WO2013184036A2 - Hepatoprotective agent - Google Patents

Hepatoprotective agent Download PDF

Info

Publication number
WO2013184036A2
WO2013184036A2 PCT/RU2013/000466 RU2013000466W WO2013184036A2 WO 2013184036 A2 WO2013184036 A2 WO 2013184036A2 RU 2013000466 W RU2013000466 W RU 2013000466W WO 2013184036 A2 WO2013184036 A2 WO 2013184036A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
caryophyllene
karyofillen
liver
pharmaceutically acceptable
hepatoprotective
Prior art date
Application number
PCT/RU2013/000466
Other languages
French (fr)
Russian (ru)
Other versions
WO2013184036A3 (en
Inventor
Михаил Александрович ГЕТЬМАН
Юрг ГЕРЧ
Original Assignee
Getman Mikhail Alexandrovich
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Getman Mikhail Alexandrovich filed Critical Getman Mikhail Alexandrovich
Publication of WO2013184036A2 publication Critical patent/WO2013184036A2/en
Publication of WO2013184036A3 publication Critical patent/WO2013184036A3/en

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/01—Hydrocarbons
    • A61K31/015—Hydrocarbons carbocyclic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics

Definitions

  • the invention relates to the field of drugs, namely to means for the treatment of liver diseases.
  • liver disease in the world is more than 30%. The most common among them is steatosis or fatty liver disease. In the Russian Federation, according to some reports, on average, 27% of the population have non-alcoholic fatty liver disease. In addition, officially in Russia there are more than 10 million people with alcoholism. Due to alcohol abuse, 90-100% of patients develop alcoholic steatosis, which in 10-20% of cases transforms into alcoholic hepatitis and liver cirrhosis. Among patients with liver pathology, death from cirrhosis due to alcoholic liver disease is about 44% of deaths.
  • the causes of steatosis, in addition to alcohol abuse, are:
  • Damage to the liver caused by hepatotoxins is characterized by varying degrees of damage to the hepatocytes, fibrosis, as well as cell death by the type of apoptosis or necrosis.
  • toxins In oxidation reactions, toxins induce excessive production and accumulation of free radicals and other toxic metabolites in the liver cell. In the process of oxidative stress, excessive mobilization of free iron ions from ferritin occurs, which in turn increases the content of hydroxyl radicals. Free radicals trigger lipid peroxidation reactions and secretion of cytokines, including tumor necrosis factor a (TNF-ct), interleukin-6 (IL-6) and interleukin-8 (IL-8). These pathological reactions lead to hepatocyte necrosis and the development of inflammatory cell infiltration. The products of lipid peroxidation, hepatocyte necrosis, TNF- ⁇ , IL-6, IL-8 are activators of Ito stellate cells. Their stimulation is accompanied by excessive production of connective tissue with the development of fibrosis, and with prolonged persistence of the process - cirrhosis of the liver.
  • TNF-ct tumor necrosis factor a
  • IL-6 interleukin-6
  • IL-8 interle
  • the processes leading to cell death include impaired cytoplasmic calcium homeostasis, glutathione depletion, lipid peroxidation, and the associated increase in permeability of the mitochondrial membrane (MRI).
  • these processes are caused by the appearance of reactive products of hepatotoxin metabolism and the appearance of reactive oxygen species (ROS) during the inflammatory reaction.
  • ROS reactive oxygen species
  • the main strategy is to reduce the amount of reactive products of hepatotoxin metabolism, use of antioxidants, stabilize cytoplasmic calcium homeostasis and modulate the biological response of Kupffer cells.
  • the arsenal of modern hepatoprotective agents contains a variety of drugs and biologically active additives, which to one degree or another have a therapeutic effect on the processes of toxic degradation of liver cells. These are mainly preparations of phospholipids, ademethionine, thioctic acid, the active substances of milk thistle, spotted and urodesoxycholic acid. A large place in connection with the practical absence of contraindications and an insignificant number of side effects is occupied by herbal preparations, for example, based on spotted milk thistle, field artichoke and long turmeric. A common disadvantage of herbal remedies is low efficiency, dependence on herbal raw materials and composition variability. Moreover, herbal products are highly likely to cause allergic reactions.
  • the objective of the invention is the development of new hepatoprotective agents.
  • a method for the treatment and prevention of inflammatory liver diseases is also provided, in which a therapeutically active amount of ⁇ -caryophyllylene, or a derivative thereof or a pharmaceutically acceptable salt thereof is administered to a patient in need thereof, as well as a pharmaceutical composition containing ⁇ -caryophylline, or derivatives or pharmaceutically acceptable salts thereof and a pharmaceutically acceptable excipient.
  • ⁇ -caryophyllene may be essentially the only active principle.
  • Figure 1 Fibrosis regression after systematic administration of ⁇ -karyofillen to cirrhotic rats.
  • FIG. 2 Regression of fibrosis caused by ethanol + PUFA for 45 days while taking ⁇ -caryophyllene (Figs. 2a and 26).
  • FIG. 3 Induction of ⁇ -caryophyllene polarization of Kupffer cells upon stimulation with lipopolysaccharides.
  • FIG. 4 Dose-dependent inhibition of ⁇ -caryophyllene-induced lipopolysaccharides (LPS) of intracellular calcium in Kupffer cells of rats.
  • LPS ⁇ -caryophyllene-induced lipopolysaccharides
  • Beta-karyofillen is a sesquiterpene hydrocarbon, quite widespread in nature as part of the ether oils of plants such as: cloves (3.56%), rosemary (up to 8.3%), hops (up to 14.5%), cannabis (up to 37.5%), black pepper (7.29%) and others .
  • Karyofillen exists in the form of two isomers: karyofillen or trans-p-karyofillen (I) proper and isocaryophillene or cis-p-karyofillen (II):
  • Karyofillen quickly oxidizes in air and very easily, especially under the action of acids, undergoes transformations associated with the rearrangement of the carbon skeleton.
  • karyofillen is mainly associated with its aromatic properties, so the main field of use is the perfume industry.
  • the known instability of caryophyllene significantly limits the possibilities of its use.
  • beta-karyofillen (cis-isomer, trans-isomer, their combination) has a combination of properties that allow its rational use in the treatment of liver diseases, namely karyofillen acts on intracellular calcium, exhibits antioxidant properties and modulates inflammatory response by exposure to Kupffer cells. Moreover, it turned out that all these effects persist with the oral use of caryophylline, which is important for the drug.
  • the inventors have shown in animal experiments that karyofillen reduces the degree of existing fibrosis and can prevent the development of alcohol-induced fibrosis.
  • beta-karyofillen has a hepatoprotective effect on its own.
  • Kariofillen is used in the form of pharmaceutical preparations (dosage forms).
  • Pharmaceutical preparations of karyophylline can be administered orally, that is, these are dosage forms such as solutions, emulsions or suspensions, as well as tablets, coated tablets, dragees, hard and soft gelatine capsules.
  • dosage forms such as solutions, emulsions or suspensions, as well as tablets, coated tablets, dragees, hard and soft gelatine capsules.
  • an oily solution of caryophyllene placed in an isolated enteric capsule can be used as an oral dosage form.
  • therapeutically inert, inorganic, or organic carriers are added to caryophyllene.
  • Lactose, corn starch or its derivatives, talc, stearic acid or its salts and the like. can be used, for example, as such carriers for tablets, coated tablets, dragees and hard gelatine capsules.
  • Suitable carriers for soft gelatin capsules are, for example, vegetable oils, waxes, fats, semi-solid and liquid polyols and the like.
  • Suitable carriers for solutions and syrups are, for example, water, polyols, sucrose, invert sugar, glucose and the like.
  • pharmaceutical preparations may contain preservatives, solubilizers, stabilizers, wetting agents, emulsifiers, sweeteners, colorants, flavoring agents, salts for regulating the osmotic pressure, buffers, masking agents or antioxidants and other components necessary for preparing the dosage form.
  • the above excipients used to formulate the dosage forms will hereinafter be referred to as “therapeutically inert excipients”.
  • the dosage forms of the agent of the invention may also contain other therapeutically active substances.
