WO2013118960A1 - 효소법을 이용하는 당화혈색소 정량분석용 용혈시약 조성물 - Google Patents

효소법을 이용하는 당화혈색소 정량분석용 용혈시약 조성물 Download PDF

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glycated hemoglobin
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reaction
quantitative analysis
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조주영
박갑수
차근식
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Definitions

  • Hemolytic reagent composition for quantitative analysis of glycated hemoglobin using enzyme method
  • the present invention relates to a hemolytic drug composition for glycated hemoglobin quantitative analysis using the enzyme method.
  • the criteria for evaluating the measurement results differ depending on whether the patient has a meal or not, and it is cumbersome to use it, and the measurement value is determined by factors such as the physical condition of the patient at the time of measurement, such as stress, drinking, and fatigue. Changes can occur.
  • the measurement of blood glucose using glycated hemoglobin can measure the average blood glucose level of the patient for 3 to 4 months regardless of the diet and the physical condition of the patient, as well as the efficiency of the blood glucose management method performed by the patient. Can be used as an indicator to evaluate. Because the glucose present in the blood reacts with a protein called hemoglobin (hemoglobin) that makes up the blood and over a long period of time, it undergoes amadori rearrangement to produce a modified protein of hemoglobin-glucose called HbAlc. . The glycated hemoglobin is shown below.
  • the glycated hemoglobin has a life span of about 90 to 120 days, thereby providing an important data for diagnosing diabetes or determining the level of glycemic control by reflecting the average blood glucose level for three to four months.
  • glycated hemoglobin The clinical evaluation of glycated hemoglobin is expressed as a percentage ratio measured relative to the total hemoglobin concentration and within 6.0% represents normal blood glucose levels. Glycated hemoglobin levels are particularly important in the management of diabetic complications. A 1% drop in glycated hemoglobin levels leads to a 14% decrease in myocardial infarction. There are reports of 19% reduction in cataracts, 37% reduction in microvascular disease, 43% reduction in peripheral vascular disease, and 21% reduction in mortality from diabetes.
  • routine blood glucose measurement is important for checking the patient's daily health and taking appropriate measures according to the condition, while glycated protein black is necessary to identify the patient's long-term blood glucose control status, to prevent complications, and to take appropriate therapeutic measures. Measurement of glycated hemoglobin is necessary.
  • the standard method of measuring glycated hemoglobin which plays an important role in managing blood glucose, is to mix the collected blood sample with a suitable sample, for example, a surfactant such as TX-100, and then hemolyze the layer with boronic acid derivatives. Passed through a thick HPLC column, and then separated from the normal protein, the method of determining the glycated ratio by measuring the specific wavelength of the protein separated by visible light.
  • a suitable sample for example, a surfactant such as TX-100
  • US Pat. No. 5,541,117 discloses a method of preparing a pad to which an immuno antibody is immobilized, allowing a sample to be developed into a fixed pad, and calculating the intensity of reflected light.
  • a method of determining a relative amount of glycated proteins using a marker compound after separating proteins from a sample using a solid phase immobilized with an immuno-antibody has been proposed.
  • these methods of electrochemical glycosylated protein crystallization methods are glycated proteins and glycated proteins.
  • the enzymatic method is a pretreatment step in which a proteolytic enzyme acts on a glycated protein in a sample and releases a glycated peptide or a glycated amino acid as a substrate for the next step, and a glycated peptide specific enzyme or a glycated amino acid specific enzyme (eg, oxy Multidose) to produce a detectable product (eg, hydrogen peroxide), which leads to the process of measuring the detectable product.
  • a proteolytic enzyme acts on a glycated protein in a sample and releases a glycated peptide or a glycated amino acid as a substrate for the next step
  • a glycated peptide specific enzyme or a glycated amino acid specific enzyme eg, oxy Multidose
  • Japanese Patent Laid-Open No. 5-192193 discloses a ketoamine structure specifically present in fructosamine, and isolates a novel enzyme ketoamineoxidase from various microorganisms which catalyzes the oxidation reaction of this structure.
  • the protease pretreated fructosamine was then oxidized in the presence of this enzyme and specifically measured by measuring its product, glucosone or hydrogen peroxide.
  • a method for quantifying fructosamine is disclosed.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 2001-95598 discloses that a sample containing glycosylated protein is treated with proteolytic enzymes, freeing glycated peptides, preferably ⁇ -glycosylated peptides, more preferably ⁇ -glycosylated peptides from glycated proteins.
  • Measurement of hydrogen peroxide produced by the action of oxidase on the liberated glycosylated peptide, or measurement of the liberated glycosylated peptide using HPLC Method of measuring glycosylated protein in sample and using enzymatic method A reagent kit is disclosed.
  • Glycosylated hemoglobin is glucose bound to the valine of the N-terminal ⁇ chain of 1 A ( ⁇ 2 ⁇ 2) of hemoglobin, and the degree of glycation is the ratio of the glycated hemoglobin concentration to the total hemoglobin concentration (3 ⁇ 4>) or The concentration ⁇ ol is expressed.
  • the enzyme method to be discussed in the present invention is a fructocyl amino acid through a cleavage enzyme capable of cleaving a protein called protease from the N-terminal ⁇ chain of hemoglobin to which glucose is described above. It should be changed to a monomolecular substance called.
  • the generated fructosyl amino acid reacts with the oxidase called FP0X (Fructocyl peptide oxidase) to generate hydrogen peroxide, and the hydrogen peroxide is oxidized through POD (Peroxidase) and the substrate by electrons released through oxidation reaction
  • FP0X Fertocyl peptide oxidase
  • POD Peroxidase
  • the degree of color development through reduction reaction of is analyzed by spectroscopic means to measure glycated hemoglobin.
  • the enzymatic method using so many enzymes has the advantage that the accuracy of the result is superior to other methods through the characteristics of the enzyme itself that gives the selectivity, but the reaction conditions are difficult to induce the enzymatic reaction and the reaction time is long and the reaction sensitivity is high. There is a low problem.
  • the inventors of the present invention while studying a method for improving the reaction rate and reaction sensitivity in the enzyme method for quantifying glycated hemoglobin, when using a reagent composition containing a zwitterion surfactant and nitrite compound in the hemolytic reagent ionic help not only due to the surface active agent is significantly improved rate of hemolysis, N- terminus of the hemoglobin from hemolyzed ⁇ _ so that the chain can be a number of molecules capable to induce to be exposed to the hemoglobin molecule to participate in the external banung glycated hemoglobin banung Sensitivity and reaction rate are improved, and the nitrite compound allows the hemoglobin protein structure to be flexibly modified, thereby facilitating proteolytic enzymes to cleave the amino acid sequence of ⁇ -terminal ⁇ -chain of hemoglobin, thereby dramatically reducing the overall measurement time. Shortening and improving the accuracy of the measurement results. Out the present invention has been completed. ⁇ Detailed Description of the Invention ⁇
  • An object of the present invention is to reduce the measurement time by increasing the reaction speed in the glycated hemoglobin concentration measurement method using the existing enzyme method, and to measure the reaction signal It is to provide a hemolytic reagent composition to maximize the reaction response.
  • Another object of the present invention is to provide a method for quantifying glycated hemoglobin using the hemolytic reagent composition.
  • the present invention is a zwitterionic surfactant represented by the formula (1);
  • hemolytic reagent composition Provided is a hemolytic reagent composition.
  • R 1 and R 2 are each independently d-5 linear or branched alkyl; ⁇ is an integer of 1-6; Single bond or Where X is m is an integer of 1-3, R 3 is C 13 linear or branched alkyl,
  • the present invention comprises the step of hemolysis of red blood cells with the hemolytic reagent composition (step 1); Measuring the amount of total hemoglobin in which red blood cells are hemolyzed in step 1 (step 2); Selectively cleaving the glycated hemoglobin from which red blood cells are hemolyzed in step 1 to glycoside Vahilis-
  • the hemolytic reagent composition comprising the zwitterionic surfactant and the nitrite compound according to the present invention not only significantly improves the hemolysis rate due to the zwitterionic surfactant, but also the hemoglobin N-terminal ⁇ -chain of the hemoglobin released from the hemoglobin molecule.
  • the glycated hemoglobin reaction and the reaction rate is improved, and the protein structure of hemoglobin is flexibly modified by the nitrite compound, so that the protease is hemoglobin ⁇ It is easy to cut the terminal ⁇ -chain amino acid sequence, which has an effect of significantly shortening the overall measurement time and improving the accuracy of the measurement results.
  • Example 1 is a graph showing that hemolytic reagent compositions according to Examples 1-3 and Comparative Example 3 of the present invention hemolyses erythrocytes over time (the slope change with time in the graph of FIG. It means that it is going on, and the time when the slope change disappears indicates the time when the hemolysis process is finished).
  • Figure 2 indicates the potential for hemolysis reagent composition according to Comparative Example 4-8 hours' lapse theta along a graph showing that hemolysis of red blood cells (Figure gradient change with time in the graph of Figure 2 of a red blood cell hemolysis course zero and continue And the time when the change disappears indicates the time of 0 hemolysis process).
  • Figure 3 is a graph showing the reaction response to the total hemoglobin of the hemolytic reagent compositions according to Examples 1-3 and Comparative Examples 1-3 of the present invention (the larger the slope in the graph of Figure 3 the greater the sensitivity to the total hemoglobin) ).
  • Figure 4 is a graph showing the semi-ungseong sensitivity to the total hemoglobin of the hemolytic reagent compositions according to Comparative Examples 4-5 and Comparative Example 8 (the larger the slope in the graph of Figure 3 shows that the greater the semi-ungseong sensitivity to total hemoglobin).
  • FIG. 5 is a graph showing the reaction resistance to glycated hemoglobin of the hemolytic reagent composition according to Examples 1 to 3 and Comparative Example 1 of the present invention (the larger the slope in the graph of FIG. 5, the greater the reaction and response to glycated hemoglobin) ).
  • Figure 6 is a graph showing the anti-ungung sensitivity to glycated hemoglobin of the hemolytic reagent composition according to Comparative Examples 2, 4, 5 and 8 (the larger the slope in the graph of Figure 6 shows the semi-ungseong sensitivity and larger for the glycated hemoglobin).
  • 7 is a graph showing the banung sensitivity to the glycated hemoglobin in the hemolysis reagent composition according to Example 1 and Comparative Example 10 of the present invention (the larger the slope of the graph of Figure 7 indicates that the banung sensitivity to glycated hemoglobin large) .
  • FIG. 8 is a graph showing the anti-ungung sensitivity to glycated hemoglobin of the hemolytic reagent compositions according to Example 1 and Comparative Example 1 of the present invention (in the graph of FIG. 8, the larger the slope, the greater the semi-ungular sensitivity to glycated hemoglobin). [Best form for implementation of the invention]
  • glycated hemoglobin glycated hemoglobin
  • concentration of total hemoglobin in the blood in particular the measurement sensitivity and measurement of glycated hemoglobin of the total hemoglobin using an improved hemolytic reagent composition to improve the sensitivity and reduce the measurement time.
  • both total hemoglobin and glycated hemoglobin levels should be measured.
