WO2014084394A1

WO2014084394A1 - Method for identifying and separating cell and device for identifying and separating cell

Info

Publication number: WO2014084394A1
Application number: PCT/JP2013/082310
Authority: WO
Inventors: 泰成韓; 杉原　宏和
Original assignee: パナソニック株式会社
Priority date: 2012-11-27
Filing date: 2013-11-26
Publication date: 2014-06-05
Also published as: JP2016026471A

Abstract

The purpose of the present invention is to improve the safety in healthcare. For this purpose, provided is a method for identifying and separating an undifferentiated cell (2) from a cell group from which the differentiation of the undifferentiated cell (2) has been induced, said method comprising an undifferentiated cell-labeling step for contacting the cell group, from which the differentiation of the undifferentiated cell (2) has been induced, with an antibody drug, wherein an antibody (9) capable of specifically binding to the undifferentiated cell (2) is bound to an undifferentiated cell inactivator, and allowing the undifferentiated cell (2) to bind to the antibody drug.

Description

細胞識別分離方法および細胞識別分離装置Cell identification separation method and cell identification separation apparatus

　本発明は、細胞識別分離方法および細胞識別分離装置に関するものである。 The present invention relates to a cell identification separation method and a cell identification separation apparatus.

　従来の細胞識別、分離の方法の一つに、フローサイトメトリがある。フローサイトメトリでは、細胞をばらばらに分解し、細胞を懸濁液の状態にした状態で、細胞表面マーカー認識抗体と蛍光標識により細胞を種類別標識した後、細胞を１個ずつ流しながら蛍光標識物を確認し、細胞を分離する方法である（非特許文献１）。 One of the conventional cell identification and separation methods is flow cytometry. In flow cytometry, cells are disassembled into pieces, and cells are classified into cells by cell surface marker recognition antibodies and fluorescent labels in a state of suspension. This is a method for confirming an object and separating cells (Non-patent Document 1).

　また、未分化細胞を排除するための遺伝子を導入して、分化細胞から未分化細胞を選択的に排除する手段がある（特許文献１）。 There is also a means for selectively removing undifferentiated cells from differentiated cells by introducing a gene for eliminating undifferentiated cells (Patent Document 1).

特表２００４−５２３２１７号公報JP-T-2004-523217

　上記従来例における課題は、健康上の安全性が低下してしまう可能性が高いことであった。 The problem with the above conventional example is that there is a high possibility that health safety will be reduced.

　すなわち、ＥＳ細胞や、ｉＰＳ細胞など未分化細胞から治療を目的に分化誘導した細胞集団の中には、未分化細胞を完全に分化誘導することができないため、一部混在してしまった未分化細胞が、移植治療後、癌を引き起こすなどの健康上の問題を引き起こす可能性が高かったのであった。 That is, undifferentiated cells that are partially differentiated in the cell population induced to treat from undifferentiated cells such as ES cells and iPS cells for the purpose of treatment cannot be completely differentiated. The cells were likely to cause health problems such as cancer after transplantation.

　現在の再生医療では、未分化細胞を増やし、分化誘導した後、治療に用いる場合において、分化誘導の効率を上げるための多くの研究がされているが、未分化細胞を１００％分化細胞に誘導することは難しいと思われる。また、分化誘導後にも混在する未分化細胞を治療に用いると人体の中で癌化する可能性が心配されている。 In the current regenerative medicine, many researches have been conducted to increase the efficiency of differentiation induction when increasing the number of undifferentiated cells and inducing differentiation and then using it for treatment. Inducing undifferentiated cells to 100% differentiated cells. It seems difficult to do. In addition, there is concern about the possibility of canceration in the human body when undifferentiated cells that are mixed even after induction of differentiation are used for treatment.

　この問題を解決するための従来法として、上記特許文献１の遺伝子導入する方法があるが、この遺伝子導入を用いて未分化細胞を選択的に排除する方法は、細胞を選別する手段にはなり得るが、遺伝子導入により以下の２点において健康上の問題を及ぼす可能性がある。 As a conventional method for solving this problem, there is a method of gene introduction described in Patent Document 1, but a method of selectively eliminating undifferentiated cells using this gene introduction is a means for selecting cells. However, gene transfer may cause health problems in the following two points.

　まず第１点目は、遺伝子を導入することにより細胞の遺伝子が損傷を受ける可能性がある。次に、第２点目として外部の遺伝子を、人体内に入れることになるので、分化誘導後も外部の遺伝子が細胞の中に残ることになり、この点においても健康上の問題となりうるのである。 First, the first point is that the gene of the cell may be damaged by the introduction of the gene. Next, as the second point, an external gene is put into the human body, so that the external gene remains in the cell even after induction of differentiation, and this can also be a health problem. is there.

　そこで本発明は、健康上の安全性を向上することを目的とするものである。 Therefore, the object of the present invention is to improve health safety.

　そして、この目的を達成するために本発明は、未分化細胞を分化誘導した細胞群から未分化細胞を識別分離する方法であって、未分化細胞を分化誘導した細胞群を、前記未分化細胞に特異的に結合する抗体に未分化細胞不活性化物質を結合させた抗体薬と接触させ、未分化細胞と抗体薬を結合させる未分化細胞標識工程を含む細胞識別分離方法としたので、所期の目的を達成できる。 In order to achieve this object, the present invention provides a method for discriminating and separating undifferentiated cells from a group of cells in which undifferentiated cells have been induced to differentiate, wherein the group of cells in which undifferentiated cells have been induced to differentiate The cell identification and separation method includes an undifferentiated cell labeling step in which an antibody that specifically binds to an antibody is contacted with an antibody drug in which an undifferentiated cell inactivating substance is bound, and the undifferentiated cell and the antibody drug are bound. The purpose of the period can be achieved.

　以上のように本発明は、未分化細胞を分化誘導した細胞群から未分化細胞を識別分離する方法であって、未分化細胞を分化誘導した細胞群を、前記未分化細胞に特異的に結合する抗体に未分化細胞不活性化物質を結合させた抗体薬と接触させ、未分化細胞と抗体薬を結合させる未分化細胞標識工程を含む細胞識別分離方法に関する。また、前記細胞識別分離方法を実施するための装置に関する。さらに、前記細胞識別分離方法を用いて獲得された未分化細胞が除去された細胞集団、および前記細胞集団を含む細胞シートに関する。またさらに、未分化細胞識別抗体および未分化細胞不活性化物質を含む、未分化細胞を識別分離する方法に用いるための試薬（抗体薬）、および前記試薬を含む、未分化細胞を識別分離するためのキットに関する。 As described above, the present invention is a method for discriminating and separating undifferentiated cells from a group of cells that have been induced to differentiate undifferentiated cells, and specifically binding the group of cells that have been induced to differentiate undifferentiated cells to the undifferentiated cells. The present invention relates to a cell identification and separation method including an undifferentiated cell labeling step in which an antibody to which an undifferentiated cell inactivating substance is bound is contacted with an antibody to be bound, and the undifferentiated cell and the antibody are bound. The present invention also relates to an apparatus for carrying out the cell identification / separation method. Furthermore, the present invention relates to a cell population from which undifferentiated cells obtained using the cell identification and separation method are removed, and a cell sheet containing the cell population. Still further, a reagent (antibody drug) for use in a method for discriminating and separating undifferentiated cells, including an undifferentiated cell identifying antibody and an undifferentiated cell inactivating substance, and discriminating and separating undifferentiated cells containing the reagent. For the kit.

　すなわち、未分化細胞と抗原抗体反応をする抗体と、この抗体と一体となった未分化細胞不活性化物質よりなる試薬を用いることで、未分化細胞を分化誘導した細胞群から、未分化細胞を識別、分離することが可能となるので、健康上の安全性を向上することができるのである。 That is, by using a reagent comprising an antibody that undergoes an antigen-antibody reaction with an undifferentiated cell and an undifferentiated cell inactivating substance integrated with the antibody, an undifferentiated cell is differentiated from a group of cells that have been induced to differentiate the undifferentiated cell. Can be identified and separated, so that health safety can be improved.

本発明の一実施形態の工程を示す図。The figure which shows the process of one Embodiment of this invention. 本発明の一実施形態の図。The figure of one embodiment of the present invention. 本発明の一実施形態の主要部の図。The figure of the principal part of one Embodiment of this invention. 本発明の一実施形態の工程を示す図。The figure which shows the process of one Embodiment of this invention. 本発明の一実施形態の工程を示す図。The figure which shows the process of one Embodiment of this invention. 本発明の一実施形態の装置の模式図。The schematic diagram of the apparatus of one Embodiment of this invention. 光感受性物質を結合させた未分化細胞識別抗体による、未分化細胞および分化細胞の染色図。（Ａ）は位相差観察図であり、（Ｂ）は（Ａ）と同視野の蛍光観察図である。The staining figure of an undifferentiated cell and a differentiated cell by the undifferentiated cell identification antibody which couple | bonded the photosensitive substance. (A) is a phase difference observation figure, (B) is a fluorescence observation figure of the same visual field as (A). 光感受性物質が結合した未分化細胞識別抗体を反応させた細胞の、ＬＥＤ照射後の生死判定図。（Ａ）は位相差観察図であり、（Ｂ）は（Ａ）と同視野の蛍光観察図である。The life-and-death determination figure after LED irradiation of the cell which reacted the undifferentiated cell identification antibody which the photosensitive substance couple | bonded. (A) is a phase difference observation figure, (B) is a fluorescence observation figure of the same visual field as (A). 光感受性物質が結合していない未分化細胞識別抗体を反応させた細胞の、ＬＥＤ照射後の生死判定図。（Ａ）は位相差観察図であり、（Ｂ）は（Ａ）と同視野の蛍光観察図である。The life-and-death determination figure after LED irradiation of the cell which reacted the undifferentiated cell identification antibody which the photosensitizer has not couple | bonded. (A) is a phase difference observation figure, (B) is a fluorescence observation figure of the same visual field as (A). 未分化細胞識別抗体（一次抗体）、次いで一次抗体に結合する二次抗体（光感受性物質で標識）を用いた、未分化細胞および分化細胞の染色図。（Ａ）は位相差観察図であり、（Ｂ）は（Ａ）と同視野の蛍光観察図である。The staining figure of an undifferentiated cell and a differentiated cell using the secondary antibody (labeled with a photosensitive substance) couple | bonded with an undifferentiated cell identification antibody (primary antibody) and then a primary antibody. (A) is a phase difference observation figure, (B) is a fluorescence observation figure of the same visual field as (A). 未分化細胞識別抗体（一次抗体）、次いで一次抗体に結合する二次抗体（光感受性物質で標識）を反応させた細胞の、ＬＥＤ照射後の生死判定図。（Ａ）は位相差観察図であり、（Ｂ）は（Ａ）と同視野の蛍光観察図である。The life-and-death determination figure after LED irradiation of the cell which reacted the undifferentiated cell identification antibody (primary antibody) and then the secondary antibody (labeled with a photosensitizer) couple | bonded with a primary antibody. (A) is a phase difference observation figure, (B) is a fluorescence observation figure of the same visual field as (A).

　（実施の形態１）
　以下、本発明の一実施形態を細胞識別分離方法の一例として添付図面を用いて説明する。 (Embodiment 1)
Hereinafter, an embodiment of the present invention will be described as an example of a cell identification separation method with reference to the accompanying drawings.

　図１は、本発明の一実施形態における、未分化細胞不活性化物質として、光感受性物質を用いた細胞識別分離方法を説明する。 FIG. 1 illustrates a cell identification and separation method using a photosensitive substance as an undifferentiated cell inactivating substance in one embodiment of the present invention.

　図１（ａ）の工程は、培養容器１（例えばフィダー細胞が培養されている培養容器）に未分化細胞２を播種した状態であり、図１（ｂ）の工程では、複数の培養容器１内の培地交換をしながら培養を行い、未分化細胞２を未分化状態を維持しながら増殖させていく工程である。 The process of FIG. 1 (a) is a state in which undifferentiated cells 2 are seeded in a culture container 1 (for example, a culture container in which feeder cells are cultured). In the process of FIG. This is a step of culturing while exchanging the medium, and growing the undifferentiated cells 2 while maintaining the undifferentiated state.

