WO2012156917A2 - Method for obtaining epsilon-viniferin and/or resveratrol and corresponding products - Google Patents

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WO2012156917A2
WO2012156917A2 PCT/IB2012/052444 IB2012052444W WO2012156917A2 WO 2012156917 A2 WO2012156917 A2 WO 2012156917A2 IB 2012052444 W IB2012052444 W IB 2012052444W WO 2012156917 A2 WO2012156917 A2 WO 2012156917A2
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resveratrol
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Joseph Vercauteren
Cécile SALMI
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Caudalie
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Definitions

  • the invention relates to a process for obtaining purified epsilon-viniferine ( ⁇ -viniferine hereinafter) and / or resveratrol which is depleted in, or even free from, s-viniferine, in particular from a crude extract, dry (EBPS-Sec) or in solution (EBPS-Sol), a plant material rich in polyphenols stilbenoid type. It also relates to the products obtained.
  • EBPS-Sec crude extract, dry
  • EBPS-Sol in solution
  • Resveratrol and its oligomers have antioxidant properties of great interest to fight against aging, which are particularly beneficial to the Applicant for the development of cosmetic compositions.
  • the specific inhibitory action of ⁇ -viniferin on tyrosinase reduces existing spots on the skin and prevent the appearance of new spots.
  • resveratrol and / or ⁇ -viniferin Various plant sources can be used to obtain resveratrol and / or ⁇ -viniferin.
  • Certain parts of plants, in particular vine shoots or vine shoots (Vitis vinifera) are able to accumulate more specifically polyphenols of the stilbenoid type (resveratrol and its oligo-mothers, including ⁇ -viniferine). They therefore constitute raw materials for the preparation of such extracts, the contents of ⁇ -viniferine and / or resveratrol oscillate between 1 to 2% and up to 40%.
  • the extract prepared from Japanese knotweed roots (Polygonum cuspidatum) falls into this category, but contains mainly resveratrol only.
  • the object of the invention is therefore, according to a first aspect, to provide a process for obtaining s-viniferin and / or resveratrol, using PVDF.
  • EBPS-Sol crude vegetable extracts of stilbenoid-type polyphenols
  • EBPS a crude plant extract rich in polyphenols of the stilbenoid type
  • EBPS-Sec EBPS obtained in the dry state by various means (evaporation, lyophilization, %),
  • EBPS-Sol the EBPS solution obtained by solubilization of EBPS-Sec or obtained directly from a plant material
  • Rv-Ads the solution enriched in resveratrol (Rv, below) which flows during the adsorption phase on the solid support of an EBPS-Sol, according to the first aspect
  • Rinc the fractions obtained during the rinsing of the solid support, according to the first aspect
  • Vf-Des the solution enriched in ⁇ -viniferine which flows during the desorption step of the solid support, after the rinsing step, according to the first aspect
  • P-Aqu the aqueous phase resulting from the partition of an EBPS-Sol
  • Vf-Sec the concentrate obtained by evaporation, lyophilization of P-Aqu or
  • Vf-Des consisting of purified ⁇ -viniferin
  • Rv-Sec the evaporation residues of Rv-Ads, Rinc and / or P-Org mainly consisting of resveratrol and possibly including resveratrol oligomers other than ⁇ -viniferine.
  • the process for obtaining purified s-viniferine Vf-Sec and / or Rv-Sec is characterized in that it comprises at least one adsorption-desorption cycle on a solid support of poly (fluoride type) vinylidene) or PVDF, with EBPS-Sol and / or a partition of this solution with ethyl acetate.
  • the PVDF support used is available under various trade names (Kynar®, Solef®, Floraflon®). It is always polymerized vinylidene perfluoride (PVDF), thus having a high chemical inertness.
  • the Kynar® product as sold is in the form of a white powder having a density of 1.78 g / cm 3 at 25 ° C.
