WO2013140919A1 - Ｌｐｓワクチン - Google Patents

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隆一 坂元
正士 坂口
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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention provides a novel vaccine useful for preventing infectious diseases caused by Gram-negative bacteria such as Salmonella and Escherichia coli.
  • the present invention relates to a method for immunizing non-human animals, particularly birds, using a structure (for example, lipopolysaccharide) containing O antigen derived from Gram-negative bacteria as a protective antigen.
  • a structure for example, lipopolysaccharide
  • Bacteria have different staining properties depending on the composition of the cell wall when the Gram staining method is performed, and are divided into two large groups, Gram-negative bacteria and Gram-positive bacteria, using the difference in staining properties as an index.
  • the cell wall consists of an outer membrane and a peptidoglycan layer inside.
  • Constituent components of the outer membrane are phospholipid, lipopolysaccharide (LPS), lipoprotein, and protein, and the unit membrane structure of the outer membrane is composed of phospholipid and lipopolysaccharide.
  • the outer leaf of the membrane has lipopolysaccharide and the inner leaf has phospholipid.
  • Lipopolysaccharide is composed of a high-molecular lipid called lipid A (Lipid ⁇ A) and a polysaccharide portion bound to it.
  • the lipid A part forms the outer leaflet of the outer membrane, and the polysaccharide part extends outward from the outer membrane.
  • the type of sugar differs between the outermost part and the part close to lipid A.
  • the outer part is called the O side chain polysaccharide (O antigen), and the inner part is called the core polysaccharide.
  • the sugars that make O antigen are mainly 6-carbon sugars and 5-carbon sugars, and a basic structure composed of 3-5 kinds of these sugars appears repeatedly.
  • Lipid A is a lipid unique to bacteria. It is a sugar in which two molecules of glucosamine are linked by ⁇ -1,6, and phosphoric acid and fatty acid are bound, and the core polysaccharide is bound at the 6 'position of the sugar. .
  • Gram-negative bacteria There are many types of bacteria belonging to Gram-negative bacteria, and Salmonella, Escherichia, and Haemophilus belonging to Pasteurellae, which are included in the Enterobacteriaceae, are also included in Gram-negative bacteria.
  • Salmonella is a bacterium that has periflagellate flagellum and is classified into groups according to the type of O antigen, and further subdivided according to the type of H antigen, and there are more than 2000 serotypes. To do.
  • the host range of Salmonella is extremely wide, and it is known that various mammals and birds including humans are infected or possessed.
  • Salmonella infects chickens, it can cause septic disease in young chicks.
  • adult chickens since they are asymptomatic even in carrier-fed chickens, they are not subject to trapping.As a result, chicken and eggs derived from Salmonella-contaminated chickens circulate and are passed on to humans through food derived from them. Causes food poisoning.
  • Salmonella food poisoning occurs after a latent period of 12 to 48 hours after ingesting contaminated food.
  • the incubation period depends on the amount of ingested bacteria, the patient's health and age. Symptoms are mainly acute gastroenteritis, mainly diarrhea, abdominal pain, vomiting and fever. Therefore, the Salmonella vaccine for chickens is an important vaccine used for public health rather than controlling chicken diseases.
  • Non-patent Document 1 there is a report of confirming the effectiveness by administering to a mouse a conjugate in which an O antigen derived from Salmonella Typhimurium is bound to a carrier protein.
  • Non-patent Document 1 there is a report of confirming the effectiveness by administering lipopolysaccharide derived from Salmonella Typhi to mice.
  • Non-Patent Document 2 In addition to the genus Salmonella, there has been a report that the effectiveness was confirmed by administering lipopolysaccharide derived from Burkholderia thailandensis or Burkholderia pseudomallei to mice (Patent Document 2).
  • Non-Patent Document 2 Non-Patent Document 2.
  • Non-patent Document 3 When lipopolysaccharide is actually administered to mice, it has been reported that 90% or more of mice die within 72 hours (Patent Document 3). Under such circumstances, the idea of using lipopolysaccharide itself as a vaccine antigen cannot generally occur.
  • the present invention is intended to reduce the inoculation reaction by enabling the production of multivalent vaccines and mixed vaccines in vaccines against Gram-negative bacteria such as Salmonella and Escherichia coli.
  • the present inventors have anticipated that when a vaccine containing a structure containing an O antigen derived from a Gram-negative bacterium (eg, lipopolysaccharide) as an active ingredient is administered to birds.
  • the structure is recovered using a method such as And a composition is prepared to the vaccine composition which uses the said structure as an active ingredient through the process of emulsifying as needed.
  • the vaccine composition thus obtained was immunized to birds (for example, chickens), it was found that the gram-negative bacteria could be immunized without showing any remarkable side reaction, and the present invention was completed.
  • a vaccine composition for birds comprising as an active ingredient a structure containing an O antigen derived from a Gram-negative bacterium (but not including whole cells).
  • the structure containing an O antigen derived from a Gram-negative bacterium is a mixture of a structure containing an O antigen derived from Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurium, and Salmonella infantis
  • a method for producing a vaccine composition for birds comprising as an active ingredient a structure containing an O antigen derived from a Gram-negative bacterium, comprising the following steps (1) to (4); (1) a step of culturing gram-negative bacteria (culture step), (2) A step of releasing the structure from the cells contained in the cultured solution (release step), (3) A step of recovering the structure from the solution after release (recovery step), and then (4) a step of preparing the solution after recovery to obtain a vaccine composition (preparation step).
  • the method according to [13], wherein the step of releasing the structure is a step of ultrasonic treatment or a step of phenol treatment.
  • a structure for example, lipopolysaccharide
  • an O antigen derived from a Gram-negative bacterium as an active ingredient of a vaccine composition, it becomes possible to reduce swelling at the administration site compared to a conventional bacterial vaccine. Moreover, by making it into a component, further multi-mixing becomes possible without increasing the amount of injection solution.
  • FIG. 1 shows a vaccine in which lipopolysaccharides derived from Salmonella enteritidis, Salmonella infantis, and Salmonella typhimurium are mixed (trivalent LPS vaccine), or a vaccine in which other antigens are added to the trivalent LPS vaccine
  • FIG. 2 is a graph showing the number of excreted bacteria when the trivalent LPS vaccine is subjected to an attack test with Salmonella typhimurium.
  • * indicates a significant difference (p ⁇ 0.05) from the control group.
  • FIG. 3 is a diagram showing the number of excreted bacteria when a trivalent LPS vaccine is subjected to an attack test with Salmonella enteritidis.
  • FIG. 4 is a diagram showing the number of excreted bacteria when a trivalent LPS vaccine is subjected to an attack test with Salmonella infantis. In the figure, * indicates a significant difference (p ⁇ 0.05) from the control group.
  • FIG. 5 is a graph showing the number of excreted bacteria when an attack test is conducted with Salmonella enteritidis for 10 types of mixed LPS vaccines. In the figure, * indicates a significant difference (p ⁇ 0.05) from the control group.
  • FIG. 6 is a graph showing the number of excreted bacteria when an attack test is conducted with Salmonella Infantis for 10 types of mixed LPS vaccines. In the figure, * indicates a significant difference (p ⁇ 0.05) from the control group.
  • a first embodiment of the present invention is a vaccine composition for birds, which contains a structure containing an O antigen derived from a Gram-negative bacterium as an active ingredient.
  • a vaccine composition comprising as an active ingredient a structure (specifically lipopolysaccharide) containing O antigen derived from Salmonella typhimurium, Salmonella infantis, or Salmonella enteritidis, It has been confirmed that the effect of eradication of bacteria against attacks using microbial cells. This is considered to be because even when the structures derived from a plurality of types of gram-negative bacteria are mixed, the antigenicity of each structure is maintained. Further, in the 10-type mixed vaccine obtained by mixing the above trivalent vaccine with an antigen different from the structure, the antigenicity against the cells that provided the structure is maintained. This is considered to be because the antigenicity to the structure is maintained even when an antigen other than the structure is included in the mixed vaccine.
  • the vaccine composition of the present invention is (A) A vaccine composition comprising the structure derived from one kind of gram-negative bacteria as an active ingredient (hereinafter sometimes referred to as a unit price vaccine), (B) A vaccine composition (hereinafter sometimes referred to as a multivalent vaccine) containing the structure derived from multiple types of Gram-negative bacteria as an active ingredient, and (C) the structure as a unitary vaccine or multivalent vaccine.
  • Vaccine composition containing an antigen different from that hereeinafter sometimes referred to as mixed vaccine including.
  • the vaccine composition of the present invention contains a structure containing O antigen as an active ingredient. Therefore, the vaccine composition of the present invention is widely applicable to gram-negative bacteria having the structure.
  • Gram-negative bacteria of the present invention include facultative anaerobic Gram-negative bacilli (Gram-negative facultatively anaerobic rod), Anaplasmataceae, Arcobacter genus (Arcobacter), Bartonellaceae, Brachyspira genus ( Brachyspira, Buchnera, Campylobacter, Chlamydiales, Chloroflexus, Gram-negative aerobic bacteria, Gram-negative anaerobic bacteria), Gram-negative oxygenic photosynthetic bacteria, Helicobacter, Lawsonia bacteria, Methylosinus, Oceanospirillaceae, Ornibacterium (Ornithobacterium), Pisciricketts (Pisciricketts) iaceae), Rhodobacter, Rhodomicrobium, Rhodovulum,
  • the facultative anaerobic gram-negative bacilli are Enterobacteriaceae, Pasturellaceae, Actinobacillus, Aeromonadaceae, Azoarcus, Capnocytophaga ), Cardiobacteriaceae, Chromobacterium, Eikenella, Gardnerella, Moritella, Rahnella, Shewanella, Streptococcus Included are the genus Bacillus (Streptobacillus moth), Vibrionaceae, and Zymomonas. Preferred are Enterobacteriaceae and Pasteurellaceae.
  • Enterobacteriaceae include Salmonella, Escherichia, Calimmatobacterium, Citrobacter, Edwardiella, Enterobacter, Erwinia ( Erwinia, Hafnia, Klebsiella, Kluyvera, Morganella, Panteaa, Pectobacterium, Photorhabdus, Pregio Monas (Plesiomonas), Proteus, Providencia, Serratia, Shigella, Wigglesworthia, Xenorhabdus, and Yersinia ( Yersinia). Of these, Salmonella and Escherichia are preferred.
  • Salmonella genus is divided into groups according to major O antigen types, and further subdivided according to H antigen types. As shown in Tables 1 and 2, O2 group (A), O4 group (B), O7 group (C1, C4), O8 group (C2, C3), O9 group (D1), and O3 / O10 group (E1 , E2, E3) (old names in parentheses).
  • a trivalent composition comprising an O antigen derived from Salmonella typhimurium (O4 group), Salmonella infantis (O7 group), and Salmonella enteritidis (O9 group) as an active ingredient.
  • O4 group Salmonella typhimurium
  • O7 group Salmonella infantis
  • O9 group Salmonella enteritidis
  • Non-Patent Document 4 in birds immunized with a vaccine containing cells of Salmonella typhimurium, Salmonella infantis, and Salmonella enteritidis, not only the above-mentioned vaccine strain but also Salmonella typhim The effect of reducing the eradication was also seen against Salmonella Heidelberg in the same O antigen group (O4 group) as Lilium. Therefore, it is considered that the vaccine is also effective against cells of different serotypes having O antigens that are homologous to the O antigen of the vaccine strain. In other words, in the case of the Salmonella vaccine, it is considered that it is also effective against bacterial cells having an O antigen that is homologous to the vaccine strain (cells of the same O antigen group as the vaccine strain). Therefore, when the vaccine composition of the present invention is applied to the genus Salmonella, it can be applied to other Salmonella bacteria belonging to the O4 group, the O7 group, and the O9 group.
