WO2013141092A1 - 癌転移マーカー及びそれを用いた癌転移の診断方法 - Google Patents
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- G01N2800/7014—(Neo)vascularisation - Angiogenesis
Definitions
- the present invention relates to a peptide that can be used as a marker in cancer metastasis, and a method for diagnosing cancer metastasis characterized by measuring the amount of the peptide in a test sample.
- cancer is the number one cause of death in Japan.
- the number of deaths was 304,286, the population was 100,000, the death rate was 241.5, and the total deaths were 31.0%.
- Cancer often metastasizes to other organs where it grows secondarily. Therefore, in addition to treating primary cancer, it is important in the treatment of cancer to detect and treat cancer metastasis early.
- Patent Document 1 discloses a malignant tumor using PICP, PINP or BALP and osteocalcin as a marker reflecting osteoblast activity, and deoxypyridinoline and / or ICTP as a marker reflecting osteoclast activity. A method for diagnosing bone metastasis is described.
- the inventors of the present invention have found a peptide having a molecular weight of about 5,800 that increases with time in serum from the onset of bone metastasis to the onset of treatment and the start of treatment by mass spectrometry using a protein chip and decreases by treatment, Furthermore, it is pointed out that the peptide may be a fragment of the neutrophil-derived heparin-binding protein azulocidin known as a monocyte chemotactic factor (Patent Document 2).
- fibrinogen a blood coagulation factor I
- fibrinogen-deficient mice it has been reported that the metastasis of cancer is significantly reduced (Non-patent Documents 2 and 3), and it is suggested that fibrinogen may play an important role in the process of metastasis of cancer.
- Non-patent Document 4 In gastric cancer patients, preoperative fibrinogen levels were not different from those in non-cancer patients in early cancer patients with few metastases, and were significantly higher in advanced cancers with high metastasis frequency (Non-patent Document 4), high fibrinogen It has been reported that sera are strongly correlated with lymph node metastasis and liver metastasis (Non-patent Document 5). From the above results, it is pointed out that hyperfibrinogenemia may form an environment in which hematogenous metastasis and lymphatic metastasis are easily established.
- Non-patent Document 6 Non-patent Document 6
- Reference 7 tumor thrombus formation associated with platelet aggregation via fibrinogen works in a protective manner against the immune mechanism of the host centering on natural killer cells
- Non-Patent Document 11 discloses a method for preventing metastasis of cancer cells from vascular endothelial cells.
- fibrinogen such as ICAM-1 expressed by the cancer cells themselves.
- the possibility of being reported has been reported (Non-Patent Document 11).
- Fibrinogen is actively involved in the process of cancer metastasis. Fibrinogen itself has no physiological activity such as blood coagulation activity, and it exhibits various physiological activities for the first time when it is decomposed by protease such as thrombin into various fragments in vivo. It is unclear whether the fragment is actually associated with cancer metastasis and plays a functional role.
- Patent Document 3 describes that a protein having a molecular weight of 5,900, which is a degradation product of human fibrinogen ⁇ -E chain, is useful as a marker for liver disease diagnosis.
- An object of the present invention is to provide a human cancer metastasis marker that enables early detection of metastasis of various cancers, and a method for early diagnosis of metastasis by measuring the amount of the marker in a biological sample of a cancer patient. Is to provide.
- the inventors of the present invention have developed a serum sample before and after the onset of metastasis in cancer patients by mass spectrometry using a protein chip that is effective in searching for disease markers including tumor markers.
- the proteome was analyzed over time.
- a peak with a molecular weight of about 5,800 which was previously identified as a bone metastasis marker, increased with time in the serum from the onset of bone metastasis to the onset of treatment and after the start of treatment, and decreased with treatment, was analyzed in detail.
- the peak was found to be a fragment of fibrinogen rather than the originally predicted fragment of azulocidin.
- this fibrinogen fragment is useful not only as a bone metastasis but also as a metastasis marker for various cancers. Further, it promotes metastasis of cancer cells by promoting angiogenesis and the like. It has been found that it has binding to new blood vessels and has led to the completion of the present invention.
- the present invention relates to the following.
- [1] A peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4.
- [2] An antibody against the peptide of [1].
- [3] A method for diagnosing metastasis in a cancer patient, comprising detecting the expression of the peptide of [1] in a biological sample derived from the patient.
- [4] The method of [3], wherein the biological sample is plasma or serum.
- the method of [3] or [4], wherein the peptide of [1] is detected using the antibody of [2].
- An angiogenesis promoter comprising any peptide selected from the following (1) to (3) or an expression vector capable of expressing the peptide: (1) a peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1; (2) a peptide comprising an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having angiogenesis promoting activity; and (3) 1 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
- a peptide comprising an amino acid sequence in which a plurality of amino acids are deleted, substituted, inserted or added, and having angiogenesis promoting activity.
- a cancer metastasis promoter comprising any peptide selected from the following (1) to (3) or an expression vector capable of expressing the peptide: (1) a peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1; (2) a peptide comprising an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having angiogenesis promoting activity; and (3) 1 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
- a peptide comprising an amino acid sequence in which a plurality of amino acids are deleted, substituted, inserted or added, and having angiogenesis promoting activity are deleted, substituted, inserted or added, and having angiogenesis promoting activity.
- a diagnostic imaging probe for detecting cancer tissue or accompanying neovascularization comprising any peptide selected from the following (1) to (3) or an expression vector capable of expressing the peptide: (1) a peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1; (2) a peptide comprising an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having angiogenesis promoting activity; and (3) 1 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
- a peptide comprising an amino acid sequence in which a plurality of amino acids are deleted, substituted, inserted or added, and having angiogenesis promoting activity comprising any peptide selected from the following (1) to (3) or an expression vector capable of expressing the peptide: (1) a peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1; (2) a peptide comprising an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having angiogenesis promoting activity; and (3) 1 in the amino acid
- RNA interference-inducing RNA or antisense nucleic acid that specifically suppresses the expression of any peptide selected from the following (1) to (3), or an expression vector that expresses these nucleic acids, or
- a cancer metastasis suppressor comprising an antibody that specifically recognizes any peptide selected from (3) to (3) and inhibits its angiogenesis promoting activity function: (1) a peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1; (2) a peptide comprising an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having angiogenesis promoting activity; and (3) 1 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
- a peptide comprising an amino acid sequence in which a plurality of amino acids are deleted, substituted, inserted or added, and having angiogenesis promoting activity.
- Angiogenesis in the mammal comprising administering to the mammal an effective amount of any peptide selected from the following (1) to (3) or an expression vector capable of expressing the peptide: Promotion method: (1) a peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1; (2) a peptide comprising an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having angiogenesis promoting activity; and (3) 1 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
- a peptide comprising an amino acid sequence in which a plurality of amino acids are deleted, substituted, inserted or added, and having angiogenesis promoting activity.
- administering comprising administering to a non-human mammal containing cancer cells an effective amount of any peptide selected from the following (1) to (3) or an expression vector capable of expressing the peptide:
- Methods for promoting cancer metastasis in the non-human mammal (1) a peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1; (2) a peptide comprising an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having angiogenesis promoting activity; and (3) 1 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
- a peptide comprising an amino acid sequence in which a plurality of amino acids are deleted, substituted, inserted or added, and having angiogenesis promoting activity.
- a peptide selected from the following (1) to (3) or an expression vector capable of expressing the peptide is administered to a test mammal, and the peptide in vivo of the mammal is administered
- a method for detecting cancerous tissue or accompanying neovascularization in the mammal by imaging comprising imaging the localization of (1) a peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1; (2) a peptide comprising an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having angiogenesis promoting activity; and (3) 1 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
- a peptide comprising an amino acid sequence in which a plurality of amino acids are deleted, substituted, inserted or added, and having angiogenesis promoting activity.
- RNA interference-inducing RNA or antisense nucleic acid that specifically suppresses expression of any peptide selected from the following (1) to (3) to mammals, or expression that expresses these nucleic acids
- Administration of a vector, or an antibody that specifically recognizes any peptide selected from (1) to (3) and inhibits its angiogenesis-promoting activity function Suppression method: (1) a peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1; (2) a peptide comprising an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having angiogenesis promoting activity; and (3) 1 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
- a peptide comprising an amino acid sequence in which a plurality of amino acids are deleted, substituted, inserted or added, and having angiogenesis promoting activity.
- a peptide comprising an amino acid sequence in which a plurality of amino acids are deleted, substituted, inserted or added, and having angiogenesis promoting activity.
- a peptide comprising an amino acid sequence in which a plurality of amino acids are deleted, substituted, inserted or added, and having angiogenesis promoting activity.
- RNA interference-inducing RNA or antisense nucleic acid that specifically suppresses the expression of any peptide selected from the following (1) to (3) for use in suppressing cancer metastasis, or these
- An expression vector that expresses a nucleic acid, or an antibody that specifically recognizes any peptide selected from (1) to (3) and inhibits its angiogenesis promoting activity function (1) a peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1; (2) a peptide comprising an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having angiogenesis promoting activity; and (3) 1 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
- a peptide comprising an amino acid sequence in which a plurality of amino acids are deleted, substituted, inserted or added, and having angiogenesis promoting activity
- the serum level begins to increase from a period earlier than the time when the symptoms of metastasis become apparent, so that early detection and early prevention of metastasis are possible. Moreover, since analysis can be performed from a small amount of patient serum, the burden on the patient is small. Furthermore, the metastasis peptide of the present invention is useful as an angiogenesis promoter, and can be used for screening an inhibitor of angiogenesis related to cancer metastasis.
- the bottom spectrum is the one at the time when the diagnosis of metastasis was confirmed by MRI, but since that time, an increase in the peak at the position of molecular weight 5,813 was observed.
- a peak with a molecular weight of 5,813 was observed.
- the bottom spectrum is the one at the time when the diagnosis of metastasis was confirmed by MRI, but since that time, an increase in the peak at the position of molecular weight 5,813 was observed.
- Target peak confirmation by SELDI CM10, pH 6
- Each fraction of the anion exchange column was analyzed by SELDI.
- Target peak confirmation by SELDI NP20.
- Each fraction of the cation exchange column was analyzed by SELDI.
- Each fraction of the cation exchange column was analyzed by SELDI.
- Target peaks were confirmed by SELDI using various protein chips (reused NP20, NP20, CM10, IMAC30). Reverse phase HPLC chromatogram.
- Reverse phase HPLC chromatogram (enlarged). Target peak confirmation by SELDI (NP20). Each fraction of reverse phase HPLC was analyzed by SELDI. Chromatogram of reverse phase HPLC (rechromatography). Chromatogram (enlarged) of reverse phase HPLC (rechromatography). Target peak confirmation by SELDI (NP20). Each fraction of reverse phase HPLC (rechromatography) was analyzed by SELDI. Normal phase HPLC chromatogram. Normal phase HPLC chromatogram (enlarged). Target peak confirmation by SELDI (NP20). Each fraction of normal phase HPLC was analyzed by SELDI. Reverse phase HPLC chromatogram. Target peak confirmation by SELDI (NP20). Each fraction of reverse phase HPLC was analyzed by SELDI.
- Immunohistochemically stained images of H460 human lung cancer cells treated with peptide A Observed with a confocal laser microscope.
- Primary antibodies rabbit anti-peptide A polyclonal antibody and mouse anti-human VEGF monoclonal antibody.
- Secondary antibodies AlexaFluor-555 Goat-anti-Rabbit IgG (red) and AlexaFluor-488 Goat-anti-Mouse IgG (green).
- VEGF green
- peptide A red
- Immunohistochemical staining image of HNNG human osteosarcoma cells treated with peptide A Observed with a confocal laser microscope.
- Primary antibodies rabbit anti-peptide A polyclonal antibody, mouse anti-human VEGF monoclonal antibody, and mouse anti-human nuclear antibody. Secondary antibodies: AlexaFluor-555 Goat-anti-Rabbit IgG (red), AlexaFluor-350 Goat-anti-Mouse-Ig-G (blue) and AlexaFluor-488 Goat-anti-Mouse-Ig-G (green).
- VEGF green
- peptide A red
- Fluorescent in vivo image showing metastasis of GFP-introduced HNNG cells to head, kidney and spine.
- Fibrinogen expression in human liver cancer In situ hybridization
- Fibrinogen expression in human liver cancer In situ hybridization
- CD51 + CD61 was stained with alexaFlour (green) and the nucleus was stained with DAPI (blue).
- Confocal laser micrograph showing the expression of CD51 + CD61 in human cancer tissue (immunohistological staining).
- CD51 + CD61 was stained with alexaFlour (green) and the nucleus was stained with DAPI (blue).
- p21 was stained with alexaFlour (green) and the nucleus was stained with DAPI (blue).
- Expression of FGA mRNA, p21 protein, and CD51 + CD61 protein in human cancer tissue The expression suppression of the peptide A by shRNA is shown.
- the effect of shRNA against peptide A on cancer cell marker expression is shown. From the left, three bars indicate PSA (ng / ml) of human prostate cancer cells, CEA of human colon cancer cells, and ErbB2 of human breast cancer cells, respectively.
- PSA ng / ml
- CEA human colon cancer cells
- ErbB2 human breast cancer cells
- the antitumor effect of the antibody with respect to peptide A is shown.
- mouth is shown.
- An immunohistochemical staining image of cancer metastasis tissue is shown.
- the present invention provides peptides useful as human cancer metastasis markers, angiogenesis promoters, and the like.
- the peptide (hereinafter sometimes referred to as “the peptide of the present invention”) (1) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1; (2) an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1; or (3) one or more amino acids deleted, substituted, or inserted in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 Or an added amino acid sequence.
- the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 corresponds to a fragment at positions 582 to 621 of the human fibrinogen ⁇ -E chain (SEQ ID NO: 3).
- SEQ ID NO: 3 The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3.
- SEQ ID NO: 3 the existence of a fragment of the human fibrinogen ⁇ -E chain consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 has not been known so far, and is a novel peptide.
- amino acid sequence contained in the peptide of (2) above has 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. It has an amino acid sequence.
- identity refers to an optimal alignment when two amino acid sequences are aligned using a mathematical algorithm known in the art (preferably, the algorithm uses a sequence of sequences for optimal alignment). The ratio of the same amino acid residue to the total overlapping amino acid residues (in which one or both of the gaps can be considered).
- NCBI BLAST-2 National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool
- matrix BLOSUM62
- expected value 10
- filtering ON
- the algorithm for determining amino acid sequence identity for example, the algorithm described in Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877 (1993) [the algorithm is NBLAST and XBLAST (Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402 (1997))], Needleman et al., J. Mol.
- the amino acid sequence contained in the peptide of (3) above is an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, for example, (1) SEQ ID NO: 1 An amino acid sequence in which one or more (preferably 1 to 10, preferably 1 to several (2 to 5)) amino acids are deleted from the amino acid sequence shown in (2), and (2) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 1 or more (preferably 1 to 10, more preferably 1 to several (2 to 5)) amino acid sequences, and (3) one or more amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 1 ( Preferably, an amino acid sequence into which 1 to 10, more preferably 1 to several (2 to 5) amino acids are inserted, (4) one or more (preferably 1 to 1) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 10 or more An amino acid sequence in which 1 to several (2 to 5) amino acids are substituted with other amino acids, or (5) an amino acid sequence in which the mutations (1) to (4) above are combined (in this case, the
- the peptide of the present invention has angiogenesis promoting activity.
- the angiogenesis promoting activity includes an activity that causes angiogenesis from an angiogenesis-free state (angiogenesis-inducing activity) and an activity that enhances angiogenesis that already exists (angiogenesis-promoting activity).
- angiogenesis-promoting activity the peptide to be evaluated is injected into chick sperm eggs, incubated under conditions that allow embryos to develop, embryos are collected before hatching, and control group (peptide non-injection group) It can be determined by evaluating whether or not the formation of new blood vessels is enhanced.
- the peptide of the present invention may contain a tag for facilitating the detection and purification of the peptide.
- Tags include Flag tag, histidine tag, c-Myc tag, HA tag, AU1 tag, GST tag, MBP tag, fluorescent protein tag (eg GFP, YFP, RFP, CFP, BFP, etc.), immunoglobulin Fc tag, etc. I can list them.
- the position of the additional sequence is not particularly limited as long as it does not impair the angiogenesis promoting activity of the peptide of the present invention, but is preferably the terminal (N-terminal or C-terminal) of the peptide.
- the length of the peptide of the present invention is not particularly limited as long as it has angiogenesis promoting activity, but is usually 1000 amino acids or less, preferably 500 amino acids or less, 100 amino acids or less, 80 amino acids or less, 70 amino acids or less, 60 amino acids or less, 55 amino acids. 54 amino acids or less, 53 amino acids or less, 52 amino acids or less, 51 amino acids or less, 50 amino acids or less, 49 amino acids or less, 48 amino acids or less, 47 amino acids or less, 46 amino acids or less, 45 amino acids or less, 44 amino acids or less, 43 amino acids or less, 42 amino acids or less, 41 amino acids or less, or 40 amino acids or less.
- the peptide of the present invention most preferably comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
- the length of the peptide is preferably 53 amino acids or less.
- a peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 a partial sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, and represented by SEQ ID NO: 1
- a peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 a peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5.
- the peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 is referred to as “peptide 1 of the present invention”.
- the present invention also provides a method for diagnosing metastasis in a patient by using the peptide 1 of the present invention as a metastasis marker and detecting its expression in a biological sample derived from a cancer patient.
- diagnosis of metastasis includes not only determining whether metastasis has already occurred, but also including determining whether metastasis has not yet occurred but is likely to occur in the near future. Used in.
- the method is applicable to humans suffering from any cancer that can cause metastasis (eg, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, thyroid cancer, kidney cancer, stomach cancer, liver cancer, uterine cancer, colon cancer, skin cancer, etc.). In particular, it is preferably applied to breast cancer, liver cancer, stomach cancer, and skin cancer patients. There are no limitations on the age, sex, etc. of the patient.
- the diagnostic method of the present invention can be applied to metastasis to any tissue (eg, bone, bone marrow, lymph node, lung, liver, skin, brain, etc.) that can become a metastatic focus.
- tissue eg, bone, bone marrow, lymph node, lung, liver, skin, brain, etc.
- the patient-derived biological sample to be the test sample is not particularly limited, but is preferably one that is less invasive to the patient, for example, blood, serum, plasma, saliva, mucous membrane, tears, etc. secreted from a person And those collected from a biopsy.
- the peptide of the present invention to be detected has a molecular weight of about 5,800, a high molecular weight protein fraction or the like can be separated and removed in advance using a spin column or the like, if necessary.
- the detection target is mRNA encoding the peptide of the present invention
- total RNA or poly (A) + RNA fraction is extracted and purified from the collected blood using a conventional method. May be.
- the expression of the peptide 1 of the present invention in a biological sample can be examined by detecting the peptide or mRNA encoding the peptide using a conventionally known method.
- a cation exchanger means an ion exchanger having a negatively charged group and trapping a cation.
- a strong cation exchanger for example, propyl sulfonic acid, benzene sulfonic acid, etc.
- Insoluble carriers having a base structure such as styrene or acrylic based
- weak cation exchangers for example, styrene or acrylic based structures having a carboxymethyl group, carboxyethyl group or the like as a functional group
- Insoluble carrier any exchanger may be used and is not particularly limited, but a weak cation exchanger is preferably used.
- the washing can be performed using water or a buffer solution.
- the pH is used in accordance with the isoelectric point of the target marker of each sample, and therefore, the Tris-HCl buffer solution and the phosphate buffer solution having a pH of 4 to 8 are used. Borate buffer solution, acetate buffer solution and the like are used.
- Detection of a peptide having a molecular weight of about 5,800 from a component bound to the cation exchanger is performed by, for example, adding an eluent (eg, 100 to 1000 mM sodium chloride aqueous solution) while changing the salt concentration to the cation exchanger. After eluting the adsorbed components and concentrating as necessary, the eluate is subjected to various molecular weight measurement methods, such as gel electrophoresis and various separation and purification methods (eg, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, affinity chromatography).
- an eluent eg, 100 to 1000 mM sodium chloride aqueous solution
- the eluate is subjected to various molecular weight measurement methods, such as gel electrophoresis and various separation and purification methods (eg, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, affinity chromatography).
- Mass spectrometer eg, double-focusing mass spectrometer, quadrupole analyzer, flight time
- Mass spectrometer a Fourier transform mass spectrometer, an ion cyclotron mass spectrometer
- the molecular weight of about 5,800 takes into account the error range of each measurement method.
- the molecular weight is 5,813 ⁇ 0.5% (preferably ⁇ 0.3%). More preferably, the peak intensity appearing at a position of ⁇ 0.1%) is measured.
- a combination of cation exchange chromatography and time-of-flight mass spectrometry is used as a most preferable measurement method.
- TOF-MS time-of-flight mass spectrometry
- a weak cation exchanger is particularly preferable.
- probes compatible with a time-of-flight mass spectrometer having a weak cation exchanger immobilized on the surface include CM10 or WCX2 ProteinChip Array (model number: C553-0075 or C553-0026) manufactured by Cyphergen Biosystems, Inc. ) And the like, but is not limited thereto.
- the washing can be performed at room temperature or the like using the buffer solution described above.
- Mass spectrometry is preferably performed by a MALDI method using a suitable matrix (MALDI-TOFMS).
- matrix molecules used include sinapinic acid (SPA), saturated 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB), and indole acrylic. Examples include acid (IAA) and cinnamic acid.
- the peak of the peptide having a molecular weight of about 5,800 may contain an azulocidin fragment (WO 2006/036002).
- ProFound search of the peak http://prowl.rockefeller.edu/profound_bin/WebProFound.exe
- peptide mass fingerprinting were performed, and it was confirmed by amino acid sequencing that the peak was derived from the fibrinogen fragment that is peptide 1 of the present invention. It is preferable to confirm or separate the peptide 1 of the present invention from the azulocidin fragment and then measure the peak of the peptide of the present invention.
- the detection of the peptide 1 of the present invention in the diagnostic method of the present invention can also be performed using an antibody against the peptide.
- the antibody against peptide 1 of the present invention can be prepared, for example, by isolating and purifying peptide 1 of the present invention from a biological sample derived from a cancer patient that expresses the peptide 1, and immunizing an animal using the peptide as an antigen. it can.
- the peptide is partially digested with peptidase or the like, the amino acid sequence of the obtained fragment is determined by the Edman method or the like, and the nucleic acid encoding the peptide based on the sequence A hybridizing oligonucleotide is synthesized, and using this as a probe, cDNA encoding the peptide is obtained by hybridization using the patient-derived cDNA library as a template, or RNA from the patient is used as a template using the oligonucleotide as a primer.
- RT-PCR is performed to obtain cDNA encoding the peptide
- the cDNA is incorporated into an appropriate expression vector, introduced into an appropriate host cell, and the resulting transformant is cultured to produce a recombinant peptide.
- peptide 1 of the present invention It can be prepared in quantity.
- the peptide 1 of the present invention can be obtained using a cell-free transcription / translation system using the cDNA obtained as described above as a template.
- the amino acid sequence of the peptide 1 of the present invention is directly identified by using the tandem mass spectrometry (MS / MS) method. Based on this, all or a part of the peptide can be synthesized and used as an antigen (hapten).
- the peptide identification method using the MS / MS method includes a de nov sequencing method for analyzing an MS / MS spectrum and determining an amino acid sequence, and partial sequence information (mass tag) included in the MS / MS spectrum.
- a database search using the method for identifying peptides and the like can be mentioned.
- peptide 1 of the present invention is a fragment of human fibrinogen ⁇ -E chain, and its amino acid sequence is SEQ ID NO: 4. Therefore, the antibody against peptide 1 of the present invention can be synthesized, for example, by synthesizing a peptide consisting of all or part of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 using a known peptide synthesis method based on the amino acid sequence information.
- the isolated human fibrinogen ⁇ -E chain may be cleaved with an appropriate peptidase or the like to obtain a peptide fragment containing all or part of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 and prepared as an immunogen. desirable.
- the antibody against peptide 1 of the present invention may be either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, and can be prepared by a known immunological technique.
- the antibody includes not only a complete antibody molecule but also a fragment thereof, and examples thereof include Fab, F (ab ') 2, ScFv, minibody and the like.
- the polyclonal antibody is cross-linked to a carrier protein such as bovine serum albumin or KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin) prepared by any one of the above methods or other methods.
- a commercially available adjuvant for example, complete or incomplete Freund's adjuvant
- the antibody titer of the collected blood serum is measured by a known antigen-antibody reaction and the increase is confirmed), and can be obtained by collecting whole blood about 3 to about 10 days after the final immunization and purifying the antiserum.
- animals to which the antigen is administered include mammals such as rats, mice, rabbits, goats, guinea pigs, and hamsters.
- Monoclonal antibodies can also be produced by cell fusion methods (for example, Takeshi Watanabe, principles of cell fusion methods and preparation of monoclonal antibodies, Akira Taniuchi, Toshitada Takahashi, “Monoclonal antibodies and cancer-basic and clinical”, 2-14). Page, Science Forum Publishing, 1985).
- the peptide of the present invention or a partial peptide thereof is administered subcutaneously or intraperitoneally to a mouse 2-4 times together with a commercially available adjuvant, and the spleen or lymph node is collected about 3 days after the final administration, and white blood cells are collected.
- This leukocyte and myeloma cells are fused to obtain a hybridoma that produces a monoclonal antibody against the peptide.
- Cell fusion was performed by the PEG method [J. Immunol. Methods, 81 (2): 223-228 (1985)] or the voltage pulse method [Hybridoma, 7 (6): 627-633 (1988)].
