WO2013183964A1 - 폐암 진단 및 치료를 위한 표적 단백질 - Google Patents

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WO2013183964A1
WO2013183964A1 PCT/KR2013/005039 KR2013005039W WO2013183964A1 WO 2013183964 A1 WO2013183964 A1 WO 2013183964A1 KR 2013005039 W KR2013005039 W KR 2013005039W WO 2013183964 A1 WO2013183964 A1 WO 2013183964A1
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canx
lung cancer
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seq
atp1a1
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PCT/KR2013/005039
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임태연
정주영
이보람
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한양대학교 산학협력단
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57423—Specifically defined cancers of lung
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere

Definitions

  • the present invention relates to a target protein for the diagnosis and treatment of lung cancer, and more particularly to a composition for diagnosing or treating lung cancer comprising a substance that specifically binds to a novel lung cancer target protein as an active ingredient.
  • Lung cancer refers to a malignant tumor in the lung, and can be classified into primary lung cancer, in which cancer cells first develop in the bronchus or alveoli, and metastatic lung cancer in which cancer cells are formed in other organs and travel through the blood vessels or lymphatic vessels to the lungs. Histologically, they are classified into non small cell lung cancer (NSCLC) and small cell lung cancer (SCLC).
  • NSCLC non small cell lung cancer
  • SCLC small cell lung cancer
  • Non-small cell lung cancer accounts for 75% of the total lung cancer distribution.
  • the non-small cell lung cancer (NSCLC) is classified into adenocarcinoma, squamous cell carcinoma, and large cell carcinoma, among which adenocarcinoma is gradually showing a high frequency.
  • lung cancer began to increase rapidly in the 20th century as smoking became more common, and in Korea, according to the Korea Central Cancer Registry released in 2008, the average annual cancer development of lung cancer in Korea in 2003-2005 was It ranks second with 12.1% of all cancer cases, and the incidence rate per 100,000 population is increasing rapidly to 33.2 cases.
  • the sex ratio of males and females was 3.83: 1, which occurred more frequently in males.
  • the number of occurrences was second to male cancers and fifth to female cancers.
  • 60's were the highest with 34.33 ⁇ 4>, followed by 70's with 31.03 ⁇ 4 and 50's with 14.6% (Data released October 15, 2008, Central Cancer Registry, Ministry of Health, Welfare and Family Affairs).
  • the increase in the smoking population and air pollution is rapidly increasing in Korea, and the mortality rate by type of cancer is 21.4%, which is the 1st, and 24.9% in males and 15.1% in females, respectively, 1st and 2nd, respectively.
  • Lung cancer usually causes symptoms such as surrounding tissue involvement or airway obstruction or lymph node metastasis due to the growth of cancer cells, but about 10-15% of patients are diagnosed at regular checkups without any symptoms. In addition, since most lung cancers are diagnosed as being quite advanced at the time of diagnosis, most cases are difficult to cure. Therefore, it is urgent to reduce lung cancer-related death by early diagnosis of lung cancer.
  • DNA biomarkers In the case of DNA biomarkers, data using cDNA microarrays have been studied so much that the National Cancer Institute has released a database of cancer-specific expression genes on the web (http: // ww.cancer.gov), which is also being developed as a marker for the development or diagnosis of targeted drugs for some cancer-specific proteins (http://www.clinicaltrial.gov). Is most likely as a DNA biomarker, such as promoter factor hypermethylation or K-ras, p53 mutations.
  • the reason why the conventionally known DNA biomarkers and protein markers in the blood are not clinically applied is (1) gene expression analysis through DNA microarrays for normal tissues versus diseased tissues.
  • the sensitization is not directly linked to the problem of protein expression
  • blood proteins have the advantage of being easy to sample, but there are many systemic problems that can be considered to reflect the condition of a particular tissue. Exclusion of abundant proteins in the blood is difficult (99% of the total protein is 22 proteins), so there is a problem that cannot be generalized as a marker of a specific disease.
  • An object of the present invention is a lung cancer diagnostic composition comprising a novel target protein for the diagnosis or treatment of lung cancer that can be detected in a non-invasive way, but specifically expressed in lung cancer tissues or cells, and an active ingredient specifically binding thereto, the treatment It provides a composition for use, lung cancer diagnostic and therapeutic uses, lung cancer diagnostic method, and treatment method of the composition.
  • AP00 Apo lipoprotein 0
  • ATPlAKATPase A + / K + transporting
  • alpha 1 polypeptide alpha 1 polypeptide
  • CANX calnexin
  • another aspect of the present invention is a pharmaceutical composition for treating lung cancer containing as an active ingredient an inhibitor of the expression or activity of at least one polypeptide selected from the group consisting of AP00, ATP1A1, CANX and DD0ST.
  • the AP00, ATP1A1, CANX and DD0ST polypeptides of the present invention are specifically overexpressed in lung cancer tissues or cells and thus are suitable as target materials for diagnosis or treatment of lung cancer.
  • the four biomarkers are membrane proteins located on the surface of the cell (more specifically, the outer cell membrane surface). The protein can be easily bound to and detected or regulated. That is, the material that binds to the four biomarkers has an advantage that can display the function by binding to the biomarker without the help of CPP cell penetrating peptide.
  • an overdose is generally administered to allow the medicine to spread and enter the cell.
  • the therapeutic agent of the present invention is a substance that specifically binds to a protein on the cell surface, an effective therapeutic effect can be achieved at a relatively low dosage. Therefore, according to the present invention, the diagnosis and treatment of lung cancer can be performed very efficiently.
  • 1 is a gel photograph obtained by SDS-PAGE of cell membrane proteins isolated from a control cell line and A549, SK-MES-1, H460 and H146 cell lines.
  • Figure 2 is a graph showing the results of performing HPLC after cleaving the cell membrane proteins isolated from the control cell line and A549, SK-MES-1, H460 and H146 cell line.
  • Figure 3 is a photograph showing the results confirmed by Western blot whether the specific expression of APOO, ATP1A1, CANX and DDOST in the control cell line and A549, SK-MES-1, H460 and H146 cell line.
  • 4 to 7 are graphs confirming the cell surface expression of ' APOO, ATP1A1, CANX and DDOST in A549 cell line, H460 cell line, SK-MES-1 cell line and H146 cell line, respectively, through flow cytometry.
  • 8 to 10 are micrographs confirmed by immunocytochemical analysis of cell surface expression of APOO, ATP1A1, CANX and DDOST in A549 cell line, H460 cell line, and SK—MES-1 cell line, respectively.
  • Figure 11 shows the results of spectral fluorescence imaging after 30 minutes, 1 hour, 1.5 hours, 3 hours, 4.5 hours, 24 hours after injection of Cy5.5-labeled Ant i -DD0ST antibody and control It is a photograph.
  • FIG. 12 is a photograph showing the results of imaging the cancer tissue surface of xenograft model constructed by intravenous injection.
  • 13 to 15 are graphs confirming death or growth inhibition of lung cancer cells by inducing ADCC reactions using antibodies against AP00, CANX and DDOST in A549 cell line, H460 cell line and SK-MES-1 cell line, respectively.
  • FIG. 16 is a graph confirming that tumor growth is suppressed using an antibody against DD0ST in nude mice in which tumors are generated by the A549 cell line.
  • Figure 17 is a graph showing the results of inhibiting the growth of cancer cells when intraperitoneal injection of the antibody against DD0ST in tumor-generated nude mice by SK-MES-1 cell line.
  • One aspect of the present invention is APCXKApo lipoprotein 0), ATPlAKATPase, Na + / + transporting, al ha 1 polypeptide), CANX (calnexin) and DDOST (do 1 i chy 1 ⁇ di phosphoo 1 i gosacchar i de-prote in glycosyltransferase) It provides a composition for diagnosing lung cancer comprising an antibody or folimer specifically binding to any one polypeptide selected from the group consisting of.
  • Another aspect of the present invention is selected from the group consisting of APOC Apolipoprotein 0), ATPlAKATPase, Na + / K + transporting, alpha 1 polypeptide), CANX (calnexin) and DDOSKdol ichyl-diphosphool igosacchari de-protein glycosyltransferase
  • APOC Apolipoprotein 0 ATPlAKATPase
  • Na + / K + transporting alpha 1 polypeptide
  • CANX calnexin
  • DDOSKdol ichyl-diphosphool igosacchari de-protein glycosyltransferase Provided is the use of an antibody or 3 ⁇ 4 timer that specifically binds to any one of the polypeptides.
  • the lung cancer diagnostic composition of the present invention is selected from the group consisting of 1) an antibody specifically binding to any one polypeptide selected from the group consisting of AP00, ATP1A1, CANX and DD0ST or 2) AP00, ATP1A1, CANX and DD0ST Aptamers that specifically bind to either polypeptide.
  • the AP00 polypeptide preferably has an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 2.
  • the AP00 polypeptide is preferably encoded by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
  • the APT1A1 polypeptide has an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 4.
  • the AP00 polypeptide is preferably encoded by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 3.
  • the CANX polypeptide preferably has an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6.
  • the AP00 polypeptide is preferably encoded by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 5.
  • the DD0ST polypeptide preferably has an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8.
  • the DD0ST polypeptide is preferably encoded by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 7.
  • the antibody means that a part or all of any one polypeptide selected from the group consisting of AP00, ATP1A1, CANX and DD0ST is recognized as an antigenic site and specifically and directly binds to the antigenic site.
  • Polyclonal antibodies or monoclonal All antibodies are included.
  • Antibodies specifically binding to any one of the polypeptides selected from the group consisting of the AP00, ATP1A1, CANX DD0ST and may be manufactured as known to those skilled in the art ball "method or not.
  • the monoclonal antibody is a fusion method (see Kohler and Mistein (1976) European Jounral of Immunology, 6: 511-519), recombinant DNA method or phage antibody library (Clackson et. al., Nature, 352: 624-628, 1991; Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 58, 1—597, 1991).
  • the polyclonal antibody can be prepared by injecting the antigen AP00, ATP1A1, CANX or DD0ST polypeptide to an external host including mammals such as mice, rats, sheep, rabbits.
  • the antigen is injected by intramuscular, intraperitoneal or subcutaneous injection methods, and can generally be administered with an adjuvant to increase antigenicity, and by regularly taking blood from an external host to form titers and antigens. Serum that exhibits specificity can be obtained and used by isolating antibodies. In addition, the antibody can be used by purchasing a commercially known AP00, ATP1A1, CANX or DD0ST antibody.
  • the aptamer is a single-stranded DNA or RNA molecule and has a high affinity for a specific chemical or biological molecule by an evolutionary method using an oligonucleotide library called SELEX Systemic Evolution of 1 igands by exponential enrichment. Can be obtained by isolating oligomers having binding and selection ability (C. Tuerand L. Gold, Science 249, 505-510, 2005; AD Ellington and JW Szostak, Nature 346, 818-822, 1990; M. Famulok, et al., Acc. Chem. Res. 33, 591-599, 2000; DS Wilson and Szostak, Annu. Rev. Biochem. 68, 611-647, 1999).
  • Aptamers can specifically bind to a target and modulate the target's activity, such as by blocking the ability of the target to function through binding.
  • an aptamer having high affinity and selectivity can be obtained and used for any one polypeptide selected from the group consisting of AP00, ATP1A1, CANX, and DD0ST by an evolutionary method using SELEX.
  • the antibody or aptamer may be tagged with the detector have.
  • the detector is for easily identifying, detecting, and quantifying whether the antibody or aptamer specifically binds to any one polypeptide target selected from the group consisting of APOO, ATP1A1, CANX, and DD0ST.
  • the detector When the detector is tagged to the antibody or aptamer, the detector is preferably attached so as not to affect the specificity or selectivity for the target in the antibody or aptamer, and for this purpose, a link (sharing) to the antibody or aptamer Combined or crosslinked).
  • the tagging position of the detector can be easily determined by a person skilled in the art through repeated experiments.
  • the lung cancer may be non-small cell lung cancer (NSCLC) or small cell lung cancer (sac), in particular the non-small cell lung cancer may be adenocarcinoma, squamous cell carcinoma or large cell carcinoma have.
  • NSCLC non-small cell lung cancer
  • sac small cell lung cancer
  • the non-small cell lung cancer may be adenocarcinoma, squamous cell carcinoma or large cell carcinoma have.
  • the composition is preferably for nasal administration. This is to improve the binding specificity and selectivity of the antibody or aptamer, and more selectively to a target (APOO, ATP1A1, CANX or DD0ST polypeptide) expressed in lung cancer tissues or cells other than other tissues when the composition is administered nasal. It can be combined.
  • a target APOO, ATP1A1, CANX or DD0ST polypeptide
  • the antibody or aptamer in the composition will specifically and selectively bind to an APOO, ATP1A1, CANX or DD0ST polypeptide expressed in lung tissue or cells, and tagged to the antibody or aptamer
  • the reactions occurring in the detected detectors can measure the position or expression level of the antibody or aptamer bound to the target as described above. In other words, if a large number of reactions of the detector occur in lung tissue or cells of a subject, an excessive amount of APOO, ATP1A1, CANX, or DD0ST polypeptide is present in the lung tissue of the subject, and the subject has lung cancer. It can be diagnosed.
  • the composition is administered in the subject by nasal administration Lung cancer cell presence can be confirmed non-invasively.
  • the four polypeptides, APOO, ATP1A1, CANX, or DD0ST were specifically overexpressed in the lung cancer cell lines A549, SK-MES-1, H460, and H146 (see FIGS. 3 to 5).
  • the composition comprising an antibody or 3 ⁇ 4 tammer specifically binding to the APOO, ATP1A1, CANX or DD0ST polypeptide of the present invention can be usefully used for the diagnosis of lung cancer.
  • An aspect of the invention is selected from the group consisting of APOO, ATP1A1, CANX and DDOST, or an antibody or aptamer specifically binding to at least one polypeptide selected from the group consisting of APOO, ATP1A1, CANX and DDOST
  • a kit for diagnosing lung cancer comprising a primer or probe complementarily binding to a polynucleotide encoding at least one polypeptide.
  • Lung cancer diagnostic kit of the present invention is 1) an antibody that specifically binds to at least one polypeptide selected from the group consisting of APOO, ATP1A1, CANX and DDOST or 2) in the group consisting of APOO, ATP1A1, CANX and DDOST An aptamer that specifically binds to at least one polypeptide selected, or 3) complementarily binds to a polynucleotide encoding at least one polypeptide selected from the group consisting of APOO, ATP1A1, CANX and DDOST Primer or 4) a probe that complementarily binds to a polynucleotide encoding at least one polypeptide selected from the group consisting of APOO, ATP1A1, CANX and DDOST.
  • the kit is not intended to be administered into a subject, unlike the composition of the item for diagnosing lung cancer, and the lung cancer of the subject is determined using a biological sample such as lung washing fluid, biopsy, blood, saliva, and urine derived from the subject. Therefore, to detect the protein or nucleic acid contained in the biological sample, and in particular, the kit of the present invention is selected from the group consisting of APOO, ATP1A1, CANX and DDOST contained in the biological sample. Any one polypeptide, or APOO, ATP1A1, CANX and It is used to detect polynucleotides encoding at least one polypeptide selected from the group consisting of DDOST.
