WO2013077639A1 - 말과동물 양막-유래 중간엽 줄기세포 - Google Patents

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WO2013077639A1
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cells
multipotent stem
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horse
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강경선
서민수
박상범
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주식회사 강스템홀딩스
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    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/03—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from non-embryonic pluripotent stem cells

Definitions

  • the present invention relates to equine amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells (eAM-MSCs) and a method of manufacturing the same. More specifically, all of the human markers CD19, CD20, CD28, CD31, CD34, CD38, CD41a, CD62L, CD62P and CD200 all exhibit negative immunological properties and are positive for the human markers CD44, CD90 and CD105. It relates to a horse animal amnion-derived mesenchymal stem cells exhibiting the immunological characteristics of, having the ability to culture at least 14 passages in an undifferentiated state and the ability to differentiate into ectoderm, mesoderm or endoderm-derived cells.
  • pluripotent stem cells which have the ability to form all organs through proliferation and differentiation, were able to fundamentally solve long-term damage as well as most diseases.
  • many scientists have suggested the possibility of applying stem cells to almost all organ regeneration as well as treatment of Parkinson's disease, which was incurable disease, various cancers, diabetes and spinal cord injury.
  • Stem cells are cells that have the ability to self-replicate and differentiate into two or more cells.
  • Totipotent stem cells pluripotent stem cells, and multipotent stem cells (multipotent stem cells (MSCs).
  • MSCs multipotent stem cells
  • Pluripotent stem cells are pluripotent cells that can develop into one complete individual. Cells up to 8 cell stages after fertilization of eggs and sperm have these properties. Can occur as an entity. Pluripotent stem cells are cells that can arise from various cells and tissues derived from ectoderm, mesoderm, and endodermal layer. They are derived from inner cell mass located inside the blastocyst appearing after 4-5 days of fertilization. Also known as embryonic stem cells, they differentiate into a variety of other tissue cells but do not form new life.
  • Multipotent stem cells were first isolated from adult bone marrow (Y. Jiang et al ., Nature , 418: 41, 2002) and subsequently identified in other adult tissues (CM Verfaillie, Trends Cell Biol. , 12: 502, 2002).
  • bone marrow is the most widely known source of stem cells, but multipotent stem cells have also been identified from skin, blood vessels, muscle and brain (JG Toma et al., Nat. Cell Biol ., 3: 778, 2001; M Sampaolesi et al ., Science , 301: 487, 2003; Y. Jiang et al., Exp. Hematol. , 30: 896, 2002).
  • stem cells in adult tissues, such as bone marrow are very rare, and these cells are difficult to culture without induction of differentiation, making them difficult to culture without specifically screened media.
  • Equine is a mammalian animal belonging to the genus Equidae (Genus Equus ), and is a very rare kind of animal familiar with humans, along with dogs and cats.
  • the horse and animal industry is a global industry, like the horse racing industry. In the horse racing industry, good horses are of great value. When such horses of good thoroughbred horses are injured, the healing is a problem, and therefore, the importance of the development of cell therapy for horses and animals has been highlighted. In this regard, in consideration of the size of the horse, it is also a major technical problem to stably supply a large number of cells.
  • stem cell research isolating and characterizing stem cells from various tissues of horses.
  • Studies on human and rat stem cells have been attempted in a number of prior arts, but in the case of horses and animals, especially in relation to the horse racing market, the need for cell therapy for the treatment of bone, cartilage, tendons or muscles is great. Nevertheless, there is still little research.
  • the method for separating adult stem cells from tissue or blood is typically cell sorting using antibodies to a number of surface antigens.
  • This method has a limitation in that it is necessary to identify surface antigens of adult stem cells, and another problem is that the surface antigens (hereinafter, markers) common to adult stem cells are not known, and various adult stem cell markers have not been developed.
  • markers also differ in expression level according to differentiation state, and in particular, there are many limitations in utilizing equipment in that cell sorting equipment is expensive.
  • the placenta plays an important role in the development and survival of the fetus by providing nutrition and oxygen to the fetus. Generally, after delivery, the placenta is treated as medical waste and discarded.
  • amnion tissue is a rich source of stem cells in humans, and much research has been conducted on stem cells derived therefrom. In clinical applications, amniotic tissue has an effect on wound healing and retinal surface reconstruction.
  • stem cells In addition to stem cells, other mononuclear cells and other stem cells may be mixed in the amnion, and the distribution of nutrients may be changed under such mixed cell culture conditions, resulting in inhomogeneity of cells. May cause.
  • the present inventors first isolated a homogeneous stem cell population from an amine membrane obtained after the delivery of a mare, a new source of stem cells, which is easy to obtain. Compared with stem cells, the present inventors have confirmed that they have fast and sustained self-renewal ability (growth ability), immune characteristics of mesenchymal stem cells, and excellent differentiation ability into other cells.
  • An object of the present invention is to provide a horse animal amnion-derived mesenchymal stem cells.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing a horse animal amnion-derived mesenchymal stem cells.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for differentiating horses amnion-derived mesenchymal stem cells into various cells.
  • Still another object of the present invention is to provide a cell therapeutic agent containing the horse animal amnion-derived mesenchymal stem cells or tissue cells differentiated therefrom as an active ingredient.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for treating a horse and animal, comprising administering the cell therapeutic agent to an individual in need thereof.
  • the amnion of horses can be a source of horsestem mesenchymal stem cells, and the horse animal amnion-derived mesenchymal stem cells prepared according to the present invention have excellent proliferation and differentiation ability.
  • stem cells of the present invention can be used as an active ingredient of a cell therapeutic agent of horses and animals, which are required in large quantities, and in particular, the stem cells of the present invention having excellent growth and differentiation ability can be used for bone, tendon, muscle injury and deletion diseases such as race horses. It can be usefully used for treatment.
  • eAM-MSCs equine amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells
  • CPDL equine amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells
  • FIG. 3 Alizarin Red S (A, B, C, D) and bone cosa staining results (E, F, G, H) and staining for induction of osteoblast differentiation of eAM-MSCs according to an embodiment of the present invention
  • a graph quantifying the results.
  • Control cells (A, B, E, F) were cultured in low glucose DMEM containing 10% fetal bovine serum.
  • FIG. 4 is a graph quantifying oil red O staining results (A, B: control; C, D: experimental group) and staining results for induction of adipocyte differentiation of eAM-MSCs according to an embodiment of the present invention (E) to be.
  • FIG. 5 is a pellet photograph (A, B) and toluidine blue (C) and alcian blue-PAS (D) staining results of induction of chondrocyte differentiation of eAM-MSCs according to an embodiment of the present invention.
  • a first step of separating the cells from the horse and animal amnion A second step of culturing the isolated stem cells in low glucose DMEM (Low-glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium; LG-DMEM) medium; And it comprises a third step of recovering the cultured cells, and provides a method for producing a horse animal amnion-derived mesenchymal stem cells showing the following characteristics.
  • DMEM Low-glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • Stem cells prepared by the above method shows the immunological properties of all of the human markers CD19, CD20, CD28, CD31, CD34, CD38, CD41a, CD62L, CD62P and CD200, CD44, which is a human marker, Both show positive immunological properties for CD90 and CD105; (b) has the ability to differentiate into ectoderm, mesoderm or endoderm derived cells; (c) Has the capacity to culture at least 14 passages in an undifferentiated state.
  • the first step is to separate the cells from the amnion of a horse and animal, which is a rich source of stem cells but has been treated as medical waste.
  • Cell separation was performed by the method described previously with minor modifications [S. Diaz-Prado et al. , Tissue Eng. Part C Methods , 2010; CM Mihu et al. , Rom. J. Morpho. Embryol , 50: 73-77, 2009], all placental samples were collected from mare animals via cesarean delivery.
  • the amniotic tissue is separated into stem cells before the stem cell separation.
  • the enzyme may be collagen type I (collagenase type I), but is not limited thereto.
  • horse animal is a mammal animal belonging to the family Equidae (Genus Eauus) and has been familiar with humans since ancient times with dogs and cats. All current horses are domesticated horses. There is a theory that prjebalski horses that do not exist in the wild are ancestors of horses. Young horses are called foals and the horse and animal racing industry is a global industry. The horse and the animal is made of a single genus horse, Grave Zebra, Donkey, Horse, Mountain Zebra, Zebra Genus Kwaga, Asian Wild Donkey, African Wild Ass, Dungeon, Tarpan, Przebalski Horse, Syrian Donkey Etc. belong to this.
  • amniotic membrane refers to a single layer that constitutes the placenta in a triple layer structure together with the chorionic and decidual membranes. It's a pocket. Clinical studies have shown that amniotic tissue is effective for wound healing and retinal surface reconstruction.
  • stem cell refers to a cell having self-replicating ability and capable of differentiating into two or more new cells, totipotent stem cells, and pluripotent stem cells. In addition, they can be classified as multipotent stem cells. In order to be recognized as the stem cells, first, they must be replicated in an undifferentiated state, and second, they must be able to differentiate into specific cells under specific culture conditions.
  • the stem cells described above have recently attracted attention as candidates for cell therapeutic compositions due to their differentiation and self-replicating ability, and many studies have been conducted.
  • the horse animal amnion-derived multipotent stem cells of the present invention were confirmed to be capable of proliferation up to 14 passages (FIG. 1D).
