WO2013022157A1 - 피불린-3 단백질을 유효성분으로 함유하는 암 줄기세포 성장 억제용 약학적 조성물 - Google Patents

피불린-3 단백질을 유효성분으로 함유하는 암 줄기세포 성장 억제용 약학적 조성물 Download PDF

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cancer stem
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김인규
신병철
김국찬
김서연
김민정
이소용
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한국원자력연구원
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Definitions

  • composition for inhibiting cancer stem cell growth containing fibulin-3 protein as an active ingredient
  • the present invention relates to a method for inhibiting the growth of cancer stem cells using fibulin-3 or a pharmaceutical composition for inhibiting cancer stem cell growth containing fibulin-3 protein as an active ingredient.
  • cancer stem cell because it had.
  • the paradigm of cancer stem cells is that tumors are caused by specific cell populations that show various potential potency and self renewal [BM Boman, MS Wicha, Cancer stem cells: a step toward the cure, J Clin. Oncol.
  • cancer stem cells show resistance to anticancer drugs developed so far. 80% to 90% of cancer cells In fact, there is no recurrence, but the remaining 10 to 20% (tumor stem cells) do not die and remain relapsed when the anticancer drug is administered.
  • the anticancer agent that removes cancer stem cells by targeting cancer stem cells having the characteristics of pleasant cells beyond the limitations of current cancer treatment methods that attack cancer cells only. Need development
  • chemotherapy is mainly used for surgery, chemotherapy and radiotherapy.
  • various agents and radiation are used, but their application is limited to the range that the human body can afford.
  • the limited application of these chemotherapy and radiotherapy results in the fact that no matter how good they can be in animal studies, they have the disadvantage of offsetting the effect, limiting coverage and limiting efficacy in the clinic. This is due to the emergence of anticancer drug resistant cancer cells or side effects due to the cytotoxicity of each therapy.
  • Cisplatin for example, is the most effective cancer treatment and is one of the 30 most effective anticancer drugs currently used in the clinic.
  • radiation therapy is an anticancer therapy that treats various cancers occurring in the human body by irradiating the affected area with an appropriate amount of radiation.
  • Such radiotherapy reduces the hematopoietic function of the human body and suppresses the immune system, thereby improving the effectiveness of cancer treatment.
  • cancer cells become resistant due to repeated irradiation, the radiation therapy also has limitations in anticancer therapy.
  • markers of such cancer stem cells CD133 (prominin-1 or AC133) and CD44 (hyaluronate receptor or P-glycoprotein 1) are used. Recently, acetaldehyde dehydrogenases (ALDH1) have been identified.
  • ALDH Detoxifying enzymes that oxidize intracellular aldehydes, resulting in significant resistance to alkylating agents or oxidative stress [Blood 87 (1996) 1097-1103; Chem. Biol. Interact. 143-144 (2003) 5-22].
  • ALDH converts retinol (Vit amine A) into retinoic acid, the most active form of retinoids important for the treatment and prevention of cancer, thereby affecting cell growth and proliferation.
  • ALDH is generally known to have 19 genes and is divided into ALDH1, 2, and 3 classes.
  • ALDH1 has retinal dehydrogenase activity that converts retinal to retinoic acid, and ALDH1A1 and ret inal dehyde dehydrogenase 3 are most efficient. Has activity [Biochim. Biophys. Acta 1790 (2009) 1660-1664. Therefore , the activity of ALDH1 is important to isolate the subpopulation of cancer stem cells in lung cancer cell lines [Mol. Cancer. Res. 7 (2009) 330-338. The winter t / (3-catenin) pathway has recently been reported to play an important role in the generation of cancer stem cells that cause cancer recurrence (Nature Reviews Cancer 5, 744-749 (September 2005)).
  • wnt is well known to be active in cancer, resulting in glycogen synthase kinase 3: GSK3) activity is inhibited and beta-catenin, a substrate of GSK3, accumulates, and this abnormal wnt pathway induces neoplastic prol i ferat ion.
  • GSK3 glycogen synthase kinase 3
  • beta-catenin a substrate of GSK3
  • this abnormal wnt pathway induces neoplastic prol i ferat ion.
  • (Fibulin) protein family are extracellular matrix Elastic cells (extracel hilar matrix,
  • ECM As a protein bound to ECM, it is a protein that contributes to cell-to-cell interactions or to cell-to-substrate interactions.
  • Six types are known from Type 1 to Type 6.
  • Such Fibulin proteins are proposed as new gene targets that suppress tumors in some species.
  • fibulin-3 homologous to fibulin-5 acts on cell growth regulation and some tumors, and fibulin-5 inhibits tumor proliferation, invasion, vascular endothelial growth factor and tumor angiogenesis.
  • fibulin-3 homologous to fibulin-5 acts on cell growth regulation and some tumors, and fibulin-5 inhibits tumor proliferation, invasion, vascular endothelial growth factor and tumor angiogenesis.
  • Fibulin-3 is also known to reduce cell growth regulation, reduce tumor angiogenesis and some tumors [Cancer Res. 66 (2006) 2621-2629.
  • the effect of fibulin 3 on cancer stem cells, which can cause tumors to develop or maintain their properties and resist chemotherapy is not yet known.
  • the present inventors isolated cancer stem cells using ALDH1 activity as a marker in H460 and A549 cells, which are non-small cell lung cancer cells but with different sensitivity to cytotoxicity such as permeability and ionizing radiation, and isolated ALDH1 activity or inactivation. It was confirmed that there was a difference in the expression level of fibrin # 3 in the cells.
  • fibulin-3 when the expression level of fibulin-3 is increased in the isolated cells, beta-catenin ( ⁇ -catenin) and infiltration related factors ⁇ P-2 and ⁇ P-7 which decreases the characteristics of cancer stem cells decrease, It was confirmed that the growth of cancer stem cells was reduced by fibulin-3, which was the same result even when treated with the medium overexpressing fibulin-3.
  • a fibrin-3 purified vector was prepared to purify the fibulin-3 protein, and the purified fibulin-3 protein is A549 cells which are non-small cell lung cancer cells, MDA-MB231 cells which are breast cancer cells, and cancer enjoyment cells.
  • the present invention was completed by identifying that the fiblin-3 may be usefully used as a composition for inhibiting growth of cancer stem cells by confirming that it inhibits cell growth of phosphorus ALDH1 activated cells.
  • An object of the present invention is to provide a fibulin-3 protein having cancer stem cell growth inhibitory activity.
  • another object of the present invention comprising the step of treating a fibulin ⁇ 3 overexpressing cell line or culture medium thereof produced by transforming an effective amount of fibulin-3 protein or fibulin-3 gene in cancer stem cells It is to provide a method for inhibiting growth of cancer stem cells.
  • Another object of the present invention is to provide a method for inhibiting cancer stem cell growth comprising administering a pharmaceutically effective amount of fibrin-3 protein to a subject having cancer stem cells.
  • Another object of the present invention comprising administering to a subject with cancer-loving cells a fibulin-3 overexpressing cell line or a culture thereof prepared by transforming a pharmaceutically effective amount of fibulin-3 gene It is to provide a method for inhibiting cancer stem cell growth.
  • Still another object of the present invention is to provide a use of fibulin ⁇ 3 protein for use in the manufacture of a pharmaceutical composition for inhibiting cancer stem cell growth.
  • Another object of the present invention to use in the manufacture of a pharmaceutical composition for inhibiting cancer stem cell growth, provides a use of a fibulin I overexpressing cell line prepared by transforming the fibulin-3 gene or a culture thereof It is to.
  • the present invention provides a fibulin-3 protein having cancer stem cell growth inhibitory activity.
  • the present invention is fibulin-3 (fibulin-3) having cancer stem cell growth inhibitory activity It provides a pharmaceutical composition for inhibiting cancer stem cell growth containing a protein as an active ingredient.
  • the present invention provides a method for inhibiting growth of cancer stem cells comprising the step of treating an effective amount of fibulin-3 in cancer stem cells.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for inhibiting cancer stem cell growth, comprising a fibulin-3 overexpressing cell line prepared by transforming a fibulin-3 gene or a culture medium thereof as an active ingredient.
  • the present invention also provides a method for inhibiting growth of cancer stem cells, comprising the step of treating a fibulin-3 overexpressing cell line or a culture medium thereof prepared by transforming the fibulin-3 gene.
  • the present invention also provides a method for inhibiting cancer stem cell growth comprising administering a pharmaceutically effective amount of fibrin-3 protein to a subject having cancer stem cells.
  • the present invention is a method for inhibiting cancer stem cell growth comprising administering to a subject with cancer stem cells a fibulin-3 overexpressing cell line or culture medium prepared by transforming a pharmaceutically effective amount of fibulin-3 gene To provide.
  • the present invention also provides the use of a fibulin-3 protein for use in the manufacture of a pharmaceutical composition for inhibiting cancer stem cell growth.
  • the present invention provides a use of a fibulin-3 overexpressing cell line prepared by transforming a fibulin-3 gene or a culture thereof for use in the manufacture of a pharmaceutical composition for inhibiting cancer stem cell growth.
  • the fibulin-3 protein of the present invention is a beta-catenin ( ⁇ - catenin) and infiltration-related factors ( ⁇ P ⁇ 2 and — P— 7) can effectively inhibit the activated cell growth of cancer stem cells, inhibit the growth of non-small cell lung cancer cells, breast cancer cells and cancer stem cells, pharmaceuticals for inhibiting cancer stem cell growth It can be usefully used in a composition.
  • ⁇ - catenin beta-catenin
  • infiltration-related factors ⁇ P ⁇ 2 and — P— 7
  • FIG. 1 is a diagram showing a protein purification vector by attaching a histidine protein sequence to the c-terminal region of the fibulin-3 gene.
  • FIG. 2 is a diagram showing the result of separating ALDH1 active cells and ALDH1 inactive cells using an FACS machine after Aldefluor staining on A549 cells;
  • AL (-) cells without ALDH1 activity.
  • Figure 3 is the result of overexpressing the fibulin-3 gene with histidine attached to CH0-K1 cells and confirmed the expression through reverse transcriptase reaction and Western blot;
  • RT-PCR reverse transcriptase Banung
  • pcDNA CH0-K1 cells overexpressed void as control; And ,
  • His-pibulin 3 ⁇ - ⁇ cells overexpressing a fibulin-3 vector with histidine attached.
  • FIG. 4 shows the results of colony formation analysis of A549 cells, ALDH1 active cells isolated from A549, and ALDH1 inactive cells isolated from A549;
  • A549 colony formation of A549 cells
  • ALDH + colony formation of cells with ALDH1 activity
  • ALDH- Colony formation in cells without ALDH1 activity.
  • Figure 5 shows the results of ALDH1 activated cells and ALDH1 inactive cells isolated from A549, the expression level of ALDH1A1, betacatenin, and fibulin-3 using A549 cells as a control, through reverse transcriptase polymerase reaction;
  • ALDH1A1 ALDH1.
  • RT-PCR result of reverse transcriptase polymer reaction
  • Western Result of Western Blot.
  • A549 A549 cell
  • A549 / V.C A control in which a vector was expressed in A549 cells
  • A549 / pcFBLN3 expresses fibulin _3 overexpressing vector in A549 cells;
  • H460 H460 cells
  • H460 / siCtl a control in which sicon vector was expressed in H460 cells
  • H460 / siFBLN3 expresses fibulin-3 expression inhibitory vector in H460 cells
  • FBLN 3 fibulin-3
  • RT-PCR result of reverse transcriptase polymer reaction
  • FIG. 8 shows the results of Western blot analysis of microscopic photographs and beta-catenin expression of cells observed after treatment of fibulin-3 overexpression medium or H460 cell culture medium with overexpression of fibulin-3 in A549 cells. ;
  • A549 A549 cell
  • A549 / H460 M cells in which A549 cells were treated with H460 culture medium; And ,
  • A549 / FBLN3 (+) M Cells treated with the culture medium of A549 cells overexpressing the fibulin-3 protein in A549 cells.
  • Figure 9 is treated with fibulin-3 overexpression medium or H460 cell culture medium overexpressing fibrin-3 in A549 cells, or in H460 cell culture medium overexpressing fibulin-3 overexpression medium or fibulin-3 Western blot confirmed the change in the expression levels of betacatenin, P-2 and V-7 in cells treated with fibrin-3 antibody;
  • A549 A549 cell
  • A549 / H460 M A549 cells were treated with H460 culture medium
  • A549 / FBLN3 (+) M treated with a culture medium of A549 cells overexpressing fibulin-3 protein in A549 cells;
  • A549 / H460 M + FBLN3 Ab treating A549 cells with H460 culture medium and fibulin-3 antibody; And, A549 / FBLN3 (+) M + FBLN3 Ab: Treated culture medium and fibulin-3 antibody of A549 cells overexpressing fibulin-3 protein in A549 cells.
  • FIG. 10 shows HLD cell culture medium in which ALDH1 activated cells are treated with fibulin-3 overexpression medium or H460 cell culture medium overexpressing fibulin-3, or fibulin-3 overexpression medium or fibulin-3 overexpression Western blots showed changes in the expression levels of betacatenin, MMP-2 and MMP-7 in cells treated with epiphyllin-3 antibody;
  • ALDH + ALDH1 active cells
  • ALDH + / H460 M ALDH1 activated cells were treated with culture medium of H460 cells
  • ALDH + / H460 M + FBLN3 Ab ALDH1 activated cells were treated with culture medium of H460 cells and fibrin-3 antibodies
  • FIG. 11 shows the results of colony formation of A549 cells after treatment with different concentrations of fibulin ⁇ 3 overexpression medium and H460 cell culture medium overexpressing fibulin-3 in A549 cells;
  • Control group control group treated with growth medium of A549 cells
  • Fibulin 3-% ratio of fibulin-3 overexpression medium in the culture medium of A549 cells overexpressing fibulin ⁇ 3 and the mixed medium of A549 growth medium; And ,
  • H460-% ratio of H460 cell culture medium in the mixed medium of H460 cells and the mixed medium of A549 growth medium.
  • FIG. 12 shows the result of confirming colony formation after treatment of the culture medium of CH0-K1 cells or 293T cells overexpressing the heath-pibulin-3 vector at A549 cells at a rate of 50%;
  • CH0-K1 medium medium of CH0-K1 cells overexpressed Hispenfibulin-3 vector
  • 293T medium medium of 293T cells overexpressed his-pibulin-3 vector
  • b Graph of colony count results.
  • Figure 13 shows the results of colony formation after treatment of purified fibulin-3 protein to A549 cells
  • CH0- 1 24h-l A549 cells treated with 1 ug of fibulin protein purified from CH0-K1 cells overexpressing his-fibulin-3 vector after 24 hours;
  • CH0-K1 24h—2 A549 cells treated with 1 ug after 24 hr of purified fibulin protein purified from CH0-K1 cells overexpressing his-pibulin-3 vector, and again after 1 ug after 24 hr;
  • 293T 24h-l A549 cells treated with 1 ug of fibulin protein purified from 293T cells overexpressing hissingfibulin-3 vector after 24 hours;
  • 293T 24h'2 A549 cells treated with 1 ug after 24 hours of purified fibulin protein purified from 293T cells overexpressing his-pibulin-3 vector and once again after 24 hours;
  • CH0-K1 24h-l MDA-MB231 cells treated with 1 ug of fibulin protein purified from CH0-K1 cells overexpressing a histopipilin-3 vector after 24 hours;
  • CH0-K1 24h-2 MDA-MB231 treated with 1 ug of purified fibulin protein in CH0-K1 cells overexpressing his-pibulin-3 vector after 24 hours, and then again 1 L1 g after 24 hours cell;
  • 293T 24h-l MDA—MB231 cells treated with 1 ug of purified fibulin protein after 24 hours in 293T cells overexpressing a His-Goblin-3 vector;
  • 293T 24h-2 MDA-MB231 cells treated with 1 ug after 24 hours of purified fibulin protein purified from 293T cells overexpressing his-pibulin ⁇ 3 vector and once again after 24 hours; pc-DNA: control group; And ,
  • ALDH1 + ALDH1 active cells
  • Control group control group treated with growth medium of ALDH1 cells
  • Fibulin 3-% ratio of fibulin-3 overexpression medium in the mixed medium of A549 cells overexpressing fibulin ⁇ 3 and ALDH1 growth medium; And ,
  • H460-% ratio of H460 cell culture medium in the mixed medium of H460 cells and ALDH1 growth medium.
  • FIG. 16 shows the result of confirming colony formation after treatment of the culture medium of CH0-K1 cells or 293T cells overexpressing his-pibulin-3 vector with ALDH1 active cells at a rate of 50 3 ⁇ 4;
  • ALDH + ALDH1 active cells
  • CH0-K1 medium medium of CHO—K1 cells overexpressed his-pibulin-3 vector
  • 293T medium medium of 293T cells overexpressed his-fibulin-3 vector
  • b Graph of colony count results.
