WO2013053471A2 - Device and method for high-pressure cryopreservation of a biological sample - Google Patents

Device and method for high-pressure cryopreservation of a biological sample Download PDF

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WO2013053471A2
WO2013053471A2 PCT/EP2012/004248 EP2012004248W WO2013053471A2 WO 2013053471 A2 WO2013053471 A2 WO 2013053471A2 EP 2012004248 W EP2012004248 W EP 2012004248W WO 2013053471 A2 WO2013053471 A2 WO 2013053471A2
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pressure
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cryopreservation
temperature
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Günter R. FUHR
Heiko Zimmermann
Frank Stracke
Markus GRABENBAUER
Jan HÜBINGER
Phillipe BASTIAENS
Frank Wehner
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Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V.
MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V.
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    • F—MECHANICAL ENGINEERING; LIGHTING; HEATING; WEAPONS; BLASTING
    • F25—REFRIGERATION OR COOLING; COMBINED HEATING AND REFRIGERATION SYSTEMS; HEAT PUMP SYSTEMS; MANUFACTURE OR STORAGE OF ICE; LIQUEFACTION SOLIDIFICATION OF GASES
    • F25D—REFRIGERATORS; COLD ROOMS; ICE-BOXES; COOLING OR FREEZING APPARATUS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • F25D31/00—Other cooling or freezing apparatus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0236—Mechanical aspects
    • A01N1/0263—Non-refrigerated containers specially adapted for transporting or storing living parts whilst preserving, e.g. cool boxes, blood bags or "straws" for cryopreservation
    • A01N1/0268—Carriers for immersion in cryogenic fluid, both for slow-freezing and vitrification, e.g. open or closed "straws" for embryos, oocytes or semen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
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    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0278—Physical preservation processes
    • A01N1/0284—Temperature processes, i.e. using a designated change in temperature over time
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
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    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0278—Physical preservation processes
    • A01N1/0289—Pressure processes, i.e. using a designated change in pressure over time

Definitions

  • the invention relates to a device for the cryopreservation of a biological sample, comprising biological cells and an aqueous preservation medium, with a pressure vessel. Furthermore, the invention relates to a method for cryopreserving the biological sample and the use of a stabilizer substance, with which a glassy phase of water is stabilized, in the cryopreservation of biological samples. Furthermore, the invention relates to a method for heating the cryopreserved biological sample.
  • Cryopreservation of cells has so far been the only way to reversibly halt vital processes at the cellular level in such a way that they can restart after being heated to physiological temperatures.
  • the cryopreservation finds no equivalent in nature.
  • organisms such. As fish, found in polar regions embedded in ice, which maintain their vitality for a limited duration. However, these organisms are not completely frozen through, but contain in their cells glycerol and other freezing point-lowering substances, or they express proteins (so-called anti-freeze proteins), which influence the ice structure ⁇ .
  • a permanent preservation is not possible in this was to ⁇ because even lead diffusion processes over weeks and months to the disintegration of the biological system at temperatures below 0 ° C. The permanent preservation would rather a cooling z. B. require to a temperature of flüssi ⁇ gem nitrogen, in which the liquid in the Cells would freeze. But then the organisms can not be reanimated.
  • cryoprotectants antifreeze additives, cryoadditiva
  • Cryoprotectants typically comprise klei ⁇ ne molecules, such. As dimethyl sulfoxide (DMSO), which penetrate into the cells, or higher molecular weight substances, such as. As sugar, which remain in the medium outside the cells or at the surface.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • Cryoprotectants are frequently only in ho ⁇ hen, for the most part non-physiological concentrations (10% to 50%) is effective. They may be added (4 ° C), therefore, only at lower than physiological temperatures, Müs ⁇ sen quickly penetrate into the cells and are washed out after thawing once.
  • cryopreservation may be due to a vitality rate (survival rate), e.g. B. by the quotient of the number of living cells after and before the cryopreservation, characterized. It is known that the vitality rate depends on the type of cell, the volume and various others in the
  • cryopreservation depends in particular on the physical-biological boundary conditions, eg. As the properties of the water and those of the cryoprotectants from. So far, it is assumed that cryoprotectants must pass through diffusion in all cells and the heat in a short time (ms to min) must be dissipated to the outside, since only from there ge ⁇ can be cooled. It is further assumed that these conditions are due to the thermal conductivity of the dominant water in the cells and the low diffuse are ions educa of cryoprotectants (suspended cells in a nutrient solution and with the addition of cryoprotectants) through the Zellmembra ⁇ NEN only very small objects fulfilled.
  • JLM Leunissen et al. [4] For cryomicroscopy, a process is described which can be expected to vitrification: a thin-walled copper tube with a diameter of ⁇ 1 mm is filled with a cell suspension, closed at the ends by squeezing gas-free and then in a cooling liquid such as propane , Nitrogen, etc., are found in cryogenic cryosections of the tubes excellently preserved cell structures indicating vitrification. However, heating the cryoprocesses shows that the cells did not survive the cooling process.
  • the paper by JLM Leunissen et al. [4] described method is unsuitable for vitality-preserving heating of the sample. So far, it is therefore assumed that methods for cryomicroscopy do not allow revitalization by reheating. There is an urgent interest in reducing or overcoming the disadvantages of conventional cryopreservation in view of evolving regenerative medicine and biotechnology as well as environmental protection and conservation.
  • the object of the invention is to provide an improved cryopreservation device which overcomes the disadvantages of conventional techniques and in particular enables cryopreservation with an increased vitality rate and / or increased sample volume.
  • the object of the invention is furthermore to provide an improved method for cryopreservation which overcomes the disadvantages of conventional techniques and which, in particular, makes it possible to adjust process conditions during cooling and / or thawing in such a way that an increased vitality rate is achieved.
  • it is an object of the invention to provide an improved method for heating a cryopreserved biological sample which overcomes the disadvantages of conventional techniques and in particular allows to suppress a vitality-limiting influence of the biological samples in the transition to a thawed state.
  • a cryopreservation apparatus provided for cryopreserving a biological sample.
  • the cryopreservation device comprises a pressure vessel having a container wall and an interior adapted to receive the biological sample is set up.
  • the pressure vessel is configured to be stored in a cooling bath of a cooling device up to a cryopreservation temperature, e.g. B. below
  • the pressure vessel is configured such that the interior of the cooling tank can be pressurized to a pressure higher than the surrounding atmospheric pressure.
  • the pressure vessel is adapted for permanent cryopreservation of the biological sample and location ⁇ tion at the cryopreservation temperature and main- conservation of the increased pressure in the pressure vessel.
  • the pressure container comprises an actuating device, which is aimed briefly- for a time and / or location-dependent SET ⁇ development of temperature and pressure in the pressure tank.
  • the adjusting device is connected to the container wall of the pressure vessel and adapted to the adjustment of the cryopreservation temperature and pressure in the interior of the pressure vessel time and / or location-dependent to beeinflus ⁇ sen.
  • the adjusting device is set up to selectively control the cooling and / or heating of the biological sample according to a predetermined temperature-time function.
  • the setting means capable of influencing the tem ⁇ peraturver republic in the pressure vessel.
  • the adjusting device is suitable for controlling the pressure in the pressure vessel in accordance with a predetermined pressure-time function.
  • the temperature and pressure-time functions can be set re ⁇ tively to each other.
  • the adjusting device allows targeted first to cool the biological sample and then to apply an increased pressure to carry out the cooling and the pressure increase simultaneously or first to increase the pressure and on ⁇ closing the cryopreservation set.
  • the actuator is suitable to control the location of pressure generation in the pressure vessel.
  • the adjusting device comprises at least one Druckeinstellelement, at least one cooling element and / or at least one heat conducting element.
  • the print setting is configured to adjust the pressure-time function, a location of a Primae ⁇ ren entry pressure and / or the amount of pressure with which the interior of the pressure vessel is pressurized.
  • the cooling element and / or the heat-conducting element optionally in conjunction with the action of the cooling device, are arranged to control the temperature-time function, the spatial temperature distribution and the cryopreservation temperature.
  • the biological sample contains biological cells and an aqueous preservation medium.
  • the biological cells comprise individual cells, such as. B. individual stem cells, progenitor cells, fibroblasts, germ cells, cell groups, in particular from the cell types mentioned, pieces of tissue or organs or parts thereof.
  • the biological cells may even form complete organisms, especially microorganisms such as worms or insects.
  • the preservation medium comprises an aqueous physiological medium (nutrient medium, culture medium) as known from the cultivation of biological cells.
  • a second aspect of the invention provides a method for the cryopreservation of the biological sample is ceremoniesge ⁇ provides, in which the biological sample is placed in a pressure vessel and the pressure vessel in a cooling device is cooled from ⁇ , to the biological sample in the cryopreserved fourth state in a at least partially glassy phase is transferred.
  • a time- and / or location-dependent adjustment of the temperature and the pressure in the pressure vessel is carried out using a control unit. tion with at least one Druckeinstellelement, at least one cooling element and / or at least one heat conducting element.
  • the cryopreservation device according to the first aspect of the invention is preferably used to carry out the method according to the invention for the cryopreservation of biological samples.
  • a method of heating a biological sample comprising biological cells and a preservation medium in a frozen state disposed in a glassy phase in a pressure vessel.
  • the temperature of the pressure vessel and the biological sample is increased and maintained during the temperature increase in the pressure vessel, an elevated pressure above the ambient atmospheric pressure.
  • the method of heating the biological sample is carried out using the cryopreservation device according to the first aspect of the invention.
  • At least one stabilizer substance ie a single substance or a mixture of several substances
  • at least one stabilizer substance in the cryopreservation of biological samples as a constituent of the preservation medium which is suitable for increasing the temperature of a biological sample biological cells and a preservation medium, preferably to obtain a glassy state of the supercooled melt without crystallization to the transition to the liquid state.
  • the invention is based on the finding that the freezing of aqueous systems avoids the formation of the crystalline phase and instead the glassy phase (amorphous phase). can be produced by applying a pressure to the aqueous system.
  • the transfer of the biological sample into the cryopreserved state, the cryopreservation and / or the heating of the cryopreserved samples take place in a region of the phase diagram of the aqueous system in which the glassy phase is preferably formed. Since the survival rate of the biological cells in the biological sample in the vitreous phase is considerably higher than in the crystalline phase, the invention enables an increased vitality rate of the cryopreservation.
  • the adjusting device makes it possible to selectively vary pressure and temperature parameters during freezing and / or thawing in order to achieve a maximum vitality rate.
  • a true cryopreservation with the possibility of re-thawing and revitalization of the cells in the biological sample is provided while the art by JLM Leunissen et al. [4] represents only a cryopreparation for microscopic examinations.
  • the glassy state of the sample particularly the preservation medium
  • this allows cryopreserved biological samples such.
  • the preservative medium is preferably stabilized with at least one stabilizer substance which is capable of stabilizing the glassy phase of the supercooled melt as the temperature of the biological sample increases, preferably to the point of melting.
  • the cryopreservation device according to the invention advantageously makes it possible to influence the path of the sample conditions through the phase diagram past the solid-liquid phase transition.
  • the adjusting device comprises at least one Druckeinstellelement which is connected to the container wall and / or the interior of the pressure vessel.
  • various variants of the Druckeinstellelements are possible, which can be selected individually or in combination depending on the preservation task and the spatial conditions of the cryopreservation.
  • At least one pressure screw can be provided in the container wall of the pressure vessel.
  • the container wall contains a threaded opening for liquid-tight recording of the pressure screw. By screwing the pressure screw into the threaded opening, the free volume of the interior can be reduced in the pressure vessel and increased according to the pressure in the pressure vessel.
  • an expansion region can be provided, which communicates with the interior of the pressure vessel and is adapted to receive a liquid or gaseous expansion medium. If the expansion medium expands in the expansion area, the free volume in the interior is correspondingly reduced and the pressure in the pressure vessel is increased.
  • the Druckeinstellelement may comprise a pressure clamp, which acts from the outside on the container wall.
  • the container wall is formed of a flexible material in order to transmit the mechanical pressure exerted by the pressure clamp on the interior of the pressure vessel.
  • the pressure clamp can be equipped with cooling openings in order to accelerate the cooling of the pressure vessel in the cooling bath of the cooling device.
  • the pressure clamp may be designed for mechanical or electrical actuation.
  • the expansion region comprises at least one hollow conduit for receiving the expansion medium, which communicates with the inner space of the pressure vessel and which protrudes from the pressure vessel.
  • the hollow line contains z. As water, an aqueous solution or parts of the biological sample. Due to the protrusion of the hollow conduit from the pressure vessel, the expansion medium in the hollow conduit is spatially separated from the interior of the pressure vessel. This advantageously allows a cooling of the hollow conduit in the cooling bath of the cooling device, while the remaining pressure vessel is still at an elevated temperature, for. B. is at room temperature. In the hollow line crystalline ice can be generated, which towards the Interior expands, reduces the remaining volume and thus causes an increase in the pressure in the interior.
  • the hollow conduit has branches.
  • this makes it possible to increase the volume of the expansion area in comparison to a single, unbranched hollow conduit.
  • the branched hollow line makes it possible to influence the time function of the pressure generation in the pressure vessel.
  • a plurality of hollow conduits may be provided which protrude from the pressure vessel in different spatial directions.
  • this makes it possible to influence the pressure generation as a function of the orientation of the pressure vessel relative to the cooling bath of the cooling device. If the inventively provided adjusting device a
  • cooling element this is preferably formed by a cooling line, which is arranged in the pressure vessel.
  • the cooling line runs through the interior of the container. It is adapted to with a coolant such. B. with liquid nitrogen to be flowed through.
  • the cooling line allows adjustment of the beginning and the time function of the temperature reduction in the pressure vessel.
  • Heat-conducting element comprises, it is preferably formed by an outer profile on an outer side of the pressure vessel, an inner profile on an inner side of the pressure vessel and / or heat-conducting body in the interior of the pressure vessel.
  • These variants of heat conducting elements make it possible to accelerate the transport of heat from the pressure vessel into the cooling bath during the cooling of the pressure vessel.
  • a further advantage of the cryopreservation device according to the invention is that the pressure vessel can be produced with a large number of geometric shapes.
  • a tubular pressure vessel may be straight or curved. In both cases, the spatial distribution of the temperature and pressure setting in the pressure vessel can each be influenced by its shape.
  • cryopreservation device may be provided in the interior of an inner container, which is adapted to receive the biological sample.
  • the biological sample in the inner container is materially separated from the remaining volume of the inner space. This allows influencing the glassy phase in the immediate vicinity of the biological sample.
  • a substrate can be arranged in the interior, which is set up for the adherent recording of biological cells which are part of the biological sample.
  • the substrate may, for. B. be arranged in the inner container.
  • a substrate substrate materials are suitable, which are used for adherent cell cultures, such. As plastic or glass.
  • a segmentation of the interior can be provided in interior sections.
  • the segmentation advantageously enables the targeted adjustment of different pressure-temperature conditions in each of the interior sections.
  • a sensor device may be arranged in the interior, which comprises at least one temperature sensor and / or at least one pressure sensor.
  • the sensor device enables teilhaft wash a measurement of temperature and / or Dru ck in the interior.
  • the cryopreservation can be controlled.
  • a substance reservoir can be arranged in the interior, which is directed to release a substance into the interior.
  • the substance reservoir comprises z. B. hollow spheres that can be destroyed under the effect of increased pressure in the interior to release a substance.
  • the mentioned variants of the interior design can be provided individually or in combination.
  • the container wall may be equipped with an optical unit.
  • the optical unit comprises an imaging optics, which is set up for an optical observation of the interior of the container Druckbe.
  • the optical unit allows optical monitoring of the state of the biological sample during cryopreservation.
  • the pressure and temperature setting in the pressure vessel to arrive in different ways in the pressure-temperature-state diagram of biological sample to the desired Kryokonservéess fortune.
  • a first variant it is possible to first increase the pressure in the pressure vessel with the at least one pressure adjusting element and then lower the temperature in the pressure vessel with the cooling device.
  • the pressure increase and the temperature reduction are in each case according to predetermined, separate time functions.
  • the increase of the pressure and the lowering of the temperature can be adjusted so that the respective time functions overlap by the lowering of the temperature before reaching the final pressure or at conversely, the increase in pressure is started before the cryoconcentration temperature is reached.
  • the pressure vessel it is possible first to lower the temperature in the pressure vessel to the cryopreservation temperature and then to increase the pressure in the pressure vessel.
  • Which of the mentioned variants is chosen depends on the conditions of the specific cryopreservation task, in particular on the structure of the cryopreservation device and the composition of the biological sample.
  • the optimal variant can be selected empirically by tests in which the vitality rate of the biological sample for the different variants is tested under the specific conditions of use.
  • the pressure and temperature-time functions in particular with respect to the speed of the pressure increase and the temperature reduction and / or the shape of the function, such.
  • the pressure-adjusting element comprises an expansion region in the form of a protruding from the pressure vessel hollow pipe
  • the pressure-temperature setting is simplified.
  • the pressure can be increased in the pressure vessel by first immersing the at least one hollow conduit in the cooling bath of the cooling device. An expansion medium in the at least one hollow conduit expands, so that the pressure in the rest of the pressure vessel increases. Subsequently, the remaining pressure vessel is also immersed in the cooling bath of the cooling device so as to set the cryopreservation temperature for the biological sample in the interior of the pressure vessel.
  • the storage of the sample takes place in the pressure vessel.
  • the preservation medium contains at least one stabilizer substance which is suitable for stabilizing the glassy phase of the supercooled melt when the temperature of the biological sample is increased, preferably until it changes to the liquid state.
  • the stabilizer substance causes the glassy phase to be maintained at higher temperatures than would be the case without the stabilizer substance.
  • the glassy phase is maintained longer on thawing, and the formation of the crystalline phase is avoided.
  • the glass transition temperature of the preservation medium is increased by the stabilizer substance.
  • the stabilizer substance results in a reduced number of nucleation nuclei in the preservation medium, so that the nucleation probability is reduced and ice formation during thawing is minimized.
  • the biological sample e.g. B. a cell suspension
  • the at least one stabilizer substance is used, as it has been used only conditionally or not at all for conventional cryopreservation or according to the invention develops its effect at much lower concentrations and this is different than that of the known cryoprotectants.
  • the stabilizer substance preferably substances are selected which do not penetrate into the cells at atmospheric pressure and therefore normally find no use in the conventional cryopreservation of cells and tissues. The remarkable thing about the use of the stabilizer substance is that experiments ments of the inventors showed that with an addition of z. B.
  • the surprising effect of the stabilizer substance is that, for the first time during the thawing of the sample, it allows the return path via the combination of high pressure / rapid freezing and pressure-controlled heating with virtually unaffected vitality of the cells. It is thus the combination of at least one substance dissolved in the preservation medium which allows the return from the vitrified area by influencing the water structure and the presence of nucleation germs.
  • the stabilizer substance materially different, in ih ⁇ rer effect and / or with respect to the preferred concentration selected from the conventional cryoprotectants.
  • the stabilizer substance is by conventional
  • Cryoprotectants targeted increases the number of nucleation to promote the formation of the largest possible number of ice crystals during freezing. With the number of Eiskris ⁇ metals, however, also reduces the chance of sizes ⁇ growth, so be prevented by conventional cryoprotectants large crystals. For this purpose, a distribution and high mobility in the Kon ⁇ Servi mecanicsmedium is desired in conventional cryoprotectants to the cells.
  • the stabilizer substance is selected from at least ei ⁇ ner of the substance groups, the long-chain uncharged polymers having a molecular weight greater than 500 g / mol, in particular greater than 1000 g / mol, monosaccharides, di- and Oligosaccharides, polysaccharides, starch derivatives, such as. Starch hydrolysis products, sugar alcohols, water-soluble polymers, colloids (nanoparticle dispersions), in particular with silver, gold, diamond and / or nanotube particles, dendrimers, polycations, and polyanions.
  • the stabilizer substance is biocompatible so that the cells in the biological sample are not adversely affected by the stabilizer substance.
  • the concentration (% vol.%) Of the stabilizer substance preferably less than 30%, particularly preferably less than 20%, in particular less than 10%, such. B. less than 3% or less than 1%. A preferred minimum concentration is 0.1%.
  • the stabilizer substance in the preservation medium outside of the biological cells is arranged. The cells remain free of the stabilizer substance, which has advantages for the vitality after thawing the sample.
  • Another advantage of the stabilizer substance therein may be stand ⁇ that this under the action of elevated pressure and reduced temperature in the cryopreservation their properties, in particular structure and / or molecular weight changes.
  • molecules of the stabilizer substance can be broken down into fragments so that they can diffuse into the interior of the cells in order to achieve an additional cryoprotective effect there.
  • a method of heating a biological sample comprising biological cells and a preservative medium in a vitrified state disposed in a glassy phase in a pressure vessel wherein the temperature of the pressure vessel and the biological sample is increased; until the biological sample reaches a liquid state, and wherein the preservation medium contains the at least one stabilizer substance capable of stabilizing the glassy state upon elevation of the temperature of the biological sample, preferably until transition to the liquid state.
  • the pressure in the pressure vessel upon reaching the transition from the glassy state of the subcooled melt to the liquid state, the pressure in the pressure vessel is reduced. This minimizes damage to the biological sample after reaching the liquid state.
  • the pressure in the pressure vessel instantaneously, ie in particular stepped and with negligible delay, reduced.
  • the pressure reduction can be achieved by the pressure container released, z. B. is opened, so that a pressure equalization is achieved with an external atmospheric pressure.
  • a release of the pressure vessel is not mandatory. Rather, the pressure reduction may also be due to a contraction of the biological sample at the transition from the supercooled melt to the liquid
  • the volume of the sample may decrease according to the processes explained below with reference to FIGS. 1 to 4, so that the pressure in the pressure vessel drops.
  • the elevated pressure above the atmospheric pressure is at least 100 MPa, in particular at least 150 MPa and / or at most 300 MPa, in particular at most 250 MPa. These pressure ranges have proven to be particularly advantageous for a rapid transition from the glassy state to the liquid state and vice versa.
  • FIGS 1 to 4 phase diagrams with illustrations of different phases of water
  • FIG. 5 Embodiments of the invention
  • FIGS. 7 to 11 experimental results showing the
  • FIG. 12 Illustrate the effect of a cryoprotectant or stabilizer substance
  • FIGS. 13 to 19 show further embodiments of cryopreservation devices according to the invention and their use
  • FIGS. 20 to 28 show further embodiments of cryopreservation devices according to the invention, in which the pressure vessel has the shape of a flat cylinder;
  • Figure 29 is a schematic illustration of an optical unit in the container wall of a pressure vessel
  • FIG. 30 shows a further embodiment of the cryopreservation device according to the invention and its use
  • FIG. 31 to 35 show further embodiments of invention shown SSER Kryokonserv istsvortechniken, wherein the pressure container has the shape of a sphere or cylinder;
  • FIG. 36 shows a further embodiment of the cryopreservation device according to the invention;
  • FIGS. 37 to 39 show further embodiments of inventive cryopreservation devices in which a substrate is arranged in the interior of the pressure vessel;
  • FIGS. 40 and 41 show further embodiments of inventive cryopreservation devices with a segmentation of the pressure vessel interior
  • FIG. 42 shows a further embodiment of the cryopreservation device according to the invention and its use.
  • the invention will be described in the following first through a Erläute ⁇ tion of findings of the inventors, and then by specifying details of Kryokonserv istsvortechnisch and the process control. It is emphasized that the following theoretical considerations serve as an approach to explain the excellent vitality rates achieved with the cryopreservation of the present invention. However, the embodiment of the invention is not bound to the completeness and accuracy of the theoretical considerations. Theoretical considerations of the phase diagrams of aqueous Sys ⁇ tems and the effect of stabilizer substances
  • phase diagrams of the water are of limited use. Nevertheless, for illustrative purposes, the inventors' explanation is referred to phase diagrams of the water shown in FIGS. 1, 2 and 4.
  • FIG. 2 shows in expanded state diagrams of the water and its metastable states that there are possibilities for influencing ice formation.
  • the freezing point z. B. be lowered stable (colligative effects). That's the principle that organisms use in nature. They freeze so z. B. at -10 ° C or 20 ° C.
  • an aqueous solution can be supercooled. Ice melts with pure water and normal pressure at 0 ° C, but it does not freeze at this temperature.
  • LDL Low Density Liquid
  • HDL High Density Liquid
  • Vitrification requires a very high cooling rate (> 10 6 ° / s) in the case of the rapid fluctuation of the water molecules, but not the limited thermal conductivity of the water in the case of a cell (> 10 ⁇ ) more accessible (max. some 10 4o / s). with increasing size of the frozen objects of cooling rates distance ever more dramatic (many orders of magnitude) is so that a real Vitrifizie- tion (formation of a glassy phase without additives) previously not possible.
  • the freezing point due to the anomaly of the water in the LDL range, the freezing point, however, can also be lowered by increasing the pressure. This process is reversed precisely at the transition from LDL to HDL in a way, that wa et ⁇ 200 MPa form the preferred upper pressure limit, which is still effective for lowering the freezing point. Thereafter, the freezing point, as in any other liquid, normally increases again with increasing pressure.
  • FIG. 4 illustrates once again that in the LD range, during cooling and thawing, a respective critical region is formed but to reach this area or to seek full vitrification would have been the solution to the problem.
  • a biolo gical ⁇ sample in a known manner to prepare biological cell h ⁇ len and a preservation medium at room temperature and un ⁇ ter atmospheric pressure.
  • At least one stabilizer substance is preferably added to the preservation medium at a concentration of less than or equal to 5%, or this takes place during the cooling process or else only in the low-temperature state or before thawing. But it can also be provided higher concentrations.
  • Suitable groups of substances for the stabilizer substance particularly for use with the below-described exporting ⁇ approximately forms of Kryokonserv mecanicsvortechnisch and Verfa ren for cooling or for heating of biological samples, sin
  • FIGS. 5A to 5C show embodiments of the cryopreservation device 100 according to the invention which has a pressure vessel 10 and an adjusting device 20.