  • multipotent stem cell of the present invention means a cell that can only differentiate into specific cells forming tissues and organs into which the stem cells are introduced. It was confirmed that the horse and animal amnion-derived multipotent stem cells of the present invention have the ability to differentiate into bone, fat, and chondrocytes, respectively, according to the culture conditions (Examples 5 to 7; FIGS. 3 to 5).
  • the second step is a step of culturing in low-glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (LG-DMEM) medium, and separating and propagating the homogenized stem cell population.
  • LG-DMEM low-glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • cells are preferably attached to the culture plate and cultured.
  • concentration of glucose in the low concentration glucose DMEM of the second step is 800 to 1200 mg / L, more preferably 1000 mg / L.
  • fetal calf serum may be added to low glucose DMEM medium, but the present invention is not limited thereto.
  • the stem cells of the present invention prepared by the first step and the second step show negative immunological properties for human markers CD19, CD20, CD28, CD31, CD34, CD38, CD41a, CD62L, CD62P and CD200.
  • Human markers CD44, CD90 and CD105 all show positive immunological properties.
  • CD44 a human marker in which the stem cells of the present invention show positive expression, is involved in the movement of MSC as a cell surface glycoprotein.
  • CD90 a human marker, is a stem cell marker of several types (skin-derived stem cells, endothelial stem cells, mesenchymal stem cells), also called Thy-1 [NM Masson et al. , Am. J. Physiol. Gastrointest Liver Physiol.
  • the human marker CD105 is an MSCs marker, also known as endoglin [M. Dominici et al ., Cytotherapy , 8 (4): 315-7, 2006].
  • the stem cells of the present invention do not express CD19, CD20, CD28, CD38, CD62L, CD200, endothelial cell markers CD31, CD62P, CD34P, and platelet markers CD41a. This suggests that the stem cells produced by the method of the present invention are multipotent stem cells.
  • the multipotent stem cells are mesenchymal stem cells.
  • the stem cells prepared by the method of the present invention can be differentiated into bone, fat, or chondrocytes according to the culture conditions, it can be confirmed that they can proliferate up to 14 passages in an undifferentiated state.
  • the stem cells produced by the method of the present invention are multipotent stem cells.
  • all of the human markers CD19, CD20, CD28, CD31, CD34, CD38, CD41a, CD62L, CD62P and CD200 from cells isolated from amnion show negative immunological properties and are human markers.
  • the immunological separation preferably uses antibodies that cross react between different species for the human marker.
  • antibodies specific to horses and animals have not been widely identified. Therefore, the present invention is characterized by characterizing the immunological phenotype of multipotent stem cells isolated from horses and amnion using human specific antibodies.
  • the immunological properties of all of the human markers CD19, CD20, CD28, CD31, CD34, CD38, CD41a, CD62L, CD62P and CD200 are all negative and CD44, the human marker Both show positive immunological properties for CD90 and CD105;
  • the human marker Both show positive immunological properties for CD90 and CD105;
  • the multipotent stem cells may be mesenchymal stem cells.
  • the arachnoid amnion-derived multipotent stem cells prepared by the method of the present invention are cultured in a culture medium containing 2-phosphate ascorbic acid, dexamethasone, and beta-glycerophosphate. It provides a method for differentiating pluripotent stem cells to osteoblasts, characterized in that.
  • a culture medium containing 2-phosphate ascorbic acid, dexamethasone, and beta-glycerophosphate. It provides a method for differentiating pluripotent stem cells to osteoblasts, characterized in that.
  • LG-DMEM Modified Eagle Medium
  • bone cell of the present invention is a star-shaped cell most abundant in dense bone tissue and includes a thin ring of nucleus and cytoplasm. Osteoblasts are trapped in the secreted matrix and form bone cells. Bone cells connect to each other through long cytoplasmic kidneys that fill small ducts called microtubules that are used to exchange nutrients and waste through gap junctions. On the other hand, osteocytes are reduced in their ability to synthesize, do not mitosis, are produced in the mesenchyme, and hydroxyapatite, calcium carbonate, and calcium phosphate accumulate around the cells.
  • the equine animal amnion-derived multipotent stem cells prepared by the method of the present invention include dexamethasone, indomethacin, 3-isobutyl-1-methyl-xanthine and insulin. It provides a method for differentiating pluripotent stem cells into adipocytes, characterized in that it is cultured in a culture medium.
  • a culture medium Preferably 1 ⁇ M dexamethasone, 60 ⁇ M indomethacin, 500 ⁇ M 3-isobutyl-1-methyl-xanthine (IBMX) and 5 ⁇ g / ml It may be cultured in adipocyte differentiation medium containing insulin, but is not limited thereto.
  • fat cell refers to a major cell constituting adipose tissue that stores energy in the form of fat. It exists in two forms: white fat cells, which contain large fat droplets surrounded by a cytoplasmic layer, and polygonal brown fat cells, which contain a significant amount of cytoplasm, evenly dispersed fat droplets.
  • white adipocytes secrete proteins that act as adipokine, such as resistin, adiponectin and leptin.
  • differentiation of multipotent stem cells into chondrocytes is characterized by culturing the amnion-derived multipotent stem cells prepared by the method of the present invention in chondrogenic differentiation medium. It provides a method to make it.
  • the cells are seeded in polypropylene tubes and centrifuged to pellet and cultured in 1 ml of chondrogenic differentiation medium.
  • the chondrogenic differentiation medium may be a medium added with TGF- ⁇ 3, dexamethasone, ascorbate, and the like, but is not limited thereto.
  • chondrocyte of the present invention is the only cell found in cartilage. Chondrocytes produce and maintain cartilage substrates, which are primarily composed of collagen and proteoglycans. The composition of chondrocytes in cartilage depends on the type of cartilage and the location of the tissue.
  • the present invention provides a cell therapeutic agent containing the multipotent stem cells isolated from the amnion of a horse and animal, or the cells differentiated therefrom as an active ingredient by the above method.
  • the term "cell therapeutic agent” refers to a medicine (U.S. FDA regulation) used for the purpose of treatment, diagnosis, and prevention of cells and tissues prepared by isolation, culture, and special manipulation from humans. Means a medicine used for the purpose of treatment, diagnosis and prevention through a series of actions, such as proliferating and screening the living autologous, allogeneic, or heterologous cells in vitro or by altering the biological characteristics of the cells in order to restore.
  • the cell therapy composition of the present invention may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier.
  • “Pharmaceutically acceptable” means that the cells or humans exposed to the composition are not toxic.
  • the carrier can be used without limitation so long as it is known in the art such as buffers, preservatives, analgesics, solubilizers, isotonic agents, stabilizers, bases, excipients, lubricants, preservatives and the like.
  • the pharmaceutical compositions of the present invention can be prepared according to techniques commonly used in the form of various formulations.
  • the cell therapy agent of the composition of the present invention can be administered by any route as long as it can induce migration to the disease site. In some cases, one may consider loading the vehicle with a means for directing stem cells to the lesion.
  • compositions of the present invention may be used topically (including buccal, sublingual, skin and intraocular administration), parenteral (including subcutaneous, intradermal, intramuscular, instillation, intravenous, intraarterial, intraarticular and cerebrospinal fluid) or transdermal administration. It can be administered through several routes, including parenteral, most preferably directly to the affected area.
  • the stem cells can be administered to a subject by suspending it in a suitable diluent at a concentration of about 1 ⁇ 10 3 to 5 ⁇ 10 6 cells / ml, which dilution protects and maintains the cells and upon injection into the desired tissue. Used for ease of use.
  • the diluent may include a saline solution, a phosphate buffer solution, a buffer solution such as HBSS, plasma, cerebrospinal fluid, or a blood component.
  • the pharmaceutical composition can be administered by any device such that the active substance can migrate to the target cell. Preferred modes of administration and preparations are injections.
  • Injections include aqueous solvents such as physiological saline solution, ring gel solution, Hank's solution or sterilized aqueous solution, vegetable oils such as olive oil, higher fatty acid esters such as ethyl oleic acid, and non-aqueous solvents such as ethanol, benzyl alcohol, propylene glycol, polyethylene glycol or glycerin
  • aqueous solvents such as physiological saline solution, ring gel solution, Hank's solution or sterilized aqueous solution
  • vegetable oils such as olive oil
  • higher fatty acid esters such as ethyl oleic acid
  • non-aqueous solvents such as ethanol, benzyl alcohol, propylene glycol, polyethylene glycol or glycerin
  • non-invasive agents known in the art, suitable for the barrier to pass through, for mucosal permeation, and ascorbic acid, sodium hydrogen sulfite, BHA, tocopherol, EDTA as
  • an emulsifier a buffer for pH adjustment, phenyl mercury nitrate, chimerosal, benzalkonium chloride, phenol, cresol, benzyl alcohol, and the like, and a pharmaceutical carrier such as a preservative for preventing the growth of microorganisms.
  • the cell therapy agent is used for treating osteoarthritis of an animal, for treating bone deletion disease of an animal, for forming adipose tissue of an animal, for forming tendon tissue of an animal or for forming muscle tissue of an animal.
  • Cell therapeutic agents are used for treating osteoarthritis of an animal, for treating bone deletion disease of an animal, for forming adipose tissue of an animal, for forming tendon tissue of an animal or for forming muscle tissue of an animal.
