WO2013115322A1 - 細胞の保存方法 - Google Patents

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WO2013115322A1
WO2013115322A1 PCT/JP2013/052229 JP2013052229W WO2013115322A1 WO 2013115322 A1 WO2013115322 A1 WO 2013115322A1 JP 2013052229 W JP2013052229 W JP 2013052229W WO 2013115322 A1 WO2013115322 A1 WO 2013115322A1
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WO
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cells
cell
solution
preservation
hsa
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Application number
PCT/JP2013/052229
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English (en)
French (fr)
Inventor
美津子 出野
文代 酒井
彰子 加藤
芽衣子 神
有花 廣田
信子 村木
泰弘 戸坂
榎　竜嗣
峰野　純一
Original Assignee
タカラバイオ株式会社
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/04—Preserving or maintaining viable microorganisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A01N1/0226—Physiologically active agents, i.e. substances affecting physiological processes of cells and tissue to be preserved, e.g. anti-oxidants or nutrients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
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    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/0231—Chemically defined matrices, e.g. alginate gels, for immobilising, holding or storing cells, tissue or organs for preservation purposes; Chemically altering or fixing cells, tissue or organs, e.g. by cross-linking, for preservation purposes

Definitions

  • the present invention relates to a cell storage method and a storage solution for use in the method.
  • non- Patent Document 1 when cells are cryopreserved, the act of preserving itself can damage the cells, and after thawing the frozen cell solution, cell viability and bioactivity are reduced (eg, non- Patent Document 1). For this reason, as a result, the necessary number of cells that can be expected to be effective for treatment of the patient cannot be secured and administration cannot be performed, and the physiological activity is also reduced, so that the expected effect can not be obtained even if administered to the patient. There is a problem that a case can occur. In particular, cells such as natural killer cells (NK cells) are usually cryopreserved, but they are still poorly preserved and preserved when stored in an unfrozen state using a cell culture medium to enhance the preservation effect. Although the property is improved, there is a problem that aggregation occurs.
  • NK cells natural killer cells
  • An object of the present invention is to provide a cell preservation method capable of maintaining a high survival rate and physiological activity, and a preservation solution having an essential composition for use in the preservation.
  • the present inventors have found a large amount of components in order to find a preservation solution that can be preserved in a state where high survival rate and physiological activity are maintained in cells that are difficult to preserve such as NK cells.
  • a solution containing sodium salt, potassium salt, saccharide, and protein as active ingredients or sodium salt, potassium salt, saccharide, bicarbonate and / or carbonate
  • cells can be stored at refrigeration or at room temperature while maintaining high survival rate and physiological activity without cryopreservation.
  • the present inventors have found that cell aggregation hardly occurs and completed the present invention.
  • the present invention (1) A method for preserving cells, comprising preserving cells in a solution containing sodium salt, potassium salt, saccharide, and protein as active ingredients, (2) The storage method of (1), wherein the solution of (1) further contains hydrogen carbonate and / or carbonate as an active ingredient, (3) The preservation method according to (1) or (2), wherein the saccharide in the solution is at least one saccharide selected from the group consisting of glucose, galactose, fructose, mannose, xylose, and arabinose, (4) The storage method according to any one of (1) to (3), wherein the protein in the solution is a biological protein.
  • a method for preserving cell aggregation (1) to (5), and (9) a preservative solution for (6) and (7) for inhibiting cell aggregation Provided, (10) A method for inhibiting cell aggregation during storage, comprising storing cells in a solution containing sodium salt, potassium salt, saccharide, and protein as active ingredients, (11) The aggregation suppression method according to (10), wherein the solution of (10) further contains hydrogen carbonate and / or carbonate as an active ingredient, (12) The method for inhibiting cell aggregation according to (10) or (11), wherein the saccharide in the solution is at least one saccharide selected from the group consisting of glucose, galactose, fructose, mannose, xylose, and arabinose.
  • a cell storage method capable of storing cells while maintaining high survival rate and physiological activity. Moreover, the cell preservation solution used for the said method is provided.
  • the present invention relates to a solution containing sodium salt, potassium salt, saccharide, and protein as active ingredients, or a solution containing sodium salt, potassium salt, saccharide, bicarbonate and / or carbonate, and protein as active ingredients.
  • a method for preserving cells comprising suspending cells therein and refrigeration or room temperature preservation of the obtained cell suspension. That is, in one embodiment of the solution used in the storage method of the present invention (the storage solution of the present invention), sodium salt, potassium salt, saccharide, and protein are substantially necessary and sufficient components.
  • sodium salts, potassium salts, sugars, bicarbonates and / or carbonates, and proteins are substantially necessary and sufficient components.
  • the preservation solution of the present invention may contain substances that are harmless to cells, such as vitamins and amino acids.
  • a buffer component such as phosphate ion may be contained, but from the viewpoint of administering the cells after storage to a living body as they are, the amount of components other than the active ingredient is reduced. Is preferred.
  • the preservation solution of the present invention essentially contains only sodium salt, potassium salt, saccharide and protein, or essentially sodium salt, potassium salt, saccharide, bicarbonate and / or carbonate and protein alone as active ingredients. It is preferable to contain as.
  • the “active ingredient” means an ingredient capable of substantially preserving cells alone or in combination while maintaining high survival rate and physiological activity.
  • the “sodium salt” is not particularly limited as long as it generates sodium ions when dissolved in a solvent, such as an oxo acid salt, halide, oxide, hydroxide, inorganic salt, or organic acid salt. Can be used.
  • sodium chloride is preferably used as one type, and a combination of sodium chloride and sodium bicarbonate, or a combination of sodium chloride, sodium bicarbonate, and sodium citrate is preferably used as a plurality of types.
  • the sodium salt content is preferably 0.001 to 10 mol / L, more preferably 0.005 as the final concentration in the preservation solution of the present invention, that is, as the final concentration of all sodium ions contained in the preservation solution of the present invention. -5 mol / L, more preferably 0.01-3 mol / L.
  • the “potassium salt” is not particularly limited as long as it generates potassium ions when dissolved in a solvent, such as oxo acid salt, halide, oxide, hydroxide, inorganic salt or organic acid salt. Can be used.
  • oxo acid salts include potassium nitrate (KNO 3 ), potassium sulfate (K 2 SO 4 ), potassium carbonate (K 2 CO 3 ), potassium hydrogen carbonate (KHCO 3 ), potassium percarbonate (K 2 CO 4 ),
  • the halides are potassium fluoride (KF), potassium hydrogen fluoride (KHF 2 ), potassium chloride (KCl), potassium bromide (KBr), potassium iodide (KI), and the oxides are potassium peroxide (K 2).
  • potassium oxide K 2 O
  • potassium hydroxide KOH
  • potassium hydride KH
  • potassium sulfide K 2 S
  • potassium hydrogen sulfide potassium permanganate
  • K 2 CrO 4 potassium chromate
  • potassium chlorate K 2O 3
  • the potassium salt content is preferably 0.0001 to 10 mol / L, more preferably 0.0005 as the final concentration in the preservation solution of the present invention, that is, the final concentration of all potassium ions contained in the preservation solution of the present invention. It is ⁇ 5 mol / L, more preferably 0.001 to 1 mol / L.
  • saccharide monosaccharide, oligosaccharide or sugar alcohol
  • glucose, galactose, fructose, mannose, xylose, arabinose as monosaccharides
  • trehalose sucrose, maltose, lactose, cellobiose as oligosaccharides, xylitol, sorbitol, etc.
  • sugar alcohols sugar alcohols.
  • these saccharides may be used alone or in combination of a plurality of types.
  • these saccharides are preferably at least one saccharide selected from the group consisting of glucose, galactose, fructose, mannose, xylose, and arabinose.
  • the saccharide content is preferably 0.01 to 500 g / L, more preferably 0.05 to 200 g / L, still more preferably 0.1 to 100 g / L as the final concentration in the preservation solution of the present invention. .
  • the “bicarbonate” is not particularly limited as long as it produces hydrogencarbonate ions when dissolved in a solvent, and salts with various cations can be used. Examples thereof include ammonium hydrogen carbonate (NH 4 HCO 3 ), potassium hydrogen carbonate (KHCO 3 ), calcium hydrogen carbonate (Ca (HCO 3 ) 2 ), sodium hydrogen carbonate (NaHCO 3 ), and the like.
  • potassium hydrogen carbonate can be contained as both a hydrogen carbonate salt and a potassium salt
  • sodium hydrogen carbonate can be contained as both a hydrogen carbonate salt and a sodium salt.
  • potassium bicarbonate when potassium bicarbonate is contained as a potassium salt or sodium bicarbonate is contained as a sodium salt, a bicarbonate other than potassium bicarbonate / sodium bicarbonate (for example, ammonium bicarbonate, bicarbonate)
  • a bicarbonate other than potassium bicarbonate / sodium bicarbonate for example, ammonium bicarbonate, bicarbonate
  • the aspect which does not contain calcium), and the aspect containing hydrogencarbonate other than potassium hydrogencarbonate / sodium hydrogencarbonate are mentioned.
  • the “carbonate” is not particularly limited as long as it generates carbonate ions when dissolved in a solvent, and salts with various cations can be used.
  • potassium carbonate can be contained as a carbonate or potassium salt
  • sodium carbonate can be contained as a carbonate or sodium salt.
  • carbonates other than potassium carbonate / sodium carbonate for example, ammonium carbonate, calcium carbonate, barium carbonate, magnesium carbonate
  • Lithium carbonate, copper carbonate, iron carbonate, silver carbonate and a hydrogen carbonate other than potassium hydrogen carbonate / sodium hydrogen carbonate.
  • hydrogen carbonates and / or carbonates may be used alone or in combination.
  • sodium hydrogen carbonate is preferably used.
  • the bicarbonate and / or carbonate content is preferably 0.0001 to 10 mol / L, more preferably 0.0005 to the final concentration of the total of bicarbonate ions and carbonate ions contained in the preservation solution of the present invention. 5 mol / L, more preferably 0.001 to 1 mol / L.