- a hybridoma producing a desired monoclonal antibody can be selected by detecting an antibody that specifically binds to an antigen from the culture supernatant using a well-known EIA or RIA method.
- Culture of hybridomas producing monoclonal antibodies can be performed in vitro or in vivo, such as mouse or rat, or preferably mouse ascites, and antibodies can be obtained from the culture supernatant of the hybridoma and the ascites of the animal, respectively. .
- the diagnostic method of the present invention using the antibody of the present invention is not particularly limited, and the amount of antibody, antigen or antibody-antigen complex corresponding to the amount of antigen in the test sample is determined by chemical or physical means. Any measurement method may be used as long as it is a measurement method that is detected from the above and calculated from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen. For example, nephrometry, competition method, immunometric method and sandwich method are preferably used.
- a labeling agent used in a measurement method using a labeling substance for example, a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance, or the like is used.
- the radioisotope for example, [ 125 I], [ 131 I], [ 3 H], [ 14 C] and the like are used.
- the enzyme is preferably stable and has a large specific activity.
- ⁇ -galactosidase, ⁇ -glucosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase and the like are used.
- the fluorescent substance for example, fluorescamine, fluorescein isothiocyanate and the like are used.
- luminescent substance for example, luminol, luminol derivatives, luciferin, lucigenin and the like are used.
- a biotin-avidin system can also be used for binding of an antibody or antigen and a labeling agent.
- the carrier include insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose, synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon, or glass.
- a test sample is reacted with an insolubilized antibody of the present invention (primary reaction), and another labeled antibody of the present invention is reacted (secondary reaction), followed by labeling on an insolubilized carrier.
- primary reaction an insolubilized antibody of the present invention
- secondary reaction another labeled antibody of the present invention
- an insolubilized carrier By measuring the amount (activity) of the agent, the amount of the peptide of the present invention in the test sample can be quantified.
- the primary reaction and the secondary reaction may be performed in the reverse order, or may be performed simultaneously or at different times.
- the monoclonal antibody against peptide 1 of the present invention can also be used in measurement systems other than the sandwich method, such as competition method, immunometric method or nephrometry.
- the antigen in the test sample and the labeled antigen are reacted competitively with the antibody, and then the unreacted labeled antigen (F) and the labeled antigen (B) bound to the antibody are separated. (B / F separation), the amount of labeled B or F is measured, and the amount of antigen in the test sample is quantified.
- a soluble antibody is used as an antibody
- B / F separation is performed using polyethylene glycol
- a liquid phase method using a second antibody against the antibody and a solid-phased antibody is used as the first antibody
- a soluble method is used, and a solid phase method using a solid phase antibody as the second antibody is used.
- the antigen of the test sample and the immobilized antigen are subjected to a competitive reaction with a certain amount of labeled antibody, and then the solid phase and the liquid phase are separated, or the antigen in the test sample is separated from the antigen. After reacting with an excess amount of labeled antibody and then adding a solid phased antigen to bind unreacted labeled antibody to the solid phase, the solid phase and the liquid phase are separated. Next, the amount of label in any phase is measured to quantify the amount of antigen in the test sample.
- nephrometry the amount of insoluble precipitate produced as a result of antigen-antibody reaction in gel or solution is measured.
- Laser nephrometry using laser scattering is preferably used even when the amount of antigen in the test sample is small and only a small amount of precipitate is obtained.
- special conditions, operations and the like are not required to be set. What is necessary is just to construct
- the antibody is immobilized on the surface of a probe that can be adapted to a mass spectrometer as described above, and a test sample is applied to the antibody on the probe.
- a test sample is applied to the antibody on the probe. Examples include a method of detecting a peptide peak having a molecular weight of about 5,800 by contacting the sample and subjecting the biological sample component captured by the antibody to mass spectrometry.
- the signal derived from the azulocidin fragment is excluded from the peak of the peptide having a molecular weight of about 5,800, and only the signal derived from the peptide of the present invention can be specifically and accurately quantified.
- the expression of the peptide 1 of the present invention in a biological sample is expressed by mRNA encoding the peptide (that is, mRNA encoding human fibrinogen ⁇ -E chain that produces the peptide upon degradation, specifically, A nucleic acid (probe) that can hybridize under stringent conditions with the mRNA, or a primer that amplifies a part or all of the mRNA when detecting by detecting the RNA comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2)
- a nucleic acid (probe) that can hybridize under stringent conditions with the mRNA, or a primer that amplifies a part or all of the mRNA when detecting by detecting the RNA comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2)
- the nucleic acid used as a probe may be DNA or RNA, or may be a DNA /
- the nucleic acid may be double-stranded or single-stranded. In the case of a double strand, it may be a double-stranded DNA, a double-stranded RNA or a DNA: RNA hybrid.
- the length of the nucleic acid is not particularly limited as long as it can specifically hybridize with the target mRNA, and is, for example, about 15 bases or more, preferably about 30 bases or more.
- the nucleic acid is preferably labeled with a labeling agent in order to enable detection and quantification of the target mRNA.
- a labeling agent for example, a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance, or the like is used.
- radioisotope for example, [ 32 P], [ 3 H], [ 14 C] and the like are used.
- enzyme those which are stable and have high specific activity are preferable.
- ⁇ -galactosidase, ⁇ -glucosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase and the like are used.
- fluorescent substance for example, fluorescamine, fluorescein isothiocyanate and the like are used.
- luminescent substance for example, luminol, luminol derivatives, luciferin, lucigenin and the like are used.
- biotin- (strept) avidin can also be used for binding between the probe and the labeling agent.
- the set of oligonucleotides used as primers may specifically hybridize with the base sequence (sense strand) of mRNA encoding human fibrinogen ⁇ -E chain and the complementary base sequence (antisense strand), respectively.
- base sequence sense strand
- antisense strand complementary base sequence
- RT-PCR is a method in which a known amount of another template nucleic acid that can be amplified by a set of primers that can amplify a target DNA is allowed to coexist in a reaction solution as a competitor to cause an amplification reaction competitively.
- an amplification product that is amplified by the primer set and can be distinguished from the target DNA for example, an amplification product having a different size from the target DNA, a restriction enzyme
- Nucleic acids that produce amplification products that exhibit different electrophoretic patterns upon treatment can be further included.
- the competitor nucleic acid may be DNA or RNA.
- cDNA may be synthesized from an RNA sample by reverse transcription reaction, and then a comparator may be added to perform PCR.
- RT-PCR can be performed by adding it to the RNA sample from the beginning. In the latter case, since the efficiency of the reverse transcription reaction is taken into consideration, the absolute amount of the original mRNA can be estimated.
- RT-PCR can monitor the amount of PCR amplification in real time, electrophoresis is not required, and gene expression of the peptide of the present invention can be analyzed more quickly. Usually, monitoring is performed using various fluorescent reagents.
- a nucleic acid that can be used as the probe in addition to a reagent (intercalator) that emits fluorescence by binding to double-stranded DNA such as SYBRGreen I, ethidium bromide, etc., a nucleic acid that can be used as the probe (provided that the nucleic acid is within the amplification region)
- a fluorescent substance eg, FAM, HEX, TET, FITC, etc.
- a quencher eg, TAMRA, DABCYL, etc.
- the nucleic acid used as the probe may be a cDNA encoding human fibrinogen ⁇ -E chain or a DNA encoding a fragment thereof (for example, the peptide shown in SEQ ID NO: 4), or its base sequence information (SEQ ID NO: 2). Based on the above), it may be obtained by chemical synthesis using a commercially available DNA / RNA automatic synthesizer or the like.
- the oligonucleotide set used as the primer is chemically synthesized using a commercially available DNA / RNA automatic synthesizer or the like based on the base sequence information. Can be obtained by:
- the diagnostic method of the present invention is preferably carried out by collecting biological samples from cancer patients in time series and examining the time course of the expression of the peptide of the present invention in each sample.
- the collection interval of the biological sample is not particularly limited, but considering the purpose of the present invention of early detection of metastasis, it is desirable to sample as frequently as possible within a range that does not impair the patient's QOL.
- blood serum, plasma
- the expression of the peptide 1 of the present invention is examined as described above, and when the expression of the peptide increases with time, it is determined that metastasis has occurred or is likely to occur in the near future. can do.
- the expression of peptide 1 of the present invention shows a decreasing tendency when the treatment for metastasis is effective after the onset of metastasis. Therefore, the diagnostic method of the present invention can also be used for early determination of the therapeutic effect in patients after the onset of metastasis. For example, when the expression of peptide 1 of the present invention does not decrease or continues to increase even after a certain period of time has elapsed since the start of treatment for metastasis, it can be determined that a change in treatment plan or the like should be considered.
- the increase in the expression of peptide 1 of the present invention was observed before metastasis actually occurred, and when preventive measures against metastasis were taken, the expression of the peptide 1 of the present invention was continuously monitored for the prevention effect. Success or failure can also be determined.
- the peptide of the present invention has angiogenesis promoting activity
- the peptide of the present invention and an expression vector capable of expressing it are useful as an angiogenesis promoter. That is, the present invention provides an angiogenesis promoter comprising the peptide of the present invention or an expression vector capable of expressing the peptide.
- angiogenesis promoting amount of the peptide of the present invention or an expression vector capable of expression can be promoted.
- a polynucleotide preferably DNA
- a nucleotide sequence encoding the above peptide exhibits promoter activity in the cell of a mammal (preferably human) to be administered. Functionally linked to a possible promoter.
- the promoter used is not particularly limited as long as it can function in mammalian cells to be administered.
- a pol I promoter, pol II promoter, pol III promoter, or the like can be used as the promoter.
- SV40-derived early promoter, viral promoter such as cytomegalovirus LTR, mammalian constituent protein gene promoter such as ⁇ -actin gene promoter, and RNA promoter such as tRNA promoter are used.
- the expression vector contains a transcription termination signal, that is, a terminator region downstream of the above-described polynucleotide. Furthermore, a selection marker gene for selecting transformed cells (a gene that imparts resistance to drugs such as tetracycline, ampicillin, and kanamycin, a gene that complements an auxotrophic mutation, and the like) can be further contained.
- the type of vector used for the expression vector in the present invention is not particularly limited, and examples of suitable vectors for administration to mammals such as humans include viral vectors such as retroviruses, adenoviruses, and adeno-associated viruses.
- viral vectors such as retroviruses, adenoviruses, and adeno-associated viruses.
- adenovirus has advantages such as extremely high gene transfer efficiency and can be introduced into non-dividing cells.
- gene expression is transient and usually lasts only about 4 weeks.
- it is also possible to use adeno-associated virus that has relatively high gene transfer efficiency can be introduced into non-dividing cells, and can be integrated into the chromosome via an inverted terminal repeat (ITR). Also preferred.
- ITR inverted terminal repeat
- the angiogenesis-promoting agent of the present invention can contain an arbitrary carrier, for example, a pharmaceutically acceptable carrier, in addition to an angiogenesis-promoting amount of the peptide of the present invention or an expression vector capable of expressing the peptide.
- Examples of pharmaceutically acceptable carriers include excipients such as sucrose and starch, binders such as cellulose and methylcellulose, disintegrants such as starch and carboxymethylcellulose, lubricants such as magnesium stearate and aerosil, citric acid, Fragrances such as menthol, preservatives such as sodium benzoate and sodium bisulfite, stabilizers such as citric acid and sodium citrate, suspensions such as methylcellulose and polyvinylpyrrolide, dispersants such as surfactants, water, Although diluents, such as physiological saline, base wax, etc. are mentioned, it is not limited to them.
- the angiogenesis promoter of the present invention can further contain a nucleic acid introduction reagent.
- a viral vector particularly a retroviral vector, retronectin, fibronectin, polybrene, or the like can be used as a gene introduction reagent.
- the polynucleotide is incorporated into a plasmid vector, lipofectin, lipfectamine, DOGS (transfectum), DOPE, DOTAP, DDAB, DHDEAB, HDEAB, polybrene, or poly (ethyleneimine) (PEI) Cationic lipids such as) can be used.
- Preparations suitable for oral administration include liquids, capsules, sachets, tablets, suspensions, emulsions and the like.
- Formulations suitable for parenteral administration include aqueous and non-aqueous isotonic sterile injection solutions, which include antioxidants Further, a buffer solution, an antibacterial agent, an isotonic agent and the like may be contained. Aqueous and non-aqueous sterile suspensions are also included, which may contain suspending agents, solubilizers, thickeners, stabilizers, preservatives and the like.
- the preparation can be enclosed in a container in unit doses or multiple doses like ampoules and vials.
- the active ingredient and a pharmaceutically acceptable carrier can be lyophilized and stored in a state that may be dissolved or suspended in a suitable sterile vehicle immediately before use.
- the content of the peptide of the present invention or the expression vector capable of expressing the same in the pharmaceutical composition is, for example, about 0.001 to 100% by weight of the whole pharmaceutical composition.
- the dose of the angiogenesis promoter of the present invention varies depending on the activity and type of the active ingredient, the severity of the disease, the animal species to be administered, the drug acceptability of the administration subject, body weight, age, etc.
- the amount of active ingredient per day for an adult is about 0.001 to about 500 mg / kg.
- the angiogenesis-promoting agent of the present invention is preferably a mammal (for example, so that an angiogenesis-promoting amount of the peptide of the present invention or an expression vector capable of expressing the peptide is delivered to a site where promotion of angiogenesis is desired.
- a mammal for example, so that an angiogenesis-promoting amount of the peptide of the present invention or an expression vector capable of expressing the peptide is delivered to a site where promotion of angiogenesis is desired.
- angiogenesis-promoting agent of the present invention When the angiogenesis-promoting agent of the present invention is administered to a patient having a disease that can be improved by sufficient angiogenesis, angiogenesis is promoted in the patient, and the disease can be treated.
- diseases that can be improved by sufficient neovascularization include ischemic diseases, pressure ulcers, and wounds.
- obstructive arteriosclerosis Buerger's disease, vascular injury, arterial embolism, arterial thrombosis, aneurysm, spinal stenosis, obstructive thromboangiitis, angina, myocardial infarction, cardiomyopathy, coronary artery
- ischemic diseases such as sclerosis, heart failure, and cerebral infarction
- pressure ulcers such as lacerations, abrasions, cuts, stab wounds, bruises, and bites
- burns due to heat, chemicals, radiation, etc.
- the angiogenesis promoter of the present invention may be used in vitro. For example, by culturing vascular endothelial cells or blood vessel-containing tissues in the presence of an angiogenesis-promoting amount of the peptide of the present invention or an expression vector capable of expressing the same, angiogenesis in the vascular endothelial cells or blood vessel-containing tissues is promoted. can do. Such promotion of angiogenesis in vitro is useful for analyzing the mechanism of angiogenesis accompanying cancer metastasis.
- a candidate for a drug that inhibits angiogenesis associated with cancer metastasis by screening for a compound that inhibits the promotion of angiogenesis in vascular endothelial cells or blood vessel-containing tissues using the peptide of the present invention or an expression vector that can express the peptide Can find compounds.
- a candidate compound for an angiogenesis inhibitor can be screened by selecting a test compound that suppresses the angiogenesis level based on the comparison result.
- the candidate compound obtained in (3) may have a possibility of inhibiting angiogenesis due to cytotoxicity, the effect may be confirmed in vivo.
- the candidate compound is administered to a non-human mammal, and the level of angiogenesis in the non-human mammal is controlled by a control non-human mammal (the non-human mammal to which the breeding conditions other than not administering the candidate compound are administered with the candidate compound) And a candidate compound that inhibits angiogenesis in the non-human mammal is selected as an angiogenesis inhibitor based on the comparison result.
- the peptide of the present invention has an activity of promoting cancer cell metastasis
- the peptide of the present invention and an expression vector capable of expressing the peptide are useful as a cancer metastasis promoter. That is, the present invention provides a cancer metastasis promoter comprising the peptide of the present invention or an expression vector capable of expressing the peptide.
- the cancer metastasis promoter of the present invention is useful for constructing a cancer metastasis model in vitro or in vivo.
- Cancer metastasis using the non-human mammal is promoted by administering a cancer metastasis promoting amount of the peptide of the present invention or an expression vector capable of expression to the non-human mammal together with the cancer cell to promote hematogenous metastasis of the cancer cell.
- a model can be built.
- cancer examples include all cancers that can cause metastasis, and examples include breast cancer, lung cancer, prostate cancer, thyroid cancer, kidney cancer, stomach cancer, liver cancer, uterine cancer, colon cancer, skin cancer, and the like.
- the cancer is preferably lung cancer, breast cancer, liver cancer, stomach cancer, or skin cancer.
- metastasis of cancer there is no particular limitation on the metastasis of cancer, and any tissue that can become a metastasis (eg, bone, bone marrow, lymph node, lung, liver, skin, brain, etc.) is included.
- tissue that can become a metastasis eg, bone, bone marrow, lymph node, lung, liver, skin, brain, etc.
- a polynucleotide preferably DNA
- a nucleotide sequence encoding the above peptide exhibits promoter activity in the cell of a mammal (preferably human) to be administered. Functionally linked to a possible promoter.
- the promoter used is not particularly limited as long as it can function in mammalian cells to be administered.
- a pol I promoter, pol II promoter, pol III promoter, or the like can be used as the promoter.
- SV40-derived early promoter, viral promoter such as cytomegalovirus LTR, mammalian constituent protein gene promoter such as ⁇ -actin gene promoter, and RNA promoter such as tRNA promoter are used.
- the expression vector contains a transcription termination signal, that is, a terminator region downstream of the above-described polynucleotide. Furthermore, a selection marker gene for selecting transformed cells (a gene that imparts resistance to drugs such as tetracycline, ampicillin, and kanamycin, a gene that complements an auxotrophic mutation, and the like) can be further contained.
- the type of vector used for the expression vector in the present invention is not particularly limited, and examples of suitable vectors for administration to mammals such as humans include viral vectors such as retroviruses, adenoviruses, and adeno-associated viruses.
- viral vectors such as retroviruses, adenoviruses, and adeno-associated viruses.
- adenovirus has advantages such as extremely high gene transfer efficiency and can be introduced into non-dividing cells.
- gene expression is transient and usually lasts only about 4 weeks.
- it is also possible to use adeno-associated virus that has relatively high gene transfer efficiency can be introduced into non-dividing cells, and can be integrated into the chromosome via an inverted terminal repeat (ITR). Also preferred.
- ITR inverted terminal repeat
- the cancer metastasis promoter of the present invention can contain any carrier, for example, a pharmaceutically acceptable carrier, in addition to a cancer metastasis promoting amount of the peptide of the present invention or an expression vector capable of expressing the same.
- Examples of pharmaceutically acceptable carriers include excipients such as sucrose and starch, binders such as cellulose and methylcellulose, disintegrants such as starch and carboxymethylcellulose, lubricants such as magnesium stearate and aerosil, citric acid, Fragrances such as menthol, preservatives such as sodium benzoate and sodium bisulfite, stabilizers such as citric acid and sodium citrate, suspensions such as methylcellulose and polyvinylpyrrolide, dispersants such as surfactants, water, Although diluents, such as physiological saline, base wax, etc. are mentioned, it is not limited to them.
- the cancer metastasis promoter of the present invention can further contain a reagent for nucleic acid introduction.
- a viral vector particularly a retroviral vector, retronectin, fibronectin, polybrene, or the like can be used as a gene introduction reagent.
- the polynucleotide is incorporated into a plasmid vector, lipofectin, lipfectamine, DOGS (transfectum), DOPE, DOTAP, DDAB, DHDEAB, HDEAB, polybrene, or poly (ethyleneimine) (PEI) Cationic lipids such as) can be used.
- Preparations suitable for oral administration include liquids, capsules, sachets, tablets, suspensions, emulsions and the like.
- Formulations suitable for parenteral administration include aqueous and non-aqueous isotonic sterile injection solutions, which include antioxidants Further, a buffer solution, an antibacterial agent, an isotonic agent and the like may be contained. Aqueous and non-aqueous sterile suspensions are also included, which may contain suspending agents, solubilizers, thickeners, stabilizers, preservatives and the like.
- the preparation can be enclosed in a container in unit doses or multiple doses like ampoules and vials.
- the active ingredient and a pharmaceutically acceptable carrier can be lyophilized and stored in a state that may be dissolved or suspended in a suitable sterile vehicle immediately before use.
- the content of the peptide of the present invention or the expression vector capable of expressing the same in the pharmaceutical composition is, for example, about 0.001 to 100% by weight of the whole pharmaceutical composition.
- the dose of the cancer metastasis promoter of the present invention varies depending on the activity and type of the active ingredient, the severity of the disease, the animal species to be administered, the drug acceptability of the administration subject, body weight, age, etc.
- the amount of active ingredient per day for an adult is about 0.001 to about 500 mg / kg.
- the cancer metastasis promoting agent of the present invention is preferably a cancer-bearing non-human mammal (eg, rat) so that a cancer metastasis promoting amount of the peptide of the present invention or an expression vector capable of expressing the peptide can be delivered to cancer tissue.
- a cancer metastasis promoting amount of the peptide of the present invention or an expression vector capable of expressing the peptide can be delivered to cancer tissue.
- Mice, guinea pigs, rabbits, sheep, horses, pigs, cows, monkeys Alternatively, by mixing the cancer metastasis promoter of the present invention with cancer cells and injecting the mixture into a non-human mammal, adhesion of the cancer cells to the blood vessel wall and angiogenesis around the cancer cells are promoted. As a result, the survival rate of the cancer cells to non-human mammals is increased, and the formation of metastases is promoted.
- the cancer metastasis promoter of the present invention may be used in vitro. For example, by culturing cancer cells in the presence of a cancer metastasis promoting amount of the peptide of the present invention or an expression vector capable of expressing the same, the motility of the cancer cells can be increased.
- cancer cells are mixed with the peptide of the present invention, and the mixture is seeded in a culture vessel. Then, at the stage where the cancer cells adhere to the culture vessel, a gel for three-dimensional culture (eg, Matrigel, peptide hydrogel, etc.) is laminated.
- a gel for three-dimensional culture eg, Matrigel, peptide hydrogel, etc.
- the cancer cells By culturing cancer cells, the cancer cells infiltrate into the gel, and the invasion is promoted by the addition of the cancer metastasis promoter of the present invention. Promotion of cancer metastasis in vitro by the peptide of the present invention or an expression vector capable of expressing the peptide is useful for analyzing the mechanism of cancer metastasis.
- a drug candidate compound that inhibits cancer metastasis can be found.
- Candidate compounds for cancer metastasis inhibitors can be screened by selecting test compounds that suppress the level of cancer cell motility based on the comparison results.
- the candidate compound obtained in (3) may have a possibility of inhibiting cancer metastasis due to cytotoxicity, the effect may be confirmed in vivo.
- the candidate compound is administered to a cancer-bearing non-human mammal, and the degree of cancer metastasis in the non-human mammal is controlled by a control non-human mammal (carcinoma bearing a candidate compound administered under a condition other than administration of the candidate compound)
- a candidate compound that has inhibited cancer metastasis in the non-human mammal based on the comparison result is selected as a cancer metastasis inhibitor.
- the peptide of the present invention binds to cancer cells and neovascularization around cancer, the peptide of the present invention can be used as a diagnostic imaging probe for detecting cancerous tissue and accompanying neovascularization. Therefore, the present invention provides a diagnostic imaging probe for detecting a cancer tissue containing the peptide of the present invention or a new blood vessel associated therewith.
- the peptide of the present invention is labeled with an appropriate labeling agent and administered to a test animal, and the localization of the peptide in vivo is directly detected (imaging), thereby allowing cancer tissue or the The presence and extent of accompanying neovascularization can be evaluated.
- a radioisotope having an appropriate half-life is preferably used. More preferably, the radioisotope is a nuclide that is commonly used in various tomography such as scintigraphy, single photon emission computed tomography (SPECT) and positron tomography (PET).
- nuclides used for scintigraphy and SPECT include 99m Tc, 201 Ti, 67 Ga, 111 In, 123 I, 131 I, 125 I, 169 Yb, 186 Re, and 99 Mo. Particularly preferred is 99m Tc.
- the PET nuclide include 15 O, 13 N, 11 C, and 18 F.
- Peptide labeling with a radioisotope can be performed using a method known per se for each radioisotope.
- a peptide when labeled with 99m Tc, it can be performed according to the technique described in RADIOISOTOPES, 53: 155-178 (2004), for example. That is, an appropriate ligand (for example, DTPA, HMPAO, DMSA, MAA, etc.) is bound to a peptide via a linker as necessary, and this is sealed in a container such as a vial.
- an appropriate ligand for example, DTPA, HMPAO, DMSA, MAA, etc.
- 99 Mo- 99m Tc generator than eluted pertechnetate (99m TcO 4 -) with a suitable reducing agent: using (eg stannous chloride, etc.) + 1, + 3, + 4 or +5 oxidation
- the 99m Tc-labeled tracer compound can be obtained by reducing to a certain number, injecting it into a container containing the tracer compound and shaking.
- 99m Tc may be reacted directly with the desired ligand, or after first reacting with a weakly coordinating ligand such as gluconic acid or tartaric acid to form a complex with the ligand.
- ligand exchange may be performed by acting a ligand having strong coordination ability.
- a linker what is normally used for manufacture of a technetium complex can be selected suitably, and can be used.
- the peptide of the present invention is labeled with a non-radioactive contrast agent used for MRI or CT, such as gadolinium, iodine, fluorine, etc. It can also be prepared as a contrast agent for diagnostic imaging such as CT and CT.
- a reporter eg, luciferase
- the peptide of the present invention can be labeled with a reporter (eg, luciferase) that generates a fluorescent substance such as green fluorescent protein (GFP) or a chemiluminescent substance.