  • ALDH + ALDH1 active cells
  • CHO-Kl 24h-l ALDH1 activating cells treated with 1 ug of fibulin protein purified from ALDH1 activating cells overexpressing his-pibulin-3 vector after 24 hours;
  • CHO-Kl 24h-2 ALDH1 activating cells treated with 1 ug after 24 hr of purified fibulin protein in ALDH1 activating cells overexpressing his-pibulin-3 vector and again after 1 ug after 24 hr;
  • 293T 24h-l ALDH1 activating cells treated with 1 ug of fibulin protein purified from 293T cells overexpressing Hissopiblin-3 vector 24 hours later;
  • the present invention provides fibulin-3 (fibL in-3) protein having cancer stem cell growth inhibitory activity.
  • the fibulin-3 protein preferably has one amino acid sequence selected from the amino acid sequences of 1) to 3), but is not limited thereto.
  • the cancer is lung cancer or breast cancer, and the lung cancer is more preferably non-small cell lung cancer.
  • the cancer is lung cancer or breast cancer, and the lung cancer is more preferably non-small cell lung cancer.
  • the present inventors A fibulin ⁇ 3 vector with a histidine protein attached to the c-terminal site was prepared (see FIG. 1), and to confirm the expression of the vector, CH0-K1 cells (Biotechnology Research Institute, Daejeon) and 293T cells (Hanyang University) , Seoul), respectively, and overexpression of fibulin-3 protein was confirmed by polymerase chain reaction and Western blot (see FIG. 3).
  • the medium was grown to A549 cells and cancer stem cells ALDH1 activated cells that are non-small cell lung cancer. This inhibition was confirmed (see FIGS. 11 and 16).
  • using the transduced cell line to purify the fibulin-3 protein and confirmed the growth inhibitory effect of cancer cells of the purified fibulin-3 protein, A549 cells, non-small cell lung cancer cells, cancer stem cells It was confirmed that there is an effect of inhibiting cell growth in ALDH1 activated cells and MDA-MB231 cells which are breast cancer cells (see FIGS. 12, 17 and 13).
  • the fibulin ⁇ 3 protein can be usefully used to inhibit the growth of cancer cells and cancer stem cells.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for inhibiting cancer stem cell growth, which contains the fibrin-3 protein according to the present invention as an active ingredient.
  • the fibulin-3 protein preferably has one amino acid sequence selected from the amino acid sequences of 1) to 3), but is not limited thereto.
  • the cancer is lung cancer or breast cancer, and the lung cancer is more preferably non-small cell lung cancer.
  • the cancer stem cell is a marker of cancer stem cells CD133 (prominin-l; AC 133),
  • CD44 honeyironate receptor; P— glycoprotein 1
  • ALDHl is preferably selected from any one selected from the group consisting of ALDH1 is more preferably selected, but not limited thereto.
  • the present inventors are non-small cell lung cancer cells Cancer stem cells were distinguished and selected using ALDEFLUOR products (stem cells) based on ALDH1 activity in A549 cells (see FIG. 2).
  • the present inventors analyzed the growth of ALDH1 activated cells and ALDH1 inactive cells isolated by colony formation experiments to identify the difference between non-small cell lung cancer and cancer stem cells.
  • ALDH1 activated cells grew better than A549 cells, whereas ALDH1 inactive cells did not grow than A549 cell control, indicating that ALDH1 activated cancer stem cells are the driving force for non-small cell lung cancer growth.
  • RT-PCR reverse transcriptase polymerase chain reaction
  • Western blot Western blot to confirm the expression levels of ALDH1, fibulin3 and betacatenin in ALDH1 active and inactive cells.
  • the present inventors overexpressed fibulin-3 in A549 cells with high expression of beta-catenin in order to confirm the expression level of betacatenin by fiblin-3 (fibulin-3).
  • the vector was transduced, and H460 cells with little beta-catenin expression level were inhibited with fibrin-3 expression by siRNA for fibulin-3 inhibition.
  • beta-catenin expression was reduced in A549 cells overexpressing fibulin-3, and in contrast, beta-catenin expression was increased in H460 cells in which fibulin-3 was inhibited (see FIGS. 6 and 7). ).
  • overexpressed fibulin-3 inhibits betacatenin, which is important for cancer stem cell growth, and that fibulin-3 may be useful for inhibiting growth of cancer stem cells.
  • fibulin-3 may be useful for inhibiting growth of cancer stem cells.
  • the present inventors inhibit the expression of beta-catenin and the invasion factor ⁇ P-2,7, which are important for tumorigenesis and proliferation by fibulin-3 in non-small cell lung cancer cells A549.
  • the A549 cells were treated with the culture medium of A549 cells overexpressing fibulin-3 and the culture medium of H460 cells with high expression of fibulin-3.
  • the cells treated with the medium were killed. It was confirmed by a microscope, it was confirmed that the expression of beta-catenin and -2 P-2, 7 compared to the control (see FIGS. 8 and 9).
  • the fibulin-3 antibody was used to further confirm that the result was due to fibulin-3.
  • fibulin ⁇ 3 directly inhibits the expression of betacatenin and ⁇ P– 2,7.
  • the inventors of the present invention to determine the expression of beta-catenin and ⁇ ?-2,7 by fibulin -3 in cancer enjoyment cells.
  • the culture medium and the culture medium of H460 cells having high expression of fibulin-3 were treated with ALDH1 activated cells and Western blot was performed.
  • the beta-catenin and MMP ⁇ 2,7 expression was reduced in the two medium-treated group.
  • the fibulin-3 antibody was used to further confirm that the result was due to fibulin-3 (see FIG. 14).
  • fibulin-3 inhibited the growth of non-small cell lung cancer cells.
  • growth of A549 cells was inhibited in a concentration-dependent manner both in the culture medium of A549 cells overexpressing fibulin-3 and the culture medium overexpressing medium of H460 cells expressing high fibulin-3. It was confirmed (see FIG. 10).
  • the present inventors conducted colony formation experiments to determine whether the growth of cancer-like cells is inhibited by fibulin-3, and as a result, the concentration of medium in both of the fibulin ⁇ 3 overexpressing medium was mixed. It was confirmed that the growth of ALDH1 activated cells was inhibited (see FIG. 10).
  • the present inventors overexpressed the heat-fibulin-3 vector for the expression of fibulin-3 protein in CHCHQ cells and 293T cells, which are easy to purify proteins, and then cultured the culture medium for 48 hours to form non-small cell lung cancer cells.
  • the cell treated with the medium was confirmed that the cell growth is inhibited compared to the control (see FIGS. 11 and 16).
  • the inventors of the present invention in order to determine whether the growth of cancer cells and cancer stem cells by purified fibulin-3 protein is inhibited A549 cells, non-small cell lung cancer cells, breast cancer cells MDA-MB231 cells and cancer stem cells Colony formation experiments were carried out after treatment of ALDH1 activated cells with fibrin-3 purified protein obtained by transforming a fibulin-3 protein-expressing heath-fibulin3 vector into CH0-K1 cells or 293T cells.
  • A549 cells which are non-small cell lung cancer cells
  • MDA 'MB231 cells which are breast cancer cells
  • ALDH1 activated cells which are cancer stem cells (see FIGS. 12, 13, and 17).
  • the fibulin-3 protein may inhibit the cell growth and penetration factors of cancer-proliferating cells in inhibiting the growth of cancer stem cells. It can be usefully used as.
  • the therapeutically effective amount of the composition of the present invention may vary depending on several factors, such as the method of administration, the target site, the condition of the patient, and the like. Therefore, when used in humans, the dosage should be determined in an appropriate amount in consideration of both safety and efficiency. It is also possible to estimate the amount used in humans from an effective amount determined through animal testing. These considerations in determining the effective amounts are given in, for example, Hardman and Limbird, eds. , Goodman and Gi lman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed. (2001), Pergamon Press; and E.W. Mart in ed. , Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed. (1990), Mack Publishing Co.
  • compositions of the present invention may also include carriers, diluents, excipients or combinations of two or more commonly used in biological agents.
  • Pharmaceutically acceptable carriers are not particularly limited so long as they are suitable for in vivo delivery of the composition, for example, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc.
  • Compounds, saline solution, sterile water, Ringer's solution, buffered saline solution, dextrose solution, maltocholine solution, glycerol, ethane and one or more of these ingredients can be used in combination.
  • Other conventional additives such as bacteriostatic agents can be added.
  • diluents may be additionally added to formulate main formulations, pills, capsules, granules or tablets such as aqueous solutions, suspensions, emulsions and the like.
  • diluents such as aqueous solutions, suspensions, emulsions and the like.
  • dispersants such as aqueous solutions, suspensions, emulsions and the like.
  • surfactants such as aqueous solutions, suspensions, emulsions and the like.
  • binders and lubricants may be additionally added to formulate main formulations, pills, capsules, granules or tablets such as aqueous solutions, suspensions, emulsions and the like.
  • lubricants may be additionally added to formulate main formulations, pills, capsules, granules or tablets such as aqueous solutions, suspensions, emulsions and the like.
  • Remington's Pharmaceutical Sc ience Mack Pub 1 ishing Company, East on PA, 18th, 1990
  • composition of the present invention comprises 0.0001 to 10% by weight of the protein, preferably 0.001 to 1% by weight, based on the total weight of the composition.
  • the composition of the present invention can be administered orally (for example, intravenously, subcutaneously, intraperitoneally or topically) or orally according to the desired method, and the dosage is based on the patient's weight, age, sex, health condition, The range varies depending on the diet, the time of administration, the method of administration, the rate of excretion and the severity of the disease.
  • the daily dose of the composition according to the present invention is 0.0001 to 10 mg / m «, preferably 0.0001 to 5 mg / m «, more preferably administered once a day to dividing the water.
  • the present invention also provides a method for inhibiting growth of cancer stem cells, comprising the step of treating an effective amount of fibulin-3 in cancer enjoyment cells.
  • the present invention also provides a method for inhibiting cancer stem cell growth comprising administering a pharmaceutically effective amount of fibulin-3 protein to a subject having cancer stem cells.
  • the cancer is lung cancer or breast cancer, and the lung cancer is more preferably non-small cell lung cancer.
  • the inventors of the present invention provide a culture medium of ALDH1 active cells overexpressing fibulin-3 protein to determine whether cancer-bearing cells are inhibited by fibulin-3 and fibulin-3 protein.
  • the culture medium of H460 cells having high expression of A460 was isolated from cancer stem cells in A549 cells and treated with ALDH1 activated cells, and then colony formation experiments were performed.
  • the purified fibulin-3 protein was purified by transforming histofibrin-3 vector for purification of fibulin-3 protein into CH0-K1 cells or 293T cells, and the ADA cell, which is a non-small cell lung cancer cell, and the MDA ⁇ , a breast cancer cell.
  • the fibulin-3 protein of the present invention can be usefully used for a method of inhibiting the growth of cancer cell.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for inhibiting cancer stem cell growth, comprising a fibulin-3 overexpressing cell line prepared by transforming a fibulin-3 gene or a culture medium thereof as an active ingredient.
  • the cancer is lung cancer or breast cancer, and the lung cancer is more preferably non-small cell lung cancer.
  • the present invention provides a method for inhibiting growth of cancer stem cells, comprising the step of treating a fibulin-3 overexpressing cell line or a culture medium prepared by transforming the fibulin-3 gene.
  • the present invention is a method for inhibiting cancer stem cell growth comprising administering to a subject with cancer stem cells a fibulin-3 overexpressing cell line or culture medium prepared by transforming a pharmaceutically effective amount of fibulin-3 gene To provide.
  • the cancer is lung cancer or breast cancer, and the lung cancer is more preferably non-small cell lung cancer.
  • fibulin-3 The overexpressing vector was overexpressed in 5 x 10 5 ALDH1 active cells and treated with ALDH1 activated cells for 48 hours of culture and for 48 hours incubation of 5 ⁇ 10 5 ⁇ 460 cells for Western blot. As a result, it was confirmed that the expression of beta-catenin and ⁇ 2,7 related to the growth of cancer stem cells was reduced in the two medium-treated groups.
  • the fibulin-3 antibody was used to further confirm that the result was due to fibulin-3. Through these results, the fibulin-3 overexpressing cell line prepared by transforming the fibulin-3 gene 11010001
  • the present inventors conducted colony formation experiments to confirm whether the growth of cancer stem cells is inhibited by fibulin-3, and as a result, the concentration of medium in both of the fibulin ⁇ 3 overexpressing medium was mixed. It was confirmed that the growth of ALDH1 activated cells was inhibited.
  • the inventors of the present invention transformed a culture medium by transforming a heath-fibulin-3 vector for the expression of a fibulin-3 protein into CH0-K1 cells or 293T cells, which are easy to purify proteins, of lung cancer cells, breast cancer cells and cancer stem cells. Colony formation experiments were conducted to see if they inhibited growth. As a result, it was confirmed that the growth of lung cancer cells, breast cancer cells and cancer stem cells by the culture medium.
  • the fibulin ⁇ 3 overexpressing cell line prepared by transforming the fibulin-3 gene or its culture medium inhibited the growth and penetration factor of cancer stem cells.
  • Fibulin-3 overexpressed cell lines or cultures thereof may be usefully used in the pharmaceutical composition for inhibiting the growth of cancer-loving cells and methods for inhibiting cancer stem cell growth.
  • the present invention also provides the use of fibulin-3 protein for use in the manufacture of a pharmaceutical composition for inhibiting cancer stem cell growth.
  • the present invention provides a fibulin-3 overexpressing cell line prepared by transforming a fibulin-3 gene or a culture solution thereof for use in the manufacture of a pharmaceutical composition for inhibiting cancer stem cell growth.
  • the fibulin-3 protein is characterized by having an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 1, but is not limited thereto.
  • the cancer may be lung cancer or breast cancer, but is not limited thereto.
  • the inventors purified the fibulin-3 protein confirmed the cancer cell growth inhibitory effect of the purified fibulin ⁇ 3 protein, A549 cells that are non-small cell lung cancer cells, cancer stem cells ALDH1 activated cells and breast cancer cells It has been confirmed that MDA-MB231 cells have an effect of inhibiting cell growth, and thus the fibulin-3 protein can be usefully used to inhibit the growth of cancer cells and cancer stem cells. It was confirmed that the expression of beta-catenin and VII 2,7 related to the growth of cancer stem cells was directly suppressed by Boolean 3 overexpressing cell line or culture medium thereof.
  • the fibulin-3 produced by transforming the fibulin-3 gene in inhibiting the growth of cancer stem cells. It was confirmed that the overexpressing cell line or its culture medium inhibited the cell growth and penetration factor of cancer stem cells, through which the fibulin-3 ' overexpressing cell line or its culture medium was useful for the preparation of pharmaceutical compositions for inhibiting the growth of cancer stem cells. It can be seen that it can be used.
  • the present invention will be described in detail by Examples, Experimental Examples and Preparation Examples.
  • the inventors constructed an overexpressed clone of the fibulin-3 gene.
  • non-small cell lung cancer cells H46C ATCC no. HTB-177) was used to extract the whole RNA using the High Pure RNA Isolation Kit (Roche, Germany), and then reverse RNA 1 "polymerase chains to total RNA 1 ig using Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Ki Roche, Germany).
  • Reverse transcrition polymerase chain reaction (RT-PCR) was performed, PCR conditions were 30 minutes at 55 ° C., and 85 0 C.
  • Hinc restriction enzyme recognition sequence at 5'_end and restriction enzyme recognition sequence at 3'-end After 5 min pre-denature at 94 ° C using a primer pair of forward primer 5'-ATATMGCTTATGTTGAAAGCCC— 3 '(SEQ ID NO: 2) and reverse primer 5'-ATATCTCGAGCTAAMTG AATGGCCCC-3' (SEQ ID NO: 3) prepared to include , 1 min degeneration at 94 ° C ,
  • the inventors produced a fibulin-3 clone with histidine protein attached to the c-terminal site for protein purification.
  • PCR was performed by preparing primers such that histidine protein was expressed in the back of fibulin-3 using DNA /0.1 of the overexpression of the fibulin-3 clone of ⁇ Example 1-1> as a template.
  • Forward primer 5'-CGGMTTCATGTO ⁇ GCCCTmCCTMCTATG— 3 '(SEQ ID NO: 14) prepared by attaching the histidine (his) protein sequence with the c Y restriction enzyme recognition sequence at the 5' end and the Xhol restriction enzyme recognition sequence at the 3 'end.
  • the present inventors prepared a culture medium in which cells overexpressing fibulin-3 were used as the fibulin-3 overexpressing vector of ⁇ Example 1-1>.
  • the penicillin-streptomycin solut ion (Hyclone) of the fibulin-3 overexpression vector 2 of ⁇ Example 1-1> was used for Lipofecamine 2000 on 5 ⁇ 10 5 cells / m A549 cells. °] was transduced in medium not added. After 4-6 hours of reaction, the cells were replaced with medium containing 100 units / mi of penicillin-straptomycin and cultured for 48 hours to obtain the medium.
  • the present inventors prepared a medium in which the cells transformed with the purified fibulin-3 protein vector (his-fibulin-3) of ⁇ Example 1_2> were cultured.
