WO2013075199A1 - "compostos acil-hidrazonas e oxadiazóis, composições farmacêuticas compreendendo os mesmos e seus usos - Google Patents

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Ricardo José NUNES
Alessandra MASCARELLO
Rosendo Augusto YUNES
Taisa Regina STUMPF
Paulo Cesar Leal
José Andres YUNES
Carolina PEREIRA DE SOUZA MELO
Rafael Renatino CANEVAROLO
Louise DOMENEGHINI CHIARADIA
André BORTOLINI SILVEIRA
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Definitions

  • the present invention relates to 3,4,5-trimethoxyphenylhydrazide-derived acylhydrazones for the treatment of diseases associated with cell proliferation (such as leukemias, tumors, inflammation and other proliferative diseases). More specifically, the invention relates to compounds having cyclin-dependent protein kinase (CDKs) and topoisomerase I inhibitory activity, which may therefore be useful in the treatment of acute lymphoid leukemia (ALL). The invention further relates to obtaining unpublished acylhydrazones and oxadiazoles from 3,4,5-trimethoxyphenylhydrazide.
  • CDKs cyclin-dependent protein kinase
  • ALL acute lymphoid leukemia
  • Neoplastic cells differ from normal cells by their high invasive power, loss of function, loss of differentiation, and metastasis because they have less adhesion to each other (Rang, HP; Dale, MM; Ritter, J. M. Moore, PK Pharmacology 5th ed Rio de Janeiro: Elsevier, 2004. 703 p).
  • Leukemias are one of several types of cancer, and occur by neoplastic proliferation of lymphoid or myeloid hematopoietic cells, resulting from the mutation of a single stem cell whose offspring forms a clone of leukemic cells.
  • leukemias are one of several types of cancer, and occur by neoplastic proliferation of lymphoid or myeloid hematopoietic cells, resulting from the mutation of a single stem cell whose offspring forms a clone of leukemic cells.
  • several genetic changes occur for malignant transformation, including inadequate expression of oncogenes and loss of function of tumor suppressor genes (Bain, BJ Diagnosis in Leukemia. Rio de Janeiro: Elsevier, 2003, Chap. 1, 01-56), which may be associated with genetic or risk factors (such as smoking, radiation exposure or chemicals such as benzene) (INCA, National Cancer Institute.
  • Leukemia - prevention, genetics, other risk factors available at:
  • Acute leukemias are characterized by a defect in cell maturation, which causes an imbalance between proliferation and maturation; as leukemic clone cells continue to proliferate without reaching maturation and death, leading to continued expansion of the leukemic clone and predominance of immature cells (INCA 2009b, Bain, BJ Leukemia diagnosis. Rio de Janeiro: Elsevier , 2003, Chap. 1, 01-56).
  • Acute lymphoid leukemia is due to the uncontrolled proliferation of immature lymphoid progenitor cells in the bone marrow, which results in very rapid accumulation of neoplastic cells (Plasschaert, S .; Van Der Kolk, D .; De Bont, E .; Vellenga, E., Kamps, W .; De Vries, E. Breast Cancer Resistance Protein (BCRP) in Acute Leukemia. Leukemia & Lymphoma, 2004, 45, 649-654).
  • ALL Acute lymphoid leukemia
  • Taxol TM paclitaxel antineoplastic
  • vincristine an alkaloid used in the therapy of acute leukemia and other tumor types, which acts in the same way as paclitaxel by binding to tubulin, interfering with microtubule formation (polymerization) or reorganization (depolymerization) (Goodman and Gilman. the pharmacological basis of therapeutics, 10th Ed., published by the McGraw-Hill Companies. 2006).
  • the most commonly used chemotherapy drugs in current leukemia therapy include daunorubicin, doxorubicin, dexamethasone, vincristine, methotrexate and mercaptopurine (Plasschaert, S .; Van Der Kolk, D .; De Bont, E .; Kell, W .; De Vries, E. Breast Cancer Resistance Protein (BCRP) in Acute Leukemia (Leukemia & Lymphoma, 2004, 45, 649-654). These drugs confer therapeutic benefit but also significant toxicity to the organism and normal cells due to their role in inducing apoptosis and inhibiting cell proliferation (Herr, I.; Debatin, KM; Cellular stress response and apoptosis in cancer therapy.
  • BCRP Breast Cancer Resistance Protein
  • Antineoplastic agents also interfere with normal tissues that have rapidly dividing cells and can cause many undesirable effects, such as reduced production of the body's defense cells, poor wound healing, alopecia, gastrointestinal epithelium damage, sterility and teratogenicity ( Rang, HP; Dale, MM; Ritter, J. M.; Moore, PK Pharmacology. 5th ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2004. 703 p).
  • results in murine cells B16F1 and A375 (in vitro) of these compounds showed no improvement in potency and selectivity of the starting compound, these results were very promising and identified some important structural components for anti-melanoma activity (Wang, Z Lu, Y; Seibel, W.; Miller, DD; Li, W. Identifying Novel Molecular Structures for Advanced Melanoma by Ligand-Based Virtual Screening. Journal of Chemical Informati 1420-1427).
  • acylhydrazones appear as an interesting class of compounds with antitumor activity.
  • the present invention relates to the production of acylhydrazones, especially derivatives of 3,4,5-trimethoxyphenylhydrazide, for the treatment of cell proliferation associated diseases (such as leukemias, tumors, inflammation and other proliferative diseases).
  • Patent application PI 0112674-1 (Cyclin-dependent kinases n- [5 - [[[5-alkyl-2-oxazolyl] methyl] thio] -2-thiazolyl] carboxamide inhibitors) describes compounds and their pharmaceutically acceptable enantiomorphs, diastereoisomers, solvates and salts as protein kinase inhibitors useful in the treatment of proliferative diseases such as cancer, inflammation and arthritis.
  • the synthesized compounds may also be useful for the treatment of Alzheimer's disease, chemotherapy-induced alopecia and cardiovascular disease.
  • the compounds described in PI 0112674-1 represent more complex structures than those disclosed throughout the present invention.
  • the compounds referenced in US Patent Application Publication No. 20040138272 (1,4-Substituted cyclohexane derivatives) may be useful in preventing cell proliferation in malignant diseases by inhibiting Rho kinases useful in inducing central and peripheral nervous system repair by induction. of axon growth and regeneration.
  • the mechanism of action of the compounds of US 20040138272 differs from that proposed for the structures of the present invention.
  • Cyclin-dependent kinase inhibitors useful in modulating cell cycle progression are proposed in patent application PI 0418095-0 (Cyclin-dependent kinase inhibitors, compositions and uses related thereto). Such compounds would be useful for treating patients with disorders associated with excessive cell proliferation.
  • the compounds described in PI 0418095-0 are different acylhydrazones from those proposed during the present invention, with a more complex synthesis process.
  • Patent application PI 0508364-8 (4-Benzimidazol-2-yl-pyridazin-3-one derivatives) describes compounds and their physiologically tolerated salts which act as kinase inhibitors, in particular CDK2 kinase 2 cyclin-dependent).
  • the compounds of PI 0508364-8 are different from those proposed throughout the present invention with more complex synthesis.
  • U.S. Patent Application Publication No. 20070066610 (Acylhydrazones as kinase modulators) describes acylhydrazones as inhibitors of tyrosine kinases, comprising c-et, a receptor tyrosine kinase that regulates cell proliferation, morphogenesis and motility.
  • the acylhydrazones described in US 20070066610 differ from those proposed in the course of this invention with more complex synthesis. Furthermore, the target action of the described compounds differs from that proposed in this invention.
  • US Patent Application Publication 20080194562 (Pyrazole Derivatives for the Inhibition of Cdk's and Gsk's) refers to the synthesis of pyrazoles, compounds which inhibit or modulate the activity of cyclin-dependent kinases (CDK) and glycogen synthase kinases (GSK), and their use in the treatment or prophylaxis of kinase-mediated disease or condition. Also disclosed are pharmaceutical compositions containing the chemical compounds and intermediates. The compounds of US 20080194562 are different from those proposed in the course of the present invention.
  • Oxadiazoles are an important class of heterocyclic compounds with a wide range of biological activities such as antiviral, antimicrobial, antineoplastic, fungicidal, tyrosinase inhibition and cathepsin K (Kumar, D .; Sundaree, S.; Johnson, EO; Shah, K. An efficient synthesis and biological study of novel indolyl-1,3,4-oxadiazoles as potent anticancer agents.
  • Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2009, 19, 4492-4494 are excellent amide and ester bioisters that can contribute substantially to increased pharmacological activity by participating in hydrogen bonds as receptors (Guimar ⁇ es, CRW; Boger, D.L; Jorgensen, W.L Elucidation of Fatty Acid Amide Hydrolase Inhibition by Potent ⁇ -Ketoheterocycle Derivatives from Monte Carlo Simulations, Journal of the American Chemical Society, 2005, 127, 17377-17384).
  • the aim of the present invention is to obtain synthetic compounds derived from 3,4,5-trimethoxyphenylhydrazide (hydrazones and oxadiazols) and all analogues and the like thereof by simple synthetic route as well as the use of these compounds.
  • synthetic compounds derived from 3,4,5-trimethoxyphenylhydrazide (hydrazones and oxadiazols) and all analogues and the like thereof by simple synthetic route as well as the use of these compounds.
  • diseases associated with cell proliferation such as leukemias, especially acute lymphoid leukemia - ALL
  • the present invention also describes the processes used for determining the biological activity of these compounds.
  • the present invention relates to a class of acylhydrazones, especially those derived from 3,4,5-trimethoxyphenylhydrazide, as well as their oxadiazole analogous compounds and other analogous and similar compounds, and the pharmaceutical application of all of these in the present invention.
  • treatment of different diseases associated with cell proliferation such as leukemias, including acute lymphoid leukemia (ALL), tumors and inflammation.
  • ALL acute lymphoid leukemia
  • the present invention also describes the methods used for determining the biological activity of all such compounds.
  • acylhydrazones with activity similar to the compound used as standard in the experiments (colchicine) were obtained.
  • the higher selectivity of the compounds presented in this invention is an important feature related to lower side effects than the drugs currently employed in the clinic.
  • Synthesized acylhydrazones, more specifically compounds 02 and 07 showed important antileukemic activity, indicating 02 and 07 as candidates for prototype drugs, or drugs, for the treatment of leukemia, especially acute lymphoid leukemia (ALL), tumors. and other proliferative diseases such as inflammation.
  • ALL acute lymphoid leukemia
  • the mechanism of action of the most active compounds was determined by the use of DNA microarrays and subsequent tests indicated by the chip, as well as selectivity studies in healthy human lymphocytes.
  • Figure 2 shows that Compound 07 induces cell cycle arrest in G2 / M.
  • Jurkat cells treated for 18 h with 125 nM of compound 07 or DMSO were subjected to cell cycle analysis after propidium iodide labeling and flow cytometry analysis.
  • Figure 3 shows results of Western blot analysis for various cell cycle regulators. Protein extracts from Jurkat cells treated with 125 nM of compound 07 (F8) or vehicle (DMSO).
  • Figure 4 shows that compound 07 is a strong apoptosis inducer in Jurkat cells. Taken together, the results suggest that compound 07 promotes cell cycle arrest and apoptosis mainly through Chk2 and Rb.
  • Jurkat cells treated for 18h with 125 nM of compound 07 or DMSO were double-labeled with annexin V / propidium iodide and analyzed by flow cytometry.
  • FIG 5 shows the effect of compound 07 on human lymphocytes (WBC) and 15 Jurkat and REH leukemic cells after 48h. Normal lymphocyte proliferation was stimulated with phytohemagglutinin. The percent survival value of the compound 07 treated cells relative to the survival of the same vehicle treated cells (DMSO) is shown.
  • the present invention comprises the obtainment and mechanism of action of synthetic acylhydrazones and their analogous compounds and the like, which may be useful in the treatment of leukemias, especially acute lymphoid leukemia (ALL), tumors and other proliferative diseases, such as inflammation.
  • ALL acute lymphoid leukemia
  • ring B represents:
  • a complementary group of compounds according to the present invention comprises compounds of structure II:
  • ring B represents:
  • ring B represents:
  • novel acylhydrazones of the present invention were obtained from the condensation reaction between 3,4,5-trimethoxyphenylhydrazide and different aldehydes using refluxing ethanol as the reaction as follows: wherein ring B represents:
  • Table 1 shows the yields obtained in the syntheses and experimental melting points of unpublished 3,4,5-trimethoxyphenylhydrazones.
  • compound 02 was previously published as a reaction intermediate to obtain oxadiazoles (azzone, G .; Bonina, F .; Formica, F. Some aroylhydrazones of halobenzaldehydes and halo-substituted 2,5-diaryl-, 3,4- Pharmaco, Ediette Scientifica, 1978, 33 (12), 963-71) and compound 07 has previously been evaluated as a MAO (monoamine oxidase) inhibitor (Mazzone, G .; Arrigo Reina, R.
  • MAO monoamine oxidase
  • ring B represents:
  • ring B represents:
  • Table 2 shows the yields obtained in the syntheses and the experimental melting point of oxadiazoles.
  • the present invention also describes the determination of the mechanism of action of synthesized acylhydrazones and their analogous and similar compounds comprising oxadiazoles.
  • the invention further relates to the use of all these compounds as prototypes of drugs, or drugs, for the treatment of
  • ALL acute lymphoid leukemia
  • tumors and other diseases associated with cell proliferation, such as inflammation.
  • ALL acute lymphoid leukemia
  • acylhydrazones described in the present invention selectively act on nanomolar-active leukemic cells as compared to their activity in healthy human lymphocytes, as will be described below in
  • the present invention describes pharmaceutical compositions comprising compounds described above in association with pharmaceutically acceptable excipients, vehicles and adjuvants.
  • pharmaceutically acceptable means a non-toxic, inert solid, semi-solid liquid excipient, diluent, auxiliary formulation of any kind, or simply a sterile aqueous medium such as saline.
  • materials that may serve as pharmaceutically acceptable carriers are sugars such as lactose,
  • glucose and sucrose starches such as cornstarch and potato starch, cellulose and its derivatives, such as sodium carboxymethylcellulose, ethylcellulose and cellulose acetate, cyclodextrin; oils such as peanut oil, cottonseed oil, sunflower oil, sesame oil, olive oil, corn oil and soybean oil; glycols such as propylene glycol, polyols such as glycerin glycol, sorbitol, mannitol and polyethylene; esters such as ethyl laurate, ethyl oleate, agar; buffering agents such as aluminum hydroxide and magnesium hydroxide; alginic acid; pyrogen free water; isotonic saline, Ringer's solution; ethyl alcohol and phosphate buffer solutions as well as other compatible non-toxic substances used in pharmaceutical formulations.
  • starches such as cornstarch and potato starch, cellulose and its derivatives, such as sodium carboxymethylcellulose, ethylcellulose and cellulose
  • compositions comprising the compounds of the present invention may be for administration in any type of administration, especially parenteral administration.
  • compositions of the present invention may comprise any type of excipient used in the manufacture of medicaments in any of the above mentioned pharmaceutical forms, such as absorbents, diluents, binders, disintegrants, lubricants, glidants, plasticizers, coating agents, matrix forming agents. controlled release solvents and co-solvents, wetting agents, emulsifying agents, surfactants, consistency donating agent, tonicity agents, wetting agents, airborne blowing agents, alkalizing or acidifying agents, preservatives, antioxidants, bactericides, bacteriostats, chelating, coloring and sweetening agents.
  • excipient used in the manufacture of medicaments in any of the above mentioned pharmaceutical forms
  • absorbents such as absorbents, diluents, binders, disintegrants, lubricants, glidants, plasticizers, coating agents, matrix forming agents. controlled release solvents and co-solvents, wetting agents, emulsifying agents, surfactants, consistency donating
  • Suitable absorbers for the compositions of the present invention may be any substance added to absorb water present in the extracts or to fix certain volatile compounds, such as essences.
  • Non-limiting examples of such excipients are calcium phosphate, kaolin, magnesium carbonate, bentonite and talc.
  • compositions of the present invention may comprise, as a diluent, any inert product added to the formula to enable tablets or capsules to be filled with adequate volumes and to provide flow and compression properties necessary for production, for example, but not limited to. lactose, tribasic calcium phosphate, starch, mannitol, calcium sulfate, microcrystalline cellulose (MicrocelD, AvicelD), dibasic calcium phosphate (EncompressD, Ditabn), magnesium oxide, magnesium carbonate, talc, kaolin, calcium carbonate, dextrose , fructose, lactose, aspartame, cellulose, maltose, mannitol, guar gum, sorbitol, starch and sucrose.
  • lactose tribasic calcium phosphate
  • starch mannitol
  • mannitol calcium sulfate
  • microcrystalline cellulose MicrocelD, AvicelD
  • dibasic calcium phosphate EncompressD, Ditab
  • Suitable binder substances for the compositions of the present invention may be agents used to promote particle adhesion during granulation and compression of solid dosage forms, they may also be used in the compositions of the present invention, for example carbopol, povidone, xanthan gum, gum arabic. , alginic acid, compressible sugar, C-Na, ethylcellulose, gelatin, methylcellulose, povidone (PVP), starch, pregelatinized starch and liquid glucose in solution, dispersion or powder form.
