WO2013015611A2

WO2013015611A2 - 효모 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 연골세포 손상방지 및 재생효과를 갖는 조성물

Info

Publication number: WO2013015611A2
Application number: PCT/KR2012/005937
Authority: WO
Inventors: 배송환; 서형주; 이현순; 박소연; 이현지
Original assignee: (주)새롬바이오
Priority date: 2011-07-26
Filing date: 2012-07-25
Publication date: 2013-01-31
Also published as: WO2013015611A3; KR101138714B1; WO2013015611A9

Abstract

본 발명은 효모 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 연골 보호용 조성물에 대한 것이다. 본 발명의 조성물은 연골 손상 저해능 및 연골 생성 촉진능을 가지며, 관절염의 예방, 치료 및 개선에 뛰어난 효과가 있다.

Description

효모 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 연골세포 손상방지 및 재생효과를 갖는 조성물

본 발명은 효모 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 연골세포 손상방지 및 재생효과를 갖는 조성물에 대한 것이다.

최근 여러 가지 원인에 의한 관절염이 젊은 층에서도 발생하고 있다. 관절의 염증에 의해 이완된 연골은 세포 외 기질의 분해가 증가하고 그에 따른 기질의 합성이 부적절하여 균형이 깨어진 상태가 되고 그로 인하여 연골조직의 파괴가 유발된다. 이러한 관절 연골 조직의 퇴행적 반응을 조절하기 위한 수많은 연구가 있어왔지만, 근본적인 치료 방법은 아직 개발되지 않고 있다.

한편, 최근 관절염 치료제의 연구 중에는 상기 치료제 중 성분으로 효모를 포함하는 경우가 종종 있었다. 예컨대, 한국공개특허공보 2005-0007996에는 맥주효모를 포함하는 관절염 치료용 조성물이 기재되어 있고, 일본공개특허공보 2010-173991에는 유산균, 납두균 및 효모의 혼합 배양물을 포함하는 관절염 개선용 피부 외용제가 기재되어 있다. 그러나 이들은 비록 효모를 조성물의 한 성분으로 포함하기는 하나, 효모 자체가 관절염 치료, 개선능을 갖는 것은 아니었다.

본 발명자들은 연골 보호 효과가 뛰어난 관절염 치료제를 연구하던 중, 효모를 가수분해하여 제조한 효모 가수분해물이 연골 보호능, 특히 염증 발생 시 연골 손상 저해 및 연골 생성 촉진능이 뛰어난 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 연골세포 손상방지 및 재생효과를 갖는 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 효모 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 연골세포 손상방지 및 재생효과를 갖는 조성물을 제공한다.

본 발명의 연골 보호용 조성물은 연골 손상 저해능 및 연골 생성 촉진능을 갖는다. 또한 본 발명의 조성물은 GAG 분해 억제능, 콜라겐 타입 Ⅱ의 발현 촉진능 또는 MMP-13의 발현 저해능을 갖는다.

도 1은 효모 가수분해물(실시예 1) 및 효모 배양물(실시예 2)를 처리시 토끼 연골의 GAG 분해에 미치는 영향을 나타낸다.

도 2는 효모 가수분해물(실시예 1) 및 효모 배양물(실시예 2)를 처리시 토끼 연골의 콜라겐 타입 Ⅱ(COL Ⅱ)합성에 미치는 영향을 보여준다. mRNA 발현량은 IL-1β 및 시료 무처리군을 기준(1.0)으로 한 상대적인 양으로 나타내었다.

도 3은 효모 가수분해물(실시예 1)이 토끼 연골의 MMP 활성에 미치는 영향을 보여준다. mRNA 발현량은 IL-1β 및 시료 무처리군을 기준(1.0)으로 한 상대적인 양으로 나타내었다.

도 4는 골관절염 모델 쥐에 시험 물질을 투여한 방법 및 기간을 나타낸다.

도 5는 골관절염 모델 쥐의 혈액 내 IL-1β의 함량을 나타낸다.

도 6은 골관절염 모델 쥐의 혈액 내 IL-6의 함량을 나타낸다.

도 7은 골관절염 모델 쥐의 혈액 내 TNF-α의 함량을 나타낸다.

도 9는 골관절염 모델 쥐의 연골 부분을 micro-CT 촬영한 2D 이미지이다((A) 정상대조군, (B) 음성대조군, (C) 양성대조군, (D) 실시예 3, (E) 실시예 4).

도 10은 골관절염 모델 쥐의 연골 부분을 micro-CT 촬영한 3D 이미지이다((A) 정상대조군, (B) 음성대조군, (C) 양성대조군, (D) 실시예 3, (E) 실시예 4).