  • the total hemoglobin level was determined by using a characteristic spectroscopic peak in the region around 530 nm of the hemoglobin released from red blood cells during the hemolysis process, which is a pretreatment step for the quantitative analysis of glycated hemoglobin using the enzyme method. Measurement can be made using a spectroscopy device.
  • the glycated hemoglobin level can be measured by the enzyme reaction using the proteolytic enzyme, fructosyl peptide oxidase (FP0X), peroxide (POD), and the substrate of the hemolytic blood sample as described above in the background art.
  • the present invention is a zwitterionic surfactant represented by the following formula (1);
  • a hemolytic reagent composition used in a pretreatment process of glycated hemoglobin quantitative analysis using an enzyme method comprising a nitrite compound.
  • R 1 and R 2 are each independently straight or branched alkyl of d- 5 ; n is an integer from 1-6; HX is a single bond or;
  • n is 1 and R 3 is straight or branched alkyl of C 13 .
  • R 3 is straight or branched alkyl of C 13 .
  • R 1 and R 2 are each independently d or 3 straight or branched alkyl
  • n is an integer from 1-4;
  • % ⁇ X is a single bond or
  • X is m is an integer from 1-3, R 3 is straight or branched alkyl of C 13 ,
  • M is 1 when X is a single bond, and R 3 is C 13 linear or branched alkyl. Particularly preferably,
  • amphoteric surfactants represented by Formula 1 are N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-oethyl
  • the bivalent surfactant represented by Chemical Formula 1 serves to increase the hemolysis rate, soften the structure of hemoglobin, and improve the activity of enzyme reactions after the pretreatment process.
  • the enzyme reactions after the pretreatment will be described in detail in the method for quantifying glycated hemoglobin using the following enzyme method.
  • the zwitterionic surfactant is preferably added at 0.5-1.0 weight 3 ⁇ 4. If the zwitterionic surfactant is less than 0.5 weight 3 ⁇ 4>, there is a problem that the hemolysis reaction reaction rate is lowered or the hemolysis reaction does not occur, and when the amphoteric surfactant exceeds 1.0 weight 3 ⁇ 4, there is a problem that the hemolysis reaction sensitivity is decreased.
  • the nitrite compound not only plays a role in facilitating the analysis of total hemoglobin as already known in the prior art, but also softens the structure of the hemoglobin, so that the proteolytic enzyme is used after the pretreatment process It selectively plays a role in obtaining monomolecular fructosyl amino acids by selectively cleaving the sugar I Val-His-
  • nitrite compounds such as sodium nitrite, potassium nitrite, magnesium nitrite and calcium nitrite may be used alone or in combination.
  • the nitrite compound is preferably added at 1-5 mM. If the nitrite compound is less than 1 mM, there is a problem in that the hemoglobin protein structure cannot be sufficiently flexibly modified. There is a problem in that scattering occurs when measuring the total hemoglobin concentration.
  • the present invention comprises the step of hemolysis of red blood cells with the hemolytic reagent composition (step 1);
  • step 2 Measuring the amount of total hemoglobin in which red blood cells are hemolyzed in step 1 (step 2);
  • step 1 red blood cells are hemolyzed, and the glycosylated hemoglobin is a proteolytic enzyme, which is the glycosylated Va ⁇ His-
  • step 4 Reacting with the fructosyl amino acid FPOX ructosyl peptide oxidase) obtained in step 3 to produce hydrogen peroxide (step 4); Reacting the hydrogen peroxide generated in step 4 with POD (peroxidase) to oxidize hydrogen peroxide (step 5);
  • step 6 Measuring the amount of coloration induced by oxidation and reduction reaction of the hydrogen peroxide and the substrate oxidized in step 5 (step 6); And
  • step 1 is a pretreatment step of hemolysing red blood cells using a hemolytic reagent composition comprising a zwitterionic surfactant represented by Formula 1 according to the present invention and a nitrite compound.
  • the zwitterionic surfactant represented by Formula 1 serves to soften the structure of hemoglobin and to improve the activity of enzyme reactions after step 1.
  • the zwitterionic surfactant is preferably added at 0.5-1.0 weight 3 ⁇ 4. If the bipolar surfactant is less than 0.5 weight 3 ⁇ 4 » there is a problem that the hemolysis reaction rate is lowered or the hemolysis reaction does not occur, and when it exceeds 1.0 weight%, there is a problem that the hemolysis reaction sensitivity is decreased.
  • the nitrite compound not only plays a role in facilitating the analysis of total hemoglobin as already known in the prior art, but also softens the structure of the hemoglobin, pretreatment. After the process, proteolytic enzymes were added to the N-terminal ⁇ -chain of glycated hemoglobin. Va ⁇ His-
  • nitrite compounds such as sodium nitrite, potassium nitrite, magnesium nitrite and calcium nitrite may be used alone or in combination.
  • the nitrite compound is preferably added at 1-5 mM. If the nitrite compound is less than 1 mM, there is a problem in that hemoglobin protein structure is not sufficiently flexibly modified, and if the nitrite compound is more than 5 mM, scattering occurs when measuring total hemoglobin concentration.
  • step 2 is a step in which red blood cells are hemolyzed in step 1 to determine the amount of better total hemoglobin. Specifically, the total hemoglobin level was measured using a spectroscopy device such as UV / Vis using the fact that the hemoglobin released from red blood cells in the hemolysis process of step 1 was characterized by a characteristic spectroscopic peak in the region around 530 nm. can do .
  • the step 3 is that the red blood cells are hemolyzed in step 1 to selectively cleave the glycosylated hemoglobin of the glycosylated hemoglobin in the N-terminal ⁇ -chain of the glycosylated hemoglobin. To obtain a monomolecular fructosyl amino acid.
  • protease Bacillus, Aspergillus, Streptomyces genus, protease derived from the genetic recombination of these microorganisms can be used alone or in combination.
  • the protease is preferably added at 500-1000 U / mL. If the protease is less than 500 u / mL, the sensitivity of the reaction is reduced. If exceeded, the enzymes used together are also decomposed together to reduce reaction there is a problem.
  • step 4 is a step of reacting the fructosyl amino acid obtained in step 3 with fructosyl peptide oxidase (FPOX) to generate hydrogen peroxide (0 2 ).
  • FPOX fructosyl peptide oxidase
  • step 5 is a step of oxidizing hydrogen peroxide by reacting hydrogen peroxide generated in step 4 with POD (peroxidase).
  • the P0D is preferably added at 5-20 U / mL. If the P0D is less than 5 U / mL, there is a problem that the sensitivity of the overall reaction decreases. If the P0D exceeds 20 U / mL, the color of the enzyme itself is similar to that of the hemoglobin, so that the concentration of glycated hemoglobin is measured. There is a problem that interferes with it.
  • step 6 is a step of measuring the amount of color induced by the hydrogen peroxide and the substrate oxidized in the step 5 to cause the oxidation and reduction reaction.
  • the substrate serves to cause color reaction through oxidized hydrogen peroxide and oxidation / reduction reaction produced by the P0D, and dyes such as DA-67 and DA-64 may be used.
  • the substrate is preferably added less than 0.12 niM. if,. If the substrate exceeds 0.12 mM, there is a problem that spontaneous color change occurs, causing errors in spectroscopic measurements. Since the substrate is an unstable substance that spontaneously discolors by the outside and the temperature, special care is required for its use.
  • step 7 is a step of quantifying glycated hemoglobin concentration in blood samples by comparing the amount of total hemoglobin measured in step 2 with the amount of glycated hemoglobin measured in step 6 relatively. .
  • the amount of glycated hemoglobin relative to the total hemoglobin amount can be calculated and expressed as a percentage.
  • the amount of total hemoglobin and glycated hemoglobin measurement quantity measured in the step 6 of the i stage 2 can be measured with a spectroscopic device, such as a UV / Vis.
  • the hemolytic reagent composition comprising the zwitterionic surfactant and the nitrite compound according to the present invention not only significantly improves the hemolysis rate due to the zwitterionic surfactant, but also the N-terminal ⁇ of the hemoglobin released from hemolysis. -Induce the chain to be exposed to the outside of the hemoglobin molecule, so that as many molecules as possible to participate in the reaction to improve the glycosylated hemoglobin reaction and reaction speed, and the nitrite compound is flexibly modified protein structure of hemoglobin Enzyme cleaves amino acid sequence that is the ⁇ -terminal ⁇ -chain of hemoglobin It is easy to make it possible to significantly shorten the overall measurement time and improve the accuracy of the measurement results.
  • a 100 iiiM MES buffer 800 U / mL of microbial protease with protease, 1 U / mL of fructosyl peptide oxidase (FPOX), 10 U / mL of POD (peroxidase) and 0.12 mM DA-67 (dye) as substrate
  • FPOX fructosyl peptide oxidase
  • POD peroxidase
  • dye 0.12 mM DA-67
  • Hemolytic reagent composition by mixing together 3— (dimethyl (3-tetradecaneamidopropyl) ammonio) propane-1-sulfonate 0.75 mg / niL with 2 mM NaN0 2 as a nitrite compound in 100 mM MES buffer 1 was prepared.
  • Hemolysis was carried out in the same manner as in Example 1, except that 0.75 mg / mL of 4- (dimethyl (3-tetradecaneamidopropyl) ammonio) butane-1-sulfonate was used instead of the surfactant used in Example 1.
  • Reagent composition 2 was prepared.
  • Hemolytic reagent composition 3 was prepared in the same manner as in Example 1 except for using (dimethyl (tetradecyl) ammonio) propane 1-sulfonate 0.75 rag / mL.
  • Hemolytic reagent composition 4 was prepared in the same manner as in Example 1, except that purified water was used instead of the surfactant used in Example 1. Comparative Example 2 Preparation of Hemolytic Reagent Compositions Used in the Pretreatment Process of Quantitative Analysis of Glycated Hemoglobin 5
  • Hemolytic reagent composition 5 was prepared in the same manner as in Example 1 except for using 0.75 mg / mL of 6- (hydroxymethyl) ⁇ tetrahydro-2H-pyranjan 3, 4 and 5-tree.
  • Hemolytic reagent composition 6 was prepared in the same manner as in Example 1 except that (dodecyldimethylammonio) butanoate 0.75 mg / mL was used. '
  • the hemolysis reagent composition 7 was prepared in the same manner as 1.
  • Hemolysis was carried out in the same manner as in Example 1, except that 0.75 mg / mL of 3- (dimethyl (3-palmitamidopropyl) ammono) propane-1-sulfonate was used instead of the surfactant used in Example 1.
  • Reagent composition 8 was prepared.
  • a hemolytic reagent composition 9 was prepared in the same manner as in Example 1 except that 0.75 mg / mL of 3- (dimethyl (octyl) ammonio) propane-1 -sulfonate was used instead of the surfactant used in Example 1. .
  • Hemolytic reagent composition 10 was prepared in the same manner as in Example 1, except that 0.75 mg / mL of 3 ′ (decyldimethylammonio) propane-1-sulfonate was used instead of the surfactant used in Example 1. Comparative Example 8 Preparation of Hemolytic Reagent Composition for Use in Pretreatment of Glycated Hemoglobin Quantitative Analysis 11
  • a hemolytic reagent composition 11 was prepared in the same manner as in Example 1 except for using (dodecyldimethylammonio) propane-1-sulfonate 0.75 mg / mL.