　次に、図１（ｃ）の工程では、前工程で増殖させた未分化細胞２を分化細胞３へ分化誘導をする工程を示す。 Next, in the step of FIG. 1 (c), a step of inducing differentiation of the undifferentiated cells 2 grown in the previous step into differentiated cells 3 is shown.

　現在の再生医療では、未分化細胞を増やし、分化誘導した後、治療に用いている。この分化誘導後にも残存する未分化細胞をそのまま残した状態で、細胞膜の移植などの治療に用いると、人体の中で未分化細胞が癌化する可能性が心配されているため、未分化細胞を１００％分化誘導することが必要となっているが、未分化細胞を１００％分化細胞に誘導することは難しいとされている。 In current regenerative medicine, undifferentiated cells are increased and induced for differentiation and then used for treatment. Since there is a concern that undifferentiated cells may become cancerous in the human body when used for treatments such as cell membrane transplantation with the remaining undifferentiated cells remaining after induction of differentiation, undifferentiated cells However, it is difficult to induce undifferentiated cells into 100% differentiated cells.

　このように分化誘導後にも分化細胞３の中に残存する未分化細胞２に対しては、図１（ｄ）の工程に示すように、未分化細胞２を抗原とし、この抗原に結合する抗体と未分化細胞不活性化物質としての光感受性物質を結合させて作った試薬（抗体薬）を混ぜた培地４を形成し、この培地４で分化誘導後の細胞群を一定時間培養して、残存する未分化細胞を抗体薬の抗体部分と結合させて標識する。 Thus, for undifferentiated cells 2 remaining in differentiated cells 3 after differentiation induction, as shown in the step of FIG. 1 (d), an antibody that uses undifferentiated cells 2 as an antigen and binds to this antigen. And a reagent 4 (antibody drug) made by binding a photosensitizing substance as an undifferentiated cell inactivating substance, and a cell group after differentiation induction is cultured in this medium 4 for a certain period of time, The remaining undifferentiated cells are labeled by binding to the antibody portion of the antibody drug.

　次に図１（ｅ）の工程では、試薬を混合した培地４を洗い流し、未分化細胞２と結合していない余分な抗体薬を洗い流す。その結果、細胞群には、未分化細胞２と抗体の結合による標識未分化細胞５ができる。 Next, in the step of FIG. 1 (e), the medium 4 mixed with the reagent is washed away, and the excess antibody drug not bound to the undifferentiated cells 2 is washed away. As a result, labeled undifferentiated cells 5 are formed in the cell group by binding of undifferentiated cells 2 and antibodies.

　次に、図１（ｆ）の工程では、標識未分化細胞５に対して、光感受性物質を活性化させるための光を照射し、光感受性物質を活性化することにより、標識された未分化細胞５を不活性化、つまり死滅させる。ここで用いる光としては、可視光、赤外線（例えば、遠赤外線および近赤外線）、紫外線等が含まれ、光感受性物質の特性等に応じて当業者が適宜選択できるものである。 Next, in the step of FIG. 1 (f), the labeled undifferentiated cells 5 are irradiated with light for activating the photosensitive substance to activate the photosensitive substance, whereby the labeled undifferentiated cells 5 are activated. Cells 5 are inactivated, ie killed. The light used here includes visible light, infrared light (for example, far infrared light and near infrared light), ultraviolet light, and the like, which can be appropriately selected by those skilled in the art according to the characteristics of the photosensitive material.

　次に、図１（ｇ）の工程では、死滅した未分化細胞６の破砕物、および、未反応活性化物質などを洗い流し、分化細胞を得る。なお、光照射後には未分化細胞は死滅しているため、洗い流す工程を経ずに、分化細胞３と死滅した未分化細胞６の混合物をそのまま治療に用いてもよい。この場合、死滅した未分化細胞６と残存する抗体薬は、体内で自然分解されるであろう。また、培養を継続することにより、培養過程中の培地交換に伴って、死滅した未分化細胞６と残存する抗体薬を除去してもよい。あるいは、以下のような、死滅した未分化細胞６と残存する抗体薬を積極的に除去する方法を採用してもよい。まず、光照射後に、細胞間結合物質を分解する試薬（例えばトリプシン）で細胞を処理し、細胞を培養容器から剥がす。これにより、細胞シートまたは細胞群は分離され、各細胞が培養液に懸濁された状態になる。次いで、細胞間結合物質を分解する試薬を排除する（例えば、培地の追加後に遠心分離をし、培地交換を行う）。この際、残存する抗体薬も除去することができる。このようにして得られた細胞懸濁液を用いて、新しい培地中で培養を継続する。新しい培地中で培養を継続すると、細胞懸濁液中の生細胞は培養容器に接着して生育できるが、死滅した細胞は接着できず培地中に存在する。そのため、培地交換の際に死滅した細胞と抗体薬を自然に除去することができる。上述のような、積極的に除去する方法を採用することで、細胞シートまたは細胞群を患者に移植する前に、より早く積極的に死滅した未分化細胞６と残存する抗体薬を排除することが可能となる。 Next, in the step of FIG. 1 (g), dead undifferentiated cell 6 crushed material and unreacted activation substances are washed away to obtain differentiated cells. Since the undifferentiated cells are dead after light irradiation, the mixture of the differentiated cells 3 and the dead undifferentiated cells 6 may be used as it is for the treatment without passing through the washing step. In this case, the dead undifferentiated cells 6 and the remaining antibody drug will be naturally degraded in the body. Further, by continuing the culture, the dead undifferentiated cells 6 and the remaining antibody drug may be removed along with the medium exchange during the culture process. Alternatively, a method of actively removing dead undifferentiated cells 6 and the remaining antibody drug as described below may be employed. First, after light irradiation, the cells are treated with a reagent that decomposes the intercellular binding substance (for example, trypsin), and the cells are detached from the culture vessel. Thereby, the cell sheet or the cell group is separated, and each cell is suspended in the culture solution. Next, a reagent that decomposes the intercellular binding substance is excluded (for example, centrifugation is performed after the addition of the medium, and the medium is exchanged). At this time, the remaining antibody drug can also be removed. Using the cell suspension thus obtained, the culture is continued in a new medium. When the culture is continued in a new medium, viable cells in the cell suspension can grow while adhering to the culture container, but dead cells cannot adhere and exist in the medium. For this reason, cells and antibody drugs that have been killed during medium replacement can be removed naturally. By adopting the method of positive removal as described above, before the cell sheet or group of cells is transplanted to the patient, the undifferentiated cells 6 that have been actively killed earlier and the remaining antibody drug are eliminated. Is possible.

　そして、図１（ｈ）の工程では、未分化細胞排除処理結果を光学システム７を用いて確認する。 Then, in the step of FIG. 1 (h), the undifferentiated cell exclusion process result is confirmed using the optical system 7.

　上記、工程において、図１（ｃ）、図１（ｄ）、図１（ｆ）の工程について、更に詳細に説明する。 In the above process, the processes of FIGS. 1C, 1D, and 1F will be described in more detail.

　図２は、図１（ｃ）、図１（ｄ）、図１（ｆ）の工程における未分化細胞２の識別、分離について説明した図である。 FIG. 2 is a diagram illustrating identification and separation of undifferentiated cells 2 in the steps of FIGS. 1 (c), 1 (d), and 1 (f).

　図２（ａ）は、図１（ｃ）の工程において、分化誘導後の細胞群を拡大したものであり、この細胞群には、分化細胞３と未分化細胞２を含んでいる。 FIG. 2 (a) is an enlarged view of the cell group after differentiation induction in the step of FIG. 1 (c), and this cell group includes differentiated cells 3 and undifferentiated cells 2. FIG.

　この分化誘導後の細胞群に、未分化細胞２を抗原とし、抗体薬としての試薬８を混ぜ合わせる。 The cell group after induction of differentiation is mixed with undifferentiated cells 2 as an antigen and reagent 8 as an antibody drug.

　この試薬８の構造について、図３に示す。 The structure of this reagent 8 is shown in FIG.

　図３に示すように、試薬８は、この抗原に結合する抗体９と未分化細胞不活性化物質としての光感受性物質１０を結合させて作ったものである。この抗体９と、未分化細胞のエピトープ１１部分が、抗体抗原反応によって結合することになる。 As shown in FIG. 3, the reagent 8 is prepared by binding an antibody 9 that binds to this antigen and a photosensitive substance 10 as an undifferentiated cell inactivating substance. This antibody 9 and the epitope 11 portion of undifferentiated cells are bound by antibody antigen reaction.

　再び図２用いた説明を行う。図２（ｂ）に示すように、未分化細胞２のエピトープ１１に、試薬８の抗体９の部分が結合し、標識未分化細胞５として識別可能となる。 The explanation using FIG. 2 will be given again. As shown in FIG. 2 (b), the antibody 9 portion of the reagent 8 binds to the epitope 11 of the undifferentiated cell 2 and can be identified as the labeled undifferentiated cell 5.

　この状態において、光を照射することで、図２（ｃ）に示すように、標識未分化細胞５に結合した試薬８の光感受性物質１０が活性化し、その結果、図２（ｄ）に示すように、標識未分化細胞５は破壊される。 In this state, irradiation with light activates the photosensitizing substance 10 of the reagent 8 bound to the labeled undifferentiated cells 5 as shown in FIG. 2 (c). As a result, the result shown in FIG. Thus, the labeled undifferentiated cells 5 are destroyed.

　上記光感受性物質１０としては、限定するものではないが、ポルフィリン（例えばヘマトポルフィリン、ベンゾポルフィリンおよびジュウテロポルフィリン、ならびにそれらの誘導体）、フタロシアニン色素（ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｄｅ　ｄｙｅ）（例えば亜鉛、シリコンおよびアルミニウムフタロシアニン、ならびにＩＲ７００）、クロリン（例えばティン（ＩＶ）クロリンｅ６（ＳｎＣｅ６）、ティン（ＩＶ）クロリンｅ６のポリ−リジン誘導体、ｍ−テトラヒドロキシフェニルクロリン、ベンゾポルフィリン誘導体、およびティンエチオプルプリン）、バクテリオクロリン、フェノチアジニウム（例えば、トルイジンブルー、メチレンブルーおよびジメチルメチレンブルー）、フェナジン（例えばニュートラルレッド）、アクリジン（例えばアクリフラビン、プロフラビン、アクリジンオレンジおよびアミナクリン）、テキサフィリン、シアニン（例えばメロシアニン５４０）、アントラサイクリン（例えばアドリアマイシンおよびエピルビシン）、フェオホルバイド、サフィリン、フラーレン、ハロゲン化キサンテン（例えばローズベンガル）、ペリレンキノノイド顔料（例えばヒペリシンおよびハイポクレリン）、ギルボカルシン、ターチオフェン、ベンゾフェナントリジン、ソラレンおよびリボフラビンなどがある。 Examples of the photosensitive material 10 include, but are not limited to, porphyrins (eg, hematoporphyrin, benzoporphyrin and deuteroporphyrin, and derivatives thereof), phthalocyanine dyes (eg, zinc, silicon and aluminum phthalocyanines, and IR700), chlorins (eg, tin (IV) chlorin e6 (SnCe6), poly-lysine derivatives of tin (IV) chlorin e6, m-tetrahydroxyphenyl chlorin, benzoporphyrin derivatives, and tin etiopurpurin), bacteriochlorin, pheno Thiazinium (eg toluidine blue, methylene blue and dimethylmethylene blue), phenazine (eg neutral red), acrylic (Eg, acriflavine, proflavine, acridine orange and aminacrine), texaphyrin, cyanine (eg, merocyanine 540), anthracyclines (eg, adriamycin and epirubicin), pheophorbide, saphyrin, fullerene, halogenated xanthene (eg, rose bengal), perylene quino There are noid pigments (eg hypericin and hypocrellin), gilbocalcin, terthiophene, benzophenanthridine, psoralen and riboflavin.

　好ましい実施形態では、上記光感受性物質１０は、近赤外線吸収化合物である。具体的には、例えば、フタロシアニン色素、ポルフィリン、クロリンである。 In a preferred embodiment, the photosensitive substance 10 is a near-infrared absorbing compound. Specific examples include phthalocyanine dyes, porphyrins, and chlorins.

