WO2012164130A1 - Construcción de células deficitarias en un modulador negativo del virus de la gripe para incrementar la producción de virus vacunales - Google Patents

Construcción de células deficitarias en un modulador negativo del virus de la gripe para incrementar la producción de virus vacunales Download PDF

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Definitions

  • the present invention consists in producing stable cell lines in which a cell protein not related to interferon is silenced, that is, deficit cells in a negative flu virus modulator, which increase the viral titer to increase the production of vaccine viruses.
  • the present invention concerns the chemistry and pharmacy sector, being also useful in its application in public and social vaccine administration services, which is carried out annually.
  • recombinant viruses are generated containing the six internal segments of the vaccine strains (A / PR8 / 8/34 or A / Ann Arbor / 6 / 60ca) and the two segments of the virus surface glycoproteins, hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) of the seasonal circulating strains. Embryonated chicken eggs are inoculated with these recombinant viruses or established cell lines are infected.
  • Vero cells Another type of cells
  • Vero cells are deficient in interferon production and have been used with the idea that having no interferon system, which is the defense system against influenza virus infection, would lessen the infection and therefore increase the vaccine virus production (Genzel, Y., C et al.).
  • Genzel, Y., C et al. what has been observed is that although the replication of the viral RNA in Vero cells is more active, the production of viruses or what is the same, the yield of virions is less than in MDCK cells.
  • the objective of the present invention is the production and use of a stable cell line whose cells express at least one silencer of the specific expression for a cellular protein that interacts with influenza virus polymerase, characterized in that when they are infected with said virus, said cells present in vitro and in vivo an increase in viral RNA replication and an increase in the production of viral particles, compared to cells that do not have said cellular protein silenced.
  • One of the main applications of the present invention is the construction of stably silenced cell lines or cells for CHD6, a host cell factor that negatively modulates influenza virus replication and therefore increases the viral titer, to improve production. of human vaccines against the flu.
  • the present invention obtains a greater production of recombinant virus / infected cell and therefore a greater viral production with the same amount of infected cells.
  • Stably silenced cell lines for CHD6 have been constructed in the present invention, which express two distinct specific silencers (s ⁇ CHD6.1 and s ⁇ CHD6.2, which correspond to SEQ ID No. 1 and SEQ ID No. 2).
  • Said cell lines are preferably constructed by transfection of a plasmid (pSuper Oligoengin Pure) that expresses specific shRNAs to silence CHD6.
  • pSuper Oligoengin Pure a plasmid that expresses specific shRNAs to silence CHD6.
  • a preferred embodiment of the invention constructs the cell lines from HEK293T and A549 cells.
  • the A549 cells are derived from human pulmonary epithelium (the influenza virus virtually only infects the pulmonary epithelium) and they are not only infected by the virus, but they are also productive, that is, they produce new viral particles, which are packaged and infect new cells HEK293T cells are transfected very effectively.
  • the cell lines obtained by the process of the present invention with the specific silencers for CHD6, have decreased CHD6 levels after successive passes and freezes, that is, they keep the silencing stable while the cells retain their viability.
  • the cell lines obtained by the process of the present invention with the specific silencers for CHD6, show a higher viral polymerase activity, which demonstrates that they improve viral RNA replication.
  • the cell lines obtained and having the specific silencers for CHD6 increase the production of the viral particles, preferably between 5 and 10 times more than in the non-silenced cells,
  • CHD6 is the only negative flu virus modulator that works in vivo through gene silencing techniques. Therefore, the construction of silenced cells for CHD6 (primarily and occasionally Vero MDCK), could be used to manufacture vaccines for the virus. the flu, since if they behaved like silenced A549 cells, the yield of viral particles and therefore the capacity of vaccine production would be increased with a decrease in the cost of production.
  • said cellular protein is a negative flu virus modulator, and more preferably it is a chromatin remodeling factor, such as CHD6, or its ortholog, more preferably its dog ortholog.
  • the present invention also aims at the method for manufacturing a stable cell line whose cells express at least one expression silencer specific for CHD6 or its ortholog, preferably its ortholog dog, since vaccine producing cells (MDCK) are of canine origin, said method comprises the following steps:
  • said specific silencer from step b) can be selected in increasing order of preference from a shRNAs and a miRNA.
