CN104244972A - Lps疫苗 - Google Patents

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Abstract

提供了一种禽用疫苗组合物，其包含作为活性成分的含有源自革兰氏阴性菌的O-抗原的结构，其中所述结构范围内不含有全细胞，及产生所述疫苗组合物的方法。在本发明中，使用含有来自革兰氏阴性菌的O-抗原(例如脂多糖)的结构作为抗原用于疫苗。因此，与传统全细胞疫苗相比，接种反应的发生可以减少并且注射溶液的量也可以减少，并且可以制备多混合疫苗。

Description

LPS疫苗
技术领域
本发明提供可用于预防由革兰氏阴性菌例如沙门氏菌和大肠杆菌(E. coli)引起的传染性疾病的新的疫苗。特别地，本发明涉及使用作为保护性抗原的源自革兰氏阴性菌的含O-抗原(例如脂多糖)的结构免疫非人动物，特别是禽类的方法。
背景技术
细菌在用革兰氏染色法进行测试的时候具有不同的染料亲和性，这取决于细胞壁的不同组成，且细菌基于它们染料亲和力的差异被分为两种主要的群体，革兰氏阴性和***。在革兰氏阴性菌的情况下，细胞壁由外膜和外膜内侧的肽聚糖层组成。外膜由磷脂，脂多糖(LPS)，脂蛋白和膜蛋白组成。外膜的单位膜结构由磷脂和脂多糖组成。发现脂多糖在膜的外层，而磷脂在其内层。脂多糖由高分子量的脂质，称为脂质A，和与其结合的多糖组成。脂质A构成外膜的外层，而脂多糖从外膜向外延伸。外部部分和邻近脂质A部分的糖的种类互不相同。外部部分被称为O-侧链多糖(O-抗原)，而内部部分被称为核心多糖。由O-抗原组成的糖主要是己糖和戊糖，并且由3-5种这些多糖组成的基本结构重复出现。在核心多糖中，除了这些糖外，还存在对于各个细菌来说独特的糖如辛糖，例如酮脱氧辛酸，和庚糖。脂质A是对各个细菌来说独特的脂质，其包含糖，即两分子的葡萄糖胺，其相互以β-1,6-结合，和与所述糖结合的磷酸和脂肪酸。脂质A与核心多糖在糖的6'-位置结合。
存在许多种革兰氏阴性菌。沙门氏菌属(Salmonella)和埃希氏菌属(Escherichia)，属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，以及嗜血杆菌属(Haemophilus), 属于巴氏杆菌科(Pasteurellaceae)也都包括在革兰氏阴性菌中。
沙门氏菌属，具有周身鞭毛的第二大杆菌，根据O-抗原的类型被分为多组，且进一步根据H-抗原的类型进行细分，导致超过2000种血清型。沙门氏菌的宿主范围非常广泛，已知多种哺乳动物包括人和禽类被沙门氏菌感染或携带沙门氏菌。当鸡被感染时，沙门氏菌可以在小鸡中引起败血症。然而，在成年鸡中，鸡携带者因无症状而避免被捕杀，且其结果是源自于被沙门氏菌污染的鸡的鸡肉和鸡蛋被发售，通过由此制造的食品而导致人食物中毒。
沙门氏菌引起的食物中毒在摄入被污染食物之后的12-48小时的潜伏期之后发生。潜伏期依赖于细菌的摄入量，患者的状况和年龄可能不同。症状主要是急性肠胃炎，且主要症状是，腹泻，腹部疼痛，呕吐和发热。因此，鸡的沙门氏菌疫苗不仅仅是预防鸡发生疾病，而且还是用于公共卫生的重要疫苗。
在传统的针对沙门氏菌的疫苗中，是包含灭活沙门氏菌细胞的全细胞疫苗。然而，全细胞疫苗可能引起副作用，这是因为它包含不具有抗原性的部分。在成群饲养的鸡中，考虑到疫苗接种的人力节约，强烈需要可以通过单次注射预防多种疾病的多价疫苗。而且，多价疫苗可以有助于减少鸡的压力，因为它减少了注射的次数。但是，虽然多价疫苗具有这样的便利性，它容易在注射部位引起接种反应，特别是当它包含细菌如沙门氏菌时。
在这种情况下，已进行了针对沙门氏菌的组分疫苗的研究，其中研究了脂多糖(O-抗原)的应用。例如，有报道由源自鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium)的O-抗原与载体蛋白结合的缀合物施用给小鼠，以证实其效力(非专利参考文献1)。还有报道源自伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhi)的脂多糖施用给小鼠以证实其效力(专利参考文献1)。除沙门氏菌外，有报道源自泰国伯克氏菌(Burkholderia thailandensis)或类鼻疽伯克氏菌(Burkholderia pseudomallei)的脂多糖施用给小鼠以证实其效力(专利参考文献2，非专利参考文献2)。
但是，在用于活体的药物中脂多糖的污染被谨慎地避免，因为脂多糖在临床上可能引起多种高致死的疾病，例如败血性休克，弥散性血管内凝血(DIC)和多器官衰竭(MOF)，而且甚至是在痕量的情况下也可能成为发热的病因(非专利参考文献3)。在实践中，据报道在施用脂多糖之后72小时内，超过90%的小鼠死亡(专利参考文献3)。在这种情况下，通常不会提出使用脂多糖本身作为疫苗抗原的想法。
专利参考文献
专利参考文献1: WO2004/052394
专利参考文献2: WO2010/082020
专利参考文献3: 日本专利公开号2001-26602
非专利参考文献
非专利参考文献1: Infect. Immun, 60, pp4679-4686, 1992
非专利参考文献2: Vaccine, 28, pp7551-7555, 2010
非专利参考文献3: Bull. Natl. Inst. Health Sci., 126, pp19-33, 2008
非专利参考文献4: AVIAN DISEASES, 53, pp281-286, 2009。
发明公开
(本发明要解决的技术问题)
本发明目的在于使用于针对革兰氏阴性菌如沙门氏菌和大肠杆菌的疫苗的多价疫苗和混合疫苗的生产成为可能，以及减少接种反应。
(解决问题的手段)
本发明人认真地研究了上面提及的问题，结果发现当给禽类施用包含作为活性成分的含有源自革兰氏阴性菌的O-抗原(例如脂多糖)的结构的疫苗时，注射部位的肿胀出人意料地被抑制。也就是说，含有O-抗原的结构从革兰氏阴性菌(例如沙门氏菌)培养物中包含的细胞被释放，例如通过超声或苯酚处理，然后用所述结构与之粘附的柱收集它。然后通过乳化的步骤，如果需要的话，制备包含作为活性成分的上述结构的疫苗组合物。本发明人发现这样制备的疫苗组合物被免疫接种时可以给禽类(例如鸡)赋予对所述革兰氏阴性菌的免疫能力，而且没有特定的副作用，从而完成本发明。