  • the lung cancer diagnostic kit of the present invention may include an antibody or aptamer specifically binding to any one polypeptide selected from the group consisting of AP00, ATPIAI, CA X and DD0ST.
  • An additional antibody or aptamer is for detecting the AP00, ATPIAI, CANX or DD0ST, the "lung cancer diagnostic
  • the antibody or aptamer specifically binding to any one polypeptide selected from the group consisting of AP00, ATP1A1, CANX and DD0ST is described in "1.
  • the polynucleotides encoding the polypeptides of AP00, ATPIAI, CANX, and DD0ST have a nucleic acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, and SEQ ID NO: 7, respectively.
  • the primers allow the synthesis of DNA complementary to template DNA under appropriate conditions and circumstances, and can be localized to polynucleotides encoding polypeptides of the APOO, ATPIAI, CANX or DDOST. Single stranded oligonucleotides.
  • the length of the primer is modified depending on various factors such as temperature, reaction conditions, and the use of the primer, but it is generally preferred that the polynucleotide is 10 to 30 nt in length.
  • the primer sequence need not be a sequence that is completely complementary to the polynucleotide sequence encoding the polypeptides of AP00, ATPIAI, CANX, and DD0ST to be the template (target), and is unique to the template (target) sequence to be native to the primer. It is only necessary to have sufficient complementarity to the extent that can be achieved.
  • the design of such primers can be readily carried out by those skilled in the art with reference to a target polynucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 7, for example, a program for primer design.
  • the probe refers to a polynucleotide that can specifically hybridize to a target polynucleotide sequence, and includes a single strand that can be localized to a polynucleotide encoding the polypeptides of the AP00, ATP1A1, CANX, and DD0ST. Linear polynucleotides.
  • the probe may be naturally present or artificially synthesized.
  • the probe may be constructed of deoxyribonucleotides or ribonucleotides if the probe is naturally present, and if the probe is artificially synthesized, the probe may be a peptide nucleic acid (PNA) (M.
  • PNA peptide nucleic acid
  • the primer or probe may be tagged with the detector.
  • the detector easily identifies, detects, and quantifies whether the primer or probe specifically binds to a polynucleotide target encoding at least one polypeptide selected from the group consisting of APOO, ATP1A1, CANX, and DD0ST.
  • a polypeptide selected from the group consisting of APOO, ATP1A1, CANX, and DD0ST.
  • chromosome peroxidase, alkaline phosphatase, etc.
  • fluorescent material FTTC, RITC, rhodamine, Texas red
  • fluorescein phycoery
  • phycoery At least one selected from the group consisting of phycoerythrin, quantum dots, chromophores, and radioisotopes (1241 1251, lllln, 99mTc, 32P, 35S, etc.).
  • the detector is tagged to the primer or probe
  • the detector is preferably attached so as not to affect specificity or selectivity to the target in the primer or probe, and for this purpose, the detector may be provided by linking (covalently or crosslinking) to the primer or probe.
  • the tagging position of the detector can be easily determined by a person skilled in the art through repeated experiments.
  • the kit is preferably a microarray chip.
  • the microarray chip is composed of an antibody or aptamer specifically binding to at least one polypeptide selected from the group consisting of APOO, ATP1A1, CANX, and DD0ST
  • the microarray chip is APOO, ATP1A1, CANX and DDOST. It is for detecting the expression level of at least one polypeptide selected from the group consisting of at the translated protein level.
  • the microarray chip when the microarray chip is composed of a primer or a probe complementary to a polynucleotide encoding at least one polypeptide selected from the group consisting of APOO, ATP1A1, CANX and DDOST, the microarray chip It is for detecting the expression level of at least one polypeptide selected from the group consisting of APOO, ATP1A1, CANX and DDOST at the level of transcription mRNA.
  • kits comprising an antibody or aptamer for the APOO, ATP1A1, CANX or DDOST polypeptide, or a primer or probe for a polynucleotide encoding the polypeptide can be usefully used as a kit for diagnosing lung cancer.
  • the polypeptide detection method may be performed in vivo or in vitro.
  • Polypeptide detection method for providing information necessary for diagnosing lung cancer of the present invention 1) an antibody that specifically binds to at least one target polypeptide selected from the group consisting of APOO, ATP1A1, CANX and DDOST Or binding an aptamer to the target polypeptide; 2) measuring the expression level of at least one polypeptide selected from the group consisting of APOO, ATP1A1, CANX and DD0ST by measuring the amount and location of the antibody bound to the target polypeptide of step 1); And 3) determining a subject at risk of developing lung cancer in a subject having an increased expression level of at least one polypeptide selected from the group consisting of APOO, ATP1A1, CANX, and DD0ST measured in step 2) above the control group. Steps.
  • the antibody or aptamer of step 1) is for detecting the APOO, ATP1A1, CANX or DDOST, and is the same as described in "1. Lung Cancer Diagnosis. Thus, the group consisting of the APOO, ATP1A1, CANX and DDOST. Regarding an antibody or aptamer that specifically binds to any one polypeptide selected from "1. The detailed description will be omitted by using the description of the lung cancer diagnosis item, and hereinafter, only the configuration specific to the polypeptide detection method (step of determining the expression level of the polypeptide and determining the lung cancer) for providing the information necessary for diagnosing lung cancer Explain.
  • the subject of step 1) is a subject suspected of having lung cancer or a subject in need of diagnosis for risk of developing lung cancer, such as a human, monkey, dog, goat, pig or rat, and the like, preferably a mammal. to be.
  • the polypeptide expression level of step 2) can be measured indirectly in the subject of step 1) by measuring the presence of a tag tagged with an antibody or aptamer bound to the target polypeptide of step 1). And DDOST can be confirmed, detected and quantified in any tissue to what extent any one polypeptide selected from the group consisting of.
  • the detector may be fluorescence such as FTTC, RITC, rhodamine (1 " 110 (13 ⁇ 116), Texas Red, fluorescein, phycoerythrin, quantum dots, etc.
  • the amount and position of the antibody or aptamer bound to the target polypeptide can be measured by fluorescence mediated tomography (FMT).
  • FMT fluorescence mediated tomography
  • the control group of step 3) is an individual recognized as not suffering from lung cancer, and the expression level of the target polypeptide in the control group of step 3) is obtained by administering the antibody or aptamer of step 1) to the control group and performing step 2). It is determined by measuring as follows.
  • the target polypeptide expression level in the control measured in step 3) is basically the amount expressed in the individual even when lung cancer is not developed.
  • Determining the subject of step 3) as an individual at risk for lung cancer is performed by comparing the expression level of the target polypeptide in the control group with the expression level of the target polypeptide in the subject. If the amount of the target polypeptide expressed in the subject is better than the expression level of the target polypeptide in the control group, the subject is recognized as having lung cancer.
  • Polypeptide detection method for providing information necessary for the diagnosis of other lung cancer of the present invention 1 ') specifically binding to at least one target polypeptide selected from the group consisting of APOO, ATP1A1, CANX and DD0ST to the subject-derived sample Treating the antibody or aptamer to bind to the target polypeptide; 2 ') measuring the expression level of at least one polypeptide selected from the group consisting of AP00, ATP1A1, CANX and DD0ST by measuring the amount and location of the antibody bound to the target polypeptide of step 1'); And 3 ′) determining a subject having an increased expression level of the target polypeptide of step 2 ′) than the control group as an individual at risk for lung cancer.
  • the antibody or aptamer of step 1 ') is for detecting the AP00, ATP1A1, CANX or DD0ST, and is the same as described in the section "1. Lung cancer diagnostic composition". Accordingly, the antibody or aptamer specifically binding to any one polypeptide selected from the group consisting of AP00, ATP1A1, CANX and DD0ST will be described in detail using the description of the item "1. In the following description, only the configuration specific to the polypeptide detection method (step of determining the expression level of the polypeptide and determining the lung cancer) for providing the information necessary for diagnosing lung cancer will be described.
  • the subject in step ⁇ ') is a subject suspected of having lung cancer or a subject in need of diagnosis for risk of developing lung cancer, a vertebrate such as a human, monkey, dog, goat, pig or rat, preferably a mammal. to be.
  • the subject-derived sample of step 1 ') may be any biological sample such as lung washing liquid, biopsy, blood, saliva, urine, etc. derived from the subject.
  • the expression level of the polypeptide of step 2 ') is determined by indirectly measuring AP00 in the subject of step 1') by measuring the presence of an antibody or aptamer specifically bound to the target polypeptide of step 1 '). It is possible to identify, detect, and quantify to what extent any one polypeptide selected from the group consisting of ATP1A1, CANX, and DD0ST exists in which tissue. Determination of the expression level of the target polypeptide is immunoprecipitation, radioimmunoassay (RI A), enzyme immunoassay (ELISA), immunohistochemistry, RT-PCR, Western Blotting and flow cytometry (FACS). It may be performed by any one method selected from the group consisting of), but is not limited thereto, and those skilled in the art can be selected appropriately.
  • RI A radioimmunoassay
  • ELISA enzyme immunoassay
  • FACS flow cytometry
  • the control group of step 3 ') is all biological samples such as lavage fluid, biopsy, blood, saliva, urine, etc. derived from an individual not recognized as having lung cancer, and the expression level of the target polypeptide in the control group of step 3'). Is determined by treatment of the antibody or aptamer of step 1 ') to the control and measurement as in step 2').
  • the target polypeptide expression level in the control measured in step 3 ′) is basically the amount expressed and present in the subject even when lung cancer is not developed.
  • Determining the subject of step 3 ') as an individual at risk for lung cancer is performed by comparing the expression level of the target polypeptide in the control group with the expression level of the target polypeptide in the subject. do. If the amount of the target polypeptide expressed in the subject is better than the expression level of the target polypeptide in the control group, the subject is recognized as having lung cancer.
  • the polypeptide detection method of the present invention can be usefully used to provide information necessary for diagnosing lung cancer by measuring the expression level of APOO, ATP1A1, CANX or DD0ST polypeptide. 4. Pharmaceutical Compositions and Uses for Lung Cancer Treatment
  • Another aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for treating lung cancer, which contains as an active ingredient an inhibitor of the expression or activity of at least one polypeptide selected from the group consisting of APOO, ATP1A1, CANX and DDOST.
  • Another aspect of the invention provides the use of a pharmaceutical composition containing as an active ingredient an inhibitor of the expression or activity of at least one polypeptide selected from the group consisting of APOO, ATP1A1, CANX and DDOST for the treatment of lung cancer. do.
  • the pharmaceutical composition for treating lung cancer of the present invention is 1) an inhibitor of expression of any one polypeptide selected from the group consisting of APOO, ATP1A1, CANX and DDOST or 2) an agent selected from the group consisting of APOO, ATP1A1, CANX and DDOST. Inhibitors of the activity of either polypeptide.
  • the AP00 polypeptide preferably has an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 2.
  • the AP0O polypeptide is preferably encoded by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
  • the APT1A1 polypeptide has an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 4.
  • the AP00 polypeptide is preferably encoded by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 3.
  • the CANX polypeptide preferably has an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6.
  • the AP00 polypeptide is preferably encoded by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 5.
  • the DD0ST polypeptide preferably has an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8.
  • the DD0ST polypeptide is preferably encoded by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 7.
  • the inhibitor of expression of at least one polypeptide selected from the group consisting of APOO, ATP1A1, CANX and DDOST is expressed in mRNA of at least one gene selected from the group consisting of APOO, ATP1A1, CANX and DDOST. It may be any one selected from the group consisting of complementary antisense nucleotides, short hairpin RNA (shR A) and small interfering RA (siRNA), but is not limited thereto.
  • the antisense nucleotides bind to (combine) the complementary sequences of DNA, immature -mRNA, or mature mRNA as defined in Watson-click base pairs to disrupt the flow of genetic information from DNA to protein. Since the antisense nucleotides are long chains of monomeric units they can be easily synthesized for the target RNA sequence. Many recent studies have demonstrated the utility of antisense nucleotides as biochemical means for studying target proteins (Rothenberg et al., J. Natl. Cancer Inst., 81: 1539-1544, 1999).
  • antisense nucleotides can be considered as a new type of inhibitor because of recent advances in nucleotide synthesis and in the field of nucleotide synthesis that exhibit improved cell adsorption, target binding affinity and nuclease resistance.
  • the small interfering RNA binds to (activates) the mRNA encoding the target polypeptide in a cell and interferes with the flow of genetic information from the DNA of the target polypeptide to the protein, and the AP00, ATP1A1 And a sense sequence having a length of 15 to 30 nt selected from within the mRNA base sequence of at least one gene selected from the group consisting of CANX and DD0ST, and an antisense sequence complementarily binding to the sense sequence.
  • the sense sequence is not particularly limited thereto, but is preferably composed of 25 nt long polynucleotides.
  • the short hairpin RNA is a single strand of RNA having a length of 50 to 100 nt to form a stem-loop structure in the cell, and both sides of the loop region of 5 to 30 nt long nucleotides
  • Complementary 15-50 nt long renal RNA is base paired to form a double stranded stem and further comprises 1 to 500 nt long nucleotides before and after each of said stem forming strands. It means the RNA.
  • Such a shRNA is a loop break in the cell, and acts to disrupt the flow of genetic information from the DNA of the target polypeptide to the protein like the siRNA.
  • the shRNA is cleaved in the cell, the AP00, ATP1A1, CANX and It is preferable to have a sense sequence of 15 to 30 nt length selected from within the mRNA base sequence of at least one gene selected from the group consisting of DDOST and an antisense sequence complementarily binding to the sense sequence, but not limited thereto. shall not. "
  • the antisense nucleotides short hairpin R A (shRNA) and small interference
  • RNA inhibits the expression of APOO, ATP1A1, CANX or DD0ST polypeptide by binding complementarily to mRNA of a gene encoding at least one polypeptide selected from the group consisting of APOO, ATP1A1, CANX and DD0ST. Therefore, it acts as an active ingredient for treating lung cancer.
  • the inhibitor of activity of at least one polypeptide selected from the group consisting of APOO, ATP1A1, CANX and DDOST binds complementarily to at least one polypeptide selected from the group consisting of APOO, ATP1A1, CANX and DDOST. It may be any one selected from the group consisting of aptamers, antibodies, and peptide mimetics, but is not limited thereto.
  • the antibody or aptamer is for detecting the APOO, ATP1A1, CANX or DDOST, and is the same as described in "1. Lung Cancer Diagnosis. Therefore, any one selected from the group consisting of the APOO, ATP1A1, CANX and DDOST.
  • antibodies or aptamers that specifically bind to one polypeptide see "1. Detailed explanations will be omitted by using the description of the lung cancer diagnosis item, and only the peptide mimetics will be described below.
  • the peptide mimetics inhibit the activity of the target polypeptide by inhibiting the binding domain of the target polypeptide, and inhibit the binding domain of any one polypeptide selected from the group consisting of APOO, ATP1A1, CANX, and DDOST.
  • the peptide mimetics may be peptides or non-peptides and may be bound by non-peptide bonds, such as p S i bonds (Benkirane, N., et al. J. Biol. Chem., 271: 33218-33224, 1996). Composed of amino acids.
  • a "conformational ly constrained" peptide, between cyclic mimetics, at least one exocyclic domain, binding moiety (binding amino acid) and active site Click mematics have.