  • the vaccine composition of the present invention includes (A) a unit cost vaccine comprising a structure containing an O antigen derived from Salmonella as an active ingredient, (B) a multivalent vaccine comprising, as an active ingredient, a structure containing an O antigen derived from two or more types of Salmonella selected from Salmonella, (C) Unit price vaccine comprising a structure containing an O antigen derived from the genus Salmonella of O4 group, O7 group, or O9 group, (D) a multivalent vaccine each comprising O antigens derived from two or more Salmonella species selected from the group consisting of O4 group, O7 group, and O9 group, (E) A mixed vaccine in which the unitary vaccine or multivalent vaccine contains an antigen different from the structure is included.
  • Salmonella genus included in the genus Salmonella, O4 group, O7 group, or O9 group include the cells in Tables 1 and 2.
  • the genus Salmonella is a genus Salmonella belonging to the O4 group, the O7 group, and the O9 group.
  • the O4 group is Salmonella typhimurium
  • the O7 group is Salmonella infantis
  • the O9 group is Salmonella enteritidis.
  • Escherichia coli is classified by a combination of three types of antigens: O antigen, K antigen, and H antigen. About 160 types of O antigen, about 100 types of K antigen, and 56 types of H antigen are known.
  • O antigen O antigen
  • K antigen K antigen
  • H antigen H antigen
  • certain types of bacteria can cause diarrhea and gastroenteritis, causing food poisoning.
  • Such bacteria are generally differentiated between toxigenic E. coli, cell-invasive E. coli, enterohemorrhagic E. coli, enteropathogenic E. coli, agglutinating E. coli, and homogeneously adherent E. coli.
  • Toxigenic E. coli includes O4, O6, O7, O8, O9, O15, O18, O20, O25, O27, O63, O77, O78, O80, O85, O114, O115, O126, O128a, O139, O148, O153 , O159, O167, O168, and O169.
  • Intestinal invasive Escherichia coli includes O28c, O29, O112a, O124, O136, O143, O144, O152, O164, and O167.
  • Enterohemorrhagic E. coli includes O1018, O26, O91, O111, O113, O114, O115, O117, O119, O121, O128, O145, and O157. Preferably, it is O78.
  • the Pasteurellae family includes the genus Haemophilus, the genus Manhemia, and the genus Pasteurella. Hemophilus is preferable.
  • the genus Haemophilus includes Haemophilus paragallinarum, flexible gonococci, Haemophilus influenzae, Haemophilus parainfluenzae, Haemophilus paraphrophilus, Haemophilus paraphrophilus, Haemophilus ⁇ ⁇ ⁇ parasu Includes Haemophilus somnus. Hemophilus paragalinarum is preferred.
  • the vaccine composition of the present invention contains a structure containing O antigen as an active ingredient. Since the O antigen is considered to be mainly antigenic, the structure containing the O antigen may be any structure as long as it contains the O antigen. However, the structure is a structure that does not contain whole cells. For example, lipopolysaccharide and structures obtained by removing lipid A from lipopolysaccharide (for example, a structure composed of O antigen, O antigen and core polysaccharide) are included. If the process of removing lipid A is not used in consideration of the ease of formulation, it is preferable to use lipopolysaccharide as an active ingredient. In the vaccine composition of the present invention, side effects are not considered a problem, but in order to further improve safety, a structure obtained by removing the lipid A portion from lipopolysaccharide is preferably used as an active ingredient.
  • the vaccine composition of the present invention includes a vaccine composition (unit price vaccine) containing as an active ingredient the structure derived from one kind of Gram-negative bacteria.
  • Gram-negative bacteria can be appropriately selected from the cells belonging to the Gram-negative bacteria.
  • the gram-negative bacterium is preferably Enterobacteriaceae or Pasteurellaceae.
  • the Enterobacteriaceae is preferably Salmonella or Escherichia.
  • the Salmonella genus is preferably the Salmonella genus belonging to the O4 group, the O7 group, or the O9 group.
  • the Salmonella genus belonging to the O4 group is preferably Salmonella typhimurium
  • the Salmonella genus belonging to the O7 group is preferably Salmonella Infantis
  • the Salmonella genus belonging to the O9 group is preferably Salmonella enteritidis.
  • the Escherichia genus is preferably an Escherichia coli having O78 O antigen.
  • the Pasteurellaceae family is preferably the genus Haemophilus, especially Haemophilus paragalinarum.
  • a vaccine composition comprising as an active ingredient an O antigen derived from one gram-negative bacterium
  • B a vaccine composition comprising as an active ingredient an O antigen derived from one type of Enterobacteriaceae
  • C a vaccine composition comprising as an active ingredient an O antigen derived from one type of Pasteurellaceae
  • D a vaccine composition comprising as an active ingredient an O antigen derived from one type of Salmonella
  • E a vaccine composition comprising as an active ingredient an O antigen derived from one kind of Escherichia coli
  • F a vaccine composition comprising as an active ingredient an O antigen derived from Salmonella belonging to one kind of O4 group
  • G a vaccine composition comprising as an active ingredient an O antigen derived from Salmonella belonging to one type of O7 group
  • H a vaccine composition comprising as an active ingredient an O antigen derived from Salmonella belonging to one type of O9 group
  • I a vaccine composition comprising as an active ingredient an O antigen derived from Salmonella belonging to one type
  • the vaccine composition of this invention contains the vaccine composition (multivalent vaccine) which uses the said structure derived from multiple types of Gram-negative bacteria as an active ingredient.
  • the number of Gram-negative bacteria derived from the structure containing the O antigen is preferably 2 or more, 3 or more, 4 or more, or 5 or more.
  • they are 2 types (2 values vaccine), 3 types (3 values vaccine), 4 types (4 values vaccine), or 5 types (5 values vaccine).
  • the structure derived from Salmonella typhimurium, Salmonella infantis, and Salmonella enteritidis is preferably included.
  • the gram-negative bacterium can be appropriately selected from the cells belonging to the gram-negative bacterium.
  • the gram-negative bacterium is preferably Enterobacteriaceae or Pasteurellaceae.
  • the Enterobacteriaceae is preferably Salmonella or Escherichia.
  • the Salmonella genus is preferably the Salmonella genus belonging to the O4 group, the O7 group, or the O9 group.
  • the Salmonella genus belonging to the O4 group is preferably Salmonella typhimurium
  • the Salmonella genus belonging to the O7 group is preferably Salmonella Infantis
  • the Salmonella genus belonging to the O9 group is preferably Salmonella enteritidis.
  • the Escherichia genus is preferably an Escherichia coli having O78 O antigen.
  • the Pasteurellaceae family is preferably the genus Haemophilus, especially Haemophilus paragalinarum.
  • the multivalent vaccine composition of the present invention comprises (A) a vaccine composition comprising as an active ingredient an O antigen derived from two or more gram-negative bacteria, (B) A vaccine composition comprising as an active ingredient an O antigen derived from two or more types of Enterobacteriaceae, (C) a vaccine composition comprising as an active ingredient an O antigen derived from two or more types of Pasteurellaceae, (D) a vaccine composition comprising as an active ingredient an O antigen derived from two or more Salmonella species, (E) a vaccine composition comprising as an active ingredient an O antigen derived from two or more E.
  • the vaccine composition of this invention contains the vaccine composition (mixed vaccine) which contains the antigen different from the said structure in a unit price vaccine or a multivalent vaccine.
  • antigens include attenuated pathogens, inactivated pathogens, proteins, peptides, nucleic acids, and virus-like particles.
  • the unitary vaccine and multivalent vaccine of the present invention include other viruses (for example, infectious bronchitis virus, infectious bursal disease virus), chicken encephalomyelitis virus (avian encephalomyelitis virus) ), Egg-laying syndrome virus (Egg drop syndrome virus), Newcastle disease virus (Newcastle disease virus), avian reovirus (avian reovirus), avian influenza virus (avian influenza virus), Marek's disease virus (Marek's disease virus), infectious Infectious ⁇ laryngotracheitis virus, avian pneumovirus, and fowlpox virus), bacteria (eg, Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae, cross Lithium septicum, Clostridium perfringens, Campylobacter jejuni, and protozoa (Campylobacter
  • the vaccine composition of the present invention uses a structure containing O antigen as an active ingredient.
  • the concentration of the structure contained in the vaccine composition is determined using an endotoxin unit (EU) as an index.
  • EU endotoxin unit
  • the method of measuring EU is performed according to the following 2- (6) measurement process.
  • the concentration of the structure contained in the vaccine composition may be different for each type of structure, or may be the same.
  • the preferred concentration of the structure is at least 5,400 EU / mL. More preferably, each is at least 54,000 EU / mL.
  • the ratio (EU ratio) in which the structure is contained may be an equal ratio or a different ratio.
  • the vaccine composition of the present invention can be used for birds.
  • Birds include birds raised for commercial or non-commercial purposes. Examples of birds include pheasants (eg, chickens, quails, and turkeys), gulls (eg, ducks, and geese), plovers (eg, gulls, quail, and plovers), pigeons (eg, pigeons).
  • Ostriches eg, ostrich
  • sparrows eg, crows, finch, sparrows, stirling, and swallows
  • parrots eg, parrots
  • hawks eg, eagle, and hawk
  • owls eg, , Owls
  • Penguins eg, Penguins
  • Parrots eg, Parakeets and Parrots
  • it is a chicken.
  • the vaccine composition of the present invention may contain a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a pharmaceutically acceptable carrier a carrier that is usually used in the production of a vaccine can be used without limitation. Specific examples include saline, buffered saline, dextrose, water, glycerol, isotonic aqueous buffers, and combinations thereof.
  • an emulsifier, a preservative (eg, thimerosal), an isotonic agent, a pH adjuster, an inactivating agent (eg, formalin), an adjuvant, and the like are appropriately blended therein.
  • the adjuvant is preferably an oil adjuvant.
  • Carrier protein A structure containing an O antigen may be bound to a carrier protein as necessary for the purpose of enhancing the immune response upon administration.
  • carrier proteins include diphtheria toxoid (DT), tetanus toxoid (TT), cholera toxin (CT), and CRM197.
  • the method for binding to the carrier protein may be via a linker (for example, SPDP or ADH) or directly.
  • a linker for example, SPDP or ADH
  • a method of binding to a carrier protein (DT / TT / CT) via SPDP or ADH using cyanogen bromide is disclosed (Non-patent Document 1).
  • the second embodiment of the present invention is a method for producing a vaccine composition for birds, comprising as an active ingredient a structure containing an O antigen derived from a Gram-negative bacterium.
  • the production method of the present invention includes a step of culturing Gram-negative bacteria (cultivation step), a step of releasing the structure from cells contained in the solution after the culture (release step), and the structure from the solution after release.
  • a step of inactivating the bacterial cells (inactivation step) and / or a step of emulsifying (emulsification step) may be included. It is preferable that the inactivation step is after the culturing step, and the emulsification step is after the recovery step.
  • lipid A removal step lipid A removal step
  • each step will be described below, but if necessary, the steps may not be in the following order, a specific step may not be included, and a specific step may be repeated. Absent. For example, when an oil adjuvant is not used, the emulsification step may not be used. The inactivation step and the liberation step may be performed simultaneously (for example, both steps are subjected to ultrasonic treatment or formalin treatment).
  • the type of medium and growth conditions may be appropriately changed according to the type of gram-negative bacteria.
  • the cells are cultured in a TPB medium at 35 to 43 ° C. (preferably 37 ° C.) for 8 to 24 hours (preferably 16 hours).
  • the cells are cultured in LB medium at 30 to 43 ° C. (preferably 37 ° C.) for 8 to 24 hours (preferably 16 hours).
  • the inactivation step may be appropriately changed according to the type of gram-negative bacteria.
  • it can be performed by operations such as physical treatment (for example, X-ray irradiation, heat treatment, or ultrasonic treatment) or chemical treatment (formalin treatment, mercury treatment, alcohol treatment, or chlorine treatment). These processes may be used alone or in combination. Formalin treatment is preferred.
  • any method may be used for the release step as long as the antigenicity of the structure is maintained.