  • Karyofillen is administered orally at a dose of 10 to 500 mg per day. For example, 20-200 mg per day.
  • Cirrhosis was induced by CCI4 (carbon tetrachloride) in accordance with the previously described method (Claria J and Jimenez W (1999) Renal dysfunction and ascites in Carbon-Tetrachloride-induced cirrhosis in rats. In Ascites and Renal Dysfunction in Liver Disease. Pathogenesis Diagnosis and Treatment ( Arroyo V, Gines P, Rodes J, and Schrier RW eds) pp 379-396, Blackwell Science Inc., Maiden, MA).
  • Ascites-free cirrhotic rats were studied between 11 and 12 weeks after the start of the cirrhosis induction program. The absence of ascites was confirmed by the laparotomy method.
  • Cirrhotic rats with ascites were studied between 13 and 17 weeks when ascites reached full development.
  • Control rats were studied in a similar period against the background of phenobarbital administration.
  • fibrosis Quantification of fibrosis. Liver sections (4 ⁇ m) were stained with a 0.1% solution of Sirius red F3B (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) in saturated picric acid (Sigma-Aldrich), specifically staining collagen. The relative area of fibrosis (expressed as a percentage of the total area of the liver) was determined by analyzing 36 fields stained with Sirius red liver sections per animal. Each field was placed in a 10x and RT-Slider SPOT digital camera and analyzed using a computerized morphometric system. To determine the relative fibrosis area, the measured collagen area was divided by the total field area and multiplied by 100.
  • the liver was pre-washed with Hank's calcium-free buffered saline (Ca '+ - free HBSS with low endotoxin content) (HyClone Laboratories. Logan, UT. USA) at pH 7.4 and 30 ° C allowing blood to flow from the incision in the inferior vena cava. After 2 minutes, the washing solution was replaced with a collagenase A solution (0.163 U / ml in high glucose DMEM) (Boehringer Mannheim. Mannheim. Germany) and the liver was washed for 30 seconds at a rate of 5 ml / minute at 35 ° C. After washing, the liver was removed from the rat and gently dispersed.
  • Hank's calcium-free buffered saline Ca '+ - free HBSS with low endotoxin content
  • a liver suspension of 8 rats was combined and incubated with constant stirring at 35 ° C for 10 minutes in 40 ml of collagenase solution, which was used for washing in 50 ml of polypropylene tubes. After that, all experiments were carried out at 4 ° C.
  • the liver cell suspension was filtered through a nylon filter (212 RT) and placed in 50 ml of HBSS containing 0.3% BSA (V. fraction low in endotoxins. Sigma, St. Louis, MO, USA) and 2 pg / ml DNase ( low endotoxin content, sterile, Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany) and centrifuged at 400 X for 15 minutes.
  • This buffer will hereinafter be called the “working buffer” (WB).
  • the precipitate was placed in 15.6 ml of WB and mixed with 21 ml of NycoPrep (low endotoxin content, sterile Nycodenz solution with a density of 1, 150 g / ml and an osmolarity of 290 milliosmoles. Nycorned Pharma. Oslo, Norway).
  • the mixture was placed in three 15 ml polypropylene tubes and 1 ml of WB was placed on top of the mixture.
  • Red blood cells and tissue mass were precipitated by centrifugation at 1500 X for 15 minutes.
  • Interphase cells which are mainly sinusoidal cells, are suspended in 50 ml of WB and washed twice to remove Nycodenz by centrifugation at 400 X for 15 minutes.
  • the pellet was placed in 5 ml of WB and further cell fractionation was performed by countercurrent centrifugal elution (CCE) using a Beckman JE-5.0 autoclaved eluting rotor with a Sanderson camera (Beckman Instruments, Palo Alto, CA. USA).
  • CCE countercurrent centrifugal elution
  • the cell suspension was introduced into the elutator at a speed of 12.
  • oral doses of HRV were effective in treating liver cirrhosis caused by CC1 4 .
  • Test rats with cirrhosis caused by SSC were randomized to
  • Nutrient medium normal granular food
  • Nutrient medium normal granular food
  • the size of the relative areas of fibrosis was determined by 30 samples
  • karyofillen demonstrates high oral bioavailability and the ability to cause regression of fibrosis in rats with cirrhosis.
  • Test healthy rats were randomized into 3 groups of 6 animals in each group.
  • Group 1 received normal granular food
  • group 2 received orally with a diet of 20% ethanol and 15% thermally oxidized polyunsaturated fatty acids (PUFA) for 45 days.
  • Group 3 received, with food, 20% ethanol and 15% PUFA, along with 5 mg / kg of caryophyllene dissolved in ethanol for 45 days.
  • part of the animals of group 3 instead of karyoflelen received 10 mg / kg of another experimental substance JWH133 during the same period.
  • Rat Kupffer cells (macrophages) (5x10 5 ), isolated in accordance with the procedure described above, were incubated for 30 minutes with caryophyllylene at a dose of 100 nM and 1 ⁇ M and then stimulated with 500 ⁇ g of lipopolysaccharide for 22 hours. During the experiment, the ratio of M1 and M2 macrophage phenotypes was determined.
  • Kupffer cells isolated in accordance with the method described above were divided into 3 groups: group 1 - intact, group 2 was incubated for 30 minutes and then stimulated with 500 ⁇ g of lipopolysaccharide for 22 hours.
  • the 3rd group of cells was divided into 6 subgroups, each of which was incubated for 30 minutes with caryophyllene in doses of 5 to 100 nM and then stimulated with 500 ⁇ g of lipopolysaccharide for 22 hours.
  • the cells of each group were mixed with Fura2-AM fluorochrome and placed for 30 minutes at 37 ° C on Williams E. Medium. Glass coverslips with samples were placed in a specially designed plastic container (Groupe de für en Transport Membranaire, Montre'al, Que ' bec) onto an inverted microscope shelf (Nikon Diaphot TMD) and washed with Krebs-Hanslight buffer containing (in mM) 140 NaCI, 25 NaHC03, 10 Hepes, 5.5 dextrose, 3.8 KCI, 1.6 CaCI2, 1.2 MgS04, 1.2 KH2P04, and 1 pyruvate Na ( pH 7.4) saturated with 95% 0 2 /5% C0 2 at 37 ° C. The temperature of the tank was monitored.
  • Fluorescence intensity was measured at 340 and 380 nm using a cooled CCD camera and Hamamatsu imaging system (Model C4880; Imaging Research, Inc)
  • the Ca content was measured by fluorescence spectroscopy in each of the 3 groups of cells.
  • the change in the content of Ca 2+ was calculated in relation to the content of Ca 2+ in group 1.
  • Kupffer cells were incubated in 96 plates for 48 hours. 500 nM karyofillen was added to the culture medium before incubation, and 1 hour later, lipopolysaccharides were added to the culture medium. To measure superoxides, the medium was aerated, and Kupffer cells were washed twice with Hank's balanced saline (HBSS). After that, Kupffer cells were incubated in HBSS together with 1 ⁇ M PMA (Sigma) and homogenized.
  • HBSS Hank's balanced saline
  • group 1 included the intact homogenization of Kupffer cells
  • group 2 included the homogenization of Kupffer cells stimulated by PMA, but without the addition of caryophylline
  • group 3 included the homogenization of Kupffer cells stimulated by PMA with an addition of 500 ⁇ M caryophyllene.
  • the concentration of superoxide radicals was studied by the content of malondialdehyde (MDA) by a method involving the use of thiobarbituric acid (TBA).
  • MDA malondialdehyde
  • TBA thiobarbituric acid
  • 0.4 ml of 0.6% TBA and 1.2 ml of 1% phosphoric acid was added to 100 ⁇ l of Kupffer cell homogenate isolated in accordance with the procedure described above, and the mixture was boiled for 40 minutes. After cooling, 1.6 ml of 1-butanol was added to the mixture, the samples were mixed and centrifuged at 1200 rpm for 12 minutes.
  • the concentration of MDA supernatant was measured by optical density at 535 nm using a TBA calibration curve as a standard.
  • Fig. 5 The results of the experiment are shown in Fig. 5 and confirm the ability of caryophyllene to effectively prevent the increase in the content of superoxides in Kupffer cells after stimulation of PMA (difference in concentrations there are practically no superoxides between the samples of group 1 (control) and group 3 ( ⁇ and caryophylline), and the concentration of superoxides in the samples of group 2 ( ⁇ without caryophylline) is more than 4 times higher than the similar indicator in the samples of group 3 ( ⁇ and caryophylline).

Abstract

Proposed is a hepatoprotective agent substantially composed of caryophyllene or derivatives or pharmaceutically acceptable salts thereof.