- GFP green fluorescent protein
- the labeled peptide of the present invention can be formulated in the same manner as the above-described angiogenesis promoter of the present invention, and can be administered by the same route of administration.
- the peptide of the present invention when labeled with a radioisotope, it has a radioactivity intensity of about 0.0001 to about 10 mCi, preferably about 0.01 to about 0.1 mCi per unit dose.
- the volume of the unit dose injection is, for example, about 0.01 to about 10 ml.
- localization of the peptide of the present invention in the subject animal is preferably, for example, scintigraphy, single photon emission computed tomography (SPECT), positron tomography (PET), etc. Detected and imaged by SPECT or PET.
- scintigraphy after the labeled peptide of the present invention is administered, its distribution in the body is depicted with a scinti camera.
- the transverse tomographic plane is drawn using a dedicated tomographic imaging device.
- the imaging start time depends on the nuclide of the labeling agent, for example, immediately after administration of the tracer to 72 hours, preferably 5 minutes to 24 hours, more preferably 10 minutes to 4 hours later.
- luciferase When luciferase is used as a labeling agent, after administering the labeled peptide of the present invention, luciferin is further administered, and chemiluminescence is converted into a digital image using a real-time in vivo imaging apparatus equipped with an ultra-sensitive cooled CCD camera. By visualizing, the peptide of the present invention can be detected. Even when another fluorescent or luminescent substance is used as a labeling agent, the distribution of the peptide of the present invention can be visualized by detecting the label using a method known per se.
- the accumulation of the peptide of the present invention is observed, it can be diagnosed that the test animal is highly likely to have cancer tissue and accompanying neovascularization.
- the present invention provides an agent comprising the peptide inhibitor of the present invention.
- the agent of the present invention is useful for inhibiting cancer metastasis and inhibiting angiogenesis (particularly, inhibiting angiogenesis around cancer cells). Inhibiting metastasis of cancer in a mammal by administering the inhibitor of the peptide of the present invention to a mammal afflicted with cancer or a mammal who has a history of cancer and may have cancer cells Can do. In addition, by administering the inhibitor of the peptide of the present invention to a mammal, angiogenesis (particularly, suppression of angiogenesis in the vicinity of cancer cells) in the mammal can be suppressed.
- Inhibitors of the peptides of the present invention can include the following: (1) an RNA interference-inducing RNA or antisense nucleic acid that specifically suppresses the expression of the peptide of the present invention or an expression vector that expresses these nucleic acids; and (2) specifically recognizes the peptide of the present invention, and An antibody that inhibits the function of promoting angiogenesis.
- Single-stranded or double-stranded RNA comprising a nucleotide sequence complementary to the sequence, and (B) mRNA (mature mRNA or initial transcript) encoding the peptide of the present invention and a mammal to be administered (for example, human etc.) Single-stranded or double-stranded that contains a nucleotide sequence of 18 bases or more that can hybridize in cells of rodents such as primates and mice) and induces RNA interference of the peptide expression of the present invention by hybridization Strand RNA Can be mentioned.
- the mRNA encoding the peptide of the present invention includes a portion encoding positions 582 to 621 of the human fibrinogen ⁇ -E chain (SEQ ID NO: 3) in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 (ie, positions 1802 to 1921). (For example, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2).
- the RNA interference-inducing RNA that specifically suppresses the expression of the peptide of the present invention preferably targets the region of positions 1802 to 1921 of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, and comprises human fibrinogen ⁇ -E chain and its The expression of the peptide of the present invention which is a fragment is suppressed.
- nucleotide sequence is described as a DNA sequence unless otherwise specified.
- polynucleotide is RNA
- thymine (T) is appropriately read as uracil (U).
- RNA interference in which double-stranded RNA is introduced into a cell and its complementary mRNA is degraded, has long been known in nematodes, insects and plants. Since this phenomenon was confirmed to occur in animal cells [Nature, 411 (6836): 494-498 (2001)], it has attracted attention as an alternative to ribozyme.
- RNA interference-inducing RNA is typically a double-stranded oligo RNA consisting of RNA having a complementary sequence to the nucleotide sequence of mRNA of a target gene or a partial sequence thereof (hereinafter referred to as target nucleotide sequence) and its complementary strand. is there.
- target nucleotide sequence a sequence complementary to a target nucleotide sequence
- second sequence a sequence complementary to a target nucleotide sequence
- shRNA small hairpin RNA in which the first sequence forms a double-stranded structure with the second sequence
- the length of the portion complementary to the target nucleotide sequence contained in the RNA interference-inducing RNA is usually about 18 bases or more, preferably about 19 bases or more, more preferably about 21 bases or more, There is no particular limitation as long as the expression of the target gene can be specifically suppressed. If the RNA interference-inducing RNA is longer than 23 bases, the RNA interference-inducing RNA can be degraded in the cell to produce siRNAs of about 20 bases, so it is theoretically complementary to the target nucleotide sequence.
- the upper limit of the length of this portion is the full length of the nucleotide sequence of the target gene mRNA (mature mRNA or early transcript).
- the length of the complementary portion is, for example, about 50 bases or less, preferably about 25 bases or less, and most preferably about 23 bases or less. is there. That is, the length of the complementary portion is usually about 18 to 50 bases, preferably about 19 to about 25 bases, more preferably about 21 to about 23 bases.
- each RNA strand constituting the RNA interference-inducing RNA is usually about 18 bases or more, preferably about 19 bases or more, more preferably about 21 bases or more. As long as it can be specifically suppressed, there is no particular limitation, and theoretically there is no upper limit on the length of each RNA strand. However, in consideration of avoidance of interferon induction, ease of synthesis, antigenic problems, etc., the length of each RNA strand constituting the RNA interference-inducing RNA is, for example, about 50 bases or less, preferably about 25 bases or less, Most preferably it is about 23 bases or less.
- each RNA strand is, for example, usually about 18 to 50 bases, preferably about 19 to about 25 bases, more preferably about 21 to about 23 bases.
- the length of shRNA shall be shown as the length of the double-stranded part when taking a double-stranded structure.
- siRNA double-stranded RNA interference-inducing RNA having a total length of 23 bases or less
- the target nucleotide sequence and the complementary sequence contained in the RNA interference-inducing RNA are preferably completely complementary.
- a base mutation at a position off the center of the complementary sequence which may be within the range of identity of at least 90% or more, preferably 95% or more
- the cleavage activity due to RNA interference is completely lost. Rather, partial activity may remain.
- the mutation of the base at the center of the complementary sequence has a large effect, and the mRNA cleavage activity due to RNA interference can be extremely reduced.
- RNA interference-inducing RNA may have an additional base that does not form a base pair at the 5 'and / or 3' end.
- the length of the additional base is not particularly limited as long as the RNA interference-inducing RNA can specifically suppress the expression of the target gene, but is usually 5 bases or less, for example, 2 to 4 bases.
- the additional base may be DNA or RNA, but the use of DNA can improve the stability of siRNA. Examples of such additional base sequences include ug-3 ', uu-3', tg-3 ', tt-3', ggg-3 ', guuu-3', gttt-3 ', tttt-3 Examples include, but are not limited to, ', uuuuu-3'.
- the length of the loop part of the hairpin loop of shRNA is not particularly limited as long as the expression of the target gene can be specifically suppressed, but is usually about 5 to 25 bases.
- the nucleotide sequence of the loop portion is not particularly limited as long as it can form a loop and shRNA can specifically suppress the expression of the target gene.
- Antisense nucleic acid includes a nucleotide sequence that can hybridize to a target mRNA under the physiological conditions in a cell that expresses the target mRNA (mature mRNA or initial transcript), and the target mRNA in a hybridized state.
- a nucleic acid capable of inhibiting the translation of a polypeptide encoded by mRNA may be DNA, RNA, or a DNA / RNA chimera, but is preferably DNA.
- Examples of the antisense nucleic acid capable of specifically suppressing the expression of the peptide of the present invention include (A) a nucleotide sequence of mRNA (mature mRNA or initial transcription product) encoding the peptide of the present invention or a partial sequence thereof having 12 bases or more.
- a nucleic acid comprising a nucleotide sequence complementary to, and (B) 12 bases or more capable of hybridizing with mRNA (mature mRNA or initial transcript) encoding the peptide of the present invention in the cells of the animal to be treated (preferably human) And a nucleic acid that can inhibit translation into the peptide of the present invention in a hybridized state.
- the length of the portion that hybridizes with the target mRNA in the antisense nucleic acid is not particularly limited as long as it specifically suppresses the expression of the peptide of the present invention, and is usually about 12 bases or more, and is long and mature (mature mRNA). (Or the initial transcription product) is the same length as the full-length sequence. In consideration of the specificity of hybridization, the length is preferably about 15 bases or more, more preferably about 18 bases or more. In consideration of easiness of synthesis and antigenicity problems, the length of the portion that hybridizes with the target mRNA is usually about 200 bases or less, preferably about 50 bases or less, more preferably about 30 bases or less. . That is, the length of the portion that hybridizes with the target mRNA is, for example, about 12 to about 200 bases, preferably about 15 to about 50 bases, more preferably about 18 to about 30 bases.
- the target nucleotide sequence of the antisense nucleic acid is not particularly limited as long as expression of the peptide encoding the peptide of the present invention can be specifically suppressed, and the mRNA (mature mRNA or initial transcription product) encoding the peptide of the present invention is not particularly limited. It may be a full-length sequence or a partial sequence (for example, about 12 bases or more, preferably about 15 bases or more, more preferably about 18 bases or more), or an intron portion of an initial transcription product.
- nucleotide sequence of the portion that hybridizes with the target mRNA in the antisense nucleic acid varies depending on the base composition of the target sequence, but can be hybridized with the mRNA encoding the peptide of the present invention under physiological conditions. Is usually about 90% or more (preferably 95% or more, most preferably 100%).
- the mRNA encoding the peptide of the present invention includes a portion encoding positions 582 to 621 of the human fibrinogen ⁇ -E chain (SEQ ID NO: 3) in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 (ie, positions 1802 to 1921). (For example, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2).
- the antisense nucleic acid that specifically suppresses the expression of the peptide of the present invention preferably targets the region of positions 1802-1192 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2, and comprises human fibrinogen ⁇ -E chain and fragments thereof. Suppresses the expression of certain peptides of the present invention.
- the size of the antisense nucleic acid is usually about 12 bases or more, preferably about 15 bases or more, more preferably about 18 bases or more.
- the size is usually about 200 bases or less, preferably about 50 bases or less, more preferably about 30 bases or less, because of ease of synthesis, antigenicity problems, and the like.
- mRNA sequence for example, nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2
- a target sequence is determined based on the sequence, and a nucleic acid having a complementary nucleotide sequence can be synthesized using a commercially available automatic nucleic acid synthesizer (Applied Biosystems, Beckman, etc.).
- the double-stranded RNA interference-inducing RNA is prepared by synthesizing a sense strand and an antisense strand with an automatic nucleic acid synthesizer and denatured at about 90 to about 95 ° C. for about 1 minute in an appropriate annealing buffer, It can be prepared by annealing at about 30 to about 70 ° C. for about 1 to about 8 hours.
- longer double-stranded polynucleotides can be prepared by synthesizing complementary oligonucleotide strands so as to alternately overlap, annealing them, and then ligating with ligase.
- a mammal to be administered for example, a primate such as a human or a rodent such as a mouse
- Cells preferably, downstream of the promoter capable of exerting the promoter activity in the target cell expressing the peptide of the present invention or human fibrinogen ⁇ -E chain
- a sense nucleic acid or a nucleic acid (preferably DNA) encoding them is functionally linked.
- the promoter used expresses the target peptide of the present invention or human fibrinogen ⁇ -E chain of a mammal to be administered (for example, a primate such as a human or a rodent such as a mouse).
- the promoter is not particularly limited as long as it can function in cells, and as a promoter, a polI promoter, a polII promoter, a polIII promoter, etc., specifically, an SV40-derived early promoter, Viral promoters such as cytomegalovirus LTR, mammalian constituent protein gene promoters such as ⁇ -actin gene promoter, and RNA promoters such as tRNA promoter are used.
- RNA interference inducing RNA When the expression of RNA interference inducing RNA is intended, it is preferable to use a polIII promoter as the promoter.
- the polIII promoter include U6 promoter, H1 promoter, tRNA promoter and the like.
- the expression vector preferably contains a transcription termination signal, that is, a terminator region, downstream of the RNA interference-inducing RNA or antisense nucleic acid or the nucleic acid encoding them.
- the expression vector may further contain a selection marker gene for selection of transformed cells (a gene that imparts resistance to drugs such as tetracycline, ampicillin, kanamycin, a gene that complements an auxotrophic mutation, etc.). it can.
- the expression vector may contain an enhancer, a splicing signal, a poly A addition signal, an SV40 replication origin, and the like in a functional manner, if desired.
- vectors suitable for administration to mammals include plasmid vectors; viral vectors such as retroviruses, adenoviruses, and adeno-associated viruses.
- an antibody that specifically recognizes the peptide of the present invention and inhibits the function of promoting angiogenesis is also included in the inhibitor of the peptide of the present invention.
- “Specific binding to the peptide of the present invention” means that the affinity for the target peptide of the present invention is stronger than the affinity for the background (eg, BSA).
- the antibodies include natural antibodies such as polyclonal antibodies and monoclonal antibodies (mAbs), chimeric antibodies that can be produced using gene recombination techniques, humanized antibodies, single chain antibodies, human antibodies, and these Binding fragments of, but not limited to.
- the antibody is a polyclonal antibody, a monoclonal antibody or a binding fragment thereof.
- the binding fragment of an antibody means a partial region of the aforementioned antibody having specific binding activity for an antigen, specifically, for example, F (ab ′) 2 , Fab ′, Fab, Fv, sFv, dsFv, sdAb and the like (Exp. Opin. Ther. Patents, Vol. 6, No. 5, p.
- the class of the antibody is not particularly limited, and includes antibodies having any isotype such as IgG, IgM, IgA, IgD, or IgE. IgG or IgM is preferable, and IgG is more preferable in consideration of ease of purification.
- the antibody specifically recognizing the peptide of the present invention uses the peptide of the present invention, a partial peptide having antigenicity thereof, or a transfectant of the peptide of the present invention as an immunogen, and an existing general antibody production method It can be manufactured according to.
- monoclonal antibodies can be produced using the method of Kohler and Milstein et al. [Nature, vol.256, p.495. (1975)] or the recombinant DNA method (Cabilly et al., US Pat. No. 4,816,567). it can.
- the chimeric antibody can be obtained by ligating the DNA encoding the V region of the monoclonal antibody obtained as described above with the DNA encoding the human antibody C region, incorporating it into an expression vector, introducing it into a host, and producing it. .
- a humanized antibody is also referred to as a reshaped human antibody, which transplants the complementarity determining region (CDR) of a non-human mammal such as a mouse antibody into the complementarity determining region of a human antibody.
- CDR complementarity determining region
- a general genetic recombination technique is also known (see EP125023, WO96 / 02576).
- a human antibody can be produced in the same manner as the above-described method for producing a monoclonal antibody by using a human antibody-producing mouse (Patent No. 3030092, US6632976, US2004073957, US2009253902, etc.) as a non-human animal to be immunized.
- the target neutralizing antibody can be obtained by selecting an antibody having an activity to inhibit angiogenesis promoting activity from the obtained antibodies specifically recognizing the peptide of the present invention.
- the activity of inhibiting the angiogenesis-promoting activity function is evaluated by injecting the antibody to be evaluated together with the peptide of the present invention into a sperm egg of a chicken, and controlling the formation of new blood vessels in the embryo in the control group ( It can be determined by evaluating whether or not the formation of new blood vessels is suppressed as compared with the group in which the peptide of the present invention is injected and the antibody is not injected.
- the agent of the present invention may be prepared by mixing the active ingredient inhibitor of the peptide of the present invention together with one or more pharmaceutically acceptable carriers, and any well known in the technical field of pharmaceutics. It can be manufactured by a method.
- the agent of the present invention may further contain an active ingredient for any other treatment other than the inhibitor of the peptide of the present invention.
- pharmacologically acceptable carrier various organic or inorganic carrier substances commonly used as pharmaceutical materials are used. Specific examples thereof include excipients, lubricants, binders, disintegrants, liquids in solid preparations. Solvents, solubilizers, suspending agents, tonicity agents, buffers, soothing agents and the like in the preparation can be mentioned. In formulation, formulation additives such as preservatives, antioxidants, coloring agents, sweeteners and the like may be used as necessary.
- Formulations suitable for parenteral administration preferably comprise a sterile aqueous solution containing the active compound that is isotonic with the blood of the recipient.
- a solution for injection is prepared using a carrier comprising a salt solution, a glucose solution, or a mixture of salt water and a glucose solution.
- a solubilizing agent, a buffering agent, a pH adjusting agent, a tonicity agent, a soothing agent, a preservative and the like can be further added as necessary.
- a preparation suitable for parenteral administration may be prepared by suspending the inhibitor of the peptide of the present invention in distilled water for injection or vegetable oil. Agents, thickeners and the like can be added.
- a preparation suitable for parenteral use may be a form in which the powder or freeze-dried product of the peptide inhibitor of the present invention is dissolved at the time of use, and an excipient or the like can be added as necessary.
- oral preparations include tablets (including sublingual tablets and orally disintegrating agents), capsules (including soft capsules and microcapsules), powders, granules, troches, syrups, emulsions, suspensions, and the like. .
- These preparations may be controlled-release preparations (eg, sustained-release microcapsules) such as immediate-release preparations or sustained-release preparations.
- the content of the inhibitor of the peptide of the present invention is usually in the range of 0.01 to 100% by weight, but may vary depending on the form of the preparation. In the case of an injection, the content of the inhibitor of the peptide of the present invention is, for example, in the range of 0.01 to 10% by weight.
- the agent of the present invention can also be formulated as a form of food (general foods, foods for patients, functional nutrition foods, foods for specified health use, etc.).
- the form of food can be powder, granule, tablet, capsule, cookie, jelly, beverage, or general food.
- the content of the inhibitor of the peptide of the present invention in food is usually about 0.01 to 100% by weight, preferably about 0.1 to 30% by weight.
- the food is a beverage, it is usually 0.01 from the viewpoint of solubility and the like. About 5% by weight is included.
- foods include various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), minerals, synthetic flavors, natural flavors, colorants, fillers (cheese, chocolate, etc.) ), Pectic acid or a salt thereof, alginic acid or a salt thereof, an organic acid, a protective colloid thickener, a pH adjuster, a stabilizer, an antiseptic, glycerin, an alcohol, or the like.
- the agent of the present invention suppresses cancer metastasis, particularly hematogenous metastasis of cancer.
- the cancer metastasis inhibitor of the present invention can be applied to any cancer that can cause metastasis (eg, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, thyroid cancer, kidney cancer, stomach cancer, liver cancer, uterine cancer, colon cancer, skin cancer, etc.)
- it is preferably applied to breast cancer, liver cancer, gastric cancer, and skin cancer patients.
- the agent of the present invention suppresses angiogenesis, particularly angiogenesis around cancer cells.
- the subject of administration of the agent of the present invention is usually a mammal.
- mammals include, for example, laboratory animals such as rodents and rabbits such as mice, rats, hamsters, and guinea pigs, domestic animals such as pigs, cows, goats, horses, sheep and minks, pets such as dogs and cats, humans, Examples include, but are not limited to, primates such as monkeys, cynomolgus monkeys, rhesus monkeys, marmosets, orangutans and chimpanzees.
- the mammal is preferably a primate (such as a human) or a rodent (such as a mouse).
- the dose and frequency of administration of the agent of the present invention vary depending on the administration form, patient age, body weight, applicable disease, type of cancer, nature or severity of symptoms to be treated, but are usually treated by intravenous administration.
- an inhibitor of the peptide of the present invention which is an active ingredient, 0.01 to 800 mg / kg body weight is administered once to several times a day.
- these doses and the number of doses vary depending on the various conditions described above.
- Example 1 We conducted a follow-up study of 83 patients after the primary cure for human primary cancer.
- Target primary cancers are liver cancer, lung cancer, breast cancer, prostate cancer, kidney cancer and complex cancer. The endpoint is until metastasis is confirmed by PET-CT and imaging. Serum transfer peptides were measured as peaks at a molecular weight of 5,813 at the monthly visits. The transition of the peak intensity at the position of molecular weight 5,813 in seven typical patients is shown below.
- Example 2 Identification of transfer marker (1) Fractionation with anion exchange column 200 ⁇ L of human serum was centrifuged at 14,000 rpm for 10 minutes to obtain a supernatant. To this serum, 1800 ⁇ L of 50 mM Tris buffer (pH 9) was added, allowed to stand in ice for 20 minutes, and then centrifuged at 14,000 rpm for 10 minutes. Supernatant was washed 4 times with buffer (pH 9 + OG) 4 times as much as the column (equilibrated) to the anion exchange column Q Sepharose Fast Flow (GE Healthcare C / N 17-0510-01) A fraction was collected under the following conditions. 1. Non-adsorbed fraction (2 ml) 2. Wash fraction (2 ml) 3.
- the target peak “m / z” 5813 ” was confirmed in fractions 41.5 and“ 42 ”(FIGS. 18 to 20). Further, the target peak could be separated from the peak having a mass of 5905 kg.
- the target peak was considered to be the C-terminal fragment of the protein.
- the mass of the region containing the sequence hit in the C-terminal region was examined, the mass of the fragment in the region 576-628 was in good agreement with the target peak mass value of 5805.
- the mass of the region 576-629 (Val added to the C terminal) is 5904, which is a plus 99 of the target peak mass. This is in good agreement with the peak detected in the serum sample with a mass plus 100 of the target peak.
- This plus 100 peak was presumed to be a protein having a sequence very similar to the target peak because the chromatographic behavior was almost the same as the target peak.
- the isoelectric point (pI) of the fragment in the region 576-628 is 8.07, which is consistent with the fact that the target peak shows the behavior of a basic substance in ion exchange. From the above results, it was concluded that the target peak 5813 is a fragment of the C-terminal region 576-628 of alpha-fibrinogen precursor.
- recombinant Fibrinogen protein Human abcam 84410 (CYGTGSETESPRNPSS (SEQ ID NO: 6) (hereinafter, peptide B) is labeled with HiLyte Fluor 555, and unreacted products are removed by gel filtration to remove HiLyte Fluor 555-labeled C2 meleimide-peptide B.
- peptide B recombinant Fibrinogen protein Human abcam 84410
- peptide B recombinant Fibrinogen protein Human abcam 84410
- peptide B recombinant Fibrinogen protein Human abcam 84410
- peptide B recombinant Fibrinogen protein Human abcam 84410
- peptide B recombinant Fibrinogen protein Human abcam 84410
- peptide B recombinant Fibrinogen protein Human abcam 84410
- peptide B recombinant Fibrinogen protein Human abcam 84410
- peptide B
- peptide A induces the formation of clear neovascularization surrounding the embryo.
- VEGF concentration in the egg was measured, it showed a high value in the sperm egg into which peptide A was injected (FIG. 25).
- the remaining egg hatched and the born chicks were raised for about one year until they became chickens, but no chief complaints were found at the living body level.
- significant changes could not be verified in sperm eggs injected with HiLyte Fluor 555-labeled C2 meleimide-CYGTGSETESPRNPSS.
- Example 4 Preparation of Cancer Cell Metastasis Model and Effect of Peptide A on Cancer Cell Metastasis Human lung cancer cell H460 was scabbed on the bottom of a petri dish, and 0.1 pg / mL of HiLyte Fluor 594-labeled C2 meleimide-peptide A was added.
- a peptide hydrogel (3D Matrix Co., Ltd.) assuming a human biological matrix was placed thereon.
- An insert cup with a hole of 8 ⁇ m was placed on the peptide hydrogel layer, and human lung microvascular endothelial cells were swollen all over the cup, and the mechanism of cancer cell movement and metastasis was examined (FIG. 26). ).
- VEGF expression of human osteosarcoma cells by peptide A HNNG cells were treated with peptide A, and VEGF expression was confirmed by immunohistochemical staining. As a result, it was shown that peptide A adheres to HNNG cells and induces the expression of VEGF by the peptide A treatment (FIG. 32).
- Example 6 In vivo metastasis test GFP-introduced HNNG cells (human osteosarcoma cells) and peptide A were mixed and injected into mice from the tail vein. As a result, metastasis of HNNG cells to the head, kidney and spine was confirmed (FIGS. 33 and 34). Similarly, HNNG cells into which GFP was not introduced (human osteosarcoma cells) and peptide A were mixed, injected into mice from the tail vein, and the localization of peptide A and VEGF was examined by immunohistochemical staining. As a result, the localization of peptide A and VEGF-expressing cells in mouse blood vessels was confirmed (FIG. 35).
- FGA expression in human cancer tissue was analyzed by in situ hybridization using TMA sections.
- Breast cancer Invasive ductal carcinoma, 82 years old, female
- Liver cancer Hepatocellular carcinoma, 65 years old, male
- Skin cancer Melanoma, 43 years old, male
- Gastric cancer Addenocarcinoma, 48 years old, male
- Thymic tumor The expression of FGA mRNA was confirmed in the tissue of the primary tumor (Malignant thymoma, 43 years old, female) (FIGS. 36 to 38).
- Example 8 Evaluation of CD51 + CD61 (GPIIb / IIIa) expression in human cancer tissue by immunohistochemical staining The expression of CD51 + CD61 (GPIIb / IIIa) in human cancer tissue was confirmed by immunohistochemical staining (FIGS. 39 and 40). Since CD51 + CD61 is present in platelets and binds to the RGD sequence that is also present in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, the fragment of the C-terminal region 576-628 of alpha-fibrinogen precursor is responsible for platelet adhesion to cancer tissue. The possibility of mediating was shown.