  • the final concentration of each of hydrogen carbonate ions and carbonate ions is within the above range.
  • protein includes biological protein.
  • serum albumin includes human serum albumin (HSA) or bovine serum albumin (BSA).
  • HSA human serum albumin
  • BSA bovine serum albumin
  • HSA human serum albumin
  • examples of commercially available products include 25% intravenous buminate solution (25% human serum albumin, manufactured by Baxter).
  • recombinant albumin may be used.
  • These biologically derived proteins may be used alone or in combination.
  • human serum albumin is preferred.
  • the content of the biological protein is preferably 0.01 to 50%, more preferably 0.1 to 20%, and still more preferably 0.2 to 10%.
  • the concentration ratio of sodium ion to potassium ion is preferably 1 / 0.0001 to 1/10. More preferably, it is 1 / 0.001 to 1/1.
  • Sodium salt, potassium salt, bicarbonate and / or carbonate, saccharide, and protein used as active ingredients of the preservation solution of the present invention are weighed in necessary amounts, and all components are purified water or physiological saline. It can be dissolved in Alternatively, each component may be prepared by separately dissolving in pure water or physiological saline, and the necessary amount of each component solution may be mixed.
  • a sterilization step for example, a sterilization filtration step
  • several commercially available solutions containing one or more selected from the group consisting of sodium salts, potassium salts, bicarbonates and / or carbonates, saccharides, and proteins may be used in combination.
  • kits include, for example, Japanese Pharmacopoeia glucose solution (eg, Nissin Pharmaceutical Co., Ltd.), Japanese Pharmacopoeia sodium chloride solution (eg, Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.), Japanese Pharmacopoeia potassium chloride solution (eg, Otsuka Pharmaceutical Factory).
  • Manufactured by Japan Pharmacopoeia sodium bicarbonate solution (for example, manufactured by Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.), Buminate IV 25% (25% human serum albumin, manufactured by Baxter) so as to contain the required concentration of the present invention. You may mix under conditions.
  • the pH of the preservation solution of the present invention is not particularly limited, but is preferably a pH that does not damage cells.
  • pH 4 to 9 is preferable.
  • a pH of 5 to 8 is more preferred.
  • Any of the active ingredients used in the storage method of the present invention can be used for pH adjustment.
  • Examples of cells that can be used in the preservation method of the present invention include various cells and cell populations isolated from mammals including humans, cells derived therefrom, and cell populations containing the cells.
  • Examples of various isolated cells include peripheral blood mononuclear cells (PBMC), hematopoietic stem cells, umbilical cord blood mononuclear cells, hematopoietic cells, lymphocytes, T cells, B cells, naive cells, memory cells, NK
  • Examples of the induced cells include lymphokine-activated killer cells (LAK cells), cytotoxic T cells (CTL), tumor infiltrating lymphocytes (TIL), NK cells and the like, which have cytotoxic activity. But are not limited to these cells. These cells may be prepared by a known method.
  • the cell concentration when the desired cells are uniformly suspended in the preservation solution is not particularly limited, and may be determined appropriately depending on the cell type, the intended use of the cell, the size of the cell, the size of the storage container, the storage period, etc. For example, it is preferably 1 ⁇ 10 4 to 1 ⁇ 10 10 cells / mL, more preferably 1 ⁇ 10 5 to 2 ⁇ 10 9 cells / mL, and further preferably 1 ⁇ 10 6 to 5 ⁇ 10 8 cells / mL. mL.
  • the storage container is not particularly limited as long as cells can be stored. Test tubes, flasks, infusion bags, cell culture bags, cryopreservation bags, and the like can be used.
  • the cell storage method refers to a method in which a target cell is suspended in the storage solution of the present invention to prepare a cell suspension, which is then stored by refrigeration or at room temperature.
  • the term “refrigerated” as used herein refers to 0 ° C. to 15 ° C., preferably 2 ° C. to 6 ° C.
  • the normal temperature refers to 15 ° C. to 28 ° C., preferably 18 ° C. to 24 ° C.
  • the desired cells are suspended in the preservation solution of the present invention to prepare a cell suspension, and then preferably 0 ° C. to 28 ° C., more preferably 2 to 24 ° C., still more preferably 4 to Store at 22 ° C.
  • the cell storage period according to the method of the present invention is not particularly limited, and is, for example, 5 minutes to 1 week, preferably 2 hours to 5 days. In a preferred embodiment of the invention, the cell suspension is stored without freezing.
  • the cells preserved by the method of the present invention maintain a high survival rate and physiological activity after the preservation. Further, the method of the present invention hardly causes cell aggregation. That is, the present invention also provides a method for suppressing cell aggregation.
  • Cell aggregation causes clogging in the injection needle, embolization in pulmonary capillaries, inhibition of tissue infiltration, and the like in the process of administering cells. Further, it can be directly administered to a living body without undergoing a washing step for cells after storage.
  • the cell aggregation suppression method of the present invention is characterized in that the cells are stored with the storage solution of the present invention.
  • the preservation solution of the present invention is as described above.
  • the cell used for this method can mention the same thing as the cell used for the preservation
  • the present invention provides a cell aggregation inhibitor used in the cell aggregation inhibition method.
  • the cell aggregation inhibitory liquid has the same components and composition ratio as the preservation liquid of the present invention.
  • Example 1 Comparison of Two Preservation Solutions (1% HSA-Containing Saline and 1% HSA-Containing RPMI 1640) -1
  • NK cell population was prepared by the method described in WO 2011/030851. The expanded culture of the NK cell population was performed for 21 days, and the obtained cell population was used as NK cells in the following examples.
  • NK cells prepared in Example 1- (1) the number of viable cells was calculated by trypan blue staining method, and physiological saline containing 1% HSA so as to be 1 ⁇ 10 7 cells / mL It was suspended in water (hereinafter referred to as 1% HSA-containing physiological saline) or RPMI 1640 containing 1% HSA (manufactured by Kojin Bio Inc., hereinafter referred to as 1% HSA-containing RPMI 1640). 100 mL of the suspended cell solution was placed in a separation bag (manufactured by Terumo) and stored at 22 ° C.
  • 1% HSA-containing physiological saline water
  • RPMI 1640 containing 1% HSA manufactured by Kojin Bio Inc.
  • Example 1- (2) CD3 negative CD56 positive cells at 0 hours (at the start of storage) and 24 hours (after storage), Each content ratio of CD56 positive CD16 positive cell and CD3 negative CD56 positive NKG2D positive cell was analyzed with a flow cytometer (Cytomics FC500: manufactured by Beckman Coulter). That is, cells were washed with DPBS (manufactured by Nissui) for 0 hours (at the start of storage) and 24 hours (after storage) after storage, and then contain 1% bovine serum albumin (manufactured by Sigma, hereinafter referred to as BSA).
  • DPBS manufactured by Nissui
  • BSA bovine serum albumin
  • DPBS 1% BSA-containing DPBS
  • FITC-labeled mouse anti-human CD3 antibody RD1-labeled mouse anti-human CD56 antibody and PC5-labeled mouse anti-human CD16 antibody (all manufactured by Beckman Coulter) or FITC-labeled mouse anti-human CD3 antibody, PC5-labeled mouse anti-human CD56 antibody (all manufactured by Beckman Coulter) and PE-labeled mouse anti-human NKG2D antibody (manufactured by eBioscience) were added.
  • FITC-labeled mouse IgG1 / RD1-labeled mouse IgG1 / PC5-labeled mouse IgG1 was added to a part of each cell population. Each antibody was added and incubated at 4 ° C. for 30 minutes. After incubation, the cells were washed with DPBS containing 0.1% BSA (hereinafter referred to as DPBS containing 0.1% BSA) and suspended again in DPBS. These cells were subjected to flow cytometry, and the content ratio of each cell subpopulation was calculated. The results are shown in Table 2. The parentheses in the table indicate the content ratio at the start of storage. The CD3 negative CD56 positive NKG2D positive cell content ratio (CD3 ⁇ CD56 + NKG2D + ) represents the NKG2D positive cell content ratio in the CD3 negative CD56 positive cells.
  • CD3-negative CD56-positive cells are NK cells
  • CD16 is a functional molecule important for antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC activity)
  • NKG2D is an important molecule involved in the mechanism of cytotoxic activity Is a molecule.
  • Example 2 Comparison of Two Preservation Solutions (1% HSA-Containing Saline and 1% HSA-Containing RPMI 1640) -2
  • Storage of NK cell suspension NK cells were stored in the same manner as in Example 1- (2). However, for the NK cells prepared in Example 1- (1), the number of viable cells was calculated by the trypan blue staining method, and 25 mL of the suspended cell solution was added to a conical tube (made by Greiner) so as to be 1 ⁇ 10 7 cells / mL. ) And stored at 22 ° C.
  • Example 2- (1) Measurement of cytotoxic activity Using the NK cells preserved in Example 2- (1), the cytotoxic activity was measured at 0 hours (at the beginning of the preservation) and 24 hours (after the preservation). Cytotoxic activity is determined by measuring cytotoxic activity using Calcein-AM [Lichtenfels R.C. (Lichtenfelds R. et al.), J. Immunol. Methods, Vol. 172, No. 2, pp. 227-239 (1994)].
  • Calcein-AM Dojin
  • a medium not containing Calcein-AM was washed with a medium not containing Calcein-AM and then used as Calcein-labeled target cells.
  • Example 2 As NK cells preserved in (1) as effector cells, 1 ⁇ 10 6 cells / mL, 3 ⁇ 10 5 cells / mL, 1 ⁇ 10 5 cells / mL, or 0.3 ⁇ 10 5 cells / mL After dilution with 5HRPMI, 100 ⁇ L / well was dispensed into each well of a 96-well cell culture plate (Corning), and calcein-labeled target cells prepared to 1 ⁇ 10 5 cells / mL. Was added at 100 ⁇ L / well. At this time, the ratio of the effector cell (E) to the Calcein-labeled target cell (T), that is, the E / T ratio was set to four types of 10, 3, 1, and 0.3.