  • PVDF is commonly used to filter solutions and rid them of their solid particles. It has been observed in a few rare cases, partial adsorption of certain solutes, but this property has never been used, to the knowledge of the inventors, to achieve enrichment of preparative size batches.
  • the significant adsorption selectivity of ⁇ -viniferine alone is totally unexpected and must result from the particular structure of this resveratrol dimer which establishes the strongest hydrophobic-type interactions with the perfluorinated polymer.
  • EBPS-Sol is advantageously obtained from vine shoots, preferably in the form of a powder, by maceration in ethanol followed by filtration. The resulting vegetable crude extract is then concentrated and dissolved in water and then used in the process of the invention.
  • the crude vegetable extract (EBPS) is directly dissolved in a solvent capable of solubilizing all the constituents of the extract and not allowing the desorption of ⁇ -viniferine from PVDF, obtaining the EBPS-Sol.
  • This solvent consists in particular of either ethyl acetate alone or a mixture forming a single phase, in which water is predominant, but which also comprises one or more organic solvents, miscible with 'water.
  • Suitable organic solvents include acetonitrile, acetone, and / or methanol. Their proportion, in total, represents 0.2 to 30%, the rest being water (99.8 to 70%).
  • the EBPS-Sol is subjected to a step of adsorption of ⁇ -viniferine by filtration through PVDF, which is rinsed with several volumes of the same solvent.
  • the ⁇ -viniferine desorption step is carried out using a solvent comprising, with respect to water, a greater, or even equal, proportion of organic solvent miscible with water.
  • a solvent comprising, with respect to water, a greater, or even equal, proportion of organic solvent miscible with water.
  • This will be for example an acetonitrile-water (95: 5), acetone-water (90:10), or methanol-water (50:50).
  • a polar solvent without water will be advantageously used.
  • the various Vf-Des filtrates are combined and concentrated by evaporation of the organic part, advantageously under reduced pressure.
  • the resulting aqueous phase is subjected to lyophilization and, in the case where ethyl acetate has been used as sole solvent in the adsorption phase, to evaporation to dryness, which leads, in these two cases, to a dry extract enriched in ⁇ -viniferine Vf-Sec.
  • the phases containing ⁇ -purified viniferine P-Aqu and the phases enriched in resveratrol P-Org are obtained by partitioning with ethyl acetate, volume to volume, of the aqueous solution of EBPS-Sol.
  • the invention also aims, as new products, ⁇ -viniferin and / or resveratrol as obtained by the different provisions of the process defined above.
  • the ⁇ -viniferine is distinguished from those previously described in the prior art by a purity higher than 77% by weight and up to almost 100% by combination of the different provisions of the process. In particular, it contains no longer or virtually no other oligomers of resveratrol, initially present in the plant extracts used. It is also characterized by a tyrosinase inhibitory activity at least 4 times stronger than that of kojic acid and more than 60 times greater than that of ascorbic acid. The value of this ⁇ -viniferine is thus measured in particular in the cosmetic and therapeutic fields.
  • the invention is therefore more particularly the applications of these products in the fields indicated above.
  • compositions containing an effective amount of s-viniferin and / or Rv defined above in combination with cosmetically acceptable excipients.
  • compositions containing effective amounts of s-viniferin and / or Rv which can be used for their pharmacological properties, in pathologies directly related to or which have as their corollary, an exaggerated production of melanin (melasma, chloasma or certain melanomas). , for example).
  • compositions of the invention are thus characterized in that they contain an effective amount of s-viniferin and / or Rv purified according to the method defined above, in combination with excipients acceptable for topical application or for use. internal.
  • FIGS. 1 to 13 which represent respectively:
  • FIGS. 4-11 the histograms representing the amounts in mg of s-viniferine and of resveratrol of the fractions resulting from Examples B1 to B8,
  • Figures 12-13 the histograms representing the amounts in mg of s-viniferine and resveratrol fractions from Examples C1 and C2.