  • Peptide mimetics are structured similar to the secondary structural properties of the MAP7D2 protein and are either antibodies (Park, BW et al. Nat Biotechnol 18, 194-198, 2000) or water soluble receptors (Takasaki, W. et al. Nat Biotechnol 15, 1266- 1270, 1997), which can mimic the inhibitory properties of large molecules, and may be novel small molecules that can act equivalent to natural antagonists (Wrighton, NC et al. Nat Biotechnol 15, 1261-1265, 1997). .
  • the aptamer, antibody, and peptide mimetics bind to the active domain of at least one polypeptide selected from the group consisting of AP00, ATP1A1, CANX, and DD0ST, thereby preventing the AP00, ATP1A1, CANX, or DD0ST polypeptide. It inhibits activity and thus acts as an active ingredient for treating lung cancer.
  • the composition preferably includes 0.0001 to 50 weight 3 ⁇ 4 of the active ingredient based on the total weight of the composition, but is not limited thereto.
  • the composition may be prepared by including one or more pharmaceutically acceptable carriers in addition to the above-described active ingredient for administration.
  • Pharmaceutically acceptable carriers may be used in combination with saline, sterile water, Ringer's solution, complete saline, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethane, liposomes and one or more of these ingredients.
  • Other conventional additives, such as antioxidants, buffers, bacteriostatics, can be added.
  • injectable formulations pills, capsules, granules or tablets, such as aqueous solutions, suspensions, emulsions, etc.
  • diluents dispersants, surfactants, binders and lubricants, which may act specifically on target organs.
  • Sudodotock target organ specific antibodies or other ligands can be used in combination with the carrier.
  • it is preferably formulated according to each disease or component using an appropriate method in the art or using the method disclosed in Remington's Pharmaceutical Science (Recent Edition), Mack Publishing Company, Easton PA. can do.
  • the composition is preferably for nasal administration. This is to improve the binding specificity and selectivity of the expression or activity inhibitor, and when the composition is administered nasal to targets (AP00, ATP1A1, CANX or DD0ST polypeptide) expressed in lung cancer tissues or cells other than other tissues. It can be combined more selectively.
  • targets AP00, ATP1A1, CANX or DD0ST polypeptide
  • the dosage of the composition varies depending on the patient's weight, age, sex, health status, diet, administration time, administration method, excretion rate and the severity of the disease, the daily dosage of the composition is 0.0001 rag / to 10 mg /, preferably 0.0001 rag / to 5 rag /, and is preferably administered once to several times a day.
  • lung cancer cell lines A549, SK-MES-1, H460 and H146 cell lines inhibit the expression or activity of the four polypeptides APOO, ATPIAI, CANX or DD0ST
  • growth of the lung cancer cell line is It was confirmed that the results were inhibited, and by inhibiting the expression or activity of APOO, ATPIAI, CANX or DD0ST polypeptide using the pharmaceutical composition for treating lung cancer of the present invention, the possibility of treating lung cancer was confirmed (see FIGS. 11 to 14).
  • the inhibitor of the expression or activity of the APOO, ATPIAI, CANX or DD0ST polypeptide can be usefully used as an active ingredient of the composition for treating lung cancer.
  • Another aspect of the invention provides a method for treating lung cancer.
  • the method for treating lung cancer of the present invention includes administering to a subject a composition containing as an active ingredient an inhibitor of the expression or activity of at least one polypeptide selected from the group consisting of APOO, ATPIAI, CANX and DDOST. .
  • polypeptides of APOO, ATPIAI, CANX and DDOST are described in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 8, respectively.
  • the expression inhibitor of at least one polypeptide selected from the group consisting of AP00, ATPIAI, CANX and DDOST is at least any one selected from the group consisting of AP00, ATPIAI, CANX and DDOST It is any one selected from the group consisting of antisense nucleotides, short hairpin RA (shRNA) and small interfering RNA (siRNA) that complementarily bind to mRNA of the gene of.
  • shRNA short hairpin RA
  • siRNA small interfering RNA
  • the activity inhibitor of at least one polypeptide selected from the group consisting of APOO, ATP1A1, CANX and DD0ST is at least any one selected from the group consisting of APOO, ATP1A1, CANX and DDOST It is any one selected from the group consisting of aptamers, antibodies and peptide mimetics that complementarily bind to one polypeptide.
  • the step of administering the composition to the subject may be administered through the nasal cavity of the subject.
  • another aspect of the present invention provides a method for screening a candidate substance for treating lung cancer.
  • the method for screening a candidate substance for treating lung cancer of the present invention comprises the steps of: 1) treating a test substance to a cell line expressing any one target polypeptide selected from the group consisting of AP00, ATP1A1, CANX, and DDOST; 2) measuring the expression level of the target polypeptide in the cell line of step 1); and 3) selecting the test substance whose expression level of the target polypeptide measured in step 2) is reduced compared to the control group not treated with the test substance. Steps.
  • Determination of the expression level of the target polypeptide of step 2) is performed by reverse sedimentation method (i ⁇ unoprecipi tat ion), radioimmunoassay (RIA), enzyme immunoassay (ELISA), immunohistochemistry, RT-PCR, Western blotting ) And flow cytometry (FACS). Any method of determining the amount of transcript or protein encoded therefrom may be used, although it is preferred to measure with any one selected from the group consisting of.
  • the test substance selected in step 3) is a substance that inhibits the expression of any one of the target polypeptides selected from the group consisting of APOO, ATP1A1, CANX and DDOST, and the "4. It can be used as an expression inhibitor described in.
  • Another method for screening a candidate substance for treating lung cancer of the present invention comprises the steps of: 1) treating a test substance with any one of the target polypeptides selected from the group consisting of APOO, ATP1A1, CANX, and DD0ST; 2) measuring the activity of the target polypeptide; And 3) selecting the test substance whose activity of the target polypeptide is reduced compared to the control which has not been treated with the test substance.
  • the activity of the target polypeptide of step 2) is preferably measured by any one selected from the group consisting of SDS-PAGE, immunofluorescence, enzyme immunoassay (ELISA), mass spectrometry and protein chips, but is not limited thereto. Any method of measuring the activity of known proteins can be used.
  • test substance selected in step 3) is a substance that inhibits the activity of any one of the target polypeptides selected from the group consisting of APOO, ATP1A1, CA X, and DD0ST, wherein the "4. pharmaceutical composition for treating lung cancer" It can be used as an activity inhibitor described in the section.
  • the screening method of the present invention can be usefully used for screening candidate substances for lung cancer treatment by screening a test substance capable of inhibiting the expression or activity of APOO, ATP1A1, CANX or DD0ST polypeptide. .
  • the present invention will be described in detail by experimental examples.
  • HPLC was performed by treating trypsin to membrane proteins of the five cell lines isolated as in Example ⁇ 1-1>, and compared to the HPLC protein profiles of normal tissues. Peak proteins were selected and identified by MS / MS. More specifically, membranes electrophoresed with membrane proteins were washed with distilled water for 5 minutes and then stained with bio-safe Coomassie stain solution (Coomassie G250 Stain) (BioRad, USA) for 1 hour at room temperature. It was. The gel was then destained for 30 minutes in distilled water. Only the protein bands stained from the gel were cut out and destained again with 75 mM ammonium bicarbonate (Sigma, USA) I 40% ethanol (Duksan, Korea) (1: 1), followed by gel fragments.
  • LC-MS / MS analysis was performed using Thermo Finnigan's ProteomeX workstation LTQ linear IT MS (Thermo Electron, USA) equipped with NSI sources (San Jose, Calif.). A peptide mixture of 12 ⁇ was injected and loaded into a peptide trap cartridge (Agilent, USA) and then separated into columns by gradient elution.
  • Apolipoprotein 0 Apolipoprotein 0
  • ATPlAKATPase A + / K + transporting, alpha 1 polypeptide
  • CANX calnexin
  • DDOSTWolichyl-diphosphoo 1 i gosacchar i de-pr ot ein glycosyl transferase)- ⁇ were finally selected.
  • Example ⁇ 1-1> The membrane protein sample obtained in Example ⁇ 1-1> was electrophoresed, and Western blot was performed on the four proteins. After cell disruption by sonication method per cell line, only membrane protein was separated by 10% SDS-PAGE through centrifuge, TE70X SEMI -DRY TRANSFER UNIT with PVDF membrane (Mi 111 ipore, Italy) Transfer was performed at 14V for 1 hour using 14 ⁇ 16 CM (Hoefer, San Francisco USA). Deceased After blocking the membrane (membrane) with 5% skim milk (Skim Mi lk) for 1 hour, the primary antibody (primary antibody) was allowed to react at room temperature for 2 hours.
  • Anti-AP00 (Sigma, USA), Ant i-ATPlAKAbClon, Korea) Anti-CANX (sigma, USA), Ant i-DD0ST (Sigma, USA) was used as the primary antibody. Secondary antibodies were then reacted at room temperature for 2 hours. As the secondary antibody, Goat ant i-mouse IgG and Goat ant i-rabbit IgG (Ab frontier, Korea) were used.
  • the membrane protein sample obtained in Example ⁇ 1-1> was electrophoresed and flow cytometry was performed on the four proteins. More specifically, each cell line was reacted with the primary antibody for 30 minutes at room temperature. Ant i-AP00 (Sigma, USA), Anti-ATPlAKAbClon, Korea), Ant i-CANX (Sigma, USA) and Ant i-DD0ST (Sigma, USA) were used as the primary antibodies. After treatment with the primary antibody, the secondary antibody was reacted at room temperature for 30 minutes, and the secondary antibody was a Goat Anti- Mouse IgG (FITC) and Goat Ant i -rabbit to which the fluorescent substance FITCCFluorescein isothiocyanate was bound. IG (FITC) (Ab frontier, Seoul, Korea) was used. Then, flow cytometry was performed using a flow cytometer BD FACSCal ibur (BD Biosciences, USA).
  • the cell lines A549 (adenocarcinoma), SK-MES-1 (squamous cell carcinoma) and H460 (large cell carcinoma) were subjected to immunocytochemical analysis on the four proteins.
  • the primary antibody was treated for 3 hours at room temperature using Lab-Tek chamber Slide (Nunc, USA), and the primary antibody was Ant i-AP00 (Sigma, USA), Ant i -ATPlAl (AbC Ion, Korea), Ant i-CANX (Sigma, USA) and Ant i-DD0ST (Sigma, USA) were used.
  • mice Male nude mice have four types of lung cancer cells: A549 (adenocarcinoma), NCI-H460 non-small cell lung carcinoma), and NCI-H146 (small cell lung carcinoma). And SK-MES-1 (squamous cell lung carcinoma) were implanted with 6 subcutaneous injections on the back of nude mice.
  • FIG. 11 The results of fluorescence imaging after each antibody was shown in FIG. 11.
  • the top 6 photographs show the injection of Cy5.5'-labeled Anti-DDOST antibody, and the bottom 6 photos show the injection of isotype control.
  • the control group was discharged to the body within 30 minutes after injection, indicating that only a small amount of fluorescence remained in the bladder region.
  • anti-DD0ST antibody lung cancer masses growing on the back were correctly labeled. Similar results were obtained with experiments involving H460 other than A549. This resulted in in vivo imaging targeting DD0ST.
  • the three cell lines were treated with Anti-APCXX Sigma, USA), Anti-CANX (Sigma, USA) and Ant i-DD0ST (Sigma, USA) antibodies in a continuous dilution method, respectively.
  • Anti-APCXX Sigma, USA Anti-APCXX Sigma, USA
  • Anti-CANX Anti-CANX
  • Ant i-DD0ST Ant i-DD0ST
  • the lethal concentration (LC50, 50%) of the cells was measured.
  • the half lethal concentrations were 7.9 fig / mi, 0.06 g / mt and 0.06 // g / i for DDOST, CANX and AP00, respectively (FIG. 15).
  • AP00 Polipoprotein 0
  • ATPlAKATPase Na + / K + transporting
  • alpha 1 polypeptide alpha 1 polypeptide
  • CANX calnexin
  • DDOST do lichyl-di phosphoo 1 i gosacchar i de-pr ot ein glycosyltransferase
  • Tumors were generated by subcutaneous injection of A549 cell line, a lung cancer cell line, to nude mice (MARA, seoul, Korea). Then, the antibody (Anti-DD0ST (Sigma, USA)) was treated twice by dose (100 iig and 200 // g), the tumor volume was measured.
  • V 1/2 X (W2 XL)" (where V is tumor volume, W is minimum diameter, L represents the maximum diameter).
  • mice were divided into five treatment groups.
  • Treatment was started when the tumor diameter averaged about 5 mm.
  • Treatment was performed by intraperitoneal injection of Anti-DDOST antibody, rabbit IgG control and PBS-control twice a week.
  • DD0ST protein expression was demonstrated by paraffin-embedded IHC.
  • Each lung tissue sample is 4 ⁇ ! It was partitioned to thickness and diparaffinized in xylene, which was hydrated in alcohol cereals. Nonspecific binding was blocked and slides were incubated with Anti-DDOST antibody (Sigma USA) for one day at 4 ° C.
  • IHC reaction was performed with a vectortasteine ABC kit (Vector Laboratories Inc., USA) using 3'3-diaminobenzidine (DAB).

Abstract

본 발명은 신규한 폐암 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 유효성분을 포함하는 폐암 진단 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, APOO(Apolipoprotein O), ATP1A1(ATPase, Na+/K+ transporting, alpha 1 polypeptide), CANX(calnexin) 및 DDOST(dolichyl-diphospho oligosaccharide-protein glycosyltransferase)로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나의 표적 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 물질을 유효성분으로 포함하는 폐암 진단 또는 치료용 조성물을 제공한다. 상기 표적 폴리펩티드는 폐암 조직 또는 세포에서 특이적으로 과발현되므로 폐암의 진단 또는 치료용 표적 물질로서 적합할 뿐만 아니라, 세포의 표면에서 발현되는 막 단백질이므로 비침습적인 방법으로도 쉽게 검출될 수 있는 바, 폐암의 진단 및 치료를 위한 표적 물질로서 유용하게 이용될 수 있다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
폐암 진단 및 치료를 위한 표적 단백질 【기술분야】
본 특허출원은 2012년 6월 7일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제 10-2012-0060732호에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 특허출원의 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다
본 발명은 폐암의 진단 및 치료를 위한 표적 단백질에 관한 것으로， 보다 구체적으로는 신규한 폐암 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 물질을 유효성분으로 포함하는 폐암 진단 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 【배경 기술】
폐암이란 폐에 생긴 악성 종양을 말하는 것으로서， 크게 암세포가 기관지나 폐포에서 처음 발생한 원발성 폐암과 암세포가 다른 기관에서 생겨나 혈관이나 림프관을 타고 폐로 이동해 자라는 전이성 폐암으로 나눌 수 있다. 조직학적으로 크게 비소세포폐암 (NSCLC, non small cell lung cancer)과 소세포폐암 (SCLC, small cell lung cancer)으로 분류되고， 비소세포폐암이 전체 폐암분포의 75%를 차지하고 있다. 상기 비소세포 폐암 (NSCLC)은 다시 선암 (adenocarcinoma), 편평상피세포암 (squamous cell carcinoma), 대세포암 (large cell carcinoma)으로 분류되고， 이 중 선암이 점차적으로 높은 빈도를 보이고 있다. 특히， 폐암은 20세기에 들어 흡연이 보편화되면서 급격하게 늘기 시작하였고, 우리나라의 경우， 2008년에 발표된 한국중앙암등록본부 자료에 의하면 2003-2005년 우리나라 연 평균 암 발생 증 폐암은 남녀를 합쳐서 전체 암 발생의 12.1%로 2위를 차지하고, 인구 10만 명당 조발생률은 33.2건이나 될 정도로 급격하게 늘고 있다. 남녀의 성비는 3.83:1로 남자에게서 더 자주 발생하였고, 발생건수로는 남성의 암 중에서 2위를 차지하였고, 여성의 암 중에서 5위를 차지하였다. 남녀를 합쳐서 본 연령대별로는 60대가 34.3¾>로 가장 많고, 70대가 31.0¾， 50대가 14.6%의 순이다 (보건복지가족부 중앙암등록본부 2008년 10월 15일 발표 자료). 더욱이 흡연인구의 증가와 대기 오염 등의 원인으로 우리나라에서도 급속히 증가하고 있는 종양이며 암의 종류별 사망률은 21.4%로 1위이고， 남자에게서는 24.9%， 여자 15.1%로 각각 1위， 2위이다 (2006년 사망원인통계연보, 통계청).