  • the pressure vessel 10 has a container wall 11 in the form of a tube (tube), the interior of which forms the interior 12 of the pressure vessel 10.
  • the adjusting device 20 comprises Druckeinstellelemente, which are each formed by pressure screws 21 at the axial ends of the pressure vessel 10.
  • a third pressure screw 21 may be radially projecting on the container wall 11 z. B. along the half axial length of the pressure vessel 10 may be provided ( Figure 5B).
  • the pressure vessel 10 preferably has an outer diameter that is less than or equal to 5 mm, more preferably less than or equal to 2 mm or 1 mm, z. B. is 0.5 mm.
  • the axial length of the pressure vessel 10 is z. B. in the range of 10 mm to 20 cm.
  • the thickness of the container wall 11 is z. B. 1/4 to 1/10 of the outer diameter of the pressure vessel.
  • the container wall 11 is z. B. made of stainless steel, aluminum, gold or silver. Alternatively, other metals or alloys may be used which have a high thermal conductivity speed for rapid cooling in the interior 12 and a pressure resistance for prints up to z. B. 200 MPa.
  • the pressure vessel made of a plastic or a composite material, for. As plastic-metal composite, be made.
  • the pressure vessel 10 For receiving the pressure screws 21, the pressure vessel 10 at its axial ends on internal thread.
  • the container wall 11 For receiving the radially projecting pressure screw 21 (FIG. 5B), the container wall 11 is provided with a threaded projection.
  • the pressure screws 21 can also be used as a bleed screw.
  • a single pressure screw 21 can be provided as the setting device (see, for example, FIG. 14A).
  • the interior 12 of the pressure vessel 10 can be subdivided into individual interior sections 15.
  • the segmentation with interior sections 15 has proven to be advantageous for the vitality rate of biological cells, which is maximum in the central interior sections 15.
  • the sample 1 in the interior 12 of the pressure vessel 10 is filled (see partially open view of the container wall 11 in Figure 5A).
  • the preservation medium contains one or more stabilizer substances, such as. B. Dextran at a concentration of 30% mixed with 10% ethylene glycol.
  • the pressure screws 21 are closed so that the inner space 12 is bubble-free.
  • the inside of the container wall 11 must be completely wetted by the biological sample 1.
  • the inside of Be ⁇ plierwand 11 may be coated hydrophilic. Furthermore, follows a vent on one of the pressure screws 21.
  • an elevated pressure in the Innraum 11 of the pressure vessel 10, z. B. in the range of 0.1 MPa to 300 MPa are set.
  • the amount of pressure can be determined by calibration ⁇ tests or by using a sensor device 16 (see below).
  • the segmentation in interior sections 15 can be provided by squeezing the container wall 11.
  • the filled cryopreservation device 100 is cooled in the cooling bath of a cooling device (not shown in FIG. 5, see, for example, FIG.
  • the pressure vessel is preferably immersed horizontally in the cooling bath, so that the cooling takes place substantially simultaneously along the entire axial length of the pressure vessel 10.
  • the cooling bath comprises z.
  • liquid propane liquid nitrogen or other liquefied gas.
  • cryopreservation temperature z. B. -197 ° C
  • the further cryopreservation in the cooling bath or in a storage container can take place, which by liquid nitrogen or by vapor of the liquid nitrogen to a temperature of, for. B. -140 ° C is cooled.
  • cryopreservation device 100 For vitality-preserving heating of the biological sample 1, the cryopreservation device 100 is placed in a heating bath
  • Liquid bath at a temperature above 0 ° C comprising, for. As water, alcohol or an oil immersed.
  • the immersion is also preferably carried out horizontally and at high speed, so that the increased pressure in the pressure vessel 10 is maintained until the crystalline ice formed melts. Subsequently, the pressure jump ⁇ decreases to z. B. 0.1 MPa.
  • FIG. 6A shows, for example, how the pressure is initially increased during freezing.
  • FIG. B the pressure screws 21 shown in FIG 5 used. Only after reaching the pressure of 200 MPa, the temperature is lowered by the immersion (Eintician) of Kryokonservierungsvortechnisch 100 in the cooling bath. When thawing a pressure relief, and then heating of the biological sample may be first reverse vorgese ⁇ hen to room temperature.
  • FIG. 6B shows the opposite variant, in which the temperature is first lowered during the cryopreservation and then the pressure is built up.
  • the pressure screws 21 are only after reaching the Kryokonserv iststemperatur of z. B. - 200 ° C actuated.
  • FIG. 6C shows a more complicated temperature-time function, which depends on the concrete preservation conditions can be selected.
  • FIG. 7 shows a sequence of microscope images of a section of the sample 1 with cells 2 at room temperature, after the preservation medium 3 has been added a cryoprotectant.
  • the time in seconds, s shows the time dependence after addition of the stabilizer substance to the sample 1. It is clear that a considerable shrinkage process takes place in a short time.
  • Figures 8 and 9 illustrate the dramatic shrinkage of the cells (here HeLa cells) to almost the residual osmotic volume which is beneficial for high vitality rates.
  • the round shape of the cells ( Figures 9A to 9C, top left) is completely lost ( Figures 9A to 9C, right and bottom).
  • the decrease in the diameter of the cells was measured with a measuring system determines Invitrogen (diagram in Figure 8), but not Reflectors ⁇ has full osmotic shrinking, since the proportion of the deviation from the spherical shape not into account is taken. Consequently, the cells shrink more than can be seen from the graph number value.
  • FIG. 10 shows the shrunken cells in the electron microscopic section. It can be seen the extremely strong shrinkage, which is achieved in the cryogenic medium with one of the above compositions, so that the cell membrane system is strongly folded.
  • FIG. 11 shows the structural changes of adherent cells (HeLa). Again, the osmotic shrinkages occur very quickly (after seconds).
  • FIG. 12 shows variants of arming and / or cooling elements provided according to the invention.
  • FIG. 12A initially shows the circular cross-section of the tubular pressure vessel 10 (see FIG. 5).
  • FIGS. 12B to 121 show embodiments of the cryopreservation device according to the invention in a schematic sectional view of the pressure vessel 10, in which the adjusting device is set up for setting the temperature using at least one heat-conducting element or at least one cooling element.
  • heat-conducting elements comprise outer profiles 35, which are arranged so as to project radially on an outer side of the container wall 11.
  • the outer profiles 35 accelerate the cooling or heating of the pressure vessel 10 when immersed in the cooling bath or the warm liquid keitsbad.
  • inner profiles 36 are arranged on an inner side of the container wall 11.
  • the inner profiles 36 also support the heat transfer from or to the biological sample in the pressure vessel 10.
  • FIGS. 12D to 12G illustrate a pressure vessel 10 having a hexagonal, hexagonal cross-section.
  • the outside of the container wall 11 forms the outer profile 35, which offers a large surface for wetting with a coolant or a thawing agent and thus is suitable for influencing the temperature-time function during cooling or thawing.
  • heat conducting bodies 37 in the form of partitions (FIG. 12E), inserted filaments or spheres (FIG. 12F) or colloidal particles (FIG. 12F) are additionally provided in the interior of the pressure vessel 10
  • FIG. 12G shows a variant of the invention in which a cooling line 34 runs in the interior 12 of the pressure vessel 10 as a cooling element.
  • the cooling line 34 is connected to ademe ⁇ dium reservoir and arranged by a cooling medium, such. As liquid nitrogen or a cooling gas, to be flown through. Alternatively, a cooling line 34 may extend adjacent to the interior 12, as shown schematically in FIG. 121.
  • FIG. 13 shows a further embodiment of the cryopreservation device 100 according to the invention (FIG. 13A) and its use during cooling (FIG. 13B) and thawing (FIG. 13C) of the biological sample with cells 2 in the preservation medium 3.
  • FIG Adjustment device for time and / or location-dependent adjustment of the temperature and the pressure in the pressure vessel 10 three Druckeinstellelemente comprising pressure screws 21 and an expansion region 22.
  • the pressure screws 21 are provided for generating the pressure and / or for venting the inner space 12 of the pressure vessel 10 (see Figure 5).
  • the expansion region 22 comprises a radially projecting from the pressure vessel 10 hollow conduit which communicates at one end via an opening in the container wall 12 with the interior 12 of the pressure vessel 10 in connection and the opposite, free end is closed. Between the inner space 12 and the expansion area 22, a filter 29 may be provided to prevent the ingress of biological cells into the expansion area 22.
  • the expansion area 22 is z. B. made of the same material as the container wall 12 of the pressure vessel 10.
  • the expansion region 22 is adapted to receive a liquid Ex ⁇ pansionsmedium that expands upon cooling.
  • the expansion medium includes z.
  • the aqueous preservative medium of the biological sample or, alternatively, another aqueous liquid suitable for forming the crystalline phase of water.
  • the dimensions (length, inner diameter, outer diameter) of the expansion area 22 can be selected by the user depending on the concrete preservation conditions.
  • the expansion region 22 allows rapid formation of the crystalline phase when the temperature of the expansion region 22 is lowered below the freezing point of water.
  • the cooling of the expansion region 22 can be decoupled in time from the cooling of the remaining pressure vessel 10, as illustrated in FIG. 13B.
  • a schematically shown cooling device 200 with a cooling bath 210 is provided.
  • the cooling device 200 includes, for example, a vessel into which the cooling bath 210, e.g. B. from liquid nitrogen, filled and which is connected to a cooling medium reservoir.
  • the cryopreservation device 100 For cryopreservation of the biological sample 1, the cryopreservation device 100 is first immersed in the cooling bath 210 exclusively with the expansion region 22 (immersion depth D1), while the remaining pressure vessel is still outside the cooling bath. In this phase, crystalline ice is formed in the expansion region 22, which expands, so that in the interior 12 of the pressure vessel 10, the pressure increases.
  • the duration of the pressure generation with the expansion area 22 is z. In the range of milliseconds, seconds or minutes.
  • the cryoconservation device 100 is completely immersed in the cooling bath 210, so that the desired cryopreservation temperature of z. B. - 195.7 ° C is reached. For this purpose, the cryopreservation device 100 is lowered to a second immersion depth D2.
  • the heating for recovery of the biological sample is carried out in the reverse manner according to FIG. 13C.
  • immersion depth Dl a heating bath 310 of a thawing device 300
  • the reduction takes place up to the immersion depth D2, so that the pressure in the pressure vessel 10 is reduced.
  • FIG. 14A illustrates an embodiment of the cryopreservation device 100 according to the invention, in which an inner container 13 is arranged in the interior 12 of the pressure container 10.
  • the inner container 13 is provided for receiving the biological sample 1 and comprises a bubble-free filled tube of a flexible material.
  • the inner container 13 is z. B.
  • the provision of the inner container 13 has the advantage that the formation of the crystalline phase on the inside of the container wall 12 is separated from the biological sample 1.
  • different liquids may be provided in the interior 12 outside the inner container 13 on the one hand and in the inner container 13 on the other hand.
  • pure water or an aqueous composition of water with a salt, glycerin and / or an alcohol may be provided outside the inner container 13.
  • the aqueous composition has the advantage of lowering the freezing point, so that it is possible to set at which temperature below the freezing point of pure water the pressure in the pressure vessel 10 is to be generated.
  • the inner container 13 does not extend over the entire length of the interior 12.
  • the pressure vessel 10 will be a relatively large space maraf ⁇ fen in which no biological sample 1 is located, and preferably generates the crystalline phase of water in the closed end 12.1 can.
  • an expansion within the pressure vessel 10 Ons Scheme created as part of the control device used in the invention which may have an advantageous effect on the cooling and heating of the Kryokonserv istsvortechnisch 100 (see in particular Figure 14C).
  • the outer shape of the inner container 13 may be the same as the inner shape of the pressure container 10.
  • other cross sections of the outer and / or inner molds may be provided, such. Square, hexagonal, octagonal or all combinations thereof.
  • different cross-sectional shapes of the outer and inner molds can be provided.
  • FIG. 14B schematically illustrates the cooling of the cryopreservation device 100 in a cooling device 200, which in this case contains two superimposed cooling baths 210 with liquid nitrogen and 220 with liquid propane.
  • the use of liquid propane has the advantage that it more easily wets the outside of the pressure vessel 10 and thus accelerates the cooling.
  • the pressure vessel 10 may be oriented such that the entire length of the pressure vessel 10 simultaneously dips into the heating bath 310 (horizontal orientation). In this case, an increase in the temperature of the biological sample 1 and, as soon as the crystalline ice has thawed, also the reduction of the pressure in the pressure vessel 10. Alternatively, first the closed end 12.1 with the expansion region immersed in the water bath 310, so that first the crystalline phase is melted and the pressure in the pressure vessel 10 is reduced and then the remaining biological sample 1 is heated (vertical orientation of the pressure vessel 10).
  • the use of the cryopreservation device 100 according to the invention is not limited to the preservation of cell suspensions. Rather, the biological sample 1 cell groups, cell aggregates, organs of 4 biological organisms or complete biological organisms 5, such as. As nematodes, worms or arthropods included.
  • the interior 12 of the pressure vessel 10 has an inner diameter in the range of at least 5 mm, preferably at least 10 mm.
  • the inner diameter of the inner space 11 is less than 5 cm, more preferably less than 3 cm.
  • an inner container 13 is provided for receiving the biological sample 1, which may optionally be divided into individual chambers.
  • the cryopreservation of the biological sample 1 also takes place in the embodiment according to FIG. 15, in that the pressure vessel 10 is immersed in at least one liquid bath of the cooling device 200.
  • immersion of the pressure vessel 10 with horizontal alignment first takes place first into the liquid bath 220 of liquid propane and then into the liquid bath 210 with liquid nitrogen.
  • the time function of the pressure generation relative to the time function of the cooling can be adjusted.
  • the heating takes place in the reverse order, by first submerging the pressure vessel 10 in a heating bath 310 until the biological sample 1 has thawed. Subsequently, the complete lowering of the cryopreservation device 100 into the heating bath 310 takes place.
  • FIGS. 16 and 17 show further embodiments of the cryopreservation device 100 which are equipped with an expansion area 22 is equipped.
  • the expansion area 22 comprises a hollow conduit which has branches in the illustrated variants.
  • the expansion portion 22 has a T-shape with side arms.
  • the expansion area 22 may first be immersed in the cooling bath 210 (immersion depth D1) so that the liquid inside it freezes, forms hexagonal ice, and increases the pressure. Only then is the system fully submerged (immersion depth D2) and completely frozen (Figure 16B).
  • Immersion depth D2 When heating is reversed, or you have the opportunity in two layers (boom first in the warm phase or as shown here last) into the heating bath 310 to dive (Figure 16C). According to the latter principle, the pressure is maintained by the existing ice until thawing at values of about 200 MPa.
  • Figure 17 shows another embodiment of the expansion area 22 with branches forming a fan-out jib system.
  • a larger internal volume and a larger surface area are provided than, for example, in FIG. 16, so that the pressure can be increased faster.
  • FIG. 18 shows embodiments of the cryopreservation device 100 with a spherical pressure vessel 10 and a plurality of expansion areas 22, which extend into different spatial axes (spatial directions).
  • the pressure vessel 10 comprises a hollow sphere for receiving the biological sample.
  • the hollow sphere is z.
  • B. stainless steel Herge ⁇ provides and has an inner diameter of 10 mm and an outer diameter of 12 mm.
  • the hollow conduits form stub lines projecting from the hollow sphere.
  • the number, geometric ⁇ specific dimensioning and orientation of the hollow tubes can be ge ⁇ selected depending on the actual use conditions (see examples in Figs 18A to 18C).
  • the filling of the hollow ball is effected by a closable opening (not shown) in the container wall or by one of the hollow conduits, which is equipped in this case with a closure element.
  • a closable opening not shown
  • the geometric orientation of the Druckbe ⁇ container 10 when immersed up to the immersion depths Dl and D2 in a cooling bath 210 ( Figure 18D) or in a heating 310 ( Figure 18E) allows a setting when the pressure in the pressure vessel 10th should rise and fall.
  • FIGS. 19A and 19B show embodiments of the cryopreservation device 100 in which the container wall 11 of the pressure vessel 10 has the shape of a curved tube with a single curvature (FIG. 19A) or a multiple curvature (FIG. 19B).
  • the pressure vessel 10 is curved in a plane of curvature, so that the local temperature distribution when immersed in a cooling bath depending on the orientation of the pressure vessel 10 can be adjusted relative to the cooling bath (see Figure 19C, 19D).
  • FIG. 19A shows by way of example variants of pressure setting elements comprising pressure screws 21 and an expansion region 22, which may be provided individually or as shown in combination.
  • the pressure screws 21 are formed as described above with reference to FIG.
  • the expansion all rich 22 includes a plurality of hollow conduits in the plane of curvature of the pressure vessel 10 and respectively to the In ⁇ are disposed communicatively nenraum of the pressure vessel 10 degrees.
  • the pressure adjustment elements can also be provided in the variant according to FIG. 19B.
  • the multiple curvature of FIG. 19B may be a waveform having more than the three extremes shown.
  • the local distributions and time functions of pressure generation and temperature reduction in the cryopreservation Device 100 depends on the orientation of the pressure vessel 10 when immersed in the cooling bath 210.
  • FIG. 19C shows, by way of example, plunging with the plane of curvature perpendicular or parallel to the surface of the cooling bath 210. With the vertical orientation, the pressure generation and the temperature reduction first take place in the extremes of the multiple curvature which protrude into the cooling bath. With the parallel orientation, however, the pressure generation and the temperature reduction in the entire pressure vessel 10 are carried out simultaneously. Deviating from the illustration, immersion with other orientations into the fluids may be provided, resulting in an extended variability in the setting of the pressure and temperature-time functions.
  • the local distributions and time functions of pressure reduction and temperature increase in the cryopreservation device 100 also depend on the orientation of the pressure vessel 10 upon immersion in a heating bath 310 ( Figure 19D).
  • Figure 20 shows an embodiment of the cryopreservation apparatus 100, wherein the container wall 11 of the pressure vessels ⁇ ters 10 has the shape of a flat or disk-shaped Zy ⁇ Linders.
  • This embodiment of the invention has the advantage that when immersed in a cooling bath, a relatively large area is cooled. Therefore, a thin layer of crystalline phase is ge ⁇ forms on the inside of the container wall 11 which is sufficient to produce the desired pressure in the Druckbe ⁇ container 10, while allowing a relatively large space for the glassy phase.
  • the pressure vessel 10 according to Figure 20A has a diameter of z. B. 1 cm to 10 cm and thickness of z. B. 1 mm to 1 cm. He is z. B. made of stainless steel, aluminum, gold or silver.
  • the adjusting device for time- and / or location-dependent adjustment of the temperature and the pressure in the pressure vessel 10 comprises a pressure clamp 23.
  • the pressure clamp 23 comprises two clamp plates 24, which via a
  • Hinge 25 (axle hinge) are pivotable. With a clamp screw 26 (set screw), the distance between the clamp plates 24 can be adjusted.
  • the pressure clamp 23 is adapted to pressurize the pressure vessel 10 with respect to the atmospheric pressure, before the cryopreservation device 100 by a dip in a
  • FIGS. 20C-20D show variants of the cylindrical pressure vessel 10 which with a reinforced peripheral region (sectional perspective view in Figure 20C) and / or a both-side (sectional view in FIG 20D) or one-sided
  • FIG. 20E (Sectional view in FIG. 20E) can be equipped with an elastically deformable container wall 11.
  • a stable bottom wall 11.3 is a side ⁇ provided.
  • Figures 21 to 24 show further variants of the pressing bracket 23, in which the clamping plates 24 are provided on their side facing the pressure vessel 10 inner sides with holes 27 and with profiles 28, in the open state and in the ge ⁇ closed state (assembled state) of the Druckklam ⁇
  • Figure 23 shows egg ⁇ ne plan view of the pressing bracket 23 with one of the clamp ⁇ plates 24, the hinge 25, the clamp screw 26 and the holes 27th
  • the holes 27 allow direct contact of a cooling fluid, for. B. of liquid nitrogen or propanol, or of a heating fluid, for. B. of water, with the pressure vessel 10 and thus an acceleration of the cooling or heating of the pressure vessel 10.
  • the profiles 28 are provided to produce locally different pressures on the pressure vessel 10.
  • the cylindrical pressure vessel 10 can be equipped with a vent pipe 30.
  • FIG. 25 shows a variant of the invention in which the cryopreservation device 100 is immersed only on one side in a liquid (cooling bath 210 or heating bath).
  • the pressure clamp 23 has holes 27 only on the lower clamp plate 24 facing the liquid. This is be ⁇ Sonder advantageous. when adherent cells grow on the lower side of the pressure vessel 10 or the cells sediment there.
  • Figure 26 schematically illustrates a variant of the invention in which the venting of the pressure vessel 10 and the mechanical ⁇ specific pressure generating chamber with the plates 24 with electric drive elements 32 are controlled 33rd
  • This embodiment of the invention is particularly advantageous for automation of cryopreservation.
  • a sensor device comprising a pressure sensor 16. 1, is arranged in the interior 12 of the pressure vessel 10.
  • the pressure sensor 16.1 supplies a sensor signal which can be used to control the pressure using the pressure screw 21, possibly with an electrical control element (eg piezo element, not shown). It can be generated a predetermined external pressure, which acts in the interior 12 on the inner container 13 during freezing and thawing.
  • the inner container 13 is formed by a flexible bag containing the biological sample, for. B. a cell suspension or a
  • the inner container 13 includes z. B. a blood bag, as it is used for blood donation purposes.
  • FIG. 29 schematically illustrates an enlarged detail of the container wall 11 of a pressure vessel 10.
  • the vessel wall 11 contains an optical unit 60, which is set up for an optical, in particular microscopic, observation of the interior 12 of the pressure vessel 10. It is Z.
  • the optical lens 61 may, for. B. be configured for a mikrosko ⁇ pische mapping of the cells 2.
  • FIG. 30 shows a further embodiment of the invention, in which the cryopreservation device 100 has a tube arrangement with external pressure generation (hydrostatically, see arrow) via a T-element comprises.
  • the tube arrangement is equipped with a pressure sensor 16.1 and a temperature sensor 16.2, with the sensor signals of which both the pressure and the temperature-time functions can be regulated.
  • Figures 31 and 32 show embodiments of the Kryokon- serv istsvoriques 100, in which the container wall 11 of the pressure vessel 10 has the shape of a ball.
  • Pressure vessel 10 is composed of two hemispheres 11.2, which are bolted together in the middle of the pressure vessel 10.
  • the ball has a diameter in the range of z. B. 5 mm to 10 cm.
  • Figure 31A is the
  • FIG. 31B additionally illustrates optionally provided parts, such as a sensor device 16 and a filling line 11.1 which can be decoupled from the pressure vessel 10.
  • FIGS. 31C and 31D illustrate the cooling and heating of the cryopreservation device 100 analogously to the methods described above.
  • the spherical pressure vessel 10 may be alternatively or additionally provided with a pressure adjustment in the shape of a ⁇ pansions Kunststoffs Ex 22 (Figure 32).
  • the expansion section 22 comprises a cylinder piece that is configured as described above for receiving an expansion medium and Dru ⁇ cker generation when cooled.
  • Figures 32C and 32D illustrate analogous to those described above procedural ⁇ ren cooling and heating of the Kryokonserv istsvor- direction 100th
  • the cryopreservation according to the invention of biological samples comprising organs 4 or whole organisms 5 is illustrated schematically in FIGS. 33 to 35.
  • the biological sample is preferably added to the stabilizer substance.
  • Fi gur ⁇ 33A is provided as the pressure vessel 10 is a cylindrical vessel, which is dimensioned in the illustrated example for receiving a fish embryo.
  • FIGS. 33C and 33D two immersion variants for pressure-temperature control during freezing of the cryopreservation device 100 are illustrated.
  • Figures 34A and 34B is shown as a pressure vessel 10, a spherical vessel which is suitable for receiving an organ 4, with an inner diameter of the
  • the organ 4 is arranged in an inner container 13.
  • Figure 35 shows a pressure vessel 10, a spherical vessel in which tissue, organisms 5 or organs in an inner container 13, z. B. a bag or a thin-walled vessel, so that the outer solution to the bag inner medium can be chosen differently (eg, outside oil, inside nutrient solution with the stabilizer substance).
  • FIG. 36 shows an embodiment of the cryopreservation device 100, in which pressure is not caused by the expansion of a freezing expansion medium but by a vaporous expansion medium, e.g. B. evaporating liquid nitrogen is formed.
  • the expansion region 22, which contains the liquid nitrogen, is connected to the pressure vessel 10 via a pressure line 39.
  • the vaporizing liquid nitrogen is injected continuously or in portions from the expansion region 22 into the pressure vessel 10.
  • FIGS. 37 to 39 show embodiments of the cryoconservation device 100 which are configured by the provision of at least one substrate 14 in the interior 12 of the pressure container 10 for the cryoconservation of adherent cells 2. According to the variants shown in FIGS.
  • the substrate 14 is in the form of an elongate strip (tongue) in a tubular pressure vessel 10, which is closed on one or both sides with a pressure screw 21 and / or with a radially protruding pressure screw 21 is.
  • the cells 2 are in the adherent state on one or both sides of the substrate 14, which may be suitably functionalized (eg by coating with fibronectin, polylysine and / or growth factors).
  • the interior 12 of the pressure vessel 10 is filled with the preservation medium, optionally with the stabilizer substance.
  • FIG. 37C additionally shows a substance reservoir 17, which is arranged in the interior 12 of the pressure vessel 10.
  • the sub-punching reservoir 17 is set up for introducing at least one additional substance into the interior space 12.
  • substances may diffuse into the interior space 12 from the substance reservoir 17 during the freezing or thawing process.
  • the substance reservoir 17 may be a destructible under the action of the pressure in the interior 12 reservoir wall, z. B. from a plastic.
  • this makes it possible for the additional substance to be released only when a certain pressure is reached in the interior space 12.
  • FIG. 38A a substrate 14 having a cross-shaped cross-section is illustrated, wherein provided For example, cells 2 may be disposed on all or only a few surfaces of the substrate 14.
  • FIG 38B a sub ⁇ strat is shown in the form of a hollow cylinder 14, the cells are in the interior of the second
  • the hollow cylinder can be made of z.
  • this allows as the use of the inner container described above is that the cells 2 are exposed inside the other boundary conditions and solutions to be outside of the substrate 14.
  • the substrate 14 is a body with a nano- or micro-structured surface to ⁇ which are optionally equipped with growth or differentiation factors in gradients.
  • Figures 39A to 39E show an example that the sub ⁇ strat 14 as a separate component (shuttle) may be configured to be inserted into the pressure vessel.
  • the boats can be formed in particular with a closed or an open mold.
  • FIGS. 39A and 40 further illustrate a variant of an adjusting device according to the invention for controlling the pressure in the pressure vessel 10.
  • a winding section 31 is provided at at least one end of the tubular pressure vessel 10 in this variant. By screwing the winding section 31 on the gas-free filled with the biological sample pressure vessel 10 can be increased in this before the temperature drop, the pressure.
  • FIG. 40A shows a tubular pressure vessel 10 with winding sections 31.
  • the preservation medium 3 in which Cells 2 may contain the stabilizer substance in the form of a gradient (eg Ficoll or Percoll of different concentration and / or molecular weight).
  • Fi gur ⁇ 40B may in the inner space 12 in addition partitions 18 be seen upstream, the rapid mixing of the biological sample 1 and z. B. prevent degradation of said gradient and allow a separation of the cells in compartments.
  • substance reservoirs in the form of hollow spheres 19, which are suspended in the preservation medium 3 and are set up to be destroyed at a predetermined pressure and release their contents may additionally be provided.
  • further antifreeze and vitrification substances or media that assist the cells in thawing can be released.
  • Figure 40D illustrates that in the pressure container ⁇ two immiscible solutions may be superposed marich ⁇ tet. In the first solution, the cells are 2. The freezing behavior of the solutions allows the pressure conditions to be set in the event of a temperature change.
  • FIG. 41 illustrates a tubular pressure vessel 10, which is closed on one side with a pressure screw 21 and on one side with a winding section 31.
  • the preservation medium in the form of built-up solutions z. B. Ficoll gradient or as overlays ver ⁇ VARIOUS molecular weights, that is, solutions with different ⁇ Licher density
  • the cells 2 are added to the gradient on one side (FIG. 41A).
  • the pressure vessel 10 is centrifuged in a vertical manner with the cells 2, so that different cell types collect at the sealing boundary surfaces (FIG. 41B). In this arrangement, the cryopreservation then takes place.
  • the cryopreservation device 100 comprises a pressure vessel 10, which is closed on one side with a pressure screw 21 and in the interior 12 of which the substrate 14 for the adherence of biological cells 2 is arranged.
  • the pressure screw 21 is further equipped with a heat-conducting element in the form of a cooling wire 38 which is pressure-tightly integrated into the pressure screw 21 and extends from the inner space 12 into the surroundings of the pressure vessel 10.
  • the cooling wire 38 is a Me ⁇ talldraht, z. B. of silver. Outside the pressure vessel 10, the cooling wire 38 is a compact bundle, z.
  • the cooling wire 38 may first enter the cooling bath 210, e.g. B. are dipped from liquid nitrogen, whereby ice forms not in the interior of the tube on the container wall 11, but the cooling wire 38 and leads to pressure increase. This is followed by the complete immersion of the system in the cooling bath 210.