  • Suitable disintegrants or disintegrants for the compositions of the present invention may be any component employed to accelerate disintegration and / or dissolution of the pharmaceutical form in biological fluids, for example alginic acid, starch, sodium alginate, CMC-Na, microcrystalline cellulose, croscarmellose sodium (Ac-Di-SolD), starch sodium glycolate (ExplotabD) and crospovidone (Kollidon CLD).
  • alginic acid starch, sodium alginate, CMC-Na, microcrystalline cellulose, croscarmellose sodium (Ac-Di-SolD), starch sodium glycolate (ExplotabD) and crospovidone (Kollidon CLD).
  • Suitable lubricants for the compositions of the present invention may be, for example, magnesium stearate, calcium stearate, stearic acid, talc and hydrogenated vegetable oil (eg LubritabD).
  • Suitable glidants for the compositions of the present invention may be, for example, colloidal silica (Aerosil 200D) and talc.
  • Plasticizing agents suitable for the compositions of the present invention may be used in conjunction with polymers to modify their phase transition temperature and to facilitate the coalescence of films formed on granules, tablets or pellets.
  • Nonlimiting examples of such agents are glycerine, triethylcitrate, dibutylphthalate, silicone and PPG.
  • Coating agents employed to coat compositions of the present invention in the form of tablets, granules, capsules or pellets may be, for example, cellulose acetophthalate, ethylcellulose, gellan gum, maltodextrin, methacrylates, methylcellulose, microcrystalline cellulose, shellac, waxes, shellacs, gelatin, cellulose derivatives (methyl or ethylcellulose, cellulose acetophthalate, hydroxypropyl methylcellulose, cellulose acetate), copolymers of acrylic and methacrylic esters (EudragitD types L100, RS 30D, RS PM, S100, among others), polyvinyl alcohol (PVA) and polyvinyl acetate.
  • PVA polyvinyl alcohol
  • Controlled release matrix forming agents possibly employed in the compositions of the present invention for the purpose of obtaining prolonged and / or controlled release of the active ingredient (s) may be HPMC, CMC-Na, xanthan gum, CarbopolD, various types of EudragitD, agar, PEOs, cyclodextrin, nanospheres and nanoparticles. any nature.
  • Solvents and co-solvents such as alcohol, corn oil, cottonseed oil, glycerin, isopropyl alcohol, mineral oil, oleic acid, peanut oil, purified water and water for injection, among others, may also be used in the present compositions. invention.
  • Suitable wetting agents for the compositions of the present invention may be any substance added for the purpose of decreasing surface tension at the solid / liquid interface, for example sodium lauryl sulfate (LSS), sodium docusate and polysorbates 20, 60, 80 (Tween 20, 60, 80).
  • LSS lauryl sulfate
  • Tween 20, 60, 80 Teween 20, 60, 80
  • Suitable emulsifying agents for the compositions of the present invention may be, for example, glyceryl monostearate, cetyl alcohol and gelatin and auxiliaries such as CMC-Na, MC, alginate and pectin.
  • Surfactants such as benzalkonium chloride, nonoxynol 10, octoxynol 9, polysorbate 80 and sodium lauryl sulfate are also suitable for the compositions of the present invention.
  • Consistency donors suitable for the compositions of the present invention may be any substance used to increase the consistency of ointments, for example cetyl alcohol, white wax, yellow wax, stearyl alcohol, paraffin, microcrystalline wax and cetyl ester wax.
  • Suitable tonicity agents for the compositions of the present invention may be any substance used to obtain solutions with osmotic characteristics similar to those of biological fluids for ocular, nasal, parenteral administration such as NaCl (0.9%), mannitol (5). , 07%) and dextrose (5.51%).
  • Suitable humectants for the compositions of the present invention may be glycerine, propylene glycol and sorbitol.
  • Suitable lifting agents for the compositions of the present invention may be any liquid used as a facilitating agent in the process of reducing drug particles during the preparation of emulsions, oily bases, among others, for example mineral oil (liquid petroleum jelly), glycerin, propylene glycol , PEG 400, cottonseed oil, castor oil and Polysorbate 80 (Tween ® 80).
  • Air release agents suitable for the compositions herein may be employed to expel air from hermetically sealed containers or fluid formulations to increase stability, for example nitrogen (N2) and carbon dioxide (CO2).
  • N2 nitrogen
  • CO2 carbon dioxide
  • Alkalizing or acidifying agents such as citric acid, ammonia solution, acetic acid, ammonium carbonate, fumaric acid, diethanolamine, hydrochloric acid (HCI), monoethanolamine, tartaric acid, potassium hydroxide (KOH), boric acid, sodium hydroxide ( NaOH), sodium bicarbonate, sodium borate and triethanolamine are also suitable for the compositions of the present invention.
  • Preservatives that may be used in the compositions of the present invention are, for example, antifungals such as benzoic acid, sodium benzoate, butylparaben, methylparaben (Nipagin), propylparaben (Nipasol), ethylparaben, sodium propionate, and antibacterials such as benzalkonium chloride. , benzethonium chloride, benzyl alcohol, cetylpyridinium chloride, chlorobutanol and phenol.
  • antifungals such as benzoic acid, sodium benzoate, butylparaben, methylparaben (Nipagin), propylparaben (Nipasol), ethylparaben, sodium propionate
  • antibacterials such as benzalkonium chloride.
  • benzethonium chloride benzyl alcohol
  • cetylpyridinium chloride chlorobutanol and phenol.
  • Suitable antioxidant agents for the compositions of the present invention may be selected from the group comprising butylhydroxyanisole (BHA), butylhydroxytoluene (BHT), ⁇ -tocopherol, ascorbic acid, sodium metabisulfite, ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA), citric acid, cysteine, glutathione vitamin C, sodium metabisulphite, cysteine and sodium thiosulphate.
  • BHA butylhydroxyanisole
  • BHT butylhydroxytoluene
  • ⁇ -tocopherol ascorbic acid
  • sodium metabisulfite sodium metabisulfite
  • EDTA ethylenediamine tetraacetic acid
  • citric acid cysteine
  • glutathione vitamin C glutathione vitamin C
  • sodium metabisulphite cysteine and sodium thiosulphate
  • compositions of the present invention may further comprise, as buffering agents, citrate buffer, phosphate buffer and borate buffer.
  • colorants flavorings and flavorings can be used, for example, vanilla, menthol, cinnamon oil, anise oil and cocoa.
  • Sweeteners may be, for example, aspartame, dextrose (glucose), mannitol, sorbitol, saccharin, sodium cyclamate, sugar, potassium acesulfame, sucralose and stevioside.
  • compositions of the present invention may further comprise excipients such as bactericides, bacteriostats, antioxidants, preservatives, buffers, stabilizers, pH adjusters, osmolarity adjusters, antifoam and surfactants, and residues of antigen inactivating or fractionating agents, growth media and solvents commonly used in the production of medicines.
  • excipients such as bactericides, bacteriostats, antioxidants, preservatives, buffers, stabilizers, pH adjusters, osmolarity adjusters, antifoam and surfactants, and residues of antigen inactivating or fractionating agents, growth media and solvents commonly used in the production of medicines. Examples of these types of components can be found in the book The Handbook of Pharmaceutical Excipients (RAYMOND C. ROWE, Publisher The Pharmaceutical Press).
  • compositions described in the present invention are available. The particular mode selected will depend on the particular active ingredient selected, the dosage required for therapeutic efficacy and the patient to whom the composition will be administered.
  • the present invention describes the use of the compounds and compositions described herein for the treatment of cell proliferation-associated diseases such as acute lymphoid leukemia (ALL), tumors and inflammation.
  • ALL acute lymphoid leukemia
  • the present invention describes methods of treating cell proliferation-associated diseases such as acute lymphoid leukemia (ALL), tumors, and inflammation using the compounds and compositions described herein for the treatment of cell proliferation-associated diseases such as lymphoid leukemia. 0 acute (ALL), tumors and inflammation.
  • ALL acute lymphoid leukemia
  • ALL acute lymphoid leukemia
  • Example 5 Effect of compounds on acute lymphoid leukemia (ALL) cell lines:
  • IC 50 is defined as the concentration of a compound at which 50% of the maximum inhibition is obtained. After absorbance reading, survival curves were constructed and IC 50 values were obtained with the aid of GraphPad Prism software.
  • HL60 leukemic cell line were treated with the 125 nM dose of compound 07 or with dimethylsulfoxide vehicle (DMSO) for 6h in DMEM medium supplemented with 10% fetal bovine serum. At the end of this period, cells were recovered by brief centrifugation and lysed in guanidine solution from the RNAspin Mini RNA Isolation (GE) kit.
  • DMSO dimethylsulfoxide vehicle
  • RNA Purification and Biotinylated Probe Preparation Total RNA was extracted from cells using the RNAspin Mini RNA Isolation (GE) kit following manufacturer's instructions. A total of 100 ng of RNA was used to prepare the biotinylated complementary RNA probe (Bio-cRNA) by cDNA synthesis followed by in vitro transcription amplification using the GeneChip WT cDNA Synthesis and Amplification Kit (Affymetrix) according to recommendations. from the manufacturer.
  • GE RNAspin Mini RNA Isolation
  • Oligonucleotide microarrays and hybridization arrays The cRNA probe of each replicate was hybridized to the human genome oligonucleotide microarray GeneChip Human Gene 1.0 ST Array (Affymetrix). Hybridization and subsequent washes and microarray development were performed following manufacturer's recommendations.
  • GSEA Gene Set Expression Analysis
  • Gene sets analyzed by GSEA were obtained from a number of public databases (BioCarta, Signaling Pathway Database, Signaling Gateway, Signal Transduction Knowledge Environment, Human Protein Reference Database, GenMAPP, KEGG, Gene Ontology, Sigma-Aldrich Pathways, Gene Arrays BioScience Corp., Human Cancer Genome Anatomy Consortium and NetAffx). The mean values of probe set expression for the same gene were considered, using 1000 permutations to define the False Discovery Rate (FDR) q-value. Gene sets with less than 5 and more than 500 components were not considered.
  • FDR False Discovery Rate
  • the mechanism of action of these drugs is the inhibition of tubulin and has recently been described as possible candidates for the treatment of leukemia (Spagnuolo PA, et al; The antihelmintic flubendazole inhibits microtubule. leukemia and myeloma Blood 2010; 1 15 (23): 4824-33) and solid tumors (Doudican N, et al; Mebendazole induces apoptosis via Bcl-2 inactivation in chemoresistant melanoma cells.
  • Table 5a Compounds positively correlated with compound 07 by ATC code.
  • Hsp90 is a chaperone that interacts and collocates with tubulin (Garnier C, et al; Heat-shock protein 90 (hsp90) in vitro binds to tubulin dimer and inhibits microtubule formation.
  • Table 5b Compounds positively correlated with compound 07 by cell line. Rank Name CMap and Cell Line Average n Enrichment P Specificity% non-n
  • Tubulin inhibitors can act in two ways: (1) by inhibiting tubulin polymerization or (2) by stabilizing tubulin to inhibit its depolymerization.
  • GSEA analysis showed that compound 07 causes a dramatic decrease in expression of a set of tubulin-specific tubulin genes and chaperones ( Figure 1), which is typical of compounds that inhibit tubulin polymerization. Inhibition of tubulin polymerization results in free (unpolymerized) tubulin accumulation in the cell cytoplasm.
  • Cytoplasmic free tubulin self-regulates negatively expression of tubulin mRNA, suppressing the formation of new tubulin mRNA and accelerating degradation of existing mRNA (Caron JM, et al; Autoregulation of tubulin synthesis in hepatocytes and fibroblasts. J Celi Biol 1985; 101 : 1763-72.). In contrast, compounds that stabilize tubulin filaments lead to increased tubulin expression.
  • Example 7 Effect of compound 07 on cell cycle progression, cell cycle regulator activation and apoptosis induction:
  • a) Cell cycle analysis assays Cells treated or not with compound 07 were fixed in 70% ethanol for 2 hours, washed in PBS and incubated for 15 min at 37 ° C in 1 ml Triton X-100 solution, 1%, 0.2 mg / mL RNAse and 20 pg / mL propidium iodide in PBS. Twenty thousand events were collected in a FACSCalibur flow cytometer, with red fluorescence quantification, excluding any cell aggregates by the width vs. width pattern. peak area of red fluorescence. Data deconvolution to obtain the percentage of cells in each phase of the cell cycle was performed using ModFit v2.0 software.
  • Annexin V / PI labeled cell apoptosis quantitation assays Cells treated or not with compound 07 were washed in PBS and labeled by Annexin V Apoptosis Assay kit (Invitrogen). Briefly, cells were resuspended in suitable calcium-containing buffer and incubated for 15 min with Annexin V-FITC and 5 pg / mL propidium iodide. 10,000 events were collected in a FACSCalibur flow cytometer, excluding any debris by the forward vs. standard pattern. side scatter, with green and red fluorescence quantification.
  • Results compatible with tubulin inhibition were obtained when analyzing the cell cycle of compound 07 treated Jurkat cells.
  • Compound 07 treated Jurkat cells showed cell cycle arrest in G2 / M ( Figure 2).
  • Bone marrow cells from healthy donors were cultured in semi-solid methylcellulose medium plus fetal bovine serum, bovine albumin serum, different growth factors (GM-CSF, G-CSF, SCF, IL-3, IL-6, Epo) and compound 07, whose action on hematopoiesis was evaluated. After two weeks of culture at 37 ° C and 5% CO 2 , the number of granulocyte (CFU-G), macrophage (CFU-), granulocyte / macrophage (CFU-GM), erythroid (BFU) colonies were counted. -E and CFU-E) and mixed colonies (CFU-GEMM).
  • CFU-G granulocyte
  • CFU- macrophage
  • CFU-GM granulocyte / macrophage
  • BFU erythroid
  • Compound 07 was tested on healthy and mature phytohemagglutinin-stimulated T lymphocytes to evaluate its action against normal cells. As a positive control, colchicine was used. Results are presented in Table 6. Table 6. Survival percentage of phytohemagglutinin-stimulated healthy lymphocytes treated with different concentrations of compound 07.
  • compound 07 was tested in a bone marrow cell colony formation assay grown in semi-solid methylcellulose medium plus growth factors. As shown in Table 7, compound 07, at a concentration very close to IC 50 (20 nM), exhibits inhibitory activity on erythrocyte formation comparable to a Pi3K pathway inhibitor used in the assay as a positive control. Compound 07 also has inhibitory activity against granulocytes and macrophages, but to a lesser extent compared to the ⁇ 3 ⁇ inhibitor. At a concentration of 200 nM, corresponding to 10 times the average IC 50 in ALL cells, compound 07 completely inhibited hematopoiesis.
  • ALL acute lymphoid leukemia

Abstract

A presente invenção refere-se a compostos acil-hidrazonas, especialmente as derivados da 3,4,5-trimetoxifenil-hidrazida, bem como a seus análogos oxadiazóis e outros compostos semelhantes, e aplicação farmacêutica dos mesmos no tratamento de diferentes doenças associadas à proliferação celular, como leucemias, incluindo leucemia linfóide aguda (LLA), tumores e inflamação. Foram obtidas acil-hidrazonas com atividade semelhante ao composto utilizado como padrão nos experimentos (colchicina). A maior seletividade dos compostos apresentados nesta invenção é uma característica importante relacionada com menores efeitos colaterais que os fármacos atualmente empregados na clínica. As acil- hidrazonas sintetizadas, mais especificamente os compostos 02 e 07, apresentaram importante atividade antileucêmica, o que indica 02 e 07 como candidatos a protótipos de fármacos, ou fármacos, para o tratamento de leucemias, especialmente leucemia linfóide aguda (LLA), tumores e outras doenças proliferativas, como inflamação. A determinação do mecanismo de ação dos compostos mais ativos foi realizada pela utilização de microarranjos de DNA e testes subsequentes indicados através do chip, além dos estudos de seletividade em linfócitos humanos saudáveis.

Description

Relatório Descritivo de Patente de Invenção para: "COMPOSTOS ACIL- HIDRAZONAS E OXADIAZÓIS, COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS COMPREENDENDO OS MESMOS E SEUS USOS".
Campo da Invenção
A presente invenção se refere a acil-hidrazonas derivadas da 3,4,5- trimetoxifenil-hidrazida, para o tratamento de doenças associadas à proliferação celular (como leucemias, tumores, inflamação e outras doenças proliferativas). Mais especificamente, a invenção se refere a compostos que têm atividade inibitória de proteínas quinase dependente de ciclina (CDKs) e da topoisomerase I, que podem ser consequentemente úteis no tratamento de leucemia linfóide aguda (LLA). A invenção se refere ainda à obtenção de acil-hidrazonas e oxadiazóis inéditos a partir da 3,4,5- trimetoxifenil-hidrazida.