  • A is reported hereinafter by way of example, a general procedure for obtaining s-viniferin from an EBPS extract from vine shoots and vine shoots making use of the PVDF polymer.
  • Solvent A must solubilize all the constituents of the EBPS.
  • Solvent A is a binary or ternary mixture of miscible (single-phase) solvents in which water is predominant, or ethyl acetate alone.
  • Suitable organic solvents include acetonitrile, acetone, and / or methanol. Their proportion, in total, represents 0.2 to 30%, the rest being water (99.8 to 70%).
  • the solvent A preferably, the solvent A consists of 3% acetonitrile + 97% water or 5% acetone + 95% water.
  • the EBPS-Sol in the solvent A is first brought into contact with the PVDF at room temperature. It is then fi ltered through PVDF, which is then rinsed with several volumes of solvent A alone.
  • PVDF resin can be stirred in the presence of EBPS-Sol, followed by filtration and rinsing on a filter funnel (sintered glass) or garnish any system provided with a filter membrane (sintered glass, stainless steel or polyethylene) resin. It can be a low pressure column or a cartridge (type "SPE"), the elution and rinsing being accelerated by the vacuum or the pressure of the solvent A.
  • the residual aqueous solution is lyophilized to provide enriched or purified resveratrol, Rv-Sec.
  • ⁇ -viniferin remains selectively adsorbed on the PVDF, while the enriched resveratrol is eluted with its other oligomers contained in the EBPS-Sol.
  • the s-viniferine is then desorbed by several volumes of solvent B.
  • the solvent B must comprise a greater, and at most, equal, proportion of organic solvent (miscible with water ). This will be for example an acetonitrile-water (95: 5), acetone-water (90:10) or methanol-water (50:50).
  • Vf-Des The desorption solution obtained, Vf-Des is concentrated by evaporation under reduced pressure on its organic part.
  • the residual aqueous solution is dried by lyophilization and abandons enriched or purified ⁇ -viniferin, Vf-Sec.
  • the PVDF (33 g / 100 ml) is conditioned with an acetonitrile-water solution (15:85) with stirring for 30 minutes.
  • the PVDF used here is marketed by Alfa Aesar.
  • the support is then introduced into an empty SPE cartridge with a sinter. The solvent is removed without, however, drying the PVDF.
  • the step of recovering the polyphenols adsorbed on the resin is carried out.
  • This step is carried out eluting ⁇ -viniferine with an acetonitrile-water (95: 5) mixture.
  • This desorption can also be carried out with a mixture of methanol-water (50-50) or acetone-water (90:10).
  • the volume used is 3 times the volume V, here 90 ml.
  • fractions Vf-Des are combined and concentrated by evaporation of the acetonitrile under vacuum, then the aqueous phase is lyophilized to deliver purified viniferine, Vf-Sec.
  • Example A2 sintered filtration
  • the PVDF support (10 g) is conditioned in 30 ml solvent CH 3 CN-H 2 O (15:85) with stirring for 30 minutes.
  • the PVDF used here is marketed by Alfa Aesar.
  • the PVDF support is filtered on sintered glass n ° 4. The support is thus ready.
  • the Rv-Ads and Rinc fractions thus obtained are combined and concentrated by evaporation under vacuum.
  • the fraction obtained contains resveratrol and oligomers other than ⁇ -viniferine, Rv-Sec.
  • the ⁇ -viniferine Vf-Sec dimer is then recovered by evaporation of the solvent B under vacuum, or after partial concentration and lyophilization of the resulting aqueous solution.
  • the PVDF (400 g / 1000 ml) is conditioned with an acetone-water solution (4:96) with stirring for 30 minutes.
  • the PVDF used here is marketed by Alfa Aesar.
  • the PVDF support is filtered on sintered glass n ° 4. The support is thus ready.