　例示的なフタロシアニン色素としては、限定するものではないが、（ジオール）（ｔ−ブチル）３−フタロシアニン；（ｔ−ブチル）４−フタロシアニン；ｃｉｓ−オクタブトキシ−ジベンゾ−ジナフト−ポルフィラジン；ｔｒａｎｓ−オクタブトキシ−ジベンゾ−ジナフト−ポルフィラジン；２，３，９，１０，１６，１７，２３，２４−オクタキス２−エトキシエトキシ）フタロシアニン；２，３，９，１０，１６，１７，２３，２４−オクタキス（３，６−ジオキサヘプチルオキシ）フタロシアニン；オクタ−ｎ−ブトキシフタロシアニン；フタロシアニン；フタロシアニンスルホネート；フタロシアニンテトラサルホネート；フタロシアニンテトラスルホネート；ｔ−ブチル−フタロシアニン；テトラ−ｔ−ブチルフタロシアニン；テトラジベンゾバレレノ−オクタブトキシ−フタロシアニン；およびＩＲ７００が挙げられる。 Exemplary phthalocyanine dyes include, but are not limited to, (diol) (t-butyl) 3-phthalocyanine; (t-butyl) 4-phthalocyanine; cis-octabutoxy-dibenzo-dinaphth-porphyrazine; Octabutoxy-dibenzo-dinaphth-porphyrazine; 2,3,9,10,16,17,23,24-octakis-2-ethoxyethoxy) phthalocyanine; 2,3,9,10,16,17,23,24- Octakis (3,6-dioxaheptyloxy) phthalocyanine; octa-n-butoxyphthalocyanine; phthalocyanine; phthalocyanine sulfonate; phthalocyanine tetrasulfonate; phthalocyanine tetrasulfonate; t-butyl-phthalocyanine; tetra-t-butyl phthalocyanine Tetra dibenzo Barre Leno - Okutabutokishi - phthalocyanine; and IR700 and the like.

　ＩＲ７００は、以下の式（Ｉ）で表される、近赤外線吸収化合物である。

IR700 is a near-infrared absorbing compound represented by the following formula (I).

　例示的なポルフィリンとしては、限定するものではないが、５−アザプロトポルフィリンジメチルエステル；ビス−ポルフィリン；コプロポルフィリンＩＩＩ；コプロポルフィリンＩＩＩテトラメチルエステル；ジュウテロポルフィリン；ジュウテロポルフィリンＩＸジメチルエステル；ジホルミルジュウテロポルフィリンＩＸジメチルエステル；ドデカフェニルポルフィリン；ヘマトポルフィリン；ヘマトポルフィリンＩＸ；ヘマトポルフィリンモノマー；ヘマトポルフィリンダイマー；ヘマトポルフィリン誘導体；ヘマトポルフィリンＩＸジヒドロクロライド；ヘマトポルフィリンジヒドロクロライド；ヘマトポルフィリンＩＸジメチルエステル；ヘマトポルフィリンＩＸジメチルエステル；メソポルフィリンジメチルエステル；メソポルフィリンＩＸジメチルエステル；モノホルミル−モノビニル−ジュウテロポルフィリンＩＸジメチルエステル；モノヒドロキシエチルビニルジュウテロポルフィリン；５，１０，１５，２０−テトラ（ｏ−ヒドロキシフェニル）ポルフィリン；５，１０，１５，２０−テトラ（ｍ−ヒドロキシフェニル）ポルフィリン；５，１０，１５，２０−テトラキス−（ｍ−ヒドロキシフェニル）ポルフィリン；５，１０，１５，２０−テトラ（ｐ−ヒドロキシフェニル）ポルフィリン；５，１０，１５，２０−テトラキス（３−メトキシフェニル）ポルフィリン；５，１０，１５，２０−テトラキス（３，４−ジメトキシフェニル）ポルフィリン；５，１０，１５，２０−テトラキス（３，５−ジメトキシフェニル）ポルフィリン；５，１０，１５，２０−テトラキス（３，４，５−トリメトキシフェニル）ポルフィリン；２，３，７，８，１２，１３，１７，１８−オクタエチル−５，１０，１５，２０−テトラフェニルポルフィリン；Ｐｈｏｔｏｆｒｉｎ（登録商標）；Ｐｈｏｔｏｆｒｉｎ（登録商標）ＩＩ；ポルフィリンｃ；プロトポルフィリン；プロトポルフィリンＩＸ；プロトポルフィリンジメチルエステル；プロトポルフィリンＩＸジメチルエステル；プロトポルフィリンプロピルアミノエチルホルムアミドヨージド；プロトポルフィリンＮ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルホルムアミド；プロトポルフィリンプロピルアミノプロピルホルムアミドヨージド；プロトポルフィリンブチルホルムアミド；プロトポルフィリンＮ，Ｎ−ジメチルアミノ−ホルムアミド；プロトポルフィリンホルムアミド；サプフィリン１　３，１２，１３，２２−テトラエチル−２，７，１８，２３テトラメチルサプフィリン−８，１７−ジプロパノール；サプフィリン２　３，１２，１３，２２−テトラエチル−２，７，１８，２３テトラメチルサプフィリン−８−モノグリコシド；サプフィリン３；メソ−テトラ−（４−Ｎ−カルボキシフェニル）−ポルフィン；テトラ−（３−メトキシフェニル）−ポルフィン；テトラ−（３−メトキシ−２，４−ジフルオロフェニル）−ポルフィン；５，１０，１５，２０−テトラキス（４−Ｎ−メチルピリジル）ポルフィン；メソ−テトラ−（４−Ｎ−メチルピリジル）−ポルフィンテトラクロライド；メソ−テトラ（４−Ｎ−メチルピリジル）−ポルフィン；メソ−テトラ−（３−Ｎ−メチルピリジル）−ポルフィン；メソ−テトラ−（２−Ｎ−メチルピリジル）−ポルフィン；テトラ（４−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアニリニウム）ポルフィン；メソ−テトラ−（４−Ｎ，Ｎ，Ｎ’’−トリメチルアミノ−フェニル）ポルフィンテトラクロライド；テトラナフタロポルフィリン；５，１０，１５，２０−テトラフェニルポルフィリン；テトラフェニルポルフィリン；メソ−テトラ−（４−Ｎ−スルフォナトフェニル）−ポルフィン；テトラフェニルポルフィンテトラスルホネート；メソ−テトラ（４−スルフォナトフェニル）ポルフィン；テトラ（４−スルフォナトフェニル）ポルフィン；テトラフェニルポルフィリンスルホネート；メソ−テトラ（４−スルフォナトフェニル）ポルフィン；テトラキス（４−スルフォナトフェニル）ポルフィリン；メソ−テトラ（４−スルフォナトフェニル）ポルフィン；メソ（４−スルフォナトフェニル）ポルフィン；メソ−テトラ（４−スルフォナトフェニル）ポルフィン；テトラキス（４−スルフォナトフェニル）ポルフィリン；メソ−テトラ（４−Ｎ−トリメチルアニリニウム）−ポルフィン；ウロポルフィリン；およびウロポルフィリンＩＸが挙げられる。 Exemplary porphyrins include, but are not limited to, 5-azaprotoporphyrin dimethyl ester; bis-porphyrin; coproporphyrin III; coproporphyrin III tetramethyl ester; deuteroporphyrin; deuteroporphyrin IX dimethyl ester; Deuteroporphyrin IX dimethyl ester; dodecaphenyl porphyrin; hematoporphyrin; hematoporphyrin IX; hematoporphyrin monomer; hematoporphyrin dimer; hematoporphyrin derivative; hematoporphyrin IX dihydrochloride; hematoporphyrin dihydrochloride; Dimethyl ester; Mesoporphyrin dimethyl ester; Meso Luffyline IX dimethyl ester; monoformyl-monovinyl-deuteroporphyrin IX dimethyl ester; monohydroxyethyl vinyl deuteroporphyrin; 5,10,15,20-tetra (o-hydroxyphenyl) porphyrin; 5,10,15,20-tetra (M-hydroxyphenyl) porphyrin; 5,10,15,20-tetrakis- (m-hydroxyphenyl) porphyrin; 5,10,15,20-tetra (p-hydroxyphenyl) porphyrin; 5,10,15,20 -Tetrakis (3-methoxyphenyl) porphyrin; 5,10,15,20-tetrakis (3,4-dimethoxyphenyl) porphyrin; 5,10,15,20-tetrakis (3,5-dimethoxyphenyl) porphyrin; 10,1 , 20-tetrakis (3,4,5-trimethoxyphenyl) porphyrin; 2,3,7,8,12,13,17,18-octaethyl-5,10,15,20-tetraphenylporphyrin; Photofrin (registered) Photofrin® II; Porphyrin c; Protoporphyrin IX; Protoporphyrin dimethyl ester; Protoporphyrin IX dimethyl ester; Protoporphyrin propylaminoethylformamide iodide; Protoporphyrin N, N-dimethylaminopropylformamide Protoporphyrin propylaminopropyl formamide iodide; protoporphyrin butylformamide; protoporphyrin N, N-dimethylamino-formamide; Supfilin 1,3,12,13,22-tetraethyl-2,7,18,23 Tetramethyl sapphirine-8,17-dipropanol; Sapphylline 3,12,13,22-tetraethyl-2,7 18,23 tetramethyl sapfilin-8-monoglycoside; sapfilin 3; meso-tetra- (4-N-carboxyphenyl) -porphine; tetra- (3-methoxyphenyl) -porphine; tetra- (3-methoxy-2 , 4-difluorophenyl) -porphine; 5,10,15,20-tetrakis (4-N-methylpyridyl) porphine; meso-tetra- (4-N-methylpyridyl) -porphine tetrachloride; meso-tetra (4 -N-methylpyridyl) -porphine; meso-tetra- (3-N-methyl) Lysyl) -porphine; meso-tetra- (2-N-methylpyridyl) -porphine; tetra (4-N, N, N-trimethylanilinium) porphine; meso-tetra- (4-N, N, N ″ -Trimethylamino-phenyl) porphine tetrachloride; tetranaphthaloporphyrin; 5,10,15,20-tetraphenylporphyrin; tetraphenylporphyrin; meso-tetra- (4-N-sulfonatophenyl) -porphine; tetraphenyl Porphine tetrasulfonate; meso-tetra (4-sulfonatophenyl) porphine; tetra (4-sulfonatophenyl) porphine; tetraphenylporphyrin sulfonate; meso-tetra (4-sulfonatophenyl) porphine; tetrakis (4- Sulfonatophenyl Porphyrin; meso-tetra (4-sulfonatophenyl) porphine; meso (4-sulfonatophenyl) porphine; meso-tetra (4-sulfonatophenyl) porphine; tetrakis (4-sulfonatophenyl) porphyrin; And meso-tetra (4-N-trimethylanilinium) -porphine; uroporphyrin; and uroporphyrin IX.