본 발명은 효모 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 연골 보호용 조성물에 대한 것이다.

본 발명은 또한 효모를 가수분해하는 단계를 포함하는 연골 보호용 조성물의 제조 방법에 대한 것이다.

본 발명은 또한 효모 가수분해물을 대상에 투여하는 단계를 포함하는 연골 보호 방법에 대한 것이다.

본 발명은 또한 효모 가수분해물을 환자에 투여하는 단계를 포함하는 관절염의 예방, 치료 또는 개선 방법에 대한 것이다.

이하, 본 발명을 자세히 설명한다.

본 발명의 효모 가수분해물은 효모에 효소를 처리한 산물이다. 바람직하게는 본 발명의 효소는 단백질 가수분해 효소일 수 있다. 예컨대, 본 발명의 효소는 알칼레이즈(Alcalase), 프로테이즈(Protease), 뉴트레이즈(Neutrase), 프로타맥스(Protamex) 또는 플라보자임(Flavourzyme)일 수 있으며, 바람직하게는 플라보자임이나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 GAG 분해 억제능, 콜라겐 타입 Ⅱ의 발현 촉진능 또는 MMP-13의 발현 저해능을 갖는다. 또한 본 발명의 조성물은 연골 손상 저해능, 연골 생성 촉진능을 갖는다.

본 발명의 조성물은 관절염의 예방, 치료 및 개선능을 갖는다. 상기 관절염은 골관절염, 류마티스 관절염, 응성관절염, 건선관절염 등 여러 종류의 관절염을 포함한다.

상기 “대상”은 연골을 보호해야 할 필요 또는 연골이 손상될 위험이 있는 인간 또는 인간을 제외한 동물을 의미한다.

상기 “환자”는 연골 손상으로 인하여 고통을 받거나 관절염으로 진단 받은 환자를 의미한다. 본 발명의 “환자”는 인간 또는 인간을 제외한 동물일 수 있다.

본 발명의 조성물은 약학적 조성물 또는 식품 조성물일 수 있다.

본 발명의 조성물은 골관절염(osteoarthritis), 류마티스 관절염, 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 응성관절염(reactive arthritis), 건선관절염, 전신성홍반성루프스(Systemic lupus erythematosus), 다발성근육염(polymyositis) 또는 류마티스다발근육통(polymyalgia rhematica) 골다공증(osteoporosis), 골전이암 또는 파젯병(Paget’s disease)의 예방 및 치료용 약학적 조성물일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 조성물 100 중량부에 대하여 상기 효모 가수분해물을 0.01 내지 99 중량부 포함할 수 있으며, 바람직하게는 0.02 내지 80 중량부 포함할 수 있다. 그러나 이는 투약자의 필요에 따라 증감할 수 있으며, 식생활, 영양 상태, 연골의 손상 정도, 상기 질환의 진행 정도 등 상황에 따라 적절히 증감할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 도포하여 사용할 수 있고, 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 바람직한 약제학적 제제는 정제, 경질 또는 연질 캅셀제, 액제, 현탁제 등과 같은 경구투여용 제제가 있으며 이들 약제학적 제제는 약제학적으로 허용 가능한 통상의 담체, 예를 들어 경구투여용 제제의 경우에는 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 가용화제, 현탁화제, 보존제 또는 증량제 등을 사용하여 조제할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 투여 용량은, 환자의 상태, 연령, 체중, 연골의 손상 정도, 질환의 진행 정도 등의 다양한 요인에 따라 전문가에 의해 결정될 수 있지만 일반적으로는 성인 1kg 당 0.1mg 내지 10g, 바람직하게는 1mg 내지 5g의 용량으로 투여될 수 있다. 또, 단위 제형당 상기 약학적 조성물의 1일 용량 또는 이의 1/2, 1/3 또는 1/4의 용량이 함유되도록 하며, 하루 1 내지 6 회 투여될 수 있다. 그러나 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

또한 본 발명의 조성물은 식품 조성물일 수 있다. 상기 식품이란 건강보조식품, 건강기능식품, 기능성 식품 등이나 이에 제한되는 것은 아니며, 천연식품, 가공식품, 일반적인 식자재 등에 본 발명의 효모 가수분해물을 첨가하는 것도 포함된다.