本发明包括下述发明。
[1]          禽用疫苗组合物，其包含作为活性成分的含有源自革兰氏阴性菌的O-抗原的结构，条件是所述结构不包括全细胞。
[2]          根据[1]的疫苗组合物，其中含有O-抗原的结构是脂多糖。
[3]          根据[1]或[2]的疫苗组合物，其中革兰氏阴性菌是肠杆菌科或巴氏杆菌科。
[4]          根据[3]的疫苗组合物，其中肠杆菌科是沙门氏菌属或埃希氏菌属。
[5]          根据[4]的疫苗组合物，其中沙门氏菌属选自O4，O7和O9组的一种或多种。
[6]          根据[4]或[5]的疫苗组合物，其中沙门氏菌属是选自肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium)和婴儿沙门氏菌(Salmonella Infantis)的一种或多种。
[7]          根据[4]或[5]的疫苗组合物，其中含有源自革兰氏阴性菌的O-抗原的结构是含有源自肠炎沙门氏菌，鼠伤寒沙门氏菌和婴儿沙门氏菌的O-抗原的结构的混合物。
[8]          根据[4]的疫苗组合物，其中埃希氏菌属是具有O78的O-抗原的埃希氏菌属。
[9]          根据[3]的疫苗组合物，其中巴氏杆菌科是嗜血杆菌属。
[10]        根据[9]的疫苗组合物，其中嗜血杆菌属是副鸡嗜血杆菌(Haemophilus paragallinarum)。
[11]        根据[1]到[10]任一项的疫苗组合物，其中含有O-抗原的结构是以每种沙门氏菌至少5,400 EU/ml 的量包含在疫苗组合物中的含有O-抗原的结构。
[12]        根据[1]到[11]任一项的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物进一步包含抗原，所述抗原源自于选自新城疫病毒，禽传染性支气管炎病毒，鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum)，减蛋综合征病毒和副鸡嗜血杆菌的一种或多种病原体。
[13]        制备禽用疫苗组合物的方法，所述疫苗组合物包含作为活性成分的含有源自革兰氏阴性菌的O-抗原的结构，所述方法包括如下的步骤(1)至(4)：
(1)   培养革兰氏阴性菌的步骤(培养步骤)；
(2)   在所述培养之后从溶液中包含的细胞释放上述结构的步骤(释放步骤);
(3)   在所述释放之后从溶液收集上述结构的步骤(收集步骤)；以及
(4)   在所述收集之后制备溶液以获得疫苗组合物的步骤(制备步骤)。
[14]        根据[13]的方法，其中所述释放上述结构的步骤是超声步骤或用苯酚处理的步骤。
[15]        根据[13]或[14]的方法，其中所述方法进一步包括灭活细胞的步骤(灭活步骤)和/或乳化上述结构的步骤(乳化步骤)。
[16]        根据[15]的方法，其中在培养步骤之后进行灭活步骤，并在收集步骤之后进行乳化步骤。
[17]        根据[13]至[16]任一项的方法，其中所述方法进一步包括测量上述结构的量的步骤(测量步骤)。
[18]        根据[17]的方法，其中在收集步骤之后进行测定步骤。
[19]        根据[13]至[18]任一项的方法，其中所述方法进一步包括除去脂质A的步骤(除去脂质A步骤)。
[20]        根据[19]的方法，其中在收集步骤之后进行除去脂质A步骤。
发明效果
通过使用含有源自革兰氏阴性菌的O-抗原(例如脂多糖)的结构作为疫苗组合物的活性成分，与传统的全细胞疫苗相比可以减轻注射部位的肿胀。此外，通过制备组分疫苗，可以进一步增加与之混合的其它抗原的数目，而不会增加注射的量。
附图描述
图1显示源自肠炎沙门氏菌，婴儿沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌的脂多糖的混合疫苗(三价LPS疫苗)或除了三价LPS疫苗之外还含有其它抗原的疫苗(10价混合LPS疫苗)在注射部位的肿胀评分。
图2显示对于三价LPS疫苗，用鼠伤寒沙门氏菌进行攻击试验时脱落细胞的数量，其中星号*表示与对照组有显著性差异(p<0.05)。
图3显示对于三价LPS疫苗，用肠炎沙门氏菌进行攻击试验时脱落细胞的数量，其中星号*表示与对照组有显著性差异(p<0.05)。
图4显示对于三价LPS疫苗，用婴儿沙门氏菌进行攻击试验时脱落细胞的数量，其中星号*表示与对照组有显著性差异(p<0.05)。
图5显示对于10价混合LPS疫苗，用肠炎沙门氏菌进行攻击试验时脱落细胞的数量，其中星号*表示与对照组有显著性差异(p<0.05)。
图6显示对于10价混合LPS疫苗，用婴儿沙门氏菌进行攻击试验时脱落细胞的数量，其中星号*表示与对照组有显著性差异(p<0.05)。
实施发明的最佳方式
1. 疫苗组合物
本发明的第一个实施方案是禽用疫苗组合物，其包含作为活性成分的含有源自革兰氏阴性菌的O-抗原的结构。
根据本发明，在包含作为活性成分的含有源自鼠伤寒沙门氏菌，婴儿沙门氏菌或肠炎沙门氏菌的O-抗原(特别是脂多糖)的结构的疫苗组合物中，针对相应细胞的攻击，细胞脱落减少。认为这是由于针对源自多个革兰氏阴性菌的相应结构的抗原性的保持，即使所述的各个结构被混合在一起。此外，在包含与不同于上述结构的抗原混合的三价疫苗的10价混合疫苗中，针对提供上述结构的细胞的抗原性被保持。认为这是由于针对上述结构的抗原性的保持，即使混合疫苗包含不同于上述结构的抗原。
如此，本发明的疫苗组合物包括：
(A)  疫苗组合物，其包含作为活性成分的源自单个革兰氏阴性菌的上述结构(以下也称为"单价疫苗")；
(B)   疫苗组合物，其包含作为活性成分的源自多个革兰氏阴性菌的上述结构(以下也称为"多价疫苗")；以及
(C)  疫苗组合物，其包含单价疫苗或多价疫苗，连同不同于上述结构的抗原(以下也称为"混合疫苗")。