  • CH0—K1 cells Life Science Research Institute, Daejeon
  • 293T cells Haanyang University, Seoul
  • Fibulin-3 vector 4 / ig and lipofect amine 2000 were used to transduce in DMEM: F12 (Gibco) medium and DMEM (Hyclone) medium without penicillin ⁇ streptomycin (penici 11 in— streptomycin solution, Hyclone).
  • DMEM Fetrachloride
  • penicillin ⁇ streptomycin penici 11 in— streptomycin solution, Hyclone
  • the inventors of the present invention purified his-pibulin-3 protein in the fibulin ⁇ 3 protein purification medium of ⁇ Example 2-2>.
  • the inventors of the stem cell company based on Aldehyde dehydrogenase (ALDH) activity based on Aldehyde dehydrogenase (ALDH) activity
  • ALDEFLU0R was used to differentiate and select cancer stem cells from A549 cells, which are non-small cell lung cancer cells.
  • the dried ALDEFLU0R reagent was added with 25 ⁇ DMSO (dimethylsulphoxide) to react at room temperature for 1 minute, and the reagent was activated from red orange to light yellow. Add 25 M of hydrochloric acid (0 ⁇ 0101 " acid) to the activated reagent
  • ALDEFLU0R substrate was made. Thereafter, the supernatant was isolated ⁇ ⁇ ⁇ 6 of A549 cells by centrifugation. Discard the supernatant and mix 1 ml of ALDEFLU0R assay buffer. Prepare two empty tubes, each containing 500 ⁇ sample containing the cells and ALDEFLU0R assay buffer, add 5 activated ALDEFLU0R substrates to one tube, and add DEAB (Di ethyl ami nobenzaldehyde) solution to another tube. f, mix and mix.
  • DEAB Di ethyl ami nobenzaldehyde
  • the inventors overexpressed the vector in order to confirm whether the fibulin-3 protein was overexpressed by a hiss-fibulin-3 vector for protein purification, and then performed polymerase chain reaction and western blot. .
  • CH 10 -K1 cells Life Science Research Institute, Daejeon
  • 293T cells Haanyang University, Seo-eul
  • RNA 1 was dissolved at 45 0 C using Intron's oligo dT cDNA kit.
  • CDNA was synthesized using an amplifier system (Takara, Japan) for 1 hour at 95 0 C for 5 minutes. Then, with the primer of Table 1 below, I-taq polymerase (Intron) 94 0 C 5 minutes
  • vector-derived CH0-K1 cells were collected, and 50 ⁇ of lysis solution was added to each cell, followed by reaction at 4 ° C for 30 minutes, followed by 4 ° C. Centrifugation was performed using a centrifuge, supernatant was obtained, and then 40 g of each protein was loaded into the SDS-gel using a protein sigma kit.
  • the protein loaded on the gel is then transferred to nitrocell membranes and reacted with BSA buffer for 30 minutes at room temperature to prevent other antibodies from binding.
  • the primary antibody anti-betacatenin antibody (santa cruz) and anti- Beta-actin antibody (sigma) was reacted in PBS buffer diluted 1: 1000 for 4 hours and then secondary antibody anti-mouse (cell signaHng) was reacted in PBS buffer diluted 1: 10000 for 1 hour. .
  • the nitrocelrose membrane was washed 5 times with PBS, and the film was then exposed to a film using a detection solution.
  • the inventors confirmed the expression levels of fibulin-3 and betacatenin in ALDH1 activated cells and inactive cells isolated therefrom. Specifically, in order to extract RNA from A549 cells and ALDH1 active and inactive cells isolated therefrom, first, each cell was mixed with 1 m of trizol for 5 minutes, and then 200 chloroform reagent was added for 5 minutes. In a 4 ° C centrifuge
  • RNA 1 / g was measured at 45 0 C for 1 hour and 95 minutes at 95 0 C using Intron oligo dT cDNA kit. Takara, Japan) was used to synthesize cDNA. Subsequently, with the primers of Table 1 below, I-taq polymerase (Intron) was used for 94 5 minutes.
  • the present inventors confirmed the amount of nucleic acid and protein expression of betacatenin in A549 cells and H460 cells, which are non-small cell lung cancer cells.
  • Each 1 I ⁇ was extracted and subjected to reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) using cDNA Synthesis Kit (Intron Biotechnology, Gyungki-do, Korea) to synthesize cDNA.
  • Western Blot analysis (Western Blot) is first centrifuged to each 50 ⁇ put by using a banong a rear 4 0 C centrifuge for 30 min at 4 0 C was dissolved solution in each cell, to obtain a supernatant, and then, Each protein 40 / was loaded into SDS-gel using a protein sigma kit (sigma).
  • the protein loaded on the SDS gel was transferred to the nitrocell membrane and reacted with BSA buffer for 30 minutes at room temperature to prevent other antibodies from binding.
  • the primary antibody anti-betacatenin antibody (santa cruz) and anti- Beta actin The antibody (sigma) was reacted with PBS buffer solution diluted 1: 1000 for 4 hours, and then the secondary antibody anti-mouse (cell signaling) was reacted with PBS complete solution diluted 1: 10000 for 1 hour. Thereafter, the nitro salrose membrane was washed five times with PBS, and then exposed to a film with a detection solution.
  • beta catenin is expressed more in A549 cells than in H460 cells (FIG. 6).
  • the present inventors confirmed whether fibulin-3 affects the expression levels of nucleic acids and proteins of betacatenin in non-small cell lung cancer cells.
  • the fibulin-3 gene overexpression clone prepared in ⁇ Example 1-1> was transduced into A549 cells having high beta-catenin expression.
  • Fibulin-3 stealth-RNAi each of 25 mers of -3 '(SEQ ID NO: 13) was fabricated and ordered from Invitrogen. Introduction of the siRNA into the cell
  • fibulin-3 was overexpressed by a fibulin-3 gene overexpression clone in A549 cells and fibulin-3 was inhibited by fibulin-3 siRNA in H460 cells. Confirmed. In addition, it was confirmed that betacatenin expression was decreased in A549 cells overexpressing fibulin-3 in each sample, and betacatenin expression was increased in H460 cells in which fibulin-3 expression was inhibited (FIG.
  • betacatenin expression was inhibited by fibrin-3 in non-small cell lung cancer cell line.
  • the present inventors confirmed the inhibitory effect of betacatenin expression by fibulin ⁇ 3 in A549 cells, which are non-small cell lung cancer cell lines.
  • the medium of the fibulin-3 overexpression medium prepared in ⁇ Example 2-1> -A549 cell medium was mixed at a ratio of 1: 4, and the expression of fibulin-3 was higher than that of the A549 cell.
  • the present inventors confirmed the growth inhibitory effect of A549 cells, which are non-small cell lung cancer cells by fibulin-3.
  • the fibulin-3 overexpression medium prepared in Example 2-1 and the A549 cell medium were mixed at a ratio of 1: 4, and the expression of fibulin-3 was higher in H460 cells 5 than in A549 cells.
  • A549 cells were treated with a mixture of ⁇ 460 cell culture medium and A549 cell medium in which ⁇ 10 5 was incubated for 48 hours at a ratio of 1: 4.
  • the present inventors treated the His-fibulin-3 overexpression medium obtained by transforming the hiss-fibulin-3 vector for protein purification of ⁇ Example 2-2> to A549 cells to treat the cells.
  • the growth inhibition effect of was confirmed by colony formation experiment.
  • the transformed CH0-K1 cells of ⁇ Example 2-2> and his-fibulin- 3 overexpression medium of 293T cells were mixed at a ratio of 1: 1 and treated with lxlO 3 A549 cells, 37 Incubated for 7 days in a carbon dioxide incubator. After staining with 0.5% reagent violet crystals for 10 minutes and washed several times with PBS, it was confirmed that A549 cells treated with heath-fibulin-3 overexpression medium inhibited cell growth compared to the control group (Fig. 11).
  • the present inventors confirmed the cancer cell growth inhibitory effect by the purified fibulin-3 protein.
  • lxlO 3 non-small cell lung cancer cells A549 cells and breast cancer cells
  • the histopipibulin-3 purified protein of Example 2-3 was applied to lung cancer cells and breast cancer cells once or twice (once treated, again for 24 hours). One more time). Thereafter, the cells were incubated in a 37 ° C. incubator for 7 days, stained with Crystal Vial 0.5% reagent for 10 minutes, and washed several times with PBS.
  • the present inventors confirmed the effect of inhibiting the expression of MMP-2,7 and betacatenin by fibulin-3 in ALDH1 activated cells, which are cancer stem cells.
  • the fibulin-3 overexpression medium prepared in Example 2-1 and the ALDH1 active cell medium were mixed in a ratio of 1: 4, and H460 cells with higher expression of fibrin-3 compared to A549 cells.
  • 5 ⁇ 10 5 dogs 48 hours incubation ⁇ 460 cell culture medium and ALDH1 active cell media 1: create a combined common culture medium in a ratio of 4, was treated with the medium in each 2 ⁇ 10 5 cells / of ALDH1 active cells.
  • protein expression was confirmed by the Western blot method of ⁇ Experimental Example 2-1> using P2 (cell signaling), MMP-7CR & D system) and betacatenin (santa cruz) antibody.
  • fibulin-3 antibody was diluted 500: 1 in two mediums mixed above and treated with ALDH1 activated cells 48 hours later. Protein expression was confirmed by Western blot using a beta-catenin antibody.
  • beta-catenin protein, H460 cell culture medium and ALDH1 active cell medium were mixed at a ratio of 1: 4, fibulin-3 overexpression medium and ALDH1 active cell medium were 1: 4. It was confirmed that the protein expression of ⁇ P-2, 7 and betacatenin decreased in the cells treated with the mixed medium at the ratio of.
  • Western blot results of treatment with ALDH1 activated cells by diluting the fibulin-3 antibody with 500: 1 in the medium showed that the protein expression of ⁇ P-2,7 and betacatenin was not different from that of the control group. It was confirmed that the expression inhibitory effect of -2,7 and betacatenin is due to the fibulin-3 protein (FIG. 14).
  • the present inventors confirmed the growth inhibitory effect of ALDH1 activated cells, which are cancer stem cells by fibulin-3.
  • the fibulin-3 overexpression medium prepared in Example 2-1 and ALDH1 activated cell medium were mixed in a ratio of 1: 4, and the expression of fibulin-3 was higher than that of A549 cells.
  • the ALDH1 activated cells were treated with a mixture of ⁇ 460 cell culture medium and ALDH1 activated cell medium in which a large number of H460 cells 5 ⁇ 10 5 were incubated for 48 hours at a ratio of 1: 4. priority,
  • One ⁇ 460 cell culture medium and ALDH1 active cell medium were mixed at a ratio of 1: 1 (50%), and the ⁇ 460 cell culture medium and ALDH1 activated cell medium were incubated for 48 hours with 5 ⁇ 10 5 cells of ⁇ 460 cells 5: 4. And treated with ⁇ 460 cell culture medium (100 3 ⁇ 4>), which were incubated for 48 hours in a medium mixed at 80 3 ⁇ 4 and 5 ⁇ 10 5 cells for 48 hours.
  • the medium was treated in a 37 ° C. carbon dioxide incubator. After 8 days of incubation, 10 minutes of staining with crystal violet 0.5 3/4 reagent It confirmed cases washed with PBS.
  • the present inventors confirmed the growth inhibitory effect of ALDH1 activated cells, which are cancer stem cells, by the heath-fibulin-3 overexpression medium prepared in Example 2-1.
  • Example 2-2> A transgenic heath of CH0-K1 cells and 293T cells-over-expressing the -3 medium called P 1: a mixture in a ratio of 1 ⁇ ⁇ ⁇ treated in three ALDH1 activated cell After incubating for 7 days in a 37 ° C carbon dioxide incubator,
  • the above ingredients were mixed and layered in an airtight cloth to prepare a powder.
  • tablets were prepared by tableting according to a conventional method for producing tablets.

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Abstract

본 발명은 피불린-3(fibulin-3) 단백질 및 이를 유효성분으로 함유하는 암 줄기세포 성장 억제용 약학적 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 비소세포성 페암 세포인 H460 및 A549세포에서 ALDH1 활성을 마커로 사용하여 분리된 암 줄기세포에서 피불린-3가 암 줄기세포의 특성을 나타나게 하는 wnt/β-catenin와 MMP2, 7의 감소를 유도함으로써 암 줄기세포의 활성화된 성장을 억제하고 침투력을 감소시켰으며, 정제된 피불린-3 단백질이 비소세포성 폐암 세포인 A549 세포, 유방암 세포인 MDA-MB231 세포 및 암 줄기세포인 ALDH1 활성 세포의 성장을 억제하였으므로, 상기 피불린-3를 암 줄기세포 성장 억제용 약학적 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용할 수 있다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
피불린—3 단백질을 유효성분으로 함유하는 암 줄기세포 성장 억제용 약학적 조성물 【기술분야】
본 발명은 피불린 -3(fibulin-3) 단백질을 제조하여, 이를 유효성분으로 함유하는 암 줄기세포 성장 억제용 약학적 조성물 또는 피불린 -3를 이용한 암 줄기세포의 성장 억제 방법에 관한 것이다.
【배경기술】
지금까지 암의 발생원인은 정상세포가 어떤 외부적인 원인에 의해 돌연변이를 일으켜 발생한다고 보고되어 왔다. 따라서， 현재까지 암의 치료를 위해 정상 세포와는 다른 암세포에서 특이적으로 발현되거나 과발현되는 유전자를 찾아 그 유전자를 목표로 하는 항암제 개발 및 치료가 이루어져 왔으나， 전이가 된 암 환자나 암이 재발된 환자에게서는 이상의 치료법만으로는 암세포를 완전히 제거하지 못했다 . 이런 환자들을 연구하던 중 최근에는 암세포 내에 암올 일으키는 세포가 따로 존재하고, 이 세포들은 정상 줄기세포의 특성을 갖고 있으며， 이와 같은 세포들이 암을 발생시킨다고 보고되어 왔으며， 이러한 세포들은 줄기세포의 특성을 갖고 있다고 하여 "암 줄기세포"라 명명되었다. 암 줄기세포의 패러다임은 종양이란 다양한 잠재적 능력 (pulprint potency)과 자가재생능력 (self renewal)을 보이는 특정한 세포군에 의하여 기인한다는 것이다 [B.M. Boman, M.S. Wicha, Cancer stem cells: a step toward the cure, J. Clin. Oncol. 26(2008) 2795-2799] . 암 줄기세포의 존재는 급성골수성 백혈병 (leukemia)에서 처음 증명되었으며 최근에는 유방암을 포함한 일반 고형암에서도 암 줄기세포의 존재를 증명함으로써， 고형암종에서도 줄기세포가 존재함을 확인하게 되었다 [D. Bonnet , J.E. Dick, Human acute myeloid leukemia is organized as hierachy that originates from a primitive hematopoietic cell . Nat . Med 3(1997)730- 737； M. Al-Haj j , M.F. Clarke, Self -renewal and tumor stem cells. Oncogene 23(2003)7274-7284] . 이러한 종양줄기세포는 지금까지 개발된 항암제에 저항성을 보인다. 암세포 중 80 ~ 90%는 실제로 재발능력이 없지만， 나머지 10 ~ 20 % (종양줄기세포)는 항암제를 투여했을 때 죽지 않고 남아서 재발한다.
따라서， 암세포 재발과 전이를 피하고 암을 완전히 제거하기 위해서는 암세포만을 공격하는 현재의 암치료법이 가지고 있는 한계를 넘어， 즐기세포의 특성을 갖는 암 줄기세포를 표적으로 하여 암 줄기세포를 제거하는 항암제의 개발이 필요하다.