폐암은 암세포의 성장으로 인한 주변 조직 침범 또는 기도폐쇄， 림프절 전이 등의 증상을 초래하는 것이 보통이지만， 환자의 10-15% 정도는 아무런 증상 없이 정기 검진에서 진단된다. 또한， 대부분의 폐암이 진단 당시에 상당히 진행된 상태로 진단되므로 완치가 어려운 경우들이 대부분이라는 문제가 있다. 따라서 폐암을 조기에 진단하여 폐암으로 인한사망를을 줄이는 것이 시급한 문제이다.
폐암을 진단하기 위해서 여러 가지 방법이 사용되고 있는데, 현재까지는 종양의 크기를 측정하고, 림프절로의 전이 유무를 조사하거나, 폐 종양 조직이나 림프절 등을 생검하여 면역조직화학방법으로 분석하거나 흉부 전산화 단층 촬영, 기관지 내시경 등을 이용하고 있다. 그러나， 흉부단층 촬영의 경우 폐암의 크기가 약 0.1 cm 이상 되어야 측정가능한데, 이 시기는 이미 암이 다른 조직으로 전이되었을 가능성이 높으며， 내시경이 기관지로 삽입되어 폐 내부를 직접 관찰할 수 있는 기관지 내시경 방법은 폐 말단에 있는 종양을 관찰하기 곤란한 한계를 가지고 있다.
이러한 문제점에 대하여, 폐암의 마커들을 이용하여 암을 진단하기 위한 시도들이 진행되고 있다. 현재까지 유전체 혹은 단백체 분석기술을 이용하여 암 특이적 바이오마커를 개발하고자 하는 시도는 DNA 바이오마커나 혈액 내 마커 단백질에 대부분 집중되어， 폐암조직 (혹은 폐암세포)과 정상조직 (흑은 정상세포)， 혹은 폐암환자 체액 (혈액 포함)과 정상인 체액에서 달리 발현되는 유전체 흑은 단백체를 대상으로 진행되는 형태가 대부분이었다. DNA 바이오마커의 경우， cDNA 마이크로어레이를 이용한 데이터는 미국 국립 암연구소 (National Cancer Institute)에서 암 특이적 발현 유전자에 대한 데이터베이스를 웹을 통하여 공개하고 있을 만큼 많은 연구가 진행되어있으며 (http://ww.cancer.gov)， 또한 일부 암 특이적인 단백질에 대하여 목표지향적인 치료제의 개발 혹은 진단용 마커로 개발되고 있기도 하지만 (http://www.clinicaltrial.gov)， 지금까지 개발된 폐암의 바이오마커로는 프로모터 인자 과메틸화나 K-ras, p53의 돌연변이와 같이 DNA 바이오마커로서 가능성이 있는 것들이 대부분이다. 다른 한편, '피 한 방울로 암올 조기에 진단 한다'는 목표 아래 주로 혈액 내에서 암특이적 발현을 보이는 마커 단백질을 찾는데 연구가 활발히 진행되어， 조직 등에서 발굴한 암배 항원 (CEA, carcinoembryonic antigen), CYFRA21-1 플라스마 칼리크레인 BKKLKBl 뉴런 특이성 엔을라제와 같은 단백질 바이오마커가 폐암에 활용할 수 있는 바이오마커로 발견되었지만， 아직까지 임상적으로 유용하게 사용되고 있지는 못하고 있다.
상기와 같이， 종래 밝혀진 DNA 바이오마커나 혈액 내 단백질마커가 임상적으로 적용되지 못하고 있는 이유는 (1)특정 조직의 정상 부위 대 질환부위에 대한 DNA 마이크로어레이 등을 통한 유전자 발현 분석의 경우 유전자의 증감이 직접적으로 단백질의 발현의 문제로 연결되지 않는 경우가 많으며， (2)혈액 단백질의 경우 시료 채취가 쉬운 장점은 있지만 특정한 조직의 상태를 반영한다고 보기에 너무 전신적인 (systemic) 문제가 많고, 혈액 내의 풍부 단백질 (abundant protein)의 배제가 까다로운 문제 (전체 단백질의 99%가 22종의 단백질임)가 있어 특정 질환의 마커로 일반화시킬 수 없는 문제가 있다. 또한， (3)세포 내부에 존재하는 단백질 및 유전자를 바이오마커로 개발하는 경우 비침습적인 진단 방법으로 개발하기 어렵고, 치료용 표적물질로의 개발 역시 별도의 약물전달체가 필요하게 되는 등의 문제가 있다. 상기와 같은 문제점에 대하여 기본적으로 폐암 조직 (또는 세포)에서만 특이적 ^로 발현되면서도， 비침습적으로 검출할 수 있어 폐암만의 특이적인 바이오마커의 개발이 절실함에도 불구하고， 아직까지 임상적으로 유용하게 이용될 만한 폐암 바이오마커는 발견되지 않고 있는 실정이다.
【발명의 내용】
【해결하고자 하는 과제】
본 발명의 목적은 폐암 조직 또는 세포에서만 특이적으로 발현되면서도 비침습적으로 검출할 수 있는 폐암의 진단 또는 치료를 위한 신규한 표적 단백질 및 이에 특이적으로 결합하는 유효성분을 포함하는 폐암 진단용 조성물, 치료용 조성물, 상기 조성물의 폐암 진단 및 치료 용도， 폐암 진단 방법， 및 치료방법을 제공하는 것이다. 【과제 해결 수단】
상기의 목적을 달성하기 위하여， 본 발명의 일 측면은
AP00(Apo lipoprotein 0), ATPlAKATPase, Na+/K+ transporting, alpha 1 polypeptide), CANX(calnexin) 및 DD0ST(dol ichyl- d i phosphoo 1 i gosacchar i de-pr ot e i n glycosyltransferase)로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 포함하는 폐암 진단용 조성물을 제공한다.
또한 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 다른 측면은 AP00, ATP1A1, CANX 및 DD0ST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리펩티드의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 폐암 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
【발명의 효과】
본 발명의 AP00, ATP1A1, CANX 및 DD0ST 폴리펩티드는 폐암 조직 또는 세포에서 특이적으로 과발현되므로 폐암의 진단 또는 치료용 표적 물질로서 적합하다. 또한， 상기 4종의 바이오마커는 세포의 표면 [보다 상세하게는， 세포막의 외측 표면 (outer cell membrane surface)]에 위치하는 막 단백질이므로 · 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 물질을 처리하면， 비교적 용이하게 상기 단백질에 결합하여 검출 또는 조절할 수 있다. 즉, 상기 4종의 바이오마커에 결합하는 물질은 CPP cell penetrating peptide)의 도움 없이도 상기 바이오마커에 결합하여 기능을 나타낼 수 있는 이점이 있다. 또한， 세포 내에 존재하는 생체물질을 타겟으로 하는 의약의 경우, 대체적으로 과량을 투여하여 의약이 세포내로 확산되어 유입되도록 한다. 그러나, 본 발명의 치료물질은 세포 표면에 있는 단백질에 특이적으로 결합하는 물질이기 때문에, 비교적 낮은 투여량으로 유효한 치료 효과를 달성할 수 있다. 따라서， 본 발명에 따르면， 폐암의 진단 및 치료를 매우 효율적으로 할 수 있다.
다만， 본 발명의 효과는 상기에서 언급한 효과로 제한되지 아니하며， 언급되지 않은 또 다른 효과들은 하기의 기재로부터 당업자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다. 【도면의 간단한 설명】
도 1은 대조군 세포주와 A549, SK-MES-1, H460 및 H146 세포주에서 분리한 세포막 단백질을 SDS-PAGE로 분리한 젤 사진이다.
도 2는 대조군 세포주와 A549, SK-MES-1, H460 및 H146 세포주에서 분리한 세포막 단백질을 절단한 후, HPLC를 수행한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 대조군 세포주와 A549, SK-MES-1, H460 및 H146 세포주에서 APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST의 특이적 발현 여부를 웨스턴 블럿을 통해 확인한 결과를 나타낸 사진이다.
도 4 내지 도 7은 각각 A549 세포주, H460 세포주, SK-MES-1 세포주 및 H146 세포주에서' APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST의 세포 표면 발현 여부를 유세포 분석을 통해 확인한 그래프이다.
도 8 내지 도 10은 각각 A549 세포주， H460 세포주 및 SK—MES-1 세포주에서 APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST의 세포 표면 발현 여부를 면역세포화학 분석을 통해 확인한 현미경 사진이다.
도 11은 Cy5.5-표지 Ant i -DD0ST항체 및 대조구를 주사한 경우, 주사 후 30분, 1시간， 1.5시간， 3시간， 4.5시간, 24시간 경과 후 스펙트럼 형광 이미지화를 수행한 결과를 나타낸 사진이다.
도 12는 정맥 주사를 통해 구축한 이종이식 (xenograft)모델의 암조직 표면에 대한 이미지화 결과를 나타낸 사진이다.
도 13 내지 도 15는 각각 A549 세포주， H460 세포주 및 SK-MES-1 세포주에서 AP00, CANX 및 DDOST에 대한 항체를 이용하여 ADCC 반웅을 유도함으로써 폐암 세포의 사멸 또는 성장 억제를 확인한 그래프이다.
도 16는 A549 세포주에 의하여 종양이 생성된 누드마우스에서 DD0ST에 대한 항체를 이용하여 종양의 성장이 억제됨을 확인한 그래프이다. 도 17은 SK-MES-1 세포주에 의하여 종양이 생성된 누드마우스에서 DD0ST에 대한 항체를 복강 주사한 경우 암세포의 생장을 억제하는 결과를 나타낸 그래프이다. 【발명을 실시하기 위한 구체적인 내용】
이하， 본 발명을 상세히 설명한다. 1. 폐암 진단용조성물 및 용도
본 발명의 일 측면은 APCXKApo lipoprotein 0)， ATPlAKATPase, Na+/ + transporting, al ha 1 polypeptide) , CANX(calnexin) 및 DDOST ( do 1 i chy 1一 d i phosphoo 1 i gosacchar i de-prote in glycosyltransferase)로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 엽타머를 포함하는 폐암 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 폐암 진단을 위한, APOC Apolipoprotein 0)， ATPlAKATPase, Na+/K+ transporting, alpha 1 polypeptide), CANX(calnexin) 및 DDOSKdol ichyl-diphosphool igosacchari de-protein glycosyltransferase)로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나의 플리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 ¾타머의 용도를 제공한다. 본 발명의 폐암 진단용 조성물은 1) AP00, ATP1A1, CANX 및 DD0ST로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 2) AP00, ATP1A1, CANX 및 DD0ST로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 앱타머를 포함한다 .
상기 AP00 폴리펩티드는 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하다. 또한, 상기 AP00 폴리펩티드는 서열번호 1로 기재돠는 뉴클레오티드 서열에 의하여 코딩되는 것이 바람직하다.
상기 APT1A1 폴리펩티드는 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하다. 또한， 상기 AP00 폴리펩티드는 서열번호 3으로 기재되는 뉴클레오티드 서열에 의하여 코딩되는 것이 바람직하다.
상기 CANX 폴리펩티드는 서열번호 6으로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하다. 또한, 상기 AP00 폴리펩티드는 서열번호 5으로 기재되는 뉴클레오티드 서열에 의하여 코딩되는 것이 바람직하다.
상기 DD0ST 폴리펩티드는 서열번호 8로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하다. 또한 상기 DD0ST 폴리펩티드는 서열번호 7로 기재되는 뉴클레오티드 서열에 의하여 코딩되는 것이 바람직하다.
상기 항체는 AP00, ATP1A1, CANX 및 DD0ST로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드의 일부 또는 전부를 항원성 부위로 인지하여， 상기 항원성 부위에 특이적이고 직접적으로 결합하는 것을 의미하며， 폴리클로날 (polyclonal) 항체 또는 모노클로날 (monoclonal) 항체를 모두 포함한다. 상기 AP00, ATP1A1, CANX 및 DD0ST로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체는 당업자에게 알려진 공'지의 방법으로 제작될 수 있다. 즉, 상기 단일클론 항체는 당업계에 널리 공지된 융합 방법 (fusion method) (Kohler 및 Mi lstein (1976) European Jounral of Immunology, 6:511ᅳ 519 참조)， 재조합 DNA 방법 또는 파지 항체 라이브러리 (Clackson et al . , Nature, 352:624-628, 1991； Marks et al . , J. Mol. Biol. , 222:58， 1—597， 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 또한， 상기 폴리클로날 항체는 항원인 AP00, ATP1A1, CANX 또는 DD0ST 폴리펩티드를 마우스， 래트， 양， 토끼와 같은 포유동물을 포함하는 외부 숙주에 주사함으로써 제조될 수 있다. 상기 항원은 근내， 복강내 또는 피하 주사방법으로 주사되며, 일반적으로 항원성을 증가시키기 위한 보조제 (adjuvant)와 함께 투여될 수 있고, 외부 숙주로부터 정기적으로 혈액을 채취하여 형상된 역가 및 항원에 대한 특이성을 보이는 혈청을 수거하여 항체를 분리함으로써 수득 및 이용될 수 있다. 또한， 상기 항체는 상업적으로 알려진 AP00, ATP1A1, CANX 또는 DD0ST항체를 구입하여 이용할 수 있다.
상기 앱타머 (aptamer)는 단일 사슬 DNA 또는 RNA 분자로서， SELEXCsystemat ic evolution of 1 igands by exponential enrichment)라 불리는 을리고뉴클레오타이드 (oligonucleotide) 라이브러리를 이용한 진화적인 방법에 의해 특정 화학 분자나 생물학적 분자에 높은 친화력과 선별력을 갖고 결합하는 올리고머를 분리하여 수득할 수 있다 (C. Tuerand L. Gold, Science 249, 505 - 510, 2005； A. D. Ellington and J. W. Szostak, Nature 346, 818 - 822， 1990； M. Famulok, et . al. , Acc. Chem. Res. 33， 591 - 599， 2000; D. S. Wilson and Szostak, Annu. Rev. Biochem. 68， 611 - 647, 1999) . 앱타머는 표적에 특이적으로 결합하고 표적의 활성을 조정할 수 있는데, 예컨대， 결합을 통하여 표적이 기능하는 능력을 차단할 수 있다. 본 발명의 경우， SELEX를 이용하여 진화적인 방법으로 상기 AP00, ATP1A1, CANX 및 DD0ST로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드에 높은 친화력 및 선별력을 갖는 앱타머를 수득하여 이용할 수 있다.
