WO2013123934A1 - Method for producing or fusing planar lipid bilayers - Google Patents

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WO2013123934A1
WO2013123934A1 PCT/DE2013/100051 DE2013100051W WO2013123934A1 WO 2013123934 A1 WO2013123934 A1 WO 2013123934A1 DE 2013100051 W DE2013100051 W DE 2013100051W WO 2013123934 A1 WO2013123934 A1 WO 2013123934A1
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vesicles
solution
centrifuge
density
solid support
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PCT/DE2013/100051
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Inventor
Mira LISCHPER
Original Assignee
Nanospot Gmbh
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
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    • G—PHYSICS
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors

Definitions

  • the invention relates to a method for the production of planar
  • Lipid bilayers on a solid support Lipid bilayers on a solid support.
  • a biological membrane serves to separate cells from an external medium as well as to form occluded regions and cell compartments within the cells.
  • a biological membrane essentially consists of a lipid bilayer and proteins arranged therein. The proteins fulfill different tasks. The exchange of substances through the membrane is made possible and regulated, for example, by transport proteins and channel proteins. In contrast, receptor proteins mediate stimuli or
  • Lipid bilayers are not only a component of natural, biological cell membranes, but are also artificially produced for scientific and pharmaceutical purposes.
  • lipid bilayers in the form of spherical, closed vesicles are used, the so-called liposomes.
  • In their interior can be pharmaceutical or cosmetic active substances
  • lipids can be included.
  • the nature and composition of the lipids can be tuned to precisely determine the site of drug release (so-called drug targeting). Different membranes can also fuse together. This plays e.g. a role in some viruses that infect cells via the fusion of their viral membrane with the membrane of the host cell, the process being mediated by viral fusion proteins.
  • the cell membrane is therefore the target for many pharmaceutical agents.
  • the exact understanding of the structure and function of membranes and membrane proteins is essential for the development of efficient therapeutic and diagnostic agents. Therefore, various model systems for biological membranes have been developed and investigated in recent years. These are for example
  • Lipid bilayers in the form of spherical vesicles with a diameter of ten nanometers so-called “small unilamellar vesicles” (abbreviated as SUVs), up to thirty microns in size “giant unilamellar vesicles” (abbreviated as GUVs) or so-called “large unilamellar vesicles” (US Pat.
  • SUVs small unilamellar vesicles
  • GUVs giant unilamellar vesicles
  • US Pat so-called “large unilamellar vesicles”
  • the vesicles or liposomes can either be freely bound in solution or bound to a solid support, in addition to the approximately spherical vesicles also flat, planar
  • Lipid bilayers so-called “supported lipid bilayers” (abbreviated as SLBs), which rest on a support, such as a glass slide or other substrate, can also be firmly attached to the support (so-called tethered bilayer lipid membranes) ", abbreviated as t-BLMs).
  • SLBs supported lipid bilayers
  • t-BLMs tethered bilayer lipid membranes
  • Lipid bilayers are suitable, these have established themselves as the most important model for natural cell membranes.
  • planar Usually arranged on a support, planar
  • Lipid bilayers ie SLBs (supported lipid bilayers), formed by adsorption of vesicles in solution on suitable surfaces, typically of SiO 2 , TiO 2 or mica.
  • suitable surfaces typically of SiO 2 , TiO 2 or mica.
  • Lipid compositions for spontaneous formation of SLBs for spontaneous formation of SLBs.
  • too high a cholesterol level in the vesicles can lead to the formation of SLBs Prevent SiO2 surfaces.
  • the formation of SLBs from vesicles of complex composition can be forced, for example, by the addition of Ca 2+ , osmotic stress, elevated temperature and long incubation times, a poor result is usually obtained because most vesicles on the surface have their spherical shape maintain and do not open.
  • Macromolecules in question including oligo (ethylene oxide), poly (ethylene oxide), poly (oxazoline) and oligopeptides with silanes or thiols as adhesion promoters.
  • membrane proteins are very sensitive and can easily denature under laboratory conditions, they must be stored in a lipophilic environment. This can be achieved by isolating the proteins from biological membranes and reconstituting them into artificial vesicles to form proteoliposomes. Then turn the proteins into planar ones
  • Proteoliposomes completely or partially absorbed by the planar lipid bilayer, so that the planar lipid bilayer then lipids and proteins of the liposomes.
  • One problem is that the merger must overcome energy barriers of both the vesicles and the receiving membrane.
  • One solution is that the vesicles and the receiving planar membrane have lipids with opposite charges.
  • Another possibility is the use of fusogenic peptides (SNAP-SNARE protein).
  • the pore-forming antibiotics nystatin and ergosterol may be added to the vesicles under specific osmotic conditions, permitting the vesicle membrane to permeate and the
  • the method comprises the following steps: a) one or more vesicles are prepared or provided b) the solid support is placed in a suitable centrifuge container in a centrifuge
  • Centrifuge container given wherein the vesicles have a higher density than the density of the solution, d) the centrifuge container with the vesicles and the
  • Solution is centrifuged until the vesicles on the support form a lipid bilayer.
  • a vesicle is to be understood as meaning approximately spherical bodies having an outer, unilamellar membrane in the form of a lipid bilayer.
  • the term "planar” is borrowed from the English term “planar bilayer” and has the meaning of planar or plan.
  • a planar lipid bilayer thus has a substantially uniformly flat surface, which is not curved in space.
  • the solid support is also essentially planar, but may also have structures, for example openings, elevations or measuring chambers.
  • a lipid bilayer is understood to be a membrane-like arrangement of lipids, as typically formed by phospholipids having a hydrophilic head and hydrophobic hydrocarbon tails in aqueous solution.
  • Lipid bilayer can be artificial lipids, natural lipids, synthetic
  • Lipid mixtures or natural lipid extracts each with or without reconstituted or naturally present protein.
  • the formation of a planar lipid bilayer from a vesicle occurs spontaneously on a solid support.
  • the vesicles must first attach to the solid support by diffusion and adsorption. Thereafter, the vesicle membrane must be broken, with the strong polar and entropic forces affecting the lipids in the membrane
  • the centrifugation step according to the invention now exerts a centrifugal force on the vesicles in the direction of the solid support.
  • the prerequisite for this is that the vesicles as a whole have a higher density than the density of the solution in which the vesicles are centrifuged.
  • the carrier is located at the bottom of the centrifuge container and is covered by the solution with the vesicles, the vesicles move by centrifugal force towards the carrier and adsorb to it.
  • the centrifuge container Since the solid support is planar and placed on the bottom of the centrifuge container, the centrifuge container must not be curved on the bottom so that the carrier is not damaged during centrifugation.
  • lipid bilayers can be prepared quickly and inexpensively on a solid support. For measurements, however, it is usually necessary in practice to reconstitute membrane proteins into an existing, planar lipid bilayer or others
  • the invention further relates to a method for the fusion of vesicles with planar lipid bilayers on a solid support, comprising the following steps: a) one or more vesicles are prepared or provided, b) the solid support having at least one planar
  • Lipid bilayer is in a suitable centrifuge container in a
  • the centrifugation step according to the invention exerts a centrifugal force on the vesicles. As a result, they move in the direction of the planar lipid bilayer, which is arranged on a support or rests on this. As a result of the further centrifugal force, the vesicles are opened when they strike the lipid bilayer and fuse with it.
  • the vesicles can be fused to a lipid bilayer prepared according to the prior art. Preferably, however, they are fused to a lipid bilayer prepared by the method of the invention on a solid support.
  • the vesicles must have a higher density than the solution in which the
  • Vesicles are centrifuged. This can be achieved by having the vesicles in their interior a solution whose density is higher than the density of the solution placed in the centrifuge container. This significantly increases the density of the vesicles overall.
  • the solution may be introduced into the vesicles by making them in the solution of increased density or by diluting the solution prior to centrifugation. Due to the increased density of the vesicles their sedimentation rate is greater and upon impact with the carrier or the lipid bilayer increase the forces acting. As a result, the vesicles or the lipid bilayers open more easily and the formation of planar lipid bilayers or their fusion with the vesicles is facilitated.
  • glycerol has the advantage that it is membrane-permeable and slow after centrifugation again diffused out of the formed and / or fused planar lipid bilayer.
  • liposomes or protein-enriched proteoliposomes can be used as vesicles.
  • GUVs giant unilamellar vesicles
  • LUVs large unilamellar vesicles
  • SUVs small unilamellar vesicles
  • Viral particles with a membrane are suitable. Also, biological membrane vesicles formed or made from natural biological membranes can be used. This provides a model system through which membrane proteins can be probed in their native lipid environment. This is a significant advantage because membrane proteins are very sensitive and may alter their conformation and behave differently in foreign lipid environments.
  • the solution introduced into the centrifuge container has at least one fusogenic substance, in particular divalent ions such as calcium chloride, destabilizing lipid membranes
  • Substances such as e.g. the pore-forming agents nystatin-cholesterol, complexing agents such as EDTA or SNARE proteins that regulate the fusion of biological membranes.
  • the fusogenic substances promote the formation and / or fusion of the planar lipid bilayer.