  • a hemolytic reagent composition 12 was prepared in the same manner as in Example 1 except that 0.75 mg / mL of (nuxadecyldimethylammonio) propane-1-sulfonate was used. Comparative Example 10 Preparation of Hemolytic Reagent Composition for Use in Pretreatment of Glycated Hemoglobin Quantitative Analysis 13
  • Hemolytic reagent composition 13 was prepared in the same manner as in Example 1 except that 2 mM NaN0 2 was not used as the nitrite compound. Chemical structures of the bivalent surfactants used in Examples 1-3 and Comparative Examples 1-9 are shown in Table 1 below.
  • solubility of the sample itself In order to use the surfactant, the solubility of the sample itself must be excellent. Thus, since it is not possible to firstly dissolve the user body, solubility of the surfactant was evaluated as a precondition for use. Specifically, the surfactants used in Examples 1 to 3 and Comparative Examples 1-9 were dissolved in distilled water so as to have a concentration of 0.75 mg / ml, and the dissolution was determined, and the results are shown in Table 2 below.
  • the hemolytic reagent compositions prepared in Examples 1-3 and Comparative Examples 1-8 were reacted with blood for 1: 400 (blood: hemolytic reagent) for 5 minutes. Absorbance change (at 530 nm) between 0 and 5 minutes was measured using a UV / Vis device (Model: UV-1800, manufacturer: Shimadzu), and the results are shown in FIGS. 1, 2 and Table 3 below. .
  • Example 1 is a graph showing that the hemolytic reagent composition according to Examples 1-3 and Comparative Example 1 3 of the present invention hemolyses erythrocytes over time (the slope change with time in the graph of FIG. 1 is a hemolytic process of erythrocytes). This means that the process continues, and the time when the change of the slope disappears indicates the time when the hemolysis process is completed).
  • Figure 2 is a graph showing that the hemolytic reagent composition according to Comparative Example 4-8 hemolyzed red blood cells over time (in the graph of Figure 2, the change in the slope with time means that the hemolysis process of red blood cells is continuing o For example, the time at which the change in slope disappears represents the time at which the hemolysis process is completed.
  • the hemolytic reagent composition prepared in Example 1-3 shows a fast hemolysis rate within about 1 minute and the change in the slope over time ⁇ hemolysis of the hemocytosis In terms of meaning that it is still true, it can be seen that it shows an intraocular signal with little change in inclination.
  • Example 3 shows a fast hemolysis rate within about 1 minute and the change in the slope over time ⁇ hemolysis of the hemocytosis In terms of meaning that it is still true, it can be seen that it shows an intraocular signal with little change in inclination.
  • the hemolytic reagent composition shows the fastest rate of hemolysis .
  • Figure 3 is a graph showing the anti-ungung sensitivity to total hemoglobin of the hemolytic reagent composition according to Examples 1-3 and Comparative Examples 1-3 of the present invention (in the graph of FIG. Big one).
  • FIG. 4 is a graph showing the anti-ungung sensitivity to total hemoglobin of the hemolytic reagent compositions according to Comparative Examples 4-5 and 8 (the larger the swelling in the graph of FIG. 3, the greater the reaction response to the total hemoglobin).
  • the substrate must be colored through the reaction of hydrogen peroxide and peroxidase produced through enzyme reactions, so that accurate quantitative analysis is possible.
  • the substrate may be colored through the reaction between the substrate and the surfactant, resulting in errors in the quantitative analysis.
  • the reaction between the surfactant and the substrate was tested as follows.
  • the hemolysis reagents prepared in Examples 1-3 and Comparative Examples 1, 2, 4, 5, and 8 were not reacted with blood samples, and the absorbance was analyzed by the UV / Vis apparatus used in Example 2.
  • the surfactants included in the hemolytic reagents prepared in Examples 1 to 3 and Comparative Examples 1, 2, 4, 5, and 8 did not react with the substrate, and thus were found to be suitable for quantitative analysis.
  • the response and the reaction rate for the glycated hemoglobin should be excellent.
  • the effect of the hemolytic reagent composition according to the present invention on the glycated hemoglobin reaction and the reaction rate was as follows. Specifically, in the case of response sensitivity, four blood samples having different glycated hemoglobin concentrations (72 ⁇ M, 120 ⁇ , 152 ⁇ , 264 ⁇ ) were prepared.
  • the absorbance at 633 nm which is a wavelength region where DA-67 (manufacturer: Wako) used as a substrate, was specifically measured in the enzyme reaction composition prepared in Preparation Example 1, was the same as that used in Experimental Example 2. It was measured using the / Vis device, the results are shown in Figures 5-6. In addition, the slope of the graph showing the glycated hemoglobin reaction sensitivity in Figure 5 ⁇ 6 is shown in Table 5 below.
  • Figure 5 is a graph showing the reaction response to glycated hemoglobin of the hemolytic reagent composition according to Example 1 ⁇ 3 and Comparative Example 1 of the present invention (the larger the slope in the graph of Figure 5 the reaction sensitivity and the reaction rate for glycated hemoglobin) Big one).
  • Figure 6 is a graph showing the reaction resistance to glycated hemoglobin of the hemolytic reagent composition according to Comparative Examples 2, 4, 5 and 8 (the larger the slope in the graph of Figure 6 shows that the reaction sensitivity and reaction rate for glycated hemoglobin is larger) ).
  • the following experiment was conducted to determine the reaction rate for glycated hemoglobin.
  • reaction rate was compared with the reaction sensitivity per unit time.
  • reaction time was fixed to 3 minutes
  • the reaction rate was compared by the slope of each hemolysis reagent. 5 and 6 can be seen as a reaction rate, because the reaction rate is slow even if the reaction rate of any one of the two reactions of hemolysis and enzyme reaction reaction rate is slow because the reaction reaction slope is small.
  • Example 1-3 the slope of the calibration curve was found to show a large value of about 0.09-0.1.
  • the length of the tail chain was all carbon The molecular structure common to 14 was confirmed. This suggests that surfactants consisting of 14 carbons in the tail chain help glycated hemoglobin and enzymes easily react.
  • nitrite compounds are known to be used to measure total hemoglobin.
  • the protein structure of hemolysed hemoglobin is flexibly changed to provide a supporting property for proteolytic enzymes to facilitate the cleavage of the sequence.
  • Example 1 three blood samples (52 uM, 98 uM, 125 ⁇ ) having different glycated hemoglobin concentrations were prepared, and each of the blood samples was prepared in Example 1 and Comparative Example 10 (the nitrite compound in the composition of Example 1). After reacting for 1 minute at a ratio of 1: 400 (blood: hemolytic reagent) and the hemolytic reagent composition prepared in the above), the mixture was added to the enzyme reaction composition prepared in Preparation Example 1 by the following process and reacted for 3 minutes to glycated hemoglobin. Was measured.
  • the absorbance at 633 nm which is a wavelength region where DA-67 (manufacturer: Wako) used as a substrate, was specifically measured in the enzyme reaction composition prepared in Preparation Example 1, was the same as that used in Experimental Example 2. It was measured using the / Vis device, the results are shown in FIG.
  • Figure 7 is a graph showing the anti-ungung sensitivity to glycated hemoglobin of the hemolytic reagent composition according to Example 1 and Comparative Example 10 of the present invention (the larger the slope in the graph of Figure 7 shows that the semi-ungseong sensitivity to glycated hemoglobin).
  • the reaction rate (slope of the black curve) for glycated hemoglobin was 0.10386, whereas' the hemolytic reagent prepared in Comparative Example 10 was used.
  • the reaction rate for glycated hemoglobin was 0.02169, which was about 5 times larger.
  • Example 1 In order to find out whether the surfactant used in the present invention induces the hemoglobin ⁇ —terminal-chain to be exposed outside the hemoglobin molecule so that as many molecules as possible can participate in reaction and affect the glycated hemoglobin reaction sensitivity.
  • the experiment was as follows. Specifically, four blood samples having different glycated hemoglobin concentrations (72 ⁇ M, 120 ⁇ , 152 ⁇ , and 264 ⁇ ) were prepared, and each of the blood samples was prepared in Example 1 and Comparative Example 1 (Example 1).
  • the absorbance at 633 nm which is the wavelength region where DA-67 (manufacturer: Wako) specifically used as a substrate in the enzyme reaction composition prepared in Preparation Example 1, was the same as that used in Experiment 2 Measurement was made using a UV / Vis device, and the results are shown in FIG. 8.
  • FIG. 8 is a graph showing the anti-ungung sensitivity to glycated hemoglobin of the hemolytic reagent compositions according to Example 1 and Comparative Example 1 of the present invention (in the graph of FIG. 8, the larger the slope, the greater the semi-ungular sensitivity to glycated hemoglobin).
  • the hemolytic reagent composition comprising the bivalent surfactant and the nitrite compound according to the present invention not only significantly improves the hemolysis rate due to the zwitterionic surfactant, but also the ⁇ -terminus of hemolytic hemoglobin.
  • ⁇ -chain can be exposed to outside the hemoglobin molecule, so that as many molecules as possible can participate in the reaction, the glycosylated hemoglobin response sensitivity and reaction rate are improved, and the nitrite compound flexibly modifies the hemoglobin protein structure.
  • the protease facilitates the cleavage of the amino acid sequence of the ⁇ -terminal ⁇ - body of hemoglobin, thereby dramatically reducing the overall measurement time and improving the accuracy of the measurement results.
  • As a hemolytic reagent composition for glycated hemoglobin quantitative analysis Can be useful.

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Abstract

본 발명은 효소법을 사용하는 당화혈색소 정량분석용 시약 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 양쪽이온성 계면활성 및 아질산 화합물을 포함하는 용혈시약 조성물은 상기 양쪽이온성 계면활성제로 인하여 용혈 속도가 현저히 향상될 뿐만 아니라, 용혈되어 나온 혈색소의 N-말단 β-체인이 혈색소 분자 외부로 노출될 수 있도록 유도하여 가능한 많은 분자가 반응에 참여할 수 있도록 도와 당화혈색소 반응감도 및 반응속도가 향상되고, 상기 아질산 화합물로 인하여 혈색소의 단백질 구조가 유연하게 변형되어 단백질분해효소가 혈색소의 N-말단 β-체인 아미노산 서열을 절단하는 것을 용이하게 하여, 전체 측정시간을 획기적으로 단축하고 측정결과의 정확성을 개선하는 효과가 있다.

Description

【명세서 】
【발명의 명칭 】
효소법을 이용하는 당화혈색소 정량분석용 용혈시약 조성물 【기술분야 】
본 발명은 효소법을 이용하는 당화혈색소 정량분석용 용혈사약 조성물에 관한 것이다.
【배경기술 】
최근 당뇨병을 진단하고 예방하는데 있어서 혈액 내의 포도당 (혈당: blood glucose)의 양을 주기적으로 측정해야 할 필요성이 증대되고 있다. 이러한 혈당 측정은 손에 쥘 수 있는 휴대용 계측기를 이용하여 손쉽게 측정할 수 있으며， 구체적으로 각자가 스트립 형태의 바이오센서를 사용하여 손쉽게 측정할 수 있다.