현재 항암요법은 외과수술과 화학요법과 방사선요법이 주로 사용된다. 특히 외과수술을 제외하고 화학요법 및 방사선요법의 경우 다양한 제제와 방사선 등이 사용되지만 그들의 적용은 인체가 감당할 수 있는 범위에 한정된다. 이들 화학요법 및 방사선요법의 제한적인 적용은 동물시험에서 아무리 우수한 효능을 보일지라도 임상에서 그 효과를 상쇄시키며 적용범위를 제한하고 효능을 제한하는 단점이 있기 때문이다. 이는 항암제 내성을 가진 암세포의 출현 또는 각각의 요법의 세포독성에 기인한 부작용으로 말미암는다. 예를 들어 시스플라틴 (cisplatin)은 가장 효과적인 암 치료제로서， 현재 임상에서 사용되고 있는 30여종의 항암제 중 가장 유용한 약제의 하나로 고환암, 난소암， 폐암， 두경부암， 방광암， 위암， 자궁 경부암 등의 암에 약효가 있는 것으로 알려져 있다 (Teni Boiilikas, Oncology Reports, 10： 1663-1682, 2003) . 그러나， 최근에는 시스플라틴 내성을 가진 암들이 많이 보고되고 있어, 현재 이런 내성을 가진 암 세포들이 문제시 되고 암 치료 후 재발의 위험이 있기 때문에 시스플라틴과 다른 화학물질과의 복합요법 또는 시스플라틴과 세포 내 발현 단백질의 조절에 의한 치료의 연구가 활발히 진행중인 실정이다 (TitoFojo, Oncogene , 22： 7512-7523, 2003). 또한， 방사선요법은 적당한 양의 방사선을 환부에 조사 (照射)함으로써 인체에 발생하는 각종 암을 치료하는 항암요법인데， 이러한 방사선요법은 인체의 조혈기능을 저하시키고 면역계를 억제시켜 암 치료의 효율성을 낮추는 문제점이 있다. 나아가 반복적인 방사선 조사로 인해 암세포가 저항성을 획득하게 되므로， 이러한 방서선 요법 또한 항암 치료에 있어 한계가 존재한다. 이러한 암 줄기세포의 마커로는 CD133(prominin— 1 또는 AC133) 및 CD44(hyaluronate receptor 또는 P-glycoprotein 1) 등이 사용되고 있으며， 최근에 아세트알데히드 분해효소 (Aldehyde dehydrogenases 1： ALDH1)가 밝혀졌다. ALDH는 세포내 알데하이드를 산화시키는 해독 (detoxifying) 효소로서 알킬화제 (alkylat ing agent)나 산화 스트레스 (oxidat ive stress)에 상당한 저항성을 나타나게 한다 [Blood 87(1996) 1097-1103； Chem. Biol. Interact. 143-144(2003)5-22]. 또한， ALDH는 레티놀 (retinol: Vit amine A)을 암의 치료와 예방에 중요한 레티노이드 (ret inoids) 중 가장 활성형태인 레티노 산 (retinoic acid)으로 전환시켜 세포의 성장 및 증식에 영향을 준다. ALDH는 보통 19개의 유전자가 존재하는 것으로 알려져 있으며 ALDH1, 2， 3 class로 구분된다. 그중 오직 ALDH1 만이 레티날 (ret inal )을 레티노 산 (ret inoic acid)으로 전환시키는 레티날 탈수소효소 (ret inal dehydrogenase) 활성도를 가지고 있으며 , ALDH1A1과 더불어 ALDH 1A3( ret inal dehyde dehydrogenase 3)가 가장 효율적인 활성도를 가지고 있다 [Biochim. Biophys. Acta 1790(2009) 1660-1664] . 따라서 ALDH1의 ,활성도는 폐암 세포주 등에서 암 줄기세포의 분화기능검사 (subpopulation)를 분리하는데 중요하게 사용되고 있다 [Mol. Cancer . Res. 7(2009) 330-338] . 최근에 암 재발의 원인이 되는 암 줄기세포 생성에 중요한 역할을 한다고 보고 된 (Nature Reviews Cancer 5， 744-749 (September 2005)) 윈트 /베타카테닌 (龍 t/(3-catenin) 경로는 진화적으로 보존 (conserved)된 경로로서， 배 발생 동안 세포 성장, 형태, 세포의 운동성 (motility)을 조절하는 경로이디-. 이 경로는 체세포 즐기세포 (somatic stem cell) 및 그들의 환경을 조절함으로써 장 (intestine) 및 뇌 (brain) 등을 포함한 조직의 항상성을 유지하는데 중요한 역할을 한다. 또한 원트 (wnt)는 암에서 활성화되어 있는 것이 잘 알려져 있으며， 그로 인해 글리코겐 생성 효소 인산화 효소 3(Glycogen synthase kinase 3： GSK3)의 활성이 저해되고 GSK3의 기질인 베타카테닌 (β-catenin)이 축적되게 된다. 이러한 비정상적인 원트 (wnt) 경로는 종양발생 및 증식 (neoplastic prol i ferat ion)을 유도한다. 피불린 (fibulin) 단백질군은 엘라스틱 세포외기질 (extracel hilar matrix,
ECM)과 결합된 단백질로서 세포간 상호작용 또는 세포와 기질간 상호작용에 기여하는 단백질이며 타입 1부터 타입 6까지 6 종류가 알려져 있다. 이러한 피불린 단백질은 종류에 따라 종양을 억제하는 새로운 유전자 표적으로 제안되고 있다. 최근에， 피불린 -5와 상동의 피불린—3가 세포 성장 조절 및 몇몇의 종양에 작용한다고 알려졌으며， 피불린—5는 종양 억제를 거쳐 세포 증식, 침투, 혈관내피성장인자와 종양 혈관신생에 관련이 있다고 보고되었다 [J. Biol. Chem. 277(2002)： 27367-27377； DNA. Cell Biol. 23(2004)： 367-379； Future Oncology 1(2005) :23-35； Cancer Res. 69(2009)： 6339-6346] . 또한， 피불린 -3는 세포 성장 조절과 종양 혈관신생 그리고 몇몇의 종양을 감소시키는 것으로 알려졌다 [Cancer Res. 66(2006) 2621- 2629] . 하지만， 종양이 발생하게 하거나 지속적으로 그 특성을 유지하게 하며 항암 치료에 저항성을 갖는 암 줄기세포에 대한 피불린— 3(fibulinᅳ 3)의 영향은 아직 알려지지 않았다. 이에, 본 발명자들은 비소세포성 페암 세포이지만， 침투성과 전리방사선과 같은 세포독성에 대해 다른 민감도를 가진 H460 및 A549 세포에서 ALDH1 활성을 마커로 사용하여 암 줄기세포를 분리하였고， 분리한 ALDH1 활성 또는 비활성 세포에서의 피블린ᅳ3의 발현량에 차이가 있음을 확인하였다. 또한， 상기 분리된 세포에 피불린—3의 발현량이 증가되면， 암 줄기세포의 특성을 나타나게 하는 베타카테닌 (β-catenin) 및 침투 관련 인자인 醒 P-2 및 丽 P-7가 감소함으로써， 피불린 -3에 의해 암 줄기세포의 성장이 감소하는 것을 확인하였으며， 이는 피불린 -3가 과발현된 배지를 처리하여도 같은 결과임을 확인하였다. 아울러， 피블린—3 정제용 백터를 제작하여, 피불린 -3 단백질을 정제하였으며， 정제한 피불린 -3 단백질이 비소세포성 폐암 세포인 A549 세포， 유방암 세포인 MDA-MB231 세포 및 암 즐기세포인 ALDH1 활성 세포의 세포 성장을 억제함을 확인하여 상기 피블린 -3가 암 줄기세포의 성장 억제용 조성물로 유용하게 사용될 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】
본 발명의 목적은 암 줄기세포 성장 억제 활성을 갖는 피불린 -3 단백질을 제공하는 것이다.
또한， 본 발명의 목적은 피불린 -3 단백질의 제조방법을 제공하는 것이다. 또한， 본 발명의 목적은 피불린 -3(fibulin-3) 단백질 또는 피불린 -3 유전자를 형질전환시켜 제조한 피불린 -3 과발현 세포주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 암 줄기세포 성장 억제용 약학적 조성물을 제공하는 것아다.
또한， 본 발명의 또 다른 목적은， 암 줄기세포에 유효한 양의 피불린 -3 단백질 또는 피불린—3 유전자를 형질전환시켜 제조한 피불린ᅳ3 과발현 세포주 또는 이의 배양액을 처리하는 단계를 포함하는 암 줄기세포의 성장 억제 방법을 제공하기 위한 것이다.
또한， 본 발명의 또 다른 목적은， 약학적으로 유효한 양의 피불린 -3 단백질을 암 줄기세포가 있는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암줄기세포 성장 억제 방법을 제공하기 위한 것이다.
또한， 본 발명의 또 다른 목적은， 약학적으로 유효한 양의 피불린 -3 유전자를 형질전환시켜 제조한 피불린 -3 과발현 세포주 또는 이의 배양액을 암 즐기세포가 있는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암줄기세포 성장 억제 방법을 제공하기 위한 것이다.
또한， 본 발명의 또 다른 목적은， 암 줄기세포 성장 억제용 약학적 조성물의 제조에 사용하기 위한， 피불린ᅳ 3 단백질의 용도를 제공하기 위한 것이다.
아울러， 본 발명의 또 다른 목적은， 암 줄기세포 성장 억제용 약학적 조성물의 제조에 사용하기 위한， 피불린 -3 유전자를 형질전환시켜 제조한 피불린一 3 과발현 세포주 또는 이의 배양액의 용도를 제공하기 위한 것이다.
【기술적 해결방법】
상기 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 암 줄기세포 성장 억제 활성을 갖는 피불린— 3(fibulin-3) 단백질을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 피불린 -3 단백질을 암호화하는 백터를 제작하는 단계;
2) 단계 1)의 백터를 세포에 형질 전환하는 단계; 및
3) 단계 2)의 세포 배양액에서 피불린 -3 단백질을 정제하는 단계를 포함하는， 폐암 성장 억제 활성을 갖는 피불린 -3 단백질의 제조 방법을 제공한다.
또한， 본 발명은 암 줄기세포 성장 억제 활성을 갖는 피불린 -3(fibulin-3) 단백질을 유효성분으로 함유하는 암 줄기세포 성장 억제용 약학적 조성물을 제공한다.
또한， 본 발명은 암 줄기세포에 유효한 양의 피불린 -3를 처리하는 단계를 포함하는 암 줄기세포의 성장 억제 방법을 제공한다.
또한， 본 발명은 피불린 -3 유전자를 형질전환시켜 제조한 피불린 -3 과발현 세포주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 암 줄기세포 성장 억제용 약학적 조성물을 제공한다.
또한， 본 발명은 피불린 -3 유전자를 형질전환시켜 제조한 피불린—3 과발현 세포주 또는 이의 배양액을 처리하는 단계를 포함하는 암 줄기세포의 성장 억제 방법을 제공한다.
또한， 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 피불린 -3 단백질을 암 줄기세포가 있는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암줄기세포 성장 억제 방법을 제공한다. 또한， 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 피불린 -3 유전자를 형질전환시켜 제조한 피불린 -3 과발현 세포주 또는 이의 배양액을 암 줄기세포가 있는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암줄기세포 성장 억제 방법을 제공한다.
또한， 본 발명은 암 줄기세포 성장 억제용 약학적 조성물의 제조에 사용하기 위한, 피불린 -3 단백질의 용도를 제공한다.
아을러, 본 발명은 암 줄기세포 성장 억제용 약학적 조성물의 제조에 사용하기 위한， 피불린 -3 유전자를 형질전환시켜 제조한 피불린—3 과발현 세포주 또는 이의 배양액의 용도를 제공한다.
【유리한 효과】
본 발명의 피불린 -3 단백질은 비소세포성 폐암 세포에서 ALDH1의 활성으로 분리된 암 줄기세포에서 암 줄기세포의 특성을 나타나게 하는 베타카테닌 (β— catenin)과 침투 관련 인자 (醒 Pᅳ 2 및 醒 P— 7)를 저해함으로써 암 줄기세포의 활성화된 세포 성장을 효과적으로 억제할 수 있으며, 비소세포성 폐암 세포， 유방암 세포 및 암 줄기세포의 성장을 억제할 수 있어， 암 줄기세포 성장 억제용 약학적 조성물에 유용하게 사용될 수 있다. 【도면의 간단한 설명】
도 1은 피불린 -3 유전자의 c-터미널 부위에 히스티딘 단백질 염기서열을 붙여 단백질 정제용 백터를 만든 것을 나타낸 그림이다.
도 2은 A549 세포에 Aldefluor 염색 후， FACS 기계를 사용하여 ALDH1 활성 세포 및 ALDH1 비활성 세포를 분리한 결과를 나타낸 그림이다;
AL (+)： ALDH1 활성을 갖는 세포들 ; 및，
AL(-): ALDH1 활성이 없는 세포들.
도 3은 히스티딘이 부착되어 있는 피불린 -3 유전자를 CH0-K1세포에 과대발현시켜 발현 여부를 역전사중합효소 반웅과 웨스턴 블랏을 통해 확인한 결과이다;
RT-PCR: 역전사중합효소 반웅 ;
웨스턴: 웨스턴 블랏;
pcDNA: 대조군으로 공백터를 과대발현시킨 CH0-K1세포; 및，
His-피불린 3: 히스티딘이 부착되어 있는 피불린 -3 백터를 과대발현시킨 αω-κι세포.
도 4는 Α549 세포， Α549에서 분리된 ALDH1 활성 세포， Α549에서 분리된 ALDH1 비활성 세포를 콜로니 형성분석을 통해 확인한 결과이다;
Α549: Α549 세포의 콜로니 형성;
ALDH+: ALDH1 활성을 갖는 세포의 콜로니 형성; 및,
ALDH-: ALDH1 활성이 없는 세포의 콜로니 형성.
도 5는 Α549에서 분리한 ALDH1 활성 세포와 ALDH1 비활성 세포에서， ALDH1A1과 베타카테닌 및 피불린 -3의 발현량을 Α549 세포를 대조군으로 하여， 역전사 중합효소 반웅을 통해 확인한 결과이다;
Alde(+): ALDH1 활성 세포; .
Alde(-): ALDH1 비활성 세포; 및，
ALDH1A1: ALDH1.
도 6은 A549 세포 및 H460 세포에서 웨스턴 블랏과 역전사중합효소 반웅으로 베타카테닌의 발현량을 확인한 결과이다;
RT-PCR: 역전사 중합효소 반웅의 결과; 및， 웨스턴: 웨스턴 블랏의 결과.
도 7은 A549 세포 및 피불린 -3가 과발현된 A549 세포， H460 세포 및 피불린 -3의 발현이 억제된 H460 세포에서 베타카테닌과 피불린 -3의 발현량을 확인한 결과이다;
A549: A549 세포;
A549/V.C: A549 세포에 컨트를 백터를 발현시킨 대조구;
A549/pcFBLN3: A549 세포에 피불린 _3 과발현 백터를 발현;
H460: H460 세포;
H460/siCtl: H460 세포에 si컨트를 백터를 발현시킨 대조구;
H460/siFBLN3: H460 세포에 피불린 -3 발현 억제 백터를 발현;
FBLN 3: 피불린 -3;
RT-PCR: 역전사 중합효소 반웅의 결과; 및，
웨스턴: 웨스턴 블랏의 결과.
도 8은 A549 세포에 피불린 -3 과발현 배지 또는 피불린 -3가 과발현되고 있는 H460세포 배양 배지를 처리한 후 관찰한 세포의 현미경 사진 및 베타카테닌의 발현량의 변화를 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이다;
A549: A549 세포;
A549/H460 M: A549 세포에 H460 배양 배지를 처리한 세포; 및，
A549/FBLN3(+) M: A549 세포에 피불린 -3 단백질을 과발현시킨 A549 세포의 배양 배지를 처리한 세포.
도 9는 A549 세포에 피불린 -3 과발현 배지 또는 피불린 -3가 과발현되고 있는 H460 세포 배양 배지를 처리하거나， 또는 피불린 -3 과발현 배지 또는 피불린 -3가 과발현되고 있는 H460 세포 배양 배지에 피블린 -3 항체를 함께 처리한 세포에서의 베타카테닌， 丽 P-2 및 醒 P-7의 발현량의 변화를 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이다;
A549: A549 세포;
A549/H460 M: A549 세포에 H460 배양 배지를 처리;
A549/FBLN3(+) M: A549 세포에 피불린 -3 단백질을 과발현시킨 A549 세포의 배양 배지를 처리;
A549/H460 M +FBLN3 Ab: A549 세포에 H460 배양 배지 및 피불린—3 항체를 처리; 및, A549/FBLN3(+) M +FBLN3 Ab: A549 세포에 피불린 -3 단백질을 과발현시킨 A549 세포의 배양 배지 및 피불린 -3 항체를 처리.
도 10은 ALDH1 활성 세포에 피불린 -3 과발현 배지 또는 피불린 -3가 과발현되고 있는 H460 세포 배양 배지를 처리하거나， 또는 피불린 -3 과발현 배지 또는 피불린 -3가 과발현되고 있는 H460 세포 배양 배지에 피불린 -3 항체를 함께 처리한 세포에서의 베타카테닌， MMP-2 및 MMP-7의 발현량의 변화를 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이다;
ALDH+: ALDH1 활성 세포;
ALDH+/FBLN3C+) M: ALDH1 활성 세포에 피불린ᅳ3 단백질올 과발현시킨 A549 세포의 배양 배지를 처리;
ALDH+/H460 M: ALDH1 활성 세포에 H460 세포의 배양 배지를 처리;
ALDH+/FBLN3C+) M +FBLN3 Ab: ALDH1 활성 세포에 피불린 -3 단백질을 과발현시킨 A549 세포의 배양 배지 및 피불린 -3 항체를 처리; 및，
ALDH+/H460 M +FBLN3 Ab: ALDH1 활성 세포에 H460 세포의 배양 배지 및 피불린 -3 항체를 처리ᅳ
도 11은 A549 세포에 피불린ᅳ 3 과발현 배지와 피불린 -3가 과발현되어 있는 H460 세포 배양 배지를 농도를 다르게 하여 처리한 후， A549 세포의 콜로니 형성 여부를 확인한 결과이다;
a: 콜로니 사진;
b: 콜로니 개수 결과를 그래프화한 그림 ;
대조군: A549 세포의 성장 배지를 처리한 대조군;
피불린 3-%: 피불린ᅳ3를 과발현시킨 A549 세포의 배양 배지와 A549 성장 배지의 흔합 배지에서 피불린 -3 과발현 배지의 비율; 및，
H460-%: H460 세포의 배양 배지와 A549 성장 배지의 흔합 배지에서 H460 세포 배양 배지의 비율.