  • said expression silencer specific for CHD6 or its ortholog is a shRNA, and more preferably it is s ⁇ CHD6.1 or s ⁇ CHD6.2.
  • the cell line of step a) is selected in increasing order of preference from MDCK, Vero, A549 and HEK293T.
  • a last preferred embodiment of the present invention is the use of a stable cell line whose cells express at least one specific expression silencer for a cellular protein that interacts with influenza virus polymerase for the production of vaccine viruses in manufacturing.
  • influenza virus vaccines preferably influenza A or influenza B.
  • the manufacture of influenza virus vaccines from one of the cell lines object of the The present invention does not require the addition of adjuvants to achieve the desired technical effect: increased production of recombinant virus / infected cell and therefore greater viral production with the same amount of infected cells.
  • FIGURE 1 Construction of A549 cells with silenced CHD6.
  • the cells were stably transfected with plasmids expressing a control silencer (TM) or specific silencers of CHD6 (s ⁇ CHD6.1 and s ⁇ CHD6.2).
  • TM control silencer
  • specific silencers of CHD6 s ⁇ CHD6.1 and s ⁇ CHD6.2.
  • the accumulation of CHD6 was evaluated in Western blot.
  • FIGURE 2 Effect of CHD6 silencing on influenza virus polymerase activity.
  • HEK293T control (TM), or CHD6-silenced cells (s ⁇ CHD6.1 and s ⁇ CHD6.2) were transfected with plasmids expressing the components of the viral RNP and a flu-like template containing the luciferase gene in the anti-sense sense .
  • A the level of accumulation of CHD6 in the different cells is shown and on the right (B) the activity of the viral polymerase measured by luciferase quantity.
  • FIGURE 3 Effect of CHD6 silencing on influenza virus replication.
  • A549 control (TM), or CHD6-silenced cells (s ⁇ CHD6.1 and s ⁇ CHD6.2) were infected with the influenza virus at a multiplicity of infection of 10 "3 plaque forming units (pfu) / cell already the indicated post-infection times (hpi) the viral titers in the supernatants of the infected cells were examined
  • pfu plaque forming units
  • hpi post-infection times
  • the viral titers in the supernatants of the infected cells were examined
  • In the upper part (A) the level of accumulation of CHD6 at the different times in the infected cells is shown, analyzed by Western blot .
  • FIGURE 4 Alignment of the sequences of the canine CHD6 protein (query) SEQ ID No. 5 and human (sbjct) SEQ ID No. 6. As can be seen, the CHD6 proteins are highly conserved between the two species with an identity percentage 92% and 95% homology
  • Host factor Ebp1 selective inhibitor of influenza virus transcriptase. Genes Cells 12: 133-42. - Huarte, M., J. J. Sanz-Ezquerro, F. Roncal, J. Ort ⁇ n, and A. Nieto. 2001 PA subunit from influenza virus polymerase complex interacts with a cellular protein with homology to a family of transcriptional activators. J. Virol. 75: 8597-8604.
  • CHD6 Huarte, M., JJ et al.
  • HEK293T and A549 cells stably silenced for CHD6 These stable cells have been constructed by transfection of a plasmid (pSuper Oligoengin Pure) that expresses specific shRNAs to silence CHD6.
  • Cell lines have been constructed that express two distinct specific silencers (s ⁇ CHD6.1 and s ⁇ CHD6.2) and another with a control silencer that expresses an irrelevant sequence (TM). After transfection of the corresponding plasmids a selection with puromycin is made.
  • CHD6 levels are effectively decreased in the cells with the specific silencers and not in the control, in addition after successive passes and freezing, the silencing is stable and the cells are viable (Figure 1).
  • HEK293T cells that are transfected very effectively, we have carried out a reconstitution of virus ribonucleoproteins by transfection of plasmids that express the component proteins of viral ribonucleoproteins together with a plasmid that expresses the luciferase gene in an anti-sense sense containing untranslated ends of the flu segments.
  • the luciferase gene is transcribed and replicated by the viral polymerase and therefore the luciferase activity represents the polymerase activity.