본 발명의 효모 가수분해물을 포함하는 식품 조성물은, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 조성물과 함께 사용될 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 개선 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 효모 가수분해물은, 식품 또는 음료의 제조 시에 식품 또는 음료의 원료 100 중량부에 대하여 0.1 내지 90 중량부, 바람직하게는 1 내지 60 중량부 첨가될 수 있다. 상기 효모 가수분해물의 유효용량은 상기 약학적 조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 연골 손상의 개선 또는 유지를 위한 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 효모 가수분해물을 포함하는 식품 조성물은 정제, 경질 또는 연질 캅셀제, 액제, 현탁제 등과 같은 경구투여용 제제의 형태로 이용될 수 있으며, 이들 제제는 허용 가능한 통상의 담체, 예를 들어 경구투여용 제제의 경우에는 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 가용화제, 현탁화제, 보존제 또는 증량제 등을 사용하여 조제할 수 있다.

상기 효모 가수분해물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제, 기타 영양제 등을 들 수 있으나 이들 종류의 식품으로 제한되는 것은 아니다.

이하, 본 발명을 다음의 실시예 및 실험예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 발명의 범위가 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<재료 및 방법>

연골세포의 분리 및 배양

4 주령의 토끼를 Ketamine 과량투여로 희생시킨 뒤에 앞발과 뒷발을 삭모한 뒤 관절에서 연골조직을 채취하였다. 채취한 연골조직을 약 1Ⅹ1 mm 크기의 작은 절편으로 자른 다음 0.2% 콜라게네이즈 타입 Ⅱ(collagenase type Ⅱ) 를 함유한 20 mL의 DMEM을 첨가하여 37℃에서 교반하면서 6시간 동안 천천히 분해시켰다. 분해시킨 용액을 cell strainer으로 걸러 분해되지 않은 조직을 제거한 다음, 유출된 연골세포를 1000 × g에서 10분간 원심 분리시켜 침전 시킨 뒤 상등액을 걷어내고 10% FBS를 함유한 DMEM을 20 mL 첨가하여 260 mL의 tissue culture flask 에 넣어 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 연골세포가 2 × 10² cell/cm2의 밀도에 도달하면 trypsin EDTA를 처리하여 cell을 떼어낸 뒤에 다시 cell을 count 하고 배양하여 4th passage가 되면 다시 cell을 떼어내 1 × 10⁵ cell/mL의 농도로 PCR측정용은 60 mm cell culture dish에 5 mL씩, GAG 측정용은 24 well plate에 1mL씩 분주하여 배양하였다.

실험 동물 및 사육 환경

본 실험에서는 Wistar rat 7~8 주령의 수놈을 1 주일간 순화 및 사육을 거쳐 사용하였다. Wistar rat의 평균 몸무게는 150~175 g이었다. 실험동물은 사육케이지 (20×26×13 cm)를 이용해 실험실 온도 22-24℃, 습도 60±5%가 유지되며 밤낮 주기 (12 시간 light/ 12 시간 dark)가 자동 조절 장치에 의해 조절되는 고려대학교 동물실에서 사육하였다. 이 때, 고려대학교 동물실험 윤리위원회 승인을 받은 후 '실험동물 관리 및 이용에 관한 지침 (Guide for the care and use of Laboratory Animals, NRC)'에 맞추어 관리하면서 실시하였다.

골관절염 모델

실험 동물실에서 적응된 150-175 g의 수컷 Wistar rat를 마취 챔버 (Royal medical, 한국)에 넣었다. 이를 70% N₂O, 21.5% O₂, 2.0% enflurane을 혼합시킨 가스로 흡입마취한 후, monosodium iodoacetate(MIA)(I2512, Sigma, Poole, UK) 3 mg을 50 μL의 멸균 생리식염수에 용해하고, 31 gauge needle (Ultra-fine insulin syringe, 0.3 mL)을 이용하여 오른쪽 슬관절 내에 주사 (intra-articular injection)하였다. 왼쪽 슬관절은 동일한 위치에 생리식염수 50 μL씩을 주사한다.

역전사 중합효소연쇄반응(Reverse transcription- polymerase chain reaction, RT-PCR)

배양된 세포를 60 mm cell culture dish당 5 × 10⁵ cell 이 되도록 분주하였다. 48시간 뒤에 2% FBS가 포함된 DMEM배지로 교환하여준 뒤 효모추출물을 10, 50, 100, 200 ug/mL 의 농도로 첨가하여 준다. 1시간 뒤에 IL-1β 을 농도 25 ng/mL 로 첨가하여준 후 48시간 뒤에 배지를 제거하여 주고 Trizol Reagent 을 이용하여 total RNA를 추출하였다.