  • the advantage of the centrifugation steps is the use of a centrifuge with a "swing-out rotor.” As the rotor rotates, the rotor containers swing upwards until they are in a horizontal position, ensuring that the vector of centrifugal force
  • the solid support may be a planar glass plate, preferably a coverslip for microscopy, or a micro- or nanostructured measuring chip, which may be of any type for a micro- or nanometer-sized measuring chip
  • Nanostructuring suitable materials such as glass, silicon, silicon nitride, plastic or metals and recesses and / or protuberances in order to use these, for example, as measuring chambers for fluorescence measurements.
  • Liposomes are described in non-limiting examples.
  • Vesicle Prep Pro ® For the preparation of the commercially available, automated device "Vesicle Prep Pro ®” was used. By means of the device may solventless GUVs, thus “Giant unilamellar vesicles", are prepared according to the Electro Welling method with a diameter of 1-30 ⁇ .
  • the device has a chamber with an upper and a lower glass plate, between which the vesicle formation takes place. In order for the glass flakes to be electrically conductive, they are coated with indium tin oxide (abbreviated as "ITO").
  • ITO indium tin oxide
  • lipid film thus prepared on the ITO-coated glass slides was dried in a desiccator for one hour in the dark.
  • the lower glass plate with the lipid film was then inserted into the chamber of the "Vesicle Prep Pro ®" device.
  • the chamber was then filled with 640 ⁇ a solution in which pmol of a 6 kDa dextran were dissolved 150, corresponding to a concentration of about 1 mg
  • the solution had a higher density than the buffer solution with calcium chloride, in which the
  • the device was turned on, being between the ITO-coated
  • Lipid composition the solution and the desired amounts and size of the vesicles.
  • the chamber was opened and the upper glass plate carefully removed.
  • the formed GUVs were then removed with a pipette tip and placed as a solution in a test tube.
  • a commercial microscope coverslip was used, which was previously cleaned with solvents such as ethanol or propanol and then rinsed with distilled water and dried.
  • the coverslip was placed on the bottom of a centrifuge container and placed in the
  • Swing-out rotor also called “swing-out rotor" of a "Heraeus Megafuge 1 .0" centrifuge.
  • These rotors are not only suitable for coverslips, but also for other carriers, e.g. SBS microtiter plates.
  • the cover glass After centrifugation, the cover glass is largely covered with a stable planar lipid bilayer and can be used directly.
  • GUVs were prepared essentially as described above, with the difference that a lipid composition from 50% phosphatidylethanolamine (“PE”), 30% phosphatidylglycerol (“PG”) and 20% phosphatidycholine (“PC”).
  • PE phosphatidylethanolamine
  • PG phosphatidylglycerol
  • PC phosphatidycholine
  • Lipid composition containing 40% phosphatidylethanolamine (“PE”), 30% phosphatidylglycerol (“PG”), 20% phosphatidycholine (“PC”) and 10% cardiolipin.
  • PE phosphatidylethanolamine
  • PG phosphatidylglycerol
  • PC phosphatidycholine
  • the GUVs from both lipid compositions were filled with a sucrose solution inside to increase the density of the vesicles. Centrifugation was carried out for 30 minutes at 200 g in a solution to which 0.5 mmol calcium chloride had been added.
  • a lipid composition containing 80% diphytanoylphosphatidylcholine (“DPhPC”) and 20% cholesterol was prepared.
  • the GUVs prepared from this lipid composition were internally filled with a solution of approximately 1 mg / ml dextran to increase the density of the vesicles 40 minutes at 75 g in a solution to which 0.5 mmol calcium chloride was added.
  • FIGS. 1 a to 1 f show individual process steps for producing a lipid bilayer.
  • vesicles 1 are first prepared, ie liposomes of phospholipids, each having a hydrophilic head 3 and lipophilic
  • Hydrocarbon tails 4 have. These form an approximately spherical double layer with an interior or interior 2.
  • GUVs are produced, ie very large liposomes.
  • the production takes place in a medium in which, inter alia, substances 5 such as glycerol, sucrose or dextran are dissolved, whereby the density of the solution increases.
  • substances 5 such as glycerol, sucrose or dextran are dissolved, whereby the density of the solution increases.
  • This solution with the substance 5 is also present in the interior 2 of the vesicles 1.
  • Vesicles 1 and GUVs are then harvested and placed in a lower density buffer solution (not shown), i. the buffer solution does not contain the substances 5 or in a lower concentration.
  • the buffer solution also contains one or more fusogenic substances, for example
  • the buffer solution containing the vesicles 1 is then given a centrifuge container (not shown), at the bottom of which a structured measuring chip 100 is arranged as a solid carrier.
  • the measuring chip 100 points
  • the aperture of the measuring chambers 101 may be in the range of micrometers to a few nanometers as needed.
  • the centrifuge container is hung in or attached to a swinging bucket rotor (not shown) and the centrifuge is turned on.
  • Substances 5 because the double layer of the vesicles 1 is not permeable to the substances 5 or at least for the duration of the centrifugation, the substance 5 is not significantly effetlsäset. By this loading with the substance 5, the density of the vesicles 1 is increased in relation to the surrounding buffer solution. Due to the centrifugation, a strong force 6 is exerted on the vesicles 1, which acts orthogonally to the surface of the measuring chip 100 and accelerates the vesicles 1 in its direction.
  • FIG. 1 c shows that the vesicles 1 strike the measuring chip 100 after a certain centrifuging time, are compressed, lose their spherical structure and finally open from above.
  • FIG. 1 d shows that the vesicles 1 have completely opened on further centrifugation and have formed a planar lipid bilayer 7 on the measuring chip 100.
  • the measuring chamber 101 shown is completely covered by the planar lipid bilayer 7 and sealed at the top.
  • FIGS. 1 e and 1 f show how in the planar shown in Figure 1 d
  • Lipid bilayer 7 Membrane proteins 8 are incorporated by means of fusion.
  • first vesicles 10 are produced, which are smaller than GUVs, so-called LUVs (see above).
  • Membrane proteins 8 were reconstituted into the LUVs during production, so that they are proteoliposomes.
  • the smaller vesicles 10 are also filled or loaded in their interior 2 with substances 5, for example sucrose, which increase the density of the vesicles 10 in relation to the surrounding buffer solution (not shown) increase, in which the vesicles 10 are centrifuged.
  • the buffer solution also contains one or more fusogenic substances, for example calcium chloride.
  • the vesicles 10 are then centrifuged in the direction 6 of the measuring chip 100 where they fuse with the planar lipid bilayer 7 arranged on the measuring chip 100. As a result of the fusion, the membrane proteins 8 are arranged from the vesicles 10 in the lipid bilayer 7.
  • the measuring chip 100 is then removed from the centrifuge and can for
  • the membrane proteins 8 are, for example, a channel protein that transports a substrate (not shown) via the lipid bilayer 7, then the substrate in the
  • Measuring chamber 101 and can there by measurements for example
  • Fluorescence imaging can be detected quantitatively and time-resolved.
  • FIGS. 2a and 2b illustrate an example of the method in which a planar lipid bilayer 7 with membrane proteins 8 in only one
  • Centrifugation step can be made.
  • the sequence corresponds to
  • 2 of the vesicles V substances 5 are located inside, for example dextran, which increase the density of the vesicles V in relation to the surrounding buffer solution.
  • vesicles 1 used are GUVs into which membrane proteins 8 have been reconstituted during or after production. It are therefore proteoliposomes. Instead of GUVs but smaller proteoliposomes can be used, for example, LUVs, as shown in Figure 1 e.
  • LUVs LUVs
  • the measuring chip 100 can then be removed and the properties of the
  • Lipid membrane and membrane proteins can be directly examined with the above measuring methods.
  • the method described is particularly suitable for high throughput screenings and measurements.

Abstract

The invention relates to a method for producing or fusing planar lipid bilayers (7) on a solid substrate (100). In order to permit an inexpensive and efficient production, the method according to the invention comprises the following steps: a) vesicles (1, 10) are prepared or provided and introduced into a solution, wherein the density of the vesicles (1, 10) is higher than the density of the solution; b) the solid substrate (100) having an optional lipid bilayer (7) is arranged in a suitable centrifuge container in a centrifuge; c) the solution having the vesicles (1, 10) is introduced into the centrifuge container, such that the substrate (100) is covered by the solution; and d) the solution having the vesicles (1, 10) is centrifuged until said vesicles form a lipid bilayer (7) on the substrate (100) or fuse with the optional lipid bilayer (17).

Description

Titel: Verfahren zur Herstellung oder Fusion von planaren  Title: Process for the preparation or fusion of planar
Lipiddoppelschichten Lipid bilayers
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von planaren The invention relates to a method for the production of planar
Lipiddoppelschichten auf einem festen Träger. Lipid bilayers on a solid support.
Biologische Membranen dienen sowohl der Trennung von Zellen von einem äußeren Medium als auch der Bildung von abgeschlossenen Bereichen und Zellkompartimenten innerhalb der Zellen. Eine biologische Membran besteht im Wesentlichen aus einer Lipiddoppelschicht und darin angeordneten Proteinen. Die Proteine erfüllen verschiedene Aufgaben. Der Austausch von Stoffen durch die Membran wird beispielsweise durch Transportproteine und Kanalproteine ermöglicht und reguliert. Hingegen vermitteln Rezeptorproteine Reize oder Biological membranes serve to separate cells from an external medium as well as to form occluded regions and cell compartments within the cells. A biological membrane essentially consists of a lipid bilayer and proteins arranged therein. The proteins fulfill different tasks. The exchange of substances through the membrane is made possible and regulated, for example, by transport proteins and channel proteins. In contrast, receptor proteins mediate stimuli or
Signale, zum Beispiel durch eine extrazelluläre Ligandenbindung, die dann intrazellulär zu sekundären Prozessen führt. Signals, for example, by extracellular ligand binding, which then leads intracellularly to secondary processes.