도 12는 히스-피불린 -3 백터를 과발현시킨 CH0-K1 세포 또는 293T 세포의 배양 배지를 A549 세포에 50 %의 비율로 처리한 후， 콜로니 형성 여부를 확인한 결과이다;
a: 콜로니 사진;
CH0-K1 배지: 히스ᅳ피불린 -3 백터를 과발현시킨 CH0-K1 세포의 배지; 293T 배지： 히스-피불린 -3 백터를 과발현시킨 293T 세포의 배지; 및， b: 콜로니 개수 결과를 그래프화한 그림 .
도 13은 정제된 피불린 -3 단백질을 A549 세포에 처리한 후, 콜로니 형성 여부를 확인한 결과이다;
a: 콜로니 사진;
CH0- 1 24h-l： 히스-피불린 -3 백터를 과발현시킨 CH0-K1 세포에서 정제한 피불린 단백질을 24시간 후 1 ug 처리한 A549 세포;
CH0-K1 24h— 2: 히스-피불린 -3 백터를 과발현시킨 CH0-K1 세포에서 정제한 피불린 단백질을 24시간 후 1 ug 처리하고, 다시 24시간 후 한번 더 1 ug 처리한 A549 세포;
293T 24h-l: 히스ᅳ피불린 -3 백터를 과발현시킨 293T 세포에서 정제한 피불린 단백질을 24시간 후 1 ug 처리한 A549 세포;
293T 24hᅳ 2: 히스-피불린 -3 백터를 과발현시킨 293T 세포에서 정제한 피불린 단백질을 24시간 후 1 ug 처리하고， 다시 24시간 후 한번 더 1 ug 처리한 A549 세포;
pc-DNA: 대조군; 및，
b: 콜로니 개수 결과를 그래프화한 그림 .
도 14는 정체된 피불린 -3 단백질을 MDA-MB231 세포에 처리한 후, 콜로니 형성 여부를 확인한 결과이다;
a: 콜로니 사진;
CH0-K1 24h-l: 히스ᅳ피불린 -3 백터를 과발현시킨 CH0-K1 세포에서 정제한 피불린 단백질을 24시간 후 1 ug 처리한 MDA-MB231 세포;
CH0-K1 24h-2: 히스-피불린 -3 백터를 과발현시킨 CH0-K1 세포에서 정제한 피불린 단백질을 24시간 후 1 ug 처리하고， 다시 24시간 후 한번 더 1 L1g 처리한 MDA-MB231 세포;
293T 24h-l: 히스-괴불린 -3 백터를 과발현시킨 293T 세포에서 정제한 피불린 단백질을 24시간 후 1 ug 처리한 MDA— MB231 세포;
293T 24h-2: 히스-피불린ᅳ 3 백터를 과발현시킨 293T 세포에서 정제한 피불린 단백질을 24시간 후 1 ug 처리하고， 다시 24시간 후 한번 더 1 ug 처리한 MDA-MB231 세포; pc-DNA: 대조군; 및，
b: 콜로니 개수 결과를 그래프화한 그림 .
도 15는 ALDH1 활성 세포에 피불린 -3 과발현 배지와 피불린 -3가 과발현되어 있는 H460 세포 배양 배지를 농도를 다르게 하여 처리한 후， ALDH1 활성 세포의 콜로니 형성 여부를 확인한 결과이다;
a: 콜로니 사진;
b: 콜로니 개수 결과를 그래프화한 그림 ;
ALDH1+: ALDH1 활성 세포;
대조군: ALDH1 세포의 성장 배지를 처리한 대조군;
피불린 3-%: 피불린ᅳ3를 과발현시킨 A549 세포의 배양 배지와 ALDH1 성장 배지의 흔합 배지에서 피불린 -3 과발현 배지의 비율; 및，
H460-%: H460 세포의 배양 배지와 ALDH1 성장 배지의 흔합 배지에서 H460 세포 배양 배지의 비율.
도 16은 히스-피불린—3 백터를 과발현시킨 CH0-K1 세포 또는 293T 세포의 배양 배지를 ALDH1 활성 세포에 50 ¾의 비율로 처리한 후, 콜로니 형성 여부를 확인한 결과이다;
a: 콜로니 사진;
ALDH+: ALDH1 활성 세포;
CH0-K1 배지: 히스-피불린 -3 백터를 과발현시킨 CHO— K1 세포의 배지;
293T 배지 : 히스-피불린 -3 백터를 과발현시킨 293T 세포의 배지 ; 및， b: 콜로니 개수 결과를 그래프화한 그림 .
도 17은 정제된 피불린 -3 단백질을 ALDH1 활성 세포에 처리한 후, 콜로니 형성 여부를 확인한 결과이다;
a: 콜로니 사진;
ALDH+: ALDH1 활성 세포;
CHO-Kl 24h-l: 히스-피불린 -3 백터를 과발현시킨 ALDH1 활성 세포에서 정제한 피불린 단백질을 24시간 후 1 ug 처리한 ALDH1 활성 세포;
CHO-Kl 24h-2: 히스-피불린 -3 백터를 과발현시킨 ALDH1 활성 세포에서 정제한 피불린 단백질을 24시간 후 1 ug 처리하고， 다시 24시간 후 한번 더 1 ug 처리한 ALDH1 활성 세포; 293T 24h-l: 히스ᅳ피블린 -3 백터를 과발현시킨 293T 세포에서 정제한 피불린 단백질을 24시간 후 1 ug 처리한 ALDH1 활성 세포;
293T 24h— 2: 히스-피블린 -3 백터를 과발현시킨 293T 세포에서 정제한 피불린 단백질을 24시간 후 1 ug 처리하고， 다시 24시간 후 한번 더 1 ug 처리한 ALDH1 활성 세포;
pc-DNA: 대조군; 및 ,
b: 콜로니 개수 결과를 그래프화한 그림 .
【발명의 실시를 위한 최선의 형태】
이하, 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명은 암 줄기세포 성장 억제 활성을 갖는 피불린 -3(fibL in-3) 단백질을 제공한다.
상기 피불린 -3 단백질은 하기 1) 내지 3)의 아미노산 서열로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다:
1) 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열 ;
2) 서열번호 1의 일부분으로 나타내는 아미노산 서열; 및
3) 서열번호 1과 80 % 이상의 상동성올 나타내는 아미노산 서열 .
상기 암은 폐암 또는 유방암인 것이 바람직하고， 상기 폐암은 비소세포성 폐암인 것이 더욱 바람직하다. 또한 본 발명은
1) 피불린—3 단백질을 암호화하는 백터를 제작하는 단계;
2) 단계 1)의 백터를 세포에 형질 전환하는 단계; 및
3) 단계 2)의 세포 배양액에서 피불린 -3 단백질을 정제하는 단계를 포함하는， 암 줄기세포 성장 억제 활성을 갖는 피불린—3 단백질의 제조 방법을 제공한다.
상기 암은 폐암 또는 유방암인 것이 바람직하고, 상기 폐암은 비소세포성 폐암인 것이 더욱 바람직하다. 본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 단백질 정제를 위한 c-터미널 부위에 히스티딘 단백질이 부착된 피불린ᅳ3 백터를 제작하였으며 (도 1 참조)， 상기 백터의 발현을 확인하기 위하여, CH0-K1 세포 (생명공학 연구원， 대전) 및 293T 세포 (한양대학교, 서울)에 각각 형질도입하여 중합연쇄효소반응 및 웨스턴 블랏을 통해 피불린 -3 단백질의 과발현을 확인하였다 (도 3 참조). 또한， 상기 형질전환한 세포를 배양한 배지를 비소세포성 폐암인 A549 세포 및 암 즐기세포 ALDH1 활성 세포에 처리한 결과， 배지를 비소세포성 폐암인 A549 세포 및 암 줄기세포 ALDH1 활성 세포 모두 세포성장이 저해됨을 확인할 수 있었다 (도 11 및 도 16 참조). 아을러, 상기 형질도입한 세포주를 이용하여 피불린 -3 단백질을 정제하여， 정제된 피불린 -3 단백질의 암세포의 성장억제 효과를 확인한 결과， 비소세포성 폐암 세포인 A549 세포, 암 줄기세포인 ALDH1 활성 세포 및 유방암 세포인 MDA-MB231 세포에서 세포 성장 억제 효과가 있음을 확인하였다 (도 12， 도 17 및 도 13 참조).
따라서， 피불린ᅳ3 단백질을 암세포 및 암 줄기세포의 성장 억제에 유용하게 사용할 수 있다. 또한， 본 발명은 본 발명에 따른 피블린— 3(fibulin— 3) 단백질을 유효성분으로 함유하는 암 줄기세포 성장 억제용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 피불린 -3 단백질은 하기 1) 내지 3)의 아미노산 서열로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다:
1) 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열;
2) 서열번호 1의 일부분으로 나타내는 아미노산 서열; 및
3) 서열번호 1과 80 % 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열.
상기 암은 폐암 또는 유방암인 것이 바람직하고， 상기 폐암은 비소세포성 폐암인 것이 더욱 바람직하다.
상기 암 줄기세포는 암 줄기세포의 마커인 CD133(prominin-l; AC 133) ,
CD44(hyahironate receptor; P— glycoprotein 1) 및 ALDHl으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 마커로 선별된 것이 바람직하몌 ALDH1로 선별된 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 구체적인 실시예에서， 본 발명자들은 비소세포성 폐암 세포인 A549 세포에서 ALDH1 활성에 기초한 ALDEFLUOR 제품 (stem cell)을 사용해 암 줄기세포를 구별 및 선별하였다 (도 2 참조). 또한, 본 발명자들은 비소세포성 폐암과 암 줄기세포의 차이를 확인하기 위하여 콜로니 형성실험으로 분리한 ALDH1 활성 세포 및 ALDH1 비활성 세포의 성장 정도를 분석하였다. 그 결과， A549 세포 보다 ALDH1 활성 세포는 성장이 더 잘 된 반면， ALDH1 비활성 세포는 A549 세포 대조군 보다 성장하지 못하였음을 확인함으로써， ALDH1 활성을 띄는 암 줄기세포가 비소세포성 폐암 성장의 원동력임을 알 수 있었다 (도 4 참조). 아울러， 본 발명자들은 ALDH1 활성 세포와 비활성 세포에서의 ALDH1, 피불린ᅳ 3 및 베타카테닌의 발현량을 확인하고자 역전사 중합효소연쇄반웅 (RT-PCR)과 웨스턴 블랏을 수행하였다. 그 결과， ALDH1 비활성 세포와 반대로 ALDH1 활성 세포에서는 ALDH1과 종양발생 및 증식에 중요한 베타카테닌의 발현량이 증가하였으나， 피불린ᅳ 3는 발현량이 감소함을 확인하였다 (도 5 참조). 이에， 암 세포 성장의 원동력인 암 줄기세포에서 암 줄기세포의 성장에 중요하다고 알려진 베타카테닌은 증가되어 있으나， 피불린 -3는 감소되어 있음을 확인함으로써 피불린 -3가 암 즐기세포의 억제에 유용하게 이용될 수 있음을 알 수 있었다.
또한， 본 발명의 또 다른 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 피블린 -3(fibulin-3)에 의한 베타카테닌의 발현량을 확인하기 위해， 베타카테닌의 발현량이 많은 A549 세포에 피불린 -3 과발현 백터를 형질도입하고， 베타카테닌의 발현량이 적은 H460 세포는 피불린 -3 억제용 siRNA로 피블린 -3의 발현을 억제하였다. 그 결과， 피불린 -3가 과발현된 A549 세포에서 베타카테닌의 발현이 감소하였고， 그 반대로 피불린 -3가 억제된 H460 세포에서는 베타카테닌의 발현이 증가함을 알 수 있었다 (도 6 및 7 참조). 이에， 과발현된 피불린—3가 암 줄기세포의 성장에 중요한 베타카테닌을 저해함을 확인하였고， 이를 통해 피불린— 3(fibulinᅳ 3)를 암 줄기세포의 성장 억제에 유용하게 이용할 수 있음을 알 수 있었다.
또한， 본 발명의 또 다른 구체적인 실시예에서， 본 발명자들은 비소세포성 폐암 세포인 A549에서 피불린 -3에 의한 종양발생 및 증식에 중요한 베타카테닌과 침투인자인 醒 P-2,7의 발현 억제를 확인하고자， 피불린 -3을 과발현시킨 A549 세포의 배양 배지와, 피불린 -3의 발현이 많은 H460 세포의 배양 배지를 A549 세포에 처리하였다. 그 결과, 상기 배지가 처리된 세포는 사멸이 진행됨을 현미경으로 확인하였으며, 베타카테닌과 麗 P-2, 7의 발현이 대조군에 비해 감소함을 확인하였다 (도 8 및 9 참조). 또한， 피불린 -3 항체를 이용하여 상기 결과가 피불린 -3에 의한 것임을 한번 더 확인하였다. 이러한 결과를 통하여， 피불린ᅳ 3가 베타카테닌과 醒 P— 2，7의 발현을 직접적으로 억제함을 알 수 있었다. 또한， 본 발명의 또 다른 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 암 즐기세포에서 피불린 -3에 의한 베타카테닌과 匪?—2,7의 발현올 확인하고자， 피불린ᅳ 3 과발현된 ALDH1 활성 세포의 배양 배지와， 피불린 -3의 발현이 많은 H460 세포의 배양 배지를 ALDH1 활성 세포에 처리하고 웨스턴 블랏을 수행하였다. 그 결과， 상기 두 배지를 처리한 군에서 베타카테닌과 MMPᅳ 2，7의 발현이 감소하였음을 확인하였다. 또한， 피불린—3 항체를 이용하여 상기 결과가 피불린 -3에 의한 것임을 한번 더 확인하였다 (도 14 참조). 이러한 결과를 통하여， 피불린ᅳ 3가 암 줄기세포에서 베타카테닌과 醒^2，7의 발현을 직접적으로 억제함을 알 수 있다.
또한, 본 발명자들은 피불린 -3에 의해 비소세포성 폐암 세포의 성장이 억제되는지를 확인하기 위해 콜로니 형성 실험을 수행하였다. 그 결과， 피불린—3을 과발현시킨 A549 세포의 배양 배지와, 피불린 -3의 발현이 많은 H460 세포의 배양 배지 과발현 배지가 흔합된 두 가지 모두에서 배지 농도 의존적으로 A549 세포의 성장이 저해됨을 확인하였다 (도 10 참조). 또한， 본 발명자들은 피불린 -3에 의해 암 즐기세포의 성장이 억제되는지를 확인하기 위해 콜로니 형성 실험을 하였으며, 그 결과， 상기 피불린ᅳ3 과발현 배지가 흔합된 두 가지 모두에서 배지 농도 의존적으로 ALDH1 활성 세포의 성장이 저해됨을 확인하였다 (도 10 참조). 또한， 본 밤명자들은 피불린 -3 단백질 발현용 히스-피불린 -3 백터를 단백질 정제가 용이한 CHCHQ 세포 및 293T 세포에 각각 과발현시킨 후， 48시간 동안 배양한 배양 배지를 비소세포성 폐암 세포인 A549 세포와 암 줄기세포인 ALDH1 활성 세포에 처리하였다. 그 결과， 상기 배지가 처리된 세포는 대조군에 비해 세포 성장이 저해됨을 확인할 수 있었다 (도 11 및 16 참조). 아울러， 본 발명자들은 정제된 피불린 -3 단백질에 의한 암세포 및 암 줄기세포의 세포 성장이 억제되는지를 확인하기 위하여 비소세포성 폐암 세포인 A549 세포， 유방암 세포인 MDA-MB231 세포 및 암 줄기세포인 ALDH1 활성 세포에 , CH0-K1 세포 또는 293T 세포에 피불린—3 단백질 발현용 히스—피불린ᅳ 3 백터를 형질전환하여 얻은 피블린—3 정제 단백질을 처리한 후 콜로니 형성실험을 하였다. 그 결과， 정제된 피불린 -3 단백질이 비소세포성 폐암 세포인 A549 세포， 유방암 세포인 MDAᅳ MB231 세포 및 암 줄기세포인 ALDH1 활성 세포에서 세포 성장을 억제함을 확인하였다 (도 12, 도 13 및 도 17 참조).