Antecedentes da Invenção
O câncer é uma doença caracterizada pela proliferação e propagação descontrolada pelo corpo de formas anormais das próprias células humanas. As células neoplásicas diferenciam-se das células normais pelo alto poder de invasão que possuem, pela perda de função, perda de diferenciação e pela capacidade de metástase, em virtude de possuírem menor adesão entre si (Rang, H. P.; Dale, M. M.; Ritter, J. M; Moore, P. K. Farmacologia. 5 ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2004. 703 p). Em 2009, foi estimado o surgimento de 49 mil novos casos de câncer de mama, 47 mil de próstata, 27 mil de pulmão, 25 mil de cólon e reto, 23 mil de estômago e 19 mil de colo do útero em 2009 no Brasil (INCA, Instituto Nacional do Câncer. Disponível em: <http://www.inca. gov.br/estimativa/2006/index.asp?link=mapa.asp&ID=8> Acesso em: 23 fevereiro 2011), sendo a segunda maior causa de mortes no país.
As leucemias são um dos vários tipos de câncer, e ocorrem pela proliferação neoplásica de células hematopoiéticas linfóides ou mielóides, resultante da mutação de uma única célula-tronco, cuja prole forma um clone de células leucêmicas. Geralmente, ocorrem várias alterações genéticas para a transformação maligna, compreendendo expressão inadequada de oncogenes e perda de função de genes supressores de tumor (Bain, B. J. Diagnóstico em leucemias. Rio de Janeiro: Elsevier, 2003, Cap. 1 , 01-56), que podem estar associadas a fatores genéticos ou de risco (como tabagismo, exposição à radiação ou a produtos químicos como o benzeno) (INCA, Instituto Nacional do Câncer. Leucemia - prevenção, genética, outros fatores de risco. Disponível em: <http://www2.inca.gov.br/wps/wcm/connect/tiposde
ao_genetica_outros_fatores_de_risco>. Acesso em: 23 fevereiro 2011; e IARC (Internatonal Agency for Research on Câncer). World Câncer Report 2008. Disponível em: <http://www.iarc.fr/en/publications/pdfs-online/wcr/2008/index.php> e <http://www.iarc.fr/en/publications/pdfs-online/wcr/2008/wcr_2008.pdf>. Acesso em: 23 fevereiro 2011). As leucemias são subdivididas com base em quão rapidamente a doença evolui e torna-se grave, podendo ser crónicas ou agudas. As leucemias agudas se caracterizam por um defeito na maturação celular, o que ocasiona um desequilíbrio entre a proliferação e a maturação; uma vez que as células do clone leucêmico continuam a se proliferar, sem chegar aos estágios de maturação e morte, acarretando uma expansão contínua do clone leucêmico e predomínio das células imaturas (INCA 2009b, Bain, B. J. Diagnóstico em leucemias. Rio de Janeiro: Elsevier, 2003, Cap. 1, 01-56).
A leucemia linfóide aguda (LLA) é decorrente da proliferação descontrolada de células progenitoras linfóides imaturas na medula óssea, que resulta em um acúmulo muito rápido de células neoplásicas (Plasschaert, S.; Van Der Kolk, D.; De Bont, E.; Vellenga, E.; Kamps, W.; De Vries, E. Breast Câncer Resistance Protein (BCRP) in Acute Leukemia. Leukemia & Lymphoma, 2004, 45, 649-654). É responsável por 80% dos casos de leucemia aguda na infância (Laks, D.; Longhi, F., Bernardes, W. M.; Ramos, G. P. C. J Pediatr, 2003, 79, 149-158) e 50% de todas as malignidades hematopoiéticas (Downing, James R.; Shannon, Kevin M. Acute leukemia: A pediatric perspective. Câncer Celi, 2002, 2, 437-445). Em adultos, a LLA é relativamente rara, contabilizando 2-3% das malignidades hematopoiéticas (Downing, James R.; Shannon, Kevin M. Acute leukemia: A pediatric perspective. Câncer Celi, 2002, 2, 437- 445); porém, o prognóstico é muito pior que para as crianças, pois acomete células- tronco multipotentes, originando uma leucemia muito mais agressiva (Greaves, M. F. Stern cell origins of leukaemia and curability. British Journal of Câncer, 1993, 67, 413- 423).
As pesquisas do uso de compostos de fontes naturais como quimioterápicos é ampla. Um exemplo disso é o antineoplásico paclitaxel (Taxol™), um dos mais importantes produtos antitumorais naturais já descobertos, reportado pela primeira vez em 1971 (Wani, M. C; Taylor, H. L; Wall, M. E.; Coggon, P.; McPhail, A. T. Plant antitumor agents. VI. Isolation and structure of taxol, a novel antileukemic and antitumor agent from Taxus brevifolia. Journal of the American Chemical Society, 1971 , 93, 2325-2327), que somente depois de um longo período foi aprovado pelo FDA para o uso clínico (em 1992). Outro exemplo é a vincristina, um alcalóide utilizado na terapia de leucemia aguda e outros tipos de tumores, que atua da mesma forma que o paclitaxel, através da ligação à tubulina, interferindo na formação (polimerização) ou reorganização (despolimerização) dos microtúbulos (Goodman e Gilman. As bases farmacológicas da terapêutica, 10a Ed., editora Mc Graw Hill. 2006).
Os quimioterápicos mais usados na terapia atual das leucemias incluem daunorrubicina, doxorrubicina, dexametasona, vincristina, metotrexato e mercaptopurina (Plasschaert, S.; Van Der Kolk, D.; De Bont, E.; Vellenga, E.; Kamps, W.; De Vries, E. Breast Câncer Resistance Protein (BCRP) in Acute Leukemia. Leukemia & Lymphoma, 2004, 45, 649-654). Estes fármacos conferem benefício terapêutico, mas também significativa toxicidade ao organismo e às células normais, devido a sua atuação na indução da apoptose e inibição da proliferação celular (Herr, I.; Debatin, K. M. Cellular stress response and apoptosis in câncer therapy. Blood 2001, 98, 2603-2614; e Leszczyniecka, M.; Roberts, T , Dent, P.; Grant, S.; Fisher, P. B. Differentiation therapy of human câncer: basic science and clinicai applications. Pharmacology & Therapeutics, 2001 , 90, 105-156). Os agentes antineoplásicos interferem também nos tecidos normais que possuem células de divisão rápida, podendo provocar muitos efeitos indesejáveis, como a redução da produção das células de defesa do organismo, a cicatrização deficiente de feridas, alopecia, lesão do epitélio gastrintestinal, esterilidade e teratogenicidade (Rang, H. P.; Dale, M. M.; Ritter, J. M; Moore, P. K. Farmacologia. 5 ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2004. 703 p).
Apesar dos recentes avanços na pesquisa contra o câncer, em 2008 foram registradas 5.686 mortes decorrentes de leucemia no Brasil, e para 2010 foram estimados 9.580 novos casos desta doença (INCA, Instituto Nacional do Câncer. Disponível em: <http://www.inca. gov.br/estimativa/2006/index.asp?link=mapa.asp&ID=8> Acesso em: 23 fevereiro 2011), o que motiva incessantemente a busca por novos fármacos para o tratamento de leucemias e outros tumores.
Em um recente estudo, Wang e colaboradores (Wang, Z.; Lu, Y.; Seibel, W.;
Miller, D. D.; Li, W. Identifying Novel Molecular Structures for Advanced Melanoma by Ligand-Based Virtual Screening. Journal of Chemical Information and Modeling, 2009, 49, 1420-1427) avaliaram novos compostos antitumorais baseados na estrutura do composto LY-1-100, que tem comprovado mecanismo de ação e afinidade aos microtúbulos (sítio de ligação da colchicina porém baixa seletividade.
Figure imgf000006_0001
LY-1-100
Β16Π - 55»Μ
'A37í - 3n :
IS 0.9
Estruturas foram selecionadas através de screening virtual baseado no ligante {ligand-based), resultando em 14 novas moléculas com grande similaridade estrutural ao composto de partida (LY-1-100). Os resultados teóricos obtidos pelos pesquisadores revelaram que o anel trimetoxilado do composto LY-1-100 precisa ser mantido para proporcionar a atividade antitumoral, mas o anel triazol parece não ser importante, podendo ser substituído pela estrutura da /V-metileno-hidrazina, o que gera a estrutura das acil-hidrazonas. Apesar dos resultados em células murinas B16F1 e A375 {in vitro) destes compostos não terem apresentado melhoria da potência e da seletividade do composto de partida, estes resultados foram muito promissores e identificaram alguns componentes estruturais importantes para a atividade anti- melanoma (Wang, Z.; Lu, Y.; Seibel, W.; Miller, D. D.; Li, W. Identifying Novel Molecular Structures for Advanced Melanoma by Ligand-Based Virtual Screening. Journal of Chemical Informati 1420-1427).
Figure imgf000006_0002
Neste sentido, as acil-hidrazonas surgem como uma classe interessante de compostos com atividade antitumoral. Assim, a presente invenção se refere à obtenção de acil-hidrazonas, especialmente derivadas da 3,4,5-trimetoxifenil-hidrazida, para o tratamento de doenças associadas à proliferação celular (como leucemias, tumores, inflamação e outras doenças proliferativas).
O pedido de patente PI 0112674-1 (Inibidores n-[5-[[[5-alquil-2-oxazolil]metil]tio]-2- tiazolil]carboxamida de quinases dependentes de ciclina) descreve compostos e seus enantiomorfos, diastereoisômeros, solvatos e sais farmaceuticamente aceitáveis como inibidores de proteína quinase, úteis no tratamento de doenças proliferativas, como por exemplo, câncer, inflamação e artrite. Os compostos sintetizados também podem ser de utilidade para o tratamento da doença de Alzheimer, alopécia induzida por quimioterapia e doença cardiovascular. Os compostos descritos no pedido PI 0112674-1 representam estruturas mais complexas que as apresentadas no decorrer da presente invenção.
Os compostos referenciados na publicação de pedido de patente n° US 20040138272 (1 ,4-Substituted cyclohexane derivatives) podem ser úteis na prevenção da proliferação celular em doenças malignas, por inibir Rho quinases, úteis na reparação do sistema nervoso central e periférico por indução do crescimento e regeneração dos axônios. O mecanismo de ação dos compostos da publicação US 20040138272 difere do proposto para as estruturas da presente invenção.
Inibidores de quinases dependentes de ciclina (cdks) úteis na modulação da progressão do ciclo celular são propostos no pedido de patente PI 0418095-0 (Inibidores de quinases dependentes de ciclina, composições e usos relacionados aos mesmos). Tais compostos seriam úteis para o tratamento de pacientes que apresentam distúrbios associados à proliferação celular excessiva. Os compostos descritos no PI 0418095-0 são acil-hidrazonas diferentes das propostas no decorrer da presente invenção, com processo de síntese mais complexo.
No pedido de patente PI 0508364-8 (Derivados de 4-benzimidazol-2-il-piridazin- 3-ona) são descritos compostos e seus sais fisioligicamente tolerados, que apresentam ação como inibidores de quinases, em particular da quinase CDK2 (quinase 2 dependente de ciclina). Os compostos do PI 0508364-8 são diferentes dos propostos no decorrer da presente invenção, com síntese mais complexa.
A publicação de pedido de patente norte-americano n° US 20070066610 (Acylhydrazones as kinase modulators) descreve acil-hidrazonas como inibidores de tirosinas quinases, compreendendo c- et, um receptor tirosina quinase que regula a proliferação celular, morfogênese e motilidade. As acil-hidrazonas descritas no documento US 20070066610 são diferentes das propostas no decorrer deste invento, com síntese mais complexa. Além disso, o alvo de ação dos compostos descritos se diferencia do proposto nesta invenção.
A publicação de pedido de patente US 20080194562 (Pyrazole Derivatives for The Inhibition Of Cdk's And Gsk's) se refere à síntese de pirazóis, compostos que inibem ou modulam a atividade de quinases dependentes de ciclina (CDK) e quinases glicogênio sintase (GSK), e ao seu uso no tratamento ou profilaxia de doença ou condição mediada por quinases. Também são descritas composições farmacêuticas contendo os compostos e intermediários químicos. Os compostos do documento US 20080194562 são diferentes dos propostos no decorrer do presente invento.
As acil-hidrazonas ainda são descritas na literatura por suas pronunciadas atividades inseticidas e estimulantes de crescimento de plantas (Robinson, B. Fischer índole synthesis. Chem. Rev., 1963, 4, 373-401); no tratamento da tuberculose (Vigorita, M. G.; Ottana, R.; Zappala, C; Maccari, R.; Pizzimenti, F. C; Gabbrielli, G. Halogenated isoniazid derivatives as possible antimycobacterial and anti-HIV agents - III. Fármaco, 1994, 49, 775-781); e como agentes bacteriológicos e bacteriostáticos (Samus, N. M.; Tsapkov, V. I.; Kuracheva, S. A.; Burdenko, T. A. Synthesis and antimicrobial activity of coordination compounds of 3d-elements with some hydrazones derived by using 5-nitro-2-furaldehyde. Khimiko-Farmatsevticheskii Zhurnal, 1994, 28, 41-44).
Considerando o que foi exposto acima, foi conduzido um estudo com acil- hidrazonas e seus derivados oxadiazóis obtidos pela estratégia de bioisosterismo não clássico, de fechamento de anel, com o objetivo de desenvolver novos agentes quimioterápicos. Os oxadiazóis são uma importante classe de compostos heterocíclicos com uma ampla gama de atividades biológicas, tais como antiviral, antimicrobiana, antineoplásica, fungicida, inibição de tirosinase e catepsina K (Kumar, D.; Sundaree, S.; Johnson, E. O.; Shah, K. An efficient synthesis and biológica) study of novel indolyl-1 ,3,4- oxadiazoles as potent anticancer agents. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2009, 19, 4492-4494). Além disso, são ótimos bioisósteros de amidas e ésteres, que podem contribuir substancialmente no aumento da atividade farmacológica, participando em ligações de hidrogénio como receptores (Guimarães, C. R. W.; Boger, D. L; Jorgensen, W. L Elucidation of Fatty Acid Amide Hydrolase Inhibition by Potent α-Ketoheterocycle Derivatives from Monte Carlo Simulations. Journal of the American Chemical Society, 2005, 127, 17377-17384).
Assim, as acil-hidrazonas específicas e seus análogos, provenientes dos processos descritos detalhadamente neste invento a seguir, bem como seu uso no tratamento de leucemias, tumores e outras doenças proliferativas, como inflamação, é de grande interesse social e económico. Objetivos da Invenção
O objetivo da presente invenção é a obtenção de compostos sintéticos derivados da 3,4,5-trimetoxifenil-hidrazida (hidrazonas e oxadiazóis) e todos os seus compostos análogos e semelhantes, por meio de rota sintética simples, bem como, o emprego destes compostos para o tratamento de doenças associadas à proliferação celular (como leucemias, especialmente leucemia linfóide aguda - LLA - tumores, inflamação e outras doenças proliferativas). A presente invenção também descreve os processos utilizados para a determinação da atividade biológica destes compostos.
Sumário da Invenção
A presente invenção refere-se a uma classe de acil-hidrazonas, especialmente as derivadas da 3,4,5-trimetoxifenil-hidrazida, bem como a seus compostos análogos oxadiazóis e outros compostos análogos e semelhantes, e a aplicação farmacêutica de todos estes no tratamento de diferentes doenças associadas à proliferação celular, como leucemias, compreendendo leucemia linfóide aguda (LLA), tumores e inflamação. A presente invenção também descreve os processos utilizados para a determinação da atividade biológica de todos esses compostos.
Foram obtidas acil-hidrazonas com atividade semelhante ao composto utilizado como padrão nos experimentos (colchicina). A maior seletividade dos compostos apresentados nesta invenção é uma característica importante relacionada com menores efeitos colaterais que os fármacos atualmente empregados na clínica. As acil-hidrazonas sintetizadas, mais especificamente os compostos 02 e 07, apresentaram importante atividade antileucêmica, o que indica 02 e 07 como candidatos a protótipos de fármacos, ou fármacos, para o tratamento de leucemias, especialmente leucemia linfóide aguda (LLA), tumores e outras doenças proliferativas, como inflamação.
A determinação do mecanismo de ação dos compostos mais ativos foi realizada pela utilização de microarranjos de DNA e testes subsequentes indicados através do chip, além dos estudos de seletividade em linfócitos humanos saudáveis.
Descrição das Figuras
A Figura 1 apresenta (A) Panorama de enriquecimento do conjunto gênico definido "REACTOME POST CHAPERONIN TUBULIN FOLDING PATHWAY", mostrando o enriquecimento nas amostras controle HL-60 versus amostras tratadas com composto 07 (p = 0,002, FDR q-valor = 0,168) e (B) Os valores de expressão dos 16 genes que fazem parte do conjunto de genes em (A) são representados como quadrados azuis (menor expressão) e quadrados vermelhos (maior expressão).
