WO2014142356A1 - 強皮症治療剤 - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to a therapeutic agent for scleroderma comprising, as an active ingredient, a complex comprising, for example, an antibody against folate receptor ⁇ and a cytotoxin or cytotoxic agent.
- Scleroderma is a collagen disease, a chronic disease of unknown cause that causes lesions in various parts of the skin and body characterized by fibrosis.
- the pathophysiology of scleroderma includes fibroblast activation (accumulation of extracellular matrix such as collagen), vascular disorders and immune abnormalities (autoantibodies).
- fibroblast activation accumulation of extracellular matrix such as collagen
- autoantibodies immune abnormalities
- Activated macrophages are cells that invade first in the early stage of fibrosis, and are presumed to secrete factors such as TGF- ⁇ , CTGF, and PDGF and play an important role in the fibrosis process of scleroderma (non- Patent Documents 1 and 2).
- corticosteroids are commonly used for early patients and immunosuppressive drugs are commonly used for pulmonary symptoms.
- the therapeutic methods under study are directed to suppressing cytokines such as interleukin-2 and TGF- ⁇ . For example, it has been reported that treatment with an anti-TGF- ⁇ antibody showed a significant therapeutic effect (Non-patent Document 3).
- FR ⁇ folate receptor ⁇
- the present inventors also provide a recombinant consisting of a fusion protein in which the heavy chain variable region (VH) of anti-FR ⁇ antibody and Pseudomonas aeruginosa toxin (PE) are linked, and the light chain variable region (VL) of anti-FR ⁇ antibody.
- VH heavy chain variable region
- PE Pseudomonas aeruginosa toxin
- VL light chain variable region
- an object of the present invention is to provide a novel therapeutic agent for scleroderma.
- the present invention includes the following.
- a therapeutic agent for scleroderma comprising, as an active ingredient, a complex in which an antibody that binds to folate receptor ⁇ (FR ⁇ ) and a cytotoxin or cytotoxic agent are conjugated.
- the scleroderma therapeutic agent according to (1), wherein the complex is a recombinant immunotoxin.
- the scleroderma therapeutic agent according to (1) or (2), wherein the antibody is a chimeric antibody, a humanized antibody or a human antibody.
- any of (1) to (4), wherein the antibody is raised against a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or a partial peptide consisting of 7 or more consecutive amino acids.
- a therapeutic agent for scleroderma according to 1. Any of (1) to (4), wherein the antibody is raised against a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or a partial peptide consisting of 7 or more consecutive amino acids. 1.
- a therapeutic agent for scleroderma according to 1. The therapeutic agent for scleroderma according to any one of (1) to (6), wherein the antibody is a monoclonal antibody, a polyclonal antibody, an antibody fragment thereof, or a recombinant antibody.
- the antibody is a heavy chain (H chain) variable region and / or a light chain (L chain) variable region of either an anti-human folate receptor ⁇ mouse monoclonal antibody or an anti-mouse folate receptor ⁇ rat monoclonal antibody.
- the therapeutic agent for scleroderma according to any one of (1) to (7), comprising an amino acid sequence comprising at least one complementarity determining region (CDR) in each amino acid sequence.
- the antibody comprises at least one complementarity determining region (CDR) in the amino acid sequence of the heavy chain variable region encoded by the polynucleotide shown in the following (a), (b), (c) or (d):
- the therapeutic agent for scleroderma according to any one of (1) to (8), comprising an amino acid sequence comprising (A) a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 3; (B) a polynucleotide encoding a protein having a biological activity that binds to FR ⁇ , including deletion, substitution, addition or insertion of one to several bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 3; (C) a polynucleotide encoding a protein having at least 90% sequence identity with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 and having biological activity binding to FR ⁇ ; (D) A polynucleotide encoding a protein having a biological activity that hybridizes with a base sequence complementary to
- the antibody comprises at least one complementarity determining region (CDR) in the amino acid sequence of the light chain variable region encoded by the polynucleotide shown in (a), (b), (c) or (d) below:
- CDR complementarity determining region
- the therapeutic agent for scleroderma according to any one of (1) to (8), comprising an amino acid sequence comprising (A) a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 4; (B) a polynucleotide encoding a protein having a biological activity of binding to FR ⁇ , comprising deletion, substitution, addition or insertion of one to several bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 4; (C) a polynucleotide encoding a protein having at least 90% sequence identity with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4 and having biological activity binding to FR ⁇ ; (D) A polynucleotide encoding a protein having a biological activity that hybridize
- the antibody comprises at least one complementarity determining region (CDR) in the amino acid sequence of the heavy chain variable region encoded by the polynucleotide shown in the following (a), (b), (c) or (d):
- CDR complementarity determining region
- the therapeutic agent for scleroderma comprising an amino acid sequence comprising (A) a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 5; (B) a polynucleotide encoding a protein having a biological activity of binding to FR ⁇ , comprising deletion, substitution, addition or insertion of one to several bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 5; (C) a polynucleotide encoding a protein having at least 90% sequence identity with the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 and having biological activity binding to FR ⁇ ; (D) A polynucleotide encoding a protein having a biological activity that hybridizes with a base sequence complementary to the base sequence shown in
- the antibody comprises at least one complementarity determining region (CDR) in the amino acid sequence of the light chain variable region encoded by the polynucleotide shown in (a), (b), (c) or (d) below:
- CDR complementarity determining region
- the therapeutic agent for scleroderma comprising an amino acid sequence comprising (A) a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 6; (B) a polynucleotide encoding a protein having a biological activity of binding to FR ⁇ , comprising deletion, substitution, addition or insertion of one to several bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 6; (C) a polynucleotide encoding a protein having at least 90% sequence identity to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 6 and binding to FR ⁇ ; (D) A polynucleotide that encodes a protein having a biological activity that hybridizes with a base sequence complementary to the base sequence shown in
- the antibody comprises at least one complementarity determining region (CDR) in the amino acid sequence of the heavy chain variable region encoded by the polynucleotide shown in (a), (b), (c) or (d) below:
- CDR complementarity determining region
- the therapeutic agent for scleroderma comprising an amino acid sequence comprising (A) a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 7; (B) a polynucleotide encoding a protein having a biological activity of binding to FR ⁇ , comprising deletion, substitution, addition or insertion of one to several bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 7; (C) a polynucleotide encoding a protein having at least 90% sequence identity with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7 and having biological activity binding to FR ⁇ ; (D) A polynucleotide that encodes a protein having a biological activity that hybridizes with a base sequence complementary to the base
- the antibody comprises at least one complementarity determining region (CDR) in the amino acid sequence of the light chain variable region encoded by the polynucleotide shown in (a), (b), (c) or (d) below:
- CDR complementarity determining region
- the therapeutic agent for scleroderma according to any one of (1) to (8), comprising an amino acid sequence comprising (A) a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 8; (B) a polynucleotide encoding a protein having a biological activity of binding to FR ⁇ , comprising deletion, substitution, addition or insertion of one to several bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 8; (C) a polynucleotide encoding a protein having at least 90% sequence identity with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 8 and having biological activity binding to FR ⁇ ; (D) A polynucleotide that encodes a protein having a biological activity that hybridize
- the antibody comprises at least one complementarity determining region (CDR) in the amino acid sequence of the heavy chain variable region encoded by the polynucleotide shown in (a), (b), (c) or (d) below:
- CDR complementarity determining region
- the therapeutic agent for scleroderma comprising an amino acid sequence comprising (A) a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 9; (B) a polynucleotide encoding a protein having a biological activity of binding to FR ⁇ , comprising deletion, substitution, addition or insertion of one to several bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 9; (C) a polynucleotide encoding a protein having at least 90% sequence identity with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 9 and having biological activity binding to FR ⁇ ; (D) A polynucleotide encoding a protein having a biological activity that hybridizes with a base sequence complementary to the base
- the antibody comprises at least one complementarity determining region (CDR) in the amino acid sequence of the light chain variable region encoded by the polynucleotide shown in (a), (b), (c) or (d) below:
- CDR complementarity determining region
- the therapeutic agent for scleroderma comprising an amino acid sequence comprising (A) a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 10; (B) a polynucleotide encoding a protein having a biological activity of binding to FR ⁇ , comprising deletion, substitution, addition or insertion of one to several bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 10; (C) a polynucleotide encoding a protein having at least 90% sequence identity with the base sequence shown in SEQ ID NO: 10 and binding to FR ⁇ ; (D) A polynucleotide encoding a protein having a biological activity that hybridizes with a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO
- the cytotoxins include Pseudomonas aeruginosa exotoxin, ricin A chain, deglycosylated ricin A chain, ribosome inactivating protein (a riboin inactivating protein (a riboin inactivating protein) protein, alpha-sarcin, gelonin, aspergillin, restrictocin, ribonuclease, epodophyllotoxin, and diphtheria Selected from the group ( ) - scleroderma treatment agent as claimed in any one of (16).
- an antibody that binds to a label and that binds to the folate receptor ⁇ (FR ⁇ ) defined in any one of (1) to (19) or a conjugate of the antibody and a cytotoxin or cytotoxic agent A diagnostic agent for scleroderma including the body.
- This specification includes the contents described in the specification and / or drawings of Japanese Patent Application No. 2013-054090 which is the basis of the priority of the present application.
- FIG. 1 is a graph showing skin infiltration of (A) CD68 positive macrophages and (B) FR ⁇ positive macrophages by bleomycin in a scleroderma model mouse.
- the vertical axis of the graph represents the number of macrophages (cells / HPF).
- FIG. 2 is an immunohistologically stained image showing infiltration of (A) CD68 positive macrophages and (B) FR ⁇ positive macrophages into the skin by bleomycin in a scleroderma model mouse.
- FIG. 1 is a graph showing skin infiltration of (A) CD68 positive macrophages and (B) FR ⁇ positive macrophages by bleomycin in a scleroderma model mouse.
- FIG. 2 is an immunohistologically stained image showing infiltration of (A) CD68 positive macrophages and (B) FR ⁇ positive macrophages into the skin by bleomycin in a scleroderma model mouse.
- FIG. 3 is a graph showing the measurement results of transforming growth factor- ⁇ (TGF- ⁇ ) mRNA and connective tissue growth factor (CTGF) mRNA one week after treatment with a recombinant anti-FR ⁇ immunotoxin in a scleroderma model mouse. It is.
- FIG. 4 is an immunohistologically stained image showing the expression of TGF- ⁇ 1 in CD68 positive macrophages and FR ⁇ positive macrophages in the skin of a scleroderma model mouse.
- TGF- ⁇ transforming growth factor- ⁇
- CTGF connective tissue growth factor
- FIG. 5 is a graph showing the number (%) of TGF- ⁇ 1 positive cells in CD68 positive macrophages and FR ⁇ positive macrophages in the skin of scleroderma model mice.
- FIG. 6 is a graph showing skin infiltration of (A) CD68-positive macrophages and (B) FR ⁇ -positive macrophages after 4 weeks of treatment with a recombinant anti-FR ⁇ immunotoxin in a scleroderma model mouse.
- the vertical axis of the graph represents the number of macrophages (cells / HPF).
- FIG. 7 is an immunohistologically stained image showing infiltration of CD68 positive macrophages and FR ⁇ positive macrophages into the skin 4 weeks after treatment with recombinant anti-FR ⁇ immunotoxin in a scleroderma model mouse.
- FIG. 8 shows (A) the amount of collagen in skin through hydroxyproline analysis (vertical axis: hydroxyproline amount ( ⁇ g / area)) after 4 weeks of treatment with a recombinant anti-FR ⁇ immunotoxin in a scleroderma model mouse, B) It is a graph which shows the result of having measured the skin thickness (vertical axis: skin thickness (mm)) of the mouse
- FIG. 9 is a photomicrograph of the skin thickness observed under a microscope 4 weeks after treatment with recombinant anti-FR ⁇ immunotoxin in a scleroderma model mouse.
- FIG. 10 is a photomicrograph of the skin thickness observed under a microscope 4 weeks after treatment with recombinant anti-FR ⁇ immunotoxin in a scleroderma model mouse.
- the scleroderma therapeutic agent according to the present invention is characterized by containing, as an active ingredient, a complex conjugated with an antibody that binds to folate receptor ⁇ (FR ⁇ ) and a cytotoxin or cytotoxic agent. It can selectively cause cell death of FR ⁇ -expressing macrophages and suppress skin fibrosis associated with the progression of scleroderma.
- FR ⁇ folate receptor ⁇
- cytotoxin or cytotoxic agent a cytotoxin or cytotoxic agent.
- the scleroderma therapeutic agent according to the present invention can also be referred to as a skin fibrosis inhibitor.
- FR ⁇ is a cell surface of a macrophage (hereinafter also referred to as scleroderma-related macrophage) localized in a lesion (ie, fibrotic cell) of scleroderma. Is a receptor protein expressed in FR ⁇ is not expressed or expressed at very low levels in macrophages in normal tissues and peripheral blood. Mammals include primates including humans, domestic animals such as cattle, pigs, horses, goats and sheep, and pet animals such as dogs and cats. A preferred mammal is a human.
- an “antibody that binds to folate receptor ⁇ (FR ⁇ )” is an antibody that can recognize and bind to the FR ⁇ protein, and as described below, the antibody comprises:
- the antibody may be an intact antibody, or an antibody fragment or a synthetic antibody (eg, a recombinant antibody, a bispecific antibody, a chimeric antibody, a humanized antibody, etc.) as long as it has binding affinity with scleroderma-related macrophages ).
- These antibodies also make it possible to bind to both scleroderma-associated macrophages and the fibrotic cells when cells fibrotic due to scleroderma express FR ⁇ on their surface.
- preferred antibodies are human antibodies or humanized antibodies.
- cytotoxin or “cytotoxic agent” refers to any substance capable of killing or damaging scleroderma-associated macrophages and, optionally, fibrotic cells.
- the complex as an active ingredient of the scleroderma therapeutic agent according to the present invention includes an antibody that binds to FR ⁇ as a molecular target expressed on the surface of a scleroderma-related macrophage, and the macrophage (and optionally, It is basically composed of a cytotoxin or cytotoxic agent that causes cell death of fibrotic cells).
- cell death means cell death, killing or damage, and is caused by a cytotoxin or cytotoxic agent.
- Cytotoxins are proteins called so-called toxins, whereas cytotoxic agents are low molecular weight chemotherapeutic agents, the former include toxins from microorganisms, especially bacteria, whereas the latter , Alkylating agents, antimetabolites, antibiotics, molecular targeted drugs, plant alkaloids, hormonal agents and the like.
- the complex in the present invention comprises the above antibody and cytotoxin, these components can take the form of a fusion protein.
- the cytotoxin can be preferably bound to the C-terminus of the antibody protein via a linker (for example, a peptide) as necessary.
- the complex in the present invention comprises the antibody and the cytotoxic agent
- these components can be bound covalently or non-covalently via a functional group for binding.
- 1.1 Antibody In the present invention, the above antibody specifically binds to FR ⁇ of scleroderma-associated macrophages.
- “specific” means that the antibody binds to FR ⁇ of the macrophage by an immunological reaction, but does not substantially bind to FR ⁇ or a protein other than a protein having 80% or more sequence identity. Means that.
- the above-mentioned antibody has FR ⁇ which is one of the isoforms of FR (for example, human FR ⁇ has about 70% amino acid sequence identity with human FR ⁇ (Japanese Patent Publication No. 2008-500025)). It is desirable not to combine.
- the antibody that can be used in the present invention is the whole antibody molecule or a fragment thereof that can bind to the antigen FR ⁇ protein or a partial peptide thereof.
- the partial peptide has 5 or more, preferably 7 or more, more preferably 8 or more consecutive amino acids.
- an antigenic epitope or antigenic determinant consists of about 5 to about 10 amino acids and has a continuous amino acid sequence or a discontinuous amino acid sequence.
- the antibody in the present invention may be any of a monoclonal antibody, a polyclonal antibody, a human antibody, or an antibody fragment thereof as long as it binds to FR ⁇ , and preferably binds specifically.
- the antibodies in the present invention may be of any immunoglobulin (Ig) class (IgA, IgG, IgE, IgD, IgM, etc.) and subclass (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, etc.).
- the light chain of the immunoglobulin may be either ⁇ or ⁇ .
- the antibody fragment in the present invention is, for example, Fab, Fab ′, F (ab ′) 2 , Fv, heavy chain monomer or dimer, light chain monomer or dimer, dimer composed of one heavy chain and one light chain, and the like.
- fragment production methods are known in the art, and can be obtained, for example, by digesting antibody molecules with proteases such as papain and pepsin, or by known genetic engineering techniques.
- the antibody in the present invention may also be a recombinant antibody, a chimeric antibody, a humanized antibody or the like. Recombinant antibodies include, for example, single chain antibodies (scFv), bispecific antibodies and the like.
- Bispecific antibodies refer to antibodies having two different binding specificities, and include, for example, diabody, ScDb (single chain diabody), dsFv-dsFv, etc. (Ryutaro Asano, Biochemistry 77 (12) 1497-1500, 2005).
- a method for producing an antibody for use in the present invention will be described in detail according to the description in International Publication No. 2010/098503.
- a protein to be used as an immunogen (antigen) that is, an FR ⁇ protein or a partial peptide thereof is first prepared.
- the partial peptide has a sequence consisting of 5 or more, preferably 7 or more consecutive amino acids.
- the origin of the FR ⁇ protein that can be used as an immunogen is not particularly limited as long as it can induce an antibody that can specifically bind to the target FR ⁇ .
- mammals such as humans and mice can be used.
- An FR ⁇ protein derived from an animal or a partial peptide thereof is used as an immunogen.
- the human FR ⁇ protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or a partial peptide thereof, or the mouse FR ⁇ protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or a partial peptide thereof can be used as the immunogen.
- the immunogen it is particularly preferred to use human FR ⁇ protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or a partial peptide thereof.
- the FR ⁇ protein or a partial peptide thereof can be prepared by a technique known in the art, for example, a solid phase peptide synthesis method, based on the amino acid sequence information (for example, SEQ ID NO: 1) of FR ⁇ .
- the sequence information of FR ⁇ derived from other mammals including humans is available from, for example, GenBank (NCBI, USA), EMBL (EBI, Europe) and the like.
- FR ⁇ protein or a partial peptide thereof can be produced using a genetic recombination technique.
- a DNA sequence encoding FR ⁇ protein is linked to an appropriate protein production vector, introduced into a host so that the target FR ⁇ protein or a partial peptide thereof can be expressed, and FR ⁇ protein or The partial peptide can be produced.
- This technique is well known to those skilled in the art, and a person skilled in the art can appropriately select the vector, host cell, transformation method, culture method, and target protein purification method employed in this case.
- gene recombination methods see, for example, Sambrook et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), Ausubel et al., Current Protocols in Mol 19 be able to.
- the antibody used in the present invention can be produced using the FR ⁇ protein prepared as described above or a partial peptide thereof as an immunogen.
- an antibody used in the present invention can be produced using an expression vector incorporating a DNA encoding a target FR ⁇ protein or a partial peptide thereof, or a mammalian cell expressing the protein or a partial peptide thereof as an immunogen. Also good.
- Polyclonal antibodies can be produced by immunizing mammals such as rabbits, rats, mice, etc. with the immunogen prepared as described above to obtain antisera.
- the above immunogen is administered intravenously, subcutaneously or intraperitoneally to a mammal together with an adjuvant for enhancing immunogenicity as necessary.
- the adjuvant commercially available complete Freund's adjuvant, incomplete Freund's adjuvant, aluminum hydroxide, alum, muramyl peptide (a kind of bacterial cell wall-related peptide) and the like can be used. Thereafter, immunization is performed 1 to 7 times at intervals of several days to several weeks, and after 1 to 7 days from the last immunization day, the antibody titer is measured by enzyme immunoassay such as ELISA, etc. Blood is collected on the day indicated to obtain antiserum. The antiserum thus obtained may be used as it is, or may be used after being purified once or several times on a column on which FR ⁇ protein or a partial peptide thereof is immobilized.
- Monoclonal antibodies that can be used in the present invention can be prepared as follows. That is, a hybridoma is prepared from antibody-producing cells (for example, spleen-derived lymphocyte cells, lymphoid cells, etc.) obtained from a mammal immunized as described above and myeloma cells having no autoantibody-producing ability. It can be produced by selecting a clone that produces a monoclonal antibody that is cloned and shows specific affinity for the antigen used for immunization. Hybridoma production methods are well known in the art, and can be performed, for example, according to the method of Kohler and Milstein et al. (Nature (1975) 256: 495-96).
- a mouse-mouse hybridoma clone 36b shown in Reference Example 1 below obtained by fusing a spleen cell of a mouse immunized with a human FR ⁇ -expressing cell and a mouse myeloma cell or Examples include monoclonal antibodies produced by clone 94b.
- a rat-rat hybridoma shown in Reference Example 1 below obtained by fusing a rat spleen cell immunized with a mouse FR ⁇ -expressing cell and a rat myeloma cell. The monoclonal antibody etc.
- the present invention includes a gene encoding an antibody containing an H chain or L chain of a monoclonal antibody produced by the hybridoma produced by the hybridoma as described above.
- These nucleic acids can be obtained from hybridomas by ordinary genetic engineering techniques, and their base sequences can also be determined by known base sequencing methods.
- the base sequences of the H chain variable region gene and L chain variable region gene of the monoclonal antibody produced by the mouse-mouse hybridoma clone 36b cell are shown in SEQ ID NOs: 3 and 4, respectively, and the monoclonal product produced by the mouse-mouse hybridoma clone 94b cell
- the nucleotide sequences of the H chain variable region gene and L chain variable region gene of the antibody are shown in SEQ ID NOs: 5 and 6, respectively.
- the nucleotide sequences of the H chain variable region gene and L chain variable region gene of the monoclonal antibody produced by rat-rat hybridoma clone CL5 are represented by SEQ ID NOs: 7 and 8, respectively, and rat-rat hybridoma clone CL10 is produced.
- the nucleotide sequences of the H chain variable region gene and L chain variable region gene of the monoclonal antibody are shown in SEQ ID NOs: 9 and 10, respectively.
- the present invention relates to the heavy chain variable region genes (for example, SEQ ID NOs: 3, 5, 7, and 9) and L chain variable region genes (for example, SEQ ID NOs: 4, 6, and 8) of monoclonal antibodies produced by the hybridomas prepared as described above.
- mutants include the following.
- the term “several” used in the context of heavy chain and light chain variable region genes refers to 1 to 20, preferably 1 to 15, more preferably 1 to 10.
- “substantially identical” used in the context of the heavy chain and light chain variable region genes refers to the heavy chain variable region gene of a monoclonal antibody produced by the hybridoma prepared as described above (for example, SEQ ID NO: 3 5, 7, 9), light chain variable region genes (eg, SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 10) and at least 80%, preferably at least 85%, more preferably at least 90%, more preferably at least 95% , 96%, 97%, 98% or 99% identity.
- the determination of percent identity between two sequences is described, for example, in Carlin and Altshur as modified in Karlin and Altschul (1993) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877). (1990) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264). This type of algorithm is described in Altshur et al. (1990) J. MoI. Mol. Biol. 215: 403 incorporated into NBLAST and XBLAST programs.
- Gapped BLAST may be used.
- PSI-BLAST can be used to perform an iterated search that detects distant associations between molecules.
- BLAST, Gapped BLAST, and PSI-BLAST programs the default parameters of the respective programs (eg, XBLAST and NBLAST) can be used (see http://www.ncbi.nlm.nih.gov.). ).
- Other preferred examples of algorithms that can be used for sequence comparison are, for example, the algorithm of Myers and Miller (1988), CABIOS 4: 11-17.
- washing conditions include conditions such as continuous washing at room temperature with a solution containing 2 ⁇ SSC and 0.1% SDS, and a 1 ⁇ SSC solution and a 0.2 ⁇ SSC solution.
- the combinations of the above conditions are exemplary, and those skilled in the art will understand the above or other factors that determine the stringency of hybridization (for example, hybridization probe concentration, length and GC content, hybridization reaction). It is possible to achieve the same stringency as above by appropriately combining the time and the like.
- “equivalent” means that biological activities such as binding specificity and binding affinity for the FR ⁇ antigen are substantially the same.
- the term may include a case where the activity is substantially the same, and the term “same quality” as used herein means that the nature of the activity such as specific binding to the FR ⁇ antigen is the same, or physiological A property, pharmacological property, or biological property is the same.
- stringent conditions in these hybridizations are described in, for example, Sambrook et al. (Above), Ausubel et al. (Above), etc., and these conditions may be used in the present invention.
- the mutants may be naturally occurring or artificially introduced with mutations. Artificial mutation can be introduced by a conventional method using, for example, site-specific mutagenesis (Proc Natl Acad Sci USA., 1984 81: 5652; Sambrook et al.
- a recombinant antibody can also be produced using a gene recombination technique.
- a gene encoding a monoclonal antibody is cloned from the prepared hybridoma, and incorporated into an appropriate vector, which is, for example, a mammalian cell line such as Chinese hamster ovary (CHO) cell, Escherichia coli, yeast cell, insect cell, It can be introduced into a host such as a plant cell to produce a recombinant antibody in the host (PJ Delves., ANTIBODY PROSECTION TECHNIQUE TECHNIQUES., 1997 WILEY, P.
- CHO Chinese hamster ovary
- human antibody-producing animals such as mice and cows lacking the endogenous antibody gene and carrying the human antibody gene are also known, so when using such animals
- fully human antibodies that bind to human FR ⁇ can be obtained (for example, International Publication WO96 / 9634096, WO96 / 33735, WO98 / 24893, etc.).
- hybridomas prepared from antibody-producing cells (for example, B cells) and myeloma cells of the animal are cultured in vitro, monoclonal antibodies can also be produced by the method described above.
- the hybridoma is grown, maintained and stored according to various conditions such as the characteristics of the cell type to be cultured, the purpose of the test research and the culture method, and used to produce a monoclonal antibody in the culture supernatant. It is possible to carry out using any nutrient medium prepared from any known nutrient medium or basal medium.
- the produced monoclonal antibody is appropriately combined with methods well known in the art, such as chromatography using a protein A or protein G column, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, ammonium sulfate precipitation, gel filtration, affinity chromatography, etc. Can be purified.
- the antibodies that can be used in the present invention can also be chimeric antibodies.
- Chimeric antibodies are described, for example, in Morrison et al. , 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 6851-6855; Neuberger et al. , 1984, Nature, 312: 604-608; Takeda et al. , 1985, Nature, 314: 452-454. In these techniques, genes from mouse antibody molecules with appropriate antigen specificity are spliced with genes from human antibody molecules with appropriate biological activity.
- a chimeric antibody is a molecule in which different portions are derived from different animal species. Examples of the chimeric antibody include an antibody having an H chain and / or L chain variable region of an anti-FR ⁇ mouse or rat monoclonal antibody and an immunoglobulin constant region derived from another mammal.
- a part of a variable region including a variable region or a hypervariable region derived from, for example, a mouse or rat monoclonal antibody, a human immunoglobulin constant region, or a part of a human immunoglobulin variable region and a constant region, And, for example, a “humanized antibody”.
- the mouse-derived antibody region is preferably less than about 10%.