  • the activity of viral polymerase an indicator of viral replication
  • A549 cells we have carried out low multiplicity infection experiments (which is used for the generation of viral particles). We have observed that the virus titer is greater in silenced cells and correlates with the silencing of CHD6. In other words, the silencer that decreases the amount of CHD6 more (s ⁇ CHD6.2), produces a greater titer of influenza virus than the silencer that decreases less CHD6 (s ⁇ CHD6.1). In any case in the two types of silenced A549 cells, the viral titer increases between 5 and 10 times more than in the control (TM) cells. That is, CHD6 is a negative flu virus modulator (Figure 3).
  • EXAMPLE 4 Silence of the CHD6 gene in canine cells.
  • MDCK cells are the cells normally used in the production of flu vaccine viruses. These cells are of canine origin and therefore the construction of stably silenced MDCK lines for CHD6 would be necessary. This should be easily achievable, since the genomic sequence of the dog CHD6 gene is known and the location in it of the 35 exons that will give rise to the corresponding protein. Therefore, the appropriate sequences would be designed for gene silencing that would be contained in any of the exons, following the criteria used in the design of human silencers. On the other hand, it should be noted that CHD6 proteins of human origin (SEQ ID No. 6) and canine (SEQ ID No. 5) have a very high homology, especially considering their molecular size, which seems to indicate a very conserved function ( Fig. 4).
  • CHD6 is the only negative flu virus modulator that works in vivo through gene silencing. Therefore the construction of silenced cells for CHD6 (primarily and occasionally Vero MDCK), could be used for the manufacture of influenza virus vaccines, since if they behaved like silenced A549 cells, the performance of viral particles would be increased and therefore the capacity of production of vaccines with a decrease in the cost of production.

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Abstract

La presente invención se refiere a una construcción de células deficitarias en CHD6 para incrementar la producción de virus vacunales de la gripe. Una de las principales aplicaciones de la presente invención es la construcción de células establemente silenciadas para CHD6, que modula negativamente la replicación del virus de la gripe y por tanto aumenta el título viral, lo que sería de gran utilidad para las compañías farmacéuticas que fabrican las vacunas contra el virus de la gripe. Ello conllevaría a una mayor producción de virus recombinante/célula infectada y por tanto a una mayor producción viral con la misma cantidad de células infectadas. La aplicación de la invención sería fundamental para los servicios públicos y sociales de administración de vacunas, que se realiza anualmente.

Description

CONSTRUCCIÓN DE CELULAS DEFICITARIAS EN UN MODULADOR NEGATIVO DEL VIRUS DE LA GRIPE PARA INCREMENTAR LA PRODUCCIÓN DE VIRUS VACUNALES. La presente invención consiste en producir líneas celulares estables en las que se silencia una proteína celular no relacionada con interferón, es decir, células deficitarias en un modulador negativo del virus de la gripe, que aumenten el título viral para incrementar la producción de virus vacunales. La presente invención concierne al sector de la química y la farmacia, siendo también útil en su aplicación en los servicios públicos y sociales de administración de vacunas, que se realiza anualmente.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR Para la fabricación de vacunas contra el virus de la gripe, se generan virus recombinantes que contienen los seis segmentos internos de las cepas vacunales (A/PR8/8/34 o A/Ann Arbor/6/60ca) y los dos segmentos de las glicoproteínas de superficie del virus, la hemaglutinina (HA) y la neuraminidasa (NA) de la/s cepas circulantes estacionales. Con estos virus recombinantes se inoculan huevos embrionados de gallina o bien se infectan líneas celulares establecidas.
Durante muchos años se han fabricado vacunas humanas contra el virus de la gripe en líquido alantoideo de huevos embrionados de gallina, sin embargo es un sistema poco flexible, fácil de contaminarse y poco eficaz en casos de producción masiva de vacunas, como en las pandemias. Estos condicionantes han llevado a la utilización de líneas celulares o células en cultivo derivadas de riñon de perro, fundamentalmente MDCK (Madin-Darby canine kidney), para el crecimiento de los virus recombinantes que son utilizados cada año en la fabricación de vacunas ya que el virus tiene en ellas una activa replicación y producción de partículas virales (Audsley, J. M., and G. A. Tannock. 2008).