  • E effector cell
  • T Calcein-labeled target cell
  • the minimum released amount is the amount of calcein released from a well containing only calcein-labeled target cells, and indicates the amount of calcein spontaneously released from calcein-labeled target cells.
  • the maximum release amount indicates the amount of Calcein released when the cells are completely destroyed by adding 0.1% surfactant Triton X-100 (manufactured by Nacalai Tesque) to Calcein-labeled target cells. The results of the cytotoxic activity measurement are shown in Table 4.
  • Example 3 Examination of New Preservation Solution (1) Storage of NK Cell Suspension NK cells were stored in the same manner as in Example 1- (2). However, the number of viable cells was calculated by trypan blue staining for the NK cells prepared in Example 1- (1), and 1% HSA, 6.6 g / L NaCl (1 ⁇ 10 7 cells / mL) Formulation name: physiological saline, manufactured by Terumo), 2 g / L Glucose (preparation name: Otsuka Sugar Solution, manufactured by Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.), 2 g / L NaHCO 3 (preparation name: Meyron IV, manufactured by Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) Suspended in a solution (hereinafter referred to as 1% HSA-containing stock solution A) prepared to be 4 g / L KCl (formulation name: Concrete solution-K or KCl correction solution, manufactured by Nipro Pharma).
  • the preservation solution A containing 1% HSA can be suitably used as a preservation solution for cells.
  • Example 3 Analysis of cell subpopulation content ratio
  • the respective content ratios of CD3 negative CD56 positive cells, CD56 positive CD16 positive cells and CD3 negative CD56 positive NKG2D positive cells were flowed. Analyzed with a cytometer. However, the analysis was conducted for 21 hours after the start of storage. The results are shown in Table 8. The parentheses in the table indicate the content ratio at the start of storage, and the CD3 negative CD56 positive NKG2D positive cell content ratio (CD3 ⁇ CD56 + NKG2D + ) indicates the NKG2D positive cell content ratio in the CD3 negative CD56 positive cells.
  • 1% HSA-containing stock solution A has the same content ratio of CD3-negative CD56-positive cells, CD56-positive CD16-positive cells and CD3-negative CD56-positive NKG2D-positive cells after storage compared to the start of storage. there were. From the above results, it was revealed that 1% HSA-containing preservation solution A that stably maintains the functional molecule expression of NK cells can be suitably used as a preservation solution for cells.
  • Cytotoxic activity was measured in the same manner as in Example 2- (3). However, there were three E / T ratios of 3, 1, and 0.3. The results of the cytotoxic activity measurement are shown in Table 9.
  • the 1% HSA-containing storage solution A is a storage solution that can maintain the function of NK cells highly and is less prone to cell aggregation.
  • the 1% HSA-containing stock solution A which is a stock solution that can prevent this cell aggregation and maintain the important functions of cells at a high level, is a stock solution that is extremely suitable for this purpose.
  • Example 4 Comparison of two kinds of preservation solutions (1% HSA-containing physiological saline and 1% HSA-containing preservation solution B) -3
  • Storage of NK cell suspension NK cells were stored in the same manner as in Example 1- (2).
  • 1% HSA-containing physiological saline was used as a preservation solution, and the NaCl concentration in 1% HSA-containing preservation solution A was 5.16 g / L NaCl (formulation name: physiological saline, manufactured by Terumo Corporation)
  • a cell strainer Becton Dickinson
  • 1% HSA-containing preservation solution B contains CD3-negative CD56-positive cells, CD56-positive CD16-positive cells, and CD3-negative CD56-positive NKG2D-positive cells after storage as compared with physiological saline containing 1% HSA. The ratio was kept high, and the same ratio was maintained even after 21 hours compared to the start of storage. Further, even after 3 days, 1% HSA-containing stock solution B maintained a higher ratio. From the above results, it was revealed that 1% HSA-containing preservation solution B that stably maintains the functional molecule expression of NK cells can be suitably used as a preservation solution for cells.
  • Cytotoxic activity was measured in the same manner as in Example 2- (3). However, the measurement was carried out at 0 hours (at the start of storage), 3 hours, 21 hours and 3 days after the start of storage, and K562 and lung cancer cell line A549 were used as target cells. After 3 days, the number of cells and the survival rate were measured again, and the E / T ratio was set according to the number of living cells. The results of the cytotoxic activity measurement are shown in Table 13.
  • the 1% HSA-containing stock solution B did not show a significant decrease in the cytotoxic activity after storage compared to the 1% HSA-containing physiological saline. While the cytotoxic activity disappears after 21 hours under the condition of 1% HSA-containing physiological saline, the 1% HSA-containing preservation solution B shows high cytotoxic activity and further has cytotoxic activity after 3 days. Was. From the above results, it was revealed that 1% HSA-containing preservation solution B that maintains high cytotoxic activity of NK cells is suitably used as a preservation solution for cells.
  • ADCC activity was measured.
  • the ADCC activity was obtained by reacting 10 ⁇ g / mL of an anti-human HER2-specific antibody Trastuzumab (formulation name: Herceptin, manufactured by Chugai Pharmaceutical Co., Ltd.) with a human gastric cancer cell line NCI-N87, which is a target cell, at 4 ° C. for 30 minutes. What was washed was used. As a control, NCI-N87 not treated with Trastuzumab was used.
  • the 1% HSA-containing stock solution B did not show a significant decrease in ADCC activity after storage compared to the 1% HSA-containing physiological saline.
  • the ADCC activity disappeared after 21 hours under the physiological saline storage conditions containing 1% HSA, while the preservation solution B containing 1% HSA showed high ADCC activity, and further had ADCC activity even after 3 days. . From the above results, it was revealed that 1% HSA-containing preservation solution B that maintains high ADCC activity of NK cells is suitably used as a preservation solution for cells.
  • the preservation solution B containing 1% HSA can maintain the function of NK cells higher than the physiological saline containing 1% HSA that has been used as a conventional preservation solution for cell administration, and It was revealed that this is a functionally excellent preservation solution in which cell aggregation does not occur easily.
  • Example 5 Comparison of three kinds of preservation solutions (1% HSA-containing physiological saline, 1% HSA-containing preservation solution A and 1% HSA-containing preservation solution C) (1) Preservation of NK cell suspension
  • Example 4- NK cells were preserved in the same manner as in 1). However, 1% HSA-containing physiological saline, 1% HSA-containing preservation solution A, and 1% HSA, 2 g / L NaHCO 3 (formulation name: Meyron IV, manufactured by Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.), and NaCl are used as preservation solutions.
  • the 1% HSA-containing stock solution A and the 1% HSA-containing stock solution C have cell recovery rates and cell viability after storage as compared to the 1% HSA-containing physiological saline over time. It was kept high.
  • the preservation solution C has NaCl, Glucose, and KCl concentrations different from those of the preservation solution A, it has been clarified that the preservation solution of the present invention can be suitably used as a cell preservation solution regardless of the NaCl, Glucose, and KCl concentrations.
  • 1% HSA-containing stock solution A and 1% HSA-containing stock solution C were compared to 1% HSA-containing saline, and CD3-negative CD56-positive cells, CD56-positive CD16-positive cells after storage, and The content ratio of CD3-negative CD56-positive NKG2D-positive cells was maintained high, and the same ratio was maintained even 21 hours after the start of storage. Further, even after 3 days, 1% HSA-containing stock solution A and 1% HSA-containing stock solution C maintained a higher ratio. From the above results, it was revealed that the preservation solution of the present invention that stably maintains the functional molecule expression of NK cells can be suitably used as a preservation solution for cells regardless of the concentration of NaCl, Glucose, and KCl.
  • the preservation solution of the present invention that maintains high cytotoxic activity of NK cells can be suitably used as a cell preservation solution regardless of the NaCl, Glucose, and KCl concentrations.
  • the preservation solution of the present invention that maintains the ADCC activity of NK cells highly can be suitably used as a cell preservation solution irrespective of the NaCl, Glucose, and KCl concentrations.
  • the preservation solution of the present invention has functions of NK cells as compared with 1% HSA-containing physiological saline conventionally used as a preservation solution for administration of cells, regardless of the concentration of NaCl, Glucose, and KCl. It was clarified that it is a functionally excellent preservation solution that can be maintained at a high level and is less likely to cause cell aggregation.
  • a method for storing cells capable of maintaining a high survival rate and physiological activity even when stored for a long time and a storage solution having an essential composition for use in the storage.
  • cells can be stored for a long period of time while maintaining a high survival rate and physiological activity and hardly cause cell aggregation, and a cell washing step after storage is unnecessary. Therefore, it is extremely useful in basic cell research and applied medical research.