- the humanized antibody is, for example, at least one complementarity determining region (CDR1, 2) in the amino acid sequence of the heavy chain variable region and / or the light chain variable region of an anti-human FR ⁇ mouse monoclonal antibody (or anti-mouse FR ⁇ rat monoclonal antibody).
- an amino acid sequence comprising 3 More specifically, the following antibodies can be exemplified.
- An amino acid comprising at least one complementarity determining region (CDR) in the amino acid sequence of the light chain variable region encoded by the polynucleotide shown in the following (a), (b), (c) or (d) Antibodies containing sequences: (A) a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 6; (B) a polynucleotide encoding a protein having a biological activity of binding to FR ⁇ , comprising deletion, substitution, addition or insertion of one to several bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 6; (C) a polynucleotide encoding a protein having at least 90% sequence identity to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 6 and binding to FR ⁇ ; (D) A polynucleotide that encodes a protein having a biological activity that hybridizes with a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 6 under stringent conditions and binds to FR ⁇ .
- CDR complementar
- a suitable human acceptor antibody sequence for the mouse donor sequence can be identified by computer comparison of the amino acid sequence of the mouse variable region with the H or L chain sequence of a known human antibody.
- a variable domain from a human antibody whose framework sequence exhibits high sequence identity with the framework regions of the murine light chain variable region and the heavy chain variable region is a Kabat that utilizes NCBI BLAST (USA) using the murine framework sequence.
- an acceptor sequence that shares 80% or more, preferably 90% or more of the sequence identity with the mouse donor sequence can be selected.
- suitable human acceptor antibody sequences can be identified. Based on the nucleotide sequences encoding the human acceptor antibody H chain and L chain sequences thus identified, recombination is performed so that a part of the variable region is replaced with that of the mouse antibody.
- a humanized antibody can be cloned and produced by incorporating the DNA encoding the obtained human / mouse chimeric H chain and L chain into an expression vector and transforming it into an appropriate host cell.
- the chimeric antibody and humanized antibody as described above have an advantage that antigenicity can be reduced when applied to humans.
- Antibodies used in the present invention are also described, for example, in US Pat. No.
- the single chain antibody used in the present invention is, for example, the above-described monoclonal antibody heavy chain variable region (for example, SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9) and L chain variable region gene (for example, SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10).
- cytotoxin that can be used in the present invention is any cytotoxin that can be used for the purpose of inducing cell death of scleroderma-associated macrophages, such as Pseudomonas aeruginosa exotoxin, ricin.
- a chain (ricin A chain), deglycosylated ricin A chain (deglycosylated ricin A chain), ribosome inactivating protein, alpha-sarcin (alpha-sarcin), geronin (gerlinin) ), Strictricin, ribonuclease, epodophylloxin (epidophyll) lotoxin), diphtheria toxin (diphtheria toxin), and the like.
- a Pseudomonas aeruginosa exotoxin such as PE38.
- the cytotoxic agent that can be used in the present invention can be appropriately selected from alkylating agents, antimetabolites, antibiotics, molecular target drugs, plant alkaloids, hormone agents, and the like.
- Such cytotoxic agents are preferably those that can kill scleroderma-associated macrophages.
- a cytotoxic agent capable of inducing the death of fibrotic cells can be used.
- the recombinant immunotoxin in the present invention is a chimeric molecule in which the antibody that binds to a target (ie, FR ⁇ protein) is conjugated to a cytotoxin or a subunit thereof.
- cytotoxins derived from plants and bacteria, cytotoxins of human origin, and synthetic cytotoxins can be used.
- Conjugation of an antibody and a cytotoxin can be performed as follows. That is, by using a reactive group (for example, amino group, carboxyl group, hydroxyl group, etc.) in an antibody molecule and bringing the antibody into contact with a cytotoxin having a functional group capable of reacting with the reactive group, a recombinant immunogen is contacted.
- a reactive group for example, amino group, carboxyl group, hydroxyl group, etc.
- Toxins can be obtained.
- Either a heavy chain fragment or a light chain fragment is made as a fusion protein with a cytotoxin, and a single chain antibody or a double chain antibody is formed via SH bond together with the other fragment not fused with the cytotoxin.
- Recombinant protein may be produced by forming it.
- the binding of the H chain fragment and the L chain fragment via the SH bond can be achieved by exposing the mercapto group (-SH group) with a reducing agent such as ⁇ -mercaptoethanol or dithiothreitol and then mixing the two together.
- a reducing agent such as ⁇ -mercaptoethanol or dithiothreitol
- a recombinant immunotoxin which is a recombinant immunotoxin of a monoclonal antibody produced by the mouse-mouse hybridoma clone 36b cell or clone 94b and Pseudomonas aeruginosa exotoxin.
- a mouse-mouse hybridoma clone 36b and a Pseudomonas aeruginosa exotoxin recombinant immunotoxin are, for example, a single chain or a double chain consisting of a heavy chain consisting of the polypeptide shown in SEQ ID NO: 11 and a light chain consisting of the polypeptide shown in SEQ ID NO: 12. This is a chain antibody.
- a recombinant immunotoxin of a monoclonal antibody produced by the mouse-mouse hybridoma clone 94b and Pseudomonas aeruginosa exotoxin is, for example, an H chain composed of the polypeptide shown in SEQ ID NO: 13 and an L chain composed of the polypeptide shown in SEQ ID NO: 14. Single-chain or double-chain antibody.
- Another example of the complex used in the present invention is a conjugate of an antibody that binds to FR ⁇ and a cytotoxic agent.
- a cytotoxic agent can be bound to the constant region of the antibody, preferably the C-terminal side.
- Binding is the NH of the antibody protein 2 It can be carried out by using a group, an SH group, an OH group, a COOH group, etc., and chemically binding this to a cytotoxic agent having a reactive functional group, for example, via a hydrocarbon linker.
- Therapeutic agent The complex thus prepared can target FR ⁇ that is highly expressed specifically in scleroderma-related macrophages, induce cell death of scleroderma-related macrophages, and suppress skin fibrosis.
- the complex such as recombinant immunotoxin in the present invention is a complex that can be used for therapeutic purposes such as missile therapy and has a therapeutic effect on scleroderma.
- the complex in the present invention is formulated as a scleroderma therapeutic agent containing this as an active ingredient. That is, the therapeutic agent for scleroderma according to the present invention contains a therapeutically effective amount of the complex.
- therapeutically effective amount refers to an amount that can give a therapeutic effect for a given symptom or usage, and the sex, age, weight, severity of the disease to which the scleroderma therapeutic agent is applied, It varies according to various factors such as administration route.
- a 60 kg adult may contain as a therapeutically effective amount an amount of the complex of the present invention administered in an amount of 200 ⁇ g or more, preferably 500 ⁇ g or more per day.
- the scleroderma therapeutic agent according to the present invention includes physiologically acceptable pharmaceutical additives such as diluents, preservatives, solubilizers, emulsifiers, adjuvants, antioxidants, isotonic agents in addition to the complex.
- physiologically acceptable pharmaceutical additives such as diluents, preservatives, solubilizers, emulsifiers, adjuvants, antioxidants, isotonic agents in addition to the complex.
- an agent, an excipient and a carrier can be included. It may also be a mixture with other drugs effective for the treatment of scleroderma. Examples of such drugs include anti-TGF- ⁇ antibody, immunoglobulin, prostaglandin E1, and the like.
- the therapeutic agent for scleroderma according to the present invention can be formulated for oral administration or parenteral administration (ie, intravenous or intramuscular administration) by injection, for example, bolus injection or continuous infusion.
- injectable formulations may be presented in unit dosage form, for example in ampoules or multi-dose containers, with the addition of preservatives.
- the therapeutic agent for scleroderma according to the present invention may be a lyophilized powder for reconstitution before use with a suitable vehicle such as sterile pyrogen-free water.
- a suitable vehicle such as sterile pyrogen-free water.
- the therapeutic agent for scleroderma according to the present invention may be directly brought into contact with the affected area of the patient.
- the subject to which the scleroderma therapeutic agent according to the present invention is applied is not particularly limited, and patients suffering from scleroderma (particularly patients suffering from early scleroderma), patients treating scleroderma, etc. Any of these may be used.
- the subject is not limited to a human but may be a mammal other than a human. Examples of mammals other than humans include humans, mice, rats, monkeys, rabbits, dogs, cats and the like.
- the present invention also relates to a method for treating scleroderma comprising administering to the scleroderma patient a therapeutically effective amount of the above-mentioned complex or scleroderma therapeutic agent.
- a method for treating scleroderma comprising administering to the scleroderma patient a therapeutically effective amount of the above-mentioned complex or scleroderma therapeutic agent.
- a skin tissue sample derived from a subject is treated with the antibody or complex (labeled with a label such as a fluorophore, a dye, a radioisotope, etc.) described in Section 1 above ( Scleroderma diagnostic agent), or non-labeled antibody or complex), and the presence or absence of scleroderma with the presence of FR ⁇ -expressing scleroderma-related macrophages or the infiltration of the macrophages into the skin as an index, and A method for measuring (testing) the risk of having the disease is provided.
- the antibody or complex label such as a fluorophore, a dye, a radioisotope, etc.
- a skin tissue sample derived from a subject is treated with the above-mentioned antibody or complex (an antibody or complex labeled with a fluorophore, a dye, a radioisotope, etc. (scleroderma diagnostic agent), or an unlabeled antibody. Or a complex) to determine whether FR ⁇ -expressing macrophages are present in the skin tissue or whether FR ⁇ -expressing macrophages are infiltrating into the skin tissue, and a negative control (for example, a skin tissue sample of a healthy person) ), The presence of scleroderma can be examined when FR ⁇ -expressing macrophages are significantly present or infiltrated into the skin tissue.
- the present invention provides a skin tissue sample derived from a subject who has undergone or has undergone scleroderma treatment, and an antibody or complex (an antibody labeled with a label such as a fluorophore, a dye, a radioisotope, or the like)
- an antibody or complex an antibody labeled with a label such as a fluorophore, a dye, a radioisotope, or the like
- the term “determining” means a means for presenting information or data of test results to a doctor, not intended for a doctor's judgment, that is, medical practice, and assisting the doctor's judgment. To do. Thus, the term “determining” can be replaced with terms such as “measuring”, “inspecting”, “determining” or “assessing”.
- the present invention further provides a scleroderma diagnostic agent or a scleroderma diagnostic kit for use in the measurement or determination method and the like.
- the scleroderma diagnostic agent or scleroderma diagnostic kit can contain the above antibody or complex, or a complex in which a label is further bound to the above antibody or complex.
- the label examples include a fluorophore (for example, GFP), a dye, and a radioisotope (for example, 18 F-FDG) and the like.
- Detection of FR ⁇ -expressing macrophages with the above antibody or complex can be performed by ELISA, fluorescent antibody method, radioimmunoassay, sandwich method, tissue staining method and the like.
- an antibody for example, peroxidase, alkaline phosphatase, etc.
- a fluorophore for example, FITC, tetramethylrhodamine, Texas red, etc.
- a dye a radioactive isotope or the like is used.
- the antibody or complex bound to the macrophages is detected.
- the binding of the label includes a chemical binding method, a binding method using a biotin- (strept) avidin system, and the like.
- a pharmaceutically acceptable radionuclide or luminescent substance is labeled on the above-mentioned antibody or complex, the antibody or complex is administered to a subject, and diagnostic imaging techniques such as PET / CT are used. Images can then be taken to determine or examine the presence of FR ⁇ -expressing scleroderma-related macrophages or skin infiltration.
- the scleroderma diagnosis kit includes, in addition to the above-mentioned (labeled or unlabeled) antibody or complex, or a contrast agent containing them, a buffer for use in measurement, a labeled secondary antibody, etc. And instructions for use describing the measurement procedure. Reagents are sealed in separate containers.
- Reagents are sealed in separate containers.
- rheumatoid synovium or Balb / c mouse liver cDNA was separately added to Bioneer PCR premix (Bioneer), and a sense primer adjusted to 10 pmoles (human rheumatic synovium: agaagacatgggtctggaatggatg (SEQ ID NO: 15); Mouse liver: tctagaaaagacatgggcctggaaaagag (SEQ ID NO: 16)) and antisense primer (human rheumatoid synovium: gactgaactcaggcaaggccagagagtt (SEQ ID NO: 17); By performing 30 cycles of PCR at 72 ° C for 60 seconds and then reacting at 72 ° C for 5 minutes, Amplified mouse FR ⁇ .
- the amplified FR ⁇ gene PCR product was ligated to the plasmid PCR2.1-TOPO (Invitrogen). Specifically, 1 ⁇ L of NaCl solution, 1.5 ⁇ l of sterilized distilled water and 1 ⁇ L of vector plasmid (PCR2.1-TOPO) were added to 2.5 ⁇ l of PCR product, and incubated at room temperature for 5 minutes, 2 ⁇ L of which was E. coli (TOP10F ′) In addition to this, the mixture was reacted in ice for 30 minutes, heat-treated at 42 ° C. for 30 seconds, allowed to stand in ice for 2 minutes, added with 250 ⁇ L of SOC medium, and then cultured in a shaker at 37 ° C. for 1 hour.
- PCR2.1-TOPO E. coli
- the cells were plated on LB medium and cultured overnight at 37 ° C.
- cultivation the white colony extract
- Plasmid purification was performed with Qiagen plasmid purification kit (Qiagen).
- Qiagen Qiagen plasmid purification kit
- the incorporated FR ⁇ gene is treated with the restriction enzyme EcoRI and then developed into agarose electrophoresis. After confirming the FR ⁇ gene product of about 0.8 kb (782 bp), the site is excised, and the extraction of the gene product is performed using the Qiagen PCR purification kit.
- 1x10 7 Sense primers human rheumatoid synovium: agaagacatgggtctgagaatggagtg (SEQ ID NO: 15); mouse liver: tctagaaaagacatgaggagggaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggagtgaggaggaggaggagtgaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggagg
- FR ⁇ expressing mouse B300-19 cells or rat RBL2H3 cells 7 The mixture was mixed with Freund's complete adjuvant, and immunized intraperitoneally at three sites in the tail of Balb / C mice (for anti-human FR ⁇ monoclonal antibody) or Whister Kyoto rats (for anti-mouse FR ⁇ monoclonal antibody). This immunization was repeated 2 to 4 times.
- Monoclonal antibodies were prepared according to the method of Koler (Kohler & Milstein, Nature (1975) 256: 495-96). That is, spleen or iliac lymph nodes were taken out and dissociated into single cells. The dissociated cells are fused with myeloma-derived cells (NS-1) to prepare hybridomas, cultured in a HAT selective medium, and the antibody secreted in the culture supernatant is compared with the FR ⁇ -expressing cells. Sorting was performed by reactivity. The obtained hybridoma was cloned by limiting dilution culture adjusted to 1 cell per well of a 96-well plate. Cloned cells were selected based on reactivity with FR ⁇ -expressing cells.
- 1x10 cloned hybridomas 7 The ascites was adjusted by administration into nude mice, and the monoclonal antibody was purified with Protein G column (GE Bioscience). The isotype of purified mouse and rat monoclonal antibodies was determined using an isotyping ELISA kit (Pharmingen). As a result, two IgG2a type clone 36b and IgG1 type 94b were obtained as anti-human FR ⁇ mouse monoclonal antibodies, and two IgG2a type CL5 and CL10 were obtained as anti-mouse FR ⁇ rat monoclonal antibodies. The reactivity of each antibody to the antigen was analyzed by flow cytometry.
- VH and VL heavy chain gene variable region (VH) and light chain gene variable region (VL) genes of anti-human FR ⁇ mouse monoclonal antibody and anti-mouse FR ⁇ rat monoclonal antibody
- Mouse hybridoma clones 36b and 94b were 1 ⁇ 10 7 Each was individually prepared, and cDNA was synthesized with cDNA synthesis kit (Invitrogen).
- VH and VL genes were determined by PCR using Ig-Prime Kit. PCR conditions were performed according to the attached instructions. That is, PCR was performed at 94 ° C. for 60 seconds, 50 ° C. for 60 seconds, and 72 ° C. for 120 seconds, and then reacted at 72 ° C.
- VH and VL PCR products were ligated to plasmid PCR2.1-TOPO (Invitrogen) and introduced into E. coli (TOP10F ′).
- the plasmid was purified from the introduced E. coli, and the VH and VL base sequences of 36b and 94b were determined.
- the nucleotide sequence was subjected to PCR using the BigDye Terminator V3.1 cycle sequencing kit (ABI), and the PCR product was analyzed with ABI 310 DNA sequencer. 1 ⁇ 10 rat hybridoma clones CL5 and CL10 7 Each was individually prepared, and cDNA was synthesized with cDNA synthesis kit (Invitrogen).
- VH and VL genes were amplified by PCR using Ig-Prime Kit and a primer designed for rat VH amplification (caccatggagtttattttgag (SEQ ID NO: 19)).
- the amplified VH and VL PCR products were ligated to plasmid PCR2.1-TOPO (Invitrogen) and introduced into E. coli (TOP10F ′).
- TOP10F ′ E. coli
- the plasmid was purified from E. coli and the VH and VL base sequences were determined.
- the nucleotide sequence was subjected to PCR using BigDye Terminator V3.1 cycle sequencing kit (ABI) and analyzed with ABI 310 DNA sequencer. 1-2.
- a primer designed to mutate the 63rd amino acid glycine (base sequence ggc) of the immunoglobulin heavy chain gene variable region (VH) of the anti-human FR ⁇ mouse monoclonal antibody 94b to cysteine (base sequence tgt) was prepared (sense primer) : Cagaggcctgaactattgtctggagtggattggaag (SEQ ID NO: 20), antisense primer: cttccatatccactccagaactgttcggccctctg (SEQ ID NO: 21)), quick change site-directed strain Mutagenesis treatment was performed on 1-TOPO 94bVH.
- the DNA after the reaction was introduced into Escherichia coli XL1-Blue and selectively cultured in an LB medium containing 0.1 mg / mL ampicillin.
- the plasmid of the selected transformant was purified by QIAprep spin Miniprep KIT (Qiagen).
- the base sequence was determined with the Big Dye Terminator v3.1 cycle sequencing kit (ABI) and the ABI310 sequencer, and it was confirmed that the 63rd glycine was mutated to cysteine (base sequence tgt).
- Each annealing primer has NdeI, which is a restriction enzyme. By cloning at this site, a protein having atg as a start codon can be expressed. In addition, a HindIII site is inserted into the other annealing primer, and by cloning at this site, it is possible to express a fusion protein in which the VH and PE genes are bound.
- the PCR product is purified, the restriction enzymes NdeI (New England Biolabs) and HindIII (New England Biolabs) are added to the purified product, the reaction is performed, and the gel is developed using QIAquick gel extraction kit (Qiagen).
- the DNA of the desired size was recovered from.
- pRK79PE38 treated with the same restriction enzyme as the mutation-introduced VH treated with the restriction enzyme was added, and ligation reaction between VH and pRK79PE38 was performed using Ligation High (Toyobo). After completion of the ligation reaction, the gene was introduced into E.
- coli TOP10F ′ (Invitrogen), and a transformant was selected in an LB medium containing 0.1 mg / mL ampicillin.
- the plasmid pRK79-VHPE of the selected transformant was purified by QIAprep spin Miniprep KIT (Qiagen). Furthermore, the base sequence was determined using the Big Dye Terminator v3.1 cycle sequencing kit (ABI) and the ABI310 sequencer, and it was confirmed that the base sequence of the mutagenized VH was linked to the PE38 base sequence of the pRK79 vector.
- a primer designed to mutate the 125th amino acid of the immunoglobulin light chain gene variable region (VL) of the anti-human FR ⁇ mouse monoclonal antibody 94b to cysteine (base sequence tgt) was prepared (sense primer: taagaaggagataatagataggacatgtgtgagtcacatc (SEQ ID NO: 28).
- This primer contains the base catatg that can be cleaved by the restriction enzyme NdeI, so that the protein can be expressed with atg as the start codon by cloning at this site); antisense primer: gctttgttagcaggccgaattccttttttattcccgtctgtgcccaaccgacc 29 ) (This primer contains the 125th amino acid. Stain mutated to (tgt), are designed as throughout Subsequently restriction enzymes EcoRI cleavable base gaattc comes codon tag)).
- a primer designed to mutate the 125th amino acid of the immunoglobulin light chain gene variable region (VL) of the anti-mouse FR ⁇ rat monoclonal antibody CL10 to cysteine (base sequence tgt) was prepared (atacatatggacatgtgcatccccatctcccatcc (SEQ ID NO: 30). And gctttgttagcagccgaattccttattgatttttccagctttgggtcccaacaaccgaacgt (SEQ ID NO: 31)).
- PCR of pCR2.1-TOPO-94bVL plasmid was performed using these primer combinations and pfu DNA polymerase (Stratagene). In this reaction, PCR was performed at 94 ° C. for 20 seconds, 55 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 60 seconds, and then reacted at 72 ° C. for 5 minutes. Next, the PCR product is purified, the restriction enzymes NdeI (New England Biolabs) and EcoRI (New England Biolabs) are added to the purified product, the reaction is performed, and the gel is developed using QIAquick gel extraction kit (Qiagen). The DNA of the desired size was recovered from.
- NdeI New England Biolabs
- EcoRI New England Biolabs
- pRK79PE38 treated with the same restriction enzyme as that of the mutation-introduced VL treated with restriction enzyme was added, and ligation reaction between VH and pRK79PE38 was performed using Ligation High (Toyobo).
- the gene was introduced into E. coli TOP10F ′ (Invitrogen), and a transformant was selected in an LB medium containing 0.1 mg / mL ampicillin.
- the plasmid pRK79-VLPE of the selected transformant was purified by QIAprep spin Miniprep KIT (Qiagen).
- the base sequence was determined with the Big Dye Terminator v3.1 cycle sequencing kit (ABI) and the ABI310 sequencer, and the 125 amino acids of the mutagenized VL were mutated to cysteine, and the start codon tag was placed. confirmed.
- coli into which the gene was introduced was carried out by culturing at 37 ° C. for 15 to 18 hours in an LB medium containing 0.1 mg / mL ampicillin. After completion of the selection, Escherichia coli was cultured in a 1000 mL super broth medium at 37 ° C. until reaching 1.0-1.5 at a visible absorbance of 600 nm. After culturing, IPTG (isopropyl-beta-D-thio-galactopyranoside) was added to the medium to a final concentration of 1 mM, and further cultured at 37 ° C. for 90 minutes.
- IPTG isopropyl-beta-D-thio-galactopyranoside
- Escherichia coli was collected by centrifugation, and suspended in 200 mL using 50 mM Tris buffer (pH 7.4, containing 20 mM EDTA). After the suspension, egg white lysozyme was added to a final concentration of 0.2 mg / mL and reacted at room temperature for 1 hour to destroy E. coli. After destruction, the precipitate was collected by centrifugation at 20,000 ⁇ g.
- the precipitate was further suspended in 50 mM Tris buffer (pH 7.4, containing 2.5% Triton X-100, 0.5 M NaCl, 20 mM EDTA) to 200 mL, and egg white lysozyme was added to a final concentration of 0.2 mg / mL. And allowed to react at room temperature for 1 hour. After completion of the reaction, the mixture was centrifuged at 20,000 ⁇ g to collect the precipitate. The precipitate was further suspended in 200 mL with 50 mM Tris buffer (pH 7.4, containing 2.5% Triton X-100, 0.5 M NaCl, 20 mM EDTA), mixed well, and centrifuged at 20,000 ⁇ g.
- 50 mM Tris buffer pH 7.4, containing 2.5% Triton X-100, 0.5 M NaCl, 20 mM EDTA
- VHPE 0.5 mL of VHPE and 0.25 mL of VL were mixed, dithiothreitol (DTT) was added to a final concentration of 10 mg / mL, and reduction treatment was performed at room temperature for 4 hours. After the treatment, it was dissolved in 75 mL of 0.1 M Tris buffer (pH 8.0, containing 0.5 M arginine, 0.9 mM oxidized glutathione, 2 mM EDTA). By leaving this solution at 10 ° C. for 40 hours, VH and VL were combined.
- DTT dithiothreitol
- the mixture was concentrated to 5 mL with a 10,000-centrifugal centrifugal concentrator (Centricon 10, Amicon), and further diluted with 50 mL of Tris buffer (pH 7.4, containing 0.1 M urea, 1 mM EDTA). This diluted solution was used as a starting material for purification of recombinant immunotoxin.
- Tris buffer pH 7.4, containing 1 mM EDTA
- the adsorbed recombinant immunotoxin was eluted with Tris buffer (pH 7.4, containing 0.3 M NaCl, 1 mM EDTA).
- the eluted sample was dialyzed with Tris buffer (containing pH 7.4, 1 mM EDTA), and further purified with an ion exchange column POROS HQ (POROS). That is, by adsorbing the dialyzed purified substance at a flow rate of 10 mL / min, washing with Tris buffer (containing pH 7.4, 1 mM EDTA), and setting a NaCl gradient from 0 M to 1.0 M in the buffer. Recombinant type immunotoxin was eluted.
- TSK300SW Tosoh gel filtration chromatography.
- endotoxin in the TSK300SW column was removed by washing with 75% disinfecting ethanol for 48 hours.
- it was washed with distilled water for injection in Japanese Pharmacopoeia, and then the TSK300SW column was equilibrated with Japanese Pharmacopoeia physiological saline.
- recombinant type immunotoxin was administered, and the eluate from the column was collected at a flow rate of 0.25 mL / min.
- SDS-PAGE polyacrylamide electrophoresis containing sodium dodecyl sulfate
- SDS-PAGE polyacrylamide electrophoresis containing sodium dodecyl sulfate
- SDS sodium dodecyl sulfate
- SDS sodium dodecyl sulfate
- An aqueous solution containing 130 mM glycine and 25 mM Tris was used. Each sample was adjusted with 100 mM Tris buffer pH 6.5 containing SDS at a final concentration of 0.1%, and boiled for 5 minutes.
- 100 ⁇ l of the sterile bleomycin solution was subcutaneously injected daily into the right skin of the mouse, and 100 ⁇ l of phosphate buffer as a control group was subcutaneously injected daily into the left skin of the same mouse. All injections were made at a defined site around 8-9 mm in diameter. This experiment was divided into two sets. In one set, three mice were sacrificed 3 days, 1 week, 2 weeks and 4 weeks after bleomycin injection, and macrophage infiltration into bleomycin-injected skin and control skin was examined. In another set, treatment with the recombinant anti-FR ⁇ immunotoxin prepared in Reference Example 1 by intravenous injection from the day after the start of bleomycin injection was performed in combination.
- Recombinant anti-FR ⁇ immunotoxin used in this example is an anti-mouse FR ⁇ anti-mouse FR ⁇ rat monoclonal antibody CL10-derived immunoglobulin heavy chain variable region (VH) and Pseudomonas aeruginosa exotoxin (PE38) linked to anti-mouse FR ⁇ . It is a double-chain Fv anti-FR ⁇ immunotoxin comprising an immunoglobulin light chain variable region (VL) derived from rat monoclonal antibody CL10.