  • a treatment method and treatment conditions are appropriately selected. It doesn't matter. For example, ultrasonic treatment, phenol treatment, mechanical treatment, freeze-thaw treatment, pressure / decompression treatment, osmotic pressure treatment, cell wall decomposition treatment (for example, lysozyme treatment in Non-Patent Document 1 or Non-Patent Document 2), and surfactant treatment Is included. These processes may be used alone or in combination. Cell wall decomposition treatment, ultrasonic treatment, or phenol treatment is preferred.
  • the ultrasonic treatment may be performed under any conditions as long as the antigenicity of the structure is maintained.
  • the treatment is performed at 25 ° C. or lower (preferably in ice water) for 5 to 30 minutes (preferably 15 minutes).
  • the solution after sonication may be subjected to centrifugation in order to remove impurities.
  • the phenol treatment may be performed under any conditions as long as the antigenicity of the structure is maintained. For example, 45 to 100% (preferably 100%) phenol, 4 to 80 ° C. (preferably 68 ° C.), Treat for 5-30 minutes (preferably 15 minutes). During the treatment, the container may be stirred at regular intervals. The solution after the reaction may be centrifuged in order to remove impurities. The solution after phenol treatment may be dialyzed with an appropriate buffer (for example, PBS).
  • an appropriate buffer for example, PBS
  • nucleic acid degradation treatment DNase treatment or RNase treatment
  • protein degradation treatment prote treatment
  • the nucleic acid may be removed by ethanol fractionation.
  • Protein removal and lipid A fatty acid side chain removal may be performed by acetic acid treatment.
  • the recovery step may be appropriately changed according to the properties of the structure.
  • lipopolysaccharide since lipopolysaccharide has many phosphate groups, it is negatively charged as a whole, and has the property of being easily adsorbed by positively charged substances. Therefore, the structure may be recovered by an adsorption method using affinity chromatography utilizing such properties or a positively charged modified membrane.
  • a positively charged modified membrane For example, polymyxin B, histidine, histamine, lysine, aminated-poly ( ⁇ -methyl-L-glutamic acid) beads, and ammonium group-introduced positively charged modified membrane can be considered as positively charged substances.
  • the structure may be recovered using the fact that lipid A is hydrophobic.
  • Hydrophobic materials include polypropylene, polyethylene, polystyrene, and PTEE membranes.
  • a method for recovering the structure a method using a substance that binds to lipopolysaccharide is also conceivable.
  • substances include anti-LPS antibodies, horseshoe crab anti-LPS factors, BPI (bactericidal-permeability-increasing) protein, CAP18 (cationic-antibacterial-protein-of-18 kDa), and LBP (LPS-Binding-Protein). Chromatography using a carrier to which these are bound can be used.
  • the method for recovering the structure is achieved by using a commercially available product.
  • ET-clean registered trademark, Chisso Corporation
  • the structure containing O antigen may be a structure containing lipid A (for example, lipopolysaccharide), or a structure not containing lipid A (for example, O antigen, O antigen and core polysaccharide) ). In the case of a structure that does not contain lipid A, it is preferable to incorporate a step of removing lipid A.
  • An example of the step of removing lipid A is a heat treatment step in which an acid is added.
  • An example of the above process is a method of treating with 1% acetic acid at 100 ° C. for 90 minutes (Non-patent Document 1).
  • This step is combined with a step of separating the removed lipid A.
  • An example of the step of separating lipid A is ultracentrifugation (Non-Patent Document 1).
  • the following method is illustrated as a measuring method of lipopolysaccharide.
  • a solution of the structure diluted with distilled water and a standard product of CSE-L set (E. coli O113: H10-derived endotoxin) are added to the microplate.
  • Add LAL reagent from Endspecy ES-50M set (Seikagaku Biobusiness Co., Ltd.). Cover the plate and incubate at 37 ° C for 30 minutes.
  • Emulsification step is a step of mixing the solution containing the structure, oil, and emulsifier.
  • the emulsifier may be a single emulsifier or a combination of a plurality of types of emulsifiers.
  • Tween 80 registered trademark
  • Tween 60 registered trademark
  • Brij 721 registered trademark
  • Eumulgin B2 registered trademark
  • Arlacel 165 FL registered trademark
  • Tefose 1500 registered trademark
  • Glucamate SSE20 Registered trademark
  • Surfhope C-1216 registered trademark
  • Surfhope C-1811 registered trademark
  • Surfhope SE Pharma D-1816 registered trademark
  • Surfhope SE Pharma D-1616 registered trademark
  • Span 60 registered trademark
  • Olepal isostearique R
  • Glucate SS Registered SS
  • Surfhope C-1205 Preferably, it is sorbitan monooleate.
  • Oils include vegetable oils, mineral oils, animal oils, synthetic oils and silicone oils. Light liquid paraffin is preferable.
  • a preparation process is a process which mixes the composition containing the said structure derived from the specific microbial cell obtained from said process.
  • a trivalent vaccine having the above-described structure derived from Salmonella typhimurium, Salmonella infantis, and Salmonella enteritidis as an active ingredient
  • the structure derived from Salmonella typhimurium is included. It is a step of mixing a composition, a composition containing the structure derived from Salmonella infantis, and a composition containing the structure derived from Salmonella enteritidis.
  • the resulting vaccine may be used alone as an avian Salmonella vaccine, such as other viruses (for example, infectious bronchitis virus, infectious bursal disease virus), chickens Encephalomyelitis virus (avian encephalomyelitis virus), egg-laying syndrome virus (Egg drop syndrome virus), Newcastle disease virus (Newcastle disease virus), avian reovirus (Avian reovirus), avian influenza virus (avian influenza virus), Marek's disease virus (Marek's disease virus), infectious ⁇ laryngotracheitis virus, avian pneumovirus, and fowlpox virus), bacteria (eg, Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma Novie (Mycoplasma synoviae), Clostridium septicum, Clostridium perfringens, Campylobacter jejuni, and Campylobacter fetus (Campylobacter fetus), Combined vaccines in combination with at least one vaccine selected from the group consisting of
  • the ratio (EU ratio) of mixing each composition containing the structure may be equal, or the ratio of a specific composition may be increased or decreased.
  • the ultrasonic disruption of the bacterial cells was performed in ice water for 15 minutes. Thereafter, the mixture was centrifuged (Tomy Seiko, 10,000 ⁇ g, 15 minutes), and the supernatant was used for the recovery step.
  • the phenol treatment of the bacterial cells was performed by mixing 20 mL of the above-mentioned formalin-inactivated bacterial solution with an equal amount of saturated phenol solution and heating at 68 ° C. for 15 minutes. At that time, the mixture was stirred every 3 minutes. Thereafter, the mixture was allowed to stand at 4 ° C. for 1 day, followed by centrifugation (Tomy Seiko, 10,000 ⁇ g, 15 minutes). Furthermore, in order to remove impurities, the supernatant was centrifuged (Tomy Seiko, 10,000 ⁇ g, 15 minutes). Thereafter, the supernatant was dialyzed against PBS for 3 days and used for the recovery step.
  • Salmonella SE (9.1 ⁇ 1O 9 CFU / feather), SI (2.3 ⁇ 1O 9 CFU / feather), or ST (1.2 ⁇ 1O 9 CFU / feather) are challenged by oral inoculation, and efficacy is confirmed confirmed. Efficacy was obtained by collecting feces after 1, 4, 7, 10 and 14 days after the attack, and the number of bacteria contained therein was measured by the following method.
  • FIG. 1 shows the observation results of leg swelling
  • FIG. 2 shows the results of attack with ST
  • FIG. 3 shows the results of attack with SE
  • FIG. 4 shows the results of attack with SI.
  • FIG. 1 shows the observation results of leg swelling
  • FIG. 2 shows the results of attack with ST
  • FIG. 3 shows the results of attack with SE
  • FIG. 4 shows the results of attack with SI.
  • FIG. 1 shows the observation results of leg swelling
  • FIG. 2 shows the results of attack with ST
  • FIG. 3 shows the results of attack with SE
  • FIG. 4 shows the results of attack with SI.
  • SE, ST, or SI-derived lipopolysaccharide is 7,200 EU / mL each, Newcastle disease virus 1O 8.4 EID 50 / mL or more, infectious bronchitis virus Nerima strain 10 6.4 EID 50 / mL or more, TM Strain 10 6.4 EID 50 / mL or higher, Mycoplasma gallisepticum 1O 7.4 EID 50 / mL or higher, Hypogenetic syndrome virus 10 6.7 EID 50 / mL or higher, infectious coryza A and C antigen (recombinant antigen) 2.4 ⁇ g / mL or higher This was designated as a 10-type LPS vaccine.
  • FIG. 1 shows the observation results of leg swelling
  • FIG. 5 shows the results of attacking with SE
  • FIG. 6 shows the results of attacking with SI.
  • FIG. 1 shows the observation results of leg swelling
  • FIG. 5 shows the results of attacking with SE
  • FIG. 6 shows the results of attacking with SI.
  • FIG. 1 shows the observation results of leg swelling
  • FIG. 5 shows the results of attacking with SE
  • FIG. 6 shows the results of attacking with SI.
  • FIG. 1 shows the observation results of leg swelling
  • FIG. 5 shows the results of attacking with SE
  • FIG. 6 shows the results of attacking with SI.
  • a vaccine comprising a structure containing an O antigen derived from a Gram-negative bacterium (for example, lipopolysaccharide) as an active ingredient can reduce side reactions at the administration site. Further, by mixing the structures derived from a plurality of types of Gram-negative bacteria, it becomes possible to produce further multivalent vaccines and mixed vaccines without increasing the amount of injection solution.