A Figura 2 mostra que o Composto 07 induz a parada do ciclo celular em G2/M. Células Jurkat tratadas durante 18 h com 125 nM de composto 07 ou DMSO foram submetidas a análise do ciclo celular após marcação com iodeto de propídio e análise 5 de citometria de fluxo.
A Figura 3 mostra resultados da análise de Western blot para vários reguladores do ciclo celular Extratos protéicos de células Jurkat tratadas com 125 nM do composto 07 (F8) ou veículo (DMSO).
A Figura 4 mostra que o composto 07 é um forte indutor de apoptose em I0 células de Jurkat. No conjunto, os resultados sugerem que o composto 07 promove a parada do ciclo celular e apoptose, principalmente, através de Chk2 e Rb. As Células Jurkat tratadas durante 18h com 125 nM de composto 07 ou DMSO foram duplamente marcadas com anexina V / iodeto de propídio e analisadas por citometria de fluxo.
A Figura 5 mostra o efeito do composto 07 sobre linfócitos humanos (WBC) e 15 células leucêmicas Jurkat e REH, após 48h. A proliferação dos linfócitos normais foi estimulada com fitohemaglutinina. É apresentado o valor percentual de sobrevivência das células tratadas com composto 07 relativo à sobrevivência das mesmas células tratadas com veículo (DMSO).
Descrição Detalhada da Invenção
.0 A presente invenção compreende a obtenção e mecanismo de ação de acil-hidrazonas sintéticas e seus compostos análogos e semelhantes, que podem ser úteis no tratamento de leucemias, especialmente leucemia linfóide aguda (LLA), tumores e outras doenças proliferativas, como inflamação.
De acordo com um dos aspectos da presente invenção, é descrito um composto de >5 estrutura (I):
Figure imgf000010_0001
0),
em que o anel B representa:
01 - fenil
02 - 4-Br-fenil
03 - 4-N02-fenil 17 -
Figure imgf000011_0001
04 - 3-OCH3-4-OH-5-Br-fenil 18 - 3-N02-fenil
05 - 3-OCH3-4-OH-5-l-fenil 19 - 4-N(CH3)2-fenil
06 - 3-OCH3-4-OH-fenil 20 - 3-CI-fenil
07 - 1-naftil 21 - 2,6-diOCH3-fenil
08 - 2-naftil
09 - 4-CI-fenil
Figure imgf000011_0002
0 - 3,4-OCH20-fenil 22 -
11 - 2-CI-fenil 23 - 2-COOH-fenil
12 - 2,5-diOCH3-fenil 24 - 3-OCH2CH3-4-OH-fenil
13 - 3,4,5-triOCH3-fenil 25 - 3-OCH3-fenil
14 - 2,4,5-triOCH3-fenil 26 - 2-OH-4-Br-fenil
15 - 4-0(CH2)3CH3-fenil 27 - (3-OCH3-4-OCH2fenil)-fenil
16 - 4-CH3-fenil 28 - 4-CF3-fenil
29 - 3-CF3-4-CI-fenil
Um grupo complementar de compostos, de acordo com a presente invenção, compreende compostos com a estrutura II:
Figure imgf000011_0003
em que o anel B representa:
30 - fenil
31 - 3,4-OCH20-fenil
32 - 4-Br-fenil
33 - 4-CH3-fenil
34 - 1-naftil
35 - 2-naftil
Adicionalmente, são também descritos os análogos sintéticos oxadiazois, de acordo com a estrutura III:
Figure imgf000012_0001
em que o anel B representa:
36 - 3-OCH3-4-OH-5-Br-fenil
37 - 3-OCH3-4-OH-fenil
38 - 1-naftil
As acil-hidrazonas inéditas da presente invenção foram obtidas a partir da reação de condensação entre a 3,4,5-trimetoxifenil-hidrazida e diferentes aldeídos, usando etanol como solvente, em refluxo, conforme a reação:
Figure imgf000012_0002
em que o anel B representa:
02 - 4-Br-fenil* 21 - 2,6-diOCH3-fenil
05 - 3-OCH3-4-OH-5-l-fenil 26 - 2-OH-4-Br-fenil
0 - 1-naftil* 29 - 3-CF3-4-CI-fenil
Figure imgf000012_0003
A Tabela 1 apresenta os rendimentos obtidos nas sínteses e os pontos de fusão experimental das 3,4,5-trimetoxifenil-hidrazonas inéditas.
Tabela 1. Rendimentos e pontos de fusão das 3,4,5-trimetoxifenil-hidrazonas inéditas sintetizadas.
Figure imgf000013_0001
Composto Rendimento Ponto de Fusão (°C)
Anel B
n° (%) Experimental
02* 4-Br-fenil 82 208-209
05 3-OCH3-4-OH-5-l-fenil 69 247-248
07* 1 -naftil 82 229-230
Figure imgf000013_0002
21 2,6-diOCH3-fenil 93 245-246
26 2-OH-4-Br-fenil 65 206-208
29 3-CF3-4-CI-fenil 83 203-204
A estrutura do composto 02 foi previamente publicada como intermediário de reação para obtenção de oxadiazóis ( azzone, G.; Bonina, F.; Formica, F. Some aroylhydrazones of halobenzaldehydes and halo-substituted 2,5-diaryl- ,3,4- oxadiazoles. Fármaco, Edizione Scientifica, 1978, 33(12), 963-71 ) e o composto 07 foi previamente avaliado como inibidor da MAO (monoamino oxidase) (Mazzone, G.; Arrigo Reina, R. 3,4,5-Trimethoxybenzoyl hydrazides and their anti-MAO [monoamine oxidase] activity. Bollettino delle Sedute della Accademia Gioenia di Scienze Naturali in Catania, 1971 , 10(8), 689-702). A caracterização química de ambos compostos (02 e 07) também foi previamente publicada por nosso grupo de pesquisas, em um trabalho que avaliou a atividade destes e de outros compostos como inibidores da cruzaina de Trypanosoma cruzi, entretanto, os compostos 02 e 07 não apresentaram atividade inibitória desta proteína (Borchhardt, Deise M.; Mascarello, Alessandra; Chiaradia, Louise Domeneghini; Nunes, Ricardo J.; Oliva, Glaucius; Yunes, Rosendo A.; Andricopulo, Adriano D. Biochemical evaluation of a series of synthetic chalcone and hydrazide derivatives as novel inhibitors of cruzain from Trypanosoma cruzi. Journal of the Brazilian Chemical Society, 2010, 21(1), 142-150). Contudo, o uso dos compostos 02 e 07 para tratamento de leucemia não se encontra descrito no estado da técnica e está compreendido no escopo da presente invenção.
As acil-hidrazonas complementares (preparadas para auxiliar na discussão dos testes biológicos) foram sintetizadas a partir da reação entre a fenil-hidrazida e diferentes aldeídos, pelo mesmo procedimento de preparação das hidrazonas descritas anteriormente, de acordo com a seguinte reação:
PhCONHNH,
Figure imgf000014_0001
re uxo,
em que o anel B representa:
30 - fenil
31 - 3,4-OCH20-fenil
32 - 4-Br-fenil
33 - 4-CH3-fenil
34 - 1-naftil
35 - 2-naftil
Foram ainda preparados os análogos oxadiazóis sintéticos inéditos das 3,4,5- trimetoxifenil-hidrazonas, a partir da reação destas com anidrido acético, conforme a seguinte reação:
Figure imgf000014_0002
em que o anel B representa:
36 - 3-OCH3-4-OH-5-Br-fenil
37 - 3-OCH3-4-OH-fenil
38 - 1-naftil
A Tabela 2 apresenta os rendimentos obtidos nas sínteses e o ponto de fusão experimental dos oxadiazóis.
Tabela 2. Rendimentos e ponto de fusão dos oxadiazóis inéditos sintetizados.
Figure imgf000015_0001
Composto Rend. p.f. (°C)
Anel B
(%) Exp.
36 3-OCH3-4-OH-5-Br-fenil 30 177-179 37 3-OCH3-4-OH-fenil 25 170-172 38 1-naftil 35 189-192
A presente invenção descreve também a determinação do mecanismo de ação das acil-hidrazonas sintetizadas e seus compostos análogos e semelhantes compreendendo oxadiazóis. A invenção se refere ainda o uso de todos estes compostos como protótipos de fármacos, ou fármacos, para o tratamento de
5 leucemias, especialmente leucemia linfóide aguda (LLA), tumores e outras doenças associadas à proliferação celular, como inflamação.
As acil-hidrazonas descritas na presente invenção atuam de maneira seletiva sobre células leucêmicas com atividade na ordem de nanomolar, quando comparadas à sua atividade em linfócitos humanos saudáveis, conforme será descrito a seguir na
) forma de exemplo. Fica evidenciada aqui a relevância dos resultados biológicos, inéditos para os compostos testados.
Em outra modalidade, a presente invenção descreve composições farmacêuticas compreendendo compostos descritos acima em associação com excipientes, veículos e adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis.
5 Conforme usado na presente invenção, o emprego do termo
"farmaceuticamente aceitável" significa um sólido não tóxico, inerte, excipiente líquido semissólido, diluente, formulação auxiliar de qualquer tipo, ou simplesmente um meio aquoso estéril, tal como solução salina. Alguns exemplos dos materiais que podem servir como veículos farmaceuticamente aceitáveis são açúcares, tais como lactose,
) glicose e sacarose, os amidos, tais como amido de milho e o amido de batata, a celulose e os seus derivados, tais como a carboximetilcelulose de sódio, a etilcelulose e o acetato de celulose, ciclodextrina; óleos, tais como óleo de amendoim, óleo de semente de algodão, óleo de girasol, óleo de gergelim, óleo de oliva, óleo de milho e óleo de semente de soja; glicóis, tais como propilenoglicol, polióleos, tais como glicerinaglicol, sorbitol, manitol e de polietileno; ésteres, tais como o laurato etílico, oleato etílico, ágar; agentes tamponantes, tais como o hidróxido de alumínio e hidróxido de magnésio; ácido algínico; água livre de pirogênio; salina isotônica, solução de Ringer; soluções tampões de álcool etílico e fosfato, assim como outras substâncias não tóxicas compatíveis usadas em formulações farmacêuticas.
Particularmente, as composições farmacêuticas ou veterinárias compreendendo os compostos da presente invenção podem ser destinadas a administração qualquer tipo de administração, em especial administração parenteral.
Especificamente, as composições da presente invenção podem compreender qualquer tipo de excipiente usado na produção de medicamentos em qualquer uma das formas farmacêuticas acima mencionadas, como absorventes, diluentes, aglutinantes, desintegrantes, lubrificantes, deslizantes, plastificantes, agentes de revestimento, agentes formadores de matrizes para liberação controlada, solventes e cossolventes, agentes molhantes, agentes emulsificantes, agentes surfactantes, agente doador de consistência, agentes de tonicidade, umectantes, agente levigante, gente para expulsão de ar, agentes alcalinizantes ou acidificantes, conservantes, antioxidantes, bactericidas, bacteriostáticos, agentes quelantes, corantes e edulcorantes.
Absorventes adequados para as composições da presente invenção podem ser qualquer substância adicionada para absorver água presente nos extratos ou para fixar certos compostos voláteis, como as essências. Exemplos não limitativos de tais excipientes são fosfato de cálcio, caulim, carbonato de magnésio, bentonita e talco.
As composições da presente invenção podem compreender, como diluente, qualquer produto inerte adicionado à fórmula para permitir a obtenção de comprimidos ou o enchimento de cápsulas com volumes adequados e propiciar propriedades de fluxo e compressão necessárias à produção, por exemplo, mas não se limitando a lactose, fosfato de cálcio tribásico, amido, manitol, sulfato de cálcio, celulose microcristalina (MicrocelD, AvicelD), fosfato de cálcio dibásico (EncompressD, Ditabn), óxido de magnésio, carbonato de magnésio, talco, caolim, carbonato de cálcio, dextrose, frutose, lactose, aspartame, celulose, maltose, manitol, goma de guar, sorbitol, amido e sacarose.
Substâncias aglutinantes adequadas para as composições da presente invenção podem ser agentes usados para promover adesão das partículas durante a granulação e compressão de formas farmacêuticas sólidas, também podem ser usadas nas composições da presente invenção, por exemplo, carbopol, povidona, goma xantana, goma arábica, ácido algínico, açúcar compressível, C C-Na, etilcelulose, gelatina, metilcelulose, povidona (PVP), amido, amido pré-gelatinizado e glicose líquida em forma de solução, dispersão ou pó.
Desagregantes ou desintegrantes adequados para as composições da presente invenção podem ser qualquer componente empregado para acelerar a desintegração e/ou a dissolução da forma farmacêutica nos fluidos biológicos, por exemplo, ácido algínico, amido, alginato de sódio, CMC-Na, celulose microcristalina, croscarmelose sódica (Ac-Di-SolD), glicolato sódico de amido (ExplotabD) e crospovidona (Kollidon CLD).
Lubrificantes adequados para as composições da presente invenção podem ser, por exemplo, estearato de magnésio, estearato de cálcio, ácido esteárico, talco e óleo vegetal hidrogenado (ex. LubritabD).
Deslizantes adequados para as composições da presente invenção podem ser, por exemplo, sílica coloidal (Aerosil 200D) e talco.
Agentes plastificantes adequados para as composições da presente invenção podem ser usados juntamente com polímeros, para modificar a temperatura de transição de fase dos mesmos e facilitar a coalescência de filmes formados sobre grânulos, comprimidos ou pellets. Exemplos não limitativos de tais agentes são glicerina, trietilcitrato, dibutilftalato, silicone e PPG.
Agentes de revestimento empregados para revestir composições da presente invenção em forma de comprimidos, grânulos, cápsulas ou pellets podem ser, por exemplo, acetoftalato de celulose, etilcelulose, goma gelana, maltodextrina, metacrilatos, metilcelulose, celulose microcristalina, goma laca, goma carragenana, ceras, shellacs, gelatina, derivados da celulose (metil ou etilcelulose, acetoftalato de celulose, hidroxipropilmetilcelulose, acetato de celulose), copolímeros de ésteres acrílico e metacrílico (EudragitD tipos L100, RS 30D, RS PM, S100, dentre outros), álcool polivinílico (PVA) e acetato de polivinila.
Agentes formadores de matrizes para liberação controlada possivelmente empregados nas cmposições da presente invenção, com a finalidade de se obter liberação prolongada e/ou controlada dos princípio(s) ativo(s), podem ser HPMC, CMC-Na, goma xantana, CarbopolD, diversos tipos de EudragitD, ágar-ágar, derivados polioxidoetilênicos (PEO's), ciclodextrina, nanoesferas e nanopartículas de qualquer natureza.
Solventes e co-solventes, como álcool, óleo de milho, óleo de algodão, glicerina, álcool isopropílico, óleo mineral, ácido oléico, óleo de amendoim, água purificada e água para injeção, entre outros, também podem ser usados nas composições da presente invenção.
Agentes molhantes adequados para as composições da presente invenção podem ser qualquer substância adicionada com a finalidade de diminuir a tensão superficial na interface sólido/líquido, por exemplo, lauril sulfato de sódio (LSS), docusato sódico e polissorbatos 20, 60, 80 (Tween 20, 60, 80).
Agentes emulsificantes adequados para as composições da presente invenção podem ser, por exemplo, monoestearato de glicerila, álcool cetílico e gelatina e auxiliares, como CMC-Na, MC, alginato e pectina.
Agentes surfactantes como, por exemplo, cloreto de benzalcônio, nonoxinol 10, octoxinol 9, polissorbato 80 e lauril sulfato de sódio também são adequados para as composições da presente invenção.
Agentes doadores de consistência adequados para as composições da presente invenção podem ser qualquer substância usada para aumentar a consistência de pomadas, por exemplo, álcool cetílico, cera branca, cera amarela, álcool estearílico, parafina, cera microcristalina e cera de ésteres cetílicos.
Agentes de tonicidade adequados para as composições da presente invenção podem ser qualquer substância usada para obtenção de soluções com características osmóticas semelhantes às dos fluidos biológicos para serem administradas pelas vias ocular, nasal, parenteral, como NaCI (0,9%), manitol (5,07%) e dextrose (5,51%).
Umectantes adequados para as composições da presente invenção podem ser glicerina, propilenoglicol e sorbitol.
Agente levigantes adequados para as composições da presente invenção podem ser qualquer líquido usado como agente facilitador no processo de redução de partículas do fármaco durante o preparo de emulsões, bases oleosas, entre outras, por exemplo, óleo mineral (vaselina líquida), glicerina, propilenoglicol, PEG 400, óleo de algodão, óleo de rícino e Polissorbato 80 (Tween ® 80).
Agentes para expulsão de ar adequados para as composições da presente invenção podem ser empregados para expulsar o ar de recipientes hermeticamente fechados ou de formulações fluidas, para aumentar a estabilidade, por exemplo nitrogénio (N2) e dióxido de carbono (C02).