Trizol reagent 가 처리된 cell에 chloroform 200μL 넣고 vortexing 한 뒤 2~3분 방치하고 12000 rpm에 15분, 4 ℃에서 원심분리 하였다. 원심분리 후 상등액 400 μL를 다른 tube에 옮겨 담은 뒤 동량의 Isopropyl alcohol 을 넣고 상온에서 10분 동안 방치하며 2분 간격으로 위 아래로 gently하게 섞어 주었다. 그 후 12000 rpm, 10분, 4 ℃로 원심분리를 하였다. Pellet이 떨어지지 않게 상징액을 제거한 후 75% ethanol 1 mL을 넣고 vortexing 한 뒤 12000rpm, 10분, 4 ℃로 원심분리를 하였다. 상징액을 제거한 뒤 Pellet이 너무 마르지 않도록 건조시킨 후 그 후 상징액을 제거하였다. RNA free water 30 μL를 넣고 탁탁 치면서 용해시킨 뒤 55~60°C에서 10분간 incubation한 후에 ice에서 1분간 방치하였다. vortexing 하여 spin down 시킨 뒤 sample은 UV전용 plate에 2μl를 분주하고 RNA free water 98μl를 96 well plate에 분주하여 각각 260, 280 nm에서 측정하여 260 nm측정 / 280 nm측정 값이 1.8~2.0 이상이 나오는지 확인한 후에 cDNA를 합성시키는 데에 사용하였다.

각 tube에 D.W 12.6 μL, 10×PCR buffer 2 μl, dNTP 2 μL, Taq polymerase 0.4 μL 넣은 뒤 primer 와 cDNA 1 μL씩 넣어 증폭시켰다. GAPDH, MMP-1, MMP-3, MMP-13, COL Ⅱ 의 발현은 전기영동방법으로 평가하였다. 프라이머 서열은 하기 표 1과 같이 제작하였으며, 증폭시킨 sample에 10 × loading buffer를 첨가한 후에 1% Agarose gel에 5 μL씩 분주하여 75 V 에서 35분간 loading하였다. Loding이 끝난 gel은 FluorChem을 사용하여 밴드를 정량하였다.

표 1

Glycosaminoglycan(GAG) 분석

GAG 분석은 Dimethylmethylene blue dye binding 방법에 의해 측정하였다. DMMB 16 mg 을 25 mL ethanol에 용해시켰다. 1 M GuHCl 100 mL, 1 g sodium formate, 98% formic acid 1 mL을 DMMB 16 mg in ethanol 에 용해시킨 뒤 500 mL로 맞춰주었다. 앞의 용액에서 DMMB를 제외한 solution을 만들어서 1:1로 섞는다. DMMB solution 1 mL 에 sample 100 μL 를 넣고 30분간 잘 섞어준 뒤 centrifuge 12000 × g, 10분 뒤에 supernatant를 버리고 pellet에 decomplexation을 1 mL넣었다. 30 min 분간 voltexing한 후에 2~3분 정치 후 656 nm에서 측정하였다.

Gelatin Zymography

Gelatin이 1.6 mg/mL의 농도로 함유된 7.5% SDS-polyacrylamide gel을 전기 영동하여 50 mM Tris buffer (pH 7.5, included 200 mM NaCl, 5 mM CaCl₂)에 gel을 넣어 37℃에서 하룻밤 방치시켰다. Gel을 0.1% coomassie brilliant blue로 염색한 후 탈색시켜 band를 확인하였다.

혈액생화학 및 혈액학적 검사

1일 1회, 주당 6회씩, 총 40일간의 실험기간이 경과한 후, 5 개 군의 실험동물을 12 시간 절식시키고, ethyl ether로 마취하여 희생시켰다. 그 후 흉강을 열고 대동맥에서 혈액을 채취하여 일부를 EDTA가 처리된 채혈관에 넣고 Mixing하여 혈액응고를 방지한 뒤 녹십자의료재단 임상연구팀에 적혈구수(RBC, red blood cell count), 백혈구 수(WBC, white blood cell count), 헤마토크리트치(HCt, hematocrit), 혈색소량(Hb, hemoglobin concentration), 평균적혈구용적(MCV, mean corpuscular volume), 평균 적혈구 혈색소량(MCH, mean corpuscular hemoglobin), 평균적혈구혈색소농도(MCHC, mean corpuscular hemoglobin concentration), 혈소판(PLT, platelet)의 총 8 항목을 측정 의뢰하였다.