따라서, 암 줄기세포의 성장 억제에 있어서 피불린 -3 단백질이 암 즐기세포의 세포 성장 및 침투 인자를 억제할 수 있으므로, 피불린 -3 단백질을 암 줄기세포의 성장 억제용 약학적 조성물의 유효 성분으로서 유용하게 사용할 수 있다. 본 발명의 조성물의 치료적으로 유효한 양은 여러 요소， 예를 들면 투여방법， 목적부위， 환자의 상태 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 인체에 사용 시 투여량은 안전성 및 효율성을 함께 고려하여 적정량으로 결정되어야 한다. 동물실험을 통해 결정한 유효량으로부터 인간에 사용되는 양을 추정하는 것도 가능하다. 유효한 양의 결정시 고려할 이러한 사항은， 예를 들면 Hardman and Limbird, eds. , Goodman and Gi lman' s The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed. (2001) , Pergamon Press； 및 E.W. Mart in ed. , Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed.(1990), Mack Publishing Co.에 기술되어있다.
본 발명의 조성물은 또한 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제， 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 조성물을 생체 내 전달에 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며， 예를 들면， Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc. 에 기재된 화합물， 식염수， 멸균수, 링거액， 완충 식염수， 덱스트로스 용액， 말토 텍스트린 용액， 글리세롤， 에탄을 및 이들 성분 증 1 성분 이상을 흔합하여 이용할 수 있으며， 필요에 따라 항산화제， 완층액， 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한， 회석제， 분산제, 계면활성제， 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액， 현탁액， 유탁액 등과 같은 주이용 제형， 환약， 캡슐， 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Sc ience( Mack Pub 1 ishing Company, East on PA, 18th, 1990)에 개入 ]되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 조성물에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 본 발명의 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 단백질을 0.0001 내지 10 중량 %로， 바람직하게는 0.001 내지 1 중량 %를 포함한다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 비 경구 투여 (예를 들어 정맥 내， 피하， 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며， 투여량은 환자의 체중， 연령, 성별， 건강상태， 식이， 투여시간， 투여방법， 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명에 따른 조성물의 일일 투여량은 0.0001 ~ 10 mg/m«이며 , 바람직하게는 0.0001 ~ 5 mg/m«이며， 하루 일 회 내지 수희에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다. 또한, 본 발명은 암 즐기세포에 유효한 양의 피불린 -3를 처리하는 단계를 포함하는 암 줄기세포의 성장 억제 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 피불린—3 단백질을 암 줄기세포가 있는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암줄기세포 성장 억제 방법을 제공한다. 상기 암은 폐암 또는 유방암인 것이 바람직하고， 상기 폐암은 비소세포성 폐암인 것이 더욱 바람직하다 . 본 발명의 구체적인 실시예에서， 본 발명자들은 암 즐기세포가 피불린—3에 의해 성장이 억제되는지를 확인하기 위해 피불린 -3 단백질을 과발현시킨 ALDH1 활성 세포의 배양 배지와， 피불린 -3 단백질의 발현이 많은 H460 세포의 배양 배지를 A549 세포에서 암 줄기세포로 분리된， ALDH1 활성 세포에 처리한 후ᅳ 콜로니 형성 실험을 하였다. 그 결과, 상기 피불린 -3 과발현 배지 두 가지 모두에서 배지 농도 의존적으로 ALDH1 활성 세포의 성장이 저해됨을 확인하였다. 아울러， 피불린 -3 단백질 정제용 히스ᅳ피블린ᅳ 3 백터를 CH0-K1 세포 또는 293T 세포에 형질전환하여 정제한 피불린 -3 단백질을 비소세포성 폐암 세포인 A549 세포， 유방암 세포인 MDAᅳ MB231 세포 및 암 줄기세포인 ALDH1 활성 세포에 처리한 후 콜로니 형성 실험을 한 결과, 정제된 피블린 -3 단백질을 처리한 세포들의 성장이 저해됨을 확인하였다. 따라서， 본 발명의 피불린 -3 단백질은 암 즐기세포의 성장을 억제하는 방법에 유용하게 이용될 수 있다. 또한， 본 발명은 피불린 -3 유전자를 형질전환시켜 제조한 피불린 -3 과발현 세포주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 암 줄기세포 성장 억제용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 암은 폐암 또는 유방암인 것이 바람직하고, 상기 폐암은 비소세포성 폐암인 것이 더욱 바람직하다 . 또한， 본 발명은 피불린 -3 유전자를 형질전환시켜 제조한 피불린 -3 과발현 세포주 또는 이의 배양액을 처리하는 단계를 포함하는 암 줄기세포의 성장 억제 방법을 제공한다. 또한， 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 피불린 -3 유전자를 형질전환시켜 제조한 피불린 -3 과발현 세포주 또는 이의 배양액을 암 줄기세포가 있는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암줄기세포 성장 억제 방법을 제공한다. 상기 암은 폐암 또는 유방암인 것이 바람직하고， 상기 폐암은 비소세포성 폐암인 것이 더욱 바람직하다. 본 발명의 구체적인 실시예에서， 본 발명자들은 피불린 -3 유전자를 형질전환시켜 제조한 피불린ᅳ 3 과발현 세포주 또는 이의 배양액에 의해 암 줄기세포의 성장이 억제되는지를 확인하기 위해， 피불린—3 과발현 백터를 5χ105 개의 ALDH1 활성 세포에 과발현시켜 48시간 배양한 배지와 5χ105개의 Η460 세포를 48시간 동안 배양한 배지를 ALDH1 활성 세포에 처리하고 웨스턴 블랏을 수행하였다. 그 결과, 상기 두 배지를 처리한 군에서 암 줄기세포의 성장과 관련된 베타카테닌과 丽 Ρᅳ 2，7의 발현이 감소하였음을 확인하였다. 또한, 피불린 -3 항체를 이용하여 상기 결과가 피불린ᅳ3에 의한 것임을 한번 더 확인하였다. 이러한 결과를 통하여 피불린ᅳ 3 유전자를 형질전환시켜 제조한 피불린 -3 과발현 세포주 11010001
19 또는 이의 배양액이 암 줄기세포에서 베타카테닌과 ffiP-2,7의 발현을 직접적으로 억제함을 알 수 있었다.
아울러， 본 발명자들은 피불린 -3에 의해 암 줄기세포의 성장이 억제되는지를 확인하기 위해 콜로니 형성실험을 하였으며， 그 결과， 상기 피불린ᅳ3 과발현 배지가 흔합된 두 가지 모두에서 배지 농도 의존적으로 ALDH1 활성 세포의 성장이 억제됨을 확인하였다. 또한， 본 발명자들은 피불린—3 단백질 발현용 히스-피불린 -3 백터를 단백질 정제가 용이한 CH0-K1 세포 또는 293T 세포에 형질전환하여 배양한 배양액이 폐암 세포, 유방암 세포 및 암 줄기세포의 성장을 억제시키는지 확인하기 위하여 콜로니 형성실험을 하였다. 그 결과， 상기 배양액에 의해 폐암 세포， 유방암 세포 및 암 줄기세포의 성장이 억제됨을 확인하였다.
따라서， 암 줄기세포의 성장 억제에 있어서 피불린 -3 유전자를 형질전환시켜 제조한 피불린ᅳ 3 과발현 세포주 또는 이의 배양액이 암 줄기세포의 세포 성장 및 침투 인자를 억제함을 확인할 수 있었으며， 이를 통해 피불린—3 과발현 세포주 또는 이의 배양액이 암 즐기세포의 성장 억제용 약학적 조성물 및 암 줄기세포 성장 억제 방법에 유용하게 이용될 수 있음을 알 수 있다. 또한, 본 발명은 암 줄기세포 성장 억제용 약학적 조성물의 제조에 사용하기 위한， 피불린 -3 단백질의 용도를 제공한다. 아을러, 본 발명은 암 줄기세포 성장 억제용 약학적 조성물의 제조에 사용하기 위한， 피불린—3 유전자를 형질전환시켜 제조한 피불린 -3 과발현 세포주 또는 이의 배양액와 용도를 제공한다.
상기 피불린—3 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하나， 이에 한정되지 않는다.
상기 암은 폐암 또는 유방암인 것을 특징으로 하나， 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 구체적인 실시예에서， 본 발명자들은 피불린 -3 단백질을 정제하여， 정제된 피불린ᅳ3 단백질의 암세포의 성장억제 효과를 확인한 결과， 비소세포성 폐암 세포인 A549 세포， 암 줄기세포인 ALDH1 활성 세포 및 유방암 세포인 MDA-MB231 세포에서 세포 성장 억제 효과가 있음을 확인하여 피불린 -3 단백질을 암세포 및 암 줄기세포의 성장 억제에 유용하게 사용할 수 있음을 확인하였으며， 피불린 -3 유전자를 형질전환시켜 제조한 피불린ᅳ 3 과발현 세포주 또는 이의 배양액에 의해 암 줄기세포의 성장과 관련된 베타카테닌과 醒 2,7의 발현을 직접적으로 억제함을 확인하였다. 아울러， 피불린 -3 과발현 배양액에 의해 폐암 세포， 유방암 세포 및 암 줄기세포의 성장이 억제됨을 확인함으로써， 암 줄기세포의 성장 억제에 있어서 피불린 -3 유전자를 형질전환시켜 제조한 피불린ᅳ 3 과발현 세포주 또는 이의 배양액이 암 줄기세포의 세포 성장 및 침투 인자를 억제함을 확인할 수 있었으며， 이를 통해 피불린 -3' 과발현 세포주 또는 이의 배양액이 암 줄기세포의 성장 억제용 약학적 조성물의 제조에 유용하게 이용될 수 있음을 알 수 있었다. 이하, 본 발명을 실시예, 실험예 및 제조예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예， 실험예 및 제조예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐， 본 발명의 내용이 하기 실시예， 실험예 및 제조예에 의해 한정되는 것은 아니다.
【발명의 실시를 위한 형태】
<실시예 1> 피불린ᅳ 3 과발현 백터의 제작
<1-1> 피불린 -3 유전자 과발현 클론의 제작
본 발명자들은 A549 세포에서 피불린 -3 유전자를 인위적으로 과발현시키기 위하여， 피불린 -3 유전자의 과발현 클론을 제작하였다.
구체적으로， 비소세포성 폐암 세포 H46C ATCC no. HTB-177)으로부터 High Pure RNA Isolation Kit (Roche, Germany)를 이용하여 전체 RNA를 추출한 뒤， Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Ki Roche, Germany)를 이용하여 전체 RNA 1 ig에 대해 역전人 1" 중합효소연쇄반웅 (reverse transcri tion polymerase chain reaction, RT-PCR)을 수행하였다. PCR 조건을 55 °C에서 30분， 및 85 0C에서
5분간으로 하여, cDNA를 합성함으로써 수득하였다. 상기 cDNA를 주형으로 하여,
5'_말단에 Hinc 제한효소 인식 서열과 3'-말단에 제한효소 인식 서열을 포함하도록 제작된 정방향 프라이머 5'-ATATMGCTTATGTTGAAAGCCC— 3' (서열번호 2) 및 역방향 프라이머 5'-ATATCTCGAGCTAAMTG AATGGCCCC-3' (서열번호 3)의 프라이머쌍을 이용하여 94 °C에서 5분간 전변성시킨 후， 94 °C에서 1분 변성，
560C에서 1분간 붙임 , 72 °C에서 1분 30초간 연장을 수행하는 조건으로 30회 반복한 다음, 72 °C에서 5분 동안 후연장을 수행하였다. 이와 같은 조건으로 PCR을 수행함으로써， 1,482 bp의 피불린 -3 유전자를 수득하였다. 상기 수득한 PCR 산물 및 pcDNA3.1(invitrogen, USA) 백터를 각각 제한효소로 처리한 후， 흔합하여 리가아제로 연결시켜 피불린 -3 과발현용 pcDNA3.1/fibulin-3 백터를 제작하였다. <1-2> 피불린 -3 단백질 정제용 히스-피불린 -3 백터의 제작
본 발명자들은 단백질 정제를 하기 위해서 c-터미널 부위에 히스티딘 단백질이 부착된 피불린—3 클론을 제작하였다.
구체적으로, 상기 <실시예 1-1>의 과발현용 피불린 -3 클론의 DNA 0.1 /g을 주형으로 하여 히스티딘 단백질이 피불린 -3의 뒤쪽에서 발현이 되도록 프라이머를 제작하여 PCR을 수행하였다. 5' 말단에 c Y제한효소 인식 서열과 3'말단에 Xhol 제한효소 인식 서열과 함께 히스티딘 (his) 단백질 염기서열을 부착시켜 제작된 정방향 프라이머 5'-CGGMTTCATGTO編 GCCCTmCCTMCTATG— 3' (서열번호 14) 및 역방향 프라이머 5 -CCGGCTCGAGCTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGAAATGAAAATGG-3 '(서열번호
15)의 프라이머 쌍을 이용하여 940C에서 5분간 전변성시킨 후， 940C에서 1분 변성， 60 oC에서 1분간 붙임， 720C에서 1분 30초간 연장을 수행하는 조건으로 30회 반복한 다음， 72 0C에서 5분 동안 후연장을 수행함으로써， PCR을 수행함으로써， his단백질 염기서열이 부착된 피불린 -3 유전자를 수득하였다. 상기 수득한 PCR 산물 및 pcDNA3.1(invitrogen, USA) 백터를 각각 제한효소로 처리한 후， 흔합하여 리가아제로 연결시켜 his 단백질이 부착된 피불린—3 단백질 정제용 pcDNA3.1/his-fibulin-3 백터 (히스-피불린ᅳ 3 백터)를 제작하였다 (도 1).
<실시예 2> 피불린—3 단백질 과발현 배지의 제조 및 정제 <2-l>피블린 -3유전자 과발현 배지의 제조
본 발명자들은 상기 <실시예 1-1>의 피불린 -3 과발현 백터로 피불린 -3를 과발현시킨 세포를 배양한 배지를 제조하였다.
구체적으로, 5χ105 세포 /m의 A549 세포에 상기 <실시예 1-1>의 피불린 -3 과발현 백터 2 을 Lipofecamine 2000을 이용하여 페니실린―스트렙토마이신 (penicillin-streptomycin solut ion)(Hyclone)°] 첨가되지 않은 배지에서 형질도입하였다. 4 ~ 6시간 반웅시킨 후， 100 units/mi의 페니실린 -스트랩토마이신을 첨가한 배지로 교체하여 48시간 동안 배양하였고 그 배지를 수득하였다.
<2-2>정제용 피불린 -3 단백질 과발현 배지의 쎄조
본 발명자들은 상기 <실시예 1_2>의 정제용 피불린 -3 단백질 백터 (his-fibulin-3)로 형질전환한 세포를 배양한 배지를 제조하였다.
구체적으로, 단백질 정제가 용이한 세포인 CH0—K1 세포 (생명공학연구원,대전) 및 293T 세포 (한양대학교，서울)를 각각 60 隱 플레이트에 각각 5χ1()5 개의 세포를 뿌려준 뒤 히스-피불린 -3 백터 4 /ig 과 lipofect amine 2000을 이용하여 페니실린ᅳ스트렙토마이신 (penici 11 in— streptomycin solution, Hyclone)이 첨가되지 않은 DMEM:F12(Gibco) 배지 및 DMEM(Hyclone) 배지에서 형질도입하였다. 12시간 반웅시킨 후， 100 units/mi의 페니실린ᅳ스트랩토마이신을 첨가한 배지로 교체하여 48시간 동안 배양하였고, 각각 그 배지를 수득하였다.
<2-3>히스-피불린 -3단백질의 정제
본 발명자들은 상기 <실시예 2-2>의 피불린ᅳ3 단백질 정제용 배지에서 히스-피불린—3 단백질을 정제하였다.
구체적으로， 히스-피불린ᅳ 3 단백질의 정제를 위해서 CH0-K1세포와 293T세포에 히스ᅳ피불린 -3 백터를 과발현시킨 후， 단백질 lysis 용액을 넣어 파이펫팅 후 4 0C에서 15 내지 20분 반웅 후 13000 RPM의 4 °C 원심분리기로 펠렛과 상층액을 분리하였다. 상기의 상층액을 PBS용액으로 2번 세척한 his bead(Qiagen)를 넣고 4 0C에서 2시간 동안 bead와 히스-피불린 -3 단백질을 결합시킨다. 그 후, 4 0C에서 3000 RPM으로 원심분리 후 bead만 수확한 뒤
PBS용액으로 3회 세척해준다. PBS용액을 깨끗이 제거한 bead에 용출용액 (25( M imidazol)을 넣고 상온에서 5분 반웅시킨 뒤 원심분리기를 이용해 정제된 히스-피불린 -3 단백질을 새로운 튜브로 옮겨 사용하였다. Bradford 방법으로 단백질 정량 kit(Bio-rad)를 사용하여 595 nm파장에서 단백질 양을 측정하여 4 °C에 보관하였다.
<실시예 3> A549 세포에서 ALDH1 활성 세포와 비활성 세포의 분리
본 발명자들은 Aldehyde dehydrogenase(ALDH) 활성에 기초한 stem cell회사의
ALDEFLU0R 제품을 사용해 비소세포성 폐암 세포인 A549 세포에서 암 줄기세포를 구별 및 선별하였다.