  • a Gram-negative bacterium for example, lipopolysaccharide

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Abstract

　グラム陰性菌に由来するＯ抗原を含む構造物（ただし、全菌体を含まない）を有効成分とする鳥類用のワクチン組成物、及びその製造方法を提供する。本発明は、グラム陰性菌に由来するＯ抗原を含む構造物（例えば、リポ多糖）をワクチンの抗原とすることで、従来の菌体ワクチンと比較して接種反応の軽減及び注射液量の少量化が達成され、ワクチンの多混化を可能ならしめる。

Description

ＬＰＳワクチン
　本発明はサルモネラ菌や大腸菌などのグラム陰性菌が起因する感染症を予防する為に有用な新規ワクチンを提供する。詳細には、本発明は、グラム陰性菌に由来するO抗原を含む構造物（例えば、リポ多糖）を防御抗原とし、この抗原を用いて非ヒト動物、特に鳥類を免疫化する方法に関する。
　細菌はグラム染色法を行った場合に細胞壁の組成の違いによって染色性が異なり、その染色性の違いを指標にして、グラム陰性菌とグラム陽性菌の大きな二つのグループに分けられる。グラム陰性菌の場合、その細胞壁は外膜とその内側にあるペプチドグリカンの層からなっている。外膜の構成成分は、リン脂質、リポ多糖(Lipopolysaccharide；LPS)、リポ蛋白、及び蛋白質であり、外膜の単位膜構造はリン脂質とリポ多糖で構成されている。膜の外葉にはリポ多糖が、内葉にはリン脂質がある。リポ多糖は、リピドA（Lipid A）と呼ばれる高分子の脂質とそれに結合した多糖の部分からなる。リピドAの部分は外膜の外葉をつくっており、多糖の部分は、外膜より外部に伸びている。最外部とリピドAに近い部分とでは糖の種類が異なり、外部をO側鎖多糖（O抗原）、内側の部分をコア多糖という。O抗原をつくる糖は、主に6炭糖、及び5炭糖で、3～5種類のこれらの糖からなる基本構造が繰返し現れる。コア多糖部分にはこれらの糖のほかに8炭糖であるケトデオキシオクトン酸や7炭糖であるヘプトースなど、細菌独特の糖が存在している。リピドAは細菌独特の脂質で、2分子のグルコサミンがβ－1,6結合した糖にリン酸と脂肪酸が結合したものであり、コア多糖部分とは糖の6’の位置で結合している。
　グラム陰性菌に属する細菌としては非常に多くの種類が含まれ、腸内細菌科に含まれるようなサルモネラ属や大腸菌属、パスツレラ科に属するヘモフィルス属もグラム陰性菌に含まれる。
　サルモネラ属（Salmonella）は中等大桿菌で周毛性鞭毛を有する細菌であり、O抗原の種類によって群に分けられ、さらにH抗原の種類によって細分化されており、2000種類を超す血清型が存在する。サルモネラ属の宿主域はきわめて広く、ヒトをはじめ、各種の哺乳動物及び鳥類が感染または保有していることが知られている。サルモネラ属が鶏に感染した場合、幼雛において敗血性疾病を引き起こすことがある。ただし、成鶏の場合、保菌鶏においても無症状であることから淘汰の対象とはならず、その結果、サルモネラ汚染鶏由来の鶏肉や鶏卵が流通し、そこから派生する食品を介してヒトに食中毒を惹起する。
　サルモネラによる食中毒は、汚染された食品を摂取してから12～48時間の潜伏期を経て発症する。潜伏期間は、摂取菌量、患者の健康状態及び年齢によって左右される。症状としては主として急性胃腸炎であり、下痢、腹痛、嘔吐及び発熱などを主徴とする。従って、鶏用サルモネラワクチンは鶏疾病をコントロールするのではなく、公衆衛生上使用される重要なワクチンである。
　従来のサルモネラ属に対するワクチンとして、不活化させたサルモネラ属の菌体を含む全菌体ワクチンが存在するが、全菌体ワクチンは抗原性を付与する以外の部分も含まれることから、副作用を惹起し得る。多数羽飼育される鶏においてはワクチネーションの省力化の観点から一回の注射で多くの疾病を予防できる多価ワクチンへの要望が強い。同時に多価ワクチンは注射回数の削減に繋がることから鶏のストレス軽減にも寄与する。しかしながら、多価ワクチンはこのような利便性を有する一方、特にサルモネラ菌のような菌類を含む場合には投与部位の接種反応が生じやすい。
　このような状況下、サルモネラに対するコンポーネントワクチンの研究が行われており、その一つとしてリポ多糖（O抗原）の応用についても検討がなされている。例えば、サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella Typhimurium）由来のO抗原をキャリアー蛋白質に結合させた結合体をマウスに投与して有効性を確認した報告がある（非特許文献１）。また、サルモネラ・ティフィ（Salmonella Typhi）由来のリポ多糖をマウスに投与して有効性を確認した報告がある（特許文献１）。また、サルモネラ属以外でもバークホルデリア・タイランデンシス（Burkholderia thailandensis）またはバークホルデリア・シュードマレイ（Burkholderia pseudomallei）由来のリポ多糖をマウスに投与して有効性を確認した報告がある（特許文献２、非特許文献２）。
　しかしながら、リポ多糖は臨床的には敗血症に伴うショック、汎発性血管内凝固症候群（DIC）、さらに多臓器障害（MOF）といった極めて致死性の高い諸疾患を引き起こすこと、ごく微量であっても発熱等の原因となることから、生体に投与する医薬品等においてはリポ多糖の混入を避けるべく細心の注意が払われている（非特許文献３）。実際にリポ多糖をマウスに投与した場合、72時間以内に90%以上のマウスが死亡することが報告されている（特許文献３）。このような状況下、リポ多糖そのものをワクチン抗原として使用するという発想は一般的には生じ得ない。
WO2004/052394号公報 WO2010/082020号公報 特開2001-26602
Infect. Immun, 60, pp4679-4686, 1992 Vaccine, 28, pp7551-7555, 2010 Bull. Natl. Inst. Health Sci., 126, pp19-33 2008 AVIAN DISEASES, 53, pp281-286, 2009
　本発明は、サルモネラ菌や大腸菌などのグラム陰性菌に対するワクチンにおいて、多価ワクチンや混合ワクチンの製造を可能とし、接種反応の軽減を図ることを目的とする。
　上記の課題に対して本発明者らは鋭意検討を行った結果、グラム陰性菌に由来するO抗原を含む構造物（例えば、リポ多糖）を有効成分とするワクチンを鳥類へ投与した場合、予想に反して投与部位での腫脹が抑えられることを見出した。すなわち、グラム陰性菌（例えば、サルモネラ属）の培養液に含まれる菌体からO抗原を含む構造物を遊離させた後（例えば、超音波処理やフェノール処理により）、前記構造物が吸着するカラムなどを用いて前記構造物を回収する。そして、必要に応じて乳化させる工程を経て、前記構造物を有効成分とするワクチン組成物へ組成を調製する。こうして得られたワクチン組成物を鳥類（例えば、ニワトリ）へ免疫すると、特筆すべき副反応を示すことなく前記グラム陰性菌に対して免疫付与できることを見出し、本願発明を完成させるに到った。
　本発明は、以下に示す通りである。
［１］グラム陰性菌に由来するＯ抗原を含む構造物（ただし、全菌体を含まない）を有効成分とする鳥類用のワクチン組成物。
［２］Ｏ抗原を含む構造物が、リポ多糖である、前記［１］に記載のワクチン組成物。
［３］グラム陰性菌が、腸内細菌科、又はパスツレラ科の細菌である、前記［１］又は［２］に記載のワクチン組成物。
［４］腸内細菌科の細菌が、サルモネラ属、又は大腸菌属の細菌である、前記［３］に記載のワクチン組成物。
［５］サルモネラ属の細菌が、０４群、０７群及び０９群からなる群より選択される１種類以上のサルモネラ属の細菌である、前記［４］に記載のワクチン組成物。
［６］サルモネラ属の細菌が、サルモネラ・エンテリティディス、サルモネラ・ティフィムリウム、及びサルモネラ・インファンティスからなる群より選択される１種類以上の細菌である、前記［４］又は［５］に記載のワクチン組成物。
［７］グラム陰性菌に由来するＯ抗原を含む構造物が、サルモネラ・エンテリティディス、サルモネラ・ティフィムリウム、及びサルモネラ・インファンティスに由来するＯ抗原を含む構造物の混合物である、前記［４］又は［５］に記載のワクチン組成物。
［８］大腸菌属の細菌が、Ｏ７８のＯ抗原を持つ大腸菌属の細菌である、前記［４］に記載のワクチン組成物。
［９］パスツレラ科の細菌が、ヘモフィルス属の細菌である、前記［３］に記載のワクチン組成物、
［１０］ヘモフィルス属の細菌が、ヘモフィルス・パラガリナルムである、前記［９］に記載のワクチン組成物。
［１１］Ｏ抗原を含む構造物が、ワクチン組成物中に少なくとも各5,400EU/mlで含まれるＯ抗原を含む構造物である、前記［１］から［１０］のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
［１２］ニューカッスル病ウイルス、鶏伝染性気管支炎ウイルス、マイコプラズマ・ガリセプチカム、産卵低下症候群ウイルス、及びヘモフィルス・パラガリナルムからなる群より選択される１種類以上の病原体に由来する抗原をさらに含有する前記［１］から［１１］のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
［１３］グラム陰性菌に由来するＯ抗原を含む構造物を有効成分とする鳥類用のワクチン組成物の製造方法であって、下記の（１）から（４）の工程を含む前記製造方法；
（１）グラム陰性菌を培養する工程（培養工程）、
（２）前記培養後の溶液に含まれる菌体から前記構造物を遊離する工程（遊離工程）、
（３）前記遊離後の溶液から前記構造物を回収する工程（回収工程）、ついで
（４）前記回収後の溶液を調製してワクチン組成物を得る工程（調製工程）。
［１４］前記構造物を遊離する工程が、超音波処理する工程、又はフェノール処理する工程である、前記［１３］に記載の製造方法。
［１５］菌体を不活化する工程（不活化工程）、及び／又は乳化する工程（乳化工程）をさらに含む、前記［１３］又は［１４］に記載の製造方法。
［１６］前記不活化工程が前記培養工程の後であり、前記乳化工程が前記回収工程の後である、前記［１５］に記載の製造方法。
［１７］前記構造物の量を測定する工程（測定工程）をさらに含む、前記［１３］から［１６］のいずれか一項に記載の製造方法。
［１８］前記測定工程が前記回収工程の後である、前記［１７］に記載の製造方法。
［１９］リピドAを除去する工程（リピドA除去工程）をさらに含む、前記［１３］から［１８］のいずれか一項に記載の製造方法。
［２０］前記リピドA除去工程が前記回収工程の後である、前記［１９］に記載の製造方法。
　ワクチン組成物の有効成分としてグラム陰性菌に由来するO抗原を含む構造物（例えばリポ多糖）を用いることによって、投与部位での腫脹を従来の菌体ワクチンより軽減することが可能となる。また、コンポーネント化することにより、注射液量を増やすことなく更なる多混化が可能となる。
図１は、サルモネラ・エンテリティディス、サルモネラ・インファンティス、及びサルモネラ・ティフィムリウム由来のリポ多糖を混合したワクチン（3価LPSワクチン）、又は3価LPSワクチンに他の抗原を添加したワクチン（10種混合LPSワクチン）について、投与部位の腫脹スコアを示す。 図２は、3価LPSワクチンについて、サルモネラ・ティフィムリウムで攻撃試験を行った際の***菌数を示した図である。図中、＊は対照群との有意差（ｐ＜0.05）を示す。 図３は、3価LPSワクチンについて、サルモネラ・エンテリティディスで攻撃試験を行った際の***菌数を示した図である。図中、＊は対照群との有意差（ｐ＜0.05）を示す。 図４は、3価LPSワクチンについて、サルモネラ・インファンティスで攻撃試験を行った際の***菌数を示した図である。図中、＊は対照群との有意差（ｐ＜0.05）を示す。 図５は、10種混合LPSワクチンについて、サルモネラ・エンテリティディスで攻撃試験を行った際の***菌数を示した図である。図中、＊は対照群との有意差（ｐ＜0.05）を示す。 図６は、10種混合LPSワクチンについて、サルモネラ・インファンティスで攻撃試験を行った際の***菌数を示した図である。図中、＊は対照群との有意差（ｐ＜0.05）を示す。
　１．ワクチン組成物
　本発明の第一の実施形態はグラム陰性菌に由来するO抗原を含む構造物を有効成分とする鳥類用のワクチン組成物である。
　本発明では、サルモネラ・ティフィムリウム、サルモネラ・インファンティス、又はサルモネラ・エンテリティディスに由来するO抗原を含む構造物（具体的にはリポ多糖）を有効成分とするワクチン組成物において、それぞれの菌体を用いた攻撃に対する排菌軽減効果が確認されている。それは、複数種類のグラム陰性菌に由来する前記構造物を混合した場合であっても、それぞれの前記構造物に対する抗原性が保持されているためと考えられる。また、上記の3価ワクチンに前記構造物とは異なる抗原を混合した10種混合ワクチンにおいて、前記構造物を提供した菌体に対する抗原性が保持されている。それは、混合ワクチンに前記構造物以外の抗原を含ませた場合であっても、前記構造物に対する抗原性が保持されているためと考えられる。
　上述より、本発明のワクチン組成物は、