상기 항체 또는 앱타머는 상기 검출체가 태깅 (tagging)된 것일 수 있다. 상기 검출체는 APOO, ATP1A1, CANX 및 DD0ST로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드 표적에 상기 항체 또는 앱타머가 특이적으로 결합하였는지 여부를 용이하게 확인， 검출 및 정량하기 위한 것으로서， 발색효소 (퍼옥시다제 (peroxidase), 알칼라인 포스파타제 (alkaline phosphatase) 등), 형광물질 (FITC, RITC, 로다민 ！ )， 텍사스레드 (Texas Red), 플로레신 (fluorescein) , 피코에리트린 (phycoerythrin), 뭔텀닷 (quantum dots)), 크로모포어 (chromophore) 및 방사성 동위원소 (1241， 1251， lllln, 99mTc , 32Ρ, 35S 등)로 구성된 군에서 선택되는 적어도 어느 하나일 수 있다. 상기 검출체가 상기 항체 또는 앱타머에 태깅되는 경우, 상기 검출체는 상기 항체 또는 앱타머에서 표적에 대한 특이성 또는 선택성에 영향이 없도록 부착되는 것이 바람직하고, 이를 위하여 상기 항체 또는 앱타머에 링크 (공유결합 또는 가교)되어 제공될 수 있다. 상기와 같은 검출체의 태깅 위치는 당업자가 반복 실험을 통하여 용이하게 결정할 수 있다.
상기 폐암은 비소세포폐암 (NSCLC) 또는 소세포폐암 (sac)일 수 있고， 특히 상기 비소세포폐암은 선암 (adenocarcinoma), 편평상피세포암 (squamous cell carcinoma) 또는 대세포암 (large cell carcinoma)일 수 있다.
상기 조성물은 비강 투여용인 것이 바람직하다. 이는 상기 항체 또는 앱타머의 결합 특이성 및 선택성을 향상시키기 위한 것으로서, 상기 조성물이 비강 투여되는 경우 다른 조직이 아닌 폐암 조직 또는 세포에서 발현되는 표적 (APOO, ATP1A1, CANX 또는 DD0ST 폴리펩티드)에 더욱 선택적으로 결합될 수 있는 것이다.
상기 조성물이 피검체에 비강투여 되는 경우， 상기 조성물 내의 항체 또는 앱타머는 폐 조직 또는 세포에서 발현되는 APOO, ATP1A1, CANX 또는 DD0ST 폴리펩티드에 특이적， 선택적으로 결합하게 되고， 상기 항체 또는 앱타머에 태깅된 검출체에서 일어나는 반웅을 통해 상기와 같이 표적에 결합된 항체 또는 앱타머의 위치 또는 발현량을 측정할 수 있다. 즉ᅳ 피검체의 폐 조직 또는 세포 내에서 상기 검출체의 반응이 많이 일어나면， 상기 피검체의 폐 조직에는 APOO, ATP1A1, CANX 또는 DD0ST 폴리펩티드가 과량으로 존재하는 것이고, 상기 피검체는 폐암에 걸린 것으로 진단될 수 있는 것이다. 또한， 상기 조성물은 비강 투여됨으로써 상기 피검체에서 폐암 세포 존부를 비침습적으로 확인할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 폐암 세포주인 A549, SK-MES-1, H460 및 H146 세포주에서 상기 4 가지 폴리펩티드인 APOO, ATP1A1, CANX 또는 DD0ST가 특이적으로 과발현됨을 확인한 바 (도 3 내지 도 5 참조)， 본 발명의 APOO, ATP1A1, CANX 또는 DD0ST 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 ¾타머를 포함하는 조성물은 폐암의 진단에 유용하게 이용될 수 있다.
2. 폐암 진단용 키트
본 발명의 다론 측면은 APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머， 또는 APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 상보적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 폐암 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 폐암 진단용 키트는 1) APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 2) APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 앱타머， 또는 3) APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 플리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 상보적으로 결합하는 프라이머 또는 4) APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 상보적으로 결합하는 프로브를 포함한다.
상기 키트는 상기 "1. 폐암 진단용 항목의 조성물과는 달리 피검체 내로 투여되기 위한 것이 아니라， 피검체로부터 유래된 폐세척액, 생검, 혈액， 타액， 소변 등의 생물학적 시료를 이용하여 피검체의 폐암 유무를 진단하기 위한 것이다. 따라서， 상기 생물학적 시료 내에 포함된 단백질 또는 핵산을 검출하기 위한 것이고， 특히 본 발명의 상기 키트는 상기 생물학적 시료 내에 포함된 APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드, 또는 APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 검출하는데 이용된다.
본 발명의 폐암 진단용 키트는 AP00, ATPIAI, CA X 및 DD0ST로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 포함할 수 있다. 상가 항체 또는 앱타머는 상기 AP00, ATPIAI, CANX 또는 DD0ST를 검출하기 위한 것으로서， 상기 " 폐암진단용
항목에서 설명한 바와 동일하다. 따라서, 상기 AP00, ATP1A1, CANX 및 DD0ST로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머에 관해서는 상기 "1. 폐암 진단용
항목의 설명을 원용하여 상세한 설명은 생략하도톡 하고, 이하에서는 상기 폐암 진단용 키트에 특이적인 구성 (프라이머 또는 프로브)에 대해서만 설명하도록 한다.
상기 AP00, ATPIAI, CANX 및 DD0ST의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 각각 서열번호 1， 서열번호 3， 서열번호 5 및 서열번호 7로 기재되는 핵산 서열올 가지는 것이 바람직하다.
상기 프라이머 (primer)는 적절한 조건 및 환경에서 주형 DNA에 상보적인 DNA의 합성이 개시될 수 있도록 하는 것으로서， 상기 APOO, ATPIAI, CANX 또는 DDOST의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 흔성화될 수 있는 단일가닥의 올리고뉴클레오티드이다. 상기 프라이머의 길이는 온도， 반응 조건 및 프라이머의 용도 등 다양한 요소에 따라 변형되지만, 일반적으로 10 내지 30 nt 길이의 폴리뉴클레오티드인 것이 바람직하다. 상기 프라이머 서열은 주형 (표적)이 되는 AP00, ATPIAI, CANX 및 DD0ST의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열과 완전하게 상보적인 서열일 필요는 없고， 상기 주형 (표적) 서열과 흔성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서 층분한 상보성만 가지면 된다. 이러한 프라이머의 디자인은 서열번호 1, 서열번호 3， 서열번호 5 또는 서열번호 7로 구성된 군으로부터 선택되는 표적 폴리뉴클레오타이드 서열을 참조하여 당업자에 의해 용이하게 실시할 수 있으며, 예컨대， 프라이머 디자인용 프로그램인 Primer 3 프로그램 (http://frodo.wi. mit.edu/primer3/), Blast 프로그램 (NCBI)을 이용하여 설계할 수 있다. 상기 프로브 (probe)는 표적 폴리뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 흔성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 의미하는 것으로서， 상기 AP00, ATP1A1, CANX 및 DD0ST의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 흔성화될 수 있는 단일가닥의 선형 폴리뉴클레오티드이다. 상기 프로브는 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것일 수 있다. 상기 프로브가 자연적으로 존재하는 것인 경우 상기 프로브는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드로 구설될 수 있고， 상기 프로브가 인위적으로 합성된 것인 경우 상기 프로브는 펩타이드 핵산 (PNA) (M. Egholm et al .， Nature, 365： 566-568 ( 1993) ) , 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, 醒 I-연결된 DNA, 2'-0-메틸 RNA, 알파 -DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대， 2'— 0-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'ᅳ 아미노 RNA, 2'ᅳ0-알킬 DNA, 2'-0-알릴 DNA, 2'-0-알카이닐 DNA, 핵소스 DNA, 피라노실 R A 및 안히드로핵시를 DNA, 및 염기 변형올 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘 (치환기는 플루오로-, 브로모ᅳ, 클로로-, 아이오도-， 메틸-， 에틸-, 비닐-， 포르밀-, 에티틸-， 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-， 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린 (치환기는 플루오로-， 브로모-， 클로로-， 아이오도-， 메틸-, 에틸ᅳ， 비닐-, 포르밀-， 알카이닐-, 알켄일-， 티아조릴_ 이미다조릴-, 피리딜 -)， 이노신 또는 디아미노퓨린 등으로 구성될 수 있다. 상기 프라이머 또는 프로브는 상기 검출체가 태깅 (tagging)된 것일 수 있다. 상기 검출체는 APOO, ATP1A1, CANX 및 DD0ST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 표적에 상기 프라이머 또는 프로브가 특이적으로 결합하였는지 여부를 용이하게 확인， 검출 및 정량하기 위한 것으로서, 발색효소 (퍼옥시다제 (peroxidase), 알칼라인 포스파타제 (alkaline phosphatase) 등) , 형광물질 (FTTC, RITC, 로다민 (rhodamine)， 텍사스레드 (Texas Red), 플로레신 (fluorescein)， 피코에리트린 (phycoerythrin)， 뭔텀닷 (quantum dots))， 크로모포어 (chromophore) 및 방사성 동위원소 (1241 1251, lllln, 99mTc, 32P, 35S 등)로 구성된 군에서 선택되는 적어도 어느 하나일 수 있다. 상기 검출체가 상기 프라이머 또는 프로브에 태깅되는 경우， 상기 검출체는 상기 프라이머 또는 프로브에서 표적에 대한 특이성 또는 선택성에 영향이 없도록 부착되는 것이 바람직하고， 이를 위하여 상기 프라이머 또는 프로브에 링크 (공유결합 또는 가교)되어 제공될 수 있다. 상기와 같은 검출체의 태깅 위치는 당업자가 반복 실험을 통하여 용이하게 결정할 수 있다.
상기 키트는 마이크로어레이칩인 것이 바람직하다. 상기 마이크로어레이 칩이 APOO, ATP1A1, CANX 및 DD0ST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머로 구성되는 경우, 상기 마이크로어레이 칩은 APOO, ATP1A1 , CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리펩티드의 발현량을 번역 (translation)된 단백질 수준에서 검출하기 위한 것이 된다. 또한， 상기 마이크로어레이 칩이 APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 상보적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브로 구성되는 경우， 상기 마이크로어레이 칩은 APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리펩티드의 발현량을 전사 (transcription)된 mRNA의 수준에서 검출하기 위한 것이 된다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 폐암 세포주인 A549, SK-MES-1, H460 및 H146 세포주에서 상기 4 가지 폴리펩티드인 APOO, ATP1A1, CANX 또는 DDOST가 특이적으로 과발현됨을 확인한 바 (도 3 내지 도 5 참조)， 상기 APOO, ATP1A1, CANX또는 DDOST폴리펩티드에 대한 항체 또는 앱타머， 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 대한 프라이머 또는 프로브를 포함하는 키트는 폐암 진단용 키트로서 유용하게 이용할 수 있다. 3. 폐암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위한 폴리펩티드 검출 방법 본 발명의 또 다른 측면은 폐암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위한 폴리펩티드 검출 방법을 제공한다. 상기 폴리펩티드 검출 방법은 in vivo 또는 in vitro상에서 수행될 수 있다.
본 발명의 폐암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위한 폴리펩티드 검출 방법은 1) 피검체에 APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 표적 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 투여하여 상기 표적 폴리펩티드에 결합시키는 단계; 2) 상기 단계 1)의 표적 폴리펩티드에 결합된 항체의 양 및 위치를 측정함으로써 APOO, ATP1A1, CANX 및 DD0ST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리펩티드의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 3) 상기 단계 2)에서 측정한 APOO, ATP1A1, CANX 및 DD0ST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리펩티드의 발현 수준이 대조군보다 증가된 피검체를 폐암에 걸릴 위험이 있는 개체로 판정하는 단계를 포함한다.
상기 단계 1)의 항체 또는 앱타머는 상기 APOO, ATP1A1, CANX 또는 DDOST를 검출하기 위한 것으로서， 상기 " 1. 폐암 진단용 항목에서 설명한 바와 동일하다. 따라서， 상기 APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머에 관해서는 상기 "1. 폐암 진단용 항목의 설명을 원용하여 상세한 설명은 생략하도록 하고， 이하에서는 상기 폐암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위한 폴리펩티드 검출 방법에 특이적인 구성 (폴리펩티드의 발현 수준 측정 단계 및 폐암으로 판정하는 단계)에 대해서만 설명하도톡 한다.
상기 단계 1)의 피검체는 폐암에 걸린 것으로 의심되는 개체 또는 폐암에 걸릴 위험이 있는지 진단을 필요로 하는 개체로서 인간, 원숭이， 개， 염소， 돼지 또는 쥐 등 척추등물이고 바람직하게는 포유동물이다.
상기 단계 2)의 폴리펩티드 발현 수준 측정은 상기 단계 1)의 표적 폴리펩티드에 결합된 항체 또는 앱타머에 태깅된 검출체의 존부를 측정함으로써 간접적으로 상기 단계 1)의 피검체 내에서 APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드가 어느 조직에 어느 정도로 존재하는지를 확인， 검출 및 정량할 수 있다. 당업자는 상기 검출체의 종류에 따라 그 검출 방법을 용이하게 선택할 수 있다. 예컨대， 상기 검출체가 FTTC, RITC, 로다민(1"110(13^116)， 텍사스레드 (Texas Red), 플로레신 (fluorescein) , 피코에리트린 (phycoerythrin), 뭔럼닷 (quantum dots) 등과 같은 형광물질인 경우， 상기 표적 폴리펩티드에 결합된 항체 또는 앱타머의 양 및 위치는 형광단층촬영 (Fluorescence mediated tomography:FMT)으로 측정할 수 있다. 상기 단계 3)의 대조군은 폐암에 걸리지 않은 것으로 인정되는 개체이고, 상기 단계 3)의 대조군 내에서 표적 폴리펩티드의 발현 수준은 상기 단계 1)의 항체 또는 앱타머를 상기 대조군에 투여하고 상기 단계 2)와 같이 측정함으로써 결정된다. 상기 단계 3)에서 측정된 대조군 내에서의 상기 표적 폴리펩티드 발현 수준은 폐암이 걸리지 않은 경우에도 기본적으로 발현되어 개체 내에 존재하는 양이다.
상기 단계 3)의 피검체를 폐암에 걸릴 위험이 있는 개체로 판정하는 단계는 상기 대조군 내에서의 상기 표적 폴리펩티드의 발현 수준과 상기 피검체 내에서의 상기 표적 폴리펩티드의 발현 수준을 비교함으로써 수행된다. 상기 피검체 내에서 발현된 상기 표적 폴리펩티드의 양이 상기 대조군 내에서의 상기 표적 폴리펩티드의 발현 수준 보다 좋은 경우, 상기 피검체는 폐암에 걸린 것으로 인정된다.