Description

ГЕПАТОПРОТЕКТОРНОЕ СРЕДСТВО  Hepatoprotective agent
Область изобретения  Field of Invention
Изобретение относится к области лекарственных средств, а именно к средствам для лечения заболеваний печени.  The invention relates to the field of drugs, namely to means for the treatment of liver diseases.
Уровень техники State of the art
Распространенность заболеваний печени в мире составляет более 30%. Самым распространенным среди них является стеатоз или жировая болезнь печени. В Российской Федерации, по некоторым данным, в среднем, у 27% населения имеется неалкогольная жировая болезнь печени. Кроме этого, официально в России насчитывается более 10 млн. человек, больных алкоголизмом. Вследствие злоупотребления алкоголем, у 90-100% пациентов развивается алкогольный стеатоз, который в 10-20% случаев трансформируется в алкогольный гепатит и цирроз печени. Среди больных с патологией печени летальный исход от цирроза печени вследствие алкогольной болезни печени составляет около 44% смертельных случаев.  The prevalence of liver disease in the world is more than 30%. The most common among them is steatosis or fatty liver disease. In the Russian Federation, according to some reports, on average, 27% of the population have non-alcoholic fatty liver disease. In addition, officially in Russia there are more than 10 million people with alcoholism. Due to alcohol abuse, 90-100% of patients develop alcoholic steatosis, which in 10-20% of cases transforms into alcoholic hepatitis and liver cirrhosis. Among patients with liver pathology, death from cirrhosis due to alcoholic liver disease is about 44% of deaths.
Причинами стеатоза, кроме злоупотребления алкоголем, являются:  The causes of steatosis, in addition to alcohol abuse, are:
- воздействие некоторых лекарств и токсических веществ;  - exposure to certain drugs and toxic substances;
- ожирение  - obesity
- сахарный диабет  - diabetes
- метаболический синдром  metabolic syndrome
- хронические заболевания пищеварительной системы с нарушением всасывания.  - chronic diseases of the digestive system with malabsorption.
Повреждения печени, вызванные гепатотоксинами, такими как, например, этанол, характеризуются различной степенью повреждения гепатоцитов, фиброзом, а также гибелью клеток по типу апоптоза или некроза.  Damage to the liver caused by hepatotoxins, such as, for example, ethanol, is characterized by varying degrees of damage to the hepatocytes, fibrosis, as well as cell death by the type of apoptosis or necrosis.
В реакциях окисления токсины индуцируют избыточную продукцию и накопление в печеночной клетке свободных радикалов и других токсических метаболитов. В процессе оксидативного стресса происходит чрезмерная мобилизация свободных ионов железа из ферритина, что в свою очередь увеличивает содержание гидроксильных радикалов. Свободные радикалы запускают реакции перекисного окисления липидов и секрецию цитокинов, включая фактор некроза опухоли a (TNF-ct), интерлейкин-6 (IL-6) и интерлейкин-8 (IL-8). Эти патологические реакции приводят к некрозу гепатоцитов и развитию воспалительной клеточной инфильтрации. Продукты перекисного окисления липидов, некроз гепатоцитов, TNF-α, IL-6, IL-8 являются активаторами стеллатных клеток Ito. Их стимуляция сопровождается избыточной продукцией соединительной ткани с развитием фиброза, а при длительном персистировании процесса - циррозом печени. In oxidation reactions, toxins induce excessive production and accumulation of free radicals and other toxic metabolites in the liver cell. In the process of oxidative stress, excessive mobilization of free iron ions from ferritin occurs, which in turn increases the content of hydroxyl radicals. Free radicals trigger lipid peroxidation reactions and secretion of cytokines, including tumor necrosis factor a (TNF-ct), interleukin-6 (IL-6) and interleukin-8 (IL-8). These pathological reactions lead to hepatocyte necrosis and the development of inflammatory cell infiltration. The products of lipid peroxidation, hepatocyte necrosis, TNF-α, IL-6, IL-8 are activators of Ito stellate cells. Their stimulation is accompanied by excessive production of connective tissue with the development of fibrosis, and with prolonged persistence of the process - cirrhosis of the liver.
Процессы, приводящие к клеточной смерти, включают в себя нарушение гомеостаза цитоплазматического кальция, истощение по глутатиону, перекисное окисление липидов и связанное с этим увеличение проницаемости митохондриальной мембраны (МРТ). В свою очередь эти процессы обусловлены возникновением реакционноспособных продуктов метаболизма гепатотоксинов и появлением активных форм кислорода (ROS) во время воспалительной реакции.  The processes leading to cell death include impaired cytoplasmic calcium homeostasis, glutathione depletion, lipid peroxidation, and the associated increase in permeability of the mitochondrial membrane (MRI). In turn, these processes are caused by the appearance of reactive products of hepatotoxin metabolism and the appearance of reactive oxygen species (ROS) during the inflammatory reaction.
В последнее время также высказано предположение о том, что предотвращение возникновения митохондриальных пор может помочь снизить гибель клеток. То есть воздействовать следует на ключевые моменты повреждения печени: окислительный стресс и перекисное окисление липидов.  Recently, it has also been suggested that preventing the occurrence of mitochondrial pores can help reduce cell death. That is, it should act on the key points of liver damage: oxidative stress and lipid peroxidation.
Таким образом, в профилактике и лечении гепатотоксического повреждения печени основной стратегией является снижение количества реакционноспособных продуктов метаболизма гепатотоксинов, применение антиоксидантов, стабилизация гомеостаза цитоплазматического кальция и модулирование биологического ответа купферовских клеток.  Thus, in the prevention and treatment of hepatotoxic liver damage, the main strategy is to reduce the amount of reactive products of hepatotoxin metabolism, use of antioxidants, stabilize cytoplasmic calcium homeostasis and modulate the biological response of Kupffer cells.
В арсенале современных гепатопротекторных средств присутствует разнообразные лекарственные средства и биологически активные добавки, которые в той или иной степени оказывают терапевтическое действие на процессы токсической деградации клеток печени. В основном это препараты фосфолипидов, адеметионина, тиоктовой кислоты, действующих веществ расторопши пятнистой и уродезоксихолевой кислоты. Большое место в связи с практическим отсутствием противопоказаний и незначительным числом побочных эффектов занимают препараты растительного происхождения, например на основе расторопши пятнистой, артишока полевого и куркумы длинной. Общим недостатком растительных средств является низкая эффективность, зависимость от растительного сырья и вариабельность состава. При этом средства растительного происхождения с высокой вероятностью вызывают аллергические реакции.  The arsenal of modern hepatoprotective agents contains a variety of drugs and biologically active additives, which to one degree or another have a therapeutic effect on the processes of toxic degradation of liver cells. These are mainly preparations of phospholipids, ademethionine, thioctic acid, the active substances of milk thistle, spotted and urodesoxycholic acid. A large place in connection with the practical absence of contraindications and an insignificant number of side effects is occupied by herbal preparations, for example, based on spotted milk thistle, field artichoke and long turmeric. A common disadvantage of herbal remedies is low efficiency, dependence on herbal raw materials and composition variability. Moreover, herbal products are highly likely to cause allergic reactions.
Все перечисленные лекарственные средства являются неспецифическими гепатопротекторами, преимущественно метаболического действия. Молекулярные механизмы их фармакологической активности до конца не понятны, а терапевтическая активность недостаточно прогнозируема. Таким образом, по-прежнему сохраняется потребность в создании новых гепатопротекторных средств. All of the listed drugs are non-specific hepatoprotectors, mainly of metabolic effect. The molecular mechanisms of their pharmacological activity are not fully understood, and therapeutic activity is not sufficiently predicted. Thus, there remains a need for new hepatoprotective agents.
Сущность изобретения SUMMARY OF THE INVENTION
Задачей данного изобретения является разработка новых гепатопротекторных средств.  The objective of the invention is the development of new hepatoprotective agents.
Данная задача решается тем, что предложено гепатопротекторное средство на основе β-кариофиллена, причем это средство пригодно для перорального введения.  This problem is solved by the fact that the proposed hepatoprotective agent based on β-caryophyllene, and this tool is suitable for oral administration.
Предложены также способ лечения и профилактики воспалительных заболеваний печени, при котором нуждающемуся в этом пациенту вводят терапевтически активное количество β-кариофиллена, или его производного или его фармацевтически приемлемой соли, а также фармацевтическая композиция, содержащая β-кариофиллен, или его производные или фармацевтически приемлемые соли и фармацевтически приемлемый эксципиент.  A method for the treatment and prevention of inflammatory liver diseases is also provided, in which a therapeutically active amount of β-caryophyllylene, or a derivative thereof or a pharmaceutically acceptable salt thereof is administered to a patient in need thereof, as well as a pharmaceutical composition containing β-caryophylline, or derivatives or pharmaceutically acceptable salts thereof and a pharmaceutically acceptable excipient.