Lipiddoppelschichten sind nicht nur ein Bestandteil von natürlichen, biologischen Zellmembranen, sondern werden auch für wissenschaftliche und pharmazeutische Zwecke künstlich hergestellt. Dazu werden Lipiddoppelschichten in Form von kugelförmigen, geschlossenen Vesikeln verwendet, den so genannten Liposomen. In ihrem Innern können pharmazeutische oder kosmetische Wirkstoffe Lipid bilayers are not only a component of natural, biological cell membranes, but are also artificially produced for scientific and pharmaceutical purposes. For this purpose, lipid bilayers in the form of spherical, closed vesicles are used, the so-called liposomes. In their interior can be pharmaceutical or cosmetic active substances
eingeschlossen sein. Die Art und Zusammensetzung der Lipide kann abgestimmt werden, um den Ort der Freisetzung des Wirkstoffs genau festzulegen (so genanntes Drug Targeting). Verschiedene Membranen können auch miteinander fusionieren. Dies spielt z.B. eine Rolle bei manchen Viren, die Zellen über die Fusion ihrer Virus-Membran mit der Membran der Wirtszelle infizieren, wobei der Vorgang durch virale Fusionsproteine vermittelt wird. be included. The nature and composition of the lipids can be tuned to precisely determine the site of drug release (so-called drug targeting). Different membranes can also fuse together. This plays e.g. a role in some viruses that infect cells via the fusion of their viral membrane with the membrane of the host cell, the process being mediated by viral fusion proteins.
Die Zellmembran ist deshalb der Angriffspunkt für zahlreiche pharmazeutische Wirkstoffe. Das genaue Verständnis der Struktur und Funktion von Membranen und Membranproteinen ist dabei für die Entwicklung effizienter therapeutischer und diagnostischer Wirkstoffe essentiell. In den letzten Jahren sind deshalb verschiedene Modellsysteme für biologische Membranen entwickelt und untersucht worden. Dies sind beispielsweise The cell membrane is therefore the target for many pharmaceutical agents. The exact understanding of the structure and function of membranes and membrane proteins is essential for the development of efficient therapeutic and diagnostic agents. Therefore, various model systems for biological membranes have been developed and investigated in recent years. These are for example
Lipiddoppelschichten in Form von kugelförmigen Vesikeln mit einem Durchmesser von zehn Nanometern, so genannte„small unilamellar vesicles" (abgekürzt als SUVs), bis zu dreißig Mikrometer große„giant unilamellare vesicles" (abgekürzt als GUVs) oder so genannte„large unilamellar vesicles" (abgekürzt als LUVs), deren Größe etwa dazwischen liegt. Die Vesikel bzw. Liposomen können entweder frei in Lösung oder an einen festen Träger gebunden sein. Neben den annähernd kugelförmigen Vesikeln werden auch flache, planare Lipid bilayers in the form of spherical vesicles with a diameter of ten nanometers, so-called "small unilamellar vesicles" (abbreviated as SUVs), up to thirty microns in size "giant unilamellar vesicles" (abbreviated as GUVs) or so-called "large unilamellar vesicles" (US Pat. The vesicles or liposomes can either be freely bound in solution or bound to a solid support, in addition to the approximately spherical vesicles also flat, planar
Lipiddoppelschichten verwendet, so genannte„supported lipid bilayers" (abgekürzt als SLBs), die auf einem Träger, beispielsweise einem Glasplättchen oder einem anderen Substrat, aufliegen. Die planaren Lipiddoppelschichten können mit dem Träger auch fest verbunden sein (so genannte„tethered bilayer lipid membranes", abgekürzt als t-BLMs). Da biologische Membranen erheblich in ihrer Zusammensetzung variieren, sind unterschiedliche Modellsysteme entwickelt worden. Die Schwierigkeit liegt darin, die künstlichen Modellsysteme einerseits so gut wie möglich den komplexen biologischen Membranen anzunähern und sie anderseits so zu vereinfachen, dass die Struktur und Funktionalität einzelner Bestandteile untersucht werden kann. Weil viele moderne Untersuchungsmethoden wie Rastersondenmikroskopie,Lipid bilayers, so-called "supported lipid bilayers" (abbreviated as SLBs), which rest on a support, such as a glass slide or other substrate, can also be firmly attached to the support (so-called tethered bilayer lipid membranes) ", abbreviated as t-BLMs). Since biological membranes vary considerably in composition, different model systems have been developed. The difficulty lies in making the artificial model systems as close as possible to the complex biological membranes and, on the other hand, simplifying them so that the structure and functionality of individual components can be investigated. Because many modern research methods such as scanning probe microscopy,
Impedanzspektroskopie, Fluoreszenz-Imaging, Quarzkristallmikrowaagen (quartz crystal microbalance, QCM), elektrophysiologische Messungen und Impedance spectroscopy, fluorescence imaging, quartz crystal microbalances (QCM), electrophysiological measurements and
Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie besonders für planare Surface plasmon resonance spectroscopy especially for planar
Lipiddoppelschichten geeignet sind, haben sich diese als wichtigstes Modell für natürliche Zellmembranen etabliert. Lipid bilayers are suitable, these have established themselves as the most important model for natural cell membranes.
Üblicherweise werden auf einem Träger angeordnete, planare Usually arranged on a support, planar
Lipiddoppelschichten, also SLBs (supported lipid bilayers), durch Adsorption von Vesikeln in Lösung an geeigneten Oberflächen gebildet, typischerweise aus SiO2, TiO2 oder Glimmer. Allerdings führen nur bestimmte Bedingungen und Lipid bilayers, ie SLBs (supported lipid bilayers), formed by adsorption of vesicles in solution on suitable surfaces, typically of SiO 2 , TiO 2 or mica. However, only certain conditions and lead
Lipidzusammensetzungen zu einer spontanen Bildung von SLBs. Zum Beispiel kann ein zu hoher Cholesterinanteil in den Vesikeln die Bildung von SLBs auf SiO2-Oberflächen verhindern. Auch wenn die Bildung von SLBs aus Vesikeln mit komplexer Zusammensetzung z.B. durch die Zugabe von Ca2+, osmotischen Stress, erhöhte Temperatur und lange Inkubationszeiten forciert werden kann, wird in der Regel ein schlechtes Ergebnis erzielt, weil die meisten Vesikel auf der Oberfläche ihre Kugelform beibehalten und sich nicht öffnen. Lipid compositions for spontaneous formation of SLBs. For example, too high a cholesterol level in the vesicles can lead to the formation of SLBs Prevent SiO2 surfaces. Although the formation of SLBs from vesicles of complex composition can be forced, for example, by the addition of Ca 2+ , osmotic stress, elevated temperature and long incubation times, a poor result is usually obtained because most vesicles on the surface have their spherical shape maintain and do not open.
Ein weiterer Ansatz besteht darin, planare Membranen herzustellen, die mit einem gewissen Abstand an einen festen Träger angebunden sind (tethered bilayer lipid membranes). Hierfür werden so genannte Spacer verwendet, die mit ihrem einen Ende kovalent an den hydrophilen Lipidköpfen und mit ihrem anderen Ende an den festen Träger gebunden sind. Als Spacer kommen zahlreiche lineare Another approach is to make planar membranes tethered to a solid support (tethered bilayer lipid membranes). For this purpose, so-called spacers are used which are covalently bonded at one end to the hydrophilic lipid heads and at the other end to the solid support. As Spacer come numerous linear
Makromoleküle in Frage, einschließlich Oligo(ethylenoxid), Poly(Ethylenoxid), poly(Oxazolin) und Oligopeptide mit Silanen oder Thiolen als Haftvermittler.  Macromolecules in question, including oligo (ethylene oxide), poly (ethylene oxide), poly (oxazoline) and oligopeptides with silanes or thiols as adhesion promoters.