본 발명의 다른 폐암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위한 폴리펩티드 검출 방법은 1') 피검체 유래 시료에 APOO, ATP1A1, CANX 및 DD0ST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 표적 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 처리하여 상기 표적 폴리펩티드에 결합시키는 단계; 2') 상기 단계 1')의 표적 폴리펩티드에 결합된 항체의 양 및 위치를 측정함으로써 AP00, ATP1A1, CANX 및 DD0ST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리펩티드의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 3') 상기 단계 2')의 표적 폴리펩티드의 발현 수준이 대조군보다 증가된 피검체를 폐암에 걸릴 위험이 있는 개체로 판정하는 단계를 포함한다.
상기 단계 1')의 항체 또는 앱타머는 상기 AP00, ATP1A1, CANX 또는 DD0ST를 검출하기 위한 것으로서 , 상기 "1. 폐암 진단용 조성물" 항목에서 설명한 바와 동일하다. 따라서， 상기 AP00, ATP1A1, CANX 및 DD0ST로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머에 관해서는 상기 "1. 폐암 진단용조성물" 항목의 설명을 원용하여 상세한 설명은 생략하도록 하고， 이하에서는 상기 폐암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위한 폴리펩티드 검출 방법에 특이적인 구성 (폴리펩티드의 발현 수준 측정 단계 및 폐암으로 판정하는 단계)에 대해서만 설명하도톡 한다. 상기 단계 ι')의 피검체는 폐암에 걸린 것으로 의심되는 개체 또는 폐암에 걸릴 위험이 있는지 진단을 필요로 하는 개체로서 인간， 원숭이， 개， 염소, 돼지 또는 쥐 등 척추동물이고 바람직하게는 포유동물이다.
상기 단계 1')의 피검체 유래 시료는 피검체로부터 유래된 폐세척액， 생검， 혈액, 타액, 소변 등의 모든 생물학적 시료일 수 있다.
상기 단계 2')의 상기 플리펩티드의 발현 수준은 상기 단계 1')의 표적 폴리펩티드에 특이적으로 결합된 항체 또는 앱타머의 존부를 측정함으로써 간접적으로 상기 단계 1')의 피검체 내에서 AP00, ATP1A1, CANX 및 DD0ST로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드가 어느 조직에 어느 정도로 존재하는지를 확인， 검출 및 정량할 수 있다. 상기 표적 폴리펩티드의 발현 수준의 측정은 면역침강법 (immunoprecipitation), 방사능면역분석법 (RI A), 효소면역분석법 (ELISA), 면역조직화학， RT-PCR, 웨스턴 블롯 (Western Blotting) 및 유세포 분석법 (FACS)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 방법으로 수행될 수 있으나, 이에 한정되지 아니하고, 당업자가 적절하게 선택하여 수행할 수 있다.
상기 단계 3')의 대조군은 폐암에 걸리지 않은 것으로 인정되는 개체에서 유래한 폐세척액， 생검, 혈액， 타액， 소변 등의 모든 생물학적 시료이고, 상기 단계 3')의 대조군 내에서 표적 폴리펩티드의 발현 수준은 상기 단계 1')의 항체 또는 앱타머를 상기 대조군에 처리하고 상기 단계 2')와 같이 측정함으로써 결정된다. 상기 단계 3')에서 측정된 대조군 내에서의 상기 표적 폴리펩티드 발현 수준은 폐암이 걸리지 않은 경우에도 기본적으로 발현되어 개체 내에 존재하는 양이다.
상기 단계 3')의 피검체를 폐암에 걸릴 위험이 있는 개체로 판정하는 단계는 상기 대조군 내에서의 상기 표적 폴리펩티드의 발현 수준과 상기 피검체 내에서의 상기 표적 플리펩티드의 발현 수준을 비교함으로써 수행된다. 상기 피검체 내에서 발현된 상기 표적 폴리펩티드의 양이 상기 대조군 내에서의 상기 표적 폴리펩티드의 발현 수준 보다 좋은 경우， 상기 피검체는 폐암에 걸린 것으로 인정된다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 폐암 세포주인 A549, SK-MES-1, H460 및 H146 세포주에서 상기 4 가지 폴리펩티드인 AP00, ATP1A1, CANX 또는 DD0ST가 특이적으로 과발현됨을 확인한 바 (도 3 내지 도 5 참조)ᅳ본 발명의 폴리펩티드 검출 방법은 APOO, ATP1A1, CANX 또는 DD0ST 폴리펩티드의 발현량올 측정함으로써， 폐암의 진단에 필요한 정보를 제공하는데 유용하게 이용할 수 있다. 4. 폐암 치료용 약학적 조성물 및 용도
본 발명의 또 다른 측면은 APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리펩티드의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 폐암 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 또 다른 측면은 폐암을 치료하기 위한， APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리펩티드의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명의 폐암 치료용 약학적 조성물은 1) APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드의 발현 억제제 또는 2) APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드의 활성 억제제를 포함한다.
상기 AP00 폴리펩티드는 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하다. 또한, 상기 AP0O 폴리펩티드는 서열번호 1로 기재되는 뉴클레오티드 서열에 의하여 코딩되는 것이 바람직하다.
상기 APT1A1 폴리펩티드는 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하다. 또한, 상기 AP00 폴리펩티드는 서열번호 3으로 기재되는 뉴클레오티드 서열에 의하여 코딩되는 것이 바람직하다.
상기 CANX 폴리펩티드는 서열번호 6으로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하다. 또한， 상기 AP00 폴리펩티드는 서열번호 5으로 기재되는 뉴클레오티드 서열에 의하여 코딩되는 것이 바람직하다.
상기 DD0ST 폴리펩티드는 서열번호 8로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하다. 또한 상기 DD0ST 폴리펩티드는 서열번호 7로 기재되는 뉴클레오티드 서열에 의하여 코딩되는 것이 바람직하다.
상기 APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리펩티드의 발현 억제제는 상기 APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드， 짧은 헤어핀 RNA(shR A) 및 작은 간섭 R A(siRNA)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나ᅳ 이에 한정되지 아니한다.
상기 안티센스 뉴클레오티드는 왓슨 -클릭 염기쌍에 정의된 바에 따라 DNA, 미성숙 -mRNA 또는 성숙된 mRNA의 상보적 염기서열에 결합 (흔성화)하여 DNA에서 단백질로의 유전정보 흐름을 방해하는 것이다. 상기 안티센스 뉴클레오티드는 모노머 단위의 긴 사슬이기 때문에 이들은 표적 RNA 서열에 대해 쉽게 합성될 수 있다. 최근 많은 연구들은 표적 단백질올 연구하기 위한 생화학적 수단으로 안티센스 뉴클레오티드의 유용성을 증명하였다 (Rothenberg et al., J. Natl. Cancer Inst. , 81:1539-1544, 1999). 올리고뉴클레오티드 화학 및 향상된 세포흡착, 표적결합 친화도 및 뉴클레아제 내성을 나타내는 뉴클레오티드 합성 분야에서 최근 많은 진보가 있었으므로 안티센스 뉴클레오티드의 사용은 새로운 형태의 억제제로 고려될 수 있다.
상기 작은 간섭 RNA(siR A)는 세포 내에서 표적 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA와 상보적으로 결합 (흔성화)하여， 상기 표적 폴리펩티드의 DNA에서 단백질로의 유전정보 흐름을 방해하는 것으로서, 상기 AP00, ATP1A1, CANX 및 DD0ST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 유전자의 mRNA 염기서열 내에서 선택되는 15 내지 30 nt 길이의 센스 서열 및 상기 센스 서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 서열로 구성된다. 상기 센스 서열은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나， 25 nt길이의 폴리뉴클레오티드로 구성되는 것이 바람직하다.
상기 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)는 50 내기 100 nt 길이를 가지는 단일 가닥의 RNA가 세포 내에서 스템 -루프 (stem-loop) 구조를 이루고， 5 내지 30 nt 길이의 뉴클레오티드의 루프 (loop) 부위 양쪽으로 상보적으로 15 내지 50 nt 길이의 신 RNA가 염기쌍을 이루어 이중가닥의 스템 (stem)을 형성하며 상기 스템 형성 가닥 각각의 이전과 이후에 1 내지 500 nt 길이의 뉴클레오티드를 추가로 더 포함하는 전체 길이의 RNA를 의미하는 것이다. 상기와 같은 shRNA는 세포 내에서 루프가 절단되고, 상기 siRNA와 같이 표적 폴리펩티드의 DNA에서 단백질로의 유전정보 흐름을 방해하는 작용을 한다. 상기 shRNA는 세포 내에서 절단된 후， 상기 AP00, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 유전자의 mRNA 염기서열 내에서 선택되는 15 내지 30 nt 길이의 센스 서열 및 상기 센스 서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 서열을 가지게 되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 아니한다 '.
상기 안티센스 뉴클레오티드, 짧은 헤어핀 R A(shRNA) 및 작은 간섭
RNA(siRNA)는 상기 APOO, ATP1A1, CANX 및 DD0ST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합함으로써 , APOO, ATP1A1, CANX 또는 DD0ST 폴리펩티드의 발현을 억제하고, 따라서 폐암을 치료할 수 있는 유효 성분으로서 작용한다. 상기 APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리펩티드의 활성 억제제는 상기 APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리펩티드에 상보적으로 결합하는 앱타머， 항체 및 펩티드 미메틱스로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나， 이에 한정되지 아니한다.
상기 항체 또는 앱타머는 상기 APOO, ATP1A1, CANX 또는 DDOST를 검출하기 위한 것으로서， 상기 "1. 폐암 진단용 항목에서 설명한 바와 동일하다. 따라서， 상기 APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머에 관해서는 상기 "1. 폐암 진단용 항목의 설명을 원용하여 상세한 설명은 생략하도록 하고, 이하에서는 펩티드 미메틱스에 관해서만 설명하도톡 한다.
상기 펩티드 미메틱스는 표적 폴리펩티드의 결합 도메인을 억제하여 표적 폴리펩티드의 활성을 억제하는 것으로서， APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드의 결합 도메인을 억제하는 것이다. 상기 펩티드 미메틱스는 펩티드 또는 비펩티드일 수 있고， pSi 결합 (Benkirane, N.， et al. J. Biol. Chem. , 271:33218-33224, 1996)과 같은， 비펩티드 결합에 의해 결합된 아미노산으로 구성될 수 있다. 또한， "구조적으로 강제된 (conformational ly constrained)" 펩티드， 사이클릭 미메틱스 (cyclic mimetics), 적어도 하나의 액소사이클릭 도메인 (exocyclic domain), 결합 부분 (결합 아미노산) 및 활성 부위를 포함하는 사이클릭 미메틱스일 수 있다. 펩티드 미메틱스는 MAP7D2 단백질의 이차구조 특성과 유사하게 구조화되고 항체 (Park, B. W. et al. Nat Biotechnol 18, 194-198, 2000) 또는 수용성 수용체 (Takasaki, W. et al. Nat Biotechnol 15， 1266-1270, 1997)와 같은 거대한 분자의 억제 특성을 모방할 수 있으며， 천연의 길항제와 동등한 효과로 작용할 수 있는 신규한 소분자일 수 있다 (Wrighton, N. C. et al. Nat Biotechnol 15, 1261-1265, 1997).
상기 앱타머, 항체 및 펩티드 미메틱스는 상기 AP00, ATP1A1, CANX 및 DD0ST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리펩티드의 활성 도메인 (active domain)에 결합함으로써, AP00, ATP1A1, CANX 또는 DD0ST 폴리펩티드의 활성을 억제하고， 따라서 폐암을 치료할 수 있는 유효 성분으로서 작용한다.
상기 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 유효성분을 0.0001 내지 50 중량 ¾로 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 또한， 상기 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수， 링거액, 완층 식염수， 덱스트로즈 용액， 말토 덱스트린 용액， 글리세를， 에탄을， 리포좀 및 이들 성분 증 1 성분 이상을 흔합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제， 완충액， 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 회석제， 분산제， 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액， 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형， 환약， 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도톡 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌 (Remington ' s Pharmaceutical Science (최근판)， Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할수 있다.
상기 조성물은 비강 투여용인 것이 바람직하다. 이는 상기 발현 또는 활성 억제제의 결합 특이성 및 선택성을 향상시키기 위한 것으로서， 상기 조성물이 비강 투여되는 경우 다른 조직이 아닌 폐암 조직 또는 세포에서 발현되는 표적 (AP00, ATP1A1, CANX 또는 DD0ST 폴리펩티드)에 더욱 선택적으로 결합될 수 있는 것이다.
상기 조성물의 투여량은 환자의 체중， 연령, 성별， 건강상태， 식이， 투여시간， 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하나, 상기 조성물의 일일 투여량은 0.0001 rag/ 내지 10 mg/ 이며, 바람직하게는 0.0001 rag/ 내지 5 rag/ 이며， 하루 일 회 내지 수회에 나누어 투여되는 것이 바람직하다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 폐암 세포주인 A549, SK-MES-1, H460 및 H146 세포주에서 상기 4 가지 폴리펩티드인 APOO, ATPIAI, CANX 또는 DD0ST의 발현 또는 활성을 억제한 경우, 상기 폐암 세포주의 성장이 억제되는 결과를 확인였고, 본 발명의 폐암 치료용 약학적 조성물을 이용하여 APOO, ATPIAI, CANX 또는 DD0ST 폴리펩티드의 발현 또는 활성을 억제함으로써， 폐암 치료의 가능성을 확인한 바 (도 11 내지 도 14 참조)， 상기 APOO, ATPIAI, CANX 또는 DD0ST 플리펩티드의 발현 또는 활성 억제제는 폐암 치료용 조성물의 유효성분으로서 유용하게 이용할 수 있다.
5. 폐암 치료 방법
본 발명의 또 다른 측면은 폐암 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 폐암 치료 방법은 APOO, ATPIAI, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리펩티드의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 조성물을 대상 (subject)에 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 APOO, ATPIAI, CANX 및 DDOST의 폴리펩티드는 각각 서열번호 2, 서열번호 4， 서열번호 6 및 서열번호 8로 기재된다.
본 발명의 다른 구현예에서， 상기 AP00, ATPIAI, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리펩티드의 발현 억제제는 상기 AP00, ATPIAI, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드， 짧은 헤어핀 R A(shRNA) 및 작은 간섭 RNA(siRNA)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나이다. 본 발명의 또 다른 구현예에서， 상기 APOO, ATP1A1, CANX 및 DD0ST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리펩티드의 활성 억제제는 상기 APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리펩티드에 상보적으로 결합하는 앱타머， 항체 및 펩티드 미메틱스로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나이다.
본 발명의 일 구체예에서， 상기 조성물을 대상에 투여하는 단계는 상기 대상의 비강을 통해 투여할 수 있다.
본 발명의 폐암 치료 방법에 대하여 "2. 폐암 진단용 ^J^" 항목 및 "4. 폐암 치료용 약학적 조성물" 항목에 이미 기재하고 있는 내용에 대하여는 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략하도록 한다.
