of the Gordonibacter genus capable of producing urolithins, identified and isolated by any of the methods object of the present invention.
  • the use of said urolithins in the formulation of pharmaceutical compositions, dietary supplements, food compositions, beverages and / or functional foods or any other use constitute another aspect of the present invention.
  • the food compositions, beverages, dietary supplements, pharmaceutical, probiotic and / or functional food compositions of the present invention can be used for both the feeding and / or treatment of humans and animals. DESCRIPTION OF THE FIGURES
  • FIG. Chromatogram of metabolites produced by Gordonibacter sp. CEBAS 1 / 15P or by G. pamelaeae DSM 19378 T by HPLC-DAD at 305 nm.
  • IS internal standard
  • 1 pentahydroxy-urolithin (pentahydroxy-urolithin or urolithin M5)
  • 2 Ellagic acid (ellagic acid).
  • 3 tetrahydroxy-urolithin (tetrahydroxy urolithin or urolithin M6)
  • FIG. 1 Phylogenetic tree of Gordonibacter sp. CEBAS 1 / 15P built with Neighborhood Joining (Jukes Cantor correction). Bar, 1 substitution for every 100 nucleotide positions. The code in brackets represents the access number in the Genbank.
  • Fig. 3 Different urolithins that can be produced by the microorganisms object of the invention (Gordonibacter sp. CEBAS 1 / 15P or by G. pamelaeae DSM 19378 T ) from ellagic acid and / or elagitannins.
  • FIG 4. Growth kinetics of Gordonibacter sp. CEBAS 1 / 15P, microorganism object of the invention.
  • FIG. Kinetics of urolithin production by Gordonibacter sp. CEBAS 1 / 15P, microorganism object of the invention, in a liquid medium containing ellagic acid and identification by HPLC.
  • the present invention relates to the identification for the first time of microorganisms of human gastrointestinal origin, which can produce urolithins, to production processes of said compounds, to the use of said compounds thus produced in the preparation of food formulations, pharmaceutical, dietary or food supplements and functional foods, as well as the preparation of probiotic compositions by incorporating urolithin-producing microorganisms and a method of isolation, detection and quantification of urolithin-producing microorganisms based on the use of a DNA fragment capable to specifically detect the urolithin producing microorganisms identified by the inventors and which also constitutes an aspect of the present invention.
  • the ability to produce urolithins can be determined by adding ellagic acid to a liquid culture medium with a final concentration of 9 ⁇ . Then, inoculating the target microorganism in the culture medium at a concentration from 70 to 10 7 cells / mL. Finally, incubating under anaerobic atmosphere (10% H 2 ; 10% C0 2 ; 80% N 2 ) at 37 ° C to reproduce bowel conditions.
  • anaerobic atmosphere (10% H 2 ; 10% C0 2 ; 80% N 2 ) at 37 ° C to reproduce bowel conditions.
  • the concentration of urolithins can be determined by routine HPLC techniques.
  • Ultraviolet detectors can be used, in which urolithins show a characteristic spectrum of their hydroxyl substitution model and can also be used to quantify urolithins against standards (González-Barrio et al., 201 1, J. Agrie. Food Chem. 59, 1 152-1 162).
  • microorganisms capable of producing urolithins refer to a new microorganism that we call Gordonibacter sp. CEBAS 1 / 15P, which has a capacity to transform ellagic acid into 100% urolithins when kept at a certain temperature for 162 hours.
  • another microorganism called G. pamelaeae DSM 19378 T that has an ability to transform ellagic acid into urolithins when maintained at a certain temperature and whose capacity to produce urolithins is also part of the present invention.
  • the new microorganism of the present invention (Gordonibacter sp. CEBAS 1 / 15P) that has an ability to produce urolithins can be selected by screening. Specifically, a sample (eg, feces) that possibly contains urolithin-producing microorganisms is seeded in a solid growth medium (eg DRCM Oxoid), incubated in anaerobiosis at 37 ° C and after 72 h, the isolated colonies are sub -cultivate in a liquid growth medium (eg brain heart broth) with ellagic and the transformation of ellagic acid into urolithins is monitored.
  • a solid growth medium eg DRCM Oxoid
  • samples that may contain urolithin-producing microorganisms are feces and contents of the digestive tract (descending colon, blind ...) of a human or animal subject producing urolithins.
  • the stool sample used is preferably homogenized in a diluent using a filter bag and a shovel homogenizer.
  • One of the bacteria that have the ability to produce urolithins and that belongs to the genus Gordonibacter has been obtained by the procedure previously mentioned. According to the Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the purposes of the Patent Procedure, a culture of the bacterium that has the capacity to produce urolithins and that belongs to the genus Gordonibacter and named Gordonibacter sp.
  • CEBAS 1 / 15P has been deposited in the German Type Culture Collection (DSMZ), 38124 Braunschweig, Germany, on October 25, 2012, corresponding to the deposit number DSM 26536.
  • the phylogeny and biochemical properties of Gordonibacter sp. CEBAS 1 / 15P DSM 26536 will be described below.
  • the nucleotide sequence of the gene encoding the 16S rRNA of Gordonibacter sp. CEBAS 1 / 15P with a length of 1477 bp was determined by direct PCR amplification of the 16S rRNA gene, partial sequencing thereof (with readings in both directions). The joint analysis of the sequences and identification of the most phylogenetically related species was performed.
  • this bacterial strain had a homology of the 16S rRNA gene of 97% with respect to another strain known as Gordonibacter pamelaeae strain type DSM 19378 (Access No. 0 : AM886059) belonging to the genus Gordonibacter.
  • the biochemical properties of the microorganism of the present invention were different from that of the nearest species phylogenetically including Gordonibacter pamelaeae DSM 19378 T. Biochemical properties common to the two Gordonibacter species were also observed ⁇ Gordonibacter sp. CEBAS 1 / 15P and Gordonibacter pamelaeae DSM 19378 T ) that make them different from the other 3 closest species phylogenetically (Paraeggerthella hongkongensis HKU10; Eggerthella slow ATCC 25559; Eggerthella sinensis HKU14). Therefore, the Gordonibacter sp. CEBAS 1 / 15P differs from the only known strain and species of the Gordonibacter genus as well as the other three phylogenetically closest species.
  • the food / beverage compositions, dietary supplements, pharmaceutical or probiotic compositions of the present invention that contain a microorganism that has a urolithin production capacity can be employed as a urolithin level enhancer in the organism, blood, intestine (for example, the large intestine), etc., for the purpose of treating, improving, preventing, etc. a variety of diseases and disorders such as arteriosclerosis and other cardiovascular diseases, breast cancer, prostate cancer, inflammatory bowel diseases and premenstrual syndrome.
  • compositions are applied to a human individual who has no urolithin production capacity (non-producer) or a human individual who has a low capacity for urolithin production, A variety of diseases and disorders where urolithins are effective can be prevented in everyday life.
  • the composition is preferably applied to middle-aged or elderly human subjects, who have a higher risk of suffering from the chronic diseases mentioned.
  • the mode of use of the microorganisms of the present invention that have a production capacity of urolithins, and any of the viable cells or thermally denatured cells (dead cells where the urolithin producing enzymes are extracted without alteration of them) can be used.
  • a lyophilized product thereof, a culture product (for example, culture supernatant containing urolithins without containing the microorganism) etc. can be used.
  • the microorganisms since the ability to transform ellagic acid into urolithins is due to one or more enzymes of the microorganism, the microorganisms will preferably be used in a state in which the inactivation of their enzymes is inhibited.
  • the food / beverage compositions, dietary supplements, pharmaceutical or probiotic compositions of the present invention may also contain ellagic acid, together with the microorganism to provide the consuming individual (animal or human) with the precursor (ellagic acid) and the ability to produce urolithin metabolites (the microorganism).
  • ellagic acid a group consisting
  • intermediate metabolites of conversion of ellagic acid to urolithin A can also be used, for example, urolithin M5, urolithin D, etc.
  • This synergistic combination (elagitannins and / or ellagic acid and / or sources thereof, together with the microorganism) provides a more potent urolithin level enhancer.
  • the elagitannins and / or ellagic acid used in the present invention can be either a commercial product or a synthetic product or a natural extract. Alternatively, a natural product containing a large amount of elagitannins or one of its processed products can also be used.
  • elagitannins examples include pomegranate, nuts, strawberries, chestnuts, blackberries, raspberries, etc.
  • the processed product include pomegranate juice and strawberry juice.
  • the dose is predetermined to achieve the desired effect according to different modes of use, for example, the target individual and the target diseases and disorders.
  • the daily dose of microorganism is preferably from 10 5 cells to 10 10 cells, in particular preferably from 10 8 cells to 10 10 cells.
  • the content of polyphenols, punicalagina and ellagic acid of the composition is preferably 500 to 2,000 mg / liter more preferably from 1,500 to 2,000 mg / liter.
  • composition of the present invention can be administered orally or parenterally.
  • oral administration of the composition is preferable.
  • the composition containing as active ingredient a microorganism having a urolithin production capacity is mixed with a solid or liquid non-toxic pharmaceutical carrier, selected depending on the method of administration (for example, oral administration, rectal administration, or by injection), to thereby produce a common pharmaceutical preparation.
  • Examples of the aforementioned pharmaceutical preparation include solid preparations such as tablets, granules, powder, and capsules, liquid preparations such as solutions, suspensions, and emulsions, syrups and lyophilized preparations. These preparations can be produced through a common manufacturing method.
  • Examples of the non-toxic pharmaceutical carrier include starch, dextrin, fatty acid glyceride, polyethylene glycol, hydroxyethyl starch, ethylene glycol, amino acid, water, gelatin, albumin, and physiological saline. If necessary, the appropriate preparation may contain common additives such as a stabilizer, a wetting agent, an emulsifier, a binder, a tonicity agent, and an excipient.
  • the food / beverage compositions, dietary supplements, pharmaceutical or probiotic compositions of the present invention can be used unmodified or in conjunction with a variety of nutritional components.
  • the food / beverage compositions of the present invention can be used as a healthy food or food material for the purpose of raising the level of urolithins in-vivo, or useful for improvement, prevention, etc. of chronic diseases or disorders such as arteriosclerosis, breast cancer, prostate cancer, inflammatory bowel diseases and premenstrual syndrome.
  • These foods and beverages, or their containers, may have a label that indicates such effects.
  • the composition of the present invention when used as a food or beverage, the composition of the present invention must be adequately mixed with an additive that can be added to a food or beverage, and the mixture can be prepared, by conventional means, in a manner suitable for be able to eat or drink, for example, granules, particles, tablet, capsule, or paste.
  • the composition can be added to a variety of foods, for example, processed meat products (for example, ham and sausages), fish products (for example, kamaboko and chikuwa), bread, confectionery, butter, powdered milk and fermented milk, or it can be added to drinks such as water, fruit juice and nectar, jam, milk, soft drinks, tea-based drinks or their combinations
  • the term "food or drink” also covers food for animals.
  • urolithins can be produced in vitro with high efficiency.
  • No particular limitation is imposed on how the microorganism is used to produce urolithins, and any of the viable cells or thermally denatured cells (dead cells) or their enzymes can be used.
  • a lyophilized product thereof, a culture product (for example, culture supernatant), a product of treated cells, etc. can be used.
  • the microorganism is preferably used in a state that inhibits the inactivation of its enzymes. In comparison with organic synthesis, the microorganism of the present invention leads to the production of urolithins with a greater chemical diversity and with less residues potentially dangerous to health, therefore with greater safety and safety for the consumer.
  • ellagic acid is added to a culture medium at a concentration of 9 ⁇ and the microorganism of the present invention that has a urolithin production capacity is inoculated in the medium at different concentrations from 70 to 10 7 cells / mL of medium, followed by anaerobic culture at 37 ° C for 72 hours or more, to thereby produce urolithins.
  • suitable components such as saccharides and nitrogen source, can be added.
  • suitable components such as saccharides and nitrogen source
  • the components that can be added to the medium include peptone, peptone tripticase, yeast extract, hemin, histidine, vitamins, such as vitamins K, L-cysteine, KH 2 P0 4 , K 2 HP0 4 , NaCI, (NH4) 2 S0 4 , CaCI 2 , MgS0 4 , carbohydrates such as fructose and fibers.
  • the culture medium of the present invention may have a composition of, for example, the Wilkins-chalgren medium, basal anaerobic medium, BHI medium, DRCM medium, etc.
  • Ellagic acid, used as a substrate can be a commercial product, a synthetic product or a natural extract obtained from fruits or plants.
  • a natural material containing a large amount of ellagic acid or one of its processed products can also be used.
  • ellagic acid can be used in the form of elagitannins, such as punicalagina, scrimtinin, peduculagina, geraniine or other elagitanin extracts from fruits, leaves or other parts of plants.
  • medium at neutral pH can be used to release ellagic acid from these compounds.
  • enzymes from the microorganism and that have the capacity to produce urolithins can be used.
  • Specific examples of how to include the use of a culture product are, the use of a concentrate or granules of a culture product obtained through a concentration process, such as centrifugation or filtration with membranes, the use of resting cells , the use of dry cells, the use of lysed cells, the use of a crude enzyme extract, the use of purified enzyme solution in suspension or powder.
  • a conventional purification technique can be employed.
  • a microorganism that has the ability to transform to urolithins is cultured, and the cells are separated from the culture product by separation means such as centrifugation, organic membrane separation, or inorganic membrane separation.
  • the culture supernatant contains the enzymes responsible for the production of urolithins
  • the recovered supernatant can be used as a crude enzyme extract.
  • the cells can be chemically or physically broken by means of a homogenizer, by ultrasound or other methods.
  • the cells can be enzymatically treated with a cell wall lysis enzyme, to thereby provide an intracellular extract, which can be used as a crude enzyme extract.
  • This extract can be treated by, for example, saline displacement with ammonium sulfate, dialysis, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, adsorption chromatography and affinity chromatography, in appropriate combination, to thereby provide an enzyme solution.
  • the microorganism that has the capacity to produce urolithins or the enzymes from the microorganism that has a capacity to produce urolithins can be immobilized by a conventional immobilization technique.
  • the immobilization technique include binding carrier, crosslinking, and entrapment.
  • binding carrier include covalent bonding, ionic bonding, and physical adsorption;
  • crosslinking include the glutaraldehyde method, and examples of entrapment include lattice entrapment and microcapsule entrapment.
  • More specific examples include adsorption on activated carbon, sawdust, etc; binding to CM-cellulose, P-cellulose, DEAE cellulose, ECTEOLA-cellulose, etc; crosslinking with glutaraldehyde, tolylene diisocyanate, etc., and entrapment with acrylamide, kappa.- carrageenan, alginic acid, gelatin, cellulose acetate, etc.
  • the bacterium or immobilized enzymes can thus be used in a conventional method (for example, in a column, etc.) and in a discontinuous or continuous process.
  • a culture medium containing ellagic acid and the microorganism of the present invention incubated at the appropriate temperature and atmosphere, centrifugation processes of the culture medium can be used to recover them in the supernatant
  • the culture medium supernatant can be subjected to a plasma extraction or conventional separation / purification process such as column chromatography or organic solvent extraction, thus separating the urolithins from the culture medium.
  • the culture medium thus obtained can be adsorbed on a non-ionic or polymeric column of ion exchange, followed by elution with methanol or other solvents and buffers, in order to obtain a purified urolithin product.