(1) 细菌细胞
本发明的疫苗组合物包含作为活性成分的含有O-抗原的结构。因此，本发明的疫苗组合物可以被广泛地应用于具有上述结构的革兰氏阴性菌。例如，用于本发明的革兰氏阴性菌可以包括革兰氏阴性兼性厌氧杆菌，无形体科(Anaplasmataceae)，弓形杆菌属(Arcobacter)，巴尔通式体科(Bartonellaceae)，短螺旋体属(Brachyspira)，布赫纳氏菌属(Buchnera)，弯曲杆菌属(Campylobacter)，衣原体目(Chlamydiales)，绿屈挠菌属(Chloroflexus)，革兰氏阴性好氧细菌，革兰氏阴性厌氧细菌，革兰氏阴性产氧光合细菌，螺杆菌属(Helicobacter)，劳森菌(Lawsonia)细菌，甲基弯曲菌属(Methylosinus)，海洋螺菌科(Oceanospirillaceae)，禽杆菌属(Ornithobacterium)，鱼立克次氏体科(Piscirickettsiaceae)，红杆菌属(Rhodobacter)，红微菌属(Rhodomicrobium)，小红卵菌属(Rhodovulum)，立克次氏体科(Rickettsiaceae)，玫瑰杆菌属(Roseobacter)，螺菌科(Spirillaceae)和软壁菌门(Tenericutes)，优选革兰氏阴性兼性厌氧杆菌。
革兰氏阴性兼性厌氧杆菌可以包括肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，巴氏杆菌科(Pasteurellaceae)，放线杆菌属(Actinobacillus)，气单胞菌科(Aeromonadaceae)，固氮弧菌属(Azoarcus)，嗜二氧化碳噬纤维菌属(Capnocytophaga)，心杆菌科(Cardiobacteriaceae)，色杆菌属(Chromobacterium)，艾肯菌属(Eikenella)，加德纳菌属(Gardnerella)，Moritella，拉恩氏菌属(Rahnella)，希瓦氏菌属(Shewanella)，链杆菌属(Streptobacillus)，弧菌科(Vibrionaceae)和发酵单胞菌属(Zymomonas)，优选肠杆菌科和巴氏杆菌科。
肠杆菌科可以包括沙门氏菌属(Salmonella)，埃希氏菌属(Escherichia)，鞘杆菌属(Calymmatobacterium)，柠檬酸杆菌属(Citrobacter)，爱德华氏菌属(Edwardsiella)，肠杆菌属(Enterobacter)，欧文氏菌属(Erwinia)，哈夫尼菌属(Hafnia)，克雷白氏杆菌属(Klebsiella)，克吕沃尔菌属(Kluyvera)，摩根氏菌属(Morganella)，泛生菌属(Pantoea)，果胶杆菌属(Pectobacterium)，发光杆菌属(Photorhabdus)，邻单胞菌属(Plesiomonas)，变形杆菌属(Proteus)，普罗维登斯菌属(Providencia)，沙雷氏菌属(Serratia)，志贺氏菌属(Shigella)，Wigglesworthia，致病杆菌属(Xenorhabdus)和耶尔森氏菌属(Yersinia)，优选沙门氏菌属和埃希氏菌属。
沙门氏菌属根据O-抗原的类型被分为多组，并根据H-抗原的类型被进一步细分，包括O2组(A)，O4组(B)，O7组(C1, C4)，O8组(C2, C3)，O9组(D1)和O3/O10组(E1, E2, E3)，如表1和表2所示(旧的命名显示在括号中)。
根据本发明，在包含作为活性成分的含有源自鼠伤寒沙门氏菌(O4组)，婴儿沙门氏菌(O7组)和肠炎沙门氏菌(O9组)的O-抗原的结构的三价疫苗中，针对相应细胞的攻击，细胞的脱落减少。认为这是由于通过本发明的制备方法制备的上述结构的抗原性的保持，而与O-抗原的类型无关。因此，认为本发明的疫苗组合物可以适用于整个沙门氏菌属，而不限于O4组，O7组和O9组的沙门氏菌。
在非专利参考文献4中，在用包含鼠伤寒沙门氏菌，婴儿沙门氏菌和肠炎沙门氏菌细胞的疫苗免疫的禽类中，不仅针对相应的疫苗菌株的攻击，而且针对与鼠伤寒沙门氏菌属于同一个O-抗原组(O4组)的海德堡沙门氏菌的攻击，细胞的脱落减少。因此，认为该疫苗可能对于与疫苗菌株具有与O-抗原同源的但属于不同血清型的细胞也有效。也就是说，在沙门氏菌疫苗的情况下，认为该疫苗对于与该疫苗菌株具有同源O-抗原的细胞，换句话说，对于与疫苗菌株属于相同O-抗原组的细胞也有效。因此，本发明的疫苗组合物，当应用于沙门氏菌时，也可以应用于属于O4组，O7组和O9组的其它沙门氏菌细胞。
因此，本发明的疫苗组合物包括：
(A)  单价疫苗，其包含作为活性成分的含有源自沙门氏菌的O-抗原的结构；
(B)   多价疫苗，其包含作为活性成分的含有源自两种或更多种沙门氏菌的O-抗原的结构；
(C)  单价疫苗，其包含作为活性成分的含有源自属于O4组，O7组或O9组的沙门氏菌的O-抗原的结构；
(D)  多价疫苗，其包含作为活性成分的结构，所述结构含有源自选自O4组，O7组和O9组的两种或更多种沙门氏菌的O-抗原；以及
(E)   混合疫苗，其包含上述单价疫苗或多价疫苗，连同不同于上述结构的抗原。
沙门氏菌，O4组，O7组和O9组中包括的示例性沙门氏菌可以包括表1和表2中所示的细胞。优选地，沙门氏菌是属于O4组，O7组和O9组的那些。而且，优选地，O4组是鼠伤寒沙门氏菌，O7组是婴儿沙门氏菌，而O9组是肠炎沙门氏菌。
大肠杆菌根据三种抗原，O-抗原，K-抗原和H-抗原的组合被分类。已知大约160种O-抗原，大约100种K-抗原和大约56种H-抗原。特定类型的大肠杆菌可能引发腹泻和肠胃炎，并且可能引起食物中毒。这种大肠杆菌通常被分类为产肠毒素大肠杆菌，肠侵袭性大肠杆菌，肠出血性大肠杆菌，肠致病性大肠杆菌，肠聚集性大肠杆菌和弥散粘附性大肠杆菌。属于产肠毒素大肠杆菌的组包括O18, O26, O44, O55, O86, O111, O112, O114, O119, O125, O126, O127, O128a和O142。产肠毒素大肠杆菌包括O4, O6, O7, O8, O9, O15, O18, O20, O25, O27, O63, O77, O78, O80, O85, O114, O115, O126, O128a, O139, O148, O153, O159, O167, O168和O169。肠侵袭性大肠杆菌包括O28c, O29, O112a, O124, O136, O143, O144, O152, O164和O167。肠出血性大肠杆菌包括O1018, O26, O91, O111, O113, O114, O115, O117, O119, O121, O128, O145和O157。这种大肠杆菌优选为O78。