（A）一種類のグラム陰性菌に由来する前記構造物を有効成分とするワクチン組成物（以下、単価ワクチンと称する場合もある）、
（B）複数種類のグラム陰性菌に由来する前記構造物を有効成分とするワクチン組成物（以下、多価ワクチンと称する場合もある）、及び
（C）単価ワクチンや多価ワクチンに前記構造物とは異なる抗原を含ませたワクチン組成物（以下、混合ワクチンと称する場合もある）
を含む。
　（1）菌体
　本発明のワクチン組成物はO抗原を含む構造物を有効成分として含む。そのため、本発明のワクチン組成物は前記構造物を有するグラム陰性菌に広く適用可能である。例えば、本発明のグラム陰性菌には、通性嫌気性グラム陰性桿菌（Gram-negative facultatively anaerobic rod）、アナプラズマ科（Anaplasmataceae）、アーコバクター属（Arcobacter）、バルトネラ科（Bartonellaceae）、ブラキスピラ属（Brachyspira）、ブフネラ属（Buchnera）、カンピロバクター属（Campylobacter）、クラミジア目（Chlamydiales）、クロロフレクサス属（Chloroflexus ）、グラム陰性好気性菌（Gram-negative aerobic bacteria）、グラム陰性嫌気性菌（Gram-negative anaerobic bacteria ）、グラム陰性酸素産生光合成細菌（Gram-negative oxygenic photosynthetic bacteria）、ヘリコバクター属（Helicobacter）、ローソニア細菌（Lawsonia bacteria）、メチロサイナス（Methylosinus）、オセアノスピリルム科（Oceanospirillaceae）、オルニソバクテリウム属（Ornithobacterium）、ピスキリケッチア科（Piscirickettsiaceae）、ロドバクター属（Rhodobacter）、ロドミクロビウム属（Rhodomicrobium）、ロドブラム属（Rhodovulum）、リケッチア科（Rickettsiaceae）、ロゼオバクター属（Roseobacter）、スピリルム科（Spirillaceae）、及びテネリクテス門（Tenericutes）が含まれる。好ましくは通性嫌気性グラム陰性桿菌である。
　通性嫌気性グラム陰性桿菌は、腸内細菌科（Enterobacteriaceae）、パスツレラ科（Pasteurellaceae）、アクチノバチルス属（Actinobacillus）、エロモナス科（Aeromonadaceae）、アゾアルカス属（Azoarcus）、キャプノサイトファーガ属（Capnocytophaga）、カルジオバクテリウム科（Cardiobacteriaceae）、クロモバクテリウム属（Chromobacterium）、エイケネラ属（Eikenella）、ガードネレラ属（Gardnerella）、モリテーラ属（Moritella）、ラーネラ属（Rahnella）、シュワネラ属（Shewanella）、ストレプトバチルス属（ Streptobacillus ）、ビブリオ科（Vibrionaceae）、及びザイモモナス属（Zymomonas）が含まれる。好ましくは腸内細菌科、及びパスツレラ科である。
　腸内細菌科は、サルモネラ属（Salmonella）、大腸菌属（Escherichia）、カリマトバクテリウム属（Calymmatobacterium）、シトロバクター属（Citrobacter）、エドワージエラ属（Edwardsiella）、エンテロバクター属（Enterobacter）、エルウィニア属（Erwinia）、ハフニア属（Hafnia）、クレブシエラ属（Klebsiella）、クライベラ属（Kluyvera）、モルガネラ属（Morganella ）、パンテア属（Pantoea ）、ペクトバクテリウム属（Pectobacterium）、フォトラブダス属（Photorhabdus）、プレジオモナス属（Plesiomonas）、プロテウス属（Proteus）、プロビデンシア属（Providencia）、セラチア属（Serratia）、赤痢菌属（Shigella）、ウィグルスウォーチア属（Wigglesworthia）、ゼノラブダス属（Xenorhabdus）、及びエルシニア属（Yersinia）が含まれる。好ましくはサルモネラ属、及び大腸菌属である。
　サルモネラ属は、主要なO抗原の種類で群に分けられ、さらにH抗原の種類によって細分化される。表１及び表２のように、O2群（A）、O4群（B）、O7群（C1、C4）、O8群（C2、C3）、O9群（D1）、及びO3/O10群（E1、E2、E3）が挙げられる（カッコ内は旧呼称）。
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　本発明では、サルモネラ・ティフィムリウム（O4群）、サルモネラ・インファンティス（O7群）、及びサルモネラ・エンテリティディス（O9群）に由来するO抗原を含む構造部を有効成分とする3価ワクチンにおいて、当該菌を用いた攻撃に対する排菌軽減効果が見出されている。それは、本発明の製造方法で得られた前記構造物は、O抗原の種類を問わず、その抗原性を保持させているためと考えられる。そのため、本発明のワクチン組成物は、O4群、O7群、及びO9群に属するサルモネラ属を問わず、サルモネラ属全般に適用可能であると考えられる。
　そして、非特許文献４で、サルモネラ・ティフィムリウム、サルモネラ・インファンティス、及びサルモネラ・エンテリティディスの菌体を含むワクチンを免疫した鳥類において、上記のワクチン株のみならず、サルモネラ・ティフィムリウムと同じO抗原群（O4群）のサルモネラ・ハイデルベルグ（Salmonella Heidelberg）に対しても排菌軽減効果が見られた。それゆえ、前記ワクチンはワクチン株のO抗原と相同性のあるO抗原を持つ異なる血清型の菌体にも効果があると考えられる。つまり、サルモネラワクチンの場合にはワクチン株と相同性のあるO抗原を持つ菌体（ワクチン株と同じO抗原群の菌体）に対しても効果があると考えられる。そのため、本発明のワクチン組成物をサルモネラ属に適用した場合には、O4群、O7群、及びO9群に属する他のサルモネラ属の細菌にも適用可能である。
　すなわち、本発明のワクチン組成物には、
（A）サルモネラ属に由来するO抗原を含む構造物を有効成分とする単価ワクチン、
（B）サルモネラ属より選択される2種類以上のサルモネラ属に由来するO抗原を含む構造物を有効成分とする多価ワクチン、
（C）O4群、O7群、又はO9群のサルモネラ属に由来するO抗原を含む構造物を有効成分とする単価ワクチン、
（D）O4群、O7群、及びO9群からなる群より選択される2種類以上のサルモネラ属に由来するO抗原をそれぞれ含む多価ワクチン、
（E）前記単価ワクチン又は多価ワクチンに前記構造物とは異なる抗原を含ませた混合ワクチン
が含まれる。
　サルモネラ属、O4群、O7群、又はO9群に含まれるサルモネラ属の一例としては、表１や表２の菌体が含まれる。好ましくは、サルモネラ属は、O4群、O7群、及びO9群に属するサルモネラ属である。また、好ましくは、O4群はサルモネラ・ティフィムリウム、O7群はサルモネラ・インファンティス、O9群はサルモネラ・エンテリティディスである。
　大腸菌属は、O抗原、K抗原、及びH抗原の3種類の抗原の組合せによって分類される。O抗原には約160種類、K抗原には約100種類、H抗原には56種類の型が知られている。大腸菌では一定の型の菌が下痢や胃腸炎を起こし、食中毒の原因となる。このような菌は、一般的には毒素原性大腸菌、細胞侵入性大腸菌、腸管出血性大腸菌、腸管病原性大腸菌、凝集付着性大腸菌、及び均一付着性大腸菌に区別される。毒素原性大腸菌に属する群としては、O18、O26、O44、O55、O86、O111、O112、O114、O119、O125、O126、O127、O128a、及びO142が含まれる。毒素原性大腸菌には、O4、O6、O7、O8、O9、O15、O18、O20、O25、O27、O63、O77、O78、O80、O85、O114、O115、O126、O128ａ、O139、O148、O153、O159、O167、O168、及びO169が含まれる。腸管侵襲性大腸菌には、O28c、O29、O112a、O124、O136、O143、O144、O152、O164、及びO167が含まれる。腸管出血性大腸菌には、O1018、O26、O91、O111、O113、O114、O115、O117、O119、O121、O128、O145、及びO157が含まれる。好ましくは、O78である。
　パスツレラ科は、ヘモフィルス属、マンヘミア属、及びパスツレラ属が含まれる。好ましくはヘモフィルス属である。
　ヘモフィルス属は、ヘモフィルス・パラガリナルム（Haemophilus paragallinarum）、軟性下疳菌、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、パラインフルエンザ菌（Haemophilus parainfluenzae）、ヘモフィルス・パラフロフィルス（Haemophilus paraphrophilus）、ヘモフィルス・パラスイス（Haemophilus parasuis）、及びヘモフィルス・ソムナス（Haemophilus somnus）が含まれる。好ましくはヘモフィルス・パラガリナルムである。
　（2）O抗原を含む構造物
　本発明のワクチン組成物は、O抗原を含む構造物を有効成分として含む。O抗原が抗原性の主体と考えられるため、O抗原を含む構造物は、O抗原を含んでいれば如何なる構造物であっても構わない。ただし、前記構造物は全菌体を含まない構造物である。例えば、リポ多糖、及びリポ多糖からリピドAの部分を除去した構造物（例えば、O抗原、O抗原とコア多糖からなる構造物）が含まれる。製剤化の簡便性を考えて、リピドAを除去する工程を用いないのであれば、好ましくはリポ多糖を有効成分としたものを用いる。本発明のワクチン組成物は副作用が問題とされないが、さらに安全性を高めるべく、好ましくはリポ多糖からリピドAの部分を除去した構造物を有効成分とする。
　（3）単価ワクチン
　本発明のワクチン組成物は、一種類のグラム陰性菌に由来する前記構造物を有効成分とするワクチン組成物（単価ワクチン）を含む。
　単価ワクチンの場合、グラム陰性菌は前記のグラム陰性菌に属する菌体から適宜選択されうる。グラム陰性菌は、腸内細菌科、又はパスツレラ科が好ましい。腸内細菌科は、サルモネラ属、又は大腸菌属が好ましい。サルモネラ属は、O4群、O7群、又はO9群に属するサルモネラ属が好ましい。O4群に属するサルモネラ属はサルモネラ・ティフィムリウム、O7群に属するサルモネラ属はサルモネラ・インファンティス、O9群に属するサルモネラ属はサルモネラ・エンテリティディスが好ましい。大腸菌属はO78のO抗原を持つ大腸菌属が好ましい。パスツレラ科はヘモフィルス属、とりわけ、ヘモフィルス・パラガリナルムが好ましい。
　すなわち、本発明の単価ワクチンとしては、
（A）1種類のグラム陰性菌に由来するO抗原を有効成分とするワクチン組成物、
（B）1種類の腸内細菌科に由来するO抗原を有効成分とするワクチン組成物、
（C）1種類のパスツレラ科に由来するO抗原を有効成分とするワクチン組成物、
（D）1種類のサルモネラ属に由来するO抗原を有効成分とするワクチン組成物、
（E）1種類の大腸菌属に由来するO抗原を有効成分とするワクチン組成物、
（F）1種類のO4群に属するサルモネラ属に由来するO抗原を有効成分とするワクチン組成物、
（G）1種類のO7群に属するサルモネラ属に由来するO抗原を有効成分とするワクチン組成物、
（H）1種類のO9群に属するサルモネラ属に由来するO抗原を有効成分とするワクチン組成物、
（I）サルモネラ・ティフィムリウムに由来するO抗原を有効成分とするワクチン組成物、
（J）サルモネラ・インファンティスに由来するO抗原を有効成分とするワクチン組成物、
（K）サルモネラ・エンテリティディスに由来するO抗原を有効成分とするワクチン組成物、
（L）1種類のO78のO抗原を持つ大腸菌属に由来するO抗原を有効成分とするワクチン組成物、
（M）1種類のヘモフィルス属に由来するO抗原を有効成分とするワクチン組成物、及び
（N）ヘモフィルス・パラガリナルムに由来するO抗原を有効成分とするワクチン組成物
が含まれる。
　（4）多価ワクチン
　本発明のワクチン組成物は、複数種類のグラム陰性菌に由来する前記構造物を有効成分とするワクチン組成物（多価ワクチン）を含む。
　多価ワクチンの場合、O抗原を含む構造物が由来とするグラム陰性菌の種類は、好ましくは2種類以上、3種類以上、4種類以上、又は5種類以上である。好ましくは2種類（2価ワクチン）、3種類（3価ワクチン）、4種類（4価ワクチン）、又は5種類（5価ワクチン）である。
　サルモネラ属を対象とした3価ワクチンの場合、サルモネラ・ティフィムリウム、サルモネラ・インファンティス、及びサルモネラ・エンテリティディスに由来する前記構造物を含むことが好ましい。
　グラム陰性菌は、前記のグラム陰性菌に属する菌体から適宜選択されうる。グラム陰性菌は、腸内細菌科、又はパスツレラ科が好ましい。腸内細菌科は、サルモネラ属、又は大腸菌属が好ましい。サルモネラ属は、O4群、O7群、又はO9群に属するサルモネラ属が好ましい。O4群に属するサルモネラ属はサルモネラ・ティフィムリウム、O7群に属するサルモネラ属はサルモネラ・インファンティス、O9群に属するサルモネラ属はサルモネラ・エンテリティディスが好ましい。大腸菌属はO78のO抗原を持つ大腸菌属が好ましい。パスツレラ科はヘモフィルス属、とりわけ、ヘモフィルス・パラガリナルムが好ましい。