그러나， 혈당을 측정할 경우 환자의 식사 유무에 따라 측정 결과를 평가하는 기준이 달라 사용의 번거로움이 있고 측정 당시 환자의 신체 상태 , 예를 들어 스트레스， 음주， 피로와 같은 요인에 의해 측정값의 변화가 발생할 수 있다.
이에 반해， 당화혈색소를 이용한 혈당의 측정은 식사 유무 및 환자의 신체 상태에 구애받지 않고 환자의 3~4달 동안의 평균 혈당 수치를 측정할 수 있을 뿐만 아니라 환자가 실시하고 있는 혈당 관리 방법의 효율성을 평가할 수 있는 지표로 사용할 수 있다. 왜냐하면 혈액 내에 존재하는 포도당은 혈액을 구성하는 혈색소 (헤모글로빈)라는 단백질과 장시간에 걸쳐 반웅하여 아마도리 전이 (Amadori rearrangement) 과정을 거쳐 당화혈색소 (HbAlc)라고 불리는 헤모글로빈-포도당의 변형 단백질을 생성하게 된다. 하기에 당화혈색소를 나타내었다.
Figure imgf000002_0001
색소
Figure imgf000002_0002
혈：색:
이렇게 형성된 당화혈색소의 수명은 약 90 120일이기 때문에 3~4개월 동안의 평균적인 혈당수치를 반영해 당뇨병을 진단하거나 혈당 관리 정도를 파악해 내는데 매우 중요한 자료를 제공할 수 있게 된다.
당화혈색소의 임상학적 평가는 전체 혈색소 농도와의 상대적 비율로 측정하여 %비율로 나타내며 6.0% 이내가 정상 혈당 수치를 나타낸다. 당화혈색소 수치는 특히 당뇨합병증을 관리하는데 있어 매우 중요한데， 당화혈색소 수치가 1% 낮아지면 심근경색 14% 감소， 백내장 19% 감소, 미세혈관질환 37% 감소， 말초혈관질환 43% 감소， 당뇨로 인한 사망률 21% 감소 효과가 있다는 연구 보고가 있다.
따라서， 일상적인 혈당의 측정은 환자의 매일 매일의 건강상태를 확인하고 상태에 합당한 조치를 취하는데 중요한 반면 환자의 장기적인 혈당 관리 상태를 파악하고 합병증을 방지하며 합당한 치료 조치를 취하기 위해서는 당화단백질 흑은 당화혈색소의 측정이 필요하다.
위와 같이 혈당을 관리하는데 증요한 지표 역할을 하는 당화혈색소를 측정하는 표준적인 측정 방법은 채취된 혈액시료를 적당한 시료, 예를 들어 TX-100과 같은 계면활성제와 섞어 용혈한 후 보론산 유도체로 층진한 HPLC 컬럼을 통과시킨 다음 보통의 단백질과 분리하고 가시광선으로 분리되어 나온 단백질들의 특이 파장을 측정함으로써 당화된 비율을 산정하는 방법을 사용한다.
1 그러나 이와 같은 표준방법은 항상 시설이 잘 갖추어진 중앙 임상실험,실에서 고가의 크로마토그래피 장비를 사용하여 전문가가 실시해야 하는 단점이 있다.
또한 , 당화혈색소 항체를 이용하는 방법이 있으나， 당화혈색소 항체를 생산하는 기업이 적어 공급이 제한적이고, 반웅 -분리단계를 거쳐야 하기 때문에 장치의 구성이 복잡하다.
US 5，541，117호에서는 면역항체를 고정한 패드를 마련하고 시료가 고정된 패드로 전개하도록 한 후 반사광의 강도로 산출하는 방법을 개시하고 있으나， 고가의 항체를 사용해야하고 다공성 패드의 불균일성에 의해 일정한 품질의 센서를 생산하기 어려운 문제점이 있다. 그리고， 면역항체를 고정한 고체상을 사용하여 시료 중의 단백질을 분리한 후 표식자 화합물을 사용하여 당화단백질의 상대적 양을 결정하는 방법이 제시되어 있으나, 이러한 전기화학적 당화단백질 : 결정방법들은 당화단백질 및 당화단백질 -표식자들을 전극표면에 경쟁적으로 모이게 한 후 표식자와 전기화학적 반웅을 일으키는 기질을 주입하여 신호의 크기를 결정하는 것으로 단화단백질의 농도 측정이 복잡하고 재현성이 어려운 문제점이 있다. 한편 , 당화혈색소 등의 당화단백질 측정 방법으로 효소법이 있다. 효소법은 시료 중의 당화단백질에 단백질분해효소를 작용시키고， 다음 공정의 기질로 되는 당화펩티드 또는 당화아미노산을 유리시키는 전처리 공정 및 유리된 기질에 당화펩티드 특이 효소 또는 당화아미노산 특이 효소 (예를 들면， 옥시다제 )를 작용시켜 검출 가능한 생성물 (예를 들면， 과산화수소)을 생성시키고, 이 검출 가능한 생성물을 측정하는 공정으로 이투어진다.
일본국 특허공개 평 5-192193호 공보에서는 프럭토사민 (fructosamine) 중에 존재하는 케토 아민 구조를 특이적으로 인식해 , 이 구조의 산화반응을 촉매 하는 신규한 효소 케토아민옥시다아제를 여러 가지 미생물로부터 분리한 다음, 프로테아제 전처리한 프럭토사민을 이 효소의 존재하에서 산화해， 그 생성물인 글루코손 또는 과산화수소를 측정하여 특이적으로 프럭토사민을 정량하는 방법에 관하여 개시하고 있다.
일본국 특허공개 2001-95598호 공보에서는 당화단백질을 '포함한 시료를 단백질분해효소로 처리하고 ， 당화단백질로부터 당화펩티드 ， 바람직게는 α-당화펩티드 ， 더욱 바람직하게는 α - 당화디펩티드를 유리시키고 ， 상기 유리된 당화펩티드에 옥시다아제를 작용시켜 생성된 과산화수소를 측정하는 것， 또는 유리된 당화펩티드를 HPLC를 이용하여 측정하는 것에 관한 것이고 ， 시료 중의 당화단백질을 측정하는 방법 및 효소적 방법을 이용한 측정용 시약 키트에 관하여 개시하고 있다.
당화혈색소는 혈색소의 1 Α( α 2β 2)의 N-말단 β 체인의 발린 (valine)에 글루코오즈가 결합된 것으로, 당화 정도는 전체 혈색소 농도에 대한 당화혈색소의 농도의 비율 (¾>) 또는 농도 隱 ol로 표현된다 . 본 발명에서 논의하고자 하는 효소법은 상기에서 설명한 글루코오즈가 ' 결합된 혈색소의 N-말단 β 체인을 단백질분해효소 (protease)라는 단백질을 절단할 수 있는 절단효소를 통해 프럭토실 아미노산 (fructocyl amino acid)이라는 단분자성 물질로 변화시켜야 한다. 이렇게 생성된 프럭토실 아미노산은 FP0X(Fructocyl peptide oxidase)라는 산화효소와 반웅해 과산화수소를 발생시키게 되며， 생성된 과산화수소는 POD(Peroxidase)를 통해 산화되며 , 산화반웅을 통해 방출된 전자에 의한 기질 (substrate)의 환원반웅을 통해 발색되는 정도를 분광학적 수단을 통해 분석하여 당화혈색소를 측정하게 된다.
이렇게 많은 효소를 사용하는 효소법은 선택성을 부여하는 효소자체의 특성을 통해 결과의 정확성이 여타 다른 방법에 비해 우수한 장점이 있지만, 효소반응을 유도하기 위한 반웅 조건이 까다로워 반웅시간이 길고， 반웅감도가 낮은 문제점이 있다.
이에 , 본 발명자들은 당화혈색소 정량분석을 위한 효소법에서 반웅속도 및 반웅감도를 향상시키는 방법을 연구하던 중, 용혈시약에 양쪽이온성 (Zwitterion) 계면활성제 및 아질산 화합물을 포함한 시약 조성물을 사용할 경우 상기 양쪽이온성 계면활성제로 인하여 용혈 속도가 현저히 향상될 뿐만 아니라， 용혈되어 나온 혈색소의 N-말단 β _체인이 혈색소 분자 외부로 노출될 수 있도록 유도하여 가능한 많은 분자가 반웅에 참여할 수 있도록 도와 당화혈색소 반웅감도 및 반웅속도가 향상되고， 상기 아질산 화합물로 인하여 혈색소의 단백질 구조가 유연하게 변형되어 단백질분해효소가 혈색소의 Ν-말단 β -체인 아미노산 서열을 절단하는 것을 용이하게 하여 , 전체 측정시간을 획기적으로 단축하고 측정결과의 정확성을 개선하는 효과가 있음을 알아내고 본 발명을 완성하였다. 【발명의 상세한 설명 】
【기술적 과제】
본 발명의 목적은 기존의 효소법을 이용한 당화혈색소 농도 측정법에서 반웅속도를 증가시켜 측정시간을 단축하고， 반웅신호를 극대화시켜 반웅감도를 증가시키는 용혈시약 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 용혈시약 조성물을 이용하는 당화혈색소 정량분석 방법을 제공하는 것이다.
【기술적 해결방법 】
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 하기 화학식 1로 나타나는 양쪽이온성 계면활성제 ; 아질산 화합물을 포함하는 효소법을 이용한 당화혈색소 정량분석의 전처리 공정에
용혈시약 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure imgf000005_0001
여기서，
R1 및 R2는 각각 독립적으로 d-5의 직쇄 또는 측쇄 알킬이고 ; η은 1—6의 정수이고; 단일결합 또는
Figure imgf000005_0002
서 X가 인 경우 m은 1-3의 정수이고, R3는 C13의 직쇄 또 측쇄 알킬이고，
X가 단일결합인 경우 m은 1이고， R3는 C13의 직쇄 또는 측쇄 알킬이다. 또한， 본 발명은 상기 용혈시약 조성물로 적혈구를 용혈시키는 단계 (단계 1) ; 상기 단계 1에서 적혈구가 용혈되어 나온 총 혈색소의 양을 측정하는 단계 (단계 2); 상기 단계 1에서 적혈구가 용혈되어 나온 당화혈색소를 단백질분해효소가 당화혈색소의 N-말단 β -체인의 당ᅳ Vahilis-|만을 선택적으로 절단하여 단분자성의 프럭토실 아미노산을 얻는 단계 (단계 3); 상기 단계 ^에서 얻어진 프럭토실 아미노산을 FPOXCfructosyl peptide oxidase)와 반웅시켜 과산화수소를 생성하는 단계 (단계 4); 상기 단계 4에서 생성된 과산화수소를 POD(peroxidase)와 반응시켜 과산화수소를 산화시키는 단계 (단계 5); 상기 단계 5에서 산화된 과산화수소와 기질이 산화.환원 반웅을 일으켜 유도되는 발색의 양을 측정하는 단계 (단계 6) ; 및 상기 단계 2에서 측정한 총 혈색소의 양과 상기 단계 6에서 측정한 당화혈색소의 양을 상대적으로 비교하여 혈액시료 중에서 당화혈색소 농도를 정량하는 단계 (단계 7);를 포함하는 효소법을 이용한 당화혈색소 정량분석 방법을 제공한다.