- Example 9 Evaluation of p21 expression in human cancer tissue by immunohistological staining Expression of p21 was confirmed in human cancer tissue by immunohistological staining (FIG. 41). Since p21 means cell cycle arrest, the possibility that the cell cycle of cancer cells was arrested in cancer tissues was shown.
- Example 11 Marker variation of each cancer cell by shRNA against peptide A shRNA that knocks down the FGA target site (ie, peptide A portion) was prepared, and Western blotting of the cancer cell supernatant was performed.
- shRNA suppressed the expression of FGA (FIG. 43).
- This shRNA was introduced into human prostate cancer cells, human breast cancer cells, and human colon cancer cells, and the cancer markers secreted from each cancer cell were measured. The results are shown in FIG. In the figure, “Control” does not contain anything during culture.
- “ShRNA” indicates cells that knocked down the target of FGA.
- “41aa” indicates a cell to which an antigen peptide was added.
- Example 14 In order to verify the molecular target of the target, white cancer metastatic tissue was immunofluorescently stained. Expression of peptide A (41aa) (Alexa 555, red) and CD61 + CD51 (Alexa 488, green) was evaluated. Cells were subjected to DAPI staining (blue). The results are shown in FIG. The expression of peptide A (41aa) was confirmed around the blood vessels of the lung cancer metastatic tissue. Around the blood vessel, colocalization (orange) of peptide A (41aa) (red) and CD61 + CD51 (green) was observed (FIG. 47, upper and middle photographs). It was observed that cancer cells (multinucleated) were hidden in the blood vessel together with peptide A (41aa) (FIG. 47, lower photo).
- Example 15 Prospective clinical trials of breast cancer patients In July 1997, breast cancer-preserving mastectomy was attempted and chemotherapy and hormone therapy were performed. In May 2000, multiple bone metastases were observed. CEA, CA15-3, NCC-ST-439, and ALP showed moderate increases or lows until 2005. However, Peptide A (41aa) showed a low value after surgery, but showed an elevated value after one year.
- the serum level starts to increase from a period earlier than the time when the symptoms of metastasis become apparent, so early detection and early prevention of metastasis are possible earlier than current imaging diagnosis, Since analysis can be performed from a small amount of patient serum, it is extremely useful in terms of application to a rapid, simple and inexpensive diagnosis method for bone metastasis, a reagent, a kit, and the like with less burden on the patient. While the invention has been described with emphasis on preferred embodiments, it will be apparent to those skilled in the art that the preferred embodiments can be modified. The present invention contemplates that the present invention may be practiced otherwise than as specifically described herein. Accordingly, this invention includes all modifications encompassed within the spirit and scope of the appended claims.
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Abstract
本発明は、癌患者において、転移発症前から転移発症後にかけて血清中で経時的に発現が増加するペプチドであって、ヒトフィブリノゲンのペプチド断片、並びに癌患者由来の生体試料における上記ペプチドの発現を検出することを特徴とする、該患者における転移の診断方法を提供する。本発明の方法によれば、転移の早期発見・早期治療が可能となる。
Description
本発明は、癌転移におけるマーカーとして用い得るペプチド、並びに被検試料中の該ペプチド量を測定することを特徴とする癌転移の診断方法等に関する。
昭和56年から現在まで、わが国における死因の1位は癌である。平成14年には死亡数304,286人、人口10万対死亡率241.5、総死亡の31.0%となっている。西暦2015年には1年間に89万人が癌にかかると推測されている(財団法人がん研究振興財団「がんの統計’03」)。
癌はしばしば他の臓器へ転移し、そこで二次的に増殖する。従って、原発巣の癌を治療することに加えて、癌の転移を早期に発見し、これを治療することが癌の治療において肝要である。
癌の転移の診断においては、血中や尿中の腫瘍マーカーが臨床の場で利用されている。例えば、骨転移マーカーとしては、これまでに血中ICTP、血中もしくは尿中NTx、血中PICP(非特許文献1)等が報告されている。また、特許文献1には、骨芽細胞の活性を反映するマーカーとしてPICP、PINPもしくはBALPおよびオステオカルシンを、破骨細胞の活性を反映するマーカーとしてデオキシピリジノリンおよび/またはICTPを用いた悪性腫瘍の骨転移診断方法が記載されている。
本発明者らは、プロテインチップを用いた質量分析により、骨転移発症前から発症後・治療開始までの血清中で経時的に増加し、治療により減少する分子量約5,800のペプチドを見出し、更に、該ペプチドが、単球走化性因子として知られる、好中球由来のヘパリン結合蛋白質アズロシジンの断片である可能性を指摘している(特許文献2)。
しかしながら、種々の癌の転移の診断に適用可能なマーカーとして、臨床での利用に十分に耐え得るものは未だに発見されていない。
一方、血液凝固第I因子であるフィブリノゲンは、肝臓で産生される糖蛋白質で、トロンビンによりフィブリンモノマーとなる。その後、重合によりフィブリン塊となり止血が完了する。近年、フィブリノゲン欠損マウスにおいて、癌の転移が有意に減少することが報告され(非特許文献2及び3)、フィブリノゲンが癌の転移過程で重要な役割を果たす可能性が示唆されている。
また、胃癌患者において、術前フィブリノゲン値は転移の少ない早期癌患者では非癌患者と差がなく、転移頻度の高い進行癌になると有意に高値であったこと(非特許文献4)、高フィブリノゲン血症はリンパ節転移、肝転移と強く相関したこと(非特許文献5)が報告されている。以上のような結果から、高フィブリノゲン血症が、血行性転移、リンパ行性転移の成立しやすい環境を形成している可能性が指摘されている。
フィブリノゲンが転移を促進するメカニズムとして、幾つかの可能性が考えられている。例えば、血中のがん細胞の周囲に血小板が凝集し腫瘍血栓を形成することは、転移の標的臓器の血管床への接着を促進し、血管外への浸潤、転移巣を形成する過程を進展させるが(非特許文献6)、トロンビンによりフィブリノゲンから生じた可溶性フィブリンが、癌細胞に対する血小板の接着を促進し、腫瘍血栓の形成における重要な役割を果たしていることが報告されている(非特許文献7)。また、フィブリノゲンを介する血小板凝集に伴う腫瘍血栓形成は、ナチュラルキラー細胞を中心とした宿主の免疫機構に対し防御的に働くことが知られている(非特許文献8~10)。更に、フィブリノゲンは、癌細胞自身が発現するICAM-1等のフィブリノゲンに対する受容体を介して、癌細胞の血管内皮細胞への接着や、血管外浸潤、という転移巣成立の重要なステップにかかわっている可能性が報告されている(非特許文献11)。
これらの知見から、フィブリノゲンが癌の転移の過程に積極的に関与すると考えられる。フィブリノゲンは、それ自体では血液凝固活性等の生理活性を有しておらず、生体内においてトロンビン等のプロテアーゼにより分解され、種々の断片となった段階で初めて種々の生理活性を発揮するが、どの断片が実際に癌の転移に関連し、機能的な役割を果たすのかについては不明である。
一方、特許文献3には、ヒトフィブリノゲンα-E鎖の分解物であって分子量5,900のタンパク質が、肝臓疾患診断用マーカーとして有用であることが記載されている。
Endocr.J.,44(5):751-7(1997)
Blood, 96: 3302-3309 (2000)
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Tromb. Haemost., 89: 1089-1097 (2003)
本発明の目的は、種々の癌の転移の早期発見を可能にするヒトの癌転移マーカーを提供することであり、癌患者の生体試料中の該マーカー量を測定することによる転移の早期診断方法を提供することである。
本発明者らは、上記の目的を達成すべく、腫瘍マーカーをはじめとする疾患マーカーの探索に威力を発揮しているプロテインチップを用いた質量分析により、癌患者の転移発症前後における血清サンプル中のプロテオームを経時的に解析した。特に以前、骨転移マーカーとして特定した、骨転移発症前から発症後・治療開始までの血清中で経時的に増加し、治療により減少する分子量約5,800のピークについて詳細に解析したところ、このピークは、当初予測されたアズロシジンの断片ではなく、フィブリノゲンの断片であることを見出した。更に、このフィブリノゲン断片が、骨転移のみならず、種々の癌の転移マーカーとして有用であり、更に、血管新生を促進するなどして、癌細胞の転移を促進すること、癌細胞や癌周囲の新生血管に結合することを有することを見出して、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下に関する。
[1]配列番号4で示されるアミノ酸配列からなるペプチド。
[2][1]のペプチドに対する抗体。
[3]癌患者における転移の診断方法であって、該患者由来の生体試料における[1]のペプチドの発現を検出することを特徴とする方法。
[4]生体試料が血漿または血清である[3]の方法。
[5][2]の抗体を用いて[1]のペプチドを検出することを特徴とする、[3]または[4]の方法。
[6]以下の(1)~(3)から選択されるいずれかのペプチド又は該ペプチドを発現し得る発現ベクターを含む、血管新生促進剤:
(1)配列番号1で表されるアミノ酸配列を含むペプチド;
(2)配列番号1で表されるアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ血管新生促進活性を有するペプチド;及び
(3)配列番号1で表されるアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ血管新生促進活性を有するペプチド。
[7]以下の(1)~(3)から選択されるいずれかのペプチド又は該ペプチドを発現し得る発現ベクターを含む、癌転移促進剤:
(1)配列番号1で表されるアミノ酸配列を含むペプチド;
(2)配列番号1で表されるアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ血管新生促進活性を有するペプチド;及び
(3)配列番号1で表されるアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ血管新生促進活性を有するペプチド。
[8]以下の(1)~(3)から選択されるいずれかのペプチド又は該ペプチドを発現し得る発現ベクターを含む、癌組織又はそれに伴う新生血管を検出するための画像診断用プローブ:
(1)配列番号1で表されるアミノ酸配列を含むペプチド;
(2)配列番号1で表されるアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ血管新生促進活性を有するペプチド;及び
(3)配列番号1で表されるアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ血管新生促進活性を有するペプチド。
[9]以下の(1)~(3)から選択されるいずれかのペプチドの発現を特異的に抑制するRNA干渉誘導性RNA若しくはアンチセンス核酸又はこれらの核酸を発現する発現ベクター、或いは(1)~(3)から選択されるいずれかのペプチドを特異的に認識し、且つその血管新生促進活性機能を阻害する抗体を含む、癌転移抑制剤:
(1)配列番号1で表されるアミノ酸配列を含むペプチド;
(2)配列番号1で表されるアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ血管新生促進活性を有するペプチド;及び
(3)配列番号1で表されるアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ血管新生促進活性を有するペプチド。
[10]哺乳動物に対し、以下の(1)~(3)から選択されるいずれかのペプチド又は該ペプチドを発現し得る発現ベクターの有効量を投与することを含む、該哺乳動物における血管新生の促進方法:
(1)配列番号1で表されるアミノ酸配列を含むペプチド;
(2)配列番号1で表されるアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ血管新生促進活性を有するペプチド;及び
(3)配列番号1で表されるアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ血管新生促進活性を有するペプチド。
[11]癌細胞を含む非ヒト哺乳動物に対し、以下の(1)~(3)から選択されるいずれかのペプチド又は該ペプチドを発現し得る発現ベクターの有効量を投与することを含む、該非ヒト哺乳動物における癌転移の促進方法:
(1)配列番号1で表されるアミノ酸配列を含むペプチド;
(2)配列番号1で表されるアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ血管新生促進活性を有するペプチド;及び
(3)配列番号1で表されるアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ血管新生促進活性を有するペプチド。
[12]被検哺乳動物に対し、以下の(1)~(3)から選択されるいずれかのペプチド又は該ペプチドを発現し得る発現ベクターを投与し、該哺乳動物の生体内での該ペプチドの局在化を画像化することを含む、該哺乳動物における癌組織又はそれに伴う新生血管を画像診断により検出する方法:
(1)配列番号1で表されるアミノ酸配列を含むペプチド;
(2)配列番号1で表されるアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ血管新生促進活性を有するペプチド;及び
(3)配列番号1で表されるアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ血管新生促進活性を有するペプチド。
[13]哺乳動物に対し、以下の(1)~(3)から選択されるいずれかのペプチドの発現を特異的に抑制するRNA干渉誘導性RNA若しくはアンチセンス核酸又はこれらの核酸を発現する発現ベクター、或いは(1)~(3)から選択されるいずれかのペプチドを特異的に認識し、且つその血管新生促進活性機能を阻害する抗体を投与することを含む、該哺乳動物における癌転移の抑制方法:
(1)配列番号1で表されるアミノ酸配列を含むペプチド;
(2)配列番号1で表されるアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ血管新生促進活性を有するペプチド;及び
(3)配列番号1で表されるアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ血管新生促進活性を有するペプチド。
[14]血管新生の促進に使用するための、以下の(1)~(3)から選択されるいずれかのペプチド又は該ペプチドを発現し得る発現ベクター:
(1)配列番号1で表されるアミノ酸配列を含むペプチド;
(2)配列番号1で表されるアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ血管新生促進活性を有するペプチド;及び
(3)配列番号1で表されるアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ血管新生促進活性を有するペプチド。
[15]癌組織又はそれに伴う新生血管の画像診断による検出に使用するための、以下の(1)~(3)から選択されるいずれかのペプチド又は該ペプチドを発現し得る発現ベクター:
(1)配列番号1で表されるアミノ酸配列を含むペプチド;
(2)配列番号1で表されるアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ血管新生促進活性を有するペプチド;及び
(3)配列番号1で表されるアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ血管新生促進活性を有するペプチド。
[16]癌転移の抑制に使用するための、以下の(1)~(3)から選択されるいずれかのペプチドの発現を特異的に抑制するRNA干渉誘導性RNA若しくはアンチセンス核酸又はこれらの核酸を発現する発現ベクター、或いは(1)~(3)から選択されるいずれかのペプチドを特異的に認識し、且つその血管新生促進活性機能を阻害する抗体:
(1)配列番号1で表されるアミノ酸配列を含むペプチド;
(2)配列番号1で表されるアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ血管新生促進活性を有するペプチド;及び
(3)配列番号1で表されるアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ血管新生促進活性を有するペプチド。
[1]配列番号4で示されるアミノ酸配列からなるペプチド。
[2][1]のペプチドに対する抗体。
[3]癌患者における転移の診断方法であって、該患者由来の生体試料における[1]のペプチドの発現を検出することを特徴とする方法。
[4]生体試料が血漿または血清である[3]の方法。
[5][2]の抗体を用いて[1]のペプチドを検出することを特徴とする、[3]または[4]の方法。
[6]以下の(1)~(3)から選択されるいずれかのペプチド又は該ペプチドを発現し得る発現ベクターを含む、血管新生促進剤:
(1)配列番号1で表されるアミノ酸配列を含むペプチド;
(2)配列番号1で表されるアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ血管新生促進活性を有するペプチド;及び
(3)配列番号1で表されるアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ血管新生促進活性を有するペプチド。
[7]以下の(1)~(3)から選択されるいずれかのペプチド又は該ペプチドを発現し得る発現ベクターを含む、癌転移促進剤:
(1)配列番号1で表されるアミノ酸配列を含むペプチド;
(2)配列番号1で表されるアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ血管新生促進活性を有するペプチド;及び
(3)配列番号1で表されるアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ血管新生促進活性を有するペプチド。
[8]以下の(1)~(3)から選択されるいずれかのペプチド又は該ペプチドを発現し得る発現ベクターを含む、癌組織又はそれに伴う新生血管を検出するための画像診断用プローブ:
(1)配列番号1で表されるアミノ酸配列を含むペプチド;
(2)配列番号1で表されるアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ血管新生促進活性を有するペプチド;及び
(3)配列番号1で表されるアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ血管新生促進活性を有するペプチド。
[9]以下の(1)~(3)から選択されるいずれかのペプチドの発現を特異的に抑制するRNA干渉誘導性RNA若しくはアンチセンス核酸又はこれらの核酸を発現する発現ベクター、或いは(1)~(3)から選択されるいずれかのペプチドを特異的に認識し、且つその血管新生促進活性機能を阻害する抗体を含む、癌転移抑制剤:
(1)配列番号1で表されるアミノ酸配列を含むペプチド;
(2)配列番号1で表されるアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ血管新生促進活性を有するペプチド;及び
(3)配列番号1で表されるアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ血管新生促進活性を有するペプチド。
[10]哺乳動物に対し、以下の(1)~(3)から選択されるいずれかのペプチド又は該ペプチドを発現し得る発現ベクターの有効量を投与することを含む、該哺乳動物における血管新生の促進方法:
(1)配列番号1で表されるアミノ酸配列を含むペプチド;
(2)配列番号1で表されるアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ血管新生促進活性を有するペプチド;及び
(3)配列番号1で表されるアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ血管新生促進活性を有するペプチド。
[11]癌細胞を含む非ヒト哺乳動物に対し、以下の(1)~(3)から選択されるいずれかのペプチド又は該ペプチドを発現し得る発現ベクターの有効量を投与することを含む、該非ヒト哺乳動物における癌転移の促進方法:
(1)配列番号1で表されるアミノ酸配列を含むペプチド;
(2)配列番号1で表されるアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ血管新生促進活性を有するペプチド;及び
(3)配列番号1で表されるアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ血管新生促進活性を有するペプチド。
[12]被検哺乳動物に対し、以下の(1)~(3)から選択されるいずれかのペプチド又は該ペプチドを発現し得る発現ベクターを投与し、該哺乳動物の生体内での該ペプチドの局在化を画像化することを含む、該哺乳動物における癌組織又はそれに伴う新生血管を画像診断により検出する方法:
(1)配列番号1で表されるアミノ酸配列を含むペプチド;
(2)配列番号1で表されるアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ血管新生促進活性を有するペプチド;及び
(3)配列番号1で表されるアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ血管新生促進活性を有するペプチド。
[13]哺乳動物に対し、以下の(1)~(3)から選択されるいずれかのペプチドの発現を特異的に抑制するRNA干渉誘導性RNA若しくはアンチセンス核酸又はこれらの核酸を発現する発現ベクター、或いは(1)~(3)から選択されるいずれかのペプチドを特異的に認識し、且つその血管新生促進活性機能を阻害する抗体を投与することを含む、該哺乳動物における癌転移の抑制方法:
(1)配列番号1で表されるアミノ酸配列を含むペプチド;
(2)配列番号1で表されるアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ血管新生促進活性を有するペプチド;及び
(3)配列番号1で表されるアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ血管新生促進活性を有するペプチド。
[14]血管新生の促進に使用するための、以下の(1)~(3)から選択されるいずれかのペプチド又は該ペプチドを発現し得る発現ベクター:
(1)配列番号1で表されるアミノ酸配列を含むペプチド;
(2)配列番号1で表されるアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ血管新生促進活性を有するペプチド;及び
(3)配列番号1で表されるアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ血管新生促進活性を有するペプチド。
[15]癌組織又はそれに伴う新生血管の画像診断による検出に使用するための、以下の(1)~(3)から選択されるいずれかのペプチド又は該ペプチドを発現し得る発現ベクター:
(1)配列番号1で表されるアミノ酸配列を含むペプチド;
(2)配列番号1で表されるアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ血管新生促進活性を有するペプチド;及び
(3)配列番号1で表されるアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ血管新生促進活性を有するペプチド。
[16]癌転移の抑制に使用するための、以下の(1)~(3)から選択されるいずれかのペプチドの発現を特異的に抑制するRNA干渉誘導性RNA若しくはアンチセンス核酸又はこれらの核酸を発現する発現ベクター、或いは(1)~(3)から選択されるいずれかのペプチドを特異的に認識し、且つその血管新生促進活性機能を阻害する抗体:
(1)配列番号1で表されるアミノ酸配列を含むペプチド;
(2)配列番号1で表されるアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ血管新生促進活性を有するペプチド;及び
(3)配列番号1で表されるアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ血管新生促進活性を有するペプチド。
本発明の転移ペプチドマーカーは、転移の症状が顕在化するより相当期間早い時期から血清中レベルが増加し始めるので、転移の早期発見と早期予防が可能となる。また、少ない用量の患者血清から解析が出来るので、患者負担が少ない。
更に、本発明の転移ペプチドは、血管新生促進剤として有用であり、癌転移に関連する血管新生の阻害剤のスクリーニング等に用いることができる。
更に、本発明の転移ペプチドは、血管新生促進剤として有用であり、癌転移に関連する血管新生の阻害剤のスクリーニング等に用いることができる。
本発明は、ヒトの癌転移マーカー、血管新生促進剤等として有用なペプチドを提供する。該ペプチド(以下、「本発明のペプチド」と称する場合がある)は、
(1)配列番号1で表されるアミノ酸配列;
(2)配列番号1で表されるアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列;又は
(3)配列番号1で表されるアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列
を含む。
(1)配列番号1で表されるアミノ酸配列;
(2)配列番号1で表されるアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列;又は