구체적으로， 건조된 ALDEFLU0R 시약을 25 ^의 DMSO(Dimethylsulphoxide)를 넣어 1분 동안 상온에서 반웅시키고 시약을 적주황색에서 밝은 연노랑색이 되도록 활성화하였다. 활성화된 시약에 2 M의 염산( 0^0101" acid)을 25 !Λ 넣고
15분 동안 상은에서 반웅시킨 뒤 360 !Λ ALDEFLU0R assay 버퍼를 넣고 냉장보관하여
ALDEFLU0R 기질을 만들었다. 이 후， ΙχΙΟ6 개의 A549 세포를 원심분리기로 상층액을 분리하였다. 상층액은 버리고 ALDEFLU0R assay 버퍼 1 ml을 섞어준다. 빈 튜브를 두 개 준비해 상기의 세포와 ALDEFLU0R assay 버퍼가 섞인 시료를 각각 500 ^ 넣고， 상기의 한 튜브에는 활성화된 ALDEFLU0R 기질을 5 넣고 다른 한 튜브의 대조군에는 DEAB(Di ethyl ami nobenzaldehyde) 용액을 5 f,넣고 섞어주었다. 두 개의 튜브를 37 °C에서 반응한 뒤 원심분리기를 이용해 상층액을 제거하고 세포에 500 ^의 ALDEFLU0R assay 버퍼를 넣고 40C에서 24시간 반옹시켰다. 그 후 음전하 ALDH-기질인 BAM는 수동적인 확산을 통해 살아있는 세포 내로 침투되면 세포 내의 ALDH에 의해 BM-로 전환되면서 형광 빛을 발산하는데, 이를 FACS sorter기계 (BD bioscience, United states)로 형광을 발산하는 세포를 활성 세포로 형광이 없는 세포를 비활성 세포로 분리하였다 (도 2). <실험예 1> 히스-피불린 -3(his-fibulin-3) 백터에 의한 피불린 -3 단백질 과발현 확인
본 발명자들은 단백질 정제용 히스-피불린 -3(his-fibulin-3) 백터에 의해 피불린 -3 단백질이 과발현되는지 확인하기 위하여 상기 백터를 과발현시킨 후， 중합연쇄효소반응 및 웨스턴 블랏을 수행하였다.
구체적으로， 단백질 정제가 용이한 세포인 CH0-K1 세포 (생명공학연구원，대전)와 293T 세포 (한양대학교,서을)를 60 隱플레이트에 각각 5 105 개의 세포를 각각 분주한 뒤 히스-피불린 -3 백터 4 과 lipofectamine
2000을 이용하여 페니실린―스트렙토마이신 (penicillinᅳ streptomycin solution, Hyclone)이 첨가되지 않은 배지에서 형질도입하였다. 12시간 후, 100 units/m«의 페니실린—스트렙토마이신을 첨가한 배지로 교체하여 48시간 동안 배양하였고， 히스-피불린 -3 백터가 도입된 CH0-K1세포를 모아 피불린 유전자의 발현을 확인하였다. 먼저， RNA를 추출하기 위하여 각 세포에 트리졸 1 m£를 5분 동안 섞어준 뒤, 200 의 클로로포름 시약을 넣고 다시 5분 동안 흔합한 후 4 0C 원심분리기에서 10분 동안 원심분리하여 200 의 상층액을 얻은 다음， 새 튜브로 옮겼다. 상기 얻어진 상층액에 500 ^의 이소프로판올을 흔합한 후 상온에서 10분 동안 반웅시키고 4 °C 원심분리기를 이용하여 상층액을 제거한 다음， 침전물을 75 % 에탄올이 있는 DEPC 용액으로 씻어준 뒤 다시 원심분리기를 이용해 상층액을 제거해준다. 원심분리하여 얻어진 침전물을 DEPC 용액으로 녹여 RNA를 얻었으며 이를 정량한 후 Intron사의 oligo dT cDNA kit를 사용하여 RNA 1 을 45 0C에서
1시간， 95 0C에서 5분으로 증폭기계 (Takara, Japan)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 이후， 하기 <표 1>의 프라이머를 가지고 I-taq 중합효소 (Intron)로 940C 5분 전변성ᅳ
94 °C 30초 변성 ; 56 °C 30초 붙임; 72 °C 30초 연장 단계를 30번을 반복한 다음，
72 0C에서 10분 후연장 한 뒤 얻어진 수득물을 1 % 아가로즈 젤에 로딩하여 확인하였다.
또한 히스-피불린 -3 단백질발현을 확인하기위해 백터가 도입된 CH0-K1세포를 모아， 각 세포에 용해 용액을 각각 50 ^씩 넣고 4°C에서 30분 동안 반웅한 뒤 4°C 원심분리기를 이용하여 원심분리하여， 상층액을 얻고， 그 다음， 단백질 정량키트 (sigma)를 사용하여 각각의 단백질 40 g씩을 SDS-젤에 로딩하였다. 이후 SDS—젤에 로딩된 단백질을 니트로셀를로즈 멤브레인에 이동시킨 뒤 BSA 버퍼로 30분 동안 상온에서 반웅시켜 다른 항체들이 결합하지 못하게 한 후， 일차 항체 항 -베타카테닌 항체 (santa cruz)와 항-베타액틴 항체 (sigma)를 1:1000으로 회석한 PBS 완충용액에 4시간 동안 반웅시킨 후， 다시 이차 항체 항 -mouse(cell signaHng)를 1:10000으로 회석한 PBS 완충용액에 1시간 동안 반웅시켰다. 그 후 PBS로 니트로셀를로즈 멤브레인을 5회 씻어준 뒤 검출 용액으로 필름에 감광시켰다.
그 결과， 히스-피불린 -3 백터가 도입된 CH0-K1세포에서 피불린 -3 단백질이 과발현 되는 것을 확인하였다 (도 3).
<실험예 2> ALDH1 활성 세포 및 ALDH1 비활성 세포의 특성 확인
<2-1> ALDH1 활성 세포 및 ALDH1 비활성 세포의 성장 확인
본 발명자들은 A549 세포와 이로부터 분리된 ALDH1 활성 세포 및 ALDH1 비활성 세포의 성장 정도를 비교하기 위해 A549 세포와， 이로부터 분리된 ALDH1 활성 세포 및 ALDH1 비활성 세포를 가지고 콜로니 형성 분석을 하였다.
구체적으로， A549 세포, 분리된 ALDH1 활성 세포 및 ALDH1 비활성 세포를
Ι ΙΟ3 세포 /ml로 분주하여 35 mm 플레이트에 접종하고 37 °C 이산화탄소 인큐베이터에서 8일을 배양하였다. 콜로니를 형성한 세포들을 0.5 % 크리스탈 바이올렛 시약으로 10분 동안 염색한 후 수차례 PBS로 세척하여 현미경으로 관찰하였다.
그 결과， A549 세포보다 이로부터 분리한 ALDH1 활성 세포가 성장이 더 잘 된 반면에 ALDH1 비활성 세포는 거의 성장하지 않음을 확인하였다 (도 4).
<2-2> ALDH1 활성 세포 및 ALDH1 비활성 세포에서 ALDH1, 피불린 -3 및 베타카테닌의 발현 확인
본 발명자들은 A549 세포를 대조군으로 하여, 이로부터 분리된 ALDH1 활성 세포 및 비활성 세포에서의 피불린 -3 및 베타카테닌의 발현량을 확인하였다. 구체적으로， A549 세포 및 이로부터 분리된 ALDH1 활성 세포 및 비활성 세포에서 RNA를 추출하기 위하여 먼저， 각 세포에 트리졸 1 m를 5분 동안 섞어준 뒤， 200 ^의 클로로포름 시약을 넣고 다시 5분 동안 흔합한 후 4°C 원심분리기에서
10분 동안 원심분리하여 200 ^의 상층액을 얻은 다음, 새 튜브로 옮겼다. 상기 얻어진 상층액에 500 의 이소프로판을을 흔합한 후 상은에서 10분 동안 반응시키고 4 °C 원심분리기를 이용하여 상층액을 제거한 다음， 침전물을 75 % 에탄올이 있는 DEPC 용액으로 씻어준 뒤 다시 원심분리기를 이용해 상층액을 제거해준다. 원심분리하여 얻어진 침전물을 DEPC 용액으로 녹여 RNA를 얻었으며， 이를 정량한 후 Intron사의 oligo dT cDNA kit를 사용하여 RNA 1 /g을 45 0C에서 1시간， 95 0C에서 5분으로 증폭기계 (Takara, Japan)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 이후, 하기 <표 1>의 프라이머를 가지고 I-taq 중합효소 (Intron)로 94 5분 전변성 ,
94 °C 30초 변성 ; 56 °C 30초 붙임; 72 °C 30초 연장 단계를 30번을 반복한 다음，
72 0C에서 10분 후연장 한 뒤 얻어진 수득물을 1 % 아가로즈 젤에 로딩하여 확인하였다.
【표 1】
Figure imgf000028_0001
그 결과， ALDH1과 베타카테닌은 ALDH1 활성 세포에서 비활성 세포보다 발현량이 많음을 확인하였고， 반대로 피불린 -3는 비활성 세포에서 활성세포보다 발현량이 많음을 확인하였다 (도 5). <실험예 3> 피불린 -3에 의한 베타카테닌 발현 억제 효과 확인
<3-1> 비소세포성 폐암 세포에서 베타카테닌의 발현 확인
본 발명자들은 비소세포성 폐암 세포인 A549 세포와 H460 세포에서의 베타카테닌의 핵산 및 단백질 발현량을 확인하였다.
구체적으로, A549 세포와 H460 세포에서 R A를 추출하기 위하여， 먼저， 각 세포에 트리졸 1 m«을 5분 동안 섞어준 뒤 200 의 클로로포름 시약을 넣고 다시
5분 동안 흔합한 후 4 0C 원심분리기로 10분 동안 원심분리하여 200 의 상층액을 얻은 다음 새 튜브로 옮겼다. 500 ^의 이소프로판을을 혼합한 후 상온에서 10분 동안 반웅시키고 4 °C 원심분리기를 이용하여 상층액을 제거한 다음， 침전물을 75% 에탄을이 있는 DEPC 용액으로 씻어준 뒤 다시 원심분리기를 이용해 상층액을 제거해준다. 원심분리하여 얻어진 침전물을 DEPC 용액으로 녹여 RNA를 얻었으며， 이를 정량하였다. 추출한諷 각 1 I返을 cDNA Synthesis Kit (Intron Biotechnology, Gyungki-do, Korea)로 역전사 중합효소연쇄반웅 (reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)을 실시하여 cDNA를 합성하였다. 합성한 cDNA를 주형으로 상기 <표 1>의 베타카테닌 프라이머를 이용하여 I-taq 중합효소 (Intron)로 94 °C 5분 전변성， 94 °C 30초 변성； 56 °C 30초 붙임； 72 °C 30초 연장 단계를 30번을 반복하여 PCR을 수행한 다음, 720C에서 10분 후연장 한 뒤 얻어진 수득물을 1% 아가로즈젤에 로딩한 뒤 결과를 확인하였다.
웨스턴 블랏 (Western Blot)은 우선, 각 세포에 용해 용액을 각각 50 ^씩 넣고 4 0C에서 30분 동안 반옹한 뒤 4 0C 원심분리기를 이용하여 원심분리하여， 상층액을 얻고， 그 다음， 단백질 정량키트 (sigma)를 사용하여 각각의 단백질 40 / 씩을 SDS-젤에 로딩하였다. 이후， SDSᅳ젤에 로딩된 단백질을 니트로셀를로즈 멤브레인에 이동시킨 뒤 BSA 버퍼로 30분 동안 상온에서 반웅시켜 다른 항체들이 결합하지 못하게 한 후， 일차 항체 항 -베타카테닌 항체 (santa cruz)와 항-베타액틴 항체 (sigma)를 1:1000으로 희석한 PBS 완충용액에 4시간 동안 반웅시킨 후, 다시 이차 항체 항— mouse(cell signaling)를 1:10000으로 희석한 PBS 완층용액에 1시간 동안 반웅시켰다. 그 후 PBS로 니트로샐를로즈 멤브레인을 5회 씻어준 뒤， 검출 용액으로 필름에 감광시켰다.
그 결과， 베타카테닌은 핵산 및 단백질 발현량이 H460 세포보다 A549 세포에서 더 많이 발현됨을 확인하였다 (도 6).
<3-2> 비소세포성 폐암 세포에서 피불린 -3에 의한 베타카테닌 발현 억제 효과
본 발명자들은, 비소세포성 폐암 세포에서 피불린 -3가 베타카테닌의 핵산 및 단백질의 발현량에 영향을 주는지 확인하였다.
구체적으로, 베타카테닌 발현이 많은 A549 세포에 상기 <실시예 1-1>에서 제작된 피불린—3 유전자 과발현 클론을 형질도입하였다. 또한， 베타카테닌 발현이 적은 H460 세포에서 피불린 -3의 발현을 억제하기 위해 피불린 -3 유전자에 대한 정방향 프라이머 5'— UAGAAUGUAGGGAUCUUGACAAGG-3' (서열번호 12)와 역방향 프라이머 5'一 CCUUGUCAAGAUCCCUACAL]UCUAA-3' (서열번호 13)의 각각 25머 (mer)인 fibulin-3 stealth-RNAi를 Invitrogen사에 제작 주문하였다. 상기 siRNA의 세포 내 도입은
H460 세포 2χ105 개당 각각의 RNAi를 100 nM씩 취해 Lipofectamine RNAi
MAX( invitrogen)를 이용하여 실시하였고， Scrambled Stealth™ RNA 분자 (molecule)을 도입한 세포 (음성 대조군; siControl)는 Scrambled Stealth™ RNA 분자를 100 nM 취해 Lipofectamine RNAi MAX( invi trogen)를 이용하여 페니실린 -스트렙토마이신이 첨가되지 않은 배지에서 세포에 형질도입하였다. 형질도입을 하고 4 ~ 6시간 후， 100 units/m^ 페니실린 -스트렙토마이신을 첨가한 배지로 교체하여 72시간 배양하였다. 상기 세포들을 <실험예 2-1>의 방법으로 피불린 -3 프라이머를 이용한 중합연쇄반웅과 피불린ᅳ3항체 (abl4926, Abeam, England)를 이용한 웨스턴 블랏을 수행하였으며， 베타카테닌 프라이머를 이용한 중합연쇄반웅과 베타카테닌 항체를 이용한 웨스턴 블랏을 수행하였다.
그 결과， A549 세포에서는 피불린 -3 유전자 과발현 클론에 의해 피불린 -3가 과발현되었고 H460 세포에서는 피불린 -3 siRNA에 의해 피불린ᅳ 3가 저해되었음을 확인하였다. 또한， 각각의 샘플에서 피불린—3가 과발현된 A549 세포에서는 베타카테닌의 발현이 감소하고 피불린 -3의 발현이 저해된 H460 세포에서는 베타카테닌의 발현이 증가함을 확인할 수 있었다 (도 .
따라서， 비소세포성 폐암 세포주에서 피블린 -3에 의해 베타카테닌의 발현이 저해됨을 확인하였다.
<실험예 4> 암세포에서 피불린 -3 단백질의 효과 확인
<4-1> 비소세포성 폐암 세포에서 피불린 -3의 베타카테닌 발현 억제 효과 확인
본 발명자들은 비소세포성 폐암세포주인 A549 세포에서 피불린ᅳ3에 의한 베타카테닌의 발현 억제 효과를 확인하였다.
구체적으로， <실시예 2ᅳ 1>에서 제조한 피불린 -3 과발현 배지와 A549 세포 배지를 1:4의 비율로 흔합한 배지와， H460 세포 배양 배지와 A549 세포 배지를
1:4의 비율로 흔합한 배지를 만들었고， 상기 배지를 각각 2χ105 세포 / 의 Α549 세포에 처리하였다. 그 후ᅳ 현미경으로 세포의 상태를 확인하였고， 상기 <실험예 3-1>의 웨스턴 블랏 방법으로 베타카테닌의 단백질 발현량을 확인하였다.
그 결과， Η460 세포 배양 배지와 Α549 세포 배지를 1:4의 비율로 흔합한 배지와, 피불린ᅳ3 과발현 배지와 Α549 세포 배지를 1:4의 비율로 흔합한 배지를 처리한 세포 모두에서 무처리 Α549 세포에 비해 베타카테닌의 발현이 억제됨을 확인할 수 있었다 (도 8).
<4-2> 비소세포성 폐암 세포에서 피불린 -3의 ΜΜΡ-2,7의 발현 억제 확인 본 발명자들은 폐암 세포주인 Α549 세포에서 피불린ᅳ3에 의한 丽 Ρ-2,7의 발현 억제 효과를 확인하였다.