  • the present invention provides a cell therapy use of the horse animal amnion-derived mesenchymal stem cells or tissue cells differentiated therefrom.
  • the present invention also provides a method for treating a horse and animal, comprising administering the cell therapeutic agent of the present invention to a subject in need thereof.
  • treatment of the present invention means any action that improves or advantageously changes the symptoms of a disease induced by a disease of a horse and animal, such as damage or deficiency of muscle, cartilage or adipose tissue, by administration of the composition of the present invention. do.
  • the invention has been carried out in accordance with the guidelines of Seoul National University's "Guide to the Protection and Use of Laboratory Animals" and has complied with applicable institutions and government policies and regulations regarding the ethical use of animals.
  • the harvested amnion was treated with trypsin-EDTA (0.25%) for 30 minutes at 37 ° C. and washed three or four times with physiological saline. Subsequently, the amnion from which epithelial cells were removed was cut into small pieces with a surgical knife, and then treated with collagen type I (collagenase type I; 2 mg / ml; Worthington biochemical, Freehold, NJ) at 37 ° C. for about 3 to 4 hours. Isolates into sexual single cells. Subsequently, the cells were washed with phosphate buffered saline solution (PBS; Cellgro, USA) at 350 g for 5 minutes.
  • PBS phosphate buffered saline solution
  • the cell pellet was resuspended in low glucose DMEM (LG-DMEM; Gibco BRL, USA) containing 10% fetal bovine serum (FBS), the basal culture medium.
  • LG-DMEM low glucose DMEM
  • FBS fetal bovine serum
  • Cells were seeded in 75T polystyrene culture flasks (Nunc, USA) and incubated in a wet incubator with 5% carbon dioxide.
  • the basal culture medium was changed three times a week and passaged when reaching 80-90% confluency.
  • FIG. 1A is amnion isolated from placental tissue of an equine animal.
  • EAM-MSCs isolated therefrom showed the typical spindle form of MSCs and attached to plastic culture dishes (FIGS. 1B and C).
  • Fig. 1D an increase curve of stable cell growth up to 14 passages was observed.
  • Gradual cell proliferation is associated with stem cell characteristics.
  • Stem cells have self-renewal capacity associated with continuous and progressive cell proliferation.
  • the CPDL results demonstrated that isolated eAM-MSCs have self-renewal ability.
  • Cells were stained with specific antibodies for flow cytometry, according to manufacturer's protocol (BD Biosciences, USA). Briefly, cultured eAM-MSCs were washed twice with PBS and harvested using 0.25% trypsin / EDTA. The cells were then washed with PBS and divided into groups for antibody staining. Each divided fraction contains about 1 ⁇ 10 5 cells.
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • PE phycoerythrin
  • MSCs generally exhibit a unique pattern of cell surface antigens, including CD44, CD90 and CD105. On the other hand, it is negative for CD11b, CD14, CD19, CD79a, CD34, CD45 and HLA-DR [M. Dominici et al ., Cytotherapy , 8 (4): 315-7, 2006].
  • CD44 is a cell-surface glycoprotein that plays a role in MSC migration.
  • CD90 called Thy-1, is a type of stem cell marker of various types, including liver stem cells, keratin stem cells, endometrial stem cells, and mesenchymal stem cells.
  • CD105 also called SH2, is a well known MSC marker.
  • Other markers such as those expressed by immune cells (CD19, CD20, CD28, CD38, CD62L and CD200), endothelial cells (CD31 and CD62P), hematopoietic stem cells (CD34) and platelets (CD41a) were not expressed.
  • Example 5 Whether can be differentiated into bone cells
  • eAM-MSCs prepared in Example 2, low glucose-Dulbecco's Modified Eagle Medium (LG-DMEM) in 2-phosphate ascorbic acid (50 ⁇ M), dexamethasone (100 nM) , osteogenic differentiation medium containing ⁇ -glycerophosphate (10 mM; Sigma-Aldrich, USA) and 10% fetal bovine serum (FBS).
  • Basic culture medium was used as a control.
  • eAM-MSCs (1 ⁇ 10 5 ) were dispensed into three 6 well plates. When the cells reached 80-90% confluency, the medium was changed to bone formation differentiation medium. The cells were kept in fresh medium for three weeks. Differentiation medium was changed twice a week.
  • alizarin red S and von cosa staining were performed to detect calcium accumulation. Briefly, for Alizarin Red S staining, the cells were washed with PBS and then fixed in ice-cold 70% ethanol at 4 ° C. for 1 hour. The cells were then rinsed 3-4 times with distilled water. Staining was performed with Alizarin Red S (40 mM; pH 4.2; Sigma-Aldrich, USA) for 10 minutes at room temperature. To remove nonspecific dyes, the cells were rinsed with distilled water.
  • the cells were stained for 30 to 60 minutes with 5% silver nitrate under UV exposure and then treated for 2 to 3 minutes with 5% sodium thiosulfate and then counterstained for 5 minutes with nucleus red staining.
  • Alizarin Red S stain was dissolved in cetylpyridinium chloride (100 mM; Sigma-Aldrich, USA) for 1 hour. The dissolved Alizarin Red S absorbance was measured at 570 nm using a spectrophotometer.
  • Example 6 Whether it can be differentiated into adipocytes
  • eAM-MSCs were dexamethasone (1 ⁇ M), indomethacin (60 ⁇ M), 3-isobutyl-1-methyl-xanthine (500 ⁇ M; IBMX) And fat forming differentiation medium comprising 10% FBS in insulin (5 ⁇ g / ml; Sigma-Aldrich, USA) and LG-DMEM.
  • Basic culture medium was used as a control. When the cells reached 80-90% confluency, the adipose differentiation medium was treated for 3 weeks. The medium was changed twice a week. After differentiation, oil red O staining was performed to check for fat droplets.
  • the cells were fixed by incubation with 10% formalin for at least 1 hour and rinsed with 60% isopropanol before incubating with freshly diluted oil red O for 10 minutes. Staining was dissolved with 100% isopropanol and the absorbance obtained was measured at 570 nm using a spectrophotometer.
  • Example 7 the possibility of differentiation into chondrocytes
  • eAM-MSCs were treated with chondrocyte forming differentiation medium.
  • Basic culture medium was used as a control.
  • the cells (5 ⁇ 10 5 ) were seeded in 15 mL polypropylene tubes and centrifuged to obtain pellets.
  • the pellet was incubated in 1 mL chondrocyte forming differentiation medium (Lonza) and incubated under 37% 5% carbon dioxide for 3 weeks. The medium was changed every 3 days.
  • pellets were inserted into paraffin and cut into 3 mm sections. To detect chondrocyte formation, the sections were stained with toluidine blue and alcian blue-paste according to standard protocols.

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Abstract

본 발명은 말과동물 양막-유래 중간엽 줄기세포(equine amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells; eAM-MSCs) 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 사람 마커인 CD19, CD20, CD28, CD31, CD34, CD38, CD41a, CD62L, CD62P 및 CD200에 대하여 모두 음성의 면역학적 특성을 나타내고, 사람 마커인 CD44, CD90 및 CD105에 대하여 모두 양성의 면역학적 특성을 나타내며, 미분화 상태로 14계대 이상 배양되는 능력 및 외배엽, 중배엽 또는 내배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가지는, 말과동물 양막-유래 중간엽 줄기세포에 관한 것이다.

Description

말과동물 양막-유래 중간엽 줄기세포
본 발명은 말과동물 양막-유래 중간엽 줄기세포(equine amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells; eAM-MSCs) 및 그 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 사람 마커인 CD19, CD20, CD28, CD31, CD34, CD38, CD41a, CD62L, CD62P 및 CD200에 대하여 모두 음성의 면역학적 특성을 나타내고, 사람 마커인 CD44, CD90 및 CD105에 대하여 모두 양성의 면역학적 특성을 나타내며, 미분화 상태로 14계대 이상 배양되는 능력 및 외배엽, 중배엽 또는 내배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가지는, 말과동물 양막-유래 중간엽 줄기세포에 관한 것이다.
21세기 생명공학은 인간복지를 목표로 식량, 환경, 건강 문제에 새로운 해결책의 가능성을 제시하고 있으며, 특히 최근 줄기세포의 이용기술은 난치병 치료의 새로운 장으로 떠오르고 있다. 이전까지는 난치병 치료를 위해 장기이식이나 유전자 치료 등이 제시되었으나, 면역 거부와 공급장기 부족, 유전자에 대한 지식 부족으로 실용화가 미진하였다.
이에 줄기세포 연구에 대한 관심이 고조되어, 증식과 분화를 통해 모든 기관을 형성할 능력을 가진 만능 줄기세포가 대부분의 질병 치료는 물론 장기 훼손을 근원적으로 해결할 수 있을 것으로 인식되었다. 또한, 많은 과학자가 거의 모든 장기재생은 물론 난치병이었던 파킨슨병, 각종 암, 당뇨병과 척추손상 등의 치료에 이르기까지 다양한 줄기세포의 적용 가능성을 제시해왔다.
줄기세포(stem cells)란 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포로, 만능 줄기세포(totipotent stem cells), 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cells), 다분화능 줄기세포(multipotent stem cells; MSCs)로 분류할 수 있다.