【유리한 효과】
본 발명에 따른 양쪽이온성 계면활성 및 아질산 화합물을 포함하는 용혈시약 조성물은 상기 양쪽이온성 계면활성제로 인하여 용혈 속도가 현저히 향상될 뿐만 아니라， 용혈되어 나온 혈색소의 N- 말단 β -체인이 혈색소 분자 외부로 노출될 수 있도록 유도하여 가능한 많은 분자가 반웅에 참여할 수 있도록 도와 당화혈색소 반웅감도 및 반웅속도가 향상되고， 상기 아질산 화합물로 인하여 혈색소의 단백질 구조가 유연하게 변형되어 단백질분해효소가 혈색소의 Ν-말단 β -체인 아미노산 서열을 절단하는 것을 용이하게 하여， 전체 측정시간을 획기적으로 단축하고 측정결과의 정확성을 개선하는 효과가 있다.
【도면의 간단한 설명 】
도 1은 본 발명의 실시예 1-3 및 비교예 3에 따른 용혈시약 조성물이 시간경과에 따라 적혈구를 용혈하는 것을 나타내는 그래프이다 (도 1의 그래프에서 시간에 따른 기울기 변화는 적혈구의 용혈과정이 계속 진행되고 있음을 의미하고， 기울기 변화가 없어지는 시간은 용혈과정이 종료된 시간을 나타낸다).
도 2는 비교예 4-8에 따른 용혈시약 조성물이 시간'경과쎄 따라 적혈구를 용혈하는 것을 나타내는 그래프이다 (도 2의 그래프에서 시간에 따른 기울기 변화는 적혈구의 용혈과정 0 계속 진행되고 있음을 의미하고 변화가 없어지는 시간은 용혈과정 0 조료된 시간을 나타낸다).
도 3은 본 발명의 실시예 1-3 및 비교예 1-3에 따른 용혈시약 조성물의 총 혈색소에 대한 반웅감도를 나타내는 그래프이다 (도 3의 그래프에서 기울기가 클수록 총 혈색소에 대한 반응감도가 큰 것을 나타낸다).
도 4는 비교예 4ᅳ 5 및 비교예 8에 따른 용혈시약 조성물의 총 혈색소에 대한 반웅감도를 나타내는 그래프이다 (도 3의 그래프에서 기울기가 클수록 총 혈색소에 대한 반웅감도가 큰 것을 나타낸다).
5는 본 발명의 실시예 1ᅳ3 및 비교예 1에 따른 용혈시약 조성물의 당화혈색소에 대한 반웅감도를 나타내는 그래프이다 (도 5의 그래프에서 기울기가 클수록 당화혈색소에 대한 반웅감도 및 반웅속도가 큰 것을 나타낸다).
도 6은 비교예 2， 4, 5 및 8에 따른 용혈시약 조성물의 당화혈색소에 대한 반웅감도를 나타내는 그래프이다 (도 6의 그래프에서 기울기가 클수록 당화혈색소에 대한 반웅감도 및 큰 것을 나타낸다). 도 7은 본 발명의 실시예 1 및 비교예 10에 따른 용혈시약 조성물의 당화혈색소에 대한 반웅감도를 나타내는 그래프이다' (도 7의 그래프에서 기울기가 클수록 당화혈색소에 대한 반웅감도가 큰 것을 나타낸다).
도 8은 본 발명의 실시예 1 및 비교예 1에 따른 용혈시약 조성물의 당화혈색소에 대한 반웅감도를 나타내는 그래프이다 (도 8의 그래프에서 기울기가 클수록 당화혈색소에 대한 반웅감도가 큰 것을 나타낸다). 【발명의 실시를 위한 최선의 형태】
본 발명에서는 혈액 중 총 혈색소 (total hemoglobin)의 농도에 대한 당화된 혈색소 (glycated hemoglobin)의 상대적 농도를 측정하기 위한 것으로， 특히 개선된 용혈시약 조성물을 사용하여 총 혈색소의 측정 감도 및 당화혈색소의 측정 감도를 향상시키고 측정시간을 감소시키고자 한다 .
상대 농도를 측정하기 위해서는 총 혈색소 (total hemoglobin) 수치와 당화혈색소 (glycated hemoglobin) 수치를 모두 측정해야 한다. 여기서， 총 혈색소 수치는 효소법을 이용하는 당화혈색소 정량분석의 전처리 공정인 용혈과정에서 적혈구로부터 용혈되어 나온 혈색소가 530 nm 부근의 영역에서 특징적인 분광학적 피크가 관찰되는 점을 이용하여 UV/Vis와 같은 분광학 장치를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 당화혈색소 수치는 배경기술에서 상술한 바와 같이 상기 용혈과정을 거친 혈액시료를 단백질분해효소， FP0X(fructosyl peptide oxidase) , POD(peroxidase) 및 기질을 이용한 효소반웅들로 측정할 수 있다.
이하， 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 하기 화학식 1로 나타나는 양쪽이온성 계면활성제 ; 아질산 화합물을 포함하는 효소법을 이용한 당화혈색소 정량분석의 전처리 공정에 사용되는 용혈시약 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure imgf000007_0001
여기서，
R1 및 R2는 각각 독립적으로 d-5의 직쇄 또는 측쇄 알킬이고 ; n은 1-6의 정수이고; H X는 단일결합 또는 이고;
Χ Η 여기서 χ가 인 경우 !„은 의 정수이고， ^는 Cl3의 직쇄 또는 측쇄 알킬이고，
X가 단일결합인 경우 m은 1이고， R3는 C13의 직쇄 또는 측쇄 알킬이다. 바람직하게는,
상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 d-3의 직쇄 또는 측쇄 알킬이고;
n은 1-4의 정수이고;
% Η X는 단일결합 또는 이고;
% Η 여기서 X가 인 경우 m은 1-3의 정수이고， R3는 C13의 직쇄 또는 측쇄 알킬이고,
X가 단일결합인 경우 m은 1이고., R3는 C13의 직쇄 또는 측쇄 알킬이다. 특히 바람직하게는,
상기 화학식 1로 나타나는 양쪽이은성 계면활성제는
, 3ᅳ (디메틸 (3-테트라데칸아미도프로필 )암모니오)프로판ᅳ1ᅳ 설포네이트;
4- (디메틸 (3-테트라데칸아미도프로필)암모니오)부탄ᅳ 1- 설포네이트; 또는
3ᅳ (디메틸 (테트라데실)암모니오)프로판 - 1—설포네이트;이다. 본 발명에 따른 시약 조성물에 있어서， 상기 화학식 1로 나타나는 양쪽이은성 계면활성제는 용혈속도를 증가시키고， 혈색소의 구조를 유연하게 함과 동시에， 전처리 공정 이후의 효소반웅들의 활성을 향상시키는 역할을 한다. 상기 전처리 이후의 효소반웅들은 하기의 효소법을 이용한 당화혈색소 정량분석 방법에서 상세히 설명한다 .
이때， 상기 양쪽이온성 계면활성제는 0.5-1.0 중량 ¾로 첨가하는 것이 바람직하다 . 만약， 상기 양쪽아온성 계면활성제가 0.5 중량 ¾> 미만일 경우에는 용혈 반웅속도가 저하하거나 용혈 반웅이 일어나지 않는 문제가 있고, 1.0 중량 ¾를 초과할 경우에는 용혈 반웅감도가 감소하는 문제가 있다. 본 발명에 따른 시약 조성물에 있어서 , 상기 아질산 화합물은 종래의 기술에서 이미 알려진 바와 같은 총 혈색소 분석을 용이하게 하는 역할을 할 뿐만 아니라， 혈색소의 구조를 유연하게 하므로， 전처리 공정 이후에 단백질분해효소가 당화혈색소의 Nᅳ말단 β -체인의 당一 Val-His-|만을 선택적으로 절단하여 단분자성의 프럭토실 아미노산을 얻는 것을 돕는 역할을 한다.
상기 아질산 화합물로는 소듐 나이트라이트， 포타슘 나이트라이트， 마그네슘 나이트라이트， 칼슘 나이트라이트 등의 아질산 화합물을 단독 또는 흔합하여 사용할 수 있다.
이때， 상기 아질산 화합물은 1-5 mM로 첨가하는 것이 바람직하다ᅳ 만약， 상기 아질산 화합물이 1 mM 미만일 경우에는 혈색소의 단백질 구조를 충분히 유연하게 변형시키지 못하는 문제가 있고， 5 mM을 초과할 경우에는 총 혈색소 농도 측정시 산란이 발생하는 문제가 있다. 또한， 본 발명은 상기 용혈시약 조성물로 적혈구를 용혈시키는 단계 (단계 1);
상기 단계 1에서 적혈구가 용혈되어 나온 총 혈색소의 양을 측정하는 단계 (단계 2);
상기 단계 1에서 적혈구가 용혈되어 나은 당화혈색소를 단백질분해효소가 당화혈색소의 Nᅳ말단 β -체인의 당ᅳ Va卜 His-| 만을 선택적으로 절단하여 단분자성의 프력토실 아미노산을 얻는 단계 (단계 3)；
상기 단계 3에서 얻어진 프럭토실 아미노산올 FPOX ructosyl peptide oxidase)와 반웅시켜 과산화수소를 생성하는 단계 (단계 4) ; 상기 단계 4에서 생성된 과산화수소를 POD(peroxidase)와 반웅시켜 과산화수소를 산화시키는 단계 (단계 5);
상기 단계 5에서 산화된 과산화수소와 기질이 산화.환원 반웅을 일으켜 유도되는 발색의 양을 측정하는 단계 (단계 6); 및
상기 단계 2에서 측정한 총 혈색소의 양과 상기 단계 6에서 측정한 당화혈색소의 양을 상대적으로 비교하여 혈액시료 중에서 · 당화혈색소 농도를 정량하는 단계 (단계 7);를 포함하는 효소법을 이용한 당화혈색소 정량분석 방법을 제공한다. 이하， 본 발명의 효소법을 이용한 당화혈색소 정량분석 방법을 단계별로 상세히 설명한다 . 본 발명에 따른 정량분석 방법에 있어서， 상기 단계 1은 본 발명에 따른 화학식 1로 나타나는 양쪽이온성 계면활성제 및 아질산 화합물을 포함하는 용혈시약 조성물을 이용하여 적혈구를 용혈하는 전처리 단계이다. 이때， 상기 화학식 1로 나타나는 양쪽이온성 계면활성제는 혈색소의 구조를 유연하게 함과 동시에， 단계 1 이후의 효소반웅들의 활성을 향상시키는 역할을 한다.