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Abstract

　ナトリウム塩、カリウム塩、糖類、並びにタンパク質を有効成分として含有する溶液中で細胞を保存することを特徴とする細胞の保存方法。本発明により、長時間保存した場合においても高い生存率及び生理活性を維持することが可能な細胞の保存方法、並びに当該保存に用いるための必須な組成を有する保存液が提供される。また、当該保存方法を用いることにより、高い生存率及び生理活性も維持した状態で、かつ細胞凝集をほとんど起こすことなく細胞の長期間保存が可能であり、更に保存後の細胞洗浄工程が不要なことから、細胞の基礎研究、医療への応用研究において極めて有用である。

Description

細胞の保存方法
　本発明は、細胞の保存方法、及び当該方法に用いるための保存液に関する。
　近年、医学の進歩に伴い、生細胞を用いた基礎研究や治療が盛んに行われるようになってきた。このため、細胞を安全にかつ細胞の活性を維持したまま保存する技術が必要となり、種々研究がなされてきている。細胞を保存する方法として、短期間保存の場合は細胞懸濁液の状態で保存する方法が知られている（例えば、特許文献１）。また長期間保存の場合は凍結を行う保存方法が知られている（例えば、特許文献２）。特に、癌に対する免疫療法である養子免疫療法やドナーリンパ球輸注（ＤＬＩ）療法では、用いる細胞を調製後、すぐに使用（投与）することは作業上困難な場合が多く、無菌試験、エンドトキシン試験、マイコプラズマ否定試験等調製細胞の安全性に関わる品質確認試験結果判定に一定の時間を要する。このため、当該細胞を使用するまでの間、当該細胞を保存しておくことが求められている。この場合、一般的に凍結保存方法が用いられ、凍結保存用に約４０種類もの成分からなる細胞培養用培地が市販されており、また医薬品である輸液と凍害保護剤を使用して細胞を凍結保存する方法も知られている（例えば、特許文献３）。
　しかしながら細胞を凍結保存する場合、保存する行為そのものが細胞に対してダメージを与えることがあり、凍結された細胞溶液の融解後において、細胞の生存率及び生理活性が低下してしまう（例えば、非特許文献１）。このため、結果的に患者の治療に効果が期待できる程度の必要細胞数を確保できず投与できないケースや、その生理活性も低下するため患者に投与しても期待される効果が得られないといったケースが起こり得るという問題がある。特に、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）のような細胞では、通常、凍結保存が試みられているが依然として保存性が低く、保存効果を高めるため細胞培養用培地を用いて非凍結状態で保存すると保存性は向上するものの、凝集を生じてしまうという問題がある。
特開２００６－２３０３９６号公報 特開２００２－２３３３５６号公報 国際公開第２０１１／０２１６１８号パンフレット
ヒューマン　イムノロジー（Ｈｕｍａｎ　Ｉｍｍｎｏｌｏｇｙ）、第７２巻、第１００７～１０１２頁（２０１１）
　本発明の課題は、高い生存率及び生理活性を維持することが可能な細胞の保存方法、並びに当該保存に用いるための必須な組成を有する保存液を提供することにある。
　本発明者らは、上記の課題を解決すべく、ＮＫ細胞のような保存が困難な細胞において、高い生存率及び生理活性を維持した状態で保存が可能な保存液を見出すため、膨大な成分の組合せを１つ１つ検証した結果、驚くべきことに、ナトリウム塩、カリウム塩、糖類、並びにタンパク質を有効成分として含有する溶液、又はナトリウム塩、カリウム塩、糖類、炭酸水素塩及び／又は炭酸塩、並びにタンパク質を有効成分として含有する溶液を用いることにより、凍結保存を行わなくても、高い生存率及び生理活性を維持したまま冷蔵又は常温で細胞の保存が可能であり、かつ保存中に細胞の凝集が生じにくいことを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち本発明は、
　（１）ナトリウム塩、カリウム塩、糖類、並びにタンパク質を有効成分として含有する溶液中で細胞を保存することを特徴とする細胞の保存方法、
　（２）（１）の溶液が、更に、炭酸水素塩及び／又は炭酸塩を有効成分として含有する（１）の保存方法、
　（３）溶液中の糖類が、グルコース、ガラクトース、フルクトース、マンノース、キシロース、及びアラビノースからなる群より選択される少なくとも１種類の糖類である（１）又は（２）に記載の保存方法、
　（４）溶液中のタンパク質が生体由来タンパク質である（１）～（３）いずれかの保存方法、
　（５）溶液中の生体由来タンパク質がヒト血清アルブミンである（４）の保存方法、
　（６）ナトリウム塩、カリウム塩、糖類、並びにタンパク質を有効成分として含有する細胞の保存液、及び
　（７）更に、炭酸水素塩及び／又は炭酸塩を有効成分として含有する（６）の保存液、
に関する。
　また本発明において、
　（８）細胞凝集抑制性の（１）～（５）の保存方法、及び
　（９）細胞凝集抑制用の（６）及び（７）の保存液、
　が、提供され、
　（１０）ナトリウム塩、カリウム塩、糖類、並びにタンパク質を有効成分として含有する溶液中で細胞を保存することを特徴とする保存中の細胞凝集抑制方法、
　（１１）（１０）の溶液が、更に、炭酸水素塩及び／又は炭酸塩を有効成分として含有する（１０）の凝集抑制方法、
　（１２）溶液中の糖類が、グルコース、ガラクトース、フルクトース、マンノース、キシロース、及びアラビノースからなる群より選択される少なくとも１種類の糖類である（１０）又は（１１）の細胞凝集抑制方法、
　（１３）溶液中のタンパク質が生体由来タンパク質である（１０）～（１２）いずれかの細胞凝集抑制方法、
　（１４）溶液中の生体由来タンパク質がヒト血清アルブミンである（１３）の細胞凝集抑制方法、
　（１５）ナトリウム塩、カリウム塩、糖類、並びにタンパク質を有効成分として含有する保存中の細胞凝集抑制液、及び
　（１６）更に、炭酸水素塩及び／又は炭酸塩を有効成分として含有する（１５）の保存中の細胞凝集抑制液、
も、提供される。
　本発明により、高い生存率及び生理活性を維持したままで細胞を保存することが可能な細胞の保存方法が提供される。また当該方法に用いる細胞保存液が提供される。
　以下に本発明について詳細に説明する。
　本発明は、ナトリウム塩、カリウム塩、糖類、並びにタンパク質を有効成分として含有する溶液中、又はナトリウム塩、カリウム塩、糖類、炭酸水素塩及び／又は炭酸塩、並びにタンパク質を有効成分として含有する溶液中に細胞を懸濁し、得られた細胞懸濁液を冷蔵又は常温保存することを特徴とする細胞の保存方法を提供する。すなわち、本発明の保存方法に用いる溶液（本発明の保存液）の一つの態様では、ナトリウム塩、カリウム塩、糖類、並びにタンパク質が実質的に必要かつ十分な成分である。また、別の態様では、ナトリウム塩、カリウム塩、糖類、炭酸水素塩及び／又は炭酸塩、並びにタンパク質が実質的に必要かつ十分な成分である。本発明の保存液は、これら成分以外に細胞に無害な物質、例えば、ビタミン類、アミノ酸類等を含有させてもよい。またｐＨ調整や緩衝作用を持たせる観点から、リン酸イオンのような緩衝成分を含有してもよいが、保存後の細胞をそのまま生体に投与するという観点から前記有効成分以外の成分は少なくする方が好ましい。本発明の保存液としては、本質的にナトリウム塩、カリウム塩、糖類、並びにタンパク質のみ、又は本質的にナトリウム塩、カリウム塩、糖類、炭酸水素塩及び／又は炭酸塩、並びにタンパク質のみを有効成分として含有することが好ましい。なお、本明細書において「有効成分」とは、単独で又は組み合わせて、細胞を高い生存率及び生理活性を維持したままで実質的に保存することが可能な成分であることを意味する。
　本願明細書において「ナトリウム塩」は、溶媒に溶解した際にナトリウムイオンを生じるものであれば特に限定はなく、オキソ酸塩、ハロゲン化物、酸化物、水酸化物、無機塩又は有機酸塩等を用いることができる。例えば、オキソ酸塩としては炭酸水素ナトリウム（重曹：ＮａＨＣＯ３）、炭酸ナトリウム（炭酸ソーダ：Ｎａ２ＣＯ３）、過炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ４）、亜二チオン酸ナトリウム（亜ジチオン酸ナトリウム、ナトリウムハイドロサルファイト）（Ｎａ２Ｓ２Ｏ４）、亜硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ３）、亜硫酸水素ナトリウム（ＮａＨＳＯ３）、硫酸ナトリウム（芒硝：Ｎａ２ＳＯ４）、チオ硫酸ナトリウム（ハイポ）（Ｎａ２Ｓ２Ｏ３）、亜硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ２）、硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ３）、ハロゲン化物としてはフッ化ナトリウム（ＮａＦ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、臭化ナトリウム（ＮａＢｒ）、ヨウ化ナトリウム（ＮａＩ）、酸化物としては酸化ナトリウム（Ｎａ２Ｏ）、過酸化ナトリウム（Ｎａ２Ｏ２）、水酸化物としては水酸化ナトリウム（苛性ソーダ：ＮａＯＨ）、無機塩としては水素化ナトリウム（ＮａＨ）、硫化ナトリウム（Ｎａ２Ｓ）、硫化水素ナトリウム（水硫化ナトリウム）（ＮａＨＳ）、珪酸ナトリウム（Ｎａ２ＳｉＯ３）、リン酸三ナトリウム（Ｎａ３ＰＯ４）、ホウ酸ナトリウム（Ｎａ３ＢＯ３）、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）、テトラクロロ金酸ナトリウム（Ｎａ［ＡｕＣｌ４］）、有機酸塩としては酢酸ナトリウム（ＣＨ３ＣＯＯＮａ）、クエン酸ナトリウム等が挙げられる。これらのナトリウム塩は、１種類又は複数種類を組み合わせてもよい。本発明において、１種類としては塩化ナトリウムが、複数種類としては塩化ナトリウム及び炭酸水素ナトリウムの組み合わせ、あるいは塩化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、及びクエン酸ナトリウムの組み合わせが好適に使用される。ナトリウム塩含有量は本発明の保存液中の終濃度として、即ち、本発明の保存液に含まれる全ナトリウムイオンの終濃度として、好ましくは０．００１～１０ｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．００５～５ｍｏｌ／Ｌ、さらに好ましくは０．０１～３ｍｏｌ／Ｌである。