- VH immunoglobulin heavy chain variable region
- PE38 Pseudomonas aeruginosa exotoxin
- TGF- ⁇ transforming growth factor- ⁇
- CGF connective tissue growth factor
- mice were sacrificed and the central site skin of the bleomycin injection was taken with a biopsy 5 mm diameter Thelma punch. Subsequently, in order to observe the anti-fibrotic effect of the recombinant anti-FR ⁇ immunotoxin, 30 mice were randomly divided into three groups, and the recombinant anti-FR ⁇ immunogen in an amount of 0.25 mg / kg / 100 ⁇ l / mouse in one group.
- Toxin was injected into the tail vein, and another set of control VHPE lacking the FR ⁇ binding site (VH chain lacking antibody binding and Pseudomonas aeruginosa toxin) was injected into the tail vein in an amount of 0.25 mg / kg / 100 ⁇ l / mouse. In another set, 100 ⁇ l of phosphate buffer was injected into the tail vein. The administration of subcutaneous injection of bleomycin was carried out once every 3 days from the next day for 2 weeks for a total of 5 times, followed by 2 weeks after administration of bleomycin alone, that is, 4 weeks later, to examine the antifibrotic effect. In addition, all the above-mentioned experiments were conducted as duplicate experiments.
- TOYOBO RNase Inhibitor
- Each total RNA sample obtained was adjusted so that the total RNA amount was 800 ng and the volume was 7 ⁇ l, and used for reverse transcription PCR.
- reverse transcription PCR RNA was denatured by first incubating at 65 ° C. for 5 minutes and then rapidly cooling on ice.
- CTGF probe sequence-GCCCTGCCCTAGCTGCCTACCGACT SEQ ID NO: 32
- Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) probe sequence-GGTGTGAACGGATTTGGCCGATTTG (SEQ ID NO: 33)
- TGF- ⁇ 1 probe sequence-CTATTGCCTTCAGCTCCCAGAGAAG SEQ ID NO: 34.
- One sample of the control skin of the control group was used as a reference gene, diluted at a ratio of 1, 1/2, 1/4, and 1/8 and reacted to prepare a standard curve. For all measurements, duplicate wells were placed and averaged.
- the measurement result is a relative quantification expressed as a ratio to the reference target gene, with the GAPDH gene used as an endogenous control, corrected for the ratio of the same sample as the target gene.
- the sections were then washed with phosphate buffer and incubated with non-serum protein block reagent (Dako) for 1 hour at room temperature to suppress nonspecific reactions.
- Rat anti-mouse CD68 (macrophage marker) or rat anti-mouse FR ⁇ as a primary antibody was reacted with the sections at a concentration of 5 ⁇ g / ml for 1 hour at room temperature.
- a peroxidase-labeled anti-rat secondary antibody manufactured by Nichirei
- P-dimethylaminobenzaldehyde is melted in a ratio of 30% peroxide acid (60% solution) in 70% Methylcellosolve.
- the sample was reacted at 60 ° C. for 20 minutes, and then the absorbance at 550 nM was measured with a microplate reader.
- the absorbances of L-4-hydroxyproline 12.5 ⁇ g / ml, 25 ⁇ g / ml, 50 ⁇ g / ml, 100 ⁇ g / ml and 200 ⁇ g / ml standards were also measured.
- a standard curve was created from the absorbance of L-4-hydroxyproline to determine the amount of hydroxyproline in the target sample.
- TGF- ⁇ transforming growth factor- ⁇
- CTGF connective tissue growth factor
- FIG. 4 is an immunohistologically stained image showing the expression of TGF- ⁇ 1 in CD68 positive macrophages and FR ⁇ positive macrophages in the skin of a scleroderma model mouse.
- FIGS. 5 is a graph showing the number (%) of TGF- ⁇ 1 positive cells in CD68 positive macrophages and FR ⁇ positive macrophages in scleroderma model mouse skin. As shown in FIGS. 4 and 5, the ratio of TGF- ⁇ 1 expression in FR ⁇ -positive macrophages was significantly higher than the ratio of TGF- ⁇ 1 expression in CD68-positive macrophages.
- (2) Changes in skin macrophages after treatment The results are shown in FIGS. In the skin samples after 4 weeks, the number of CD68 positive macrophages and FR ⁇ positive macrophages in the group treated with the recombinant anti-FR ⁇ immunotoxin was significantly reduced.
- Antifibrotic effect The results are shown in FIGS.
- Recombinant anti-FR ⁇ immunotoxin showed the same therapeutic effect as the anti-TGF- ⁇ antibody in reports on conventional scleroderma treatment.
- Recombinant anti-FR ⁇ immunotoxin has the following advantages over anti-TGF- ⁇ antibody.
- the intranasal route of administration has advantages such as less antibody production against the toxin and direct arrival in the lung
- the suppression of skin fibrosis was effective in the venous route.
- the organ fibrosis mechanism involves cells that are inherent to the organ, the fibrosis mechanism is different in various organs. For example, if a drug effective for pulmonary fibrosis suppresses fibrosis of the skin Is not limited. Therefore, in this Example, the fact that the recombinant anti-FR ⁇ immunotoxin was effective in suppressing skin fibrosis indicates that a new skin fibrosis inhibitor is provided.
- a novel therapeutic agent for scleroderma is provided.
- the therapeutic agent for scleroderma according to the present invention can bring about a therapeutic effect on scleroderma by selectively inducing cell death or cytotoxicity of FR ⁇ -expressing macrophages involved in skin fibrosis. All publications, patents and patent applications cited herein are incorporated herein by reference in their entirety.
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Abstract
本発明は、新規な強皮症治療剤を提供することを目的とし、具体的には、葉酸受容体β(FRβ)に結合する抗体と細胞毒素又は細胞毒性剤とをコンジュゲートした複合体を有効成分として含有する強皮症治療剤に関する。
Description
本発明は、例えば葉酸受容体βに対する抗体と細胞毒素又は細胞毒性剤とをコンジュゲートした複合体を有効成分として含む強皮症治療剤に関する。
強皮症は、膠原病の一つで、線維化を特徴とする皮膚と身体のいろいろな部分に病変を発症する原因不明の慢性疾患である。強皮症の病態としては、線維芽細胞の活性化(コラーゲン等の細胞外基質の蓄積)、血管障害及び免疫異常(自己抗体)が挙げられる。
強皮症の発病機序の一つとして、マクロファージの早期浸潤と浸潤した当該マクロファージからの分泌によるTGF−βの上昇が注目されている。活性化マクロファージは線維化の早期に最初に浸潤する細胞であり、TGF−β、CTGF、PDGF等の因子を分泌して強皮症の線維化過程において重要な働きをすると推測されている(非特許文献1及び2)。
強皮症の治療の現状においては、早期の患者に対しては副腎皮質ステロイド薬が一般的に使用され、また肺の症状に対しては免疫抑制薬が一般的に使用される。また、研究中の治療方法はインターロイキン2、TGF−β等のサイトカインを抑制することに向けられている。例えば、抗TGF−β抗体を用いた治療が有意な治療効果を示したことが報告されている(非特許文献3)。しかしながら、従来において、強皮症の進行を完全に根治させる治療は確立していない。
一方、本発明者等は、葉酸受容体β(FRβ)がリウマチの滑膜のマクロファージ等の炎症時の組織マクロファージにおいて高発現し、そのFRβ陽性マクロファージの除去が線維芽細胞の活性化と血管新生を抑制することを報告した(非特許文献4及び5)。
また、本発明者等は、抗FRβ抗体の重鎖可変領域(VH)と緑膿菌毒素(PE)とを連結した融合タンパク質と、抗FRβ抗体の軽鎖可変領域(VL)とから成るリコンビナント抗FRβイムノトキシンを有効成分として含む間質性肺炎治療剤を開示する(特許文献1)。
しかしながら、非特許文献4及び5並びに特許文献1のいずれも、リコンビナント抗FRβイムノトキシンを強皮症の治療に使用できることを開示していない。
強皮症の発病機序の一つとして、マクロファージの早期浸潤と浸潤した当該マクロファージからの分泌によるTGF−βの上昇が注目されている。活性化マクロファージは線維化の早期に最初に浸潤する細胞であり、TGF−β、CTGF、PDGF等の因子を分泌して強皮症の線維化過程において重要な働きをすると推測されている(非特許文献1及び2)。
強皮症の治療の現状においては、早期の患者に対しては副腎皮質ステロイド薬が一般的に使用され、また肺の症状に対しては免疫抑制薬が一般的に使用される。また、研究中の治療方法はインターロイキン2、TGF−β等のサイトカインを抑制することに向けられている。例えば、抗TGF−β抗体を用いた治療が有意な治療効果を示したことが報告されている(非特許文献3)。しかしながら、従来において、強皮症の進行を完全に根治させる治療は確立していない。
一方、本発明者等は、葉酸受容体β(FRβ)がリウマチの滑膜のマクロファージ等の炎症時の組織マクロファージにおいて高発現し、そのFRβ陽性マクロファージの除去が線維芽細胞の活性化と血管新生を抑制することを報告した(非特許文献4及び5)。
また、本発明者等は、抗FRβ抗体の重鎖可変領域(VH)と緑膿菌毒素(PE)とを連結した融合タンパク質と、抗FRβ抗体の軽鎖可変領域(VL)とから成るリコンビナント抗FRβイムノトキシンを有効成分として含む間質性肺炎治療剤を開示する(特許文献1)。
しかしながら、非特許文献4及び5並びに特許文献1のいずれも、リコンビナント抗FRβイムノトキシンを強皮症の治療に使用できることを開示していない。
Higashi−Kuwata N.ら,Exp.Dermatol.,2009年,Vol.18,pp.727−729
Yamamoto T,ら,J.Invest.Dermatol.,1999年,Vol.112,pp.456−462
McCormick LL.ら,J.Immunol.,1999年,Vol.163,pp.5693−5699
Nagayoshi R.ら,Arthritis Rheum.,2005年,Vol.52,pp.2666−2675
Nagai T.ら,Arthritis Rheum.,2006年,Vol.54,pp.3126−3134
上述のように、従来において、強皮症の進行を完全に根治させる治療は確立しておらず、新規な強皮症治療剤を開発するニーズがある。
そこで、本発明は、新規な強皮症治療剤を提供することを目的とする。
上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、強皮症モデルマウスにおいて、リコンビナント抗FRβイムノトキシンを投与したところ、強皮症の病態である皮膚における線維化を抑制し、リコンビナント抗FRβイムノトキシンが強皮症の治療に使用できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下を包含する。
(1)葉酸受容体β(FRβ)に結合する抗体と細胞毒素又は細胞毒性剤とをコンジュゲートした複合体を有効成分として含有する強皮症治療剤。
(2)前記複合体は、リコンビナントイムノトキシンである、(1)記載の強皮症治療剤。
(3)前記抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である、(1)又は(2)記載の強皮症治療剤。
(4)前記抗体は、葉酸受容体αに結合しない、(1)~(3)のいずれか1記載の強皮症治療剤。
(5)前記抗体は、配列番号1に示すアミノ酸配列から成るポリペプチド、又は7以上の連続アミノ酸から成るその部分ペプチドに対して誘起されたものである、(1)~(4)のいずれか1記載の強皮症治療剤。
(6)前記抗体は、配列番号2に示すアミノ酸配列から成るポリペプチド、又は7以上の連続アミノ酸から成るその部分ペプチドに対して誘起されたものである、(1)~(4)のいずれか1記載の強皮症治療剤。
(7)前記抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、それらの抗体フラグメント、又は組換え抗体である、(1)~(6)のいずれか1記載の強皮症治療剤。
(8)前記抗体は、抗ヒト葉酸受容体βマウスモノクローナル抗体又は抗マウス葉酸受容体βラットモノクローナル抗体のいずれかの重鎖(H鎖)可変領域及び/又は軽鎖(L鎖)可変領域の各アミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、(1)~(7)のいずれか1記載の強皮症治療剤。
(9)前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるH鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、(1)~(8)のいずれか1記載の強皮症治療剤。
(a)配列番号3に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b)配列番号3に示す塩基配列において1個~数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号3に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号3に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(10)前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、(1)~(8)のいずれか1記載の強皮症治療剤。
(a)配列番号4に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b)配列番号4に示す塩基配列において1個~数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号4に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号4に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(11)前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるH鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、(1)~(8)のいずれか1記載の強皮症治療剤。
(a)配列番号5に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b)配列番号5に示す塩基配列において1個~数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号5に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号5に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(12)前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、(1)~(8)のいずれか1記載の強皮症治療剤。
(a)配列番号6に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b)配列番号6に示す塩基配列において1個~数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号6に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号6に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(13)前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるH鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、(1)~(8)のいずれか1記載の強皮症治療剤。
(a)配列番号7に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b)配列番号7に示す塩基配列において1個~数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号7に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号7に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(14)前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、(1)~(8)のいずれか1記載の強皮症治療剤。
(a)配列番号8に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b)配列番号8に示す塩基配列において1個~数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号8に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号8に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(15)前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるH鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、(1)~(8)のいずれか1記載の強皮症治療剤。
(a)配列番号9に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b)配列番号9に示す塩基配列において1個~数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号9に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号9に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(16)前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、(1)~(8)のいずれか1記載の強皮症治療剤。
(a)配列番号10に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b)配列番号10に示す塩基配列において1個~数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号10に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号10に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(17)前記細胞毒素は、緑膿菌外毒素(Pseudomonas aeruginosa exotoxin)、リシンA鎖(ricin A chain)、脱糖鎖リシンA鎖(deglycosylated ricin A chain)、リボゾーム不活性化タンパク質(a ribosome inactivating protein)、アルファサルシン(alpha−sarcin)、ゲロニン(gelonin)、アスペルギリン(aspergillin)、リストリクトシン(restrictocin)、リボヌクレアーゼ(ribonuclease)、エポドフィロトキシン(epidophyllotoxin)及びジフテリアトキシン(diphtheria toxin)から成る群より選択されるものである、(1)~(16)のいずれか1記載の強皮症治療剤。
(18)前記複合体は、配列番号11に示すポリペプチドから成るH鎖と、配列番号12に示すポリペプチドから成るL鎖との一本鎖又は二本鎖抗体である、(1)記載の強皮症治療剤。
(19)前記複合体は、配列番号13に示すポリペプチドから成るH鎖と、配列番号14に示すポリペプチドから成るL鎖との一本鎖又は二本鎖抗体である、(1)記載の強皮症治療剤。
(20)標識に結合した、(1)~(19)のいずれか1に規定される葉酸受容体β(FRβ)に結合する抗体又は該抗体と細胞毒素若しくは細胞毒性剤とをコンジュゲートした複合体を含む強皮症診断剤。
(21)前記標識が発蛍光団、色素又は放射性同位元素である、(20)記載の強皮症診断剤。
(22)(1)~(19)のいずれか1に規定される葉酸受容体β(FRβ)に結合する抗体又は該抗体と細胞毒素若しくは細胞毒性剤とをコンジュゲートした複合体、又は(20)若しくは(21)記載の強皮症診断剤を含む強皮症診断キット。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2013−054090号の明細書及び/又は図面に記載される内容を包含する。
そこで、本発明は、新規な強皮症治療剤を提供することを目的とする。
上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、強皮症モデルマウスにおいて、リコンビナント抗FRβイムノトキシンを投与したところ、強皮症の病態である皮膚における線維化を抑制し、リコンビナント抗FRβイムノトキシンが強皮症の治療に使用できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下を包含する。
(1)葉酸受容体β(FRβ)に結合する抗体と細胞毒素又は細胞毒性剤とをコンジュゲートした複合体を有効成分として含有する強皮症治療剤。
(2)前記複合体は、リコンビナントイムノトキシンである、(1)記載の強皮症治療剤。
(3)前記抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である、(1)又は(2)記載の強皮症治療剤。
(4)前記抗体は、葉酸受容体αに結合しない、(1)~(3)のいずれか1記載の強皮症治療剤。
(5)前記抗体は、配列番号1に示すアミノ酸配列から成るポリペプチド、又は7以上の連続アミノ酸から成るその部分ペプチドに対して誘起されたものである、(1)~(4)のいずれか1記載の強皮症治療剤。
(6)前記抗体は、配列番号2に示すアミノ酸配列から成るポリペプチド、又は7以上の連続アミノ酸から成るその部分ペプチドに対して誘起されたものである、(1)~(4)のいずれか1記載の強皮症治療剤。
(7)前記抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、それらの抗体フラグメント、又は組換え抗体である、(1)~(6)のいずれか1記載の強皮症治療剤。
(8)前記抗体は、抗ヒト葉酸受容体βマウスモノクローナル抗体又は抗マウス葉酸受容体βラットモノクローナル抗体のいずれかの重鎖(H鎖)可変領域及び/又は軽鎖(L鎖)可変領域の各アミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、(1)~(7)のいずれか1記載の強皮症治療剤。
(9)前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるH鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、(1)~(8)のいずれか1記載の強皮症治療剤。
(a)配列番号3に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b)配列番号3に示す塩基配列において1個~数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号3に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号3に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(10)前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、(1)~(8)のいずれか1記載の強皮症治療剤。
(a)配列番号4に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b)配列番号4に示す塩基配列において1個~数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号4に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号4に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(11)前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるH鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、(1)~(8)のいずれか1記載の強皮症治療剤。
(a)配列番号5に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b)配列番号5に示す塩基配列において1個~数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号5に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号5に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(12)前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、(1)~(8)のいずれか1記載の強皮症治療剤。
(a)配列番号6に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b)配列番号6に示す塩基配列において1個~数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号6に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号6に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(13)前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるH鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、(1)~(8)のいずれか1記載の強皮症治療剤。
(a)配列番号7に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b)配列番号7に示す塩基配列において1個~数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号7に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号7に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(14)前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、(1)~(8)のいずれか1記載の強皮症治療剤。