　例示的なクロリン色素としては、限定するものではないが、５−アザクロリンジメチルエステル誘導体；５，１０，１５，２０−テトラキス−（ｍ−ヒドロキシフェニル）バクテリオクロリン；ベンゾポルフィリン誘導体一酸環Ａ；ベンゾポルフィリン誘導体一酸環−Ａ；ポルフィン−２，１８−ジプロパン酸，７−［２−ジメチル−アミノ）−２−オキソエチル］−８−エチリデン−７，８−ジヒドロ−３，７，１２，１７−テトラメチル，ジメチルエステル；ポルフィン−２，１８−ジプロパン酸，７−［２−ジメチル−アミノ）−２−オキソエチル］−８−エチリデン−８−エチル−７，８−ジヒドロ−３，７，１２，１７−テトラメチル，ジメチルエステルＺ；ポルフィン−２，１８−ジプロパン酸，７−［２−ジメチル−アミノ）−２−オキソエチル］−８−エチリデン−８−エチル−７，８−ジヒドロ−３，７，１２，１７−テトラメチル，ジメチルエステルＺ　ＥＣＨＬ；ポルフィン−２，１８−ジプロパン酸，７−［２−ジメチル−アミノ）−２−オキソエチル］−８−エチリデン−８−ｎ−ヘプチル−７，８−ジヒドロ−３，７，１２，１７−テトラメチル，ジメチルエステルＺ；スズ（ＩＩ）ポルフィン−２，１８−ジプロパン酸，７−［２−（ジメチルアミノ−２−オキソエチル］−８−エチリデン−８−ｎ−ヘプチル−７，８−ジヒドロ−３，７，１２，１７−テトラメチル，ジメチルエステルＺ；クロリンｅ６；クロリンｅ６ジメチルエステル；クロリンｅ６ｋ３；クロリンｅ６モノメチルエステル；クロリンｅ６Ｎａ３；クロリンｐ６；クロリンｐ６−トリメチルエステル；クロリン誘導体亜鉛（ＩＩ）ポルフィン−２，１８−ジプロパン酸，７−［２−（ジメチルアミノ）−２−オキソエチル］−８−エチリデン−８−ｎ−ヘプチル−７，８−ジヒドロ−３，７，１２，１７−テトラメチル，ジメチルエステルＺ；１３１−デオキシ−２０−ホルミル−ｖｉｃ−ジヒドロキシ−バクテリオクロリン　ジ−ｔｅｒｔ−ブチルアスパルテート；１３１−デオキシ−２０−ホルミル−４−ケト−バクテリオクロリン　ジ−ｔｅｒｔ−ブチルアスパルテート；ジ−Ｌ−アスパルチルクロリンｅ６；メソクロリン；５，１０，１５，２０−テトラキス−（ｍ−ヒドロキシフェニル）クロリン；メタ−（テトラヒドロキシフェニル）クロリン；メチル−１３１−デオキシ−２０−ホルミル−４−ケト−バクテリオクロリン；モノ−Ｌ−アスパルチルクロリンｅ６；フォトプロトポルフィリンＩＸジメチルエステル；フィコシアノビリンジメチルエステル；プロトクロロフィリドａ；スズクロリンｅ６；スズＬ−アスパルチルクロリンｅ６；スズオクタエチル−ベンゾクロリン；ティン（ＩＶ）クロリン；亜鉛クロリンｅ６；亜鉛Ｌ−アスパルチルクロリンｅ６および；ティン（ＩＶ）クロリンｅ６（ＳｎＣｅ６）が挙げられる。 Exemplary chlorin dyes include, but are not limited to, 5-azachlorin dimethyl ester derivatives; 5,10,15,20-tetrakis- (m-hydroxyphenyl) bacteriochlorin; benzoporphyrin derivatives monoacid ring A; Benzoporphyrin derivative monoacid ring-A; porphin-2,18-dipropanoic acid, 7- [2-dimethyl-amino) -2-oxoethyl] -8-ethylidene-7,8-dihydro-3,7,12,17 -Tetramethyl, dimethyl ester; porphin-2,18-dipropanoic acid, 7- [2-dimethyl-amino) -2-oxoethyl] -8-ethylidene-8-ethyl-7,8-dihydro-3,7,12 , 17-tetramethyl, dimethyl ester Z; porphin-2,18-dipropanoic acid, 7- [2-dimethyl-amino -2-oxoethyl] -8-ethylidene-8-ethyl-7,8-dihydro-3,7,12,17-tetramethyl, dimethyl ester Z ECHL; porphin-2,18-dipropanoic acid, 7- [2- Dimethyl-amino) -2-oxoethyl] -8-ethylidene-8-n-heptyl-7,8-dihydro-3,7,12,17-tetramethyl, dimethyl ester Z; tin (II) porphine-2,18 Dipropanoic acid, 7- [2- (dimethylamino-2-oxoethyl] -8-ethylidene-8-n-heptyl-7,8-dihydro-3,7,12,17-tetramethyl, dimethyl ester Z; chlorin chlorin e6 dimethyl ester; chlorin e6k3; chlorin e6 monomethyl ester; chlorin e6Na3; chlorin p6; chlorin p -Trimethyl ester; Chlorine derivative zinc (II) porphin-2,18-dipropanoic acid, 7- [2- (dimethylamino) -2-oxoethyl] -8-ethylidene-8-n-heptyl-7,8-dihydro- 3,7,12,17-tetramethyl, dimethyl ester Z; 131-deoxy-20-formyl-vic-dihydroxy-bacteriochlorin di-tert-butyl aspartate; 131-deoxy-20-formyl-4-keto-bacteria Chlorine di-tert-butyl aspartate; di-L-aspartyl chlorin e6; mesochlorin; 5,10,15,20-tetrakis- (m-hydroxyphenyl) chlorin; meta- (tetrahydroxyphenyl) chlorin; methyl-131 -Deoxy-20-formyl-4-keto- Bacteriochlorin; mono-L-aspartylchlorin e6; photoprotoporphyrin IX dimethyl ester; phycocyanobilin dimethyl ester; protochlorophyllide a; tin chlorin e6; tin L-aspartyl chlorin e6; tin octaethyl-benzochlorin; IV) chlorin; zinc chlorin e6; zinc L-aspartyl chlorin e6; and tin (IV) chlorin e6 (SnCe6).

　より好ましい実施形態では、上記光感受性物質１０は、ＩＲ７００またはＳｎＣｅ６である。最も好ましい実施形態では、ＩＲ７００である。 In a more preferred embodiment, the photosensitive material 10 is IR700 or SnCe6. In the most preferred embodiment, it is IR700.

　以上説明したように、未分化細胞を分化誘導した細胞群から、未分化細胞を識別、分離することが可能となるので、例えば、この細胞群を再生医療に用いる場合に、健康上の安全性を向上することができるのである。 As described above, since it becomes possible to identify and separate undifferentiated cells from the cell group in which undifferentiated cells have been induced to differentiate, for example, when using this cell group for regenerative medicine, health safety Can be improved.

　次に、本実施の形態１における細胞識別分離装置について説明する。 Next, the cell identification / separation apparatus according to the first embodiment will be described.

　図６に細胞識別分離装置を示す。 Fig. 6 shows a cell identification / separation apparatus.

　この装置は、上述した図１（ｆ）の工程において、標識未分化細胞５に対して、光感受性物質を活性化させるための光を照射し、光感受性物質を活性化することにより、標識された未分化細胞５を不活性化、つまり死滅させる工程を行う装置である。 In the step of FIG. 1 (f) described above, this device is labeled by irradiating the labeled undifferentiated cells 5 with light for activating the photosensitive substance and activating the photosensitive substance. This is a device for performing a step of inactivating, ie killing, the undifferentiated cells 5.

　まず、使用者は、標識未分化細胞５の入った培養容器１を、標識未分化細胞設置部としての培養容器保持部１６に設置する。そして、操作部１７の操作ボタンを押すと、その操作信号は、制御部１８に入力される。 First, the user installs the culture vessel 1 containing the labeled undifferentiated cells 5 in the culture vessel holding unit 16 as the labeled undifferentiated cell installation unit. When an operation button on the operation unit 17 is pressed, the operation signal is input to the control unit 18.

　次に制御部１８は、光源１９に対して点灯を指示する。光源から出た光は、所定の光だけを通すフィルター２０を通して、並行照明手段２１に入力される。 Next, the control unit 18 instructs the light source 19 to turn on. The light emitted from the light source is input to the parallel illumination means 21 through the filter 20 that passes only predetermined light.

　そして、並行照明手段２１から出た並行光は、培養容器保持部１６に設置された培養容器１に照射される。この光によって、培養容器１内の標識未分化細胞５の光感受性物質は活性化され、その結果、標識された未分化細胞５を不活性化、つまり死滅することになる。 Then, the parallel light emitted from the parallel illumination means 21 is applied to the culture vessel 1 installed in the culture vessel holding unit 16. This light activates the photosensitive substance of the labeled undifferentiated cells 5 in the culture container 1, and as a result, the labeled undifferentiated cells 5 are inactivated, that is, killed.

　所定時間の間、光を照射した後、制御部１８は、光源１９からの光を遮断するためにシャッター２２を閉じる。 After irradiating light for a predetermined time, the control unit 18 closes the shutter 22 to block the light from the light source 19.

　尚、これらの装置は、外部からの光を遮断するために遮光箱２３内に設けられている。 These devices are provided in the light shielding box 23 in order to block light from the outside.

　（実施の形態２）
　以下、本発明の一実施形態を細胞識別分離方法の一例として添付図面を用いて説明する。 (Embodiment 2)
Hereinafter, an embodiment of the present invention will be described as an example of a cell identification separation method with reference to the accompanying drawings.

　図４は、本発明の一実施形態における、未分化細胞不活性化物質として、抗癌物質を用いた細胞識別分離方法を説明する。 FIG. 4 illustrates a cell identification and separation method using an anticancer substance as an undifferentiated cell inactivating substance in one embodiment of the present invention.

　図４（ａ）の工程は、培養容器１（例えばフィダー細胞が培養されている培養容器）に未分化細胞２を播種した状態であり、図４（ｂ）の工程では、複数の培養容器１内の培地交換をしながら培養を行い、未分化細胞２を未分化状態を維持しながら増殖させていく工程である。 4A is a state in which undifferentiated cells 2 are seeded in a culture vessel 1 (for example, a culture vessel in which feeder cells are cultured). In the step of FIG. 4B, a plurality of culture vessels 1 are used. This is a step of culturing while exchanging the medium, and growing the undifferentiated cells 2 while maintaining the undifferentiated state.

　次に、図４（ｃ）の工程では、前工程で増殖させた未分化細胞２を分化細胞３へ分化誘導をする工程を示す。 Next, the step of FIG. 4 (c) shows a step of inducing differentiation of the undifferentiated cells 2 grown in the previous step into differentiated cells 3.

　このように分化誘導後にも分化細胞３の中に残存する未分化細胞２に対しては、図４（ｄ）の工程に示すように、未分化細胞２を抗原とし、この抗原に結合する抗体と未分化細胞不活性化物質としての抗癌物質を結合させて作った、抗体薬としての試薬１２を混ぜた培地４を形成し、この培地４で分化誘導後の細胞群を一定時間培養して、残存する未分化細胞を試薬１２の抗体部分と結合させる。 Thus, for undifferentiated cells 2 remaining in differentiated cells 3 after differentiation induction, as shown in the step of FIG. 4 (d), an antibody that uses undifferentiated cells 2 as an antigen and binds to this antigen. And a medium 4 mixed with an anti-cancer substance as an undifferentiated cell inactivating substance and mixed with a reagent 12 as an antibody drug, and a cell group after differentiation induction is cultured in this medium 4 for a certain period of time. The remaining undifferentiated cells are bound to the antibody portion of the reagent 12.

　次に図４（ｅ）の工程では、試薬１２（抗体薬）を混合した培地４を洗い流し、未分化細胞２と結合していない余分な抗体薬を洗い流す。その結果、細胞群には、未分化細胞２と抗癌物質の結合による標識未分化細胞１３ができる。 Next, in the step of FIG. 4 (e), the medium 4 mixed with the reagent 12 (antibody drug) is washed away, and excess antibody drug that is not bound to the undifferentiated cells 2 is washed away. As a result, labeled undifferentiated cells 13 formed by binding of undifferentiated cells 2 and anticancer substances are formed in the cell group.

　次に、図４（ｆ）の工程では、標識未分化細胞１３に対して、所定の時間をおくことで、標識未分化細胞１３を死滅させる。 Next, in the step of FIG. 4 (f), the labeled undifferentiated cells 13 are killed by leaving a predetermined time for the labeled undifferentiated cells 13.

　次に、図４（ｇ）の工程では、死滅した未分化細胞６の破砕物、および、抗癌物質などを洗い流し、分化細胞を得る。なお、上述の光感受性物質を用いる場合と同様に、洗い流す工程を経ずに、分化細胞３と死滅した未分化細胞６の混合物をそのまま治療に用いてもよい。また、培地交換に伴って、死滅した未分化細胞６と残存する抗体薬を除去してもよい。あるいは、細胞間結合物質を分解する試薬（例えばトリプシン）で細胞を処理することによる、死滅した未分化細胞６と残存する抗体薬を積極的に除去する方法を採用してもよい。 Next, in the step of FIG. 4 (g), the dead undifferentiated cell 6 crushed material and anticancer substances are washed away to obtain differentiated cells. As in the case of using the photosensitive substance described above, the mixture of the differentiated cells 3 and the dead undifferentiated cells 6 may be used as it is for the treatment without passing through the washing step. Moreover, you may remove the dead undifferentiated cell 6 and the remaining antibody drug with a culture medium exchange. Alternatively, a method of positively removing dead undifferentiated cells 6 and the remaining antibody drug by treating the cells with a reagent that degrades an intercellular binding substance (for example, trypsin) may be employed.