(3)配列番号1で表されるアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列
を含む。
配列番号1で示されるアミノ酸配列は、ヒトフィブリノゲンα-E鎖(配列番号3)の582~621位の断片に相当する。しかしながら、配列番号1で示されるアミノ酸配列からなるヒトフィブリノゲンα-E鎖の断片の存在はこれまで全く知られておらず、新規なペプチドである。
上記(2)のペプチドに含まれるアミノ酸配列は、配列番号1で表されるアミノ酸配列と90%以上、好ましくは95%以上、より好ましくは98%以上、更に好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列である。
ここで「同一性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて2つのアミノ酸配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメント(好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである)における、オーバーラップする全アミノ酸残基に対する、同一アミノ酸残基の割合(%)を意味する。
本明細書におけるアミノ酸配列の同一性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST-2(National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)を用い、以下の条件(マトリックス=BLOSUM62;ギャップオープン=11;ギャップエクステンション=1;x_ドロップオフ=50;期待値=10;フィルタリング=ON)にて計算することができる。アミノ酸配列の同一性を決定するためのアルゴリズムとしては、例えば、Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877 (1993) に記載のアルゴリズム[該アルゴリズムはNBLASTおよびXBLASTプログラム(version 2.0) に組み込まれている(Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402 (1997))]、Needleman et al., J. Mol. Biol., 48:444-453 (1970) に記載のアルゴリズム[該アルゴリズムはGCGソフトウェアパッケージ中のGAPプログラムに組み込まれている]、Myers and Miller, CABIOS, 4: 11-17 (1988) に記載のアルゴリズム[該アルゴリズムはCGC配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム (version 2.0) に組み込まれている]、Pearson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444-2448 (1988) に記載のアルゴリズム[該アルゴリズムはGCGソフトウェアパッケージ中のFASTAプログラムに組み込まれている]等が挙げられるが、それらに限定されない。
上記(3)のペプチドに含まれるアミノ酸配列は、配列番号1で表されるアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列、例えば、(1)配列番号1に示されるアミノ酸配列中の1又は複数(好ましくは1~10個、好ましくは1~数(2~5)個)のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、(2)配列番号1に示されるアミノ酸配列に1又は複数(好ましくは1~10個、より好ましくは1~数(2~5)個)のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列、(3)配列番号1に示されるアミノ酸配列に1又は複数(好ましくは1~10個、より好ましくは1~数(2~5)個)のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、(4)配列番号1に示されるアミノ酸配列中の1又は複数(好ましくは1~10個、より好ましくは1~数(2~5)個)のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または(5)上記(1)~(4)の変異が組み合わされたアミノ酸配列(この場合、変異したアミノ酸の総和が、好ましくは1~10個、より好ましくは1~数(2~5)個)である。
好ましい態様において、本発明のペプチドは、血管新生促進活性を有する。血管新生促進活性には、血管新生のない状態から血管新生を生じさせる活性(血管新生誘導活性)及び既にある血管新生を亢進する活性(血管新生亢進活性)が包含される。血管新生促進活性は、評価対象のペプチドをニワトリの有精卵の中へ注入して、胚が発生可能な条件下でインキュベートし、孵化前に胚を採取し、コントロール群(ペプチド非注入群)と比較して、新生血管の形成が亢進しているか否かを評価することにより決定することができる。
本発明のペプチドは、ペプチドの検出や精製等を容易にならしめるためのタグを含んでいてもよい。タグとしては、Flagタグ、ヒスチジンタグ、c-Mycタグ、HAタグ、AU1タグ、GSTタグ、MBPタグ、蛍光タンパク質タグ(例えばGFP、YFP、RFP、CFP、BFP等)、イムノグロブリンFcタグ等を挙げることが出来る。付加配列の位置は、本発明のペプチドが有する血管新生促進活性を損なわない限り特に限定されないが、好ましくは、該ペプチドの末端(N末端又はC末端)である。
本発明のペプチドの長さは、血管新生促進活性を有する限り特に限定されないが、通常1000アミノ酸以下、好ましくは500アミノ酸以下、100アミノ酸以下、80アミノ酸以下、70アミノ酸以下、60アミノ酸以下、55アミノ酸以下、54アミノ酸以下、53アミノ酸以下、52アミノ酸以下、51アミノ酸以下、50アミノ酸以下、49アミノ酸以下、48アミノ酸以下、47アミノ酸以下、46アミノ酸以下、45アミノ酸以下、44アミノ酸以下、43アミノ酸以下、42アミノ酸以下、41アミノ酸以下、又は40アミノ酸以下である。
本発明のペプチドは、最も好ましくは配列番号1で示されるアミノ酸配列を含む。該ペプチドの長さは、好ましくは53アミノ酸以下である。配列番号1で示されるアミノ酸配列を含むペプチドの好適な態様としては、配列番号4で示されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号4で示されるアミノ酸配列の部分配列からなり、且つ配列番号1で示されるアミノ酸配列を含むペプチド、及び配列番号5で示されるアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。この配列番号4で示されるアミノ酸配列からなるペプチドを「本発明のペプチド1」と称する。
本発明はまた、本発明のペプチド1を転移マーカーとして、癌患者由来の生体試料におけるその発現を検出することによる、該患者における転移の診断方法を提供する。ここで「転移の診断」とは、既に転移が起こっているか否かの判定だけでなく、まだ転移は起こっていないが、近い将来起こる可能性が高いか否かを判定することを包含する意味で使用される。
本発明の診断方法の被検対象となり得る癌患者は、癌の原発巣に特に制限はない。該方法は、転移を生じ得るあらゆる癌(例:乳癌、肺癌、前立腺癌、甲状腺癌、腎癌、胃癌、肝癌、子宮癌、大腸癌、皮膚癌など)に罹患したヒトに適用可能であるが、特に乳癌、肝癌、胃癌、および皮膚癌患者に対して好ましく適用される。患者の年齢、性別等は何ら限定されない。
癌の転移巣についても特に制限はない。本発明の診断方法は、転移巣となり得るあらゆる組織(例、骨、骨髄、リンパ節、肺、肝臓、皮膚、脳など)への転移について適用可能である。
被検試料となる患者由来の生体試料は特に限定されないが、患者への侵襲が少ないものであることが好ましく、例えば、血液、血清、血漿、唾液、粘膜、涙などの人から分泌されるものや、生検から採取されるものが挙げられる。
血清や血漿を用いる場合、常法に従って患者から採血し、液性成分を分離することにより調製することができる。検出対象である本発明のペプチドは分子量約5,800であるので、必要に応じて、スピンカラムなどを用いて、予め高分子量の蛋白質画分などを分離除去しておくこともできる。また、後述するように、検出対象を本発明のペプチドをコードするmRNAとする場合には、採取した血液から常法を用いて全RNAもしくはポリ(A)+RNA画分を抽出・精製しておいてもよい。
生体試料における本発明のペプチド1の発現は、該ペプチドもしくはそれをコードするmRNAを従来公知の方法を用いて検出することにより調べることができる。例えば、本発明のペプチドを検出する場合は、該試料を陽イオン交換体に接触させた後、適当な条件で洗浄し、該陽イオン交換体に結合した成分から、分子量約5,800のペプチドを検出することによって行うことができる。ここで「陽イオン交換体」とは、負の荷電基を持ち、陽イオンを捕捉するイオン交換体をいい、その性状により強陽イオン交換体(例えば、プロピルスルホン酸、ベンゼンスルホン酸等を官能基とするスチレン系、アクリル系等の母体構造を有する不溶性担体など)、および弱陽イオン交換体(例えば、カルボキシメチル基、カルボキシエチル基等を官能基とするスチレン系、アクリル系等の母体構造を有する不溶性担体など)に分けられる。本発明の方法においては、いずれの交換体でもよく、特に限定されないが、好ましくは弱陽イオン交換体が用いられる。
洗浄は水または緩衝液を用いて行うことができるが、例えば、pHは、各々の試料のターゲットマーカーの等電点に合わせて使用し、よってpH4~8のトリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酢酸緩衝液等が用いられる。
陽イオン交換体に結合した成分からの分子量約5,800のペプチドの検出は、例えば、陽イオン交換体に塩濃度を変化させながら溶離液(例:100~1000mM塩化ナトリウム水溶液など)を加えて吸着成分を溶出し、必要に応じて濃縮後、溶出液を各種の分子量測定法、例えば、ゲル電気泳動や、各種の分離精製法(例:イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなど)、イオン化法(例:電子衝撃イオン化法、フィールドディソープション法、二次イオン化法、高速原子衝突法、マトリックス支援レーザー脱離イオン化(MALDI)法、エレクトロスプレーイオン化法など)、質量分析計(例:二重収束質量分析計、四重極型分析計、飛行時間型質量分析計、フーリエ変換質量分析計、イオンサイクロトロン質量分析計など)を組み合わせる方法等に供することにより行うことができる。
分子量約5,800とは各測定方法の誤差の範囲を考慮したものであり、例えば、質量分析計を用いる方法による場合は、分子量5,813±0.5%(好ましくは±0.3%、より好ましくは±0.1%)の位置に出現するピーク強度を測定することが好ましい。
本発明の診断方法における分子量約5,800のペプチドの検出において、最も好ましい測定法として、陽イオン交換クロマトグラフィーと飛行時間型質量分析(TOF-MS)を組み合わせて、陽イオン交換体に一定条件下で捕捉されるすべての生体試料成分の質量を一括して測定する方法、とりわけ飛行時間型質量分析に使用するプローブの表面に陽イオン交換体を固定し、このプローブ表面と被検試料を接触させ、適当な条件で洗浄した後、該プローブ表面に捕捉された成分の質量を飛行時間型質量分析計で測定する方法などが挙げられる。陽イオン交換体としては、上記と同様のものを用いることができ、弱陽イオン交換体が特に好ましい。弱陽イオン交換体を表面に固定化した飛行時間型質量分析計に適合可能なプローブとしては、前記したサイファージェン・バイオシステムズ社製のCM10またはWCX2 ProteinChip Array(型番:C553-0075またはC553-0026)等が挙げられるが、それらに限定されない。洗浄は、上記した緩衝液等を用いて、室温等で行うことができる。質量分析は適当なマトリックスを用いてMALDI法で行うことが好ましく(MALDI-TOFMS)、使用するマトリックス分子としては、例えばシナピン酸(SPA)、飽和2,5-ジヒドロキシ安息香酸(DHB)、インドールアクリル酸(IAA)、桂皮酸などが挙げられる。
尚、分子量約5,800のペプチドのピークには、本発明のペプチド1に加えて、アズロシジンの断片(WO 2006/036002)が含まれる可能性があるため、この分子量約5,800のペプチドのピークをProFound検索(http://prowl.rockefeller.edu/profound_bin/WebProFound.exe)してペプチドマスフィンガープリンティングを行い、本発明のペプチド1であるフィブリノゲン断片由来のピークであることをアミノ酸配列決定によって確認するか、本発明のペプチド1をアズロシジン断片と分離した上で、本発明のペプチドのピークを測定することが好ましい。
本発明の診断方法における本発明のペプチド1の検出は、該ペプチドに対する抗体を用いて行うこともできる。本発明のペプチド1に対する抗体は、例えば、本発明のペプチド1を、これを発現する癌患者由来の生体試料から単離・精製し、該ペプチドを抗原として動物を免疫することにより調製することができる。あるいは、得られるペプチド量が少量である場合等は、該ペプチドをペプチダーゼ等によって部分消化し、得られる断片のアミノ酸配列をエドマン法などにより決定し、その配列を基に該ペプチドをコードする核酸とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドを合成、これをプローブとして該患者由来のcDNAラリブラリーを鋳型にハイブリダイゼーション法により該ペプチドをコードするcDNAを得るか、あるいは該オリゴヌクレオチドをプライマーとして該患者由来のRNAを鋳型にしてRT-PCRを行うことにより、該ペプチドをコードするcDNAを得て、該cDNAを適当な発現ベクターに組み込んで適当な宿主細胞に導入し、得られる形質転換体を培養して組換えペプチドを採取することによって、本発明のペプチド1を大量に調製することができる。あるいは上記のようにして得られるcDNAを鋳型として、無細胞転写・翻訳系を用いて本発明のペプチド1を取得することもできる。
あるいはまた、上記の陽イオン交換体と質量分析を組み合わせた検出法において、タンデム質量分析(MS/MS)法を用いることにより、直接本発明のペプチド1のアミノ酸配列を同定し、該配列情報に基づいて該ペプチドの全部もしくは一部を合成し、これを抗原(ハプテン)として利用することもできる。MS/MS法を用いたペプチド同定法としては、MS/MSスペクトルを解析してアミノ酸配列を決定するde novo sequencing法と、MS/MSスペクトル中に含まれる部分的な配列情報(質量タグ)を用いてデータベース検索を行い、ペプチドを同定する方法等が挙げられる。
上述のように、本発明のペプチド1はヒトフィブリノゲンα-E鎖の断片であり、そのアミノ酸配列は配列番号4である。従って、本発明のペプチド1に対する抗体は、例えば、配列番号4で示されるアミノ酸配列の全部もしくは一部からなるペプチドを、上記アミノ酸配列情報に基づき、公知のペプチド合成法を用いて合成するか、あるいは単離したヒトフィブリノゲンα-E鎖を適当なペプチダーゼ等で切断して、配列番号4で示されるアミノ酸配列の全部もしくは一部を含むペプチド断片を取得し、これを免疫原として調製することが望ましい。
本発明のペプチド1に対する抗体(以下、「本発明の抗体」と称する場合がある)は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれであってもよく、周知の免疫学的手法により作製することができる。また、該抗体は完全抗体分子だけでなくそのフラグメントをも包含し、例えば、Fab、F(ab’)2、ScFv、minibody等が挙げられる。例えば、ポリクローナル抗体は、上記のいずれかの方法または他の方法によって調製された本発明のペプチドもしくはその部分ペプチド(必要に応じて、ウシ血清アルブミン、KLH(Keyhole Limpet Hemocyanin)等のキャリアータンパク質に架橋した複合体とすることもできる)を抗原として、市販のアジュバント(例えば、完全または不完全フロイントアジュバント)とともに、動物の皮下あるいは腹腔内に2~3週間おきに2~4回程度投与し(部分採血した血清の抗体価を公知の抗原抗体反応により測定し、その上昇を確認しておく)、最終免疫から約3~約10日後に全血を採取して抗血清を精製することにより取得できる。抗原を投与する動物としては、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、ハムスターなどの哺乳動物が挙げられる。
また、モノクローナル抗体は、細胞融合法(例えば、渡邊武、細胞融合法の原理とモノクローナル抗体の作成、谷内昭、高橋利忠編、「モノクローナル抗体とがん-基礎と臨床-」、第2-14頁、サイエンスフォーラム出版、1985年)により作成することができる。例えば、本発明のペプチドもしくはその部分ペプチドを市販のアジュバントと共にマウスに2~4回皮下あるいは腹腔内に投与し、最終投与の約3日後に脾臓あるいはリンパ節を採取し、白血球を採取する。この白血球と骨髄腫細胞(例えば、NS-1、P3X63Ag8など)を細胞融合して該ペプチドに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得る。細胞融合はPEG法[J.Immunol.Methods,81(2):223-228(1985)]でも電圧パルス法[Hybridoma,7(6):627-633(1988)]であってもよい。所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、周知のEIAまたはRIA法等を用いて抗原と特異的に結合する抗体を、培養上清中から検出することにより選択できる。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの培養は、インビトロ、またはマウスもしくはラット、このましくはマウス腹水中等のインビボで行うことができ、抗体はそれぞれハイブリドーマの培養上清および動物の腹水から取得することができる。
本発明の抗体を用いる本発明の診断方法は、特に制限されるべきものではなく、被検試料中の抗原量に対応した抗体、抗原もしくは抗体-抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法等が好適に用いられる。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔125I〕、〔131I〕、〔3H〕、〔14C〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β-ガラクトシダーゼ、β-グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン-アビジン系を用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通常タンパク質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等が挙げられる。
サンドイッチ法においては、不溶化した本発明の抗体に被検試料を反応させ(1次反応)、さらに標識化した別の本発明の抗体を反応させ(2次反応)た後、不溶化担体上の標識剤の量(活性)を測定することにより、被検試料中の本発明のペプチド量を定量することができる。1次反応と2次反応は逆の順序に行っても、また、同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。
本発明のペプチド1に対するモノクローナル抗体を、サンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることもできる。
競合法では、被検試料中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させた後、未反応の標識抗原(F)と、抗体と結合した標識抗原(B)とを分離し(B/F分離)、B、Fいずれかの標識量を測定し、被検試料中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、B/F分離をポリエチレングリコール、前記抗体に対する第2抗体などを用いる液相法、および、第1抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、第1抗体は可溶性のものを用い第2抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。イムノメトリック法では、被検試料の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるいは、被検試料中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させた後、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被検試料中の抗原量を定量する。
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検試料中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のペプチド1の測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。
例えば、入江 寛編「ラジオイムノアッセイ」(講談社、昭和49年発行)、入江 寛編「続ラジオイムノアッセイ」(講談社、昭和54年発行)、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」(医学書院、昭和53年発行)、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」(第2版)(医学書院、昭和57年発行)、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」(第3版)(医学書院、昭和62年発行)、「Methods in ENZYMOLOGY」Vol.70(Immunochemical Techniques(Part A))、同書Vol.73(Immunochemical Techniques(Part B))、同書Vol.74(Immunochemical Techniques(Part C))、同書Vol.84(Immunochemical Techniques(Part D:Selected Immunoassays))、同書Vol.92(Immunochemical Techniques(Part E:Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods))、同書Vol.121(Immunochemical Techniques(Part I:Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies))(以上、アカデミックプレス社発行)などを参照することができる。
あるいは、本発明の抗体を用いる別の本発明の診断方法として、該抗体を上記したような質量分析計に適合し得るプローブの表面上に固定化し、該プローブ上の該抗体に被検試料を接触させ、該抗体に捕捉された生体試料成分を質量分析にかけ、分子量約5,800のペプチドのピークを検出する方法が挙げられる。この方法を採用することにより、分子量約5,800のペプチドのピークから、アズロシジン断片に由来するシグナルを除き、本発明のペプチドに由来するシグナルのみを特異的且つ正確に定量することができる。
本発明の診断方法において、生体試料における本発明のペプチド1の発現を、該ペプチドをコードするmRNA(即ち、分解により該ペプチドを生ずるヒトフィブリノゲンα-E鎖をコードするmRNA、具体的には、配列番号2に示される塩基配列を含むRNA)を検出することにより行う場合、該mRNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸(プローブ)や、該mRNAの一部もしくは全部を増幅するプライマーとして機能し得るオリゴヌクレオチドのセットを用いて、ノーザンハイブリダイゼーションやRT-PCRなどにより行うことができる。プローブとして用いられる核酸は、DNAであってもRNAであってもよく、あるいはDNA/RNAキメラであってもよい。好ましくはDNAが挙げられる。また、該核酸は二本鎖であっても一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖DNA、二本鎖RNAまたはDNA:RNAのハイブリッドでもよい。該核酸の長さは標的mRNAと特異的にハイブリダイズし得る限り特に制限はなく、例えば約15塩基以上、好ましくは約30塩基以上である。該核酸は、標的mRNAの検出・定量を可能とするために、標識剤により標識されていることが好ましい。標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔32P〕、〔3H〕、〔14C〕などが用いられる。酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β-ガラクトシダーゼ、β-グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、プローブと標識剤との結合にビオチン-(ストレプト)アビジンを用いることもできる。
プライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドのセットとしては、ヒトフィブリノゲンα-E鎖をコードするmRNAの塩基配列(センス鎖)およびそれに相補的な塩基配列(アンチセンス鎖)とそれぞれ特異的にハイブリダイズすることができ、それらに挟まれるDNA断片を増幅し得るものであれば特に制限はなく、例えば、各々約15~約100塩基、好ましくは各々約15~約50塩基の長さを有し、約100bp~数kbpのDNA断片を増幅するようにデザインされたオリゴDNAのセットが挙げられる。
微量RNA試料を用いて本発明のペプチド1の遺伝子発現を定量的に解析するためには、競合RT-PCRまたはリアルタイムRT-PCRを用いることが好ましい。競合RT-PCRとは、目的のDNAを増幅し得るプライマーのセットにより増幅され得る既知量の他の鋳型核酸をcompetitorとして反応液中に共存させて競合的に増幅反応を起こさせ、増幅産物の量を比較することにより、目的DNAの量を算出する方法をいう。従って、競合RT-PCRを用いる場合、上記プライマーセットに加えて、該プライマーセットにより増幅され、目的DNAと区別することができる増幅産物(例えば、目的のDNAとはサイズの異なる増幅産物、制限酵素処理により異なる泳動パターンを示す増幅産物など)を生じる核酸をさらに含有することができる。このcompetitor核酸はDNAであってもRNAであってもよい。DNAの場合、RNA試料から逆転写反応によりcDNAを合成した後にcompetitorを添加してPCRを行えばよく、RNAの場合は、RNA試料に最初から添加してRT-PCRを行うことができる。後者の場合、逆転写反応の効率も考慮に入れているので、元のmRNAの絶対量を推定することができる。
一方、リアルタイムRT-PCRは、PCRの増幅量をリアルタイムでモニタリングできるので、電気泳動が不要で、より迅速に本発明のペプチドの遺伝子発現を解析可能である。通常、モニタリングは種々の蛍光試薬を用いて行われる。これらの中には、SYBRGreen I、エチジウムブロマイド等の二本鎖DNAに結合することにより蛍光を発する試薬(インターカレーター)の他、上記プローブとして用いることができる核酸(但し、該核酸は増幅領域内で標的核酸にハイブリダイズする)の両端をそれぞれ蛍光物質(例:FAM、HEX、TET、FITC等)および消光物質(例:TAMRA、DABCYL等)で修飾したもの等が含まれる。
上記プローブとして用いる核酸は、ヒトフィブリノゲンα-E鎖をコードするcDNAやその断片(例えば、配列番号4で示されるペプチド等)をコードするDNAであってよく、あるいはその塩基配列情報(配列番号2参照)に基づいて、市販のDNA/RNA自動合成機等を用いて化学的に合成することによって得られるものであってもよい。また、上記プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドのセットは、上記塩基配列情報に基づいて、該塩基配列およびその相補鎖配列の一部を市販のDNA/RNA自動合成機等を用いて化学的に合成することによって得ることができる。
本発明の診断方法は、癌患者から時系列で生体試料を採取し、各試料における本発明のペプチドの発現の経時変化を調べることにより行うことが好ましい。生体試料の採取間隔は特に限定されないが、転移の早期発見という本発明の目的を考慮すれば、患者のQOLを損なわない範囲でできるだけ頻繁にサンプリングすることが望ましく、例えば、血液(血清、血漿)を試料とする場合には、約1ヶ月間の間隔で採血を行うことが好ましい。各試料について上記のようにして本発明のペプチド1の発現を調べ、経時的に該ペプチドの発現が増加した場合には、転移が起こっている、もしくは近い将来転移を起こす可能性が高いと判定することができる。
後述の実施例において示される通り、本発明のペプチド1の発現は、転移の発症後、転移に対する治療が奏効した場合には減少傾向を示す。従って、本発明の診断方法は、転移発症後の患者における治療効果の早期判定にも用いることができる。例えば、転移に対する治療開始から一定期間を経過しても本発明のペプチド1の発現が低下しないか増加し続ける場合には、治療計画の変更等を考慮すべきであると判定することができる。また、実際に転移が起こる前に本発明のペプチド1の発現増加が認められ、転移に対する予防的措置を施した場合に、継続的に本発明のペプチド1の発現をモニタリングすることにより予防効果の成否を判定することもできる。