(a)配列番号8に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b)配列番号8に示す塩基配列において1個~数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号8に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号8に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(15)前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるH鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、(1)~(8)のいずれか1記載の強皮症治療剤。
(a)配列番号9に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b)配列番号9に示す塩基配列において1個~数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号9に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号9に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(16)前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、(1)~(8)のいずれか1記載の強皮症治療剤。
(a)配列番号10に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b)配列番号10に示す塩基配列において1個~数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号10に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号10に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(17)前記細胞毒素は、緑膿菌外毒素(Pseudomonas aeruginosa exotoxin)、リシンA鎖(ricin A chain)、脱糖鎖リシンA鎖(deglycosylated ricin A chain)、リボゾーム不活性化タンパク質(a ribosome inactivating protein)、アルファサルシン(alpha−sarcin)、ゲロニン(gelonin)、アスペルギリン(aspergillin)、リストリクトシン(restrictocin)、リボヌクレアーゼ(ribonuclease)、エポドフィロトキシン(epidophyllotoxin)及びジフテリアトキシン(diphtheria toxin)から成る群より選択されるものである、(1)~(16)のいずれか1記載の強皮症治療剤。
(18)前記複合体は、配列番号11に示すポリペプチドから成るH鎖と、配列番号12に示すポリペプチドから成るL鎖との一本鎖又は二本鎖抗体である、(1)記載の強皮症治療剤。
(19)前記複合体は、配列番号13に示すポリペプチドから成るH鎖と、配列番号14に示すポリペプチドから成るL鎖との一本鎖又は二本鎖抗体である、(1)記載の強皮症治療剤。
(20)標識に結合した、(1)~(19)のいずれか1に規定される葉酸受容体β(FRβ)に結合する抗体又は該抗体と細胞毒素若しくは細胞毒性剤とをコンジュゲートした複合体を含む強皮症診断剤。
(21)前記標識が発蛍光団、色素又は放射性同位元素である、(20)記載の強皮症診断剤。
(22)(1)~(19)のいずれか1に規定される葉酸受容体β(FRβ)に結合する抗体又は該抗体と細胞毒素若しくは細胞毒性剤とをコンジュゲートした複合体、又は(20)若しくは(21)記載の強皮症診断剤を含む強皮症診断キット。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2013−054090号の明細書及び/又は図面に記載される内容を包含する。
図1は、強皮症モデルマウスにおけるブレオマイシンによる(A)CD68陽性マクロファージと(B)FRβ陽性マクロファージの皮膚への浸潤を示すグラフである。グラフの縦軸は、マクロファージ数(cells/HPF)である。
図2は、強皮症モデルマウスにおけるブレオマイシンによる(A)CD68陽性マクロファージと(B)FRβ陽性マクロファージの皮膚への浸潤を示す免疫組織学的染色像である。
図3は、強皮症モデルマウスにおけるリコンビナント抗FRβイムノトキシンを用いた治療1週後のトランスフォーミング増殖因子−β(TGF−β)mRNA及び結合組織増殖因子(CTGF)mRNAの測定結果を示すグラフである。
図4は、強皮症モデルマウス皮膚でのCD68陽性マクロファージとFRβ陽性マクロファージにおけるTGF−β1の発現を示す免疫組織学的染色像である。マウス正常皮膚における(a)CD68/TGF−β1 二重染色及び(b)FRβ/TGF−β1 二重染色、並び強皮症モデルマウス皮膚における(c)CD68/TGF−β1 二重染色及び(d)FRβ/TGF−β1 二重染色。
図5は、強皮症モデルマウス皮膚でのCD68陽性マクロファージとFRβ陽性マクロファージにおけるTGF−β1陽性細胞数(%)を示すグラフである。
図6は、強皮症モデルマウスにおけるリコンビナント抗FRβイムノトキシンを用いた治療4週後の(A)CD68陽性マクロファージと(B)FRβ陽性マクロファージの皮膚への浸潤を示すグラフである。グラフの縦軸は、マクロファージ数(cells/HPF)である。
図7は、強皮症モデルマウスにおけるリコンビナント抗FRβイムノトキシンを用いた治療4週後のCD68陽性マクロファージとFRβ陽性マクロファージの皮膚への浸潤を示す免疫組織学的染色像である。CD68陽性マクロファージの皮膚への浸潤:(a)正常皮膚、(c)毒素だけのIV、(e)リコンビナント抗FRβイムノトキシンのIV。FRβ陽性マクロファージの皮膚への浸潤:(b)正常皮膚、(d)毒素だけのIV、(f)リコンビナント抗FRβイムノトキシンのIV。
図8は、強皮症モデルマウスにおけるリコンビナント抗FRβイムノトキシンを用いた治療4週後の(A)hydroxyproline分析を通じた皮膚のコラーゲン量(縦軸:ハイドロキシプロリン量(μg/area))、又(B)HE染色をしたマウスの皮膚の厚さ(縦軸:皮膚の厚さ(mm))を顕微鏡下で測定した結果を示すグラフである。
図9は、強皮症モデルマウスにおけるリコンビナント抗FRβイムノトキシンを用いた治療4週後の皮膚の厚さを顕微鏡下で観察した顕微鏡写真である。
図10は、強皮症モデルマウスにおけるリコンビナント抗FRβイムノトキシンを用いた治療4週後の皮膚の厚さを顕微鏡下で観察した顕微鏡写真である。
図2は、強皮症モデルマウスにおけるブレオマイシンによる(A)CD68陽性マクロファージと(B)FRβ陽性マクロファージの皮膚への浸潤を示す免疫組織学的染色像である。
図3は、強皮症モデルマウスにおけるリコンビナント抗FRβイムノトキシンを用いた治療1週後のトランスフォーミング増殖因子−β(TGF−β)mRNA及び結合組織増殖因子(CTGF)mRNAの測定結果を示すグラフである。
図4は、強皮症モデルマウス皮膚でのCD68陽性マクロファージとFRβ陽性マクロファージにおけるTGF−β1の発現を示す免疫組織学的染色像である。マウス正常皮膚における(a)CD68/TGF−β1 二重染色及び(b)FRβ/TGF−β1 二重染色、並び強皮症モデルマウス皮膚における(c)CD68/TGF−β1 二重染色及び(d)FRβ/TGF−β1 二重染色。
図5は、強皮症モデルマウス皮膚でのCD68陽性マクロファージとFRβ陽性マクロファージにおけるTGF−β1陽性細胞数(%)を示すグラフである。
図6は、強皮症モデルマウスにおけるリコンビナント抗FRβイムノトキシンを用いた治療4週後の(A)CD68陽性マクロファージと(B)FRβ陽性マクロファージの皮膚への浸潤を示すグラフである。グラフの縦軸は、マクロファージ数(cells/HPF)である。
図7は、強皮症モデルマウスにおけるリコンビナント抗FRβイムノトキシンを用いた治療4週後のCD68陽性マクロファージとFRβ陽性マクロファージの皮膚への浸潤を示す免疫組織学的染色像である。CD68陽性マクロファージの皮膚への浸潤:(a)正常皮膚、(c)毒素だけのIV、(e)リコンビナント抗FRβイムノトキシンのIV。FRβ陽性マクロファージの皮膚への浸潤:(b)正常皮膚、(d)毒素だけのIV、(f)リコンビナント抗FRβイムノトキシンのIV。
図8は、強皮症モデルマウスにおけるリコンビナント抗FRβイムノトキシンを用いた治療4週後の(A)hydroxyproline分析を通じた皮膚のコラーゲン量(縦軸:ハイドロキシプロリン量(μg/area))、又(B)HE染色をしたマウスの皮膚の厚さ(縦軸:皮膚の厚さ(mm))を顕微鏡下で測定した結果を示すグラフである。
図9は、強皮症モデルマウスにおけるリコンビナント抗FRβイムノトキシンを用いた治療4週後の皮膚の厚さを顕微鏡下で観察した顕微鏡写真である。
図10は、強皮症モデルマウスにおけるリコンビナント抗FRβイムノトキシンを用いた治療4週後の皮膚の厚さを顕微鏡下で観察した顕微鏡写真である。
本発明に係る強皮症治療剤は、葉酸受容体β(FRβ)に結合する抗体と細胞毒素又は細胞毒性剤とをコンジュゲートした複合体を有効成分として含有することを特徴とし、これにより、FRβ発現性マクロファージの細胞死を選択的に引き起こし、且つ強皮症の進行に伴う皮膚の線維化を抑制することができる。換言すれば、本発明に係る強皮症治療剤は、皮膚線維化抑制剤ということもできる。
本明細書で使用する「葉酸受容体β」又は「FRβ」は、強皮症の病変部(すなわち、線維化細胞)に局在するマクロファージ(以下、強皮症関連マクロファージとも称する)の細胞表面に発現される受容体タンパク質である。FRβは正常組織や末梢血中のマクロファージでは発現されないか又は非常に低レベルで発現される。
哺乳動物には、ヒトを含む霊長類、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ等の家畜動物、イヌ、ネコ等のペット動物等が含まれる。好ましい哺乳動物はヒトである。
本明細書で使用される「葉酸受容体β(FRβ)に結合する抗体」は、FRβタンパク質を認識して該タンパク質に結合することができる抗体であり、以下に述べるように、該抗体は、無傷の抗体であってもよいし、或いは、強皮症関連マクロファージとの結合親和性を有する限り、抗体フラグメントや合成抗体(例えば組換え抗体、二重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体等)であってもよい。これらの抗体はまた、強皮症により線維化した細胞がその表面にFRβを発現するような場合には、強皮症関連マクロファージ及び該線維化細胞の両方に結合することを可能にする。抗体をヒトに対して使用する場合、好ましい抗体はヒト抗体又はヒト化抗体である。
本明細書で使用する「細胞毒素」又は「細胞毒性剤」は、強皮症関連マクロファージ及び、場合により、線維化細胞を死滅させる又は障害する能力を持つ任意の物質を指す。
1.複合体
本発明に係る強皮症治療剤の有効成分としての複合体は、上記の通り、強皮症関連マクロファージの表面に発現する分子標的としてのFRβと結合する抗体と、該マクロファージ(及び場合により、線維化細胞)の細胞死を引き起こす細胞毒素又は細胞毒性剤とから基本的に構成される。
ここで、細胞死は、細胞の死滅、殺傷又は障害を意味し、細胞毒素又は細胞毒性剤によって引き起こされる。細胞毒素は、いわゆるトキシンとも呼ばれるタンパク質であるのに対して、細胞毒性剤は、低分子量の化学療法剤であり、前者には、微生物、特に細菌由来のトキシンが含まれ、一方、後者には、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗生物質、分子標的薬、植物アルカロイド、ホルモン剤等が含まれる。
本発明における複合体が上記抗体と細胞毒素から成るとき、これらの成分は融合タンパク質の形態をとることができる。この場合、細胞毒素は、好ましくは抗体タンパク質のC末端に、必要に応じてリンカー(例えばペプチド)を介して、結合することができる。一方、本発明における複合体が上記抗体と細胞毒性剤から成るとき、これらの成分は、結合のための官能基を介して共有結合又は非共有結合によって結合することができる。
1.1 抗体
本発明において、上記抗体は、強皮症関連マクロファージのFRβに特異的に結合するものである。ここで、「特異的」とは、上記抗体が上記マクロファージのFRβと免疫学的反応により結合するが、FRβ又はそれと80%以上の配列同一性を持つタンパク質以外のタンパク質とは実質的に結合しないことを意味する。この点で、上記抗体は、FRのアイソフォームの1つであるFRα(例えばヒトFRαはヒトFRβとの間に約70%のアミノ酸配列同一性がある(特表2008−500025号公報))と結合しないことが望ましい。
本発明で使用可能な抗体は、抗原であるFRβタンパク質又はその部分ペプチドに結合可能な抗体分子全体又はそのフラグメントである。部分ペプチドは、5以上、好ましくは7以上、より好ましくは8以上の連続アミノ酸を有する。一般に、抗原性エピトープ又は抗原決定基は、約5~約10アミノ酸から成り、且つ連続的アミノ酸配列又は不連続的アミノ酸配列を有する。
本発明における抗体は、FRβと結合する、好ましくは特異的に結合する限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、それらの抗体フラグメントのいずれであってもよい。
本発明における抗体はまた、いずれの免疫グロブリン(Ig)クラス(IgA、IgG、IgE、IgD、IgM等)及びサブクラス(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2等)のものであってもよい。また、免疫グロブリンの軽鎖は、κ又はλのいずれであってもよい。
本発明における抗体フラグメントは、例えば、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、重鎖モノマー又はダイマー、軽鎖モノマー又はダイマー、1つの重鎖と1つの軽鎖から成るダイマー等を含む。このようなフラグメントの作製方法は当該技術分野で公知であり、例えばパパイン、ペプシン等のプロテアーゼによる抗体分子の消化、或いは公知の遺伝子工学的手法により得ることができる。
本発明における抗体はまた、組換え抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体等であってもよい。組換え抗体には、例えば一本鎖抗体(scFv)、二重特異性抗体等が含まれる。二重特異性抗体は、2つの異なる結合特異性を有する抗体を指し、例えばdiabody、ScDb(single chain diabody)、dsFv−dsFv等が含まれる(浅野竜太郎,生化学77(12)1497−1500,2005参照)。
以下、国際公開第2010/098503号の記載に準じて、本発明において使用するための抗体の作製方法について詳述する。
本発明において使用可能な抗体を作製するにあたり、最初に免疫原(抗原)として使用するタンパク質、すなわちFRβタンパク質又はその部分ペプチドを調製する。ここで部分ペプチドは、5以上、好ましくは7以上の連続アミノ酸からなる配列を有するものである。免疫原として使用することができるFRβタンパク質の由来は、標的とするFRβと特異的に結合することができる抗体を誘起できるものであるものであれば特に限定されず、例えばヒト、マウス等の哺乳動物に由来するFRβタンパク質又はその部分ペプチドを免疫原として使用する。本発明では、免疫原として、配列番号1に示すアミノ酸配列から成るヒトFRβタンパク質又はその部分ペプチド、あるいは配列番号2に示すアミノ酸配列から成るマウスFRβタンパク質又はその部分ペプチドを使用することができる。免疫原として、配列番号1に示すアミノ酸配列から成るヒトFRβタンパク質又はその部分ペプチドを使用することが特に好ましい。
FRβタンパク質又はその部分ペプチドは、FRβのアミノ酸配列情報(例えば配列番号1等)に基づき、当該技術分野で公知の手法、例えば固相ペプチド合成法等により調製することができる。ヒトを含む他の哺乳動物由来のFRβの配列情報は、例えばGenBank(NCBI、米国)、EMBL(EBI、欧州)等から入手可能である。
あるいは、遺伝子組換え手法を利用して、FRβタンパク質又はその部分ペプチドを生産することも可能である。簡単に説明すると、FRβタンパク質をコードするDNAの配列を適当なタンパク質産生用ベクターに連結し、標的FRβタンパク質又はその部分ペプチドが発現し得るように宿主中に導入し、該宿主中でFRβタンパク質又はその部分ペプチドを生産することができる。この手法は当業者に周知であり、この場合に採用するベクター、宿主細胞、形質転換方法、培養方法、標的タンパク質の精製方法は、当業者が適宜選択することができる。遺伝子組換え手法については、例えば、Sambrookら,Molecular Cloning A Laboratory Manual,2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)、Ausubelら,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons(1998)等を参照することができる。
上記のようにして調製したFRβタンパク質又はその部分ペプチドを免疫原として、本発明で使用する抗体を製造することができる。あるいは、標的FRβタンパク質又はその部分ペプチドをコードするDNAを組み込んだ発現ベクター、或いは該タンパク質又はその部分ペプチドを発現する哺乳動物細胞を免疫原として使用して、本発明で使用する抗体を製造してもよい。
ポリクローナル抗体は、上記のようにして作製した免疫原を、哺乳動物、例えばウサギ、ラット、マウス等に免疫して、抗血清を得ることによって製造することができる。具体的には、上記免疫原を、必要に応じて免疫原性を高めるためのアジュバントと共に、哺乳動物に静脈内、皮下又は腹腔内投与する。アジュバントとしては、市販の完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、水酸化アルミニウム、ミョウバン(Alum)、ムラミルペプチド(細菌細胞壁関連ペプチドの一種)等を使用することができる。その後、数日から数週間の間隔で、1~7回の免疫を行い、最後の免疫日から1~7日後に、ELISA等の酵素免疫測定法等によって抗体価を測定し、最大の抗体価を示した日に採血して抗血清を得る。このようにして取得した抗血清は、そのまま使用してもよいし、FRβタンパク質又はその部分ペプチドを固定化したカラムで1回又は数回精製処理を行った後に使用してもよい。
本発明で使用可能なモノクローナル抗体は、以下のようにして作製することができる。すなわち、上記のようにして免疫感作した哺乳動物から得た抗体産生細胞(例えば、脾臓由来リンパ球細胞、リンパ系細胞等)と自己抗体産生能のないミエローマ細胞からハイブリドーマを調製し、ハイブリドーマをクローン化し、免疫に用いた抗原に対して特異的親和性を示すモノクローナル抗体を産生するクローンを選択することによって製造することができる。ハイブリドーマの製造方法は当該技術分野で周知であり、例えばKohler及びMilsteinら(Nature(1975)256:495−96)の方法に準じて行うことができる。
本発明におけるモノクローナル抗体の例として、ヒトFRβ発現細胞により免疫されたマウスの脾細胞と、マウスミエローマ細胞とを融合させることにより得られた、下記の参考例1に示すマウス−マウスハイブリドーマクローン36b又はクローン94bが産生するモノクローナル抗体等を挙げることができる。
また本発明におけるモノクローナル抗体の他の例として、マウスFRβ発現細胞により免疫されたラットの脾細胞と、ラットミエローマ細胞とを融合させることにより得られた、下記の参考例1に示すラット−ラットハイブリドーマクローンCL5又はクローンCL10が産生するモノクローナル抗体等を挙げることができる。
本発明は、上記のようにして作製したハイブリドーマが有する核酸であって、該ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体のH鎖又はL鎖を含む抗体をコードする遺伝子を包含する。これらの核酸はハイブリドーマから通常の遺伝子工学的手法により得ることができ、またその塩基配列も公知の塩基配列決定法により決定することができる。例として、マウス−マウスハイブリドーマクローン36b細胞が産生するモノクローナル抗体のH鎖可変領域遺伝子及びL鎖可変領域遺伝子の塩基配列をそれぞれ配列番号3及び4に、マウス−マウスハイブリドーマクローン94b細胞が産生するモノクローナル抗体のH鎖可変領域遺伝子及びL鎖可変領域遺伝子の塩基配列をそれぞれ配列番号5及び6に示す。また他の例として、ラット−ラットハイブリドーマクローンCL5が産生するモノクローナル抗体のH鎖可変領域遺伝子及びL鎖可変領域遺伝子の塩基配列をそれぞれ配列番号7及び8に、ラット−ラットハイブリドーマクローンCL10が産生するモノクローナル抗体のH鎖可変領域遺伝子及びL鎖可変領域遺伝子の塩基配列をそれぞれ配列番号9及び10に示す。
本発明は、上記のようにして作製したハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体のH鎖可変領域遺伝子(例えば配列番号3、5、7、9)、L鎖可変領域遺伝子(例えば配列番号4、6、8、10)に制限されず、これらの遺伝子の変異体を包含する。
かかる変異体としては例えば以下のものを挙げることができる。
(i)上記H鎖又はL鎖可変領域遺伝子において、1個~数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を有し、且つFRβに結合する同等若しくは同質の生物学的活性を有するタンパク質をコードする変異体;(ii)上記H鎖可変領域コード核酸又はL鎖可変領域コード核酸と実質的に同一の塩基配列を有し、且つFRβに結合する同等若しくは同質の生物学的活性を有するタンパク質をコードする変異体;及び(iii)上記H鎖可変領域コード核酸又はL鎖可変領域コード核酸に相補的な核酸(塩基配列)とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つFRβに結合する同等若しくは同質の生物学的活性を有するタンパク質をコードする変異体。
本発明において、H鎖及びL鎖可変領域遺伝子の関連で使用する「数個」という用語は、1~20個、好ましくは1~15個、より好ましくは1~10個を指す。
本発明において、H鎖及びL鎖可変領域遺伝子の関連で使用する「実質的に同一」とは、上記のようにして作製したハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体のH鎖可変領域遺伝子(例えば配列番号3、5、7、9)、L鎖可変領域遺伝子(例えば配列番号4、6、8、10)と、少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%の同一性を有することを意味する。なお、2つの配列間の同一性%は、配列が共有する同一な位置の数の関数である(すなわち、同一性%=同一な位置の数/位置(例えば、一部重複する位置)の総数x100)。
2つの配列間の同一性%の決定は、例えばカーリン(Karlin)及びアルトシュール(Altschul)(1993)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873−5877)において改変されたカーリン及びアルトシュール(1990)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264)のアルゴリズムを用いて行うことができる。この種のアルゴリズムは、アルトシュールら(1990)J.Mol.Biol.215:403のNBLAST及びXBLASTプログラムに組み込まれている。また、比較用のギャップが入ったアライメントを得るためには、アルトシュールら(1997)Nucleic Acids Res.25:3389に記載されたGapped BLASTを用いるとよい。または、分子間の遠隔的な関連を検出する反復検索を行うためにPSI−BLASTを用いることもできる。BLAST、Gapped BLAST及びPSI−BLASTプログラムを用いる際には、それぞれのプログラム(例えば、XBLAST及びNBLAST)のデフォルトパラメーターを使用することができる(http://www.ncbi.nlm.nih.gov.参照)。配列比較のために使用できるアルゴリズムのその他の好ましい例として、例えばマイヤーズ(Myers)及びミラー(Miller)(1988)、CABIOS 4:11−17のアルゴリズムである。この種のアルゴリズムは、GCC配列整列化ソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム(version 2.0)に組み込まれている。
本明細書において使用する「ストリンジェントな条件」とは、これに限定されるものではないが、例えば30℃~50℃で、3~4×SSC(150mM 塩化ナトリウム、15mM クエン酸ナトリウム、pH7.2)、0.1~0.5% SDS中で1~24時間のハイブリダイゼーション、より好ましくは40℃~45℃で、3.4×SSC、0.3%SDS中で1~24時間のハイブリダイゼーション、そしてその後の洗浄を含む。洗浄条件としては、例えば、2×SSCと0.1%SDSを含む溶液、及び1×SSC溶液、0.2×SSC溶液による室温での連続した洗浄等の条件を挙げることができる。ただし、上記条件の組み合わせは例示であり、当業者であればハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記の又は他の要素(例えば、ハイブリダーゼーションプローブの濃度、長さ及びGC含量、ハイブリダイゼーションの反応時間等)を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
本明細書において「同等」とは、例えばFRβ抗原に対する結合特異性、結合親和性といった生物学的な活性が実質的に同一であることを指す。またこの用語は、実質的に同質の活性を有する場合を含んでもよく、ここでいう「同質」の活性とは、FRβ抗原に対する特異的結合性といった活性の性質が同一であること、或いは生理的性質、薬理的性質、又は生物学的性質が同一であることをいう。
これらのハイブリダイゼーションにおける「ストリンジェントな条件」の他の例については、例えばSambrookら(上記)、Ausubelら(上記)等に記載されており、これらの条件を本発明に使用してもよい。
上記変異体は、天然に生じたものであってもよいし、人為的に変異を導入したものであってもよい。人為的な変異の導入は、例えば部位特異的変異導入法(Site specific mutagenesis)を用いて常法により導入することができる(Proc Natl Acad Sci USA.,1984 81:5662;Sambrookら(上記))。
本発明では、上記のように作製したハイブリドーマに基づき、遺伝子組換え技術を用いて組換え抗体を作製することもできる。
具体的には、作製したハイブリドーマからモノクローナル抗体をコードする遺伝子をクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを例えばチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞等の哺乳類細胞株、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞といった宿主に導入して、宿主において組換え抗体を生産させることができる(P.J.Delves.,ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES.,1997 WILEY、P.Shepherd and C.Dean.,Monoclonal Antibodies.,2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS,J.W.Goding.,Monoclonal Antibodies:principles and practice.,1993 ACADEMIC PRESS)。
さらに、トランスジェニック動物作製技術を用いて目的抗体の遺伝子が内在性遺伝子に組み込まれたトランスジェニックなマウス、ウシ、ヤギ、ヒツジ又はブタを作製し、FRβタンパク質又はその部分ペプチドを抗原として免疫した後、そのトランスジェニック動物の血液、ミルク中等からその抗体遺伝子に由来する抗体を大量に取得することも可能である。また、上記トランスジェニック動物の中には、内因性抗体遺伝子を欠失した且つヒト抗体遺伝子を保有するマウスやウシ等のヒト抗体産生動物も知られているので、このような動物を利用する場合には、ヒトFRβに結合する完全ヒト抗体を得ることができる(例えば国際公開WO96/9634096、WO96/33735、WO98/24893等)。さらにまた、当該動物の抗体産生細胞(例えばB細胞)とミエローマ細胞から作製したハイブリドーマをin vitroで培養する場合には、上記のような手法で、モノクローナル抗体を産生することもできる。このとき、培養する細胞種の特性、試験研究の目的及び培養方法等の種々の条件に応じて、ハイブリドーマを増殖、維持及び保存させ、培養上清中にモノクローナル抗体を産生させるために用いられるような既知の栄養培地又は基本培地から誘導調製されるあらゆる栄養培地を用いて実施することが可能である。
産生されたモノクローナル抗体は、当該技術分野において周知の方法、例えばプロテインAあるいはプロテインGカラムによるクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、硫安塩析法、ゲル濾過、アフィニティクロマトグラフィー等を適宜組み合わせることにより精製することができる。
本発明で使用可能な抗体はまた、キメラ抗体であることができる。キメラ抗体は、例えばMorrison et al.,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.,81:6851−6855;Neuberger et al.,1984,Nature,312:604−608;Takeda et al.,1985,Nature,314:452−454に記載される技術を用いて製造することができる。これらの技術では、適当な抗原特異性を有するマウス抗体分子からの遺伝子を適当な生物学的活性を有するヒト抗体分子からの遺伝子と共にスプライシングする。キメラ抗体は、異なる動物種に由来する異なる部分が存在する分子である。キメラ抗体として、例えば、抗FRβマウス又はラットモノクローナル抗体のH鎖及び/又はL鎖可変領域と他の哺乳動物由来の免疫グロブリン定常領域とを有する抗体を挙げることができる。
本発明においてはまた、例えばマウス又はラットモノクローナル抗体由来の可変領域又は超可変領域を含む可変領域の一部と、ヒト免疫グロブリンの定常領域、又はヒト免疫グロブリンの可変領域の一部及び定常領域、とを有する抗体、例えば「ヒト化抗体」を挙げることができる。ヒト化抗体の場合、マウス由来の抗体領域部分は約10%未満が望ましい。
上記ヒト化抗体は、例えば抗ヒトFRβマウスモノクローナル抗体(又は抗マウスFRβラットモノクローナル抗体)のH鎖可変領域及び/又はL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR1、2及び3)を含むアミノ酸配列を含むことができる。さらに具体的には、以下の抗体を例示することができる。
(1)以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるH鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む抗体:
(a)配列番号3に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b)配列番号3に示す塩基配列において1個~数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号3に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号3に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(2)以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む抗体:
(a)配列番号4に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b)配列番号4に示す塩基配列において1個~数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号4に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号4に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(3)以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるH鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む抗体:
(a)配列番号5に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b)配列番号5に示す塩基配列において1個~数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号5に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号5に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(4)以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む抗体:
(a)配列番号6に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b)配列番号6に示す塩基配列において1個~数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号6に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号6に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(5)以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるH鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む抗体:
(a)配列番号7に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b)配列番号7に示す塩基配列において1個~数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号7に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号7に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(6)以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む抗体:
(a)配列番号8に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b)配列番号8に示す塩基配列において1個~数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号8に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号8に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(7)以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるH鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む抗体:
(a)配列番号9に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b)配列番号9に示す塩基配列において1個~数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号9に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号9に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(8)以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む抗体:
(a)配列番号10に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b)配列番号10に示す塩基配列において1個~数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号10に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号10に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
なお、配列番号3~10のCDR1~3のヌクレオチド位置を下記表1に示す。
上記マウスドナー配列に適するヒトアクセプター抗体配列は、マウス可変領域のアミノ酸配列の既知のヒト抗体のH鎖又はL鎖の配列とのコンピュータ比較によって同定されうる。そのフレームワーク配列がマウスL鎖可変領域及びH鎖可変領域のフレームワーク領域と高い配列同一性を表すヒト抗体からの可変ドメインは、マウスフレームワーク配列を用いてNCBI BLAST(米国)を利用するKabatデータベースに照会することによって同定することができる。このとき、マウスドナー配列と80%以上、好ましくは90%以上の配列の同一性を共有するアクセプター配列を選択することができる。ラットドナー配列についても同様に、それに適するヒトアクセプター抗体配列を同定することができる。
このようにして同定されたヒトアクセプター抗体H鎖及びL鎖配列をコードする塩基配列をベースにして、その可変領域の一部をマウス抗体のものと置換するように組換えを行う。得られたヒト/マウスキメラH鎖及びL鎖をコードするDNAを発現ベクターに組込み、適当な宿主細胞に形質転換することによって、ヒト化抗体をクローン化、産生することができる。
上記のようなキメラ抗体、ヒト化抗体は、ヒトへの適用に際し、抗原性を低減できるという利点を有する。
本発明において使用する抗体はまた、例えば米国特許第4,946,778号;Bird,1988,Science 242:423−426;Huston et al.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879−5883;Ward et al.,1989,Nature 334:544−546に記載される技術を用いて作製した、FRβタンパク質又はその部分ペプチドに対する一本鎖抗体(scFv)であってもよい。本発明において使用する一本鎖抗体は、例えば上述のモノクローナル抗体のH鎖可変領域(例えば配列番号3、5、7、9)及びL鎖可変領域遺伝子(例えば配列番号4、6、8、10)の配列情報に基づき、常法に従ってそれぞれH鎖フラグメントとL鎖フラグメントを調製し、アミノ酸架橋によってFv領域のH鎖フラグメントとL鎖フラグメントとを連結し、一本鎖のポリペプチドを得ることにより形成することができる。
1.2 細胞毒素又は細胞毒性剤
本発明に使用することができる細胞毒素は、強皮症関連マクロファージの細胞死を誘導する目的で使用することができる任意の細胞毒素であり、例えば緑膿菌外毒素(Pseudomonas aeruginosa exotoxin)、リシンA鎖(ricin A chain)、脱糖鎖リシンA鎖(deglycosylated ricin A chain)、リボゾーム不活性化タンパク質(a ribosome inactivating protein)、アルファサルシン(alpha−sarcin)、ゲロニン(gelonin)、アスペルギリン(aspergillin)、リストリクトシン(restrictocin)、リボヌクレアーゼ(ribonuclease)、エポドフィロトキシン(epidophyllotoxin)、ジフテリアトキシン(diphtheria toxin)等を挙げることができる。本発明においては、特に、PE38等の緑膿菌外毒素を使用することが好ましい。
あるいは、本発明に使用することができる細胞毒性剤は、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗生物質、分子標的薬、植物アルカロイド、ホルモン剤等から適宜選択可能である。このような細胞毒性剤としては、強皮症関連マクロファージを死滅させることができるものが好ましい。また、FRβを細胞表面に発現する線維化細胞の場合には、線維化細胞の死滅も誘導可能な細胞毒性剤を利用することができる。
1.3 リコンビナントイムノトキシン等の複合体
本発明における複合体の1つであるリコンビナントイムノトキシンを作製するために、上記のようにして作製された抗体又はその部分ペプチドは細胞毒素とコンジュゲートされる。すなわち、本発明におけるリコンビナントイムノトキシンとは、標的(すなわちFRβタンパク質)に結合する上記抗体が、細胞毒素又はそのサブユニットにコンジュゲートされたキメラ分子である。本発明においては、植物や細菌等に由来する細胞毒素、ヒト起源の細胞毒素、合成の細胞毒素を使用することができる。
抗体と細胞毒素とのコンジュゲートは、以下のようにして行うことができる。すなわち、抗体分子中の反応性基(例えばアミノ基、カルボキシル基、水酸基等)を利用し、該反応性基と反応しうる官能基を持つ細胞毒素と該抗体とを接触させることによって、リコンビナントイムノトキシンを得ることができる。あるいは、上記抗体のH鎖可変領域遺伝子(配列番号3、5、7、9)及びL鎖可変領域遺伝子(配列番号4、6、8、10)の配列情報に基づき、遺伝子工学的手法により、H鎖フラグメント又はL鎖フラグメントのいずれかを細胞毒素との融合タンパク質として作製し、細胞毒素と融合していない他方のフラグメントと一緒に、SH結合を介して一本鎖抗体又は二本鎖抗体を形成させることによって、リコンビナントタンパク質を作製してもよい。SH結合を介したH鎖フラグメントとL鎖フラグメントの結合は、βメルカプトエタノールやジチオスレイトール等の還元剤によってメルカプト基(−SH基)を露出後、両者を混和することによって達成することができる。
本発明において使用するリコンビナントイムノトキシンの一例として、それぞれ上記マウス−マウスハイブリドーマクローン36b細胞又はクローン94bが産生するモノクローナル抗体と緑膿菌外毒素とのリコンビナントイムノトキシンであるリコンビナントイムノトキシンが挙げられる。マウス−マウスハイブリドーマクローン36bと緑膿菌外毒素のリコンビナントイムノトキシンは、例えば配列番号11に示すポリペプチドから成るH鎖と、配列番号12に示すポリペプチドから成るL鎖との一本鎖又は二本鎖抗体である。またマウス−マウスハイブリドーマクローン94bが産生するモノクローナル抗体と緑膿菌外毒素とのリコンビナントイムノトキシンは、例えば配列番号13に示すポリペプチドから成るH鎖と、配列番号14に示すポリペプチドから成るL鎖との一本鎖又は二本鎖抗体である。
本発明において使用する複合体のもう1つの例は、上記のFRβに結合する抗体と細胞毒性剤との結合体である。一般に、抗体の定常領域、好ましくはC末端側に細胞毒性剤を結合することができる。結合は、抗体タンパク質のNH2基、SH基、OH基、COOH基等を利用し、これと反応性の官能基を持つ細胞毒性剤とを、場合により例えば炭化水素リンカーを介して、化学的に結合することによって実施できる。
2.治療剤
こうして作製された複合体は、強皮症関連マクロファージに特異的に高発現しているFRβを標的とし、強皮症関連マクロファージの細胞死を誘導して皮膚の線維化を抑制することができる。
このように、本発明におけるリコンビナントイムノトキシン等の複合体は、ミサイル療法等の治療目的に使用可能な複合体であり、強皮症に対する治療効果を有するものである。また、当該複合体は、強皮症において特異的に高発現しているFRβを標的とするため、正常細胞への影響が少なく、副作用のリスクが低いという利点を有する。
本発明における複合体は、これを有効成分として含有する強皮症治療剤として製剤化される。すなわち、本発明に係る強皮症治療剤は、治療上有効量の複合体を含むものである。ここで、「治療上有効量」とは、所与の症状や用法について治療効果を与え得る量を指し、強皮症治療剤を適用する対象の性別、年齢、体重、疾患の重篤度、投与経路等様々な要因に応じて変化する。例えば、所与の用法に従って、60kgの成人に、本発明における複合体が1日当たり200μg以上、好ましくは500μg以上の量で投与される量を治療上有効量として含むことができる。
本発明に係る強皮症治療剤は、複合体に加えて、生理学的に許容し得る製薬上の添加物、例えば希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバント、酸化防止剤、等張化剤、賦形剤及び担体等の1種以上を含むことができる。また強皮症の治療に効果的な他の薬剤との混合物としてよい。このような薬剤として、抗TGF−β抗体、immunoglobulin、プロスタグランジンE1等を挙げることができる。
本発明に係る強皮症治療剤は、経口投与、或いは注射、例えばボーラス注射又は連続注入による非経口投与(すなわち静脈内又は筋肉内投与)用に製剤化することができる。注射用製剤は、保存剤を添加して、例えばアンプル又は複数回投与容器中の単位投与剤形として提供することができる。あるいは、本発明に係る強皮症治療剤は、好適なビヒクル、例えば発熱物質不含の滅菌水等で使用前に再構成するための凍結乾燥粉剤としてもよい。
投与経路は、経口経路、並びに静脈内、筋肉内、皮下及び腹腔内の注射等が考えられる。あるいは、患者の患部に直接本発明に係る強皮症治療剤を接触させてもよい。
本発明に係る強皮症治療剤を適用する対象は特に限定されず、強皮症に罹患している患者(特に、早期の強皮症罹患患者)、強皮症を治療している患者等のいずれであってもよい。またその対象はヒトに限らず、ヒト以外の哺乳動物であってもよい。例えば、ヒト以外の哺乳動物として、ヒト、マウス、ラット、サル、ウサギ、イヌ、ネコ等を例として挙げることができる。
また、本発明は、上述の複合体又は強皮症治療剤の治療上有効量を強皮症患者に投与することを含む、強皮症の治療方法に関する。
3.強皮症の診断
上記第1節で説明した抗体又は複合体は、強皮症の診断、例えば、強皮症の存在又は不在、及び該疾患を有するリスクを判定するために使用することができる。
具体的には、本発明は、被験者由来の皮膚組織サンプルを、上記第1節で説明した抗体又は複合体(発蛍光団、色素、放射性同位元素等のラベルで標識された抗体又は複合体(強皮症診断剤)、或いは、非標識抗体又は複合体)と接触させ、FRβ発現強皮症関連マクロファージの存在又は当該マクロファージの皮膚への浸潤を指標として、強皮症の存在又は不在、及び該疾患を有するリスクを測定(検査)する方法を提供する。
例えば、被験者由来の皮膚組織サンプルを、上述の抗体又は複合体(発蛍光団、色素、放射性同位元素等のラベルで標識された抗体又は複合体(強皮症診断剤)、或いは、非標識抗体又は複合体)と接触させて、FRβ発現マクロファージが該皮膚組織中に存在するか否かあるいはFRβ発現マクロファージが皮膚組織へ浸潤しているか否かを調べ、陰性対照(例えば健常者の皮膚組織サンプル)と比較して、FRβ発現マクロファージが有意に存在するか又は皮膚組織へ浸潤している場合に、強皮症の存在を検査することができる。
あるいは、本発明は、強皮症治療を受けているか又は受けた被験者由来の皮膚組織サンプルを、上述の抗体又は複合体(発蛍光団、色素、放射性同位元素等のラベルで標識された抗体又は複合体(強皮症診断剤)、或いは、非標識抗体又は複合体)と接触させて、FRβ発現強皮症関連マクロファージの存在又は不在あるいは皮膚組織への浸潤の存在又は不在を指標として強皮症治療の治療効果を判定する方法を提供する。
本明細書で使用する「判定する」という用語は、医師の判断、すなわち医療行為を意図したものではなく、医師に検査結果の情報又はデータを提示し、医師の判断を助けるための手段を意味する。従って、「判定する」という用語は、「測定する」、「検査する」、「決定する」又は「評価する」等の用語で置き換えることができる。
本発明はさらに、上記測定又は判定方法等において使用するための強皮症診断剤又は強皮症診断キットも提供する。
強皮症診断剤又は強皮症診断キットには、上記抗体又は複合体、あるいは上記抗体又は複合体に更に標識を結合した複合体を含めることができる。標識には、例えば発蛍光団(例えばGFP等)、色素、放射性同位元素(例えば、18F−FDG)等が含まれる。
上記抗体又は複合体によるFRβ発現マクロファージの検出は、ELISA、蛍光抗体法、放射免疫法、サンドイッチ法、組織染色法等によって行うことができる。二次抗体に、例えば酵素(例えばペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等)、発蛍光団(例えばFITC、テトラメチルローダミン、テキサスレッド等)、色素、放射性同位元素等のラベル(標識)を結合したものを使用して、マクロファージに結合した抗体又は複合体を検出する。ラベルの結合には、化学的結合法、ビオチン−(ストレプト)アビジン系を利用する結合法等が含まれる。
画像診断の場合には、薬学的に許容可能な放射性核種や発光体を上述の抗体又は複合体にラベルし、被験者に該抗体又は複合体を投与し、PET/CT等の画像診断技術を使用して画像をとり、FRβ発現強皮症関連マクロファージの存在又は皮膚への浸潤を判定又は検査することができる。
本発明に係る強皮症診断キットには、上記(標識された、又は標識されない)抗体又は複合体或いはそれらを含む造影剤の他に、測定に使用するためのバッファー、ラベル化二次抗体等の試薬、測定手順を記載した使用説明書等を含めることができる。試薬は、別々の容器に密封される。
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
〔参考例1〕リコンビナント抗FRβイムノトキシンの製造
本参考例では、国際公開WO2010/098503の実施例の記載に準じて、リコンビナント抗FRβイムノトキシンを以下のように作製した。
1−1.抗ヒトFRβマウスモノクローナル抗体及び抗マウスFRβラットモノクローナル抗体の製造
[抗原であるFRβ発現細胞の調製]
関節リウマチ滑膜又はBalb/cマウス肝臓からTrizol(GibcoBRL)、cDNA synthesis kit(Invitrogen)にて添付説明書に従って全RNAを抽出後、SuperScript plasmid System(Invitrogen)にて添付説明書に従ってcDNAを合成した。次に、1μlのリウマチ滑膜、又はBalb/cマウス肝臓cDNAをそれぞれ別個にBioneer PCR premix(Bioneer)に加え、10ピコモル量に調整したセンスプライマー(ヒトリウマチ滑膜:agaaagacatgggtctggaaatggatg(配列番号15);マウス肝臓:tctagaaagacatggcctggaaacag(配列番号16))及びアンチセンスプライマー(ヒトリウマチ滑膜:gactgaactcagccaaggagccagagtt(配列番号17);マウス肝臓:cccaacatggatcaggaact(配列番号18))を加え、94℃20秒、58℃30秒、72℃60秒で30サイクルPCRを行い、その後72℃5分で反応させることにより、ヒトあるいはマウスFRβを増幅した。増幅したFRβ遺伝子のPCR産物をプラスミドPCR2.1−TOPO(Invitrogen)にライゲーションを行った。すなわち、PCR産物2.5μlにNaCl溶液を1μL、滅菌蒸留水1.5μl、ベクタープラスミド(PCR2.1−TOPO)1μLを加えて室温で5分間インキュベートし、その内の2μLを大腸菌(TOP10F’)に加えて氷中で30分反応後、42℃30秒の熱処理し、氷中で2分間静置し、250μLのSOC培地を加えた後、37℃で1時間シェーカー内で培養した。培養終了後、LB培地に捲き、37℃で一晩培養した。
大腸菌培養の為、プレート上より採取した白いコロニーをアンピシリン(50mg/mL)を含むLB液体培地に加えて37℃一晩培養した。プラスミドの精製はQiagenプラスミド精製キット(Qiagen)にて行った。組み込まれたFRβ遺伝子は、制限酵素EcoRIによる処理後、アガロース電気泳動に展開し、約0.8kb(782bp)のFRβ遺伝子産物を確認後、その部位を切り出し、遺伝子産物の抽出をQuiagen PCR purification kit(Quiagen)にて精製した。次に予めEcoRI処理を行った哺乳細胞発現用ベクターpER−BOS(Mizushima et al.pEF−BOS,a powerful mammalian expression vector.Nucleic Acid Res.1990;18(17):5322)と混和し、T4 ligase(Roshe)を用いてライゲーションを行った。ライゲーション産物の大腸菌(TOP10F’)への遺伝子導入並びにFRβ遺伝子の確認は上記と同様の手法で行った。
pEF−BOSに組み込まれたFRβ遺伝子を確認後、ヒトFRβを含むベクターはマウスB300−19細胞に、マウスFRβを含むベクターはラットRBL2H3細胞にそれぞれ遺伝子導入を行った。すなわち、予め1x105個に調整した各細胞に、20μLのリポフェクタミン(GibcoBRL)と混和したFRβベクター1μgを加えて遺伝子導入を行った。遺伝子導入されたB300−19マウス細胞及びラットRBL2H3細胞は抗生物質G418耐性を獲得するため、1mg/mLの濃度のG418を含む培地にて遺伝子導入された細胞を選択培養した。遺伝子導入された細胞のFRβ遺伝子導入の確認はPCR法にて行った。すなわち、1x107個に調整した各細胞をcDNA synthesis kit(Invitrogen)にてcDNAを合成し、10ピコモル量に調整したセンスプライマー(ヒトリウマチ滑膜:agaaagacatgggtctggaaatggatg(配列番号15);マウス肝臓:tctagaaagacatggcctggaaacag(配列番号16))及びアンチセンスプライマー(ヒトリウマチ滑膜:gactgaactcagccaaggagccagagtt(配列番号17);マウス肝臓:cccaacatggatcaggaact(配列番号18))をBioneer PCR premix(Bioneer)に加え、94℃20秒、58℃30秒、72℃60秒で30サイクルPCRを行い、その後72℃5分で反応させることにより、ヒトあるいはマウスFRβを増幅した。増幅後アガロース電気泳動を行い、FRβが示すバンド0.8kbを確認した。
[抗ヒトFRβマウスモノクローナル抗体及び抗マウスFRβラットモノクローナル抗体の作製]
FRβ発現マウスB300−19細胞あるいはラットRBL2H3細胞を1x107個に調整し、フロインド完全アジュバンドと混合し、Balb/Cマウス(抗ヒトFRβモノクローナル抗体用)あるいはWhister Kyotoラット(抗マウスFRβモノクローナル抗体用)の尾部に3ヵ所、腹腔内に免疫した。この免疫を2~4回繰り返した。
モノクローナル抗体の作製はKolerの方法(Kohler & Milstein,Nature(1975)256:495−96)に従って行った。すなわち、脾臓あるいは腸骨リンパ節を取りだし、単一細胞に解離させた。解離した細胞を骨髄腫由来の細胞(NS−1)と細胞融合させてハイブリドーマを作製し、HAT選択培地にて培養し、培養上清中に分泌された抗体を、先のFRβ発現細胞との反応性で選別を行った。
得られたハイブリドーマのクローン化は、96穴プレートの各穴当たり1細胞となるように調整した限界希釈培養にて行った。クローン化細胞の選別は、FRβ発現細胞との反応性で行った。
クローン化したハイブリドーマを1x107個に調整し、ヌードマウス腹腔内に投与して腹水を調整し、Protein Gカラム(GEバイオサイエンス)にてモノクローナル抗体を精製した。精製したマウス及びラットモノクローナル抗体のアイソタイプは、アイソタイピングELISAキット(Pharmingen)を用いて決定した。その結果、抗ヒトFRβマウスモノクローナル抗体はIgG2aタイプのクローン36bとIgG1タイプの94bの二つが得られ、抗マウスFRβラットモノクローナル抗体は、IgG2aタイプのCL5とCL10の二つが得られた。これら各抗体の抗原に対する反応性はフローサイトメトリーにて解析した。
[抗ヒトFRβマウスモノクローナル抗体及び抗マウスFRβラットモノクローナル抗体の重鎖遺伝子可変領域(VH)及び軽鎖遺伝子可変領域(VL)遺伝子の決定]
マウスハイブリドーマクローン36b、94bを1x107個にそれぞれ調整し、cDNA synthesis kit(Invitrogen)にてcDNAを合成した。36b及び94bはIg−Prime Kitを用いてVH及びVLの遺伝子をPCRにて決定した。PCR条件は添付の説明書に従って行った。すなわち、94℃60秒、50℃60秒、72℃120秒で30サイクルPCRを行い、その後72℃5分で反応させ、VH及びVLの遺伝子を増幅した。増幅したVH及びVLのPCR産物をプラスミドPCR2.1−TOPO(Invitrogen)にライゲーションし、大腸菌(TOP10F’)に遺伝子導入した。遺伝子導入した大腸菌よりプラスミドを精製し、36b、94bのVH及びVLの塩基配列を決定した。塩基配列はBigDye Terminaor V3.1 cycle sequencing kit(ABI)を用いてPCRを行い、PCR産物をABI 310 DNA sequencerにて解析した。
ラットハイブリドーマクローンCL5、CL10を1x107個にそれぞれ調整し、cDNA synthesis kit(Invitrogen)にてcDNAを合成した。次に、Ig−Prime Kit及びラットVH増幅用にデザインしたプライマー(caccatggagttacttttgag(配列番号19))を用い、VH及びVLの遺伝子をPCRで増幅させた。増幅したVH及びVLのPCR産物をプラスミドPCR2.1−TOPO(Invitrogen)にライゲーションし、大腸菌(TOP10F’)に遺伝子導入した。次に、大腸菌よりプラスミドを精製し、VH及びVLの塩基配列を決定した。塩基配列はBigDye Terminaor V3.1 cycle sequencing kit(ABI)を用いてPCRを行い、ABI 310 DNA sequencerにて解析した。
1−2.リコンビナント抗FRβイムノトキシンの製造
[免疫グロブリン重鎖遺伝子可変領域(VH)にシステインの変異を導入]
抗ヒトFRβマウスモノクローナル抗体94bの免疫グロブリン重鎖遺伝子可変領域(VH)の63番目のアミノ酸グリシン(塩基配列ggc)をシステイン(塩基配列tgt)に変異させるようにデザインしたプライマーを作製し(センスプライマー:cagaggcctgaacattgtctggagtggattggaag(配列番号20)、アンチセンスプライマー:cttccaatccactccagacactgttcaggcctctg(配列番号21))、Quick change site−directed mutagenesis kit(Stratagene)を用いて上記第1−1節で得た94bのVHを含むプラスミドpCR2.1−TOPO 94bVHに変異誘発処理を行った。このPCR反応は、反応液を95℃30秒、55℃60秒、68℃4分のサイクルを12回連続して行った。抗マウスFRβラットモノクローナル抗体CL10の免疫グロブリン重鎖遺伝子可変領域(VH)へのシステイン導入も上記と同様の方法にてプライマーをデザインして行った(センスプライマー:gtccgccaggctccaacgaagtgtctggagtgggtcgc(配列番号22)、アンチセンスプライマー:gcgacccactccagacacttcgttggagcctggcggac(配列番号23))。
次に、反応後のDNAを大腸菌XL1−Blueに遺伝子導入し、0.1mg/mLのアンピシリンを含むLB培地で選択培養した。選択した形質転換体のプラスミドをQIAprep spin Miniprep KIT(Qiagen)により精製した。さらに塩基配列をBig Dye Terminator v3.1 cycle sequencing kit(ABI)とABI310シーケンサーにて決定し、63番目のグリシンがシステイン(塩基配列tgt)に変異したことを確認した。
[pRK79PE38ベクターに変異を導入したVHを挿入]
次に、PE38遺伝子を含むpRK79ベクターpRK79PE38に、94bVH及びCL10VHの変異を導入したVHの挿入を以下の方法にて行った。
変異を導入した94bの5’末端部と3’末端部のアニーリングプライマーとしてtaagaaggagatatacatatggaggttcagctgcagcagtc(配列番号24)とgccctcgggacctccggaagcttttgaggagactgtgagagtgg(配列番号25)を、CL10の5’末端部と3’末端部のアニーリングプライマーとしてatacatatggaggtgcagctggtggagtctggg(配列番号26)とtccggaagcttttgaggagacagtgactgaagc(配列番号27)をそれぞれデザインした。アニーリングプライマーにはそれぞれ制限酵素であるNdeIがあり、この部位でのクローニングにより、atgを開始コドンとしたタンパク質の発現が可能である。また、もう片方のアニーリングプライマーにはHindIII部位が挿入されており、この部位でのクローニングにより、VHとPE遺伝子が結合した融合タンパク質の発現が可能である。
これらのプライマーの組み合わせとpfu DNA polymerase(Stratagene)を使って変異を導入したpCR2.1−TOPO−94bVH及びpCR2.1−TOPO−CL10VHプラスミドのPCRを行った。この反応は94℃20秒、55℃30秒、72℃60秒で30サイクルPCRを行い、その後72℃5分で反応させた。次に、PCR産物を精製し、精製産物に制限酵素NdeI(New England Biolabs)とHindIII(New England Biolabs)を加えて反応後、電気泳動に展開し、QIAquick gel extraction kit(Qiagen)を用いてゲルから目的の大きさのDNAを回収した。回収したDNAに、制限酵素処理した変異導入VHと同様の制限酵素で処理したpRK79PE38を添加し、さらにLigation High(Toyobo)を用いてVHとpRK79PE38のライゲーション反応を行った。ライゲーション反応終了、大腸菌TOP10F’(Invitrogen)に遺伝子導入し、0.1mg/mLのアンピシリンを含むLB培地にて形質転換体を選択した。選択した形質転換体のプラスミドpRK79−VHPEをQIAprep spin Miniprep KIT(Qiagen)により精製した。さらに塩基配列をBig Dye Terminator v3.1 cycle sequencing kit(ABI)とABI310シーケンサーにて決定し、変異導入VHの塩基配列がpRK79ベクターのPE38塩基配列と連結していることを確認した。
[免疫グロブリン軽鎖遺伝子可変領域にシステイン変異を導入]
抗ヒトFRβマウスモノクローナル抗体94bの免疫グロブリン軽鎖遺伝子可変領域(VL)の125番目のアミノ酸をシステイン(塩基配列tgt)に変異させるようにデザインしたプライマーを作製した(センスプライマー:taagaaggagatatacatatggacattgtgatgtcacaatc(配列番号28)(このプライマーには制限酵素NdeI切断可能な塩基catatgを含むため、この部位でクローニングすることにより、atgを開始コドンとしたタンパク質の発現が可能である);アンチセンスプライマー:gctttgttagcagccgaattcctatttgatttccagcttggtgccacaaccgaacgt(配列番号29)(このプライマーは125番目のアミノ酸をシステイン(tgt)に変異させ、終始コドンtagに続いて制限酵素EcoRI切断可能な塩基gaattcが来るようにデザインしてある))。同様に抗マウスFRβラットモノクローナル抗体CL10の免疫グロブリン軽鎖遺伝子可変領域(VL)の125番目のアミノ酸をシステイン(塩基配列tgt)に変異させるようにデザインしたプライマーを作製した(atacatatggacattgtgatgcccaatctccatcc(配列番号30)及びgctttgttagcagccgaattcctatttgatttccagcttggtgccacaaccgaacgt(配列番号31))。
これらのプライマーの組み合わせとpfu DNA polymerase(Stratagene)を使ってpCR2.1−TOPO−94bVLプラスミドのPCRを行った。この反応は94℃20秒、55℃30秒、72℃60秒で30サイクルPCRを行い、その後72℃5分で反応させた。次に、PCR産物を精製し、精製産物に制限酵素NdeI(New England Biolabs)とEcoRI(New England Biolabs)を加えて反応後、電気泳動に展開し、QIAquick gel extraction kit(Qiagen)を用いてゲルから目的の大きさのDNAを回収した。回収したDNAに、制限酵素処理した変異導入VLと同様の制限酵素で処理したpRK79PE38を添加し、さらにLigation High(Toyobo)を用いてVHとpRK79PE38のライゲーション反応を行った。ライゲーション反応終了、大腸菌TOP10F’(Invitrogen)に遺伝子導入し、0.1mg/mLのアンピシリンを含むLB培地にて形質転換体を選択した。選択した形質転換体のプラスミドpRK79−VLPEをQIAprep spin Miniprep KIT(Qiagen)により精製した。さらに塩基配列をBig Dye Terminator v3.1 cycle sequencing kit(ABI)とABI310シーケンサーにて決定し、変異導入VLの125アミノ酸がシステインに変異していることや、終始コドンtagが配置されていることを確認した。
[リコンビナントタンパク質封入体の調製]
上記の変異導入VHを組み込んだプラスミドpRK79−94bVHPE、pRK79−CL10VHPE、変異導入VLを組み込んだプラスミドpRK79−VL94b、pRK79−VLCL10を50ng調整し、タンパク質発現用大腸菌BL21(DE3)に遺伝子導入した。遺伝子が導入された大腸菌の選抜は0.1mg/mLのアンピシリンを含むLB培地にて37℃15~18時間の培養で行った。
選択終了後の大腸菌は1000mLのスーパーブロース培地で37℃の条件で培養し、可視吸光度600nmで1.0−1.5に到達するまで培養した。培養後、IPTG(isopropyl−beta−D−thio−galactopyranoside)を終濃度1mMになるように培地に添加し、さらに90分間37℃で培養した。培養終了後、遠心分離にて大腸菌を回収後、50mMトリス緩衝液(pH7.4、20mM EDTAを含む)を用いて200mLとなるまで懸濁した。懸濁終了後、卵白リゾチームを最終濃度0.2mg/mLとなるように加え、室温で1時間反応させて大腸菌の破壊を行った。破壊後、20,000xgで遠心分離を行い、沈殿を回収した。沈殿物はさらに50mMトリス緩衝液(pH7.4、2.5%のTritonX−100、0.5M NaCl、20mM EDTAを含む)で200mLとなるまで懸濁し、卵白リゾチームを最終濃度0.2mg/mLとなるように加え、室温で1時間反応させた。反応終了後、20,000xgで遠心分離を行い、沈殿を回収した。沈殿はさらに50mMトリス緩衝液(pH7.4、2.5%のTritonX−100、0.5M NaCl、20mM EDTAを含む)で200mLとなるまで懸濁し、十分混和させた後、20,000xgで遠心分離を行い、沈殿を回収した。この操作を5回繰り返した後の沈殿物をリコンビナントイムノトキシン封入体とし、さらに0.1Mトリス緩衝液(pH8.0、6Mグアニジン塩酸塩、1mM EDTAを含む)で溶解させ、最終濃度10mg/mLとなるように調節した。