만능 줄기세포는 하나의 완전한 개체로 발생해 나갈 수 있는 만능의 성질을 가진 세포로 난자와 정자의 수정 이후 8 세포기까지의 세포가 이러한 성질을 가지며 이 세포를 분리하여 자궁에 이식하면 하나의 완전한 개체로 발생해 나갈 수 있다. 전분화능 줄기세포는 외배엽, 중배엽, 내배엽층 유래의 다양한 세포와 조직으로 발생할 수 있는 세포로, 수정 4 내지 5일 후 나타나는 배반포(blastocyst)의 안쪽에 위치한 내세포괴(inner cell mass)에서 유래하며 이를 배아 줄기세포라고도 하며 다양한 다른 조직세포로 분화되지만 새로운 생명체를 형성하지는 못한다.
다분화능 줄기세포는 성체 골수에서 최초로 분리되었고(Y. Jiang et al., Nature, 418: 41, 2002), 그 후 다른 여러 성체 조직에서도 확인되었다(C. M. Verfaillie, Trends Cell Biol., 12: 502, 2002). 다시 말해, 골수는 가장 널리 알려진 줄기세포의 공급원이지만, 다분화능 줄기세포는 피부, 혈관, 근육 및 뇌로부터도 확인되었다(J. G. Toma et al., Nat. Cell Biol., 3: 778, 2001; M. Sampaolesi et al., Science, 301: 487, 2003; Y. Jiang et al., Exp. Hematol., 30: 896, 2002). 그러나, 골수와 같은 성체 조직 내의 줄기세포는 매우 드물게 존재하고, 이러한 세포들은 분화유도하지 않고 배양하기 어려워서, 특이적으로 스크린 된 배지들이 없으면 그 세포들을 배양하기 어렵다.
이러한 다분화능 줄기세포주의 확립이 중요한 이유는 줄기세포주의 증식/동결 연구, 특성화 연구, 약품 시험 및 자가/동종/이종 이식의 목적에 기인한다.
말과동물(Equine)은 말과(Equidae;Genus Equus)에 속하는 포유류 동물이며, 개나 고양이와 함께, 인간과 친숙한 매우 드문 종류의 동물이다. 말과동물과 관련된 산업은 경마 산업과 같이 범세계적인 산업을 이루고 있다. 경마 산업에서는 좋은 혈통의 말은 매우 큰 가치를 가지고 있다. 이러한 좋은 혈통의 경마용 말이 부상을 당할 경우, 그 치유가 문제되므로, 말과동물을 위한 세포 치료제의 개발의 중요성이 부각되어 왔다. 이에 있어서, 말의 크기를 고려할 때, 많은 세포를 안정적으로 공급하는 것도 주요한 기술적 과제이다.
따라서, 말의 여러 조직 유래의 줄기세포를 분리하고 특성화하는 것이 줄기세포 연구 분야의 주요과제가 되어왔다. 인간과 쥐 유래의 줄기세포에 대한 연구는 여러 종래기술에서 시도되어 왔으나, 말과동물의 경우, 특히 경마시장과 관련하여, 뼈, 연골, 힘줄 또는 근육의 치료를 위한 세포 치료제로서의 필요성이 큼에도 불구하고 아직 연구가 미진한 상황이다.
말과동물의 지방조직에서 줄기세포를 분리하는 것이 보고된 바 있으나 (Armando de Mattos Carvalho et al., Veterinary Immunology and Immunopathology, 132: 303, 2009), 말과동물의 경우, 다른 포유류와는 달리 그 특성상 지방조직이 개체에 다량 존재하지 않으므로 수득이 극히 어렵다는 문제가 있다. 또한, 지방을 개체로부터 획득하는 방법은 침습적이며(invasive), 고통을 유발한다. 말과동물 골수 유래 줄기세포의 경우도 골수 획득의 방법이 지방과 마찬가지로 침습적인 방법을 사용한다는 점과 경주마로 이용되는 말과 동물의 특성상 지방 또는 골수 유래 줄기세포는 세포 획득에 뚜렷한 한계가 있다.
한편, 성체줄기세포를 세포 치료제로 사용하기 위해서 현 기술단계에서는 미분화 상태가 유지될 수 있는 배양 조건이 규격화되어야 하며, 이와 더불어, 조직으로부터 분리한 성체줄기세포는 다종의 세포가 혼합된 상태이기 때문에, 균질의 성체줄기세포를 다량 배양할 수 있는 기술도 해결해야 할 문제점 중에 하나이다. 특히 조직 또는 혈액으로부터 성체줄기세포를 분리하는 방법은 통상적으로 다수의 표면항원에 대한 항체를 이용한 Cell sorting을 예로 들 수 있다. 상기 방법은 성체줄기세포의 표면항원을 파악하고 있어야 한다는 한계가 있으며, 다른 문제는 성체줄기세포 공통의 표면항원(이하, 마커)이 밝혀지지 않았고, 또한 성체줄기세포 마커가 다양하게 개발되어 있지 않은 상태이며, 알려진 마커도 분화상태에 따라서 발현 정도가 다르며, 특히 마커의 발현 정도에 따라 세포를 분류하는 장비가 고가라는 점에서 활용하는데 제약이 많다.
태반은 태아에 영양과 산소를 공급함으로 태아의 발달과 생존에 중요한 역할을 한다. 일반적으로, 분만 후 태반은 의료 폐기물로 취급되어 버려진다. 그러나 최근의 연구에 따르면 인간에서 양막 조직은 풍부한 줄기세포의 원천으로 이로부터 유래된 줄기세포에 관한 많은 연구가 진행되어 왔다. 임상적용에 있어서, 양막 조직은 창상 치료와 망막 표면 재건에 효과를 갖는다. 양막에는 줄기세포뿐만 아니라, 기타 단핵세포 및 타 줄기세포가 함께 혼합되어 있을 가능성이 있으며, 이러한 혼합된 세포배양 조건에서는 양분(nutrient)의 분배 정도가 달라질 수 있으며, 이로 인하여 세포의 분화상태에 비균질성을 야기할 수 있다. 결국, 균질한 세포군으로 제조할 수 없다는 문제는 치료제로서 사용할 경우 예상하는 효과와 다르게 나타날 수 있다는 치명적인 단점으로 작용하기 때문에, 균질한 성체줄기세포를 다량 얻을 수 있는 효과적인 배양 기술의 개발이 시급한 상황이다.
본 발명자들은 수득이 용이한 새로운 줄기세포 공급원인 암말의 분만 후 채취하는 양막(equine amniotic membrane)으로부터 최초로 균질성이 향상된 줄기세포(stem cells) 군(population)을 분리하여, 상기 분리된 줄기세포가 타 줄기세포에 비해 빠르고 지속적인 자기 재생 능력(성장능), 중간엽 줄기세포의 면역특성 및 다른 세포로의 우수한 분화 능력을 가짐을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 말과동물 양막-유래 중간엽 줄기세포를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 말과동물 양막-유래 중간엽 줄기세포의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 말과동물 양막-유래 중간엽 줄기세포를 다양한 세포로 분화시키는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 말과동물 양막-유래 중간엽 줄기세포 또는 이로부터 분화된 조직세포를 유효성분으로 함유하는 세포 치료제를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 말과동물 양막-유래 중간엽 줄기세포 또는 이로부터 분화된 조직세포의 세포치료 용도를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 세포 치료제를 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 말과동물을 치료하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명에 따르면, 말과동물의 양막이 말과동물 중간엽 줄기세포의 공급원이 될 수 있음을 확인하였고, 본 발명에 따라 제조된 말과동물 양막-유래 중간엽 줄기세포는 우수한 증식능 및 분화능을 나타내는 바, 줄기세포가 대량으로 요구되는 말과동물의 세포 치료제의 유효성분으로 사용될 수 있으며, 특히 성장능 및 분화능이 뛰어난 본 발명의 줄기세포는 경주마 등의 뼈, 힘줄, 근육 부상 및 결실 질환의 치료에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은, 본 발명의 일 실시예에 따른 말과동물 양막-유래 중간엽 줄기세포(equine amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells; eAM-MSCs)의 초대 배양과 누적 집단 배가 수준(cumulative population doubling level; CPDL)을 나타낸 그래프이다. (A)는 수득한 말과동물 양막 조직, (B, C)는 eAM-MSCs의 위상차 이미지를 나타낸다. (D)는 eAM-MSCs의 세포 성장곡선을 나타낸다.
도 2는, 본 발명의 일 실시예에 따른 eAM-MSCs의 FACS 분석 결과이다.
도 3은, 본 발명의 일 실시예에 따른 eAM-MSCs의 골세포 분화 유도에 대한 알리자린 레드 S(A, B, C, D)와 본 코사 염색 결과(E, F, G, H) 및 염색 결과를 정량한 그래프이다. 대조군 세포(A, B, E, F)는 10% 소태아혈청을 포함한 저농도 글루코스 DMEM에서 배양하였다.
도 4는, 본 발명의 일 실시예에 따른 eAM-MSCs의 지방세포 분화 유도에 대한 오일 레드 O 염색 결과(A, B: 대조군; C, D: 실험군) 및 염색 결과를 정량한 그래프 (E) 이다.