　本願明細書において「カリウム塩」は、溶媒に溶解した際にカリウムイオンを生じるものであれば特に限定はなく、オキソ酸塩、ハロゲン化物、酸化物、水酸化物、無機塩又は有機酸塩等を用いることができる。例えば、オキソ酸塩としては、硝酸カリウム（ＫＮＯ３）、硫酸カリウム（Ｋ２ＳＯ４）、炭酸カリウム（Ｋ２ＣＯ３）、炭酸水素カリウム（ＫＨＣＯ３）、過炭酸カリウム（Ｋ２ＣＯ４）、ハロゲン化物としてはフッ化カリウム（ＫＦ）、フッ化水素カリウム（ＫＨＦ２）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、臭化カリウム（ＫＢｒ）、ヨウ化カリウム（ＫＩ）、酸化物としては過酸化カリウム（Ｋ２Ｏ２）、酸化カリウム（Ｋ２Ｏ）、水酸化物塩としては水酸化カリウム（ＫＯＨ）、無機塩として水素化カリウム（ＫＨ）、硫化カリウム（Ｋ２Ｓ）、硫化水素カリウム（水硫化カリウム：ＫＳＨ）、過マンガン酸カリウム（ＫＭｎＯ４）、クロム酸カリウム（Ｋ２ＣｒＯ４）、塩素酸カリウム（ＫＣｌＯ３）等が挙げられる。これらのカリウム塩は、１種類又は複数種類を組み合わせてもよい。本発明において、塩化カリウムが好適に使用される。カリウム塩含有量は本発明の保存液中の終濃度として、即ち、本発明の保存液に含まれる全カリウムイオンの終濃度として、好ましくは０．０００１～１０ｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．０００５～５ｍｏｌ／Ｌ、さらに好ましくは０．００１～１ｍｏｌ／Ｌである。
　本願明細書において「糖類」は、単糖、オリゴ糖又は糖アルコールを用いることができる。例えば、単糖としてはグルコース、ガラクトース、フルクトース、マンノース、キシロース、アラビノース、オリゴ糖としてはトレハロース、スクロース、マルトース、ラクトース、セロビオース、糖アルコールとしてはキシリトール、ソルビトール等が挙げられる。これらの糖類は、１種類又は複数種類を組み合わせてもよいが、本発明においては好ましくは、グルコース、ガラクトース、フルクトース、マンノース、キシロース、及びアラビノースからなる群より選択される少なくとも１種類の糖類であり、より好ましくはグルコースである。糖類の含有量は、本発明の保存液中の終濃度として、好ましくは０．０１～５００ｇ／Ｌ、より好ましくは０．０５～２００ｇ／Ｌ、さらに好ましくは０．１～１００ｇ／Ｌである。
　本明細書において「炭酸水素塩」は、溶媒に溶解した際に炭酸水素イオンを生じるものであれば特に限定はなく、種々の陽イオンとの塩を用いることができる。例えば、炭酸水素アンモニウム（ＮＨ４ＨＣＯ３）、炭酸水素カリウム（ＫＨＣＯ３）、炭酸水素カルシウム（Ｃａ（ＨＣＯ３）２）、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）等が挙げられる。なお、炭酸水素カリウムは炭酸水素塩としてもカリウム塩としても、炭酸水素ナトリウムは炭酸水素塩としてもナトリウム塩としても、それぞれ含有することができる。本発明には、炭酸水素カリウムをカリウム塩として含有する場合や炭酸水素ナトリウムをナトリウム塩として含有する場合には、炭酸水素カリウム／炭酸水素ナトリウム以外の炭酸水素塩（例えば、炭酸水素アンモニウム、炭酸水素カルシウム）を含有しない態様や、炭酸水素カリウム／炭酸水素ナトリウム以外の炭酸水素塩を含有する態様が挙げられる。
　本明細書において「炭酸塩」は、溶媒に溶解した際に炭酸イオンを生じるものであれば特に限定はなく、種々の陽イオンとの塩を用いることができる。例えば、炭酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＣＯ３）、炭酸カリウム（Ｋ２ＣＯ３）、炭酸カルシウム（ＣａＣＯ３）、炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３）、炭酸バリウム（ＢａＣＯ３）、炭酸マグネシウム（ＭｇＣＯ３）、炭酸リチウム（Ｌｉ２ＣＯ３）、炭酸銅（ＩＩ）（ＣｕＣＯ３）、炭酸鉄（ＩＩ）（ＦｅＣＯ３）、炭酸銀（Ｉ）（Ａｇ２ＣＯ３）等が挙げられる。なお、炭酸カリウムは炭酸塩としてもカリウム塩としても、炭酸ナトリウムは炭酸塩としてもナトリウム塩としても、それぞれ含有することができる。本発明には、炭酸カリウムをカリウム塩として含有する場合や炭酸ナトリウムをナトリウム塩として含有する場合には、炭酸カリウム／炭酸ナトリウム以外の炭酸塩（例えば、炭酸アンモニウム、炭酸カルシウム、炭酸バリウム、炭酸マグネシウム、炭酸リチウム、炭酸銅、炭酸鉄、炭酸銀）を含有しない態様や、炭酸水素カリウム／炭酸水素ナトリウム以外の炭酸水素塩を含有する態様が挙げられる。
　これら炭酸水素塩及び／又は炭酸塩は、１種類又は複数種類を組み合わせてもよい。本発明において、炭酸水素ナトリウムが好適に使用される。炭酸水素塩及び／又は炭酸塩の含有量は本発明の保存液に含まれる炭酸水素イオンと炭酸イオンの合計の終濃度として、好ましくは０．０００１～１０ｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．０００５～５ｍｏｌ／Ｌ、さらに好ましくは０．００１～１ｍｏｌ／Ｌである。なお、炭酸水素イオンと炭酸イオン、それぞれの終濃度は、前記範囲内であることが好ましい。
　本願明細書において「タンパク質」とは、生体由来タンパク質が挙げられる。例えば、血清成分である血清アルブミン、血清グロブリン等が挙げられる。また血清アルブミンとしては、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）又はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が挙げられる。更に、他の生体由来タンパク質を用いて、代替することが考えられる。市販品としてはブミネート静注液２５％（２５％ヒト血清アルブミン、バクスター社製）等が挙げられる。また、入手可能な組換えアルブミンを使用してもよい。これらの生体由来タンパク質は、１種類又は複数種類を組み合わせてもよい。本発明においては、ヒト血清アルブミンが好適である。生体由来タンパク質の含有量は、好ましくは０．０１～５０％、より好ましくは０．１～２０％、さらに好ましくは０．２～１０％である。
　本発明の方法に用いる保存液の成分のうちナトリウム塩とカリウム塩の濃度比として、ナトリウムイオンとカリウムイオンの濃度比（ナトリウムイオン／カリウムイオン）は、好ましくは１／０．０００１～１／１０、より好ましくは１／０．００１～１／１である。
　本発明の保存液の有効成分として使用される、ナトリウム塩、カリウム塩、炭酸水素塩及び／又は炭酸塩、糖類、並びにタンパク質は、それぞれ必要量秤量し、全ての成分を純水又は生理食塩水に溶解させて調製することができる。また、それぞれの成分を別々に純水又は生理食塩水に溶解させて調製し、それぞれの成分溶液を必要量混合することにより調製してもよい。上記、保存液を調製する際には、各成分を純水又は生理食塩水に溶解後に除菌工程（例えば除菌ろ過工程）を組入れてもよい。あるいは、ナトリウム塩、カリウム塩、炭酸水素塩及び／又は炭酸塩、糖類、並びにタンパク質からなる群より選ばれる１種以上を含む市販されている溶液を数種類組み合わせて用いてもよい。市販品としては、例えば、日本薬局方　ブドウ糖液（例えば、日新製薬社製）、日本薬局方　塩化ナトリウム液（例えば、大塚製薬工場社製）、日本薬局方　塩化カリウム液（例えば、大塚製薬工場社製）、日本薬局方　炭酸水素ナトリウム液（例えば、大塚製薬工場社製）、ブミネート静注液２５％（２５％ヒト血清アルブミン、バクスター社製）を、本発明の必要濃度を含むように無菌条件下で混合してもよい。
　本発明の保存液のｐＨについて特に限定されることはないが、細胞に対して損傷を与えないｐＨであることが望ましく、例えば、ヒトリンパ球系細胞の保存に使用する場合、ｐＨ４～９が好ましく、ｐＨ５～８がより好ましい。ｐＨ調整には、本発明の保存方法に使用される有効成分のいずれかを用いることが可能である。
　本発明の保存方法に用いることができる細胞としては、ヒトを含む哺乳動物から単離した種々の細胞や細胞集団、これらから誘導された細胞や当該細胞を含有する細胞集団等が挙げられる。単離された種々の細胞としては、例えば、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、造血幹細胞、臍帯血単核球、血球系細胞、リンパ球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナイーブ細胞、メモリー細胞、ＮＫ細胞等が挙げられ、誘導された細胞としては、細胞傷害活性を有する、リンフォカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ細胞）、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、ＮＫ細胞等が挙げられるが、これらの細胞に限定されるものではない。これら細胞は公知の方法で調製すればよい。
　目的とする細胞を保存液に均一に懸濁する際の細胞濃度は特に限定はなく、細胞の種類、細胞の使用用途、細胞の大きさ、保存容器のサイズ、保存期間等により適宜決定すればよいが、例えば、好ましくは１×１０４～１×１０１０ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、より好ましくは１×１０５～２×１０９ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、さらに好ましくは１×１０６～５×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬである。保存容器としては、細胞の保存が可能であれば特に限定はなく、試験管、フラスコ、輸液バッグ、細胞培養用バッグ、凍結保存用バッグ等を用いることができる。
　本発明において、細胞の保存方法とは、目的とする細胞を本発明の保存液に懸濁して細胞懸濁液を調製後、冷蔵又は常温にて放置して保存する方法をいう。ここでいう冷蔵とは、０℃～１５℃をいい、好ましくは２℃～６℃である。常温とは１５℃～２８℃をいい、好ましくは１８℃～２４℃である。また、本発明においては、目的とする細胞を本発明の保存液に懸濁して細胞懸濁液を調製後、好ましくは０℃～２８℃、より好ましくは２～２４℃、さらに好ましくは４～２２℃で放置して保存する。本発明の方法による細胞の保存期間は特に限定はなく、例えば５分～１週間、好ましくは２時間～５日間である。本発明の好適な態様において、細胞懸濁液は凍結させることなく保存される。