Согласно данному изобретению, β-кариофиллен может являться по существу единственным действующим началом.  According to this invention, β-caryophyllene may be essentially the only active principle.
Краткое описание графических материалов A brief description of the graphic materials
Фиг.1. Регрессия фиброза после систематического введения β- кариофиллена циррозным крысам.  Figure 1. Fibrosis regression after systematic administration of β-karyofillen to cirrhotic rats.
Фиг. 2. Регрессия фиброза, вызванного этанол + PUFA в течение 45 дней на фоне приема β-кариофиллена (Фиг. 2а и 26).  FIG. 2. Regression of fibrosis caused by ethanol + PUFA for 45 days while taking β-caryophyllene (Figs. 2a and 26).
Фиг. 3. Индуцирование β-кариофилленом поляризации купферовских клеток при стимулировании липополисахаридами.  FIG. 3. Induction of β-caryophyllene polarization of Kupffer cells upon stimulation with lipopolysaccharides.
Фиг. 4. Доза-зависимое ингибирование β-кариофилленом индуцированного липополисахаридами (ЛПС) внутриклеточного кальция в Купферовских клетках крыс.  FIG. 4. Dose-dependent inhibition of β-caryophyllene-induced lipopolysaccharides (LPS) of intracellular calcium in Kupffer cells of rats.
Фи г.5 Ингибирование бета-кариофилленом индуцированного РМА пероксидирования в Купферовских клетках крыс.  Fi g. 5 Inhibition of beta-caryophyllin-induced PMA peroxidation in Kupffer rat cells.
Подробное описание изобретения DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Бета-кариофиллен (кариофиллен) представляет собой сесквитерпеновый углеводород, достаточно широко распространенный в природе в составе эфирных масел таких растений как: гвоздика (3,56%), розмарин (до 8,3%), хмель (до 14,5%), каннабис (до 37,5%), черный перец (7,29%) и других. Beta-karyofillen (karyofillen) is a sesquiterpene hydrocarbon, quite widespread in nature as part of the ether oils of plants such as: cloves (3.56%), rosemary (up to 8.3%), hops (up to 14.5%), cannabis (up to 37.5%), black pepper (7.29%) and others .
Кариофиллен существует в виде двух изомеров: собственно кариофиллен или транс-р-кариофиллен (I) и изокариофиллен или цис-р-кариофиллен (II):  Karyofillen exists in the form of two isomers: karyofillen or trans-p-karyofillen (I) proper and isocaryophillene or cis-p-karyofillen (II):
Figure imgf000005_0001
Figure imgf000005_0001
Кариофиллен быстро окисляется на воздухе и очень легко, особенно под действием кислот, претерпевает превращения, связанные с перестройкой углеродного скелета.  Karyofillen quickly oxidizes in air and very easily, especially under the action of acids, undergoes transformations associated with the rearrangement of the carbon skeleton.
Применение кариофиллена в основном связано с его ароматическими свойствами, поэтому основной областью использования является парфюмерная промышленность. Известная нестабильность кариофиллена существенно ограничивает возможности его применения.  The use of karyofillen is mainly associated with its aromatic properties, so the main field of use is the perfume industry. The known instability of caryophyllene significantly limits the possibilities of its use.
Неожиданно авторами изобретения было обнаружено, что бета- кариофиллен (cis-изомер, trans-изомер, их комбинация) обладает сочетанием свойств, которые позволяют рационально применять его при лечении заболеваний печени, а именно кариофиллен воздействует на внутриклеточный кальций, проявляет свойства антиоксиданта и модулирует воспалительный ответ путем воздействия на купферовские клетки. Более того, оказалось, что все эти эффекты сохраняются при пероральном применении кариофиллена, что важно для лекарственного средства. Авторами изобретения показано в экспериментах на животных, что кариофиллен снижает степень существующего фиброза и позволяет предупредить развитие индуцируемого алкоголем фиброза. Это воздействие опосредуется влиянием кариофиллена на купферовские клетки, внутриклеточый кальций (восстанавливается гомеостаз кальция, нарушенный воспалительным процессом) и его антиоксидантными свойствами, что как было отмечено выше, является основной стратегией в предупреждении и лечении стеатоза и последующего цирроза печени.  Unexpectedly, the inventors found that beta-karyofillen (cis-isomer, trans-isomer, their combination) has a combination of properties that allow its rational use in the treatment of liver diseases, namely karyofillen acts on intracellular calcium, exhibits antioxidant properties and modulates inflammatory response by exposure to Kupffer cells. Moreover, it turned out that all these effects persist with the oral use of caryophylline, which is important for the drug. The inventors have shown in animal experiments that karyofillen reduces the degree of existing fibrosis and can prevent the development of alcohol-induced fibrosis. This effect is mediated by the effect of karyofillen on Kupffer cells, intracellular calcium (calcium homeostasis is restored, disturbed by the inflammatory process) and its antioxidant properties, which, as noted above, is the main strategy in the prevention and treatment of steatosis and subsequent liver cirrhosis.
Для оказания гепатопротекторного действия достаточно введения только бета-кариофиллена как единственного действующего начала. Хотя, конечно, при желании в препарат могут быть добавлены другие активные ингредиенты. «По существу состоящий» в контексте данного изобретения как раз и означает, что средство или композиция по изобретению не включают существенные количества иных ингредиентов. Хотя при желании они могут быть добавлены. Согласно данному изобретению бета-кариофиллен оказывает гепатопротекторное действие сам по себе. To provide a hepatoprotective effect, it is sufficient to administer only beta-karyofillen as the only active principle. Although, of course, if desired, other active ingredients can be added to the drug. "Essentially consisting" in the context of this invention means that the agent or composition according to the invention does not include significant amounts of other ingredients. Although, if desired, they can be added. According to this invention, beta-karyofillen has a hepatoprotective effect on its own.
Кариофиллен используют в форме фармацевтических препаратов (лекарственных форм). Фармацевтические препараты кариофиллена могут вводиться перорально, то есть это такие лекарственные формы как растворы, эмульсии или суспензии, а также таблетки, таблетки, покрытые оболочкой, драже, твердые и мягкие желатиновые капсулы. Например, в целях предупреждения окисления и разложения кариофиллена в качестве лекарственной формы для перорального применения может быть использован масляный раствор кариофиллена, помещаемый в изолированную кишечнорастворимую капсулу.  Kariofillen is used in the form of pharmaceutical preparations (dosage forms). Pharmaceutical preparations of karyophylline can be administered orally, that is, these are dosage forms such as solutions, emulsions or suspensions, as well as tablets, coated tablets, dragees, hard and soft gelatine capsules. For example, in order to prevent the oxidation and decomposition of caryophyllene, an oily solution of caryophyllene placed in an isolated enteric capsule can be used as an oral dosage form.
Для получения фармацевтических препаратов (лекарственных форм) к кариофиллену добавляют терапевтически инертные, неорганические или органические носители. Лактоза, кукурузный крахмал или его производные, тальк, стеариновая кислота или ее соли и т.п. могут быть использованы, например, в качестве таких носителей для таблеток, таблеток, покрытых оболочкой, драже и твердых желатиновых капсул. Подходящими носителями для мягких желатиновых капсул являются, например, растительные масла, воски, жиры, полутвердые и жидкие полиолы и т.п. Подходящими носителями для получения растворов и сиропов являются, например, вода, полиолы, сахароза, инвертный сахар, глюкоза и т.п.  To obtain pharmaceutical preparations (dosage forms), therapeutically inert, inorganic, or organic carriers are added to caryophyllene. Lactose, corn starch or its derivatives, talc, stearic acid or its salts and the like. can be used, for example, as such carriers for tablets, coated tablets, dragees and hard gelatine capsules. Suitable carriers for soft gelatin capsules are, for example, vegetable oils, waxes, fats, semi-solid and liquid polyols and the like. Suitable carriers for solutions and syrups are, for example, water, polyols, sucrose, invert sugar, glucose and the like.
Кроме того, фармацевтические препараты могут содержать консерванты, солюбилизаторы, стабилизаторы, смачивающие вещества, эмульгаторы, подсластители, красители, корригенты, соли для регулирования осмотического давления, буферы, маскирующие агенты или антиоксиданты и другие, необходимые для приготовления лекарственной формы, компоненты.  In addition, pharmaceutical preparations may contain preservatives, solubilizers, stabilizers, wetting agents, emulsifiers, sweeteners, colorants, flavoring agents, salts for regulating the osmotic pressure, buffers, masking agents or antioxidants and other components necessary for preparing the dosage form.