Agentes alcalinizantes ou acidificantes, como ácido cítrico, solução de amónia, ácido acético, carbonato de amónio, ácido fumárico, dietanolamina, ácido clorídrico (HCI), monoetanolamina, ácido tartárico, hidróxido de potássio (KOH), ácido bórico, hidróxido de sódio (NaOH), bicarbonato de sódio, borato de sódio e trietanolamina também são adequados para as composições da presente invenção.
Conservantes que podem ser usados nas composições da presente invenção são, por exemplo, antifúngicos, como ácido benzóico, benzoato de sódio, butilparabeno, metilparabeno (Nipagin), propilparabeno (Nipasol), etilparabeno, propionato de sódio, e antibacterianos, como cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio, álcool benzílico, cloreto de cetilpiridínio, clorobutanol e fenol.
Agentes antioxidantes adequados para as composições da presente invenção podem ser selecionados do grupo compreendendo butílhidroxianisol (BHA), butilhidroxitolueno (BHT), β-tocoferol, ácido ascórbico, palmitato de ascorbila, metabissulfito de sódio, ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA), ácido cítrico, cisteína, glutationa vitamina C, metabissulfito de sódio, cisteína e tiossulfato de sódio.
As composições da presente invenção podem compreender ainda, como agentes tamponantes, tampão citrato, tampão fosfato e tampão borato. Como corantes, aromatizantes e flavorizantes podem ser usados, por exemplo, baunilha, mentol, óleo de canela, óleo de anis e cacau. Edulcorantes podem ser, por exemplo, aspartame, dextrose (glicose), manitol, sorbitol, sacarina, ciclamato sódico, açúcar, acesulfame de potássio, sucralose e esteviosídeo.
As composições da presente invenção podem compreender ainda excipientes, como bactericidas, bacteriostáticos, antioxidantes, conservantes, tampões, estabilizantes, ajustadores de pH, ajustadores de osmolaridade, agentes antiespuma e tensoativos, além de resíduos de agentes de inativação ou fracionamento de antígenos, componentes de meios de crescimento e solventes comumente utilizados na produção de medicamentos. Exemplos destes tipos de componentes podem ser encontrados no livro "The Handbook of Pharmaceutical Excipients",(RAYMOND C. ROWE, Editora The Pharmaceutical Press).
Uma variedade de vias de administração das composições descritas na presente invenção está disponível. O modo particular selecionado dependerá do princípio ativo em particular selecionado, a dosagem necessária para eficácia terapêutica e do paciente ao qual será administrada a composição.
Em outra modalidade, a presente invenção descreve o uso dos compostos e composições aqui descritos para o tratamento de doenças associadas à proliferação 5 celular, como leucemia linfóide aguda (LLA), tumores e inflamação.
Em outra modalidade, a presente invenção descreve métodos de tratamento de doenças associadas à proliferação celular, como leucemia linfóide aguda (LLA), tumores e inflamação, usando os compostos e composições aqui descritos para o tratamento de doenças associadas à proliferação celular, como leucemia linfóide 0 aguda (LLA), tumores e inflamação.
Exemplos
A presente invenção será agora descrita por meio de exemplos ilustrativos. Exemplo 1. Procedimento geral para a preparação das 3,4,5-trimetoxifenil- hidrazonas 01-29
5 Para a síntese das 3,4,5-trimetoxifenil-hidrazonas 01-29, utilizou-se a metodologia descrita por Troeberg e col. (Troeberg, L; Chen, X.; Flaherty, T. M.; Morty, R. E.; Cheng, M.; Hua, H.; Springer, C; McKerrow, J. H.; Kenyon, G. L.; Lonsdale-Eccles, J. D.; Coetzer, T. H. T.; Cohen, F. E. Chalcone, acyl hydrazide, and related amides kill cultured Trypanosoma brucei brucei. Molecular Medicine , 2000, 6,
D 660-669). Em um balão de reação de 100 mL e 1 boca, colocou-se a 3,4,5- trimetoxifenil-hidrazida (2 mmol), preparada conforme descrito no exemplo 2, em um solvente orgânico: acetona, acetato de etila, éter etílico, etanol, metanol (20mL) e o aldeído apropriado (2 mmol). A mistura foi refluxada por 1 a 10 horas. Depois, a solução foi filtrada e o sólido recristalizado em um solvente orgânico.
5 Exemplo 2. Procedimento geral para obtenção da 3,4,5-trimetoxifenil-hidrazida, utilizada para obterás 3,4,5-trimetoxifenil-hidrazonas 01-29
Para a síntese da 3,4,5-trimetoxifenil-hidrazida, usada na preparação das acil- hidrazonas 01-29, utilizou-se metodologia já descrita (Chida, A. S.; Vani, P. V. S. N.; Chandrasekharam, M.; Srinivasan, R.; Singh, A. K. Synthesis of 2,3-dimethoxy-5-
D methyl-1 ,4-benzoquinone: a key fragment in coenzyme-Q series. Synyhethic Communications, 31 , 657-660, 2001), realizada em duas etapas:
Obtenção do éster. Em um balão de reação de 1000 mL e 1 boca, colocou-se o ácido gálico (50g, 0,294mol), sulfato de dimetila (178,1g, 1 ,413mol), carbonato de potássio anidro (175,5g, 1 ,293mol) e TBAI (iodeto de tetra-n-butilamonio) (1g) em um solvente orgânico que pode ser etanol, éter etílico, acetato de etila, acetona, éter de petróleo (375mL) e foi refluxado por 1 a 12h. O sólido obtido foi filtrado e lavado com o mesmo solvente orgânico (3 x 50mL). O éster foi obtido em forma de sólido amorfo de cor creme, com rendimento de 78%; p.f.: 84 °C (lit. p.f.: 82-83 °C). RMN 1H (CDCI3): 1 ,60 (s, 3H, CH3), 3,92 (s, 9H, OCH3), 7,33 (s, 2H, Ar).
Obtenção da hidrazida Em um balão de reação de 1000 mL e 1 boca, colocou- se o éster obtido na primeira etapa (48g, 0,212mol), uma solução de hidrazina hidratada 99% (N2H4.H20) (77, 6g, 1 ,54mol) e um solvente orgânico que pode ser etanol, acetato de etila, diclorometano, acetona, metanol (200mL). A mistura foi refluxada por 1 a 5h e mantida apenas sob agitação magnética overnight à temperatura entre 0 e 50°C. O sólido obtido foi filtrado e recristalizado em metanol, obtendo a 3,4,5-trimetoxifenil-hidrazida na forma de cristais brancos, com rendimento de 85%; p.f.: 162-163 °C (lit. p.f.: 168 °C). RMN 1H (CDCI3): 3,80 (s, 3H, OCH3), 3,90 (s, 6H, OCH3), 7,18 (s, 2H, Ar), 9,55 (NH).
Exemplo 3. Procedimento geral para a preparação das fenil-hidrazonas 30-35
Para a síntese das fenil-hidrazonas 30-35, utilizou-se a metodologia descrita por Troeberg e col. (Troeberg, L; Chen, X.; Flaherty, T. M.; Morty, R. E.; Cheng, M.; Hua, H.; Springer, C; McKerrow, J. H.; Kenyon, G. L; Lonsdale-Eccles, J. D.; Coetzer, T. H. T.; Cohen, F. E. Chalcone, acyl hydrazide, and related amides kill cultured Trypanosoma brucei brucei. Molecular Medicine , 2000, 6, 660-669), da mesma forma como descrito para a obtenção das 3,4,5-trimetoxifenil-hidrazonas.
Exemplo 4. Procedimento geral para a preparação dos oxadiazóis 36-38
Para a síntese dos oxadiazóis 36-38, utilizou-se a metodologia descrita por Jin e col. (Jin, L; Chen, J.; Song, B.; Chen, Z.; Yang, S.; Li, Q.; Hu, D.; Xu, R. Bioorg Med Chem, 2006, 16, 5036-5040). Em um balão de reação de 100 mL e 1 boca, misturou- se a 3,4,5-trimetoxifenil-hidrazona correspondente (1 mmol) e anidrido acético (10mL). A mistura foi refluxada por 1 a 10 horas e após foi resfriada com adição de gelo picado e deixada a temperatura entre 0 e 60°C overnight para precipitação do produto. O sólido obtido foi filtrado, lavado com água e recristalizado com solvente orgânico/água. DADOS ESPECTRAIS DE INFRAVERMELHO (IV) E RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR
(RMN) DE 1H E DE 13C DOS COMPOSTOS INÉDITOS
* ci nppm em relação ao TMS, Multiplicidade (J em Hz). Solvente CDCI3.
05 - H NMR (DMSO-d6)□ 3.73 (s, 3H, p-OCH3), 3.86 (s, 6H, m-OCH3), 3.89 (s, 3H, m-OCHa), 7.22 (s, 2H, H2, H6), 7.34 (s, 1 H, H6"), 7.60 (s, 1 H, H2'), 8.31 (s, 1 H, HC=N), 10.08 (1H, OH), 11.66 (s, 1 H, NH). 3C NMR (DMSO-d6)□ 56.78 (m-OCH3), 60.81 (p- OCH3), 85.17 (C3'), 105.84 (C2, C6), 109.72 (C6'), 128.28 (C1), 129.31 (C1 '), 130.75 (C2'), 141.03 (C4), 147.35 (C=N), 147.97 (C5'), 149.00 (C4'), 153.36 (C3, C5), 163.16 (C=0). IR Dmax/cm-1 3382 (N-H), 1636, 1228 (C=0), 1565 (C=N), 1290, 1045 (C-O), 2999, 2839, 1585, 1490, 1334, 1137, 997 (Ar) (KBr).
Figure imgf000022_0001
17 - H NMR (DMSO-d6)□ 3.74 (s, 3H, p-OCH3), 3.88 (s, 6H, m-OCH3), 7.23 (s, 2H, H2, H6), 7.53 (s, 1 H, H2'), 7.66 (m, 1 H, H4'), 8.02 (s, 1 H, NH5'), 8.43 (s, 1 H, HC=N), 11.37 (s, 1 H, NH). 13C NMR (DMSO-d6) □ 56.76 (m-OCH3), 60.81 (p-OCH3), 105.71 (C2, C6), 129.51 (C1), 131.94 (CV), 132.16 (C2'), 135.37 (C4'), 145.45 (C=N), 153.35 (C3, C5), 162.29 (C=0). IR t crTT1 3212 (N-H), 1623, 1234 (C=0), 1580 (C=N), 1280, 1054 (C-O), 2994, 2941 , 2838, 1503, 1456, 1411 , 1344, 1125, 1006, 844 (Ar) (KBr).
Figure imgf000022_0002
21 - H NMR (DMSO-d6)□ 3.71 (s, 3H, p-OCH3), 3.79 (s, 6H, o-OCH3), 3.85 (s, 6H, m-OCH3), 6.72 (d, J = 8.0 Hz, 2H, Η3', H5"), 7.23 (s, 2H, H2, H6), 7.34 (t, J = 8.0 Hz, 1 H, H4'), 8.60 (s, 1 H, HC=N), 1 1.52 (s, 1 H, NH). 3C NMR (DMSO-d6) □ 56.72 (m- OCH3), 56.78 (o-OCH3), 60.76 (p-OCH3), 105.08 (C3\ C5'), 105.76 (C2, C6), 1 1 1.75 (C1 '), 129.37 (C1), 131.87 (C4'), 140.88 (C4), 143.92 (C=N), 153.31 (C3, C5), 159.38 (C2\ C6'), 162.81 (C=0). IR Dmax/crrT1 3186 (N-H), 1644, 1240 (C=0), 1586 (C=N), 1258, 1068 (C-O), 3002, 2928, 2838, 1502, 1473, 1417, 1378, 1342, 1 121 , 1007, 783 (Ar) (KBr).
Figure imgf000022_0003
26 - 1H N R (DMSO-d6)□ 3.42 (s, 3H, p-OCH3), 3.85 (s, 6H, m-OCH3), 6.89 (d, J = 8.6 Hz, 1 H, Η5'), 7.25 (s, 2Η, Η2, Η6), 7.42 (d, J = 8.6 Hz, 1H, H6'), 7.78 (s, 1 H, H3'), 8.61 (s, 1H, HC=N), 11.26 (s, H, NH), 12.01 (1H, OH). IR Dmax/cnV1 3220 (N-H), 1653, 1228 (C=0), 1588 (C=N), 1275, 1099 (C-0), 3004, 2941 , 2834, 1550, 1503, 1479, 1463, 1416, 1352, 1335, 118 760 (Ar) (KBr).
Figure imgf000023_0001
29 - 1H NMR (DMSO-d6)□ 3.72 (s, 3H, p-OCH3), 3.85 (s, 6H, m-OCH3), 7.22 (s, 2H, H2, H6), 7.82 (d, J = 8.6 Hz, 1 H, H5'), 8.02 (d, J = 8.6 Hz, 1H, H6'), 8.15 (s, 1 H, H2'), 8.51 (s, 1 H, HC=N), 11.96 (s, 1H, NH). 13C NMR (DMSO-d6)□ 56.65 ( -OCH3), 60.73 (p-OCH3), 105.96 (C2, C6), 126.29 (C2'), 127.98 (CV), 128.88 (C1), 132.31 (CF3), 132.91 (C4'), 133.01 (C5'), 134.82 (C6'), 141.27 (C4), 145.61 (C=N), 153.40 (C3, C5), 163.50 (C=0). IR Dmax/cm-1 3182 (N-H), 1655, 1242 (C=0), 1587 (C=N), 1269, 1039 (C-0), 3008, 2938, 2838, 1506, 1480, 1417, 1336, 1316, 1173, 1121 , 1006, 958, 666 (Ar) (KBr).
Figure imgf000023_0002
36 - 1H NMR (DMSO-d6)□ 2.36 (s, 3H, CH3), 3.85 (s, 3H, p-OCH3), 3.91 (s, 3H, m- OCH3), 3.92 (s, 6H, m-OCH3), 6.00 (s, 1 H, OH), 6.99 (s, 1 H, H2'), 7.06 (s, 1 H, H6'), 7.11 (s, 2H, H2, H6), 7.26 (s, 1H, HC-N). 13C NMR (DMSO-d6)□ 21.75 (CH3), 56.56 (m-OCH3), 61.25 (p-OCH3), 91.52 (C-N), 104.44 (C2, C6), 117.93 (C5'), 119.37 (C2'), 122.52 (C6'), 136.02 (C1 ', C1), 139.24 (C4'), 141.49 (C4), 152.90 (C3'), 153.64 (C3, C5), 155.84 (C=N), 168.32 (C=0). IR CWcrrf1 1766, 1238 (C=0), 1667, 1582 (C=N), 1254, 1047 (C-0), 1177 (C-N), 3445 (OH), 1130, 621 (C-Br), 3004, 2941 , 2838, 1466, 1416, 1366, 1306, 1190, 99
Figure imgf000023_0003
37 - H NMR (DMSO-d6)□ 2.35 (s, 3H, CH3), 3.82 (s, 3H, p-OCH3), 3.90 (s, 3H, m- OCH3), 3.92 (s, 6H, m-OCH3), 6.97 (s, 1 H, H2'), 7.06 (m, 1 H, H5'), 7.10 (s, 2H, H2, H6), 7.25 (s, 1 H, HC-N), 7.44 (m, 1 H, H6'); o sinal correspondente ao grupo OH não é observado. 13C NMR (DMSO-d6) □ 21.54 (CH3), 56.27 (m-OCH3), 56.33 (m-OCH3), 61.02 (p-OCH3), 91.14 (C-N), 104.22 (C2, C6), 109.77 (C2'), 1 19.16 (C5'), 128.09 (C61), 136.402 (C1 ', C1), 141.24 (C4'), 141.96 (C4), 151.78 (C3'), 153.42 (C3, C5), 155.60 (C=N), 168.10 (C=0). IR Dmax cnT1 1767, 1243 (C=0), 1665, 1581 (C=N), 1250, 1043 (C-O), 1 77 (C-N), 3445 (OH), 1 129, 644 (C-Br), 2967, 2945, 2838, 1507, 1466, 1417, 1365, 1036, 1287, 1197, 1083, 997, 958, 861 , 699 (Ar) (KBr).
Figure imgf000024_0001
38 - 1H NMR (DMSO-d6)□ 2.47 (s, 3H, CH3), 3.87 (s, 9H, OCH3), 7.08 (s, 2H, H2, H6), 7.26 (s, 1 H, HC-N), 7.26 (m, 1 H, H2'), 7.48 (t, J = 8.0 Hz, 1 H, H3'), 7.55 (t, J = 8.0 Hz, 1 H, Η7', H8'), 7.62 (t, J = 8.0 Hz, 1 H, H7'), 7.76 (m, 1 H, H4'), 7.92 (d, J = 8.0 Hz, 1 H, H6'), 8.22 (d, J = 8.0 Hz, 1 H, H9'). 13C NMR (DMSO-d6) Π 21.57 (CH3), 56.28 (m- OCH3), 60.98 (p-OCH3), 91.17 (C-N), 104.27 (C2, C6), 1 19.61 (C1), 123.04 (C2'), 125.07 (C9'), 125.20 (C3'), 126.05 (C7'), 126.95 (C8'), 128.95 (C4'), 130.51 (C6'), 130.61 (C10'), 130.79 (C5'), 134.04 (C1 '), 141.11 (C4), 153.29 (C3, C5), 155.83 (C=N), 168.26 (C=0). IR C crn 1 1731 , 1243 (C=0), 1669, 1587 (C=N), 1254, 1039 (C-O), 1124 (C-N), 2997, 2941 , 2827, 1509, 1465, 1416, 1369, 1332, 1 191 , 1006, 980, 847, 784, 699 (Ar) (KBr).