상기 양쪽이온성 계면활성제는 0.5-1.0 중량 ¾로 첨가하는 것이 바람직하다. 만약， 상기 양쪽이은성 계면활성제가 0.5 중량 ¾» 미만일 경우에는 용혈 반웅속도가 저하하거나 용혈 반웅이 일어나지 않는 문제가 있고， 1.0 중량 %를 초과할 경우에는 용혈 반웅감도가 감소하는 문제가 있다. 또한， 상기 아질산 화합물은 종래의 기술에서 이미 알려진 바와 같은 총 혈색소 분석을 용이하게 하는 역할을 할 뿐만 아니라， 혈색소의 구조를 유연하게 하므로， 전처리 . 공정 이후에 단백질분해효소가 당화혈색소의 N-말단 β -체인의 당ᅳ Va卜 His-| 만을 선택적으로 절'단하여 단분자성의 프럭토실 아미노산을 얻는 것을 돕는 역할을 한다.
상기 아질산 화합물로는 소듐 나이트라이트， 포타슘 나이트라이트， 마그네슘 나이트라이트， 칼슘 나이트라이트 등의 아질산 화합물을 단독 또는 흔합하여 사용할 수 있다.
상기 아질산 화합물은 1-5 mM로 첨가하는 것이 바람직하다 . 만약， 상기 아질산 화합물이 1 mM 미만일 경우에는 혈색소의 단백질 구조를 충분히 유연하게 변형시키지 못하는 문제가 있고, 5 mM을 초과할 경우에는 총 혈색소 농도 측정시 산란이 발생하는 문제가 있다 본 발명에 따른 정량분석 방법에 있어서 , 상기 단계 2는 단계 1에서 적혈구가 용혈되어 나은 총 혈색소의 양을 측정하는 단계이다. 구체적으로 , 총 혈색소 수치는 상기 단계 1의 용혈과정에서 적혈구로부터 용혈되어 나온 혈색소가 530 nm 부근의 영역에서 특징적인 분광학적 피크가 관찰되는 점을 이용하여 UV/Vis와 같은 분광학 장치를 이용하여 측정할 수 있다 . 본 발명에 따른 정량분석 방법에 있어서， 상기 단계 3은 상기 단계 1에서 적혈구가 용혈되어 나은 당화혈색소를 단백질분해효소가 당화혈색소의 N-말단 β -체인의 당ᅳ 卜^ᅳ I만을 선택적으로 절단하여 단분자성의 프럭토실 아미노산을 얻는 단계이다.
상기 단백질분해효소로는 바실러스속， 아스페르길러스속， 스트렙토마이세스속, 이들 미생물의 유전자 재조합으로부터 유래된 단백질분해효소 등을 단독 또는 흔합하여 사용할 수 있디-.
이때， 상기 단백질분해효소는 500-1000 U/mL로 첨가하는 것이 바람직하다ᅳ 만약， 상기 단백질분해효소가 500 u/mL 미만일 경우에는 전체 반웅의 감도가 작아지는 문제가 있고， 1000 U/mL를 초과할 경우에는 함께 사용되는 효소도 함께 분해되어 반웅성이 저하하는 문제가 있다.
본 발명에 따른 정량분석 방법에 있어서， 상기 단계 4는 상기 단계 3에서 얻어진 프럭토실 아미노산을 FPOX(fructosyl peptide oxidase)와 반웅시켜 과산화수소 ( 02)를 생성하는 단계이다.
이때， 상기 FP0X는 1.0 U/mL 이상 첨가하는 것이 바람직하다. 만약， 상기 FP0X가 1.0 U/mL 미만일 경우에는 전체 반웅의 감도가 작아지는 문제가 있다.
본 발명에 따른 정량분석 방법에 있어서， 상기 단계 5는 상기 단계 4에서 생성된 과산화수소를 POD(peroxidase)와 반웅시켜 과산화수소를 산화시키는 단계이다.
이때 , 상기 P0D는 5-20 U/mL로 첨가하는 것이 바람직하다. 만약， 상기 P0D가 5 U/mL 미만일 경우에는 전체 반웅의 감도가 저하하는 문제가 있고， 20 U/mL를 초과할 경우에는 효소 자체가 가지고 있는 색상이 혈색소의 색상과 유사하여 당화혈색소 농도 측정에 방해 요인이 되는 문제가 있다.
본 발명에 따른 정량분석 방법에 있어서， 상기 단계 6은 상기 단계 5에서 산화된 과산화수소와 기질이 산화.환원 반웅을 일으켜 유도되는 발색의 양을 측정하는 단계이다.
이때， 상기 기질은 상기 P0D에 의해 생성되는 산화된 과산화수소와 산화.환원 반웅을 통해 발색반웅을 일으키는 역할을 하는 것으로， DA-67, DA-64 등의 염료를 사용할 수 있다.
이때， 상기 기질은 0.12 niM 미만으로 첨가하는 것이 바람직하다. 만약，. 상기 기질이 0.12 mM을 초과할 경우에는 자발적 색변화가 일어나 분광학적 측정에 오차를 유발하는 문제가 있다. 상기 기질은 외부 및 온도에 의해 자발적으로 변색되는 불안정한 물질이므로 사용에 특별한 주의가 요구된다.
본 발명에 따른 정량분석 방법에 있어서， 상기 단계 7은 상기 단계 2에서 측정한 총 혈색소의 양과 상기 단계 6에서 측정한 당화혈색소의 양을 상대적으로 비교하여 혈액시료 중에서 당화혈색소 농도를 정량하는 단계이다.
구체적으로, 상기 총 혈색소 양에 대한 당화혈색소의 양을 백분율로 계산하여 나타낼 수 있다.
이때 상기 ᅵ단계 2의 총 혈색소 양 측정 및 단계 6의 당화혈색소 양 측정은 UV/Vis 등과 같은 분광학적 장치를 이용하여 측정할 수 있다.
상술한 바와 같이 , 본 발명에 따른 양쪽이온성 계면활성 및 아질산 화합물을 포함하는 용혈시약 조성물은 상기 양쪽이온성 계면활성제로 인하여 용혈 속도가 현저히 향상될 뿐만 아니라， 용혈되어 나온 혈색소의 N-말단 β -체인이 혈색소 분자 외부로 노출될 수 있도록 유도하여 가능한 많은 분자가 반응에 참여할 수 있도록 도와 당화혈색소 반웅감도 및 반웅속도가 향상되고, 상기 아질산 화합물로 인하여 혈색소의 단백질 구조가 유연하게 변형되어 단백질분해효소가 혈색소의 Ν-말단 β -체인 아미노산 서열을 절단하는 것을 용이하게 하여， 전체 측정시간을 획기적으로 단축하고 측정결과의 정확성을 개선하는 효과가 있다.
【발명의 실시를 위한 형태 】
이하， 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<제조예 1> 당화혈색소 정량분석의 전처리공정 이후에 사용하는 효소반웅 조성물의 제조
100 iiiM MES 버퍼에 단백질분해효소로 800 U/mL의 미생물 유래 프로테아제， FPOX(fructosyl peptide oxidase) 1 U/mL, POD(peroxidase) 10 U/mL 및 기질로 0.12 mM의 DA-67(염료)을 함께 흔합하여 당화혈색소 정량분석의 용혈과정인 전처리공정 이후에 사용하는 효소반웅을 위한 조성물을 제조하였다.
<실시예 1> 당화혈색소 정량분석의 전처리공정에 사용하는 용혈시약 조성물의 제조 1
100 mM MES 버퍼에 계면활성제로 3— (디메틸 (3- 테트라데칸아미도프로필)암모니오)프로판 -1-설포네이트 0.75 mg/niL와 아질산 화합물로 2 mM의 NaN02를 함께 흔합하여 용혈시약 조성물 1을 제조하였다.
<실시예 2> 당화혈색소 정량분석의 전처리공정에 사용하는 용혈시약 조성물의 제조 2
실시예 1에서 사용한 계면활성제 대신에 4- (디메틸 (3- 테트라데칸아미도프로필)암모니오)부탄 -1-설포네이트 0.75 mg/mL을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 수행하여 용혈시약 조성물 2를 제조하였다.
<실시예 3> 당화혈색소 정량분석의 전처리공정에 사용하는 용혈시약 조성물의 제조 3
실시예 1에서 사용한 계면활성제 대신에 3-
(디메틸 (테트라데실)암모니오)프로판ᅳ 1-설포네이트 0.75 rag/mL을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 수행하여 용혈시약 조성물 3을 제조하였다.
<비교예 1> 당화혈색소 정량분석의 전처리공정에 사용하는 용혈시약 조성물의 제조 4
실시예 1에서 사용한 계면활성제 대신에 정제수를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 수행하여 용혈시약 조성물 4를 제조하였다. <비교예 2> 당화혈색소 정량분석의 전처리공정에 사용하는 용혈시약 조성물의 제조 5
실시예 1에서 사용한 계면활성제 대신에 2ᅳ (6ᅳ (도데실옥시 ) - 4 , 5—디히드록시 -2- (디히드록시메틸) -테트라히드로 -2H-피란 -3-일옥시 ) - 6- (히드록시메틸)ᅳ테트라히드로 -2H-피 란ᅳ 3, 4, 5-트리을 0.75 mg/mL을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 수행하여 용혈시약 조성물 5를 제조하였다.
<비교예 3> 당화혈색소 정량분석의 전처리공정에 사용하는 용혈시약 조성물의 제조 6
실시예 1에서 사용한 계면활성제 대신에 4ᅳ
(도데실디메틸암모니오)부타노에이트 0.75 mg/mL을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 수행하여 용혈시약 조성물 6을 제조하였다. '
<비교예 4> 당화혈색소 정량분석의 전처리공정에 사용하는 용혈시약 조성물의 제조 7
실시예 1에서 사용한 계면활성제 대신에 3-((3-(4-헵틸페닐) -3- 히드록시프로필 )디메틸암모니오)프로판 -1ᅳ설포네이트 0.75 mg/mL을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 수행하여 용혈시약 조성물 7을 제조하였다.
<비교예 5> 당화혈색소 정량분석의 전처리공정에 사용하는 용혈시약 조성물의 제조 8
실시예 1에서 사용한 계면활성제 대신에 3- (디메틸 (3- 팔미트아미도프로필)암모나오)프로판 -1-설포네이트 0.75 mg/mL을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 수행하여 용혈시약 조성물 8을 제조하였다. <비교예 6> 당화혈색소 정량분석의 전처리공정에 사용하는 용혈시약 조성물의 제조 9 '
실시예 1에서 사용한 계면활성제 대신에 3- (디메틸 (옥틸 )암모니오)프로판 -1ᅳ설포네이트 0.75 mg/mL을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 수행하여 용혈시약 조성물 9를 제조하였다.
<비교예 7> 당화혈색소 정량분석의 전처리공정에 사용하는 용혈시약 조성물의 제조 10
실시예 1에서 사용한 계면활성제 대신에 3ᅳ (데실디메틸암모니오)프로판 -1-설포네이트 0.75 mg/mL을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 수행하여 용혈시약 조성물 10을 제조하였다. <비교예 8> 당화혈색소 정량분석의 전처리공정에 사용하는 용혈시약 조성물의 제조 11
실시예 1에서 사용한 계면활성제 대신에 3-
(도데실디메틸암모니오)프로판 -1-설포네이트 0.75 mg/mL을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 수행하여 용혈시약 조성물 11을 제조하였다.