本発明のペプチドは、血管新生促進活性を有しているので、本発明のペプチドや、これを発現し得る発現ベクターは血管新生促進剤として有用である。即ち、本発明は上記本発明のペプチド又は該ペプチドを発現し得る発現ベクターを含む、血管新生促進剤を提供するものである。血管新生促進量の本発明のペプチド又は発現し得る発現ベクターを哺乳動物へ投与することにより、該哺乳動物内における血管新生を促進することができる。
本発明のペプチドを発現し得る発現ベクターは、上述のペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド(好ましくはDNA)が、投与対象である哺乳動物(好ましくはヒト)の細胞内でプロモーター活性を発揮し得るプロモーターに機能的に連結されている。
使用されるプロモーターは、投与対象である哺乳動物の細胞内で機能し得るものであれば特に制限はない。プロモーターとしては、polI系プロモーター、polII系プロモーター、polIII系プロモーター等を使用することができる。具体的には、SV40由来初期プロモーター、サイトメガロウイルスLTR等のウイルスプロモーター、β-アクチン遺伝子プロモーター等の哺乳動物の構成蛋白質遺伝子プロモーター、並びにtRNAプロモーター等のRNAプロモーター等が用いられる。
発現ベクターは、上述のポリヌクレオチドの下流に転写終結シグナル、すなわちターミネーター領域を含有する。さらに、形質転換細胞選択のための選択マーカー遺伝子(テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン等の薬剤に対する抵抗性を付与する遺伝子、栄養要求性変異を相補する遺伝子等)をさらに含有することもできる。
本発明において発現ベクターに使用されるベクターの種類は特に制限されないが、ヒト等の哺乳動物への投与に好適なベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス等のウイルスベクターが挙げられる。このうち、アデノウイルスは、遺伝子導入効率が極めて高く、非***細胞にも導入可能である等の利点を有する。但し、導入遺伝子の宿主染色体への組込みは極めて稀であるので、遺伝子発現は一過性で通常約4週間程度しか持続しない。治療効果の持続性を考慮すれば、比較的遺伝子導入効率が高く、非***細胞にも導入可能で、且つ逆位末端繰り返し配列(ITR)を介して染色体に組み込まれ得るアデノ随伴ウイルスの使用もまた好ましい。
本発明の血管新生促進剤は、血管新生促進量の本発明のペプチド又はこれを発現し得る発現ベクターに加え、任意の担体、例えば医薬上許容される担体を含むことができる。
医薬上許容される担体としては、例えば、ショ糖、デンプン等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル等の滑剤、クエン酸、メントール等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリド等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水等の希釈剤、ベースワックス等が挙げられるが、それらに限定されるものではない。
発現ベクターの細胞内への導入を促進するために、本発明の血管新生促進剤は更に核酸導入用試薬を含むことができる。該ポリヌクレオチドがウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターに組み込まれている場合には、遺伝子導入試薬としてはレトロネクチン、ファイブロネクチン、ポリブレン等を用いることができる。また、該ポリヌクレオチドがプラスミドベクターに組み込まれている場合は、リポフェクチン、リプフェクタミン(lipfectamine)、DOGS(トランスフェクタム)、DOPE、DOTAP、DDAB、DHDEAB、HDEAB、ポリブレン、あるいはポリ(エチレンイミン)(PEI)等の陽イオン性脂質を用いることが出来る。
経口投与に好適な製剤としては、液剤、カプセル剤、サッシェ剤、錠剤、懸濁液剤、乳剤等を挙げることができる。
非経口的な投与(例えば、皮下注射、筋肉注射、局所注入、腹腔内投与など)に好適な製剤としては、水性および非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性および非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分および医薬上許容される担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解または懸濁すればよい状態で保存することもできる。
医薬組成物中の本発明のペプチド又はこれを発現し得る発現ベクターの含有量は、例えば、医薬組成物全体の約0.001ないし100重量%である。
本発明の血管新生促進剤の投与量は、有効成分の活性や種類、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なり一概に云えないが、通常、成人1日あたり有効成分量として約0.001~約500mg/kgである。
本発明の血管新生促進剤は、好ましくは、血管新生促進量の本発明のペプチド又はこれを発現し得る発現ベクターが、血管新生の促進が望まれる部位に送達されるように、哺乳動物(例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ウシ、サル、ヒト)に対して投与される。
本発明の血管新生促進剤を、十分な血管の新生が行われることによって改善されうる疾患の患者に投与すると、該患者において血管新生が促進され、該疾患の治療を行うことができる。ここでいう十分な血管の新生が行われることによって改善されうる疾患としては、虚血性疾患、褥瘡、創傷などが含まれる。具体的には、閉塞性動脈硬化症、バージャー病、血管損傷、動脈塞栓症、動脈血栓症、動脈瘤、脊柱管狭窄症、閉塞性血栓血管炎、狭心症、心筋梗塞、心筋症、冠動脈硬化、心不全、脳梗塞などの虚血性疾患;褥瘡;裂創、擦過創、切創、刺創、挫創、咬創などの創傷;熱傷(熱・化学薬品・放射線などによる)が挙げられるが、これらに限定はされない。
また、本発明の血管新生促進剤はインビトロで使用してもよい。例えば、血管新生促進量の本発明のペプチド又はこれを発現し得る発現ベクターの存在中で、血管内皮細胞や血管含有組織を培養することにより、該血管内皮細胞や血管含有組織における血管新生を促進することができる。このようなインビトロにおける血管新生促進は、癌の転移に伴う血管新生のメカニズムを解析する上で有用である。
また、本発明のペプチド又はこれを発現し得る発現ベクターによる、血管内皮細胞や血管含有組織における血管新生促進を阻害する化合物をスクリーニングすることにより、癌の転移に伴う血管新生を阻害する医薬の候補化合物を見出すことができる。具体的には、
(1)被検化合物、及び血管新生促進量の本発明のペプチド又はこれを発現し得る発現ベクターの存在下で、血管内皮細胞又は血管含有組織を培養し、
(2)被検化合物存在下で培養した血管内皮細胞又は血管含有組織における血管新生レベルを測定し、該血管新生レベルを、コントロール(被検化合物不在下であること以外の培養条件は(1)と同一)における血管新生レベルと比較し、
(3)比較結果に基づき、血管新生レベルを抑制した被検化合物を選択することにより、血管新生阻害剤の候補化合物をスクリーニングすることができる。
(1)被検化合物、及び血管新生促進量の本発明のペプチド又はこれを発現し得る発現ベクターの存在下で、血管内皮細胞又は血管含有組織を培養し、
(2)被検化合物存在下で培養した血管内皮細胞又は血管含有組織における血管新生レベルを測定し、該血管新生レベルを、コントロール(被検化合物不在下であること以外の培養条件は(1)と同一)における血管新生レベルと比較し、
(3)比較結果に基づき、血管新生レベルを抑制した被検化合物を選択することにより、血管新生阻害剤の候補化合物をスクリーニングすることができる。
(3)で得られた候補化合物は、細胞毒性により血管新生を阻害している可能性も考えられるため、その効果を生体内において確認してもよい。例えば、該候補化合物を非ヒト哺乳動物へ投与し、該非ヒト哺乳動物における血管新生レベルをコントロール非ヒト哺乳動物(候補化合物を投与しないこと以外の飼育条件が候補化合物を投与した非ヒト哺乳動物と同一)と比較し、比較結果に基づき該非ヒト哺乳動物における血管新生を阻害した候補化合物を、血管新生阻害剤として選択する。
本発明のペプチドは、癌細胞の転移を促進する活性を有しているので、本発明のペプチドや、これを発現し得る発現ベクターは癌転移促進剤として有用である。即ち、本発明は上記本発明のペプチド又は該ペプチドを発現し得る発現ベクターを含む、癌転移促進剤を提供するものである。本発明の癌転移促進剤は、インビトロやインビボにおける癌転移モデルの構築に有用である。癌転移促進量の本発明のペプチド又は発現し得る発現ベクターを癌細胞と共に非ヒト哺乳動物へ投与することにより、該癌細胞の血行性の転移を促進し、該非ヒト哺乳動物を用いた癌転移モデルを構築することができる。
癌の種類としては、転移を生じ得るあらゆる癌が包含され、例えば、乳癌、肺癌、前立腺癌、甲状腺癌、腎癌、胃癌、肝癌、子宮癌、大腸癌、皮膚癌などが挙げられる。癌は好ましくは、肺癌、乳癌、肝癌、胃癌、又は皮膚癌である。
癌の転移巣についても特に制限はなく、転移巣となり得るあらゆる組織(例、骨、骨髄、リンパ節、肺、肝臓、皮膚、脳などが包含される。
本発明のペプチドを発現し得る発現ベクターは、上述のペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド(好ましくはDNA)が、投与対象である哺乳動物(好ましくはヒト)の細胞内でプロモーター活性を発揮し得るプロモーターに機能的に連結されている。
使用されるプロモーターは、投与対象である哺乳動物の細胞内で機能し得るものであれば特に制限はない。プロモーターとしては、polI系プロモーター、polII系プロモーター、polIII系プロモーター等を使用することができる。具体的には、SV40由来初期プロモーター、サイトメガロウイルスLTR等のウイルスプロモーター、β-アクチン遺伝子プロモーター等の哺乳動物の構成蛋白質遺伝子プロモーター、並びにtRNAプロモーター等のRNAプロモーター等が用いられる。
発現ベクターは、上述のポリヌクレオチドの下流に転写終結シグナル、すなわちターミネーター領域を含有する。さらに、形質転換細胞選択のための選択マーカー遺伝子(テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン等の薬剤に対する抵抗性を付与する遺伝子、栄養要求性変異を相補する遺伝子等)をさらに含有することもできる。
本発明において発現ベクターに使用されるベクターの種類は特に制限されないが、ヒト等の哺乳動物への投与に好適なベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス等のウイルスベクターが挙げられる。このうち、アデノウイルスは、遺伝子導入効率が極めて高く、非***細胞にも導入可能である等の利点を有する。但し、導入遺伝子の宿主染色体への組込みは極めて稀であるので、遺伝子発現は一過性で通常約4週間程度しか持続しない。治療効果の持続性を考慮すれば、比較的遺伝子導入効率が高く、非***細胞にも導入可能で、且つ逆位末端繰り返し配列(ITR)を介して染色体に組み込まれ得るアデノ随伴ウイルスの使用もまた好ましい。
本発明の癌転移促進剤は、癌転移促進量の本発明のペプチド又はこれを発現し得る発現ベクターに加え、任意の担体、例えば医薬上許容される担体を含むことができる。
医薬上許容される担体としては、例えば、ショ糖、デンプン等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル等の滑剤、クエン酸、メントール等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリド等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水等の希釈剤、ベースワックス等が挙げられるが、それらに限定されるものではない。
発現ベクターの細胞内への導入を促進するために、本発明の癌転移促進剤は更に核酸導入用試薬を含むことができる。該ポリヌクレオチドがウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターに組み込まれている場合には、遺伝子導入試薬としてはレトロネクチン、ファイブロネクチン、ポリブレン等を用いることができる。また、該ポリヌクレオチドがプラスミドベクターに組み込まれている場合は、リポフェクチン、リプフェクタミン(lipfectamine)、DOGS(トランスフェクタム)、DOPE、DOTAP、DDAB、DHDEAB、HDEAB、ポリブレン、あるいはポリ(エチレンイミン)(PEI)等の陽イオン性脂質を用いることが出来る。
経口投与に好適な製剤としては、液剤、カプセル剤、サッシェ剤、錠剤、懸濁液剤、乳剤等を挙げることができる。
非経口的な投与(例えば、皮下注射、筋肉注射、局所注入、腹腔内投与など)に好適な製剤としては、水性および非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性および非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分および医薬上許容される担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解または懸濁すればよい状態で保存することもできる。
医薬組成物中の本発明のペプチド又はこれを発現し得る発現ベクターの含有量は、例えば、医薬組成物全体の約0.001ないし100重量%である。
本発明の癌転移促進剤の投与量は、有効成分の活性や種類、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なり一概に云えないが、通常、成人1日あたり有効成分量として約0.001~約500mg/kgである。
本発明の癌転移促進剤は、好ましくは、癌転移促進量の本発明のペプチド又はこれを発現し得る発現ベクターが、癌組織に送達されるように、担癌非ヒト哺乳動物(例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ウシ、サル)に対して投与される。或いは、本発明の癌転移促進剤を、癌細胞と混合し、該混合物を非ヒト哺乳動物へ注入することにより、該癌細胞の血管壁への接着や、癌細胞周辺における血管新生が促進され、その結果該癌細胞の非ヒト哺乳動物への生着率が上がり、転移巣の形成が促進される。
また、本発明の癌転移促進剤はインビトロで使用してもよい。例えば、癌転移促進量の本発明のペプチド又はこれを発現し得る発現ベクターの存在中で、癌細胞を培養することにより、該癌細胞の運動性を上げることができる。例えば、癌細胞を本発明のペプチドと混合し、混合物を培養容器へ播取する。そして、該癌細胞が培養容器へ接着した段階で、三次元培養用のゲル(例、マトリゲル、ペプチドハイドロゲル等)を積層する。癌細胞を培養することにより、ゲル中へ癌細胞が浸潤するが、本発明の癌転移促進剤の添加により、この浸潤が促進される。本発明のペプチド又はこれを発現し得る発現ベクターによる、インビトロにおける癌転移促進は、癌の転移メカニズムを解析する上で有用である。
また、本発明のペプチド又はこれを発現し得る発現ベクターによる、癌細胞転移促進を阻害する化合物をスクリーニングすることにより、癌転移を阻害する医薬の候補化合物を見出すことができる。具体的には、
(1)被検化合物、及び癌転移促進量の本発明のペプチド又はこれを発現し得る発現ベクターの存在下で、癌細胞を培養し、
(2)被検化合物存在下で培養した癌細胞の運動性のレベルを測定し、該運動性のレベルを、コントロール(被検化合物不在下であること以外の培養条件は(1)と同一)における運動性のレベルと比較し、
(3)比較結果に基づき、癌細胞の運動性のレベルを抑制した被検化合物を選択することにより、癌転移阻害剤の候補化合物をスクリーニングすることができる。
(1)被検化合物、及び癌転移促進量の本発明のペプチド又はこれを発現し得る発現ベクターの存在下で、癌細胞を培養し、
(2)被検化合物存在下で培養した癌細胞の運動性のレベルを測定し、該運動性のレベルを、コントロール(被検化合物不在下であること以外の培養条件は(1)と同一)における運動性のレベルと比較し、
(3)比較結果に基づき、癌細胞の運動性のレベルを抑制した被検化合物を選択することにより、癌転移阻害剤の候補化合物をスクリーニングすることができる。
(3)で得られた候補化合物は、細胞毒性により癌転移を阻害している可能性も考えられるため、その効果を生体内において確認してもよい。例えば、該候補化合物を担癌非ヒト哺乳動物へ投与し、該非ヒト哺乳動物における癌転移の程度をコントロール非ヒト哺乳動物(候補化合物を投与しないこと以外の飼育条件が候補化合物を投与した担癌非ヒト哺乳動物と同一)と比較し、比較結果に基づき該非ヒト哺乳動物における癌転移を阻害した候補化合物を、癌転移阻害剤として選択する。
本発明のペプチドは癌細胞や癌周囲の新生血管に結合するので、本発明のペプチドは癌組織やそれに伴う新生血管を検出するための画像診断用プローブとして用いることができる。従って、本発明は上記本発明のペプチドを含む癌組織又はそれに伴う新生血管を検出するための画像診断用プローブを提供するものである。本発明のペプチドを、適当な標識剤で標識して被検動物に投与し、生体内での該ペプチドの局在化を該標識剤を直接検出(画像化)することにより、癌組織又はそれに伴う新生血管の有無や程度を評価することができる。このような標識剤としては、例えば、適当な半減期を有する放射性同位元素を用いることが好ましい。より好ましくは、放射性同位元素は、シンチグラフィや、単光子放射計算断層撮影(SPECT)およびポジトロン断層撮影(PET)などの各種断層撮影において通常使用される核種である。シンチグラフィやSPECTに用いられる核種としては、例えば、99mTc、201Ti、67Ga、111In、123I、131I、125I、169Yb、186Re、99Mo等が挙げられる。特に好ましくは、99mTcが挙げられる。PET核種としては、例えば、15O、13N、11C、18F等が挙げられる。
放射性同位元素によるペプチドの標識は、各放射性同位元素について自体公知の方法をそれぞれ用いて行うことができる。例えば、99mTcでペプチドを標識する場合、例えばRADIOISOTOPES, 53: 155-178 (2004) に記載の手法に従って行うことができる。即ち、ペプチドに、必要に応じてリンカーを介して適当な配位子(例:DTPA、HMPAO、DMSA、MAAなど)を結合し、これをバイアルなどの容器に封入する。99Mo-99mTcジェネレータより溶出した過テクネチウム酸イオン(99mTcO4
-)を適当な還元剤(例:塩化第一スズなど)を用いて+1、+3、+4もしくは+5価の酸化数の状態にまで還元し、これをトレーサー化合物を封入した容器中に注入して振とうすることにより、99mTc標識されたトレーサー化合物を得ることができる。99mTcは目的の配位子と直接反応させてもよいし、あるいは最初にグルコン酸や酒石酸などの配位能の弱い配位子と反応させて該配位子との錯体を生成させた後、配位能の強い配位子を作用させて配位子交換を行ってもよい。リンカーとしては、テクネチウム錯体の製造に通常用いられているものを適宜選択して用いることができる。
SPECTやPETなどの放射性同位元素を用いる画像診断以外にも、本発明のペプチドは、MRIやCTに使用される非放射性の造影剤、例えば、ガドリニウム、ヨード、フッ素などで標識することにより、MRIやCTなどの画像診断用の造影剤として調製することもできる。あるいは、緑色蛍光蛋白質(GFP)などの蛍光物質や化学発光物質を生成するレポーター(例、ルシフェラーゼなど)で本発明のペプチドを標識することもできる。
標識された本発明のペプチドは、上記本発明の血管新生促進剤の場合と同様に製剤化することができ、同様の投与経路で投与することができる。また、本発明のペプチドが放射性同位元素で標識されている場合、単位用量あたり約0.0001~約10mCi、好ましくは約0.01~約0.1mCiの放射能強度を有する。単位用量の注射剤の容量としては、例えば、約0.01~約10mlである。
標識剤として放射性同位元素を用いた場合、被験動物体内での本発明のペプチドの局在化は、例えばシンチグラフィ、単光子放射計算断層撮影(SPECT)、ポジトロン断層撮影(PET)等、好ましくはSPECTもしくはPETにより検出・画像化される。シンチグラフィの場合、標識した本発明のペプチドを投与した後、その体内分布をシンチカメラにより描出する。SPECTおよびPETの場合、それぞれ専用の断層撮像装置を用いて横断断層面を描画する。撮像開始時間は、標識剤の核種にもよるが、例えば、トレーサーの投与直後~72時間後、好ましくは5分後~24時間後、より好ましくは10分後~4時間後が挙げられる。
標識剤としてルシフェラーゼを用いた場合、標識した本発明のペプチドを投与した後、ルシフェリンをさらに投与し、超高感度冷却CCDカメラを搭載したリアルタイムin vivoイメージング装置を用いて、化学発光をデジタル画像として可視化することにより、本発明のペプチドを検出することができる。他の蛍光もしくは発光物質を標識剤として用いた場合も、自体公知の方法を用いて該標識を検出することにより、本発明のペプチドの体内分布を描出することができる。
その結果、本発明のペプチドの集積が認められた場合、被検動物は癌組織やそれに伴う新生血管を有する可能性が高いと診断することができる。
また、更なる局面において、本発明は、上記本発明のペプチドの阻害剤を含む剤を提供する。本発明の剤は、癌転移抑制や、血管新生抑制(特に、癌細胞周辺における血管新生の抑制)のために有用である。本発明のペプチドの阻害剤を、癌に罹患した哺乳動物や、癌罹患歴があり、癌細胞を有する可能性がある哺乳動物に投与することにより、該哺乳動物における癌の転移を抑制することができる。また、本発明のペプチドの阻害剤を哺乳動物に投与することにより、該哺乳動物における血管新生(特に、癌細胞周辺における血管新生の抑制)を抑制することができる。
本発明のペプチドの阻害剤としては、以下を挙げることができる:
(1)本発明のペプチドの発現を特異的に抑制するRNA干渉誘導性RNA若しくはアンチセンス核酸又はこれらの核酸を発現する発現ベクター;及び
(2)本発明のペプチドを特異的に認識し、且つその血管新生促進活性機能を阻害する抗体。
(1)本発明のペプチドの発現を特異的に抑制するRNA干渉誘導性RNA若しくはアンチセンス核酸又はこれらの核酸を発現する発現ベクター;及び
(2)本発明のペプチドを特異的に認識し、且つその血管新生促進活性機能を阻害する抗体。
本発明のペプチドの発現を特異的に抑制するRNA干渉誘導性RNAとしては、例えば
(A)本発明のペプチドをコードするmRNA(成熟mRNA又は初期転写産物)のヌクレオチド配列又は18塩基以上のその部分配列に相補的なヌクレオチド配列を含む1本鎖又は2本鎖のRNA、及び
(B)本発明のペプチドをコードするmRNA(成熟mRNA又は初期転写産物)と投与対象の哺乳動物(例えばヒト等の霊長類やマウス等のげっ歯類)の細胞内でハイブリダイズし得る18塩基以上のヌクレオチド配列を含み、且つハイブリダイズすることにより本発明のペプチド発現のRNA干渉を誘導する1本鎖又は2本鎖のRNA
を挙げることができる。
(A)本発明のペプチドをコードするmRNA(成熟mRNA又は初期転写産物)のヌクレオチド配列又は18塩基以上のその部分配列に相補的なヌクレオチド配列を含む1本鎖又は2本鎖のRNA、及び
(B)本発明のペプチドをコードするmRNA(成熟mRNA又は初期転写産物)と投与対象の哺乳動物(例えばヒト等の霊長類やマウス等のげっ歯類)の細胞内でハイブリダイズし得る18塩基以上のヌクレオチド配列を含み、且つハイブリダイズすることにより本発明のペプチド発現のRNA干渉を誘導する1本鎖又は2本鎖のRNA
を挙げることができる。
本発明のペプチドをコードするmRNAとしては、配列番号2で示されるヌクレオチド配列のうち、ヒトフィブリノゲンα-E鎖(配列番号3)の582~621位をコードする部分(即ち、1802~1921位)を含むヌクレオチド(例えば、配列番号2で示されるヌクレオチド配列)を挙げることができる。本発明のペプチドの発現を特異的に抑制するRNA干渉誘導性RNAは、好適には、配列番号2で示されるヌクレオチド配列の1802~1921位の領域を標的とし、ヒトフィブリノゲンα-E鎖及びその断片である本発明のペプチドの発現を抑制する。
なお、本明細書においてヌクレオチド配列は、特にことわりのない限りDNAの配列として記載するが、ポリヌクレオチドがRNAである場合は、チミン(T)をウラシル(U)に適宜読み替えるものとする。
二本鎖RNAを細胞内に導入するとそのRNAに相補的なmRNAが分解される、いわゆるRNA干渉(RNAi)と呼ばれる現象は、以前から線虫、昆虫、植物等で知られていたが、最近、この現象が動物細胞でも起こることが確認されたことから[Nature, 411(6836): 494-498 (2001)]、リボザイムの代替技術として注目されている。
RNA干渉誘導性RNAは、代表的には、標的遺伝子のmRNAのヌクレオチド配列又はその部分配列(以下、標的ヌクレオチド配列)と相補的な配列を有するRNAとその相補鎖からなる2本鎖オリゴRNAである。また、ヘアピンループ部分を介して、標的ヌクレオチド配列に相補的な配列(第1の配列)と、その相補配列(第2の配列)とが連結された一本鎖RNAであって、ヘアピンループ型の構造をとることにより、第1の配列が第2の配列と2本鎖構造を形成するRNA(small hairpin RNA: shRNA)もRNA干渉誘導性RNAの好ましい態様の1つである。
RNA干渉誘導性RNAに含まれる、標的ヌクレオチド配列と相補的な部分の長さは、通常、約18塩基以上、好ましくは約19塩基以上、より好ましくは約21塩基以上の長さであるが、標的遺伝子の発現を特異的に抑制可能である限り、特に限定されない。RNA干渉誘導性RNAが23塩基よりも長い場合には、該RNA干渉誘導性RNAは細胞内で分解されて、約20塩基前後のsiRNAを生じ得るので、理論的には標的ヌクレオチド配列と相補的な部分の長さの上限は、標的遺伝子のmRNA(成熟mRNAもしくは初期転写産物)のヌクレオチド配列の全長である。しかし、インターフェロン誘導の回避、合成の容易さ、抗原性の問題等を考慮すると、該相補部分の長さは、例えば約50塩基以下、好ましくは約25塩基以下、最も好ましくは約23塩基以下である。即ち、該相補部分の長さは、通常、約18~50塩基、好ましくは約19~約25塩基、より好ましくは約21~約23塩基である。
また、RNA干渉誘導性RNAを構成する各RNA鎖の長さも、通常、約18塩基以上、好ましくは約19塩基以上、より好ましくは約21塩基以上の長さであるが、標的遺伝子の発現を特異的に抑制可能である限り、特に限定されず、理論的には各RNA鎖の長さの上限はない。しかし、インターフェロン誘導の回避、合成の容易さ、抗原性の問題等を考慮すると、RNA干渉誘導性RNAを構成する各RNA鎖の長さは、例えば約50塩基以下、好ましくは約25塩基以下、最も好ましくは約23塩基以下である。即ち、各RNA鎖の長さは、例えば通常、約18~50塩基、好ましくは約19~約25塩基、より好ましくは約21~約23塩基である。なお、shRNAの長さは、2本鎖構造をとった場合の2本鎖部分の長さとして示すものとする。
尚、本明細書において、全長が23塩基以下の2本鎖のRNA干渉誘導性RNAをsiRNAという。
標的ヌクレオチド配列と、RNA干渉誘導性RNAに含まれるそれに相補的な配列とは、完全に相補的であることが好ましい。しかし、当該相補配列の中央から外れた位置についての塩基の変異(少なくとも90%以上、好ましくは95%以上の同一性の範囲内であり得る)については、完全にRNA干渉による切断活性がなくなるのではなく、部分的な活性が残存し得る。他方、相補配列の中央部の塩基の変異は影響が大きく、RNA干渉によるmRNAの切断活性が極度に低下し得る。
RNA干渉誘導性RNAは、5’及び/又は3’末端に塩基対を形成しない、付加的な塩基を有していてもよい。該付加的塩基の長さは、RNA干渉誘導性RNAが標的遺伝子の発現を特異的に抑制可能である限り特に限定されないが、通常5塩基以下、例えば2~4塩基である。該付加的塩基は、DNAでもRNAでもよいが、DNAを用いるとsiRNAの安定性を向上させることができる。このような付加的塩基の配列としては、例えばug-3’、uu-3’、tg-3’、tt-3’、ggg-3’、guuu-3’、gttt-3’、ttttt-3’、uuuuu-3’などの配列が挙げられるが、これに限定されるものではない。
shRNAのヘアピンループのループ部分の長さは、標的遺伝子の発現を特異的に抑制可能である限り、特に限定されないが、通常、5~25塩基程度である。該ループ部分のヌクレオチド配列は、ループを形成することができ、且つ、shRNAが標的遺伝子の発現を特異的に抑制可能である限り、特に限定されない。
「アンチセンス核酸」とは、標的mRNA(成熟mRNA又は初期転写産物)を発現する細胞内の生理的条件下で該標的mRNAとハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含み、且つハイブリダイズした状態で該標的mRNAにコードされるポリペプチドの翻訳を阻害し得る核酸をいう。アンチセンス核酸の種類はDNAであってもRNAであってもよいし、あるいはDNA/RNAキメラであってもよいが、好ましくはDNAである。
本発明のペプチドの発現を特異的に抑制し得るアンチセンス核酸としては、例えば
(A)本発明のペプチドをコードするmRNA(成熟mRNA又は初期転写産物)のヌクレオチド配列又は12塩基以上のその部分配列に相補的なヌクレオチド配列を含む核酸、及び
(B)本発明のペプチドをコードするmRNA(成熟mRNA又は初期転写産物)と治療対象動物(好ましくはヒト)の細胞内でハイブリダイズし得る12塩基以上のヌクレオチド配列を含み、且つハイブリダイズした状態で当該本発明のペプチドへの翻訳を阻害し得る核酸