Указанные выше вспомогательные вещества, используемые для образования лекарственных форм, будут названы далее «терапевтически инертными эксципиентами». Однако лекарственные формы средства по изобретению также могут содержать и другие терапевтически активные вещества.  The above excipients used to formulate the dosage forms will hereinafter be referred to as “therapeutically inert excipients”. However, the dosage forms of the agent of the invention may also contain other therapeutically active substances.
Кариофиллен вводят перорально в дозе от 10 до 500 мг в день. Например, 20-200 мг в день. Конкретные примеры осуществления изобретения Karyofillen is administered orally at a dose of 10 to 500 mg per day. For example, 20-200 mg per day. Specific Embodiments
Индукция цирроза у крыс. Induction of cirrhosis in rats.
Исследования проводились на мужских особях крыс линии Вистар с циррозом печени, осложненным асцитом или без такового. Контрольная группа также состояла из мужских особей крыс линии Вистар.  Studies were conducted on males of Wistar rats with cirrhosis complicated by ascites or without ascites. The control group also consisted of male Wistar rats.
Цирроз был индуцирован CCI4 (тетрахлорметаном) в соответствии с ранее описанным методом (Claria J and Jimenez W (1999) Renal dysfunction and ascites in Carbon-Tetrachloride-induced cirrhosis in rats. In Ascites and Renal Dysfunction in Liver Disease. Pathogenesis Diagnosis and Treatment (Arroyo V, Gines P, Rodes J, and Schrier RW eds) pp 379-396, Blackwell Science Inc., Maiden, MA).  Cirrhosis was induced by CCI4 (carbon tetrachloride) in accordance with the previously described method (Claria J and Jimenez W (1999) Renal dysfunction and ascites in Carbon-Tetrachloride-induced cirrhosis in rats. In Ascites and Renal Dysfunction in Liver Disease. Pathogenesis Diagnosis and Treatment ( Arroyo V, Gines P, Rodes J, and Schrier RW eds) pp 379-396, Blackwell Science Inc., Maiden, MA).
Циррозные крысы без асцита изучались между 11 и 12 неделями после начала программы индукции цирроза. Отсутствие асцита подтверждалось лапаротомическим методом.  Ascites-free cirrhotic rats were studied between 11 and 12 weeks after the start of the cirrhosis induction program. The absence of ascites was confirmed by the laparotomy method.
Циррозные крысы с асцитом изучались между 13 и 17 неделями, когда асцит достигал полного развития.  Cirrhotic rats with ascites were studied between 13 and 17 weeks when ascites reached full development.
Контрольные крысы изучались в аналогичный период на фоне введения фенобарбитала.  Control rats were studied in a similar period against the background of phenobarbital administration.
В примере Ns1 использовались асцитные крысы.  In the Ns1 example, ascites rats were used.
Исследование проводилось в соответствии с критериями Комитета по исследованиям и этике университета Гвадалахары.  The study was conducted in accordance with the criteria of the Research and Ethics Committee of the University of Guadalajara.
Количественная оценка фиброза. Срезы печени (4 мкм) окрашивались 0,1 % раствором Сириус красный F3B (Сигма-Олдрич, Сент Луис, МО) в насыщенной пикриновой кислоте (Сигма-Олдрич), специфически окрашивающим коллаген. Относительная площадь фиброза (выраженная в процентах от общей площади печени) определялась посредством анализа 36 полей окрашенных Сириусом красным срезов печени на одно животное. Каждое поле помещалось в 10х and RT- Slider SPOT цифровую камеру и анализировалось при помощи компьютеризированной морфометрической системы. Для определения относительной площади фиброза, измеряемая площадь коллагена делилась на общую площадь поля и умножалась на 100. Вычитание площади просвета сосудов из общей площади давало итоговое значение фактической площади фиброза. Для каждого животного измерялась величина фиброза в процентах и рассчитывалось среднее значение площади фиброза. Содержание коллагена определялось спектрофотометрически методом Весснера. Изолирование купферовских клеток. Крысы анестезировались интраперитонеально Нембуталом. В брюшной полости делался вентральный разрез в срединной линии и стерильная тефлоновая канюля 24-го размера (introcan-w. 24Gi, Braun Melsungen. Melsungen. Germany) вводилась в портальную вену. Печень предварительно промывалась бескальциевым буферным солевым раствором Хэнка (Ca'+-free HBSS с низким содержанием эндотоксинов) (HyClone Laboratories. Logan, UT. USA) при pH 7,4 и 30°С позволяя крови вытекать из разреза в нижней полой вене. Через 2 минуты промывающий раствор замещался раствором коллагеназы А (0.163 U/ml в DMEM с высоким содержанием глюкозы) (Boehringer Mannheim. Mannheim. Germany) и печень промывалась 30 секунд со скоростью 5 мл/минуту при 35°С. После промывания печень удалялась из крысы и аккуратно диспергировалась. Печеночная суспензия из 8 крыс объединялась и инкубировалась при постоянном перемешивании при 35°С в течение 10 минут в 40 мл раствора коллагеназы, который использовался для промывания в 50 мл полипропиленовых пробирках. После этого все эксперименты проводились при 4°С. Суспензия клеток печени фильтровалась через нейлоновый фильтр (212 рт) и помещалась в 50 мл HBSS, содержащий 0,3% BSA (фракция V. с низким содержанием эндотоксинов. Sigma, St. Louis, МО, USA) и 2 пг/мл ДНКазы (низкое содержание эндотоксинов, стерильный, Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany) и центрифугировалась при 400 X в течение 15 минут. Этот буфер в дальнейшем будет называться «рабочий буфер» (WB). Осадок помещался в 15,6 мл WB и смешивался с 21 мл NycoPrep (низкое содержание эндотоксинов, стерильный раствор Nycodenz с плотностью 1 ,150 г/мл и осмолярностью 290 миллиосмоль. Nycorned Pharma. Oslo, Norway). Смеси помещались в три 15 мл полипропиленовые пробирки и поверх смеси помещался 1 мл WB. Красные кровяные клетки и тканевая масса осаждались центрифугированием при 1500 X в течение 15 минут. Клетки интерфазы, являющиеся, в основном, синусоидальными клетками, суспендировались в 50 мл WB и дважды промывались для удаления Nycodenz центрифугированием при 400 X в течение 15 минут. Осадок помещался в 5 мл WB и дальнейшее фракционирование клеток производилось методом противоточной центрифужной элютриации (ССЕ) с использованием автоклавируемого элютриаторного ротора Beckman JE-5.0 с камерой Sanderson (Beckman Instruments, Palo Alto, CA. USA). Клеточная суспензия вводилась в элютриатор на скорости 12. Статистический анализ результатов, когда применимо, производился с применением непарных критериев Стьюдента. Quantification of fibrosis. Liver sections (4 μm) were stained with a 0.1% solution of Sirius red F3B (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) in saturated picric acid (Sigma-Aldrich), specifically staining collagen. The relative area of fibrosis (expressed as a percentage of the total area of the liver) was determined by analyzing 36 fields stained with Sirius red liver sections per animal. Each field was placed in a 10x and RT-Slider SPOT digital camera and analyzed using a computerized morphometric system. To determine the relative fibrosis area, the measured collagen area was divided by the total field area and multiplied by 100. Subtraction of the vessel lumen area from the total area gave the final value of the actual fibrosis area. For each animal, fibrosis was measured as a percentage and the average fibrosis area was calculated. The collagen content was determined spectrophotometrically by the Wessner method. Isolation of Kupffer cells. Rats were anesthetized intraperitoneally with Nembutal. A midline ventral incision was made in the abdominal cavity and a 24-gauge sterile Teflon cannula (introcan-w. 24Gi, Braun Melsungen. Melsungen. Germany) was inserted into the portal vein. The liver was pre-washed with Hank's calcium-free buffered saline (Ca '+ - free HBSS with low endotoxin content) (HyClone Laboratories. Logan, UT. USA) at pH 7.4 and 30 ° C allowing blood to flow from the incision in the inferior vena cava. After 2 minutes, the washing solution was replaced with a collagenase A solution (0.163 U / ml in high glucose DMEM) (Boehringer Mannheim. Mannheim. Germany) and the liver was washed for 30 seconds at a rate of 5 ml / minute at 35 ° C. After washing, the liver was removed from the rat and gently dispersed. A liver suspension of 8 rats was combined and incubated with constant stirring at 35 ° C for 10 minutes in 40 ml of collagenase solution, which was used for washing in 50 ml of polypropylene tubes. After that, all experiments were carried out at 4 ° C. The liver cell suspension was filtered through a nylon filter (212 RT) and placed in 50 ml of HBSS containing 0.3% BSA (V. fraction low in endotoxins. Sigma, St. Louis, MO, USA) and 2 pg / ml DNase ( low endotoxin content, sterile, Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany) and centrifuged at 400 X for 15 minutes. This buffer will hereinafter be called the “working buffer” (WB). The precipitate was placed in 15.6 ml of WB and mixed with 21 ml of NycoPrep (low endotoxin content, sterile Nycodenz solution with a density of 1, 150 g / ml and an osmolarity of 290 milliosmoles. Nycorned Pharma. Oslo, Norway). The mixture was placed in three 15 ml polypropylene tubes and 1 ml of WB was placed on top of the mixture. Red blood cells and tissue mass were precipitated by centrifugation at 1500 X for 15 minutes. Interphase cells, which are mainly sinusoidal cells, are suspended in 50 ml of WB and washed twice to remove Nycodenz by centrifugation at 400 X for 15 minutes. The pellet was placed in 5 ml of WB and further cell fractionation was performed by countercurrent centrifugal elution (CCE) using a Beckman JE-5.0 autoclaved eluting rotor with a Sanderson camera (Beckman Instruments, Palo Alto, CA. USA). The cell suspension was introduced into the elutator at a speed of 12. Statistical analysis of the results, when applicable, was performed using unpaired student criteria.