　そして、図４（ｈ）の工程では、未分化細胞排除処理結果を光学システム７を用いて確認する。 Then, in the step of FIG. 4 (h), the undifferentiated cell exclusion processing result is confirmed using the optical system 7.

　尚、上記抗癌物質としては、限定するものではないが、イホスファミド、シクロホスファミド、ダカルバジン、ラニムスチンおよびメルファランなどのアルキル化剤、ビンクリスチンおよびビンブラスチンなどの紡錘体阻害剤植物アルカロイド、アクチノマイシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、マイトマイシンＣおよびドキソルビシンなどの細胞障害性／抗腫瘍抗生物質、イリノテカンおよびエトポシドなどのトポイソメラーゼ阻害薬、シスプラチン及びカルボプラチンなどのプラチナ類似体、メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの代謝拮抗剤、６−メルカプトプリンおよびチオグアニンなどのプリン類似体、ならびにドキシフルリジンなどのピリミジン類似体が挙げられる。 Examples of the anticancer substance include, but are not limited to, alkylating agents such as ifosfamide, cyclophosphamide, dacarbazine, ranimustine and melphalan, spindle inhibitors such as vincristine and vinblastine, plant alkaloids, actinomycin, Metabolisms such as cytotoxic / antitumor antibiotics such as bleomycin, daunorubicin, mitomycin C and doxorubicin, topoisomerase inhibitors such as irinotecan and etoposide, platinum analogues such as cisplatin and carboplatin, methotrexate and 5-fluorouracil (5-FU) Antagonists, purine analogs such as 6-mercaptopurine and thioguanine, and pyrimidine analogs such as doxyfluridine.

　（実施の形態３）
　以下、本発明の一実施形態を細胞識別分離方法の一例として添付図面を用いて説明する。 (Embodiment 3)
Hereinafter, an embodiment of the present invention will be described as an example of a cell identification separation method with reference to the accompanying drawings.

　図５は、本発明の一実施形態における、未分化細胞不活性化物質として、磁性体を用いた細胞識別分離方法を説明する。 FIG. 5 illustrates a cell identification and separation method using a magnetic substance as an undifferentiated cell inactivating substance in one embodiment of the present invention.

　図５（ａ）の工程は、培養容器１（例えばフィダー細胞が培養されている培養容器）に未分化細胞２を播種した状態であり、図５（ｂ）の工程では、複数の培養容器１内の培地交換をしながら培養を行い、未分化細胞２を未分化状態を維持しながら増殖させていく工程である。 The process of FIG. 5A is a state in which undifferentiated cells 2 are seeded in a culture container 1 (for example, a culture container in which feeder cells are cultured). In the process of FIG. This is a step of culturing while exchanging the medium, and growing the undifferentiated cells 2 while maintaining the undifferentiated state.

　次に、図５（ｃ）の工程では、前工程で増殖させた未分化細胞２を分化細胞３へ分化誘導をする工程を示す。 Next, the step of FIG. 5 (c) shows a step of inducing differentiation of the undifferentiated cells 2 grown in the previous step into differentiated cells 3.

　このように分化誘導後にも分化細胞３の中に残存する未分化細胞２に対しては、図５（ｄ）の工程に示すように、未分化細胞２を抗原とし、この抗原に結合する抗体と未分化細胞不活性化物質としての磁性体を結合させて作った、抗体薬としての試薬１４を混ぜた培地４を形成し、この培地４で分化誘導後の細胞群を一定時間培養して、残存する未分化細胞を抗体薬の抗体部分と結合させて標識する。 Thus, for undifferentiated cells 2 remaining in differentiated cells 3 after differentiation induction, as shown in the step of FIG. 5 (d), an antibody that uses undifferentiated cells 2 as an antigen and binds to this antigen. And a magnetic substance as an undifferentiated cell inactivating substance, and a medium 4 in which a reagent 14 as an antibody drug is mixed is formed, and a cell group after differentiation induction is cultured in this medium 4 for a certain period of time. The remaining undifferentiated cells are labeled by binding to the antibody portion of the antibody drug.

　次に図５（ｅ）の工程では、試薬１４（抗体薬）を混合した培地４を洗い流し、未分化細胞２と結合していない余分な抗体薬を洗い流す。その結果、細胞群には、未分化細胞２と抗体の結合による標識未分化細胞１５ができる。 Next, in the step of FIG. 5 (e), the medium 4 mixed with the reagent 14 (antibody drug) is washed away, and the excess antibody drug that is not bound to the undifferentiated cells 2 is washed away. As a result, labeled undifferentiated cells 15 by binding of undifferentiated cells 2 and antibodies are formed in the cell group.

　次に、図５（ｆ）の工程では、標識未分化細胞１５に対して、磁性体物質を活性化させるための交流電場を掛け、磁性体物質を活性化することにより、標識された未分化細胞１５を不活性化、つまり死滅させる。 Next, in the step of FIG. 5 (f), the labeled undifferentiated cells 15 are activated by applying an alternating electric field for activating the magnetic substance to activate the magnetic substance. Cells 15 are inactivated, ie killed.

　次に、図５（ｇ）の工程では、死滅した未分化細胞６の破砕物、および、未反応活性化物質などを洗い流し、分化細胞を得る。なお、上述の光感受性物質を用いる場合と同様に、洗い流す工程を経ずに、分化細胞３と死滅した未分化細胞６の混合物をそのまま治療に用いてもよい。また、培地交換に伴って、死滅した未分化細胞６と残存する抗体薬を除去してもよい。あるいは、細胞間結合物質を分解する試薬（例えばトリプシン）で細胞を処理することによる、死滅した未分化細胞６と残存する抗体薬を積極的に除去する方法を採用してもよい。 Next, in the step of FIG. 5 (g), dead undifferentiated cell 6 fragments and unreacted activation substances are washed away to obtain differentiated cells. As in the case of using the photosensitive substance described above, the mixture of the differentiated cells 3 and the dead undifferentiated cells 6 may be used as it is for the treatment without passing through the washing step. Moreover, you may remove the dead undifferentiated cell 6 and the remaining antibody drug with a culture medium exchange. Alternatively, a method of positively removing dead undifferentiated cells 6 and the remaining antibody drug by treating the cells with a reagent that degrades an intercellular binding substance (for example, trypsin) may be employed.

　そして、図５（ｈ）の工程では、未分化細胞排除処理結果を光学システム７を用いて確認する。 Then, in the process of FIG. 5 (h), the result of the undifferentiated cell exclusion process is confirmed using the optical system 7.

　尚、上記磁性体物質としては、限定するものではないが、マグネタイト、フェライトなどのセラミック、またはパーマロイなどの強磁性金属が挙げられる。 The magnetic substance includes, but is not limited to, a ceramic such as magnetite and ferrite, or a ferromagnetic metal such as permalloy.

　本発明で用いられる、「未分化細胞に特異的に結合する抗体」とは、未分化細胞に特異的に発現しているタンパク質またはペプチド（すなわち、未分化マーカー）を特異的に認識する抗体をいう。未分化マーカーには、例えば、Ｎａｎｏｇ、ＰＯＵ５Ｆ１（Ｏｃｔ−４）、ＴＤＧＦ１、ＧＣＴＭ２、ＧＣＴＭ３４３、ＨＥＳＣＡ−１、ＨＥＳＣＡ−２、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、Ｔｒａ−２−５４、ＳＳＥＡ−３およびＳＳＥＡ−４が挙げられる。特に、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０などは、ＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞の未分化マーカーとして当業者に知られている。当業者であれば、細胞の種類に応じて、本発明を実施するために適している未分化マーカーを選択することができる。なお、本明細書において、「未分化細胞に特異的に結合する抗体」および「未分化細胞識別抗体」は、同義的に用いられる。 As used herein, “an antibody that specifically binds to undifferentiated cells” refers to an antibody that specifically recognizes a protein or peptide (ie, an undifferentiated marker) that is specifically expressed in undifferentiated cells. Say. Examples of undifferentiated markers include Nanog, POU5F1 (Oct-4), TDGF1, GCTM2, GCTM343, HESCA-1, HESCA-2, TRA-1-60, TRA-1-81, Tra-2-54, SSEA -3 and SSEA-4. In particular, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60 and the like are known to those skilled in the art as undifferentiated markers of ES cells and iPS cells. A person skilled in the art can select an undifferentiated marker suitable for carrying out the present invention according to the type of cell. In the present specification, “an antibody that specifically binds to an undifferentiated cell” and “an undifferentiated cell identification antibody” are used interchangeably.

　「未分化細胞識別抗体」は、一つの抗体であってもよく、あるいは二つ以上の抗体の組み合わせであってもよい。例えば、二つの抗体の組み合わせの場合には、未分化マーカーを特異的に認識する抗体が一次抗体として用いられ、未分化細胞不活性化物質で標識された、前記一次抗体を特異的に認識する抗体が二次抗体として用いられる。同様にして、三つ以上の抗体の組み合わせを採用することもできる。当業者であれば組み合わせる抗体を適宜選択することができる。 The “undifferentiated cell identification antibody” may be a single antibody or a combination of two or more antibodies. For example, in the case of a combination of two antibodies, an antibody that specifically recognizes an undifferentiated marker is used as a primary antibody, and specifically recognizes the primary antibody labeled with an undifferentiated cell inactivating substance. An antibody is used as a secondary antibody. Similarly, a combination of three or more antibodies can be employed. Those skilled in the art can appropriately select antibodies to be combined.

　また、「未分化細胞識別抗体」として、異なる未分化マーカーを認識する複数種類の抗体を用いてもよい。あるいは、同一の未分化マーカーにおける異なるエピトープを認識する複数種類の抗体を用いてもよい。これらの場合、例えば、一種類の未分化細胞における複数の未分化マーカー（あるいは複数のエピトープ）を認識することによって、細胞をより確実に標識することが可能である。さらに、例えば、複数種類の未分化細胞が混在する場合において、各未分化細胞が発現する異なる未分化マーカーを、それぞれ認識することによって、複数種類の細胞を標識することが可能である。すなわち、識別分離したい未分化細胞の種類および／または数に応じて、複数種類の抗体を用いることができる。 In addition, as the “undifferentiated cell identification antibody”, a plurality of types of antibodies that recognize different undifferentiated markers may be used. Alternatively, multiple types of antibodies that recognize different epitopes in the same undifferentiated marker may be used. In these cases, for example, by recognizing a plurality of undifferentiated markers (or a plurality of epitopes) in one type of undifferentiated cell, it is possible to more reliably label the cell. Furthermore, for example, when a plurality of types of undifferentiated cells coexist, it is possible to label a plurality of types of cells by recognizing different undifferentiated markers expressed by each undifferentiated cell. That is, a plurality of types of antibodies can be used depending on the type and / or number of undifferentiated cells to be identified and separated.

　本発明で用いられる抗体は、全長抗体であってもよく、抗体のフラグメントであってもよい。抗体のフラグメントには、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２）、ｄｓＦｖ、小型抗体（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）、三重特異性抗体（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、四重特異性抗体（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）などが挙げられる。また抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、オリゴクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体または完全ヒト抗体であってもよい。 The antibody used in the present invention may be a full-length antibody or an antibody fragment. Antibody fragments include, for example, Fv, Fab, Fab ′, F (ab ′) 2, single chain antibody (scFv, (scFv) 2), dsFv, small antibody (minibody), bispecific antibody (diabody). ), Trispecific antibodies (tetrabodies), and tetraspecific antibodies (tetrabodies). The antibody may be, for example, a polyclonal antibody, an oligoclonal antibody, a monoclonal antibody, a chimeric antibody, a humanized antibody or a fully human antibody.