Da Membranproteine sehr empfindlich sind und unter Laborbedingungen leicht denaturieren können, müssen sie in einer lipophilen Umgebung aufbewahrt werden. Dies kann dadurch erreicht werden, dass die Proteine aus biologischen Membranen isoliert und in künstliche Vesikel rekonstituiert werden, wodurch Proteoliposomen gebildet werden. Um die Proteine dann in planare Since membrane proteins are very sensitive and can easily denature under laboratory conditions, they must be stored in a lipophilic environment. This can be achieved by isolating the proteins from biological membranes and reconstituting them into artificial vesicles to form proteoliposomes. Then turn the proteins into planar ones
Lipiddoppelschichten einzubringen, werden die Proteoliposomen mit einer planaren Membran fusioniert. Bei einer Fusion werden also Liposomen bzw. To introduce lipid bilayers, the proteoliposomes are fused with a planar membrane. In a fusion, therefore, liposomes or
Proteoliposomen vollständig oder teilweise von der planaren Lipiddoppelschicht aufgenommen, sodass die planare Lipiddoppelschicht danach Lipide und Proteine der Liposomen aufweist. Ein Problem besteht allerdings darin, dass zur Fusion energetische Barrieren sowohl der Vesikel als auch der aufnehmenden Membran überwunden werden müssen. Ein Lösungsversuch besteht darin, dass die Vesikel und die aufnehmende planare Membran Lipide mit entgegengesetzten Ladungen aufweisen. Eine andere Möglichkeit ist die Verwendung von fusogenen Peptiden (SNAP-SNARE-Protein). Alternativ können zu den Vesikeln unter speziellen osmotischen Bedingungen die porenbildenden Antibiotika Nystatin und Ergosterol gegeben werden, wodurch die Vesikelmembran permeabel und die Proteoliposomes completely or partially absorbed by the planar lipid bilayer, so that the planar lipid bilayer then lipids and proteins of the liposomes. One problem, however, is that the merger must overcome energy barriers of both the vesicles and the receiving membrane. One solution is that the vesicles and the receiving planar membrane have lipids with opposite charges. Another possibility is the use of fusogenic peptides (SNAP-SNARE protein). Alternatively, the pore-forming antibiotics nystatin and ergosterol may be added to the vesicles under specific osmotic conditions, permitting the vesicle membrane to permeate and the
Fusionswahrscheinlichkeit erhöht wird. Alle diese bekannten Verfahren sind zeitlich und technisch sehr aufwändig sowie ineffizient, da ein nennenswerter Anteil der Proteine nicht in die planaren The probability of fusion is increased. All these known methods are time-consuming and technically very complex and inefficient, since a significant proportion of the proteins are not in the planar
Membranen eingebaut wird und verloren geht. Bis heute ist außerdem kein Membranes is installed and lost. To date, no
Verfahren bekannt, um SLBs direkt aus biologischen Zellmembranen herzustellen und so Membranproteine in ihrer nativen Lipidumgebung zu untersuchen. Methods are known to produce SLBs directly from biological cell membranes and thus to study membrane proteins in their native lipid environment.
Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein Verfahren vorzuschlagen, dass die genannten Nachteile nicht aufweist und eine kostengünstige und effiziente The object of the invention is therefore to propose a method that does not have the disadvantages mentioned and a cost-effective and efficient
Herstellung von planaren Membranen bzw. Lipiddoppelschichten auf einem festen Träger ermöglicht. Diese Aufgabe wird dadurch gelöst, dass das Verfahren folgende Schritte umfasst: a) ein oder mehrere Vesikel werden hergestellt oder bereitgestellt, b) der feste Träger wird in einem geeigneten Zentrifugenbehälter in einer Zentrifuge Production of planar membranes or lipid bilayers on a solid support allows. This object is achieved in that the method comprises the following steps: a) one or more vesicles are prepared or provided b) the solid support is placed in a suitable centrifuge container in a centrifuge
angeordnet, c) die Vesikel werden zusammen mit einer Lösung in den c) the vesicles are together with a solution in the
Zentrifugenbehälter gegeben, wobei die Vesikel eine höhere Dichte aufweisen als die Dichte der Lösung, d) der Zentrifugenbehälter mit den Vesikeln und derCentrifuge container given, wherein the vesicles have a higher density than the density of the solution, d) the centrifuge container with the vesicles and the
Lösung wird zentrifugiert, bis die Vesikel auf dem Träger eine Lipiddoppelschicht ausbilden. Solution is centrifuged until the vesicles on the support form a lipid bilayer.
Unter einem Vesikel im Sinne der Erfindung sind annähernd kugelförmige Körper mit einer äußeren, unilamellaren Membran in Form einer Lipiddoppelschicht zu verstehen. Der Begriff„planar" ist dem englischen Fachbegriff„planar bilayer" entlehnt und hat die Bedeutung flächig bzw. plan. Eine planare Lipiddoppelschicht weist also eine im Wesentlichen gleichmäßig ebene Fläche auf, die im Raum nicht gekrümmt ist. Der feste Träger ist im Wesentlichen ebenfalls planar, kann allerdings auch Strukturen aufweisen, zum Beispiel Öffnungen, Erhebungen oder Messkammern. Unter einer Lipiddoppelschicht ist eine membranartige Anordnung von Lipiden zu verstehen, wie sie typischerweise von Phospholipiden mit einem hydrophilen Kopf und hydrophoben Kohlenwasserstoffschwänzen in wässriger Lösung gebildet wird. Für die Herstellung von Vesikeln und/oder planaren For the purposes of the invention, a vesicle is to be understood as meaning approximately spherical bodies having an outer, unilamellar membrane in the form of a lipid bilayer. The term "planar" is borrowed from the English term "planar bilayer" and has the meaning of planar or plan. A planar lipid bilayer thus has a substantially uniformly flat surface, which is not curved in space. The solid support is also essentially planar, but may also have structures, for example openings, elevations or measuring chambers. A lipid bilayer is understood to be a membrane-like arrangement of lipids, as typically formed by phospholipids having a hydrophilic head and hydrophobic hydrocarbon tails in aqueous solution. For the preparation of vesicles and / or planar
Lipiddoppelschicht können artifizielle Lipide, natürliche Lipide, synthetische Lipid bilayer can be artificial lipids, natural lipids, synthetic
Lipidgemische oder natürliche Lipidextrakte jeweils mit oder ohne rekonstituiertem oder natürlich vorhanden Protein verwendet werden. Nach dem Stand der Technik erfolgt die Bildung einer planaren Lipiddoppelschicht aus einem Vesikel spontan auf einem festen Träger. Bei diesem Vorgang müssen die Vesikel zunächst durch Diffusion und Adsorption an den festen Träger anheften. Danach muss die Vesikelmembran aufgebrochen werden, wobei die starken polaren und entropischen Kräfte, die die Lipide in der Membran Lipid mixtures or natural lipid extracts, each with or without reconstituted or naturally present protein. In the prior art, the formation of a planar lipid bilayer from a vesicle occurs spontaneously on a solid support. In this process, the vesicles must first attach to the solid support by diffusion and adsorption. Thereafter, the vesicle membrane must be broken, with the strong polar and entropic forces affecting the lipids in the membrane
zusammenhalten, überwunden werden müssen. Dieser energetisch ungünstige bzw. unwahrscheinliche Prozess erfordert viel Zeit und ist technisch aufwändig. hold together, must be overcome. This energetically unfavorable or unlikely process requires a lot of time and is technically complex.
Durch den erfindungsgemäßen Zentrifugationsschritt wird nun auf die Vesikel eine Zentrifugalkraft in Richtung des festen Trägers ausgeübt. Voraussetzung hierfür ist, dass die Vesikel insgesamt eine höhere Dichte als die Dichte der Lösung aufweisen, in der die Vesikel zentrifugiert werden. Verfahrensschritte zur The centrifugation step according to the invention now exerts a centrifugal force on the vesicles in the direction of the solid support. The prerequisite for this is that the vesicles as a whole have a higher density than the density of the solution in which the vesicles are centrifuged. Procedural steps for
Erhöhung der Dichte der Vesikel sind unten beschrieben. Da der Träger am Boden des Zentrifugenbehälters angeordnet ist und von der Lösung mit den Vesikeln bedeckt wird, bewegen sich die Vesikel durch die Zentrifugalkraft in Richtung zum Träger und adsorbieren an ihm. Durch die weiter wirkende Increasing the density of the vesicles are described below. Since the carrier is located at the bottom of the centrifuge container and is covered by the solution with the vesicles, the vesicles move by centrifugal force towards the carrier and adsorb to it. By the further acting
Zentrifugalkraft werden die Vesikel geöffnet und es bildet sich eine planare Centrifugal force, the vesicles are opened and it forms a planar
Lipiddoppelschicht auf dem Träger aus. Da der feste Träger planar bzw. eben ist und auf dem Boden des Zentrifugenbehälters angeordnet bzw. diesem aufliegt, darf der Zentrifugenbehälter am Boden nicht gekrümmt sein, damit der Träger beim Zentrifugieren nicht beschädigt wird. Lipid bilayer on the support. Since the solid support is planar and placed on the bottom of the centrifuge container, the centrifuge container must not be curved on the bottom so that the carrier is not damaged during centrifugation.
Nach dem oben beschriebenen Verfahren können schnell und kostengünstig Lipiddoppelschichten auf einem festen Träger hergestellt werden. Für Messungen ist es in der Praxis jedoch in der Regel erforderlich, Membranproteine in eine vorhandene, planare Lipiddoppelschicht zu rekonstituieren oder andere By the method described above, lipid bilayers can be prepared quickly and inexpensively on a solid support. For measurements, however, it is usually necessary in practice to reconstitute membrane proteins into an existing, planar lipid bilayer or others
Substanzen einzubringen oder die Lipidzusammensetzung zu verändern. Zur Lösung dieser Aufgabe betrifft die Erfindung weiterhin ein Verfahren zur Fusion von Vesikeln mit planaren Lipiddoppelschichten auf einem festen Träger, welches folgende Schritte umfasst: a) ein oder mehrere Vesikel werden hergestellt oder bereitgestellt, b) der feste Träger mit mindestens einer planaren Introduce substances or alter the lipid composition. To achieve this object, the invention further relates to a method for the fusion of vesicles with planar lipid bilayers on a solid support, comprising the following steps: a) one or more vesicles are prepared or provided, b) the solid support having at least one planar
Lipiddoppelschicht wird in einem geeigneten Zentrifugenbehälter in einer Lipid bilayer is in a suitable centrifuge container in a
Zentrifuge angeordnet, c) die Vesikel werden zusammen mit einer Lösung in den Zentrifugenbehälter gegeben, d) der Zentrifugenbehälter mit den Vesikeln und der Lösung wird zentrifugiert, bis die Vesikel mit der Lipiddoppelschicht auf dem Centrifuge arranged, c) the vesicles are together with a solution in the Centrifuge container is added, d) the centrifuge container with the vesicles and the solution is centrifuged until the vesicles with the lipid bilayer on the
Träger fusionieren. Carriers merge.