等を挙げることが出来る。
(A)本発明のペプチドをコードするmRNA(成熟mRNA又は初期転写産物)のヌクレオチド配列又は12塩基以上のその部分配列に相補的なヌクレオチド配列を含む核酸、及び
(B)本発明のペプチドをコードするmRNA(成熟mRNA又は初期転写産物)と治療対象動物(好ましくはヒト)の細胞内でハイブリダイズし得る12塩基以上のヌクレオチド配列を含み、且つハイブリダイズした状態で当該本発明のペプチドへの翻訳を阻害し得る核酸
等を挙げることが出来る。
アンチセンス核酸中の標的mRNAとハイブリダイズする部分の長さは、本発明のペプチドの発現を特異的に抑制する限り特に制限はなく、通常、約12塩基以上であり、長いものでmRNA(成熟mRNA又は初期転写産物)の全長配列と同一の長さである。ハイブリダイゼーションの特異性を考慮すると、該長さは好ましくは約15塩基以上、より好ましくは約18塩基以上である。また、合成の容易さや抗原性の問題等を考慮すると、標的mRNAとハイブリダイズする部分の長さは、通常、約200塩基以下、好ましくは約50塩基以下、より好ましくは約30塩基以下である。即ち、標的mRNAとハイブリダイズする部分の長さは、例えば約12~約200塩基、好ましくは約15~約50塩基、より好ましくは約18~約30塩基である。
アンチセンス核酸の標的ヌクレオチド配列は、本発明のペプチドをコードするの発現を特異的に抑制可能であれば特に制限はなく、本発明のペプチドをコードするのmRNA(成熟mRNA又は初期転写産物)の全長配列であっても部分配列(例えば約12塩基以上、好ましくは約15塩基以上、より好ましくは約18塩基以上)であってもよいし、あるいは初期転写産物のイントロン部分であってもよい。
アンチセンス核酸中の標的mRNAとハイブリダイズする部分のヌクレオチド配列は、標的配列の塩基組成によっても異なるが、生理的条件下で本発明のペプチドをコードするmRNAとハイブリダイズし得るために、標的配列の相補配列に対して通常約90%以上(好ましくは95%以上、最も好ましくは100%)の同一性を有するものである。
本発明のペプチドをコードするmRNAとしては、配列番号2で示されるヌクレオチド配列のうち、ヒトフィブリノゲンα-E鎖(配列番号3)の582~621位をコードする部分(即ち、1802~1921位)を含むヌクレオチド(例えば、配列番号2で示されるヌクレオチド配列)を挙げることができる。本発明のペプチドの発現を特異的に抑制するアンチセンス核酸は、好適には、配列番号2で示されるヌクレオチド配列の1802~1921位の領域を標的とし、ヒトフィブリノゲンα-E鎖及びその断片である本発明のペプチドの発現を抑制する。
アンチセンス核酸の大きさは、通常約12塩基以上、好ましくは約15塩基以上、より好ましくは約18塩基以上である。該大きさは、合成の容易さや抗原性の問題等から、通常約200塩基以下、好ましくは約50塩基以下、より好ましくは約30塩基以下である。
天然型の核酸は、細胞中に存在する核酸分解酵素によってそのリン酸ジエステル結合が容易に分解されるので、本発明において使用されるRNA干渉誘導性RNAやアンチセンス核酸は、分解酵素に安定なチオリン酸型(リン酸結合のP=OをP=Sに置換)や2’-O-メチル型等の修飾ヌクレオチドを用いて合成することもできる。RNA干渉誘導性RNAやアンチセンス核酸の設計に重要な他の要素として、水溶性及び細胞膜透過性を高めること等が挙げられるが、これらはリポソームやマイクロスフェアを使用するなどの剤形の工夫によっても克服することができる。
本発明のペプチドの発現を特異的に抑制するRNA干渉誘導性RNA及びアンチセンス核酸は、標的とする本発明のペプチドをコードするmRNA配列(例えば配列番号2で表されるヌクレオチド配列)や染色体DNA配列に基づいて標的配列を決定し、市販の核酸自動合成機(アプライド・バイオシステムズ社、ベックマン社等)を用いて、これに相補的なヌクレオチド配列を有する核酸を合成することにより調製できる。2本鎖のRNA干渉誘導性RNAは、センス鎖及びアンチセンス鎖を核酸自動合成機でそれぞれ合成し、適当なアニーリング緩衝液中、約90~約95℃で約1分程度変性させた後、約30~約70℃で約1~約8時間アニーリングさせることにより調製できる。また、相補的なオリゴヌクレオチド鎖を交互にオーバーラップするように合成して、これらをアニーリングさせた後リガーゼでライゲーションすることにより、より長い2本鎖ポリヌクレオチドを調製できる。
本発明のペプチドの発現を特異的に抑制するRNA干渉誘導性RNA又はアンチセンス核酸を発現し得る発現ベクターにおいては、投与対象である哺乳動物(例えばヒト等の霊長類、マウス等のげっ歯類)の細胞(好ましくは、標的とする、本発明のペプチド又はヒトフィブリノゲンα-E鎖を発現している細胞内でプロモーター活性を発揮し得るプロモーターの下流に、上述のRNA干渉誘導性RNA又はアンチセンス核酸或いはそれらをコードする核酸(好ましくはDNA)が機能的に連結されている。
使用されるプロモーターは、投与対象である哺乳動物(例えばヒト等の霊長類、マウス等のげっ歯類)の細胞(好ましくは、標的とする本発明のペプチド又はヒトフィブリノゲンα-E鎖を発現している細胞内で機能し得るものであれば特に制限はない。プロモーターとしては、polI系プロモーター、polII系プロモーター、polIII系プロモーター等を使用することができる。具体的には、SV40由来初期プロモーター、サイトメガロウイルスLTR等のウイルスプロモーター、β-アクチン遺伝子プロモーター等の哺乳動物の構成蛋白質遺伝子プロモーター、並びにtRNAプロモーター等のRNAプロモーター等が用いられる。
RNA干渉誘導性RNAの発現を意図する場合には、プロモーターとしてpolIII系プロモーターを使用することが好ましい。polIII系プロモーターとしては、例えば、U6プロモーター、H1プロモーター、tRNAプロモーター等を挙げることができる。
上記発現ベクターは、好ましくはRNA干渉誘導性RNA又はアンチセンス核酸或いはそれらをコードする核酸の下流に転写終結シグナル、すなわちターミネーター領域を含有する。さらに、上記発現ベクターは、形質転換細胞選択のための選択マーカー遺伝子(テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン等の薬剤に対する抵抗性を付与する遺伝子、栄養要求性変異を相補する遺伝子等)をさらに含有することもできる。上記発現ベクターは、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、SV40複製オリジンなどを、それぞれ機能可能な態様で含有していてもよい。
発現ベクターに使用されるベクターの種類は特に制限されないが、哺乳動物への投与に好適なベクターとしては、プラスミドベクター;レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス等のウイルスベクターが挙げられる。
本発明のペプチドを特異的に認識し、且つその血管新生促進活性機能を阻害する抗体(中和抗体)も、本発明のペプチドの阻害剤に包含される。「本発明のペプチドへの特異的結合」とは、標的となる本発明のペプチドへの親和性が、バックグラウンド(例、BSA)への親和性よりも強いことを意味する。
本明細書において、抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体(mAb)等の天然型抗体、遺伝子組換技術を用いて製造され得るキメラ抗体、ヒト化抗体や一本鎖抗体、ヒト抗体、およびこれらの結合性断片が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体又はこれらの結合性断片である。抗体の結合性断片とは、抗原に対する特異的結合活性を有する前述の抗体の一部分の領域を意味し、具体的には例えばF(ab')2、Fab'、Fab、Fv、sFv、dsFv、sdAb等が挙げられる(Exp. Opin. Ther. Patents, Vol.6, No.5, p.441-456, 1996)。抗体のクラスは、特に限定されず、IgG、IgM、IgA、IgDあるいはIgE等のいずれのアイソタイプを有する抗体をも包含する。好ましくは、IgG又はIgMであり、精製の容易性等を考慮するとより好ましくはIgGである。
本発明のペプチドを特異的に認識する抗体は、本発明のペプチドやその抗原性を有する部分ペプチド、或いは本発明のペプチドのトランスフェクタントを免疫原として用い、既存の一般的な抗体製造方法に準じて製造することができる。
例えば、モノクローナル抗体は、ケーラーおよびミルシュタインらの方法[Nature, vol.256, p.495 (1975)]や、組換えDNA法(Cabillyら、米国特許第4816567号)を用いて作製することができる。
キメラ抗体は、前記のようにして得たモノクローナル抗体のV領域をコードするDNAをヒト抗体C領域をコードするDNAと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得られる。
ヒト化抗体は、再構成(reshaped)ヒト抗体とも称され、これは、ヒト以外の哺乳動物、例えばマウス抗体の相補性決定領域(CDR; complementarity determining region)をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている(EP125023、WO96/02576参照)。
ヒト抗体は、免疫する非ヒト動物としてヒト抗体産生マウス(特許第3030092号、US6632976、US2004073957、US2009253902等)を用いることにより、上述のモノクローナル抗体の製造方法と同様にして製造することが出来る。
更に、得られた本発明のペプチドを特異的に認識する抗体の中から、血管新生促進活性機能を阻害する活性を有するものを選択することにより、目的とする中和抗体を得ることが出来る。血管新生促進活性機能を阻害する活性の評価は、上述のように、本発明のペプチドとともに評価対象の抗体をニワトリの有精卵の中へ注入し、胚における新生血管の形成を、コントロール群(本発明のペプチドを注入し、抗体は注入しない群)と比較して、新生血管の形成を抑制しているか否かを評価することにより決定することができる。
本発明の剤は、活性成分である本発明のペプチドの阻害剤を薬理学的に許容される一種もしくはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られている任意の方法により製造することができる。本発明の剤は、本発明のペプチドの阻害剤以外の任意の他の治療のための有効成分を更に含んでいてもよい。
薬理学的に許容される担体としては、製剤素材として慣用の各種有機あるいは無機担体物質が用いられ、その具体例としては、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤などが挙げられる。製剤化の際には、必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤などの製剤添加剤を用いてもよい。
また、投与経路は、治療に際し最も効果的なものを使用するのが望ましく、通常は、経皮、静脈内等の非経口又は経口で投与される。非経口投与に適当な製剤は、好ましくは受容者の血液と等張である活性化合物を含む滅菌水性剤からなる。例えば、注射剤の場合は、塩溶液、ブドウ糖溶液又は塩水とブドウ糖溶液の混合物からなる担体等を用いて注射用の溶液を調製する。これら非経口剤には、更に、必要に応じて溶解補助剤、緩衝剤、pH調整剤、等張化剤、無痛化剤、保存剤等を添加することもできる。また、非経口に適当な製剤は、本発明のペプチドの阻害剤を、注射用蒸留水又は植物油に懸濁して調製したものであってもよく、この場合、必要に応じて基剤、懸濁化剤、粘調剤等を添加することができる。また、非経口に適当な製剤は、本発明のペプチドの阻害剤の粉末又は凍結乾燥品を用時溶解する形であってもよく、必要に応じて賦形剤等を添加することができる。経口製剤としては、錠剤(舌下錠、口腔内崩壊剤を含む)、カプセル剤(ソフトカプセル、マイクロカプセルを含む)、散剤、顆粒剤、トローチ剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などが挙げられる。これらの製剤は、速放性製剤又は徐放性製剤などの放出制御製剤(例、徐放性マイクロカプセル)であってもよい。
本発明の剤における、本発明のペプチドの阻害剤の含有量は、通常0.01~100重量%の範囲内であるが、製剤の形態等により変動し得る。注射剤の場合には、本発明のペプチドの阻害剤の含有量は例えば、0.01~10重量%の範囲内である。
また、本発明の剤は、食品(一般食品類、病者用食品、栄養機能食品、特定保健用食品等)の形態として製剤化することもできる。食品の形態は、粉末、顆粒、錠剤、カプセル、クッキー、ゼリー、飲料、あるいは一般食品の形態が可能である。食品中の本発明のペプチドの阻害剤の含有量は、通常0.01~100重量%、好ましくは0.1~30重量%程度とするが、食品が飲料である場合は、溶解性等の観点から通常0.01~5重量%程度が含まれる。
また、食品には、一般の食品素材をベースとするほか、例えば、様々な栄養剤、ビタミン、鉱物(電解質)、ミネラル、合成風味剤、天然風味剤、着色剤、充填剤(チーズ、チョコレート等)、ペクチン酸又はその塩、アルギン酸又はその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、pH調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール等が含まれていても良い。
本発明の剤は、癌の転移、特に癌の血行性転移を抑制する。本発明の癌転移抑制剤は、転移を生じ得るあらゆる癌(例:乳癌、肺癌、前立腺癌、甲状腺癌、腎癌、胃癌、肝癌、子宮癌、大腸癌、皮膚癌など)に適用可能だが、特に乳癌、肝癌、胃癌、および皮膚癌患者に対して好ましく適用される。また、本発明の剤は、血管新生、特に癌細胞周辺における血管新生を抑制する。
本発明の剤の投与対象は、通常哺乳動物である。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンク等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、ヒト、サル、カニクイザル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等を挙げることが出来るが、これらに限定されるものではない。哺乳動物は、好ましくは霊長類(ヒト等)又はげっ歯類(マウス等)である。
本発明の剤の投与量及び投与回数は、投与形態、患者の年齢、体重、適用疾患、癌の種類、治療すべき症状の性質もしくは重篤度により異なるが、通常、静脈内投与により治療する場合、有効成分である本発明のペプチドの阻害剤として、体重1kg当たり0.01~800 mgを一日1回ないし数回投与する。しかしながら、これら投与量、投与回数は前述の種々の条件により変動する。
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明がこれらに限定されないことは言うまでもない。
[実施例1]
ヒト原発がん根治後の患者83名の追跡調査を行った。対象原発ガンは、肝臓癌、肺がん、乳癌、前立腺癌、腎臓癌及び複合癌である。エンドポイントは、PET-CT及び画像診断による転移確定までである。一か月ごとの外来受診時に、血清中の転移ペプチドを、分子量5,813の位置のピークとして測定した。
以下に、代表的な7例の患者中における、分子量5,813の位置のピーク強度の推移を示す。
ヒト原発がん根治後の患者83名の追跡調査を行った。対象原発ガンは、肝臓癌、肺がん、乳癌、前立腺癌、腎臓癌及び複合癌である。エンドポイントは、PET-CT及び画像診断による転移確定までである。一か月ごとの外来受診時に、血清中の転移ペプチドを、分子量5,813の位置のピークとして測定した。
以下に、代表的な7例の患者中における、分子量5,813の位置のピーク強度の推移を示す。
(1)肝臓癌患者8年間後ろ向き臨床試験
肝臓癌患者より、骨シンチにより骨転移が確認される前(1994年~1999年6月)から、骨転移確認後(1999年6月)、骨転移治療開始後(2002年)まで時系列で採血を行い、常法に従って血清を調製した。血清1μLに変性バッファー9μLを加え、よく混合した。10分間、氷上でインキュベーションを行い、プロテインチップ実験バッファー(pH6)90μLを加えた。
プロテインチップ実験バッファー150μLを陽イオン交換プロテインチップ(CM10型番:C5730075)に添加し、5分間室温で振盪しながら平衡化を行った。この作業を2回繰り返した。上記の調整済みの血清サンプルを100μLずつ該プロテインチップに添加し、30分間室温で振盪しながらインキュベーションを行った。プロテインチップ実験バッファー(pH6)150μLをプロテインチップに添加し、5分間室温で振盪しながら平衡化を行った。この作業を3回繰り返した。MilliQ水200μLを各プロテインチップに添加し、リンス、脱塩を行った。この作業を2回繰り返した。プロテインチップを風乾し、飽和エネルギー吸収分子(シナピン酸)溶液を0.5μL添加し、風乾し、この作業を2回行った。その後、プロテインチップリーダーにより測定を行った。ベースライン補正、分子量校正、正規化処理を行った。
結果を図1に示す。分子量5,813の位置のピーク強度は、骨転移発症前の1997年より経時的に増加し(1999年まで)、骨転移に対する治療開始後は減少した(2002年)。
肝臓癌患者より、骨シンチにより骨転移が確認される前(1994年~1999年6月)から、骨転移確認後(1999年6月)、骨転移治療開始後(2002年)まで時系列で採血を行い、常法に従って血清を調製した。血清1μLに変性バッファー9μLを加え、よく混合した。10分間、氷上でインキュベーションを行い、プロテインチップ実験バッファー(pH6)90μLを加えた。
プロテインチップ実験バッファー150μLを陽イオン交換プロテインチップ(CM10型番:C5730075)に添加し、5分間室温で振盪しながら平衡化を行った。この作業を2回繰り返した。上記の調整済みの血清サンプルを100μLずつ該プロテインチップに添加し、30分間室温で振盪しながらインキュベーションを行った。プロテインチップ実験バッファー(pH6)150μLをプロテインチップに添加し、5分間室温で振盪しながら平衡化を行った。この作業を3回繰り返した。MilliQ水200μLを各プロテインチップに添加し、リンス、脱塩を行った。この作業を2回繰り返した。プロテインチップを風乾し、飽和エネルギー吸収分子(シナピン酸)溶液を0.5μL添加し、風乾し、この作業を2回行った。その後、プロテインチップリーダーにより測定を行った。ベースライン補正、分子量校正、正規化処理を行った。
結果を図1に示す。分子量5,813の位置のピーク強度は、骨転移発症前の1997年より経時的に増加し(1999年まで)、骨転移に対する治療開始後は減少した(2002年)。
(2)(1)と同様に、骨転移を発症した種々の癌患者の骨転移前後における分子量5,813の位置のピーク強度を測定した。結果を図2~7に示す。いずれのケースにおいても、分子量5,813の位置のピークは、骨転移発症前から検出され、経時的に増加した。
[実施例2]
転移マーカーの同定
(1)陰イオン交換カラムによる分画
ヒト血清200μLを14,000rpm, 10分間遠心し、上清を得た。この血清に50mM Tris buffer (pH9) 1800μLを加え、氷中20分静置後、14,000rpmで、10分間遠心した。上清を、カラムの4倍量のBuffer (pH 9 + OG) で4回洗浄(平衡化)した陰イオン交換カラムQ Sepharose Fast Flow (GE Healthcare C/N 17-0510-01)へ上清を付し、以下の条件でフラクションの回収をおこなった。
1.非吸着画分(2 ml)
2.洗浄画分(2 ml)
3.50mM Phosphate buffer (pH 7)+ OG (2 ml)
4.50mM Acetate buffer (pH 5)+ OG (2 ml)
5.50mM Acetate buffer (pH 4)+ OG (2 ml)
6.50mM Sitrate buffer (pH 3)+ OG (2 ml)
転移マーカーの同定
(1)陰イオン交換カラムによる分画
ヒト血清200μLを14,000rpm, 10分間遠心し、上清を得た。この血清に50mM Tris buffer (pH9) 1800μLを加え、氷中20分静置後、14,000rpmで、10分間遠心した。上清を、カラムの4倍量のBuffer (pH 9 + OG) で4回洗浄(平衡化)した陰イオン交換カラムQ Sepharose Fast Flow (GE Healthcare C/N 17-0510-01)へ上清を付し、以下の条件でフラクションの回収をおこなった。
1.非吸着画分(2 ml)
2.洗浄画分(2 ml)
3.50mM Phosphate buffer (pH 7)+ OG (2 ml)
4.50mM Acetate buffer (pH 5)+ OG (2 ml)
5.50mM Acetate buffer (pH 4)+ OG (2 ml)
6.50mM Sitrate buffer (pH 3)+ OG (2 ml)
各フラクションを、陽イオン交換チップ(CM10)を用いたSELDIにより解析したところ、非吸着画分(pH9)とpH 7 溶出画分にターゲットピークを検出した(図8)。この画分を粗精製画分として、次のクロマト分画に供した。
(2)陽イオン交換カラムによる分画
(1)で得られた非吸着画分(pH9)pH 7 溶出画分を10%酢酸でpH6に調整し、カラムの5倍量のBuffer (pH 6 + OG) で3回洗浄(平衡化)した陽イオン交換カラムCM Sepharose Fast Flow(GE Healthcare C/N 17-0510-01)に付し、以下の条件でフラクションの回収をおこなった。
1.非吸着画分(4 ml)
2.洗浄画分(0.2 ml×3)
3.0.1M NaCl in 50mM Phosphate buffer (pH 6)+ OG (0.2 ml×3)
4.0.2M NaCl in 50mM Phosphate buffer (pH 6)+ OG (0.2 ml×3)
5.0.3M NaCl in 50mM Phosphate buffer (pH 6)+ OG (0.2 ml×3)
6.0.5M NaCl in 50mM Phosphate buffer (pH 6)+ OG (0.2 ml×3)
7.1M NaCl in 50mM Phosphate buffer (pH 6)+ OG (0.2 ml×3)
(1)で得られた非吸着画分(pH9)pH 7 溶出画分を10%酢酸でpH6に調整し、カラムの5倍量のBuffer (pH 6 + OG) で3回洗浄(平衡化)した陽イオン交換カラムCM Sepharose Fast Flow(GE Healthcare C/N 17-0510-01)に付し、以下の条件でフラクションの回収をおこなった。
1.非吸着画分(4 ml)
2.洗浄画分(0.2 ml×3)
3.0.1M NaCl in 50mM Phosphate buffer (pH 6)+ OG (0.2 ml×3)
4.0.2M NaCl in 50mM Phosphate buffer (pH 6)+ OG (0.2 ml×3)
5.0.3M NaCl in 50mM Phosphate buffer (pH 6)+ OG (0.2 ml×3)
6.0.5M NaCl in 50mM Phosphate buffer (pH 6)+ OG (0.2 ml×3)
7.1M NaCl in 50mM Phosphate buffer (pH 6)+ OG (0.2 ml×3)
各フラクションを、順相チップ(NP20)を用いたSELDIにより解析したところ、0.2M NaCl溶出画分と0.3M NaCl溶出画分にターゲットピークを検出した(図9)。また、+16 ピークの増加が確認されたが(図10)、再利用のチップを用いたときに+16 ピークの増加が認められやすいため(図11)、再利用のチップではサンプルをチップに添加した時に酸化されやすい傾向がある(即ち、+16 ピークは酸化物のピークである)と判断し、+16 ピークはターゲットピークと同じものと考えて精製を進めた。
(3)逆相HPLCによる分画
(2)で得られた0.2M NaCl溶出画分及び0.3M NaCl溶出画分を、0.1% TFAで5倍希釈して逆相HPLC(2mm column)に供し、以下の条件でアセトニトリル濃度勾配にて溶出した。
カラム: TSK-GEL SuperODS (東ソー)(2×100 mm)
流速: 200μL/min
検出: 210 nm
溶媒A: 0.1% TFA
溶媒B: 90% アセトニトリル/0.1% TFA
グラジエント: 10-50% B/5-40 min
フラクション: 200μL/1 min/Fr
: 100μL/1 min/Fr (リクロマト)
(2)で得られた0.2M NaCl溶出画分及び0.3M NaCl溶出画分を、0.1% TFAで5倍希釈して逆相HPLC(2mm column)に供し、以下の条件でアセトニトリル濃度勾配にて溶出した。
カラム: TSK-GEL SuperODS (東ソー)(2×100 mm)
流速: 200μL/min
検出: 210 nm
溶媒A: 0.1% TFA
溶媒B: 90% アセトニトリル/0.1% TFA
グラジエント: 10-50% B/5-40 min
フラクション: 200μL/1 min/Fr
: 100μL/1 min/Fr (リクロマト)
各フラクションを SELDI にて分析したところ、目的ピーク m/z 5813 がフラクション28, 29 に確認された(図12~14)。更に純度をあげるために 1fr / 0.5 min でリクロマトを行った。目的ピークはフラクション28.5 に確認できた(図15~17)。しかし、目的ピーク右隣の質量5905 を分離できていないこと、SELDI では確認できない高分子タンパク質が存在する可能性があることから、順相HPLC による更なる精製を行った。
(4)順相HPLCによる分画
(3)のリクロマトで得られたフラクション28.5を、アセトニトリルで5倍希釈して順相HPLCに供し、以下の条件でアセトニトリル濃度勾配にて溶出した。
カラム: TSK-GEL Amide-80 (東ソー)(2×150 mm)
流速: 200μL/min
検出: 210 nm
溶媒A: 0.1% TFA
溶媒B: 90% アセトニトリル/0.1% TFA
グラジエント: 100-85-65% B/5-40 min
フラクション: 100μL/0.5 min/Fr
(3)のリクロマトで得られたフラクション28.5を、アセトニトリルで5倍希釈して順相HPLCに供し、以下の条件でアセトニトリル濃度勾配にて溶出した。
カラム: TSK-GEL Amide-80 (東ソー)(2×150 mm)
流速: 200μL/min
検出: 210 nm
溶媒A: 0.1% TFA
溶媒B: 90% アセトニトリル/0.1% TFA
グラジエント: 100-85-65% B/5-40 min
フラクション: 100μL/0.5 min/Fr
各フラクションを SELDI にて分析したところ、目的ピーク m/z 5813 がフラクション41.5, 42に確認された(図18~20)。また、目的ピークを質量5905 のピークと分離させることができた。
(5)逆相HPLCによる精製
(4)で得られたフラクション41.5, 42を0.1% TFAで5倍希釈して、更にmicro逆相HPLC(2mm column)に供し、以下の条件でアセトニトリル濃度勾配にて溶出した。
カラム: TSK-GEL SuperODS (東ソー)(1×50 mm)
流速: 50μL/min
検出: 210 nm
溶媒A: 0.1% TFA
溶媒B: 90% アセトニトリル/0.1% TFA
グラジエント: 10-50% B/5-40 min
フラクション: 50μL/1 min/Fr
(4)で得られたフラクション41.5, 42を0.1% TFAで5倍希釈して、更にmicro逆相HPLC(2mm column)に供し、以下の条件でアセトニトリル濃度勾配にて溶出した。
カラム: TSK-GEL SuperODS (東ソー)(1×50 mm)
流速: 50μL/min
検出: 210 nm
溶媒A: 0.1% TFA
溶媒B: 90% アセトニトリル/0.1% TFA
グラジエント: 10-50% B/5-40 min
フラクション: 50μL/1 min/Fr
各フラクションを SELDI にて分析したところ、目的ピーク m/z 5813 がフラクション22と22.5に確認された(図21~22)。このフラクションは、SELDIデータ m/z 2,000~100,000の範囲で単一ピークを示したことから、同フラクションをMS/MS 同定用サンプルとした。
(6)ターゲットピークm/z 5813の同定解析方法
(5)で得られたフラクション22と22.5中のタンパク質をドライアップした。Digestion bufferを加えて70℃にて3分静置後、修飾トリプシン(Promega)を加え35℃にて、5時間反応させ、消化産物をSELDI分析(NP20チップ)に付した。External calibrationは、Arg-8-Vasopressin (1084.25 mass)、Dynorphin A 209-225 porcine (2147.5 mass)、ACTH1-24 human (29335 mass)、Insulin B-chain bovine (3495.94 mass)で行った。トリプシン消化溶液をLC-MS-MS分析Q-Tof Ultima API (Waters Micromass, UK)にて分析し、マスコットサーチを行った。