염증성 지표 cytokine 측정

사이토카인(cytokine)이란 세포간의 의사소통을 원활하게 하는 언어와도 같은 단백질 분자들이다. 일부 일반세포와 면역계의 세포들이 분비하며 그 자신을 분비한 모세포 및 인근 세포에 작용한다. 항원과 반응하는 등으로 인하여 활성화된 림프구가 생성, 방출하는 물질로서 다른 세포에 작용하게 하는 활성물질을 림포카인(Iymphokine)이라고 총칭하고 있다. 한편, 대식세포(macrophage)가 생성하는 동일한 활성물질은 모노카인 (monokine)이라 하지만, 이것은 단핵구 (monocyte)의 억제 작동물질의 의미이다. 그와 같은 물질을 합하여 사이토카인이라 부르는 세포의 억제 작용물질이라고 하는 것이다. 어느 것이나 여러 가지 형태로 면역반응의 수행에 관여하고 있다. 세포성장, 세포활성, 염증, 면역성, 조직회복, 섬유증 (섬유형성, 형태발생과 같은 모든 중요한 생물학적 작용을 조절하게 된다.

실험동물의 혈장 내 IL-1β, IL-6, TNF-α 및 염증성 cytokine류의 양은 ELISA법을 이용하여 각각 Rat IL-1β Quantikine^ⓡ ELISA (R&D Systems, Inc. Minneapolis, USA), Rat IL-6 Quantikine^ⓡ ELISA (R&D Systems, Inc. Minneapolis, USA), Rat TNF-α Quantikine^ⓡ ELISA (R&D Systems, Inc. Minneapolis, USA)로 측정하였다.

Micro-CT 촬영

1일 1회, 주당 6회씩, 총 40일간의 실험기간이 경과한 후 5 개 군의 실험동물들을 12 시간 절식시키고 ethyl ether로 마취하여 희생시켰다. 그 후 실험동물의 다리 부위를 적출하여 포르말린 용액에 고정한 후, 슬관절 부위를 TOMONICS V90 (RAY)을 이용하여 Micro-CT 촬영하였다.

<실시예 1>

압착효모 8g을 증류수 100 ml에 현탁하여 pH를 6-8로 조정한 후 단백분해효소(Flavourzyme, Novozymes Korea Limited, 1000 LAPU/g)를 1.0%를 첨가하여 50℃에서 48시간 동안 가수분해하였다. 이를 원심분리한 후 상등액을 한외여과막 (PM -10 & -30)을 이용하여 분자량 10,000-30,000 사이의 획분을 모아 이를 건조하여 효모 가수분해물을 제조하였다(실시예 1).

<실시예 2>

대두 100 g을 세척한 후 증류수 1 L를 가하여 20시간 침지하였다. 물을 제거한 후 증류수를 1 L 를 가하여 마쇄한 후 cheese cloth 두겹으로 여과한 두유를 121℃에서 15분간 가압살균하였다. 가압 살균한 두유에 효모 (Saccharomyce cerevisae) 전배양액을 2% 접종하여 37℃에서 24시간 배양하여 배양물을 얻었다. 상기 배양물은 100℃에서 3시간 열수 추출하였으며, 열수추출 후의 상징액을 회수하여 효모 배양 추출물(yeast extract)을 제조하였다(실시예 2).

<실험예 1> 연골보호능

연골세포에 염증을 유도하지 않은 상태에서 실시예 1 및 실시예 2를 농도별로 처리하고, GAG 함량 및 콜라겐 타입 Ⅱ(collagen type Ⅱ) 함량을 측정하였다.

그 결과, 실시예 1의 경우 GAG 함량은 대조군에 비하여 유의한 차이가 없었으나, 콜라겐 타입 Ⅱ 발현량은 증가하는 것으로 나타났다. 한편, 실시예 2의 경우, GAG 함량 및 콜라겐 타입 Ⅱ 발현량 모두 유의한 변화가 없었다(표 2). 그러므로 실시예 1은 연골 보호능이 있는 것으로 확인되었으나, 실시예 2는 그러하지 않았다.

표 2

<실험예 2> 관절염 억제능

<2-1> GAG 분해 억제능

연골세포에 IL-1β 을 처리하여 염증을 유도하고, 여기에 시료(실시예 1 및 실시예 2)를 농도별로 처리하여, GAG이 분해되는 양을 배양액에서 측정하였다.

그 결과 IL-1β 만을 처리한 경우 배지 내 GAG 함량이 무처리 대조군 2.99 ± 0.32 μg/mL에 비해 4.72 ± 0.05 μg/mL으로 증가하였다. 동일 조건에서 실시예 1을 10μg/mL ~100μg/mL 처리한 경우 농도 의존적으로 GAG 함량이 감소하는 경향은 보였지만 그 감소량이 그리 크지는 않았다. 그러나 실시예 1을 200 μg/mL 처리 시에는 배지의 GAG 함량이 3.43±0.23 μg/mL로 대조군에 비해 유의적으로 감소한 것이 확인되었는바(도 1(a)), 실시예 1은 관절염 억제 효과가 있는 것으로 판단되었다.