Evidentemente el rendimiento de partículas virales producidas a partir de las células infectadas, determina el coste de producción de vacunas y en condiciones de pandemia permite obtener o no la suficiente cantidad de vacunas. Para intentar aumentar la producción de partículas virales se han utilizado otro tipo de células, denominadas células Vero. Estas células son deficitarias en producción de interferón y se han utilizado con la ¡dea de que al no tener sistema de interferón, que es el sistema de defensa contra la infección por el virus de la gripe, contrarrestarían menos la infección y por tanto aumentaría la producción de virus vacunales (Genzel, Y., C et al.). Sin embargo lo que se ha observado es que aunque la replicación del RNA viral en células Vero es más activa, la producción de virus o lo que es lo mismo, el rendimiento de viriones, es menor que en las células MDCK.
Existen factores de la célula hospedadora que interaccionan con proteínas virales y la inmensa mayoría de estos factores mejoran la replicación viral. En el caso del virus de la gripe, se han descrito distintos factores celulares que interaccionan con la polimerasa del virus de la gripe, de distintas categorías funcionales y de la mayoría de ellos no se ha caracterizado su función en la infección (Jorba, N., S. et al.), aunque de aquellos que se han analizado, fundamentalmente son factores que mejoran la replicación viral. De entre los factores que interaccionan con la polimerasa se ha descrito la interacción con un factor remodelador de cromatina, denominado CHD6 (Huarte, M., J. J. et al.).
Esto es particularmente importante en el caso de la aparición de pandemias en que la cantidad de vacunas generadas tiene que ser mucho mayor y de hecho en la pandemia del año 2009, las empresas farmacéuticas no pudieron obtener la cantidad suficiente de virus recombinantes vacunales, por lo que se procedió a la adición de adyuvantes, ya que ello produce un aumento en la respuesta inmune del hospedador con la misma cantidad de inoculo viral.
A la vista del estado actual de la técnica, existe la necesidad de producir líneas celulares estables útiles para la fabricación de vacunas frente a la gripe, caracterizadas por emplear factores celulares que interaccionen con el virus de la gripe y que aumenten in vitro e in vivo la replicación del RNA viral sin disminuir el rendimiento de los viriones o partículas virales. DESCRIPCION BREVE DE LA INVENCION
El objetivo de la presente invención es la producción y el uso de una línea celular estable cuyas células expresan al menos un silenciador de la expresión específico para una proteína celular que interacciona con la polimerasa del virus de la gripe, caracterizada porque cuando son infectadas con dicho virus, dichas células presentan in vitro e in vivo un aumento de la replicación del RNA viral y un aumento en la producción de partículas virales, comparadas con células que no tienen silenciada dicha proteína celular.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Una de las principales aplicaciones de la presente invención es la construcción de líneas celulares o células establemente silenciadas para CHD6, un factor de la célula hospedadora que modula negativamente la replicación del virus de la gripe y por tanto aumenta el título viral, para mejorar la producción de vacunas humanas frente a la gripe. La presente invención obtiene una mayor producción de virus recombinante/célula infectada y por tanto una mayor producción viral con la misma cantidad de células infectadas.
En la presente invención se han construido líneas celulares establemente silenciadas para CHD6, que expresan dos silenciadores específicos distintos (s¡CHD6.1 y s¡CHD6.2, que corresponden con SEQ ID No. 1 y SEQ ID No. 2). Dichas líneas celulares se construyen preferentemente mediante transfección de un plásmido (pSuper Puro de Oligoengin) que expresa shRNAs específicos para silenciar CHD6. Una realización preferente de la invención construye las líneas celulares a partir de células HEK293T y A549. Las células A549 se derivan de epitelio pulmonar humano (el virus de la gripe prácticamente solo infecta a epitelio pulmonar) y no solamente son infectadas por el virus, sino que también son productivas, es decir producen nuevas partículas virales, que son empaquetadas e infectan a nuevas células. Las células HEK293T se transfectan muy eficazmente.