Данные представлены в виде среднего значения ± S.E.M., и считаются значимыми на уровне р 0.05 или ниже.  Data are presented as mean ± S.E.M., and are considered significant at p 0.05 or lower.
Результаты results
Как показано в приведенных ниже примерах, оральные дозы ВСР были эффективны при лечении цирроза печени, вызванного СС14. As shown in the examples below, oral doses of HRV were effective in treating liver cirrhosis caused by CC1 4 .
ПРИМЕР 1  EXAMPLE 1
Испытуемые крысы с циррозом, вызванным ССЦ, были рандомизированы в Test rats with cirrhosis caused by SSC were randomized to
5 групп. Одной группе перорально вводилась питательная среда (нормальная гранулированная пища) в чистом виде, другим группам - та же питательная среда, содержащая 1 мг/кг, 3 мг/кг, 5 мг/кг и 10 мг/кг кариофиллена, соответственно, в течение 9 дней. Размер относительных площадей фиброза определялся по 30 образцам 5 groups. Nutrient medium (normal granular food) was orally administered to one group in a pure form, to the other groups the same nutrient medium containing 1 mg / kg, 3 mg / kg, 5 mg / kg and 10 mg / kg of caryophylline, respectively, for 9 days. The size of the relative areas of fibrosis was determined by 30 samples
Как показано на Фиг. 1 , дневная доза 5 мг/кг показала самое значительное уменьшение относительной площади фиброза (около 50%). Таким образом, как показано в эксперименте, кариофиллен демонстрирует высокую оральную биодоступность и способность вызывать регрессию фиброза у крыс с циррозом.  As shown in FIG. 1, a daily dose of 5 mg / kg showed the most significant decrease in the relative area of fibrosis (about 50%). Thus, as shown in the experiment, karyofillen demonstrates high oral bioavailability and the ability to cause regression of fibrosis in rats with cirrhosis.
ПРИМЕР 2  EXAMPLE 2
Испытуемые здоровые крысы были рандомизированы в 3 группы по 6 животных в каждой группе. Группа 1 получала нормальную гранулированную пищу, группа 2 получала перорально вместе с питанием 20% этанола и 15% термически окисленных полиненасыщенных жирных кислот (PUFA) в течение 45 дней. Группа 3 получала вместе с питанием 20% этанол и 15% PUFA вместе с 5 мг/кг кариофиллена, растворенного в этаноле, в течение 45 дней. Для сравнения действия кариофиллена, часть животных группы 3 вместо кариофллена получала 10 мг/кг другого экспериментального вещества JWH133 в течение того же срока.  Test healthy rats were randomized into 3 groups of 6 animals in each group. Group 1 received normal granular food, group 2 received orally with a diet of 20% ethanol and 15% thermally oxidized polyunsaturated fatty acids (PUFA) for 45 days. Group 3 received, with food, 20% ethanol and 15% PUFA, along with 5 mg / kg of caryophyllene dissolved in ethanol for 45 days. To compare the effect of caryophyllene, part of the animals of group 3 instead of karyoflelen received 10 mg / kg of another experimental substance JWH133 during the same period.
В результате эксперимента, у крыс, содержащихся в группе 2, развился фиброз, а у крыс, содержащихся к группе 3, развитие фиброза было значительно замедлено (Фиг 2а и Фиг 26). Результаты эксперимента подтверждают высокую биодоступность кариофиллена при пероральном применении и показывают способность кариофиллена замедлять процесс развития фиброза при хронической алкогольной и жировой интоксикации. Кроме того, как показано на Фиг.2б селективный агонист СВ2 рецепторов JWH133 недостаточно эффективно подавлял развитие цирроза печени, что подтверждает гипотезу о том, что только сочетание нескольких свойств, присущее кариофиллену, обеспечивает эффективное гепатопротекторное действие. As a result of the experiment, rats in group 2 developed fibrosis, and in rats contained in group 3, the development of fibrosis was significantly slowed down (Fig 2a and Fig 26). The results of the experiment confirm the high bioavailability of karyofillen when administered orally and show the ability of karyofillen to slow down the development of fibrosis in chronic alcohol and fat intoxication. In addition, as shown in FIG. 2b, the selective JWH133 CB2 receptor agonist did not sufficiently inhibit the development of cirrhosis, which confirms the hypothesis that only a combination of several properties inherent in caryophyllene provides an effective hepatoprotective effect.
ПРИМЕР 3  EXAMPLE 3
Купферовские клетки крыс (макрофаги) (5x105), изолированные в соответствии с методикой описанной выше, были инкубированы в течение 30 минут с кариофилленом в дозе 100 нМ и 1 мкМ и затем стимулированы 500 мкг липополисахарида в течение 22 часов. В ходе эксперимента определялось соотношение М1 и М2 фенотипов макрофагов. Rat Kupffer cells (macrophages) (5x10 5 ), isolated in accordance with the procedure described above, were incubated for 30 minutes with caryophyllylene at a dose of 100 nM and 1 μM and then stimulated with 500 μg of lipopolysaccharide for 22 hours. During the experiment, the ratio of M1 and M2 macrophage phenotypes was determined.
Результаты представлены на Фиг.З и свидетельствуют, что кариофиллен эффективно индуцирует поляризацию купферовских клеток с М1 до М2 при стимулировании липополисахаридами. Из этого следует, что кариофиллен оказывает выраженное модулирующее действие на купферовские клетоки, опосредованное, по всей видимости, его агонистической активностью по отношению к эндоканнабиноидным рецепторам 2-го типа.  The results are presented in FIG. 3 and indicate that karyofillen effectively induces the polarization of Kupffer cells from M1 to M2 when stimulated with lipopolysaccharides. From this it follows that karyofillen exerts a pronounced modulating effect on Kupffer cells and is mediated, apparently, by its agonistic activity with respect to endocannabinoid receptors of the 2nd type.
ПРИМЕР 4. Исследование влияния на внутриклеточный кальций EXAMPLE 4. Study of the effect on intracellular calcium
Методика. Купферовские клетки, изолированные в соответствии с методикой, описанной выше, были разделены на 3 группы: 1 группа - интактная, 2- я группа была инкубирована в течение 30 минут и затем стимулирована 500 мкг липополисахарида в течение 22 часов. 3-я группа клеток была разделена на 6 подгрупп, каждая из которых была инкубирована в течение 30 минут с кариофилленом в дозах от 5 до 100 нМ и затем стимулирована 500 мкг липополисахарида в течение 22 часов.  Methodology Kupffer cells isolated in accordance with the method described above were divided into 3 groups: group 1 - intact, group 2 was incubated for 30 minutes and then stimulated with 500 μg of lipopolysaccharide for 22 hours. The 3rd group of cells was divided into 6 subgroups, each of which was incubated for 30 minutes with caryophyllene in doses of 5 to 100 nM and then stimulated with 500 μg of lipopolysaccharide for 22 hours.
Клетки каждой группы были смешаны с флуорохромом Fura2-AM и помещены на 30 минут при 37°С в среду Вильямса Е. Покровные стекла с образцами помещались в специально спроектированной пластиковой емкости (Groupe de Recherche en Transport Membranaire, Montre'al, Que'bec) на полку инверсионного микроскопа (Nikon Diaphot TMD) и промывались буфером Кребса- Ханслайта, содержащим (в мМ) 140 NaCI, 25 NaHC03, 10 Hepes, 5.5 декстрозы, 3.8 KCI, 1.6 CaCI2, 1.2 MgS04, 1.2 КН2Р04, и 1 пирувата Na (рН 7.4), насыщенный 95% 02 / 5% С02 при 37°С. Температура емкости контролировалась. Интенсивность флуоресценции измерялась при 340 и 380 нм при помощи охлаждаемой CCD камеры и системы визуализации Hamamatsu (Model С4880; Imaging Research, Inc) Измерение содержания Са методом флуоресцентной спектроскопии производилось в каждой из 3-х групп клеток. Изменение содержания Са2+ рассчитывалось по отношению к содержанию Са2+ в группе 1. The cells of each group were mixed with Fura2-AM fluorochrome and placed for 30 minutes at 37 ° C on Williams E. Medium. Glass coverslips with samples were placed in a specially designed plastic container (Groupe de Recherche en Transport Membranaire, Montre'al, Que ' bec) onto an inverted microscope shelf (Nikon Diaphot TMD) and washed with Krebs-Hanslight buffer containing (in mM) 140 NaCI, 25 NaHC03, 10 Hepes, 5.5 dextrose, 3.8 KCI, 1.6 CaCI2, 1.2 MgS04, 1.2 KH2P04, and 1 pyruvate Na ( pH 7.4) saturated with 95% 0 2 /5% C0 2 at 37 ° C. The temperature of the tank was monitored. Fluorescence intensity was measured at 340 and 380 nm using a cooled CCD camera and Hamamatsu imaging system (Model C4880; Imaging Research, Inc) The Ca content was measured by fluorescence spectroscopy in each of the 3 groups of cells. The change in the content of Ca 2+ was calculated in relation to the content of Ca 2+ in group 1.
Результаты представлены на Фиг.4. Как было показано, кариофиллен доза- зависимо ингибирует внутриклеточный кальций, индуцированный липополисахаридами. Причем, если в группе 2 (без кариофиллена) содержание кальция увеличилось почти 2,3 раза, в группе 3 (с добавлением кариофиллена) увеличение содержания кальция было незначительным.  The results are presented in FIG. 4. As shown, caryophyllene dose-dependently inhibits intracellular calcium induced by lipopolysaccharides. Moreover, if in group 2 (without karyofillen) the calcium content increased almost 2.3 times, in group 3 (with the addition of karyofillen) the increase in calcium content was insignificant.