  • the Rv-Ads and Rinc fractions thus obtained are combined and concentrated by evaporation under vacuum. It contains resveratrol and oligomers other than ⁇ -viniferine, Rv-Sec Desorption of ⁇ -viniferine
  • the ⁇ -viniferine Vf-Sec dimer is then recovered by evaporation of the solvent B under vacuum, or after partial concentration and lyophilization of the resulting aqueous solution.
  • the A3-Rv-Sec fraction then contains more than 42% of the total mass of resveratrol whereas the A3-Vf-Sec fraction contains more than 51% of the total mass of s-viniferin.
  • the organic fraction obtained B4-Rv-Sec contains more than 50% of the total mass of resveratrol while the aqueous phase 1 obtained, B4-Vf-Secl contains more than 57%> of the total mass of s-viniferine.
  • the aqueous phase 2 obtained, B4-Vf-Sec2 contains less than 1.6% of the total mass of EBPS deposited.
  • Example B6 liquid-liquid separation from shoots
  • Example C1 the aqueous phase resulting from a liquid liquid extraction with ethyl acetate (P-Aqu) is treated by the implementation of the process making use of the PVDF polymer. This results in additional enrichment of ⁇ -viniferine in the aqueous phase by a factor of 10.
  • Example C2 the aqueous phase resulting from the implementation of the process making use of the PVDF polymer (Vf-Des) is then subjected to a liquid liquid extraction with ethyl acetate. This results in additional enrichment of ⁇ -viniferine in the aqueous phase by a factor of 14.
  • Example C1 liquid-liquid separation followed by purification by PVDF on sintered
  • the PVDF support (35 g) is conditioned in 100 ml of acetone-H 2 O (2:98) with stirring for 30 minutes.
  • the PVDF used here is marketed by Alfa Aesar.
  • the PVDF support is filtered on sintered glass n ° 4. The support is thus ready.
  • EBPS-Sol is extracted twice with an equivalent volume of ethyl acetate.
  • the ethyl acetate phase is concentrated under vacuum and freeze-dried or evaporated to dryness (Cl-Rv-Sec), while the aqueous phase (Cl-P-Aqu) is treated on the PVDF support as follows.
  • the aqueous phase (180 ml) is mixed with the PVDF support (mechanical stirring). Once the mixture is homogeneous, the whole is filtered on sintered No. 4.
  • the support is then rinsed with 2 times 100 ml acetone-water (2:98).
  • the support is then stirred with 100 ml of acetone-water (90:10) before being filtered. This operation is performed again.
  • a fraction rich in ⁇ -viniferine dimer is then recovered by evaporation of the solvent under vacuum, or after partial concentration and lyophilization of the resulting aqueous solution, denoted Clc-Vf-Sec.
  • Clc-Vf-Sec In the organic phase (Cl-Rv-Sec), more than 57% of the total mass of resveratrol is recovered, whereas in the Clc-Vf-Sec fraction, more than 47% of the total mass of ⁇ -viniferine is isolated. .
  • Example C2 Sintered PVDF purification of an EBPS extract, followed by a liquid-liquid separation of the aqueous phase
  • the PVDF support (50 g) is conditioned in 500 ml of acetone-H 2 O (2:98) with stirring for 30 minutes.
  • the PVDF used here is marketed by Alfa Aesar.
  • the PVDF support is filtered on sintered glass n ° 4. The support is thus ready.
  • the support is then stirred with 100 ml of acetone-water (90:10) before being filtered. This operation is performed again. The aqueous fraction rich in ⁇ -viniferine dimer is then recovered.
  • the aqueous fraction is divided in two.
  • the first part is concentrated and lyophilized (C2c-Vf-Sec).
  • the second part undergoes a liquid-liquid extraction with ethyl acetate.
  • Purified viniferine is 4 times more active than kojic acid and 62 times more active than vitamin C.