　すなわち、本発明の多価ワクチン組成物は、
（A）2種類以上のグラム陰性菌に由来するO抗原を有効成分とするワクチン組成物、
（B）2種類以上の腸内細菌科に由来するO抗原を有効成分とするワクチン組成物、
（C）2種類以上のパスツレラ科に由来するO抗原を有効成分とするワクチン組成物、
（D）2種類以上のサルモネラ属に由来するO抗原を有効成分とするワクチン組成物、
（E）2種類以上の大腸菌属に由来するO抗原を有効成分とするワクチン組成物、
（F）O4群、及びO7群に属するサルモネラ属に由来するO抗原を有効成分とするワクチン組成物、
（G）O4群、及びO9群に属するサルモネラ属に由来するO抗原を有効成分とするワクチン組成物、
（H）O7群、及びO9群に属するサルモネラ属に由来するO抗原を有効成分とするワクチン組成物、
（I）O4群、O7群、及びO9群に属するサルモネラ属に由来するO抗原を有効成分とするワクチン組成物、
（J）サルモネラ・ティフィムリウム、及びサルモネラ・インファンティスに由来するO抗原を有効成分とするワクチン組成物、
（K）サルモネラ・ティフィムリウム、及びサルモネラ・エンテリティディスに由来するO抗原を有効成分とするワクチン組成物、
（L）サルモネラ・インファンティス、及びサルモネラ・エンテリティディスに由来するO抗原を有効成分とするワクチン組成物、
（M）サルモネラ・ティフィムリウム、サルモネラ・インファンティス、及びサルモネラ・エンテリティディスに由来するO抗原を有効成分とするワクチン組成物、
（N）2種類以上のO78のO抗原を持つ大腸菌属に由来するO抗原を有効成分とするワクチン組成物、
（O）2種類以上のヘモフィルス属に由来するO抗原を有効成分とするワクチン組成物、
が含まれる。
　（5）混合ワクチン
　本発明のワクチン組成物は、単価ワクチンや多価ワクチンに前記構造物とは異なる抗原を含むワクチン組成物（混合ワクチン）を含む。
　そうした抗原としては、弱毒化病原体、不活化病原体、蛋白質、ペプチド、核酸、及びウイルス様粒子が含まれる。本発明の単価ワクチンや多価ワクチンは、他のウイルス（例えば、伝染性気管支炎ウイルス（infectious bronchitis virus）、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（infectious bursal disease virus ）、鶏脳脊髄炎ウイルス（avian encephalomyelitis virus）、産卵低下症候群ウイルス（Egg drop syndrome virus）、ニューカッスル病ウイルス（Newcastle disease virus）、トリレオウイルス（Avian reovirus）、鳥インフルエンザウイルス（avian influenza virus）、マレック病ウイルス（Marek's disease virus ）、伝染性喉頭気管炎ウイルス（infectious laryngotracheitis virus）、トリニューモウイルス（avian pneumovirus）、及び鶏痘ウイルス（fowlpox virus））、細菌（例えば、マイコプラズマ・ガリセプチカム（Mycoplasma gallisepticum）、マイコプラズマ・シノビエ（Mycoplasma synoviae）、クロストリジウム・セプチカム（Clostridium septicum）、クロストリジウム・パーフリンゲンス（Clostridium perfringens）、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni ）、及びカンピロバクター・フェタス（Campylobacter fetus））及び原虫（例えば、ロイコチトゾーム・カウレリー（Leucocytozoon caulleryi）、アイメリア・テネラ（Eimeria tenella）、アイメリア・マキシマ（Eimeria maxima）、及びアイメリア・ネカトリックス（Eimeria necatrix））に対するワクチンよりなる群から選択される少なくとも1種類のワクチンと組み合わせることにより混合ワクチンとして使用することもできる。
　（6）有効成分の濃度と比率
　本発明のワクチン組成物は、O抗原を含む構造物を有効成分とする。ワクチン組成物に含まれる前記構造物の濃度は、エンドトキシンユニット（endotoxin unit＝EU）を指標にして定められる。EUを測定する方法は下記の2-（6）測定工程に準じて行われる。ワクチン組成物に含まれる前記構造物の濃度は、多価ワクチンの場合には、前記構造物の種類毎に異なっても良く、同一であっても構わない。前記構造物の好ましい濃度としては、少なくとも各5,400EU/mLである。さらに好ましくは少なくとも各54,000EU/mLである。
　多価ワクチンの場合、前記構造物が含まれる比率（EU比）は、等比であっても、異なる比率であっても構わない。サルモネラ・ティフィムリウム、サルモネラ・インファンティス、又はサルモネラ・エンテリティディスに由来する前記構造物を有効成分とする3価ワクチンの場合、前記構造物の比率はサルモネラ・ティフィムリウム：サルモネラ・インファンティス：サルモネラ・エンテリティディス＝1：1：1であることが好ましい。
　（7）投与対象
　本発明は、実施例１で3価ワクチンをニワトリに免疫した場合に排菌軽減効果が確認された。そのため、本発明のワクチン組成物は鳥類に使用することができる。鳥類は商用又は非商用目的で飼育されている鳥類が含まれる。鳥類の一例としては、キジ目（例えば、ニワトリ、ウズラ類、及びシチメンチョウ）、カモ目（例えば、アヒル、及びガチョウ）、チドリ目（例えば、カモメ、ミフウズラ、及びチドリ）、ハト目（例えば、ハト）、ダチョウ目（例えば、ダチョウ）、スズメ目（例えば、カラス、フィンチ、スズメ、スターリング、及びツバメ）、オウム目（例えば、オウム）、タカ目（例えば、イーグル、及びタカ）、フクロウ目（例えば、フクロウ）、ペンギン目（例えば、ペンギン）、及びオウム目（例えば、インコ、及びオウム）が含まれる。好ましくはニワトリである。
　（8）投与経路
　本発明のワクチン組成物は、投与部位での腫脹がワクチンとして許容されるレベルに抑えられていたため、本発明のワクチン組成物の投与経路としては様々な経路が想定され、例えば、脚部、胸部、頸部、経口、直腸、経皮、腸内投与、筋内、皮下、髄内注入、鞘内、直接脳室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内及び眼内注入が含まれる。また、脚部はワクチン組成物を投与する際に簡便な投与経路である。そのため、好ましい投与経路は脚部である。
　（9）担体
　本発明のワクチン組成物は、医薬として許容されうる担体を含んでいてもよい。前記医薬として許容されうる担体としては、ワクチンの製造に通常用いられる担体を限定なく使用することができる。具体的には、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、等張水性緩衝液及びそれらの組み合わせが挙げられる。また、これに乳化剤、保存剤（例、チメロサール）、等張化剤、pH調整剤、不活化剤（例、ホルマリン）、及びアジュバントなどが適宜配合される。アジュバントとして好ましくはオイルアジュバントである。
　（10）キャリアー蛋白質
　O抗原を含む構造物は、投与時の免疫応答を増強する等の目的で必要に応じてキャリアー蛋白質に結合させても構わない。そうしたキャリアー蛋白質としては、ジフテリアトキソイド（DT）、破傷風トキソイド(TT)、コレラ毒素(CT)、及びCRM197が含まれる。キャリアー蛋白質に結合させる方法は、リンカー（例えば、SPDPやADH）を介しても、直接結合させても構わない。結合方法の一例としては、臭化シアンを用いて、SPDP又はADHを介してキャリアー蛋白質（DT/TT/CT）に結合させる方法が開示されている（非特許文献１）。
　２．ワクチン組成物の製造方法
　本発明の第二の実施形態は、グラム陰性菌に由来するO抗原を含む構造物を有効成分とする鳥類用のワクチン組成物の製造方法である。
　本発明の製造方法は、グラム陰性菌を培養する工程（培養工程）、前記培養後の溶液に含まれる菌体から前記構造物を遊離する工程（遊離工程）、前記遊離後の溶液から前記構造物を回収する工程（回収工程）、及び前記回収後の溶液を調製してワクチン組成物を得る工程（調製工程）を含む。さらに、前記工程に加えて、菌体を不活化する工程（不活化工程）、及び／又は乳化する工程（乳化工程）を含んでいても構わない。前記不活化工程は前記培養工程の後、前記乳化工程は前記回収工程の後であることが好ましい。また、回収工程の後に前記構造物の量を測定する工程（測定工程）があることが好ましい。前記構造物がリピドAを含まない構造物である場合はリピドAを除去する工程（リピドA除去工程）があることが好ましい。リピドA除去工程は、前記回収工程の後であることが好ましい。
　各工程を下記で説明するが、必要に応じて、各工程は下記の順番でなくとも構わず、特定の工程を入れなくても構わず、また、特定の工程を重複して行っても構わない。例えば、オイルアジュバントを使用しない場合は乳化工程を用いずとも構わない。不活化工程と遊離工程を同時に行っても構わない（例えば、両工程とも超音波処理やホルマリン処理する）。
　（1）培養工程
　前記培養工程は、グラム陰性菌の種類に応じて培地の種類や増殖条件（時間、温度、酸素濃度、炭酸ガス濃度、pH、及び塩濃度）を適宜変更して構わない。サルモネラ属の場合は、TPB培地で35～43℃（好ましくは37℃）で8～24時間（好ましくは16時間）培養する。大腸菌属の場合は、LB培地で30～43℃（好ましくは37℃）で8～24時間（好ましくは16時間）培養する。
　（2）不活化工程
　前記不活化工程は、グラム陰性菌の種類に応じて適宜変更して構わない。例えば、物理的処理（例えば、X線照射、熱処理、又は超音波処理）、又は化学的処理（ホルマリン処理、水銀処理、アルコール処理、又は塩素処理）などの操作により行うことができる。それらの処理は単独でも組み合わせても構わない。好ましくはホルマリン処理である。
　（3）遊離工程
　前記遊離工程は、前記構造物の抗原性が保持されていれば如何なる方法でも構わず、グラム陰性菌や前記構造物の性質に応じて、処理方法や処理条件を適宜選択して構わない。例えば、超音波処理、フェノール処理、機械的処理、凍結融解処理、加圧減圧処理、浸透圧処理、細胞壁分解処理（例えば非特許文献１や非特許文献２のリゾチーム処理）、及び界面活性剤処理が含まれる。それらの処理は単独でも組み合わせても構わない。好ましくは細胞壁分解処理、超音波処理、又はフェノール処理である。
　超音波処理は、前記構造物の抗原性が保持されていれば如何なる条件であっても構わず、例えば25℃以下（好ましくは氷水中）で5～30分間（好ましくは15分間）処理する。超音波処理後の溶液は、不純物を除去するために遠心分離を行っても構わない。
　フェノール処理は、前記構造物の抗原性が保持されていれば如何なる条件であっても構わず、例えば45～100％（好ましくは100％）フェノールで、4～80℃（好ましくは68℃）、5～30分間（好ましくは15分間）処理する。処理中は一定時間毎に容器を攪拌しても構わない。反応後の溶液は、不純物を除去するために遠心分離を行っても構わない。フェノール処理後の溶液は、適当なバッファー（例えばPBS）で透析しても構わない。
　非特許文献１や非特許文献２のように遊離工程後に核酸分解処理（DNase処理やRNase処理）、又は蛋白質分解処理（プロテアーゼ処理）を行っても構わない。また、エタノール分画によって核酸を除去しても構わない。酢酸処理により蛋白質の除去及びリピドAの脂肪酸側鎖除去をしても構わない。
　（4）回収工程
　前記回収工程は、前記構造物の性質に応じて、適宜変更して構わない。例えば、リポ多糖は多くのリン酸基を持っていることから全体としてマイナスチャージとなり、プラス荷電の物質に吸着され易い特性を持っている。そのため、前記構造物はこのような性質を利用したアフィニティークロマトグラフィーやプラス荷電修飾膜等による吸着方法により回収しても構わない。例えば、プラス荷電物質として、ポリミキシンＢ、ヒスチジン、ヒスタミン、リジン、アミノ化－ポリ（γ－メチル－Ｌ－グルタミン酸）ビーズ、及びアンモニウム基導入プラス荷電修飾膜が考えられる。
　また、前記構造物は、リピドAが疎水性であることを利用して回収しても構わない。疎水性の物質としては、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン、及びＰＴＥＥ膜がある。また、前記構造物の回収方法としては、リポ多糖に結合する物質を利用した方法も考えられる。そうした物質としては、抗LPS抗体、カブトガニ抗LPS因子、BPI（bactericidal permeability increasing）蛋白質、CAP18（cationic antibacterial protein of 18 kDa）、及びLBP（LPS-Binding-Protein）がある。これらを結合させた担体によるクロマトグラフィーを用いることができる。