도 5는, 본 발명의 일 실시예에 따른 eAM-MSCs의 연골세포 분화 유도의 펠렛 사진 (A, B) 및 톨루이딘 블루 (C)와 알시안 블루-PAS (D) 염색 결과이다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 실시양태로서, 말과동물 양막에서 세포를 분리하는 제1단계; 분리한 줄기세포를 저농도 글루코스 DMEM(low-glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium; LG-DMEM) 배지에서 배양하는 제2단계; 및 배양된 세포를 회수하는 제3단계를 포함하여, 다음과 같은 특성을 나타내는 말과동물 양막-유래 중간엽 줄기세포의 제조방법을 제공한다. 상기의 방법으로 제조된 줄기세포는 (a) 사람 마커인 CD19, CD20, CD28, CD31, CD34, CD38, CD41a, CD62L, CD62P 및 CD200에 대하여 모두 음성의 면역학적 특성을 나타내고, 사람 마커인 CD44, CD90 및 CD105에 대하여 모두 양성의 면역학적 특성을 나타내며; (b) 외배엽, 중배엽 또는 내배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가지고; (c) 미분화상태로 14계대 이상 배양되는 능력을 가진다.
상기 제1단계는, 줄기세포의 풍부한 원천이지만 의료 폐기물로 취급되어 버려지고 있는, 말과동물의 양막으로부터 세포를 분리하는 단계이다. 세포분리는 약간의 변형을 가해 이전에 기술된 방법으로 실시하였으며[S. Diaz-Prado et al., Tissue Eng. Part C Methods, 2010; C. M. Mihu et al., Rom. J. Morpho. Embryol, 50: 73-77, 2009], 모든 태반 시료는 말과동물로부터 제왕절개 분만을 통해 수거하였다.
상기 제1단계에서 줄기세포 분리 전 양막 조직에 효소를 처리하여 단일세포로 분리한다. 바람직하게 상기 효소로는 제1형 콜라겐 분해효소(collagenase type I)가 사용될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어 "말과동물"이란, 말과(Equidae; Genus Eauus)에 속하는 포유류 동물이며 개나 고양이와 함께 예로부터 인간과 친숙하게 지내온 동물 중 하나로 현재의 말은 모두 길들여진 말이며, 지금은 야생상태로 존재하지 않는 프르제발스키말이 말의 조상이라는 설이 있다. 어린 말은 망아지라 부르며 말과동물과 관련된 경마산업은 범세계적인 산업을 이루고 있다. 상기 말과동물은 단일 속인 말속으로 되어있으며, 그레비얼룩말, 당나귀, 말, 산얼룩말, 얼룩말아속의 콰가, 아시아야생당나귀, 아프리카야생당나귀, 컁당나귀, 타르판, 프셰발스키말, 시리아당나귀 등이 이에 속한다.
본 발명의 용어 "양막"이란, 융모막, 탈락막과 함께 삼중층의 구조로 태반을 구성하는 하나의 층으로, 상피 단층과 기질막의 이중층 구조를 갖는 얇은 무혈관 막으로 태아에 결합하여 환경을 구성하는 주머니이다. 임상연구에 의하면 양막 조직은 창상 치료 및 망막 표면 재건에 효과가 있는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 용어 "줄기세포"란, 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 새로운 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 의미하며, 만능 줄기세포(totipotent stem cells), 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cells), 다분화능(다능성) 줄기세포(multipotent stem cells)로 분류할 수 있다. 상기 줄기세포로 인정되기 위해서는 첫째, 미분화상태로 계속 복제 되어야하며, 둘째, 특정 배양조건에서 특정 세포로 분화가 가능해야 한다. 상기 기술된 줄기세포는 분화능력과 자가복제능력 때문에 최근 세포 치료제 조성물 후보로 주목받고 많은 연구가 진행되고 있다. 본 발명의 말과동물 양막-유래 다분화능 줄기세포는 14계대까지 증식 가능함을 확인하였다(도 1D).
본 발명의 용어 "다분화능 줄기세포"란, 줄기세포가 도입되는 조직 및 기관을 형성하는 특이적인 세포로만 분화할 수 있는 세포를 의미한다. 본 발명의 말과동물 양막-유래 다분화능 줄기세포는 배양조건에 따라 각각 골, 지방, 연골세포로 분화하는 능력을 가짐을 확인하였다(실시예 5 내지 7; 도 3 내지 5).
상기 제2단계는 저농도 글루코스 DMEM(low-glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium; LG-DMEM) 배지에서 배양하는 단계로서 균질성이 향상된 줄기세포군을 분리하여 증식시키는 단계이다. 상기 제2단계의 배양은 세포가 배양접시에 부착 배양하는 것이 바람직하다. 또한 상기 제2단계의 저농도 글루코스 DMEM 중 글루코스의 농도는 800 내지 1200 mg/L이며, 보다 바람직하게는 1000 mg/L이다. 더불어 저농도 글루코스 DMEM 배지에 소태아혈청을 첨가하여 배양할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 제1단계 및 제2단계에 의해 제조된 본 발명의 줄기세포는 사람 마커인 CD19, CD20, CD28, CD31, CD34, CD38, CD41a, CD62L, CD62P 및 CD200에 대하여 모두 음성의 면역학적 특성을 나타내고, 사람 마커인 CD44, CD90 및 CD105에 대하여 모두 양성의 면역학적 특성을 나타낸다. 이때, 본 발명의 줄기세포가 양성 발현을 나타내는 사람 마커인 CD44는 세포 표면 당단백질로서 MSC의 이동에 관여한다. 사람 마커인 CD90은 Thy-1이라고도 불리는 여러 종류(피부유래 줄기세포, 내피유래 줄기세포, 중간엽 줄기세포)의 줄기세포 마커이고[N. M. Masson et al., Am. J. Physiol. Gastrointest Liver Physiol., 290(1): G45-65, 2006], 사람 마커인 CD105는 엔도글린(endoglin)이라고도 알려져 있는, MSCs 마커이다[M. Dominici et al., Cytotherapy, 8(4): 315-7, 2006]. 한편, 본 발명의 줄기세포는 면역세포 마커인 CD19, CD20, CD28, CD38, CD62L, CD200, 내피세포 마커인 CD31, CD62P, 혈구세포 마커인 CD34 및 혈소판 마커인 CD41a에 대해서는 발현하지 않는다. 이는 본 발명의 방법으로 제조된 줄기세포가 다분화능 줄기세포임을 제시하는 것이다. 바람직하게는 상기 다분화능 줄기세포는 중간엽 줄기세포이다.
본 발명의 실시예에 의하면, 상기 본 발명의 방법으로 제조된 줄기세포가 배양 조건에 따라 골, 지방, 또는 연골세포로 분화하는 것을 확인할 수 있었고, 미분화상태로 14계대까지 증식할 수 있음을 확인할 수 있었다. 이 또한 본 발명의 방법으로 제조된 줄기세포가 다분화능 줄기세포임을 제시하는 것이다.
본 발명의 다른 실시양태로서, 양막으로부터 분리된 세포로부터 사람 마커인 CD19, CD20, CD28, CD31, CD34, CD38, CD41a, CD62L, CD62P 및 CD200에 대하여 모두 음성의 면역학적 특성을 나타내고, 사람 마커인 CD44, CD90 및 CD105에 대하여 모두 양성의 면역학적 특성을 나타내는 중간엽 줄기세포를 분리하는 단계를 포함하여, 다음과 같은 특성을 나타내는 균질의 말과동물 양막-유래 다분화능 줄기세포의 제조방법을 제공한다: (a) 외배엽, 중배엽 또는 내배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가지며; (b) 미분화상태로 14계대 이상 배양되는 능력을 가짐.
상기 면역학적 분리는 상기 사람 마커에 대한 상이한 종(species)간에도 교차반응하는 항체를 사용하는 것이 바람직하다. 현재까지 말과동물에 특이적인 항체는 다양하게 밝혀지지 않은 상태이다. 따라서, 본 발명은 말과동물 양막으로부터 분리한 다분화능 줄기세포의 면역학적 표현형을 사람 특이적 항체를 이용하여 특성화하였다는데 그 특징이 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태로서, (a) 사람 마커인 CD19, CD20, CD28, CD31, CD34, CD38, CD41a, CD62L, CD62P 및 CD200에 대하여 모두 음성의 면역학적 특성을 나타내고, 사람 마커인 CD44, CD90 및 CD105에 대하여 모두 양성의 면역학적 특성을 나타내며; (b) 외배엽, 중배엽 또는 내배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가지고; (c) 미분화상태로 14계대 이상 배양되는 능력을 가지는 말과동물 양막-유래 다분화능 줄기세포를 제공한다. 바람직하게 상기 다분화능 줄기세포는 중간엽 줄기세포일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태로서, 상기 말과동물 양막-유래 중간엽 줄기세포를 골세포, 지방세포 또는 연골세포로 분화시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 본 발명의 방법에 의해 제조된 말과동물 양막-유래 다분화능 줄기세포를 2-인산 아스코르브산, 덱사메타손, 및 베타-글리세로포스페이트를 포함하는 배양 배지에 배양하는 것을 특징으로 하는 다분화능 줄기세포를 골세포로 분화시키는 방법을 제공한다. 바람직하게는 저농도 글루코스 DMEM(low glucose-Dulbecco's Modified Eagle Medium; LG-DMEM)에 50 μM 2-인산 아스코르브산(ascorbic acid 2-phosphate), 100 nM 덱사메타손, 10 mM β-글리세로포스페이트(β-glycerophosphate) 및 10% 소태아혈청을 포함하는 골형성 분화 배지를 사용하여 배양할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어 "골세포"란 촘촘한 골조직에 가장 풍부한 별모양의 세포로 핵과 세포질의 얇은 고리를 포함한다. 골모세포가 스스로 분비한 기질에 갇혀 골세포를 형성한다. 골세포는 간극결합을 통해 영양분과 폐기물을 교환하는데 사용되는 소관계라 불리는 작은 관을 채우는 긴 세포질 신장을 통해 서로 연결된다. 한편, 골세포는 합성 능력이 감소되어 유사분열하지 않으며 중간엽에서 생성되고, 수산화인회석, 탄산칼슘, 및 인산칼슘이 세포 주위에 축적된다.