Las líneas celulares obtenidas por el procedimiento de la presente invención con los silenciadores específicos para CHD6, presentan disminuidos los niveles de CHD6 tras sucesivos pases y congelaciones, es decir, mantienen estable el silenciamiento mientras que las células conservan su viabilidad. Las líneas celulares obtenidas por el procedimiento de la presente invención con los silenciadores específicos para CHD6, presentan una mayor actividad polimerasa viral, lo que demuestra que mejoran la replicación del RNA viral.
En otra realización de la presente invención, las líneas celulares obtenidas y que presentan los silenciadores específicos para CHD6, aumentan la producción de las partículas virales, preferentemente entre 5 y 10 veces más que en las células no silenciadas,
Hasta la fecha se ha descrito un único modulador negativo de la actividad de la polimerasa viral (solo in vitro), que tiene un efecto moderado en la producción de partículas virales por sobreexpresion, pero no se ha caracterizado su efecto en silenciamiento y por tanto si existen células viables con este factor silenciado (Ebp-1 ) (3). Por tanto CHD6 es el único modulador negativo del virus de la gripe que funciona in vivo mediante técnicas de silenciamiento génico Por tanto la construcción de células silenciadas para CHD6 (MDCK fundamentalmente y ocasionalmente Vero), podrían ser utilizadas para la fabricación de vacunas del virus de la gripe, ya que si se comportaran como las células A549 silenciadas, se aumentaría el rendimiento de partículas virales y por tanto la capacidad de producción de vacunas con una bajada en el coste de producción.
En una realización preferente de la invención dicha proteína celular es un modulador negativo del virus de la gripe, y más preferentemente es un factor remodelador de cromatina, como es CHD6, o su ortólogo, más preferiblemente su ortólogo de perro.
La presente invención también tiene como objetivo el método para la fabricación de una línea celular estable cuyas células expresan al menos un silenciador de la expresión específico para CHD6 o su ortólogo, preferentemente su ortólogo de perro, ya que las células productoras de vacunas (MDCK) son de origen canino, dicho método comprende los siguientes pasos:
a) transfección en una línea celular de un plásmido que expresa al menos un shRNAs específico para silenciar una proteína celular que interacciona con la polimerasa del virus de la gripe, y
b) selección de las células que expresan al menos un silenciador de la expresión específico para dicha proteína celular.
En una realización preferente de la invención, dicho silenciador específico del paso b) puede seleccionarse en orden creciente de preferencia de entre un shRNAs y un miRNA. En una realización aún más preferente, dicho silenciador de la expresión específico para CHD6 o su ortólogo, es un shRNA, y más preferentemente es s¡CHD6.1 o s¡CHD6.2. En una realización más preferente de la invención, la línea celular del paso a) se selecciona en orden creciente de preferencia entre MDCK, Vero, A549 y HEK293T.
Una última realización preferida de la presente invención es el uso de una línea celular estable cuyas células expresan al menos un silenciador de la expresión específico para una proteína celular que interacciona con la polimerasa del virus de la gripe para la producción de virus vacunales en la fabricación de vacunas contra el virus de la gripe, preferentemente de la gripe A o de la gripe B. En una realización más preferente de la invención, la fabricación de vacunas contra el virus de la gripe a partir de una de las líneas celulares objeto de la presente invención no precisa la adición de adyuvantes para conseguir el efecto técnico deseado: mayor producción de virus recombinante/célula infectada y por tanto una mayor producción viral con la misma cantidad de células infectadas. A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Las siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
FIGURA 1. Construcción de células A549 con CHD6 silenciado. Las células fueron transfectadas establemente con plásmidos expresando un silenciador control (TM) o silenciadores específicos de CHD6 (s¡CHD6.1 y s¡CHD6.2). La acumulación de CHD6 se evaluó en Western blot.
FIGURA 2. Efecto del silenciamiento de CHD6 en la actividad de la polimerasa del virus de la gripe. Células HEK293T control (TM), o CHD6- silenciadas (s¡CHD6.1 y s¡CHD6.2) fueron transfectadas con plásmidos que expresan los componentes de la RNP viral y un molde flu-like conteniendo el gen de la luciferasa en sentido antimensajero. En la parte izquierda (A) se muestra el nivel de acumulación de CHD6 en las distintas células y a la derecha (B) la actividad de la polimerasa viral medida por cantidad de luciferasa.