구체적으로, <실시예 2ᅳ1>에서 제조한 피불린 -3 과발현 배지의- Α549 세포 배지를 1:4의 비율로 흔합한 배지와， 피불린 -3의 발현이 Α549 세포에 비해 많은
Η460 세포 5χ105개를 48시간 동안 배양한 Η460 세포 배양 배지와 Α549 세포 배지를
1:4의 비율로 흔합한 배지를 만들었고， 상기 배지를 각각 2χ105 세포 /m 의 A549 세포에 처리하였다. 48시간 후, 항-画 P-2(cell signaling), 항-讓 P_7(R&D system) 항체를 1:1000의 비율로 사용하여 상기 <실험예 3-1>의 웨스턴 블랏 방법으로 단백질 발현을 확인하였다. 또한, 피불린 -3의 직접적인 작용인 것을 확인하기 위해 상기 두 배지에 피불린 -3 항체를 500:1로 회석하여 피불린ᅳ3의 활성을 저해한 후， A549 세포에 처리한 뒤 48시간 후 항 -MMP-2,7과 항 -베타카테닌 항체를 이용한 웨스턴 블랏으로 각각의 배지에서 단백질 발현을 확인하였다.
그 결과， 베타카테닌 단백질과 같이 A549 세포 대조군에 비해서 H460 세포 배양 배지와 A549 세포 배지를 1:4의 비율로 흔합한 배지와, 피불린—3 과발현 배지와 A549 세포 배지를 1:4의 비율로 흔합한 배지를 처리한 세포에서 應 P-2와 7 단백질이 감소함을 확인할 수 있었다. 그러나 상기 배지에 피불린 -3 항체를 500:1로 희석하여 A549 세포에 처리한 웨스턴 블랏 결과에서는 醒 P-2,7과 베타카테닌의 단백질 발현이 대조군에 비해 차이가 없음을 확인하였으며， 이를 통해 丽 P— 2，7 및 베타카테닌의 발현 억제 효과가 피불린 -3 단백질에 의한 것임을 확인하였다 (도 9). <4-3>피불린 -3의 비소세포성 폐암 세포 성장 억제 효과 확인
본 발명자들은 피불린 -3에 의한 비소세포성 폐암 세포인 A549 세포의 성장 억제 효과를 확인하였다.
구체적으로, <실시예 2-1>에서 제조한 피불린 -3 과발현 배지와 A549 세포 배지를 1:4의 비율로 흔합한 배지와， 피불린 -3의 발현이 A549 세포에 비해 많은 H460 세포 5χ105개를 48시간 배양한 Η460 세포 배양 배지와 Α549세포 배지를 1:4의 비율로 흔합한 배지를 Α549 세포에 처리하였다. 우선, Α549 세포 ΙχΙΟ3개를 35 mm 플레이트에 깔고 24시간 후 피불린 -3를 과발현한 배지와 A549 세포 배지를 1:1의 비율 (50 %)로 흔합한 배지， 피불린 -3 과발현 배지와 A549 세포 배지 5:4의 비율 (80 %)로 흔합한 배지， 및 피불린 -3 과발현 배지 (100 %)를 각각 처리하였다. 또한, H460 세포 5χ105 개를 48시간 배양한 Η460 세포 배양 배지와 Α549 세포 배지를 1:1의 비율 (50 로 흔합한 배지， Η460 세포 배양 배지와 Α549 세포 배지를 5:4의 비율 (80 %)로 흔합한 배지 그리고 Η460 세포 배양 배지 (100 %)를 각각 처리하였다. 상기 조합의 배지를 처리한 후， 37 °C 이산화탄소 인큐베이터에서 8일을 배양한 뒤， 크리스탈 바이올렛 0.5 % 시약으로 10분 동안 염색을 하고 PBS로 수차례 씻어 확인하였다.
그 결과， A549 세포 대조군보다 피불린 -3 과발현 배지， 또는 H460 세포
5 10δ개를 48시간 배양한 Η460 세포 배양 배지의 흔합 비율이 높은 배지를 처리한 Α549 세포의 성장이 대조군에 비해 저해됨을 확인하였다 (도 10).
아울러， 본 발명자들은 <실시예 2— 2>의 단백질 정제용 히스-피불린 -3(hisᅳ fibulin-3) 백터를 형질전환하여 얻은 히스-피불린 -3 과발현 배지를 A549 세포에 처리하여 세포의 성장 억제 효과를 콜로니 형성 실험으로 확인하였다.
구체적으로， <실시예 2-2〉의 형질전환한 CH0-K1 세포와 293T 세포의 히스-피불린 -3 과발현 배지를 1:1의 비율로 혼합하여 lxlO3 개의 A549 세포에 처리한 뒤， 37°C이산화탄소 인큐베이터에서 7일 동안 배양하였다. 그 후， 크리스탈 바이올렛 0.5 %시약으로 10분 동안 염색을 하고 PBS로 수차례 씻어 확인한 결과， 히스—피불린 -3 과발현 배지를 처리한 A549 세포가 대조군에 비해 세포성장이 저해됨을 확인할 수 있었다 (도 11).
<4-4> 정제한 피불린 -3 단백질의 암세포 성장 억제 효과 확인
본 발명자들은 정제된 피불린 -3 단백질에 의한 암세포 성장 억제 효과를 확인하였다.
구체적으로， lxlO3개의 비소세포성 폐암 세포인 A549 세포 및 유방암 세포인
MDA-MB231 세포를 35mm 플레이트에 접종하고 24시간 후， <실시예 2-3>의 히스ᅳ피불린 -3 정제 단백질을 폐암 세포 및 유방암 세포에 각각 1 한번 또는 두번 (한번 처리한 곳에 다시 24시간 후 한번 더 처리) 처리하였다. 그 후， 세포들을 37°C인큐베이터에서 7일 배양한 후 크리스탈 바이을렛 0.5%시약으로 10분 동안 염색한 후 PBS로 수차례 씻었다.
그 결과， 폐암 세포인 A549 세포 및 유방암 세포인 MDA— MB231 세포 모두에서 세포성장이 억제됨을 확인할 수 있었다 (도 12 및 13). <실험예 5> 암 줄기세포에서 피블린 -3의 효과 확인
<5-1> 암 줄기세포에서 피불린 -3에 의한 MMP-2,7과 베타카테닌 발현 억제 효과 확인
본 발명자들은 암 줄기세포인 ALDH1 활성 세포에서 피불린 -3에 의한 MMP-2,7 및 베타카테닌의 발현 억제 효과를 확인하였다.
구체적으로, <실시예 2-1>에서 제조한 피불린 -3 과발현 배지와 ALDH1 활성 세포 배지를 1:4의 비율로 흔합한 배지와， 피블린 -3의 발현이 A549 세포에 비해 많은 H460 세포 5χ105개를 48시간 배양한 Η460 세포 배양 배지와 ALDH1 활성 세포 배지를 1:4의 비율로 흔합한 배지를 만들고， 상기 배지를 각각 2χ105 세포 / 의 ALDH1 활성 세포에 처리하였다. 48시간 후， 丽 P_2(cell signaling), MMP-7CR&D system), 베타카테닌 (santa cruz) 항체를 사용하여 상기 <실험예 2ᅳ 1>의 웨스턴 블랏 방법으로 단백질 발현을 확인해보았다. 또한， 피불린 -3의 직접적인 작용인 것을 확인하기 위해, 상기에서 흔합한 두 배지에 피불린 -3 항체를 500:1로 희석하여 ALDH1 활성 세포에 처리한 뒤 48시간 후 匪 Pᅳ 2，7과 베타카테닌 항체를 이용한 웨스턴 블랏으로 단백질 발현을 확인하였다.
그 결과, 베타카테닌 단백질과 같이 ALDH1 활성 세포 대조군에 비해서 H460 세포 배양 배지와 ALDH1 활성 세포 배지를 1:4의 비율로 흔합한 배지와， 피불린 -3 과발현 배지와 ALDH1 활성 세포 배지를 1:4의 비율로 흔합한 배지를 처리한 세포에서 應 P-2, 7 및 베타카테닌의 단백질 발현이 감소함을 확인할 수 있었다. 또한 상기 배지에 피불린 -3 항체를 500:1로 회석하여 ALDH1 활성 세포에 처리한 웨스턴 블랏 결과에서 醒 P-2,7 및 베타카테닌의 단백질 발현이 대조군에 비해 차이가 없음을 확인하여 醒 P-2,7 및 베타카테닌의 발현 억제 효과가 피불린 -3 단백질에 의한 것임을 확인하였다 (도 14). <5-2> 피불린 -3의 암 줄기세포 성장 억제 효과 확인
본 발명자들은 피불린 -3에 의한 암 줄기세포인 ALDH1 활성 세포의 성장 억제 효과를 확인하였다.
구체적으로， <실시예 2ᅳ 1>에서 제조한 피불린—3 과발현 배지와 ALDH1 활성 세포 배지를 1:4의 비율로 흔합한 배지와, 피불린 -3의 발현이 A549 세포에 비해 많은 H460 세포 5χ105개를 48시간 배양한 Η460 세포 배양 배지와 ALDH1 활성 세포 배지를 1:4의 비율로 흔합한 배지를 가지고 ALDH1 활성 세포에 처리하였다. 우선，
ALDH1 활성 세포 ΙχΙΟ3개를 35 麵 플레이트에 깔고 24시간 후 피블린 -3를 과발현한 배지와 ALDH1 활성 세포 배지를 1:1의 비율 (50 ¾)로 흔합한 배지, 피불린 -3 과발현 배지와 ALDH1 활성 세포 배지를 5:4의 비율 (80 로 흔합한 배지， 및 피불린ᅳ3 과발현 배지 (100 <¾)를 각각 처리하였다. 또한， H460 세포 5χ105개를 48시간 동안 배양한 Η460 세포 배양 배지와 ALDH1 활성 세포 배지를 1:1의 비율 (50 %)로 흔합한 배지， Η460 세포 5χ105개를 48시간 배양한 Η460 세포 배양 배지와 ALDH1 활성 세포 배지를 5:4의 비율 (80 ¾ 로 흔합한 배지， 및 Η460 세포 5χ105개를 48시간 동안 배양한 Η460 세포 배양 배지 (100 ¾>)를 각각 처리하였다. 상기 배지를 처리 후， 37 °C 이산화탄소 인큐베이터에서 8일 동안 배양한 후， 크리스탈 바이올렛 0.5 ¾ 시약으로 10분 동안 염색 후 수차례 PBS로 씻고 확인하였다.
그 결과， ALDH1 활성 세포 대조군보다 피불린—3 과발현 배지， 또는 H460 세포 배양 배지의 비율이 높은 배지를 처리한 ALDH1 활성 세포에서 그 성장이 저해됨을 확인 하였다 (도 15).
아울러， 본 발명자들은 <실시예 2ᅳ2>에서 제조한 히스—피불린 -3 과발현 배지에 의한 암 줄기세포인 ALDH1 활성 세포의 성장 억제 효과를 확인하였다.
구체적으로, <실시예 2— 2>의 형질전환한 CH0-K1 세포와 293T 세포의 히스—피불린 -3 과발현 배지를 1:1의 비율로 혼합하여 ΙχΙΟ3개의 ALDH1 활성 세포에 처리한 뒤 37 °C이산화탄소 인큐베이터에서 7일 동안 배양한 후, 크리스탈 바이올뻣
0.5 %시약으로 10분 동안 염색을 하고 PBS로 수차례 씻어 콜로니 형성 실험을 하였다.
그 결과， 히스-피불린ᅳ3 과발현 배지를 처리한 ALDH1 활성 세포가 대조군에 비해 세포성장이 저해됨을 확인할 수 있었다 (도 16).
<5-3> 정제한 피불린 -3 단백질의 암 줄기세포 성장 억제 효과 확인
본 발명자들은 정제된 피불린 -3 단백질에 의한 암 줄기세포 성장 억제 효과를 확인하였다. 구체적으로， ΙχΙΟ3개의 암 줄기세포인 ALDH1 활성 세포를 35醒 플레이트에 접종하고 24시간 후， <실시예 2-3>의 히스-피불린—3 정제 단백질을 ALDH1 활성 세포에 각각 1 g 한번 또는 두번 (한번 처리한 곳에 다시 24시간 후 한번 더 처리) 처리하였다. 그 후， 세포들을 37 인큐베이터에서 7일 배양한 후 크리스탈 바이올렛 0.5 %시약으로 10분 동안 염색한 후 PBS로 수차례 씻었다.
그 결과， 암 줄기세포인 ALDH1 활성 세포의 세포성장이 억제됨을 확인할 수 있었다 (도 17). <제조예 1> 약학적 제제의 제조
<1-1>산제의 제조
피블린ᅳ 3 단백질 2 g
유당 1 g
상기의 성분을 흔합하고 기밀포에 층진하여 산제를 제조하였다.
<1-2> 정제의 제조
피불린—3 단백질 100 mg
옥수수전분 100 nig
유 당 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 nig
상기의 성분을 흔합한 후， 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
<1-3> 캡슐제의 제조
피블린 -3 단백질 100 mg
옥수수전분 100 mg
유 당 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 nig
상기의 성분을 흔합한 후， 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슬에 충전하여 캡슐제 제조하였다.
<1-4>환의 제조
피불린 -3 단백질 1 g
유당 1.5 g
글리세린 1 g
자일리틀 0.5 g
상기의 성분을 혼합한 후， 통상의 방법에 따라 1환 당 4 g이 되도록 제조하였다.
<1-5> 과립의 제조
피불린ᅳ3 단백질 150 nig
대두추출물 50 rag
포도당 200 mg
전분 600 nig
상기의 성분을 흔합한 후， 30 % 에탄올 100 nig을 첨가하여 섭씨 60 t에서 건조하여 과립을 형성한 후 포에 층진 하였다.

Claims

【청구의 범위】
【청구항 11
암 줄기세포 성장 억제 활성을 갖는 피불린 -3 단백질.
【청구항 2】
제 1항에 있어서， 상기 피불린ᅳ3 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 단백질.
【청구항 3]
제 1항에 있어서, 상기 암은 폐암 또는 유방암인 것을 특징으로 하는 피불린 -3 단백질.
【청구항 4]
1) 피불린 -3 단백질을 암호화하는 백터를 제작하는 단계;
2) 단계 1)의 백터를 세포에 형질 전환하는 단계; 및
3) 단계 2)의 세포 배양액에서 피불린 -3 단백질을 정제하는 단계를 포함하는， 암 줄기세포 성장 억제 활성을 갖는 피불린 -3 단백질의 제조 방법.
【청구항 5】
제 4항에 있어서, 상기 암은 폐암 또는 유방암인 것을 특징으로 하는 피불린 -3 단백질 제조 방법.
【청구항 6]
피불린ᅳ 3(fibulin-3) 단백질을 유효성분으로 함유하는 암 줄기세포 성장 억제용 약학적 조성물.
【청구항 7】
제 6항에 있어서， 상기 피불린ᅳ 3 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
【청구항 8】
피불린 -3 유전자를 형질전환시켜 제조한 피불린 -3 과발현 세포주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 암 줄기세포 성장 억제용 약학적 조성물.
【청구항 9】
제 6항에 있어서， 상기 암 줄기세포는 암 줄기세포 마커인 CD133 (proniinin一 1； AC 133) , CD44(hyaluronate receptor； P-glycoprotein 1) 및 ALDHKAldehyde dehydrogenase 1)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 마커에 의해 선별된 것인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
【청구항 10]
제 6항에 있어서， 상기 암은 폐암 또는 유방암인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
【청구항 11】
암 줄기세포에 유효량의 피불린 -3 단백질， 피불린 -3 유전자를 형질전환시켜 제조한 피블린—3 과발현 세포주 및 이의 배양액으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 처리하는 단계를 포함하는 암 줄기세포의 성장 억제 방법.
【청구항 12】
제 11항에 있어서， 상기 암은 폐암 또는 유방암인 것을 특징으로 하는 암 줄기세포의 성장 억제 방법 . -
【청구항 13]
약학적으로 유효한 양의 피불린ᅳ 3 단백질을 암 줄기세포가 있는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암즐기세포 성장 억제 방법ᅳ
【청구항 14]
약학적으로 유효한 양의 피불린—3 유전자를 형질전환시켜 제조한 피불린 -3 과발현 세포주 또는 이의 배양액을 암 줄기세포가 있는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암즐기세포 성장 억제 방법 .
【청구항 15]
제 13항에 있어서, 상기 피불린 -3 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 16]
제 13항에 있어서， 상기 암은 폐암 또는 유방암인 것을 특징으로 하는 피불린 -3 방법 .
【청구항 17]
암 줄기세포 성장 억제용 약학적 조성물의 제조에 사용하기 위한， 피불린 -3 단백질의 용도.
【청구항 18】
암 줄기세포 성장 억제용 약학적 조성물의 제조에 사용하기 위한, 피불린 -3 유전자를 형질전환시켜 제조한 피불린 -3 과발현 세포주 또는 이의 배양액의 용도.
【청구항 19】
제 17항에 있어서， 상기 피불린 -3 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 용도.
【청구항 20]
제 17항에 있어서， 상기 암은 폐암 또는 유방암인 것을 특징으로 하는 용도.
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