巴氏杆菌科包括嗜血杆菌属，曼氏杆菌属和巴氏杆菌属，优选嗜血杆菌属。
嗜血杆菌属包括副鸡嗜血杆菌(Haemophilus paragallinarum)，杜克雷嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)，流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)，副流感嗜血杆菌(Haemophilus parainfluenzae)，副嗜沫嗜血杆菌(Haemophilus paraphrophilus)，副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)和睡眠嗜血杆菌(Haemophilus somnus)，优选副鸡嗜血杆菌。
(2) 含有O-抗原的结构
本发明的疫苗组合物包含作为活性成分的含有O-抗原的结构。由于O-抗原主要负责抗原性，含有O-抗原的结构可以是任何结构，只要其含有O-抗原，条件是它是不含有全细胞的结构。例如，含有O-抗原的结构包括脂多糖和脂质A被排除的含有脂多糖的结构(例如由O-抗原组成或O-抗原和核心多糖组成的结构)。在为了有效生产不使用除去脂质A步骤的情况下，本发明的疫苗组合物优选包含作为活性成分的脂多糖。虽然并不担心本发明的疫苗组合物的副作用，本发明的疫苗组合物优选包含作为活性成分的含有脂多糖的结构，其中脂质A被排除，以具有更高的安全性。
(3) 单价疫苗
本发明的疫苗组合物包括包含作为活性成分的上述结构的疫苗组合物，所述的上述结构源自单一种类的革兰氏阴性菌(单价疫苗)。
在单价疫苗的情况下，革兰氏阴性菌可以适当地选自上述的革兰氏阴性菌的细胞。革兰氏阴性菌优选是肠杆菌科或巴氏杆菌科。肠杆菌科优选是沙门氏菌属或大肠杆菌。沙门氏菌属优选是属于O4，O7和O9组的沙门氏菌属。属于O4组的沙门氏菌属优选是鼠伤寒沙门氏菌，属于O7组的沙门氏菌属优选是婴儿沙门氏菌，以及属于O9组的沙门氏菌属优选是肠炎沙门氏菌。埃希氏菌属优选是具有O78的O-抗原的埃希氏菌属。巴氏杆菌科优选是嗜血杆菌属，特别是副鸡嗜血杆菌。
因此，本发明的单价疫苗包括：
(A) 疫苗组合物，其包含作为活性成分的源自单一种类的革兰氏阴性菌的O-抗原；
(B) 疫苗组合物，其包含作为活性成分的源自单一种类的肠杆菌科的O-抗原；
(C) 疫苗组合物，其包含作为活性成分的源自单一种类的巴氏杆菌科的O-抗原；
(D) 疫苗组合物，其包含作为活性成分的源自单一种类的沙门氏菌属的O-抗原；
(E) 疫苗组合物，其包含作为活性成分的源自单一种类的埃希氏菌属的O-抗原；
(F) 疫苗组合物，其包含作为活性成分的源自单一种类的属于O4组的沙门氏菌属的O-抗原；
(G) 疫苗组合物，其包含作为活性成分的源自单一种类的属于O7组的沙门氏菌属的O-抗原；
(H) 疫苗组合物，其包含作为活性成分的源自单一种类的属于O9组的沙门氏菌属的O-抗原；
(I) 疫苗组合物，其包含作为活性成分的源自鼠伤寒沙门氏菌的O-抗原；
(J) 疫苗组合物，其包含作为活性成分的源自婴儿沙门氏菌的O-抗原；
(K) 疫苗组合物，其包含作为活性成分的源自肠炎沙门氏菌的O-抗原；
(L) 疫苗组合物，其包含作为活性成分的源自单一种类的具有O78的O-抗原的埃希氏菌属的O-抗原；
(M) 疫苗组合物，其包含作为活性成分的源自单一种类的嗜血杆菌属的O-抗原；以及
(N) 疫苗组合物，其包含作为活性成分的源自单一种类的副鸡嗜血杆菌的O-抗原。
(4) 多价疫苗
本发明的疫苗组合物包括包含作为活性成分的上述结构的疫苗组合物，所述的上述结构源自多种革兰氏阴性菌(多价疫苗)。
在多价疫苗的情况下，含有O-抗原的结构源自的革兰氏阴性菌的种类优选是2种或更多种，3种或更多种，4种或更多种，或5种或更多种。优选为2种(二价疫苗)，3种(三价疫苗)，4种(4价疫苗)，或5种(5价疫苗)。
沙门氏菌属的三价疫苗优选包含源自鼠伤寒沙门氏菌，婴儿沙门氏菌和肠炎沙门氏菌的上述结构。
革兰氏阴性菌可以适当地选自上述的革兰氏阴性菌的细胞。革兰氏阴性菌优选是肠杆菌科或巴氏杆菌科。肠杆菌科优选是沙门氏菌属或大肠杆菌。沙门氏菌属优选是属于O4，O7和O9组的沙门氏菌属。属于O4组的沙门氏菌属优选是鼠伤寒沙门氏菌，属于O7组的沙门氏菌属优选是婴儿沙门氏菌，属于O9组的沙门氏菌属优选是肠炎沙门氏菌。埃希氏菌属优选是具有O78的O-抗原的埃希氏菌属。巴氏杆菌科优选是嗜血杆菌属，特别是副鸡嗜血杆菌。
因此，本发明的多价疫苗包括：
(A) 疫苗组合物，其包含作为活性成分的源自两种或更多种革兰氏阴性菌的O-抗原；
(B) 疫苗组合物，其包含作为活性成分的源自两种或更多种肠杆菌科的O-抗原；
(C) 疫苗组合物，其包含作为活性成分的源自两种或更多种巴氏杆菌科的O-抗原；
(D) 疫苗组合物，其包含作为活性成分的源自两种或更多种沙门氏菌属的O-抗原；
(E) 疫苗组合物，其包含作为活性成分的源自两种或更多种埃希氏菌属的O-抗原；
(F) 疫苗组合物，其包含作为活性成分的源自属于O4组的沙门氏菌属和属于O7组的沙门氏菌属的O-抗原；
(G) 疫苗组合物，其包含作为活性成分的源自属于O4组的沙门氏菌属和属于O9组的沙门氏菌属的O-抗原；
(H) 疫苗组合物，其包含作为活性成分的源自属于O7组的沙门氏菌属和属于O9组的沙门氏菌属的O-抗原；
(I) 疫苗组合物，其包含作为活性成分的源自属于O4组的沙门氏菌属，属于O7组的沙门氏菌属和属于O9组的沙门氏菌属的O-抗原；
(J) 疫苗组合物，其包含作为活性成分的源自鼠伤寒沙门氏菌和婴儿沙门氏菌的O-抗原；