　本発明の方法により保存した細胞は、保存後も高い生存率及び生理活性を維持している。更に、本発明の方法では細胞の凝集が生じにくい。すなわち、本発明により細胞凝集の抑制方法も提供される。細胞凝集は、細胞を投与する過程における注射針内での詰まり、肺毛細血管内での塞栓形成、組織への浸潤阻害などを引き起こす原因となる。また、保存後の細胞の洗浄工程を経ずにそのまま生体に投与することが可能である。
　本発明の細胞の凝集抑制方法は、本発明の保存液にて細胞を保存することを特徴とする。本発明の保存液は前述の通りである。また、該方法に供される細胞は、本発明の保存方法に供される細胞と同じものを挙げることができる。
　また、本発明は、前記細胞凝集抑制方法にて用いられる細胞凝集抑制液を提供する。細胞凝集抑制液は、その構成成分及び組成比は、本発明の保存液と同じである。
　以下に実施例をもって本発明を更に具体的に示すが、本発明は以下の実施例の範囲のみに何ら限定されるものではない。
実施例１　２種の保存液（１％ＨＳＡ含有生理食塩水及び１％ＨＳＡ含有ＲＰＭＩ１６４０）の比較－１
（１）ＮＫ細胞集団の調製
　国際公開第２０１１／０３０８５１号パンフレット記載の方法により、ＮＫ細胞集団を調製した。なお、ＮＫ細胞集団の拡大培養は２１日間行い、得られた細胞集団をＮＫ細胞として以下の実施例に使用した。
（２）ＮＫ細胞の保存
　実施例１－（１）で調製したＮＫ細胞についてトリパンブルー染色法で生細胞数を算出し、１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１％ＨＳＡを含む生理食塩水（以下１％ＨＳＡ含有生理食塩水と記載）又は１％ＨＳＡを含むＲＰＭＩ１６４０（コージンバイオ社製、以下１％ＨＳＡ含有ＲＰＭＩ１６４０と記載）に懸濁した。懸濁細胞液１００ｍLを分離バッグ（テルモ社製）に入れ、２２℃で静置保存した。
（３）細胞回収率及び細胞生存率の測定
　実施例１－（２）で保存したＮＫ細胞を用いて、保存開始０時間（保存開始時）及び２４時間後（保存後）についてトリパンブルー染色法にて生細胞数を算出し、さらに生細胞数と死細胞数から細胞生存率を算出した。細胞回収率は式１を用いて算出した。２４時間保存後の結果を表１に示す。
（式１）　細胞回収率（％）＝（保存後の総生細胞数／保存開始時の総生細胞数）×１００
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１から明らかなように、１％ＨＳＡ含有生理食塩水では保存後の細胞回収率及び細胞生存率が顕著に低下するのに対し、１％ＨＳＡ含有ＲＰＭＩ１６４０ではいずれも低下が見られず、高い細胞回収率及び細胞生存率を維持し細胞の状態を良好に保っていた。この結果より、１％ＨＳＡ含有ＲＰＭＩ１６４０はＮＫ細胞の保存に適している可能性が示唆された。
（４）細胞亜集団含有比率の解析
　実施例１－（２）で保存したＮＫ細胞を用いて、保存開始０時間（保存開始時）及び２４時間後（保存後）についてＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性細胞、ＣＤ５６陽性ＣＤ１６陽性細胞及びＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性ＮＫＧ２Ｄ陽性細胞、のそれぞれの含有比率をフローサイトメーター（Ｃｙｔｏｍｉｃｓ　ＦＣ５００：ベックマンコールター社製）で解析した。すなわち、保存開始０時間（保存開始時）及び２４時間（保存後）の細胞をＤＰＢＳ（ニッスイ社製）で洗浄した後、１％ウシ血清アルブミン（シグマ社製、以下、ＢＳＡと記載）を含むＤＰＢＳ（以下、１％ＢＳＡ含有ＤＰＢＳと記載）中に細胞を懸濁し、ＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＤ３抗体、ＲＤ１標識マウス抗ヒトＣＤ５６抗体及びＰＣ５標識マウス抗ヒトＣＤ１６抗体（全てベックマンコールター社製）又はＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＤ３抗体、ＰＣ５標識マウス抗ヒトＣＤ５６抗体（全てベックマンコールター社製）及びＰＥ標識マウス抗ヒトＮＫＧ２Ｄ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を添加した。同様に、各細胞集団の一部に、ネガティブコントロールとしてＦＩＴＣ標識マウスＩｇＧ１／ＲＤ１標識マウスＩｇＧ１／ＰＣ５標識マウスＩｇＧ１（ベックマンコールター社製）を添加した。各々の抗体を添加後、４℃で３０分インキュベートした。インキュベート後、細胞を０．１％ＢＳＡを含むＤＰＢＳ（以下、０．１％ＢＳＡ含有ＤＰＢＳと記載）で洗浄し、再度ＤＰＢＳに懸濁した。これらの細胞をフローサイトメトリーに供し、各細胞亜集団の含有比率を算出した。結果を表２に示す。なお、表中のカッコ内は保存開始時の含有比率を示す。また、ＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性ＮＫＧ２Ｄ陽性細胞含有比率（ＣＤ３－ＣＤ５６＋ＮＫＧ２Ｄ＋）はＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性細胞中のＮＫＧ２Ｄ陽性細胞含有比率を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２から明らかなように、１％ＨＳＡ含有生理食塩水では保存後に各細胞亜集団の含有比率の低下が見られ、特にＣＤ５６陽性ＣＤ１６陽性細胞含有比率の低下が顕著であった。これに対し、１％ＨＳＡ含有ＲＰＭＩ１６４０ではＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性細胞及びＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性ＮＫＧ２Ｄ陽性細胞含有比率のいずれもほとんど低下が見られず、またＣＤ５６陽性ＣＤ１６陽性細胞比率の低下も抑制され、細胞の状態を良好に保っていた。ＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性細胞はＮＫ細胞であり、ＣＤ１６は抗体依存性細胞傷害活性（Ａｎｔｉｇｅｎ　ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：ＡＤＣＣ活性）に重要な機能性分子であり、またＮＫＧ２Ｄは細胞傷害活性のメカニズムに関与する重要な分子である。この結果より、ＮＫ細胞の機能性分子発現を安定に維持する１％ＨＳＡ含有ＲＰＭＩ１６４０はＮＫ細胞の保存液に適している可能性が示唆された。
実施例２　２種の保存液（１％ＨＳＡ含有生理食塩水及び１％ＨＳＡ含有ＲＰＭＩ１６４０）の比較－２
（１）ＮＫ細胞懸濁液の保存
　実施例１－（２）と同様の方法で、ＮＫ細胞を保存した。ただし、実施例１－（１）で調製したＮＫ細胞についてトリパンブルー染色法で生細胞数を算出し、１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁細胞液２５ｍＬをコニカルチューブ（グライナー社製）に入れ、２２℃で静置保存した。
（２）細胞回収率及び細胞生存率の測定
　実施例１－（３）と同様の方法で、細胞回収率及び細胞生存率の測定を行った。ただし測定は、保存開始０時間（保存開始時）、３時間後及び２４時間後について実施した。結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３から明らかなように、１％ＨＳＡ含有生理食塩水では保存後の細胞回収率及び細胞生存率が顕著に低下するのに対し、１％ＨＳＡ含有ＲＰＭＩ１６４０ではいずれも低下が見られず、高い細胞回収率及び細胞生存率を維持し、細胞の状態を良好に保っていた。
（３）細胞傷害活性の測定
　実施例２－（１）で保存したＮＫ細胞を用いて、保存開始０時間（保存開始時）及び２４時間後（保存後）について細胞傷害活性を測定した。細胞傷害活性は、Ｃａｌｃｅｉｎ－ＡＭを用いた細胞傷害活性測定法〔リヒテンフェルズ　Ｒ．ら（Ｌｉｃｈｔｅｎｆｅｌｓ　Ｒ．ｅｔ　ａｌ．）、Ｊ.Ｉｍｍｕｎｏｌ.Ｍｅｔｈｏｄｓ、第１７２巻、第２号、第２２７～２３９頁（１９９４）〕にて評価した。すなわち慢性骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２細胞を（１～２）×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように５％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０に懸濁後、終濃度２５μＭとなるようにＣａｌｃｅｉｎ－ＡＭ（同仁化学研究所社製）を添加し、３７℃で１時間培養した。細胞をＣａｌｃｅｉｎ－ＡＭを含まない培地にて洗浄後、Ｃａｌｃｅｉｎ標識標的細胞とした。
　実施例２－（１）で保存したＮＫ細胞をエフェクター細胞として１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ又は０．３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるよう５ＨＲＰＭＩで希釈後、９６穴細胞培養プレート（コーニング社製）の各ウェルに１００μＬ／ウェルずつ分注しておき、これらに１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように調製したＣａｌｃｅｉｎ標識標的細胞を１００μＬ／ウェルずつ添加した。この際、Ｃａｌｃｅｉｎ標識標的細胞（Ｔ）に対するエフェクター細胞（Ｅ）の比、すなわちＥ／Ｔ比は１０、３、１、０．３の４通りとした。上記細胞懸濁液の入ったプレートを４００×ｇで１分間遠心後、３７℃、５％ＣＯ２存在下で４時間インキュベートした。その後、各ウェルから培養上清１００μＬを採取し、蛍光プレートリーダー（Ｍｉｔｈｒａｓ　ＬＢ　９４０：ベルトールド社製）（励起４８５ｎｍ／測定５３５ｎｍ）によって培養上清中に放出されたＣａｌｃｅｉｎ量を測定した。「細胞傷害活性（％）」は以下の式２に従って算出した。
（式２）　細胞傷害活性（％）＝｛（各ウェルの測定値－最小放出量）／（最大放出量－最小放出量）｝×１００