FIGURA 3. Efecto del silenciamiento de CHD6 en la replicación del virus de la gripe. Células A549 control (TM), o CHD6-silenciadas (s¡CHD6.1 y s¡CHD6.2) fueron infectadas con el virus de la gripe a una multiplicidad de infección de 10"3 unidades formadoras de placa (pfu)/célula y a los tiempos post-infección indicados (hpi) se examinaron los título virales en los sobrenadantes de las células infectadas. En la parte superior (A) se muestra el nivel de acumulación de CHD6 a los distintos tiempos en las células infectadas, analizado por Western blot.
FIGURA 4. Alineamiento de las secuencias de la proteina CHD6 canina (query) SEQ ID No. 5 y humana (sbjct) SEQ ID No. 6. Como se puede observar las proteínas CHD6 están muy conservadas entre las dos especies con un porcentage de identidad del 92% y de homología del 95%
BIBLIOGRAFÍA
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EJEMPLOS Los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan en este documento de patente sirven para ¡lustrar la naturaleza de la presente invención. Estos ejemplos se incluyen solamente con fines ilustrativos y no han de ser interpretados como limitaciones a la invención que aquí se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos más adelante ¡lustran la invención sin limitar el campo de aplicación de la misma.
EJEMPLO 1 - Construcción de células A549 con CHD6 silenciado
De entre los factores que interaccionan con la polimerasa nosotros hemos descrito la interacción con CHD6 (Huarte, M. , J. J. et al.). Para analizar la función de esta proteína CHD6, hemos construido células HEK293T y A549 establemente silenciadas para CHD6. Estas células estables se han construido por transfección de un plásmido (pSuper Puro de Oligoengin) que expresa shRNAs específicos para silenciar CHD6. Se han construido líneas celulares que expresan dos silenciadores específicos distintos (s¡CHD6.1 y s¡CHD6.2) y otra con un silenciador control que expresa una secuencia irrelevante (TM). Después de la transfección de los plásmidos correspondientes se hace una selección con puromicina. Estas células han sido analizadas y efectivamente los niveles de CHD6 están disminuidos en las células con los silenciadores específicos y no en el control, además tras sucesivos pases y congelaciones, se mantiene estable el silenciamiento y las células son viables (Figura 1 ).
EJEMPLO 2 - Efecto del silenciamiento de CHD6 en la replicación viral
En las células HEK293T que se transfectan muy eficazmente, hemos realizado una reconstitución de ribonucleoproteínas del virus por transfección de plásmidos que expresan las proteínas componentes de las ribonucleoproteínas virales junto con un plásmido que expresa el gen de la luciferasa en sentido antimensajero conteniendo los extremos no traducidos de los segmentos de gripe. En este sistema, el gen de la luciferasa es trascrito y replicado por la polimerasa viral y por ello la actividad luciferasa representa la actividad de la polimerasa. En este ensayo hemos observado que la actividad de la polimerasa viral, indicador de la replicación viral, es mayor en las células silenciadas (Figura 2).
EJEMPLO 3 - Experimentos de infección a baja multiplicidad
Utilizando células A549 hemos realizado experimentos de infección a baja multiplicidad (que es la utilizada para la generación de partículas virales). Hemos observado que el título del virus es mayor en las células silenciadas y se correlaciona con el silenciamiento de CHD6. Es decir el silenciador que disminuye más la cantidad de CHD6 (s¡CHD6.2), produce un titulo mayor de virus de la gripe que el silenciador que disminuye menos CHD6 (s¡CHD6.1 ). En cualquier caso en los dos tipos de células A549 silenciadas, el titulo viral aumenta entre 5 y 10 veces más que en las células control (TM). Es decir que CHD6 es un modulador negativo del virus de la gripe (Figura 3).