6. 폐암 치료용 후보물질 스크리닝 방법
아울러， 본 발명의 또 다른 측면은 폐암 치료용 후보 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 폐암 치료용 후보 물질의 스크리닝 방법은 1) AP00, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나의 표적 폴리펩티드를 발현하는 세포주에 피검물질을 처리하는 단계; 2) 상기 단계 1)의 세포주에서 표적 폴리펩티드의 발현 정도를 측정하는 단계； 및 3) 상기 단계 2)에서 측정한 표적 폴리펩티드의 발현 수준이 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소한 피검물질을 선별하는 단계를 포함한다. 상기 단계 2)의 표적 폴리펩티드의 발현 정도 측정은 역침강법 ( i腿 unoprecipi tat ion)， 방사능면역분석법 (RIA)， 효소면역분석법 (ELISA), 면역조직화학， RT-PCR, 웨스턴 블롯 (Western Blotting) 및 유세포 분석법 (FACS)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것이 바람직하나 당업자에게 알려진 전사체 또는 그로부터 코딩된 단백질의 양을 측정하는 모든 방법을 사용할 수 있다.
상기 단계 3)에서 선별된 피검물질은 상기 APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나의 표적 폴리펩티드의 발현을 억제하는 물질로서， 상기 "4. 폐암치료용 약학적조성물" 항목에서 설명된 발현 억제제로 이용될 수 있다. 본 발명의 또 다른 폐암 치료용 후보 물질의 스크리닝 방법은 1) APOO, ATP1A1, CANX 및 DD0ST로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나의 표적 폴리펩티드에 피검물질올 처리하는 단계; 2) 상기 표적 폴리펩티드의 활성 정도를 측정하는 단계; 및 3) 상기 표적 폴리펩티드의 활성 정도가 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소한 피검물질을 선별하는 단계를 포함한다.
상기 단계 2)의 표적 폴리펩티드의 활성 정도는 SDS-PAGE, 면역형광법， 효소면역분석법 (ELISA), 질량분석 및 단백질 칩으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나로 측정하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니하고, 당업자에게 알려진 단백질의 활성 정도를 측정하는 모든 방법을 사용할 수 있다.
상기 단계 3)에서 선별된 피검물질은 상기 APOO, ATP1A1, CA X 및 DD0ST로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나의 표적 폴리펩티드의 활성을 억제하는 물질로서, 상기 "4. 폐암치료용 약학적조성물" 항목에서 설명된 활성 억제제로 이용될 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 폐암 세포주인 A549, SK-MES-1, H460 및 H146 세포주에서 상기 4 가지 폴리펩티드인 APOO, ATP1A1, CANX 또는 DD0ST의 발현 또는 활성을 억제한 경우， 상기 폐암 세포주의 성장이 억제되는 결과를 확인한 바, 본 발명의 스크리닝 방법은 APOO, ATP1A1, CANX 또는 DD0ST 폴리펩티드의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 피검물질을 스크리닝함으로써, 폐암 치료의 후보 물질을 스크리닝하는데 유용하게 이용될 수 있다. 이하, 본 발명을 실험예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실험예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기의 실험예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
【실시예 1】
신규 폐암 마커 폴리펩티드의 선별
<1-1>세포막 단백질의 분리
정상 허파조직과 A549 (편평세포암, squamous cell carcinoma), SK- MES-K선암, adenocarcinoma), H460(대세포암， large cell carcinoma) 및 H146(소세포암， small cell carcinoma) 세포주로부터 단백질가수분해효소 억제제 (protease inhibitor)인 PMSFXsigma, St Louis, USA) 100 mM을 이용해 소니케이션 (sonication) 방법으로 세포 및 조직을 파쇄한 후, 15,000 rpm에서 30분 동안 분별원심분리 (di f ferential centri fugat ion)하여 세포막 분획을 농화 (enrichment)하고， 펠렛 (pel let) 부분인 막 단백질 (membrane protein)만으로 10% SDS-PAGE를 수행하여 세포막 단백질을 분리하였다 (도 1),
<1-2>세포막 단백질의 동정
상기 실시예 <1-1>과 같이 분리한 5 가지 세포주의 막 단백질에 트립신 (trypsin)을 처리하여 HPLC를 수행하였고, 정상조직의 HPLC 단백질 프로파일과 비교하여 상기 4가지 종류의 폐암 세포주에서 나타나는 상이한 피크 (peak)의 단백질을 선별하여 MS/MS로 이를 동정하였다. 보다 상세하게는, 막 단백질을 전기영동한 젤을 증류수로 5분동안 세척한 뒤 바이오-세이프 쿠마시 염색 (coomassie stain) 용액 (Coomassie G250 Stain)(BioRad, USA)으로 상온에서 한 시간 반웅시켜 염색하였다. 그런 다음， 상기 젤을 증류수에 30분 동안 담가 탈염색 (destaining)하였다. 상기 젤로부터 염색된 단백질 밴드만 잘라내어， 75 mM 암모늄 바이카보네이트 (ammonium bicarbonate) (Sigma, USA) I 40% 에탄올 (Duksan, Korea) (1:1)로 다시 탈염색 (destainin)한 후， 젤 조각이 층분히 덮힐 정도로 5 mM DTT / 25 mM 암모늄 바이카보네이트 (ammonium bicarbonate) (Sigma, USA) 용액을 첨가하여 60 °C에서 30분 동안 반웅시켰다. 용액은 버리고, 젤 조각은 상온에 두어 온도를 낮추어 냉각시켰고， 젤의 알킨화 (alkylation)를 위해 55 mM의 요오드아세트아미드 (iodoacetamideXSigma, USA) 용액을 처리하여 상온에 30분 동안 반응시킨 다음， 상기 젤 조각을 100% ACN에 세척하여 건조시켰다. 상기 건조된 젤 조각을 20 rag/ 의 수정된 시퀀싱 그레이드 트립신 (modified sequencing grade trypsin) (Roche Applied Science)를 포함하는 25 mM 암모늄 바이카보네이트 버퍼 (ammonium bicarbonate buffer) 10 에 적신 다음， 37 °C에 밤새 반웅시켰다. 트립신 분해된 펩타이드 흔합물 (tryptic peptide mixure)을 젤과 함께 0.1% 포름산 (formic acid)(Junsei, Japan)에 흩려주었다. LC-MS/MS 분석은 NSI sources (San Jose, CA)7- 장착된 Thermo Finnigan's ProteomeX workstation LTQ linear IT MS (Thermo Electron, USA)을 이용해 수행하였다. 12 ^의 펩타이드 혼합물을 주입하고 펩타이드 트랩 카트리지 (peptide trap cartridge) (Agilent, USA)에 로딩한 다음， 그래디언트 일루션 (gradient elution)에 의해 컬럼으로 분리시켰다.
그 결과， 상기 4가지 종류의 폐암 세포주에서 정상 세포와는 달리 발현되는, 총 1,340종의 단백질을 검출할 수 있었다.
상기와 같이 검출된 총 1，340종의 단백질 중， 정상 허파 조직에서는 전혀 발현되지 않으면서 4가지 종류의 폐암에서 모두 발현되는 136개의 단백질을 선별하였다. 이후, Protein Atlas의 immunohistochemistry 등의 자료를 확인하여 136개의 단백질 중 막 단백질 16개를 확인하였다. 상기 16개 단백질의 구체적인 발현 위치를 PS0RTII 분석을 통해 확인하여， 세포 내막 (inner cell membrane) 등 치료 타겟 및 진단 마커로 이용되기 어려운 단백질을 제외하고, 암세포에서 발현량이 가장 많은 4 종의 단백질 AP00(Apolipoprotein 0), ATPlAKATPase, Na+/K+ transporting, alpha 1 polypeptide), CANX(calnexin) 및 DDOSTWolichyl- d i phosphoo 1 i gosacchar i de-pr ot e i n glycosyl transferase)-^ 최종적으로 선별하였다.
<1-3> AP00, ATP1A1, CANX및 DD0ST의 발현 특성 분석
상기 실시예 <1-2>에서 선별한 4개의 폐암 특이적 막 단백질, APOO, ATP1A1, CANX 및 DD0ST의 발현 특성 분석을 위하여， 웨스턴 블럿 (Western Blot), 유세포 분석 (FACS) 및 면역세포화학 분석 (immunocytochemistry)을 각각수행하였다.
<1-3-1>웨스턴 블¾ (Western Blot)
상기 실시예 <1-1>에서 수득한 막 단백질 시료를 전기영동하고， 상기 4 가지 단백질들에 대하여 웨스턴 블럿을 실시하였다. 세포주별로 소니케이션 (sonication) 방법으로 세포를 파쇄한 후, 원심분리기를 통해 막 단백질만을 10% SDS-PAGE로 분리하여， PVDF 막 (membrane) (Mi 111 ipore, Italy)으로 TE70X SEMI -DRY TRANSFER UNIT 14X16 CM(Hoef er , San Francisco USA)을 이용해 30V로 1시간동안 전사 (transfer)시켰다. 전사된 막 (membrane)에 1시간동안 5%스킴 밀크 (Skim Mi lk)로 차단 (blocking)한 후 1차 항체 (primary antibody)를 상온에 2시간 동안 반응시켰다. 상기 1차 항체는 Anti-AP00(Sigma, USA), Ant i-ATPlAKAbClon, Korea) Anti- CANX( sigma, USA), Ant i-DD0ST( Sigma, USA)를 사용하였다. 그 다음， 2차 항체 (secondary antibody)를 상온에서 2시간 동안 반웅시켰다. 상기 2차 항체는 Goat ant i -mouse IgG 및 Goat ant i -rabbit IgG(Ab frontier , Korea)를 사용하였다.
그 결과, 상기 4가지 단백질이 상기 4가지 종류의 폐암 세포주에서 특이적으로 발현됨을 확인하였다 (도 3).
<1-3-2>유세포 분석 (FACS)
상기 실시예 <1-1>에서 수득한 막 단백질 시료를 전기영동하고， 상기 4 가지 단백질들에 대하여 유세포 분석을 실시하였다. 보다 구체적으로， 세포주 별로 1차 항체를 상온에서 30분 동안 반응시켰다. 상기 1차 항체는 Ant i-AP00( Sigma, USA), Anti-ATPlAKAbClon, Korea), Ant i-CANX( Sigma, USA) 및 Ant i-DD0ST( Sigma, USA)를 사용하였다. 상기 1차 항체를 처리한 후, 2차 항체를 상온에서 30분 동안 반웅시켰고， 상기 2차 항체는 형광물질인 FITCCFluorescein isothiocyanate)가 결합되어 있는 Goat Anti- Mouse IgG(FITC) 및 Goat Ant i -rabbit I G(FITC)(Ab frontier, Seoul , Korea)를 사용하였다. 그런 다음， 유세포 분석기 BD FACSCal ibur(BD Biosciences, USA)를 이용해 유세포 분석을 실시하였다.
그 결과, 상기 4가지 단백질이 상기 4가지 종류의 폐암 세포주에서 세포 표면에 발현되고 세포막 밖에서 항체와 결합함올 알 수 있었다 (도 4 내지 도 7).
<1-3-3>면역세포화학 분석 (i画 unocytochemistry)
상기 .세포주 A549 (선암， adenocarcinoma), SK-MES-1(편평세포암, squamous cell carcinoma) 및 H460(대세포암, large cell carcinoma)를 대상으로 상기 4 가지 단백질들에 대하여 면역세포화학 분석을 실시하였다. 상기 4가지 세포주들에 대하여， Lab-Tek chamber Slide(Nunc, USA)을 이용하여 상온에서 3시간 동안 1차 항체를 처리하였고, 상기 1차 항체는 Ant i-AP00( Sigma, USA), Ant i-ATPlAl(AbC Ion, Korea ) , Ant i-CANX( Sigma, USA) 및 Ant i-DD0ST( Sigma, USA)를 이용하였다. 상기와 같이 1차 항체를 처리하고 난 뒤, 상온에서 30분 동안 2차 항체를 반응시켰다. 상기 2차 항체로는 horseradish peroxidase가 결합되어 있는 Goat ant i -mouse IgG 및 Goat ant i -rabbit IgG(Ab frontier, Korea)를 사용하였다. 그런 다음， VECTASTAIN Elite ABC kit (Vecter Laboratories, USA)을 이용해 DAB(3,3*- Diaminobenzidine) 발색 반웅을 관찰하였다.
그 결과， 상기 4가지 단백질이 상기 3 가지 종류의 폐암 세포주에서 세포 표면에 발현되고, 세포막 밖에서 항체와 결합함을 확인할 수 있었다 (도 8 내지 도 10).
항체를 이용한 이미지화
<1-4> 형광 표지
50 mM Na2HP04(PH 7.4) 내의 5 μ 1의 Anti-DDOST 항체 (Sigma, 단백질 농도 1 yg/ul)를 상온에서 4시간 등안 5 nmol/L의 DMS0에 용해한 40 nii l의 Cy5.5 NHS 에스터에 함께 배양하였다. 흔합물은 프리 Cy5.5를 제거하기 위해, 세파텍스 G50 컬럼 (Sigma, USA)으로 필터링 하였다. Cy5.5-표지 Anti-DDOST 항체 또는 토끼 IgG 대조구 샘플은 스특 용액으로 4°C로 유지하였다. Cy5.5 표지된 Anti-DDOST 항체 또는 IgG 샘플의 단백질 농도는 BCA단백질 분석에 의해 결정하였다.
<1-5> In vivo 이미지화
수컷 누드 마우스는 네 종류의 폐암 세포， A549 (선암 (adenocarcinoma) )， NCI-H460 비소세포성 폐 암종 (Non-small cell lung carcinoma)), NCI-H146 (소세포 폐암종 (Small cell lung carcinoma)) 및 SK-MES-1 (편평상피성 폐암종 (squamous cell lung carcinoma))를 누드 마우스의 등에 6군데 피하 주사하여 이식하였다.
그리고나서, 종양의 직경이 약 5 mm에 이르렀을 때 이미지화를 수행하였다. Cy5.5로 표지된 Anti-DDOST 항체와 Anti-Rabbit IgG 항체를 각각 1 ug/μΐ의 농도로 섞은 50μ1의 용액을 광학 이미지화 전에 마우스 꼬리 정맥을 통해 정맥 내로 주입하였다. 주사 후 30분, 1시간, 1.5시간， 3시간， 4.5시간， 24시간 경과 후 스펙트럼 형광 이미지화를 수행하였다. 항체가 종양을 특이적으로 표적할 수 있는지 확인하기 위하여 항체에 표지한 cy5.5를 이용하여 항체를 검출하고자 하였단. 이미지스테이션 (Kodak Image Station 400顧； Eastman Kodak Company , New Haven , CT)으로 마우스의 종양 부위를 이미지화 하였다. 각각의 종양은 1500， 800， 800， 400, 400, 및 300의 최소 레벨로 이미지화 하였다.
각각의 항체를 추사한 후 형광 이미지화한 결과를 도 11에 나타내었다. 상단의 6장의 사진은 Cy5.5ᅳ표지 Anti-DDOST 항체를 주사한 경우이며, 하단의 6장의 사진은 아이소타입 대조구를 주사한 경우를 나타낸다. 도 11에서 보는 바와 같이 대조구의 경우 주사 후 30분 이내에 체외로 배출되어 미량의 형광만이 방광부위에 남아있음을 알 수 있다. 반면에 항 -DD0ST 항체를 주사한 경우 등위에 자라는 폐암덩어리에 정확히 표지되었다. A549 이외 H460을 대상으로 한 실험에서도 유사한 결과를 얻을 수 있었다. 이로서 DD0ST를 타겟으로 하는 in vivo 이미지화가 가능하다는 결과를 도출하였다.