(K) 疫苗组合物，其包含作为活性成分的源自鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌的O-抗原；
(L) 疫苗组合物，其包含作为活性成分的源自婴儿沙门氏菌和肠炎沙门氏菌的O-抗原；
(M) 疫苗组合物，其包含作为活性成分的源自鼠伤寒沙门氏菌，婴儿沙门氏菌和肠炎沙门氏菌的O-抗原；
(N) 疫苗组合物，其包含作为活性成分的源自两种或更多种具有O78的O-抗原的埃希氏菌属的O-抗原；以及
(O) 疫苗组合物，其包含作为活性成分的源自两种或更多种嗜血杆菌属的O-抗原。
(5) 混合疫苗
本发明的疫苗组合物包括含有单价疫苗或多价疫苗，连同不同于上述结构的抗原的疫苗组合物(混合疫苗)。
这些抗原包括减毒病原体，灭活病原体，蛋白质，肽，核酸和病毒样颗粒。本发明的单价疫苗或多价疫苗可以与选自针对其它病毒(例如传染性支气管炎病毒，传染性法氏囊病病毒，禽脑脊髓炎病毒，减蛋综合征病毒，新城疫病毒，禽呼肠孤病毒，禽流感病毒，马立克氏病病毒，传染性喉气管炎病毒，禽肺病毒和禽痘病毒)，细菌(例如鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum)，滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae)，败毒梭菌(Clostridium septicum)，产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)，空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)和胎儿弯曲杆菌(Campylobacter fetus)和原生动物(例如卡氏住白细胞虫(Leucocytozoon caulleryi)，柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)，巨型艾美耳球虫(Eimeria maxima)和毒害艾美耳球虫(Eimeria necatrix)的疫苗的至少一种组合，用作混合疫苗。
(6) 活性成分的浓度和比例
本发明的疫苗组合物包含作为活性成分的含有O-抗原的结构。上述结构的浓度的确定使用内毒素单位(=EU)作为指标。按照下述的2-(6) 的测定步骤测定EU。疫苗组合物中含有的上述结构的浓度，在多价疫苗的情况下，可以随上述结构的种类而不同或者可以是相同的。上述结构的浓度对相应结构来说优选为至少5,400 EU/mL，更优选为54,000 EU/mL。
在多价疫苗的情况下，上述结构的比例(EU比例)可以是相等的或是不同的比例。在含有作为活性成分的源自鼠伤寒沙门氏菌，婴儿沙门氏菌或肠炎沙门氏菌的上述结构的三价疫苗的情况下，上述结构的比例优选为鼠伤寒沙门氏菌：婴儿沙门氏菌：肠炎沙门氏菌(1:1:1)。
(7) 用于施用的主体
根据本发明，在用三价疫苗免疫的鸡中，细胞向盲肠粪便中的脱落减少，如实施例1所示。因此，本发明的疫苗组合物可用于禽类。禽类包括为商业目的和非商业目的饲养的禽类。禽类的实例包括鸡形目(Galliformes) (例如鸡，鹌鹑和火鸡)，雁形目(Anseriformes) (例如鸭和鹅)，鸻形目(Charadriiformes) (例如鸥，棕三趾鹑和千禽)，鸽形目(Columbiformes) (例如鸽子)，鸵形目(Struthioniformes) (例如鸵禽)，雀形目(Passeriformes) (例如乌鸦，雀，麻雀，椋禽和燕子)，鹦形目(Psittaciformes) (例如鹦鹉)，隼形目(Falconiformes) (例如鹰和隼)，鸮形目(Strigiformes) (例如猫头鹰)，企鹅目(Sphenisciformes) (例如企鹅)和鹦形目(Psittaciformes) (例如长尾小鹦鹉和鹦鹉)，优选鸡。
(8) 施用途径
本发明的疫苗组合物在施用部位引起的肿胀被抑制至作为疫苗可被接受的水平。因此，可为本发明的疫苗组合物设想多种施用途径，包括，例如腿部，胸部，子宫颈口腔，直肠，经皮，肠内施用，肌肉内，皮下，髓内注射，直接心室内，静脉内，腹腔内，鼻内和眼内注射。腿部是本发明组合物的一种便利的施用途径。因此，施用的优选途径是腿部。
(9) 载体
本发明的疫苗组合物可以包含药学可接受的载体。对于药学可接受的载体，任何可用于生产疫苗的载体都可以使用，没有限制。特别地，载体包括盐水，缓冲盐水，右旋糖，水，甘油，等张水缓冲液及其组合。除此之外，本发明的疫苗组合物还可以进一步包含乳化剂，防腐剂(例如硫柳汞)，等张剂，pH调节剂，灭活剂(例如***)和佐剂。佐剂优选是油佐剂。
(10) 载体蛋白
为了在施用时增强免疫反应，含有O-抗原的结构任选地可以与载体蛋白结合。这种载体蛋白包括白喉类毒素(DT)，破伤风类毒素(TT)，霍乱毒素(CT)和CRM197。与载体蛋白的结合可以通过接头(例如SPDP或ADH)进行，或者所述结构可以直接与载体蛋白。作为实例，公开了使用溴化氰通过SPDP或ADH与载体蛋白(DT/TT/CT)的结合(非专利参考文献1)。
2. 制备疫苗组合物的方法
本发明的第二个实施方案是制备禽用疫苗组合物的方法，所述疫苗组合物包含作为活性成分的含有源自革兰氏阴性菌的O-抗原的结构。
本发明的方法包括培养革兰氏阴性菌的步骤(培养步骤)；在所述培养之后从溶液中包含的细胞释放上述结构的步骤(释放步骤)；在所述释放之后从溶液收集上述结构的步骤(收集步骤)，和在所述收集之后制备溶液以获得疫苗组合物的步骤(制备步骤)。除了上述步骤之外，所述方法可以进一步包括灭活细胞的步骤(灭活步骤)和/或乳化上述结构的步骤(乳化步骤)。优选地，灭活步骤在培养步骤之后进行，而乳化步骤在收集步骤之后进行。此外，所述方法优选在收集步骤之后包括测量上述结构的量的步骤(测量步骤)。在上述结构是不含有脂质A的结构的情况下，所述方法优选包括除去脂质A的步骤(除去脂质A步骤)。除去脂质A步骤优选在收集步骤之后进行。