  • the Gordonibacter CEBAS 1 / 15P DSM 26536 nucleotide sequence that the present inventors obtained through the direct PCR amplification of the 16S rRNA gene is used as the target.
  • highly reliable for phylogenetic studies SEQ. ID NO: 1. Since the analysis of the fragments requires PCR media or the like, the DNA was used instead of an RNA.
  • the nucleotide sequence of the Gordonibacter CEBr 16S rDNA gene 1 / 15P DSM 26536 SEQ.
  • the alignment of the 16S rRNA gene is carried out by the Mega4 program using the databases (EMBL) where the sequences of the 16S rRNA gene of the closely related Gordonibacter bacteria, belonging to the family Coriobacteriaceae (Paraeggerthella hongkongensis) are available HKU10 (AY288517); Eggerthella Slow ATCC 25559 (AF292375); Eggerthella sinensis HKU14 (AY321958)) and which are not producing urolithins.
  • EMBL the databases
  • This comparison allows to identify a fragment of the sequence of the 16S rRNA gene that presents greater homology for Gordonibacter CEBAS 1 / 15P DSM 26536 and Gordonibacter pamelaeae DSM 19378 T and greater difference with the rest of bacteria nearby phylogenetically, this fragment has a length of 689 nucleotides (SEQ. ID NO: 2). From this fragment (SEQ ID NO: 2) they are designed using the Primer express program, four primers, two direct and two reverse, identified as SEQ. ID NO: 3, 4, 5 and 6 and a TaqMan probe identified as SEQ. ID NO: 7.
  • the nucleic acid fragment that can hybridize specifically with the DNA and / or RNA of the bacteria of the Gordonibacter genus is not limited to the nucleotide sequences so designed (SEQ. ID NO: 2, 3, 4, 5 , 6 and 7), and those skilled in the art can conceive other equivalents based on common technical knowledge. Examples of such equivalents include a nucleic acid fragment having a nucleotide sequence complementary to the sequences so designed (SEQ. ID NO: 2, 3, 4, 5, 6 and 7), and a nucleic acid fragment having a nucleotide sequence homologous to any of the above sequences and which is functionally equivalent to the above nucleic acid fragment.
  • nucleic acid fragment having a homologous nucleotide sequence and which is functionally equivalent include the following nucleic acid fragments (a) to (c): (a) a nucleic acid fragment having a nucleotide sequence represented by the nucleotide sequence SEQ. ID NO: 2 or 3 or 4 or 5 or 6 or 7 or a complementary nucleotide sequence, where one to several bases, preferably 1 to 10 bases, are deleted, substituted or added;
  • nucleic acid fragment having a nucleotide sequence having an identity of 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 99% or more, to the nucleotide sequence of SEQ. ID NO: 2 or 3 OR 4 OR 5 OR 6 OR 7 OR a complementary sequence of nucleotides; Y
  • the identity of a nucleotide sequence is calculated by means of a homology analysis program, GENETYX (R).
  • the designed nucleic acid fragments can be synthesized artificially, according to their nucleotide sequences, by means of a DNA synthesizer.
  • the specificity of nucleic acid fragments is investigated by using two nucleic acid fragments as primers (SEQ. ID NO: 3 and 5) or (SEQ. ID NO: 4 and 6) or combinations of both and the third as probe (SEQ. ID NO: 7) and confirmed by the use of, as indices, the presence of specific amplicons as any of those identified as (SEQ.
  • the nucleic acid fragment (SEQ. ID NO: 2, 3, 4, 5, 6 and 7) of the present invention has specificity for microorganisms of the Gordonibacter genus that have an ability to produce urolithins
  • the microorganism that has a capacity If urolithins are produced, they can be specifically detected, identified, and quantified by PCR with the DNA or RNA recovered from human or animal feces or the contents of the digestive tract, or by other means such as FISH (fluorescent in situ hybridization) or the like.
  • the urolithin production capacity that an individual possesses can be easily verified, so that the risk of suffering a variety of diseases and disorders that could potentially be related to the Low level of urolithins such as arteriosclerosis, breast cancer, prostate cancer, inflammatory bowel diseases can be determined. Therefore, prevention measures (for example, the administration of the composition of the present invention) could be carried out in individuals with low or no urolithin production capacity. In addition, through, for example, the administration of the composition of the present invention, an individual who already suffers from a disease and who does not have or has a low capacity for urolithin production could be treated or improved.
  • PCR or real-time PCR or Polymerase chain reaction with reverse transcriptase (RT-PCR) analysis can be performed through, for example, the following steps:
  • step (2) a step of detecting an amplified DNA fragment in step (2) (SEQ. ID NO: 8 or 9 or 10 or 1 1).
  • the amplification reaction is carried out using oligonucleotides as primers (SEQ. ID NO: 3 or 4 or 5 or 6) in combination with the DNA extracted from the sample (cDNA in case the template is RNA), it can be obtain a DNA fragment (product of the PCR reaction) (SEQ. ID NO: 8 or 9 or 10 or 1 1) specific for target bacteria belonging to the Gordonibacter genus and producing urolithins.
  • SEQ. ID NO: 8 or 9 or 10 or 1 a DNA fragment specific for target bacteria belonging to the Gordonibacter genus and producing urolithins.
  • electrophoresis of the DNA fragment obtained in this way the target bacteria belonging to the Gordonibacter genus can be specifically detected and identified according to the presence or absence of the corresponding band.
  • the detection of the PCR reaction product can also be performed by labeling the PCR product with a fluorescent intercalating dye, such as SYBR (R) Green I and measuring the fluorescence intensity at each PCR stage. Since the intercalating dye increases the fluorescence intensity through intercalation with a double stranded nucleic acid, the PCR product formed through amplification can be correctly detected. Among intercalating dyes, among others SYBR (R) Green I can be used.
  • CT value predetermined level
  • a TaqMan or Molecular Beacon probe is a probe in which a fluorescent dye and a fluorescence inhibitor are linked to an oligonucleotide that has a homology with an internal sequence of a region that is amplified by PCR.
  • the probe is additionally used in the PCR together with the primers (SEQ. ID NO: 3, or 4, or 5, or 6). Since fluorescence is emitted based on the PCR amplification reaction, through the interaction between the fluorescent dye and the probe-bound inhibitor, the PCR product formed through the amplification can be monitored by measurement of fluorescence intensity at each stage of PCR.
  • the target bacteria contained in the sample which belongs to the Gordonibacter genus, can be quantified, detected or identified by means of a calibration curve between the CT values and the log concentration determined by means of a culture plate count or a similar method.
  • the CT values are represented along the vertical axis, and along the horizontal axis the logarithms of the cell concentrations obtained by counting are represented.
  • each concentration of CT obtained through the PCR corresponds to a concentration of cells of the calibration curve, so that the target bacteria contained in the sample belonging to the Gordonibacter genus can be quantified, detected or identified.
  • Bacteria belonging to the Gordonibacter genus can be quantified by PCR using serial dilutions of the DNA or template RNA (cDNA).
  • cDNA DNA or template RNA
  • real-time PCR is preferably used although other methods such as those mentioned above may be employed.
  • a bacterium contained in the sample belonging to the genus Gordonibacter can be quantified.
  • SEQ nucleic acid fragments. ID NO: 3, 4, 5 and 6 of the present invention are used as primers in the PCR, but can also be used as a probe in combination with a pair of known universal primers, oligonucleotides, etc.
  • nucleic acid fragments of the present invention SEQ ID NO: 2 or 3 or 4 or 5 or 6, or, 7, or 8, or 9, or 10, or 1
  • examples of the use of the nucleic acid fragments of the present invention include, among others, in situ hybridization and dot blot hybridization.
  • in situ hybridization is preferable, since it does not require the extraction step of the nucleic acid contained in a sample.
  • the FISH method can be used, using a nucleic acid fragment labeled with a fluorescent dye.
  • the FISH method can be performed through the following steps: (1) a stage of fixing the sample with formaldehyde or formalin; (2) a stage of application of the sample fixed on a glass slide or membrane filter, (3) a stage of hybridization with a nucleic acid fragment labeled with the fluorescent dye, (4) a washing step of the nucleic acid fragment that remains after hybridization and does not specifically bind, and (5) a stage of visual observation of the results of hybridization under a fluorescence microscope or by means of a counting chamber or similar apparatus to take a picture of it.
  • the target bacteria belonging to the Gordonibacter genus are present in the sample, their DNA is hybridized with the nucleic acid fragment used, and the positive signal is obtained after hybridization.
  • the Gordonibacter genus bacteria can be isolated, specifically detected or identified. Through counting the labeled cells, quantification can be carried out.
  • the method of isolation of urolithin-producing bacteria by use as probe, of any of the nucleic acid fragments of the present invention (SEQ ID NO: 2 or 3 or 4 or 5 or 6, or, 7, or 8, or 9, or 10, or 1 1) also constitutes another of Aspects of the present invention.
  • EXAMPLE 1 Isolation and recovery of a microorganism that has an ability to convert ellagic acid and elagitannins into urolithins
  • feces excreted by healthy urolithin-producing individuals were obtained. These feces were diluted 1/10 weight / volume, in a diluent (1% lab-lemco powder; 1% peptone, 0.5% NaCI, 0.05% L-cysteine hydrochloride and 20% glycerol). It was then homogenized using filter bags and a pallet homogenizer. The suspension residue was removed through the bag filter.
  • a diluent 1% lab-lemco powder; 1% peptone, 0.5% NaCI, 0.05% L-cysteine hydrochloride and 20% glycerol.
  • the resulting suspension was diluted in the same diluent and an aliquot (0.1 mL) of the solution was applied to agar plates containing (1.6% peptone, 0.7% yeast extract, 0.5% NaCI, 0.1% starch, 0.1% Dextrose, 0.1% sodium pyruvate, 1% arginine, 0.05% sodium succinate, 0.05% L-cysteine hydrochloride, 0.04% sodium bicarbonate, 0.5% ferric pyrophosphate, 0.0005% hemin, 0.00005% vitamin K, 0.05% sodium thioglycolate, 0.1% dithiothreitol and 20% agar).
  • the plates were incubated at 37 ° C for 72 hours in an anaerobiosis cabin, thereby forming colonies.
  • the determination of the concentration of urolithins in the liquid cultures resulting from the incubation described in the previous paragraph was performed using an HPLC equipment (Agilent 1200) equipped with two series detectors: UV-Vis detector (wavelengths 280, 305 and 360 nm) and a single quadrupole mass detector (Agilent 6120).
  • a C18 Poroshell 120 column (3 x 100 mm, 2.7 ⁇ particle size) was used that was maintained at a temperature of 25 0 C.
  • phase B) at a flow rate of 0.5 mL / min and an injection volume of 5 ⁇ _ of sample.
  • UV chromatograms were obtained at 360 nm and 305 nm.
  • Urolithins were identified based on their UV-Vis spectrum and molecular mass and when possible by comparison with known standards.
  • Ellagic acid was quantified with its standard at 360 nm, urolithin C with its standard at 305 nm and the rest of urolithins were quantified at 305 nm using urolithin A as the external standard.
  • the chromatographic profile is shown in Figure 1.
  • the concentration of urolithins of each of the cultures was determined by HPLC following the indicated procedure, in order to select a urolithin-producing microorganism that turned out to be a flagellated, cocobacillary, Gram-positive bacterium with high urolithin production capacity and which was named CEBAS 1 / 15P DSM26536.
  • EXAMPLE 2 Identification, genetic analysis and biochemical properties of microorganisms that have the capacity to produce urolithins
  • PCR amplification of 16S ribosomal RNA was performed.
  • a genomic DNA purification of the bacterium isolated in Example 1 (CEBAS 1 / 15P) was used as template DNA, and the primer pair 616V (forward) (SEQ ID. NO: 12) was used as primers. and 699R (reverse) (SEQ ID. NO: 13), as well as the pair of primers P609D (SEQ ID. NO: 14) and P1525R (SEQ ID. NO: 15) described by other authors (Arahal et al., 2008 Int.
  • the sequence obtained corresponded to the almost complete sequence of the 16S rRNA gene, had a length of 1477 nucleotides.
  • a comparative analysis of the sequence obtained against 16S rRNA gene sequences of other bacteria was performed and the nearest species were identified phylogenetically using the Ez-Taxon-e server, which performs BLAST and megaBLAST analyzes. The result is shown by collecting the extent of the overlapping fragment, the percentage of similarity and the name of the microorganism with a higher degree of sequence identity (Table 2).
  • a phylogenetic analysis was performed using the ARB program and the curated SILVA database (LTPs108_SSU.arb). For the analysis, 32 species were used, 3 of which have been used as an outgroup to root the tree. With the data obtained, a phylogenetic tree was developed using the parameters of Neighborhood Joining (Jukes Cantor correction). The tree presented in Figure 2 only shows the type strains of the species most related to the bacteria isolated in Example 1 (CEBAS 1 / 15P). As a result, it was concluded that the bacteria isolated in example 1 (CEBAS 1 / 15P) belongs to the Coriobacteriaceae family ( Figure 2).
  • Example 1 The biochemical properties of the bacteria of Example 1 (Gordonibacter sp. CEBAS 1 / 15P DMS 26536), and the 4 closest species phylogenetically, G. pamelaeae DSM 19378, Paraeggerthella hongkongensis HKU10; Slow Eggerthella ATCC 25559; Eggerthella sinensis HKU14, were analyzed using the Rapid ID 32A, 20A system (SYSMEX bioMerieux Co., Ltd.) and GEN III (Biolog). These systems allow to characterize the growth capacity of microorganisms using different carbon sources in their metabolism, their enzymatic capacities and their ability to grow under certain conditions of pH, NaCl, as well as in the presence of some compounds eg. antibiotics Each bacterium tested was grown on agar plate at 37 ° C for 72 hours under anaerobic conditions. The determination of API 20A, ID32A, and GEN III was carried out following the protocol of the commercial house. Table 3 shows the results.
  • the bacteria isolated in example 1 exhibited certain properties that differentiate it from the nearest species phylogenetically (G. pamelaeae DSM 19378, P. hongkongensis HKU10, E. slow ATCC 25559 and E. sinensis HKU14).
  • G. pamelaeae DSM 19378, P. hongkongensis HKU10, E. slow ATCC 25559 and E. sinensis HKU14 the bacteria isolated in example 1 exhibited certain properties that differentiate it from the nearest species phylogenetically (G. pamelaeae DSM 19378, P. hongkongensis HKU10, E. slow ATCC 25559 and E. sinensis HKU14).
  • Gordonibacter sp. CEBAS 1 / 15P is able to metabolize certain carbon sources such as L-fucose, D-turanosa, D-fructose, D-galacturonic acid, and ⁇ -ketobutyric acid while G. pamelae
  • CEBAS 1 / 15P and G. pamelaeae DSM 19378 were able to metabolize dextrin while Paraeggerthella hongkongensis HKU10; Slow Eggerthella ATCC 25559; Eggerthella sinensis HKU14 no.
  • example 1 is a new species belonging to the genus Gordonibacter, and has been named by the inventors strain Gordonibacter urolithinfaciens CEBAS 1 / 15P DSM 26536.
  • Enterorhabdus caecimuris B7 (DQ789120) 92.2 1342/1455
  • aliquots were taken periodically to determine the type and concentration of urolithins of the culture solution by means of HPLC and thus, to analyze the biotransformation route of ellagic acid in different urolithins.