반면 실시예 2(효모 배양 추출물)는 처리 농도에 관계없이 IL-1β 만을 처리한 경우의 배지의 GAG 함량과 유사한 GAG의 함량을 보였다. 그러므로 실시예 2는 관절염 억제 효과가 없는 것으로 판단되었다(도 1(b)).

<2-2> 콜라겐 타입 Ⅱ 합성 촉진능

연골세포에 IL-1β를 처리하여 염증을 유도시키고, 여기에 시료(실시예 1 및 실시예 2)를 농도별로 처리한 후 세포 내에 콜라겐 타입 Ⅱ(COL Ⅱ) 합성 정도를 측정하였다.

그 결과, IL-1β 만을 처리한 경우, 무처리 대조군 (1.00 ± 0.00)에 비하여 콜라겐 타입 Ⅱ의 mRNA 발현량이 0.95 ± 0.03으로 다소 낮아지는 경향이 있음을 알 수 있었다. 실시예 1(효모가수분해물) 처리군에서는 연골세포 내 콜라겐 타입 Ⅱ 합성이 농도 의존적으로 증가되었으며, 200 μg/mL 처리군에서는 1.21 ± 0.04 배로 유의적으로 증가하였다(도 2(a)). 반면, 실시예 2(효모배양 추출물) 처리군에서는 연골세포 내 콜라겐 타입 Ⅱ 합성은 농도와 무관하게 변화량이 없었다(도 2(b)). 그러므로 실시예 1(효모 가수분해물)이 연골의 구성성분인 콜라겐 타입 Ⅱ 생성을 촉진하는 것으로 확인되었다.

실험예 1에서 연골세포에 실시예 1(효모 가수분해물)을 처리 시, 콜라겐 타입 Ⅱ의 발현량이 대조군에 비하여 증가하기는 하였으나, 상기 증가량이 그렇게 큰 것은 아니었다. 그러나 실험예 2에서 염증이 유발된 연골세포에 실시예 1을 처리한 때에는 농도의존적으로 콜라겐 타입 Ⅱ 발현이 상당히 증가하였는바, 실시예 1이 콜라겐 타입 Ⅱ의 발현을 증가시키기는 하나, 염증이 유발되었을 때 콜라겐 타입 Ⅱ 발현을 더욱 촉진시키는 것으로 판단되었다.

<실험예 3> 효모가수분해물의 관절염 억제 기전

상기 실험예 1 및 2에서 연골 보호능이 있는 것으로 확인된 실시예 1을 대상으로 Matrix metalloproteinases 발현에 대한 실험을 실시하여, 관절염 억제 기전을 살펴보았다. Matrix metalloproteinases (MMP)는 활막에 존재하여 조직의 기질을 분해하는 효소로, 골 및 연골의 기질 구성요소를 파괴하는 단백 분해효소이다. 특히 MMP 활성화는 관절연골조직 파괴의 가장 직접적인 원인으로 생각되며 다양한 MMP 활성 조절이 관절조직 퇴행제어에 중요한 타겟이 될 수 있다. 토끼의 연골세포에 IL-1β 및 실시예 1을 농도별로 처리한 후 MMP-1, MMP-3, MMP-13의 발현 정도를 mRNA 수준에서 측정하였다.

그 결과 실시예 1은 MMP-1(도 3(a))과 MMP-13(도 3(b))의 활성화는 억제하지 못하였다. 그러나 MMP-13의 경우, IL-1β 처리군은 IL-1β 무처리군(1.0)에 비하여, 1.35 ± 0.06으로 증가하였으나 실시예 1을 100 μg/mL 이상 처리한 군에서는 유의적으로 MMP-13의 발현이 낮아졌다(도 3(c)). 또한 zymography를 이용하여 MMP-13의 활성을 측정한 결과, 실시예 1을 100 μg/mL 이상 처리한 군에서는 유의적으로 MMP-13의 양이 감소한 것이 확인되었다(도 3(d)).

<실험예 4> 효모가수분해물이 MIA-유발 관절염 쥐에 미치는 영향

상기 MIA로 유발한 골관절염 모델 쥐들을 무작위 추출법에 의해 군당 10 마리씩 5 개 군으로 분류하였다. 음성대조군은 골관절염 모델 쥐에 생리식염수(PBS)를 경구 투여하였다. 양성대조군은 골관절염 모델 쥐에 Glucosamine-sulfate 및 Chondroitin-sulfate를 경구 투여하였다. 실험군은 골관절염 모델 쥐에 실시예 1의 효모가수분해물을 0.5 g/kg 및 1.0 g/kg의 농도로 각각 경구 투여하였다(각각 실시예 3 및 실시예 4). 한편, 정상대조군은 골관절염 모델 쥐가 아닌 정상 쥐로, 실험 군과 동일한 스트레스를 주기 위해 생리식염수(PBS)를 경구 투여하였다.