Abstract

A cryopreservation device (100) which is arranged for cryopreservation of a biological sample (1) comprises a pressure vessel (10) with a vessel wall (11) and an internal space (12) which is arranged to receive the biological sample (1), wherein the pressure vessel (10) is equipped with an actuating device (20) for cooling by lowering the temperature and raising the pressure in the pressure vessel (10) and configured for the cryopreservation of the biological sample (1). Said actuating device (20) is connected to the vessel wall (11) and comprises at least one pressure setting element (21 - 23, 31) and at least one of at least one cooling element (34) and at least one heat conducting element (35 - 38), wherein the actuating device (20) is configured for a time-dependent and/or location-dependent setting of the temperature and of the pressure in the pressure vessel (10). Methods are also described for cryopreservation of a biological sample (1), comprising biological cells (2) and a preservation medium (3), and methods for heating the biological sample (1) to maintain vitality.

Description

Vorrichtung und Verfahren zur Druck-Kryokonservierung  Apparatus and method for pressure cryopreservation
einer biologischen Probe  a biological sample
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Kryokonservierung einer biologischen Probe, umfassend biologische Zellen und ein wässriges Konservierungsmedium, mit einem Druckbehälter. Des Weiteren betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Kryokonservierung der biologischen Probe und die Verwendung einer Stabilisatorsubstanz, mit der eine glasartige Phase von Wasser stabilisierbar ist, bei der Kryokonservierung der biologischen Proben. Des Weiteren betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Erwärmung der kryokonservierten biologischen Probe . The invention relates to a device for the cryopreservation of a biological sample, comprising biological cells and an aqueous preservation medium, with a pressure vessel. Furthermore, the invention relates to a method for cryopreserving the biological sample and the use of a stabilizer substance, with which a glassy phase of water is stabilized, in the cryopreservation of biological samples. Furthermore, the invention relates to a method for heating the cryopreserved biological sample.
Die Tieftemperaturkonservierung (Kryokonservierung) von Zellen ist bisher die einzige Möglichkeit, Lebensprozesse auf zellulärer Ebene reversibel (vitalitätserhaltend) so anzuhalten, dass sie nach einer Erwärmung auf physiologische Temperaturen wieder anlaufen können. Die Kryokonservierung findet keine Entsprechung in der Natur. Es werden zwar Organismen, wie z. B. Fische, in polaren Regionen im Eis eingebettet gefunden, die ihre Vitalität für eine begrenzte Dauer erhalten. Diese Organismen sind jedoch nicht vollständig durchgefroren, sondern enthalten in ihren Zellen Glycerin und andere gefrierpunktserniedrigende Stoffe, oder sie exprimieren Proteine (sog. Gefrierschutzproteine), welche die Eisstruktur be¬ einflussen. Eine dauerhafte Konservierung ist in diesem Zu¬ stand nicht möglich, da auch noch bei Temperaturen unter 0°C Diffusionsprozesse über Wochen und Monate zum Zerfall des biologischen Systems führen. Die dauerhafte Konservierung würde vielmehr eine Abkühlung z. B. auf eine Temperatur von flüssi¬ gem Stickstoff erfordern, bei der auch die Flüssigkeit in den Zellen gefrieren würde. Dann aber können die Organismen nicht mehr reanimiert werden. Cryopreservation of cells has so far been the only way to reversibly halt vital processes at the cellular level in such a way that they can restart after being heated to physiological temperatures. The cryopreservation finds no equivalent in nature. Although organisms, such. As fish, found in polar regions embedded in ice, which maintain their vitality for a limited duration. However, these organisms are not completely frozen through, but contain in their cells glycerol and other freezing point-lowering substances, or they express proteins (so-called anti-freeze proteins), which influence the ice structure ¬ . A permanent preservation is not possible in this was to ¬ because even lead diffusion processes over weeks and months to the disintegration of the biological system at temperatures below 0 ° C. The permanent preservation would rather a cooling z. B. require to a temperature of flüssi ¬ gem nitrogen, in which the liquid in the Cells would freeze. But then the organisms can not be reanimated.
Ein besonderes Problem der Kryokonservierung ist die Kris- talleisbildung (kristalline Phase des Wassers) in und außerhalb der Zellen, die unmittelbar oder mittelbar zu irreversiblen Schädigungen führen. Da die Eisbildung einen der primären Gründe für die Zellschädigung darstellt, werden seit Jahrzehnten so genannte Kryoprotektiva (Gefrierschutzzusätze, Kryoadditiva) gesucht und den obligaten physiologischen Medien beigemengt. Kryoprotektiva umfassen typischerweise klei¬ ne Moleküle, wie z. B. Dimethylsulfoxid (DMSO) , die in die Zellen eindringen, oder höhermolekulare Substanzen, wie z. B. Zucker, die im Medium außerhalb der Zellen oder an deren Oberfläche verbleiben. Kryoprotektiva sind häufig erst in ho¬ hen, zum großen Teil unphysiologischen Konzentrationen (10% bis 50%) wirksam. Sie können daher nur bei niedrigeren als physiologischen Temperaturen (um 4°C) zugesetzt werden, müs¬ sen schnell in die Zellen eindringen und nach dem Auftauen sofort ausgewaschen werden. A particular problem of cryopreservation is the formation of crystals (crystalline phase of the water) inside and outside the cells, which directly or indirectly lead to irreversible damage. Since ice formation is one of the primary causes of cell damage, so-called cryoprotectants (antifreeze additives, cryoadditiva) have been sought for decades and added to the obligate physiological media. Cryoprotectants typically comprise klei ¬ ne molecules, such. As dimethyl sulfoxide (DMSO), which penetrate into the cells, or higher molecular weight substances, such as. As sugar, which remain in the medium outside the cells or at the surface. Cryoprotectants are frequently only in ho ¬ hen, for the most part non-physiological concentrations (10% to 50%) is effective. They may be added (4 ° C), therefore, only at lower than physiological temperatures, Müs ¬ sen quickly penetrate into the cells and are washed out after thawing once.
Bisherige Entwicklungen in der Kryokonservierung biologischer Proben sind darauf gerichtet, Kryoprotektiva durch physiolo¬ gisch und osmotisch weniger problematische Substanzen zu er- setzen, ihre Konzentration zu verringern oder ganz ohne sie auszukommen. Im Ergebnis wurden, abgesehen von den Gefrier- schut zproteinen der Organismen selbst, seit der Entdeckung der Gefrierschutzeigenschaften des DMSO und Glycerins sowie einiger Zucker durch Polge und Lovelock nur wenige Stoffgrup- pen gefunden [1,2,3]. Bisher geht man davon aus, dass keine Kryokonservierung von Zellen ohne Zellstress und Zellrepara¬ turprozesse mit Genexpressionen etc. nach dem Auftauen mög¬ lich ist, da die Bildung der kristallinen Phase unter physiologischen Bedingungen nicht ganz vermieden werden kann. [1] Polge C, Smith AU, Parkes AS (1949), Nature 164: 666 Previous developments in the cryopreservation of biological samples aimed must be replaced with Physiologist ¬ cally and osmotically less problematic substances cryoprotectants to reduce their concentration or to get along without them. As a result, apart from the antifreeze proteins of the organisms themselves, only a few groups of substances have been found since the discovery of the antifreeze properties of DMSO and glycerol and some sugars by Polge and Lovelock [1,2,3]. So far, it is believed that no cryopreservation of cells without cell stress and Zellrepara ¬ turprozesse with gene expression is mög ¬ Lich etc. after thawing since the formation of the crystalline phase can not be completely avoided under physiological conditions. [1] Polge C, Smith AU, Parkes AS (1949), Nature 164: 666
[2] Lovelock JE (1954), Biochemical Journal 56 (2): 265-270 [3] Lovelock JE, Bishop MWH, 1959, Nature 183: 1394-1395  [2] Lovelock JE (1954), Biochemical Journal 56 (2): 265-270 [3] Lovelock JE, Bishop MWH, 1959, Nature 183: 1394-1395
Der Erfolg der Kryokonservierung kann durch eine Vitalitätsrate (Überlebensrate), z. B. durch den Quotienten der Anzahl lebender Zellen nach und vor der Kryokonservierung, charakterisiert werden. Es ist bekannt, dass die Vitalitätsrate von der Zellart, dem Volumen und verschiedenen anderen, in derThe success of cryopreservation may be due to a vitality rate (survival rate), e.g. B. by the quotient of the number of living cells after and before the cryopreservation, characterized. It is known that the vitality rate depends on the type of cell, the volume and various others in the
Regel bereits empirisch optimierten Randbedingungen, abhängt. Aufgrund der Notwendigkeit einer schnellen Diffusion der Kry- oprotektiva in die Zellen und der geordneten Wärmeableitung nach außen, versagen die herkömmlichen Kryokonservierungsver- fahren bei makroskopischen Objekten, wie Geweben, Organen und ganzen Organismen bisher ohne Ausnahme. Vielmehr führt die herkömmliche Kryokonservierung unter Zusatz von Kryoprotek- tiva nur bei suspendierten Zellen und kleinsten Gewebestücken (< 0,5 mm3) zu praktikablen Vitalitätsraten. Stark wasserhal- tige Pflanzenzellen, sowie ein Vielzahl großer tierischerRule already empirically optimized boundary conditions, depends. Due to the need for rapid diffusion of the cryoprotectants into the cells and the orderly dissipation of heat to the outside, conventional cryopreservation methods have so far failed without exception for macroscopic objects such as tissues, organs and whole organisms. Rather, conventional cryopreservation with the addition of cryoprotectants only leads to practicable vitality rates for suspended cells and the smallest pieces of tissue (<0.5 mm 3 ). Highly watery plant cells, as well as a variety of large animal
Zellen, wie z. B. die Oozyten der Katzen und anderer Spezies, entziehen sich bisher einer Kryokonservierung vollständig. Andererseits werden mit kryokonservierten Krebszellen Vitalitätsraten von mehr als 90% erreicht. Cells, such. As the oocytes of cats and other species, so far elude cryopreservation completely. On the other hand, vitality rates of more than 90% are achieved with cryopreserved cancer cells.
Der Erfolg der Kryokonservierung hängt insbesondere von den physikalisch-biologischen Randbedingungen, z. B. den Eigenschaften des Wassers und denen der Kryoprotektiva, ab. Bisher wird angenommen, dass Kryoprotektiva durch Diffusion in alle Zellen gelangen müssen und die Wärme in kurzer Zeit (ms bis min) nach außen abgeführt werden muss, da nur von dort ge¬ kühlt werden kann. Es wird ferner angenommen, dass diese Bedingungen aufgrund der Wärmeleitfähigkeit des auch in den Zellen dominierenden Wassers und der geringen Diffus- ionsgeschwindigkeit von Kryoprotektiva durch die Zellmembra¬ nen nur bei sehr kleinen Objekten (Zellen suspendiert in einer Nährlösung und unter Zusatz von Gefrierschutzmitteln) erfüllt sind. The success of the cryopreservation depends in particular on the physical-biological boundary conditions, eg. As the properties of the water and those of the cryoprotectants from. So far, it is assumed that cryoprotectants must pass through diffusion in all cells and the heat in a short time (ms to min) must be dissipated to the outside, since only from there ge ¬ can be cooled. It is further assumed that these conditions are due to the thermal conductivity of the dominant water in the cells and the low diffuse are ionsgeschwindigkeit of cryoprotectants (suspended cells in a nutrient solution and with the addition of cryoprotectants) through the Zellmembra ¬ NEN only very small objects fulfilled.
Um die Bildung der kristallinen Phase zu vermeiden, wurde in der Praxis versucht, biologische Proben durch schnelle Abkühlung in eine glasartige oder amorphe Phase (vitrifizierter Zustand) zu überführen, was jedoch selbst bei der Verwendung von Kryoprotektiva nur einen beschränkten Erfolg hatte. Allgemein galt daher bis zu einer Veröffentlichung von J. L. . Leunissen et al. [4] die Vorstellung, dass eine Vitrifizie- rung (Vitrifikation) zellulärer Zellsuspensionen ohne Zusätze aus physikalischen Gründen nicht erreichbar wäre. In order to avoid the formation of the crystalline phase, it has been tried in practice to convert biological samples by rapid cooling into a glassy or amorphous phase (vitrified state), which, however, had only limited success, even with the use of cryoprotectants. Generally, therefore, until a publication by J.L. Leunissen et al. [4] the idea that vitrification (vitrification) of cellular cell suspensions without additives would not be achievable for physical reasons.
[4] J. L. M. Leunissen und H. Yi (2009) Journal of Microsco- py, 235: 25-35 [4] J.L.M. Leunissen and H.Yi (2009) Journal of Microscopy, 235: 25-35
Von J. L. M. Leunissen et al. [4] wird für die Kryomikrosko- pie ein Verfahren beschrieben, das eine Vitrifizierung erwarten lässt: wird ein dünnwandiges Kupferröhrchen mit einem Durchmesser von < 1 mm mit einer Zellsuspension gefüllt, an den Enden durch Zusammenquetschen gasfrei geschlossen und anschließend in einer Kühlflüssigkeit, wie Propan, Stickstoff etc., eingefroren, so werden in Tieftemperaturkryoschnitten der Röhrchen ausgezeichnet erhaltene Zellstrukturen gefunden, die eine Vitrifizierung anzeigen. Werden die Tieftempera- turkryoproben erwärmt, zeigt sich jedoch, dass die Zellen den Kühlprozess nicht überlebt haben. Das von J. L. M. Leunissen et al. [4] beschriebene Verfahren ist für eine vitalitätser- haltende Erwärmung der Probe ungeeignet. Bisher wird daher angenommen, dass Verfahren für die Kryomikroskopie keine Revitalisierung durch Rückerwärmung erlauben. Es besteht angesichts der sich entwickelnden regenerativen Medizin und Biotechnologie sowie des Umweltschutzes und der Arterhaltung ein dringendes Interesse, die Nachteile der herkömmlichen Kryokonservierung zu vermindern oder zu überwin- den. By JLM Leunissen et al. [4] For cryomicroscopy, a process is described which can be expected to vitrification: a thin-walled copper tube with a diameter of <1 mm is filled with a cell suspension, closed at the ends by squeezing gas-free and then in a cooling liquid such as propane , Nitrogen, etc., are found in cryogenic cryosections of the tubes excellently preserved cell structures indicating vitrification. However, heating the cryoprocesses shows that the cells did not survive the cooling process. The paper by JLM Leunissen et al. [4] described method is unsuitable for vitality-preserving heating of the sample. So far, it is therefore assumed that methods for cryomicroscopy do not allow revitalization by reheating. There is an urgent interest in reducing or overcoming the disadvantages of conventional cryopreservation in view of evolving regenerative medicine and biotechnology as well as environmental protection and conservation.
Die Aufgabe der Erfindung ist es, eine verbesserte Kryokon- servierungsvorrichtung bereitzustellen, mit der Nachteile herkömmlicher Techniken überwunden werden und die insbesondere eine Kryokonservierung mit einer erhöhten Vitalitätsrate und/oder von vergrößerten Probenvolumen ermöglicht. Die Aufgabe der Erfindung ist es des Weiteren, ein verbessertes Verfahren zur Kryokonservierung bereitzustellen, mit dem Nachteile herkömmlicher Techniken überwunden werden und das insbesondere erlaubt, beim Abkühlen und/oder Auftauen Verfahrensbedingungen so einzustellen, dass eine erhöhte Vitalitätsrate erzielt wird. Des Weiteren ist es eine Aufgabe der Erfindung, ein verbessertes Verfahren zur Erwärmung einer kryokonservierten biologischen Probe bereitzustellen, mit dem Nachteile herkömmlicher Techniken überwunden werden und das insbesondere erlaubt, eine vitalitätsbeschränkende Beeinflussung der biologischen Proben beim Übergang in einen aufgetauten Zustand zu unterdrücken. Diese Aufgaben werden durch Vorrichtungen und Verfahren mit den Merkmalen der unabhängigen Ansprüche gelöst. Vorteilhafte Ausführungsformen und Anwendungen der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen. Gemäß einem ersten Gesichtspunkt der Erfindung wird eineThe object of the invention is to provide an improved cryopreservation device which overcomes the disadvantages of conventional techniques and in particular enables cryopreservation with an increased vitality rate and / or increased sample volume. The object of the invention is furthermore to provide an improved method for cryopreservation which overcomes the disadvantages of conventional techniques and which, in particular, makes it possible to adjust process conditions during cooling and / or thawing in such a way that an increased vitality rate is achieved. Furthermore, it is an object of the invention to provide an improved method for heating a cryopreserved biological sample, which overcomes the disadvantages of conventional techniques and in particular allows to suppress a vitality-limiting influence of the biological samples in the transition to a thawed state. These objects are achieved by devices and methods having the features of the independent claims. Advantageous embodiments and applications of the invention will become apparent from the dependent claims. According to a first aspect of the invention is a
Kryokonservierungsvorrichtung bereitgestellt, die zur Kryokonservierung einer biologischen Probe eingerichtet ist. Die Kryokonservierungsvorrichtung umfasst einen Druckbehälter mit einer Behälterwand und einem Innenraum, der zur Aufnahme der biologischen Probe eingerichtet ist. Der Druckbehälter ist konfiguriert, in einem Kühlbad einer Kühlvorrichtung bis zu einer Kryokonservierungstemperatur, z. B. unterhalb von A cryopreservation apparatus provided for cryopreserving a biological sample is provided. The cryopreservation device comprises a pressure vessel having a container wall and an interior adapted to receive the biological sample is set up. The pressure vessel is configured to be stored in a cooling bath of a cooling device up to a cryopreservation temperature, e.g. B. below
- 138°C, abgekühlt zu werden. Des Weiteren ist der Druckbe- hälter konfiguriert, dass der Innenraum des Kühlbehälters mit einem Druck beaufschlagt werden kann, der höher als der umgebende Atmosphärendruck ist. Der Druckbehälter ist für die dauerhafte Kryokonservierung der biologischen Probe und Lage¬ rung bei der Kryokonservierungstemperatur und unter Aufrecht- erhaltung des erhöhten Drucks im Druckbehälter eingerichtet. - 138 ° C, to be cooled. Furthermore, the pressure vessel is configured such that the interior of the cooling tank can be pressurized to a pressure higher than the surrounding atmospheric pressure. The pressure vessel is adapted for permanent cryopreservation of the biological sample and location ¬ tion at the cryopreservation temperature and main- conservation of the increased pressure in the pressure vessel.
Gemäß der Erfindung umfasst der Druckbehälter eine Stelleinrichtung, die für eine zeit- und/oder ortsabhängige Einstel¬ lung der Temperatur und des Druckes im Druckbehälter einge- richtet ist. Die Stelleinrichtung ist mit der Behälterwand des Druckbehälters verbunden und geeignet, die Einstellung der Kryokonservierungstemperatur und des Druckes im Innenraum des Druckbehälters zeit- und/oder ortsabhängig zu beeinflus¬ sen. Die Stelleinrichtung ist dazu eingerichtet, die Abküh- lung und/oder Erwärmung der biologischen Probe entsprechend einer vorbestimmten Temperatur-Zeitfunktion gezielt zu steuern. Des Weiteren ist die Stelleinrichtung geeignet, die Tem¬ peraturverteilung im Druckbehälter zu beeinflussen. Des Weiteren ist die Stelleinrichtung geeignet, den Druck im Druck- behälter gemäß einer vorbestimmten Druck-Zeitfunktion zu steuern. Die Temperatur- und Druck-Zeitfunktionen können re¬ lativ zueinander eingestellt werden. Beispielsweise ermöglicht die Stelleinrichtung, gezielt zuerst die biologische Probe abzukühlen und anschließend mit einem erhöhten Druck zu beaufschlagen, die Abkühlung und die Druckerhöhung gleichzeitig auszuführen oder zunächst den Druck zu erhöhen und an¬ schließend die Kryokonservierungstemperatur einzustellen. Schließlich ist die Stelleinrichtung geeignet, die den Ort der Druckerzeugung im Druckbehälter zu steuern. Gemäß der Erfindung umfasst die Stelleinrichtung mindestens ein Druckeinstellelement, mindestens ein Kühlelement und/oder wenigstens ein Wärmeleitelement. Das Druckeinstellelement ist konfiguriert, die Druck-Zeitfunktion, einen Ort eines primä¬ ren Druckeintrags und/oder die Höhe des Drucks einzustellen, mit dem der Innenraum des Druckbehälters beaufschlagt wird. Entsprechend sind das Kühlelement und/oder das Wärmeleitelement, ggf. in Verbindung mit der Wirkung der Kühlvorrichtung, eingerichtet, die Temperatur-Zeitfunktion, die räumliche Temperaturverteilung und die Kryokonservierungstemperatur zu steuern . According to the invention the pressure container comprises an actuating device, which is aimed einge- for a time and / or location-dependent SET ¬ development of temperature and pressure in the pressure tank. The adjusting device is connected to the container wall of the pressure vessel and adapted to the adjustment of the cryopreservation temperature and pressure in the interior of the pressure vessel time and / or location-dependent to beeinflus ¬ sen. The adjusting device is set up to selectively control the cooling and / or heating of the biological sample according to a predetermined temperature-time function. Furthermore, the setting means capable of influencing the tem ¬ peraturverteilung in the pressure vessel. Furthermore, the adjusting device is suitable for controlling the pressure in the pressure vessel in accordance with a predetermined pressure-time function. The temperature and pressure-time functions can be set re ¬ tively to each other. For example, the adjusting device allows targeted first to cool the biological sample and then to apply an increased pressure to carry out the cooling and the pressure increase simultaneously or first to increase the pressure and on ¬ closing the cryopreservation set. Finally, the actuator is suitable to control the location of pressure generation in the pressure vessel. According to the invention, the adjusting device comprises at least one Druckeinstellelement, at least one cooling element and / or at least one heat conducting element. The print setting is configured to adjust the pressure-time function, a location of a Primae ¬ ren entry pressure and / or the amount of pressure with which the interior of the pressure vessel is pressurized. Accordingly, the cooling element and / or the heat-conducting element, optionally in conjunction with the action of the cooling device, are arranged to control the temperature-time function, the spatial temperature distribution and the cryopreservation temperature.
Die biologische Probe enthält biologische Zellen und ein wässriges Konservierungsmedium. Die biologischen Zellen umfassen einzelne Zellen, wie z. B. einzelne Stammzellen, Vorläuferzellen, Fibroblasten, Keimzellen, Zellgruppen, insbesondere aus den genannten Zelltypen, Gewebestücke oder Organe oder deren Teile. Die biologischen Zellen können sogar komplette Organismen, insbesondere von Kleinstlebewesen, wie Würmer oder Insekten, bilden. Das Konservierungsmedium umfasst ein wässriges physiologisches Medium (Nährmedium, Kultivierungsmedium) , wie es aus der Kultivierung biologischer Zellen bekannt ist. The biological sample contains biological cells and an aqueous preservation medium. The biological cells comprise individual cells, such as. B. individual stem cells, progenitor cells, fibroblasts, germ cells, cell groups, in particular from the cell types mentioned, pieces of tissue or organs or parts thereof. The biological cells may even form complete organisms, especially microorganisms such as worms or insects. The preservation medium comprises an aqueous physiological medium (nutrient medium, culture medium) as known from the cultivation of biological cells.
Gemäß einem zweiten Gesichtspunkt der Erfindung wird ein Verfahren zur Kryokonservierung der biologischen Probe bereitge¬ stellt, bei dem die biologische Probe in einem Druckbehälter angeordnet und der Druckbehälter in einer Kühlvorrichtung ab¬ gekühlt wird, bis die biologische Probe in den kryokonser- vierten Zustand in einer zumindest teilweise glasartigen Phase überführt ist. Gemäß der Erfindung erfolgt eine zeit- und/oder ortsabhängige Einstellung der Temperatur und des Druckes im Druckbehälter unter Verwendung einer Stelleinrich- tung mit mindestens einem Druckeinstellelement, mindestens einem Kühlelement und/oder mindestens einem Wärmeleitelement. Vorzugsweise wird zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Kryokonservierung biologischer Proben die Kryo- konservierungsvorrichtung gemäß dem ersten Gesichtspunkt der Erfindung verwendet. According to a second aspect of the invention provides a method for the cryopreservation of the biological sample is bereitge ¬ provides, in which the biological sample is placed in a pressure vessel and the pressure vessel in a cooling device is cooled from ¬, to the biological sample in the cryopreserved fourth state in a at least partially glassy phase is transferred. According to the invention, a time- and / or location-dependent adjustment of the temperature and the pressure in the pressure vessel is carried out using a control unit. tion with at least one Druckeinstellelement, at least one cooling element and / or at least one heat conducting element. The cryopreservation device according to the first aspect of the invention is preferably used to carry out the method according to the invention for the cryopreservation of biological samples.
Gemäß einem dritten Gesichtspunkt der Erfindung wird ein Verfahren zur Erwärmung einer biologischen Probe, umfassend bio- logische Zellen und ein Konservierungsmedium in einem gefrorenen Zustand, die in einer glasartigen Phase in einem Druckbehälter angeordnet ist, bereitgestellt. Gemäß der Erfindung wird die Temperatur des Druckbehälters und der biologischen Probe erhöht und während der Temperaturerhöhung im Druckbe- hälter ein erhöhter Druck oberhalb des umgebenden Atmosphärendrucks aufrechterhalten. Vorzugsweise wird das Verfahren zur Erwärmung der biologischen Probe unter Verwendung der Kryokonservierungsvorrichtung gemäß dem ersten Gesichtspunkt der Erfindung ausgeführt. According to a third aspect of the invention, there is provided a method of heating a biological sample comprising biological cells and a preservation medium in a frozen state disposed in a glassy phase in a pressure vessel. According to the invention, the temperature of the pressure vessel and the biological sample is increased and maintained during the temperature increase in the pressure vessel, an elevated pressure above the ambient atmospheric pressure. Preferably, the method of heating the biological sample is carried out using the cryopreservation device according to the first aspect of the invention.
Gemäß einem vierten Gesichtspunkt der Erfindung wird vorgeschlagen, mindestens eine Stabilisatorsubstanz (d. h. eine einzelne Substanz oder eine Mischung von mehreren Substanzen) bei der Kryokonservierung biologischer Proben als Bestandteil des Konservierungsmediums zu verwenden, die geeignet ist, bei der Erhöhung der Temperatur einer biologischen Probe, umfassend biologische Zellen und ein Konservierungsmedium, vorzugsweise bis zum Übergang in den flüssigen Zustand einen glasartigen Zustand der unterkühlten Schmelze ohne Kristalli- sation zu erhalten. According to a fourth aspect of the invention, it is proposed to use at least one stabilizer substance (ie a single substance or a mixture of several substances) in the cryopreservation of biological samples as a constituent of the preservation medium which is suitable for increasing the temperature of a biological sample biological cells and a preservation medium, preferably to obtain a glassy state of the supercooled melt without crystallization to the transition to the liquid state.
Die Erfindung basiert auf der Erkenntnis, dass beim Einfrieren wässriger Systeme die Bildung der kristallinen- Phase vermieden und stattdessen die glasartige Phase (amorphe Phase) erzeugt werden kann, indem das wässrige System mit einem Druck beaufschlagt wird. Die Überführung der biologischen Probe in den kryokonservierten Zustand, die Kryokonservierung und/oder die Erwärmung der kryokonservierten Proben erfolgen in einem Bereich des Phasendiagramms des wässrigen Systems, in dem die glasartige Phase bevorzugt gebildet wird. Da die Überlebensrate der biologischen Zellen in der biologischen Probe in der glasartigen Phase erheblich höher als in der kristallinen Phase ist, ermöglicht die Erfindung eine erhöhte Vitalitätsrate der Kryokonservierung. The invention is based on the finding that the freezing of aqueous systems avoids the formation of the crystalline phase and instead the glassy phase (amorphous phase). can be produced by applying a pressure to the aqueous system. The transfer of the biological sample into the cryopreserved state, the cryopreservation and / or the heating of the cryopreserved samples take place in a region of the phase diagram of the aqueous system in which the glassy phase is preferably formed. Since the survival rate of the biological cells in the biological sample in the vitreous phase is considerably higher than in the crystalline phase, the invention enables an increased vitality rate of the cryopreservation.
Bei der herkömmlichen Kryomikroskopie unter Verwendung von druckfesten Probenröhrchen (siehe oben, [4]) wurde im geschlossenen Probenröhrchen bereits ein erhöhter Druck erzeugt. Bei der herkömmlichen Technik besteht jedoch kein Freiheitsgrad, den Druck- oder Temperaturverlauf beim Einfrieren, während der Kryokonservierung oder beim Erwärmen gezielt entsprechend vorgegebenen Zeitfunktionen zu beeinflussen. Die Erfinder haben festgestellt, dass insbesondere beim Auftauen unweigerlich das beim raschen Abkühlen vermiedene Eis mit all seinen negativen Wirkungen auf die Probe entsteht, wodurch die Zellen abgetötet werden. Vorteilhafterweise wird mit der erfindungsgemäßen Bereitstellung der Stelleinrichtung ermöglicht, dass die Druck-Temperatur-Verläufe zeitlich und/oder räumlich so gesteuert werden, dass im Innenraum des Druckbehälters vorrangig die glasartige Phase der biologischen Probe erzeugt und aufrechterhalten wird. Im Unterschied zur herkömmlichen Technik ermöglicht die Stelleinrichtung, Druck- und Temperaturparameter beim Einfrieren und/oder Auftauen gezielt zu variieren, um eine maximale Vitalitätsrate zu erzielen. Vorteilhafterweise wird damit erfindungsgemäß eine echte Kryokonservierung mit der Möglichkeit des Wiederauftauens und der Revitalisierung der Zellen in der biologischen Probe bereitgestellt, während die Technik von J. L. M. Leunissen et al. [4] lediglich eine Kryopräpara tion für mikroskopische Untersuchungen darstellt. In conventional cryomicroscopy using pressure-resistant sample tubes (see above, [4]), an increased pressure was already generated in the closed sample tube. In the conventional technique, however, there is no degree of freedom to influence the pressure or temperature course during freezing, during the cryopreservation or during heating specifically according to predetermined time functions. The inventors have found that, especially during thawing, inevitably the ice avoided during rapid cooling is produced with all its negative effects on the sample, whereby the cells are killed. Advantageously, with the provision of the adjusting device according to the invention it is made possible that the pressure-temperature curves are controlled temporally and / or spatially so that the vitreous phase of the biological sample is primarily generated and maintained in the interior of the pressure vessel. In contrast to the conventional technique, the adjusting device makes it possible to selectively vary pressure and temperature parameters during freezing and / or thawing in order to achieve a maximum vitality rate. Advantageously, according to the invention, a true cryopreservation with the possibility of re-thawing and revitalization of the cells in the biological sample is provided while the art by JLM Leunissen et al. [4] represents only a cryopreparation for microscopic examinations.