Figure imgf000024_0002
Exemplo 5. Efeito dos compostos em linhagens celulares de leucemia linfóide aguda (LLA):
a) Diluição e armazenamento dos compostos: Todos os compostos foram ressuspendidos em DMSO na concentração estoque de 20 mM e armanezados a - 20°C. Para os testes de citotoxicidade, as diluições a partir das soluções estoque foram feitas em meio de cultura (RPMI-1640 acrescido de 10% de soro fetal bovino, 100 UI/mL penicilina e 100 pg/mL estreptomicina), imediatamente antes de serem lançadas às células.
b) Ensaios in vitro da sensibilidade/resistência das células aos compostos pelo método do MTT: As linhagens celulares REH e Jurkat foram mantidas em meio RPMI- 1640 com 10% de SFB (soro fetal bovino), 100 UI/mL penicilina, 100 pg/mL estreptomicina e incubadas a 37°C e 5% C02. Os ensaios de citotoxicidade foram realizados de acordo com método descrito na literatura (Pieters, R.; et al. In vitro drug sensitivity of cells from children with leukemia using the MTT assay with improved culture conditions. Blood, 1990, 76, 2327-2336; Pieters, R.; er al. Relation of cellular drug resistance to long-term clinicai outcome in childhood acute lymphoblastic leukaemia. Lancet, 1991 , 338, 399-403 e Kaspers, G. J.; et al. In vitro cellular drug resistance and prognosis in newly diagnosed childhood acute lymphoblastic leukemia. Blood, 1997, 90, 2723). As células foram ressuspendidas na concentração de 3,75 105 células/mL em meio de cultura, como descrito. Oitenta microlitros desta suspensão foram semeados em placas de 96 poços de fundo arredondado, contendo 20 microlitros de diferentes concentrações do composto ou apenas veículo. Cada tratamento foi feito em triplicata. Após 48 horas de incubação a 37°C e 5% C02, foram adicionados 20 μΐ de solução MTT (5 mg/mL de PBS 1x), seguindo-se nova incubação por 4h e 30min a 37°C e 5% C02. Durante estas 4h e 30min, o MTT (de coloração amarelada) é metabolizado a sal de formazan (de coloração azulada) pelas células vivas. A seguir, foram acrescentados 100 μΙ_ de dodecil sulfato de sódio (DSS) 10% + 0,1M de HCI, para a dissolução dos cristais de formazan. Após nova incubação overnight, procedeu-se à leitura de absorbância a 570 nm. Os percentuais de células sobreviventes aos tratamentos foram calculados em relação ao número de células sobreviventes no meio sem adição dos compostos em questão ("controle negativo"). c) Determinação da IC : A IC50 é definida como a concentração de um composto na qual é obtida 50% da inibição máxima. Após a leitura da absorbância, foram construídas curvas de sobrevivência e obtidos os valores de IC50 com o auxílio do software GraphPad Prism.
RESULTADOS: AÇÂO DAS ACIL-HIDRAZONAS E OXADIAZÓIS SOBRE CÉLULAS LEUCÊMICAS DE LINHAGEM B E T (REH E JURKAT, RESPECTIVAMENTE)
Foi estudado o efeito citotóxico dos compostos sintetizados em células leucêmicas humanas Jurkat e REH, por meio de ensaio de viabilidade celular (MTT), de acordo com os métodos descritos por Pieters e colaboradores (Pieters, R.; et al. In vitro drug sensitivity of cells from children with leukemia using the MTT assay with improved culture conditions. Blood, 1990, 76, 2327-2336; e Pieters, R.; et ai Relation of cellular drug resistance to long-term clinicai outcome in childhood acute lymphoblastic leukaemia. Lancet, 1991, 338, 399-403) e Kaspers e colaboradores (Kaspers, G. J.; eí ai In vitro cellular drug resistance and prognosis in newly diagnosed childhood acute lymphoblastic leukemia. Blood, 1997 90, 2723). Os resultados obtidos estão apresentados na Tabela 3.
Tabela 3. Screening dos compostos 01-29 na concentração de 0,1 DM em células leucêmicas humanas Jurkat e REH com destaque para os compostos mais ativos).
Figure imgf000026_0001
Porcentagem de sobrevivência de células leucêmicas (48h de tratamento)
Composto
Anel B B-derivada T-derivada
(REH) (Jurkat)
0,1 μ 0,1 μ
01 Fenil 92% 88%
02 4-Br-fenil 45% 30%
03 4-N02-fenil 98% 96%
04 3-OCH3-4-OH-5-Br-fenil 99% 102%
05 3-OCH3-4-OH-5-l-fenil 103% 103%
06 3-OCH 4-OH-fenil 99% 101%
07 1-naftil 39% 30% l
08 2-naftil 94% 104%
09 4-CI-fenil 68% 33%
10 3,4-OCH20-fenil 43% 30% 11 - ^-Cl-fénil ¾8% " 34%"
• . , . · . · ! · ' . : ·■ ·· . · ^ ' . . ■
12 2,5-diOCH3-fenil 106% 122%
3,4,5-triOCH3-fenil 101% 121% 2,4,5-triOCH3-fenil 94% 83% -0(CH2)3CH3-fenil 88% 100%
Figure imgf000027_0001
18 3-N02-fenil 97% 119%
19 4-N(CH3)2-fenil 94% 121%
20 3-CI-fenil 100% 86%
21 2,6-diOCH3-fenil 102% 90%
Figure imgf000027_0002
23 2-COOH-fenil 96% 81%
24 3-OCH2CH3-4-OH-fenil 95% 86%
25 3-OCH3-fenil 89% 78%
26 2-OH-4-Br-fenil 90% 79%
27 (3-OCH3-4-OCH2Bz)-fenil 91% 91%
28 4-CF3-fenil 94% 63%
29 3-CF3-4-CI-fenil 98% 98%
Colchicina 41% 18%
Figure imgf000027_0003
Para analisarmos a influência das metoxilas no anel A das acil-hidrazonas 01- 29, foi testada a série de acil-hidrazonas complementares (30-35). Nenhum dos compostos desta série apresentou atividade frente às células no screening realizado, provando assim, a necessidade do anel A trimetoxilado para a atividade antileucêmica.
Em uma terceira tentativa, na busca por compostos correlatos aos ativos, foram testados os 1 ,3,4-oxadiazóis (36-38) derivados cíclicos das 3,4,5-trimetoxifenil- hidrazonas. Do mesmo modo que para as acil-hidrazonas complementares (30-35), nenhum dos 1 ,3,4-oxadiazóis (36-38) apresentou-se ativo. A explicação destes resultados pode ser devido à rigidez dos anéis promovida pela ciclização, impedindo a interação da molécula com o alvo.
Assim, os compostos 02, 07, 09, 10, 11 e 16 foram selecionados para determinação da IC50; os valores estão apresentados na Tabela 4.
Tabela 4. IC50 dos compostos mais ativos em células leucêmicas Jurkat e REH.
Figure imgf000028_0001
02 4-Br-fenil 33,7 31 ,4
07 1-naftil 25,4 15,7
09 4-CI-fenil 328,3 202,9
10 3,4-OCH20-fenil 206,2 154,5
11 2-CI-fenil 458,7 189,4
16 4-CH3-fenil 70,6 71 ,5
Figure imgf000029_0001
As acil-hidrazonas 02 e 07 apresentaram excelentes resultados, com IC50 de 33,7nM e 25,4n para linhagem leucêmica REH e 31 ,4nM e 15,7nM para Jurkat. Exemplo 6. Experimentos de determinação do mecanismo de ação dos compostos com microarranjos de DNA:
As células foram incubadas durante 12 horas em meio fresco antes de experimentos. Dois milhões de células da linhagem celular leucêmica HL60, em triplicata, foram tratadas com a dose de125 nM do composto 07 ou com veículo dimetilsulfóxido (DMSO), durante 6h, em meio DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino. Ao final deste período, as células foram recuperadas por breve centrifugação e lisadas em solução de guanidina do kit RNAspin Mini RNA Isolation (GE).
a) Purificação do RNA e preparo da sonda biotinilada: o RNA total foi extraído das células usando-se o kit RNAspin Mini RNA Isolation (GE) seguindo instruções do fabricante. Um total de 100 ng de RNA foi utilizado para preparar a sonda de RNA complementar biotinilado (Bio-cRNA), através de síntese de cDNA seguida de amplificação por transcrição in vitro, usando o kit GeneChip WT cDNA Synthesis and Amplification (Affymetrix) segundo recomendações do fabricante.
b) Microarranjos de oligonucleotídeos e "arrays" de hibridização: a sonda de cRNA de cada replica foi hibridizada em microarranjo de oligonucleotídeos do genoma humano GeneChip Human Gene 1.0 ST Array (Affymetrix). A hibridização e posterior lavagens e revelação dos microarranjos foram feitas seguindo recomendações do fabricante.
c) Análise dos dados: os resultados de hibridização nos microarranjos foram lidos no scanner Affymetrix Gene Chip Scanner 3000-7G. Os dados foram analisados na plataforma Bioconductor. Para a obtenção dos valores de expressão gênica utilizou-se o algoritmo iterPLIER+16 ao nívelde gene com o Affymetrix Expression Console. Os genes diferencialmente expressos em resposta ao composto 07, foram obtidos por analise de regressão usando o pacote LIMMA e critério de Fold Change (FC) >1 ,5 e valor p<0,05. A lista de genes diferencialmente expressos foram analisados com o CMap (http://www. broad. mit. edu/cmap ) para identificação de possíveis mecanismos de ação correlatos à ação de compostos conhecidos (Lamb, J.; Crawford E. D. The Connectivity Map: Using Gene-Expression Signatures to Connect Small Molecules, Genes and Disease. Science, 2006, 313, 1929-1935).
Para estabelecer se componentes de determinado conjunto gênico (gene set) encontram-se co-regulados nos dados experimentais de microarranjo utilizou-se análise Gene Set Expression Analysis (GSEA; http://www.broadinstitute.org/gsea/). O algoritmo do GSEA cria uma lista dos genes representados nos microarranjos, organizados em função da expressão diferencial entre dois grupos experimentais (tratado com composto 07 e controle). Neste caso, genes reprimidos por composto 07 estarão no topo desta lista, ao passo que genes induzidos estarão em sua base. O algoritmo irá então localizar nesta lista os genes que compõem determinado conjunto gênico. Se estes genes estiverem significativamente mais representados no topo desta lista, pode-se dizer que o conjunto gênico está reprimido pelo composto 07. Na situação inversa, o conjunto gênico estará induzido pelo tratamento com a droga. Os conjuntos gênicos analisados por GSEA foram obtidos a partir de diversos bancos de dados públicos (BioCarta, Signaling Pathway Database, Signaling Gateway, Signal Transduction Knowledge Environment, Human Protein Reference Database, GenMAPP, KEGG, Gene Ontology, Sigma-Aldrich Pathways, Gene Arrays BioScience Corp, Human Câncer Genome Anatomy Consortium e NetAffx). Foram consideradas as médias dos valores de expressão de probe sets referentes a um mesmo gene, utilizando 1000 permutações para a definição do False Discovery Rate (FDR) q-valor. Gene sets com menos que 5 e mais que 500 componentes não foram considerados.
RESULTADOS; MECANISMO DE AÇÃO PROPOSTO ATRAVÉS DE ESTUDOS COM MICROARRANJOS DE DNA
No intuito de determinarmos o mecanismo de ação destes compostos, selecionamos o composto 07 para análise da expressão gênica, através de biochip de DNA. Estes ensaios geraram um conjunto de dados (algoritmos) que posteriormente foram interpretados através de Mapas de Conectividade (CMap) (www.broadinstitute.org/cmap) e análise de GSEA.
O tratamento das células HL-60 com o composto 07 resultou na repressão da transcrição de 102 genes e da ativação da transcrição de 353 genes (FC> 1 ,5, p <0,05).
Os resultados obtidos na análise de microarranjo de expressão gênica, das células tratadas com o composto teste 07, foram analisados no CMap. Genes diferencialmente expressos nas células sob ação do composto 07 foram cruzados com uma série de listas de genes responsivos às mais diferentes drogas. Estas listas fazem parte do banco de dados do CMap. Quando considerados os dados do conjunto das drogas agrupadas pelo sistema de classificação ATC (Anatomícal Therapeutic Chemical; http://www.whocc.no/atcddd/), o efeito do composto 07 foi mais semelhante ao efeito das drogas do grupo P02CA, que são derivados da Benzimidazol (por exemplo, albendazol, mebendazol, fenbendazol, tiabendazol) usados como anti- helminticos. Os resultados da análise do composto 07 no CMap são apresentados na tabela 5a abaixo.
O mecanismo de ação destas drogas se dá pela inibição da tubulina e tem recentemente sido descritas como possíveis candidatos para o tratamento de leucemias (Spagnuolo PA, et al; The antihelmintic flubendazole inhibits microtubule function through a mechanism distinct from Vinca alkaloids and displays preclinical activity in leukemia and myeloma. Blood 2010; 1 15(23):4824-33) e tumores sólidos (Doudican N, et al; Mebendazole induces apoptosis via Bcl-2 inactivation in chemoresistant melanoma cells. Mol Câncer Res 2008; 6(8): 1308- 315; Gupta K, et al; Antimitotic antifungai compound benomyl inhibits brain microtubule polymerization and dynamics and câncer cell proliferation at mitosis, by binding to a novel site in tubulin. Biochemistry 2004; 43(21 ):6645-6655).
Tabela 5a: Compostos positivamente correlacionados com o composto 07, por código ATC.
Ranque Código ATC média n Enriquecimento p Especificidade % não-nulo 1 P02CA 0,404 16 0,511 0,00018 0,017 68
2 C01AA 0,541 10 0,63 0,00022 0,1852 80
3 N05AC 0,32 24 0,42 0,00026 0,2477 62
4 P01AX 0,415 9 0,638 0,00048 0,0194 77
5 V03AF -0,532 5 -0,774 0,00106 0,0153 80
6 P02CX 0,585 6 0,724 0,001 17 0,0884 83
7 D06BX -0,386 5 -0,768 0,00124 0 60
8 G04BD 0,354 8 0,597 0,00279 0 62
9 S0 GA 0,257 20 0,373 0,0056 0,0148 60
10 G04CB -0,314 6 -0,642 0,00612 0,1281 50
1 1 P02CE 0,53 4 0,746 0,0079 0 100
12 S01 EX 0,567 3 0,84 0,00803 0 100
13 P02BX 0,513 4 0,733 0,00985 0 00
14 G03CC 0,352 17 0,38 0,01053 0,05 64
15 P03AA 0,47 5 0,666 0,01093 0,1214 80
16 N05CE -0,294 4 -0,708 0,01486 0,0423 50
17 R01AA 0,248 16 0,376 0,01544 0,016 56
18 R01AB 0,248 16 0,376 0,01544 0,016 56
19 D08AC -0,455 5 -0,639 0,01568 0,0376 80
20 R02AA -0,455 5 -0,639 0,01568 0,0376 80
Em comparação aos dados dos demais perturbagens constantes na plataforma CMap, considerando apenas dados para a linhagem celular HL-60, o efeito do composto 07 foi mais semelhante ao efeito da tanespimicina (enriquecimento = 0,699, p<0,001), que é uma droga que inibe Hsp90. A Hsp90 é uma chaperone que interage e se colocaliza com a tubulina (Garnier C, et al; Heat-shock protein 90 (hsp90) binds in vitro to tubulin dimer and inhibits microtubule formation. Biochem Biophys Res Commun 1998; 250(2):414-9; Redmond T et al; Immunofluorescence colocalization of the 90-kDa heat-shock protein and microtubules in interphase and mitotic mammalian cells. Eur J Celi Biol 1989; 50(1):66-75; Sanchez ER et al; Evidence that the 90- kilodalton heat shock protein is associated with tubulin-containing complexes in L cell cytosol and in intact PtK cells. Mol Endocrinol 1988; 2(8):756-60; Czar MJ et al; Immunofluorescence localization of the 90-kDa heat-shock protein to cytoskeleton. Eur J Cell Biol 1996; 70(4):322-30), protegendo-a da desnaturação e mantendo-a em um estado compatível para a polimerização (Weis F et al; The 90-kDa heat shock protein Hsp90 protects tubulin against thermal denaturation. J Biol Chem 2010; 285(13):9525- 34). O resultado sugere que, assim como a tanespimicina, o composto 07 pode afetar o processo de montagem de tubulina ou desestabilizar os microtúbulos já formados.