<비교예 9> 당화혈색소 정량분석의 전처리공정에 사용하는 용혈시약 조성물의 제조 12
실시예 1에서 사용한 계면활성제 대신에 3-
(핵사데실디메틸암모니오)프로판 -1-설포네이트 0.75 mg/mL을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 수행하여 용혈시약 조성물 12를 제조하였다. <비교예 10> 당화혈색소 정량분석의 전처리공정에 사용하는 용혈시약 조성물의 제조 13
아질산 화합물로 2 mM의 NaN02를 사용하지 않은 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 수행하여 용혈시약 조성물 13을 제조하였다. 상기 실시예 1-3 및 비교예 1-9에서 사용한 양쪽이은성 계면활성제의 화학구조식을 하기 표 1에 나타내었다.
【표 11
Figure imgf000014_0001
Figure imgf000015_0001
<실험예 1> 계면활성제의 용해도 평가
계면활성제를 사용하기 위해서는 시료 자체의 용해도가 우수해야 한다. 이에， 일차적으로 용해되지 않는다면 사용자체가 불가능하므로 사용의 전제조건으로 계면활성의 용해도를 평가하였다. 구체적으로， 0.75 mg/ml 농도가 되도록 실시예 1ᅳ 3 및 비교예 1-9에서 사용한 계면활성제를 증류수에 용해시켜 용해 여부를 판단하였고 , 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
【표 2】
Figure imgf000016_0001
표 2에 나타난 바와 같이， 비교예 9를 제외한 모든 계면활성제가 0.75 mg/ml 농도에서 용해되어 시약 조성물에 사용하기 적합한 것을 알 수 있었다 .
본 실험의 결과로 비교예 9의 용혈시약 조성물을 다음 실험 후보군에서 제외하였다. <실험예 2> 용혈 속도 평가
실시예 1ᅳ3 및 비교예 1-8에서 제조한 용혈시약 조성물의 용혈 속도를 알아보기 위하여 다음과 같이 실험하였다.
구체적으로， 실시예 1-3 및 비교예 1-8에서 제조한 용혈시약 조성물을 혈액과 1:400(혈액 :용혈시약)으로 5분 동안 반웅시켰다. UV/Vis 장치 (모델명 : UV-1800, 제조사: Shimadzu)를 이용하여 0—5분 사이의 흡광도 변화 (530 nm에서 )를 측정하였고， 그 결과를 도 1， 또 2 및 하기 표 3에 나타내었다.
이때， 하기 표 3에 나타낸 수치의 경우 1분의 흡광도 수치에서 30초의 흡광도 수치를 뺀 절대값으로， 용혈 속도가 빨라 0.5~1분 이내로 충분히 용혈이 완료된다면， 그 수치가 거의 0에 가깝게 나타나고， 반웅이 느리다면 상대적으로 큰 값을 나타낸다.
【표 3]
Figure imgf000016_0002
Figure imgf000017_0001
도 1은 본 발명의 실시예 1-3 및 비교예 1 3에 따른 용혈시약 조성물이 시간경과에 따라 적혈구를 용혈하는 것을 나타내는 그래프이다 (도 1의 그래프에서 시간에 따른 기울기 변화는 적혈구의 용혈과정이 계속 진행되고 있음을 의미하고， 기울기 변화가 없어지는 시간은 용혈과정이 종료된 시간을 나타낸다).
도 2는 비교예 4-8에 따른 용혈시약 조성물이 시간경과에 따라 적혈구를 용혈하는 것을 나타내는 그래프이다 (도 2의 그래프에서 시간에 따른 기울기 변화는 적혈구의 용혈과정 o 계속 진행되고 있음을 의미하고, 기울기 변화가 없어지는 시간은 용혈과정이 종료된 시간을 나타낸다).
표 3 및 도 1-2에 나타난 바와 같이， 실시예 1-3에서 제조한 용혈시약 조성물이 약 1분 이내로 빠른 용혈속도를 나타낸다는 것과ᅳ 시간 경과에 따른 기울기 변화가 절혈구의 용혈과 -정이 계속 진 있음을 의미한다는 관점에서 기울기 변화가 거의 없는 안 시그널을 보이는 것을 확인할 수 있었다. 특히， 실시예 3에서
용혈시약 조성물이 가장 빠른 용혈속도를 나타내는 것을 알 수 .행정제있
조실되적었 본 실험의 결과로 비교예 6-7의 용혈시약 조성물을 다^
고한다험인 후보군에서 제외하였다. <실험예 3> 총 혈색소 반웅감도 평가
효소법을 이용하여 당화혈색소 상대 농도를 측정하기 위해서 함께 측정해야 하는 항목인 총 혈색소 (total hemoglobin) 농도의 측정이 필요하다. 이를 위해， 총 혈색소에 대한 반웅감도가 중요하다. 본 발명에 따른 용혈시약 조성물이 총 혈색소 반웅감도에 미치는 영향을 알아보기 위하여 다음과 같아 실험하였다.
구체적으로， 총 혈색소 농도가 서로 다른 3개의 혈액 샘플 (10.5 g/dL, 13.4 g/dL, 15.6 g/dL)을 준비하고 ; 상기 혈액 샘플 각각을 실시예 1-3, 비교예 1-5 및 비교예 8에서 제조한 용혈시약 조성물과 1:400(혈액 :용혈시약)의 비율로 1분 동안 반웅시킨 다음， 530 醒 파장의 흡광도를 실험예 2에서 사용한 것과 동일한 UV/Vis 장치를 이용하여 측정하였고， 그 결과를 도 3ᅳ4에 나타내었다. 또한, 도 3- 4에서 총 혈색소 반웅감도를 나타내는 그래프의 기울기를 하기 표 4에 나타내었다. ^ 【표 4】
Figure imgf000018_0001
도 3은 본 발명의 실시예 1-3 및 비교예 1-3에 따른 용혈시약 조성물의 총 혈색소에 대한 반웅감도를 나타내는 그래프이다 (도 3의 그래프에서 기울기가 클수톡 총 혈색소에 대한 반웅감도가 큰 것을 나타낸다).
도 4는 비교예 4-5 및 비교예 8에 따른 용혈시약 조성물의 총 혈색소에 대한 반웅감도를 나타내는 그래프이다 (도 3의 그래프에서 기을기가 클수록 총 혈색소에 대한 반웅감도가 큰 것을 나타낸다).
표 4 및 도 3-4에 나타난 바와 같이 , 비교예 1의 경우 총 혈색소 반응감도가 낮은 것으로 나타났다. 반면， 실시예 1-3, 비교예 5 및 비교예 8의 경우 총 혈색소 반웅감도가.우수한 것을 확인할 수
<실험예 4> 계면활성제와 기질의 반응성 평가
기질은 효소반웅을 통해 생성되는 과산화수소와 퍼옥시다아제의 반웅을 통해서 발색이 되어야 정확한 정량분석이 가능하지만， 기질과 계면활성제의 반응을 통해서 발색되어 정량분석에 오차를 가져오는 경우가 있다. 이에， 계면활성제와 기질간의 반웅성을 알아보기 위하여 다음과 같이 실험하였다.
구체적으로, 실시예 1-3 및 비교예 1 , 2 , 4， 5， 8에서 제조한 용혈시약을 혈액샘플과 반웅시키지 않고 , 실시예 2에서 사용한 UV/Vis 장치로 흡광도를 분석하였다.
분석한 결과， 실시예 1ᅳ 3 및 비교예 1, 2， 4， 5, 8에서 제조한 용혈시약에 포함된 계면활성제 모두 기질과 반웅하지 않아 정량분석 용도로 적합한 것을 확인하였다.
<실험예 5> 당화혈색소 반웅감도 및 반응속도 평가
효소법을 이용하여 당화혈색소의 농도를 정량할 경우 당화혈색소에 대한 반웅감도와 반웅속도가 우수하여야 한다. 이에， 본 발명에 따른 용혈시약 조성물이 당화혈색소 반웅감도 및 반웅속도에 미치는 영향을 알아보기 위하여 다음과 같이 실험하였다. . 구체적으로， 반응감도의 경우 당화혈색소 농도가 서로 다른 4개의 혈액 샘플 (72 μ M, 120 μ Μ, 152 μ Μ, 264 μ Μ)을 준비하고， 상기 혈액 샘플 각각을 실시예 1ᅳ 3 및 비교예 1, 2, 4, 5， 8에서 제조한 용혈시약 조성물과 1:400(혈액 :용혈시약)의 비율로 1분 동안 반웅시킨 후에， 다음 공정으로 제조예 1에서 준비한 효소반응용 조성물에 넣고 2-3분 동안 반웅시켜 당화혈색소를 측정하였다.
상기에서 당화혈색소의 측정은 제조예 1에서 준비한 효소반웅 조성물 중에서 기질로 사용한 DA-67(제조사: Wako)이 특이적으로 방출하는 파장 영역인 633 nm에서의 흡광도를 실험예 2에서 사용한 것과 동일한 UV/Vis 장치를 이용하여 측정하였고， 그 결과를 도 5-6에 나타내었다. 또한， 도 5ᅳ6에서 당화혈색소 반웅감도를 나타내는 그래프의 기울기를 하기 표 5에 나타내었다 .
【표 5】
Figure imgf000019_0001
도 5는 본 발명의 실시예 1ᅳ3 및 비교예 1에 따른 용혈시약 조성물의 당화혈색소에 대한 반웅감도를 나타내는 그래프이다 (도 5의 그래프에서 기울기가 클수록 당화혈색소에 대한 반응감도 및 반웅속도가 큰 것을 나타낸다).
도 6은 비교예 2， 4， 5 및 8에 따른 용혈시약 조성물의 당화혈색소에 대한 반웅감도를 나타내는 그래프이다 (도 6의 그래프에서 기울기가 클수록 당화혈색소에 대한 반응감도 및 반웅속도가 큰 것을 나타낸다). 또한， 당화혈색소에 대한 반웅속도를 알아보기 위하여 다음과 같이 실험하였다.
구체적으로, 단위 시간당 반응감도로 반응속도를 비교하였다. 총 반웅시간을 3분으로 고정하였을 때 각 용혈시약에서 나타나는 기울기로 반응속도를 비교하였다. 도 5 및 도 6의 그래프에서 기을기를 반응속도로 볼 수 있는 이유로는， 용혈 및 효소 반웅속도 두 반웅 중 어느 하나의 반웅속도가 느리더라도 전체 반응속도가 느려 반웅 기울기가 작게 나오기 때문이다.
표 5 및 도 5-6에 나타난 바와 같이， 비교예 1의 경우 당화혈색소에 대한 반웅감도가 반응시간 3분 안에 거의 나타나지 않는 것을 알 수 있었다. 반면에 , 실시예 1-3의 경우 검정곡선의 기울기가 0.09-0.1 정도의 큰 값을 나타내는 것을 알 수 있었다. 특히 , 실시예 1-3에서 사용한 계면활성제의 경우 꼬리 체인의 길이가 모두 탄소 14개로 이루어진 분자구조적 공통점을 확인할 수 있었다. 이것은 상기 꼬리 체인의 길이가 탄소 14개로 이루어진 계면활성제들이 당화혈색소와 효소가 반웅을 쉽게 일으키도록 도움을 주는 것으로 사료된다.