  • To these aliquots of the culture were added an equivolumen of ethyl acetate (5 mL).
  • EXAMPLE 4 Design of a specific nucleic acid fragment for microbial species producing urolithins.
  • the nucleotide sequences of the 16S rRNA gene of bacteria belonging to the Coriobacteriaceae family were obtained from a public database (EMBL) and the sequences thus obtained from closely related strains (Paraeggerthella hongkongensis HKU10; Eggerthella slow ATCC 25559; Eggerthella sinensis HKU14 ), aligned with the 16S rRNA nucleotide sequences of the two urolithin-producing strains, Gordonibacter sp. CEBAS 1 / 15P (SEQ ID NO: 1) and G. pamelaeae DSM 19378 through the Mega4 program.
  • Quantitative PCR was performed for 40 cycles (each cycle: 95 ° C for 15 s, 60 ° C for 1 min.) PCR amplification was correlated with the number of cells in the range of 10 ⁇ 3 to 10 3 cells demonstrating the utility of quantitative PCR in the identification of bacteria capable of producing urolithins using the oligonucleotides SEQ ID NO: 3 and 5 as primers and as a probe the oligonucleotide SEQ ID NO: 7.
  • EXAMPLE 5 Analysis of human faecal samples.
  • DNA was extracted from stool samples from 10 healthy volunteers. Each DNA sample was subjected to quantitative PCR using the primers defined by SEQ ID NO: 3 and 5 and the TaqMan probe SEQ ID NO: 7. Specifically, stool samples (20 mg) were taken from each volunteer , and immediately after, the total DNA was extracted using the commercial kit QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Madrid, Spain). The concentration and purity of the DNA were measured in a spectrophotometer at 260 nm (Nanodrop Technologies). Total DNAs obtained in this way were properly diluted, and the diluted product was subjected to quantitative PCR according to the method described in Example 4. The Gordonibacter sp. CEBAS 1 / 15P of the sample was calculated using the quantification curve described in example 4. EXAMPLE 6. Production and identification of urolithins.
  • EXAMPLE 7 Production of capsules, tablets or equivalent formulations.
  • EXAMPLE 8 Production of a non-alcoholic beverage.
  • a food composition it is possible to modify the flavoring indicated in Table 6 and substitute pomegranate juice as a source of elagitannins, with another source of these such as strawberries, raspberries, chestnuts, blackberries, nuts, extracts of medicinal plants rich in ellagic acid or elagitannins, or plant material such as oak leaf or acorns.
  • Any food composition containing an effective amount of the bacteria of the present invention can be formulated Gordonibacter sp. CEBAS 1 / 15P or Gordonibacter pamelaeae DSM 19378 together with food and vehicle components that do not inhibit the activity of urolithin-producing enzymes from ellagic acid and / or elagitannins.
  • the preparation of food compositions is also possible by adding an effective amount of the bacteria of the present invention Gordonibacter sp. CEBAS 1 / 15P or Gordonibacter pamelaeae DSM 19378, to a variety of foods, for example, processed meat products (for example, ham and sausages), fish products (for example, kamaboko and chikuwa), bread, confectionery, butter, milk powder and fermented milk.
  • processed meat products for example, ham and sausages
  • fish products for example, kamaboko and chikuwa
  • bread for example, confectionery, butter, milk powder and fermented milk.

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Abstract

La presente invención se refiere a la identificación por primera vez de microorganismos de origen gastrointestinal humano, que pueden producir urolitinas, a procedimientos de producción de dichos compuestos, al uso de dichos compuestos así producidos en la elaboración de formulaciones alimenticias, farmacéuticas, complementos dietéticos o alimentarios y alimentos funcionales, así como la elaboración de composiciones probióticas mediante la incorporación de microorganismos productores de urolitinas y a un método de aislamiento, de detección y de cuantificación de microorganismos productores de urolitinas basado en el uso de un fragmento de ADN capaz de detectar específicamente los microorganismos productores de urolitinas.

Description

MICROORGANISMO CAPAZ DE CONVERTIR ÁCIDO ELÁGICO Y
ELAGITANINOS EN U ROL IT I ÑAS Y USO DEL MISMO SECTOR DE LA TÉCNICA
La presente invención pertenece al campo de la biotecnología y se refiere a un microorganismo que pertenece a una nueva especie bacteriana, que puede producir urolitinas, a un procedimiento para que se produzcan dichos compuestos y a un método de aislamiento, detección y cuantificación de microorganismos productores de urolitinas basado en el uso de un fragmento de ADN capaz de aislar, detectar y cuantificar específicamente el microorganismo productor de urolitinas mencionado. La presente invención permitiría por primera vez desarrollar composiciones alimenticias para humanos o animales, bebidas, complementos dietéticos, cosméticos o composiciones farmacéuticas ricas en urolitinas, en probióticos que contengan dicho microorganismo o en ambos. ESTADO DE LA TÉCNICA
Las urolitinas son compuestos que pueden absorberse en el intestino y que poseen actividad biológica en humanos y otros mamíferos (modulador estrogénico, actividad anti-inflamatoria y anticancerígena, efectos prebióticos, prevención cardiovascular, etc.). Las urolitinas se producen por la microbiota del intestino a partir de elagitaninos y ácido elágico de la dieta (Cerdá y col., Agrie. Food Chem., 2005, 53, 5571 -5576) que no pueden absorberse a diferencia de las urolitinas. Entre los individuos existe una gran variabilidad en producción de urolitinas siendo algunos individuos altos, medios, bajos o nulos productores de estos compuestos (Cerdá y col., Agrie. Food Chem. 2005, 53, 227-235). Se han descrito diversas urolitinas (A, B, C, D, M6, M5, M7, isourolithina A) las cuales difieren entre sí por el número de grupos hidroxilos y posición de los mismos. Varias urolitinas (A, B, C y conjugados de las mismas con ácido glucurónico y sulfato) se han identificado en fluidos biológicos (orina y sangre) y en órganos humanos y animales (rumen de vacas, próstata humano, próstata de ratones, tejido cardiaco...) (Cerdá y col, Eur. J. Nutrition., 2003, 42, 18-28; González-Sarrias y col., Mol. Nut. Food Res., 2010, 54, 31 1 - 322; J. Agrie. Food Chem., 2009, 57, 5623-5632; J. Agrie. Food Chem., 2012. 60, 3068-3077.). Esto pone de manifiesto que las urolitinas son absorbidas en el intestino pasando al torrente sanguíneo y a los diversos órganos ejerciendo un efecto biológico. En consecuencia, tanto la identificación y aislamiento de microorganismos capaces de producir urolitinas y su uso como probióticos, como los procedimientos capaces de producir estos compuestos son de gran interés, por lo que ha habido diferentes tecnologías orientadas a abordar estas cuestiones.
Así Pottie y colaboradores (Synlett., 201 1 , 15, 2245-2247 DOI: 10.1055/S-0030- 1261203) describen la producción de urolitina M7 mediante síntesis orgánica a partir de 2-hydroxy-4-metoxybenzaldehido en 8 pasos y con un 48% de rendimiento global. El paso clave es la utilización de una reacción retro Diels- Alder. Sin embargo, esta reacción presenta limitaciones debido a su baja eficiencia, conduce a productos con muy poca diversidad química (únicamente urolitina M7 de entre las urolitinas A, B, C, D, E, M6, M5, M7...) y genera muchos residuos químicos por tanto, su consumo puede presentar problemas de seguridad.
Nawwar y colaboradores (Nawwar y col., 1984, Phytochemistry, 23, 2966-2967) describen algunas plantas (especies de Tamarix y Púnica) que contienen urolitinas, sin embargo su uso es limitado y el proceso de extracción genera extractos complejos con numerosos constituyentes, en los que las urolitinas son un componente minoritario y presentan bajo grado de pureza.
Existen algunos productos de la medicina tradicional que también contienen urolitinas como el Shilajit y Pteropi faeces (Jeong y col., 2000, Planta Med. 66, 76-7). En este caso nos encontramos de nuevo con extractos complejos con numerosos constituyentes en los que las urolitinas son un componente minoritario y con bajo grado de pureza.
Por otro lado, no se ha identificado ningún microorganismo, ni de origen gastrointestinal humano, ni de cualquier otro origen, capaz de producir urolitinas como resultado del metabolismo de elagitaninos, ácido elágico u otros productos naturales o sintéticos. Por tanto, no existen precedentes sobre el empleo de microorganismos para la producción de urolitinas en el cuerpo humano o para la producción de urolitinas a nivel industrial. El uso como probiótico de microorganismos con estas propiedades podría mejorar la producción de urolitinas a nivel intestinal, en animales o humanos, siendo particularmente relevante en aquellos individuos que no son productores de urolitinas o lo son en muy baja proporción, debido a las características de su microbiota. Tampoco se conoce ningún método capaz de aislar y detectar ni de cuantificar microorganismos productores de urolitinas en muestras de heces ni en ningún otro tipo de muestra biológica. Por lo tanto, el aislamiento y caracterización de microorganismos productores de urolitinas, el desarrollo de un procedimiento de producción de urolitinas de forma eficiente y viable económicamente, con suficiente diversidad química y grado de pureza, así como el diseño de métodos de detección de microorganismos productores de urolitinas son de gran interés, todos estos aspectos constituyen el objeto de la presente invención y su novedad radica en que por primera vez se ha aislado y caracterizado un microorganismo capaz de producir urolitinas como resultado del metabolismo de elagitaninos, ácido elágico u otros productos naturales o sintéticos, se ha puesto a punto un procedimiento de producción de urolitinas y se ha diseñado un procedimiento de aislamiento, detección y cuantificación de microorganismos capaces de producir urolitinas.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se enfrenta en primer lugar con el problema del desconocimiento de los grupos microbianos y cepas bacterianas del intestino de humanos u otros mamíferos, implicados en la transformación del ácido elágico y otros compuestos fenólicos de la dieta, en urolitinas.
En un primer aspecto, la presente invención se refiere a microorganismos con capacidad de producir urolitinas. Uno de los cuales ha sido aislado del intestino de humanos sanos y es una nueva especie bacteriana que pertenece al género Gordonibacter denominado Gordonibacter sp. CEBAS 1/15P. Dicho microorganismo tiene un 97% de similitud con la cepa tipo de Gordonibacter pamelaeae DSM 19378T que es la única cepa y especie descrita dentro del género Gordonibacter (Würdemann y col., 2009. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 59, 1405-1415). No obstante, hasta el momento no se había descrito la capacidad de G. pamelaeae DSM 19378T de producir urolitinas, por lo que la producción de urolitinas por este otro microorganismo también constituye un aspecto de la presente invención.
Por lo tanto, un aspecto concreto de la presente invención lo constituyen especies del género Gordonibacter capaces de crecer en medios de crecimiento, líquidos y sólidos y en presencia de compuestos fenólicos de la dieta.
La utilización de dichos microorganismos para el desarrollo de procedimientos para la producción de urolitinas constituye otro aspecto de la presente invención. Dichos procedimientos consisten en la transformación de elagitaninos, acido elágico y derivados, que son compuestos fenólicos presentes en la dieta que no pueden absorberse, en diferentes urolitinas absorbibles en el intestino (urolitina A, B, C, D, E, M6, M5, M7 y metabolitos relacionados) utilizando o bien el microorganismo objeto de la presente invención (Gordonibacter sp. CEBAS 1/15P) o bien G. pamelaeae DSM 19378T. El procedimiento de producción de urolitinas objeto de la presente invención, en comparación con la producción de urolitinas mediante síntesis orgánica, conduce a productos con una mayor diversidad química (ejemplo pentahidroxi- urolitina, tetrahidroxi-urolitina y urolitina C) y con menos residuos químicos por tanto, con mayor seguridad e inocuidad para el consumidor. Además, dicho procedimiento, en comparación con la potencial extracción de urolitinas a partir de ciertas plantas, conduce a urolitinas con mayor grado de pureza y sin el resto de constituyentes que acompañan a los extractos de plantas y otros preparados de medicina tradicional, que son muy complejos y en los que las urolitinas son constituyentes minoritarios. En otro aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento para el aislamiento de microorganismos productores de urolitinas. El procedimiento objeto de la presente invención, permite elaborar composiciones alimenticias, bebidas, complementos dietéticos, composiciones farmacéuticas, probióticas y/o alimentos funcionales enriquecidos en urolitinas fabricadas de forma similar a como ocurre en el intestino de humanos (metabolismo bacteriano de polifenoles de la dieta utilizando un microorganismo aislado del contenido intestinal de individuos sanos). Las urolitinas así producidas, su uso y las composiciones alimenticias, bebidas, complementos dietéticos, composiciones farmacéuticas, probióticas y/o alimentos funcionales enriquecidos en urolitinas, constituyen otro aspecto de la presente invención.
La producción de urolitinas puede realizarse directamente en la formulación y posteriormente inactivar el microorganismo. Mientras que, la obtención de urolitinas mediante otros procedimientos, (síntesis orgánica o extracción desde productos naturales), solo permite la adición de urolitinas al alimento. Por tanto, en este caso no son necesarios procesos de extracción y purificación de urolitinas ni el uso de disolventes orgánicos que podrían dejar residuos tóxicos en el alimento.
Los microorganismos objeto de la invención (Gordonibacter sp. CEBAS 1/15P o bien G. pamelaeae DSM 19378T) también pueden usarse como bacterias probiótica en composiciones alimenticias, bebidas, complementos dietéticos, composiciones farmacéuticas, probióticas y/o alimentos funcionales lo que constituye otro aspecto de la presente invención.
Asimismo, otro aspecto de la presente invención se refiere a la posibilidad de elaborar composiciones alimenticias, bebidas, complementos dietéticos, composiciones farmacéuticas, probióticas y/o alimentos funcionales con la combinación sinérgica (elagitaninos y/o ácido elágico y/o fuentes de estos, junto con el/los microorganismos capaces de producir urolitinas) para proveer al individuo consumidor (animal o humano) del precursor (fuente de elagitaninos y/o elágico) y de la capacidad para producir los metabolitos urolitinas (el/los microorganismos). Otro aspecto de la presente invención se refiere a la elaboración de composiciones alimenticias, bebidas, complementos dietéticos, composiciones farmacéuticas, probióticas y/o alimentos funcionales que contengan la combinación sinérgica de los microorganismos de la presente invención y las urolitinas, bien obtenidas por el procedimiento objeto de la presente invención o bien incorporadas a la composición.
En otro aspecto la presente invención proporciona el primer método de aislamiento, identificación y cuantificación de microorganismos productores de urolitinas. Dicho método está basado en la utilización de oligonucleótidos y/o polinucleótidos y/o fragmentos de ácido nucléico, identificados por los inventores, en técnicas de aislamiento, detección y cuantificación específica de microorganismos productores de urolitinas tal como los descritos anteriormente y objeto de la presente invención. Dichos oligonucleótidos, polinucleótidos y fragmento de ácidos nucleicos también constituyen un aspecto de la presente invención. Asimismo, los métodos de aislamiento, detección y cuantificación de microorganismos productores de urolitinas basados en el uso de dichos oligonucleótidos, polinucleótidos y fragmento de ácidos nucléicos constituyen otro aspecto de la presente invención.
De esta manera, la presente invención proporciona un método de cuantificación microbiana que hace posible comprobar la capacidad de producción de urolitinas que tiene un individuo y por tanto identificar individuos con capacidad de producir urolitinas, lo que constituye otro aspecto de la presente invención.