Gemäß dem o. g. dritten Gesichtspunkt der Erfindung wird ins besondere vorgeschlagen, den glasartigen Zustand der Probe, insbesondere des Konservierungsmediums unter Erhaltung des Druckes bis zum Schmelzen des in der Probe enthaltenen Wassers zu erhalten. Vorteilhafterweise wird damit ermöglicht, kryokonservierte biologische Proben, wie z. B. die von J. L. . Leunissen et al. [4] beschriebenen, in extrem guter Struk turerhaltung und vitrifiziert vorliegenden Zellsuspensionen, wieder so aufzutauen, dass lebende Zellen vorhanden sind. Dies ist bisher noch bei keinem Gefrier-Druckschockverfahren wie es für die Kryomikroskopie eingesetzt wird, gelungen. Um die genannte Stabilisierung zu erreichen, wird dem Konservie rungsmedium vorzugsweise mindestens eine Stabilisatorsubstanz, die geeignet ist, bei der Erhöhung der Temperatur der biologischen Probe, vorzugsweise bis zur Schmelze, die glasartige Phase der unterkühlten Schmelze zu stabilisieren. Die erfindungsgemäße Kryokonservierungsvorrichtung ermöglicht vorteilhafterweise eine Beeinflussung des Weges der Probenbe dingungen durch das Phasendiagramm vorbei am Fest-Flüssig- Phasenübergang . Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst die Stelleinrichtung mindestens ein Druckeinstellelement, das mit der Behälterwand und/oder dem Innenraum des Druckbehälters verbunden ist. Vorteilhafterweise sind verschiedene Varianten des Druckeinstellelements möglich, die in Abhängig- keit von der Konservierungsaufgabe und den räumlichen Bedingungen der Kryokonservierung einzeln oder in Kombination gewählt werden können. Gemäß einer ersten Variante kann in der Behälterwand des Druckbehälters mindestens eine Druckschraube vorgesehen sein. Die Behälterwand enthält eine Gewindeöffnung zur flüssigkeitsdichten Aufnahme der Druckschraube. Durch ein Einschrauben der Druckschraube in die Gewindeöffnung kann das freie Volumen des Innenraums im Druckbehälter verringert und entsprechend der Druck im Druckbehälter erhöht werden. Gemäß einer zweiten Variante kann ein Expansionsbereich vorgesehen sein, der mit dem Innenraum des Druckbehälters in Verbindung steht und zur Aufnahme eines flüssigen oder gasförmigen Expansionsmediums eingerichtet ist. Wenn sich das Expansionsmedium im Expansionsbereich ausdehnt, wird entsprechend das freie Volumen im Innenraum verringert und der Druck im Druckbehälter erhöht. Gemäß einer dritten Variante kann das Druckeinstellelement eine Druckklammer umfassen, die von außen auf die Behälterwand wirkt. In diesem Fall ist die Behälterwand aus einem biegsamen Material gebildet, um den von der Druck- klammer ausgeübten mechanischen Druck auf den Innenraum des Druckbehälters zu übertragen. Vorteilhafterweise kann die Druckklammer mit Kühlöffnungen ausgestattet sein, um die Abkühlung des Druckbehälters im Kühlbad der Kühlvorrichtung zu beschleunigen. Des Weiteren kann die Druckklammer für eine mechanische oder elektrische Betätigung ausgelegt sein. According to the above-mentioned third aspect of the invention, it is particularly proposed to obtain the glassy state of the sample, particularly the preservation medium, while maintaining the pressure until the water contained in the sample is melted. Advantageously, this allows cryopreserved biological samples such. For example, those of JL. Leunissen et al. [4] described in extremely good struc turerhaltung and vitrifiziert present cell suspensions, thaw again so that living cells are present. This has not yet been achieved with any freeze-pressure shock method as used for cryomicroscopy. In order to achieve said stabilization, the preservative medium is preferably stabilized with at least one stabilizer substance which is capable of stabilizing the glassy phase of the supercooled melt as the temperature of the biological sample increases, preferably to the point of melting. The cryopreservation device according to the invention advantageously makes it possible to influence the path of the sample conditions through the phase diagram past the solid-liquid phase transition. According to a preferred embodiment of the invention, the adjusting device comprises at least one Druckeinstellelement which is connected to the container wall and / or the interior of the pressure vessel. Advantageously, various variants of the Druckeinstellelements are possible, which can be selected individually or in combination depending on the preservation task and the spatial conditions of the cryopreservation. According to a first variant, at least one pressure screw can be provided in the container wall of the pressure vessel. The container wall contains a threaded opening for liquid-tight recording of the pressure screw. By screwing the pressure screw into the threaded opening, the free volume of the interior can be reduced in the pressure vessel and increased according to the pressure in the pressure vessel. According to a second variant, an expansion region can be provided, which communicates with the interior of the pressure vessel and is adapted to receive a liquid or gaseous expansion medium. If the expansion medium expands in the expansion area, the free volume in the interior is correspondingly reduced and the pressure in the pressure vessel is increased. According to a third variant, the Druckeinstellelement may comprise a pressure clamp, which acts from the outside on the container wall. In this case, the container wall is formed of a flexible material in order to transmit the mechanical pressure exerted by the pressure clamp on the interior of the pressure vessel. Advantageously, the pressure clamp can be equipped with cooling openings in order to accelerate the cooling of the pressure vessel in the cooling bath of the cooling device. Furthermore, the pressure clamp may be designed for mechanical or electrical actuation.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst der Expansionsbereich mindestens eine Hohlleitung zur Aufnahme des Expansionsmediums, die mit dem Innen- räum des Druckbehälters kommuniziert und die vom Druckbehälter absteht. Die Hohlleitung enthält z. B. Wasser, eine wäss- rige Lösung oder Teile der biologischen Probe. Durch das Abstehen der Hohlleitung vom Druckbehälter wird das Expansionsmedium in der Hohlleitung räumlich vom Innenraum des Druckbe- hälters getrennt. Dies ermöglicht vorteilhafterweise eine Abkühlung der Hohlleitung im Kühlbad der Kühlvorrichtung, während sich der übrige Druckbehälter noch auf erhöhter Temperatur, z. B. bei Raumtemperatur befindet. In der Hohlleitung kann kristallines Eis erzeugt werden, welches sich hin zum Innenraum ausdehnt, dessen übriges Volumen verringert und somit eine Erhöhung des Druckes im Innenraum bewirkt. Gemäß einer bevorzugten Variante weist die Hohlleitung Verzweigungen auf. Vorteilhafterweise ermöglicht dies eine Vergrößerung des Volumens des Expansionsbereichs im Vergleich zu einer einzelnen, unverzweigten Hohlleitung. Gleichzeitig ermöglicht die verzweigte Hohlleitung eine Beeinflussung der Zeitfunktion der Druckerzeugung im Druckbehälter. Alternativ und zusätzlich können mehrere Hohlleitungen vorgesehen sein, die in verschiedenen Raumrichtungen vom Druckbehälter abstehen. Vorteilhafterweise ermöglicht dies eine Beeinflussung der Druckerzeugung in Abhängigkeit von der Orientierung des Druckbehälters relativ zum Kühlbad der Kühlvorrichtung. Wenn die erfindungsgemäß vorgesehene Stelleinrichtung einAccording to a particularly preferred embodiment of the invention, the expansion region comprises at least one hollow conduit for receiving the expansion medium, which communicates with the inner space of the pressure vessel and which protrudes from the pressure vessel. The hollow line contains z. As water, an aqueous solution or parts of the biological sample. Due to the protrusion of the hollow conduit from the pressure vessel, the expansion medium in the hollow conduit is spatially separated from the interior of the pressure vessel. This advantageously allows a cooling of the hollow conduit in the cooling bath of the cooling device, while the remaining pressure vessel is still at an elevated temperature, for. B. is at room temperature. In the hollow line crystalline ice can be generated, which towards the Interior expands, reduces the remaining volume and thus causes an increase in the pressure in the interior. According to a preferred variant, the hollow conduit has branches. Advantageously, this makes it possible to increase the volume of the expansion area in comparison to a single, unbranched hollow conduit. At the same time, the branched hollow line makes it possible to influence the time function of the pressure generation in the pressure vessel. Alternatively and additionally, a plurality of hollow conduits may be provided which protrude from the pressure vessel in different spatial directions. Advantageously, this makes it possible to influence the pressure generation as a function of the orientation of the pressure vessel relative to the cooling bath of the cooling device. If the inventively provided adjusting device a
Kühlelement umfasst, so wird dieses vorzugsweise durch eine Kühlleitung gebildet, die im Druckbehälter angeordnet ist. Die Kühlleitung verläuft durch den Innenraum des Behälters. Sie ist dazu eingerichtet, mit einem Kühlmittel, wie z. B. mit flüssigem Stickstoff, durchströmt zu werden. Vorteilhafterweise ermöglicht die Kühlleitung eine Einstellung des Beginns und der Zeitfunktion der Temperaturabsenkung im Druckbehälter . Wenn die erfindungsgemäß vorgesehene Stelleinrichtung einIncludes cooling element, this is preferably formed by a cooling line, which is arranged in the pressure vessel. The cooling line runs through the interior of the container. It is adapted to with a coolant such. B. with liquid nitrogen to be flowed through. Advantageously, the cooling line allows adjustment of the beginning and the time function of the temperature reduction in the pressure vessel. If the inventively provided adjusting device a
Wärmeleitelement umfasst, so wird dieses vorzugsweise durch ein Außenprofil auf einer Außenseite des Druckbehälters, ein Innenprofil auf einer Innenseite des Druckbehälters und/oder Wärmeleitkörper im Inneren des Druckbehälters gebildet. Diese Varianten von Wärmeleitelementen ermöglichen, bei der Abkühlung des Druckbehälters den Wärmetransport vom Druckbehälter in das Kühlbad zu beschleunigen. Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Kryokonservie- rungsvorrichtung besteht darin, dass der Druckbehälter mit einer Vielzahl geometrischer Formen herstellbar ist. Besonders bevorzugt sind Varianten der Erfindung, bei denen die Behälterwand des Druckbehälters die Gestalt eines Rohres, einer Kugel oder eines Zylinders, z. B. eines flachen Zylinders (Dose), aufweist. Ein rohrförmiger Druckbehälter kann gerade oder gekrümmt gebildet sein. In beiden Fällen kann jeweils die räumliche Verteilung der Temperatur- und Druckeinstellung im Druckbehälter durch dessen Gestalt beeinflusst werden. Heat-conducting element comprises, it is preferably formed by an outer profile on an outer side of the pressure vessel, an inner profile on an inner side of the pressure vessel and / or heat-conducting body in the interior of the pressure vessel. These variants of heat conducting elements make it possible to accelerate the transport of heat from the pressure vessel into the cooling bath during the cooling of the pressure vessel. A further advantage of the cryopreservation device according to the invention is that the pressure vessel can be produced with a large number of geometric shapes. Particularly preferred variants of the invention in which the container wall of the pressure vessel, the shape of a tube, a sphere or a cylinder, for. B. a flat cylinder (box) has. A tubular pressure vessel may be straight or curved. In both cases, the spatial distribution of the temperature and pressure setting in the pressure vessel can each be influenced by its shape.
Weitere vorteilhafte Merkmale der erfindungsgemäßen Kryokon- servierungsvorrichtung beziehen sich auf die Gestaltung des Innenraums des Druckbehälters. Gemäß einer Variante der Erfindung kann im Innenraum ein Innenbehälter vorgesehen sein, der zur Aufnahme der biologischen Probe eingerichtet ist. In diesem Fall ist die biologische Probe im Innenbehälter vom übrigen Volumen des Innenraums stofflich getrennt. Dies ermöglicht eine Beeinflussung der glasartigen Phase in der unmittelbaren Umgebung der biologischen Probe. Gemäß einer weiteren Variante kann im Innenraum ein Substrat angeordnet sein, das zur adhärenten Aufnahme biologischer Zellen, die Teil der biologischen Probe sind, eingerichtet ist. Das Substrat kann z. B. im Innenbehälter angeordnet sein. Als Substrat sind Substratmaterialien geeignet, die für adhärente Zellkulturen verwendet werden, wie z. B. Kunststoff oder Glas. Gemäß einer weiteren Variante kann eine Segmentierung des Innenraums in Innenraumabschnitte vorgesehen sein. Die Segmentierung ermöglicht vorteilhafterweise die gezielte Einstellung von verschiedenen Druck-Temperatur-Bedingungen in jedem der Innenraumabschnitte. Gemäß einer weiteren Variante kann im Innenraum eine Sensoreinrichtung angeordnet sein, die mindestens einen Temperatursensor und/oder mindestens einen Drucksensor umfasst. Die Sensoreinrichtung ermöglicht vor- teilhafterweise eine Messung der Temperatur und/oder des Dru ckes im Innenraum. In Abhängigkeit von dem mindestens einen Signal der Sensoreinrichtung kann die Kryokonservierung gesteuert werden. Schließlich kann mit einer weiteren Variante der Erfindung im Innenraum ein Substanzreservoir angeordnet sein, das zur Freigabe einer Substanz in den Innenraum einge richtet ist. Das Substanzreservoir umfasst z. B. Hohlkugeln, die unter der Wirkung eines erhöhten Druckes im Innenraum zerstört werden können, um eine Substanz freizusetzen. Die genannten Varianten der Innenraum-Gestaltung können einzeln oder in Kombination vorgesehen sein. Further advantageous features of the cryopreservation device according to the invention relate to the design of the interior of the pressure vessel. According to a variant of the invention may be provided in the interior of an inner container, which is adapted to receive the biological sample. In this case, the biological sample in the inner container is materially separated from the remaining volume of the inner space. This allows influencing the glassy phase in the immediate vicinity of the biological sample. According to a further variant, a substrate can be arranged in the interior, which is set up for the adherent recording of biological cells which are part of the biological sample. The substrate may, for. B. be arranged in the inner container. As a substrate substrate materials are suitable, which are used for adherent cell cultures, such. As plastic or glass. According to a further variant, a segmentation of the interior can be provided in interior sections. The segmentation advantageously enables the targeted adjustment of different pressure-temperature conditions in each of the interior sections. According to a further variant, a sensor device may be arranged in the interior, which comprises at least one temperature sensor and / or at least one pressure sensor. The sensor device enables teilhafterweise a measurement of temperature and / or Dru ck in the interior. Depending on the at least one signal of the sensor device, the cryopreservation can be controlled. Finally, with a further variant of the invention, a substance reservoir can be arranged in the interior, which is directed to release a substance into the interior. The substance reservoir comprises z. B. hollow spheres that can be destroyed under the effect of increased pressure in the interior to release a substance. The mentioned variants of the interior design can be provided individually or in combination.
Gemäß einer weiteren, vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung kann die Behälterwand mit einer Optikeinheit ausgestattet sein. Die Optikeinheit umfasst eine abbildende Optik, die für eine optische Beobachtung des Innenraums des Druckbe hälters eingerichtet ist. Die Optikeinheit ermöglicht eine optische Überwachung des Zustands der biologischen Probe wäh rend der Kryokonservierung. According to a further advantageous embodiment of the invention, the container wall may be equipped with an optical unit. The optical unit comprises an imaging optics, which is set up for an optical observation of the interior of the container Druckbe. The optical unit allows optical monitoring of the state of the biological sample during cryopreservation.
Vorteilhafterweise bestehen verschiedene Varianten der Druck und Temperatureinstellung im Druckbehälter, um auf verschiedenen Wegen im Druck-Temperatur-Zustandsdiagramm der biologi sehen Probe zu den gewünschten Kryokonservierungsbedingungen zu gelangen. Beispielsweise ist es gemäß einer ersten Varian te möglich, zuerst den Druck im Druckbehälter mit dem mindes tens einen Druckeinstellelement zu erhöhen und anschließend die Temperatur im Druckbehälter mit der Kühlvorrichtung abzu senken. Die Druckerhöhung und die Temperaturabsenkung erfolgen jeweils gemäß vorbestimmten, getrennten Zeitfunktionen. Gemäß einer zweiten Variante können die Erhöhung des Druckes und die Absenkung der Temperatur so eingestellt werden, dass sich die jeweiligen Zeitfunktionen überlappen, indem die Absenkung der Temperatur vor Erreichung des Enddruckes oder um gekehrt die Erhöhung des Druckes vor Erreichung der Kryokon- servierungstemperatur gestartet wird. Schließlich ist es gemäß einer weiteren Variante möglich, zunächst die Temperatur im Druckbehälter bis zur Kryokonservierungstemperatur abzu- senken und anschließend den Druck im Druckbehälter zu erhöhen. Welche der genannten Varianten gewählt wird, hängt von den Bedingungen der konkreten Kryokonservierungsaufgäbe , insbesondere vom Aufbau der Kryokonservierungsvorrichtung und der Zusammensetzung der biologischen Probe, ab. Die optimale Variante kann empirisch durch Tests ausgewählt werden, bei denen unter den konkreten Anwendungsbedingungen die Vitalitätsrate der biologischen Probe für die verschiedenen Varianten getestet wird. In gleicher Weise ist es möglich, die Druck- und Temperatur-Zeitfunktionen, insbesondere in Bezug auf die Geschwindigkeit der Druckerhöhung und der Temperaturabsenkung und/oder die Gestalt der Funktion, wie z. B. eine Stufenform, zu wählen. Advantageously, there are different variants of the pressure and temperature setting in the pressure vessel to arrive in different ways in the pressure-temperature-state diagram of biological sample to the desired Kryokonservierungsbedingungen. For example, according to a first variant, it is possible to first increase the pressure in the pressure vessel with the at least one pressure adjusting element and then lower the temperature in the pressure vessel with the cooling device. The pressure increase and the temperature reduction are in each case according to predetermined, separate time functions. According to a second variant, the increase of the pressure and the lowering of the temperature can be adjusted so that the respective time functions overlap by the lowering of the temperature before reaching the final pressure or at conversely, the increase in pressure is started before the cryoconcentration temperature is reached. Finally, according to another variant, it is possible first to lower the temperature in the pressure vessel to the cryopreservation temperature and then to increase the pressure in the pressure vessel. Which of the mentioned variants is chosen depends on the conditions of the specific cryopreservation task, in particular on the structure of the cryopreservation device and the composition of the biological sample. The optimal variant can be selected empirically by tests in which the vitality rate of the biological sample for the different variants is tested under the specific conditions of use. In the same way it is possible, the pressure and temperature-time functions, in particular with respect to the speed of the pressure increase and the temperature reduction and / or the shape of the function, such. B. a step shape to choose.
Wenn das Druckeinstellelement gemäß einer bevorzugten Ausfüh- rungsform der Erfindung einen Expansionsbereich in Gestalt einer vom Druckbehälter abstehenden Hohlleitung umfasst, wird die Druck-Temperatur-Einstellung vereinfacht. Der Druck kann im Druckbehälter erhöht werden, indem zuerst die mindestens eine Hohlleitung in das Kühlbad der Kühlvorrichtung getaucht wird. Ein Expansionsmedium in der mindestens einen Hohlleitung dehnt sich aus, so dass der Druck im übrigen Druckbehälter ansteigt. Anschließend wird auch der übrige Druckbehälter in das Kühlbad der Kühlvorrichtung getaucht, um so für die biologische Probe im Innenraum des Druckbehälters die Kryo- konservierungstemperatur einzustellen. If the pressure-adjusting element according to a preferred embodiment of the invention comprises an expansion region in the form of a protruding from the pressure vessel hollow pipe, the pressure-temperature setting is simplified. The pressure can be increased in the pressure vessel by first immersing the at least one hollow conduit in the cooling bath of the cooling device. An expansion medium in the at least one hollow conduit expands, so that the pressure in the rest of the pressure vessel increases. Subsequently, the remaining pressure vessel is also immersed in the cooling bath of the cooling device so as to set the cryopreservation temperature for the biological sample in the interior of the pressure vessel.
Vorzugsweise ist eine dauerhafte Lagerung der biologischen Probe unter Aufrechterhaltung des erhöhten Druckes, insbesondere in flüssigem Stickstoff oder im Dampf des flüssigen Stickstoffs vorgesehen. Besonders bevorzugt erfolgt die Lagerung der Probe im Druckbehälter. Preferably, a permanent storage of the biological sample while maintaining the elevated pressure, in particular in liquid nitrogen or in the vapor of the liquid Nitrogen provided. Particularly preferably, the storage of the sample takes place in the pressure vessel.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens zur Kryokonservierung enthält das Konservierungsmedium mindestens eine Stabilisatorsubstanz, die geeignet ist, bei der Erhöhung der Temperatur der biologischen Probe, vorzugsweise bis zu dem Übergang in den flüssigen Zustand, die glasartige Phase der unterkühlten Schmelze zu stabilisieren (erhalten) . Vorteilhafterweise bewirkt die Stabilisatorsubstanz, dass die glasartige Phase bis zu höheren Temperaturen erhalten bleibt, als dies ohne die Stabilisatorsubstanz der Fall wäre. Die glasartige Phase wird beim Auftauen länger aufrecht erhalten, und die Bildung der kristallinen Phase wird vermieden. Des Weiteren ist die Glasübergangstemperatur des Konservierungsmedium durch die Stabilisatorsubstanz erhöht. Die Stabilisatorsubstanz ergibt eine verringerte Zahl von Nuklea- tionskeimen im Konservierungsmedium, so dass die Nukleations- wahrscheinlichkeit verringert und die Eisbildung beim Auftauen minimiert wird. According to a particularly preferred embodiment of the method for cryopreservation, the preservation medium contains at least one stabilizer substance which is suitable for stabilizing the glassy phase of the supercooled melt when the temperature of the biological sample is increased, preferably until it changes to the liquid state. , Advantageously, the stabilizer substance causes the glassy phase to be maintained at higher temperatures than would be the case without the stabilizer substance. The glassy phase is maintained longer on thawing, and the formation of the crystalline phase is avoided. Furthermore, the glass transition temperature of the preservation medium is increased by the stabilizer substance. The stabilizer substance results in a reduced number of nucleation nuclei in the preservation medium, so that the nucleation probability is reduced and ice formation during thawing is minimized.
Gemäß dieser Ausführungsform werden die obigen Aufgaben gelöst, in dem der biologische Probe, z. B. einer Zellsuspension, die mindestens eine Stabilisatorsubstanz zugesetzt wird. Es wird die mindestens eine Stabilisatorsubstanz verwendet, wie sie für die herkömmliche Kryokonservierung nur bedingt oder gar nicht angewendet wurde bzw. erfindungsgemäß ihre Wirkung bei viel geringeren Konzentrationen entfaltet und diese eine andere ist, als die der bekannten Kryoprotektiva . Als Stabilisatorsubstanz werden vorzugsweise Stoffe gewählt, die bei Normaldruck nicht in die Zellen eindringen und daher normalerweise keine Anwendung in der herkömmlichen Kryokonservierung von Zellen und Geweben finden. Das Bemerkenswerte an der Verwendung der Stabilisatorsubstanz ist, dass Experi- mente der Erfinder zeigten, dass bei einem Zusatz von z. B. von Percoll bzw. Ficoll im Bereich von wenigen Prozent Säugerzellen, die Druckschockgefrier- und Auftauprozedur analog zu Publikation [4] mit hoher Überlebensrate (> 97%) überstan¬ den. Dies ist umso erstaunlicher, da nicht von einem Eindrin¬ gen in die Zellen auszugehen ist. According to this embodiment, the above objects are achieved, in which the biological sample, e.g. B. a cell suspension, which is added at least one stabilizer substance. The at least one stabilizer substance is used, as it has been used only conditionally or not at all for conventional cryopreservation or according to the invention develops its effect at much lower concentrations and this is different than that of the known cryoprotectants. As the stabilizer substance preferably substances are selected which do not penetrate into the cells at atmospheric pressure and therefore normally find no use in the conventional cryopreservation of cells and tissues. The remarkable thing about the use of the stabilizer substance is that experiments ments of the inventors showed that with an addition of z. B. Percoll or Ficoll in the range of a few percent mammalian cells, the Druckschockgefrier- and thawing procedure similar to publication [4] with high survival rate (> 97%) überstan ¬ the. This is all the more surprising since it is not probable that a Eindrin ¬ gen into the cells.
Die überraschende Wirkung der Stabilisatorsubstanz ist, dass sie erstmalig beim Auftauen der Probe den Rückweg über die Kombination hoher Druck/schnelles Tiefkühlen und Druckgesteuerte Erwärmung bei nahezu unbeeinflusster Vitalität der Zellen erlaubt. Es ist also die Kombination mindestens einer, im Konservierungsmedium gelösten Substanz, die über die Beeinflussung der Wasserstruktur und des Vorhandenseins von Nu- kleationskeimen die Rückkehr aus dem vitrifizierten Bereich erlaubt . The surprising effect of the stabilizer substance is that, for the first time during the thawing of the sample, it allows the return path via the combination of high pressure / rapid freezing and pressure-controlled heating with virtually unaffected vitality of the cells. It is thus the combination of at least one substance dissolved in the preservation medium which allows the return from the vitrified area by influencing the water structure and the presence of nucleation germs.
Die Stabilisatorsubstanz unterscheidet sich stofflich, in ih¬ rer Wirkung und/oder in Bezug auf die bevorzugt gewählte Konzentration von den herkömmlichen Kryoprotektiva. Im Unterschied zur Stabilisatorsubstanz wird durch herkömmliche The stabilizer substance materially different, in ih ¬ rer effect and / or with respect to the preferred concentration selected from the conventional cryoprotectants. In contrast to the stabilizer substance is by conventional
Kryoprotektiva die Zahl der Nukleationskeime gezielt erhöht, um die Bildung einer möglichst großen Anzahl von Eiskristallen beim Einfrieren zu fördern. Mit der Anzahl von Eiskris¬ tallen verringert sich aber auch deren Chance auf Größen¬ wachstum, so dass durch herkömmliche Kryoprotektiva große Kristalle verhindert werden. Hierzu wird bei herkömmlichen Kryoprotektiva eine Verteilung und hohe Beweglichkeit im Kon¬ servierungsmedium bis in die Zellen gewünscht. Cryoprotectants targeted increases the number of nucleation to promote the formation of the largest possible number of ice crystals during freezing. With the number of Eiskris ¬ metals, however, also reduces the chance of sizes ¬ growth, so be prevented by conventional cryoprotectants large crystals. For this purpose, a distribution and high mobility in the Kon ¬ Servierungsmedium is desired in conventional cryoprotectants to the cells.
Vorzugsweise ist die Stabilisatorsubstanz aus mindestens ei¬ ner der Substanzgruppen ausgewählt, die langkettige ungeladene Polymere mit einem Molekulargewicht größer als 500 g/mol, insbesondere größer als 1000 g/mol, Monosaccharide, Di- und Oligosaccharide, Polysaccharide, Stärke-Derivate, wie z. B. Stärke-Hydrolyse-Produkte, Zuckeralkohole, wasserlösliche Polymere, Kolloide (Nanopartikeldispersionen) , insbesondere mit Silber-, Gold, Diamant- und/oder Nanotube-Partikeln, Dendri- mere, Polykationen, und Polyanionen umfassen. Als besonders geeignet erwiesen sich langkettige Polysaccharide, insbeson¬ dere aus Saccharose und Epichlorhydrin hergestellte hydrophi¬ le Copolymerisate (Ficoll, reg. Name), und/oder Polivinylpyr- rolidone, insbesondere mit Polyvinylpyrrolidon beschichtetes Kieselgel (Percoll, reg. Name), mit einer molekularen Masse zwischen 2.000 und mehreren Mio. g/mol, Nanopartikeldispersi¬ onen, insbesondere Silber-, Gold, Diamant- und/oder Nanotube- Partikel, sind besonders vorteilhaft, da sie geeignet sind, die Wärmeleitfähigkeit des Konservierungsmediums zu verrin- gern. Vorteilhafterweise ist die Stabilisatorsubstanz biokompatibel, so dass die Zellen in der biologischen Probe durch die Stabilisatorsubstanz nicht ungünstig beeinflusst werden. Preferably, the stabilizer substance is selected from at least ei ¬ ner of the substance groups, the long-chain uncharged polymers having a molecular weight greater than 500 g / mol, in particular greater than 1000 g / mol, monosaccharides, di- and Oligosaccharides, polysaccharides, starch derivatives, such as. Starch hydrolysis products, sugar alcohols, water-soluble polymers, colloids (nanoparticle dispersions), in particular with silver, gold, diamond and / or nanotube particles, dendrimers, polycations, and polyanions. Particularly suitable are long-chain polysaccharides (Name Ficoll, reg.) Proved insbeson ¬ particular hydrophi ¬ le copolymers produced from sucrose and epichlorohydrin, and / or Polivinylpyr- rolidone, in particular with polyvinylpyrrolidone-coated silica gel (Percoll, reg. Name), with a Molecular mass between 2,000 and several million g / mol, Nanopartikeldispersi ¬ onen, especially silver, gold, diamond and / or nanotube particles, are particularly advantageous because they are suitable to reduce the thermal conductivity of the preservative medium. Advantageously, the stabilizer substance is biocompatible so that the cells in the biological sample are not adversely affected by the stabilizer substance.
Die Konzentration (% = vol.%) der Stabilisatorsubstanz vor- zugsweise geringer als 30 %, besonders bevorzugt geringer als 20 %, insbesondere geringer als 10 %, wie z. B. geringer als 3 % oder geringer als 1 % ist. Eine bevorzugte Mindestkonzentration ist 0,1 %. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfin¬ dung ist die Stabilisatorsubstanz im Konservierungsmedium außerhalb der biologischen Zellen angeordnet. Die Zellen bleiben frei von der Stabilisatorsubstanz, was Vorteile für die Vitalität nach dem Auftauen der Probe hat. The concentration (% = vol.%) Of the stabilizer substance preferably less than 30%, particularly preferably less than 20%, in particular less than 10%, such. B. less than 3% or less than 1%. A preferred minimum concentration is 0.1%. According to a further preferred embodiment of the dung OF INVENTION ¬ the stabilizer substance in the preservation medium outside of the biological cells is arranged. The cells remain free of the stabilizer substance, which has advantages for the vitality after thawing the sample.
Ein weiterer Vorteil der Stabilisatorsubstanz kann darin be¬ stehen, dass diese unter der Wirkung des erhöhten Druckes und der verringerten Temperatur bei der Kryokonservierung ihre Eigenschaften, insbesondere Struktur und/oder Molekularge- wicht ändert. Beispielsweise können Moleküle der Stabilisatorsubstanz in Bruchstücke zerlegt werden, so dass sie in das Innere der Zellen eindiffundieren können, um dort eine zusätzliche kryoprotektive Wirkung zu erzielen. Another advantage of the stabilizer substance therein may be stand ¬ that this under the action of elevated pressure and reduced temperature in the cryopreservation their properties, in particular structure and / or molecular weight changes. For example, molecules of the stabilizer substance can be broken down into fragments so that they can diffuse into the interior of the cells in order to achieve an additional cryoprotective effect there.
Es wird betont, dass bei Zusatz der Stabilisatorsubstanz zum Konservierungsmedium es nicht notwendig ist, dass im Druckbe¬ hälter ein erhöhter Druck aufrecht erhalten wird, bis die biologische Probe den Übergang von der unterkühlten Schmelze zum flüssigen Zustand erreicht. In diesem Fall kann der Druck bereits vor Erreichen des Übergangs abfallen, insbesondere bis zum Atmosphärendruck reduziert werden. It is emphasized that in addition of the stabilizer substance to the preservation medium, it is not necessary that an elevated pressure is maintained in the Druckbe ¬ container until the biological sample reaches the transition from the melt to the supercooled liquid state. In this case, the pressure may drop even before reaching the transition, in particular reduced to atmospheric pressure.
Gemäß einer bevorzugten Variante des o. g. dritten Gesichtspunkts der Erfindung wird somit ein Verfahren zur Erwärmung einer biologischen Probe, umfassend biologische Zellen und ein Konservierungsmedium in einem vitrifizierten Zustand, die mit einer glasartigen Phase in einem Druckbehälter angeordnet ist, bereitgestellt, wobei die Temperatur des Druckbehälters und der biologischen Probe erhöht wird, bis die biologische Probe einen den flüssigen Zustand erreicht, und wobei das Konservierungsmedium die mindestens eine Stabilisatorsubstanz enthält, die geeignet ist, bei der Erhöhung der Temperatur der biologischen Probe, vorzugsweise bis zu dem Übergang in den flüssigen Zustand, den glasartigen Zustand zu stabilisieren . According to a preferred variant of the o. G. Thus, in a third aspect of the invention, there is provided a method of heating a biological sample comprising biological cells and a preservative medium in a vitrified state disposed in a glassy phase in a pressure vessel, wherein the temperature of the pressure vessel and the biological sample is increased; until the biological sample reaches a liquid state, and wherein the preservation medium contains the at least one stabilizer substance capable of stabilizing the glassy state upon elevation of the temperature of the biological sample, preferably until transition to the liquid state.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird bei Erreichen des Übergangs vom glasartigen Zustand der un- terkühlten Schmelze hin zum flüssigen Zustand der Druck im Druckbehälter reduziert. Damit wird eine Schädigung der biologischen Probe nach Erreichen des flüssigen Zustands minimiert. Besonders bevorzugt wird der Druck im Druckbehälter instantan, d. h. insbesondere stufenförmig und mit vernachlässigbarer Verzögerung, reduziert. According to a preferred embodiment of the invention, upon reaching the transition from the glassy state of the subcooled melt to the liquid state, the pressure in the pressure vessel is reduced. This minimizes damage to the biological sample after reaching the liquid state. Particularly preferred is the pressure in the pressure vessel instantaneously, ie in particular stepped and with negligible delay, reduced.
Die Druckreduzierung kann erzielt werden, indem der Druckbe- hälter freigegeben, z. B. geöffnet, wird, so dass ein Druckausgleich mit einem äußeren atmosphärischen Druck erreicht wird. Vorteilhafterweise ist eine Freigabe des Druckbehälters jedoch nicht zwingend erforderlich. Vielmehr kann die Druckreduzierung auch durch eine Kontraktion der biologischen Pro- be am Übergang von der unterkühlten Schmelze zum flüssigenThe pressure reduction can be achieved by the pressure container released, z. B. is opened, so that a pressure equalization is achieved with an external atmospheric pressure. Advantageously, however, a release of the pressure vessel is not mandatory. Rather, the pressure reduction may also be due to a contraction of the biological sample at the transition from the supercooled melt to the liquid
Zustand erzeugt werden. Das Volumen der Probe kann sich entsprechend den unten unter Bezug auf die Figuren 1 bis 4 erläuterten Prozesse verringern, so dass der Druck im Druckbehälter abfällt. Condition are generated. The volume of the sample may decrease according to the processes explained below with reference to FIGS. 1 to 4, so that the pressure in the pressure vessel drops.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung beträgt der erhöhte Druck oberhalb des Atmosphärendrucks mindestens 100 MPa, insbesondere mindestens 150 MPa und/oder höchstens 300 MPa, insbesondere höchstens 250 MPa. Diese Druckbereiche haben sich als besonders vorteilhaft für einen schnellen Übergang vom glasartigen Zustand zum flüssigen Zustand und umgekehrt erwiesen. According to a further preferred embodiment of the invention, the elevated pressure above the atmospheric pressure is at least 100 MPa, in particular at least 150 MPa and / or at most 300 MPa, in particular at most 250 MPa. These pressure ranges have proven to be particularly advantageous for a rapid transition from the glassy state to the liquid state and vice versa.