MIA 주사 후 시험 물질은 임상 적용 경로를 따라 경구로 투여하였으며, 투여기간은 1일 1회, 주당 6회로 반복 투여하였으며 총 40일간 실험을 진행하였다(도 4). 각 개체가 해당하는 군의 평균 체중 기준으로 그 군에 해당하는 용량에 맞게 생리식염수에 시험물질을 용해시켜 마리당 1 mL/day로 경구 투여하였다.

<4-1> 체중 및 식이섭취량

정상군에 비하여 MIA로 골관절염을 유도한 음성대조군(PBS 경구 투여)에서 체중이 감소하는 경향을 보였으나, 유의적인 차이는 보이지 않았다. 골관절염 모델 마우스에 실시예 1의 효모 가수분해물을 투여한 실험군(실시예 3 및 실시예 4)의 체중은 정상대조군에 비해 유의적으로 낮아졌다.

한편, 식이섭취량의 경우, 정상군에 비해 골관절염을 유도한 군들에서 모두 유의적으로 감소함을 확인할 수 있었다(표 3).

표 3

<4-2> 장기무게

심장, 비장 무게는 각 군 간에 통계적으로 유의하지 않은 것으로 보아 MIA를 이용한 골관절염 유도는 심장, 비장의 무게에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 또한 글루코사민+콘드로이틴 황산염, 실시예 1의 효모가수분해물 처치에 따른 차이도 나타나지 않았는바, 이들의 처치로 인해 쥐의 심장 및 비장의 무게의 변화가 야기되지 않는 것으로 생각되었다. 그러나 간, 폐 및 신장에서는 골관절염 유도에 따라 해당 장기의 무게가 감소하는 경향을 보였다(표 4).

표 4

<4-3> 혈액학적 검사

효모가수분해물을 투여한 실시예 3 및 실시예 4의 검사 결과 MCV 및 MCH을 제외한 혈액학적 수치에는 유의적인 차이가 없었다(표 5).

표 5

<4-4> 골관절염 모델 쥐에서 효모가수분해물이 IL-1β 농도에 미치는 영향

IL-1은 관절의 활막내층에 풍부히 분포되어 있는 사이토카인으로 관절손상을 매개하는 면역과 염증전구작용을 한다. IL-1은 관절퇴화를 촉진하는 프로스타그란딘 E2, 산화질소, MMPs를 자극한다. 연골파괴에 관여하는 messenger molecule 중 하나인 IL-1β에 의하여 관절 연골세포의 collagenase 합성이 촉진되어 관절염 등이 유발된다.

본 발명에서 실험한 결과, 골관절염 유도에 의하여 IL-1이 증가하였으며(71.4 pg/mL), 양성대조군 (60.6 pg/mL)과 특히 저농도의 효모가수분해물 경구투여군인 실시예 3(53.8 pg/mL)에서 IL-1β의 농도가 유의적으로 감소한 것으로 확인되었다(도 5).

<4-5> 골관절염 모델 쥐에서 효모가수분해물이 IL-6 농도에 미치는 영향

IL-6은 조직손상 시에 면역반응이 자극되어 T-세포나 대식세포에서 분비되는 염증전구 사이토카인으로 염증을 일으키는 단백질이다. IL-6은 B세포의 형질세포로 성숙하는데 강력한 자극을 하며 활막섬유아세포는 지속적인 형질세포 활성화와 류마티스인자 생산에 T 세포 독립적인 자극을 제공한다. TNF에 의한 IL-6의 유도는 염증의 전신적 양상을 설명해준다. 관절염에서 TNF-α, IL-1, IL-6는 염증을 일으키는 사이토카인이다.

본 발명에서, IL-6의 발현 양을 측정한 결과, 정상대조군(224.6 pg/mL)에 비해 골관절염을 유도한 음성대조군(237.9 pg/mL)에서 그 발현양이 증가하였다. 한편, 골관절염 모델 쥐에 실시예 1의 효모가수물해물을 경구투여한 군인 실시예 3(227.8 pg/mL) 및 실시예 4(227.7 pg/mL)의 경우 정상대조군과 유사한 수준으로 IL-6 농도가 감소되는 것을 확인하였다(도 6).