Esto puede ayudar a predecir el riesgo de sufrir una variedad de enfermedades y trastornos que pueden estar relacionadas potencialmente con el bajo nivel de urolitinas. Además, puede servir para determinar si existe una relación entre una enfermedad que posea el individuo y su nivel de microorganismos productores de urolitinas.
La presente invención también hace referencia a la utilización de las composiciones alimenticias, bebidas, complementos dietéticos, composiciones farmacéuticas, probióticas y/o alimentos funcionales que contienen urolitinas, y/o microorganismos capaces de producir urolitinas, y/o ácido elágico y/o elagitaninos y/o fuentes de estos para la producción de urolitinas in vivo preferentemente para el tratamiento, prevención o mejora de una variedad de enfermedades y trastornos tales como, entre otros, la arteriosclerosis y otras enfermedades cardiovasculares, cáncer de mama, cáncer de próstata, enfermedades inflamatorias intestinales y síndrome premenstrual u otros. En otro aspecto, la presente invención se refiere a un sistema de producción de urolitinas y a las urolitinas así producidas por cualquier procedimiento que implique al microorganismo de la presente invención (Gordonibacter sp. CEBAS 1/15P) o al microorganismo G. pamelaeae DSM 19378T que forma parte del objeto de la presente invención, o cualquier otro microorganismo del género Gordonibacter capaz de producir urolitinas, identificado y aislado por cualquiera de los procedimientos objeto de la presente invención. Asimismo el uso de dichas urolitinas en la formulación de composiciones farmacéuticas, complementos dietéticos, composiciones alimenticias, bebidas y/o alimentos funcionales o cualquier otro uso, constituyen otro aspecto de la presente invención.
Las composiciones alimenticias, bebidas, complementos dietéticos, composiciones farmacéuticas, probióticas y/o alimentos funcionales de la presente invención se puede utilizar tanto para la alimentación y/o el tratamiento de humanos como de animales. DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
FIG 1. Cromatograma de los metabolitos producidos por Gordonibacter sp. CEBAS 1/15P o por G. pamelaeae DSM 19378T mediante HPLC-DAD a 305 nm. IS (estándar interno), 1 : pentahydroxy-urolithin (pentahidroxi-urolitina o urolitina M5), 2: Ellagic acid (ácido elágico). 3: tetrahydroxy-urolithin (tetrahidroxi urolitina o urolitina M6), 4: urolithin C (urolitina C).
FIG 2. Árbol filogenético de Gordonibacter sp. CEBAS 1/15P construido con Neighbour Joining (corrección Jukes Cantor). Barra, 1 sustitución por cada 100 posiciones nucleotídicas. El código entre paréntesis representa el número de acceso en el Genbank. Fig. 3: Distintas urolitinas que pueden producir los microorganismos objeto de la invención (Gordonibacter sp. CEBAS 1/15P o por G. pamelaeae DSM 19378T) a partir de acido elágico y/o elagitaninos.
FIG 4. Cinética de crecimiento de Gordonibacter sp. CEBAS 1/15P, microorganismo objeto de la invención.
FIG 5. Cinética de producción de urolitinas por Gordonibacter sp. CEBAS 1/15P, microorganismo objeto de la invención, en un medio líquido que contenga ácido elágico e identificación por HPLC.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a la identificación por primera vez de microorganismos de origen gastrointestinal humano, que pueden producir urolitinas, a procedimientos de producción de dichos compuestos, al uso de dichos compuestos así producidos en la elaboración de formulaciones alimenticias, farmacéuticas, complementos dietéticos o alimentarios y alimentos funcionales, así como a la elaboración de composiciones probióticas mediante la incorporación de microorganismos productores de urolitinas y a un método de aislamiento, detección y cuantificación de microorganismos productores de urolitinas basado en el uso de un fragmento de ADN capaz de detectar específicamente los microorganismos productores de urolitinas identificados por los inventores y que también constituye un aspecto de la presente invención.
En la presente invención, la capacidad de producir urolitinas se puede determinar mediante la adición de ácido elágico a un medio de cultivo líquido con una concentración final de 9 μΜ. A continuación, inoculando en el medio de cultivo el microorganismo diana a una concentración desde 70 a 107 células/mL. Por último, incubando en atmósfera de anaerobiosis (10% H2; 10% C02; 80% N2) a 37 °C para reproducir la condiciones del intestino. Comparando la concentración de urolitinas con la concentración inicial de ácido elágico podemos calcular la capacidad de producir urolitinas de cada microorganismo. Capacidad de producir urolitinas (%)= 100 x (concentración de urolitinas en el cultivo)/(concentración inicial de elágico en el cultivo)
La concentración de urolitinas se puede determinar mediante técnicas rutinarias de HPLC. Se pueden emplear detectores de ultravioleta, en los que las urolitinas muestran un espectro característico de su modelo de sustitución de hidroxilos y puede además utilizarse para cuantificar las urolitinas frente a patrones (González-Barrio y col., 201 1 , J. Agrie. Food Chem. 59, 1 152-1 162).
En la presente invención, los microorganismos con capacidad de producir urolitinas se refieren a un nuevo microorganismo que denominamos Gordonibacter sp. CEBAS 1/15P, que tiene una capacidad de transformar ácido elágico en urolitinas de 100 % cuando se mantiene a una determinada temperatura durante 162 horas. Alternativamente, otro microorganismo denominado G. pamelaeae DSM 19378T que tiene una capacidad de transformar ácido elágico en urolitinas cuando se mantiene a una determinada temperatura y cuya capacidad de producir urolitinas también forma parte de la presente invención.
En un procedimiento más específico, el nuevo microorganismo de la presente invención (Gordonibacter sp. CEBAS 1/15P) que tiene una capacidad de producir urolitinas puede seleccionarse mediante un cribado. Específicamente, una muestra (por ejemplo, heces) que posiblemente contiene microorganismos productores de urolitinas se siembra en un medio de crecimiento sólido (ej. DRCM Oxoid), se incuba en anaerobiosis a 37 °C y tras 72 h, las colonias aisladas se sub-cultivan en un medio de crecimiento líquido (ej. caldo cerebro corazón) con elágico y se monitoriza la transformación de acido elágico en urolitinas. Ejemplos de muestras que pueden contener microorganismos productores de urolitinas son heces y contenidos del tracto digestivo (colon descendente, ciego...) de un sujeto humano o animal productor de urolitinas. La muestra de heces empleada es preferiblemente homogeneizada en un diluyente usando una bolsa con filtro y un homogeneizador de palas. Una de las bacterias que tienen la capacidad de producir urolitinas y que pertenece al género Gordonibacter se ha obtenido mediante el procedimiento mencionado anteriormente. De acuerdo con el Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los fines del Procedimiento en materia de Patentes, un cultivo de la bacteria que tiene la capacidad de producir urolitinas y que pertenece al género Gordonibacter y denominada Gordonibacter sp. CEBAS 1/15P se ha depositado en la Colección Alemana de Cultivos Tipo (DSMZ), 38124 Braunschweig, Alemania, el 25 de Octubre de 2012, correspondiéndole el número de depósito DSM 26536. La filogenia y las propiedades bioquímicas de Gordonibacter sp. CEBAS 1/15P DSM 26536 se describirá a continuación. La secuencia de nucleótidos del gen que codifica el ARNr 16S de Gordonibacter sp. CEBAS 1/15P con una longitud de 1477 pb (SEQ ID. NO: 1 ), se determinó mediante amplificación directa por PCR del gen ARNr 16S, secuenciación parcial del mismo (con lecturas en las dos direcciones). Se realizó el análisis conjunto de las secuencias e identificación de las especies más relacionadas filogenéticamente. Como resultado, se encontró que esta cepa bacteriana tenía una homología del gen ARNr 16S de 97 % con respecto a otra cepa conocida como Gordonibacter pamelaeae cepa tipo DSM 19378 (N 0 de acceso: AM886059) que pertenece al género Gordonibacter.
Las propiedades bioquímicas del microorganismo de la presente invención resultaron diferentes al de las especies más cercanas filogenéticamente incluyendo Gordonibacter pamelaeae DSM 19378T. También se observaron propiedades bioquímicas comunes a las dos especies de Gordonibacter {Gordonibacter sp. CEBAS 1/15P y Gordonibacter pamelaeae DSM 19378T) que las hacen distintas de las otras 3 especies más cercanas filogenéticamente (Paraeggerthella hongkongensis HKU10; Eggerthella lenta ATCC 25559; Eggerthella sinensis HKU14). Por tanto, la cepa Gordonibacter sp. CEBAS 1/15P difiere de la única cepa y especie conocida del genero Gordonibacter así como de las otras tres especies más cercanas filogenéticamente.
Las composiciones alimenticias/ bebidas, complementos dietéticos, composiciones farmaceúticas o probióticas de la presente invención que contienen un microorganismo que tiene una capacidad de producción de urolitinas se pueden emplear como un potenciador del nivel de urolitinas en el organismo, la sangre, el intestino (por ejemplo, el intestino grueso), etc, con el propósito de tratar, mejorar, prevenir, etc. una variedad de enfermedades y trastornos tales como arteriosclerosis y otras enfermedades cardiovasculares, cáncer de mama, cáncer de próstata, enfermedades inflamatorias intestinales y síndrome premenstrual. En particular, si las composiciones alimenticias/bebidas, complementos dietéticos, composiciones farmaceúticas o probióticas se aplican a un individuo humano que no tiene ninguna capacidad de producción de urolitinas (no productor) o un individuo humano que tiene una baja capacidad de producción de urolitinas, una variedad de enfermedades y trastornos donde las urolitinas son eficaces pueden prevenirse en la vida cotidiana. Además, la composición se aplica preferentemente a los sujetos humanos de mediana edad o ancianos, que tienen un mayor riesgo de sufrir las enfermedades crónicas mencionadas.
No se impone una limitación particular sobre el modo de uso de los microorganismos de la presente invención que tienen una capacidad de producción de urolitinas, y cualquiera de las células viables o células térmicamente desnaturalizadas (células muertas donde se extraen las enzimas productoras de urolitinas sin alteración de las mismas) pueden utilizarse. Además, se puede usar un producto liofilizado del mismo, un producto de cultivo (por ejemplo, sobrenadante de cultivo que contenga urolitinas sin contener el microorganismo) etc. En particular, dado que la capacidad de transformación de acido elágico en urolitinas se debe a una o varias enzimas del microorganismo, los microorganismos se emplearan preferiblemente en un estado en el que se inhiba la inactivación de sus enzimas. Las composiciones alimenticias/bebidas, complementos dietéticos, composiciones farmacéuticas o probióticas de la presente invención pueden contener además ácido elágico, junto con el microorganismo para proveer al individuo consumidor (animal o humano) del precursor (ácido elágico) y de la capacidad para producir los metabolitos urolitinas (el microorganismo). Teniendo en cuenta que a partir de ciertos elagitaninos de la dieta se libera ácido elágico en el tracto gastrointestinal, se pueden emplear en lugar de ácido elágico, compuestos tales como la punicalagina de la granada, los elagitaninos de las nueces, las fresas, las frambuesas, plantas medicinales, así como tejidos vegetales ricos en elagitaninos (hoja de roble, bellotas etc). Alternativamente, también se pueden usar metabolitos intermedios de conversión del ácido elágico a urolitina A, por ejemplo, urolitina M5, urolitina D, etc. Esta combinación sinérgica (elagitaninos y/o ácido elágico y/o fuentes de estos, junto con el microorganismo) proporciona un mejorador más potente del nivel de urolitinas. Los elagitaninos y/o ácido elágico utilizado en la presente invención puede ser tanto un producto comercial como un producto sintético o un extracto natural. Alternativamente, también se puede usar un producto natural que contenga una gran cantidad de elagitaninos o uno de sus productos procesados. Los ejemplos específicos de los productos que contienen una gran cantidad de elagitaninos incluyen la granada, nueces, fresas, castañas, moras, frambuesas, etc. Ejemplos del producto procesado incluyen el zumo de granada y el zumo de fresa. No se impone una limitación estricta de la dosis de urolitinas en las composiciones alimenticias/ bebidas, complementos dietéticos, composiciones farmacéuticas o probióticas de la presente invención que contengan un microorganismo que tiene una capacidad de producir urolitinas. Preferiblemente, la dosis está predeterminada para alcanzar el efecto deseado de acuerdo con diferentes modos de uso, por ejemplo, el individuo objetivo y las enfermedades diana y trastornos. La dosis diaria de microorganismo (como reducido a células viables) es preferiblemente de 105 células a 1010 células, en particular preferiblemente de 108 células a 1010 células. El contenido de polifenoles, punicalagina y ácido elágico de la composición es preferentemente de 500 a 2.000 mg/litro más preferiblemente desde 1 .500 hasta 2.000 mg/litro.
La composición de la presente invención se puede administrar por vía oral o parenteral. Sin embargo, la administración oral de la composición es la preferible. En un ejemplo de administración, la composición que contiene como ingrediente activo un microorganismo que tiene una capacidad de producción de urolitinas se mezcla con un portador farmacéutico no tóxico sólido o líquido, seleccionado dependiendo del método de administración (por ejemplo, administración oral, administración rectal, o por inyección), para producir con ello una preparación farmacéutica común.
Ejemplos de la preparación farmacéutica antes mencionada incluyen preparaciones sólidas tales como tabletas, gránulos, polvo, y cápsulas, preparaciones líquidas tales como soluciones, suspensiones, y emulsiones, jarabes y preparaciones liofilizadas. Estas preparaciones pueden producirse a través de un método de fabricación común. Ejemplos del vehículo farmacéutico no tóxico incluyen almidón, dextrina, glicérido de ácido graso, polietilenglicol, almidón de hidroxietilo, etilenglicol, aminoácido, agua, gelatina, albúmina, y solución salina fisiológica. Si es necesario, la preparación apropiada puede contener aditivos comunes tales como un estabilizador, un agente humectante, un emulsionante, un aglutinante, un agente de tonicidad, y un excipiente.
Las composiciones alimenticias/bebidas, complementos dietéticos, composiciones farmacéuticas o probióticas de la presente invención se pueden usar sin modificar o junto con una variedad de componentes nutricionales. Las composiciones alimenticias/bebidas de la presente invención pueden utilizarse como un alimento saludable o material alimenticio con el propósito de elevar el nivel de urolitinas in-vivo, o útiles para la mejora, prevención, etc. de enfermedades o trastornos crónicos como arteriosclerosis, cáncer de mama, cáncer de próstata, enfermedades inflamatorias intestinales y síndrome premenstrual. Estos alimentos y bebidas, o sus contenedores, pueden tener una etiqueta que indique tales efectos. Específicamente, cuando se emplea como un alimento o bebida, la composición de la presente invención debe estar adecuadamente mezclada con un aditivo que puede añadirse a un alimento o bebida, y la mezcla se puede preparar, a través de medios convencionales, de forma adecuada para poder comerse o beberse, por ejemplo, gránulos, partículas, comprimido, cápsula, o pasta. La composición se puede añadir a una variedad de alimentos, por ejemplo, productos cárnicos procesados (por ejemplo, jamón y salchichas), los productos de pescado (por ejemplo, kamaboko y chikuwa), pan, productos de confitería, mantequilla, leche en polvo y leche fermentada, o se puede añadir a bebidas tales como agua, zumo y néctar de frutas, mermelada, leche, refrescos, bebidas a base de té o sus combinaciones. Tal como se utiliza aquí, el término "alimento o bebida" abarca alimentos también para animales.