Durch den erfindungsgemäßen Zentrifugationsschritt wird auf die Vesikel eine Zentrifugalkraft ausgeübt. Hierdurch bewegen sie sich in Richtung der planaren Lipiddoppelschicht, die auf einem Träger angeordnet ist bzw. diesem aufliegt. Durch die weiter wirkende Zentrifugalkraft werden die Vesikel beim Auftreffen auf die Lipiddoppelschicht geöffnet und fusionieren mit ihr. The centrifugation step according to the invention exerts a centrifugal force on the vesicles. As a result, they move in the direction of the planar lipid bilayer, which is arranged on a support or rests on this. As a result of the further centrifugal force, the vesicles are opened when they strike the lipid bilayer and fuse with it.
Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung mit zusätzlichen Verfahrensmerkmalen werden nachfolgend beschrieben. Advantageous embodiments of the invention with additional process features are described below.
Die Vesikel können mit einer Lipiddoppelschicht fusioniert werden, die nach dem Stand der Technik hergestellt wurde. Vorzugsweise werden sie jedoch mit einer Lipiddoppelschicht fusioniert, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren auf einem festen Träger hergestellt wurde. Die Vesikel müssen eine höhere Dichte als die Lösung aufweisen, in der dieThe vesicles can be fused to a lipid bilayer prepared according to the prior art. Preferably, however, they are fused to a lipid bilayer prepared by the method of the invention on a solid support. The vesicles must have a higher density than the solution in which the
Vesikel zentrifugiert werden. Dies kann dadurch erreicht werden, dass die Vesikel in ihrem Innern eine Lösung aufweisen, deren Dichte höher ist als die Dichte der in den Zentrifugenbehälter gegebene Lösung. Hierdurch wird die Dichte der Vesikel insgesamt signifikant erhöht. Die Lösung kann in die Vesikel eingebracht werden, indem deren Herstellung in der Lösung mit erhöhter Dichte erfolgt oder die Lösung vor dem Zentrifugieren verdünnt wird. Durch die erhöhte Dichte der Vesikel ist deren Sedimentationsgeschwindigkeit größer und beim Auftreffen auf den Träger oder die Lipiddoppelschicht vergrößern sich die einwirkenden Kräfte. Hierdurch öffnen sich die Vesikel bzw. die Lipiddoppelschichten leichter und die Bildung von planaren Lipiddoppelschichten oder deren Fusion mit den Vesikeln wird erleichtert. Vesicles are centrifuged. This can be achieved by having the vesicles in their interior a solution whose density is higher than the density of the solution placed in the centrifuge container. This significantly increases the density of the vesicles overall. The solution may be introduced into the vesicles by making them in the solution of increased density or by diluting the solution prior to centrifugation. Due to the increased density of the vesicles their sedimentation rate is greater and upon impact with the carrier or the lipid bilayer increase the forces acting. As a result, the vesicles or the lipid bilayers open more easily and the formation of planar lipid bilayers or their fusion with the vesicles is facilitated.
Es hat sich gezeigt, dass zur Erhöhung der Dichte Glycerol, Dextran, Sucrose, andere Zucker, Salze oder Nanopartikel geeignet sind. Unter anderem Glycerol hat den Vorteil, dass es membrangängig ist und nach der Zentrifugation langsam wieder aus der gebildeten und/oder fusionierten planaren Lipiddoppelschicht ausdiffundiert. It has been found that glycerol, dextran, sucrose, other sugars, salts or nanoparticles are suitable for increasing the density. Among other things, glycerol has the advantage that it is membrane-permeable and slow after centrifugation again diffused out of the formed and / or fused planar lipid bilayer.
Als Vesikel können Liposomen oder mit Proteinen angereicherte Proteoliposomen verwendet werden. Insbesondere GUVs („giant unilamellare vesicles"), LUVs („large unilamellar vesicles"), SUVs („small unilamellar vesicles") oder As vesicles, liposomes or protein-enriched proteoliposomes can be used. In particular, GUVs ("giant unilamellar vesicles"), LUVs ("large unilamellar vesicles"), SUVs ("small unilamellar vesicles") or
Virenpartikel mit einer Membran sind geeignet. Ebenfalls lassen sich biologische Membranvesikel verwenden, die aus natürlichen, biologischen Membranen gebildet sind oder hergestellt wurden. Hierdurch wird ein Modellsystem zur Verfügung gestellt, durch das Membranproteine in ihrer nativen Lipidumgebung untersucht werden können. Dies ist ein erheblicher Vorteil, da Membranproteine sehr empfindlich sind und in fremden Lipidumgebungen möglicherweise ihre Konformation verändern und ein anderes Verhalten zeigen.  Viral particles with a membrane are suitable. Also, biological membrane vesicles formed or made from natural biological membranes can be used. This provides a model system through which membrane proteins can be probed in their native lipid environment. This is a significant advantage because membrane proteins are very sensitive and may alter their conformation and behave differently in foreign lipid environments.
Eine weitere Verbesserung ist möglich, wenn die in den Zentrifugenbehälter gegebene Lösung mindestens einen fusogenen Stoff aufweist, insbesondere zweiwertige Ionen wie Calciumchlorid, Lipidmembranen destabilisierende A further improvement is possible if the solution introduced into the centrifuge container has at least one fusogenic substance, in particular divalent ions such as calcium chloride, destabilizing lipid membranes
Substanzen wie z.B. die Porenbildner Nystatin-Cholesterol, Komplexbildner wie EDTA oder SNARE-Proteine, die die Fusion von biologischen Membranen regulieren. Durch die fusogenen Stoffe wird die Bildung und/oder Fusion der planaren Lipiddoppelschicht gefördert. Vorteilhaft für die Zentrifugationsschritte ist die Verwendung einer Zentrifuge mit einem Ausschwingrotor („Swing-out Rotor"). Bei der Drehung des Rotors schwingen die Rotorbehälter nach oben, bis sie sich in einer waagrechten Position befinden. Dadurch ist sichergestellt, dass der Vektor der Zentrifugalkraft radial von der Rotorachse und orthogonal zur Ebene des festen Trägers verläuft. Der feste Träger kann ein planares Glasplättchen, vorzugsweise ein Deckglas für die Mikroskopie sein. Besonders geeignet ist auch oder ein mikro- oder nanostrukturierter Messchip. Dieser kann aus allen für eine Mikro- oder  Substances such as e.g. the pore-forming agents nystatin-cholesterol, complexing agents such as EDTA or SNARE proteins that regulate the fusion of biological membranes. The fusogenic substances promote the formation and / or fusion of the planar lipid bilayer. The advantage of the centrifugation steps is the use of a centrifuge with a "swing-out rotor." As the rotor rotates, the rotor containers swing upwards until they are in a horizontal position, ensuring that the vector of centrifugal force The solid support may be a planar glass plate, preferably a coverslip for microscopy, or a micro- or nanostructured measuring chip, which may be of any type for a micro- or nanometer-sized measuring chip
Nanostrukturierung geeigneten Materialien wie Glas, Silizium, Siliziumnitrid, Plastik oder Metallen bestehen und Vertiefungen und/oder Ausstülpungen aufweisen, um diese beispielsweise als Messkammern für Fluoreszenzmessungen zu nutzen. Nanostructuring suitable materials such as glass, silicon, silicon nitride, plastic or metals and recesses and / or protuberances in order to use these, for example, as measuring chambers for fluorescence measurements.
Insbesondere mit den genannten Messchips können die hergestellten In particular, with the mentioned measuring chips, the produced
Lipiddoppelschichten mittels Fluoreszenz-Imaging, Rastersondenmikroskopie, Impedanzspektroskopie, Quarzkristallmikrowaagen („Quartz Crystal Lipid bilayers using fluorescence imaging, Scanning Probe Microscopy, Impedance Spectroscopy, Quartz Crystal Microbalances ("Quartz Crystal
Microbalance", abgekürzt als QCM), Microbalance ", abbreviated as QCM),
Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie oder elektrophysiologisch vermessen werden.  Surface plasmon resonance spectroscopy or electrophysiologically.
Nachstehend wird die Herstellung von planaren Lipiddoppelschichten aus The preparation of planar lipid bilayers will be described below
Liposomen in nicht einschränkenden Beispielen beschrieben. Liposomes are described in non-limiting examples.