各个步骤的每一个在下面进行解释。必要时，各个步骤无需以下面指出的顺序进行，一些步骤可以被忽略，或者一些步骤可以重复进行。例如，当不使用油佐剂时，乳化步骤无需进行。灭活步骤和释放步骤可以同时进行(例如在两个步骤中都可以进行超声处理和***处理)。
(1) 培养步骤
培养步骤可以因培养基的种类和生长条件(时间，温度，氧浓度，二氧化碳浓度，pH和盐浓度)适当地被修改，这取决于革兰氏阴性菌的种类。在沙门氏菌的情况下，细胞在TPB培养基上在35o至43℃(优选在37℃)培养8-24小时(优选16小时)。在大肠杆菌的情况下，细胞在LB培养基上在30o至43℃(优选在37℃)培养8-24小时(优选16小时)。
(2) 灭活步骤
培养步骤可以根据革兰氏阴性菌的种类适当地被修改。例如，它可以用物理处理(例如X射线辐射，热处理或超声处理)或化学处理(例如***处理，汞处理，乙醇处理或氢处理)进行。这些处理的任一种可以单独进行或组合进行。***处理是优选的。
(3) 释放步骤
释放步骤可以是任何程序，条件是上述结构的抗原性被保留。程序和条件可以根据革兰氏阴性菌或上述结构的性质而适当地被选择。例如，它包括超声，苯酚处理，机械处理，冻融，加减压，渗透压，细胞壁分解(例如非专利参考文献1和非专利参考文献2中公开的溶菌酶处理)，和表面活性剂处理，单独进行或组合进行，优选细胞壁分解，超声或苯酚处理。
超声可以在任何条件下进行，条件是上述结构的抗原被保留。例如，它可以在25℃或更低温度下，优选在冰水中进行5-30分钟，优选15分钟。超声处理后的溶液可进行离心除去杂质。
苯酚处理可以在任何条件下进行，条件是上述结构的抗原被保留。例如，它可以用45-100%，优选100%的苯酚在4-80℃，优选在68℃进行5-30分钟，优选15分钟。在这个过程中，容器可以以固定的时间间隔被搅动。反应后的溶液进行离心除去杂质。苯酚处理之后的溶液可以用合适的缓冲液(例如PBS)进行透析。
可以在释放步骤之后进行核分解处理(例如DNase处理或RNase处理)或蛋白质水解处理(蛋白酶处理)，如非专利参考文献1和非专利参考文献2中所公开的。核酸可以通过乙醇分级除去。蛋白质的去除和脂质A的脂肪酸侧链的去除可以通过乙酸处理进行。
(4) 收集步骤
收集步骤可以根据上述结构的性质适当地被修改。例如，由于脂多糖包含大量的磷酸基团，它总体上是带负电荷的，并因此易于吸附带正电荷的物质。因此，可以利用这种性质通过吸附收集上述结构，例如亲和层析和用带正电荷的膜吸附。例如对于带正电荷的物质可以设想多粘菌素B，组氨酸，组胺，赖氨酸，胺化的聚(γ-甲基-L-谷氨酸)珠，和引入铵基基团的带正电荷的膜。
或者，可以利用脂质A的疏水性收集上述结构。疏水物质包括聚丙烯，聚乙烯，聚苯乙烯和PTEE膜。为了收集上述物质，还设想利用与脂多糖结合的物质，包括抗-LPS抗体，源自鲎(Limulus polyphemus)的抗-LPS因子，BPI (杀菌性通透性增加)蛋白，CAP18 (18 kDa的阳离子抗菌蛋白)，和LBP (LPS-结合蛋白)。可以利用层析，其具有这种物质与之结合的载体。
可以通过使用商业可获得的产品收集上述结构。例如，可以使用ET-clean (注册商标；Chisso Corporation)。还可以通过超速离心进行收集，如非专利参考文献1中所公开的。
(5) 除去脂质A步骤
含有O-抗原的结构可以是含有脂质A的结构(例如脂多糖)或不含脂质A的结构(例如O-抗原，O-抗原加上核心多糖)。在不含脂质A的结构的情况下，优选引入除去脂质A步骤。
除去脂质A步骤包括，作为一个例子，加入酸热处理。示例性的过程包括用1%乙酸在100℃ 处理90分钟(非专利参考文献1)。这个过程与被除去的脂质A的分离过程结合进行。分离脂质A的示例性过程包括超速离心(非专利参考文献1)。
(6) 测量步骤
测量脂多糖的示例性过程可以如下述进行。用蒸馏水稀释的上述结构的溶液和CSE-L set参考标准(大肠杆菌O113：源自H10的内毒素)被加入到微孔板中。加入Endospecy ES-50M Set(SEIKAGAKU BIOBUSINESS CORPORATION)的LAL试剂。盖住板，在37℃反应30分钟。加入Toxicolor System DIA Set (SEIKAGAKU BIOBUSINESS CORPORATION)中的亚硝酸钠/盐酸，氨基磺酸铵溶液的混合物，和N-(1-萘基)乙二胺二盐酸/N-甲基-2-吡咯烷酮的混合物并充分摇动微孔板。在两个波长545nm和630nm测量吸收(Molecular Devices Japan, VersaMax)以确定内毒素。
(7) 乳化步骤
乳化步骤是将含有上述结构的溶液，油和乳化剂一起混合的过程。乳化剂包括Tween 80 (注册商标)，Tween 60 (注册商标)，Brij 721 (注册商标)，Eumulgin B2 (注册商标)，Arlacel 165 FL (注册商标)，Tefose 1500 (注册商标)，Glucamate SSE20 (注册商标)，Surfhope C-1216 (注册商标)，Surfhope C-1811 (注册商标)，Surhope SE Pharma D-1816 (注册商标)，Surfhope SE Pharma D-1616 (注册商标)，Span 60 (注册商标)，Olepal isostearique (注册商标)，Glucate SS (注册商标)和Surfhope C-1205 (注册商标)，优选山梨醇酐单油酸酯。油包括植物油，矿物油，动物油，合成油和硅油，优选轻质液体石蜡。
(8) 制备步骤
制备步骤是，在多价疫苗的情况下，将包含上述步骤中获得的源自特定微生物细胞的各个上述结构混合的过程。例如，在包含作为活性成分的源自鼠伤寒沙门氏菌，婴儿沙门氏菌和肠炎沙门氏菌的上述结构的三价疫苗的情况下，包含源自鼠伤寒沙门氏菌的上述结构的组合物，包含源自婴儿沙门氏菌的上述结构的组合物和包含源自肠炎沙门氏菌的上述结构的组合物被混合在一起。