　本発明で用いられる未分化細胞識別抗体と未分化細胞不活性化物質は、直接的に結合されてもよく、または間接的に結合されてもよい。間接的に結合される場合は、リンカーなどを用いることができる。例えば、本発明で用いることができる、未分化細胞不活性化物質ＩＲ７００は、カルボン酸とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｎ−Ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ、ＮＨＳ）を溶媒中で撹拌することで生成する、ＮＨＳ活性エステルの一つである。ＮＨＳ活性エステルはアミン（たんぱく質、抗体等）と穏和な条件下で反応し、アミド結合を形成する。従って、この性質を利用して、抗体にＩＲ７００などのＮＨＳ活性エステルを直接結合することができる。なお、当業者であれば、所望の物質を抗体に結合させる方法を当然に理解することができる。 The undifferentiated cell identification antibody and the undifferentiated cell inactivating substance used in the present invention may be bound directly or indirectly. In the case of being indirectly bound, a linker or the like can be used. For example, the undifferentiated cell inactivating substance IR700 that can be used in the present invention is an NHS active ester produced by stirring carboxylic acid and N-hydroxysuccinimide (N-Hydroxysuccinimide, NHS) in a solvent. One. NHS active esters react with amines (proteins, antibodies, etc.) under mild conditions to form amide bonds. Therefore, using this property, NHS active ester such as IR700 can be directly bound to the antibody. A person skilled in the art can naturally understand how to bind a desired substance to an antibody.

　本発明において、「接触させ」とは、細胞上の未分化マーカーと、抗体薬の抗体部分とが結合しうる状態に置くことをいう。未分化細胞を分化誘導した細胞群と、未分化細胞識別抗体と未分化細胞不活性化物質とを結合させた抗体薬との接触は、前記細胞群を、前記抗体薬を溶かした培養液で一定時間培養することにより行ってもよい。あるいは、前記細胞群をあらかじめ培養し、そこに前記抗体薬を添加することによって行ってもよい。前記抗体薬を添加する場合には、その後一定時間の培養を行ってもよい。いずれの場合においても、一定時間とは、未分化細胞を分化誘導した細胞群から、未分化細胞を識別分離することができるのに十分な時間をいう。当業者であれば、用いられる細胞群および抗体薬に応じて、常套的な実験を用いて、培養条件（培地組成、培養温度、培養時間等）を容易に定めうるものである。 In the present invention, “contacting” refers to placing the undifferentiated marker on the cell and the antibody portion of the antibody drug in a bindable state. The contact between the cell group in which differentiation of undifferentiated cells is induced and the antibody drug in which the undifferentiated cell identification antibody and the undifferentiated cell inactivating substance are combined is performed by using a culture solution in which the antibody drug is dissolved. You may carry out by culturing for a fixed time. Alternatively, the cell group may be cultured in advance, and the antibody drug may be added thereto. When the antibody drug is added, culture for a certain period of time may be performed thereafter. In any case, the fixed time refers to a time sufficient to discriminate and separate undifferentiated cells from the cell group in which the undifferentiated cells are induced to differentiate. A person skilled in the art can easily determine culture conditions (medium composition, culture temperature, culture time, etc.) using routine experiments depending on the cell group and antibody drug used.

　他の態様では、本発明は、上述した本発明の細胞識別分離方法を用いて得られた未分化細胞が除去された細胞集団に関する。かかる細胞集団は、分化した細胞からなるものである。かかる細胞は、限定するものではないが、角膜上皮細胞、表皮角化細胞、口腔粘膜細胞、結膜上皮細胞、骨芽細胞、神経細胞、心筋細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞、肝実質細胞、および脂肪細胞などが挙げられる。かかる細胞は、限定するものではないが、ヒト、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ラット、サル、ブタ、ヒツジ、ウシなどに由来する。 In another aspect, the present invention relates to a cell population from which undifferentiated cells obtained using the above-described cell identification and separation method of the present invention have been removed. Such a cell population consists of differentiated cells. Such cells include, but are not limited to, corneal epithelial cells, epidermal keratinocytes, oral mucosal cells, conjunctival epithelial cells, osteoblasts, neurons, cardiomyocytes, fibroblasts, vascular endothelial cells, hepatocytes, And adipocytes. Such cells are derived from, but not limited to, humans, dogs, cats, rabbits, mice, rats, monkeys, pigs, sheep, cows and the like.

　別の態様では、本発明は、上述した本発明の細胞集団を用いて作製される細胞シートに関する。かかる細胞シートは、細胞が産生したもの以外のコラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン等のスキャホールドを含んでいてもよく、または含まなくてもよい。本発明の細胞シートに含まれる細胞は、一種類の細胞であってもよく、または複数種類の細胞の組み合わせであってもよい。ただし、本発明の細胞シートをヒトの治療に用いる場合はヒト由来の細胞を使用することが好ましい。一実施形態では、本発明の細胞シートは一層構造である。他の実施形態では、本発明の細胞シートは多層構造、例えば、二層構造または三層構造である。特定の実施形態では、本発明の細胞シートを公知の方法で３次元化することで、３次元構造体を得ることができる。 In another aspect, the present invention relates to a cell sheet produced using the above-described cell population of the present invention. Such cell sheets may or may not contain scaffolds such as collagen, fibronectin and laminin other than those produced by the cells. The cells contained in the cell sheet of the present invention may be one type of cell or a combination of a plurality of types of cells. However, when the cell sheet of the present invention is used for human therapy, it is preferable to use human-derived cells. In one embodiment, the cell sheet of the present invention is a single layer structure. In other embodiments, the cell sheet of the present invention is a multi-layer structure, such as a two-layer structure or a three-layer structure. In a specific embodiment, a three-dimensional structure can be obtained by three-dimensionalizing the cell sheet of the present invention by a known method.

　また別の態様では、本発明は、上述した未分化細胞識別抗体および未分化細胞不活性化物質を含む、未分化細胞を識別分離するための試薬（抗体薬）に関する。必要に応じて、かかる試薬に、賦形剤、保存剤、安定化剤、希釈剤、バッファーおよび／または担体などを添加してもよい。また、必要に応じて、かかる試薬を溶液または凍結乾燥品などの様々な形状で提供することができる。 In another aspect, the present invention relates to a reagent (antibody drug) for discriminating and separating undifferentiated cells, comprising the above-mentioned undifferentiated cell identifying antibody and an undifferentiated cell inactivating substance. If necessary, excipients, preservatives, stabilizers, diluents, buffers and / or carriers and the like may be added to such reagents. Moreover, if necessary, such a reagent can be provided in various forms such as a solution or a lyophilized product.

　さらに別の態様では、本発明は、上述した本発明の試薬を含む、未分化細胞を識別分離するためのキットに関する。かかるキットは、本発明の細胞識別分離方法の実施を簡便にするための適当な試薬、例えば抗体希釈液、反応希釈液、バッファー、洗浄剤、標識抗体検出試薬などを含んでもよい。またさらに、本発明の方法の実行に必要な説明書などの資材を含んでもよい。 In still another aspect, the present invention relates to a kit for discriminating and separating undifferentiated cells, which contains the reagent of the present invention described above. Such a kit may contain an appropriate reagent for simplifying the cell identification and separation method of the present invention, such as an antibody diluent, a reaction diluent, a buffer, a detergent, a labeled antibody detection reagent, and the like. Furthermore, materials such as instructions necessary for carrying out the method of the present invention may be included.

　以下に実施例を示して本発明を具体的かつ詳細に説明するが、実施例は本発明を限定するものと解してはならない。 Hereinafter, the present invention will be described specifically and in detail with reference to examples. However, the examples should not be construed as limiting the present invention.

１．光感受性物質で標識した未分化細胞識別抗体を用いた細胞の染色
　本発明者は、光感受性物質で標識した未分化細胞識別抗体を用いて、分化細胞と未分化細胞を識別することが可能であるかを確認するために、以下の検討を行った。 1. Staining of cells using an undifferentiated cell identification antibody labeled with a photosensitive substance The present inventor is able to distinguish between differentiated cells and undifferentiated cells using an undifferentiated cell identification antibody labeled with a photosensitive substance. In order to confirm whether there is, the following examination was performed.

　１．材料および方法
　１−１．自然分化によって分化細胞コロニーが現れたｉＰＳ細胞コロニーを用いた。未分化細胞識別抗体としては、抗ＳＳＥＡ−４抗体（ａｂｃａｍ、Ａｎｔｉ−ＳＳＥＡ４　ａｎｔｉｂｏｄｙ、ａｂ１６２８７）を用いた。光感受性物質としては、ＩＲ７００（ＬＩ−ＣＯＲ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＩＲＤｙｅ　７００ＤＸ　ＮＨＳ　Ｅｓｔｅｒ、９２９−７００１０）を用いた。 1. 1. Material and method 1-1. IPS cell colonies in which differentiated cell colonies appeared by natural differentiation were used. An anti-SSEA-4 antibody (abcam, Anti-SSEA4 antibody, ab16287) was used as an undifferentiated cell identification antibody. IR700 (LI-COR Bioscience, IRDye 700DX NHS Ester, 929-7010) was used as the photosensitizer.

　１−２．抗体の標識
　抗ＳＳＥＡ−４抗体（１０μｇ）を、ＩＲ７００（２μｇ、ＤＭＳＯ溶液）と、Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ８．５）中、室温で２時間インキュベートした。混合液をセファデックスＧ５０カラム（ＰＤ−１０；ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製した。 1-2. Antibody Labeling Anti-SSEA-4 antibody (10 μg) was incubated with IR700 (2 μg, DMSO solution) in Na 2 HPO 4 (pH 8.5) for 2 hours at room temperature. The mixture was purified using a Sephadex G50 column (PD-10; GE Healthcare).

　１−３．ｉＰＳ細胞の染色
　ＩＲ７００標識した抗ＳＳＥＡ−４抗体を用いて、分化細胞コロニーが現れたｉＰＳ細胞コロニーを染色した。培地で希釈した抗体（１０μｇ／ｍＬ）を用い、３７℃のＣＯ２インキュベーターでオーバーナイト反応させた。次いで、培地で細胞を洗浄し、未反応の抗体試薬を除去した。その後、蛍光顕微鏡（オリンパス倒立顕微鏡　ＩＸ７１）を用いて、細胞を観察した。ＩＲ７００の蛍光観察には、蛍光キューブ（オリンパス、Ｕ−ＤＭ−ＣＹ５−３）を用いた。 1-3. Staining of iPS cells Using an anti-SSEA-4 antibody labeled with IR700, iPS cell colonies in which differentiated cell colonies appeared were stained. An antibody (10 μg / mL) diluted with a medium was used, and an overnight reaction was performed in a CO 2 incubator at 37 ° C. Next, the cells were washed with a medium to remove unreacted antibody reagents. Thereafter, the cells were observed using a fluorescence microscope (Olympus inverted microscope IX71). A fluorescent cube (Olympus, U-DM-CY5-3) was used for IR700 fluorescence observation.

　２．結果
　結果を図７に示す。（Ａ）は位相差観察図である。左下には未分化のｉＰＳ細胞群が確認でき、右には自然分化によってｉＰＳ細胞から分化した細胞群が確認できる。（Ｂ）は（Ａ）と同視野の蛍光観察図である。図７（Ｂ）に示される通り、未分化のｉＰＳ細胞は赤色蛍光を示した。これは、ＩＲ７００標識−抗ＳＳＥＡ−４抗体が未分化ｉＰＳ細胞を認識したことを示している。一方で、分化した細胞は、赤色蛍光を全く示さなかった。これは、ＩＲ７００標識−抗ＳＳＥＡ−４抗体が分化した細胞を全く認識しなかったことを示している。これらのことから、抗ＳＳＥＡ−４抗体をＩＲ７００で標識し、細胞と反応させることで、細胞の分化／未分化を識別することができることがわかった。 2. Results The results are shown in FIG. (A) is a phase difference observation figure. An undifferentiated iPS cell group can be confirmed in the lower left, and a cell group differentiated from the iPS cells by natural differentiation can be confirmed on the right. (B) is the fluorescence observation figure of the same visual field as (A). As shown in FIG. 7B, undifferentiated iPS cells showed red fluorescence. This indicates that IR700-labeled anti-SSEA-4 antibody recognized undifferentiated iPS cells. On the other hand, differentiated cells did not show any red fluorescence. This indicates that the IR700-labeled anti-SSEA-4 antibody did not recognize any differentiated cells. From these facts, it was found that differentiation / undifferentiation of cells can be identified by labeling anti-SSEA-4 antibody with IR700 and reacting with cells.

２．光照射による細胞死の確認
　本発明者は、光感受性物質で標識した未分化細胞識別抗体が結合した細胞について、近赤外光の照射後の細胞死を判定するために、以下の検討を行った。 2. Confirmation of cell death by light irradiation The present inventor conducted the following examination to determine cell death after irradiation with near-infrared light for cells bound with an undifferentiated cell identification antibody labeled with a photosensitive substance. It was.