[リコンビナント二重鎖Fv抗FRβイムノトキシンの作製]
上記で調製した94b−VHPEと94b−VL、CL10−VHPEとCL10−VLを混和させ、リコンビナント二重鎖Fv抗FRβイムノトキシンを作製した。
まず、0.5mLのVHPE、0.25mLのVLを混和し、ジチオトレイトール(DTT)を最終濃度10mg/mLとなるように加え、室温で4時間の還元処理を行った。処理後、75mLの0.1Mトリス緩衝液(pH8.0、0.5Mアルギニン、0.9mM酸化型グルタチオン、2mM EDTAを含む)に溶解させた。この溶液を10℃で40時間放置することによって、VHとVLを結合させた。結合終了後、分子量10,000カットの遠心濃縮器(Centricon 10、Amicon)で5mLまで濃縮し、さらに50mLのトリス緩衝液(pH7.4、0.1M尿素、1mM EDTAを含む)で希釈した。この希釈液をリコンビナントイムノトキシン精製の出発物質とした。
次に、トリス緩衝液(pH7.4、1mM EDTAを含む)で平衡化したイオン交換カラムHi−Trap Q(GE)に、30mL/時間の流速で、上記出発物質を吸着させた後、トリス緩衝液(pH7.4、1mM EDTAを含む)で洗浄した。洗浄後、吸着したリコンビナントタイプイムノトキシンの溶出をトリス緩衝液(pH7.4、0.3M NaCl、1mM EDTAを含む)で行った。溶出サンプルはトリス緩衝液(pH7.4、1mM EDTAを含む)で透析した後、イオン交換カラムPOROS HQ(POROS)でさらに精製した。すなわち、透析した精製物質を10mL/分の流速で吸着させ、トリス緩衝液(pH7.4、1mM EDTAを含む)で洗浄後、上記緩衝液に0Mから1.0MのNaCl勾配を設定することにより、リコンビナントタイプイムノトキシンの溶出を行った。精製リコンビナントタイプイムノトキシンの最終調製はTSK300SW(Tosoh)ゲル濾過クロマトグラフィーにて行った。まず、75%の消毒用エタノールで48時間洗浄することによってTSK300SWカラム中のエンドトキシン除去を行った。次に日本薬局方注射用蒸留水で洗浄し、その後日本薬局方生理食塩水でTSK300SWカラムの平衡化を行った。平衡化終了後、リコンビナントタイプイムノトキシンを投与し、流速0.25mL/分でカラムからの溶出液を採取した。採取後、0.22μmの濾過滅菌機で処理し、純度をSDS−PAGEにて確認後、−80℃で保存した。
[SDS−PAGEによる純度検定]
SDS−PAGE(ドデシル硫酸ナトリウムを含むポリアクリルアミド電気泳動)は0.1%のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を含む12%ポリアクリルアミドの平板ゲルを用い、移動相には終濃度0.1%のSDS、130mMグリシン、25mMトリスを含む水溶液を用いた。各サンプルは終濃度0.1%のSDSを含む100mMトリス緩衝液pH6.5で調整し、5分間の煮沸処理を行った。煮沸終了後、平板ゲルにサンプルを投与し、30mAの定電流で電気泳動を展開させた。展開後、0.05%のクマシーブリリアントブルーR溶液(ナカライテスク)でリコンビナントタイプイムノトキシンの染色を行った。
本明細書で使用する「葉酸受容体β」又は「FRβ」は、強皮症の病変部(すなわち、線維化細胞)に局在するマクロファージ(以下、強皮症関連マクロファージとも称する)の細胞表面に発現される受容体タンパク質である。FRβは正常組織や末梢血中のマクロファージでは発現されないか又は非常に低レベルで発現される。
哺乳動物には、ヒトを含む霊長類、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ等の家畜動物、イヌ、ネコ等のペット動物等が含まれる。好ましい哺乳動物はヒトである。
本明細書で使用される「葉酸受容体β(FRβ)に結合する抗体」は、FRβタンパク質を認識して該タンパク質に結合することができる抗体であり、以下に述べるように、該抗体は、無傷の抗体であってもよいし、或いは、強皮症関連マクロファージとの結合親和性を有する限り、抗体フラグメントや合成抗体(例えば組換え抗体、二重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体等)であってもよい。これらの抗体はまた、強皮症により線維化した細胞がその表面にFRβを発現するような場合には、強皮症関連マクロファージ及び該線維化細胞の両方に結合することを可能にする。抗体をヒトに対して使用する場合、好ましい抗体はヒト抗体又はヒト化抗体である。
本明細書で使用する「細胞毒素」又は「細胞毒性剤」は、強皮症関連マクロファージ及び、場合により、線維化細胞を死滅させる又は障害する能力を持つ任意の物質を指す。
1.複合体
本発明に係る強皮症治療剤の有効成分としての複合体は、上記の通り、強皮症関連マクロファージの表面に発現する分子標的としてのFRβと結合する抗体と、該マクロファージ(及び場合により、線維化細胞)の細胞死を引き起こす細胞毒素又は細胞毒性剤とから基本的に構成される。
ここで、細胞死は、細胞の死滅、殺傷又は障害を意味し、細胞毒素又は細胞毒性剤によって引き起こされる。細胞毒素は、いわゆるトキシンとも呼ばれるタンパク質であるのに対して、細胞毒性剤は、低分子量の化学療法剤であり、前者には、微生物、特に細菌由来のトキシンが含まれ、一方、後者には、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗生物質、分子標的薬、植物アルカロイド、ホルモン剤等が含まれる。
本発明における複合体が上記抗体と細胞毒素から成るとき、これらの成分は融合タンパク質の形態をとることができる。この場合、細胞毒素は、好ましくは抗体タンパク質のC末端に、必要に応じてリンカー(例えばペプチド)を介して、結合することができる。一方、本発明における複合体が上記抗体と細胞毒性剤から成るとき、これらの成分は、結合のための官能基を介して共有結合又は非共有結合によって結合することができる。
1.1 抗体
本発明において、上記抗体は、強皮症関連マクロファージのFRβに特異的に結合するものである。ここで、「特異的」とは、上記抗体が上記マクロファージのFRβと免疫学的反応により結合するが、FRβ又はそれと80%以上の配列同一性を持つタンパク質以外のタンパク質とは実質的に結合しないことを意味する。この点で、上記抗体は、FRのアイソフォームの1つであるFRα(例えばヒトFRαはヒトFRβとの間に約70%のアミノ酸配列同一性がある(特表2008−500025号公報))と結合しないことが望ましい。
本発明で使用可能な抗体は、抗原であるFRβタンパク質又はその部分ペプチドに結合可能な抗体分子全体又はそのフラグメントである。部分ペプチドは、5以上、好ましくは7以上、より好ましくは8以上の連続アミノ酸を有する。一般に、抗原性エピトープ又は抗原決定基は、約5~約10アミノ酸から成り、且つ連続的アミノ酸配列又は不連続的アミノ酸配列を有する。
本発明における抗体は、FRβと結合する、好ましくは特異的に結合する限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、それらの抗体フラグメントのいずれであってもよい。
本発明における抗体はまた、いずれの免疫グロブリン(Ig)クラス(IgA、IgG、IgE、IgD、IgM等)及びサブクラス(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2等)のものであってもよい。また、免疫グロブリンの軽鎖は、κ又はλのいずれであってもよい。
本発明における抗体フラグメントは、例えば、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、重鎖モノマー又はダイマー、軽鎖モノマー又はダイマー、1つの重鎖と1つの軽鎖から成るダイマー等を含む。このようなフラグメントの作製方法は当該技術分野で公知であり、例えばパパイン、ペプシン等のプロテアーゼによる抗体分子の消化、或いは公知の遺伝子工学的手法により得ることができる。
本発明における抗体はまた、組換え抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体等であってもよい。組換え抗体には、例えば一本鎖抗体(scFv)、二重特異性抗体等が含まれる。二重特異性抗体は、2つの異なる結合特異性を有する抗体を指し、例えばdiabody、ScDb(single chain diabody)、dsFv−dsFv等が含まれる(浅野竜太郎,生化学77(12)1497−1500,2005参照)。
以下、国際公開第2010/098503号の記載に準じて、本発明において使用するための抗体の作製方法について詳述する。
本発明において使用可能な抗体を作製するにあたり、最初に免疫原(抗原)として使用するタンパク質、すなわちFRβタンパク質又はその部分ペプチドを調製する。ここで部分ペプチドは、5以上、好ましくは7以上の連続アミノ酸からなる配列を有するものである。免疫原として使用することができるFRβタンパク質の由来は、標的とするFRβと特異的に結合することができる抗体を誘起できるものであるものであれば特に限定されず、例えばヒト、マウス等の哺乳動物に由来するFRβタンパク質又はその部分ペプチドを免疫原として使用する。本発明では、免疫原として、配列番号1に示すアミノ酸配列から成るヒトFRβタンパク質又はその部分ペプチド、あるいは配列番号2に示すアミノ酸配列から成るマウスFRβタンパク質又はその部分ペプチドを使用することができる。免疫原として、配列番号1に示すアミノ酸配列から成るヒトFRβタンパク質又はその部分ペプチドを使用することが特に好ましい。
FRβタンパク質又はその部分ペプチドは、FRβのアミノ酸配列情報(例えば配列番号1等)に基づき、当該技術分野で公知の手法、例えば固相ペプチド合成法等により調製することができる。ヒトを含む他の哺乳動物由来のFRβの配列情報は、例えばGenBank(NCBI、米国)、EMBL(EBI、欧州)等から入手可能である。
あるいは、遺伝子組換え手法を利用して、FRβタンパク質又はその部分ペプチドを生産することも可能である。簡単に説明すると、FRβタンパク質をコードするDNAの配列を適当なタンパク質産生用ベクターに連結し、標的FRβタンパク質又はその部分ペプチドが発現し得るように宿主中に導入し、該宿主中でFRβタンパク質又はその部分ペプチドを生産することができる。この手法は当業者に周知であり、この場合に採用するベクター、宿主細胞、形質転換方法、培養方法、標的タンパク質の精製方法は、当業者が適宜選択することができる。遺伝子組換え手法については、例えば、Sambrookら,Molecular Cloning A Laboratory Manual,2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)、Ausubelら,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons(1998)等を参照することができる。
上記のようにして調製したFRβタンパク質又はその部分ペプチドを免疫原として、本発明で使用する抗体を製造することができる。あるいは、標的FRβタンパク質又はその部分ペプチドをコードするDNAを組み込んだ発現ベクター、或いは該タンパク質又はその部分ペプチドを発現する哺乳動物細胞を免疫原として使用して、本発明で使用する抗体を製造してもよい。
ポリクローナル抗体は、上記のようにして作製した免疫原を、哺乳動物、例えばウサギ、ラット、マウス等に免疫して、抗血清を得ることによって製造することができる。具体的には、上記免疫原を、必要に応じて免疫原性を高めるためのアジュバントと共に、哺乳動物に静脈内、皮下又は腹腔内投与する。アジュバントとしては、市販の完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、水酸化アルミニウム、ミョウバン(Alum)、ムラミルペプチド(細菌細胞壁関連ペプチドの一種)等を使用することができる。その後、数日から数週間の間隔で、1~7回の免疫を行い、最後の免疫日から1~7日後に、ELISA等の酵素免疫測定法等によって抗体価を測定し、最大の抗体価を示した日に採血して抗血清を得る。このようにして取得した抗血清は、そのまま使用してもよいし、FRβタンパク質又はその部分ペプチドを固定化したカラムで1回又は数回精製処理を行った後に使用してもよい。
本発明で使用可能なモノクローナル抗体は、以下のようにして作製することができる。すなわち、上記のようにして免疫感作した哺乳動物から得た抗体産生細胞(例えば、脾臓由来リンパ球細胞、リンパ系細胞等)と自己抗体産生能のないミエローマ細胞からハイブリドーマを調製し、ハイブリドーマをクローン化し、免疫に用いた抗原に対して特異的親和性を示すモノクローナル抗体を産生するクローンを選択することによって製造することができる。ハイブリドーマの製造方法は当該技術分野で周知であり、例えばKohler及びMilsteinら(Nature(1975)256:495−96)の方法に準じて行うことができる。
本発明におけるモノクローナル抗体の例として、ヒトFRβ発現細胞により免疫されたマウスの脾細胞と、マウスミエローマ細胞とを融合させることにより得られた、下記の参考例1に示すマウス−マウスハイブリドーマクローン36b又はクローン94bが産生するモノクローナル抗体等を挙げることができる。
また本発明におけるモノクローナル抗体の他の例として、マウスFRβ発現細胞により免疫されたラットの脾細胞と、ラットミエローマ細胞とを融合させることにより得られた、下記の参考例1に示すラット−ラットハイブリドーマクローンCL5又はクローンCL10が産生するモノクローナル抗体等を挙げることができる。
本発明は、上記のようにして作製したハイブリドーマが有する核酸であって、該ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体のH鎖又はL鎖を含む抗体をコードする遺伝子を包含する。これらの核酸はハイブリドーマから通常の遺伝子工学的手法により得ることができ、またその塩基配列も公知の塩基配列決定法により決定することができる。例として、マウス−マウスハイブリドーマクローン36b細胞が産生するモノクローナル抗体のH鎖可変領域遺伝子及びL鎖可変領域遺伝子の塩基配列をそれぞれ配列番号3及び4に、マウス−マウスハイブリドーマクローン94b細胞が産生するモノクローナル抗体のH鎖可変領域遺伝子及びL鎖可変領域遺伝子の塩基配列をそれぞれ配列番号5及び6に示す。また他の例として、ラット−ラットハイブリドーマクローンCL5が産生するモノクローナル抗体のH鎖可変領域遺伝子及びL鎖可変領域遺伝子の塩基配列をそれぞれ配列番号7及び8に、ラット−ラットハイブリドーマクローンCL10が産生するモノクローナル抗体のH鎖可変領域遺伝子及びL鎖可変領域遺伝子の塩基配列をそれぞれ配列番号9及び10に示す。
本発明は、上記のようにして作製したハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体のH鎖可変領域遺伝子(例えば配列番号3、5、7、9)、L鎖可変領域遺伝子(例えば配列番号4、6、8、10)に制限されず、これらの遺伝子の変異体を包含する。
かかる変異体としては例えば以下のものを挙げることができる。
(i)上記H鎖又はL鎖可変領域遺伝子において、1個~数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を有し、且つFRβに結合する同等若しくは同質の生物学的活性を有するタンパク質をコードする変異体;(ii)上記H鎖可変領域コード核酸又はL鎖可変領域コード核酸と実質的に同一の塩基配列を有し、且つFRβに結合する同等若しくは同質の生物学的活性を有するタンパク質をコードする変異体;及び(iii)上記H鎖可変領域コード核酸又はL鎖可変領域コード核酸に相補的な核酸(塩基配列)とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つFRβに結合する同等若しくは同質の生物学的活性を有するタンパク質をコードする変異体。
本発明において、H鎖及びL鎖可変領域遺伝子の関連で使用する「数個」という用語は、1~20個、好ましくは1~15個、より好ましくは1~10個を指す。
本発明において、H鎖及びL鎖可変領域遺伝子の関連で使用する「実質的に同一」とは、上記のようにして作製したハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体のH鎖可変領域遺伝子(例えば配列番号3、5、7、9)、L鎖可変領域遺伝子(例えば配列番号4、6、8、10)と、少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%の同一性を有することを意味する。なお、2つの配列間の同一性%は、配列が共有する同一な位置の数の関数である(すなわち、同一性%=同一な位置の数/位置(例えば、一部重複する位置)の総数x100)。
2つの配列間の同一性%の決定は、例えばカーリン(Karlin)及びアルトシュール(Altschul)(1993)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873−5877)において改変されたカーリン及びアルトシュール(1990)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264)のアルゴリズムを用いて行うことができる。この種のアルゴリズムは、アルトシュールら(1990)J.Mol.Biol.215:403のNBLAST及びXBLASTプログラムに組み込まれている。また、比較用のギャップが入ったアライメントを得るためには、アルトシュールら(1997)Nucleic Acids Res.25:3389に記載されたGapped BLASTを用いるとよい。または、分子間の遠隔的な関連を検出する反復検索を行うためにPSI−BLASTを用いることもできる。BLAST、Gapped BLAST及びPSI−BLASTプログラムを用いる際には、それぞれのプログラム(例えば、XBLAST及びNBLAST)のデフォルトパラメーターを使用することができる(http://www.ncbi.nlm.nih.gov.参照)。配列比較のために使用できるアルゴリズムのその他の好ましい例として、例えばマイヤーズ(Myers)及びミラー(Miller)(1988)、CABIOS 4:11−17のアルゴリズムである。この種のアルゴリズムは、GCC配列整列化ソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム(version 2.0)に組み込まれている。
本明細書において使用する「ストリンジェントな条件」とは、これに限定されるものではないが、例えば30℃~50℃で、3~4×SSC(150mM 塩化ナトリウム、15mM クエン酸ナトリウム、pH7.2)、0.1~0.5% SDS中で1~24時間のハイブリダイゼーション、より好ましくは40℃~45℃で、3.4×SSC、0.3%SDS中で1~24時間のハイブリダイゼーション、そしてその後の洗浄を含む。洗浄条件としては、例えば、2×SSCと0.1%SDSを含む溶液、及び1×SSC溶液、0.2×SSC溶液による室温での連続した洗浄等の条件を挙げることができる。ただし、上記条件の組み合わせは例示であり、当業者であればハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記の又は他の要素(例えば、ハイブリダーゼーションプローブの濃度、長さ及びGC含量、ハイブリダイゼーションの反応時間等)を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
本明細書において「同等」とは、例えばFRβ抗原に対する結合特異性、結合親和性といった生物学的な活性が実質的に同一であることを指す。またこの用語は、実質的に同質の活性を有する場合を含んでもよく、ここでいう「同質」の活性とは、FRβ抗原に対する特異的結合性といった活性の性質が同一であること、或いは生理的性質、薬理的性質、又は生物学的性質が同一であることをいう。
これらのハイブリダイゼーションにおける「ストリンジェントな条件」の他の例については、例えばSambrookら(上記)、Ausubelら(上記)等に記載されており、これらの条件を本発明に使用してもよい。
上記変異体は、天然に生じたものであってもよいし、人為的に変異を導入したものであってもよい。人為的な変異の導入は、例えば部位特異的変異導入法(Site specific mutagenesis)を用いて常法により導入することができる(Proc Natl Acad Sci USA.,1984 81:5662;Sambrookら(上記))。
本発明では、上記のように作製したハイブリドーマに基づき、遺伝子組換え技術を用いて組換え抗体を作製することもできる。
具体的には、作製したハイブリドーマからモノクローナル抗体をコードする遺伝子をクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを例えばチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞等の哺乳類細胞株、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞といった宿主に導入して、宿主において組換え抗体を生産させることができる(P.J.Delves.,ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES.,1997 WILEY、P.Shepherd and C.Dean.,Monoclonal Antibodies.,2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS,J.W.Goding.,Monoclonal Antibodies:principles and practice.,1993 ACADEMIC PRESS)。
さらに、トランスジェニック動物作製技術を用いて目的抗体の遺伝子が内在性遺伝子に組み込まれたトランスジェニックなマウス、ウシ、ヤギ、ヒツジ又はブタを作製し、FRβタンパク質又はその部分ペプチドを抗原として免疫した後、そのトランスジェニック動物の血液、ミルク中等からその抗体遺伝子に由来する抗体を大量に取得することも可能である。また、上記トランスジェニック動物の中には、内因性抗体遺伝子を欠失した且つヒト抗体遺伝子を保有するマウスやウシ等のヒト抗体産生動物も知られているので、このような動物を利用する場合には、ヒトFRβに結合する完全ヒト抗体を得ることができる(例えば国際公開WO96/9634096、WO96/33735、WO98/24893等)。さらにまた、当該動物の抗体産生細胞(例えばB細胞)とミエローマ細胞から作製したハイブリドーマをin vitroで培養する場合には、上記のような手法で、モノクローナル抗体を産生することもできる。このとき、培養する細胞種の特性、試験研究の目的及び培養方法等の種々の条件に応じて、ハイブリドーマを増殖、維持及び保存させ、培養上清中にモノクローナル抗体を産生させるために用いられるような既知の栄養培地又は基本培地から誘導調製されるあらゆる栄養培地を用いて実施することが可能である。
産生されたモノクローナル抗体は、当該技術分野において周知の方法、例えばプロテインAあるいはプロテインGカラムによるクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、硫安塩析法、ゲル濾過、アフィニティクロマトグラフィー等を適宜組み合わせることにより精製することができる。
本発明で使用可能な抗体はまた、キメラ抗体であることができる。キメラ抗体は、例えばMorrison et al.,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.,81:6851−6855;Neuberger et al.,1984,Nature,312:604−608;Takeda et al.,1985,Nature,314:452−454に記載される技術を用いて製造することができる。これらの技術では、適当な抗原特異性を有するマウス抗体分子からの遺伝子を適当な生物学的活性を有するヒト抗体分子からの遺伝子と共にスプライシングする。キメラ抗体は、異なる動物種に由来する異なる部分が存在する分子である。キメラ抗体として、例えば、抗FRβマウス又はラットモノクローナル抗体のH鎖及び/又はL鎖可変領域と他の哺乳動物由来の免疫グロブリン定常領域とを有する抗体を挙げることができる。
本発明においてはまた、例えばマウス又はラットモノクローナル抗体由来の可変領域又は超可変領域を含む可変領域の一部と、ヒト免疫グロブリンの定常領域、又はヒト免疫グロブリンの可変領域の一部及び定常領域、とを有する抗体、例えば「ヒト化抗体」を挙げることができる。ヒト化抗体の場合、マウス由来の抗体領域部分は約10%未満が望ましい。
上記ヒト化抗体は、例えば抗ヒトFRβマウスモノクローナル抗体(又は抗マウスFRβラットモノクローナル抗体)のH鎖可変領域及び/又はL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR1、2及び3)を含むアミノ酸配列を含むことができる。さらに具体的には、以下の抗体を例示することができる。
(1)以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるH鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む抗体:
(a)配列番号3に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b)配列番号3に示す塩基配列において1個~数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号3に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号3に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(2)以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む抗体:
(a)配列番号4に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b)配列番号4に示す塩基配列において1個~数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号4に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号4に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(3)以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるH鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む抗体:
(a)配列番号5に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b)配列番号5に示す塩基配列において1個~数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号5に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号5に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(4)以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む抗体:
(a)配列番号6に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b)配列番号6に示す塩基配列において1個~数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号6に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号6に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(5)以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるH鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む抗体:
(a)配列番号7に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b)配列番号7に示す塩基配列において1個~数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号7に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号7に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(6)以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む抗体:
(a)配列番号8に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b)配列番号8に示す塩基配列において1個~数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号8に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号8に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(7)以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるH鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む抗体:
(a)配列番号9に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b)配列番号9に示す塩基配列において1個~数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号9に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号9に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(8)以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む抗体:
(a)配列番号10に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b)配列番号10に示す塩基配列において1個~数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号10に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号10に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
なお、配列番号3~10のCDR1~3のヌクレオチド位置を下記表1に示す。
このようにして同定されたヒトアクセプター抗体H鎖及びL鎖配列をコードする塩基配列をベースにして、その可変領域の一部をマウス抗体のものと置換するように組換えを行う。得られたヒト/マウスキメラH鎖及びL鎖をコードするDNAを発現ベクターに組込み、適当な宿主細胞に形質転換することによって、ヒト化抗体をクローン化、産生することができる。
上記のようなキメラ抗体、ヒト化抗体は、ヒトへの適用に際し、抗原性を低減できるという利点を有する。
本発明において使用する抗体はまた、例えば米国特許第4,946,778号;Bird,1988,Science 242:423−426;Huston et al.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879−5883;Ward et al.,1989,Nature 334:544−546に記載される技術を用いて作製した、FRβタンパク質又はその部分ペプチドに対する一本鎖抗体(scFv)であってもよい。本発明において使用する一本鎖抗体は、例えば上述のモノクローナル抗体のH鎖可変領域(例えば配列番号3、5、7、9)及びL鎖可変領域遺伝子(例えば配列番号4、6、8、10)の配列情報に基づき、常法に従ってそれぞれH鎖フラグメントとL鎖フラグメントを調製し、アミノ酸架橋によってFv領域のH鎖フラグメントとL鎖フラグメントとを連結し、一本鎖のポリペプチドを得ることにより形成することができる。
1.2 細胞毒素又は細胞毒性剤
本発明に使用することができる細胞毒素は、強皮症関連マクロファージの細胞死を誘導する目的で使用することができる任意の細胞毒素であり、例えば緑膿菌外毒素(Pseudomonas aeruginosa exotoxin)、リシンA鎖(ricin A chain)、脱糖鎖リシンA鎖(deglycosylated ricin A chain)、リボゾーム不活性化タンパク質(a ribosome inactivating protein)、アルファサルシン(alpha−sarcin)、ゲロニン(gelonin)、アスペルギリン(aspergillin)、リストリクトシン(restrictocin)、リボヌクレアーゼ(ribonuclease)、エポドフィロトキシン(epidophyllotoxin)、ジフテリアトキシン(diphtheria toxin)等を挙げることができる。本発明においては、特に、PE38等の緑膿菌外毒素を使用することが好ましい。