　前記構造物を回収する方法は、市販の製品を使用することにより達成される。例えば、ET－clean（登録商標、チッソ社）を用いることができる。また、非特許文献１のように超遠心分離で回収しても構わない。
　（5）リピドA除去工程
　O抗原を含む構造物は、リピドAを含む構造（例えば、リポ多糖）であっても良く、リピドAを含まない構造物（例えば、O抗原、O抗原とコア多糖）であっても構わない。リピドAを含まない構造物の場合にはリピドAを除去する工程を組み込むことが好ましい。
　リピドAを除去する工程の一例としては、酸を添加した熱処理工程が挙げられる。上記の工程の例は、1％酢酸で100℃、90分処理する方法が例示される（非特許文献１）。この工程に、除去されたリピドAを分離する工程が組み合わされる。リピドAを分離する工程の一例としては、超遠心分離が挙げられる（非特許文献１）。
　（6）測定工程
　リポ多糖の測定方法としては次の方法が例示される。蒸留水で希釈した前記構造物の溶液とCSE-Lセットの標準品（大腸菌O113：H10由来エンドトキシン）をマイクロプレートへ添加する。エンドスペシーES-50Mセット（生化学バイオビジネス株式会社）のLAL試薬を添加する。プレートにフタを被せ、37℃で30分間反応させる。トキシカラーシステムDIAセット（生化学バイオビジネス株式会社）内の亜硝酸ナトリウム・塩酸溶液混合液、スルファミン酸アンモニウム溶液、及びN-(1-ナフチル)エチレンジアミン二塩酸塩・N-メチル-2-ピロリドン溶液混合液をそれぞれ添加し、マイクロプレートを十分振とうさせる。545nm・630nmの二波長で吸光度を測定（日本モレキュラーデバイス社、VersaMax）し、エンドトキシンを定量する。
　（7）乳化工程
　乳化する工程は、前記構造物を含有する溶液、オイル、及び乳化剤を混合する工程である。乳化剤としては単独の乳化剤であっても良く、複数種類の乳化剤を組み合わせても構わない。乳化剤としては、Tween 80（登録商標）、Tween 60（登録商標）、Brij 721（登録商標）、Eumulgin B2（登録商標）、Arlacel 165 FL（登録商標）、Tefose 1500（登録商標）、Glucamate SSE20（登録商標）、Surfhope C-1216（登録商標）、Surfhope C-1811（登録商標）、Surhope SE Pharma D-1816（登録商標）、Surfhope SE Pharma D-1616（登録商標）、Span 60（登録商標）、Olepal isostearique（登録商標）、Glucate SS（登録商標）、及びSurfhope C-1205（登録商標）が挙げられる。好ましくは、モノオレイン酸ソルビタンである。オイルとしては、植物油、鉱油、動物油、合成油及びシリコーン油が挙げられる。好ましくは、軽質流動パラフィンである。
　（8）調製工程
　調製工程は、多価ワクチンの場合に、上記の工程から得られた、特定の菌体に由来する前記構造物を含む組成物を混合する工程である。例えば、サルモネラ・ティフィムリウム、サルモネラ・インファンティス、及びサルモネラ・エンテリティディスに由来する前記構造物を有効成分とする3価ワクチンの場合、サルモネラ・ティフィムリウムに由来する前記構造物を含む組成物、サルモネラ・インファンティスに由来する前記構造物を含む組成物、及びサルモネラ・エンテリティディスに由来する前記構造物を含む組成物を混合する工程である。
　得られたワクチンは、単独で鳥類用サルモネラワクチンとして使用してもよく、他のウイルス（例えば、伝染性気管支炎ウイルス（infectious bronchitis virus）、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（infectious bursal disease virus）、鶏脳脊髄炎ウイルス（avian encephalomyelitis virus）、産卵低下症候群ウイルス（Egg drop syndrome virus）、ニューカッスル病ウイルス（Newcastle disease virus）、トリレオウイルス（Avian reovirus）、鳥インフルエンザウイルス（avian influenza virus）、マレック病ウイルス（Marek's disease virus）、伝染性喉頭気管炎ウイルス（infectious laryngotracheitis virus）、トリニューモウイルス（avian pneumovirus）、及び鶏痘ウイルス（fowlpox virus））、細菌（例えば、マイコプラズマ・ガリセプチカム（Mycoplasma gallisepticum）、マイコプラズマ・シノビエ（Mycoplasma synoviae）、クロストリジウム・セプチカム（Clostridium septicum）、クロストリジウム・パーフリンゲンス（Clostridium perfringens）、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni ）、及びカンピロバクター・フェタス（Campylobacter fetus））及び原虫（例えば、ロイコチトゾーム・カウレリー（Leucocytozoon caulleryi）、アイメリア・テネラ（Eimeria tenella）、アイメリア・マキシマ（Eimeria maxima）、及びアイメリア・ネカトリックス（Eimeria necatrix））に対するワクチンよりなる群から選択される少なくとも1種類のワクチンと組み合わせることにより混合ワクチンとして使用することもできる。
　多価ワクチンや混合ワクチンの場合に、前記構造物を含む各組成物を混合する比率（EU比）は等比でもよく、特定の組成物の比率を増減させても構わない。
　以下、実施例に従って更に詳述するが、本発明は、何らこれらの実施例に限定されるものではない。
　（1）抗原の調製
　1）培養工程
　サルモネラ・エンテリティディス（Salmonella Enteritidis、以下SEと称する）、サルモネラ・インファンティス（Salmonella Infantis、以下SIと称する）、及びサルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella Typhimurium、以下STと称する）をそれぞれ50mLのLB培地（培地1,000mL中、塩化ナトリウム10ｇ、Bact Tryptone 10ｇ、Bact Yeast Extract 5ｇを含む）で培養した（37℃、16～24時間、4×1O8～4×1O9CFU/mL）。
　2）不活化工程
　O.4%ホルマリンとなるように各培養液にホルマリンを添加し、37℃で16時間処理して菌体を不活化した。
　3）遊離工程
　不活化菌体を超音波破砕、又はフェノール処理してリポ多糖を遊離させた。
　菌体の超音波破砕（ブランソン社、ソニファイヤー 350）は、氷水中で15分行った。その後、遠心分離（トミー精工、10,000×g、15分）し、上清を回収工程に使用した。
　菌体のフェノール処理は、前記のホルマリン不活化後の菌液20mLを等量の飽和フェノール溶液と混合し、68℃で15分加温して行った。その際、3分毎に攪拌した。その後、4℃で1日静置後に遠心分離（トミー精工、10,000×g、15分）を行った。更に不純物を除去するために上清を遠心分離（トミー精工、10,000×g、15分）した。その後、上清をPBSで3日間透析し、回収工程に使用した。
　4）回収工程
　各上清をET-clean Lカラム（チッソ社、カタログ番号20015）に30mL添加した。0.15MのNaClを含むリン酸バッファー溶液で洗浄（溶液1,000mL中、NaCl 8.76g）後、2MのNaClを含むリン酸バッファー溶液でリポ多糖を溶出させた（溶液1,000mL中、NaCl 117.54g）。
　（2）エンドトキシン定量
　蒸留水で希釈した各抗原液とCSE-Lセットの標準品（大腸菌O113：H10由来エンドトキシン）をマイクロプレートへ添加した。エンドスペシーES-50Mセット（生化学バイオビジネス株式会社）のLAL試薬を添加した。プレートにフタを被せ、37℃で30分間反応させた。トキシカラーシステムDIAセット（生化学バイオビジネス株式会社）内の亜硝酸ナトリウム・塩酸溶液混合液、スルファミン酸アンモニウム溶液、及びN-(1-ナフチル)エチレンジアミン二塩酸塩・N-メチル-2-ピロリドン溶液混合液をそれぞれ添加し、マイクロプレートを十分振とうさせた。545nm・630nmの二波長で吸光度を測定（日本モレキュラーデバイス社、VersaMax）し、エンドトキシンの定量を行った。
　（3）乳化及び調製工程
　各抗原液3.6mLをオイルアジュバント14.4mL（軽質流動パラフィン、モノオレイン酸ソルビタン、及びポリソルベート80を混合したもの）と混合・乳化した。各ワクチンを等量混合し、3種類のリポ多糖を混合したサルモネラワクチンとした（3価LPSワクチン）。前記ワクチンとして、SE、ST、又はSI由来のリポ多糖を各54,000EU/mL含むワクチン、各5,400EU/mL含むワクチン、及び各540EU/mL含むワクチンを調製した。
　（4）免疫試験
　5週齢のSPF鶏に各ワクチンを0.5mLずつ下腿部筋肉内へ投与した。比較対照として、SE、ST、及びSIの不活化全菌体を含む3種混合全菌体ワクチンを使用した。3種混合全菌体ワクチンは、各菌株を培養・不活化後にリポ多糖量がそれぞれ54,000EU/mLとなるようにPBSで希釈後、オイルアジュバントと混合・乳化して調製した。また、ワクチン未投与群を用意した。投与部位を10週後まで観察し、安全性を評価した。免疫4週後にサルモネラ菌SE（9.1×1O9CFU/羽）、SI（2.3×1O9CFU/羽）、又はST（1.2×1O9CFU/羽）を用いて経口接種により攻撃し、有効性を確認した。有効性は攻撃1、4、7、10、及び14日後に糞便を回収し、そこに含まれる菌数を下記の方法で測定した。
　（5）菌数測定
　回収した糞便を20％乳剤となるようHTT培地で希釈し、DHL寒天プレートに50μL塗布し培養した（37℃、16～24時間）。翌日、出てきたコロニー数をカウントし、盲腸便菌数（CFU/g）を算出した。この直接培養でコロニーが得られなかった検体については一日増菌培養を行い、コロニーの有無により菌数を決定した（ここでコロニーが出た検体は、菌数50CFU/gとなる）。また、一日増菌培養でもコロニーが得られなかった検体については遅延二次培養を行い、コロニーの有無により菌数を決定した（コロニーが出た検体は菌数10CFU/gとし、コロニーが全く出なかった検体は菌数0CFU/gとした）。
　（6）脚部浮腫の評価方法
　安全性は投与部位を10週間観察し、脚部の腫脹スコアを用いて評価した。腫脹スコアは投与部位の軽度の腫脹(下腿部の一部の腫脹)をスコア1、中度の腫脹(下腿部全体の腫脹)をスコア2、重度の腫脹(下腿部全体の腫脹に加えて、触診により水腫が確認されるもの)をスコア3とした。スコア基準は目視及び触診により判定した。
　（7）結果
　脚部腫脹の観察結果を図１、STで攻撃した結果を図２、SEで攻撃した結果を図３、SIで攻撃した結果を図４にそれぞれ示した。図１に示すように、3種混合全菌体ワクチンと比較して3価LPSワクチンでは脚部腫脹の軽減が確認された。またフェノール抽出工程を加えて蛋白等の夾雑物をさらに除去した3価LPSワクチンではさらに脚部腫脹が軽減された。有効性については、図２、図３及び図４に示すように3価LPSワクチン投与群ではST、SE及びSI全ての攻撃試験においてワクチン未投与群に対して有意な排菌軽減効果が認められ、3価LPSワクチンの有効性を確認された。フェノール抽出した3価LPSワクチン投与群についても排菌軽減効果が認められ、サルモネラワクチン抗原としてO抗原を含む構造物（具体的にはリポ多糖）が有用であることが確認された。
　（1）抗原の調製
　実施例1で作製したSE、ST、又はSI由来のリポ多糖を各54,000EU/mL含むワクチンについて、オイルバックス7（登録商標、一般財団法人化学及血清療法研究所製；伝染性気管支炎ウイルス練馬株、TM株、マイコプラズマ・ガリセプチカム、産卵低下症候群ウイルス、及び伝染性コリーザA及びC（組換え抗原）を含む）を混合した。混合後の組成は、SE、ST、又はSI由来のリポ多糖は各7,200EU/mL、ニューカッスル病ウイルス1O8.4EID50/mL以上、伝染性気管支炎ウイルス練馬株106.4EID50/mL以上、TM株106.4EID50/mL以上、マイコプラズマ・ガリセプチカム1O7.4EID50/mL以上、産卵低下症候群ウイルス106.7EID50/mL以上、伝染性コリーザＡ及びＣ抗原（組換え抗原）2.4μg/mL以上となり、これを10種混合LPSワクチンとした。
　（2）免疫試験
　5週齢のSPF鶏に前記の10種混合LPSワクチンを0.5mLずつ下腿部筋肉内へ投与した。比較対照として、オイルバックス7、又は3価LPSワクチン（SE、ST、及びSIのリポ多糖を各5,400EU/mL）を投与した群、及びワクチン未投与群を用意した。脚部の腫脹を10週後まで観察し、安全性を評価した。免疫4週後にサルモネラ菌SE（9.1×1O9CFU/羽）、又はSI(2.3×1O9CFU/羽）を用いて経口接種により攻撃し、有効性を確認した。有効性は攻撃1、4、7、10、及び14日後に糞便を回収し、そこに含まれる菌数を実施例1の菌数測定方法で測定した。また、脚部腫脹の程度を実施例１の方法で評価した。