Teniendo en cuenta que el microorganismo de la presente invención tiene una capacidad de actuar sobre ácido elágico convirtiéndolo en urolitinas, las urolitinas se pueden producir in-vitro con alta eficiencia. No se impone limitación particular sobre el modo en que se usa el microorganismo para producir urolitinas, y se pueden utilizar cualquiera de las células viables o células térmicamente desnaturalizados (células muertas) o sus enzimas. Además se puede utilizar, un producto liofilizado del mismo, un producto de cultivo (por ejemplo, sobrenadante de cultivo), un producto de células tratadas, etc. En particular, dado que la capacidad de transformación en urolitinas se debe a las enzimas microbianas, el microorganismo se emplea preferiblemente en un estado que se inhiba la inactivación de sus enzimas. En comparación con la síntesis orgánica, el microorganismo de la presente invención conduce a la producción de urolitinas con una mayor diversidad química y con menos residuos potencialmente peligrosos para la salud, por tanto con mayor seguridad e inocuidad para el consumidor.
En un procedimiento de producción concreto, el ácido elágico se añade a un medio de cultivo a una concentración de 9 μΜ y el microorganismo de la presente invención que tiene una capacidad de producción de urolitinas se inocula en el medio a distintas concentraciones desde 70 a 107 células/mL de medio, seguido de cultivo anaerobio a 37 °C durante 72 horas o más, para producir con ello urolitinas. Para el medio de cultivo, se pueden añadir componentes adecuados, como sacáridos y fuente de nitrógeno. Sin embargo, no se recomienda el uso de un componente que inhiba la capacidad de producción de urolitinas o la proliferación del microorganismo de la presente invención que tiene una capacidad de producir urolitinas. Ejemplos de los componentes que pueden añadirse al medio incluyen peptona, peptona tripticasa, extracto de levadura, hemina, histidina, vitaminas, como la vitaminas K, L-cisteína, KH2P04, K2HP04, NaCI, (NH4)2S04, CaCI2, MgS04, glúcidos como la fructosa y fibras. Excepto ácido elágico y arginina, el medio de cultivo de la presente invención puede tener una composición de, por ejemplo, el medio Wilkins-chalgren, medio basal para anaerobios, el medio BHI, el medio DRCM, etc.
El ácido elágico, utilizado como substrato, puede ser un producto comercial, un producto sintético o un extracto natural obtenido de frutas o plantas. Alternativamente, también se puede usar un material natural que contenga una gran cantidad de ácido elágico o uno de sus productos procesados. También alternativamente, se puede emplear ácido elágico en forma de elagitaninos, tales como punicalagina, estrictinina, peduculagina, geraniina u otros extractos de elagitaninos procedentes de frutas, hojas u otras partes de las plantas. En este caso, se pueden utilizar medio a pH neutro para liberar el acido elágico de estos compuestos.
En lugar de realizar el cultivo con el microorganismo de la presente invención que tiene una capacidad de producir urolitinas, se pueden utilizar las enzimas procedentes del microorganismo y que tienen capacidad de producir urolitinas. No se impone limitación particular sobre el modo de uso del preparado enzimático. Ejemplos específicos del modo de incluir el uso de un producto de cultivo son, el uso de un concentrado o gránulos de un producto de cultivo obtenido a través de un proceso de concentración, tal como centrifugación o filtración con membranas, el uso de células en reposo, el uso de células secas, el uso de células lisadas, el uso de un extracto bruto de enzimas, el uso de solución de la enzima purificada en suspensión o en polvo.
No se impone limitación particular sobre las condiciones de purificación y el grado de purificación de las enzimas, y se puede emplear una técnica de purificación convencional. En un procedimiento de purificación enzimático, se cultiva un microorganismo que tiene capacidad de transformación a urolitinas, y las células se separan del producto de cultivo por medios de separación tales como centrifugación, separación por membrana orgánica, o separación por membrana inorgánica. Cuando el sobrenadante de cultivo contiene las enzimas responsables de la producción de urolitinas, el sobrenadante recuperado se puede emplear como un extracto bruto de enzimas. En el caso de que las células contengan las enzimas responsables, las células se pueden romper químicamente o físicamente por medio de un homogeneizador, por ultrasonidos u otros métodos. Alternativamente, las células se pueden tratar enzimáticamente con una enzima de lisis de la pared celular, para proporcionar así un extracto intracelular, que se puede emplear como un extracto bruto de enzimas. Este extracto se pueden tratar mediante, por ejemplo, desplazamiento salino con sulfato de amonio, diálisis, cromatografía de filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de adsorción y cromatografía de afinidad, en combinación apropiada, para proporcionar así una solución de la enzima de alta pureza.
El microorganismo que tiene capacidad de producir urolitinas o las enzimas procedentes del microorganismo que tiene una capacidad de producir urolitinas pueden inmovilizarse mediante una técnica de inmovilización convencional. No se impone limitación particular en la técnica de inmovilización, y los ejemplos de la técnica de inmovilización incluyen portador de unión, reticulación, y atrapamiento. Ejemplos de portador de unión incluyen unión covalente, enlace iónico, y la adsorción física; ejemplos de reticulación incluyen el método del glutaraldehído, y ejemplos de atrapamiento incluyen atrapamiento en forma de celosía y atrapamiento en microcápsula. Ejemplos más específicos incluyen la adsorción sobre carbón activado, serrín, etc; unión a CM-celulosa, P-celulosa, celulosa DEAE, ECTEOLA-celulosa, etc; reticulación con glutaraldehído, diisocianato de tolileno, etc, y el atrapamiento con acrilamida, kappa.- carragenano, ácido algínico, gelatina, acetato de celulosa, etc. La bacteria o enzimas inmovilizadas así pueden emplearse en un método convencional (por ejemplo, en columna, etc) y en proceso discontinuo o continuo.
Para la separación de las urolitinas producidas en un medio de cultivo que contenga ácido elágico y el microorganismo de la presente invención, incubado a la temperatura y la atmósfera adecuada, se pueden emplear procesos de centrifugación del medio de cultivo para la recuperación de las mismas en el sobrenadante. El sobrenadante del medio de cultivo puede someterse a un proceso de extracción con plasma o de separación / purificación convencional tales como cromatografía en columna o la extracción con disolvente orgánico, así separamos las urolitinas del medio de cultivo. El medio de cultivo así obtenido se puede adsorber sobre una columna polimérica no-iónica o de intercambio iónico, seguido de elución con metanol u otros disolventes y tampones, a fin de obtener un producto purificado de urolitinas.
Para la producción de los fragmentos de ácido nucléico de la presente invención, se emplea como diana la secuencia de nucleótidos de Gordonibacter CEBAS 1/15P DSM 26536 que los presentes inventores obtuvieron a través de la amplificación directa por PCR del gen ARNr 16S, que es altamente fiable para estudios filogenéticos (SEQ. ID NO: 1 ). Puesto que el análisis de los fragmentos requiere medios de PCR o similar, se empleó el ADN en lugar de un ARN. En el diseño de los fragmentos de ácidos nucléicos de la presente invención, la secuencia de nucleótidos del gen ARNr 16S de Gordonibacter CEBAS 1/15P DSM 26536 (SEQ. ID NO: 1 ), se alinea con la secuencia del gen ARNr 16S de Gordonibacter pamelaeae DSM 19378T que tiene una capacidad de producir urolitinas, así como con la de bacterias estrechamente relacionadas filogenéticamente. Específicamente, la alineación del gen ARNr 16S se lleva a cabo mediante el programa Mega4 utilizando las bases de datos (EMBL) donde están disponibles las secuencias del gen ARNr 16S de las bacterias estrechamente relacionadas a Gordonibacter, que pertenecen a la familia Coriobacteriaceae (Paraeggerthella hongkongensis HKU10 (AY288517); Eggerthella lenta ATCC 25559 (AF292375); Eggerthella sinensis HKU14 (AY321958)) y que no son productoras de urolitinas. Esta comparación permite identificar un fragmento de la secuencia del gen ARNr 16S que presenta mayor homología para Gordonibacter CEBAS 1/15P DSM 26536 y Gordonibacter pamelaeae DSM 19378T y mayor diferencia con el resto de bacterias cercanas filogenéticamente, este fragmento tiene una longitud de 689 nucleótidos (SEQ. ID NO: 2). A partir de este fragmento (SEQ ID NO: 2) se diseñan mediante el programa Primer express, cuatro cebadores, dos directos y dos reversos, identificados como SEQ. ID NO: 3, 4, 5 y 6 y una sonda TaqMan identificada como SEQ. ID NO: 7. El fragmento de ácido nucléico que puede hibridar específicamente con el ADN y / o ARN de las bacterias del genero Gordonibacter no se limita a las secuencias de nucleótidos diseñadas así (SEQ. ID NO: 2, 3, 4, 5, 6 y 7), y los expertos en la técnica pueden concebir otros equivalentes sobre la base del conocimiento técnico común. Ejemplos de tales equivalentes incluyen un fragmento de ácido nucléico que tenga una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencias diseñadas así (SEQ. ID NO: 2, 3, 4, 5, 6 y 7), y un fragmento de ácido nucléico que tenga una secuencia de nucleótidos homologa a cualquiera de las secuencias anteriores y que es funcionalmente equivalente al fragmento de ácido nucléico anterior. Los ejemplos del fragmento de ácido nucléico que tiene una secuencia de nucleótidos homologa y que es funcionalmente equivalente incluyen los siguientes fragmentos de ácido nucléico (a) a (c): (a) un fragmento de ácido nucléico que tiene una secuencia de nucleótidos representada por la secuencia de nucleótidos SEQ. ID NO: 2 ó 3 ó 4 ó 5 ó 6 ó 7 o una secuencia complementaria de nucleótidos, donde una a varias bases, preferiblemente de 1 a 10 bases, están suprimidas, sustituidas o añadidas;
(b) un fragmento de ácido nucléico que tiene una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de 90 % o superior, preferiblemente 95 % o más, más preferiblemente 99 % o más, a la secuencia de nucleótidos de SEQ. ID NO: 2 ó 3 Ó 4 Ó 5 Ó 6 Ó 7 Ó una secuencia complementaria de nucleótidos; y
(c) un fragmento de ácido nucléico que híbrida en condiciones restrictivas con un fragmento de ADN que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ. ID NO: 2 Ó 3 Ó 4 Ó 5 Ó 6 Ó 7 Ó una secuencia complementaria de nucleótidos,
Estos ejemplos se pueden emplear en la detección, identificación y cuantificación de los microorganismos diana capaces de producir urolitinas.
La identidad de una secuencia de nucleótidos se calcula por medio de un programa de análisis de homología, GENETYX (R). Los fragmentos de ácidos nucléicos diseñados pueden sintetizarse artificialmente, de acuerdo con las secuencias de nucleótidos de los mismos, por medio de un sintetizador de ADN. La especificidad de los fragmentos de ácido nucléico se investiga mediante el uso de dos fragmentos de ácido nucléico como cebadores (SEQ. ID NO: 3 y 5) o (SEQ. ID NO: 4 y 6) o combinaciones de ambos y el tercero como sonda (SEQ. ID NO: 7) y confirmado por el uso de, como índices, la presencia de amplicones específicos como cualquiera de los identificados como (SEQ. ID NO: 8 ó 9 ó 10 ó 1 1 ) o sus complementarios u homólogos o no frente a cepas estrechamente relacionadas Paraeggerthella hongkongensis HKU10 (AY288517), Eggerthella lenta ATCC 25559 (AF292375), Eggerthella sinensis HKU14 (AY321958), Adlercreutzia equolifaciens FJC-B9 (AB306661 ), Asaccharobacter celatus do03 (AB266102), Enterorhabdus caecimuris B7 (DQ789120), Enterorhabdus mucosicola Mt1 B8 (AM74781 1 ), Denitrobacterium detoxificans NPOH1 (U43492), Cryptobacterium curtum ATCC 700683 (AB019260), Slackia faecicanis CCUG 48399 (AJ608686), Slackia piriformis YIT 12062 (AB490806), Slackia equolifaciens DZE (EU377663), Slackia isoflavoniconvertens HE8 (EU826403), Slackia exigua ATCC 700122 (AF101240), Slackia heliotrinireducens ATCC 29202 (AF101241 ), Collinsella intestinalis RCA56-68 (AB031063), Collinsella stercoris RCA55-54 (AB031061 ), Collinsella tanakaei W 12063 (AB490807), Collinsella aerofaciens JCM 10188 (AB01 1816), Coriobacterium glomerans DSM 20642 (X79048). Como resultado, la especificidad se confirma.
Puesto que el fragmento de ácido nucléico (SEQ. ID NO: 2, 3, 4, 5, 6 y 7) de la presente invención tiene especificidad para microorganismos del género Gordonibacter que tienen una capacidad de producir urolitinas, el microorganismo que tiene una capacidad de producir urolitinas puede detectarse, identificarse, y cuantificarse específicamente mediante PCR con el ADN o ARN recuperado a partir de heces humanas o animales o el contenido del tubo digestivo, o por otros medios tales como FISH (hibridación fluorescente in situ) o similares. A través de la cuantificación del microorganismo que tiene una capacidad de producir urolitinas, la capacidad de producción de urolitinas que posee un individuo se puede comprobar fácilmente, por lo que el riesgo de sufrir una variedad de enfermedades y trastornos que pudieran estar relacionadas potencialmente con el bajo nivel de urolitinas tales como arteriosclerosis, cáncer de mama, cáncer de próstata, enfermedades inflamatorias intestinales puede determinarse. Por lo tanto, medidas de prevención (por ejemplo, la administración de la composición de la presente invención) podrían llevarse a cabo en individuos que presenten baja o nula capacidad de producción de urolitinas. Además, a través de, por ejemplo, la administración de la composición de la presente invención, un individuo que ya sufre una enfermedad y que no tiene o tiene baja capacidad de producción de urolitinas podría tratarse o mejorarse.
El análisis por PCR convencional o por PCR a tiempo real o de Reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) se pueden realizar a través de, por ejemplo, los siguientes pasos:
(1 ) una etapa de extracción del ADN o ARN que contiene una muestra de heces;
(2) una etapa de realización de la reacción de PCR o RT-PCR mediante el uso de uno o más de los fragmentos de ácido nucléico mencionados anteriormente
(SEQ. ID NO: 3, 4, 5, 6 y 7), y
(3) una etapa de detección de un fragmento de ADN amplificado en el paso (2) (SEQ. ID NO: 8 ó 9 ó 10 ó 1 1 ). Cuando la reacción de amplificación se realiza utilizando como cebadores los oligonucleótidos (SEQ. ID NO: 3 ó 4 ó 5 ó 6) en combinación con el ADN extraído de la muestra (ADNc en el caso de que el molde sea RNA), se puede conseguir un fragmento de ADN (producto de la reacción de PCR) (SEQ. ID NO: 8 ó 9 ó 10 ó 1 1 ) específico para bacterias diana que pertenecen al género Gordonibacter y que producen urolitinas. A través de la electroforesis del fragmento de ADN obtenido de este modo, las bacterias diana que pertenecen al género Gordonibacter pueden detectarse e identificarse específicamente de acuerdo con la presencia o ausencia de la banda correspondiente.