<4-6> 골관절염 모델 쥐에서 효모가수분해물이 TNF-α 농도에 미치는 영향

TNF-α는 염증에 관여하는 주요한 사이토카인의 하나로 면역세포를 조절하여 IL-1을 유도한다. TNF-α와 IL-1은 염증반응에 "master regulator"라고 할 만큼 중요하며, 관절염에 존재하는 대식세포에서 생긴 사이토카인이다. 이 두가지 사이토카인은 활액막 섬유모세포에서 기질분해 단백분해효소(matrix-degrading proteases), prostanoids, IL-6, IL-8 과 류코트리엔, platelet activating factor (PAF), agranulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF)의 분비나 합성을 유도한다. 이상과 같이 TNF-α는 염증유발 사이토카인으로서 관절염의 질병발생 및 진행에 중심적 역할을 한다.

본 발명에서 TNF-α의 발현 양을 측정한 결과, 정상대조군(12.1 pg/mL)에 비하여 음성대조군(13.0 pg/mL)에서 그 발현양이 증가하였다. 또한 효모가수물해물을 경구투여한 실시예 3(11.4 pg/mL) 및 실시예 4(11.6 pg/mL)의 경우 정상대조군과 유사한 수준으로 TNF-α의 발현이 감소되는 것을 확인하였다(도 7)

<4-7> Micro-CT 촬영

본 발명에서 Micro-CT를 촬영한 2D 이미지를 보면, 정상대조군(A)의 경우 연골 부분에 손상(화살표 부분)이 없는 반면, 골관절염 모델 쥐인 음성 대조군(B)은 연골 부분이 심하게 손상을 받은 것을 확인할 수 있었다. Glucosamine-sulfate 및 Chondroitin-sulfate를 경구 투여한 양성대조군(C)도 연골 부분의 손상이 심하였다. 반면 효모 가수분해물을 경구투여한 실시예 3(D) 및 실시예 4(E)는 연골 부분의 손상이 상대적으로 적은 것으로 관찰되었다(도 8). 그러므로, 효모 가수분해물이 관절염에 효과가 있는 것을 알 수 있었다.

한편, Micro-CT를 촬영한 결과를 3D로 전환 한 결과, 정상대조군(A)의 경우 뼈의 표면은 손상이 없어 부드러운 영상을 보인 반면, MIA를 처리한 군인 음성대조군, 실시예 3 및 실시예 4는 뼈 표면에 손상을 입어 거친 표면 영상을 보여주었다. 특히 음성대조군은 실시예 3 및 실시예 4에 비하여 표면의 거침 정도가 심하였다. 또한 실시예 3 및 실시예 4 중에서는, 실시예 3의 손상에 의한 표면의 거친 정도가 다소 심하였다. 이상의 결과에 의하여 효모 가수분해물은 관절염에 효과가 있는 것을 알 수 있었다(도 9).

Claims

효모 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 연골 보호용 조성물.
제 1항에 있어서,

상기 효모 가수분해물은 효모에 단백질 가수분해 효소를 처리한 산물인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서,

상기 효모 가수분해물은 효모에 플라보자임을 처리한 산물인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서,

관절염을 예방, 치료 또는 개선시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서,

골관절염(osteoarthritis), 류마티스 관절염, 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 응성관절염(reactive arthritis), 건선관절염, 전신성홍반성루프스(Systemic lupus erythematosus), 다발성근육염(polymyositis) 또는 류마티스다발근육통(polymyalgia rhematica) 골다공증(osteoporosis), 골전이암 또는 파젯병(Paget’s disease)의 예방 및 치료용 약학적 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서,

골관절염(osteoarthritis), 류마티스 관절염, 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 응성관절염(reactive arthritis), 건선관절염, 전신성홍반성루프스(Systemic lupus erythematosus), 다발성근육염(polymyositis) 또는 류마티스다발근육통(polymyalgia rhematica) 골다공증(osteoporosis), 골전이암 또는 파젯병(Paget’s disease)의 예방 및 개선용 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서,

GAG 분해 억제능, 콜라겐 타입 Ⅱ의 발현 촉진능 또는 MMP-13의 발현 저해능을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서,

연골의 손상 저해능 또는 연골의 생성 촉진능을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
효모를 가수분해하는 단계를 포함하는 연골 보호용 조성물의 제조 방법.
제 9항에 있어서,

효모에 단백질 가수분해 효소를 처리하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
효모 가수분해물을 대상에 투여하는 단계를 포함하는 연골 보호 방법.
효모 가수분해물을 환자에 투여하는 단계를 포함하는 관절염의 예방 및 치료 방법.