<실험예 6> 당화혈색소 반웅감도에 아질산 화합물이 미치는 영향 평가
보통 아질산 화합물은 총 혈색소를 측정하기 위해 사용하는 물질로 알려져 있다. 하지만, 본 발명에서는 아질산 화합물의 산화제 성질뿐만 아니라， 당화혈색소를 측정하는 효소법에 있어서 용혈된 혈색소의 단백질 구조를 유연하게 변화시켜 단백질분해효소가 시퀀스의 절단을 용이하게 도와주는 보조적 성질을 제공하는 역할을 하는 것을 알아보기 위하여 다음과 같이 실험하였다.
구체적으로， 당화혈색소 농도가 서로 다른 3개의 혈액 샘플 (52 u M, 98 u M, 125 μΜ)을 준비하고， 상기 혈액 샘플 각각을 실시예 1 및 비교예 10(실시예 1의 조성물에서 아질산 화합물을 제외 )에서 제조한 용혈시약 조성물과 1:400(혈액 :용혈시약)의 비율로 1분 동안 반웅시킨 후에， 다음 공정으로 제조예 1에서 준비한 효소반웅용 조성물에 넣고 3분 동안 반웅시켜 당화혈색소를 측정하였다.
상기에서 당화혈색소의 측정은 제조예 1에서 준비한 효소반웅 조성물 중에서 기질로 사용한 DA-67(제조사: Wako)이 특이적으로 방출하는 파장 영역인 633 nm에서의 흡광도를 실험예 2에서 사용한 것과 동일한 UV/Vis 장치를 이용하껴 측정하였고 , 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7은 본 발명의 실시예 1 및 비교예 10에 따른 용혈시약 조성물의 당화혈색소에 대한 반웅감도를 나타내는 그래프이다 (도 7의 그래프에서 기울기가 클수록 당화혈색소에 대한 반웅감도가 큰 것을 나타낸다).
도 7에 나타난 바와 같이， 실시예 1에서 제조한 용혈시약 조성물을 사용할 경우 당화혈색소에 대한 반웅감도 (검정곡선의 기울기 )는 0.10386으로 나타난 반면에， '비교예 10에서 제조한 용혈시약을 사용할 경우 당화혈색소에 대한 반웅감도는 0.02169로 나타나 약 5배 정도 큰 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 아질산 화합물로 인하여 혈색소의 단백질 구조가 유연하게 변형되어 단백질분해효소가 혈색소의 N-말단 β-체인 아미노산 서열을 절단하는 것을 도와주기 때문인 것으로 사료된다.
<실험예 7> 당화혈색소 반웅감도에 계면활성제가 미치는 영향 평가
본 발명에서 사용되는 계면활성제가 용혈되어 나온 혈색소의 Ν— 말단 -체인이 혈색소 분자 외부로 노출될 수 있도록 유도하여 가능한 많은 분자가 반웅에 참여할 수 있도록 도와 당화혈색소 반웅감도에 영향을 미치는지 알아보기 위하여 다음과 같이 실험하였다. 구체적으로， 당화혈색소 농도가 서로 다른 4개의 혈액 샘폴 (72 μ M, 120 μΜ, 152 μ Μ, 264 μ Μ)을 준비하고， 상기 혈액 샘플 각각을 실시예 1 및 비교예 1(실시예 1의 조성물에서 계면활성제를 제외 )에서 제조한 용혈시약 조성물과 1:400(혈액 :용혈시약)의 비율로 1분 동안 반응시킨 후에， 다음 공정으로 제조예 1에서 준비한 효소반웅용 조성물에 넣고 3분 동안 반응시켜 당화혈색소를 측정하였다.
상기에서 당화혈색소의 측정은 제조예 1에서 준비한 효소반웅 조성물 증에서 기질로 사용한 DA-67(제조사: Wako)이 특이적으로 방출하는 파장 영역인 633 nm에서의 흡광도를 실험예 2에서 사용한 것과 동일한 UV/Vis 장치를 이용하여 측정하였고 , 그 결과를 도 8에 나타내었다.ᅳ
도 8은 본 발명의 실시예 1 및 비교예 1에 따른 용혈시약 조성물의 당화혈색소에 대한 반웅감도를 나타내는 그래프이다 (도 8의 그래프에서 기울기가 클수록 당화혈색소에 대한 반웅감도가 큰 것을 나타낸다).
도 8에 나타난 바와 같이 , 실시예 1에서 제조한 용혈시약 조성물을 사용할 경우 . 당화혈색소에 대한 반응감도 (검정곡선의 기울기 )는 0.13209으로 나타난 반면에， 비교예 1에서 제조한 용혈시약을 사용할 경우 당화혈색소에 대한 반웅감도는 0.00459로 나타나 약 30배 정도 큰 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 양쪽이온성 계면활성제가 용혈되어 나온 혈색소의 Nᅳ말단 β -체인이 혈색소 분자 외부로 노출될 수 있도록 유도하여 가능한 많은 분자가 반웅에 참여할 수 있도록 도와주기 때문인 것으로 사료된다. 【산업상 이용가능성 】 ' 본 발명에 따른 양쪽이은성 계면활성 및 아질산 화합물을 포함하는 용혈시약 조성물은 상기 양쪽이온성 계면활성제로 인하여 용혈 속도가 현저히 향상될 뿐만 아니라， 용혈되어 나온 혈색소의 Ν- 말단 β—체인이 혈색소 분자 외부로 노출될 수 있도특 유도하여 가능한 많은 분자가 반웅에 참여할 수 있도록 도와 당화혈색소 반응감도 및 반웅속도가 향상되고， 상기 아질산 화합물로 인하여 혈색소의 단백질 구조가 유연하게 변형되어 단백질분해효소가 혈색소의 Ν-말단 βᅳ체인 아미노산 서열을 절단하는 것을 용이하게 하여， 전체 측정시간을 획기적으로 단축하고 측정결과꾀 정확성을 개선하는 효과가 있으므로, 당화혈색소 정량분석용 용혈시약 조성물로 유용할 수 있다.

Claims

【청구의 범위 】 【청구항 1】 하기 화학식 1로 나타나는 양쪽이온성 계면활성제 ; 및 아질산 화합물을 포함하는 효소법을 이용한 당화혈색소 정량분석의 전처리 공정에 사용되는 용혈시약 조성물:
[화학식 1]
Figure imgf000022_0001
R1 및 R 각각 독립적으로 d-5의 직쇄 또는 측쇄 알킬이고; n은 1-6의 정수이고；
Χ Η X는 단일결합 또는 이고;
Figure imgf000022_0002
여기서 X가 인 경우 m은 1-3의 정수이고， R3는 C13의 직쇄 또는 측쇄 알킬이고，
X가 단일결합인 경우 ni은 1이고， R3는 C13의 직쇄 또는 측쇄 알킬이다) .
【청구항 2】
제 1항에 있어서，
상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 d-3의 직쇄 또는 측쇄 알킬이고;
n은 1-4의 정수이고;
H X는 단일결합 또는 이고;
Figure imgf000022_0003
여기서 X가 인 경우 m은 1-3의 정수이고, R3는 C13의 직쇄 또는 측쇄 알킬이고，
X가 단일결합인 경우 m은 1이고, R3는 C13의 직쇄 또는 측쇄 알킬인 것을 특징으로 하는 효소법을 이용한 당화혈색소 정량분석의 전처리 공정에 사용되는 용혈시약 조성물.
【청구항 3】 제 1항에 있어서ᅳ
상기 화학식 1로 나타나는 양쪽이온성 계면활성제는
3ᅳ (디메틸 (3-테트라데칸아미도프로필)암모니오)프로판 -1— 설포네이트;
4ᅳ (디메틸 (3ᅳ테트라데칸아미도프로필)암모니오)부탄 -1- 설포네이트; 또는
3- (디메틸 (테트라데실)암모니오)프로판 -1-설포네이트 ;인 것을 특징으로 하는 효소법을 이용한 당화혈색소 정량분석의 전처리 공정에 사용되는 용혈시약 조성물.
【청구항 4】
： 제 1항에 있어서 ,
상기 아질산 화합물은 소듐 나이트라이트, 포타슘 나이트라이트 , 마그네슘 나이트라이트 및 칼슘 나이트라이트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 효소법을 이용한 당화혈색소 정량분석의 전처리 공정에 사용되는 용혈시약 조성물.
【청구항 5】
제 1항에 따른 용혈시약 조성물로 적혈구를 용혈시키는 단계 (단계 1);
상기 단계 1에서 적혈구가 용혈되어 나온 총 혈색소의 양을 측정하는 단계 (단계 2);
당ᅳ Valᅳ His-| 상기 단계 1에서 적혈구가 용혈되어 나은 당화혈색소를 단백질분해효소가 당화혈색소의 Nᅳ말단 β -체인의 만을 선택적으로 절단하여 단분자성의 프럭토실 아미노산을 얻는 단계 (단계 3)；
상기 단계 3에서 얻어진 프럭토실 아미노산을 FPOX ructosyl peptide oxidase)와 반웅시켜 과산화수소를 생성하는 단계 (단계 4);
상기 단계 4에서 생성된 과산화수소를 POD(peroxidase)와 반웅시켜 과산화수소를 산화시키는 단계 (단계 5);
상기 단계 5에서 산화된 과산화수소와 기질이 산화.환원 반웅을 일으켜 유도되는 발색의 양을 측정하는 단계 (단계 6); 및
상기 단계 2에서 측정한 총 혈색소의 양과 상기 단계 6에서 측정한 당화혈색소의 양을 상대적으로 비교하여 혈액시료 중에서 당화혈색소 농도를 정량하는 단계 (단계 7);를 포함하는 효소법을' 이용한 당화혈색소 정량분석 방법 .
【청구항 6】
제 5항에 있어서 ,
상기 단백질분해효소는 바실러스속， 아스페르길러스속， 스트랩토마이세스속 및 이들 미생물의 유전자 재조합으로부터 유래된 단백질분해효소로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 효소법을 이용한 당화혈색소 정량분석 방법 .
【청구항 7】
제 5항에 있어서，
상기 단계 2의 총 혈색소 양 측정 및 단계 6의 당화혈색소 양 측정은 광학적 센서를 이용하는 것을 특징으로 하는 효소법을 이용한 당화혈색소 정량분석 방법ᅳ
【청구항 8】
제 5항에 있어서，
상기 화학식 1의 양쪽이온성 계면활성제는 적혈구의 용혈 속도를 증가시키고， 효소반웅의 활성을 향상시키는 것을 특징으로 하는 효소법을 이용한 당화혈색소 정량분석 방법 . 【청구항 9】
제 5항에 있어서，
상기 아질산 화합물은 혈색소의 단백질 구조를 유연하게 하여 단백질분해효소의 활성을 향상시키는 것을 특징으로 하는 효소법을 이용한 당화혈색소 정량분석 방법 .
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