(5)で得られたフラクション22と22.5中のタンパク質をドライアップした。Digestion bufferを加えて70℃にて3分静置後、修飾トリプシン(Promega)を加え35℃にて、5時間反応させ、消化産物をSELDI分析(NP20チップ)に付した。External calibrationは、Arg-8-Vasopressin (1084.25 mass)、Dynorphin A 209-225 porcine (2147.5 mass)、ACTH1-24 human (29335 mass)、Insulin B-chain bovine (3495.94 mass)で行った。トリプシン消化溶液をLC-MS-MS分析Q-Tof Ultima API (Waters Micromass, UK)にて分析し、マスコットサーチを行った。
逆相HPLCで得られたフラクション22及び22.5をトリプシン消化に付したところ、複数個のピークが確認された(図23)。目的ピーク質量から判断して問題のないピーク数であると判断し、LC-MS/MS解析に供した。同消化産物のMS/MSイオンシグナルを収集し、そのデータをマスコットにてデータベースサーチした。その結果、高スコアで alpha-fibrinogen precursor にヒットし、MS/MSシグナルの配列一致度は高かった。ヒットしたペプチドは、SELDI分析で検出されている主要ピークの質量に一致することから、逆相HPLCで得られたタンパク質が精製タンパク質であると判断された。ヒットタンパク質のデータベース配列からalpha-fibrinogen precursorのC末端領域のペプチドがヒットしていることから(図24)、ターゲットピークは同タンパク質のC末端フラグメントであると考えられた。C末端領域でヒットした配列を含む領域の質量を調べたところ、領域576-628の断片の質量が 5805 とターゲットピークの質量値とよく一致した。一方、領域576-629 (C末端にVal付加)の質量は5904となり、ターゲットピーク質量のプラス99となる。これは、血清サンプルにおいて、ターゲットピークのプラス100の質量で検出されているピークによく一致する。このプラス100ピークは、クロマトグラフィーの挙動がターゲットピークとほとんど同じであったことから、ターゲットピークと非常に類似した配列のタンパク質であると推測された。また、領域576-628のフラグメントの等電点(pI)が8.07であることは、ターゲットピークがイオン交換において塩基性物質の挙動を示すことに一致した。
以上の結果より、ターゲットピーク 5813 はalpha-fibrinogen precursorのC末端領域576-628のフラグメントであると結論した。
以上の結果より、ターゲットピーク 5813 はalpha-fibrinogen precursorのC末端領域576-628のフラグメントであると結論した。
[参考例1]
5、813bpターゲットペプチドの部分配列であるQFTSSTSYNRGDSTFESKSYKMADEAGSEADHEGTHSTKR(配列番号1)を含むペプチドCQFTSSTSYNRGDSTFESKSYKMADEAGSEADHEGTHSTKR(配列番号5)(以下、ペプチドA)をHiLyte Fluor 594により標識し、ゲル濾過により未反応物を除去することによりHiLyte Fluor 594標識C2 meleimide-ペプチドAを得た。同様に、リコンビナントFibrinogen protein Human abcam 84410(CYGTGSETESPRNPSS(配列番号6)(以下、ペプチドB)をHiLyte Fluor 555により標識し、ゲル濾過により未反応物を除去することによりHiLyte Fluor 555標識C2 meleimide-ペプチドBを得た。
更に、ペプチドAをウサギに免疫することにより、ペプチドAに対する抗体を作成した。
5、813bpターゲットペプチドの部分配列であるQFTSSTSYNRGDSTFESKSYKMADEAGSEADHEGTHSTKR(配列番号1)を含むペプチドCQFTSSTSYNRGDSTFESKSYKMADEAGSEADHEGTHSTKR(配列番号5)(以下、ペプチドA)をHiLyte Fluor 594により標識し、ゲル濾過により未反応物を除去することによりHiLyte Fluor 594標識C2 meleimide-ペプチドAを得た。同様に、リコンビナントFibrinogen protein Human abcam 84410(CYGTGSETESPRNPSS(配列番号6)(以下、ペプチドB)をHiLyte Fluor 555により標識し、ゲル濾過により未反応物を除去することによりHiLyte Fluor 555標識C2 meleimide-ペプチドBを得た。
更に、ペプチドAをウサギに免疫することにより、ペプチドAに対する抗体を作成した。
[実施例3]
転移ペプチドの血管新生促進活性
複数のニワトリの有精卵の殻に注射針が入る穴を開け、参考例1で合成したHiLyte Fluor 594標識C2 meleimide-ペプチドAを注入した。その後、20日間、8時間置きに37℃、高湿度状態の環境で卵を回転し続けた。孵化する予定の1~3日前に摘出し、胚組織、血管の摘出を行った。コントロールである正常有精卵(n=3)の血管組織の平均重量が0.29gであったのに対してペプチドAを注入した有精卵(n=19)の血管組織の平均重量は1.55gであった。この結果から、ペプチドAにより、胚を取り巻く明らかな新生血管の形成が誘導されることが示された。卵中のVEGF濃度を測定したところ、ペプチドAを注入した有精卵において高値を示した(図25)。
残り1個の卵は、孵化し、生まれた雛をニワトリになるまで約1年間飼育したが、生体レベルでの主訴は認められなかった。
一方、HiLyte Fluor 555標識C2 meleimide-CYGTGSETESPRNPSSを注入した有精卵では、有意な変化は検証できなかった。
転移ペプチドの血管新生促進活性
複数のニワトリの有精卵の殻に注射針が入る穴を開け、参考例1で合成したHiLyte Fluor 594標識C2 meleimide-ペプチドAを注入した。その後、20日間、8時間置きに37℃、高湿度状態の環境で卵を回転し続けた。孵化する予定の1~3日前に摘出し、胚組織、血管の摘出を行った。コントロールである正常有精卵(n=3)の血管組織の平均重量が0.29gであったのに対してペプチドAを注入した有精卵(n=19)の血管組織の平均重量は1.55gであった。この結果から、ペプチドAにより、胚を取り巻く明らかな新生血管の形成が誘導されることが示された。卵中のVEGF濃度を測定したところ、ペプチドAを注入した有精卵において高値を示した(図25)。
残り1個の卵は、孵化し、生まれた雛をニワトリになるまで約1年間飼育したが、生体レベルでの主訴は認められなかった。
一方、HiLyte Fluor 555標識C2 meleimide-CYGTGSETESPRNPSSを注入した有精卵では、有意な変化は検証できなかった。
[実施例4]
癌細胞の転移モデルの作製及びペプチドAの癌細胞転移への影響
シャーレの底にヒト肺がん細胞H460を幡腫し、HiLyte Fluor 594標識C2 meleimide-ペプチドAを0.1pg/mL添加した。その上にヒトの生体マトリックスを想定したペプチドハイドロゲル(株式会社スリー・ディー・マトリックス)をのせた。ペプチドハイドロゲル層の上に8μmの穴の開いたインサートカップを載せ、該カップ中にヒト肺微小血管内皮細胞を一面に幡腫し、がん細胞が動き、転移するメカニズムを調べた(図26)。
培養24時間後にSEM電子顕微鏡で観察をすると、メンブレン上で新生血管が形成され、その血管の外壁に癌細胞が寄生、生存している様子が確認された(図27、28)。下層のH460細胞が上層の肺微小血管内皮細胞にまで到達したことが確認された(図29)。H460細胞へのペプチドAの導入により、培地中のVEGF濃度が上昇した(図30)。免疫組織染色の結果、H460細胞の表面にペプチドAが接着し、H460細胞がVEGFを産生していることが示された(図31)。ヒト肺がん細胞H460の不在下でヒト肺微小血管内皮細胞を培養しても、新生血管は生じなかった。
以上の結果から、ペプチドAが癌細胞に作用し、VEGFの発現を促すことで、新生血管の形成を促進する可能性が示された。また、ペプチドAが癌細胞の浸潤及び新生血管への接着に関与する可能性が示された。
癌細胞の転移モデルの作製及びペプチドAの癌細胞転移への影響
シャーレの底にヒト肺がん細胞H460を幡腫し、HiLyte Fluor 594標識C2 meleimide-ペプチドAを0.1pg/mL添加した。その上にヒトの生体マトリックスを想定したペプチドハイドロゲル(株式会社スリー・ディー・マトリックス)をのせた。ペプチドハイドロゲル層の上に8μmの穴の開いたインサートカップを載せ、該カップ中にヒト肺微小血管内皮細胞を一面に幡腫し、がん細胞が動き、転移するメカニズムを調べた(図26)。
培養24時間後にSEM電子顕微鏡で観察をすると、メンブレン上で新生血管が形成され、その血管の外壁に癌細胞が寄生、生存している様子が確認された(図27、28)。下層のH460細胞が上層の肺微小血管内皮細胞にまで到達したことが確認された(図29)。H460細胞へのペプチドAの導入により、培地中のVEGF濃度が上昇した(図30)。免疫組織染色の結果、H460細胞の表面にペプチドAが接着し、H460細胞がVEGFを産生していることが示された(図31)。ヒト肺がん細胞H460の不在下でヒト肺微小血管内皮細胞を培養しても、新生血管は生じなかった。
以上の結果から、ペプチドAが癌細胞に作用し、VEGFの発現を促すことで、新生血管の形成を促進する可能性が示された。また、ペプチドAが癌細胞の浸潤及び新生血管への接着に関与する可能性が示された。
[実施例5]
ペプチドAによるヒト骨肉腫細胞のVEGF発現
HNNG細胞(ヒト骨肉腫細胞)をペプチドAで処理し、VEGFの発現を免疫組織染色により確認した。その結果、ペプチドA処理により、ペプチドAがHNNG細胞へ接着し、VEGFの発現が誘導されることが示された(図32)。
ペプチドAによるヒト骨肉腫細胞のVEGF発現
HNNG細胞(ヒト骨肉腫細胞)をペプチドAで処理し、VEGFの発現を免疫組織染色により確認した。その結果、ペプチドA処理により、ペプチドAがHNNG細胞へ接着し、VEGFの発現が誘導されることが示された(図32)。
[実施例6]
インビボ転移試験
GFPを導入したHNNG細胞(ヒト骨肉腫細胞)とペプチドAを混合し、尾静脈よりマウスへ注入した。その結果、HNNG細胞の頭部、腎臓及び脊椎への転移が確認された(図33、34)。
同様に、GFPを導入していないHNNG細胞(ヒト骨肉腫細胞)とペプチドAを混合し、尾静脈よりマウスへ注入し、免疫組織染色により、ペプチドA及びVEGFの局在を調べた。その結果、マウス血管へのペプチドA及びVEGF発現細胞の局在が確認された(図35)。
インビボ転移試験
GFPを導入したHNNG細胞(ヒト骨肉腫細胞)とペプチドAを混合し、尾静脈よりマウスへ注入した。その結果、HNNG細胞の頭部、腎臓及び脊椎への転移が確認された(図33、34)。
同様に、GFPを導入していないHNNG細胞(ヒト骨肉腫細胞)とペプチドAを混合し、尾静脈よりマウスへ注入し、免疫組織染色により、ペプチドA及びVEGFの局在を調べた。その結果、マウス血管へのペプチドA及びVEGF発現細胞の局在が確認された(図35)。
[実施例7]
In situ hybridization によるヒト癌組織におけるフィブリノゲンα(FGA)の発現確認
TMA切片を用いてヒト癌組織におけるFGAの発現をIn situ hybridization により解析した。乳癌(Invasive ductal carcinoma、82才・女性)、肝臓癌(Hepatocellular carcinoma、65才・男性)、皮膚がん(Melanoma、43才・男性)、胃癌(Adenocarcinoma、48才・男性)、及び胸腺腫瘍(Malignant thymoma、43才・女性)の原発腫瘍の組織でFGAのmRNAの発現を確認できた(図36~38)。
In situ hybridization によるヒト癌組織におけるフィブリノゲンα(FGA)の発現確認
TMA切片を用いてヒト癌組織におけるFGAの発現をIn situ hybridization により解析した。乳癌(Invasive ductal carcinoma、82才・女性)、肝臓癌(Hepatocellular carcinoma、65才・男性)、皮膚がん(Melanoma、43才・男性)、胃癌(Adenocarcinoma、48才・男性)、及び胸腺腫瘍(Malignant thymoma、43才・女性)の原発腫瘍の組織でFGAのmRNAの発現を確認できた(図36~38)。
[実施例8]
免疫組織染色によるヒト癌組織におけるCD51+CD61(GPIIb/IIIa)の発現の評価
免疫組織染色により、ヒト癌組織においてCD51+CD61(GPIIb/IIIa)の発現が確認された(図39、40)。CD51+CD61は血小板に存在し、配列番号1のアミノ酸配列中にも存在するRGD配列に結合することから、alpha-fibrinogen precursorのC末端領域576-628のフラグメントが、癌組織への血小板の接着を媒介する可能性が示された。
免疫組織染色によるヒト癌組織におけるCD51+CD61(GPIIb/IIIa)の発現の評価
免疫組織染色により、ヒト癌組織においてCD51+CD61(GPIIb/IIIa)の発現が確認された(図39、40)。CD51+CD61は血小板に存在し、配列番号1のアミノ酸配列中にも存在するRGD配列に結合することから、alpha-fibrinogen precursorのC末端領域576-628のフラグメントが、癌組織への血小板の接着を媒介する可能性が示された。
[実施例9]
免疫組織染色によるヒト癌組織におけるp21の発現の評価
免疫組織染色により、ヒト癌組織においてp21の発現が確認された(図41)。p21は、細胞周期の停止を意味することから、癌組織内において癌細胞の細胞周期が停止している可能性が示された。
免疫組織染色によるヒト癌組織におけるp21の発現の評価
免疫組織染色により、ヒト癌組織においてp21の発現が確認された(図41)。p21は、細胞周期の停止を意味することから、癌組織内において癌細胞の細胞周期が停止している可能性が示された。
[実施例10]
ヒト癌組織におけるFGA、p21及びCD51+CD61の発現の評価
ドットブロットハイブリダイゼーションにより、種々のヒト癌組織においてFGA mRNAの発現が確認された(図42)。また、ドットELISA法により、種々のヒト癌組織においてp21及びCD51+CD61のタンパク質発現が確認された(図42)。
ヒト癌組織におけるFGA、p21及びCD51+CD61の発現の評価
ドットブロットハイブリダイゼーションにより、種々のヒト癌組織においてFGA mRNAの発現が確認された(図42)。また、ドットELISA法により、種々のヒト癌組織においてp21及びCD51+CD61のタンパク質発現が確認された(図42)。
[実施例11]
ペプチドAに対するshRNAによる各がん細胞のマーカー変動
FGAターゲット部位(すなわち、ペプチドA部分)をノックダウンするshRNAを作製し、がん細胞上清のウエスタンブロットを実施した。shRNAは、FGAの発現を抑制した(図43)。このshRNAをヒト前立腺がん細胞、ヒト乳がん細胞、ヒト大腸がん細胞に導入し、各がん細胞から分泌されているがんマーカーを測定した。
結果を図44に示す。図中、“Control”は、培養中に何も入れていない。“shRNA”は、FGAのターゲットをノックダウンした細胞を示す。“41aa”は、抗原ペプチドを添加した細胞を示す。ヒト前立腺がん細胞では、shRNAでターゲットFGAを抑制するとPSAマーカーは減少し、ターゲット抗原ペプチド41aaを入れるとPSAマーカーは高値を示した。同じく、ヒト乳がん細胞でも、shRNAでは、がんマーカーErbB2の発現は抑制され、ターゲット抗原ペプチド41aaを入れるとErbB2は高値を示した。ヒト大腸がん細胞でもshRNAによりFGAを抑制するとCEAマーカーは低値を示し、ターゲット抗原ペプチド41aaを入れるとCEAは高値を示した。
ペプチドAに対するshRNAによる各がん細胞のマーカー変動
FGAターゲット部位(すなわち、ペプチドA部分)をノックダウンするshRNAを作製し、がん細胞上清のウエスタンブロットを実施した。shRNAは、FGAの発現を抑制した(図43)。このshRNAをヒト前立腺がん細胞、ヒト乳がん細胞、ヒト大腸がん細胞に導入し、各がん細胞から分泌されているがんマーカーを測定した。
結果を図44に示す。図中、“Control”は、培養中に何も入れていない。“shRNA”は、FGAのターゲットをノックダウンした細胞を示す。“41aa”は、抗原ペプチドを添加した細胞を示す。ヒト前立腺がん細胞では、shRNAでターゲットFGAを抑制するとPSAマーカーは減少し、ターゲット抗原ペプチド41aaを入れるとPSAマーカーは高値を示した。同じく、ヒト乳がん細胞でも、shRNAでは、がんマーカーErbB2の発現は抑制され、ターゲット抗原ペプチド41aaを入れるとErbB2は高値を示した。ヒト大腸がん細胞でもshRNAによりFGAを抑制するとCEAマーカーは低値を示し、ターゲット抗原ペプチド41aaを入れるとCEAは高値を示した。
[実施例12]
ペプチドAに対する抗体の抗腫瘍効果の評価
SCIDマウス(n=80)に癌細胞を移植し、腫瘍重量の経時的な変化を調べた。SCIDマウスに対して、ペプチドAに対する抗体を連日又は隔日、120mg/kgの用量で尾静注した。対照群には抗体医薬の投与を行わなかった。その結果、ペプチドAに対する抗体の投与により、腫瘍重量の増加が有意に抑制された(図45)。
ペプチドAに対する抗体の抗腫瘍効果の評価
SCIDマウス(n=80)に癌細胞を移植し、腫瘍重量の経時的な変化を調べた。SCIDマウスに対して、ペプチドAに対する抗体を連日又は隔日、120mg/kgの用量で尾静注した。対照群には抗体医薬の投与を行わなかった。その結果、ペプチドAに対する抗体の投与により、腫瘍重量の増加が有意に抑制された(図45)。
[実施例13]
SCIDマウス(n=21)に癌細胞を移植し、マウスの生存日数をモニターした。SCIDマウスに対して、ペプチドAに対する抗体(120mg/kg)又はペプチドAを尾静注した。対照群にはなにも投与しなかった。その結果、ペプチドAに対する抗体の投与により、生存日数が長くなり、ペプチドAの投与により生存日数が短くなった(図46)。
SCIDマウス(n=21)に癌細胞を移植し、マウスの生存日数をモニターした。SCIDマウスに対して、ペプチドAに対する抗体(120mg/kg)又はペプチドAを尾静注した。対照群にはなにも投与しなかった。その結果、ペプチドAに対する抗体の投与により、生存日数が長くなり、ペプチドAの投与により生存日数が短くなった(図46)。
[実施例14]
ターゲットの分子標的性を検証するために、白人のがん転移組織を免疫蛍光染色した。ペプチドA(41aa)(Alexa 555、赤)及びCD61+CD51(Alexa 488、緑)の発現を評価した。細胞はDAPI染色(青)に付した。結果を図47に示す。肺がん転移組織の血管の周囲にペプチドA(41aa)の発現が確認された。血管の周囲に、ペプチドA(41aa)(赤)とCD61+CD51(緑)の共局在(オレンジ色)が観察された(図47、上及び中の写真)。癌細胞(多核)がペプチドA(41aa)と共に血管内に潜んでいる様子が観察された(図47、下の写真)。
ターゲットの分子標的性を検証するために、白人のがん転移組織を免疫蛍光染色した。ペプチドA(41aa)(Alexa 555、赤)及びCD61+CD51(Alexa 488、緑)の発現を評価した。細胞はDAPI染色(青)に付した。結果を図47に示す。肺がん転移組織の血管の周囲にペプチドA(41aa)の発現が確認された。血管の周囲に、ペプチドA(41aa)(赤)とCD61+CD51(緑)の共局在(オレンジ色)が観察された(図47、上及び中の写真)。癌細胞(多核)がペプチドA(41aa)と共に血管内に潜んでいる様子が観察された(図47、下の写真)。
[実施例15]
乳がん患者の前向き臨床試験
乳がん患者に対して、1997年7月に胸筋温存***切除術を試行し、化学療法とホルモン療法を行った。2000年5月多発性骨転移を認めた。CEA、CA15-3、NCC-ST-439、ALPは、2005年まで、緩やかに上昇または、低値を示した。しかし、ペプチドA(41aa)は、手術後、低値を示したが、一年後には上昇値を示した。
乳がん患者の前向き臨床試験
乳がん患者に対して、1997年7月に胸筋温存***切除術を試行し、化学療法とホルモン療法を行った。2000年5月多発性骨転移を認めた。CEA、CA15-3、NCC-ST-439、ALPは、2005年まで、緩やかに上昇または、低値を示した。しかし、ペプチドA(41aa)は、手術後、低値を示したが、一年後には上昇値を示した。
本発明の転移ペプチドマーカーは、転移の症状が顕在化するより相当期間早い時期から血清中レベルが増加し始めるので、現在の画像診断より早く、転移の早期発見と早期予防が可能となり、また、少ない用量の患者血清から解析が出来るので、患者負担が少なく、迅速・簡便且つ安価な骨転移の診断方法およびそのための試薬・キット等への応用という意味で極めて有用である。
本発明を好ましい態様を強調して説明してきたが、好ましい態様が変更され得ることは当業者にとって自明であろう。本発明は、本発明が本明細書に詳細に記載された以外の方法で実施され得ることを意図する。したがって、本発明は添付の「特許請求の範囲」の精神および範囲に包含されるすべての変更を含むものである。
本発明を好ましい態様を強調して説明してきたが、好ましい態様が変更され得ることは当業者にとって自明であろう。本発明は、本発明が本明細書に詳細に記載された以外の方法で実施され得ることを意図する。したがって、本発明は添付の「特許請求の範囲」の精神および範囲に包含されるすべての変更を含むものである。
本出願は日本で出願された特願2012-064340(出願日:2012年3月21日)を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
Claims (16)
- 配列番号4で示されるアミノ酸配列からなるペプチド。
- 請求項1記載のペプチドに対する抗体。
- 癌患者における転移の診断方法であって、該患者由来の生体試料における請求項1記載のペプチドの発現を検出することを特徴とする方法。
- 生体試料が血漿または血清である請求項3記載の方法。
- 請求項2記載の抗体を用いて請求項1記載のペプチドを検出することを特徴とする、請求項3または4記載の方法。
- 以下の(1)~(3)から選択されるいずれかのペプチド又は該ペプチドを発現し得る発現ベクターを含む、血管新生促進剤:
(1)配列番号1で表されるアミノ酸配列を含むペプチド;
(2)配列番号1で表されるアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ血管新生促進活性を有するペプチド;及び
(3)配列番号1で表されるアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ血管新生促進活性を有するペプチド。 - 以下の(1)~(3)から選択されるいずれかのペプチド又は該ペプチドを発現し得る発現ベクターを含む、癌転移促進剤:
(1)配列番号1で表されるアミノ酸配列を含むペプチド;
(2)配列番号1で表されるアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ血管新生促進活性を有するペプチド;及び
(3)配列番号1で表されるアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ血管新生促進活性を有するペプチド。 - 以下の(1)~(3)から選択されるいずれかのペプチド又は該ペプチドを発現し得る発現ベクターを含む、癌組織又はそれに伴う新生血管を検出するための画像診断用プローブ:
(1)配列番号1で表されるアミノ酸配列を含むペプチド;
(2)配列番号1で表されるアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ血管新生促進活性を有するペプチド;及び
(3)配列番号1で表されるアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ血管新生促進活性を有するペプチド。 - 以下の(1)~(3)から選択されるいずれかのペプチドの発現を特異的に抑制するRNA干渉誘導性RNA若しくはアンチセンス核酸又はこれらの核酸を発現する発現ベクター、或いは(1)~(3)から選択されるいずれかのペプチドを特異的に認識し、且つその血管新生促進活性機能を阻害する抗体を含む、癌転移抑制剤:
(1)配列番号1で表されるアミノ酸配列を含むペプチド;
(2)配列番号1で表されるアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ血管新生促進活性を有するペプチド;及び
(3)配列番号1で表されるアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ血管新生促進活性を有するペプチド。 - 哺乳動物に対し、以下の(1)~(3)から選択されるいずれかのペプチド又は該ペプチドを発現し得る発現ベクターの有効量を投与することを含む、該哺乳動物における血管新生の促進方法:
(1)配列番号1で表されるアミノ酸配列を含むペプチド;
(2)配列番号1で表されるアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ血管新生促進活性を有するペプチド;及び
(3)配列番号1で表されるアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ血管新生促進活性を有するペプチド。 - 癌細胞を含む非ヒト哺乳動物に対し、以下の(1)~(3)から選択されるいずれかのペプチド又は該ペプチドを発現し得る発現ベクターの有効量を投与することを含む、該非ヒト哺乳動物における癌転移の促進方法:
(1)配列番号1で表されるアミノ酸配列を含むペプチド;
(2)配列番号1で表されるアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ血管新生促進活性を有するペプチド;及び
(3)配列番号1で表されるアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ血管新生促進活性を有するペプチド。 - 被検哺乳動物に対し、以下の(1)~(3)から選択されるいずれかのペプチド又は該ペプチドを発現し得る発現ベクターを投与し、該哺乳動物の生体内での該ペプチドの局在化を画像化することを含む、該哺乳動物における癌組織又はそれに伴う新生血管を画像診断により検出する方法:
(1)配列番号1で表されるアミノ酸配列を含むペプチド;
(2)配列番号1で表されるアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ血管新生促進活性を有するペプチド;及び
(3)配列番号1で表されるアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ血管新生促進活性を有するペプチド。 - 哺乳動物に対し、以下の(1)~(3)から選択されるいずれかのペプチドの発現を特異的に抑制するRNA干渉誘導性RNA若しくはアンチセンス核酸又はこれらの核酸を発現する発現ベクター、或いは(1)~(3)から選択されるいずれかのペプチドを特異的に認識し、且つその血管新生促進活性機能を阻害する抗体を投与することを含む、該哺乳動物における癌転移の抑制方法:
(1)配列番号1で表されるアミノ酸配列を含むペプチド;
(2)配列番号1で表されるアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ血管新生促進活性を有するペプチド;及び
(3)配列番号1で表されるアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ血管新生促進活性を有するペプチド。 - 血管新生の促進に使用するための、以下の(1)~(3)から選択されるいずれかのペプチド又は該ペプチドを発現し得る発現ベクター:
(1)配列番号1で表されるアミノ酸配列を含むペプチド;
(2)配列番号1で表されるアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ血管新生促進活性を有するペプチド;及び
(3)配列番号1で表されるアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ血管新生促進活性を有するペプチド。 - 癌組織又はそれに伴う新生血管の画像診断による検出に使用するための、以下の(1)~(3)から選択されるいずれかのペプチド又は該ペプチドを発現し得る発現ベクター:
(1)配列番号1で表されるアミノ酸配列を含むペプチド;
(2)配列番号1で表されるアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ血管新生促進活性を有するペプチド;及び
(3)配列番号1で表されるアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ血管新生促進活性を有するペプチド。 - 癌転移の抑制に使用するための、以下の(1)~(3)から選択されるいずれかのペプチドの発現を特異的に抑制するRNA干渉誘導性RNA若しくはアンチセンス核酸又はこれらの核酸を発現する発現ベクター、或いは(1)~(3)から選択されるいずれかのペプチドを特異的に認識し、且つその血管新生促進活性機能を阻害する抗体:
(1)配列番号1で表されるアミノ酸配列を含むペプチド;
(2)配列番号1で表されるアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ血管新生促進活性を有するペプチド;及び
(3)配列番号1で表されるアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ血管新生促進活性を有するペプチド。
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