La detección del producto de la reacción de PCR también se puede realizar mediante el etiquetado del producto de PCR con un colorante intercalante fluorescente, tal como SYBR (R) Green I y la medición de la intensidad de fluorescencia en cada etapa de PCR. Puesto que el colorante intercalante aumenta la intensidad de fluorescencia a través de intercalación con un ácido nucléico de doble cadena, el producto de la PCR formado a través de la amplificación puede detectarse correctamente. Entre colorantes intercalantes, se puede emplear entre otros SYBR (R) Green I. A través de la determinación del número de ciclos de PCR en el momento en que la intensidad de fluorescencia (concentración de ADN molde) ha alcanzado un nivel predeterminado (denominado en lo sucesivo valor CT), la bacteria diana contenida en la muestra puede cuantificarse, detectarse, o identificarse. Este análisis también se puede realizar mediante el uso de sondas fluorescibles para lo que se diseñó una sonda TaqMan (SEQ. ID NO: 7). Una sonda TaqMan o Molecular Beacon es una sonda en la que un colorante fluorescente y un inhibidor de la fluorescencia están unidos a un oligonucleótido que tiene una homología con una secuencia interna de una región que se amplifica mediante PCR. La sonda se emplea adicionalmente en la PCR junto a los cebadores (SEQ. ID NO: 3, ó 4, ó 5, ó 6). Dado que la fluorescencia se emite en función de la reacción de amplificación de PCR, a través de la interacción entre el colorante fluorescente y el inhibidor unido a la sonda, el producto de la PCR formado a través de la amplificación se puede monitorizar mediante la medición de la intensidad de fluorescencia en cada etapa de PCR.
Las bacterias diana contenidas en la muestra, que pertenece al género Gordonibacter, pueden cuantificarse, detectarse o identificarse por medio de una curva de calibración entre los valores CT y el logaritmo de la concentración de células determinado mediante recuento en placa de cultivo o un método similar. Específicamente, para dibujar una curva de calibración se representan a lo largo del eje vertical los valores CT, y a lo largo del eje horizontal se representan los logaritmos de las concentraciones de células obtenidas mediante recuento. De esta manera, a cada valor de CT obtenido a través de la PCR le corresponde una concentración de células de la curva de calibración, por lo que la bacteria diana contenida en la muestra que pertenece al género Gordonibacter puede cuantificarse, detectase o identificarse.
Las bacterias que pertenecen al género Gordonibacter pueden cuantificarse por PCR utilizando diluciones seriadas del ADN o ARN (ADNc) molde. En la cuantificación por PCR, se emplea preferiblemente la PCR a tiempo real aunque pueden emplearse otros métodos tales como los mencionados anteriormente. Mediante el seguimiento del producto de PCR formado a través de la amplificación por PCR y la determinación del número de ciclos de PCR cuando la concentración de ADN ha alcanzado una cierta cantidad, puede cuantificarse una bacteria contenida en la muestra que pertenezca al género Gordonibacter.
Los fragmentos de ácidos nucléicos SEQ. ID NO: 3, 4, 5 y 6 de la presente invención se emplean como cebadores en la PCR, pero también se pueden emplear como una sonda en combinación con un par de cebadores universales conocidos, oligonucleótido, etc.
Ejemplos de la utilización de los fragmentos de ácido nucléico de la presente invención (SEQ ID NO: 2 ó 3 ó 4 ó 5 ó 6, ó, 7, ó 8, ó 9, ó 10, ó 1 1 ) para construir una sonda incluyen entre otros, la hibridación in situ y la hibridación dot blot. Como método de análisis rápido es preferible la hibridación in situ, ya que no requiere el paso de extracción del ácido nucléico contenido en una muestra. Más concretamente, se puede utilizar el método FISH, empleando un fragmento de ácido nucléico marcado con un tinte fluorescente Específicamente, el método FISH se puede realizar a través de los siguientes pasos: (1 ) una etapa de fijación la muestra con formaldehído o formalina; (2) una etapa de aplicación de la muestra fijada en un portaobjetos de vidrio o filtro de membrana, (3) una etapa de realización de la hibridación con un fragmento de ácido nucléico marcado con el colorante fluorescente, (4) una etapa de lavado del fragmento de ácido nucléico que queda después de la hibridación y no se une específicamente, y (5) una etapa de la observación visual de los resultados de la hibridación bajo una microscopio de fluorescencia o por medio de una cámara de recuento o un aparato similar para tomar una imagen de la misma. Cuando las bacterias diana que pertenecen al género Gordonibacter están presentes en la muestra, su ADN se híbrida con el fragmento de ácido nucléico empleado, y la señal positiva se obtiene después de la hibridación. Sobre la base de la señal positiva, las bacterias del género Gordonibacter pueden aislarse, detectarse específicamente o identificarse. A través del contaje las células marcadas, se puede llevar a cabo la cuantificación. El método de aislamiento de bacterias productoras de urolitinas mediante la utilización como sonda, de alguno de los fragmentos de ácido nucléico de la presente invención (SEQ ID NO: 2 ó 3 ó 4 ó 5 ó 6, ó, 7, ó 8, ó 9, ó 10, ó 1 1 ) también constituye otro de los aspectos de la presente invención.
EJEMPLOS DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores. Los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan en este documento de patente sirven para ilustrar la naturaleza de la presente invención. Estos ejemplos se incluyen solamente con fines ilustrativos y no deben ser interpretados en sentido limitativo del alcance de la invención que aquí se reivindica. Por tanto los ejemplos descritos no deben limitar el campo de aplicación de la misma.
EJEMPLO 1. Aislamiento y recuperación de un microorganismo que tiene una capacidad de convertir ácido elágico y elagitaninos en urolitinas
En primer lugar se obtuvieron heces frescas excretadas por individuos sanos productores de urolitinas. Estas heces se diluyeron 1/10 peso/volumen, en un diluyente (1 % lab-lemco powder; 1 % peptona, 0.5% NaCI, 0.05% de hidrocloruro de L-cisteína y 20% de glicerol). A continuación se homogeneizó utilizando bolsas con filtro y un homogeneizador de paletas. El residuo de la suspensión se eliminó a través del filtro de la bolsa. La suspensión resultante se diluyó en el mismo diluyente y se aplicó una alícuota (0.1 mL) de la solución a placas de agar que contenían (1 .6% peptona, 0.7% extracto de levadura, 0.5% NaCI, 0.1 % almidón, 0.1 % Dextrosa, 0.1 % piruvato sódico, 1 % arginina, 0.05% succinato de sodio, 0.05% hidrocloruro de L-cisteína, 0.04% bicarbonato sódico, 0.5% pirofosfato férrico, 0.0005% hemina, 0.00005 % vitamina K, 0.05% tioglicolato de sodio, 0.1 % ditiotreitol y 20% agar). Las placas se incubaron a 37 °C durante 72 horas en una cabina de anaerobiosis, para con ello formar colonias. Las colonias así obtenidas se inocularon individualmente en un medio líquido que contenía ácido elágico disuelto a una concentración final de 30 μΜ, seguido de incubación a 37 °C durante 72 horas bajo una mezcla de gas (N2: H2: CO2 = 80:10:10). La determinación de la concentración de urolitinas en los cultivos líquidos resultantes de la incubación descrita en el párrafo anterior se realizó utilizando un equipo de HPLC (Agilent 1200) equipado con dos detectores en serie: detector UV-Vis (longitudes de onda 280, 305 y 360 nm) y un detector de masas de cuadrupolo simple (Agilent 6120). Se utilizó una columna C18 Poroshell 120 (3 x 100 mm, 2.7 μιη de tamaño de partícula) que se mantuvo a una temperatura de 25 0 C. Como fases móviles se empleó agua con 1 % de ácido fórmico (fase A) y acetonitrilo (fase B) a un flujo de 0.5 mL/min y un volumen de inyección de 5 μΙ_ de muestra. Los cromatogramas de UV se obtuvieron a 360 nm y 305 nm. Las urolitinas se identificaron en función de su espectro de UV-Vis y su masa molecular y cuando fue posible por la comparación con estándares conocidos. El ácido elágico se cuantificó con su estándar a 360 nm, la urolitina C con su estándar a 305 nm y el resto de urolitinas se cuantificaron a 305 nm usando urolitina A como patrón externo. El perfil cromatográfico se muestra en la Figura 1.
Se determinó la concentración de urolitinas de cada una de los cultivos mediante HPLC siguiendo el procedimiento indicado, para así seleccionar un microorganismo productor de urolitinas que resultó ser una bacteria flagelada, cocobacilar, Gram-positiva con alta capacidad de producción de urolitinas y que se denominó CEBAS 1/15P DSM26536.
EJEMPLO 2. Identificación, análisis genético y de propiedades bioquímicas de los microorganismos que tienen capacidad de producir urolitinas
Para caracterizar el microorganismo productor de urolitinas seleccionado en el ejemplo anterior se realizó una amplificación mediante PCR del ARN ribosómico 16S. En dicha reacción se utilizó como ADN molde, una purificación de ADN genómico de la bacteria aislada en el Ejemplo 1 (CEBAS 1/15P), y como cebadores se utilizaron el par de cebadores 616V (forward) (SEQ ID. NO: 12) and 699R (reverse) (SEQ ID. NO: 13), así como el par de cebadores P609D (SEQ ID. NO: 14) and P1525R (SEQ ID. NO: 15) descritos por otros autores (Arahal y col., 2008 Int. Microbiol., 1 1 , 33-39; Lucena y col., 2010, Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 60, 1844-1848) y recogidos en la Tabla 1. La secuencia obtenida correspondía a la secuencia casi completa del gen ARNr 16S, tenía una longitud de 1477 nucleótidos. Se realizó un análisis comparativo de la secuencia obtenida frente a secuencias de gen ARNr 16S de otras bacterias y se identificaron las especies más cercanas filogenéticamente utilizando el servidor Ez-Taxon-e, que realiza análisis BLAST y megaBLAST. El resultado se muestra recogiendo la extensión del fragmento solapado, el porcentaje de semejanza y el nombre del microorganismo con un mayor grado de identidad de secuencia (Tabla 2).
Posteriormente se realizó un análisis filogenético utilizando el programa ARB y la base de datos curada de SILVA (LTPs108_SSU.arb). Para el análisis se emplearon 32 especies, 3 de las cuales se han usado como outgroup para enraizar el árbol. Con los datos obtenidos se elaboró un árbol filogenético mediante los parámetros de Neighbour Joining (corrección Jukes Cantor). El árbol que se presenta en la Figura 2 sólo muestra las cepas tipo de las especies más relacionadas con la bacteria aislada en el Ejemplo 1 (CEBAS 1/15P). Como resultado, se concluyó que la bacteria aislada en el ejemplo 1 (CEBAS 1/15P) pertenece a la familia Coriobacteriaceae (Figura 2). Aunque Gordonibacter pamelaeae (cepa tipo DSM 19378) es la cepa conocida más cercana filogenéticamente, su semejanza con la cepa Gordonibacter sp. (CEBAS 1/15P DMS 26536) es baja (97% sobre la secuencia AM886059). Por lo tanto, la bacteria del ejemplo 1 se considera perteneciente a una nueva especie dentro del género Gordonibacter donde la única cepa y especie conocida es Gordonibacter pamelaeae (cepa tipo DSM 19378). En la Tabla 2 se muestra el porcentaje de similitud de cada cepa tipo frente a la secuencia Gordonibacter sp. CEBAS 1/15P DMS 26536 calculado con el programa ARB.
Las propiedades bioquímicas de la bacteria del Ejemplo 1 (Gordonibacter sp. CEBAS 1/15P DMS 26536), y las 4 especies más cercanas filogenéticamente, G. pamelaeae DSM 19378, Paraeggerthella hongkongensis HKU10; Eggerthella lenta ATCC 25559; Eggerthella sinensis HKU14, se analizaron por medio del sistema Rapid ID 32A, 20A (SYSMEX bioMerieux Co., Ltd.) y GEN III (Biolog). Estos sistemas permiten caracterizar la capacidad de crecimiento de microorganismos utilizando diferentes fuentes de carbono en su metabolismo, sus capacidades enzimáticas y su capacidad de crecer en ciertas condiciones de pH, NaCI, así como en presencia de algunos compuestos ej. antibióticos. Cada bacteria ensayada se cultivó en placa de agar a 37°C durante 72 horas bajo condiciones anaeróbicas. La determinación de API 20A, ID32A, y GEN III se realizó siguiendo el protocolo de la casa comercial. La Tabla 3 muestra los resultados.
En el análisis por medio de API 20A, ID32A, y GEN III, la bacteria aislada en el ejemplo 1 exhibió ciertas propiedades que la diferencian de las especies más próximas filogenéticamente (G. pamelaeae DSM 19378, P. hongkongensis HKU10, E. lenta ATCC 25559 y E. sinensis HKU14). Particularmente, Gordonibacter sp. CEBAS 1/15P es capaz de metabolizar ciertas fuentes de carbono como L-fucosa, D-turanosa, D-fructosa, ácido D-galacturónico, y ácido α-ketobutírico mientras que G. pamelaeae DSM 19378 carece de esa capacidad. Por otro lado, Gordonibacter sp. CEBAS 1/15P y G. pamelaeae DSM 19378 fueron capaces de metabolizar la dextrina mientras que Paraeggerthella hongkongensis HKU10; Eggerthella lenta ATCC 25559; Eggerthella sinensis HKU14 no.
Por lo tanto, los estudios genéticos y bioquímicos han revelado que la bacteria aislada en el ejemplo 1 es una nueva especie que pertenece al género Gordonibacter, y ha sido denominada por los inventores cepa Gordonibacter urolithinfaciens CEBAS 1/15P DSM 26536.
También se estudió la actividad de producción de urolitinas de otras cepas bacterianas pertenecientes a especies cercanas filogenéticamente a la bacteria de la presente invención CEBAS 1/15P DSM26536. Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 3. G. pamelaeae DSM 19378 también fue capaz de transformar el ácido elágico en urolitinas por lo que esta capacidad de dicha cepa bacteriana también forma parte de la presente invención. En contraste, otras bacterias pertenecientes a especies bacterianas filogenéticamente cercanas, como Paraeggerthella hongkongensis HKU10; Eggerthella lenta ATCC 25559; Eggerthella sinensis HKU14 no fueron capaces de producir urolitinas a partir de ácido elágico. Por tanto, los estudios realizados han puesto de manifiesto la capacidad de G. pamelaeae DSM 19378 de producir urolitinas que no había sido demostrada previamente.
Tabla 1. Cebadores utilizados para la secuenciación del gen ARNr 16S de Gordonibacter CEBAS 1/15P.
Figure imgf000029_0001
Tabla 2. Cálculo de los valores de semejanza entre las secuencias Gordonibacter sp. CEBAS 1/15P y las de las especies más cercanas filogenéticamente.