ПРИМЕР 5. Исследование влияния кариофиллена на процесс перекисного окисления липидов  EXAMPLE 5. Study of the effect of caryophylllene on the process of lipid peroxidation
Методика. Для изучения влияния кариофиллена на процесс перекисного окисления липидов, купферовские клетки инкубировались в 96 чашках в течение 48 часов. Кариофиллен в дозировке 500 нМ был добавлен в питательную среду перед инкубированием и через 1 час после этого в питательную среду были добавлены липополисахариды. Для измерения супероксидов среда подвергалась аэрации, а купферовские клетки были дважды промыты сбалансированным солевым раствором Ханка (HBSS). После этого, купферовские клетки инкубировались в HBSS вместе с 1 мкМ РМА (Сигма) и гомогенизировались.  Methodology To study the effect of caryophyllene on lipid peroxidation, Kupffer cells were incubated in 96 plates for 48 hours. 500 nM karyofillen was added to the culture medium before incubation, and 1 hour later, lipopolysaccharides were added to the culture medium. To measure superoxides, the medium was aerated, and Kupffer cells were washed twice with Hank's balanced saline (HBSS). After that, Kupffer cells were incubated in HBSS together with 1 μM PMA (Sigma) and homogenized.
Для последующих измерений были сформированы 3 группы образцов: 1 группа включала в себя интактный гомогенизат купферовских клеток, 2 группа включала в себя гомогенизат купферовских клеток, стимулированных РМА, но без добавления кариофиллена, 3 группа включала в себя гомогенизат купферовских клеток, стимулированных РМА с добвлением 500 мкМ кариофиллена.  For subsequent measurements, 3 groups of samples were formed: group 1 included the intact homogenization of Kupffer cells, group 2 included the homogenization of Kupffer cells stimulated by PMA, but without the addition of caryophylline, group 3 included the homogenization of Kupffer cells stimulated by PMA with an addition of 500 μM caryophyllene.
Концентрация супероксидных радикалов изучалось по содержанию малонового диальдегида (MDA) методом, предусматривающим использование тиобарбитуровой кислоты (ТВА). К 100 мкл гомогената купферовских клеток, изолированных в соответствии с методикой, описанной выше, было добавлено 0,4 мл 0,6% ТВА и 1 ,2 мл 1 % ортофосфорной кислоты и смесь кипятилась в течение 40 минут. После охлаждения к смеси было добавлено 1 ,6 мл 1-бутанола, образцы перемешивались и центрифугировались при 1200 об/мин в течение 12 минут. Концентрация MDA супернатанте измерялась по оптической плотности при 535 нм с использованием калибровочной кривой ТВА в качестве стандарта.  The concentration of superoxide radicals was studied by the content of malondialdehyde (MDA) by a method involving the use of thiobarbituric acid (TBA). 0.4 ml of 0.6% TBA and 1.2 ml of 1% phosphoric acid was added to 100 μl of Kupffer cell homogenate isolated in accordance with the procedure described above, and the mixture was boiled for 40 minutes. After cooling, 1.6 ml of 1-butanol was added to the mixture, the samples were mixed and centrifuged at 1200 rpm for 12 minutes. The concentration of MDA supernatant was measured by optical density at 535 nm using a TBA calibration curve as a standard.
Результаты эксперимента приведены на Фиг.5 и подтверждают способность кариофиллена эффективно предупреждать рост содержания супероксидов в купферовских клетках после стимулирования РМА (разница в концентрациях супероксидов между образцами группы 1 (контроль) и группой 3 (РМА и кариофиллен) практически отсутствует, а концентрация супероксидов в образцах группы 2 (РМА без кариофиллена) более чем в 4 раза превышает аналогичный показатель в образцах группы 3 (РМА и кариофиллен). The results of the experiment are shown in Fig. 5 and confirm the ability of caryophyllene to effectively prevent the increase in the content of superoxides in Kupffer cells after stimulation of PMA (difference in concentrations there are practically no superoxides between the samples of group 1 (control) and group 3 (РМА and caryophylline), and the concentration of superoxides in the samples of group 2 (РМА without caryophylline) is more than 4 times higher than the similar indicator in the samples of group 3 (РМА and caryophylline).
Пример 6. Приготовление масляного раствора кариофиллена 100 мг в мягких желатиновых капсулах: Example 6. Preparation of an oil solution of caryophyllene 100 mg in soft gelatin capsules:
Чистый кариофиллен в количестве 100 г растворяется в 1 кг очищенного оливкового или подсолнечного масла при комнатной температуре. Полученный раствор помещается в подающую емкость коэкструзионной машины по изготовлению мягких желатиновых капсул. Мягкие желатиновые капсулы, каждая из которых содержит 100 мг кариофиллена в 1 г оливкового или подсолнечного масла, изготавливаются методом коэкструзии. Из указанного количества сырья получают 1000 мягких желатиновых капсул.  Pure caryophyllene in an amount of 100 g is dissolved in 1 kg of purified olive or sunflower oil at room temperature. The resulting solution is placed in the supply tank of a coextrusion machine for the manufacture of soft gelatin capsules. Soft gelatin capsules, each of which contains 100 mg of caryophyllene in 1 g of olive or sunflower oil, are made by coextrusion. From the indicated amount of raw materials, 1000 soft gelatin capsules are obtained.
Таким образом, в ходе проведенных лабораторных экспериментов, авторами было убедительно подтверждено, что кариофиллен: Thus, in the course of laboratory experiments, the authors have convincingly confirmed that caryophyllene:
- индуцирует поляризацию купферовских клеток  - induces the polarization of Kupffer cells
- доза-зависимо ингибирует внутриклеточный кальций  - dose-dependently inhibits intracellular calcium
- предупреждает рост содержания супероксидных радикалов и перекисного окисления липидов.  - prevents the growth of superoxide radicals and lipid peroxidation.
При этом в опытах in vivo кариофиллен:  Moreover, in experiments in vivo karyofillen:
- способствует регрессии имеющегося фиброза печени и  - promotes regression of existing liver fibrosis and
- предупреждает развитие фиброза, вызванного алкогольной и жировой интоксикацией.  - prevents the development of fibrosis caused by alcohol and fat intoxication.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ CLAIM
1. Гепатопротекторное средство, содержащее β-кариофиллен, или его производные или фармацевтически приемлемые соли.  1. Hepatoprotective agent containing β-caryophyllene, or its derivatives or pharmaceutically acceptable salts.
2. Гепатопротекторное средство по п.1 по существу состоящее из β- кариофиллена.  2. The hepatoprotective agent according to claim 1, essentially consisting of β-caryophyllene.
3. Гепатопротекторное средство по п.1 или 2 для перорального введения. 3. Hepatoprotective agent according to claim 1 or 2 for oral administration.
4. Гепатопротекторное средство по п.З, включающее от 10 до 500 мг β- кариофиллена, предпочтительно 20-200 мг, в частности 50 мг. 4. The hepatoprotective agent according to claim 3, comprising from 10 to 500 mg of β-caryophyllene, preferably 20-200 mg, in particular 50 mg.
5. Способ лечения и профилактики воспалительных заболеваний печени, при котором нуждающемуся в этом пациенту вводят терапевтически активное количество β-кариофиллена, или его производного или его фармацевтически приемлемой соли.  5. A method for the treatment and prevention of inflammatory liver diseases, in which a therapeutically active amount of β-caryophyllene, or a derivative thereof or a pharmaceutically acceptable salt thereof is administered to a patient in need thereof.
6. Способ по п.5, где β-кариофиллен является по существу единственным активным компонентом.  6. The method according to claim 5, where β-caryophyllene is essentially the only active component.
7. Способ по п.5 или 6, где β-кариофиллен вводят в количестве от 10 до 500 мг, предпочтительно 20-200 мг, в частности 50 мг в день.  7. The method according to claim 5 or 6, where β-caryophyllene is administered in an amount of from 10 to 500 mg, preferably 20-200 mg, in particular 50 mg per day.
8. Фармацевтическая композиция, обладающая гепатопротекторной активностью, содержащая β-кариофиллен, или его производные или фармацевтически приемлемые соли и фармацевтически приемлемый эксципиент.  8. A pharmaceutical composition having hepatoprotective activity, containing β-caryophylline, or its derivatives or pharmaceutically acceptable salts and a pharmaceutically acceptable excipient.
9. Фармацевтическая композиция по п.8, где действующее начало представлено по существу β-кариофилленом.  9. The pharmaceutical composition of claim 8, wherein the active principle is substantially β-caryophyllene.
10. Фармацевтическая композиция по п.8 или 9, включающая от 10 до 500 мг β-кариофиллена, предпочтительно 20-200 мг, в частности 50 мг.  10. The pharmaceutical composition of claim 8 or 9, comprising from 10 to 500 mg of β-caryophyllene, preferably 20-200 mg, in particular 50 mg.
11. Применение β-кариофиллена, или его производных или фармацевтически приемлемых солей в качестве гепатопротекторного средства.  11. The use of β-caryophyllene, or its derivatives or pharmaceutically acceptable salts, as a hepatoprotective agent.
PCT/RU2013/000466 2012-06-07 2013-06-06 Hepatoprotective agent WO2013184036A2 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EA201200799 2012-06-07
EA201200799A EA024466B1 (en) 2012-06-07 2012-06-07 Hepatoprotecting medication