Weitere Einzelheiten und Vorteile der Erfindung werden im Folgenden unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben. Es zeigen: Further details and advantages of the invention will be described below with reference to the accompanying drawings. Show it:
Figuren 1 bis 4: Phasendiagramme mit Illustrationen verschiedener Phasen von Wasser, und Figures 1 to 4: phase diagrams with illustrations of different phases of water, and
Figur 5: Ausführungsformen der erfindungsgemäßen FIG. 5: Embodiments of the invention
KryokonservierungsVorrichtung; Figur 6: grafische Darstellungen verschiedener Varianten der Druck- und Temperatur- Zeitfunktionen; Figuren 7 bis 11: experimentelle Ergebnisse, welche die KryokonservierungsVorrichtung; Figure 6: graphical representations of different variants of the pressure and temperature-time functions; FIGS. 7 to 11: experimental results showing the
Wirkung eines Kryoprotektivums oder einer Stabilisatorsubstanz illustrieren; Figur 12: schematische Schnittdarstellungen verschiedener Varianten eines Druckbehälters, der mit Wärmeleit- und/oder Kühlelementen ausgestattet ist;  Illustrate the effect of a cryoprotectant or stabilizer substance; Figure 12: schematic sectional views of different variants of a pressure vessel, which is equipped with Wärmeleit- and / or cooling elements;
Figuren 13 bis 19: weitere Ausführungsformen erfindungsgemäßer Kryokonservierungsvorrichtungen und deren Verwendung; FIGS. 13 to 19 show further embodiments of cryopreservation devices according to the invention and their use;
Figuren 20 bis 28: weitere Ausführungsformen erfindungsgemäßer Kryokonservierungsvorrichtungen, bei denen der Druckbehälter die Gestalt eines flachen Zylinders aufweist; FIGS. 20 to 28 show further embodiments of cryopreservation devices according to the invention, in which the pressure vessel has the shape of a flat cylinder;
Figur 29: eine schematische Illustration einer Optikeinheit in der Behälterwand eines Druckbehälters ; Figure 29 is a schematic illustration of an optical unit in the container wall of a pressure vessel;
Figur 30: eine weitere Ausführungsform der erfindungsgemäßen KryokonservierungsVorrichtung und deren Verwendung; FIG. 30 shows a further embodiment of the cryopreservation device according to the invention and its use;
Figuren 31 bis 35: weitere Ausführungsformen erfindungsgemä¬ ßer Kryokonservierungsvorrichtungen, bei denen der Druckbehälter die Gestalt einer Kugel oder eines Zylinders aufweist; Figur 36: eine weitere Ausführungsform der erfin- dungsgemäßen Kryokonservierungsvorrich- tung; Figures 31 to 35 show further embodiments of invention shown SSER Kryokonservierungsvorrichtungen, wherein the pressure container has the shape of a sphere or cylinder; FIG. 36 shows a further embodiment of the cryopreservation device according to the invention;
Figuren 37 bis 39: weitere Ausführungsformen erfindungsgemäßer Kryokonservierungsvorrichtungen, bei denen im Innenraum des Druckbehälters ein Substrat angeordnet ist; FIGS. 37 to 39 show further embodiments of inventive cryopreservation devices in which a substrate is arranged in the interior of the pressure vessel;
Figuren 40 und 41: weitere Ausführungsformen erfindungsgemäßer Kryokonservierungsvorrichtungen mit einer Segmentierung des Druckbehälter- Innenraums; und FIGS. 40 and 41 show further embodiments of inventive cryopreservation devices with a segmentation of the pressure vessel interior; and
Figur 42: eine weitere Ausführungsform der erfin- dungsgemäßen Kryokonservierungsvorrich- tung und deren Verwendung. Die Erfindung wird im Folgenden zunächst durch eine Erläute¬ rung von Erkenntnissen der Erfinder und anschließend durch die Angabe von Einzelheiten der Kryokonservierungsvorrichtung und der Verfahrensführung beschrieben. Es wird betont, dass die folgenden theoretischen Betrachtungen als Ansatz zur Er- klärung der hervorragenden Vitalitätsraten dienen, die mit der erfindungsgemäßen Kryokonservierung erzielt wurden. Die Ausführung der Erfindung ist jedoch nicht an die Vollständigkeit und Richtigkeit der theoretischen Betrachtungen gebunden . Theoretische Betrachtungen der Phasendiagramme wässriger Sys¬ teme und der Wirkung von Stabilisatorsubstanzen FIG. 42 shows a further embodiment of the cryopreservation device according to the invention and its use. The invention will be described in the following first through a Erläute ¬ tion of findings of the inventors, and then by specifying details of Kryokonservierungsvorrichtung and the process control. It is emphasized that the following theoretical considerations serve as an approach to explain the excellent vitality rates achieved with the cryopreservation of the present invention. However, the embodiment of the invention is not bound to the completeness and accuracy of the theoretical considerations. Theoretical considerations of the phase diagrams of aqueous Sys ¬ tems and the effect of stabilizer substances
Die Kryokonservierung wird bisher empirisch und unter verein- fachenden Annahmen beschrieben. Der empirische Ansatz resul¬ tiert aus der Komplexität der Zusammensetzung des Zytoplasmas der biologischen Zellen. Da das Zytoplasma Hunderte von Proteinen, Nukleotide und eine Vielzahl von Kohlenhydraten, Ionen zahlreicher Elemente, nanoskalige Systeme wie Membranen, Organellen und Strukturelemente, wie das Zytoskelett, und gebundenes Wasser an Oberflächen enthält, sind Phasendiagramme des Wassers nur beschränkt nutzbar. Dennoch wird hier zu Illustrationszwecken bei der Erläuterung der Erkenntnisse der Erfinder auf Phasendiagramme des Wassers Bezug genommen, die in den Figuren 1, 2 und 4 dargestellt sind. Cryopreservation has so far been described empirically and under simplifying assumptions. The empirical approach resul ¬ advantage of the complexity of the composition of the cytoplasm of the biological cells. Since the cytoplasm contains hundreds of proteins, nucleotides and a variety of carbohydrates, ions of numerous elements, nanoscale systems such as membranes, organelles and structural elements, such as the cytoskeleton, and bound water on surfaces, phase diagrams of the water are of limited use. Nevertheless, for illustrative purposes, the inventors' explanation is referred to phase diagrams of the water shown in FIGS. 1, 2 and 4.
Das Druck-Temperatur-Zustandsdiagramm des Wassers (Figur 1, Quelle: Jackson et al., J. Phys . Chem. (1997), zitiert in www.wikipedia.de, Stichwort Wasser) zeigt, dass bei Abkühlung unter Normaldruck (0,1 MPa = 0,0001 GPa, Linie auf der Ordi- natenachse) so genanntes Ih (hexagonales Eis) entsteht. Dieses nimmt gegenüber der flüssigen Phase ein größeres Volumen ein (ca. 1/10), was in umgrenzten Volumina zu mechanischen Spannungen (Druck) führt. Hinzu kommt bei der Eisbildung eine Entmischung von Vielkomponentenlösungen (Ionen und andere molekulare Bestandteile werden aufkonzentriert ) , die im Zyto¬ plasma sonst nicht auftritt und daher vermieden werden sollte . Wie das Phasendiagramm der Figur 1 zeigt, existieren weitere Eisstrukturen, von denen man weiß, dass sie bei höherem Druck die genannte Volumenzunahme nicht aufweisen. Es handelt sich dann aber um Drücke (z. B. > 0.1 GPa), unter denen biologi¬ sche Objekte im ungefrorenen Zustand zerstört werden würden. Figur 2 zeigt in erweiterten Zustandsdiagrammen des Wassers und seiner metastabilen Zustände, dass Möglichkeiten bestehen, die Eisbildung zu beeinflussen. Durch Zugabe von Stoffen kann der Gefrierpunkt z. B. stabil erniedrigt werden (kolli- gative Effekte) . Das ist das Prinzip, das Organismen in der Natur nutzen. Sie gefrieren so erst z. B. bei -10 °C oder 20° C. Des Weiteren kann unter bestimmten Bedingungen eine wässrige Lösung unterkühlt werden. Eis schmilzt bei reinem Wasser und Normaldruck bei 0°C, es gefriert aber nicht bei dieser Temperatur. Dafür ist eine Nukleation erforderlich. Bei so genannter homogener Nukleation ist das Gefrieren ein stochastischer Vorgang, der durch kleinste Störungen ausgelöst wird. In beiden Fällen erweitert sich der Bereich der flüssigen Phase bis hinunter zu -50° bis -70°C. Bei Betrachtung des Druckbereichs bis 300 MPa = 3.000 atm an (Figur 2, rechte Seite) , so ergibt sich: The pressure-temperature-state diagram of the water (Figure 1, Source: Jackson et al., J. Phys. Chem. (1997), cited in www.wikipedia.de, keyword water) shows that when cooled under normal pressure (0, 1 MPa = 0.0001 GPa, line on the ordinate axis) so-called Ih (hexagonal ice) is formed. This takes up a larger volume than the liquid phase (about 1/10), which leads to mechanical stresses (pressure) in circumscribed volumes. Addition of ice formation at a separation of multi-component solutions (ions and other molecular components are concentrated), which is not otherwise occurs in cyto ¬ plasma and should therefore be avoided. As the phase diagram of Figure 1 shows, there are other ice structures which are known not to exhibit the stated volume increase at higher pressure. It is then but to pressures (z. B.> 0.1 GPa), would be among those biological ¬ cal properties destroyed in the unfrozen state. FIG. 2 shows in expanded state diagrams of the water and its metastable states that there are possibilities for influencing ice formation. By adding substances, the freezing point z. B. be lowered stable (colligative effects). That's the principle that organisms use in nature. They freeze so z. B. at -10 ° C or 20 ° C. Furthermore, under certain conditions, an aqueous solution can be supercooled. Ice melts with pure water and normal pressure at 0 ° C, but it does not freeze at this temperature. This requires nucleation. In so-called homogeneous nucleation, freezing is a stochastic process that is triggered by the smallest disturbances. In both cases, the liquid phase extends down to -50 ° to -70 ° C. Looking at the pressure range up to 300 MPa = 3,000 atm (Figure 2, right side), we get:
1. Bis 200 MPa liegt sogenanntes LDL - (Low Density Liquid, unterkühlte Flüssigkeit) Wasser in seinen Aggre- gatszuständen vor, das all die bei Normaldruck auftretenden Anomalien aufweist. 1. Up to 200 MPa, so-called LDL (Low Density Liquid) water is present in its aggregate states, which has all the anomalies occurring at atmospheric pressure.
2. Darüber entstehen HDL -(High Density Liquid) Zustände, die möglicherweise für die Kryokonservierung günstiger wären. Es handelt sich aber um unphysiologisch hohe Drücke (in der Tiefsee werden maximal 100 MPa erreicht) .  2. This creates HDL (High Density Liquid) conditions which may be more favorable for cryopreservation. However, these are unphysiologically high pressures (in the deep sea a maximum of 100 MPa is reached).
Bei den metastabilen Zuständen findet man bei einer Temperatur von etwa 136 K = -137 °C eine Grenztemperatur unterhalb der ein Glaszustand des Wassers auch bei physiologischen Drücken eingenommen werden könnte. Wasser erstarrt dann wie Glas, nämlich amorph, d.h. ohne Kristallbildung. Die Wassermoleküle bleiben dann an der Stelle, wo sie sich gerade befinden. Dies ist ein metastabiler Zustand. Ihn zu erreichen, ist der Wunschzustand, den man beim Tieffrieren biologischer Objekte anstrebt. Er wird als „Vitrifizierung" bezeichnet. Die Vitrifizierung setzt bei der raschen Fluktuation der Wassermoleküle eine sehr hohe Abkühlrate (>106 °/s) voraus, die bei der Dimension einer Zelle (>10 μπι) bereits durch die begrenzte Wärmeleitfähigkeit des Wassers nicht mehr erreichbar ist (max. einige 104o/s). Mit zunehmender Größe der einzufrierenden Objekte wird der Kühlratenabstand immer dramatischer (viele Zehnerpotenzen) , so dass eine echte Vitrifizie- rung (Bildung einer glasartigen Phase ohne Zusätze) bisher nicht möglich ist. In the metastable states, at a temperature of about 136 K = -137 ° C, a limit temperature is found below which a glassy state of the water could be taken even at physiological pressures. Water then solidifies like glass, namely amorphous, ie without crystal formation. The water molecules then stay where they are. This is a metastable state. To reach him, is the desired state, which one strives for when deep-freezing biological objects. It is referred to as "vitrification." Vitrification requires a very high cooling rate (> 10 6 ° / s) in the case of the rapid fluctuation of the water molecules, but not the limited thermal conductivity of the water in the case of a cell (> 10 μπι) more accessible (max. some 10 4o / s). with increasing size of the frozen objects of cooling rates distance ever more dramatic (many orders of magnitude) is so that a real Vitrifizie- tion (formation of a glassy phase without additives) previously not possible.
Die Erfinder haben festgestellt, dass aufgrund der Anomalie des Wassers im LDL-Bereich der Gefrierpunkt allerdings auch über Druckerhöhung erniedrigt werden kann. Dieser Prozess kehrt sich exakt beim Übergang von LDL zu HDL um, so dass et¬ wa 200 MPa die bevorzugte Druckobergrenze bilden, die für eine Gefrierpunktserniedrigung noch wirksam ist. Danach steigt der Gefrierpunkt, wie in jeder anderen Flüssigkeit normaler- weise, mit steigendem Druck wieder an. The inventors have found that due to the anomaly of the water in the LDL range, the freezing point, however, can also be lowered by increasing the pressure. This process is reversed precisely at the transition from LDL to HDL in a way, that wa et ¬ 200 MPa form the preferred upper pressure limit, which is still effective for lowering the freezing point. Thereafter, the freezing point, as in any other liquid, normally increases again with increasing pressure.
Der Weg in die Vitrifizierung (glasartige Phase) ist bei die¬ sem Druck der Kürzeste (vgl. Figur 2, rechtes Diagramm, ver¬ tikale Linie in der Mitte bei 0,2 GPa) , nur noch etwas mehr als 100 Grad müssen rasch durchlaufen werden, weshalb man das Schockgefrieren anwendet. Ein seit langem bestehendes Paradoxon der Kryokonservierung ist, dass bei Druck-Schock- Gefrieren die Strukturen der Zellen am Besten erhalten sind, es aber nach dem Auftauen keine überlebenden Zellen mehr gibt. Andererseits ist bekannt, dass bei langsamer Abkühlung mit selbst mikroskopisch sichtbarer Eisdomänenbildung und Schädigung der Zellen (Membranleckagen) es zu Überlebensraten von über 90% kommen kann. Die Erfinder haben festgestellt, dass der Grund dafür vor allem im Auftauprozess zu suchen ist. Hier durchläuft man nochmals den kritischen Bereich von -137°C bis zum Schmelzpunkt (vielleicht -5 bis -15°C), so dass die beim Einfrieren vermiedene oder verringerte Ih- Eisbildung doch noch erfolgt. Selbst HD-Eis wandelt sich bei niedrigem Druck schnell in die LD-Eisform um. Hinzu kommt noch, dass entsprechend der thermischen Stöße (k*T) ab The way in vitrification (glassy phase) is in the ¬ sem pressure of the shortest (see FIG. 2, right panel, ver ¬ Tikale line in the center at 0.2 GPa), only a little more than 100 degrees must undergo rapid why you use shock freezing. A long-standing paradox of cryopreservation is that in pressure-shock freezing, the structures of the cells are best preserved, but there are no surviving cells after thawing. On the other hand, it is known that with slow cooling with even microscopically visible Eisdomänenbildung and damage to the cells (membrane leaks) it can lead to survival rates of over 90%. The inventors have found that the reason to look for it mainly in the thawing process is. Again, it goes through the critical range from -137 ° C to the melting point (perhaps -5 to -15 ° C), so that the avoided or reduced Ih- ice formation still occurs during freezing. Even high-pressure ice quickly transforms into low-pressure ice at low pressure. In addition, according to the thermal shocks (k * T) from
-100°C mit steigender Temperatur die Wahrscheinlichkeit des Platzwechsels eines Wassermoleküls auch in der gefrorenen Phase relevant ist. Das führt zum so genannten „migratori- sehen Wachstum" großer Eiskristalle, da diese auf Kosten der kleineren an Größe gewinnen (aufgrund der Oberflächenspannungsdifferenzen) . Deshalb müssen Langzeitlagerungen unterhalb der Glasübergangstemperatur (-137°C) erfolgen. Doch es gibt noch einen weiteren Weg, die Vitrifizierung oder zumindest eine „Pseudo-Vitrifizierung" zu erreichen, in dem man Additiva zugibt, die zu sehr kleinen Eisdomänen führen. Ein wirklich physiologischer Weg ist auch das nicht, aber er wird seit langem beim Einfrieren benutzt und funktioniert auch bei Normaldruck. -100 ° C with increasing temperature the probability of a change of place of a water molecule is also relevant in the frozen phase. This leads to the so-called "migratory growth" of large ice crystals, as they increase in size at the expense of the smaller ones (due to surface tension differences), so long-term storage must be below the glass transition temperature (-137 ° C), but there is another way to achieve vitrification, or at least a "pseudo-vitrification", by adding additives that lead to very small ice domains. It's not really a physiological path either, but it's been used for a long time in freezing and works well at normal pressure.
Nun besteht prinzipiell noch die Möglichkeit, die Glasübergangstemperatur durch Additiva zu erhöhen. Durch Zugabe von Trehalose lässt sich z. B. die Glasübergangstemperatur bis nahe 0°C verschieben, was für biologische Objekte ideal wäre. Die dafür erforderlichen Konzentrationen der Trehalose liegen jedoch oberhalb jeder physiologischen Verträglichkeit für lebende Zellen. In der Gefrierpunktserniedrigung sind die Gewinne gering (Figur 3, Gefrierpunktserniedrigung und Ver- Schiebung der Glasübergangstemperatur durch Zugabe von Trehalose) , was nahezu für alle derartigen StoffZusätze gilt. In principle, there is still the possibility of increasing the glass transition temperature by adding additives. By adding trehalose can be z. For example, move the glass transition temperature to near 0 ° C, which would be ideal for biological objects. However, the required concentrations of trehalose are above any physiological compatibility for living cells. In the freezing point depression, the profits are low (Figure 3, freezing point depression and shift of the glass transition temperature by addition of trehalose), which is almost true for all such substance additions.
Figur 4 verdeutlicht nochmals, dass man im LD-Bereich beim Abkühlen und Auftauen jeweils einen kritischen Bereich, der in den Diagrammen als „no mans land" bezeichnet wird, durchlaufen muss. Gerade diesen Bereich zu erreichen oder eben die vollständige Vitrifizierung anzustreben, wäre aber die Lösung des Problems gewesen. FIG. 4 illustrates once again that in the LD range, during cooling and thawing, a respective critical region is formed but to reach this area or to seek full vitrification would have been the solution to the problem.
Gemäß einem praktischen Beispiel ist vorgesehen, eine biolo¬ gische Probe in an sich bekannter Weise mit biologischen Zel¬ len und einem Konservierungsmedium bei Raumtemperatur und un¬ ter Atmosphärendruck vorzubereiten. Dem Konservierungsmedium wird mindestens eine Stabilisatorsubstanz vorzugsweise mit einer Konzentration kleiner oder gleich 5 % zugesetzt oder dies erfolgt während des Abkühlvorgangs oder auch erst im tiefkalten Zustand bzw. vor dem Auftauen. Es können aber auch höhere Konzentrationen vorgesehen sein. According to a practical example, there is provided a biolo gical ¬ sample in a known manner to prepare biological cell h ¬ len and a preservation medium at room temperature and un ¬ ter atmospheric pressure. At least one stabilizer substance is preferably added to the preservation medium at a concentration of less than or equal to 5%, or this takes place during the cooling process or else only in the low-temperature state or before thawing. But it can also be provided higher concentrations.
Geeignete Stoffgruppen für die Stabilisatorsubstanz, insbesondere zur Verwendung mit den unten beschriebenen Ausfüh¬ rungsformen der Kryokonservierungsvorrichtung und der Verfa ren zum Abkühlen oder zum Erwärmen biologischer Proben, sin Suitable groups of substances for the stabilizer substance, particularly for use with the below-described exporting ¬ approximately forms of Kryokonservierungsvorrichtung and Verfa ren for cooling or for heating of biological samples, sin
Stoffklasse Substanzbeispiele Substance class examples of substance
Alkohole Ethylenglykol  Alcohols Ethylene glycol
Monosaccharide Glucose  Monosaccharides glucose
Fructose  fructose
Mannose  mannose
Galaktose  galactose
Ribose  ribose
Xylose  xylose
Arabinose  arabinose
sowie nicht natürl  as well as not natural
vorkommende Zucker  occurring sugars
Saccharose (Rohrzu-Sucrose (pipe
Di- und Oligosaccharide cker ) Lactose (Milchzucker) Di- and oligosaccharides cker) Lactose (milk sugar)
Maltose (Malzzucker)  Maltose (malt sugar)
Trehalose  trehalose
Cellobiose  cellobiose
Polyether Polyethylenglycol  Polyether Polyethylene glycol
Molekülmasse 1000 bis  Molecular weight 1000 to
35.000  35,000
Polysaccha Cellulose  Polysaccha cellulose
Hemicellulose  hemicellulose
Amylose  amylose
Glycogen  glycogen
Pektine  pectins
Dextrane (künstlich)  Dextrane (artificial)
Alginate  alginates
Ficoll, insbesondere  Ficoll, in particular
mit einem  with a
Molekulargewicht von  Molecular weight of
2500 g/mol  2500 g / mol
bis 2,5 Mio g/mol  to 2.5 million g / mol
Weitere Medien, mit denen unter Verwendung der unten beschriebenen Ausführungsformen der Kryokonservierungsvorrich- tung und der Verfahren zum Abkühlen oder zum Erwärmen biolo- gischer Proben hervorragende experimentelle Ergebnisse erzielt wurden, sind: Other media with which excellent experimental results have been obtained using the cryopreserving apparatus embodiments described below and the methods for cooling or heating biological samples are:
Dextran Kryomedium nach Kryomedium nach Dextran cryomedium after cryomedium after
Mazur Matsumura  Mazur Matsumura
30% Dextran Ethylen glycol 10% Ethylen glycol 20%  30% dextran ethylene glycol 10% ethylene glycol 20%
(3,23M) (6.5M)  (3,23M) (6.5M)
Acetamide 10.7% e-poly-L-Lysine  Acetamide 10.7% e-poly-L-Lysine
(3,27M) 10%  (3.27M) 10%
Ficoll 70 24%  Ficoll 70 24%
(3,5mM) Sucrose 10.9% Sucrose 25.7% (3.5mm) Sucrose 10.9% sucrose 25.7%
(0, 4M) (0.75M)  (0, 4M) (0.75M)
BSA & Glucose (low  BSA & glucose (low
concentrations )  concentrations)
325 mOsm 3.4 Osm 6.7 Osm  325 mOsm 3.4 Osm 6.7 Osm
In Experimenten der Erfinder hat sich z. B. das Kryomedium nach Mazur mit einem Zusatz von Ethylenglykol und Dextran als vorteilhaft erwiesen. In experiments of the inventors z. As the cryomedium to Mazur with an addition of ethylene glycol and dextran proved advantageous.
Ausführungsformen der Kryokonservierungsvorrichtung und der Verfahren zum Abkühlen oder zum Erwärmen biologischer Proben Embodiments of the cryopreservation device and methods for cooling or heating biological samples
Die Figuren 5A bis 5C zeigen Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Kryokonservierungsvorrichtung 100, die einen Druckbehälter 10 und eine Stelleinrichtung 20 aufweist. Der Druckbehälter 10 weist eine Behälterwand 11 in Gestalt eines Rohres (Röhrchen) auf, dessen Inneres den Innenraum 12 des Druckbehälters 10 bildet. Die Stelleinrichtung 20 umfasst Druckeinstellelemente, die jeweils durch Druckschrauben 21 an den axialen Enden des Druckbehälters 10 gebildet werden. Eine dritte Druckschraube 21 kann radial abstehend an der Behälterwand 11 z. B. entlang der halben axialen Länge des Druckbehälters 10 vorgesehen sein (Figur 5B) . FIGS. 5A to 5C show embodiments of the cryopreservation device 100 according to the invention which has a pressure vessel 10 and an adjusting device 20. The pressure vessel 10 has a container wall 11 in the form of a tube (tube), the interior of which forms the interior 12 of the pressure vessel 10. The adjusting device 20 comprises Druckeinstellelemente, which are each formed by pressure screws 21 at the axial ends of the pressure vessel 10. A third pressure screw 21 may be radially projecting on the container wall 11 z. B. along the half axial length of the pressure vessel 10 may be provided (Figure 5B).
Der Druckbehälter 10 hat vorzugsweise einen Außendurchmesser, der kleiner oder gleich 5 mm, besonders bevorzugt kleiner oder gleich 2 mm oder 1 mm, z. B. 0,5 mm beträgt. Die axiale Länge des Druckbehälters 10 ist z. B. im Bereich von 10 mm bis 20 cm gewählt. Die Dicke der Behälterwand 11 beträgt z. B. 1/4 bis 1/10 des Außendurchmessers des Druckbehälters. Die Behälterwand 11 ist z. B. aus Edelstahl, Aluminium, Gold oder Silber hergestellt. Alternativ können weitere Metalle oder Legierungen verwendet werden, die eine hohe Wärmeleitfähig- keit für eine schnelle Abkühlung im Innenraum 12 und eine Druckbeständigkeit für Drucke bis zu z. B. 200 MPa aufweisen. Des Weiteren kann der Druckbehälter aus einem Kunststoff oder einem Kompositmaterial, z. B. Kunststoff-Metall-Komposit , hergestellt sein. The pressure vessel 10 preferably has an outer diameter that is less than or equal to 5 mm, more preferably less than or equal to 2 mm or 1 mm, z. B. is 0.5 mm. The axial length of the pressure vessel 10 is z. B. in the range of 10 mm to 20 cm. The thickness of the container wall 11 is z. B. 1/4 to 1/10 of the outer diameter of the pressure vessel. The container wall 11 is z. B. made of stainless steel, aluminum, gold or silver. Alternatively, other metals or alloys may be used which have a high thermal conductivity speed for rapid cooling in the interior 12 and a pressure resistance for prints up to z. B. 200 MPa. Furthermore, the pressure vessel made of a plastic or a composite material, for. As plastic-metal composite, be made.
Zur Aufnahme der Druckschrauben 21 weist der Druckbehälter 10 an seinen axialen Enden Innengewinde auf. Für die Aufnahme der radial abstehenden Druckschraube 21 (Figur 5B) ist die Behälterwand 11 mit einem Gewindeansatz versehen. Die Druckschrauben 21 können zusätzlich als Entlüftungsschraube verwendet werden. Abweichend von den Illustrationen der Figur 5 kann als Stelleinrichtung eine einzige Druckschraube 21 vorgesehen sein (siehe z. B. Figur 14A) . For receiving the pressure screws 21, the pressure vessel 10 at its axial ends on internal thread. For receiving the radially projecting pressure screw 21 (FIG. 5B), the container wall 11 is provided with a threaded projection. The pressure screws 21 can also be used as a bleed screw. In contrast to the illustrations of FIG. 5, a single pressure screw 21 can be provided as the setting device (see, for example, FIG. 14A).
Gemäß Figur 5C kann der Innenraum 12 des Druckbehälters 10 in einzelne Innenraumabschnitte 15 unterteilt sein. Die Segmentierung mit Innenraumabschnitten 15 hat sich als vorteilhaft für die Vitalitätsrate biologischer Zellen erwiesen, die in den mittleren Innenraumabschnitten 15 maximal ist. According to FIG. 5C, the interior 12 of the pressure vessel 10 can be subdivided into individual interior sections 15. The segmentation with interior sections 15 has proven to be advantageous for the vitality rate of biological cells, which is maximum in the central interior sections 15.
Für die Kryokonservierung einer biologischen Probe 1, umfassend z. B. biologische Zellen 2 in einem Konservierungsmedium 3, wird die Probe 1 in den Innenraum 12 des Druckbehälters 10 gefüllt (siehe teilweise durchbrochene Ansicht der Behälterwand 11 in Figur 5A) . Das Konservierungsmedium enthält eine oder mehrere Stabilisatorsubstanzen, wie z. B. Dextran mit einer Konzentration von 30% gemischt mit 10% Ethylenglykol . Wenn der Innenraum 12 vollständig gefüllt ist, werden die Druckschrauben 21 so geschlossen, dass der Innenraum 12 blasenfrei ist. Um den Innenraum blasenfrei zu füllen, muss die Innenseite der Behälterwand 11 von der biologischen Probe 1 vollständig benetzt sein. Hierzu kann die Innenseite der Be¬ hälterwand 11 hydrophil beschichtet sein. Des Weiteren er- folgt eine Entlüftung über eine der Druckschrauben 21. Durch Eindringen der Druckschrauben 21 kann bei Bedarf schon bei Raumtemperatur ein erhöhter Druck im Innraum 11 des Druckbehälters 10, z. B. im Bereich von 0,1 MPa bis 300 MPa einge- stellt werden. Die Höhe des Druckes kann durch Kalibrierungs¬ tests oder unter Verwendung einer Sensoreinrichtung 16 (siehe unten) ermittelt werden. Optional kann in oder nach dieser Phase durch ein Zusammenquetschen der Behälterwand 11 die Segmentierung in Innenraumabschnitte 15 (Figur 5C) vorgesehen sein. For the cryopreservation of a biological sample 1, comprising e.g. B. biological cells 2 in a preservation medium 3, the sample 1 in the interior 12 of the pressure vessel 10 is filled (see partially open view of the container wall 11 in Figure 5A). The preservation medium contains one or more stabilizer substances, such as. B. Dextran at a concentration of 30% mixed with 10% ethylene glycol. When the inner space 12 is completely filled, the pressure screws 21 are closed so that the inner space 12 is bubble-free. In order to fill the interior bubble-free, the inside of the container wall 11 must be completely wetted by the biological sample 1. For this purpose, the inside of Be ¬ hälterwand 11 may be coated hydrophilic. Furthermore, follows a vent on one of the pressure screws 21. By penetrating the pressure screws 21 may, if necessary, even at room temperature, an elevated pressure in the Innraum 11 of the pressure vessel 10, z. B. in the range of 0.1 MPa to 300 MPa are set. The amount of pressure can be determined by calibration ¬ tests or by using a sensor device 16 (see below). Optionally, in or after this phase, the segmentation in interior sections 15 (FIG. 5C) can be provided by squeezing the container wall 11.
Zur Kryokonservierung der biologischen Proben wird die gefüllte Kryokonservierungseinrichtung 100 im Kühlbad einer Kühlvorrichtung (in Figur 5 nicht gezeigt, siehe z. B. Figur 13) abgekühlt. Hierzu wird der Druckbehälter vorzugsweise waagerecht in das Kühlbad eingetaucht, so dass die Abkühlung entlang der gesamten axialen Länge des Druckbehälters 10 im Wesentlichen gleichzeitig erfolgt. Das Kühlbad umfasst z. B. flüssiges Propan, flüssigen Stickstoff oder ein anderes ver- flüssigtes Gas. For cryopreservation of the biological samples, the filled cryopreservation device 100 is cooled in the cooling bath of a cooling device (not shown in FIG. 5, see, for example, FIG. For this purpose, the pressure vessel is preferably immersed horizontally in the cooling bath, so that the cooling takes place substantially simultaneously along the entire axial length of the pressure vessel 10. The cooling bath comprises z. As liquid propane, liquid nitrogen or other liquefied gas.
Beim Eintauchen in das Kühlbad erfolgt zuerst eine Eisbildung an der Innenseite der Behälterwand 11. Da zuerst die kristalline Phase gebildet wird, erfolgt eine Expansion, die eine Druckerhöhung im Innenraum bis zu einem Enddruck von 200 MPa ergibt. Oberhalb dieses Druckes ist ein weiteres Eiswachstum ausgeschlossen, so dass der Rest der biologischen Probe 1 in einen glasartigen (vitrifizierten) Zustand übergeht oder zu¬ mindest keine hexagonal kristalline Phase aufweist. When immersed in the cooling bath, ice formation first takes place on the inside of the container wall 11. Since the crystalline phase is first formed, an expansion takes place, which results in an increase in pressure in the interior up to a final pressure of 200 MPa. Above this pressure, a further ice growth is excluded, so that the remainder of the biological sample 1 passes into a glassy (vitrified) state or ¬ least no hexagonal crystalline phase has.
Wenn die Kryokonservierungsvorrichtung 100 im Kühlbad die Kryokonservierungstemperatur , z. B. -197 °C, erreicht hat, kann die weitere Kryokonservierung im Kühlbad oder in einem Lagerbehälter (nicht dargestellt) erfolgen, der durch flüssi- gen Stickstoff oder durch Dampf des flüssigen Stickstoffs auf eine Temperatur von z. B. -140 °C gekühlt ist. When the cryopreservation device 100 in the cooling bath, the cryopreservation temperature, z. B. -197 ° C, the further cryopreservation in the cooling bath or in a storage container (not shown) can take place, which by liquid nitrogen or by vapor of the liquid nitrogen to a temperature of, for. B. -140 ° C is cooled.
Zur vitalitätserhaltenden Erwärmung der biologischen Probe 1 wird die Kryokonservierungsvorrichtung 100 in ein HeizbadFor vitality-preserving heating of the biological sample 1, the cryopreservation device 100 is placed in a heating bath
(Flüssigkeitsbad mit einer Temperatur oberhalb von 0 °C) , umfassend z. B. Wasser, Alkohol oder ein Öl, eingetaucht. Das Eintauchen erfolgt ebenfalls vorzugsweise waagerecht und mit hoher Geschwindigkeit, so dass der erhöhte Druck im Druckbe- hälter 10 so lange erhalten bleibt, bis das gebildete kristalline Eis schmilzt. Anschließend sinkt der Druck sprung¬ haft auf z. B. 0,1 MPa ab. (Liquid bath at a temperature above 0 ° C), comprising, for. As water, alcohol or an oil immersed. The immersion is also preferably carried out horizontally and at high speed, so that the increased pressure in the pressure vessel 10 is maintained until the crystalline ice formed melts. Subsequently, the pressure jump ¬ decreases to z. B. 0.1 MPa.