본 발명의 다른 실시예에 의하면, 상기 본 발명의 방법에 의해 제조된 말과동물 양막-유래 다분화능 줄기세포를 덱사메타손, 인도메타신, 3-이소부틸-1-메틸-크산틴 및 인슐린을 포함하는 배양 배지에 배양하는 것을 특징으로 하는 다분화능 줄기세포를 지방세포로 분화시키는 방법을 제공한다. 바람직하게는 1 μM 덱사메타손(dexamethasone), 60 μM 인도메타신(indomethacin), 500 μM 3-이소부틸-1-메틸-크산틴(3-isobutyl-1-metyl-xanthine; IBMX) 및 5 μg/ml 인슐린을 포함하는 지방세포화 분화 배지에 배양할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어 "지방세포"란 지방의 형태로 에너지를 저장하는 지방 조직을 구성하는 주된 세포이다. 이는 세포질 층으로 둘러싸인 커다란 지방 방울을 포함하는 백색지방세포와 지방 방울이 고루 흩어져있는 상당량의 세포질을 포함하는 다각형의 갈색지방세포의 두가지 형태로 존재한다. 백색지방세포는 레지스틴, 아디포넥틴 및 렙틴과 같은 아디포카인(adipokine)으로 작용하는 단백질을 분비한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 의하면, 상기 본 발명의 방법에 의해 제조된 말과동물 양막-유래 다분화능 줄기세포를 연골발생 분화 배지에 배양하는 것을 특징으로 하는 다분화능 줄기세포를 연골세포로 분화시키는 방법을 제공한다. 바람직하게는 폴리프로필렌 튜브에 세포를 시딩하고 원심분리하여 펠렛으로 만들어 1 ml의 연골발생 분화 배지에서 배양할 수 있다. 상기 연골발생 분화 배지는 TGF-β3, 덱사메타손, 아스코르브산염 등을 첨가한 배지일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 상용화된 것을 구입하여 사용할 수도 있다.
본 발명의 용어 "연골세포"란 연골에서 발견되는 유일한 세포이다. 연골세포는 주로 콜라겐과 프로테오글리칸으로 구성되는 연골기질을 생산하고 유지한다. 연골 내에서 연골세포의 구성은 연골의 형태 및 조직의 위치에 따라 달라진다.
본 발명의 또 다른 실시양태에 의하면, 본 발명은 상기 방법으로 말과동물의 양막으로부터 분리된 다분화능 줄기세포, 또는 이로부터 분화된 세포를 유효성분으로 함유하는 세포 치료제를 제공한다.
본 발명의 용어 "세포치료제"란, 사람으로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FDA규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종세포를 체외에서 증식 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 의미한다.
상기 본 발명의 세포치료 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수도 있다. 상기 "약학적으로 허용되는" 이란 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 것을 말한다. 상기 담체는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제, 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등 당업계에 공지된 것이라면 제한없이 사용할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 각종 제형의 형태로 통용되는 기법에 따라 제조될 수 있다. 본 발명의 조성물인 세포치료제는 질병부위로 이동을 유도할 수 있다면 어떠한 경로를 통해서든지 투여 가능하다. 경우에 따라서는 줄기세포를 병변으로 향하게 하는 수단을 구비한 비히클에 로딩하는 방안을 고려할 수도 있다. 따라서 본 발명의 조성물은 국소 (협측, 설하, 피부 및 안내 투여를 포함), 비경구 (피하, 피내, 근육내, 점적, 정맥 내, 동맥 내, 관절 내 및 뇌척수액 내를 포함) 또는 경피성 투여를 포함한 여러 경로를 통해 투여할 수 있으며, 바람직하게는 비경구로, 가장 바람직하게는 발병부위에 직접 투여한다. 일 양태로서 줄기세포는 적합한 희석제에 약 1×103 내지 5×106 세포/ml의 농도로 현탁시켜 개체에 투여할 수 있는데, 이 희석제는 세포를 보호 및 유지하고, 목적하는 조직에 주입시 사용에 용이하도록 하는 용도로 사용된다. 상기 희석제로는 생리식염수, 인산완충용액, HBSS 등의 완충용액, 혈장, 뇌척수액, 또는 혈액성분 등이 있을 수 있다. 또한, 제약 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있도록 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다. 바람직한 투여방식 및 제제는 주사제이다. 주사제는 생리식염액, 링겔액, Hank 용액 또는 멸균된 수용액 등의 수성용제, 올리브 오일 등의 식물유, 에틸올레인산 등의 고급 지방산 에스테르 및 에탄올, 벤질알코올, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 또는 글리세린 등의 비수성용제 등을 이용하여 제조할 수 있고, 점막 투과를 위해, 통과할 배리어에 적합한 당업계에 공지된 비침투성제가 사용될 수 있으며, 변질방지를 위한 안정화제로 아스코르빈산, 아황산수소나트륨, BHA, 토코페롤, EDTA 등과, 유화제, pH 조절을 위한 완충제, 질산페닐수은, 치메로살, 염화벤잘코늄, 페놀, 크레솔, 벤질알코올 등의 미생물 발육을 저지하기 위한 보존제 등의 약학적 담체를 추가적으로 포함할 수 있다.
바람직하게 상기 세포 치료제는 말과동물의 골관절염 치료용, 말과동물의 골 결실 질환 치료용, 말과동물의 지방 조직 형성용, 말과동물의 힘줄 조직 형성용 또는 말과동물의 근육 조직 형성용인 세포 치료제일 수 있다.
따라서, 본 발명의 말과동물 양막-유래 중간엽 줄기세포 또는 이로부터 분화된 조직세포의 세포치료 용도를 제공한다.
또한, 본 발명의 상기 세포 치료제를 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 말과동물을 치료하는 방법을 제공한다.
상기 본 발명의 용어 "치료"란 본 발명의 조성물의 투여로 말과동물의 질환 예컨대, 근육, 연골 또는 지방조직의 손상 또는 결핍에 의해 유도되는 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아닌 것은 당업자에게 자명할 것이다.
본 발명은 서울대학교의 "실험동물의 보호 및 사용에 관한 가이드"의 지침을 따라 수행되었으며 동물의 윤리적 사용과 관련된 적용가능한 기관 및 정부의 정책과 규제를 준수하였다.
또한 이하 모든 실시예의 통계 분석은 Stat View software package (SAS, Cary, NC)를 사용하여 실시하였다. 데이터는 다섯 번 또는 그 이상의 독립적 실험으로부터 평균 ±S.E.M로서 보고하였다. 그룹간의 통계학적으로 유의한 차이는 ANOVA 시험의 반복된 측정으로 계산하였다.
실시예 1: 말과동물 양막 수거
분만을 위한 제왕절개에 의해 분리된 후 정상적으로 버려지는 양막을 사용하였다(서울대학교 수의과 병원). 이는 연구의 목적으로 비용없이 제공되었다. 이렇게 분리된 막은 오로지 조직으로부터의 줄기세포의 분리와 특성화에만 사용되었다.
모든 태반 샘플(n=4)은 한국의 개인 말 농장에서 분만 후 순종 암말로부터 얻었다. 조직에 대한 오염 및 손상을 줄이기 위해, 모든 샘플은 멸균된 수술 도구를 사용하여 분만 후 즉시 수거되었다. 수거된 태반 샘플은 먼지 많은 환경으로부터 가능한 오염을 피하고자 4℃에서 보관되어 가능한 즉시 실험실로 옮겨졌다. 양막은 융모막으로부터 물리적으로 벗겨냈다.