　上式において、最小放出量は、Ｃａｌｃｅｉｎ標識標的細胞のみ含有するウェルのＣａｌｃｅｉｎ放出量であり、Ｃａｌｃｅｉｎ標識標的細胞からのＣａｌｃｅｉｎ自然放出量を示す。また、最大放出量は、Ｃａｌｃｅｉｎ標識標的細胞に０．１％界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００（ナカライテスク社製）を加えて細胞を完全破壊した際のＣａｌｃｅｉｎ放出量を示している。細胞傷害活性測定の結果を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表４から明らかなように、１％ＨＳＡ含有生理食塩水では保存後の細胞傷害活性は著しい低下・失活が見られたのに対し、１％ＨＳＡ含有ＲＰＭＩ１６４０ではほとんど低下が見られなかった。以上の結果より、１％ＨＳＡ含有ＲＰＭＩ１６４０はＮＫ細胞の細胞傷害活性の維持に有効であることが示唆された。
（４）細胞凝集状態の確認
　実施例２－（１）で保存したＮＫ細胞について、保存開始０時間（保存開始時）、３時間後及び２４時間後について細胞凝集の状態を観察した。細胞凝集の程度は表５によって分類し、細胞凝集状態の結果を表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表６に示されるように、１％ＨＳＡ含有生理食塩水では保存後の細胞凝集がほとんど確認されないのに対し、１％ＨＳＡ含有ＲＰＭＩ１６４０では保存開始後３時間で多量の細胞凝集が確認された。この結果より、一般的に使用されている１％ＨＳＡ含有ＲＰＭＩ１６４０はＮＫ細胞の機能を高く保持する事が出来る一方で、細胞の凝集が起こりやすい保存液であることが明らかとなった。
実施例３　新規保存液の検討
（１）ＮＫ細胞懸濁液の保存
　実施例１－（２）と同様の方法で、ＮＫ細胞を保存した。ただし、実施例１－（１）で調製したＮＫ細胞についてトリパンブルー染色法で生細胞数を算出し、１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、１％ＨＳＡ、６．６ｇ／Ｌ　ＮａＣl（製剤名：生理食塩水、テルモ社製）、２ｇ／Ｌ　Ｇｌｕｃｏｓｅ（製剤名：大塚糖液、大塚製薬社製）、２ｇ／Ｌ　ＮａＨＣＯ３（製剤名：メイロン静注、大塚製薬社製）及び０．４ｇ／Ｌ　ＫＣｌ（製剤名：コンクライト液―Ｋ又はＫＣｌ補正液、ニプロファーマ社製）となるように各製剤を用い調製した溶液（以下、１％ＨＳＡ含有保存液Ａと記載）に懸濁した。懸濁細胞液１５ｍＬをコニカルチューブに入れ、２２℃又は４℃で静置保存した。前記１％ＨＳＡ含有保存液Ａは、ナトリウムイオン終濃度１４３．１ｍｍｏｌ／Ｌ、カリウムイオン終濃度５．４ｍｍｏｌ／Ｌ、糖類（グルコース）濃度２ｇ／Ｌ、炭酸水素イオンと炭酸イオンの合計の終濃度２３．８ｍｍｏｌ／Ｌ、ナトリウムイオン／カリウムイオン＝２６．７／１（または１／０．０３７）であった。
（２）細胞回収率及び細胞生存率の測定
　実施例１－（３）と同様の方法で、細胞回収率及び細胞生存率の測定を行った。ただし測定は、保存開始０時間（保存開始時）及び２１時間後について実施した。結果を表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　表７に示されるように、１％ＨＳＡ含有保存液Ａは保存後の細胞回収率及び細胞生存率が保存開始時と同様に高く維持されていた。以上の結果より、１％ＨＳＡ含有保存液Ａは細胞の保存液として好適に使用できることが明らかとなった。
（３）細胞亜集団含有比率の解析
　実施例１－（４）と同様の方法で、ＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性細胞、ＣＤ５６陽性ＣＤ１６陽性細胞及びＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性ＮＫＧ２Ｄ陽性細胞、のそれぞれの含有比率をフローサイトメーターで解析した。ただし解析は、保存開始後２１時間について実施した。結果を表８に示す。なお、表中のカッコ内は保存開始時の含有比率を示し、ＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性ＮＫＧ２Ｄ陽性細胞含有比率（ＣＤ３－ＣＤ５６＋ＮＫＧ２Ｄ＋）はＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性細胞中のＮＫＧ２Ｄ陽性細胞含有比率を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　表８に示されるように、１％ＨＳＡ含有保存液Ａは保存後のＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性細胞、ＣＤ５６陽性ＣＤ１６陽性細胞及びＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性ＮＫＧ２Ｄ陽性細胞含有比率が保存開始時と比較して同等であった。以上の結果より、ＮＫ細胞の機能性分子発現を安定に維持する１％ＨＳＡ含有保存液Ａは細胞の保存液として好適に使用できることが明らかとなった。
（４）細胞傷害活性の測定
　実施例２－（３）と同様の方法で、細胞傷害活性の測定を行った。ただし、Ｅ／Ｔ比は３、１、０．３の３通りとした。細胞傷害活性測定の結果を表９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　表９に示されるように、１％ＨＳＡ含有保存液Ａでは保存後の細胞傷害活性は保存開始時前と同様に高く維持されていた。以上の結果より、ＮＫ細胞の細胞傷害活性を安定に維持する１％ＨＳＡ含有保存液Ａは細胞の保存液として好適に使用されることが明らかとなった。
（５）細胞凝集状態の確認
　実施例３－（１）で保存したＮＫ細胞を用いて、保存開始０時間（保存開始時）、２１時間後について細胞凝集の状態について観察した。その結果を表１０に示す。なお、細胞凝集の程度は表５の分類に従って評価した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　表１０に示されるように、１％ＨＳＡ含有保存液Ａでは保存後の細胞凝集が全く起こらないことが確認された。
　以上の結果より、１％ＨＳＡ含有保存液ＡはＮＫ細胞の機能を高く保持する事が出来、なおかつ細胞の凝集が起こりにくい保存液であることが明らかとなった。この細胞凝集を防ぎ、細胞の重要な機能を高く維持することができる保存液である１％ＨＳＡ含有保存液Ａは当該目的に極めて適した保存液である。
実施例４　２種の保存液（１％ＨＳＡ含有生理食塩水及び１％ＨＳＡ含有保存液Ｂ）の比較－３
（１）ＮＫ細胞懸濁液の保存
　実施例１－（２）と同様の方法で、ＮＫ細胞を保存した。ただし、保存液として１％ＨＳＡ含有生理食塩水を用い、また、１％ＨＳＡ含有保存液ＡにおけるＮａＣｌ濃度を５．１６ｇ／Ｌ　ＮａＣl（製剤名：生理食塩水、テルモ社製）とした１％ＨＳＡ含有保存液Ｂを用いた（ナトリウムイオン終濃度１１８．４ｍｍｏｌ／Ｌ、、カリウムイオン終濃度５．４ｍｍｏｌ／Ｌ、糖類（グルコース）濃度２ｇ／Ｌ、炭酸水素イオンと炭酸イオンの合計の終濃度２３．８ｍｍｏｌ／Ｌ、ナトリウムイオン／カリウムイオン＝２２．１／１（または１／０．０４５））。セルストレーナー（ベクトン・ディッキンソン社製）にて処理した後懸濁細胞液３０ｍＬをコニカルチューブに入れ、２２℃で静置保存した。
（２）細胞回収率及び細胞生存率の測定
　実施例１－（３）と同様の方法で、細胞回収率及び細胞生存率の測定を行った。ただし測定は、保存開始０時間（保存開始時）、２１時間後及び３日後について実施した。結果を表１１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　表１１に示されるように、１％ＨＳＡ含有保存液Ｂは１％ＨＳＡ含有生理食塩水と比較して保存後の細胞回収率及び細胞生存率が継時的に高く維持されていた。以上の結果より、１％ＨＳＡ含有保存液Ｂは細胞の保存液として好適に使用できることが明らかとなった。
（３）細胞亜集団含有比率の解析
　実施例１－（４）と同様の方法で、ＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性細胞、ＣＤ５６陽性ＣＤ１６陽性細胞及びＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性ＮＫＧ２Ｄ陽性細胞、のそれぞれの含有比率をフローサイトメーターで解析した。ただし解析は、保存開始後２１時間後及び３日後について実施した。結果を表１２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　表１２に示されるように、１％ＨＳＡ含有保存液Ｂは１％ＨＳＡ含有生理食塩水と比較して保存後のＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性細胞、ＣＤ５６陽性ＣＤ１６陽性細胞及びＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性ＮＫＧ２Ｄ陽性細胞含有比率が高く維持されており、保存開始時と比較して２１時間後でも同等の比率を維持していた。さらに３日後においても１％ＨＳＡ含有保存液Ｂはより高い比率を維持していた。以上の結果より、ＮＫ細胞の機能性分子発現を安定に維持する１％ＨＳＡ含有保存液Ｂは細胞の保存液として好適に使用できることが明らかとなった。
（４）細胞傷害活性の測定
　実施例２－（３）と同様の方法で、細胞傷害活性の測定を行った。ただし、測定は保存開始０時間（保存開始時）、３時間後、２１時間後及び３日後について実施し、標的細胞はＫ５６２及び肺癌細胞株Ａ５４９を用いた。３日後においては、再度細胞数及び生存率を測定し、生細胞数に応じてＥ／Ｔ比を設定した。細胞傷害活性測定の結果を表１３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　表１３に示されるように、１％ＨＳＡ含有保存液Ｂでは１％ＨＳＡ含有生理食塩水と比較して保存後の細胞傷害活性の著しい低下が見られなかった。１％ＨＳＡ含有生理食塩水保存条件では２１時間後には細胞傷害活性が消失している一方、１％ＨＳＡ含有保存液Ｂでは高い細胞傷害活性を示しており、さらに３日後でも細胞傷害活性を有していた。以上の結果より、ＮＫ細胞の細胞傷害活性を高く維持する１％ＨＳＡ含有保存液Ｂは細胞の保存液として好適に使用されることが明らかとなった。