あるいは、本発明に使用することができる細胞毒性剤は、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗生物質、分子標的薬、植物アルカロイド、ホルモン剤等から適宜選択可能である。このような細胞毒性剤としては、強皮症関連マクロファージを死滅させることができるものが好ましい。また、FRβを細胞表面に発現する線維化細胞の場合には、線維化細胞の死滅も誘導可能な細胞毒性剤を利用することができる。
1.3 リコンビナントイムノトキシン等の複合体
本発明における複合体の1つであるリコンビナントイムノトキシンを作製するために、上記のようにして作製された抗体又はその部分ペプチドは細胞毒素とコンジュゲートされる。すなわち、本発明におけるリコンビナントイムノトキシンとは、標的(すなわちFRβタンパク質)に結合する上記抗体が、細胞毒素又はそのサブユニットにコンジュゲートされたキメラ分子である。本発明においては、植物や細菌等に由来する細胞毒素、ヒト起源の細胞毒素、合成の細胞毒素を使用することができる。
抗体と細胞毒素とのコンジュゲートは、以下のようにして行うことができる。すなわち、抗体分子中の反応性基(例えばアミノ基、カルボキシル基、水酸基等)を利用し、該反応性基と反応しうる官能基を持つ細胞毒素と該抗体とを接触させることによって、リコンビナントイムノトキシンを得ることができる。あるいは、上記抗体のH鎖可変領域遺伝子(配列番号3、5、7、9)及びL鎖可変領域遺伝子(配列番号4、6、8、10)の配列情報に基づき、遺伝子工学的手法により、H鎖フラグメント又はL鎖フラグメントのいずれかを細胞毒素との融合タンパク質として作製し、細胞毒素と融合していない他方のフラグメントと一緒に、SH結合を介して一本鎖抗体又は二本鎖抗体を形成させることによって、リコンビナントタンパク質を作製してもよい。SH結合を介したH鎖フラグメントとL鎖フラグメントの結合は、βメルカプトエタノールやジチオスレイトール等の還元剤によってメルカプト基(−SH基)を露出後、両者を混和することによって達成することができる。
本発明において使用するリコンビナントイムノトキシンの一例として、それぞれ上記マウス−マウスハイブリドーマクローン36b細胞又はクローン94bが産生するモノクローナル抗体と緑膿菌外毒素とのリコンビナントイムノトキシンであるリコンビナントイムノトキシンが挙げられる。マウス−マウスハイブリドーマクローン36bと緑膿菌外毒素のリコンビナントイムノトキシンは、例えば配列番号11に示すポリペプチドから成るH鎖と、配列番号12に示すポリペプチドから成るL鎖との一本鎖又は二本鎖抗体である。またマウス−マウスハイブリドーマクローン94bが産生するモノクローナル抗体と緑膿菌外毒素とのリコンビナントイムノトキシンは、例えば配列番号13に示すポリペプチドから成るH鎖と、配列番号14に示すポリペプチドから成るL鎖との一本鎖又は二本鎖抗体である。
本発明において使用する複合体のもう1つの例は、上記のFRβに結合する抗体と細胞毒性剤との結合体である。一般に、抗体の定常領域、好ましくはC末端側に細胞毒性剤を結合することができる。結合は、抗体タンパク質のNH2基、SH基、OH基、COOH基等を利用し、これと反応性の官能基を持つ細胞毒性剤とを、場合により例えば炭化水素リンカーを介して、化学的に結合することによって実施できる。
2.治療剤
こうして作製された複合体は、強皮症関連マクロファージに特異的に高発現しているFRβを標的とし、強皮症関連マクロファージの細胞死を誘導して皮膚の線維化を抑制することができる。
このように、本発明におけるリコンビナントイムノトキシン等の複合体は、ミサイル療法等の治療目的に使用可能な複合体であり、強皮症に対する治療効果を有するものである。また、当該複合体は、強皮症において特異的に高発現しているFRβを標的とするため、正常細胞への影響が少なく、副作用のリスクが低いという利点を有する。
本発明における複合体は、これを有効成分として含有する強皮症治療剤として製剤化される。すなわち、本発明に係る強皮症治療剤は、治療上有効量の複合体を含むものである。ここで、「治療上有効量」とは、所与の症状や用法について治療効果を与え得る量を指し、強皮症治療剤を適用する対象の性別、年齢、体重、疾患の重篤度、投与経路等様々な要因に応じて変化する。例えば、所与の用法に従って、60kgの成人に、本発明における複合体が1日当たり200μg以上、好ましくは500μg以上の量で投与される量を治療上有効量として含むことができる。
本発明に係る強皮症治療剤は、複合体に加えて、生理学的に許容し得る製薬上の添加物、例えば希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバント、酸化防止剤、等張化剤、賦形剤及び担体等の1種以上を含むことができる。また強皮症の治療に効果的な他の薬剤との混合物としてよい。このような薬剤として、抗TGF−β抗体、immunoglobulin、プロスタグランジンE1等を挙げることができる。
本発明に係る強皮症治療剤は、経口投与、或いは注射、例えばボーラス注射又は連続注入による非経口投与(すなわち静脈内又は筋肉内投与)用に製剤化することができる。注射用製剤は、保存剤を添加して、例えばアンプル又は複数回投与容器中の単位投与剤形として提供することができる。あるいは、本発明に係る強皮症治療剤は、好適なビヒクル、例えば発熱物質不含の滅菌水等で使用前に再構成するための凍結乾燥粉剤としてもよい。
投与経路は、経口経路、並びに静脈内、筋肉内、皮下及び腹腔内の注射等が考えられる。あるいは、患者の患部に直接本発明に係る強皮症治療剤を接触させてもよい。
本発明に係る強皮症治療剤を適用する対象は特に限定されず、強皮症に罹患している患者(特に、早期の強皮症罹患患者)、強皮症を治療している患者等のいずれであってもよい。またその対象はヒトに限らず、ヒト以外の哺乳動物であってもよい。例えば、ヒト以外の哺乳動物として、ヒト、マウス、ラット、サル、ウサギ、イヌ、ネコ等を例として挙げることができる。
また、本発明は、上述の複合体又は強皮症治療剤の治療上有効量を強皮症患者に投与することを含む、強皮症の治療方法に関する。
3.強皮症の診断
上記第1節で説明した抗体又は複合体は、強皮症の診断、例えば、強皮症の存在又は不在、及び該疾患を有するリスクを判定するために使用することができる。
具体的には、本発明は、被験者由来の皮膚組織サンプルを、上記第1節で説明した抗体又は複合体(発蛍光団、色素、放射性同位元素等のラベルで標識された抗体又は複合体(強皮症診断剤)、或いは、非標識抗体又は複合体)と接触させ、FRβ発現強皮症関連マクロファージの存在又は当該マクロファージの皮膚への浸潤を指標として、強皮症の存在又は不在、及び該疾患を有するリスクを測定(検査)する方法を提供する。
例えば、被験者由来の皮膚組織サンプルを、上述の抗体又は複合体(発蛍光団、色素、放射性同位元素等のラベルで標識された抗体又は複合体(強皮症診断剤)、或いは、非標識抗体又は複合体)と接触させて、FRβ発現マクロファージが該皮膚組織中に存在するか否かあるいはFRβ発現マクロファージが皮膚組織へ浸潤しているか否かを調べ、陰性対照(例えば健常者の皮膚組織サンプル)と比較して、FRβ発現マクロファージが有意に存在するか又は皮膚組織へ浸潤している場合に、強皮症の存在を検査することができる。
あるいは、本発明は、強皮症治療を受けているか又は受けた被験者由来の皮膚組織サンプルを、上述の抗体又は複合体(発蛍光団、色素、放射性同位元素等のラベルで標識された抗体又は複合体(強皮症診断剤)、或いは、非標識抗体又は複合体)と接触させて、FRβ発現強皮症関連マクロファージの存在又は不在あるいは皮膚組織への浸潤の存在又は不在を指標として強皮症治療の治療効果を判定する方法を提供する。
本明細書で使用する「判定する」という用語は、医師の判断、すなわち医療行為を意図したものではなく、医師に検査結果の情報又はデータを提示し、医師の判断を助けるための手段を意味する。従って、「判定する」という用語は、「測定する」、「検査する」、「決定する」又は「評価する」等の用語で置き換えることができる。
本発明はさらに、上記測定又は判定方法等において使用するための強皮症診断剤又は強皮症診断キットも提供する。
強皮症診断剤又は強皮症診断キットには、上記抗体又は複合体、あるいは上記抗体又は複合体に更に標識を結合した複合体を含めることができる。標識には、例えば発蛍光団(例えばGFP等)、色素、放射性同位元素(例えば、18F−FDG)等が含まれる。
上記抗体又は複合体によるFRβ発現マクロファージの検出は、ELISA、蛍光抗体法、放射免疫法、サンドイッチ法、組織染色法等によって行うことができる。二次抗体に、例えば酵素(例えばペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等)、発蛍光団(例えばFITC、テトラメチルローダミン、テキサスレッド等)、色素、放射性同位元素等のラベル(標識)を結合したものを使用して、マクロファージに結合した抗体又は複合体を検出する。ラベルの結合には、化学的結合法、ビオチン−(ストレプト)アビジン系を利用する結合法等が含まれる。
画像診断の場合には、薬学的に許容可能な放射性核種や発光体を上述の抗体又は複合体にラベルし、被験者に該抗体又は複合体を投与し、PET/CT等の画像診断技術を使用して画像をとり、FRβ発現強皮症関連マクロファージの存在又は皮膚への浸潤を判定又は検査することができる。
本発明に係る強皮症診断キットには、上記(標識された、又は標識されない)抗体又は複合体或いはそれらを含む造影剤の他に、測定に使用するためのバッファー、ラベル化二次抗体等の試薬、測定手順を記載した使用説明書等を含めることができる。試薬は、別々の容器に密封される。
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
〔参考例1〕リコンビナント抗FRβイムノトキシンの製造
本参考例では、国際公開WO2010/098503の実施例の記載に準じて、リコンビナント抗FRβイムノトキシンを以下のように作製した。
1−1.抗ヒトFRβマウスモノクローナル抗体及び抗マウスFRβラットモノクローナル抗体の製造
[抗原であるFRβ発現細胞の調製]
関節リウマチ滑膜又はBalb/cマウス肝臓からTrizol(GibcoBRL)、cDNA synthesis kit(Invitrogen)にて添付説明書に従って全RNAを抽出後、SuperScript plasmid System(Invitrogen)にて添付説明書に従ってcDNAを合成した。次に、1μlのリウマチ滑膜、又はBalb/cマウス肝臓cDNAをそれぞれ別個にBioneer PCR premix(Bioneer)に加え、10ピコモル量に調整したセンスプライマー(ヒトリウマチ滑膜:agaaagacatgggtctggaaatggatg(配列番号15);マウス肝臓:tctagaaagacatggcctggaaacag(配列番号16))及びアンチセンスプライマー(ヒトリウマチ滑膜:gactgaactcagccaaggagccagagtt(配列番号17);マウス肝臓:cccaacatggatcaggaact(配列番号18))を加え、94℃20秒、58℃30秒、72℃60秒で30サイクルPCRを行い、その後72℃5分で反応させることにより、ヒトあるいはマウスFRβを増幅した。増幅したFRβ遺伝子のPCR産物をプラスミドPCR2.1−TOPO(Invitrogen)にライゲーションを行った。すなわち、PCR産物2.5μlにNaCl溶液を1μL、滅菌蒸留水1.5μl、ベクタープラスミド(PCR2.1−TOPO)1μLを加えて室温で5分間インキュベートし、その内の2μLを大腸菌(TOP10F’)に加えて氷中で30分反応後、42℃30秒の熱処理し、氷中で2分間静置し、250μLのSOC培地を加えた後、37℃で1時間シェーカー内で培養した。培養終了後、LB培地に捲き、37℃で一晩培養した。
大腸菌培養の為、プレート上より採取した白いコロニーをアンピシリン(50mg/mL)を含むLB液体培地に加えて37℃一晩培養した。プラスミドの精製はQiagenプラスミド精製キット(Qiagen)にて行った。組み込まれたFRβ遺伝子は、制限酵素EcoRIによる処理後、アガロース電気泳動に展開し、約0.8kb(782bp)のFRβ遺伝子産物を確認後、その部位を切り出し、遺伝子産物の抽出をQuiagen PCR purification kit(Quiagen)にて精製した。次に予めEcoRI処理を行った哺乳細胞発現用ベクターpER−BOS(Mizushima et al.pEF−BOS,a powerful mammalian expression vector.Nucleic Acid Res.1990;18(17):5322)と混和し、T4 ligase(Roshe)を用いてライゲーションを行った。ライゲーション産物の大腸菌(TOP10F’)への遺伝子導入並びにFRβ遺伝子の確認は上記と同様の手法で行った。
pEF−BOSに組み込まれたFRβ遺伝子を確認後、ヒトFRβを含むベクターはマウスB300−19細胞に、マウスFRβを含むベクターはラットRBL2H3細胞にそれぞれ遺伝子導入を行った。すなわち、予め1x105個に調整した各細胞に、20μLのリポフェクタミン(GibcoBRL)と混和したFRβベクター1μgを加えて遺伝子導入を行った。遺伝子導入されたB300−19マウス細胞及びラットRBL2H3細胞は抗生物質G418耐性を獲得するため、1mg/mLの濃度のG418を含む培地にて遺伝子導入された細胞を選択培養した。遺伝子導入された細胞のFRβ遺伝子導入の確認はPCR法にて行った。すなわち、1x107個に調整した各細胞をcDNA synthesis kit(Invitrogen)にてcDNAを合成し、10ピコモル量に調整したセンスプライマー(ヒトリウマチ滑膜:agaaagacatgggtctggaaatggatg(配列番号15);マウス肝臓:tctagaaagacatggcctggaaacag(配列番号16))及びアンチセンスプライマー(ヒトリウマチ滑膜:gactgaactcagccaaggagccagagtt(配列番号17);マウス肝臓:cccaacatggatcaggaact(配列番号18))をBioneer PCR premix(Bioneer)に加え、94℃20秒、58℃30秒、72℃60秒で30サイクルPCRを行い、その後72℃5分で反応させることにより、ヒトあるいはマウスFRβを増幅した。増幅後アガロース電気泳動を行い、FRβが示すバンド0.8kbを確認した。
[抗ヒトFRβマウスモノクローナル抗体及び抗マウスFRβラットモノクローナル抗体の作製]
FRβ発現マウスB300−19細胞あるいはラットRBL2H3細胞を1x107個に調整し、フロインド完全アジュバンドと混合し、Balb/Cマウス(抗ヒトFRβモノクローナル抗体用)あるいはWhister Kyotoラット(抗マウスFRβモノクローナル抗体用)の尾部に3ヵ所、腹腔内に免疫した。この免疫を2~4回繰り返した。
モノクローナル抗体の作製はKolerの方法(Kohler & Milstein,Nature(1975)256:495−96)に従って行った。すなわち、脾臓あるいは腸骨リンパ節を取りだし、単一細胞に解離させた。解離した細胞を骨髄腫由来の細胞(NS−1)と細胞融合させてハイブリドーマを作製し、HAT選択培地にて培養し、培養上清中に分泌された抗体を、先のFRβ発現細胞との反応性で選別を行った。
得られたハイブリドーマのクローン化は、96穴プレートの各穴当たり1細胞となるように調整した限界希釈培養にて行った。クローン化細胞の選別は、FRβ発現細胞との反応性で行った。
クローン化したハイブリドーマを1x107個に調整し、ヌードマウス腹腔内に投与して腹水を調整し、Protein Gカラム(GEバイオサイエンス)にてモノクローナル抗体を精製した。精製したマウス及びラットモノクローナル抗体のアイソタイプは、アイソタイピングELISAキット(Pharmingen)を用いて決定した。その結果、抗ヒトFRβマウスモノクローナル抗体はIgG2aタイプのクローン36bとIgG1タイプの94bの二つが得られ、抗マウスFRβラットモノクローナル抗体は、IgG2aタイプのCL5とCL10の二つが得られた。これら各抗体の抗原に対する反応性はフローサイトメトリーにて解析した。
[抗ヒトFRβマウスモノクローナル抗体及び抗マウスFRβラットモノクローナル抗体の重鎖遺伝子可変領域(VH)及び軽鎖遺伝子可変領域(VL)遺伝子の決定]
マウスハイブリドーマクローン36b、94bを1x107個にそれぞれ調整し、cDNA synthesis kit(Invitrogen)にてcDNAを合成した。36b及び94bはIg−Prime Kitを用いてVH及びVLの遺伝子をPCRにて決定した。PCR条件は添付の説明書に従って行った。すなわち、94℃60秒、50℃60秒、72℃120秒で30サイクルPCRを行い、その後72℃5分で反応させ、VH及びVLの遺伝子を増幅した。増幅したVH及びVLのPCR産物をプラスミドPCR2.1−TOPO(Invitrogen)にライゲーションし、大腸菌(TOP10F’)に遺伝子導入した。遺伝子導入した大腸菌よりプラスミドを精製し、36b、94bのVH及びVLの塩基配列を決定した。塩基配列はBigDye Terminaor V3.1 cycle sequencing kit(ABI)を用いてPCRを行い、PCR産物をABI 310 DNA sequencerにて解析した。
ラットハイブリドーマクローンCL5、CL10を1x107個にそれぞれ調整し、cDNA synthesis kit(Invitrogen)にてcDNAを合成した。次に、Ig−Prime Kit及びラットVH増幅用にデザインしたプライマー(caccatggagttacttttgag(配列番号19))を用い、VH及びVLの遺伝子をPCRで増幅させた。増幅したVH及びVLのPCR産物をプラスミドPCR2.1−TOPO(Invitrogen)にライゲーションし、大腸菌(TOP10F’)に遺伝子導入した。次に、大腸菌よりプラスミドを精製し、VH及びVLの塩基配列を決定した。塩基配列はBigDye Terminaor V3.1 cycle sequencing kit(ABI)を用いてPCRを行い、ABI 310 DNA sequencerにて解析した。
1−2.リコンビナント抗FRβイムノトキシンの製造
[免疫グロブリン重鎖遺伝子可変領域(VH)にシステインの変異を導入]
抗ヒトFRβマウスモノクローナル抗体94bの免疫グロブリン重鎖遺伝子可変領域(VH)の63番目のアミノ酸グリシン(塩基配列ggc)をシステイン(塩基配列tgt)に変異させるようにデザインしたプライマーを作製し(センスプライマー:cagaggcctgaacattgtctggagtggattggaag(配列番号20)、アンチセンスプライマー:cttccaatccactccagacactgttcaggcctctg(配列番号21))、Quick change site−directed mutagenesis kit(Stratagene)を用いて上記第1−1節で得た94bのVHを含むプラスミドpCR2.1−TOPO 94bVHに変異誘発処理を行った。このPCR反応は、反応液を95℃30秒、55℃60秒、68℃4分のサイクルを12回連続して行った。抗マウスFRβラットモノクローナル抗体CL10の免疫グロブリン重鎖遺伝子可変領域(VH)へのシステイン導入も上記と同様の方法にてプライマーをデザインして行った(センスプライマー:gtccgccaggctccaacgaagtgtctggagtgggtcgc(配列番号22)、アンチセンスプライマー:gcgacccactccagacacttcgttggagcctggcggac(配列番号23))。
次に、反応後のDNAを大腸菌XL1−Blueに遺伝子導入し、0.1mg/mLのアンピシリンを含むLB培地で選択培養した。選択した形質転換体のプラスミドをQIAprep spin Miniprep KIT(Qiagen)により精製した。さらに塩基配列をBig Dye Terminator v3.1 cycle sequencing kit(ABI)とABI310シーケンサーにて決定し、63番目のグリシンがシステイン(塩基配列tgt)に変異したことを確認した。
[pRK79PE38ベクターに変異を導入したVHを挿入]
次に、PE38遺伝子を含むpRK79ベクターpRK79PE38に、94bVH及びCL10VHの変異を導入したVHの挿入を以下の方法にて行った。
変異を導入した94bの5’末端部と3’末端部のアニーリングプライマーとしてtaagaaggagatatacatatggaggttcagctgcagcagtc(配列番号24)とgccctcgggacctccggaagcttttgaggagactgtgagagtgg(配列番号25)を、CL10の5’末端部と3’末端部のアニーリングプライマーとしてatacatatggaggtgcagctggtggagtctggg(配列番号26)とtccggaagcttttgaggagacagtgactgaagc(配列番号27)をそれぞれデザインした。アニーリングプライマーにはそれぞれ制限酵素であるNdeIがあり、この部位でのクローニングにより、atgを開始コドンとしたタンパク質の発現が可能である。また、もう片方のアニーリングプライマーにはHindIII部位が挿入されており、この部位でのクローニングにより、VHとPE遺伝子が結合した融合タンパク質の発現が可能である。
これらのプライマーの組み合わせとpfu DNA polymerase(Stratagene)を使って変異を導入したpCR2.1−TOPO−94bVH及びpCR2.1−TOPO−CL10VHプラスミドのPCRを行った。この反応は94℃20秒、55℃30秒、72℃60秒で30サイクルPCRを行い、その後72℃5分で反応させた。次に、PCR産物を精製し、精製産物に制限酵素NdeI(New England Biolabs)とHindIII(New England Biolabs)を加えて反応後、電気泳動に展開し、QIAquick gel extraction kit(Qiagen)を用いてゲルから目的の大きさのDNAを回収した。回収したDNAに、制限酵素処理した変異導入VHと同様の制限酵素で処理したpRK79PE38を添加し、さらにLigation High(Toyobo)を用いてVHとpRK79PE38のライゲーション反応を行った。ライゲーション反応終了、大腸菌TOP10F’(Invitrogen)に遺伝子導入し、0.1mg/mLのアンピシリンを含むLB培地にて形質転換体を選択した。選択した形質転換体のプラスミドpRK79−VHPEをQIAprep spin Miniprep KIT(Qiagen)により精製した。さらに塩基配列をBig Dye Terminator v3.1 cycle sequencing kit(ABI)とABI310シーケンサーにて決定し、変異導入VHの塩基配列がpRK79ベクターのPE38塩基配列と連結していることを確認した。
[免疫グロブリン軽鎖遺伝子可変領域にシステイン変異を導入]
抗ヒトFRβマウスモノクローナル抗体94bの免疫グロブリン軽鎖遺伝子可変領域(VL)の125番目のアミノ酸をシステイン(塩基配列tgt)に変異させるようにデザインしたプライマーを作製した(センスプライマー:taagaaggagatatacatatggacattgtgatgtcacaatc(配列番号28)(このプライマーには制限酵素NdeI切断可能な塩基catatgを含むため、この部位でクローニングすることにより、atgを開始コドンとしたタンパク質の発現が可能である);アンチセンスプライマー:gctttgttagcagccgaattcctatttgatttccagcttggtgccacaaccgaacgt(配列番号29)(このプライマーは125番目のアミノ酸をシステイン(tgt)に変異させ、終始コドンtagに続いて制限酵素EcoRI切断可能な塩基gaattcが来るようにデザインしてある))。同様に抗マウスFRβラットモノクローナル抗体CL10の免疫グロブリン軽鎖遺伝子可変領域(VL)の125番目のアミノ酸をシステイン(塩基配列tgt)に変異させるようにデザインしたプライマーを作製した(atacatatggacattgtgatgcccaatctccatcc(配列番号30)及びgctttgttagcagccgaattcctatttgatttccagcttggtgccacaaccgaacgt(配列番号31))。
これらのプライマーの組み合わせとpfu DNA polymerase(Stratagene)を使ってpCR2.1−TOPO−94bVLプラスミドのPCRを行った。この反応は94℃20秒、55℃30秒、72℃60秒で30サイクルPCRを行い、その後72℃5分で反応させた。次に、PCR産物を精製し、精製産物に制限酵素NdeI(New England Biolabs)とEcoRI(New England Biolabs)を加えて反応後、電気泳動に展開し、QIAquick gel extraction kit(Qiagen)を用いてゲルから目的の大きさのDNAを回収した。回収したDNAに、制限酵素処理した変異導入VLと同様の制限酵素で処理したpRK79PE38を添加し、さらにLigation High(Toyobo)を用いてVHとpRK79PE38のライゲーション反応を行った。ライゲーション反応終了、大腸菌TOP10F’(Invitrogen)に遺伝子導入し、0.1mg/mLのアンピシリンを含むLB培地にて形質転換体を選択した。選択した形質転換体のプラスミドpRK79−VLPEをQIAprep spin Miniprep KIT(Qiagen)により精製した。さらに塩基配列をBig Dye Terminator v3.1 cycle sequencing kit(ABI)とABI310シーケンサーにて決定し、変異導入VLの125アミノ酸がシステインに変異していることや、終始コドンtagが配置されていることを確認した。
[リコンビナントタンパク質封入体の調製]
上記の変異導入VHを組み込んだプラスミドpRK79−94bVHPE、pRK79−CL10VHPE、変異導入VLを組み込んだプラスミドpRK79−VL94b、pRK79−VLCL10を50ng調整し、タンパク質発現用大腸菌BL21(DE3)に遺伝子導入した。遺伝子が導入された大腸菌の選抜は0.1mg/mLのアンピシリンを含むLB培地にて37℃15~18時間の培養で行った。
選択終了後の大腸菌は1000mLのスーパーブロース培地で37℃の条件で培養し、可視吸光度600nmで1.0−1.5に到達するまで培養した。培養後、IPTG(isopropyl−beta−D−thio−galactopyranoside)を終濃度1mMになるように培地に添加し、さらに90分間37℃で培養した。培養終了後、遠心分離にて大腸菌を回収後、50mMトリス緩衝液(pH7.4、20mM EDTAを含む)を用いて200mLとなるまで懸濁した。懸濁終了後、卵白リゾチームを最終濃度0.2mg/mLとなるように加え、室温で1時間反応させて大腸菌の破壊を行った。破壊後、20,000xgで遠心分離を行い、沈殿を回収した。沈殿物はさらに50mMトリス緩衝液(pH7.4、2.5%のTritonX−100、0.5M NaCl、20mM EDTAを含む)で200mLとなるまで懸濁し、卵白リゾチームを最終濃度0.2mg/mLとなるように加え、室温で1時間反応させた。反応終了後、20,000xgで遠心分離を行い、沈殿を回収した。沈殿はさらに50mMトリス緩衝液(pH7.4、2.5%のTritonX−100、0.5M NaCl、20mM EDTAを含む)で200mLとなるまで懸濁し、十分混和させた後、20,000xgで遠心分離を行い、沈殿を回収した。この操作を5回繰り返した後の沈殿物をリコンビナントイムノトキシン封入体とし、さらに0.1Mトリス緩衝液(pH8.0、6Mグアニジン塩酸塩、1mM EDTAを含む)で溶解させ、最終濃度10mg/mLとなるように調節した。
[リコンビナント二重鎖Fv抗FRβイムノトキシンの作製]
上記で調製した94b−VHPEと94b−VL、CL10−VHPEとCL10−VLを混和させ、リコンビナント二重鎖Fv抗FRβイムノトキシンを作製した。
まず、0.5mLのVHPE、0.25mLのVLを混和し、ジチオトレイトール(DTT)を最終濃度10mg/mLとなるように加え、室温で4時間の還元処理を行った。処理後、75mLの0.1Mトリス緩衝液(pH8.0、0.5Mアルギニン、0.9mM酸化型グルタチオン、2mM EDTAを含む)に溶解させた。この溶液を10℃で40時間放置することによって、VHとVLを結合させた。結合終了後、分子量10,000カットの遠心濃縮器(Centricon 10、Amicon)で5mLまで濃縮し、さらに50mLのトリス緩衝液(pH7.4、0.1M尿素、1mM EDTAを含む)で希釈した。この希釈液をリコンビナントイムノトキシン精製の出発物質とした。
次に、トリス緩衝液(pH7.4、1mM EDTAを含む)で平衡化したイオン交換カラムHi−Trap Q(GE)に、30mL/時間の流速で、上記出発物質を吸着させた後、トリス緩衝液(pH7.4、1mM EDTAを含む)で洗浄した。洗浄後、吸着したリコンビナントタイプイムノトキシンの溶出をトリス緩衝液(pH7.4、0.3M NaCl、1mM EDTAを含む)で行った。溶出サンプルはトリス緩衝液(pH7.4、1mM EDTAを含む)で透析した後、イオン交換カラムPOROS HQ(POROS)でさらに精製した。すなわち、透析した精製物質を10mL/分の流速で吸着させ、トリス緩衝液(pH7.4、1mM EDTAを含む)で洗浄後、上記緩衝液に0Mから1.0MのNaCl勾配を設定することにより、リコンビナントタイプイムノトキシンの溶出を行った。精製リコンビナントタイプイムノトキシンの最終調製はTSK300SW(Tosoh)ゲル濾過クロマトグラフィーにて行った。まず、75%の消毒用エタノールで48時間洗浄することによってTSK300SWカラム中のエンドトキシン除去を行った。次に日本薬局方注射用蒸留水で洗浄し、その後日本薬局方生理食塩水でTSK300SWカラムの平衡化を行った。平衡化終了後、リコンビナントタイプイムノトキシンを投与し、流速0.25mL/分でカラムからの溶出液を採取した。採取後、0.22μmの濾過滅菌機で処理し、純度をSDS−PAGEにて確認後、−80℃で保存した。
[SDS−PAGEによる純度検定]
SDS−PAGE(ドデシル硫酸ナトリウムを含むポリアクリルアミド電気泳動)は0.1%のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を含む12%ポリアクリルアミドの平板ゲルを用い、移動相には終濃度0.1%のSDS、130mMグリシン、25mMトリスを含む水溶液を用いた。各サンプルは終濃度0.1%のSDSを含む100mMトリス緩衝液pH6.5で調整し、5分間の煮沸処理を行った。煮沸終了後、平板ゲルにサンプルを投与し、30mAの定電流で電気泳動を展開させた。展開後、0.05%のクマシーブリリアントブルーR溶液(ナカライテスク)でリコンビナントタイプイムノトキシンの染色を行った。
強皮症モデルマウスにおけるリコンビナント抗FRβイムノトキシンによる強皮症治療の評価
1−1.材料及び方法
[強皮症モデルマウスの作製]
8週齢20gぐらいのC3H/HeJ純系マウスの背部両側の皮膚を、直径20mmぐらいに毛を剃ってモデル作製用のマウスを用意した。
一方、抗腫瘍性抗生物質である注射用医薬品ブレオマイシン(日本化薬株式会社製)をリン酸バッファーで0.5mg/mlの濃度に溶解させた。無菌状態の当該ブレオマイシン溶液100μlを上記マウスの右側の皮膚に、またリン酸バッファー100μlを対照群として同一マウスの左側の皮膚に毎日皮下注射した。全ての注射は直径8~9mm前後の定められた部位に打った。
本実験は2つのセットに分かれて行った。ワンセットはブレオマイシンの注射後3日、1週、2週、4週後にマウスを3匹ずつ屠殺して、ブレオマイシン注射の皮膚と対照皮膚へのマクロファージ浸潤を調べた。
別のワンセットは、ブレオマイシン注射開始次の日から静脈注射による参考例1で作製したリコンビナント抗FRβイムノトキシンを用いた治療を併用で行った。本実施例で使用するリコンビナント抗FRβイムノトキシンは、抗マウスFRβラットモノクローナル抗体CL10由来の免疫グロブリン重鎖可変領域(VH)と緑膿菌外毒素(PE38)とが連結した融合タンパク質と抗マウスFRβラットモノクローナル抗体CL10由来の免疫グロブリン軽鎖可変領域(VL)とから成る二重鎖Fv抗FRβイムノトキシンである。
先ず、リコンビナント抗FRβイムノトキシンがトランスフォーミング増殖因子−β(TGF−β)mRNA及び結合組織増殖因子(CTGF)mRNAの発現に影響があるか否かを調べるために、6匹のマウスをランダムに2群に分けて、一組はリコンビナント抗FRβイムノトキシンをリン酸バッファーに溶かして0.25mg/kg/100μl/マウスの量で3日に一回マウス尾静脈にて投与した。コントロール群は100μl/マウスのリン酸バッファーを静脈注射した。計3回の静脈注射とブレオマイシンの7日目の皮下注射後24時間の時、マウスを屠殺して生検用の直径5mmテルマパンチでブレオマイシン注射の中心部位皮膚を取った。
続いて、リコンビナント抗FRβイムノトキシンの抗線維化効果を観察するために、マウス30匹をランダムに3組に分けて、一組において0.25mg/kg/100μl/マウスの量でリコンビナント抗FRβイムノトキシンを尾静脈注射し、もう一組においてFRβ結合部位が欠けたコントロールVHPE(抗体の結合を欠くVH鎖と緑膿菌毒素)を0.25mg/kg/100μl/マウスの量で尾静脈注射し、更にもう一組においてリン酸バッファー100μlを尾静脈注射した。ブレオマイシン皮下注射開始次の日から三日に一回で2週間、合計5回投与した後、続いてブレオマイシンだけの投与2週間、即ち4週間後にマウスを屠殺して抗線維化効果を検討した。
なお、上述の実験は全て重複実験で行った。
[TGF−βmRNAとCTGFmRNAの相対定量]