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2013184036A2 true WO2013184036A2 (en) 2013-12-12
WO2013184036A3 WO2013184036A3 (en) 2014-03-27

Family

ID=49712780

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2013/000466 WO2013184036A2 (en) 2012-06-07 2013-06-06 Hepatoprotective agent

Country Status (2)

Country Link
EA (1) EA024466B1 (en)
WO (1) WO2013184036A2 (en)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7466748B1 (en) 2023-08-18 2024-04-12 日本たばこ産業株式会社 Composition for maintaining or improving liver function

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS62132822A (en) * 1985-12-05 1987-06-16 Eisai Co Ltd Remedy for hepatitis
RU2327482C1 (en) * 2006-12-28 2008-06-27 Дмитрий Николаевич Мясников Composition and method of treatment of postintoxicational state and alcoholic abstinence syndrome-hangover (versions)
WO2008144880A1 (en) * 2007-05-31 2008-12-04 F.P.L. Pharma Inc. Compositions for prevention or treatment of anorexia-cachexia syndrome and uses thereof

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100512811C (en) * 2002-05-10 2009-07-15 科学与工业研究会 Hepatoprotective activity of 10-o-p-hydroxybenzoyiaucubin
US7625587B2 (en) * 2006-11-16 2009-12-01 Jose Angel Olalde Rangel Hepato phyto-nutraceutical synergistic composition

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS62132822A (en) * 1985-12-05 1987-06-16 Eisai Co Ltd Remedy for hepatitis
RU2327482C1 (en) * 2006-12-28 2008-06-27 Дмитрий Николаевич Мясников Composition and method of treatment of postintoxicational state and alcoholic abstinence syndrome-hangover (versions)
WO2008144880A1 (en) * 2007-05-31 2008-12-04 F.P.L. Pharma Inc. Compositions for prevention or treatment of anorexia-cachexia syndrome and uses thereof

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7466748B1 (en) 2023-08-18 2024-04-12 日本たばこ産業株式会社 Composition for maintaining or improving liver function

Also Published As

Publication number Publication date
EA024466B1 (en) 2016-09-30
EA201200799A1 (en) 2013-12-30
WO2013184036A3 (en) 2014-03-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Mohagheghi et al. The neuroprotective effect of olive leaf extract is related to improved blood–brain barrier permeability and brain edema in rat with experimental focal cerebral ischemia
US11224629B2 (en) Fraction of Melissa leaf extract having angiogenesis and MMP inhibitory activities, and composition comprising the same
Sirtori et al. N-3 fatty acids do not lead to an increased diabetic risk in patients with hyperlipidemia and abnormal glucose tolerance. Italian Fish Oil Multicenter Study
US20190167749A1 (en) The oleo gel composition and delivery system with active compounds from cannabis sativa and mentha arvensis for reduction of inflammation and pain in deep tissues
JP5933164B2 (en) Composition containing terpene compound and method for inhibiting neurotransmission
El‐Kirsh et al. The effect of L‐arginine or L‐citrulline supplementation on biochemical parameters and the vascular aortic wall in high‐fat and high‐cholesterol‐fed rats
Lu et al. Citronellal prevents endothelial dysfunction and atherosclerosis in rats
Franconi et al. Is extra virgin olive oil an ally for women’s and men’s cardiovascular health?
Brunetta et al. Does L-leucine supplementation cause any effect on glucose homeostasis in rodent models of glucose intolerance? A systematic review
Fang et al. Docosahexaenoic acid reduces linoleic acid induced monocyte chemoattractant protein‐1 expression via PPARγ and nuclear factor‐κB pathway in retinal pigment epithelial cells
P Karagodin et al. Antiatherosclerotic and cardioprotective effects of time-released garlic powder pills
Zhou et al. Supplementation of mussel peptides reduces aging phenotype, lipid deposition and oxidative stress in D-galactose-induce aging mice
Fernandes et al. Long-term treatment with fish oil prevents memory impairments but not hippocampal damage in rats subjected to transient, global cerebral ischemia
US20140148399A1 (en) Compositions and methods for treating or ameliorating obesity or for reducing diabetic hypercholesterolemia
RU2701567C1 (en) Agent possessing hepatoprotective activity
Ugbaja et al. Ameliorative effects of aloe vera gel extract on circulatory and tissue lipid profile status in streptozotocin-induced diabetic rats
BRPI0712389A2 (en) functional food composition rich in phenolic compounds and their use
WO2013184036A2 (en) Hepatoprotective agent
Katsa et al. Olive oil phenolics and platelets—from molecular mechanisms to human studies
US20170135930A1 (en) Cosmetic, dermatic, protective compositions comprising phospholipids, lecithins with peptides and at least one acetylating compound.
Das et al. Formulation and assessment of in vivo anti-inflammatory potential of omega-3-fatty acid loaded self emulsifying nanoemulsion
TW201600084A (en) Use, pharmaceutical composition and manufacturing method thereof for applying resveratrol and curcumin in fatty liver treatment
DE102005062417A1 (en) Hormonal composition, useful in the preparation of agent e.g. against hormone problems and hormone disorder, comprises hormone and prehormone, a ginkgoloid active against alkyl-acyl-glycerophosphocholine, a mineral and a trace element
Chen et al. Extract of Zanthoxylum bungeanum maxim seed oil reduces hyperlipidemia in hamsters fed high-fat diet via activation of peroxisome proliferator-activated receptor γ
CN106456783A (en) Homogeneous formulation comprising omega-3 polyunsatured fatty acid and resveratrol for oral administration

Legal Events

Date Code Title Description
122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 13800769

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2