EJEMPLO 4. Silenciamiento del gen CHD6 en células caninas. Las células MDCK son las células utilizadas normalmente en la producción de virus vacunales de gripe. Estas células son de origen canino y por ello sería necesario la construcción de lineas MDCK establemente silenciadas para CHD6. Esto debería ser fácilmente alcanzable, dado que se conoce la secuencia genomica del gen de CHD6 de perro y la localización en ella de los 35 exones que darán origen a la proteína correspondiente. Por ello se diseñarían las secuencias adecuadas para su silenciamiento génico que estarían contenidas en alguno de los exones, siguiendo los criterios utilizados en el diseño de los silenciadores humanos. Por otro lado hay que destacar que las proteínas CHD6 de origen humano (SEQ ID No 6) y canino (SEQ ID No 5) presentan una homología elevadísima, sobre todo teniendo en cuenta su tamaño molecular, lo que parece indicar una función muy conservada (Fig.4).
Hasta la fecha se ha descrito un único modulador negativo de la actividad de la polimerasa viral (solo in vitro) y que tiene un efecto moderado en la producción de partículas virales por sobreexpresión transitoria (Ebp-1 ) (3), por tanto CHD6 es el único modulador negativo del virus de la gripe que funciona in vivo mediante silenciamiento génico. Por tanto la construcción de células silenciadas para CHD6 (MDCK fundamentalmente y ocasionalmente Vero), podrían ser utilizadas para la fabricación de vacunas del virus de la gripe, ya que si se comportaran como las células A549 silenciadas, se aumentaría el rendimiento de partículas virales y por tanto la capacidad de producción de vacunas con una bajada en el coste de producción.

Claims

REIVINDICACIONES
1 . Una línea celular estable cuyas células expresan al menos un silenciador de la expresión específico para una proteína celular que interacciona con la polimerasa del virus de la gripe, caracterizada porque cuando son infectadas con dicho virus, dichas células presentan un aumento de la replicación del RNA viral y un aumento en la producción de partículas virales, comparadas con células que no tienen silenciada dicha proteína celular.
2. La línea celular según la reivindicación 1 , caracterizada porque dicha proteína celular es un modulador negativo del virus de la gripe.
3. La línea celular según una de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizada porque dicho modulador negativo del virus de la gripe es un factor remodelador de cromatina.
4. La línea celular según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque dicho factor remodelador de cromatina es CHD6 o su ortólogo.
5. La línea celular según la reivindicación 4, caracterizada porque dicho ortólogo es de perro.
6. La línea celular según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque el silenciador de la expresión se selecciona entre un shRNAs o un miRNA específico para CHD6 o su ortólogo.
7. La línea celular según la reivindicación 6, caracterizada porque el shRNA se selecciona entre s¡CHD6.1 o s¡CHD6.2.
8. Un método para la fabricación de la línea celular definida en una de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende los siguientes pasos: a) transfección en una línea celular de un vector o plásmido, que expresa al menos un silenciador de la expresión específico para una proteína celular que interacciona con la polimerasa del virus de la gripe, y
b) selección de las células que expresan al menos un silenciador de la 5 expresión específico para dicha proteína celular.
9. El método según la reivindicación 8, caractenzado porque dicha proteína celular es un modulador negativo del virus de la gripe.
10 10. El método según una de las reivindicaciones 8 o 9, caractenzado porque dicho modulador negativo del virus de la gripe es un factor remodelador de cromatina.
1 1 . El método según una de las reivindicaciones 8 a 10, caracterizado porque 15 dicho factor remodelador de cromatina es CHD6 o su ortólogo
12. El método según la reivindicación 1 1 , caractenzado porque el ortólogo es de perro.
20 13. El método según una de las reivindicaciones 8 a129, caractenzado porque el silenciador de la expresión específico para CHD6 o su ortólogo del paso b) se selecciona entre el siguiente grupo: un shRNAs, un miRNA, un micro ARN, específico para CHD6 o su ortólogo.
25 14. El método según la reivindicación 13, caracterizado porque el shRNA se selecciona entre s¡CHD6.1 o s¡CHD6.2.
15. El método según una de las reivindicaciones 8 a 14, caracterizado porque la línea celular del paso a) se selecciona en orden creciente de preferencia entre
30 entre MDCK, Vero, A549 y HEK293T.
16. Uso de la línea celular definida en una de las reivindicaciones 1 a 7, para la producción de virus vacunales en la fabricación de vacunas contra el virus de la gripe A o gripe B.
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