　１．材料および方法
　１−１．実施例１と同様、自然分化によって分化細胞コロニーが現れたｉＰＳ細胞コロニー、抗ＳＳＥＡ−４抗体（ａｂｃａｍ、Ａｎｔｉ−ＳＳＥＡ４　ａｎｔｉｂｏｄｙ、ａｂ１６２８７）、およびＩＲ７００を用いた。実施例１と同様の方法で、ＩＲ７００標識−抗ＳＳＥＡ−４抗体を作製した。 1. 1. Material and method 1-1. As in Example 1, iPS cell colonies in which differentiated cell colonies appeared by natural differentiation, anti-SSEA-4 antibodies (abcam, Anti-SSEA4 antibody, ab16287), and IR700 were used. In the same manner as in Example 1, IR700-labeled anti-SSEA-4 antibody was prepared.

　１−２．ｉＰＳ細胞の生死判定
　実施例１と同様に、ＩＲ７００標識−抗ＳＳＥＡ−４抗体とｉＰＳ細胞を反応させた。次いで、細胞にＬＥＤ（６９０ｎｍ）を室温で４０分間照射した。その後、細胞生死判定試薬（ＤＯＪＩＮＤＯ、Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭ溶液、Ｃ３９６）を用いて細胞を染色し、観察した。なお、この細胞生死判定試薬によって、生細胞は緑色に染色される。 1-2. iPS cell viability determination In the same manner as in Example 1, IRPS-labeled anti-SSEA-4 antibody was reacted with iPS cells. The cells were then irradiated with LED (690 nm) at room temperature for 40 minutes. Thereafter, the cells were stained with a cell viability determination reagent (DOJINDO, Calcein-AM solution, C396) and observed. The living cells are stained green by this cell viability determination reagent.

　２．結果
　結果を図８に示す。（Ａ）は位相差観察図である。左下には未分化のｉＰＳ細胞群が確認でき、右には自然分化によってｉＰＳ細胞から分化した細胞群が確認できる。（Ｂ）は（Ａ）と同視野の蛍光観察図である。図８（Ｂ）に示される通り、分化した細胞は緑色蛍光を示した。これは、分化した細胞が、ＬＥＤ照射後にも生存していることを示している。一方で、未分化のｉＰＳ細胞は、緑色蛍光を全く示さなかった。これは、ＩＲ７００標識−抗ＳＳＥＡ−４抗体が結合した未分化ｉＰＳ細胞が、ＬＥＤ照射後に死滅し、生細胞として残存していないことを示している。 2. Results The results are shown in FIG. (A) is a phase difference observation figure. An undifferentiated iPS cell group can be confirmed in the lower left, and a cell group differentiated from the iPS cells by natural differentiation can be confirmed on the right. (B) is the fluorescence observation figure of the same visual field as (A). As shown in FIG. 8 (B), the differentiated cells showed green fluorescence. This indicates that the differentiated cells are alive after LED irradiation. On the other hand, undifferentiated iPS cells did not show any green fluorescence. This indicates that undifferentiated iPS cells bound with IR700-labeled anti-SSEA-4 antibody are killed after LED irradiation and do not remain as living cells.

３．光感受性物質に特異的な細胞死の確認
　本発明者は、実施例２の結果が、抗体に結合した光感受性物質によるものであるのかを確認するために、以下の検討を行った。 3. Confirmation of Cell Death Specific to Photosensitizer The present inventor conducted the following examination in order to confirm whether the result of Example 2 was due to the photosensitizer bound to the antibody.

　１．材料および方法
　１−１．自然分化によって分化細胞コロニーが現れたｉＰＳ細胞コロニーに対して、ＩＲ７００で標識していない抗ＳＳＥＡ−４抗体（ａｂｃａｍ、Ａｎｔｉ−ＳＳＥＡ４　ａｎｔｉｂｏｄｙ、ａｂ１６２８７）を反応させた。 1. 1. Material and method 1-1. Anti-SSEA-4 antibodies (abcam, Anti-SSEA4 antibody, ab16287) not labeled with IR700 were reacted with iPS cell colonies in which differentiated cell colonies appeared by spontaneous differentiation.

　１−２．ｉＰＳ細胞の生死判定
　実施例２と同様の方法で、抗ＳＳＥＡ−４抗体（ＩＲ７００未標識）とｉＰＳ細胞を反応させた。次いで、細胞にＬＥＤ（６９０ｎｍ）を４０分間照射した。その後、細胞生死判定試薬（ＤＯＪＩＮＤＯ、Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭ溶液、Ｃ３９６）を用いて細胞を染色し、観察した。なお、この細胞生死判定試薬によって、生細胞は緑色に染色される。 1-2. Determination of iPS cell life / death In the same manner as in Example 2, anti-SSEA-4 antibody (IR700 unlabeled) was reacted with iPS cells. The cells were then irradiated with LED (690 nm) for 40 minutes. Thereafter, the cells were stained with a cell viability determination reagent (DOJINDO, Calcein-AM solution, C396) and observed. The living cells are stained green by this cell viability determination reagent.

　２．結果
　結果を図９に示す。（Ａ）は位相差観察図である。左の円には未分化のｉＰＳ細胞群が確認でき、右の円には自然分化によってｉＰＳ細胞から分化した細胞群が確認できる。（Ｂ）は（Ａ）と同視野の蛍光観察図である。図９（Ｂ）に示される通り、未分化のｉＰＳ細胞と分化した細胞の両方が、緑色蛍光を示した。これは、いずれの細胞も、ＬＥＤ照射後に生存していることを示している。分化した細胞は緑色蛍光を示している。これは、分化した細胞が、ＬＥＤ照射後にも生存していることを示している。一方で、未分化のｉＰＳ細胞は、緑色蛍光を全く呈していない。これは、ＩＲ７００標識−抗ＳＳＥＡ−４抗体が結合した未分化ｉＰＳ細胞が、ＬＥＤ照射後には死滅したことを示している。 2. Results The results are shown in FIG. (A) is a phase difference observation figure. An undifferentiated iPS cell group can be confirmed in the left circle, and a cell group differentiated from iPS cells by natural differentiation can be confirmed in the right circle. (B) is the fluorescence observation figure of the same visual field as (A). As shown in FIG. 9 (B), both undifferentiated iPS cells and differentiated cells showed green fluorescence. This indicates that all cells are alive after LED irradiation. Differentiated cells show green fluorescence. This indicates that the differentiated cells are alive after LED irradiation. On the other hand, undifferentiated iPS cells do not exhibit green fluorescence at all. This indicates that undifferentiated iPS cells bound with IR700-labeled anti-SSEA-4 antibody were killed after LED irradiation.

４．未分化細胞識別抗体（一次抗体）および一次抗体に結合する二次抗体（光感受性物質で標識）を用いた細胞の染色
　本発明者は、未分化細胞識別抗体（一次抗体）と光感受性物質で標識した二次抗体を用いて、分化細胞と未分化細胞を識別することが可能であるかを確認するために、以下の検討を行った。 4). Staining of cells using an undifferentiated cell identification antibody (primary antibody) and a secondary antibody (labeled with a photosensitizer) that binds to the primary antibody The present inventor uses an undifferentiated cell identification antibody (primary antibody) and a photosensitizer In order to confirm whether differentiated cells and undifferentiated cells can be distinguished using a labeled secondary antibody, the following examination was performed.

　１．材料および方法
　１−１．自然分化によって分化細胞コロニーが現れたｉＰＳ細胞コロニーを用いた。未分化細胞識別抗体（一次抗体）としては、抗ＳＳＥＡ−４抗体（ａｂｃａｍ、Ａｎｔｉ−ＳＳＥＡ４　ａｎｔｉｂｏｄｙ、ａｂ１６２８７）を用いた。ＩＲ７００で標識されている二次抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．、Ａｎｔｉ−ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ），Ｍｏｕｓｅ，Ｇｏａｔ−Ｐｏｌｙ，ＩＲＤｙｅ７００ＤＸ、６１０−１３０−１２１）を用いた。 1. 1. Material and method 1-1. IPS cell colonies in which differentiated cell colonies appeared by natural differentiation were used. An anti-SSEA-4 antibody (abcam, Anti-SSEA4 antibody, ab16287) was used as an undifferentiated cell identification antibody (primary antibody). Secondary antibodies (Rockland Immunochemicals, Inc., Anti-IgG (H + L), Mouse, Goat-Poly, IRDye700DX, 610-130-121) labeled with IR700 were used.

　１−２．ｉＰＳ細胞の染色
　抗ＳＳＥＡ−４抗体（一次抗体）を用いて、分化細胞コロニーが現れたｉＰＳ細胞コロニーと反応させた。培地で希釈した抗体（１０μｇ／ｍＬ）を用い、３７℃のＣＯ２インキュベーターでオーバーナイト反応させた。次いで、培地で細胞を洗浄し、未反応の抗体試薬を除去した。その後、ＩＲ７００で標識されている二次抗体を３７℃のＣＯ２インキュベーターで４時間反応させた。次いで、培地で細胞を洗浄し、未反応の抗体試薬を除去した。蛍光顕微鏡（オリンパス倒立顕微鏡　ＩＸ７１）を用いて、細胞を観察した。ＩＲ７００の蛍光観察には、蛍光キューブ（オリンパス、Ｕ−ＤＭ−ＣＹ５−３）を用いた。 1-2. Staining of iPS cells Anti-SSEA-4 antibody (primary antibody) was used to react with iPS cell colonies in which differentiated cell colonies appeared. An antibody (10 μg / mL) diluted with a medium was used, and an overnight reaction was performed in a CO 2 incubator at 37 ° C. Next, the cells were washed with a medium to remove unreacted antibody reagents. Thereafter, the secondary antibody labeled with IR700 was reacted in a CO 2 incubator at 37 ° C. for 4 hours. Next, the cells were washed with a medium to remove unreacted antibody reagents. Cells were observed using a fluorescence microscope (Olympus inverted microscope IX71). A fluorescent cube (Olympus, U-DM-CY5-3) was used for IR700 fluorescence observation.

　２．結果
　結果を図１０に示す。（Ａ）は位相差観察図である。中央には自然分化によってｉＰＳ細胞から分化した細胞群が確認でき、周りには未分化のｉＰＳ細胞群が確認できる。（Ｂ）は（Ａ）と同視野の蛍光観察図である。図１０（Ｂ）に示される通り、未分化のｉＰＳ細胞は赤色蛍光を示した。これは、ＩＲ７００標識−二次抗体−抗ＳＳＥＡ−４抗体（一次抗体）が未分化のｉＰＳ細胞を認識したことを示している。一方で、分化した細胞は、赤色蛍光を全く示さなかった。これは、ＩＲ７００標識−二次抗体−抗ＳＳＥＡ−４抗体（一次抗体）が分化した細胞を全く認識しなかったことを示している。これらのことから、抗ＳＳＥＡ−４抗体とＩＲ７００で標識した二次抗体で、細胞と反応させることで、細胞の分化／未分化を識別することができることがわかった。 2. Results The results are shown in FIG. (A) is a phase difference observation figure. A cell group differentiated from iPS cells by natural differentiation can be confirmed at the center, and an undifferentiated iPS cell group can be confirmed around. (B) is the fluorescence observation figure of the same visual field as (A). As shown in FIG. 10B, undifferentiated iPS cells showed red fluorescence. This indicates that IR700-labeled-secondary antibody-anti-SSEA-4 antibody (primary antibody) recognized undifferentiated iPS cells. On the other hand, differentiated cells did not show any red fluorescence. This indicates that IR700-labeled-secondary antibody-anti-SSEA-4 antibody (primary antibody) did not recognize any differentiated cells. From these results, it was found that differentiation / undifferentiation of cells can be discriminated by reacting with cells using a secondary antibody labeled with anti-SSEA-4 antibody and IR700.

５．光照射による細胞死の確認
　本発明者は、未分化細胞識別抗体（一次抗体）および一次抗体に結合する二次抗体（光感受性物質で標識）を反応させた細胞について、近赤外光の照射後の細胞死を判定するために、以下の検討を行った。 5. Confirmation of cell death by light irradiation The present inventor applied irradiation of near-infrared light to cells reacted with an undifferentiated cell identification antibody (primary antibody) and a secondary antibody (labeled with a photosensitive substance) that binds to the primary antibody. In order to determine subsequent cell death, the following examination was performed.