（５）抗体依存性細胞傷害活性の測定
　実施例４－（１）で保存したＮＫ細胞を用いて、保存開始０時間（保存開始時）、３時間後、２１時間後及び３日後について抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）を測定した。ＡＤＣＣ活性は、抗ヒトＨＥＲ２特異的抗体であるＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ（製剤名：ハーセプチン、中外製薬社製）１０μｇ／ｍＬをあらかじめ標的細胞であるヒト胃癌細胞株ＮＣＩ－Ｎ８７に４℃で３０分反応させた後洗浄したものを使用した。また対照としてＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂで処理しないＮＣＩ－Ｎ８７を用いた。これら標的細胞を実施例２－（３）と同様にＣａｌｃｅｉｎ－ＡＭを用いた細胞傷害活性測定法にて評価した。ただし、Ｅ／Ｔ比は３、１、０．３の３通りとし、３日後においては、再度細胞数及び生存率を測定し、生細胞数に応じてＥ／Ｔ比を設定した。「ＡＤＣＣ活性（％）」は以下の式３に従って算出した。ＡＤＣＣ活性測定の結果を表１４に示す。
（式３）　ＡＤＣＣ活性（％）＝
（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ処理標的細胞に対する細胞傷害活性）－（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ未処理標的細胞に対する細胞傷害活性）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　表１４に示されるように、１％ＨＳＡ含有保存液Ｂでは１％ＨＳＡ含有生理食塩水と比較して保存後のＡＤＣＣ活性の著しい低下が見られなかった。１％ＨＳＡ含有生理食塩水保存条件では２１時間後にはＡＤＣＣ活性が消失している一方、１％ＨＳＡ含有保存液Ｂでは高いＡＤＣＣ活性を示しており、さらに３日後でもＡＤＣＣ活性を有していた。以上の結果より、ＮＫ細胞のＡＤＣＣ活性を高く維持する１％ＨＳＡ含有保存液Ｂは細胞の保存液として好適に使用されることが明らかとなった。
（６）細胞凝集状態の確認
　実施例４－（１）で保存したＮＫ細胞を用いて、保存開始０時間（保存開始時）、３時間後、２１時間後、３日後について細胞凝集の状態について観察した。その結果を表１５に示す。なお、細胞凝集の程度は表５の分類によった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
　表１５に示されるように、１％ＨＳＡ含有保存液Ｂでは１％ＨＳＡ含有生理食塩水同様保存後の細胞凝集が全く起こらないことが確認された。以上の結果より、１％ＨＳＡ含有保存液Ｂは従来細胞の投与用保存液として使用されていた１％ＨＳＡ含有生理食塩水と比較して、ＮＫ細胞の機能を高く保持する事が出来、なおかつ細胞の凝集が起こりにくい機能的に優れた保存液であることが明らかとなった。
実施例５　３種の保存液（１％ＨＳＡ含有生理食塩水、１％ＨＳＡ含有保存液Ａ及び１％ＨＳＡ含有保存液Ｃ）の比較
（１）ＮＫ細胞懸濁液の保存
　実施例４－（１）と同様の方法で、ＮＫ細胞を保存した。ただし、保存液として、１％ＨＳＡ含有生理食塩水、１％ＨＳＡ含有保存液Ａ、並びに１％ＨＳＡ、２ｇ／Ｌ　ＮａＨＣＯ３（製剤名：メイロン静注、大塚製薬社製）、及びＮａＣｌ　２．２８ｇ／Ｌ、Ｇｌｕｃｏｓｅ　２６．３５ｇ／Ｌ、ＫＣｌ　０．７３ｇ／Ｌ（ブドウ糖‐電解質液（製剤名：ソルデム４、テルモ社製））となるように各製剤を用い調製した溶液（以下、１％ＨＳＡ含有保存液Ｃと記載）を使用した。前記保存液Ｃは、ナトリウムイオン終濃度６９．２ｍｍｏｌ／Ｌ、カリウムイオン終濃度９．８ｍｍｏｌ／Ｌ、糖類（グルコース）濃度２６．３５ｇ／Ｌ、炭酸水素イオンと炭酸イオンの合計の終濃度２３．８ｍｍｏｌ／Ｌ、ナトリウムイオン／カリウムイオン＝７．１／１（または１／０．１４１）であった。
（２）細胞回収率及び細胞生存率の測定
　実施例４－（２）と同様の方法で、細胞回収率及び細胞生存率の測定を行った。結果を表１６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　表１６に示されるように、１％ＨＳＡ含有保存液Ａ及び１％ＨＳＡ含有保存液Ｃは１％ＨＳＡ含有生理食塩水と比較して保存後の細胞回収率及び細胞生存率が継時的に高く維持されていた。保存液ＣはＮａＣｌ、Ｇｌｕｃｏｓｅ、ＫＣｌ濃度が保存液Ａと異なるが、当該発明の保存液はＮａＣｌ、Ｇｌｕｃｏｓｅ、ＫＣｌ濃度によらず、細胞の保存液として好適に使用できることが明らかとなった。
（３）細胞亜集団含有比率の解析
　実施例４－（３）と同様の方法で、ＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性細胞、ＣＤ５６陽性ＣＤ１６陽性細胞及びＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性ＮＫＧ２Ｄ陽性細胞、のそれぞれの含有比率をフローサイトメーターで解析した。結果を表１７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
　表１７に示されるように、１％ＨＳＡ含有保存液Ａ及び１％ＨＳＡ含有保存液Ｃは１％ＨＳＡ含有生理食塩水と比較して保存後のＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性細胞、ＣＤ５６陽性ＣＤ１６陽性細胞及びＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性ＮＫＧ２Ｄ陽性細胞含有比率が高く維持されており、保存開始時と比較して２１時間後でも同等の比率を維持していた。さらに３日後においても１％ＨＳＡ含有保存液Ａ及び１％ＨＳＡ含有保存液Ｃはより高い比率を維持していた。以上の結果より、ＮＫ細胞の機能性分子発現を安定に維持する当該発明の保存液はＮａＣｌ、Ｇｌｕｃｏｓｅ、ＫＣｌ濃度によらず、細胞の保存液として好適に使用できることが明らかとなった。
（４）細胞傷害活性の測定
　実施例４－（４）と同様の方法で、細胞傷害活性の測定を行った。細胞傷害活性測定の結果を表１８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
　表１８に示されるように、１％ＨＳＡ含有保存液Ａ及び１％ＨＳＡ含有保存液Ｃでは１％ＨＳＡ含有生理食塩水と比較して保存後の細胞傷害活性の著しい低下が見られなかった。１％ＨＳＡ含有生理食塩水保存条件では２１時間後には細胞傷害活性が消失している一方、１％ＨＳＡ含有保存液Ａ及び１％ＨＳＡ含有保存液Ｃでは高い細胞傷害活性を示しており、さらに３日後でも細胞傷害活性を有していた。以上の結果より、ＮＫ細胞の細胞傷害活性を高く維持する当該発明の保存液はＮａＣｌ、Ｇｌｕｃｏｓｅ、ＫＣｌ濃度によらず、細胞の保存液として好適に使用されることが明らかとなった。
（５）抗体依存性細胞傷害活性の測定
　実施例５－（１）で保存したＮＫ細胞を用いて、保存開始０時間（保存開始時）、３時間後、２１時間後について抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）を測定した。ＡＤＣＣ活性測定の結果を表１９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
　表１９に示されるように、１％ＨＳＡ含有保存液Ａ及び１％ＨＳＡ含有保存液Ｃでは１％ＨＳＡ含有生理食塩水と比較して保存後のＡＤＣＣ活性の著しい低下が見られなかった。１％ＨＳＡ含有生理食塩水保存条件では２１時間後にはＡＤＣＣ活性が消失している一方、１％ＨＳＡ含有保存液Ａ及び１％ＨＳＡ含有保存液Ｃでは高いＡＤＣＣ活性を示していた。以上の結果より、ＮＫ細胞のＡＤＣＣ活性を高く維持する当該発明の保存液はＮａＣｌ、Ｇｌｕｃｏｓｅ、ＫＣｌ濃度によらず、細胞の保存液として好適に使用されることが明らかとなった。
（６）細胞凝集状態の確認
　実施例５－（１）で保存したＮＫ細胞を用いて、保存開始０時間（保存開始時）、３時間後、２１時間後、３日後について細胞凝集の状態について観察した。その結果を表２０に示す。なお、細胞凝集の程度は表５の分類によった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
　表２０に示されるように、１％ＨＳＡ含有保存液Ａ及び１％ＨＳＡ含有保存液Ｃでは１％ＨＳＡ含有生理食塩水同様保存後の細胞凝集が全く起こらないことが確認された。
　以上の結果より、当該発明の保存液はＮａＣｌ、Ｇｌｕｃｏｓｅ、ＫＣｌ濃度によらず、従来細胞の投与用保存液として使用されていた１％ＨＳＡ含有生理食塩水と比較して、ＮＫ細胞の機能を高く保持する事が出来、なおかつ細胞の凝集が起こりにくい機能的に優れた保存液であることが明らかとなった。
　本発明により、長時間保存した場合においても高い生存率及び生理活性を維持することが可能な細胞の保存方法、並びに当該保存に用いるための必須な組成を有する保存液が提供される。また、当該保存方法を用いることにより、高い生存率及び生理活性も維持した状態で、かつ細胞凝集をほとんど起こすことなく細胞の長期間保存が可能であり、更に保存後の細胞洗浄工程が不要なことから、細胞の基礎研究、医療への応用研究において極めて有用である。

Claims (7)

  1. 　ナトリウム塩、カリウム塩、糖類、並びにタンパク質を有効成分として含有する溶液中で細胞を保存することを特徴とする細胞の保存方法。
  2. 　請求項１記載の溶液が、更に、炭酸水素塩及び／又は炭酸塩を有効成分として含有する請求項１記載の保存方法。
  3. 　溶液中の糖類が、グルコース、ガラクトース、フルクトース、マンノース、キシロース、及びアラビノースからなる群より選択される少なくとも１種類の糖類である請求項１又は２に記載の保存方法。
  4. 　溶液中のタンパク質が生体由来タンパク質である請求項１～３いずれかに記載の保存方法。
  5. 　溶液中の生体由来タンパク質がヒト血清アルブミンである請求項４記載の保存方法。
  6. 　ナトリウム塩、カリウム塩、糖類、及びタンパク質を有効成分として含有する細胞の保存液。
  7. 　更に、炭酸水素塩及び／又は炭酸塩を有効成分として含有する請求項６記載の保存液。
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