Für die Präparation wurde die kommerziell erhältliche, automatische Vorrichtung „Vesicle Prep Pro®" verwendet. Mittels der Vorrichtung können lösungsmittelfreie GUVs, also„Giant unilamellar vesicles", mit einem Durchmesser von 1 bis 30 μιτι nach der Electroswelling-Methode hergestellt werden. Die Vorrichtung weist eine Kammer mit einem oberen und einem unteren Glasplättchen auf, zwischen denen die Vesikelbildung erfolgt. Damit die Glasplättchen elektrisch leitfähig sind, sind sie mit Indiumzinnoxid („indium tin oxide", abgekürzt als„ITO") beschichtet. For the preparation of the commercially available, automated device "Vesicle Prep Pro ®" was used. By means of the device may solventless GUVs, thus "Giant unilamellar vesicles", are prepared according to the Electro Welling method with a diameter of 1-30 μιτι. The device has a chamber with an upper and a lower glass plate, between which the vesicle formation takes place. In order for the glass flakes to be electrically conductive, they are coated with indium tin oxide (abbreviated as "ITO").
Zunächst wurden 10 μΙ der gewünschten Lipide in Chloroform gelöst und gleichmäßig mit einer Pipettenspitze auf den ITO-beschichteten Seiten der Glasplättchen verteilt. Als Lipid wurde Diphytanoylphosphatidylcholin („DPhPC") verwendet. Der so hergestellte Lipidfilm auf den ITO-beschichteten Glasplättchen wurde in einem Exsikkator für eine Stunde im Dunkeln getrocknet. First, 10 μΙ of the desired lipids were dissolved in chloroform and evenly distributed with a pipette tip on the ITO-coated sides of the glass slides. Diphytanoylphosphatidylcholine ("DPhPC") was used as the lipid, The lipid film thus prepared on the ITO-coated glass slides was dried in a desiccator for one hour in the dark.
Das untere Glasplättchen mit dem Lipidfilm wurde dann in die Kammer der „Vesicle Prep Pro®" Vorrichtung eingesetzt. Die Kammer wurde danach mit 640 μΙ einer Lösung befüllt, in der 150 pmol eines 6 kDa Dextrans gelöst waren, was einer Konzentration von ungefähr 1 mg/ml entspricht. Dadurch hatte die Lösung eine höhere Dichte als die Pufferlösung mit Calciumchlorid, in der die The lower glass plate with the lipid film was then inserted into the chamber of the "Vesicle Prep Pro ®" device. The chamber was then filled with 640 μΙ a solution in which pmol of a 6 kDa dextran were dissolved 150, corresponding to a concentration of about 1 mg Thus, the solution had a higher density than the buffer solution with calcium chloride, in which the
Zentrifugation erfolgte. In die Kammer wurde dann das zweite, obere ITO- beschichtete Glasplättchen eingesetzt und die Kannnner mit einem Teflon-Ring und Fett dicht verschlossen. Centrifugation took place. The second, upper ITO coated glass slides and the Kannnner with a Teflon ring and grease sealed.
Die Gerät wurde eingeschaltet, wobei zwischen den ITO-beschichteten The device was turned on, being between the ITO-coated
Glasplättchen, die als Elektroden wirken, ein Strom fließt. Hierdurch beginnen sich die GUVs zu bilden. Die Bildung der Liposomen kann zwischen wenigen Stunden und 18 Stunden dauern. Die benötigte Zeit hängt von der Art der Glass slides, which act as electrodes, a current flows. As a result, the GUVs begin to form. The formation of the liposomes can take between a few hours and 18 hours. The time needed depends on the type of
Lipidzusammensetzung, der Lösung und der gewünschte Mengen und Größe der Vesikel ab. Lipid composition, the solution and the desired amounts and size of the vesicles.
Nach dem Abschalten der Vorrichtung wurde die Kammer geöffnet und das obere Glasplättchen vorsichtig entfernt. Die gebildeten GUVs wurden dann mit einer Pipettenspitze entnommen und als Lösung in ein Reagenzglas gegeben. After switching off the device, the chamber was opened and the upper glass plate carefully removed. The formed GUVs were then removed with a pipette tip and placed as a solution in a test tube.
Als fester Träger wurde ein handelsübliches Mikroskop-Deckglas verwendet, das vorher mit Lösungsmitteln wie Ethanol oder Propanol gereinigt und danach mit destilliertem Wasser abgespült und getrocknet wurde. Das Deckglas wurde auf dem Boden eines Zentrifugenbehälters angeordnet und dieser in den As a solid support, a commercial microscope coverslip was used, which was previously cleaned with solvents such as ethanol or propanol and then rinsed with distilled water and dried. The coverslip was placed on the bottom of a centrifuge container and placed in the
Ausschwingrotor (auch„Swing-Out Rotor" genannt) einer„Heraeus Megafuge 1 .0" Zentrifuge gesetzt. Diese Rotoren sind nicht nur für Deckgläser geeignet sondern auch für andere Träger, wie z.B. SBS Mikrotiterplatten.  Swing-out rotor (also called "swing-out rotor") of a "Heraeus Megafuge 1 .0" centrifuge. These rotors are not only suitable for coverslips, but also for other carriers, e.g. SBS microtiter plates.
40 μΙ der GUV-haltigen Lösung wurden dann in eine Puffer-Lösung gegeben, die u.a. Calciumchlorid in einer Konzentration von 0,5 mmol/l enthielt. Das Forty μΙ of the GUV-containing solution was then placed in a buffer solution which i.a. Calcium chloride in a concentration of 0.5 mmol / l contained. The
Calciumchlorid verbessert die spätere Ausbreitung der Vesikel auf der Oberfläche und die Ausbildung der planaren Lipiddoppelschicht. Danach wurde die Lösung 40 min bei 75 g zentrifugiert. Bei anderer Zusammensetzung der Lipide und der verwendeten Lösungen müssen die Zentrifugationsparameter entsprechend angepasst werden.  Calcium chloride improves the later spread of the vesicles on the surface and the formation of the planar lipid bilayer. Thereafter, the solution was centrifuged at 75 g for 40 minutes. With other composition of the lipids and the solutions used, the centrifugation parameters must be adjusted accordingly.
Nach der Zentrifugation ist das Deckglas zu großen Teilen mit einer stabilen planaren Lipiddoppelschicht bedeckt und kann direkt weiter verwendet werden. After centrifugation, the cover glass is largely covered with a stable planar lipid bilayer and can be used directly.
In einer Variante des Verfahrens wurden GUVs im Wesentlichen wie oben beschrieben hergestellt, mit dem Unterschied, dass eine Lipidzusammensetzung aus 50% Phosphatidylethanolamin („PE"), 30% Phosphatidylglycerol („PG") und 20% Phosphatidycholin („PC") verwendet wurde. In one variant of the method, GUVs were prepared essentially as described above, with the difference that a lipid composition from 50% phosphatidylethanolamine ("PE"), 30% phosphatidylglycerol ("PG") and 20% phosphatidycholine ("PC").
In einer anderen Variante des Verfahrens wurden die GUVs aus einer In another variant of the method, the GUVs from a
Lipidzusammensetzung hergestellt, die 40% Phosphatidylethanolamin („PE"), 30% Phosphatidylglycerol („PG"), 20% Phosphatidycholin („PC") und 10% Cardiolipin enthielt. Lipid composition containing 40% phosphatidylethanolamine ("PE"), 30% phosphatidylglycerol ("PG"), 20% phosphatidycholine ("PC") and 10% cardiolipin.
Die GUVs aus beiden Lipidzusammensetzungen waren im Innern mit einer Sucroselösung gefüllt, um die Dichte der Vesikel zu erhöhen. Die Zentrifugation erfolgte 30 min bei 200 g in einer Lösung, der 0,5 mmol Calciumchlorid zugesetzt war. The GUVs from both lipid compositions were filled with a sucrose solution inside to increase the density of the vesicles. Centrifugation was carried out for 30 minutes at 200 g in a solution to which 0.5 mmol calcium chloride had been added.
In einer weiteren Variante des Verfahrens wurden die GUVs aus einer In another variant of the method, the GUVs from a
Lipidzusammensetzung hergestellt, die 80% Diphytanoylphosphatidylcholin („DPhPC") und 20% Cholesterol enthielt. Die aus dieser Lipidzusammensetzung hergestellten GUVs waren im Innern mit einer Lösung aus ungefähr 1 mg/ml Dextran gefüllt, um die Dichte der Vesikel zu erhöhen. Die Zentrifugation erfolgte 40 Minuten bei 75 g in einer Lösung, der 0,5 mmol Calciumchlorid zugesetzt war. A lipid composition containing 80% diphytanoylphosphatidylcholine ("DPhPC") and 20% cholesterol was prepared The GUVs prepared from this lipid composition were internally filled with a solution of approximately 1 mg / ml dextran to increase the density of the vesicles 40 minutes at 75 g in a solution to which 0.5 mmol calcium chloride was added.
Die Erfindung wird unter Bezugnahme auf eine Zeichnung beispielhaft und nicht beschränkend beschrieben, wobei weitere vorteilhafte Einzelheiten den Figuren der Zeichnung zu entnehmen sind. Gattungs- oder funktionsmäßig gleiche Objekte sind dabei mit denselben Bezugszeichen versehen. Die Zeichnungen und die Beschreibung dienen der Veranschaulichung und sind nicht als quantitative Angaben zu verstehen. Alle Objekte sind schematisch und nicht maßstabsgetreu dargestellt. The invention will be described with reference to a drawing by way of example and not limitation, with further advantageous details of the figures of the drawing can be seen. Genus or functionally identical objects are provided with the same reference numerals. The drawings and description are illustrative and are not meant to be quantitative. All objects are shown schematically and not true to scale.