　１．材料および方法
　１−１．実施例４と同様、自然分化によって分化細胞コロニーが現れたｉＰＳ細胞コロニーを用いた。未分化細胞識別抗体（一次抗体）としては、抗ＳＳＥＡ−４抗体（ａｂｃａｍ、Ａｎｔｉ−ＳＳＥＡ４　ａｎｔｉｂｏｄｙ、ａｂ１６２８７）を用いた。ＩＲ７００で標識されている二次抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．、Ａｎｔｉ−ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ），Ｍｏｕｓｅ，Ｇｏａｔ−Ｐｏｌｙ，ＩＲＤｙｅ７００ＤＸ、６１０−１３０−１２１）を用いた。 1. 1. Material and method 1-1. As in Example 4, iPS cell colonies in which differentiated cell colonies appeared by natural differentiation were used. An anti-SSEA-4 antibody (abcam, Anti-SSEA4 antibody, ab16287) was used as an undifferentiated cell identification antibody (primary antibody). A secondary antibody labeled with IR700 (Rockland Immunochemicals, Inc., Anti-IgG (H + L), Mouse, Goat-Poly, IRDye700DX, 610-130-121) was used.

　２．結果
　結果を図１１に示す。（Ａ）は位相差観察図である。中央には自然分化によってｉＰＳ細胞から分化した細胞群が確認でき、その周りには未分化のｉＰＳ細胞群が確認できる。点線の円は赤外線を照射したエリアである。（Ｂ）は（Ａ）と同視野の蛍光観察図である。図１１（Ｂ）に示される通り、赤外線を照射したエリアでは、分化した細胞は緑色蛍光を示した。これは、分化した細胞が、赤外線を照射後にも生存していることを示している。一方で、未分化のｉＰＳ細胞は、緑色蛍光を全く示さなかった。これは、ＩＲ７００標識−二次抗体−抗ＳＳＥＡ−４抗体（一次抗体）が結合した未分化ｉＰＳ細胞が、赤外線を照射後に死滅し、生細胞として残存していないことを示している。また、照射エリア以外の場所では、分化細胞と未分化細胞の両方が生存していることも示されている。 2. Results The results are shown in FIG. (A) is a phase difference observation figure. A cell group differentiated from iPS cells by natural differentiation can be confirmed at the center, and an undifferentiated iPS cell group can be confirmed around them. A dotted circle is an area irradiated with infrared rays. (B) is the fluorescence observation figure of the same visual field as (A). As shown in FIG. 11B, the differentiated cells showed green fluorescence in the area irradiated with infrared rays. This indicates that the differentiated cells survive even after irradiation with infrared rays. On the other hand, undifferentiated iPS cells did not show any green fluorescence. This indicates that undifferentiated iPS cells to which IR700-labeled-secondary antibody-anti-SSEA-4 antibody (primary antibody) is bound are killed after irradiation with infrared rays and do not remain as living cells. It is also shown that both differentiated cells and undifferentiated cells are alive outside the irradiated area.

　上記の実施例の結果から、ＩＲ７００標識−抗ＳＳＥＡ−４抗体が未分化細胞と分化した細胞を識別することができることが示された。また、実施例２の結果から、ＩＲ７００標識−抗ＳＳＥＡ−４抗体を、未分化／分化細胞群に反応させ、次いでＬＥＤを照射することで、未分化細胞を死滅させ、分化した細胞群のみを生存させることができることが示された。さらに、実施例３の結果から、このような効果、すなわち光照射による細胞死、は、抗ＳＳＥＡ−４抗体に起因するものではなく、光感受性物質（ＩＲ７００）の有無によって引き起こされていることが明らかとなった。またさらに、実施例４および５の結果から、非標識−抗ＳＳＥＡ−４抗体とＩＲ７００標識−二次抗体を組み合わせることによっても、同様の効果が得られることが示された。これらのことから、光感受性物質などの未分化細胞不活性化物質を結合した未分化マーカーを認識する抗体を、未分化細胞を含む分化細胞群と反応させることで、分化した細胞のみを識別・分離することが可能であることが示された。 From the results of the above examples, it was shown that IR700-labeled anti-SSEA-4 antibody can distinguish undifferentiated cells from differentiated cells. Further, from the results of Example 2, IR700-labeled anti-SSEA-4 antibody was allowed to react with undifferentiated / differentiated cell groups, and then irradiated with LED to kill undifferentiated cells and only differentiated cell groups. It was shown that it can survive. Furthermore, from the result of Example 3, such an effect, that is, cell death due to light irradiation, is not caused by the anti-SSEA-4 antibody, but is caused by the presence or absence of a photosensitive substance (IR700). It became clear. Furthermore, from the results of Examples 4 and 5, it was shown that the same effect can be obtained by combining an unlabeled-anti-SSEA-4 antibody and an IR700 labeled-secondary antibody. Based on these findings, antibodies that recognize undifferentiated markers bound to undifferentiated cell inactivating substances such as photosensitizers are allowed to react with differentiated cells including undifferentiated cells to identify only differentiated cells. It was shown that it can be separated.

　以上のように本発明は、未分化細胞を分化誘導した細胞群から未分化細胞を識別分離する方法であって、未分化細胞を分化誘導した細胞群を、前記未分化細胞に特異的に結合する抗体に未分化細胞不活性化物質を結合させた抗体薬と接触させ、未分化細胞と抗体薬を結合させる未分化細胞標識工程を含む細胞識別分離方法であるので、健康上の安全性を向上することができる。 As described above, the present invention is a method for discriminating and separating undifferentiated cells from a group of cells that have been induced to differentiate undifferentiated cells, and specifically binding the group of cells that have been induced to differentiate undifferentiated cells to the undifferentiated cells. This is a cell identification separation method that includes an undifferentiated cell labeling step in which an antibody that binds an undifferentiated cell inactivator to an antibody to be contacted and binds the undifferentiated cell and the antibody drug. Can be improved.

　したがって、再生医療に用いる細胞膜の製造方法として、広く活用が期待されるものである。 Therefore, it is expected to be widely used as a method for producing cell membranes used in regenerative medicine.

　１　培養容器
　２　未分化細胞
　３　分化細胞
　４　培地
　５　標識未分化細胞
　６　死滅した未分化細胞
　７　光学システム
　８　試薬
　９　抗体
　１０　光感受性物質
　１１　エピトープ
　１２　試薬
　１３　標識未分化細胞
　１４　試薬
　１５　標識未分化細胞
　１６　培養容器保持部
　１７　操作部
　１８　制御部
　１９　光源
　２０　フィルター
　２１　並行照明手段
　２２　シャッター
　２３　遮光箱 DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 Culture container 2 Undifferentiated cell 3 Differentiated cell 4 Medium 5 Labeled undifferentiated cell 6 Dead undifferentiated cell 7 Optical system 8 Reagent 9 Antibody 10 Photosensitive substance 11 Epitope 12 Reagent 13 Labeled undifferentiated cell 14 Reagent 15 Labeled undifferentiated cell Reference Signs List 16 Culture container holding unit 17 Operation unit 18 Control unit 19 Light source 20 Filter 21 Parallel illumination means 22 Shutter 23 Shading box

Claims

　未分化細胞を分化誘導した細胞群から未分化細胞を識別分離する方法であって、未分化細胞を分化誘導した細胞群を、前記未分化細胞に特異的に結合する抗体に未分化細胞不活性化物質を結合させた抗体薬と接触させ、未分化細胞と抗体薬を結合させる未分化細胞標識工程を含む、方法。 A method for discriminating and separating undifferentiated cells from a group of cells that have been induced to differentiate undifferentiated cells, wherein the cells that have been induced to differentiate undifferentiated cells are inactivated by an antibody that specifically binds to the undifferentiated cells. A method comprising a step of labeling an undifferentiated cell by bringing the antibody drug into contact with an antibody drug to which a chemical substance is bound, and binding the undifferentiated cell and the antibody drug.
　前記未分化細胞不活性化物質は、光感受性物質である請求項１に記載の方法。 The method according to claim 1, wherein the undifferentiated cell inactivating substance is a photosensitive substance.
　前記未分化細胞標識工程の後に、光を照射して、光感受性物質の活性化を行う工程を含む、請求項１または２に記載の方法。 The method according to claim 1 or 2, comprising a step of activating the photosensitive substance by irradiating light after the undifferentiated cell labeling step.
　前記光感受性物質がフタロシアニン色素（ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｄｅ　ｄｙｅ）、ポルフィリンおよびクロリンからなる群から選択される、請求項１から３のいずれか一つに記載の方法。 The method according to any one of claims 1 to 3, wherein the photosensitive substance is selected from the group consisting of phthalocyanine dyes, porphyrins and chlorins.
　前記光感受性物質がＩＲ７００およびティン（ＩＶ）クロリンｅ６（ＳｎＣｅ６）からなる群から選択される、請求項４に記載の方法。 The method of claim 4, wherein the photosensitizer is selected from the group consisting of IR700 and tin (IV) chlorin e6 (SnCe6).
　前記未分化細胞不活性化物質が抗癌物質である、請求項１に記載の方法。 The method according to claim 1, wherein the undifferentiated cell inactivating substance is an anticancer substance.
　前記未分化細胞不活性化物質が磁性体物質である、請求項１に記載の方法。 The method according to claim 1, wherein the undifferentiated cell inactivating substance is a magnetic substance.
　前記抗体が、Ｎａｎｏｇ、ＰＯＵ５Ｆ１（Ｏｃｔ−４）、ＴＤＧＦ１、ＧＣＴＭ２、ＧＣＴＭ３４３、ＨＥＳＣＡ−１、ＨＥＳＣＡ−２、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、Ｔｒａ−２−５４、ＳＳＥＡ−３およびＳＳＥＡ−４からなる群から選択される未分化マーカーを認識する抗体である、請求項１から７のいずれか一つに記載の方法。 The antibodies are Nanog, POU5F1 (Oct-4), TDGF1, GCTM2, GCTM343, HESCA-1, HESCA-2, TRA-1-60, TRA-1-81, Tra-2-54, SSEA-3 and SSEA The method according to any one of claims 1 to 7, wherein the antibody recognizes an undifferentiated marker selected from the group consisting of -4.
　前記抗体が、ＳＳＥＡ−３およびＳＳＥＡ−４からなる群から選択される未分化マーカーを認識する抗体である、請求項８に記載の方法。 The method according to claim 8, wherein the antibody is an antibody that recognizes an undifferentiated marker selected from the group consisting of SSEA-3 and SSEA-4.
　前記未分化細胞標識工程の後に、培地交換を行い、未分化細胞不活性化物質と抗体の洗浄を行う工程を含む、請求項１から９のいずれか一つに記載の方法。 The method according to any one of claims 1 to 9, further comprising a step of performing a medium exchange after the undifferentiated cell labeling step and washing the undifferentiated cell inactivating substance and the antibody.
　請求項１から１０のいずれか一つに記載の方法を用いて獲得された、細胞集団。 A cell population obtained using the method according to any one of claims 1 to 10.
　請求項１１に記載の細胞集団を含む細胞シート。 A cell sheet comprising the cell population according to claim 11.
　請求項１から１０のいずれか一つに記載の方法に用いるための抗体薬。 An antibody drug for use in the method according to any one of claims 1 to 10.
　請求項１３に記載の抗体薬を含む、未分化細胞を識別分離するためのキット。 A kit for identifying and separating undifferentiated cells, comprising the antibody drug according to claim 13.
　請求項１から１０のいずれか一つに記載の方法に用いる装置であって、
操作部と、この操作部からの指示に従う制御部と、この制御部からの指示に従い点灯、消灯をする光源と、この光源からの光を並行光に変える光変換手段と、この光変換手段からの光を受光する受光部と、この受光部に設けた標識未分化細胞設置部と、を備えた細胞識別分離装置。 An apparatus used in the method according to any one of claims 1 to 10,
From the operation unit, a control unit in accordance with an instruction from the operation unit, a light source that is turned on and off in accordance with an instruction from the control unit, a light conversion unit that converts light from the light source into parallel light, and a light conversion unit The cell identification separation apparatus provided with the light-receiving part which light-receives the light, and the labeled undifferentiated cell installation part provided in this light-receiving part.