실시예 2: 줄기세포 분리 및 배양
세포 분리 및 배양은 약간의 변형을 가해 이전에 기술된 방법으로 실시하였다[S. Diaz-Prado et al., Tissue Eng. Part C Methods, 2010; C. M. Mihu et al., Rom. J. Morpho. Embryol, 50: 73-77, 2009]. 모든 태반 시료는 실시예 1의 방법으로 말과동물로부터 제왕절개 분만을 통해 수거하였다. 전체 태반으로부터 양막을 분리하기 위하여, 양막을 융모막으로부터 물리적으로 벗겨냈다. 멸균 조건하에서, 수거된 양막을 생리 식염수(0.9%)로 서너번 씻어냈다. 상피세포들을 제거하기 위해, 수거된 양막에 트립신-EDTA(0.25%)를 37℃에서 30분간 처리하고, 생리 식염수로 서너번 세척하였다. 이어서, 상피세포를 제거한 양막을 수술용 칼로 작게 자른 후 37℃에서 약 3 내지 4시간 동안 제1형 콜라겐 분해효소(collagenase type I; 2 mg/ml; Worthington biochemical, Freehold, NJ)로 처리하여 중배엽성 단일세포로 분리시켰다. 이어서, 인산 완충 염용액(PBS; Cellgro, USA)으로 350 g로 5분간 원심분리하여 세척하였다. 상등액을 제거한 후, 세포 펠렛은 기본 배양 배지인 10% 소태아혈청(FBS)을 포함하는 저농도 글루코스 DMEM(LG-DMEM; Gibco BRL, USA)으로 재현탁하였다. 세포를 75T 폴리스티렌 배양 플라스크(Nunc, USA)에 시딩하고 5% 이산화탄소의 습식 배양기에서 인큐베이션하였다. 기본 배양 배지는 일주일에 3회 교환하였고 80 내지 90% 컨플루언시에 이르렀을 때 계대배양하였다.
그 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1A는 말과동물의 태반조직으로부터 분리된 양막이다. 이로부터 분리된 eAM-MSCs는 MSCs의 전형적인 방추형태를 나타내었고 플라스틱 배양접시에 부착되었다(도 1B 및 C).
실시예 3: 누적 집단 배가 수준 분석(cumulative population doubling level analysis)
세포 증식 분석은 약간의 변형을 가하여 이전에 기술된 바와 같이 실시하였다[S. B. Park et al., Cytotherapy, 13: 1431-43, 2011]. 다분화능 줄기세포를 비롯한 줄기세포는 자기 재생 능력이 있으며, 이는 계속적이고 꾸준한 증식율과 관련되어 있다[Reya T. et al., Nature, 414(6859): 105-11, 2001]. 따라서 상기 실시예 2에서 수득된 eAM-MSCs의 추산된 성장 효율 및 증식 잠재력은 전체 누적 집단 배가 수준에 기초하여 결정하였다. 이것은 공식 CPDL = ln ( Nf / Ni ) ln2를 사용하였고, 여기서 Ni는 초기 시딩 세포 수이고, Nf는 최종 수거 세포 수 및 ln은 자연 로그이다. 세포(5×104)를 6웰 배양 용기 3개에 분주하여 5 내지 7일 후 계대배양하였다. 최종 세포수를 계수하였고 5×104 세포를 재분주하였다. 누적 집단 배가 수준을 산출하기 위해, 각 계대의 집단 배가를 계산하였고 이전 계대의 집단 배가 수준에 더하였다. 상기 과정은 증식률이 감소하기 시작하는 14계대까지 반복되었다.
그 결과는 도 1D에 나타낸 바와 같이 14계대까지 안정적인 세포 성장의 증가 곡선이 관찰되었다. 점진적인 세포 증식능은 줄기세포의 특성과 연관된다. 줄기세포는 계속적이고 점진적인 세포 증식과 관계된 자기 재생 능력을 가지고 있다. 상기 CPDL 결과는 분리된 eAM-MSCs가 자기 재생 능력을 가짐을 증명하였다.
실시예 4: 유세포 분석에 의한 eAM-MSCs의 면역표현형 특성 확인
세포는 제조사의 프로토콜(BD Biosciences, USA)에 따라, 유세포 분석을 위해 특이적 항체로 염색하였다. 간략하게, 배양된 eAM-MSCs는 PBS로 두번 세척하여 0.25% 트립신/EDTA를 사용하여 수거하였다. 그 후, 상기 세포를 PBS로 세척하여 항체 염색을 위한 그룹으로 나누었다. 각 나누어진 분획은 약 1 × 105의 세포를 포함하고 있다. 하기의 항체는 세포 표면 항원 감지를 위해 사용하였다: 마우스 항-인간 CD19, 마우스 항-인간 CD20, 마우스 항-인간 CD28, 마우스 항-인간 CD31, 마우스 항-인간 CD34, 마우스 항-인간 CD38, 마우스 항-인간 CD41a, 마우스 항-인간 CD44, 마우스 항-인간 CD62L, 마우스 항-인간 CD62P, 마우스 항-인간 CD90, 마우스 항-인간 CD200 (BD Biosciences) 및 마우스 항-인간 CD105 (Serotec, USA); 모든 항체는 플루오레세인이소티오시안산염(FITC) 또는 피코에리트린(PE)에 결합되었다. 상기 세포를 4℃에서 30분간 염색하였다. 항온처리 후, 세포를 PBS로 세척한 후 PBS 500 ㎕에 재현탁하였다. 상기 분석은 FACS CaliburTMBD Biosciences) 및 Quest ProTM(BD Biosciences) 소프트웨어를 가지고 실시하였다.
일반적으로 MSCs는 CD44, CD90 및 CD105를 포함하는 세포 표면 항원의 독특한 패턴을 나타낸다. 반면, CD11b, CD14, CD19, CD79a, CD34, CD45 및 HLA-DR에 대해서는 음성을 나타낸다[M. Dominici et al., Cytotherapy, 8(4): 315-7, 2006]. 본 발명자들은 계대 5에서 eAM-MSCs의 유세포 분석을 실시하여 이들 세포가 MSCs 형질을 나타내는지 여부를 결정하기 위해 13개의 CD 마커(CD19, CD20, CD28, CD31, CD34, CD38, CD41a, CD44, CD62L, CD62P, CD90, CD105 및 CD200)를 사용하였다(도 2). 상기 eAM-MSCs는 CD44, CD90 및 CD105를 발현하였다. CD44는 MSC 이동에 역할을 하는 세포-표면 당단백질이다. Thy-1이라고 불리는 CD90은 간 줄기세포, 각질 줄기 세포, 자궁 내막 줄기 세포 및 중간엽 줄기 세포를 포함하는 다양한 타입의 줄기 세포 마커이다. SH2라고도 불리는 CD105는 잘 알려진 MSC 마커이다. 면역세포(CD19, CD20, CD28, CD38, CD62L 및 CD200), 내피세포(CD31 및 CD62P), 조혈모세포(CD34) 및 혈소판(CD41a)에 의해 발현되는 것과 같은 다른 마커는 발현되지 않았다. 이들 결과는 eAM-MSCs가 통상적인 MSC와 유사한 면역 형질을 지님을 보여준다.
실시예 5: 골세포로의 분화 가능 여부
상기 실시예 2에서 제조된 eAM-MSCs의 골 형성능을 시험하기 위해, 저농도 글루코스 DMEM(low glucose-Dulbecco's Modified Eagle Medium; LG-DMEM)에 2-인산 아스코르브산(50 μM), 덱사메타손(100 nM), β-글리세로포스페이트(10 mM; Sigma-Aldrich, USA) 및 10% 소태아혈청(fetal bovine serum; FBS)을 포함하는 골형성 분화 배지로 처리하였다. 대조군으로는 기본 배양 배지가 사용되었다. eAM-MSCs (1 × 105)는 6웰 플레이트 3개에 분주하였다. 상기 세포가 80 내지 90%의 컨플루언시를 도달했을 때, 배지를 골 형성 분화 배지로 갈아 주었다. 상기 세포는 3주 동안 새 배지에서 유지하였다. 분화 배지는 1주일에 2번 갈아 주었다. 분화 후, 칼슘 축적 감지를 위해 알리자린 레드 에스 및 본 코사 염색을 실시하였다. 간략하게, 알리자린 레드 에스 염색을 위해, 상기 세포를 PBS로 세척한 후 얼음으로 냉장된 70% 에탄올에 4℃에서 1시간 동안 고정하였다. 그 후, 세포를 증류수로 3 내지 4번 린스하였다. 염색은 실온에서 10분간 알리자린 레드 에스(40 mM; pH 4.2; Sigma-Aldrich, USA)로 실시하였다. 비특이적 염료를 제거하기 위해, 상기 세포를 증류수로 린스하였다. 본 코사 염색을 위해, 상기 세포는 자외선 노출하에 5% 질산은으로 30 내지 60분간 염색하였고 그 후 5% 티오황산나트륨으로 2 내지 3분간 처리하였고, 그 후 뉴클리어 레드 염색으로 5분간 카운터스테이닝을 하였다. 알리자린 레드 에스 염색은 세틸피리디늄 클로라이드(100 mM; Sigma-Aldrich, USA)에서 1시간동안 용해하였다. 용해된 알리자린 레드 에스 흡광도는 분광 광도계를 사용하여 570 nm에서 측정하였다.
그 결과, 대조군인 기본 배양 조건하에서, 상기 줄기세포는 알리자린 레드 에스 및 본 코사 염색에 음성인 반면(도 3A, B, E 및 F), 골형성 분화 배지로 처리한 경우, 알리자린 레드 에스 및 본 코사 염색에 강한 양성 반응이 감지되었다(도 3C, D, G 및 H). 정량화를 위해, 세틸피리디늄 클로라이드로 용출시킨 알리자린 레드 에스의 흡광도는, 대조군과 비교하여, 분화된 세포에서 약 15배 더 높았다(도 3I).