Especie, cepa, (n° acceso secuencia) % de id/total nt semejanza
Gordonibacter sp. CEBAS 1/15P 100 1458/1458
Gordonibacter pamelaeae 7-10-1 -b 97,1 141 1/1453 (AM886059)
Paraeggerthella hongkongensis HKU10 94,3 1346/1427 (AY288517)
Eggerthella sinensis HKU14 (AY321958) 94,3 1348/1429
Eggerthella lenta ATCC 25559 (AF292375) 93,0 1374/1476
Adlercreutzia equolifaciens FJC-B9 92,6 1347/1455 (AB306661 )
Asaccharobacter celatus do03 (AB266102) 92,4 1304/141 1
Enterorhabdus caecimuris B7 (DQ789120) 92,2 1342/1455
Slackia heliotrinireducens ATCC 29202 91 ,9 1340/1458 (AF101241 ) Denitrobacterium detoxificans NPOH1 91 ,8 1295/1410 (U43492)
Slackia exigua ATC 700122 (AF101240) 91 ,7 1340/1460
Enterorhabdus mucosicola Mt1 B8 91 ,6 1223/1335 (AM74781 1 )
Tabla 3. Comparación de las propiedades bioquímicas de (1 ) Gordonibacter sp. CEBAS 1/15P; (2) G. pamelaeae DSM 19378; (3) Paraeggerthella hongkongensis HKU10; (4) Eggerthella lenta ATCC 25559; (5) Eggerthella sinensis HKU14 analizadas mediante el método API ID32A, 20A y GEN III. +, Positivo; -, negativo; V, variable; NA, dato no disponible.
Características 1 2 3 4 5
Producción de urolitinas + + - - -
Dextrina + + - - -
L-Fucosa + - - - +
D-Fructosa + - NA NA NA
D-Turanosa + - NA NA NA
Acido D-Galacturonic + - NA NA NA
D-Mannosa - - - + -
Raffinosa - - - + -
L-Rhamnosa - - + - -
Trehalose - - - + -
Acido a-Ketobutyrico + - - - +
P-Galactosidasa-6- - - - - - β-Galactosidasa - - - - - β-Glucosidasa - - + - - a-Arabinosidasa - - - - - a-Fucosidasa - - - V -
Arginina arilamidasa - - - V +
Prolina arilamidasa - - - V -
Fenilalanina arilamidasa - - - V -
Leucina arilamidasa - - - V -
Tirosina arilamidasa - - - V -
Alanina arilamidasa - - - V -
Glicina arilamidasa - - - V -
Histidina arilamidasa - - - V - EJEMPLO 3: Análisis de la ruta de biotransformación de ácido elágico en urolitinas mediante Gordonibacter sp. CEBAS 1/15P y Gordonibacter pamelaeae DMS 19378
La capacidad de Gordonibacter sp. CEBAS 1/15P y Gordonibacter pamelaeae DMS 19378 para convertir el ácido elágico en urolitinas se analizó tal como se describe a continuación. A un medio líquido (1 .6% peptona, 0.7% extracto de levadura, 0.5% NaCI, 0.1 % almidón, 0.1 % Dextrosa, 0.1 % piruvato sódico, 1 % arginina, 0.05% succinato de sodio, 0.05% hidrocloruro de L-cisteína, 0.04% bicarbonato sódico, 0.5% pirofosfato férrico, 0.0005% hemina, 0.00005 % vitamina K, 0.05% tioglicolato de sodio, 0.1 % ditiotreitol) se añadió ácido elágico a una concentración final de 9 μΜ, y la bacteria Gordonibacter sp. CEBAS 1/15P o Gordonibacter pamelaeae DMS 19378 a una concentración final de 70 y 107 células/mL de medio. Las suspensiones se incubaron a 37 °C bajo una mezcla de gas (N2: H2: C02 = 80:10:10) durante 172 horas. Durante el curso del cultivo, se tomaron alícuotas periódicamente para determinar el tipo y concentración de urolitinas de la solución de cultivo mediante HPLC y de este modo, analizar la ruta de biotransformación el ácido elágico en distintas urolitinas. A estas alícuotas del cultivo se les añadió un equivolumen de acetato de etilo (5 mL). La mezcla se agitó en un vortex y se centrifugó (3.500 x g durante 10 minutos) para separar así la mezcla en dos capas. Se recuperó la capa superior de acetato de etilo que se llevó a sequedad a 35 °C en un concentrador a vacío. Finalmente se reconstituyó en 250 μί de metanol y se filtró utilizando filtros de PVDF de 0.45 μιη. La ruta metabólica de producción de urolitinas se muestra en la Figura 3. La cuantificación de los resultados obtenidos mediante HPLC muestran que Gordonibacter sp. CEBAS 1/15P DSM (70 células /mL de medio) fue capaz de convertir el 100 % del ácido elágico disuelto a urolitinas en la incubación durante 162 horas coincidiendo con fase estacionaria de la curva de crecimiento de la bacteria (Figura 4). Cuando se utilizaron concentraciones celulares de Gordonibacter sp. CEBAS 1/15P mayores (107 células /mL de medio) el porcentaje de conversión fue del 24% a las 72 h y del 100 % a las 175 horas. Las principales urolitinas sintetizadas por las bacterias Gordonibacter sp. CEBAS 1/15P y Gordonibacter pamelaeae DMS 19378 fueron penta-hidroxi urolitina, tetra-hidroxi urolitina y urolitina C y su cinética de producción se muestra en la Figura 5.
EJEMPLO 4. Diseño de un fragmento de ácido nucléico específico para especies microbianas productoras de urolitinas. Las secuencias de nucleótidos del gen ARNr 16S de bacterias pertenecientes a la familia Coriobacteriaceae se obtuvieron a partir de una base de datos pública (EMBL) y las secuencias así obtenidas de cepas estrechamente relacionadas (Paraeggerthella hongkongensis HKU10; Eggerthella lenta ATCC 25559; Eggerthella sinensis HKU14), se alinearon con las secuencias de nucleótidos de ARNr 16S de las dos cepas productoras de urolitinas, Gordonibacter sp. CEBAS 1/15P (SEQ ID NO: 1 ) y G. pamelaeae DSM 19378 por medio del programa Mega4. Se diseñaron dos cebadores directos (Uro-F y Uro2-F) y dos cebadores reversos (Uro-R y Uro2-R (SEQ ID NO: 3, 4, 5 y 6) y una sonda TaqMan (Uro Probé; SEQ ID NO: 7) frente a la región específica de estas dos bacterias productoras de urolitinas (SEQ ID NO: 2) (Tabla 4).
Se hicieron diluciones seriadas del ADN extraído de Gordonibacter sp. CEBAS 1/15P DSM 26536 (2x108 células/mL) con el fin de ajustar la concentración de células desde 2x106 a 2x10"1 células/mL. Una alícuota (5 μΙ_) de la solución diluida de ADN se empleó como ADN molde, y se realizó la PCR a tiempo real cuantitativa utilizando como cebadores los oligonucleótidos identificados como SEQ ID NO: 3 y 5, así como la sonda TaqMan identificada como SEQ ID NO: 7. Se realizó la PCR cuantitativa durante 40 ciclos (cada ciclo: 95 °C durante 15 s, 60 °C durante 1 min). La amplificación por PCR se correlacionó con el número de células en el intervalo de 10~3 a 103 células poniendo de manifiesto la utilidad de la PCR cuantitativa en la identificación de bacterias capaces de producir urolitinas utilizando como cebadores los oligonucleótidos SEQ ID NO: 3 y 5 y como sonda el oligonucleótido SEQ ID NO: 7.
Tabla 4. Cebadores y sonda utilizadas para la identificación y cuantificación de Gordonibacter CEBAS 1/15P y Gordonibacter pamelaeae. Gen Cebadores Secuencia de los cebadores (5 -3 ) Identificación de la
secuencia en la patente
ARN Uro F GGCTCGAGTTTGGTAGAGGAAGAT SEQ ID NO: 3
16S Uro2 F CGGGTTCCGAACTGGCA SEQ ID NO: 4
Uro R GGCCCAGAAGACTGCCTT SEQ ID NO: 5
Uro2 R AGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCC SEQ ID NO: 6
Uro probé FAM- SEQ ID NO: 7
AATTCCCGGTGTAGCGGTGGAATGC- BBQ
EJEMPLO 5. Análisis de muestras fecales de humanos.
Se extrajo el ADN de muestras de heces de 10 voluntarios sanos. Cada muestra de ADN se sometió a PCR cuantitativa mediante el uso de los cebadores definidos por las SEQ ID NO: 3 y 5 y la sonda TaqMan SEQ ID NO: 7. Específicamente, se tomaron muestras de las heces (20 mg) de cada voluntario, e inmediatamente después, se extrajo el ADN total utilizando el kit comercial QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Madrid, Spain). La concentración y la pureza del ADN se midieron en un espectrofotómetro a 260 nm (Nanodrop Technologies). Los ADN totales obtenidos de este modo se diluyeron apropiadamente, y el producto diluido se sometió a PCR cuantitativa según el método descrito en el Ejemplo 4. El recuento de Gordonibacter sp. CEBAS 1/15P de la muestra se calculó utilizando la curva de cuantificación descrita en el ejemplo 4. EJEMPLO 6. Producción e identificación de urolitinas.
A un medio líquido (1 .6% peptona, 0.7% extracto de levadura, 0.5% NaCI, 0.1 % almidón, 0.1 % Dextrosa, 0.1 % piruvato sódico, 1 % arginina, 0.05% succinato de sodio, 0.05% hidrocloruro de L-cisteína, 0.04% bicarbonato sódico, 0.5% pirofosfato férrico, 0.0005% hemina, 0.00005 % vitamin K, 0.05% tioglicolato de sodio, 0.1 % ditiotreitol) que contenía ácido elágico, se le añadió Gordonibacter sp. CEBAS 1/15P (107 células / ml_ de medio). El medio que contenía las células se incubó durante 175 horas a 37 °C bajo una mezcla de gas (N2: H2: C02 = 80:10:10). A continuación, al medio de cultivo se le añadió un equivolumen de acetato de etilo. La mezcla se agitó y se centrifugó (3.500 x g durante 10 minutos) para separar así la mezcla en dos capas. Se recuperó la capa superior de acetato de etilo que se llevó a sequedad a 35 °C en un concentrador a vacío. Finalmente se reconstituyó en metanol y se filtró utilizando filtros de PVDF de 0.45 μιη. Las urolitinas se identificaron en el producto resultante de la filtración tal como se describe en el ejemplo N° 1 de la presente invención.
EJEMPLO 7. Producción de cápsulas, comprimidos o formulaciones equivalentes.
Para la preparación de cápsulas, comprimidos o preparaciones equivalentes se mezcló una cantidad efectiva de células de bacterias de la presente invención, con cantidades apropiadas de celulosa, trealosa, estearato de magnesio, metilcelulosa y extracto de granada en las cantidades indicadas en la Tabla 5. La mezcla se granuló, se secó y refino, para de ese modo producir los comprimidos. Para la producción de cápsulas se podría prescindir de celulosa en la formulación. Para la preparación de formulaciones equivalentes es imprescindible que la formulación cuente, entre sus ingredientes, con una cantidad efectiva de las bacterias de la presente invención Gordonibacter sp. CEBAS 1/15P o Gordonibacter pamelaeae DSM 19378 o ambas, y una fuente de elagitaninos o ácido elágico como extracto de granada entre otros, el resto de componentes de la Tabla 5 pueden ser sustituidos por otros componentes equivalentes o eliminados, siempre que los componentes utilizados no afecten a la producción de urolitinas o al metabolismo del ácido elágico y elagitaninos.
TABLA 5. Ejemplo de formulación de capsulas o comprimidos.
Formulación (mg)
Bacterias de la presente 10
Celulosa 100 Trealosa 15
Estearato de magnesio 0.5
Metil-celulosa 12
Extracto de granada: 200
contenido en punicalagina y
1 ) Células viables liofilizadas de Gordonibacter sp. CEBAS 1/15P (1010 células viables / g).
EJEMPLO 8. Producción de una bebida no alcohólica.
Para la formulación de una composición alimenticia o bebida no alcohólica, los ingredientes que se muestran en la Tabla 6 se mezclaron mediante un método rutinario. La mezcla se homogeneizó, se incubó a 37 °C bajo una mezcla de gas (N2: H2: C02 = 80:10:10) a fin de obtener una bebida no alcohólica rica en urolitinas. La bebida se envasó en una botella fotoprotectora marrón, y la botella se cerró herméticamente con un tapón de aluminio, y a continuación se llevó a cabo un tratamiento térmico para inactivar las bacterias. También es posible formular bebidas no alcohólicas que incluyan en su composición una cantidad efectiva de las bacterias de la presente invención Gordonibacter sp. CEBAS 1/15P o Gordonibacter pamelaeae DSM 19378 que se añadan a zumo y néctar de frutas, mermelada, leche, refrescos, bebidas a base de té o sus combinaciones.
Para la formulación de una composición alimenticia es posible modificar el saborizante indicado en la Tabla 6 y sustituir el zumo de granada como fuente de elagitaninos, por otra fuente de éstos como fresas, frambuesas, castañas, moras, nueces, extractos de plantas medicinales ricos en ácido elágico o elagitaninos, o material vegetal como hoja de roble o bellotas. Se puede formular cualquier composición alimenticia que contenga una cantidad efectiva de las bacterias de la presente invención Gordonibacter sp. CEBAS 1/15P o Gordonibacter pamelaeae DSM 19378 junto con componentes alimenticios y vehiculares que no inhiban la actividad de las enzimas productoras de urolitinas a partir de ácido elágico y/o elagitaninos. La preparación de composiciones alimenticias también es posible añadiendo una cantidad efectiva de las bacterias de la presente invención Gordonibacter sp. CEBAS 1/15P o Gordonibacter pamelaeae DSM 19378, a una variedad de alimentos, por ejemplo, productos cárnicos procesados (por ejemplo, jamón y salchichas), los productos de pescado (por ejemplo, kamaboko y chikuwa), pan, productos de confitería, mantequilla, leche en polvo y leche fermentada. Tal como se utiliza aquí, el término "alimento o bebida" abarca alimentos también para animales.
TABLA 6. Ejemplo de formulación de una bebida no alcohólica.
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1 ) Células viables liofilizadas de Gordonibacter sp. CEBAS 1/15P (1010 células viables / g).

Claims

REIVINDICACIONES
1 . Microorganismos capaces de producir urolitinas caracterizados porque:
(i) Se seleccionan a partir de muestras biológicas de individuos productores de urolitinas,
(ii) Son capaces de crecer en un medio de cultivo apropiado que contiene ácido elágico y/o elagitaninos ,
(iii) Son capaces de produccir urolitinas cuando se incuban en medio de cultivo (ii), durante un periodo de tiempo determinado y suficiente, en condiciones de atmósfera y temperatura adecuadas,
(iv) Las urolitinas producidas pueden determinarse mediante técnicas adecuadas,
y porque pertenecen a especies bacterianas del género Gordonibacter seleccionadas entre Gordonibacter sp. CEBAS 1/15P (DSM 26536) o Gordonibacter amelaeae (DSM 19378).
2. Microorganismos capaces de producir urolitinas según la reivindicación anterior caracterizados porque dicha selección (i) se realiza a partir de muestras biológicas de individuos (humanos o animales) productores de urolitinas tales como heces, contenidos del tracto digestivo como colon descendente, ciego u otros.
3. Microorganismos productores de urolitinas según reivindicación anterior caracterizados porque dicha selección (i) se realiza a partir de muestras procedentes de individuos productores de urolitinas que se someten a un cribado mediante subcultivo en medio de crecimiento líquido.