Die Figuren 6A bis 6D zeigen vier typische Temperatur- und Druck-Zeitfunktionen, wie sie bei der Kryokonservierung (lin¬ ker Teil der Kurven) oder bei dem Auftauen (rechter Teil der Kurven) mit der Kryokonservierungsvorrichtung 100 gemäß den hier erläuterten Ausführungsformen der Erfindung realisiert werden können. Figur 6A zeigt beispielsweise, wie beim Ein- frieren zunächst der Druck erhöht wird. Hierzu werden z. B. die Druckschrauben 21 gemäß Figur 5 verwendet. Erst nach Erreichen des Druckes von 200 MPa erfolgt die Absenkung der Temperatur durch das Eintauchen (Einwerfen) der Kryokonservierungsvorrichtung 100 in das Kühlbad. Beim Auftauen kann umgekehrt zunächst eine Druckentlastung und anschließend eine Erwärmung der biologischen Probe auf Raumtemperatur vorgese¬ hen sein. Figur 6B zeigt die entgegengesetzte Variante, bei der bei der Kryokonservierung zunächst die Temperatur abgesenkt und anschließend der Druck aufgebaut wird. In diesem Fall werden die Druckschrauben 21 erst nach Erreichen der Kryokonservierungstemperatur von z. B. - 200 °C betätigt. Beim Auftauen kann eine Druckentlastung während des Tempera¬ turanstiegs vorgesehen sein. Figur 6C zeigt eine kompliziertere Temperatur-Zeitfunktion, die in Abhängigkeit von den konkreten Konservierungsbedingungen gewählt werden kann. Mit der erfindungsgemäßen Kryokonservierungsvorrichtung 100 lässt sich auch ein Druck-Temperatur-Verlauf realisieren, wie er mit einer Kryokonservierungsvorrichtung ohne Stelleinrichtung gegeben wäre (Figur 6D) , wobei der Druckaufbau unmittelbar nach Unterschreiten des Gefrierpunkts durch die Bildung der kristallinen Phase von Eis in der biologischen Probe gestartet wird. Mit der erfindungsgemäß verwendeten Stelleinrichtung wird die Gestalt der Zeitfunktionen beeinflusst. Gemäß einer weiteren Variante einer Temperatur- und Druck- Zeitfunktion (nicht dargestellt) kann vorgesehen sein, dass während der gesamten Konservierungszeit durchgehend der erhöhte Druck eingestellt ist. Figur 7 zeigt eine Folge von Mikroskopbildern eines Ausschnitts der Probe 1 mit Zellen 2 bei Raumtemperatur, nachdem dem Konservierungsmedium 3 ein Kryoprotektivum zugesetzt wurde. Die Zeitangabe (in Sekunden, s) zeigt die Zeitabhängigkeit nach Zugabe der Stabilisatorsubstanz zu der Probe 1. Es wird deutlich, dass ein erheblicher Schrumpfungsprozess in einer kurzen Zeit erfolgt. Die Erfinder haben gefunden, dass diese Schrumpfung für das Erreichen hoher Vitalitätsraten von Vorteil sein kann. Die Figuren 8 und 9 verdeutlichen die dramatische Schrumpfung der Zellen (hier HeLa-Zellen) nahezu auf das osmotische Restvolumen, die für hohe Vitalitätsraten von Vorteil ist. Die runde Form der Zellen (Figuren 9A bis 9C, links oben) geht vollständig verloren (Figuren 9A bis 9C, rechts und unten) . Die Abnahme des Durchmessers der Zellen wurde mit einem In- vitrogen-Messsystem ermittelt (Diagramm in Figur 8), reflek¬ tiert aber nicht vollständig das osmotische Schrumpfen, da der Anteil der Abweichung von der Kugelform nicht berücksich- tigt wird. Die Zellen schrumpfen folglich stärker als aus dem Diagrammzahlenwert hervorgeht. Figures 6A to 6D show four typical temperature and pressure versus time functions as implemented in the cryopreservation (lin ¬ ker portion of the curves) or at thawing (right part of the curves) with the Kryokonservierungsvorrichtung 100 according to the illustrated herein embodiments of the invention can be. FIG. 6A shows, for example, how the pressure is initially increased during freezing. For this purpose, for. B. the pressure screws 21 shown in FIG 5 used. Only after reaching the pressure of 200 MPa, the temperature is lowered by the immersion (Einwerfen) of Kryokonservierungsvorrichtung 100 in the cooling bath. When thawing a pressure relief, and then heating of the biological sample may be first reverse vorgese ¬ hen to room temperature. FIG. 6B shows the opposite variant, in which the temperature is first lowered during the cryopreservation and then the pressure is built up. In this case, the pressure screws 21 are only after reaching the Kryokonservierungstemperatur of z. B. - 200 ° C actuated. When thawing a pressure relief during the tempera ¬ turan Stieg may be provided. FIG. 6C shows a more complicated temperature-time function, which depends on the concrete preservation conditions can be selected. With the cryopreservation device 100 according to the invention, it is also possible to realize a pressure-temperature curve as would be the case with a cryopreservation device without an adjusting device (FIG. 6D), wherein the pressure build-up immediately after the freezing point has been undershot is due to the formation of the crystalline phase of ice in the biological sample is started. With the adjusting device used according to the invention, the shape of the time functions is influenced. According to a further variant of a temperature and pressure-time function (not shown), it can be provided that the increased pressure is continuously set throughout the entire preservation period. FIG. 7 shows a sequence of microscope images of a section of the sample 1 with cells 2 at room temperature, after the preservation medium 3 has been added a cryoprotectant. The time (in seconds, s) shows the time dependence after addition of the stabilizer substance to the sample 1. It is clear that a considerable shrinkage process takes place in a short time. The inventors have found that this shrinkage can be beneficial for achieving high vitality rates. Figures 8 and 9 illustrate the dramatic shrinkage of the cells (here HeLa cells) to almost the residual osmotic volume which is beneficial for high vitality rates. The round shape of the cells (Figures 9A to 9C, top left) is completely lost (Figures 9A to 9C, right and bottom). The decrease in the diameter of the cells was measured with a measuring system determines Invitrogen (diagram in Figure 8), but not Reflectors ¬ has full osmotic shrinking, since the proportion of the deviation from the spherical shape not into account is taken. Consequently, the cells shrink more than can be seen from the graph number value.
Figur 10 zeigt die geschrumpften Zellen im elektronenmikro- skopischen Schnitt. Man erkennt die extrem starke Schrumpfung, die im Kryomedium mit einer der oben genannten Zusammensetzungen erreicht wird, so dass das Zellmembransystem stark gefaltet vorliegt. In Figur 11 sind die strukturellen Änderungen adhärenter Zellen (HeLa) gezeigt. Auch hier treten sehr schnell (nach Sekunden) die osmotischen Schrumpfungen auf . FIG. 10 shows the shrunken cells in the electron microscopic section. It can be seen the extremely strong shrinkage, which is achieved in the cryogenic medium with one of the above compositions, so that the cell membrane system is strongly folded. FIG. 11 shows the structural changes of adherent cells (HeLa). Again, the osmotic shrinkages occur very quickly (after seconds).
Fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen mit einer unterschiedlichen Darstellung der Zellkerne und des Golgi- Apparates (hier nicht gezeigt) haben ergeben, dass das Fluorescence microscopy studies with a different representation of the cell nuclei and the Golgi apparatus (not shown here) have shown that the
Schrumpfen lediglich die Zytoplasmakomponenten verdichtet, nicht jedoch die Zellkerne und andere wichtige Zell- Organellen beeinflusst, was für das vitalitätserhaltende Einfrieren und Auftauen von großem Vorteil ist.  Shrinking only densifies the cytoplasmic components, but does not affect cell nuclei and other important cell organelles, which is of great benefit for vitality-preserving freezing and thawing.
Figur 12 zeigt Varianten erfindungemäß vorgesehener ärme- leit- und/oder Kühlelemente. Zu Vergleichszwecken zeigt zunächst Figur 12A den kreisförmigen Querschnitt des rohrförmi- gen Druckbehälters 10 (siehe Figur 5) . Die Figuren 12B bis 121 zeigen Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Kryokon- servierungsvorrichtung in schematischer Schnittansicht des Druckbehälters 10, bei denen die Stelleinrichtung für eine Einstellung der Temperatur unter Verwendung von mindestens einem Wärmeleitelement oder mindestens einem Kühlelement ein- gerichtet ist. Gemäß Figur 12B umfassen Wärmeleitelemente Außenprofile 35, die auf einer Außenseite der Behälterwand 11 radial abstehend angeordnet sind. Die Außenprofile 35 beschleunigen die Abkühlung oder Erwärmung des Druckbehälters 10 beim Eintauchen in das Kühlbad oder das warme Flüssig- keitsbad. Gemäß Figur 12C sind Innenprofile 36 auf einer Innenseite der Behälterwand 11 angeordnet. Die Innenprofile 36 unterstützen ebenfalls den Wärmetransport von oder zu der biologischen Probe im Druckbehälter 10. FIG. 12 shows variants of arming and / or cooling elements provided according to the invention. For comparison purposes, FIG. 12A initially shows the circular cross-section of the tubular pressure vessel 10 (see FIG. 5). FIGS. 12B to 121 show embodiments of the cryopreservation device according to the invention in a schematic sectional view of the pressure vessel 10, in which the adjusting device is set up for setting the temperature using at least one heat-conducting element or at least one cooling element. According to FIG. 12B, heat-conducting elements comprise outer profiles 35, which are arranged so as to project radially on an outer side of the container wall 11. The outer profiles 35 accelerate the cooling or heating of the pressure vessel 10 when immersed in the cooling bath or the warm liquid keitsbad. According to FIG. 12C, inner profiles 36 are arranged on an inner side of the container wall 11. The inner profiles 36 also support the heat transfer from or to the biological sample in the pressure vessel 10.
Die Figuren 12D bis 12G illustrieren einen Druckbehälter 10 mit einem sechseckigen, hexagonalen Querschnitt. Die Außenseite der Behälterwand 11 bildet das Außenprofil 35, das eine große Oberfläche für die Benetzung mit einem Kühlmittel oder einem Auftaumittel bietet und somit geeignet ist, die Temperatur-Zeitfunktion bei der Abkühlung oder beim Auftauen zu beeinflussen. Gemäß den Figuren 12E, 12F und 12G sind zusätzlich im Innenraum des Druckbehälters 10 Wärmeleitkörper 37 in Gestalt von Trennwänden (Figur 12E) , eingelegten Filamenten oder Kugeln (Figur 12F) oder kolloidalen Partikeln (FigurFigures 12D to 12G illustrate a pressure vessel 10 having a hexagonal, hexagonal cross-section. The outside of the container wall 11 forms the outer profile 35, which offers a large surface for wetting with a coolant or a thawing agent and thus is suitable for influencing the temperature-time function during cooling or thawing. According to FIGS. 12E, 12F and 12G, heat conducting bodies 37 in the form of partitions (FIG. 12E), inserted filaments or spheres (FIG. 12F) or colloidal particles (FIG. 12F) are additionally provided in the interior of the pressure vessel 10
12G) vorgesehen. Die kolloidalen Partikel 37 gemäß Figur 12G sind schematisch vergrößert dargestellt, können aber in der Praxis Dimensionen im Sub- ikrometer-Bereich aufweisen. Mit den Außenprofilen 35, Innenprofilen 36 und/oder Wärmeleitkör- pern 37 können vorteilhafterweise die Kühl- oder Auftaugeschwindigkeiten erhöht werden. Die Wärmeleitelemente sind vorzugsweise aus Silber oder Gold oder anderen Substanzen mit hoher Wärmeleitfähigkeit hergestellt. Gemäß weiteren Varianten kann die Wärmeleitung zwischen dem Innenraum 12 und der äußeren Umgebung des Druckbehälters 10 durch eine Beschich- tung der Behälterwand 11 auf deren Innen- und/oder Außenseite, z. B. mit Diamant oder anderen Substanzen mit hoher Wärmeleitung beeinflusst werden. Figur 12H zeigt eine Variante der Erfindung, bei der im Innenraum 12 des Druckbehälters 10 als Kühlelement eine Kühlleitung 34 verläuft. Die Kühlleitung 34 ist mit einem Kühlme¬ dium-Reservoir verbunden und eingerichtet, von einem Kühlmedium, wie z. B. flüssigem Stickstoff oder einem Kühlgas, durchströmt zu werden. Alternativ kann eine Kühlleitung 34 benachbart zum Innenraum 12 verlaufen, wie schematisch in Figur 121 gezeigt ist. Figur 13 zeigt eine weiter Ausführungsform der erfindungsgemäßen Kryokonservierungsvorrichtung 100 (Figur 13A) und deren Verwendung bei der Abkühlung (Figur 13B) und dem Auftauen (Figur 13C) der biologischen Probe mit Zellen 2 im Konservierungsmedium 3. Bei dieser Ausführungsform der Erfindung ent- hält die Stelleinrichtung zur zeit- und/oder ortsabhängigen Einstellung der Temperatur und des Druckes im Druckbehälter 10 drei Druckeinstellelemente, umfassend Druckschrauben 21 und einen Expansionsbereich 22. Die Druckschrauben 21 sind zur Erzeugung des Druckes und/oder zur Entlüftung des Innen- räum 12 des Druckbehälters 10 vorgesehen (siehe Figur 5) . Der Expansionsbereich 22 umfasst eine radial vom Druckbehälter 10 abstehende Hohlleitung, die an einem Ende über eine Öffnung in der Behälterwand 12 mit dem Innenraum 12 des Druckbehälters 10 in Verbindung steht und deren entgegengesetztes, freies Ende geschlossen ist. Zwischen dem Innenraum 12 und dem Expansionsbereich 22 kann ein Filter 29 vorgesehen sein, um das Eindringen von biologischen Zellen in den Expansionsbereich 22 zu unterbinden. Der Expansionsbereich 22 ist z. B. aus dem selben Material hergestellt wie die Behälterwand 12 des Druckbehälters 10. Der Expansionsbereich 22 ist eingerichtet, ein flüssiges Ex¬ pansionsmedium aufzunehmen, das sich bei Abkühlung ausdehnt. Das Expansionsmedium umfasst z. B. das wässrige Konservie- rungsmedium der biologischen Probe oder alternativ eine andere wässrige Flüssigkeit, die zur Bildung der kristallinen Phase von Wasser geeignet ist. Die Dimensionen (Länge, Innendurchmesser, Außendurchmesser) des Expansionsbereiches 22 können vom Anwender in Abhängigkeit von den konkreten Konservierungsbedingungen gewählt werden. 12G). The colloidal particles 37 according to FIG. 12G are illustrated schematically enlarged, but in practice they may have dimensions in the sub-micrometer range. With the outer profiles 35, inner profiles 36 and / or Wärmeleitkör- pern 37 advantageously the cooling or thawing speeds can be increased. The heat-conducting elements are preferably made of silver or gold or other substances with high thermal conductivity. According to further variants, the heat conduction between the inner space 12 and the outer environment of the pressure vessel 10 by a coating of the container wall 11 on its inner and / or outer side, for. B. with diamond or other substances with high thermal conductivity can be influenced. FIG. 12H shows a variant of the invention in which a cooling line 34 runs in the interior 12 of the pressure vessel 10 as a cooling element. The cooling line 34 is connected to a Kühlme ¬ dium reservoir and arranged by a cooling medium, such. As liquid nitrogen or a cooling gas, to be flown through. Alternatively, a cooling line 34 may extend adjacent to the interior 12, as shown schematically in FIG. 121. FIG. 13 shows a further embodiment of the cryopreservation device 100 according to the invention (FIG. 13A) and its use during cooling (FIG. 13B) and thawing (FIG. 13C) of the biological sample with cells 2 in the preservation medium 3. In this embodiment of the invention, FIG Adjustment device for time and / or location-dependent adjustment of the temperature and the pressure in the pressure vessel 10 three Druckeinstellelemente comprising pressure screws 21 and an expansion region 22. The pressure screws 21 are provided for generating the pressure and / or for venting the inner space 12 of the pressure vessel 10 (see Figure 5). The expansion region 22 comprises a radially projecting from the pressure vessel 10 hollow conduit which communicates at one end via an opening in the container wall 12 with the interior 12 of the pressure vessel 10 in connection and the opposite, free end is closed. Between the inner space 12 and the expansion area 22, a filter 29 may be provided to prevent the ingress of biological cells into the expansion area 22. The expansion area 22 is z. B. made of the same material as the container wall 12 of the pressure vessel 10. The expansion region 22 is adapted to receive a liquid Ex ¬ pansionsmedium that expands upon cooling. The expansion medium includes z. For example, the aqueous preservative medium of the biological sample or, alternatively, another aqueous liquid suitable for forming the crystalline phase of water. The dimensions (length, inner diameter, outer diameter) of the expansion area 22 can be selected by the user depending on the concrete preservation conditions.
Der Expansionsbereich 22 erlaubt eine schnelle Bildung der kristallinen Phase, wenn die Temperatur des Expansionsbereiches 22 unter den Gefrierpunkt von Wasser gesenkt wird. Vorteilhafterweise kann die Abkühlung des Expansionsbereichs 22 zeitlich von der Abkühlung des übrigen Druckbehälters 10 entkoppelt werden, wie in Figur 13B illustriert ist. Für die Ab- kühlung ist eine schematisch gezeigte Kühlvorrichtung 200 mit einem Kühlbad 210 vorgesehen. Die Kühlvorrichtung 200 umfasst zum Beispiel ein Gefäß, in welches das Kühlbad 210, z. B. aus flüssigem Stickstoff, gefüllt und das mit einem Kühlmedium- Reservoir verbunden ist. The expansion region 22 allows rapid formation of the crystalline phase when the temperature of the expansion region 22 is lowered below the freezing point of water. Advantageously, the cooling of the expansion region 22 can be decoupled in time from the cooling of the remaining pressure vessel 10, as illustrated in FIG. 13B. For the cooling, a schematically shown cooling device 200 with a cooling bath 210 is provided. The cooling device 200 includes, for example, a vessel into which the cooling bath 210, e.g. B. from liquid nitrogen, filled and which is connected to a cooling medium reservoir.
Zur Kryokonservierung der biologischen Probe 1 wird die Kryo- konservierungsvorrichtung 100 zunächst ausschließlich mit dem Expansionsbereich 22 in das Kühlbad 210 eingetaucht (Eintauchtiefe Dl) , während sich der übrige Druckbehälter noch außerhalb des Kühlbades befindet. In dieser Phase wird im Expansionsbereich 22 kristallines Eis gebildet, das sich ausdehnt, so dass im Innenraum 12 des Druckbehälters 10 der Druck steigt. Die Dauer der Druckerzeugung mit dem Expansionsbereich 22 wird z. B. im Bereich von Millisekunden, Sekun- den oder Minuten gewählt. Anschließend wird die Kryokonser- vierungsvorrichtung 100 vollständig in das Kühlbad 210 eingetaucht, so dass die gewünschte Kryokonservierungstemperatur von z. B. - 195,7 °C erreicht wird. Hierzu wird die Kryokon- servierungsvorrichtung 100 bis zu einer zweiten Eintauchtiefe D2 abgesenkt. For cryopreservation of the biological sample 1, the cryopreservation device 100 is first immersed in the cooling bath 210 exclusively with the expansion region 22 (immersion depth D1), while the remaining pressure vessel is still outside the cooling bath. In this phase, crystalline ice is formed in the expansion region 22, which expands, so that in the interior 12 of the pressure vessel 10, the pressure increases. The duration of the pressure generation with the expansion area 22 is z. In the range of milliseconds, seconds or minutes. Subsequently, the cryoconservation device 100 is completely immersed in the cooling bath 210, so that the desired cryopreservation temperature of z. B. - 195.7 ° C is reached. For this purpose, the cryopreservation device 100 is lowered to a second immersion depth D2.
Die Erwärmung zur Wiedergewinnung der biologischen Probe erfolgt gemäß Figur 13C in umgekehrter Weise. Zum Aufrechterhalten des Druckes im Druckbehälter 10 wird zunächst der In- nenraum mit der biologischen Probe in ein Heizbad 310 einer Auftauvorrichtung 300 eingetaucht (Eintauchtiefe Dl) , während der Expansionsbereich 22 noch nicht abgekühlt wird. Nach dem Auftauen der biologischen Probe 1 im Druckbehälter 10 erfolgt die Absenkung bis zur Eintauchtiefe D2, so dass auch der Druck im Druckbehälter 10 reduziert wird. The heating for recovery of the biological sample is carried out in the reverse manner according to FIG. 13C. In order to maintain the pressure in the pressure vessel 10, first of all interior space with the biological sample immersed in a heating bath 310 of a thawing device 300 (immersion depth Dl), while the expansion region 22 is not yet cooled. After thawing the biological sample 1 in the pressure vessel 10, the reduction takes place up to the immersion depth D2, so that the pressure in the pressure vessel 10 is reduced.
Figur 14A illustriert eine Ausführungsform der erfindungsgemäßen Kryokonservierungsvorrichtung 100, bei der im Innenraum 12 des Druckbehälters 10 ein Innenbehälter 13 angeordnet ist. Der Innenbehälter 13 ist zur Aufnahme der biologischen Probe 1 vorgesehen und umfasst ein blasenfrei gefülltes Rohr aus einem biegsamen Material. Der Innenbehälter 13 ist z. B. aus dem gleichen Material hergestellt, wie die Behälterwand 12 des Druckbehälters 10. Die Bereitstellung des Innenbehälters 13 hat den Vorteil, dass die Bildung der kristallinen Phase auf der Innenseite der Behälterwand 12 von der biologischen Probe 1 getrennt wird. Des Weiteren können im Innenraum 12 außerhalb des Innenbehälters 13 einerseits und im Innenbehäl- ter 13 andererseits verschiedene Flüssigkeiten vorgesehen sein. Beispielsweise kann außerhalb des Innenbehälters 13 reines Wasser oder eine wässrige Zusammensetzung aus Wasser mit einem Salz, Glycerin und/oder einem Alkohol vorgesehen sein. Die wässrige Zusammensetzung hat den Vorteil einer Ge- frierpunktabsenkung, so dass eingestellt werden kann, bei welcher Temperatur unterhalb des Gefrierpunkts von reinem Wasser der Druck in dem Druckbehälter 10 erzeugt werden soll. FIG. 14A illustrates an embodiment of the cryopreservation device 100 according to the invention, in which an inner container 13 is arranged in the interior 12 of the pressure container 10. The inner container 13 is provided for receiving the biological sample 1 and comprises a bubble-free filled tube of a flexible material. The inner container 13 is z. B. The provision of the inner container 13 has the advantage that the formation of the crystalline phase on the inside of the container wall 12 is separated from the biological sample 1. Furthermore, different liquids may be provided in the interior 12 outside the inner container 13 on the one hand and in the inner container 13 on the other hand. For example, outside the inner container 13, pure water or an aqueous composition of water with a salt, glycerin and / or an alcohol may be provided. The aqueous composition has the advantage of lowering the freezing point, so that it is possible to set at which temperature below the freezing point of pure water the pressure in the pressure vessel 10 is to be generated.
Der Innenbehälter 13 erstreckt sich nicht über die gesamte Länge des Innenraums 12. Dadurch wird am geschlossenen Ende 12.1 des Druckbehälters 10 ein relativ großer Raum geschaf¬ fen, in dem sich keine biologische Probe 1 befindet und in dem bevorzugt die kristalline Phase von Wasser erzeugt werden kann. Damit wird innerhalb des Druckbehälters 10 ein Expansi- onsbereich als Teil der erfindungsgemäß verwendeten Stelleinrichtung geschaffen, der sich vorteilhaft auf die Abkühlung und auf die Erwärmung der Kryokonservierungsvorrichtung 100 auswirken kann (siehe insbesondere Figur 14C) . The inner container 13 does not extend over the entire length of the interior 12. As a result of the pressure vessel 10 will be a relatively large space geschaf ¬ fen in which no biological sample 1 is located, and preferably generates the crystalline phase of water in the closed end 12.1 can. Thus, an expansion within the pressure vessel 10 Onsbereich created as part of the control device used in the invention, which may have an advantageous effect on the cooling and heating of the Kryokonservierungsvorrichtung 100 (see in particular Figure 14C).
Die Außenform des Innenbehälters 13 kann gleich der Innenform des Druckbehälters 10 sein. Alternativ zu der gezeigten zylindrischen Form können andere Querschnitte der Außen- und/oder Innenformen vorgesehen sein, wie z. B. quadratisch, hexagonal, oktagonal oder sämtliche Kombinationen davon. Es können insbesondere verschiedene Querschnittsformen der Außen- und Innenformen vorgesehen sein. The outer shape of the inner container 13 may be the same as the inner shape of the pressure container 10. As an alternative to the cylindrical shape shown, other cross sections of the outer and / or inner molds may be provided, such. Square, hexagonal, octagonal or all combinations thereof. In particular, different cross-sectional shapes of the outer and inner molds can be provided.
Figur 14B illustriert schematisch die Abkühlung der Kryokon- servierungsvorrichtung 100 in einer Kühlvorrichtung 200, die in diesem Fall zwei übereinander geschichtete Kühlbäder 210 mit flüssigem Stickstoff und 220 mit flüssigem Propan enthält. Die Verwendung von flüssigem Propan hat den Vorteil, dass dieses die Außenseite des Druckbehälters 10 leichter be- netzt und damit die Abkühlung beschleunigt. FIG. 14B schematically illustrates the cooling of the cryopreservation device 100 in a cooling device 200, which in this case contains two superimposed cooling baths 210 with liquid nitrogen and 220 with liquid propane. The use of liquid propane has the advantage that it more easily wets the outside of the pressure vessel 10 and thus accelerates the cooling.
Zur Erwärmung der biologischen Probe 1 im Druckbehälter 10 wird dieser gemäß Figur 14C in ein Heizbad 310 getaucht. Der Druckbehälter 10 kann so ausgerichtet sein, dass die gesamte Länge des Druckbehälters 10 gleichzeitig in das Heizbad 310 taucht (horizontale Ausrichtung) . In diesem Fall erfolgt zunächst eine Erhöhung der Temperatur der biologischen Probe 1 und, sobald das kristalline Eis aufgetaut ist, auch die Reduzierung des Druckes im Druckbehälter 10. Alternativ kann zu- erst das geschlossene Ende 12.1 mit dem Expansionsbereich in das Wasserbad 310 eingetaucht werden, so dass zuerst die kristalline Phase geschmolzen und der Druck im Druckbehälter 10 reduziert und anschließend die übrige biologische Probe 1 erwärmt wird (vertikale Ausrichtung des Druckbehälters 10) . Figur 15 illustriert schematisch, dass die Anwendung der erfindungsgemäßen Kryokonservierungsvorrichtung 100 nicht auf die Konservierung von Zellsuspensionen beschränkt ist. Viel- mehr kann die biologische Probe 1 Zellgruppen, Zellaggregate, Organe 4 biologischer Organismen oder komplette biologische Organismen 5, wie z. B. Nematoden, Würmer oder Arthropoden enthalten. Hierzu weist der Innenraum 12 des Druckbehälters 10 einen Innendurchmesser im Bereich von mindestens 5 mm, vorzugsweise mindestens 10 mm auf. Vorzugsweise ist der Innendurchmesser des Innenraums 11 geringer als 5 cm, besonders bevorzugt geringer als 3 cm. Wie in Figur 14 ist ein Innenbehälter 13 zur Aufnahme der biologischen Probe 1 vorgesehen, der optional in einzelne Kammern unterteilt sein kann. For heating the biological sample 1 in the pressure vessel 10, this is immersed in a heating bath 310 according to FIG. 14C. The pressure vessel 10 may be oriented such that the entire length of the pressure vessel 10 simultaneously dips into the heating bath 310 (horizontal orientation). In this case, an increase in the temperature of the biological sample 1 and, as soon as the crystalline ice has thawed, also the reduction of the pressure in the pressure vessel 10. Alternatively, first the closed end 12.1 with the expansion region immersed in the water bath 310, so that first the crystalline phase is melted and the pressure in the pressure vessel 10 is reduced and then the remaining biological sample 1 is heated (vertical orientation of the pressure vessel 10). FIG. 15 schematically illustrates that the use of the cryopreservation device 100 according to the invention is not limited to the preservation of cell suspensions. Rather, the biological sample 1 cell groups, cell aggregates, organs of 4 biological organisms or complete biological organisms 5, such as. As nematodes, worms or arthropods included. For this purpose, the interior 12 of the pressure vessel 10 has an inner diameter in the range of at least 5 mm, preferably at least 10 mm. Preferably, the inner diameter of the inner space 11 is less than 5 cm, more preferably less than 3 cm. As in Figure 14, an inner container 13 is provided for receiving the biological sample 1, which may optionally be divided into individual chambers.
Die Kryokonservierung der biologischen Probe 1 erfolgt auch bei der Ausführungsform gemäß Figur 15, indem der Druckbehälter 10 in mindestens ein Flüssigkeitsbad der Kühlvorrichtung 200 eingetaucht wird. Gemäß Figur 15C erfolgt zuerst ein Ein- tauchen des Druckbehälters 10 mit horizontaler Ausrichtung zuerst in das Flüssigkeitsbad 220 aus flüssigem Propan und anschließend in das Flüssigkeitsbad 210 mit flüssigem Stickstoff. Mit der Wahl der Ausrichtung der Druckschraube 21 relativ zum Flüssigkeitsbad 220, 210, kann die Zeitfunktion der Druckerzeugung relativ zur Zeitfunktion der Abkühlung eingestellt werden. Die Erwärmung erfolgt gemäß Figur 15D entsprechend in umgekehrter Reihenfolge, indem zunächst der Druckbehälter 10 in ein Heizbad 310 eingetaucht wird, bis die biologische Probe 1 aufgetaut ist. Anschließend erfolgt die voll- ständige Absenkung der Kryokonservierungsvorrichtung 100 in das Heizbad 310. The cryopreservation of the biological sample 1 also takes place in the embodiment according to FIG. 15, in that the pressure vessel 10 is immersed in at least one liquid bath of the cooling device 200. According to FIG. 15C, immersion of the pressure vessel 10 with horizontal alignment first takes place first into the liquid bath 220 of liquid propane and then into the liquid bath 210 with liquid nitrogen. With the choice of the orientation of the pressure screw 21 relative to the liquid bath 220, 210, the time function of the pressure generation relative to the time function of the cooling can be adjusted. According to FIG. 15D, the heating takes place in the reverse order, by first submerging the pressure vessel 10 in a heating bath 310 until the biological sample 1 has thawed. Subsequently, the complete lowering of the cryopreservation device 100 into the heating bath 310 takes place.
Die Figuren 16 und 17 zeigen weitere Ausführungsformen der Kryokonservierungsvorrichtung 100, die mit einem Expansions- bereich 22 ausgestattet ist. Der Expansionsbereich 22 umfasst wie in Figur 13 eine Hohlleitung, die bei den illustrierten Varianten Verzweigungen aufweist. Gemäß Figur 16A weist der Expansionsbereich 22 eine T-Gestalt mit seitlichen Auslegern auf. Der Expansionsbereich 22 kann zuerst in das Kühlbad 210 getaucht werden (Eintauchtiefe Dl), so dass die Flüssigkeit in seinem Inneren gefriert, hexagonales Eis bildet und den Druck erhöht. Erst danach wird das System ganz versenkt (Eintauchtiefe D2) und vollständig tiefgekühlt (Figur 16B) . Beim Erwärmen verfährt man umgekehrt, oder man hat die Möglichkeit, in zwei Lagen (Ausleger zuerst in die warme Phase oder wie hier dargestellt zuletzt) in das Heizbad 310 zu tauchen (Figur 16C) . Nach letzterem Prinzip bleibt der Druck durch das vorhandene Eis bis zum Auftauen bei Werten von etwa 200 MPa erhalten. FIGS. 16 and 17 show further embodiments of the cryopreservation device 100 which are equipped with an expansion area 22 is equipped. As in FIG. 13, the expansion area 22 comprises a hollow conduit which has branches in the illustrated variants. Referring to Fig. 16A, the expansion portion 22 has a T-shape with side arms. The expansion area 22 may first be immersed in the cooling bath 210 (immersion depth D1) so that the liquid inside it freezes, forms hexagonal ice, and increases the pressure. Only then is the system fully submerged (immersion depth D2) and completely frozen (Figure 16B). When heating is reversed, or you have the opportunity in two layers (boom first in the warm phase or as shown here last) into the heating bath 310 to dive (Figure 16C). According to the latter principle, the pressure is maintained by the existing ice until thawing at values of about 200 MPa.
Figur 17 zeigt eine weitere Ausführung des Expansionsbereiches 22 mit Verzweigungen, die ein gefächertes Auslegersystem bilden. Im Ergebnis werden ein größeres Innenvolumen und eine größere Oberfläche als zum Beispiel in Figur 16 bereitgestellt, so dass der Druck schneller erhöht werden kann. Figure 17 shows another embodiment of the expansion area 22 with branches forming a fan-out jib system. As a result, a larger internal volume and a larger surface area are provided than, for example, in FIG. 16, so that the pressure can be increased faster.
Figur 18 zeigt Ausführungsformen der Kryokonservierungsvor- richtung 100 mit einem kugelförmigen Druckbehälter 10 und ei- nem mehrere, in verschiedene Raumachsen (Raumrichtungen) abstehende Hohlleitungen umfassenden Expansionsbereich 22. Der Druckbehälter 10 umfasst eine Hohlkugel zur Aufnahme der biologischen Probe. Die Hohlkugel ist z. B. aus Edelstahl herge¬ stellt und weist einen Innendurchmesser von 10 mm und einen Außendurchmesser von 12 mm auf. Die Hohlleitungen bilden von der Hohlkugel abstehende Stichleitungen. Die Zahl, geometri¬ sche Dimensionierung und Orientierung der Hohlleitungen kann in Abhängigkeit von den konkreten Anwendungsbedingungen ge¬ wählt werden (siehe Beispiele in den Figuren 18A bis 18C) . Die Befüllung der Hohlkugel erfolgt durch eine verschließbare Öffnung (nicht dargestellt) in der Behälterwand oder durch eine der Hohlleitungen, die in diesem Fall mit einem Verschlusselement ausgestattet ist. Auch bei diesen Ausführungs- formen gestattet die geometrische Orientierung des Druckbe¬ hälters 10 beim Eintauchen bis zu den Eintauchtiefen Dl und D2 in ein Kühlbad 210 (Figur 18D) oder in ein Heizbad 310 (Figur 18E) eine Einstellung, wann der Druck im Druckbehälter 10 ansteigen und abfallen soll. FIG. 18 shows embodiments of the cryopreservation device 100 with a spherical pressure vessel 10 and a plurality of expansion areas 22, which extend into different spatial axes (spatial directions). The pressure vessel 10 comprises a hollow sphere for receiving the biological sample. The hollow sphere is z. B. stainless steel Herge ¬ provides and has an inner diameter of 10 mm and an outer diameter of 12 mm. The hollow conduits form stub lines projecting from the hollow sphere. The number, geometric ¬ specific dimensioning and orientation of the hollow tubes can be ge ¬ selected depending on the actual use conditions (see examples in Figs 18A to 18C). The filling of the hollow ball is effected by a closable opening (not shown) in the container wall or by one of the hollow conduits, which is equipped in this case with a closure element. Also in these embodiments, the geometric orientation of the Druckbe ¬ container 10 when immersed up to the immersion depths Dl and D2 in a cooling bath 210 (Figure 18D) or in a heating 310 (Figure 18E) allows a setting when the pressure in the pressure vessel 10th should rise and fall.
Die Figuren 19A und 19B zeigen Ausführungsformen der Kryokon- servierungsvorrichtung 100, bei denen die Behälterwand 11 des Druckbehälters 10 die Gestalt eines gekrümmten Rohres mit einer Einfachkrümmung (Figur 19A) oder einer Mehrfachkrümmung (Figur 19B) aufweist. In beiden Fällen ist der Druckbehälter 10 in einer Krümmungsebene gekrümmt, so dass die örtliche Temperaturverteilung beim Eintauchen in ein Kühlbad in Abhängigkeit von der Ausrichtung des Druckbehälters 10 relativ zum Kühlbad eingestellt werden kann (siehe Figur 19C, 19D) . Figur 19A zeigt beispielhaft Varianten von Druckeinstellelementen, umfassend Druckschrauben 21 und einen Expansionsbereich 22, die einzeln oder wie dargestellt in Kombination vorgesehen sein können. Die Druckschrauben 21 sind gebildet, wie oben unter Bezug auf Figur 5 beschrieben ist. Der Expansionsbe- reich 22 umfasst eine Vielzahl von Hohlleitungen, die in der Krümmungsebene des Druckbehälters 10 und jeweils mit dem In¬ nenraum des Druckbehälters 10 kommunizierend angeordnet sind. Die Druckeinstellelemente können auch bei der Variante gemäß Figur 19B vorgesehen sein. Die Mehrfachkrümmung gemäß Figur 19B kann eine Wellenform mit mehr als den gezeigten drei Ex- trema gebildet sein. FIGS. 19A and 19B show embodiments of the cryopreservation device 100 in which the container wall 11 of the pressure vessel 10 has the shape of a curved tube with a single curvature (FIG. 19A) or a multiple curvature (FIG. 19B). In both cases, the pressure vessel 10 is curved in a plane of curvature, so that the local temperature distribution when immersed in a cooling bath depending on the orientation of the pressure vessel 10 can be adjusted relative to the cooling bath (see Figure 19C, 19D). FIG. 19A shows by way of example variants of pressure setting elements comprising pressure screws 21 and an expansion region 22, which may be provided individually or as shown in combination. The pressure screws 21 are formed as described above with reference to FIG. The expansion all rich 22 includes a plurality of hollow conduits in the plane of curvature of the pressure vessel 10 and respectively to the In ¬ are disposed communicatively nenraum of the pressure vessel 10 degrees. The pressure adjustment elements can also be provided in the variant according to FIG. 19B. The multiple curvature of FIG. 19B may be a waveform having more than the three extremes shown.