Die Figuren 1 a bis 1f zeigen einzelne Verfahrensschritte zur Herstellung einer Lipiddoppelschicht. Hierzu werden zunächst Vesikel 1 hergestellt, also Liposomen aus Phospholipiden, die jeweils einen hydrophilen Kopf 3 und lipophile FIGS. 1 a to 1 f show individual process steps for producing a lipid bilayer. For this purpose, vesicles 1 are first prepared, ie liposomes of phospholipids, each having a hydrophilic head 3 and lipophilic
Kohlenwasserstoffschwänze 4 aufweisen. Diese bilden eine etwa kugelförmige Doppelschicht mit einem Innenraum bzw. Innern 2 aus. Im dargestellten Beispiel werden GUVs hergestellt, also sehr große Liposomen. Die Herstellung erfolgt in einem Medium, in dem u.a. Substanzen 5 wie Glycerol, Sucrose oder Dextran gelöst werden, wodurch sich die Dichte der Lösung erhöht. Diese Lösung mit der Substanz 5 ist auch im Innenraum 2 der Vesikel 1 vorhanden. Hydrocarbon tails 4 have. These form an approximately spherical double layer with an interior or interior 2. In the example shown, GUVs are produced, ie very large liposomes. The production takes place in a medium in which, inter alia, substances 5 such as glycerol, sucrose or dextran are dissolved, whereby the density of the solution increases. This solution with the substance 5 is also present in the interior 2 of the vesicles 1.
Die Vesikel 1 bzw. die GUVs werden dann geerntet und in eine (nicht gezeigte) Pufferlösung mit geringerer Dichte gegeben, d.h. die Pufferlösung enthält die Substanzen 5 nicht oder in geringerer Konzentration. Die Pufferlösung enthält außerdem eine oder mehrere fusogene Substanzen, beispielsweise Vesicles 1 and GUVs are then harvested and placed in a lower density buffer solution (not shown), i. the buffer solution does not contain the substances 5 or in a lower concentration. The buffer solution also contains one or more fusogenic substances, for example
Calciumchlorid. Die Pufferlösung mit den Vesikeln 1 wird dann einen (nicht dargestellten) Zentrifugenbehälter gegeben, an dessen Boden ein strukturierter Messchip 100 als fester Träger angeordnet wird. Der Messchip 100 weist Calcium chloride. The buffer solution containing the vesicles 1 is then given a centrifuge container (not shown), at the bottom of which a structured measuring chip 100 is arranged as a solid carrier. The measuring chip 100 points
Vertiefungen 101 auf, die später als Messkammern dienen. Die Apertur der Messkammern 101 kann je nach Bedarf im Bereich von Mikrometern bis einigen Nanometern liegen. Der Zentrifugenbehälter wird in einen (nicht gezeigten) Ausschwingrotor eingehängt oder an diesem befestigt und die Zentrifuge eingeschaltet. Wells 101, which later serve as measuring chambers. The aperture of the measuring chambers 101 may be in the range of micrometers to a few nanometers as needed. The centrifuge container is hung in or attached to a swinging bucket rotor (not shown) and the centrifuge is turned on.
Wie Figur 1 b zeigt, befinden sich im Innern 2 der Vesikel 1 weiterhin die As Figure 1 b shows, are located inside 2 of the vesicles 1 continue to
Substanzen 5, weil die Doppelschicht der Vesikel 1 für die Substanzen 5 nicht permeabel ist oder zumindest für die Dauer der Zentrifugation die Substanz 5 nicht nennenswert durchläset. Durch diese Beladung mit der Substanz 5 ist die Dichte der Vesikel 1 im Verhältnis zur umgebenden Pufferlösung erhöht. Durch die Zentrifugation wird auf die Vesikel 1 deshalb eine starke Kraft 6 ausgeübt, die orthogonal zur Oberfläche des Messchips 100 wirkt und die Vesikel 1 in dessen Richtung beschleunigt. Substances 5, because the double layer of the vesicles 1 is not permeable to the substances 5 or at least for the duration of the centrifugation, the substance 5 is not significantly durchlsäset. By this loading with the substance 5, the density of the vesicles 1 is increased in relation to the surrounding buffer solution. Due to the centrifugation, a strong force 6 is exerted on the vesicles 1, which acts orthogonally to the surface of the measuring chip 100 and accelerates the vesicles 1 in its direction.
Figur 1 c zeigt, dass die Vesikel 1 nach einer gewissen Zentrifugationszeit auf den Messchip 100 auftreffen, zusammengedrückt werden, ihre kugelförmige Struktur verlieren und sich schließlich von oben her öffnen. FIG. 1 c shows that the vesicles 1 strike the measuring chip 100 after a certain centrifuging time, are compressed, lose their spherical structure and finally open from above.
Figur 1 d zeigt, dass sich die Vesikel 1 bei weiterer Zentrifugation vollständig geöffnet und auf dem Messchip 100 eine planare Lipiddoppelschicht 7 ausgebildet haben. Die gezeigte Messkammer 101 wird von der planaren Lipiddoppelschicht 7 vollständig bedeckt und nach oben hin abgedichtet. Die Figuren 1 e und 1f zeigen, wie in die in Figur 1 d dargestellte planare FIG. 1 d shows that the vesicles 1 have completely opened on further centrifugation and have formed a planar lipid bilayer 7 on the measuring chip 100. The measuring chamber 101 shown is completely covered by the planar lipid bilayer 7 and sealed at the top. FIGS. 1 e and 1 f show how in the planar shown in Figure 1 d
Lipiddoppelschicht 7 Membranproteine 8 mittels Fusion eingebaut werden. Hierzu werden zunächst Vesikel 10 hergestellt, die kleiner als GUVs sind, so genannte LUVs (siehe oben). In die LUVs wurden bei der Herstellung Membranproteine 8 rekonstituiert, so dass es sich also um Proteoliposomen handelt. Wie bei den in Figur 1 a bis 1 b gezeigten Vesikeln 1 sind auch die kleineren Vesikel 10 in ihrem Innern 2 mit Substanzen 5 gefüllt bzw. beladen, beispielsweise mit Sucrose, die die Dichte der Vesikel 10 im Verhältnis zur umgebenden (nicht gezeigten) Pufferlösung erhöhen, in der die Vesikel 10 zentrifugiert werden. Die Pufferlösung enthält außerdem eine oder mehrere fusogene Substanzen, beispielsweise Calciumchlorid. Lipid bilayer 7 Membrane proteins 8 are incorporated by means of fusion. For this purpose, first vesicles 10 are produced, which are smaller than GUVs, so-called LUVs (see above). Membrane proteins 8 were reconstituted into the LUVs during production, so that they are proteoliposomes. As in the case of the vesicles 1 shown in FIGS. 1 a to 1 b, the smaller vesicles 10 are also filled or loaded in their interior 2 with substances 5, for example sucrose, which increase the density of the vesicles 10 in relation to the surrounding buffer solution (not shown) increase, in which the vesicles 10 are centrifuged. The buffer solution also contains one or more fusogenic substances, for example calcium chloride.
Die Vesikel 10 werden dann in Richtung 6 des Messchips 100 zentrifugiert, wo sie mit der auf dem Messchip 100 angeordneten planaren Lipiddoppelschicht 7 fusionieren. Durch die Fusion ordnen sich die Membranproteine 8 aus den Vesikeln 10 in der Lipiddoppelschicht 7 an. The vesicles 10 are then centrifuged in the direction 6 of the measuring chip 100 where they fuse with the planar lipid bilayer 7 arranged on the measuring chip 100. As a result of the fusion, the membrane proteins 8 are arranged from the vesicles 10 in the lipid bilayer 7.
Der Messchip 100 wird dann aus der Zentrifuge entnommen und kann für The measuring chip 100 is then removed from the centrifuge and can for
Messungen verwendet werden. Handelt es sich bei den Membranproteinen 8 beispielsweise um ein Kanalprotein, das ein (nicht gezeigtes) Substrat über die Lipiddoppelschicht 7 transportiert, dann reichert sich das Substrat in der Measurements are used. If the membrane proteins 8 are, for example, a channel protein that transports a substrate (not shown) via the lipid bilayer 7, then the substrate in the
Messkammer 101 an und kann dort durch Messungen, beispielsweise Measuring chamber 101 and can there by measurements, for example
Fluoreszenz-Imaging, quantitativ und zeitaufgelöst nachgewiesen werden.  Fluorescence imaging, can be detected quantitatively and time-resolved.
Die Figuren 2a und 2b veranschaulichen ein Beispiel des Verfahrens, durch dass eine planare Lipiddoppelschicht 7 mit Membranproteinen 8 in nur einem FIGS. 2a and 2b illustrate an example of the method in which a planar lipid bilayer 7 with membrane proteins 8 in only one
Zentrifugationsschritt hergestellt werden kann. Der Ablauf entspricht im Centrifugation step can be made. The sequence corresponds to
Wesentlichen den in den Figuren 1 a bis 1 d dargestellten und beschriebenenEssentially those shown in Figures 1 a to 1 d and described
Schritten. So befinden sich im Innern 2 der Vesikel V Substanzen 5, beispielweise Dextran, die die Dichte der Vesikel V im Verhältnis zur umgebenden Pufferlösung erhöhen. Steps. Thus, 2 of the vesicles V substances 5 are located inside, for example dextran, which increase the density of the vesicles V in relation to the surrounding buffer solution.