Tabela 5b: Compostos positivamente correlacionados com o composto 07, por linhagem celular. Ranque Nome CMap e Linhagem celular Média n Enriquecimento P Especificidade % não-n
1 geldanamycin - MCF7 0,598 10 0,781 0 0,0168 90
2 tanespimycin - MCF7 0,551 36 0,676 0 0,0263 80
3 trichostatin A - MCF7 -0,322 92 -0,396 0 0,5347 55
4 trichostatin A - PC3 -0,275 55 -0,385 0 0,5058 50
5 tanespimycin - HL60 0,571 12 0,699 0,00002 0,0814 75
6 methotrexate - HL60 -0,835 2 -0,989 0,00026 0 100
7 helveticoside - PC3 0,8 2 0,987 0,00032 0,0128 100
8 alvespimycin - MCF7 0,624 7 0,703 0,0005 0,0326 85
9 0175029-0000 - PC3 0,598 4 0,856 0,00056 0,0573 100
10 PNU-0251126 - PC3 -0,57 4 -0,868 0,0006 0,0067 100
11 puromycin - MCF7 0,763 2 0,98 0,0007 0,0699 00
12 monorden - MCF7 0,414 12 0,534 0,0009 0,0909 58
13 finasteride - MCF7 -0,628 3 -0,918 0,00096 0,019 100
14 methyldopate - MCF7 -0,726 2 -0,978 0,00107 0,008 100
15 albendazole - MCF7 0,765 2 0,964 0,00225 0 100
16 PHA-00745360 - CF7 -0,374 4 -0,812 0,00229 0,0073 75
17 bendroflumethiazide - MCF7 0,636 3 0,894 0,00234 0 100
18 0198306-0000 - MCF7 -0,688 2 -0,964 0,00288 0 100
19 tanespimycin - PC3 0,41 12 0,496 0,00311 0,2159 66
20 CP-690334-01 - PC3 -0,431 4 -0,799 0,00318 0,0362 75
A dinâmica dos processos celulares demanda continua reorganização do citoesqueleto, portanto, polimerização e despolimerização da tubulina. Os inibidores de tubulina podem atuar de duas formas: (1) inibindo a polimerização da tubulina ou (2) estabilizando a tubulina de tal forma a inibir a sua despolimerização. A análise de GSEA mostrou que o composto 07 causa diminuição drástica da expressão de um conjunto de genes de tubulina e chaperonas específicas de tubulina (Figura 1), o que é típico de compostos que inibem a polimerização da tubulina. A inibição da polimerização de tubulina resulta em acumulo de tubulina livre (não polimerizada) no citoplasma celular. A tubulina livre citoplasmática autoregula negativamente a expressão do mRNA de tubulina, suprimindo a formação de novo mRNA de tubulina e acelerando a degradação do mRNA existente (Caron JM, et al; Autoregulation of tubulin synthesis in hepatocytes and fibroblasts. J Celi Biol 1985; 101 :1763-72.). Ao contrário, compostos que estabilizam os filamentos de tubulina levam a aumento da expressão de tubulina.
Exemplo 7. Efeito do composto 07 sobre a progressão das células no ciclo celular, ativação dos reguladores do ciclo celular e indução de apoptose:
As células foram incubadas durante 12 horas em meio fresco antes de experimentos. Dois milhões de células da linhagem Jurkat foram incubadas por 12h, 18h, 24h e 30h em meio RPMI- 640 suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino (SFB) e 0,2% Penicilina/Streptomicina (PS) com a concentração de 125 nM de composto 07 ou DMSO (veículo).
a) Ensaios de análise do ciclo celular: As células tratadas ou não com composto 07 foram fixadas em etanol 70% por 2 horas, lavadas em PBS e incubadas por 15 min a 37°C em 1 mL de solução Triton X-100 0,1 %, 0,2 mg/mL de RNAse e 20 pg/mL de iodeto de propídio em PBS. Foram coletados 20 mil eventos em citômetro de fluxo FACSCalibur, com quantificação de fluorescência vermelha, excluindo eventuais agregados de células pelo padrão de largura vs. área do pico de fluorescência vermelha. A deconvolução dos dados para obtenção da porcentagem de células em cada fase do ciclo celular foi realizada através do programa ModFit v2.0.
b) Ensaios de quantificação da apoptose celular por marcação com Annexin V/PI: As células tratadas ou não com composto 07 foram lavadas em PBS e marcadas por kit Annexin V Apoptosis Assay (Invitrogen). Resumidamente, as células foram ressuspendidas em tampão adequado contendo cálcio e incubadas por 15 min com Annexin V-FITC e iodeto de propídio a 5 pg/mL. Foram coletados 10 mil eventos em citômetro de fluxo FACSCalibur, excluindo eventuais debris pelo padrão de forward vs. side scatter, com quantificação de fluorescência verde e vermelha.
c) Ensaios de Western Blot para análise de expressão e fosforílação de proteínas reguladoras do ciclo celular. As células tratadas ou não com composto 07 foram lisadas em tampão contendo 50 mM Tris pH 7,7, 150 mM NaCI, 5 mM EDTA, 1 % Sigma phosphatase inhibitor cocktail I, 1% Sigma phosphatase inhibitor cocktail II, 1% Sigma protease inhibitor cocktail II, 1% Igepal, 0.1 % SDS, 0.5% sodium deoxycholate e 1 mM PMSF. Após incubação por 30 min no gelo e 3 ciclos de congelamento e descongelamento, os extratos foram centrifugados a 10.000 rpm por 20 min a 4°C para sedimentação de restos de membrana. Do sobrenadante, procedeu-se com a quantificação protéica por reagente de Bradford (Biorad). As amostras foram fervidas durante 5 minutos com previa adição de β-mercaptoetanol e 100 g de proteína foram submetidos a eletroforese em gel acrilamida.bisacrilamida (39: 1) 10% com SDS e eletrotransferidas a membrana de nitrocelulose 0,45 pm (Schleicher & Schuell). A imunodetecção foi realizada pela incubação da membrana com anticorpos do Celi Cycle/Checkpoint Antibody Sampler Kit #9917 (Celi Signaling Technology) e Cyclin Dependent Kinase Inhibitor Antibody Sampler Kit #9867 (Celi Signaling Technology), seguindo instruções do fabricante. A revelação dos resultados foi feita com o kit Super Signal West Pico Chemiluminiscent Substrate (Pierce) seguido de exposição a filme de raios X.
RESULTADOS: O COMPOSTO 07 INDUZ PARADA DO CICLO CELULAR EM G2 E MORTE CELULAR POR APOPTOSE
Resultados compatíveis com a inibição da tubulinas foram obtidos quando da análise do ciclo celular de células Jurkat tratadas com o composto 07. As células de Jurkat tratadas com o composto 07 mostraram paragem do ciclo celular em G2/M (Figura 2).
Alterações no estado de expressão e fosforilação de várias proteínas que regulam o ciclo celular, foram investigados. Como mostra a Figura 3, após 12 horas de tratamento com o composto 07, já é possível detectar a fosforilação de Chk2 na Thr68. A fosforilação do resíduo Thr68 é feita pelo fator Mutated in Ataxia Teleangiectasia (ATM) e resulta na ativação de Chk2 e subsequente fosforilação de uma série de alvos a jusante, incluindo cdc25, BRCA1 , p53 e E2F, que são importantes fatores de controle (chekpoint) do ciclo celular, reparo de danos ao DNA e indução de apoptose em resposta a danos ao DNA (Falck J, et al; The ATM-Chk2-Cdc25A checkpoint pathway guards against radioresistant DNA synthesis. Nature 2001 ; 410(6830):842-7; Matsuoka S, et al; Linkage of ATM to cell cycle regulation by the Chk2 protein kinase. Science 1998; 282(5395): 1893-7; Lee JS et al; hCdsl-mediated phosphorylation of BRCA1 regulates the DNA damage response. Nature 2000; 404(6774):201-4; Hirao A, et al; DNA damage-induced activation of p53 by the checkpoint kinase Chk2. Science 2000; 287(5459): 1824-7; Stevens C et al; Chk2 activates E2F-1 in response to DNA damage. Nat Cell Biol 2003: 5(5): 401-9). A ausência de p53 detectável nos resultados do western blot (Figura 3) pode ser explicada pela baixa expressão de p53 em células Jurkat (Vigorito E, et al; Contributions of p53 and PMA to gamma-irradiation induced apoptosis in Jurkat cells. Hematol Cell Ther 1999; 41 (4): 153-61 ).
O tratamento com composto 07 resultou em repressão da expressão de CDK4 e em menor proporção também de CDK6, isoforma mais curta de CDK2 e isoforma maior de CDK9 (Figura 3). A ciclina D/CDK4/CDK6 e complexos de ciclina E/cdk2 fosforilam e inativam Rb, de modo a permitir progressão do ciclo celular. A diminuição de CD 2, CD 4 e CDK6 em células tratadas com o composto em 07, diminue inativação de Rb, que é então capaz de desempenhar as suas funções de inibição da progressão do ciclo celular e induzir a apoptose. Exemplo8. Efeito do composto 07 sobre linfócitos humanos saudáveis e sobre a formação de colónias, avaliando sua seletividade: a) ensaios in vitro da sensibilidade/resistência das células ao composto 07 pelo método do mtt: para o teste do composto 07 contra linfócitos normais, sangue de doadores humanos foi separado em gradiente de ficoll e as células mononucleares foram cultivadas a 200.000 células/poço, em 80 microlitros de meio rpmi-1640 (contendo 10% de sfb, 100 ui/ml de penicilina e 100 pg/ml de estreptomicina) e 20 microlitros de solução de fitohemaglutinina (cultilab) em cada poço, para estímulo dos linfócitos t. o composto 07 foi adicionado em diluições seriadas (50%) de 300 a 1 nm. como controle, correu-se em paralelo ensaios iguais com células das linhagens leucêmicas jurkat e reh, assim como experimentos com colchicina nas mesmas concentrações que o composto 07. a citotoxicidade foi avaliada após 48h pelo método do mtt, como descrito anteriormente. b) Experimentos de formação de colónias: A citotoxicidade do composto 07 também foi avaliada em ensaio de formação de colónias de células hematopoéticas. Utilizou-se kit "HSC-CFU complete with Epo" da Miltenyi (cat# 130-091-280), seguindo recomendações do fabricante. Células de medula óssea de doadores saudáveis foram cultivadas em meio semi-sólido de metilcelulose, acrescido de soro fetal bovino, soro albumina bovina, diferentes fatores de crescimento (GM-CSF, G-CSF, SCF, IL-3, IL-6, Epo) e do composto 07, cuja ação sobre a hematopoese foi avaliada. Após duas semanas de cultura a 37°C e 5% C02, procedeu-se à contagem do número de colónias de granulócitos (CFU-G), macrófagos (CFU- ), granulócitos/macrófagos (CFU-GM), eritróide (BFU-E e CFU-E) e colónias mistas (CFU-GEMM).
RESULTADOS: SELETIVIDADE DO COMPOSTO 07
O composto 07 foi testado em linfócitos T maduros e saudáveis, estimulados com fitohemaglutinina, para avaliar sua ação contra células normais. Como controle positivo usou-se a colchicina. Os resultados são apresentados na Tabela 6. Tabela 6. Porcentagem de sobrevivência de linfócitos saudáveis estimulados com fitohemaglutinina e tratados com diferentes concentrações do composto 07.
Concentração (nM)
Composto n°
300 150 75 37,5 18,75 9,38 4,6 0
1 07 95% 107% 108% 101% 105% 105% 103% 100%
Colchicina 63% 69% 75% 84% 95% 110% 109% 100%
Em concentrações de 300 nM o composto 07 apresentou toxicidade de 5% em relação ao controle, enquanto a colchicina, na mesma concentração, causou inibição de 37% na viabilidade dos linfócitos T.
A análise de dose-resposta do composto 07 frente a células leucêmicas em comparação com linfócitos normais estimulados com fitohemaglutinina (Figura 5), mostra que concentrações até 10 vezes maiores que a dose citotóxica para células leucêmicas parecem não afetar os linfócitos normais induzidos por fitohemaglutinina. Isto indica que o composto 07 poderia atuar em células leucêmicas sem afetar a função imunológica normal dos pacientes.
Para averiguar o efeito do composto 07 na hematopoese, o mesmo foi testado em ensaio de formação de colónias de células da medula óssea, cultivadas em meio semi-sólido de metilcelulose acrescido de fatores de crescimento. Como mostra a Tabela 7, o composto 07, em concentração muito próxima a IC50 (20 nM), apresenta atividade inibitória sobre a formação de eritrócitos comparável a um inibidor da via Pi3K, usado no ensaio como controle positivo. O composto 07 também apresenta atividade inibitória contra granulócitos e macrófagos, porém em intensidade pequena quando comparada ao inibidor da ΡΊ3Κ. Na concentração de 200 nM, correspondente a 10 vezes o IC50 médio em linhagens de LLA, o composto 07 inibiu completamente a hematopoese.
Tabela 7. Formação de colónias de células de medula óssea (%) utilizando o composto 07. , - , ' BFU-E ; , CFU-E ' . CFU-G CFU-M CFU-GM CFU-GEMM i
Controle negativo 30,7±13,9 27,0±9,5 20,0±4,0 40,7±5,1 46,7±14,6 5,7±7,4
Figure imgf000038_0001
Inibidor da Pi3K 18 12 8 9 20 1
* Para o controle são apresentados a média ± o desvio padrão de 3 repetições.
Conforme relatado acima, foram obtidas cinco 3,4,5-trimetoxifenil-hidrazonas inéditas e três ,3,4-oxadiazóis inéditos. Todas as acil-hidrazonas e oxadiazóis sintetizados e compreendidos no escopo da presente invenção foram avaliados em células leucêmicas das linhagens Jurkat e REH, e os compostos 02 e 07
apresentaram excelente atividade antileucêmica, semelhante ao composto padrão
(colchicina). O mecanismo de ação do composto 07 foi determinado com a utilização de microarranjos de DNA, mostrando sua atividade inibitória de tubulina, com ativação de Chk2 e Rb, parada do cilo celular em G2/M e indução de morte celular por apoptose. Testes subsequentes mostraram a seletividade do composto 07 para células leucêmicas na ordem de 10 vezes, quando comparado à sua ação em linfócitos humanos saudáveis.
As 3,4,5-trimetoxifeni)-hidrazonas, bem como seus compostos análogos e semelhantes, compreendendo os oxadiazóis, presentes nesta invenção, apresentam, portanto, grande potencial como protótipos de fármacos, pré-fármacos ou fármacos, para o tratamento de diferentes doenças associadas à proliferação celular, como leucemias, compreendendo leucemia linfóide aguda (LLA), tumores e inflamação.
A descrição da presente invenção foi apresentada com o propósito de ilustração e detalhamento para futuras aplicações. Entretanto, a presente descrição não tem caráter limitativo em relação às invenções descritas, conforme aqui reveladas e exemplificadas. Variações e modificações compatíveis com os descritos acima, e a habilidade ou conhecimento da técnica relevante, estão dentro do escopo da presente invenção. É intenção legítima que a presente invenção compreenda em seu escopo todas as modificações e variações da mesma, de acordo com a descrição do relatório e nas reivindicações.

Claims

REIVINDICAÇÕES
1. Composto caracterizado pela fórmula estrutural
Figure imgf000039_0001
em que o Anel B representa um substituinte selecionado do grupo compreendendo fenil, 4-Br-fenil, 4-N02-fenil; 3-OCH3-4-OH-5-Br-fenil; 3-OCH3-4-OH-5-l-fenil; 3-OCH3- 4-OH-fenil; 1-naftil; 2-naftil; 4-CI-fenil; 3,4-OCH20-fenil; 2-CI-fenil; 2,5-diOCH3-fenil;
3,4,5-triOCH3-fenil; 2,4,5-triOCH3-fenil; 4-0(CH2)3CH3-fenil; 4-CH3-fenil; N ; 3-N02- fenil; 4-N(CH3)2-fenil; 3-CI-fenil; 2,6-diOCH3-fenil; "N°2 ; 2-COOH-fenil; 3- OCH2CH3-4-OH-fenil; 3-OCH3-fenil; 2-OH-4-Br-fenil; (3-OCH3-4-OCH2fenil)-fenil; 4- CF3-fenil; e 3-CF3-4-CI-fenil.
2. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o Anel B representa um substituinte selecionado do grupo compreendendo 3-OCH3-4-
ΟΗ-5-l-fenil; ; 2,6-diOCH3-fenil; 2-OH-4-Br-fenil; e 3-CF3-4-CI-fenil.
3. Composto caracterizado pela estrutura II
Figure imgf000039_0002
em que Anel B representa um substituinte selecionado do grupo compreendendo 3- OCH3-4-OH-5-Br-fenil, 3-OCH3-4-OH-fenil e 1-naftil.
4. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de compreender um ou mais compostos descritos em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 e excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
5. Uso do composto descrito nas reivindicação 1 caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para tratar doenças associadas à proliferação celular.