得到的疫苗可以单独用作禽用沙门氏菌疫苗，或者可以与选自针对其它病毒(例如传染性支气管炎病毒，传染性法氏囊病病毒，禽脑脊髓炎病毒，减蛋综合征病毒，新城疫病毒，禽呼肠孤病毒，禽流感病毒，马立克氏病病毒，传染性喉气管炎病毒，禽肺病毒和禽痘病毒)，细菌(例如鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum)，滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae)，败毒梭菌(Clostridium septicum)，产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)，空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)和胎儿弯曲杆菌(Campylobacter fetus)和原生动物(例如卡氏住白细胞虫(Leucocytozoon caulleryi)，柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)，巨型艾美耳球虫(Eimeria maxima)和毒害艾美耳球虫(Eimeria necatrix)的疫苗的至少一种疫苗组合用作混合疫苗。
在多价疫苗和混合疫苗的情况下，含有上述结构的各个组合物的比例(EU比例)可以是相等的，或者特定组分的比例可以增加或减少。
本发明通过下述实施例更详细地进行解释，但不限于此。
实施例 1
(1) 抗原的制备
1) 培养步骤
在每个50 mL的LB培养基(1000 mL培养基中包含氯化钠10g，Bact胰蛋白胨10g，Bact酵母提取物5g)上，培养(37℃，16-24小时，4 X 108-4 X 109 CFU/mL)肠炎沙门氏菌(以下称"SE")，婴儿沙门氏菌(以下称"SI")和鼠伤寒沙门氏菌(以下称"ST")。
2) 灭活步骤
向各个培养物中加入***，以0.4%***在37℃处理16小时以灭活细胞。
3) 释放步骤
灭活的细胞经超声破碎或用苯酚处理以释放脂多糖。
细胞的超声破碎(Branson, Sonifier 350)在冰水中进行15分钟。然后，进行离心(TOMY SEIKO Co, Ltd.，10,000 X g，15分钟)，上清用于收集步骤。
细胞的苯酚处理通过将***灭活后的20 mL细胞溶液与等体积的饱和酚溶液混合并将混合物在68℃ 加热15分钟，同时每3分钟进行搅拌来进行。然后，将混合物在4℃放置1天后，进行离心(TOMY SEIKO Co, Ltd.，10,000 X g，15分钟)。为进一步去除杂质，上清被离心(TOMY SEIKO Co, Ltd.，10,000 X g，15分钟)。然后，上清用PBS透析3天并用于收集步骤。
4) 收集步骤
将每个30 mL的上清加到ET-clean L柱(Chisso Corporation, catalogue No. 20015)上。用含有0.15M NaCl (1,000 mL溶液中8.76 g NaCl)的磷酸盐缓冲液洗涤柱之后，用含有2M NaCl (1,000 mL溶液中117.54 g NaCl)的磷酸盐缓冲液洗脱脂多糖。
(2) 内毒素的确定
用蒸馏水稀释的各个抗原的溶液和CSE-L set参考标准(大肠杆菌O113：源自H10的内毒素)被加入到微孔板中。加入Endospecy ES-50M Set(SEIKAGAKU BIOBUSINESS CORPORATION)的LAL试剂。盖住板，在37℃反应30分钟。加入Toxicolor System DIA Set (SEIKAGAKU BIOBUSINESS CORPORATION)中的亚硝酸钠/盐酸，氨基磺酸铵溶液的混合物，和N-(1-萘基)乙二胺二盐酸/N-甲基-2-吡咯烷酮的混合物并充分摇动微孔板。在两个波长545nm和630nm测量吸收(Molecular Devices Japan, VersaMax)以确定内毒素单位。
(3) 乳化步骤和制备步骤
每个3.6 mL的抗原溶液与14.4 mL的油佐剂(轻质液体石蜡，山梨醇酐单油酸酯和聚山梨醇酯80的混合物)混合并乳化。等量的各个疫苗被混合在一起制备含有三种脂多糖的疫苗(三价LPS疫苗)。对于所述的疫苗，制备含有源自SE，ST或SI的脂多糖的每种54,000 EU/mL 的疫苗，每种5,400 EU/mL 的疫苗和每种540 EU/mL 的疫苗。
(4) 免疫试验
各个疫苗每个0.5 mL施用给5-周龄的SPF鸡的下部大腿肌肉。作为对照，使用含有SE，ST和SI的灭活全细胞的三价混合全细胞疫苗。通过培养相应细胞，灭活细胞，用PBS稀释细胞，使脂多糖为54,000 EU/mL，并用油佐剂混合和乳化灭活的细胞来制备三价混合全细胞疫苗。还提供无疫苗施用组。观察施用部位直至施用后10周并评估安全性。免疫后四周，鸡通过口服途径给予沙门氏菌SE (9.1 X 109 CFU/鸡)，SI (2.3 X 109 CFU/鸡)或ST (1.2 X 109 CFU/鸡)攻击以研究其效果。为评估效果，在攻击之后第1, 4, 7, 10和14天收集***物，并通过下述方法测量脱落到盲肠粪便中的细胞数量。
(5) 细胞数量的测量
用HTT培养基稀释收集的***物为20%乳化液，并将50 μL乳化液应用到DHL琼脂平板上进行培养(37℃，16-24小时)。第二天对出现的菌落的数量进行计数，以测量盲肠粪便中细胞的数量(CFU/g)。对于那些在这次直接培养之后没有菌落的样品，进行1天的富集培养并通过菌落的存在确定细胞的数量(在这次培养之后具有菌落的那些样品具有50 CFU/g的细胞数量)。对于在富集培养1天之后没有菌落的样品，进行延时继代培养，并由菌落的存在确定细胞的数量(在这次培养之后具有菌落的那些样品具有10 CFU/g的细胞数量，而在这次培养之后没有菌落的那些样品的细胞数量为0 CFU/g)。
(6) 大腿水肿的评估方法
对施用部位观察10周并用腿部肿胀评分评估安全性。对于肿胀评分，1分是施用部位轻度肿胀(下部大腿的一部分肿胀)，2分是中度肿胀(下部大腿整个肿胀)，而3分是严重肿胀(除了下部大腿整个肿胀之外，触诊发现水肿)。通过目测和触诊确定评分。
(7) 结果