실시예 6: 지방세포로의 분화 가능 여부
상기 실시예 2에서 제조된 eAM-MSCs의 지방 분화능을 시험하기 위해, eAM-MSCs를 덱사메타손(1μM), 인도메타신(60μM), 3-이소부틸-1-메틸-크산틴(500μM; IBMX) 및 인슐린(5 ㎍/ml; Sigma-Aldrich, USA) 및 LG-DMEM 중의 10% FBS를 포함하는 지방 형성 분화 배지에 처리하였다. 대조군으로는 기본 배양 배지를 사용하였다. 상기 세포가 80 내지 90%의 컨플루언시를 도달했을 때, 지방 형성 분화 배지를 3주 동안 처리하였다. 배지는 1주일에 2번 갈아 주었다. 분화 후, 지방 방울을 확인하기 위해, 오일 레드 O 염색을 실시하였다. 상기 세포는 10% 포르말린으로 적어도 1시간 동안 항온처리하여 고정하였으며 새로이 희석된 오일 레드 O로 10분간 항온처리하기 전에 60% 이소프로판올로 린스하였다. 염색은 100% 이소프로판올을 가지고 용해하였고, 수득된 흡광도는 분광 광도계를 사용하여 570 nm에서 측정하였다.
그 결과, 본 발명자들은 분화 조건하에서 형성된 지방 방울을 검출할 수 있었고(도 4C 및 D) 대조 조건하에서는 그렇지 않음을 확인하였다(도 4A 및 B). 세포의 분화 상태를 정량하기 위하여 오일 레드 O를 용출시켜 흡광도를 측정한 결과는 도 4E에 나타내었다. 분화된 세포는 대조군 세포보다 5배 높은 흡광도 값을 나타내었다.
실시예 7: 연골세포로의 분화 가능 여부
상기 실시예 2에서 제조된 eAM-MSCs의 연골 세포 형성능을 시험하기 위해, eAM-MSCs는 연골 세포 형성 분화 배지로 처리하였다. 대조군으로는 기본 배양 배지가 사용되었다. 상기 세포(5 ×105)를 15mL 폴리프로필렌 튜브에 시딩하여 펠렛을 얻기 위해 원심분리를 하였다. 상기 펠렛은 1mL 연골 세포 형성 분화 배지(Lonza)에서 배양하였고 3주동안 37℃ 5% 이산화탄소 하에서 항온처리하였다.상기 배지는 3일마다 갈아주었다. 분화 후, 펠렛을 파라핀에 끼워 넣고 3 mm 절편으로 잘랐다. 연골 세포 형성을 감지하기 위해, 상기 절편을 표준 프로토콜에 따라 톨루이딘 블루 및 알시안 블루-파스로 염색하였다. 간략하게, 슬라이드에 마운트된 3mm 세포 펠렛 슬라이스를 탈파라핀화하고 증류수를 가지고 수화하였다. 톨루이딘 블루 염색을 위해, 슬라이드를 톨루이딘 블루 워킹 용액에 1분간 잠구었다. 과량의 결합되지 않은 염료를 증류수로 몇번 세척하여 제거하였다. 상기 슬라이드는 95% 및 절대 알코올로 연속적으로 세척하여 재빠르게 탈수하였다. 알시안 블루-파스 염색을 위해, 상기 슬라이드를 알시안 블루 (pH 2.5), 0.5% Periodic acid 및 Schiff 시약으로 염색하였다. 상기 슬라이드를 자일렌으로 깨끗이 한 후 카나다 발삼 및 커버슬립으로 닫았다.
그 결과, 3주간의 분화 후, 분화 후, 본 발명자들은 폴리프로필렌 튜브의 바닥에서 펠렛의 형성을 관찰하였다. 펠렛의 형태는 타원형의 불투명한 구조를 보여주었다(도 5A, B). 검은 화살표는 펠렛 형성을 나타내었다(도 5A). 그러나, 대조군 조건하에서, 펠렛 형성은 관찰되지 않았다. 배지가 바뀔 때, 상기 세포는 재현탁되어 연골 형성이 기본 배양 배지에서는 일어나지 않음을 암시하였다. 펠렛은 톨루이딘블루(toluidine blue; 도 5C) 및 알시안 블루-파스(alcian blue-PAS; 도 5D)로 양성적으로 염색되었다.

Claims (19)

  1. 말과동물 양막에서 세포를 분리하는 제1단계;
    분리한 세포를 저농도 글루코스 DMEM(low-glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium; LG-DMEM) 배지에서 배양하는 제2단계; 및
    배양된 세포를 회수하는 제3단계를 포함하여,
    다음과 같은 특성을 나타내는 말과동물 양막-유래 다분화능 줄기세포의 제조방법:
    (a) 사람 마커인 CD19, CD20, CD28, CD31, CD34, CD38, CD41a, CD62L, CD62P 및 CD200에 대하여 모두 음성의 면역학적 특성을 나타내고, 사람 마커인 CD44, CD90 및 CD105에 대하여 모두 양성의 면역학적 특성을 나타냄;
    (b) 외배엽, 중배엽 또는 내배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가짐; 및
    (c) 미분화상태로 14계대 이상 배양되는 능력을 가짐.
  2. 제1항에 있어서,
    제1단계는 양막을 효소로 분해시켜 양막 상피 세포층을 제거하는 제1세부단계; 및
    상기 상피세포층을 제거한 양막을 화학적 방법으로 중배엽성 단일세포를 분리하는 제2세부단계로 구성되는 제조방법.
  3. 제2항에 있어서,
    제1세부단계의 효소는 트립신-EDTA를 사용하는 것이 특징인 제조방법.
  4. 제2항에 있어서,
    제2세부단계의 화학적 방법은 제1형 콜라겐 분해효소를 처리하는 것이 특징인 제조방법.
  5. 제1항에 있어서,
    제2단계는 부착배양하는 것이 특징인 제조방법.
  6. 제1항에 있어서,
    제2단계의 LG-DMEM은 글루코스의 농도가 800 내지 1200 mg/L인 것이 특징인 제조방법.
  7. 제1항에 있어서,
    제2단계에서 LG-DMEM 배지에 소태아혈청을 첨가하여 배양하는 것이 특징인 제조방법.
  8. 양막으로부터 분리된 세포로부터 사람 마커인 CD19, CD20, CD28, CD31, CD34, CD38, CD41a, CD62L, CD62P 및 CD200에 대하여 모두 음성의 면역학적 특성을 나타내고, 사람 마커인 CD44, CD90 및 CD105에 대하여 모두 양성의 면역학적 특성을 나타내는 중간엽 줄기세포를 분리하는 단계를 포함하여,
    다음과 같은 특성을 나타내는 균질의 말과동물 양막-유래 다분화능 줄기세포의 제조방법:
    (a) 외배엽, 중배엽 또는 내배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가짐; 및
    (b) 미분화상태로 14계대 이상 배양되는 능력을 가짐.
  9. 제8항에 있어서,
    면역학적 분리는 상기 사람 마커에 대해 상이한 종(species)간에도 교차반응하는 항체를 사용하는 것이 특징인 제조방법.
  10. 다음과 같은 특성을 가지는 말과동물 양막-유래 다분화능 줄기세포:
    (a) 사람 마커인 CD19, CD20, CD28, CD31, CD34, CD38, CD41a, CD62L, CD62P 및 CD200에 대하여 모두 음성의 면역학적 특성을 나타내고, 사람 마커인 CD44, CD90 및 CD105에 대하여 모두 양성의 면역학적 특성을 나타냄;
    (b) 외배엽, 중배엽 또는 내배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가짐; 및
    (c) 미분화상태로 14계대 이상 배양되는 능력을 가짐.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 말과동물은 얼룩말, 말, 노새 및 당나귀로 구성된 군에서 선택되는 하나인 것이 특징인 다분화능 줄기세포.
  12. 제10항에 있어서,
    중간엽 줄기세포인 다분화능 줄기세포.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항의 다분화능 줄기세포를 2-인산 아스코르브산, 덱사메타손, 및 베타-글리세로포스페이트를 포함하는 배양 배지에 배양하는 것을 특징으로 하는 다분화능 줄기세포를 골세포로 분화시키는 방법.
  14. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항의 다분화능 줄기세포를 덱사메타손, 인도메타신, 3-이소부틸-1-메틸-크산틴 및 인슐린을 포함하는 배양 배지에 배양하는 것을 특징으로 하는 다분화능 줄기세포를 지방세포로 분화시키는 방법.
  15. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항의 다분화능 줄기세포를 연골발생 분화 배지에 배양하는 것을 특징으로 하는 다분화능 줄기세포를 연골세포로 분화시키는 방법.
  16. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 제조된 다분화능 줄기세포, 또는 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 기재된 다분화능 줄기세포, 또는 이로부터 분화된 세포를 유효성분으로 함유하는 세포 치료제.
  17. 제16항에 있어서,
    말과동물의 골관절염 치료용, 말과동물의 골 결실 질환 치료용, 말과동물의 지방 조직 형성용, 말과동물의 힘줄 조직 형성용 또는 말과동물의 근육 조직 형성용인 세포 치료제.
  18. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 제조된 다분화능 줄기세포, 또는 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 기재된 다분화능 줄기세포, 또는 이로부터 분화된 세포의 세포치료 용도.
  19. 제16항의 세포 치료제를 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 말과동물을 치료하는 방법.
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