6. Uso do composto descrito na reivindicação 2 caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para o tratamento de doenças associadas à proliferação celular.
7. Uso do composto de fórmula la
Figure imgf000040_0001
(la)
caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para o tratamento de doenças associadas à proliferação celular.
8. Uso do composto de fórmula lia
Figure imgf000040_0002
caracterizado pelo fato de ser na preparação de medicamentos para o tratamento de doenças associadas à proliferação celular.
9. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 8, caracterizado pelo fato de que as referidas doenças associadas à proliferação celular são leucemia linfóide aguda (LLA), tumores e inflamação.
10. Método de tratamento de doenças associadas à proliferação celular caracterizado pelo fato de compreender a administração de um composto descrito em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou de uma composição descrita na reivindicação 4.
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101719541B1 (ko) 2015-08-13 2017-03-24 연세대학교 산학협력단 항암용 약학 조성물 및 ano1 활성억제제
KR20170141542A (ko) * 2016-06-15 2017-12-26 국립암센터 위암을 예방 및 치료하는 rhoa 억제제의 약학적 조성물
CN110498809B (zh) * 2018-05-17 2022-04-05 香港科技大学深圳研究院 基于酰腙配体类的有机硼化合物及其制备方法和应用
KR102131331B1 (ko) 2018-09-19 2020-07-07 연세대학교 산학협력단 항암용 신규 약학 조성물 및 ano1 활성억제제
CN113336729B (zh) * 2021-05-31 2022-05-27 四川大学华西医院 硝呋齐特类衍生物及其制备方法和用途

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040138272A1 (en) 2002-09-03 2004-07-15 Mckerracher Lisa 1,4-Substituted cyclohexane derivatives
US20070066610A1 (en) 2005-03-18 2007-03-22 Kristi Leonard Acylhydrazones as kinase modulators
BRPI0418095A (pt) 2003-12-23 2007-04-17 Gpc Biotech Inc inibidores de quinases dependentes de ciclina, composições e usos relacionados aos mesmos
BRPI0508364A (pt) 2004-03-02 2007-07-24 Aventis Pharma Sa derivados de 4-benzimidazol-2-ilpiridazin-3-ona
US20080194562A1 (en) 2005-01-21 2008-08-14 Astex Therapeutics Limited Pyrazole Derivatives For The Inhibition Of Cdk's And Gsk's

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS60105621A (ja) * 1983-11-14 1985-06-11 Agency Of Ind Science & Technol 細胞の分化誘導作用を有する生理活性物質およびその製法
IL94389A0 (en) * 1989-06-01 1991-03-10 Health Research Inc Monoclonal antibody reactive to a unique antigen widely present on various human leukemia and lymphoma cells and method of using same for diagnosis and treatment
US5372808A (en) * 1990-10-17 1994-12-13 Amgen Inc. Methods and compositions for the treatment of diseases with consensus interferon while reducing side effect
US6197806B1 (en) * 1995-12-20 2001-03-06 Nippon Zoki Pharmaceutical Co., Ltd. Eliminating agent for activated oxygen and free radicals
CN1956984B (zh) * 2004-04-01 2010-06-09 安万特药物公司 1,3,4-二唑-2-酮作为PPAR-δ调节剂
CN1824657A (zh) * 2006-04-05 2006-08-30 贵州大学 3－取代－2－芳基取代－5－(3,4,5－三烷氧基苯基)－1,3,4－噁二唑衍生物及制备方法和用途
US20110189306A1 (en) * 2010-01-13 2011-08-04 Norbert Kartner COMPOUNDS, COMPOSITIONS AND TREATMENTS FOR V-ATPase RELATED DISEASES

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040138272A1 (en) 2002-09-03 2004-07-15 Mckerracher Lisa 1,4-Substituted cyclohexane derivatives
BRPI0418095A (pt) 2003-12-23 2007-04-17 Gpc Biotech Inc inibidores de quinases dependentes de ciclina, composições e usos relacionados aos mesmos
BRPI0508364A (pt) 2004-03-02 2007-07-24 Aventis Pharma Sa derivados de 4-benzimidazol-2-ilpiridazin-3-ona
US20080194562A1 (en) 2005-01-21 2008-08-14 Astex Therapeutics Limited Pyrazole Derivatives For The Inhibition Of Cdk's And Gsk's
US20070066610A1 (en) 2005-03-18 2007-03-22 Kristi Leonard Acylhydrazones as kinase modulators

Non-Patent Citations (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"The Handbook of Pharmaceutical Excipients", THE PHARMACEUTICAL PRESS
BAIN, B.: "J. Diagn6stico em leucemias", 2003, ELSEVIER, pages: 01 - 56
BORCHHARDT, D.M. ET AL.: "Biochemical Evaluation of a Series of Synthetic Chalcone and Hydrazine Derivates as Novel Inhibitors of Cruzain from Trypanosoma cruzi", JOURNAL OF THE BRAZILIAN CHEMICAL SOCIETY, vol. 21, no. 1, 2010, pages 142 - 150, XP055069491 *
BORCHHARDT, DEISE M.; MASCARELLO, ALESSANDRA; CHIARADIA, LOUISE DOMENEGHINI; NUNES, RICARDO J.; OLIVA, GLAUCIUS; YUNES, ROSENDO A.: "Biochemical evaluation of a series of synthetic chalcone and hydrazide derivatives as novel inhibitors of cruzain from Trypanosoma cruzi", JOURNAL OF THE BRAZILIAN CHEMICAL SOCIETY, vol. 21, no. 1, 2010, pages 142 - 150
C GARNIER: "Heat-shock protein 90 (hsp90) binds in vitro to tubulin dimer and inhibits microtubule formation", BIOCHEM BIOPHYS RES COMMUN, vol. 250, no. 2, 1998, pages 414 - 9
C STEVENS ET AL.: "Chk2 activates E2F-1 in response to DNA damage", NAT CELL BIOL, vol. 5, no. 5, 2003, pages 401 - 9, XP002309315, DOI: doi:10.1038/ncb974
CAO, X. ET AL.: "Synthesis and Biological Activity of a Series of Novel N-Substituted p-Lactams Derived from Natural Gallic Acid", JOURNAL OF THE CHINESE CHEMICAL SOCIETY, vol. 58, 2011, pages 35 - 40, XP055069493 *
CARON JM ET AL.: "autoregulation of tubulin synthesis in hepatocytes and fibroblasts", CELL J BIOL, vol. 101, 1985, pages 1763 - 72
CHIDA, A. S.; VANL, P. V. S. N.; CHANDRASEKHARAM, M.; SRINIVASAN, R.; SINGH, A. K: "Synthesis of 2,3-dimethoxy-5-methyl-1,4-benzoquinone: a key fragment in coenzyme-Q series", SYNTHETIC COMMUNICATIONS, vol. 31, 2001, pages 657 - 660, XP001019402, DOI: doi:10.1081/SCC-100103252
CZAR MJ ET AL.: "Immunofluorescence localization of the 90-kDa heat-shock protein to cytoskeleton", EUR J CELL BIOL, vol. 70, no. 4, 1996, pages 322 - 30
DOUDICAN N ET AL.: "Mebendazole induces apoptosis via Bcl-2 inactivation in chemoresistant melanoma cells", MOL CANCER RES, vol. 6, no. 8, 2008, pages 1308 - 315
DOWNING, JAMES R.; SHANNON, KEVIN M.: "Acute leukemia: A pediatric perspective", CANCER CELL, vol. 2, 2002, pages 437 - 445
F WEIS ET AL.: "The 90-kDa heat tubulin shock protein Hsp90 protects against thermal denaturation", J BIOL CHEM, vol. 285, no. 13, 2010, pages 9525 - 34
FALCK J ET AL.: "The ATM-Chk2-Cdc25A checkpoint pathway guards against radioresistant DNA synthesis", NATURE, vol. 410, no. 6830, 2001, pages 842 - 7
GOODMAN; GILMAN: "As bases farmacofogicas da terapeutica", 2006
GREAVES, M. F.: "Stem cell origins of leukaemia and curability", BRITISH JOURNAL OF CANCER, vol. 67, 1993, pages 413 - 423
GUIMARAES, C. R. W.; BOGER, D. L; JORGENSEN, W. L.: "Elucidation of Fatty Acid Amide Hydrolase Inhibition by Potent a-Ketoheterocycle Derivatives from Monte Carlo Simulations", JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, vol. 127, 2005, pages 17377 - 17384
GUPTA K ET AL.: "antifungal antimitotic compound benomyl inhibits brain microtubule polymerization and dynamics and cancer cell proliferation at mitosis, by binding to a novel site in tubulin", BIOCHEMISTRY, vol. 43, no. 21, 2004, pages 6645 - 6655
HERR, I.; DEBATIN, K. M.: "Cellular stress response and apoptosis in cancer therapy", BLOOD, vol. 98, 2001, pages 2603 - 2614, XP001145463, DOI: doi:10.1182/blood.V98.9.2603
HIRAO A: "DNA damage-induced activation of p53 by the checkpoint kinase Chk2", SCIENCE, vol. 287, no. 5459, 2000, pages 1824 - 7
JIN, L. ET AL.: "Synthesis, structure, and bioactivity of N'-substituted benzylidene- 3,4,5- trimethoxybenzohydrazide and 3-acetyl-2-substituted phenyl-5-( 3,4,5-trimethoxyphenyl)-2,3-dihydro-1,3,4-oxadiazole derivates", BIOORGANIC & MEDICINAL CHEMISTRY LETTERS, vol. 16, 2006, pages 5036 - 5040, XP005611690 *
JIN, L.; CHEN, J.; SONG, B.; CHEN, Z.; YANG, S.; LI, Q.; HU, D.; XU, R., BIOORG MED CHEM, vol. 16, 2006, pages 5036 - 5040
KASPERS, G. J. ET AL.: "In vitro cellular drug resistance and prognosis in newly diagnosed childhood acute lymphoblastic leukemia", BLOOD, vol. 90, 1997, pages 2723, XP002363591
KASPERS, G. J.: "In vitro cellular drug resistance and prognosis in newly diagnosed childhood acute lymphoblastic leukemia", BLOOD, vol. 90, 1997, pages 2723, XP002363591
KUMAR, D.; SUNDAREE, S.; JOHNSON, E. 0.; SHAH, K.: "An efficient synthesis and biological study of novel indolyl-1,3,4- oxadiazoles as potent anticancer agents", BIOORGANIC & MEDICINAL CHEMISTRY LETTERS, vol. 19, 2009, pages 4492 - 4494, XP026301732, DOI: doi:10.1016/j.bmcl.2009.03.172
LAKS, D.; LONGHI, F.; BEMARDES, W. M.; RAMOS, G. P. C., J PEDIATR, vol. 79, 2003, pages 149 - 158
LAMB, J.; CRAWFORD E.D.: "The Connectivity Map: Using Gene-Expression Signatures to Connect Small Molecules", GENES AND DISEASE SCIENCE, vol. 313, 2006, pages 1929 - 1935, XP055253665, DOI: doi:10.1126/science.1132939
LEE JS ET AL.: "hCdsl-mediated phosphorylation of BRCA1 regulates the DNA damage response", NATURE, vol. 404, no. 6774, 2000, pages 201 - 4
LESZCZYNIECKA, M.; ROBERTS, T.; DENT, P.; GRANT, S.; FISHER, P. B.: "Differentiation therapy of human cancer: basic science and clinical applications", PHARMACOLOGY & THERAPEUTICS, vol. 90, 2001, pages 105 - 156
MATSUOKA S ET AL.: "Linkage of ATM to cell cycle regulation by the Chk2 protein kinase", SCIENCE, vol. 282, no. 5395, 1998, pages 1893 - 7, XP002922301, DOI: doi:10.1126/science.282.5395.1893
MAZZONE, G.; ARRIGO REINA, R.: "3,4,5-Trimethoxybenzoyl hydrazides and their anti-MAO [monoamine oxidase] activity", BOLLETTINO DELLE SEDUTE DELLA ACCADEMIA GIOENIA DI SCIENZE NATURALI IN CATANIA, vol. 10, no. 8, 1971, pages 689 - 702
MAZZONE, G.; BONINA, F.; FORMICA, F.: "Some aroylhydrazones of halobenzaldehydes and halo-substituted 2,5-diaryl-1,3,4-oxadiazoles", FARMACO, EDIZIONE SCIENTIFICA, vol. 33, no. 12, 1978, pages 963 - 71
PIETERS, R. ET AL.: "In vitro drug sensitivity of cells from children with leukemia using the MTT assay with improved culture conditions", BLOOD, vol. 76, 1990, pages 2327 - 2336
PIETERS, R. ET AL.: "Relation of cellular drug resistance to long-term clinical outcome in childhood acute lymphoblastic leukaemia", LANCET, vol. 338, 1991, pages 399 - 403
PIETERS, R.: "In vitro drug sensitivity of cells from children with leukemia using the MTT assay with improved culture conditions", BLOOD, vol. 76, 1990, pages 2327 - 2336
PLASSCHAERT, S.; VAN DER KOLK, D.; DE BONT, E.; VELLENGA, E.; KAMPS, W.; DE VRIES, E.: "Breast Cancer Resistance Protein (BCRP) in Acute Leukemia", LEUKEMIA & LYMPHOMA, vol. 45, 2004, pages 649 - 654
RANG, H. P.; DALE, M. M.; RITTER, J. M; MOORE, P. K.: "Farmacologia.", 2004, ELSEVIER, pages: 703
RANG, H. P; DALE, M. M.; RITTER, J. M; MOORE, P. K.: "Farmacologia", 2004, ELSEVIER, pages: 703
REDMOND T ET AL.: "Immunofluorescence colocalization of the 90-kDa heat-shock protein and microtubules in interphase and mitotic mammalian cells", EUR J CELI BIOI, vol. 50, no. 1, 1989, pages B6 - 75
ROBINSON, B.: "Fischer indole synthesis", CHEM. REV., vol. 4, 1963, pages 373 - 401
SAMUS, N. M.; TSAPKOV, V. I.; KURACHEVA, S. A.; BURDENKO, T. A.: "Synthesis and antimicrobial activity of coordination compounds of 3d-elements with some hydrazones derived by using 5-nitro-2-furaldehyde", KHIMLKO-FARMATSEVTICHESKII ZHURNAL, vol. 28, 1994, pages 41 - 44
SANCHEZ ER ET AL.: "Evidence that the 90-kilodalton heat shock protein is associated with tubulin-containing complexes in L cell cytosol and in intact PtK cells", MOL ENDOCRINOL, vol. 2, no. 8, 1988, pages 756 - 60
SPAGNUOLO PA ET AL.: "The antihelmintic flubendazole inhibits microtubule function through a mechanism distinct from Vinca alkaloids and displays preclinical activity in leukemia and myeloma", BLOOD, vol. 115, no. 23, 2010, pages 4824 - 33
TROEBERG, L.; CHEN, X.; FLAHERTY, T. M.; MORTY, R. E.; CHENG, M.; HUA, H.; SPRINGER, C.; MCKERROW, J. H.; KENYON, G. L.; LONSDALE-: "Chalcone, acyl hydrazide, and related amides kill cultured Trypanosoma brucei brucei", MOLECULAR MEDICINE, vol. 6, 2000, pages 660 - 669
VIGORITA, M. G.; OTTANA, R; ZAPPALA, C.; MACCARI, R.; PIZZIMENTI, F. C.; GABBRIELLI, G.: "Halogenated isoniazid derivatives as possible antimycobacterial and anti-HIV agents - 111", FARMACO, vol. 49, 1994, pages 775 - 781
VIGORITO E ET AL.: "Contributions of p53 and PMA to gamma-irradiation induced apoptosis in Jurkat cells", HEMATOL CELL THER, vol. 41, no. 4, 1999, pages 153 - 61, XP019372038
WANG, Z. ET AL.: "Identifying Novel Molecular Structures for Advanced Melanoma by Ligant-Based Virtual Screening", JOURNAL OF CHEMICAL INFORMATION AND MODELING, vol. 49, 2009, pages 1420 - 1427, XP009170439 *
WANG, Z.; LU, Y.; SEIBEL, W.; MILLER, D. D.; LI, W.: "Identifying Novel Molecular Structures for Advanced Melanoma by Ligand-Based Virtual Screening", JOURNAL OF CHEMICAL INFORMATION AND MODELING, vol. 49, 2009, pages 1420 - 1427, XP009170439, DOI: doi:10.1021/ci800445a
WANI, M. C.; TAYLOR, H. L.; WALL, M. E.; COGGON, P.; MCPHAIL, A. T.: "Plant antitumor agents. VI. Isolation and structure of taxol, a novel antileukemic and antitumor agent from Taxus brevifolia", JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, vol. 93, 1971, pages 2325 - 2327, XP002037887, DOI: doi:10.1021/ja00738a045
WORLD CANCER REPORT 2008, 23 February 2011 (2011-02-23), Retrieved from the Internet <URL:http://www.iarc.fr/en/publications/pdfs-online/wcr/2008/index.php>

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