한편, 정맥 주사를 통해 구축한 이종이식 (xenograft)모델의 경우에 대하여도 동일한 실험을 수행하였다. 살아있는 상태에서의 이미징은 시그널이 약하여 관찰이 어려웠으나， 도 12에서 보는 바와 같이 조직을 적출하여 조직의 절편을 관찰해 보면 암조직 표면에 정확히 붙어 표지가 가능함을 알 수 있었다. 따라서 시그널이 강한 물질을 결합시킨다면 폐조직내에서의 in vivo이미지화도 층분히 가능하다는 결론을 도출하였다.
【실시예 2】
상기 실시예 <1-2>에서 선별한 4개의 폐암 특이적 막 단백질， AP00,
ATP1A1, CANX 및 DD0ST 폴리펩티드의 활성을 억제함으로써， 상기 폴리펩티드들에 대한 항체의 항암 약제로서의 적용 가능성올 확인하기 위하여， in vitro및 in vivo실험을 각각 수행하였다.
<2-1> in vitro에서의 항암 효과 확인
A549, SK-MES-1 및 H460 세포주에서 항체를 이용하여 AP00, CANX 및
DD0ST의 활성을 억제한 후， 상기 폐암 세포주의 성장이 억제되는지 여부를 확인하였다. 보다 상세하게는， 상기 3 세포주에 Anti-APCXXSigma, USA), Anti-CANX(Sigma, USA) 및 Ant i-DD0ST( Sigma, USA) 항체를 각각 연속적인 회석 (Serial dilution) 방법으로 처리하고, 상기 처리한 항체의 생성 동물종과 동일한 동물종에서 유래한 혈청 (rabbit serum) (Sigma, USA)을 첨가하여 항체의존성 세포매개성 세포독성 (Antibody-Dependent Cell- medicated Cytotoxicity, ADCC)을 유도하였다. 그런 다음， 상기 폐암 세포주에서 세포의 사멸 혹은 성장 억제 정도를 측정하였다.
그 결과， 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 상기 3 폐암 세포주에서 상기 AP00, CANX 및 DD0ST에 대한 항체의 농도에 비례하여 , 폐암 세포의 성장이 억제되는 것을 확인하였다.
상기와 같은 폐암 세포의 사멸 및 성장 억제 데이터로부터 세포의 반수치사농도 (LC50, lethal concentration 50%)를 측정하였다.
그 결과， A549 세포주의 경우， DDOST, CANX 및 AP00에 대하여 각각 0.77 ug/mt, 0.03 ug/mt 및 0.05 / ^의 농도로 항체를 처리하면 전체 세포의 성장을 반으로 억제 할 수 있는 것으로 나타났다 (도 13). 또한 H460 세포주의 경우， DDOST, C細 X 및 AP00에 대하여 반수치사농도가 각각 6.4 ug/mi, 0.07 g/mi> 및 0.05 //g/m로 나타났다 (도 14). 아을러, SK- MES-1 세포주의 경우, DDOST, CANX 및 AP00에 대하여 반수치사농도가 각각 7.9 fig/ mi, 0.06 g/mt 및 0.06 //g/i 로 나타났다 (도 15).
상기와 같은 결과로부터， 상기 4 종의 폴리펩티드
AP00(Apolipoprotein 0) , ATPlAKATPase, Na+/K+ transporting, alpha 1 polypeptide), CANX(calnexin) 및 DDOST (do lichyl- d i phosphoo 1 i gosacchar i de-pr ot e i n glycosyltransferase)가 폐암 치료의 표적이 될 수 있고, 상기 4 폴리펩티드에 대한 항체가 폐암을 치료할 수 있는 유효 성분으로서 작용 할 수 있음을 확인하였다.
<2-2> in vivo에서의 항암 효과 확인 1
누드마우스 (MARA, seoul , Korea)에 폐암 세포주인 A549 세포주를 피하주입하여 종양올 생성시켰다. 그런 다음， 항체 (Anti-DD0ST(Sigma, USA))를 dose 별 (100 iig 및 200 //g)로 두 차례 처리한 후， 종양의 부피를 측정하였다.
그 결과， 항체를 처리하지 않은 대조군에 비하여, 시간이 지날수록 처리 dose에 비례하여 종양의 성장이 억제됨을 확인하였다 (도 16).
상기와 같은 결과로부터, 상기 4 종의 폴리펩티드 APOCKApolipoprotein 0)， ATPlAKATPase, Na+/K+ transporting, alpha 1 polypeptide), CANX(calnexin) 및 DDOS dolichyl-diphospho oligosaccharide一 protein glycosyl transferase )7} 폐암 치료의 표적이 될 수 있고, 상기 4 폴리펩티드에 대한 항체가 폐암을 치료할 수 있는 유효 성분으로서 작용 할 수 있음을 확인하였다.
<2-3> in vivo에서의 항암 효과 확인 2
<2-3-1>폐암 피하 이종이식 모델 준비
피하 이종이식 모델을 위하여, A549 세포 (1X107/200 μΐ)를 BALB/c 누드 마우스의 등에 4-6군데 피하 주사하였다. 종양을 버니어 캘리퍼를 사용하여 일주일간 모니터링 하고 측정하였고, 그 부피는 식 "V= 1/2 X ( W2 X L )" 에 의해서 계산되었다 (상기 식에서 V는 종양 부피, W는 최소 직경 (diameter), L은 최대 직경을 나타낸다).
마우스는 5개의 처치 (treatment) 그룹으로 나누었다. A549 세포의 모델에서의 Anti-DDOST 항체 처치의 효능을 테스트하기 위하여， 종양 직경이 평균 약 5 mm 되었을때 처치를 시작하였다. Anti-DDOST 항체， 래빗 IgG 대조구 및 PBS-대조구를 일주일에 한번씩 총 2회 복강 내 주사하여 처치를 수행하였다.
<2-3-2> 면역조직화학 분석 (Immunohistochemistry)
DD0ST 단백질 발현은 파라핀-내장형의 IHC에 의해 입증되었다. 각각의 폐 조직 샘폴은 4μη! 두께로 구획화 하였고， 알코을의 시리얼 내에서 수화된 크실렌 (xylene) 내에서 디파라핀화되었다. 비특이적 결합은 차단되었고， 슬라이드는 4 °C에서 하루동안 Anti-DDOST 항체 (시그마 USA)와 함께 배양하였다. IHC 반웅은 3'3-디아미노벤지딘 (DAB)을 사용한 백타스테인 ABC 킷 (Vector Laboratories Inc., USA)으로써 수행하였다.
그 결과， 도 17에서 볼 수 있듯이 DD0ST에 대한 항체를 복강 주사한 경우 그렇지 않은 경우에 비하여 효과적으로 암세포의 생장을 억제하는 것을 볼 수 있었으며, 이러한 경향은 항체의 양에 비례하여 커짐을 확인하였다. 상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 예시적으로 설명하였으나， 본 발명의 범위는 상기와 같은 특정 실시예에만 한정되지 아니하며， 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 특허청구범위에 기재된 범주 내에서 적절하게 변경이 가능할 것이다.

Claims

【특허청구범위】
【청구항 1】
APOOCApo lipoprotein 0)， ATPlAKATPase, Na+/K+ transporting, alpha 1 polypeptide), CANX(calnexin) 및 DDOST (do lichyl- diphosphool igosaccharide -protein glycosyltransferase)로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머, 또는 APOO, ATP1A1, CANX 및 DD0ST로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 상보적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 폐암 진단용 조성물.
【청구항 2】
제 1항에 있어서， 상기 APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST의 폴리펩티드는 각각 서열번호 2， 서열번호 4， 서열번호 6 및 서열번호 8로 기재되는 것을 특징으로 하는 폐암 진단용 조성물.
[청구항 3】
제 1항에 있어서， 상기 항체 또는 앱타머는 발색효소, 형광물질 및 방사성 동위원소로 구성된 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 검출체로 태깅 (tagging)된 것을 특징으로 하는 폐암 진단용 조성물.
【청구항 4]
제 1항에 있어서， 상기 조성물은 비강 투여용인 것을 특징으로 하는 폐암 진단용 조성물.
【청구항 5】
APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머, 또는 APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 상보적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 폐암 진단용 키트.
【청구항 6】
제 5항에 있어서， 상기 APOO, ATP1A1, CANX 및 DD0ST의 폴리펩티드는 각각 서열번호 2， 서열번호 4， 서열번호 6 및 서열번호 8로 기재되는 것을 특징으로 하는 폐암 진단용 키트.
【청구항 7】
제 5항에 있어서， 상기 APOO, ATP1A1 , CANX 및 DD0ST의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 각각 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5 및 서열번호 7로 기재되는 것올 특징으로 하는 폐암 진단용 키트.
【청구항 8】
제 5항에 있어서， 상기 키트는 마이크로어레이 칩인 것을 특징으로 하는 폐암 진단용 키트.
【청구항 9】
하기의 단계를 포함하는 폐암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위한 폴리펩티드 검출방법:
(a) 피검체에 APOO, ATP1A1, CANX 및 DD0ST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 표적 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 투여하여 상기 표적 폴리펩티드에 결합시키는 단계; (b) 상기 단계 (a)의 표적 폴리펩티드에 결합된 항체 또는 앱타머의 양 및 위치를 측정함으로써 APOO, ATP1A1, CANX 및 DD0ST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리펩티드의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(c) 상기 단계 (b)에서 측정한 APOO, ATP1A1, CANX 및 DD0ST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리펩티드의 발현 수준이 대조군보다 증가된 피검체를 폐암에 걸릴 위험이 있는 개체로 판정하는 단계.
【청구항 10】
제 9항에 있어서, 상기 APOO, ATP1A1, CANX 및 DD0ST이 폴리펩티드는 각각 서열번호 2， 서열번호 4， 서열번호 6 및 서열번호 8로 기재되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 검출 방법.
【청구항 11】
제 9항에 있어서， 표적 폴리펩티드에 결합된 항체 또는 앱타머는 검출체로 태깅되어 있는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 검출방법.
【청구항 12】
제 11항에 있어서， 상기 검출체가 FTTC, RITC, 로다민 (rhodamine), 텍사스레드 (Texas Red), 플로레신 (fluorescein)， 피코에리트린 (phycoerythrin), 퀀팀닷 (quantum dots) 등과 같은 형광물질인 경우， 상기 표적 폴리펩티드에 결합된 항체 또는 앱타머의 양 및 위치는 형광단층촬영 (Fluorescence mediated tomography:FMT)으로 측정되는 것올 특징으로 하는 폴리펩티드 검출방법.
【청구항 13】
다음 단계를 포함하는 폐암 진단 방법:
(a) 피검체 유래 시료에서 APOO, ATP1A1, CANX 및 DD0ST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리펩티드의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(b) APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리펩티드의 발현 수준이 대조군보다 증가된 피검체를 폐암에 걸릴 위험이 있는 개체로 판정하는 단계.
【청구항 14]
제 13항에 있어서, 상기 APOO, ATP1A1, CANX 및 DDOST이 폴리펩티드는 각각 서열번호 2， 서열번호 4， 서열번호 6 및 서열번호 8로 기재되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 검출 방법.
【청구항 15】
제 13항에 있어서, 상기 폴리펩티드의 발현 수준은 면역침강법 (immunoprecipitation), 방사능면역분석법 (RIA) , 효소면역분석법 (ELISA)， 면역조직화학， RT-PCR, 웨스턴 블롯 (Western Blotting) 및 유세포 분석법 (FACS)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 방법으로 측정되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 검출 방법.
【청구항 16】
AP00, ATP1A1, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리펩티드의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 폐암 치료용 약학적 조성물.
【청구항 17】
제 16항에 있어서， 상기 AP00, ATP1A1, CANX 및 DDOST의 폴리펩티드는 각각 서열번호 2, 서열번호 4， 서열번호 6 및 서열번호 8로 기재되는 것을 특징으로 하는 폐암 치료용 약학적 조성물.
【청구항 18】
제 16항에 있어서, 상기 AP00, ATP1A1, CANX 및 DD0ST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리펩티드의 발현 억제제는 상기
AP00, ATP1A1, CANX 및 DD0ST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드， 짧은 헤어핀 RNA(shRNA) 및 작은 간섭 RNA(siR A)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 폐암 치료용 약학적 조성물.
【청구항 19】
제 16항에 있어서, 상기 AP00, ATP1A1, CANX 및 DD0ST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리펩티드의 활성 억제제는 상기
AP00, ATP1A1, CANX 및 DD0ST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리펩티드에 상보적으로 결합하는 앱타머， 항체 및 펩티드 미메틱스로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 폐암 치료용 약학적 조성물.
【청구항 20]
제 16항에 있어서, 상기 조성물은 비강 투여용인 것을 특징으로 하는 폐암 치료용 약학적 조성물.
【청구항 21]
AP0O, ATPIAI, CANX 및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드를 발현하는 세포주에 피검물질을 처리하는 단계;
상기 세포주에서 AP00, ATPIAI, CANX 및 DD0ST로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드의 발현 정도를 측정하는 단계; 및
상기 APOO, ATPIAI, CANX및 DDOST로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드의 발현 정도가 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소한 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는， 폐암 치료용 후보 물질의 스크리닝 방법 .
【청구항 22】
제 21항에 있어서, 상기 폴리펩티드의 발현 정도는 면역침강법 (immunoprecipitation), 방사능면역분석법 (RI A)， 효소면역분석법 (ELISA), 면역조직화학， RT-PCR, 웨스턴 블롯 (Western Blotting) 및 유세포 분석법 (FACS)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법 .
【청구항 23】
AP00, ATPIAI, CANX 및 DD0ST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리펩티드의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 조성물을 대상 (subject)에 투여하는 단계를 포함하는 폐암 치료 방법.
【청구항 24】
제 23항에 있어서， 상기 AP00, ATPIAI, CANX 및 DD0ST의 폴리펩티드는 각각 서열번호 2， 서열번호 4， 서열번호 6 및 서열번호 8로 기재되는 것을 특징으로 하는 폐암 치료 방법 .
【청구항 25】
제 23항에 있어서, 상기 AP00, ATPIAI, CANX 및 DD0ST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리펩티드의 발현 억제제는 상기 AP00, ATPIAI, CANX 및 DD0ST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 유전자의 m NA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드， 짧은 헤어핀 RNA(shRNA) 및 작은 간섭 RNA(siRNA)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 폐암 치료 방법 .
【청구항 26】
제 23항에 있어서， 상기 APOO, ATP1A1, CANX 및 DD0ST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리펩티드의 활성 억제제는 상기
APOO, ATP1A1, CANX 및 DD0ST로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리펩티드에 상보적으로 결합하는 앱타머, 항체 및 펩티드 미메틱스로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 폐암 치료 방법.
【청구항 27】
제 23항에 있어서, 상기 조성물을 대상에 투여하는 단계는
Figure imgf000037_0001
대상의 비강을 통해 투여하는 것을 특징으로 하는 폐암 치료 방법.
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