腿部肿胀的观察结果显示在图1中。用ST攻击后得到的结果显示在图2中。用SE攻击后得到的结果显示在图3中。用SI攻击后得到的结果显示在图4中。如图1所示，与三价混合全细胞疫苗相比，对于三价LPS疫苗，证明腿部肿胀减轻。对于其中杂质如蛋白质通过苯酚提取步骤被进一步去除的三价LPS疫苗，腿部肿胀进一步减轻。至于效果，对于三价LPS疫苗施用组，用ST，SE和SI进行的所有攻击试验中，细胞脱落显著减少，如图3，图4和图5所示，证明三价LPS疫苗是有效的。在用苯酚提取的三价LPS疫苗施用组中，细胞脱落也减少，证明含有O-抗原的结构(特别是脂多糖)可用做沙门氏菌疫苗的抗原。
实施例 2
(1) 抗原的制备
实施例1中制备的含有源自SE，ST或SI的脂多糖每种54,000 EU/mL 的疫苗与OILVAX 7 (注册商标；The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute；包含传染性支气管炎病毒Nerima株，TM株，鸡毒支原体，减蛋综合征病毒和传染性鼻炎A和C(重组抗原))混合。得到的混合物为10价混合LPS疫苗，其包含源自ST，SE或SI的脂多糖每种7,200 EU/mL ，新城疫病毒108.4 EID50/mL 或更多，传染性支气管炎病毒Nerima株106.4 EID50/mL或更多，TM株106.4 EID50/mL或更多，鸡毒支原体107.4 EID50/mL或更多，减蛋综合征病毒106.7 EID50/mL或更多，以及传染性鼻炎A和C(重组抗原)2.4 μg/mL或更多。
(2) 免疫试验
上述制备的10价混合LPS疫苗每个0.5 mL施用给5-周龄的SPF鸡的下部大腿肌肉。作为对照，提供OILVAX 7施用组或三价LPS疫苗施用组(源自SE，ST和SI的脂多糖每种5,400 EU/mL)和无疫苗施用组。观察腿部肿胀直至施用后10周以评估安全性。免疫后四周，鸡通过口服途径用沙门氏菌SE (9.1 X 109 CFU/鸡)或SI (2.3 X 109 CFU/鸡)攻击以研究其效果。为评估效果，在攻击之后第1, 4, 7, 10和14天收集***物，通过实施例1中描述的测定细胞数量的方法测定细胞脱落到盲肠粪便中的数量。如实施例1所述评估肿胀的程度。
(3) 结果
腿部肿胀的观察结果显示在图1中。用SE攻击后得到的结果显示在图5中。用SI攻击后得到的结果显示在图6中。如图1所示，当通过加入苯酚提取步骤进一步纯化脂多糖时，对于10价混合LPS疫苗，证明腿部肿胀减轻。观察注射部位直至免疫后10周的结果是，对于含有未用苯酚处理的脂多糖的10价混合LPS疫苗，在引起起立困难(3分)的区域没有肿胀问题，证明10价混合疫苗的安全性。至于效果，在用SE或SI攻击的试验中观察到细胞脱落的减少相当于三价LPS疫苗，证明10价混合LPS疫苗的有效性。
工业实用性
包含作为活性成分的含有源自革兰氏阴性菌的O-抗原的结构(例如脂多糖)的疫苗使得能够减少注射部位的副作用。此外，通过混合源自多种革兰氏阴性菌的上述结构，能够制造多价疫苗和混合疫苗，而不增加注射的量。

Claims (20)

1.禽用疫苗组合物，其包含作为活性成分的含有源自革兰氏阴性菌的O-抗原的结构，条件是所述结构不含有全细胞。
2.根据权利要求1的疫苗组合物，其中所述含有O-抗原的结构是脂多糖。
3.根据权利要求1或2的疫苗组合物，其中所述革兰氏阴性菌是肠杆菌科细菌或巴氏杆菌科细菌。
4.根据权利要求3的疫苗组合物，其中肠杆菌科细菌是沙门氏菌属细菌或埃希氏菌属细菌。
5.根据权利要求4的疫苗组合物，其中沙门氏菌属细菌是选自O4，O7和O9组的一种或多种的沙门氏菌属细菌。
6.根据权利要求4或5的疫苗组合物，其中沙门氏菌属选自肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium)和婴儿沙门氏菌(Salmonella Infantis)的一种或多种。
7.根据权利要求4或5的疫苗组合物，其中所述含有源自革兰氏阴性菌的O-抗原的结构是含有源自肠炎沙门氏菌，鼠伤寒沙门氏菌和婴儿沙门氏菌的O-抗原的结构的混合物。
8.根据权利要求4的疫苗组合物，其中埃希氏菌属是具有O78的O-抗原的埃希氏菌属。
9.根据权利要求3的疫苗组合物，其中巴氏杆菌科细菌是嗜血杆菌属细菌。
10.根据权利要求9的疫苗组合物，其中嗜血杆菌属细菌是副鸡嗜血杆菌(Haemophilus paragallinarum)。
11.根据权利要求1-10任一项的疫苗组合物，其中含有O-抗原的结构是以每种沙门氏菌至少5,400 EU/ml 的量包含在疫苗组合物中的含有O-抗原的结构。
12.根据权利要求1-11任一项的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物进一步包含抗原，所述抗原源自于选自新城疫病毒，禽传染性支气管炎病毒，鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum)，减蛋综合征病毒和副鸡嗜血杆菌的一种或多种抗原。
13.制备禽用疫苗组合物的方法，所述疫苗组合物包含作为活性成分的含有源自革兰氏阴性菌的O-抗原的结构，所述方法包括如下的步骤(1)至(4)：
(1) 培养革兰氏阴性菌的步骤(培养步骤)；
(2) 在所述培养之后从溶液中包含的细胞释放上述结构的步骤(释放步骤)；
(3) 在所述释放之后从溶液收集上述结构的步骤(收集步骤)；以及
(4) 在所述收集之后制备溶液以获得疫苗组合物的步骤(制备步骤)。
14.根据权利要求13的方法，其中释放上述结构的步骤是超声步骤或用苯酚处理的步骤。
15.根据权利要求13或14的方法，其中所述方法进一步包括灭活细胞的步骤(灭活步骤)和/或乳化上述结构的步骤(乳化步骤)。
16.根据权利要求15的方法，其中在培养步骤之后进行灭活步骤，并在收集步骤之后进行乳化步骤。
17.根据权利要求13-16任一项的方法，其中所述方法进一步包括测量上述结构的量的步骤(测量步骤)。
18.根据权利要求17的方法，其中在收集步骤之后进行测定步骤。
19.根据权利要求13-18任一项的方法，其中所述方法进一步包括除去脂质A的步骤(除去脂质A步骤)。
20.根据权利要求19的方法，其中在收集步骤之后进行除去脂质A步骤。
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