治療1週後のマウス皮膚からトータルRNAを抽出した。皮膚サンプルに500μlのSepasol(登録商標)−RNA I Super G(Nacalai Tesque)を加え、ホモジナイズ後、室温で5分間静置した。次いで、200μlのクロロホルムを加え、転倒混和し、室温で5分間静置した。静置後、4℃、12,000xgで15分間遠心し、上層(水相)を別チューブに移した。
さらに、当該上層含有チューブに500μlの2−プロパノールを加え、転倒混和し、室温で10分間静置した。静置後、4℃、12,000xgで10分間遠心し、上清(約1ml)を除いてから、1mlの75%エタノールを加えて撹拌し、ペレットを懸濁させた。懸濁後、4℃、12,000xgで5分間遠心し、上清(約1ml)を除いた。75%エタノール洗浄をもう一回行った後、ペレットを乾かして、20μlのDEPC処理水でRNAを融解し、0.5μlのRNase Inhibitor(TOYOBO)を加えて、RNaseの活性を抑えた。
得られた各トータルRNAサンプルを、トータルRNA総量が800ngで且つ容量7μlになるように調整して、逆転写PCRに使用した。
逆転写PCRでは、最初65℃で5分間インキュベートし、氷上で急冷して、RNAの変性を行った。続き、各サンプルにReverTra Ace(登録商標)qPCR RT Kit(TOYOBO)の5×RT buffer 2μl、RT Enzyme Mix 0.5μl及びPrimer Mix 0.5μlを添加し、37℃で15分間インキュベートして逆転写PCRを行った。逆転写PCR後、サンプルを98℃で5分間インキュベートし、酵素失活反応を行った後、サンプルをReal time PCR反応に使用した。
上述の実験で得たcDNAの10倍希釈液2μl、Taqman(登録商標)Gene expression master mix 10μl、20×Taqman Gene Expression Assay Mix 1μl及びDEPC処理水7μl(合計20μl反応液/well)で、Roche社のlightcycler 2.0機におけるReal time PCR分析を行った。温度設定は以下の通りである:開始95℃、10分後にサイクルに入る;変性95℃:15秒、アニール60℃:1分の45サイクルの反応をさせ、蛍光を測定した。
用いたプローブは以下の3種類である:
CTGFプローブsequence−GCCCTGCCCTAGCTGCCTACCGACT(配列番号32);
Glyceraldehyde−3−phosphate dehydrogenase(GAPDH)プローブsequence−GGTGTGAACGGATTTGGCCGTATTG(配列番号33);
TGF−β1プローブsequence−CTATTGCTTCAGCTCCACAGAGAAG(配列番号34)。
コントロール群の対照皮膚の一つのサンプルをリファレンス遺伝子として、1、1/2、1/4、1/8の比率で希釈し、反応させ、標準曲線を作成した。全ての測定は重複ウェルを設置し、平均値を取った。測定結果は、GAPDH遺伝子を内因性コントロールとして、同一サンプルのターケット遺伝子との割合にて補正を行い、リファレンスターゲット遺伝子との比率で表した相対定量である。
[免疫染色を用いたマクロファージ皮膚浸潤検討]
直径5mmテルマパンチで取った皮膚サンプルをOCTで包埋して−80℃にて凍らせた。次いで、クリオスタットで厚さ5μmの皮膚横断面切片を作製し、−20℃のアセトンの中で一夜放置し、固定した。固定後、切片をアセトンの中から取り出し、十分乾燥させた後、0.3% H2O溶液で10分反応させ、内在性ペルオキシダーゼ活性をブロックした。次いで、切片をリン酸バッファーで洗浄し、ノン血清プロテインブロック試薬(Dako製)と室温で1時間インキュベートし、非特異性反応を抑えた。一次抗体としてラット抗マウスCD68(マクロファージマーカー)又はラット抗マウスFRβを5μg/mlの濃度で、切片と室温で1時間反応させた。リン酸バッファーによる洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗ラット2次抗体(ニチレイ製)を、切片と室温で1時間インキュベートさせた。2次抗体を洗浄した後、Nova Red発色試薬で免疫反応を可視化した。
結果の検定として顕微鏡下で褐色に染まったCD68又はFRβ陽性細胞を数えた。顕微鏡下で、皮膚の真皮から皮下脂肪組織までの構造が40倍の視野に満たされるように動かして、一匹のマウスでランダムに5ヶ所視野の陽性細胞数を数え、その平均値を皮膚に浸潤したマクロファージ陽性細胞数の統計に用いた。
[ハイドロキシプロリンアッセイ]
参考例1で作製したリコンビナント抗FRβイムノトキシンを用いた治療を併用して4週後のマウス皮膚を液体窒素で潰し、75%エタノール500μlで収集して、110℃で30分間乾燥させた。乾燥後、サンプルに6Nの塩酸を500μl添加し、110℃で一夜放置した。次いで、0.5Mの500μlナトリウムバッファーに2−propanolを添加して10%に調整した溶液250μlをサンプルと混濁し、中和した後、12,000xgで10分間遠心し、上清を取った。
0.5M酢酸ナトリウムの2−propanol溶液で1.4%のクロラミンTを調整し、1.4%のクロラミンT溶液500μlを、得られた上清サンプルに添加した。室温で10分インキュベートし、クロラミンTによって酸化されたハイドロキシプロリンに0.1%P−ジメチルアミノベンズアルデヒド溶液500μlを添加した。P−ジメチルアミノベンズアルデヒドは70%のMethylcellosolveに30%の過酸化酸(60%の溶液)の比率で融解させたものである。サンプルを60℃で20分反応させた後、マイクロプレートリーダーで550nMの吸光度を測定した。ターゲットサンプルと同時にL−4−ハイドロキシプロリン12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/mlのスタンダードの吸光度も測定した。L−4−ハイドロキシプロリンの吸光度で標準曲線を作成してターゲットサンプルのハイドロキシプロリン量を求めた。
[皮膚の厚さの検定]
上述のクリオスタットで作製した厚さ5μmの皮膚横断面切片をヘマトキシリンとイオジンでHE染色を行った。ヘマトキシリンを30秒反応させ、核を染めた後、イオジンで細胞質を染色し、100%エタノールで脱水し、キシリンで透明、永久性封入剤で封入した。10倍の顕微鏡下で、多層鱗状上皮の下から脂肪組織までの距離、即ち、真皮の厚さを測定した。一つのサンプルでランダムに5ヶ所の距離を測り、平均値を取って統計を行った。
[統計]
全ての有意差を求める統計は、One−way analysis of variance(ANOVA)で有意差を確認した後、post hoc analysisのBonferroni/Dunn testで有意差を検定した。
1−2.結果及び考察
[BLM(ブレオマイシン)で誘発した強皮症モデルマウスでのFRβ+マクロファージ]
マウス皮膚にBLMを毎日皮下注射し、3日、1週、2週後のマクロファージの動態的変化を観察した。
結果を図1及び2に示す。BLMの代わりにリン酸バッファーを皮下注射した皮膚を陰性コントロール(N.C)とした。陰性コントロールに比べてBLM注射後、CD68(マクロファージマーカーとして使われている膜タンパク質)陽性マクロファージとFRβ陽性マクロファージの皮膚への浸潤は徐々に増加して2週の時にピークに達した。
[強皮症モデルマウスにおけるリコンビナント抗FRβイムノトキシンを用いた治療]
BLM注射開始の次の日からリン酸バッファー(Vehicle)、抗体の結合を欠くVH鎖と緑膿菌毒素(VHPE)又はリコンビナント抗FRβイムノトキシンを3日に一回2週間、合計5回で静脈注射(IV)した。治療1週後にトランスフォーミング増殖因子−β(TGF−β)mRNA及び結合組織増殖因子(CTGF)mRNAを測定し、4週後にhydroxyproline分析を通じて皮膚のコラーゲン量、又HE染色をしたマウスの皮膚の厚さを顕微鏡下で測定した。更に、4週後の皮膚のマクロファージ浸潤を調べた。
(1)TGF−β1 mRNA及びCTGF mRNAの変化
結果を図3に示す。BLM注射開始1週間後、皮膚のTGF−β1 mRNAとCTGF mRNAはそれぞれ2.4倍、1.4倍上昇したが、リコンビナント抗FRβイムノトキシン治療によってこれらのサイトカインmRNA量は低下した。このように、リコンビナント抗FRβイムノトキシン治療によって強皮症の発病早期のTGF−β mRNA発現量を抑制した。
図4は、強皮症モデルマウス皮膚でのCD68陽性マクロファージとFRβ陽性マクロファージにおけるTGF−β1の発現を示す免疫組織学的染色像である。また、図5は、強皮症モデルマウス皮膚でのCD68陽性マクロファージとFRβ陽性マクロファージにおけるTGF−β1陽性細胞数(%)を示すグラフである。図4及び5に示すように、FRβ陽性マクロファージにおけるTGF−β1発現の割合は、CD68陽性マクロファージにおけるTGF−β1発現の割合より有意に高かった。
(2)治療後の皮膚マクロファージの変化
結果を図6及び7に示す。4週後の皮膚サンプルで、リコンビナント抗FRβイムノトキシンで治療したグループのCD68陽性マクロファージ数とFRβ陽性マクロファージ数は有意に減少した。
(3)抗線維化効果
結果を図8~10に示す。リコンビナント抗FRβイムノトキシンを投与したグループ(FR−β−rIT)のコラーゲンの主成分であるハイドロキシプロリン量は、溶媒だけ注射したグループ(Vehicle)と毒素だけ注射したグループ(VHPE)に比べて有意に低下した。皮膚の厚さも、リコンビナント抗FRβイムノトキシンを投与したグループ(FR−β−rIT)は、当該2つのコントロール群に比べて有意に薄くなった。
[まとめ]
リコンビナント抗FRβイムノトキシンは、従来の強皮症の治療に関する報告における抗TGF−β抗体と同じ治療効果を示した。リコンビナント抗FRβイムノトキシンは、抗TGF−β抗体と比べて以下の利点がある。すなわち、抗TGF−β抗体を用いた強皮症の治療に関する報告(J Immunol.1999 Nov 15;163(10):5693−9.)では4週続いて治療をしたが、本実施例ではリコンビナント抗FRβイムノトキシンを用いた2週間の治療で有意な治療効果が証明された。短時間の治療は抗体の免疫拒絶反応を避けられる。
また、これまでに、本発明者等は、リコンビナント抗FRβイムノトキシンが肺線維症に効果があることを報告した(Clinical and Experimental immunology(2010)Vol.161,pp.348−356)。しかしながら、動物モデル肺疾患に効果的な投与経路である鼻腔経路では効果があったものの、ヒト疾患に一般的な静脈経路においては効果が得られなかった。鼻腔内投与経路は、毒素に対する抗体産生が少ないことや直接肺に到達する等の利点があるものの、本実施例において、皮膚線維化抑制が静脈経路において効果が得られたことは、当該イムノトキシンの新たな投与経路を示す。
臓器の線維化のメカニズムには臓器固有に存在する細胞が関与することから、種々の臓器において線維化のメカニズムは異なっており、例えば肺線維症に効果のある薬剤が皮膚の線維化を抑制するとは限らない。従って、本実施例において、リコンビナント抗FRβイムノトキシンが皮膚の線維化抑制に有効であったことは、新たな皮膚線維化抑制薬を提供することを示す。
1−1.材料及び方法
[強皮症モデルマウスの作製]
8週齢20gぐらいのC3H/HeJ純系マウスの背部両側の皮膚を、直径20mmぐらいに毛を剃ってモデル作製用のマウスを用意した。
一方、抗腫瘍性抗生物質である注射用医薬品ブレオマイシン(日本化薬株式会社製)をリン酸バッファーで0.5mg/mlの濃度に溶解させた。無菌状態の当該ブレオマイシン溶液100μlを上記マウスの右側の皮膚に、またリン酸バッファー100μlを対照群として同一マウスの左側の皮膚に毎日皮下注射した。全ての注射は直径8~9mm前後の定められた部位に打った。
本実験は2つのセットに分かれて行った。ワンセットはブレオマイシンの注射後3日、1週、2週、4週後にマウスを3匹ずつ屠殺して、ブレオマイシン注射の皮膚と対照皮膚へのマクロファージ浸潤を調べた。
別のワンセットは、ブレオマイシン注射開始次の日から静脈注射による参考例1で作製したリコンビナント抗FRβイムノトキシンを用いた治療を併用で行った。本実施例で使用するリコンビナント抗FRβイムノトキシンは、抗マウスFRβラットモノクローナル抗体CL10由来の免疫グロブリン重鎖可変領域(VH)と緑膿菌外毒素(PE38)とが連結した融合タンパク質と抗マウスFRβラットモノクローナル抗体CL10由来の免疫グロブリン軽鎖可変領域(VL)とから成る二重鎖Fv抗FRβイムノトキシンである。
先ず、リコンビナント抗FRβイムノトキシンがトランスフォーミング増殖因子−β(TGF−β)mRNA及び結合組織増殖因子(CTGF)mRNAの発現に影響があるか否かを調べるために、6匹のマウスをランダムに2群に分けて、一組はリコンビナント抗FRβイムノトキシンをリン酸バッファーに溶かして0.25mg/kg/100μl/マウスの量で3日に一回マウス尾静脈にて投与した。コントロール群は100μl/マウスのリン酸バッファーを静脈注射した。計3回の静脈注射とブレオマイシンの7日目の皮下注射後24時間の時、マウスを屠殺して生検用の直径5mmテルマパンチでブレオマイシン注射の中心部位皮膚を取った。
続いて、リコンビナント抗FRβイムノトキシンの抗線維化効果を観察するために、マウス30匹をランダムに3組に分けて、一組において0.25mg/kg/100μl/マウスの量でリコンビナント抗FRβイムノトキシンを尾静脈注射し、もう一組においてFRβ結合部位が欠けたコントロールVHPE(抗体の結合を欠くVH鎖と緑膿菌毒素)を0.25mg/kg/100μl/マウスの量で尾静脈注射し、更にもう一組においてリン酸バッファー100μlを尾静脈注射した。ブレオマイシン皮下注射開始次の日から三日に一回で2週間、合計5回投与した後、続いてブレオマイシンだけの投与2週間、即ち4週間後にマウスを屠殺して抗線維化効果を検討した。
なお、上述の実験は全て重複実験で行った。
[TGF−βmRNAとCTGFmRNAの相対定量]
治療1週後のマウス皮膚からトータルRNAを抽出した。皮膚サンプルに500μlのSepasol(登録商標)−RNA I Super G(Nacalai Tesque)を加え、ホモジナイズ後、室温で5分間静置した。次いで、200μlのクロロホルムを加え、転倒混和し、室温で5分間静置した。静置後、4℃、12,000xgで15分間遠心し、上層(水相)を別チューブに移した。
さらに、当該上層含有チューブに500μlの2−プロパノールを加え、転倒混和し、室温で10分間静置した。静置後、4℃、12,000xgで10分間遠心し、上清(約1ml)を除いてから、1mlの75%エタノールを加えて撹拌し、ペレットを懸濁させた。懸濁後、4℃、12,000xgで5分間遠心し、上清(約1ml)を除いた。75%エタノール洗浄をもう一回行った後、ペレットを乾かして、20μlのDEPC処理水でRNAを融解し、0.5μlのRNase Inhibitor(TOYOBO)を加えて、RNaseの活性を抑えた。
得られた各トータルRNAサンプルを、トータルRNA総量が800ngで且つ容量7μlになるように調整して、逆転写PCRに使用した。
逆転写PCRでは、最初65℃で5分間インキュベートし、氷上で急冷して、RNAの変性を行った。続き、各サンプルにReverTra Ace(登録商標)qPCR RT Kit(TOYOBO)の5×RT buffer 2μl、RT Enzyme Mix 0.5μl及びPrimer Mix 0.5μlを添加し、37℃で15分間インキュベートして逆転写PCRを行った。逆転写PCR後、サンプルを98℃で5分間インキュベートし、酵素失活反応を行った後、サンプルをReal time PCR反応に使用した。
上述の実験で得たcDNAの10倍希釈液2μl、Taqman(登録商標)Gene expression master mix 10μl、20×Taqman Gene Expression Assay Mix 1μl及びDEPC処理水7μl(合計20μl反応液/well)で、Roche社のlightcycler 2.0機におけるReal time PCR分析を行った。温度設定は以下の通りである:開始95℃、10分後にサイクルに入る;変性95℃:15秒、アニール60℃:1分の45サイクルの反応をさせ、蛍光を測定した。
用いたプローブは以下の3種類である:
CTGFプローブsequence−GCCCTGCCCTAGCTGCCTACCGACT(配列番号32);
Glyceraldehyde−3−phosphate dehydrogenase(GAPDH)プローブsequence−GGTGTGAACGGATTTGGCCGTATTG(配列番号33);
TGF−β1プローブsequence−CTATTGCTTCAGCTCCACAGAGAAG(配列番号34)。
コントロール群の対照皮膚の一つのサンプルをリファレンス遺伝子として、1、1/2、1/4、1/8の比率で希釈し、反応させ、標準曲線を作成した。全ての測定は重複ウェルを設置し、平均値を取った。測定結果は、GAPDH遺伝子を内因性コントロールとして、同一サンプルのターケット遺伝子との割合にて補正を行い、リファレンスターゲット遺伝子との比率で表した相対定量である。
[免疫染色を用いたマクロファージ皮膚浸潤検討]
直径5mmテルマパンチで取った皮膚サンプルをOCTで包埋して−80℃にて凍らせた。次いで、クリオスタットで厚さ5μmの皮膚横断面切片を作製し、−20℃のアセトンの中で一夜放置し、固定した。固定後、切片をアセトンの中から取り出し、十分乾燥させた後、0.3% H2O溶液で10分反応させ、内在性ペルオキシダーゼ活性をブロックした。次いで、切片をリン酸バッファーで洗浄し、ノン血清プロテインブロック試薬(Dako製)と室温で1時間インキュベートし、非特異性反応を抑えた。一次抗体としてラット抗マウスCD68(マクロファージマーカー)又はラット抗マウスFRβを5μg/mlの濃度で、切片と室温で1時間反応させた。リン酸バッファーによる洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗ラット2次抗体(ニチレイ製)を、切片と室温で1時間インキュベートさせた。2次抗体を洗浄した後、Nova Red発色試薬で免疫反応を可視化した。
結果の検定として顕微鏡下で褐色に染まったCD68又はFRβ陽性細胞を数えた。顕微鏡下で、皮膚の真皮から皮下脂肪組織までの構造が40倍の視野に満たされるように動かして、一匹のマウスでランダムに5ヶ所視野の陽性細胞数を数え、その平均値を皮膚に浸潤したマクロファージ陽性細胞数の統計に用いた。
[ハイドロキシプロリンアッセイ]
参考例1で作製したリコンビナント抗FRβイムノトキシンを用いた治療を併用して4週後のマウス皮膚を液体窒素で潰し、75%エタノール500μlで収集して、110℃で30分間乾燥させた。乾燥後、サンプルに6Nの塩酸を500μl添加し、110℃で一夜放置した。次いで、0.5Mの500μlナトリウムバッファーに2−propanolを添加して10%に調整した溶液250μlをサンプルと混濁し、中和した後、12,000xgで10分間遠心し、上清を取った。
0.5M酢酸ナトリウムの2−propanol溶液で1.4%のクロラミンTを調整し、1.4%のクロラミンT溶液500μlを、得られた上清サンプルに添加した。室温で10分インキュベートし、クロラミンTによって酸化されたハイドロキシプロリンに0.1%P−ジメチルアミノベンズアルデヒド溶液500μlを添加した。P−ジメチルアミノベンズアルデヒドは70%のMethylcellosolveに30%の過酸化酸(60%の溶液)の比率で融解させたものである。サンプルを60℃で20分反応させた後、マイクロプレートリーダーで550nMの吸光度を測定した。ターゲットサンプルと同時にL−4−ハイドロキシプロリン12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/mlのスタンダードの吸光度も測定した。L−4−ハイドロキシプロリンの吸光度で標準曲線を作成してターゲットサンプルのハイドロキシプロリン量を求めた。
[皮膚の厚さの検定]
上述のクリオスタットで作製した厚さ5μmの皮膚横断面切片をヘマトキシリンとイオジンでHE染色を行った。ヘマトキシリンを30秒反応させ、核を染めた後、イオジンで細胞質を染色し、100%エタノールで脱水し、キシリンで透明、永久性封入剤で封入した。10倍の顕微鏡下で、多層鱗状上皮の下から脂肪組織までの距離、即ち、真皮の厚さを測定した。一つのサンプルでランダムに5ヶ所の距離を測り、平均値を取って統計を行った。
[統計]
全ての有意差を求める統計は、One−way analysis of variance(ANOVA)で有意差を確認した後、post hoc analysisのBonferroni/Dunn testで有意差を検定した。
1−2.結果及び考察
[BLM(ブレオマイシン)で誘発した強皮症モデルマウスでのFRβ+マクロファージ]
マウス皮膚にBLMを毎日皮下注射し、3日、1週、2週後のマクロファージの動態的変化を観察した。
結果を図1及び2に示す。BLMの代わりにリン酸バッファーを皮下注射した皮膚を陰性コントロール(N.C)とした。陰性コントロールに比べてBLM注射後、CD68(マクロファージマーカーとして使われている膜タンパク質)陽性マクロファージとFRβ陽性マクロファージの皮膚への浸潤は徐々に増加して2週の時にピークに達した。
[強皮症モデルマウスにおけるリコンビナント抗FRβイムノトキシンを用いた治療]
BLM注射開始の次の日からリン酸バッファー(Vehicle)、抗体の結合を欠くVH鎖と緑膿菌毒素(VHPE)又はリコンビナント抗FRβイムノトキシンを3日に一回2週間、合計5回で静脈注射(IV)した。治療1週後にトランスフォーミング増殖因子−β(TGF−β)mRNA及び結合組織増殖因子(CTGF)mRNAを測定し、4週後にhydroxyproline分析を通じて皮膚のコラーゲン量、又HE染色をしたマウスの皮膚の厚さを顕微鏡下で測定した。更に、4週後の皮膚のマクロファージ浸潤を調べた。
(1)TGF−β1 mRNA及びCTGF mRNAの変化
結果を図3に示す。BLM注射開始1週間後、皮膚のTGF−β1 mRNAとCTGF mRNAはそれぞれ2.4倍、1.4倍上昇したが、リコンビナント抗FRβイムノトキシン治療によってこれらのサイトカインmRNA量は低下した。このように、リコンビナント抗FRβイムノトキシン治療によって強皮症の発病早期のTGF−β mRNA発現量を抑制した。
図4は、強皮症モデルマウス皮膚でのCD68陽性マクロファージとFRβ陽性マクロファージにおけるTGF−β1の発現を示す免疫組織学的染色像である。また、図5は、強皮症モデルマウス皮膚でのCD68陽性マクロファージとFRβ陽性マクロファージにおけるTGF−β1陽性細胞数(%)を示すグラフである。図4及び5に示すように、FRβ陽性マクロファージにおけるTGF−β1発現の割合は、CD68陽性マクロファージにおけるTGF−β1発現の割合より有意に高かった。
(2)治療後の皮膚マクロファージの変化
結果を図6及び7に示す。4週後の皮膚サンプルで、リコンビナント抗FRβイムノトキシンで治療したグループのCD68陽性マクロファージ数とFRβ陽性マクロファージ数は有意に減少した。
(3)抗線維化効果
結果を図8~10に示す。リコンビナント抗FRβイムノトキシンを投与したグループ(FR−β−rIT)のコラーゲンの主成分であるハイドロキシプロリン量は、溶媒だけ注射したグループ(Vehicle)と毒素だけ注射したグループ(VHPE)に比べて有意に低下した。皮膚の厚さも、リコンビナント抗FRβイムノトキシンを投与したグループ(FR−β−rIT)は、当該2つのコントロール群に比べて有意に薄くなった。
[まとめ]
リコンビナント抗FRβイムノトキシンは、従来の強皮症の治療に関する報告における抗TGF−β抗体と同じ治療効果を示した。リコンビナント抗FRβイムノトキシンは、抗TGF−β抗体と比べて以下の利点がある。すなわち、抗TGF−β抗体を用いた強皮症の治療に関する報告(J Immunol.1999 Nov 15;163(10):5693−9.)では4週続いて治療をしたが、本実施例ではリコンビナント抗FRβイムノトキシンを用いた2週間の治療で有意な治療効果が証明された。短時間の治療は抗体の免疫拒絶反応を避けられる。
また、これまでに、本発明者等は、リコンビナント抗FRβイムノトキシンが肺線維症に効果があることを報告した(Clinical and Experimental immunology(2010)Vol.161,pp.348−356)。しかしながら、動物モデル肺疾患に効果的な投与経路である鼻腔経路では効果があったものの、ヒト疾患に一般的な静脈経路においては効果が得られなかった。鼻腔内投与経路は、毒素に対する抗体産生が少ないことや直接肺に到達する等の利点があるものの、本実施例において、皮膚線維化抑制が静脈経路において効果が得られたことは、当該イムノトキシンの新たな投与経路を示す。
臓器の線維化のメカニズムには臓器固有に存在する細胞が関与することから、種々の臓器において線維化のメカニズムは異なっており、例えば肺線維症に効果のある薬剤が皮膚の線維化を抑制するとは限らない。従って、本実施例において、リコンビナント抗FRβイムノトキシンが皮膚の線維化抑制に有効であったことは、新たな皮膚線維化抑制薬を提供することを示す。
本発明によれば、新規な強皮症治療剤が提供される。本発明に係る強皮症治療剤は、皮膚の線維化に関与するFRβ発現マクロファージの細胞死又は細胞傷害を選択的に誘導することによって、強皮症の治療効果をもたらすことができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
Claims (15)
- 葉酸受容体β(FRβ)に結合する抗体と細胞毒素又は細胞毒性剤とをコンジュゲートした複合体を有効成分として含有する強皮症治療剤。
- 前記複合体は、リコンビナントイムノトキシンである、請求項1記載の強皮症治療剤。
- 前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるH鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、請求項1又は2記載の強皮症治療剤。
(a)配列番号3に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b)配列番号3に示す塩基配列において1個~数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号3に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号3に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。 - 前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、請求項1又は2記載の強皮症治療剤。
(a)配列番号4に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b)配列番号4に示す塩基配列において1個~数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号4に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号4に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。 - 前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるH鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、請求項1又は2記載の強皮症治療剤。
(a)配列番号5に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b)配列番号5に示す塩基配列において1個~数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号5に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号5に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。 - 前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、請求項1又は2記載の強皮症治療剤。
(a)配列番号6に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b)配列番号6に示す塩基配列において1個~数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号6に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号6に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。 - 前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるH鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、請求項1又は2記載の強皮症治療剤。
(a)配列番号7に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b)配列番号7に示す塩基配列において1個~数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号7に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号7に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。 - 前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、請求項1又は2記載の強皮症治療剤。
(a)配列番号8に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b)配列番号8に示す塩基配列において1個~数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号8に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号8に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。 - 前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるH鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、請求項1又は2記載の強皮症治療剤。
(a)配列番号9に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b)配列番号9に示す塩基配列において1個~数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号9に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号9に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。 - 前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、請求項1又は2記載の強皮症治療剤。
(a)配列番号10に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b)配列番号10に示す塩基配列において1個~数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号10に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号10に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。 - 前記細胞毒素は、緑膿菌外毒素(Pseudomonas aeruginosa exotoxin)、リシンA鎖(ricin A chain)、脱糖鎖リシンA鎖(deglycosylated ricin A chain)、リボゾーム不活性化タンパク質(a ribosome inactivating protein)、アルファサルシン(alpha−sarcin)、ゲロニン(gelonin)、アスペルギリン(aspergillin)、リストリクトシン(restrictocin)、リボヌクレアーゼ(ribonuclease)、エポドフィロトキシン(epidophyllotoxin)及びジフテリアトキシン(diphtheria toxin)から成る群より選択されるものである、請求項1~10のいずれか1項記載の強皮症治療剤。
- 前記複合体は、配列番号11に示すポリペプチドから成るH鎖と、配列番号12に示すポリペプチドから成るL鎖との一本鎖又は二本鎖抗体である、請求項1記載の強皮症治療剤。
- 前記複合体は、配列番号13に示すポリペプチドから成るH鎖と、配列番号14に示すポリペプチドから成るL鎖との一本鎖又は二本鎖抗体である、請求項1記載の強皮症治療剤。
- 標識に結合した、請求項1~13のいずれか1項に規定される葉酸受容体β(FRβ)に結合する抗体又は該抗体と細胞毒素若しくは細胞毒性剤とをコンジュゲートした複合体を含む強皮症診断剤。
- 請求項1~13のいずれか1項に規定される葉酸受容体β(FRβ)に結合する抗体又は該抗体と細胞毒素若しくは細胞毒性剤とをコンジュゲートした複合体、又は請求項14記載の強皮症診断剤を含む強皮症診断キット。
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Title |
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