4. Microorganismos productores de urolitinas según reivindicación 1 caracterizado porque dicha (ii) capacidad de crecer en medio que contiene ácido elágico y/o elagitaninos se establece preferentemente mediante cultivo en medio líquido suplementado con ácido elágico y/o elagitaninos en una concentración final de entre 3 y 30 μΜ.
5. Microorganismos productores de urolitinas según reivindicación anterior caracterizado porque dicha (ii) capacidad de crecer en medio que contiene ácido elágico y/o elagitaninos se realiza en un medio que contiene componentes adecuados, como sacáridos y fuente de nitrógeno y que no contenga componentes que inhiban la capacidad de producción de urolitinas o la proliferación de los microorganismos de la presente invención. Entre los componentes del medio de cultivo se pueden encontrar componentes tales como peptona, peptona tripticasa, extracto de levadura, hemina, histidina, vitaminas, como la vitaminas K, L-cisteína, KH2PO4, K2HPO4, NaCI, (NH4)2S04, CaC , MgS04, glúcidos y fibras. Alternativamente podrían sustituirse los componentes del medio excepto el ácido elágico y/o elagitaninos y la arginina utilizando el medio Wilkins-chalgren, medio basal para anaerobios, el medio BHI, el medio DRCM, u otros.
6. Microorganismos productores de urolitinas según reivindicación 1 caracterizados porque dicha (iii) capacidad de producir urolitinas cuando se incuban en medio de cultivo (ii), durante un periodo de tiempo determinado y suficiente, en condiciones de atmósfera y temperatura adecuadas, tiene lugar preferentemente durante un tiempo de entre 20 y 300 horas, a una temperatura de entre 28 y 40 °C y en una atmosfera que contenga concentraciones de N2:H2:C02 que garanticen la ausencia de O2, o cualquiera de las combinaciones posibles de tiempo, atmósfera y temperatura indicadas.
7. Microorganismos productores de urolitinas según reivindicación anterior caracterizados porque dicha (iii) capacidad de producir urolitinas cuando se incuban en medio de cultivo (ii), durante un periodo de tiempo determinado y suficiente, en condiciones de atmósfera y temperatura adecuadas, tiene lugar preferentemente a una temperatura de 37 °C, en una atmosfera de N2:H2:C02 = 80:10:10, y durante un periodo de entre 40 y 175 horas.
8. Microorganismos productores de urolitinas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en el que dichas especies bacterianas son capaces de crecer en medios de crecimiento líquidos o sólidos y metabolizar compuestos fenólicos de la dieta.
9. Procedimiento de producción de urolitinas basado en la utilización de los microorganismos productores de urolitinas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque comprende los siguientes pasos:
(i) Inoculación del microorganismo productor de urolitinas en medio líquido suplementado con ácido elágico y/o elagitaninos para generar el cultivo
(ii) Incubación del cultivo durante un periodo de tiempo adecuado y suficiente, en condiciones de atmósfera y temperatura adecuadas
(iii) Extracción y purificación de las urolitinas producidas.
10. Procedimiento de producción de urolitinas según reivindicación anterior caracterizado porque dicha inoculación del microorganismos en medio líquido (i) se realiza preferentemente en un medio según reivindicación 5 suplementado con ácido elágico y/o elagitaninos según reivindicación 4.
1 1 . Procedimiento de producción de urolitinas según reivindicación 9 caracterizado porque dicha Incubación (ii) del cultivo durante un periodo de tiempo adecuado y suficiente, en condiciones de atmósfera y temperatura adecuadas, se realiza preferentemente según cualquiera de las reivindicaciones 6 ó 7.
12. Procedimiento de producción de urolitinas según reivindicación 9 en la que la dicha extracción y purificación (iii) de las urolitinas producidas en el medio de cultivo se realiza mediante un proceso de extracción con plasma o un proceso de purificación convencional tales como cromatografía en columna o la extracción con disolvente orgánico u otros procedimientos de extracción y purificación conocidos y aplicables.
13. Procedimiento para el aislamiento de microorganismos productores de urolitinas a partir de muestras biológicas caracterizado porque comprende los siguientes pasos:
(i) Recogida de colonias de bacterias crecidas en medio de cultivo sólido (ii) Subcultivo de las colonias aisladas en medio de cultivo líquido suplementado con ácido elágico o elagitaninos
(iii) Incubación de los medios inoculados a temperatura y tiempo adecuados, en condiciones de atmosfera adecuada
(iv) Extracción del medio de cultivo con un disolvente orgánico
(v) Adsorción en columna de intercambio iónico y elución con metanol
(vi) Análisis de las urolitinas producidas mediante HPLC un otros medios de análisis como RMN u otros.
14. Polinucleótido cuya secuencia de nucleótidos tiene un grado de identidad de al menos un 90 % frente a la secuencia de nucleótidos identificada como SEQ ID NO: 1 ó 2 ó 3 ó 4 ó 5 ó 6 ó 7 ó 8 ó 9 ó 10 ó 11 o a su complementaria.
15. Polinucleótido según reivindicación anterior cuya secuencia de nucleótidos tiene un grado de identidad de al menos un 95 % frente a la secuencia de nucleótidos identificada como SEQ ID NO: 1 Ó2ó3ó4ó5ó6ó 7Ó8Ó9Ó10Ó11 oasu complementaria.
16. Polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 14 y 15 cuya secuencia de nucleótidos es la secuencia de nucleótidos identificada como SEQ ID NO: 1 Ó2ó3ó4ó5ó6ó7ó8ó9ó10ó11 o su complementaria.
17. Procedimiento de aislamiento e identificación de microorganismos productores de urolitinas caracterizado por la utilización de un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16 para dicho aislamiento e identificación mediante hibridación por técnicas tales como la hibridación in situ, la hibridación dot blot, la hibridación southern blot u otros métodos de hibridación con el material genético de las bacterias de una muestra biológica.
18. Procedimiento de aislamiento e identificación de microorganismos productores de urolitinas, según reivindicación anterior, caracterizado por la utilización del polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, mediante hibridación in situ se realiza preferentemente mediante métodos tales como el método FISH, empleando dicho polinucleótido marcado con un tinte fluorescente u otros marcadores.
19. Procedimiento de identificación y cuantificación de microorganismos productores de urolitinas, a través del contaje las células marcadas caracterizado por la utilización del polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, mediante hibridación in situ que se realiza mediante métodos tales como el método FISH, empleando dicho polinucleótido marcado con un tinte fluorescente u otros marcadores.
20. Procedimiento para el aislamiento, identificación y cuantificación de microorganismos productores de urolitinas caracterizado porque comprende los siguientes pasos:
(i) Extracción de ácidos nucleicos totales de los microorganismos candidatos (ADN o ARN)
(ii) Amplificación mediante PCR convencional o a tiempo real
(iii) Correlación de los resultados de la amplificación con la amplificación del microorganismo productor de urolitinas.
21 . Procedimiento para el aislamiento, identificación y cuantificación de microorganismos productores de urolitinas según reivindicación anterior caracterizado porque en dicha amplificación (ii) mediante PCR a tiempo real cuantitativa se correlacionan los resultados de la amplificación con el número de células del microorganismo productor de urolitinas.
22. Procedimiento para el aislamiento, identificación y cuantificación de microorganismos productores de urolitinas según reivindicación 20 caracterizado porque dicha amplificación (i) mediante PCR se hace utilizando como cebadores dos oligonucleótidos seleccionados entre los oligonucleótidos identificados como SEQ ID NO: 3 ó 4, ó 5, ó 6 o sus complementarios u oligonucleótidos que presentan un grado de identidad de secuencia superior al 90 % con dichas secuencias o cualquiera de sus combinaciones.
23. Procedimiento para el aislamiento, identificación y cuantificación de microorganismos productores de urolitinas según reivindicación 20 caracterizado porque dicha amplificación (ii) mediante PCR a tiempo real cuantitativa se hace utilizando como sonda TaqMan un polinucleótido cuya secuencia es la secuencia identificada como SEQ ID. NO: 7 o su complementaria o un polinucleótido que presenta un grado de identidad de secuencia superior al 90 % con dicha secuencia.
24. Método de identificación de individuos que contienen microorganismos capaces de producir urolitinas, caracterizado porque se obtienen muestras de heces o contenidos del tracto digestivo como colon descendente, ciego u otros en cantidad adecuada y se somete al procedimiento para el aislamiento e identificación de microorganismos productores de urolitinas según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 18, o a un procedimiento de identificación y cuantificación según reivindicación 19, o se extrae ADN total de dichas muestras, mediante métodos convencionales y una dilución apropiada de dicho ADN se somete al procedimiento de aislamiento, identificación y cuantificación según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23.
25. Sistema de producción de urolitinas caracterizado porque se utilizan los microorganismos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o los microorganismos aislados por el procedimiento descrito según reivindicación 13, o los microorganismos aislados e identificados por los procedimientos descritos según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, o los microorganismos aislados identificados y cuantificados cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23.
26. Sistema de producción de urolitinas según reivindicación anterior caracterizado porque las urolitinas se producen preferentemente por el sistema descrito según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12 o por un sistema de producción in vitro basado en el uso cualquiera de las células viables o células térmicamente desnaturalizados (células muertas) de dichos microorganismos o sus enzimas, o productos de dichos microorganismos tales como un producto liofilizado, un producto de cultivo (por ejemplo, sobrenadante de cultivo), un producto de células tratadas, u otro producto donde el microorganismo se emplea preferiblemente en un estado en que se inhiba la inactivación de sus enzimas.
27. Urolitinas producidas según cualquiera de las reivindicaciones 25 o 26.
28. Composiciones alimenticias, bebidas, complementos dietéticos, composiciones farmacéuticas, probióticas y/o alimentos funcionales que contienen urolitinas según reivindicación anterior.
29. Composiciones alimenticias, bebidas, complementos dietéticos, composiciones farmacéuticas, probióticas y/o alimentos funcionales con un microorganismo productor de urolitinas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o un microorganismo aislado por el procedimiento descrito según la reivindicación 13, o los microorganismos aislados e identificados por los procedimientos descritos según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, o según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23.
30. Composiciones alimenticias, bebidas, complementos dietéticos, composiciones farmacéuticas, probióticas y/o alimentos funcionales según reivindicación anterior caracterizados por que contienen células viables o células térmicamente desnaturalizadas de dicho microorganismo, o un producto liofilizado del mismo, o un producto de cultivo (por ejemplo, sobrenadante de cultivo que contenga urolitinas sin contener el microorganismo), u otros, siempre y cuando las células o productos derivados de los microorganismos se empleen en un estado en el que se inhiba la inactivación de sus enzimas.
31 . Composiciones alimenticias, bebidas, complementos dietéticos, composiciones farmacéuticas, probióticas y/o alimentos funcionales según cualquiera de las reivindicaciones 29 a 30 caracterizados por que además de dicho microorganismo o sus productos contienen ácido elágico.
32. Composiciones alimenticias, bebidas, complementos dietéticos, composiciones farmacéuticas, probióticas y/o alimentos funcionales según reivindicación anterior caracterizados por que contienen además, o en vez de ácido elágico, elagitaninos tales como por ejemplo la punicalagina de la granada, los elagitaninos de las nueces, las fresas, las frambuesas, plantas medicinales, así como tejidos vegetales ricos en elagitaninos (hoja de roble, bellotas etc), entre otros.
33. Composiciones alimenticias, bebidas, complementos dietéticos, composiciones farmacéuticas, probióticas y/o alimentos funcionales según cualquiera de las reivindicaciones 29 a 32 caracterizados por que además de dicho microorganismo o sus productos contienen metabolitos intermedios de conversión del ácido elágico a urolitina A, por ejemplo, urolitina M5, urolitina D, u otras.
34. Composiciones alimenticias, bebidas, complementos dietéticos, composiciones farmacéuticas, probióticas y/o alimentos funcionales según cualquiera de las reivindicaciones 29 a 33 caracterizados por que además de dicho microorganismo o sus productos, contienen un producto natural que contenga una gran cantidad de elagitaninos o uno de sus productos procesados. Dichos productos pueden ser preferentemente productos tales como granada, nueces, fresas, castañas, moras, frambuesas, u otros. Dichos productos procesados pueden incluir preferentemente productos tales como el zumo de granada, el zumo de fresa u otros zumos o derivados de cualquier producto rico en elagitaninos.
35. Composiciones alimenticias, bebidas, complementos dietéticos, composiciones probióticas y/o alimentos funcionales según cualquiera de las reivindicaciones 28 a 34 que se administra por vía oral sin modificar o mezclada con aditivos y/o componentes nutricionales por medios convencionales que pueden añadirse a un alimento o bebida, de forma adecuada para poder comerse o beberse.
36. Composiciones alimenticias, bebidas, complementos dietéticos, composiciones probióticas y/o alimentos funcionales según reivindicación anterior caracterizada por que se presenta en forma de gránulos, partículas, comprimidos, cápsulas, pasta u otros, que se añaden entre otros a alimentos tales como productos cárnicos procesados (tales como por ejemplo, jamón y salchichas) u otros, a productos de pescado (tales como por ejemplo, kamaboko y chikuwa) u otros, a pan, productos de confitería, mantequilla, leche en polvo y leche fermentada, o se añaden a bebidas tales como agua, zumo y néctar de frutas, mermelada, leche, refrescos, bebidas a base de té o sus combinaciones, u otros.
37. Composiciones farmacéuticas según cualquiera de las reivindicaciones 28 a 34 que se administran por vía oral, rectal o parenteral mediante mezcla de dichas composiciones con un portador farmacéutico no tóxico sólido o líquido, seleccionado dependiendo del método de administración (por ejemplo, administración oral, administración rectal, o por inyección), para producir con ello una preparación farmacéutica común.
38. Composiciones farmacéuticas según reivindicación anterior que pueden presentarse en preparaciones sólidas tales como tabletas, gránulos, polvo, y cápsulas, preparaciones líquidas tales como soluciones, suspensiones, y emulsiones, jarabes y preparaciones liofilizadas, producidas a través de un método de fabricación común. Que contienen un vehículo farmacéutico no tóxico tales como cualquier seleccionado de entre almidón, dextrina, glicérido de ácido graso, polietilenglicol, almidón de hidroxietilo, etilenglicol, aminoácido, agua, gelatina, albúmina, solución salina fisiológica u otros. En caso necesario, las composiciones pueden contener aditivos comunes tales como un estabilizador, un agente humectante, un emulsionante, un aglutinante, un agente de tonicidad, y/o un excipiente, entre otros.
39. Composiciones alimenticias, bebidas, complementos dietéticos, composiciones probióticas y/o alimentos funcionales según cualquiera de las reivindicaciones 35 a 36, o composiciones farmacéuticas según cualquiera de las reivindicaciones 37 a 38, para la alimentación y/o tratamiento de individuos humanos y/o animales.
40. Utilización de las composiciones alimenticias, bebidas, complementos dietéticos, composiciones farmacéuticas, probióticas y/o alimentos funcionales según cualquiera de las reivindicaciones 28 a 39 para elevar el nivel de urolitinas in vivo, en el organismo, la sangre, el intestino (por ejemplo, el intestino grueso), preferentemente para el tratamiento, mejora, prevención, etc de una variedad de enfermedades y trastornos tales como entre otros la arteriosclerosis y otras enfermedades cardiovasculares, cáncer de mama, cáncer de próstata, enfermedades inflamatorias intestinales y síndrome premenstrual u otros.
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