Die örtlichen Verteilungen und Zeitfunktionen der Druckerzeugung und der Temperaturabsenkung in der Kryokonservierungs- Vorrichtung 100 hängen von der Ausrichtung des Druckbehälters 10 beim Eintauchen in das Kühlbad 210 ab. Figur 19C zeigt beispielhaft ein Eintauchen mit der Krümmungsebene zum senkrecht oder parallel zur Oberfläche des Kühlbades 210. Mit der senkrechten Ausrichtung erfolgen die Druckerzeugung und die Temperaturabsenkung zuerst in den Extrema der Mehrfachkrümmung, die in das Kühlbad ragen. Mit der parallelen Ausrichtung hingegen erfolgen die Druckerzeugung und die Temperaturabsenkung im gesamten Druckbehälter 10 gleichzeitig. Abwei- chend von der Illustration kann ein Eintauchen mit anderen Ausrichtungen in die Flüssigkeiten vorgesehen sein, woraus eine erweiterte Variabilität der Einstellung der Druck- und Temperatur-Zeitfunktionen folgt. Die örtlichen Verteilungen und Zeitfunktionen der Druckreduzierung und der Temperaturerhöhung in der Kryokonservierungs- vorrichtung 100 hängen ebenfalls von der Ausrichtung des Druckbehälters 10 beim Eintauchen in ein Heizbad 310 ab (Figur 19D) . The local distributions and time functions of pressure generation and temperature reduction in the cryopreservation Device 100 depends on the orientation of the pressure vessel 10 when immersed in the cooling bath 210. FIG. 19C shows, by way of example, plunging with the plane of curvature perpendicular or parallel to the surface of the cooling bath 210. With the vertical orientation, the pressure generation and the temperature reduction first take place in the extremes of the multiple curvature which protrude into the cooling bath. With the parallel orientation, however, the pressure generation and the temperature reduction in the entire pressure vessel 10 are carried out simultaneously. Deviating from the illustration, immersion with other orientations into the fluids may be provided, resulting in an extended variability in the setting of the pressure and temperature-time functions. The local distributions and time functions of pressure reduction and temperature increase in the cryopreservation device 100 also depend on the orientation of the pressure vessel 10 upon immersion in a heating bath 310 (Figure 19D).
Figur 20 zeigt eine Ausführungsform der Kryokonservierungs- vorrichtung 100, bei der die Behälterwand 11 des Druckbehäl¬ ters 10 die Gestalt eines flachen oder scheibenförmigen Zy¬ linders aufweist. Diese Ausführungsform der Erfindung hat den Vorteil, dass beim Eintauchen in ein Kühlbad eine relative große Fläche gekühlt wird. Daher wird auf der Innenseite des Behälterwand 11 eine dünne Schicht der kristallinen Phase ge¬ bildet, die ausreicht, um den gewünschten Druck im Druckbe¬ hälter 10 zu erzeugen, und gleichzeitig relativ viel Raum für die glasartige Phase lässt. Der Druckbehälter 10 gemäß Figur 20A hat einen Durchmesser von z. B. 1 cm bis 10 cm und Dicke von z. B. 1 mm bis 1 cm. Er ist z. B. aus Edelstahl, Aluminium, Gold oder Silber hergestellt. Gemäß Figur 20B umfasst die Stelleinrichtung zur zeit- und/oder ortsabhängigen Einstellung der Temperatur und des Druckes im Druckbehälter 10 eine Druckklammer 23. Die Druckklammer 23 umfasst zwei Klammerplatten 24, die über ein Figure 20 shows an embodiment of the cryopreservation apparatus 100, wherein the container wall 11 of the pressure vessels ¬ ters 10 has the shape of a flat or disk-shaped Zy ¬ Linders. This embodiment of the invention has the advantage that when immersed in a cooling bath, a relatively large area is cooled. Therefore, a thin layer of crystalline phase is ge ¬ forms on the inside of the container wall 11 which is sufficient to produce the desired pressure in the Druckbe ¬ container 10, while allowing a relatively large space for the glassy phase. The pressure vessel 10 according to Figure 20A has a diameter of z. B. 1 cm to 10 cm and thickness of z. B. 1 mm to 1 cm. He is z. B. made of stainless steel, aluminum, gold or silver. According to Figure 20B, the adjusting device for time- and / or location-dependent adjustment of the temperature and the pressure in the pressure vessel 10 comprises a pressure clamp 23. The pressure clamp 23 comprises two clamp plates 24, which via a
Scharnier 25 (Achsenscharnier) verschwenkbar sind. Mit einer Klammerschraube 26 (Stellschraube) kann der Abstand zwischen den Klammerplatten 24 eingestellt werden. Die Druckklammer 23 ist geeignet, den Druckbehälter 10 mit einem im Vergleich zum Atmosphärendruck erhöhten Druck zu beaufschlagen, bevor die Kryokonservierungsvorrichtung 100 durch ein Tauchen in einHinge 25 (axle hinge) are pivotable. With a clamp screw 26 (set screw), the distance between the clamp plates 24 can be adjusted. The pressure clamp 23 is adapted to pressurize the pressure vessel 10 with respect to the atmospheric pressure, before the cryopreservation device 100 by a dip in a
Kühlbad (siehe Figur 24) abgekühlt wird. Des weiteren ermög¬ licht die Druckklammer 23 vorteilhafterweise eine Stabilisie¬ rung des Druckbehälters 10. Die Figuren 20C bis 20D zeigen Varianten des zylinderförmigen Druckbehälters 10, der mit einem verstärkten Umfangsbereich (perspektivische Schnittansicht in Figur 20C) und/oder einer beidseitig (Schnittansicht in Figur 20D) oder einseitig Cooling bath (see Figure 24) is cooled. Furthermore made ¬ light the pressing bracket 23 advantageously provides a stabilization ¬ tion of the pressure vessel 10. Figures 20C-20D show variants of the cylindrical pressure vessel 10 which with a reinforced peripheral region (sectional perspective view in Figure 20C) and / or a both-side (sectional view in FIG 20D) or one-sided
(Schnittansicht in Figur 20E) elastisch deformierbaren Behäl- terwand 11 ausgestattet sein kann. Im letzteren Fall ist ein¬ seitig eine stabile Bodenwand 11.3 vorgesehen. (Sectional view in FIG. 20E) can be equipped with an elastically deformable container wall 11. In the latter case a stable bottom wall 11.3 is a side ¬ provided.
Die Figuren 21 bis 24 zeigen weitere Varianten der Druckklammer 23, bei denen die Klammerplatten 24 mit Löchern 27 und auf ihren zum Druckbehälter 10 weisenden Innenseiten mit Profilen 28 ausgestattet sind, im geöffneten Zustand und im ge¬ schlossenen Zustand (zusammengebauten Zustand) der Druckklam¬ mer 23. Im geschlossenen Zustand der Druckklammer 23 wird über die Klammerplatten 24 mechanischer Druck auf die Behäl- terwand 11 des Druckbehälters 10 ausgeübt. Figur 23 zeigt ei¬ ne Draufsicht auf die Druckklammer 23 mit einer der Klammer¬ platten 24, dem Scharnier 25, der Klammerschraube 26 und den Löchern 27. Die Löcher 27 erlauben einen direkten Kontakt von einer Kühlflüssigkeit, z. B. von flüssigem Stickstoff oder Propanol, oder von eine Heizflüssigkeit, z. B. von Wasser, mit dem Druckbehälter 10 und somit eine Beschleunigung der Abkühlung oder Erwärmung des Druckbehälters 10. Die Profile 28 sind vorgesehen, um am Druckbehälter 10 lokal verschiedene Drucke zu erzeugen. Des Weiteren ist gezeigt, dass der zylinderförmige Druckbehälter 10 mit einem Entlüftungsstutzen 30 ausgestattet sein kann. Figures 21 to 24 show further variants of the pressing bracket 23, in which the clamping plates 24 are provided on their side facing the pressure vessel 10 inner sides with holes 27 and with profiles 28, in the open state and in the ge ¬ closed state (assembled state) of the Druckklam ¬ In the closed state of the pressure clamp 23, mechanical pressure is exerted on the container wall 11 of the pressure vessel 10 via the clamp plates 24. Figure 23 shows egg ¬ ne plan view of the pressing bracket 23 with one of the clamp ¬ plates 24, the hinge 25, the clamp screw 26 and the holes 27th The holes 27 allow direct contact of a cooling fluid, for. B. of liquid nitrogen or propanol, or of a heating fluid, for. B. of water, with the pressure vessel 10 and thus an acceleration of the cooling or heating of the pressure vessel 10. The profiles 28 are provided to produce locally different pressures on the pressure vessel 10. Furthermore, it is shown that the cylindrical pressure vessel 10 can be equipped with a vent pipe 30.
Figur 25 zeigt eine Variante der Erfindung, bei der die Kryo- konservierungsvorrichtung 100 nur einseitig in eine Flüssigkeit (Kühlbad 210 oder Heizbad) getaucht wird. Die Druckklammer 23 weist in diesem Fall nur auf der unteren, zur Flüssig- keit weisenden Klammerplatte 24 Löcher 27 auf. Dies ist be¬ sonders vorteilhaft ,. wenn adhärente Zellen auf der unteren Seite des Druckbehälters 10 wachsen oder die Zellen dorthin sedimentieren . FIG. 25 shows a variant of the invention in which the cryopreservation device 100 is immersed only on one side in a liquid (cooling bath 210 or heating bath). In this case, the pressure clamp 23 has holes 27 only on the lower clamp plate 24 facing the liquid. This is be ¬ Sonder advantageous. when adherent cells grow on the lower side of the pressure vessel 10 or the cells sediment there.
Figur 26 illustriert schematisch eine Variante der Erfindung, bei der die Entlüftung des Druckbehälters 10 und die mechani¬ sche Druckerzeugung mit den Kammerplatten 24 mit elektrische Antriebselementen 32, 33 gesteuert werden. Diese Ausführungsform der Erfindung ist insbesondere für eine Automatisierung der Kryokonservierung von Vorteil. Figure 26 schematically illustrates a variant of the invention in which the venting of the pressure vessel 10 and the mechanical ¬ specific pressure generating chamber with the plates 24 with electric drive elements 32 are controlled 33rd This embodiment of the invention is particularly advantageous for automation of cryopreservation.
Bei einer abgewandelten, in Figur 27 gezeigten Ausführungs¬ form der Kryokonservierungsvorrichtung 100, bei der die Be¬ hälterwand 11 des Druckbehälters 10 die Gestalt eines Zylin- ders aufweist, ist als Druckeinstellelement keine Klammer sondern eine Druckschraube 21 vorgesehen. Mit der Druck¬ schraube 21 ist der Druck im Innenraum 12 des Druckbehälters 10 vor oder nach Beginn der Kühlung oder Erwärmung im Kühloder Heizbad (nicht dargestellt) vorgesehen. Im Innenraum 12 sind mehrere Innenbehälter 13 angeordnet, die jeweils gasfrei mit biologischen Proben, z. B. Zellsuspensionen gefüllt und z. B. stapeiförmig übereinander angeordnet sind. Die Wanddi¬ cke der Innenbehälter 13 kann extrem dünn gewählt werden, z. B. geringer als 400 μπι, da sie keinem Druck oder entsprechen¬ den mechanischen Kräften ausgesetzt werden. In an alternative, shown in Figure 27 execution ¬ form of Kryokonservierungsvorrichtung 100, wherein the Be ¬ container wall 11 of the pressure vessel 10 has the shape of a cylinder idem, but no clamp a pressure screw 21 is provided as the print setting. With the pressure ¬ screw 21 is the pressure in the interior 12 of the pressure vessel 10 is provided (not shown) before or after the start of cooling or heating the cooling or heating bath. In the interior 12 a plurality of inner container 13 are arranged, each gas-free with biological samples, eg. B. cell suspensions filled and z. B. stapeiförmig are arranged one above the other. The Wanddi ¬ bridge of the inner container 13 can be selected extremely thin, z. B. less than 400 μπι, since they are no pressure or ¬ correspond to the mechanical forces are exposed.
Gemäß Figur 27 ist im Innenraum 12 des Druckbehälters 10 eine Sensoreinrichtung, umfassend einen Drucksensor 16.1, angeord- net. Der Drucksensor 16.1 liefert ein Sensorsignal, das zur Steuerung des Druckes unter Verwendung der Druckschraube 21, ggf. mit einem elektrischen Steuerelement (z. B. Piezoele- ment, nicht dargestellt) verwendet werden kann. Es kann ein vorbestimmter Außendruck erzeugt werden, der im Innenraum 12 auf die Innenbehälter 13 beim Einfrieren und Auftauen wirkt. According to FIG. 27, a sensor device, comprising a pressure sensor 16. 1, is arranged in the interior 12 of the pressure vessel 10. The pressure sensor 16.1 supplies a sensor signal which can be used to control the pressure using the pressure screw 21, possibly with an electrical control element (eg piezo element, not shown). It can be generated a predetermined external pressure, which acts in the interior 12 on the inner container 13 during freezing and thawing.
Eine abgewandelte Variante des Druckbehälters 10 mit Druckschraube 21 ist in Figur 28 gezeigt. In diesem Fall wird der Innenbehälter 13 durch einen flexiblen Beutel gebildet, der die biologische Probe, z. B. eine Zellsuspension oder eineA modified variant of the pressure vessel 10 with pressure screw 21 is shown in FIG. In this case, the inner container 13 is formed by a flexible bag containing the biological sample, for. B. a cell suspension or a
Blutprobe, aufnimmt. Der Innenbehälter 13 umfasst z. B. einen Blutbeutel, wie er für Blutspendezwecke verwendet wird. Blood sample, absorbs. The inner container 13 includes z. B. a blood bag, as it is used for blood donation purposes.
Figur 29 illustriert schematisch einen vergrößerten Aus- schnitt der Behälterwand 11 eines Druckbehälters 10. Die Behälterwand 11 enthält eine Optikeinheit 60, die für eine optische, insbesondere mikroskopische Beobachtung des Innenraums 12 des Druckbehälters 10 eingerichtet ist. Es ist z. B. möglich, dass Zellen 2 auf einer optischen Linse 61 adhärent wachsen. Die optische Linse 61 kann z. B. für eine mikrosko¬ pische Abbildung der Zellen 2 konfiguriert sein. FIG. 29 schematically illustrates an enlarged detail of the container wall 11 of a pressure vessel 10. The vessel wall 11 contains an optical unit 60, which is set up for an optical, in particular microscopic, observation of the interior 12 of the pressure vessel 10. It is Z. For example, it is possible for cells 2 to grow adherently on an optical lens 61. The optical lens 61 may, for. B. be configured for a mikrosko ¬ pische mapping of the cells 2.
Figur 30 zeigt eine weitere Ausführungsform der Erfindung, bei der die Kryokonservierungsvorrichtung 100 eine Röhrchen- anordnung mit externer Druckerzeugung (hydrostatisch, siehe Pfeil) über ein T-Element umfasst. Die Röhrchenanordnung ist mit einem Drucksensor 16.1 und einem Temperatursensor 16.2 ausgestattet, mit deren Sensorsignalen sowohl die Druck- als auch die Temperatur-Zeitfunktionen regelbar sind. FIG. 30 shows a further embodiment of the invention, in which the cryopreservation device 100 has a tube arrangement with external pressure generation (hydrostatically, see arrow) via a T-element comprises. The tube arrangement is equipped with a pressure sensor 16.1 and a temperature sensor 16.2, with the sensor signals of which both the pressure and the temperature-time functions can be regulated.
Die Figuren 31 und 32 zeigen Ausführungsformen der Kryokon- servierungsvorrichtung 100, bei denen die Behälterwand 11 des Druckbehälters 10 die Gestalt einer Kugel aufweist. Der Figures 31 and 32 show embodiments of the Kryokon- servierungsvorrichtung 100, in which the container wall 11 of the pressure vessel 10 has the shape of a ball. Of the
Druckbehälter 10 ist aus zwei Halbkugeln 11.2 zusammengesetzt, die in der Mitte des Druckbehälters 10 miteinander verschraubt sind. Die Kugel besitzt einen Durchmesser im Bereich von z. B. 5 mm bis 10 cm. Gemäß Figur 31A ist der Pressure vessel 10 is composed of two hemispheres 11.2, which are bolted together in the middle of the pressure vessel 10. The ball has a diameter in the range of z. B. 5 mm to 10 cm. According to Figure 31A is the
Druckbehälter 10 mit einer Druckschraube 21 ausgestattet, die zur Befüllung des Druckbehälters 10, Entlüftung des Druckbehälters 10 und Erzeugung des Druckes im Innenraum des Druck¬ behälters 10 verwendet wird. Figur 31B illustriert zusätzlich optional vorgesehene Teile, wie eine Sensoreinrichtung 16 und eine vom Druckbehälter 10 entkoppelbare Füll-Leitung 11.1. Die Figuren 31C und 31D illustrieren analog zu den oben beschriebenen Verfahren die Abkühlung und Erwärmung der Kryo- konservierungsvorrichtung 100. Pressure vessel 10 equipped with a pressure screw 21, which is used to fill the pressure vessel 10, venting of the pressure vessel 10 and generating the pressure in the interior of the pressure ¬ container 10. FIG. 31B additionally illustrates optionally provided parts, such as a sensor device 16 and a filling line 11.1 which can be decoupled from the pressure vessel 10. FIGS. 31C and 31D illustrate the cooling and heating of the cryopreservation device 100 analogously to the methods described above.
Der kugelförmige Druckbehälter 10 kann alternativ oder zusätzlich mit einem Druckeinstellelement in Gestalt eines Ex¬ pansionsbereichs 22 ausgestattet sein (Figur 32) . Der Expansionsbereich 22 umfasst einen Zylinderstutzen, der wie oben beschrieben zur Aufnahme eines Expansionsmediums und zur Dru¬ ckerzeugung bei Abkühlung konfiguriert ist. Die Figuren 32C und 32D illustrieren analog zu den oben beschriebenen Verfah¬ ren die Abkühlung und Erwärmung der Kryokonservierungsvor- richtung 100. Die erfindungsgemäße Kryokonservierung biologischer Proben, die Organe 4 oder ganze Organismen 5 umfassen, ist schematisch in den Figuren 33 bis 35 illustriert. Insbesondere bei diesen Anwendungen der Erfindung ist die biologische Probe vorzugsweise mit der Stabilisatorsubstanz versetzt. Gemäß Fi¬ gur 33A ist als Druckbehälter 10 ein zylindrisches Gefäß vorgesehen, das beim dargestellten Beispiel für die Aufnahme eines Fischembryos dimensioniert ist. In den Figuren 33C und 33D sind zwei Tauchyarianten zur Druck-Temperatur-Steuerung beim Einfrieren der Kryokonservierungsvorrichtung 100 illustriert. Gemäß den Figuren 34A und 34B ist entsprechend als Druckbehälter 10 ein kugelförmiges Gefäß gezeigt, das für die Aufnahme eines Organs 4, mit einem Innendurchmesser des The spherical pressure vessel 10 may be alternatively or additionally provided with a pressure adjustment in the shape of a ¬ pansionsbereichs Ex 22 (Figure 32). The expansion section 22 comprises a cylinder piece that is configured as described above for receiving an expansion medium and Dru ¬ cker generation when cooled. Figures 32C and 32D illustrate analogous to those described above procedural ¬ ren cooling and heating of the Kryokonservierungsvor- direction 100th The cryopreservation according to the invention of biological samples comprising organs 4 or whole organisms 5 is illustrated schematically in FIGS. 33 to 35. In particular, in these applications of the invention, the biological sample is preferably added to the stabilizer substance. According Fi gur ¬ 33A is provided as the pressure vessel 10 is a cylindrical vessel, which is dimensioned in the illustrated example for receiving a fish embryo. In FIGS. 33C and 33D, two immersion variants for pressure-temperature control during freezing of the cryopreservation device 100 are illustrated. According to Figures 34A and 34B is shown as a pressure vessel 10, a spherical vessel which is suitable for receiving an organ 4, with an inner diameter of the
Druckbehälters 10 im Bereich von z. B. 10 cm bis 30 cm, di- mensioniert ist. Gemäß Figur 34B ist das Organ 4 in einem Innenbehälter 13 angeordnet. Figur 35 zeigt als Druckbehälter 10 ein kugelförmiges Gefäß, in dem sich Gewebe, Organismen 5 oder Organe in einem Innenbehälter 13, z. B. einem Beutel oder einem dünnwandigen Gefäß, befinden, so dass die Außenlö- sung zum Beutelinnenmedium verschieden gewählt werden kann (z. B. außen Öl, innen Nährlösung mit der Stabilisatorsubstanz) . Pressure vessel 10 in the range of z. B. 10 cm to 30 cm, is dimensioned. According to FIG. 34B, the organ 4 is arranged in an inner container 13. Figure 35 shows a pressure vessel 10, a spherical vessel in which tissue, organisms 5 or organs in an inner container 13, z. B. a bag or a thin-walled vessel, so that the outer solution to the bag inner medium can be chosen differently (eg, outside oil, inside nutrient solution with the stabilizer substance).
Figur 36 zeigt eine Ausführungsform der Kryokonservierungs- Vorrichtung 100, bei der Druck nicht durch die Expansion ei¬ nes gefrierenden Expansionsmedium, sondern durch ein dampfförmiges Expansionsmedium, z. B. verdampfenden flüssigen Stickstoff gebildet wird. Der Expansionsbereich 22, der den flüssigen Stickstoff enthält, ist über eine Druckleitung 39 mit dem Druckbehälter 10 verbunden. Der verdampfende flüssige Stickstoff wird kontinuierlich oder in Portionen vom Expansionsbereich 22 in den Druckbehälter 10 injiziert. Die Figuren 37 bis 39 zeigen Ausführungsformen der Kryokon- servierungsvorrichtung 100, die durch die Bereitstellung mindestens eines Substrats 14 im Innenraum 12 des Druckbehälters 10 für die Kryokonservierung adhärenter Zellen 2 konfiguriert sind. Gemäß den in den Figuren 37A bis 37C gezeigten Varianten befindet sich das Substrat 14 in Gestalt eines langgestreckten Streifens (Zunge) in einem rohrförmigen Druckbehälter 10, der ein- oder beidseitig mit einer Druckschraube 21 und/oder mit einer radial abstehenden Druckschraube 21 ver- schlössen ist. Die Zellen 2 befinden sich im adhärentem Zustand ein- oder beidseitig auf dem Substrat 14, das in geeigneter Weise funktionalisiert sein kann (z. B. durch eine Be- schichtung mit Fibronektin, Polylysin und/oder Wachstumsfaktoren) . Im übrigen ist der Innenraum 12 des Druckbehälters 10 mit dem Konservierungsmedium, ggf. mit der Stabilisatorsubstanz gefüllt. FIG. 36 shows an embodiment of the cryopreservation device 100, in which pressure is not caused by the expansion of a freezing expansion medium but by a vaporous expansion medium, e.g. B. evaporating liquid nitrogen is formed. The expansion region 22, which contains the liquid nitrogen, is connected to the pressure vessel 10 via a pressure line 39. The vaporizing liquid nitrogen is injected continuously or in portions from the expansion region 22 into the pressure vessel 10. FIGS. 37 to 39 show embodiments of the cryoconservation device 100 which are configured by the provision of at least one substrate 14 in the interior 12 of the pressure container 10 for the cryoconservation of adherent cells 2. According to the variants shown in FIGS. 37A to 37C, the substrate 14 is in the form of an elongate strip (tongue) in a tubular pressure vessel 10, which is closed on one or both sides with a pressure screw 21 and / or with a radially protruding pressure screw 21 is. The cells 2 are in the adherent state on one or both sides of the substrate 14, which may be suitably functionalized (eg by coating with fibronectin, polylysine and / or growth factors). Moreover, the interior 12 of the pressure vessel 10 is filled with the preservation medium, optionally with the stabilizer substance.
Figur 37C zeigt zusätzlich ein Substanzreservoir 17, das im Innenraum 12 des Druckbehälters 10 angeordnet ist. Das Sub- Stanzreservoir 17 ist für eine Einführung von mindestens einer Zusatzsubstanz in den Innenraum 12 eingerichtet. Beispielsweise können aus dem Substanzreservoir 17 während des Gefrier- oder Auftauverfahrens Substanzen in den Innenraum 12 diffundieren. Das Substanzreservoir 17 kann eine unter der Wirkung des Druckes im Innenraum 12 zerstörbare Reservoirwand, z. B. aus einem Kunststoff aufweisen. Vorteilhafterweise ermöglicht dies, dass die Zusatzsubstanz erst bei Erreichen eines bestimmten Druckes im Innenraum 12 freigesetzt wird . FIG. 37C additionally shows a substance reservoir 17, which is arranged in the interior 12 of the pressure vessel 10. The sub-punching reservoir 17 is set up for introducing at least one additional substance into the interior space 12. For example, substances may diffuse into the interior space 12 from the substance reservoir 17 during the freezing or thawing process. The substance reservoir 17 may be a destructible under the action of the pressure in the interior 12 reservoir wall, z. B. from a plastic. Advantageously, this makes it possible for the additional substance to be released only when a certain pressure is reached in the interior space 12.
Anstelle des langgestreckten Streifens sind kompliziertere Formen des Substrats 14 verwendbar, wie beispielhaft in Figur 38 gezeigt ist. Gemäß Figur 38A ist ein Substrat 14 mit einem kreuzförmigen Querschnitt illustriert, wobei vorgesehen sein kann, dass Zellen 2 auf allen oder nur einigen Flächen des Substrats 14 angeordnet sind. Gemäß Figur 38B ist ein Sub¬ strat 14 in Gestalt eines Hohlzylinders gezeigt, in dessen Inneren sich die Zellen 2 befinden. Der Hohlzylinder kann aus z. B. aus Keramik, Kunststoff, Zellulose oder Chitin mit ei¬ ner extrem geringen Wanddicke, insbesondere geringer als 250 μπι, hergestellt sein. Vorteilhafterweise ermöglicht dies wie die Verwendung der oben beschriebenen Innenbehälter, dass die Zellen 2 im Inneren anderen Randbedingungen und Lösungen ausgesetzt werden als außerhalb des Substrats 14. Gemäß wei¬ teren Varianten der Erfindung kann das Substrat 14 einen Körper mit einer nano- oder mikrostrukturierten Oberfläche um¬ fassen, die optional mit Wachstums- oder Differenzierungsfaktoren in Gradienten ausgestattet sind. Instead of the elongated strip, more complicated shapes of the substrate 14 can be used, as shown by way of example in FIG. Referring to Figure 38A, a substrate 14 having a cross-shaped cross-section is illustrated, wherein provided For example, cells 2 may be disposed on all or only a few surfaces of the substrate 14. As shown in FIG 38B, a sub ¬ strat is shown in the form of a hollow cylinder 14, the cells are in the interior of the second The hollow cylinder can be made of z. Example of ceramic, plastic, cellulose or chitin with egg ¬ ner extremely small wall thickness, in particular less than 250 μπι, be prepared. Advantageously, this allows as the use of the inner container described above is that the cells 2 are exposed inside the other boundary conditions and solutions to be outside of the substrate 14. According to wei ¬ more advanced versions of the invention, the substrate 14 is a body with a nano- or micro-structured surface to ¬ which are optionally equipped with growth or differentiation factors in gradients.
Die Figuren 39A bis 39E zeigen beispielhaft, dass das Sub¬ strat 14 als separate Komponente (Schiffchen) konfiguriert sein kann, die in den Druckbehälter einschiebbar ist. Die Schiffchen können insbesondere mit einer geschlossenen oder einer offenen Form gebildet sein. Figures 39A to 39E show an example that the sub ¬ strat 14 as a separate component (shuttle) may be configured to be inserted into the pressure vessel. The boats can be formed in particular with a closed or an open mold.
Die Figuren 39A und 40 illustriert ferner eine Variante einer erfindungemäß vorgesehenen Stelleinrichtung zur Steuerung des Druckes im Druckbehälter 10. Als Druckeinstellelement ist bei dieser Variante an mindestens einem Ende des rohrförmigen Druckbehälters 10 ein Wickelabschnitt 31 vorgesehen. Durch ein Eindrehen des Wickelabschnitts 31 am gasfrei mit der biologischen Probe gefüllten Druckbehälter 10 kann in diesem vor der Temperaturabsenkung der Druck erhöht werden. FIGS. 39A and 40 further illustrate a variant of an adjusting device according to the invention for controlling the pressure in the pressure vessel 10. As a pressure adjusting element, a winding section 31 is provided at at least one end of the tubular pressure vessel 10 in this variant. By screwing the winding section 31 on the gas-free filled with the biological sample pressure vessel 10 can be increased in this before the temperature drop, the pressure.
In Figur 40A ist ein rohrförmiger Druckbehälter 10 mit Wickelabschnitten 31 gezeigt. Im Innenraum 12 des Druckbehäl¬ ters 10 befindet sich die biologische Probe 1 mit dem Konservierungsmedium 3. Das Konservierungsmedium 3, in dem sich Zellen 2 befinden, kann die Stabilisatorsubstanz in Form eines Gradienten (z. B. Ficoll oder Percoll verschiedener Konzentration und/oder Molekulargewichtes) enthalten. Gemäß Fi¬ gur 40B können im Innenraum 12 zusätzlich Trennwände 18 vor- gesehen sein, die ein schnelles Vermischen der biologischen Probe 1 und z. B. einen Abbau des genannten Gradienten verhindern und eine Trennung der Zellen in Kompartimente erlauben. Optional können, wie in Figur 40C gezeigt ist, im Innen¬ raum zusätzlich Substanzreservoire in Gestalt von Hohlkugeln 19 vorgesehen sein, die im Konservierungsmedium 3 suspendiert sind und eingerichtet sind, bei einem vorbestimmten Druck zerstört zu werden und ihren Inhalt freisetzen. So können zum Beispiel weitere Gefrierschutz- und Vitrifizierungssubstanzen oder Medien, die die Zellen beim Auftauen unterstützen, frei- gesetzt werden. In Figur 40D ist illustriert, dass im Druck¬ behälter zwei nicht mischbare Lösungen übereinander geschich¬ tet angeordnet sein können. In der ersten Lösung befinden sich die Zellen 2. Über das Gefrierverhalten der Lösungen lassen sich die Druckverhältnisse bei Temperaturänderung ein- stellen. FIG. 40A shows a tubular pressure vessel 10 with winding sections 31. In the interior 12 of the Druckbehäl ¬ age 10 is the biological sample 1 with the preservation medium 3. The preservation medium 3, in which Cells 2 may contain the stabilizer substance in the form of a gradient (eg Ficoll or Percoll of different concentration and / or molecular weight). According Fi gur ¬ 40B may in the inner space 12 in addition partitions 18 be seen upstream, the rapid mixing of the biological sample 1 and z. B. prevent degradation of said gradient and allow a separation of the cells in compartments. Optionally, as shown in FIG. 40C, substance reservoirs in the form of hollow spheres 19, which are suspended in the preservation medium 3 and are set up to be destroyed at a predetermined pressure and release their contents, may additionally be provided. For example, further antifreeze and vitrification substances or media that assist the cells in thawing can be released. In Figure 40D illustrates that in the pressure container ¬ two immiscible solutions may be superposed geschich ¬ tet. In the first solution, the cells are 2. The freezing behavior of the solutions allows the pressure conditions to be set in the event of a temperature change.
Figur 41 illustriert einen rohrförmigen Druckbehälter 10, der einseitig mit einer Druckschraube 21 und einseitig mit einem Wickelabschnitt 31 verschlossen ist. Im Innenraum befindet sich das Konservierungsmedium 3 in Form aufgeschichteter Lösungen (z. B. Ficoll als Gradient oder Überschichtungen ver¬ schiedener Molekulargewichte, d. h. Lösungen mit unterschied¬ licher Dichte) , wie sie bei der Dichtegradientenzentrifuga- tion von Zellen verwendet werden. Die Zellen 2 werden einsei- tig in den Gradienten gegeben (Figur 41A) . Der Druckbehälter 10 wird in senkrechter Form mit den Zellen 2 zentrifugiert , so dass sich verschiedene Zelltypen an den Dichtegrenzflächen sammeln (Figur 41B) . In dieser Anordnung erfolgt dann die Kryokonservierung . In den Figuren 42A und 42B ist eine weitere Ausführungsform der erfindungsgemäßen Kryokonservierungsvorrichtung 100 und deren Anwendung schematisch illustriert. Die Kryokonservie- rungsvorrichtung 100 umfasst einen einseitig mit einer Druckschraube 21 verschlossenen Druckbehälter 10, in dessen Innenraum 12 das Substrat 14 zur adhärenten Aufnahme biologischer Zellen 2 angeordnet ist. Die Druckschraube 21 ist des Weiteren mit einem Wärmeleitelement in Gestalt eines Kühldrahtes 38 ausgestattet, der druckdicht in die Druckschraube 21 integriert ist und sich vom Innenraum 12 bis in die Umgebung des Druckbehälters 10 erstreckt. Der Kühldraht 38 ist ein Me¬ talldraht, z. B. aus Silber. Außerhalb des Druckbehälters 10 ist der Kühldraht 38 zu einem kompakten Bündel, z. B. in Form einer Spirale, eines Knäuels, eines Zylinder oder einer Kugel konzentriert. Beim Einfrieren kann der Kühldraht 38 zuerst in das Kühlbad 210, z. B. aus flüssigem Stickstoff getaucht werden, wodurch sich im Inneren des Rohres Eis nicht an der Behälterwand 11, sondern dem Kühldraht 38 bildet und zur Druck- erhöhung führt. Danach folgt das vollständige Eintauchen des Systems in das Kühlbad 210. FIG. 41 illustrates a tubular pressure vessel 10, which is closed on one side with a pressure screw 21 and on one side with a winding section 31. In the interior of the preservation medium in the form of built-up solutions (z. B. Ficoll gradient or as overlays ver ¬ VARIOUS molecular weights, that is, solutions with different ¬ Licher density) is 3 as in the Dichtegradientenzentrifuga- tion are used by cells. The cells 2 are added to the gradient on one side (FIG. 41A). The pressure vessel 10 is centrifuged in a vertical manner with the cells 2, so that different cell types collect at the sealing boundary surfaces (FIG. 41B). In this arrangement, the cryopreservation then takes place. A further embodiment of the cryopreservation device 100 according to the invention and its application are schematically illustrated in FIGS. 42A and 42B. The cryopreservation device 100 comprises a pressure vessel 10, which is closed on one side with a pressure screw 21 and in the interior 12 of which the substrate 14 for the adherence of biological cells 2 is arranged. The pressure screw 21 is further equipped with a heat-conducting element in the form of a cooling wire 38 which is pressure-tightly integrated into the pressure screw 21 and extends from the inner space 12 into the surroundings of the pressure vessel 10. The cooling wire 38 is a Me ¬ talldraht, z. B. of silver. Outside the pressure vessel 10, the cooling wire 38 is a compact bundle, z. In the form of a spiral, a coil, a cylinder or a sphere. Upon freezing, the cooling wire 38 may first enter the cooling bath 210, e.g. B. are dipped from liquid nitrogen, whereby ice forms not in the interior of the tube on the container wall 11, but the cooling wire 38 and leads to pressure increase. This is followed by the complete immersion of the system in the cooling bath 210.
Die in der vorstehenden Beschreibung, den Zeichnungen und den Ansprüchen offenbarten Merkmale der Erfindung können einzeln oder auch in Kombination für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausgestaltungen von Bedeutung sein. The features of the invention disclosed in the above description, the drawings and the claims may be of importance individually or in combination for the realization of the invention in its various embodiments.