　（3）結果
　脚部腫脹の観察結果を図１、SEで攻撃した結果を図５、SIで攻撃した結果を図６にそれぞれ示した。図１に示すように10種混合LPSワクチンでは、フェノール抽出工程を加えて精製したリポ多糖抗原において腫脹の軽減が確認された。免疫10週後まで投与部位を観察した結果、フェノール未処理リポ多糖を含む10種混合LPSワクチン群においても起立困難を引き起こすような野外で問題となる腫脹（スコア3）は認められず、10種混合LPSワクチンの安全性が確認された。有効性については、SE又はSIを用いた攻撃試験において3価LPSワクチンと同等の排菌軽減効果が認められ、10種混合LPSワクチンとしての有効性が確認された。
　グラム陰性菌に由来するO抗原を含む構造物（例えばリポ多糖）を有効成分とするワクチンは、投与部位の副反応を軽減することが可能となる。また、複数種類のグラム陰性菌に由来する前記構造物を混合することにより、注射液量を増やすことなく更なる多価ワクチンや混合ワクチンの製造が可能となる。

Claims (20)

  1. 　グラム陰性菌に由来するＯ抗原を含む構造物（ただし、全菌体を含まない）を有効成分とする鳥類用のワクチン組成物。
  2. 　Ｏ抗原を含む構造物が、リポ多糖である、請求項１に記載のワクチン組成物。
  3. 　グラム陰性菌が、腸内細菌科、又はパスツレラ科の細菌である、請求項１又は請求項２に記載のワクチン組成物。
  4. 　腸内細菌科の細菌が、サルモネラ属、又は大腸菌属の細菌である、請求項３に記載のワクチン組成物。
  5. 　サルモネラ属の細菌が、０４群、０７群及び０９群からなる群より選択される１種類以上のサルモネラ属の細菌である、請求項４に記載のワクチン組成物。
  6. 　サルモネラ属の細菌が、サルモネラ・エンテリティディス、サルモネラ・ティフィムリウム、及びサルモネラ・インファンティスからなる群より選択される１種類以上の細菌である、請求項４又は請求項５に記載のワクチン組成物。
  7. 　グラム陰性菌に由来するＯ抗原を含む構造物が、サルモネラ・エンテリティディス、サルモネラ・ティフィムリウム、及びサルモネラ・インファンティスに由来するＯ抗原を含む構造物の混合物である、請求項４又は請求項５に記載のワクチン組成物。
  8. 　大腸菌属の細菌が、Ｏ７８のＯ抗原を持つ大腸菌属の細菌である、請求項４に記載のワクチン組成物。
  9. 　パスツレラ科の細菌が、ヘモフィルス属の細菌である、請求項３に記載のワクチン組成物、
  10. 　ヘモフィルス属の細菌が、ヘモフィルス・パラガリナルムである、請求項９に記載のワクチン組成物。
  11. 　Ｏ抗原を含む構造物が、ワクチン組成物中に少なくとも各5,400EU/mlで含まれるＯ抗原を含む構造物である、請求項１から請求項１０のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
  12. 　ニューカッスル病ウイルス、鶏伝染性気管支炎ウイルス、マイコプラズマ・ガリセプチカム、産卵低下症候群ウイルス、及びヘモフィルス・パラガリナルムからなる群より選択される１種類以上の病原体に由来する抗原をさらに含有する請求項１から請求項１１のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
  13. 　グラム陰性菌に由来するＯ抗原を含む構造物を有効成分とする鳥類用のワクチン組成物の製造方法であって、下記の（１）から（４）の工程を含む前記製造方法；
    （１）グラム陰性菌を培養する工程（培養工程）、
    （２）前記培養後の溶液に含まれる菌体から前記構造物を遊離する工程（遊離工程）、
    （３）前記遊離後の溶液から前記構造物を回収する工程（回収工程）、ついで
    （４）前記回収後の溶液を調製してワクチン組成物を得る工程（調製工程）。
  14. 　前記構造物を遊離する工程が、超音波処理する工程、又はフェノール処理する工程である、請求項１３に記載の製造方法。
  15. 　菌体を不活化する工程（不活化工程）、及び／又は乳化する工程（乳化工程）をさらに含む、請求項１３又は請求項１４に記載の製造方法。
  16. 　前記不活化工程が前記培養工程の後であり、前記乳化工程が前記回収工程の後である、請求項１５に記載の製造方法。
  17. 　前記構造物の量を測定する工程（測定工程）をさらに含む、請求項１３から請求項１６のいずれか一項に記載の製造方法。
  18. 　前記測定工程が前記回収工程の後である、請求項１７に記載の製造方法。
  19. 　リピドAを除去する工程（リピドA除去工程）をさらに含む、請求項１３から請求項１８のいずれか一項に記載の製造方法。
  20. 　前記リピドA除去工程が前記回収工程の後である、請求項１９に記載の製造方法。
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2829281B1 (en) * 2012-03-22 2019-01-16 KM Biologics Co., Ltd. Lps vaccine
CN106177937A (zh) * 2016-07-25 2016-12-07 江苏省农业科学院 鸡减蛋综合征和禽脑脊髓炎二联灭活疫苗及其制备方法
CN109486741B (zh) * 2018-12-20 2021-10-29 天津瑞普生物技术股份有限公司 一种副鸡禽杆菌的灭活方法
KR20220110785A (ko) * 2019-11-29 2022-08-09 베링거잉겔하임베트메디카게엠베하 애비박테리움 파라갈리나룸 및 조류 뇌척수염 바이러스 및 계두 바이러스에 대한 삼중 백신
US20220053799A1 (en) * 2020-06-26 2022-02-24 Zivo Bioscience, Inc. Positive latency effects on coccidiosis prevention and treatment via animal feed
CA3208643A1 (en) 2021-01-18 2022-07-21 Conserv Bioscience Limited Coronavirus immunogenic compositions, methods and uses thereof

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001026602A (ja) 1999-07-16 2001-01-30 Seikagaku Kogyo Co Ltd エンドトキシンショック抑制剤
WO2004052394A1 (en) 2002-12-06 2004-06-24 Biosynth S.R.L. Broad-spectrum lps based vaccines of unencapsulated strains of haemophilus influenzae and other pathogenic species of gram-negative bacteria
WO2010082020A1 (en) 2009-01-13 2010-07-22 The Secretary Of State For Defence Vaccine

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6713073B1 (en) 1998-07-24 2004-03-30 Megan Health, Inc. Method of vaccination of newly hatched poultry
BRPI0510882A (pt) 2004-05-14 2007-12-26 Ca Nat Research Council epìtopes lipopolisacarìdeos de núcleo interno conservado como candidatos de espécie de vacina: epìtopes lipopolisacarìdeos de núcleo interno como candidatos de vacina para a prevenção de doenças causadas por patogêneses bacterianas veterinárias incluindo actinobacillus pleuropneumoniae, mannheimia haemolytica e pasteurella multocida
US20050260225A1 (en) * 2004-05-18 2005-11-24 Goldberg Joanna B Intranasal recombinant Salmonella vaccine encoding heterologous polysaccharide antigens
UA100370C2 (uk) 2006-12-11 2012-12-25 Мериал Лимитед Спосіб вакцинації птахів проти salmonella
WO2009046449A1 (en) 2007-10-05 2009-04-09 The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University Recombinant bacterium capable of eliciting an immune response against enteric pathogens
RU2377015C1 (ru) * 2008-04-29 2009-12-27 Николай Васильевич Пименов Вакцина инактивированная против сальмонеллеза голубей и способ ее применения
EP2829281B1 (en) * 2012-03-22 2019-01-16 KM Biologics Co., Ltd. Lps vaccine

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001026602A (ja) 1999-07-16 2001-01-30 Seikagaku Kogyo Co Ltd エンドトキシンショック抑制剤
WO2004052394A1 (en) 2002-12-06 2004-06-24 Biosynth S.R.L. Broad-spectrum lps based vaccines of unencapsulated strains of haemophilus influenzae and other pathogenic species of gram-negative bacteria
WO2010082020A1 (en) 2009-01-13 2010-07-22 The Secretary Of State For Defence Vaccine

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AVIAN DISEASES, vol. 53, 2009, pages 281 - 286
BULL. NATL. INST. HEALTH SCI., vol. 126, 2008, pages L9 - 33
DEGUSHI,K. ET AL.: "Efficacy of a novel trivalent inactivated vaccine against the shedding Salmonella in a chicken challenge model", AVIAN DISEASES, vol. 53, no. 2, 2009, pages 281 - 286, XP009174244 *
INFECT. IMMUN, vol. 60, 1992, pages 4679 - 4686
REBERS,P.A. ET AL.: "The effect of formalin- killing of Pasteurella multocida on the antigenicity and extractability of its lipopolysaccharide", CARBOHYDRATE RESEARCH, vol. 133, 1984, pages 83 - 94, XP026622253 *
See also references of EP2829281A4
TIWARI,R.P. ET AL.: "Immunobiology of lipopolysaccharide(LPS) and LPS-derived immunoconjugates vaccinate mice against Salmonella typhimurium", MICROBIOL. IMMUNOL., vol. 42, no. L, 1998, pages 1 - 5, XP055162292 *
VACCINE, vol. 28, 2010, pages 7551 - 7555

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