Der Unterschied besteht darin, dass als Vesikel 1 GUVs verwendet werden, in die während oder nach der Herstellung Membranproteine 8 rekonstituiert wurden. Es handelt sich also um Proteoliposomen. Statt GUVs können aber auch kleinere Proteoliposomen verwendet werden, beispielsweise LUVs, wie dies in Figur 1 e dargestellt ist. Durch die Zentrifugation treffen die Vesikel 1 ' auf den Messchip 100 auf und bilden auf dem Messchip 100 eine planare Lipiddoppelschicht 7 mit den rekonstituierten Membranproteinen 8. The difference is that vesicles 1 used are GUVs into which membrane proteins 8 have been reconstituted during or after production. It are therefore proteoliposomes. Instead of GUVs but smaller proteoliposomes can be used, for example, LUVs, as shown in Figure 1 e. By centrifuging, the vesicles 1 'impinge on the measuring chip 100 and form on the measuring chip 100 a planar lipid bilayer 7 with the reconstituted membrane proteins 8.
Der Messchip 100 kann dann entnommen und die Eigenschaften der The measuring chip 100 can then be removed and the properties of the
Lipidmembran und der Membranproteine mit den oben genannten Messverfahren direkt untersucht werden. Lipid membrane and membrane proteins can be directly examined with the above measuring methods.
Aufgrund seiner Schnelligkeit und Einfachheit ist das beschriebene Verfahren besonders für Screenings und Messungen mit hohem Durchsatz geeignet. Because of its speed and simplicity, the method described is particularly suitable for high throughput screenings and measurements.
Bezugszeichenliste LIST OF REFERENCE NUMBERS
1 . Große Vesikel 1 . Great vesicles
2. Innenraum  2nd interior
3. Lipid köpfe  3. Lipid heads
4. Lipidschwänze  4. Lipid tails
5. Substanz  5. substance
6. Kraftvektor  6. force vector
7. Lipiddoppelschicht  7. Lipid bilayer
8. Membranprotein  8. membrane protein
10. Kleine Vesikel 10. Small vesicles
100. Messchip  100th Messchip
101 . Messkammer  101. measuring chamber

Claims

Patentansprüche claims
1 . Verfahren zur Herstellung von planaren Lipiddoppelschichten (7) auf einem festen Träger (100), welches folgende Schritte umfasst: 1 . Process for the preparation of planar lipid bilayers (7) on a solid support (100), comprising the following steps:
a) ein oder mehrere Vesikel (1 , 10) werden hergestellt oder bereitgestellt, b) der feste Träger (100) wird in einem geeigneten Zentrifugenbehälter in einer Zentrifuge angeordnet,  a) one or more vesicles (1, 10) are prepared or provided, b) the solid support (100) is placed in a suitable centrifuge container in a centrifuge,
c) die Vesikel (1 , 10) werden zusammen mit einer Lösung in den  c) the vesicles (1, 10) together with a solution in the
Zentrifugenbehälter gegeben, wobei die Vesikel (1 , 10) eine höhere Dichte aufweisen als die Dichte der Lösung,  Centrifuge container given, wherein the vesicles (1, 10) have a higher density than the density of the solution,
d) der Zentrifugenbehälter mit den Vesikeln (1 , 10) und der Lösung wird zentrifugiert, bis die Vesikel (1 , 10) auf dem Träger (100) eine  d) the centrifuge container with the vesicles (1, 10) and the solution is centrifuged until the vesicles (1, 10) on the carrier (100) a
Lipiddoppelschicht (7) ausbilden.  Form lipid bilayer (7).
2. Verfahren zur Fusion von Vesikeln (1 , 10) mit planaren 2. Method for the fusion of vesicles (1, 10) with planar
Lipiddoppelschichten (7) auf einem festen Träger (100), welches folgende Schritte umfasst:  Lipid bilayers (7) on a solid support (100) comprising the steps of:
a) ein oder mehrere Vesikel (1 , 10) werden hergestellt oder bereitgestellt, b) der feste Träger (100) mit mindestens einer planaren Lipiddoppelschicht (7) wird in einem geeigneten Zentrifugenbehälter in einer Zentrifuge angeordnet,  a) one or more vesicles (1, 10) are prepared or provided, b) the solid support (100) having at least one planar lipid bilayer (7) is placed in a suitable centrifuge container in a centrifuge,
c) die Vesikel (1 , 10) werden zusammen mit einer Lösung in den  c) the vesicles (1, 10) together with a solution in the
Zentrifugenbehälter gegeben, wobei die Vesikel (1 , 10) eine höhere Dichte aufweisen als die Dichte der Lösung,  Centrifuge container given, wherein the vesicles (1, 10) have a higher density than the density of the solution,
d) der Zentrifugenbehälter mit den Vesikeln (1 , 10) und der Lösung wird zentrifugiert, bis die Vesikel (1 , 10) mit der Lipiddoppelschicht (7) auf dem Träger (100) fusionieren.  d) the centrifuge container with the vesicles (1, 10) and the solution is centrifuged until the vesicles (1, 10) fuse with the lipid bilayer (7) on the carrier (100).
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die planaren Lipiddoppelschichten (7) auf einem festen Träger (100) gemäß dem 3. The method according to claim 2, characterized in that the planar lipid bilayers (7) on a solid support (100) according to the
Verfahren nach Anspruch 1 hergestellt wurde.  The method of claim 1 was prepared.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch 4. The method according to any one of the preceding claims, characterized
gekennzeichnet, dass die Vesikel (1 , 10) in ihrem Innern (2) eine Lösung aufweisen, deren Dichte höher ist, als die Dichte der in den characterized in that the vesicles (1, 10) in their interior (2) a solution whose density is higher than the density of the in
Zentrifugenbehälter gegebenen Lösung.  Centrifuge container given solution.
5. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch 5. Method according to the preceding claim, characterized
gekennzeichnet, dass die Lösung eine oder mehrere Substanzen (5) aufweist, die die Dichte erhöhen, vorzugsweise Glycerol, Dextran, Sucrose, andere Zucker, Salze, oder Nanopartikel.  in that the solution comprises one or more substances (5) which increase the density, preferably glycerol, dextran, sucrose, other sugars, salts, or nanoparticles.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch 6. The method according to any one of the preceding claims, characterized
gekennzeichnet, dass die Vesikel (1 , 10) Liposomen oder  characterized in that the vesicles (1, 10) are liposomes or
Proteoliposomen (10'), insbesondere GUVs, LUVs, SUVs, oder  Proteoliposomes (10 '), in particular GUVs, LUVs, SUVs, or
Virenpartikel sind, oder dass die Vesikel (1 , 10) aus natürlichen,  Are virus particles, or that the vesicles (1, 10) consist of natural,
biologischen Membranen gebildet sind.  biological membranes are formed.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch 7. The method according to any one of the preceding claims, characterized
gekennzeichnet, dass die in den Zentrifugenbehälter gegebene Lösung einen oder mehrere fusogene Stoffe aufweist, insbesondere zweiwertige Ionen wie Calciumchlorid, Porenbildner wie Nystatin-Cholesterol,  in that the solution introduced into the centrifuge container has one or more fusogenic substances, in particular divalent ions such as calcium chloride, pore formers such as nystatin cholesterol,
Komplexbildner wie EDTA oder SNARE-Proteine.  Complexing agents such as EDTA or SNARE proteins.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch 8. The method according to any one of the preceding claims, characterized
gekennzeichnet, dass eine Zentrifuge mit einem Ausschwingrotor verwendet wird.  in that a centrifuge with a swing-bucket rotor is used.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch 9. The method according to any one of the preceding claims, characterized
gekennzeichnet, dass der feste Träger ein Glasplättchen, vorzugsweise ein Deckglas für die Mikroskopie, oder ein mikro- oder nanostrukturierter Messchip (100) ist. Die Träger können eine funktionalisierte Oberfläche aufweisen, die die Fusion an der Oberfläche erleichtert. Mehrere Träger können in Multiwellformaten, z.B. in 96-Wellformaten angeordnet und gleichzeitig in die Zentrifuge gebracht werden.  in that the solid support is a glass plate, preferably a cover glass for microscopy, or a micro- or nanostructured measuring chip (100). The supports may have a functionalized surface that facilitates surface fusion. Several carriers can be used in multiwell formats, e.g. arranged in 96-well formats and placed simultaneously in the centrifuge.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch 10. The method according to any one of the preceding claims, characterized
gekennzeichnet, dass die hergestellten Lipiddoppelschichten (7) mittels Rastersondenmikroskopie, Impedanzspektroskopie, Fluoreszenz-Imaging, Quarzkristallmikrowaagen (quartz crystal microbalance, QCM), Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie oder elektrophysiologisch vermessen werden. characterized in that the lipid bilayers (7) produced by means of scanning probe microscopy, impedance spectroscopy, fluorescence imaging, quartz crystal microbalance (QCM), Surface plasmon resonance spectroscopy or electrophysiologically.
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