Claims

ANSPRÜCHE 1. Kryokonservierungsvorrichtung (100), die zur Kryokonser¬ vierung einer biologischen Probe (1) eingerichtet ist, umfassend : CLAIMS 1. Kryokonservierungsvorrichtung (100), which is arranged to Kryokonser ¬ crossing of a biological sample (1), comprising:
- einen Druckbehälter (10) mit einer Behälterwand (11) und einem Innenraum (12) , der zur Aufnahme der biologischen Probe (1) eingerichtet ist, wobei  - A pressure vessel (10) having a container wall (11) and an interior space (12) which is adapted to receive the biological sample (1), wherein
- der Druckbehälter (10) für eine Abkühlung mit einer Absen¬ kung der Temperatur und einer Erhöhung des Druckes im Druckbehälter (10) und für die Kryokonservierung der biologischen Probe (1) konfiguriert ist, - The pressure vessel (10) is configured for cooling with a Absen ¬ kung the temperature and an increase in the pressure in the pressure vessel (10) and for the cryopreservation of the biological sample (1),
- der Druckbehälter (10) mit einer Stelleinrichtung (20) ausgestattet ist, die mit der Behälterwand (11) verbunden ist und mindestens ein Druckeinstellelement (21 - 23, 31) und mindestens eines von mindestens einem Kühlelement (34) und mindestens einem Wärmeleitelement (35 - 38) umfasst, und - die Stelleinrichtung (20) für eine zeit- und/oder ortsabhängige Einstellung der Temperatur und des Druckes im Druck¬ behälter (10) konfiguriert ist, - The pressure vessel (10) is equipped with an adjusting device (20) which is connected to the container wall (11) and at least one Druckeinstellelement (21 - 23, 31) and at least one of at least one cooling element (34) and at least one heat conducting element ( is the adjusting device (20) for a time and / or location-dependent setting of the temperature and the pressure in the pressure ¬ container (10) configured to - 35-38), and
dadurch gekennzeichnet dass characterized in that
- das Druckeinstellelement mindestens eines von einer Druck- schraube (21) in der Behälterwand (11), einem Expansionsbereich (22), der zur Aufnahme eines flüssigen oder gasförmigen Expansionsmediums eingerichtet ist und mit dem Innenraum (12) kommuniziert, und einer Druckklammer (23), die von außen auf die Behälterwand (11) wirkt, umfasst.  - The Druckeinstellelement at least one of a pressure screw (21) in the container wall (11), an expansion region (22) which is adapted to receive a liquid or gaseous expansion medium and communicates with the inner space (12), and a pressure bracket (23 ), which acts on the container wall (11) from the outside.
2. Kryokonservierungsvorrichtung gemäß Anspruch 1, bei der - das Druckeinstellelement einen Wickelabschnitt (31) um¬ fasst, der auf ein Ende des Druckbehälters (10) wirkt. 2. Kryokonservierungsvorrichtung according to claim 1, wherein - the Druckeinstellelement a winding portion (31) sums around ¬ acts on one end of the pressure vessel (10).
3. Kryokonservierungsvorrichtung gemäß Anspruch 2, bei der3. cryopreservation device according to claim 2, wherein
- der Expansionsbereich (22) mindestens eine Hohlleitung um- fasst, die vom Druckbehälter (10) absteht. - The expansion region (22) comprises at least one hollow conduit which protrudes from the pressure vessel (10).
4. Kryokonservierungsvorrichtung gemäß Anspruch 3, bei der4. cryopreservation device according to claim 3, wherein
- die mindestens eine Hohlleitung Verzweigungen aufweist und/oder in verschiedenen Raumrichtungen vom Druckbehälter (10) absteht. - Has at least one hollow line branches and / or in different directions from the pressure vessel (10) protrudes.
5. Kryokonservierungsvorrichtung gemäß einem der vorherge- henden Ansprüche, bei der 5. A cryopreservation device according to any one of the preceding claims, wherein
- das Kühlelement eine Kühlleitung (34) umfasst, die im Druckbehälter (10) angeordnet ist.  - The cooling element comprises a cooling line (34) which is arranged in the pressure vessel (10).
6. Kryokonservierungsvorrichtung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der 6. cryopreservation device according to one of the preceding claims, wherein
- das Wärmeleitelement (35 - 38) mindestens eines von einem Profil auf einer Außenseite des Druckbehälters (10), einem Profil auf einer Innenseite des Druckbehälters (10) und Wärmeleitkörpern im Inneren des Druckbehälters (10) umfasst.  - The heat-conducting element (35 - 38) at least one of a profile on an outer side of the pressure vessel (10), a profile on an inner side of the pressure vessel (10) and Wärmeleitkörpern inside the pressure vessel (10).
7. Kryokonservierungsvorrichtung gemäß einem der vorherge¬ henden Ansprüche, bei der 7. cryopreservation device according to one of vorherge ¬ existing claims, wherein
- die Behälterwand (11) des Druckbehälters (10) die Gestalt eines Rohres, einer Kugel oder eines flachen Zylinders aufweist . - The container wall (11) of the pressure vessel (10) has the shape of a tube, a ball or a flat cylinder.
8. Kryokonservierungsvorrichtung gemäß Anspruch 7, bei der - die Behälterwand (11) des Druckbehälters (10) die Gestalt eines gekrümmten Rohres aufweist. 8. cryopreservation device according to claim 7, wherein - the container wall (11) of the pressure vessel (10) has the shape of a curved tube.
9. Kryokonservierungsvorrichtung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der im Innenraum (12) des Druckbehälters (10) vorgesehen ist 9. cryopreservation device according to one of the preceding claims, wherein in the interior (12) of the pressure vessel (10) is provided
- ein Innenbehälter (13), der zur Aufnahme der biologischen Probe (1) eingerichtet ist,  - An inner container (13) which is adapted to receive the biological sample (1),
- ein Substrat (14), das zur adhärenten Aufnahme biologischer Zellen in der biologischen Probe (1) eingerichtet ist,  a substrate (14) adapted for the adherence of biological cells in the biological sample (1),
- eine Segmentierung des Innenraums (12) in Innenraumab- schnitte ( 15 ) ,  a segmentation of the interior (12) into interior sections (15),
- eine Sensoreinrichtung (16) mit mindestens einem von einem Drucksensor (16.1) und einem Temperatursensor (16.2), und/oder a sensor device (16) with at least one of a pressure sensor (16.1) and a temperature sensor (16.2), and / or
- ein Substanzreservoir (17, 19), das zur Freigabe einer Substanz in den Innenraum (12) eingerichtet ist.  - A substance reservoir (17, 19) which is adapted to release a substance in the interior (12).
10. Kryokonservierungsvorrichtung gemäß Anspruch 9, bei der10. cryopreservation device according to claim 9, wherein
- das Substanzreservoir Hohlkugeln (19) aus einem druckempfindlichen Material umfasst, die im Innenraum (12) verteilt angeordnet sind. - The substance reservoir comprises hollow spheres (19) made of a pressure-sensitive material, which are arranged distributed in the interior (12).
11. Kryokonservierungsvorrichtung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der 11. cryopreservation device according to one of the preceding claims, wherein
- die Behälterwand (11) eine Optikeinheit (60) enthält, die für eine optische Beobachtung des Innenraums (12) des Druck- behälters (10) eingerichtet ist.  - The container wall (11) includes an optical unit (60) which is adapted for an optical observation of the interior (12) of the pressure vessel (10).
12. Verfahren zur Kryokonservierung einer biologischen Probe (1), umfassend biologische Zellen (2) und ein Konservierungsmedium (3) , mit den Schritten: 12. A method for cryopreserving a biological sample (1) comprising biological cells (2) and a preservation medium (3), comprising the steps of:
- Bereitstellung der biologischen Probe (1) in einem Druckbehälter (10) mit einer Behälterwand (11) und einem Innenraum (12), und - Providing the biological sample (1) in a pressure vessel (10) having a container wall (11) and an interior space (12), and
- Abkühlung des Druckbehälters (10) in einer Kühlvorrichtung (200) mit einer Absenkung der Temperatur und einer Erhöhung des Druckes im Druckbehälter (10) , wobei die biologische Probe (1) zumindest teilweise in einen kryokonservierten Zustand in einer glasartige Phase überführt wird, - Cooling of the pressure vessel (10) in a cooling device (200) with a lowering of the temperature and an increase the pressure in the pressure vessel (10), wherein the biological sample (1) is at least partially transferred to a cryopreserved state in a vitreous phase,
- der Druckbehälter (10) mit einer Stelleinrichtung (20) aus- gestattet ist, die mindestens ein Druckeinstellelement (21 - - The pressure vessel (10) is equipped with an adjusting device (20), the at least one Druckeinstellelement (21 -
23, 31) und mindestens eines von mindestens einem Kühlelement (34) und mindestens einem Wärmeleitelement (35 - 38) umfasst, und 23, 31) and at least one of at least one cooling element (34) and at least one heat conducting element (35-38), and
- eine zeit- und/oder ortsabhängige Einstellung der Tempera- tur und des Druckes im Druckbehälter (10) unter Verwendung der Stelleinrichtung (20) vorgesehen ist  - A time- and / or location-dependent adjustment of the temperature and the pressure in the pressure vessel (10) using the adjusting device (20) is provided
dadurch gekennzeichnet dass characterized in that
- der Druck im Druckbehälter (10) unter Verwendung einer Druckschraube (21) in der Behälterwand (11), eines Expansi- onsbereiches (22), der zur Aufnahme eines flüssigen oder gasförmigen Expansionsmediums eingerichtet ist und mit dem Innenraum (12) kommuniziert, und/oder einer Druckklammer (23) , die von außen auf die Behälterwand (11) wirkt, eingestellt wird .  - The pressure in the pressure vessel (10) using a pressure screw (21) in the container wall (11), an expansion area (22), which is adapted to receive a liquid or gaseous expansion medium and communicates with the interior (12), and / or a pressure clamp (23), which acts from the outside on the container wall (11) is adjusted.
13. Verfahren gemäß Anspruch 12, bei dem die Einstellung der Temperatur und des Druckes im Druckbehälter (10) die Schritte umfasst : 13. The method according to claim 12, wherein the adjustment of the temperature and the pressure in the pressure vessel (10) comprises the steps:
- Erhöhung des Druckes im Druckbehälter (10) mit dem Druck- einstellelement (21 - 23, 31), und anschließend  - Increasing the pressure in the pressure vessel (10) with the pressure adjusting element (21 - 23, 31), and then
- Absenkung der Temperatur im Druckbehälter (10) mit der Kühlvorrichtung .  - Lowering the temperature in the pressure vessel (10) with the cooling device.
14. Verfahren gemäß Anspruch 13, bei dem 14. The method according to claim 13, wherein
- der Druck im Druckbehälter (10) unter Verwendung eines Wickelabschnitts (31), der auf ein Ende des Druckbehälters (10) wirkt, erhöht wird. - The pressure in the pressure vessel (10) using a winding portion (31) acting on one end of the pressure vessel (10) is increased.
15. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12 bis 14, bei dem - der Expansionsbereich (22) mindestens eine Hohlleitung um- fasst, die vom Druckbehälter (10) absteht, und 15. The method according to any one of claims 12 to 14, wherein - The expansion region (22) comprises at least one hollow conduit which protrudes from the pressure vessel (10), and
- der Druck im Druckbehälter (10) erhöht wird, indem zuerst die mindestens eine Hohlleitung und anschließend der übrige Druckbehälter (10) in ein Kühlbad (210, 220) der Kühlvorrichtung (200) getaucht wird.  - The pressure in the pressure vessel (10) is increased by first the at least one hollow conduit and then the remaining pressure vessel (10) in a cooling bath (210, 220) of the cooling device (200) is immersed.
16. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12 bis 15, bei dem die Einstellung der Temperatur und des Druckes im Druckbehälter (10) die Schritte umfasst: 16. The method according to any one of claims 12 to 15, wherein the adjustment of the temperature and the pressure in the pressure vessel (10) comprises the steps:
- Absenkung der Temperatur im Druckbehälter (10) mit der Kühlvorrichtung, und anschließend  - Lowering the temperature in the pressure vessel (10) with the cooling device, and then
- Erhöhung des Druckes im Druckbehälter (10) mit dem Druckeinstellelement (21 - 23, 31) .  - Increasing the pressure in the pressure vessel (10) with the Druckeinstellelement (21 - 23, 31).
17. Verfahren gemäß Anspruch 16, bei dem 17. The method according to claim 16, wherein
- das Konservierungsmedium eine Stabilisatorsubstanz enthält, die geeignet ist, bei einer Erhöhung der Temperatur der biologischen Probe (1), vorzugsweise bis zu einem Übergang zu einem flüssigen Zustand, die glasartige Phase der unterkühlten Schmelze zu stabilisieren.  - The preservation medium contains a stabilizer substance which is suitable to stabilize the glassy phase of the supercooled melt with an increase in the temperature of the biological sample (1), preferably until a transition to a liquid state.
18. Verfahren gemäß Anspruch 16 oder 17, bei dem die Stabilisatorsubstanz aus mindestens einer der Substanzgruppen aus- gewählt ist, die umfassen: 18. A method according to claim 16 or 17, wherein the stabilizer substance is selected from at least one of the substance groups comprising:
- langkettige ungeladene Polymere mit einem Molekulargewicht größer als 500 g/mol, insbesondere größer als 1000 g/mol, long-chain uncharged polymers having a molecular weight greater than 500 g / mol, in particular greater than 1000 g / mol,
- Monosaccharide, - monosaccharides,
- Ethylenglykol ,  Ethylene glycol,
- Di- und Oligosaccharide, - di- and oligosaccharides,
- Polysaccharide,  - polysaccharides,
- Stärke-Derivate, wie z. B. Stärke-Hydrolyse-Produkte,  - starch derivatives, such as. B. starch hydrolysis products,
- Zuckeralkohole,  - sugar alcohols,
- wasserlösliche Polymere - Kolloide (Nanopartikeldispersionen) , insbesondere mit Silber-, Gold, Diamant- und/oder Nanotube-Partikeln, - water-soluble polymers - colloids (nanoparticle dispersions), in particular with silver, gold, diamond and / or nanotube particles,
- Dendrimere,  - dendrimers,
- Polykationen, und  - polycations, and
- Polyanionen. - Polyanions.
19. Verfahren gemäß Anspruch 18, bei dem die Stabilisator- Substanz von mindestens einer der Substanzen ausgewählt ist, die umfassen: 19. The method of claim 18, wherein the stabilizer substance is selected from at least one of the substances comprising:
- Saccharose-Epichlorhydrin-Copolymer (Ficoll, reg. Name), und - sucrose-epichlorohydrin copolymer (Ficoll, reg. Name), and
- mit Polyvinylpyrrolidon beschichtetes Kieselgel, wie z. B. Percoll (reg. Name) .  - Polyvinylpyrrolidone coated silica gel, such as. B. Percoll (reg. Name).
20. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12 bis 19, bei dem20. The method according to any one of claims 12 to 19, wherein
- die Stabilisatorsubstanz im Konservierungsmedium eine Konzentration aufweist, die geringer als 10 %, insbesondere geringer als 8 %, insbesondere geringer als 5 %, insbesondere geringer als 3 %, insbesondere geringer als 1 % ist. - The stabilizer substance in the preservation medium has a concentration which is less than 10%, in particular less than 8%, in particular less than 5%, in particular less than 3%, in particular less than 1%.
21. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12 bis 20, bei dem21. The method according to any one of claims 12 to 20, wherein
- die Stabilisatorsubstanz im Konservierungsmedium (3) außerhalb der biologischen Zellen (2) angeordnet ist. - The stabilizer substance in the preservation medium (3) outside the biological cells (2) is arranged.
22. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12 bis 21, bei dem22. The method according to any one of claims 12 to 21, wherein
- die Kryokonservierungsvorrichtung (100) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 verwendet wird. - The cryopreservation device (100) is used according to one of claims 1 to 11.
23. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12 bis 22, mit dem Schritt: 23. The method according to any one of claims 12 to 22, comprising the step:
- Lagerung der biologischen Probe (1) unter Aufrechterhaltung des erhöhten Druckes. - Storage of the biological sample (1) while maintaining the elevated pressure.
24. Verfahren zur Vitalitätserhaltenden Erwärmung einer bio¬ logischen Probe (1), umfassend biologische Zellen (1) und ein Konservierungsmedium (3) in einem gefrorenen Zustand, die in einer glasartigen Phase in einem Druckbehälter (10) angeord- net ist, wobei die Temperatur des Druckbehälters (10) und der biologischen Probe (1) erhöht und gleichzeitig im Druckbehälter (10) ein erhöhter Druck oberhalb des Atmosphärendrucks aufrecht erhalten wird. 24. A method for vitality-preserving heating a bio ¬ logical sample (1) comprising biological cells (1) and a preservative medium (3) in a frozen state, which is in a glassy phase in a pressure vessel (10) angeord- net, wherein the Temperature of the pressure vessel (10) and the biological sample (1) increases and at the same time in the pressure vessel (10) an elevated pressure above the atmospheric pressure is maintained.
25. Verfahren gemäß Anspruch 24, bei dem 25. The method according to claim 24, wherein
- im Druckbehälter (10) der erhöhte Druck oberhalb des Atmosphärendrucks aufrecht erhalten wird, bis die biologische Probe (1) einen Übergang vom gefrorenen oder vitrifizierten zum flüssigen Zustand erreicht.  - In the pressure vessel (10) the elevated pressure above the atmospheric pressure is maintained until the biological sample (1) reaches a transition from the frozen or vitrifiziert to the liquid state.
26. Verfahren gemäß Anspruch 25, bei dem 26. The method according to claim 25, wherein
- beim Übergang vom gefrorenen oder vitrifizierten zum flüssigen Zustand der Druck im Druckbehälter (10) reduziert wird.  - Is reduced in the transition from frozen or vitrifiziert to liquid state, the pressure in the pressure vessel (10).
27. Verfahren gemäß Anspruch 26, bei dem 27. The method according to claim 26, wherein
- beim Übergang vom gefrorenen oder vitrifizierten zum flüssigen Zustand der Druck im Druckbehälter (10) instantan reduziert wird. ' - When passing from frozen or vitrifiziert to liquid state, the pressure in the pressure vessel (10) is reduced instantaneously. '
28. Verfahren gemäß Anspruch 26 oder 27, bei dem 28. The method according to claim 26 or 27, wherein
- der Druck im Druckbehälter (10) durch eine Kontraktion der biologischen Probe (1) am Übergang vom gefrorenen oder vitri- fizierten zum flüssigen Zustand reduziert wird.  - The pressure in the pressure vessel (10) is reduced by a contraction of the biological sample (1) at the transition from the frozen or vitri- fected to the liquid state.
29. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 24 bis 28, bei dem29. The method according to any one of claims 24 to 28, wherein
- der erhöhte Druck mindestens 100 MPa, insbesondere mindes¬ tens 150 MPa und/oder höchstens 300 MPa, insbesondere höchstens 250 MPa beträgt. - the elevated pressure is at least 100 MPa, in particular Minim ¬ least 150 MPa and / or at most 300 MPa, is more preferably at most 250 MPa.
30. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 24 bis 29, bei dem30. The method according to any one of claims 24 to 29, wherein
- das Konservierungsmedium (3) eine Stabilisatorsubstanz enthält, die geeignet ist, bei der Erhöhung der Temperatur der biologischen Probe (1), vorzugsweise bis zu dem Übergang, die glasartige Phase der unterkühlten Schmelze zu stabilisieren. - The preservation medium (3) contains a stabilizer substance which is suitable, when increasing the temperature of the biological sample (1), preferably to stabilize the transition, the glassy phase of the supercooled melt.
31. Verwendung einer Stabilisatorsubstanz, die geeignet ist, bei der Erhöhung der Temperatur einer biologischen Probe (1), umfassend biologische Zellen und ein Konservierungsmedium, bis zu einem Übergang zum flüssigen Zustand eine glasartige Phase zu erhalten, bei der Kryokonservierung biologischer Proben ( 1 ) . 31. Use of a stabilizer substance which is suitable for increasing the temperature of a biological sample (1) comprising biological cells and a preservation medium to obtain a glassy phase until a transition to the liquid state, in the cryopreservation of biological samples (1) ,
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109997841A (en) * 2019-04-09 2019-07-12 上海交通大学 Maintain mankind's gamete fast freeze-thaw visible environment cabin of atmospheric air atmosphere

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9936690B2 (en) 2014-03-28 2018-04-10 Board Of Trustees Of Northern Illinois University Ultra-rapid tissue cryopreservation method and apparatus
EP3142487B1 (en) * 2014-05-13 2019-07-03 Assuta Medical Centers Ltd Cell tray
CN108882698A (en) * 2015-10-29 2018-11-23 阿西姆普托特有限公司 Method for cryo-conservation
DE102016005070A1 (en) 2016-04-27 2017-11-02 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Apparatus and method for monitoring the temperature of a cryopreserved biological sample
DE102016005075A1 (en) 2016-04-27 2017-11-02 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Method and device for monitoring the temperature of a cryopreserved biological sample
DE102016005078A1 (en) 2016-04-27 2017-11-02 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Apparatus and method for monitoring the temperature of a cryopreserved biological sample
DE102016005133A1 (en) 2016-04-27 2017-11-02 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Method and device for monitoring the temperature of a cryopreserved biological sample
FR3062284B1 (en) * 2017-01-30 2020-10-09 Genialis PROCESS FOR COOLING A BIOLOGICAL MATERIAL AND ITS CONSERVATION
GB201705652D0 (en) 2017-04-07 2017-05-24 Asymptote Ltd Cryopreservation apparatus and methods
RU2688331C1 (en) * 2018-04-02 2019-05-21 Российская Федерация, от имени которой выступает ФОНД ПЕРСПЕКТИВНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Method for cryopreservation of biological samples under pressure and device for its implementation
CN109964921A (en) * 2019-02-25 2019-07-05 天津美电医疗科技有限公司 Temperature below freezing saves the multiphase volume fixing device of biological substance, system and method
US20210000104A1 (en) * 2019-07-05 2021-01-07 CryoStasis Ltd. Methods, systems and apparatus for preservation of organs and other aqueous-based materials utilizing low temperature and elevated pressure

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3579999A (en) * 1968-08-08 1971-05-25 Redeco Method and apparatus for the preservation of biological substances
US4559298A (en) * 1982-11-23 1985-12-17 American National Red Cross Cryopreservation of biological materials in a non-frozen or vitreous state
US4688387A (en) * 1985-11-12 1987-08-25 Vital Force, Inc. Method for preservation and storage of viable biological materials at cryogenic temperatures
US6054287A (en) * 1994-05-27 2000-04-25 Methodist Hospital Of Indiana, Inc. Cell-type-specific methods and devices for the low temperature preservation of the cells of an animal species
US6047557A (en) * 1995-06-07 2000-04-11 Copeland Corporation Adaptive control for a refrigeration system using pulse width modulated duty cycle scroll compressor
US6337205B1 (en) * 1998-01-06 2002-01-08 Integrated Biosystems, Inc Cryopreservation vial apparatus and methods
DE19826350A1 (en) * 1998-06-12 1999-12-23 Schmid Schoenbein Holger Preservation of blood cells, especially red blood cells
US6194137B1 (en) * 1999-04-13 2001-02-27 Organ Recovery Systems, Inc. Method of cryopreservation of blood vessels by vitrification
DE10025512A1 (en) * 1999-07-06 2001-01-11 Leica Mikrosysteme Ag Wien High pressure freezing device for attainment of fine crystalline or amorphous state with rapid freezing of water-containing substances, especially biological probes
DK2309245T3 (en) * 2003-03-28 2016-01-04 Inguran Llc Methods for providing sex-sorted animal semen
HU0302888D0 (en) * 2003-09-09 2003-11-28 Pribenszky Csaba Dr In creasing of efficacity of stable storage by freezing of embryos in preimplantation stage with pretreatment by pressure
WO2005022996A1 (en) * 2003-09-09 2005-03-17 Cryo-Innovation Kft. Improving post-thaw survival of cryopreserved biological material by hydrostatic pressure challenge
US7643472B2 (en) * 2005-10-19 2010-01-05 At&T Intellectual Property I, Lp Methods and apparatus for authorizing and allocating outdial communication services
US20100184012A1 (en) * 2006-04-04 2010-07-22 Voelker Mark A Methods and devices for imaging and manipulating biological samples
AT505427B1 (en) * 2007-07-06 2011-05-15 Leica Mikrosysteme Gmbh PROCESS FOR FREEZING CONSERVATION OF SAMPLES
CN101939631A (en) * 2008-01-17 2011-01-05 库克泌尿科学公司万斯产品公司 Be used for vitrified quick cooling device
AT508582B1 (en) * 2009-07-01 2011-09-15 Leica Mikrosysteme Gmbh METHOD FOR PRODUCING A WATER-RESISTANT SAMPLE INCLUDED IN A SAMPLE CONTAINER AND A SAMPLE CONTAINER FOR IMPLEMENTING THE PROCESS
EP2482761A4 (en) * 2009-09-30 2014-03-19 Brigham & Womens Hospital Tissue transplant compositions and methods for use
US8834067B2 (en) * 2010-07-06 2014-09-16 Paul Joseph Hubbell, JR. Oil containment barrier boom for shorelines/marshes/wetlands
US20120210734A1 (en) * 2011-02-22 2012-08-23 Hoffman Gary A Production and use of high pressure for cryopreservation and cryofixation
US10440644B2 (en) * 2012-06-29 2019-10-08 Qualcomm Incorporated Methods and apparatus for turbo decoder throttling

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J. L. M. LEUNISSEN; H. YI, JOURNAL OF MICROSCOPY, vol. 235, 2009, pages 25 - 35
JACKSON ET AL., J. PHYS. CHEM., 1997
LOVELOCK JE, BIOCHEMICAL JOURNAL, vol. 56, no. 2, 1954, pages 265 - 270
LOVELOCK JE; BISHOP MWH, NATURE, vol. 183, 1959, pages 1394 - 1395
POLGE C; SMITH AU; PARKES AS, NATURE, vol. 164, 1949, pages 666

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109997841A (en) * 2019-04-09 2019-07-12 上海交通大学 Maintain mankind's gamete fast freeze-thaw visible environment cabin of atmospheric air atmosphere
CN109997841B (en) * 2019-04-09 2021-02-02 上海交通大学 Human gamete rapid freezing and thawing visualization environment cabin maintaining atmospheric air atmosphere

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