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Abstract

The invention relates to a method for obtaining purified ε-viniferin (Vf-Dry) and/or resveratrol which has a low content or is even free of ε-viniferin (Rv-Dry), from an extract, which is crude (EBPS), dry (EBPS-dry), or in solution (EBPS-Sol), of a plant material rich in stilbenoid polyphenols, characterized in that it comprises at least one cycle of adsorption-desorption on a solid substrate such as poly(vinylidene fluoride) or PVDF with EBPS-Sol, and/or partition of this EBPS-Sol solution with ethyl acetate. Applications in particular in the cosmetics industry and in therapy.

Description

Procédé d'obtention d' epsilon- viniférine et/ou de resvératrol et produits correspondants  Process for obtaining epsilon-viniferin and / or resveratrol and corresponding products
L'invention se rapporte à un procédé d'obtention d'epsilon- viniférine (ε-viniférine ci-après) purifiée et/ou de resvératrol appauvri en, voire exempt d's- viniférine, en particulier à partir d'un extrait, brut, sec (EBPS-Sec) ou en solution (EBPS-Sol), d'une matière végétale riche en polyphénols de type stilbénoïde. Elle se rapporte également aux produits obtenus. The invention relates to a process for obtaining purified epsilon-viniferine (ε-viniferine hereinafter) and / or resveratrol which is depleted in, or even free from, s-viniferine, in particular from a crude extract, dry (EBPS-Sec) or in solution (EBPS-Sol), a plant material rich in polyphenols stilbenoid type. It also relates to the products obtained.
Le resvératrol et ses oligomères présentent des propriétés anti-oxydantes de grand intérêt pour lutter contre le vieillissement, qui sont mises particulièrement à profit par la Demanderesse pour l'élaboration de compositions cosmétiques. En outre, l'action spécifique inhibitrice de l'ε-viniférine sur la tyrosinase permet de réduire les taches existantes sur la peau et de prévenir l'apparition de nouvelles taches.  Resveratrol and its oligomers have antioxidant properties of great interest to fight against aging, which are particularly beneficial to the Applicant for the development of cosmetic compositions. In addition, the specific inhibitory action of ε-viniferin on tyrosinase reduces existing spots on the skin and prevent the appearance of new spots.
Diverses sources végétales peuvent être utilisées pour obtenir du resvératrol et/ou de l'ε- viniférine. Certaines parties de plantes, notamment les sarments ou les rafles de vigne (Vitis vinifera), sont capables d'accumuler plus spécifiquement des polyphénols de type stilbénoïde (resvératrol et ses oligo mères, dont l'ε- viniférine). Elles constituent donc des matières premières pour la préparation de tels extraits, dont les teneurs en ε-viniférine et/ou resvératrol oscillent entre 1 à 2% et jusqu'à 40%. L'extrait préparé à partir des racines de renouée du Japon {Polygonum cuspidatum), entre dans cette catégorie, mais ne renferme principalement que du resvératrol. A partir de ces extraits, il est possible de purifier les stilbénoïdes d'intérêt (voir notamment, l'article de Delaunay J.-C. et al, Preparative isolation of polyphenolic compounds from Vitis vinifera by centrifugal partition chromatography. J. Chrom. A, 2002, 964, (1-2), 123- 128).  Various plant sources can be used to obtain resveratrol and / or ε-viniferin. Certain parts of plants, in particular vine shoots or vine shoots (Vitis vinifera), are able to accumulate more specifically polyphenols of the stilbenoid type (resveratrol and its oligo-mothers, including ε-viniferine). They therefore constitute raw materials for the preparation of such extracts, the contents of ε-viniferine and / or resveratrol oscillate between 1 to 2% and up to 40%. The extract prepared from Japanese knotweed roots (Polygonum cuspidatum) falls into this category, but contains mainly resveratrol only. From these extracts, it is possible to purify the stilbenoids of interest (see, in particular, the article by Delaunay J.-C. et al, Preparative isolation of polyphenolic compounds from Vitis vinifera by centrifugal partition chromatography J. Chrom. A, 2002, 964, (1-2), 123-128).
Pour effectuer le dosage des différents stilbénoïdes présents dans ces extraits, par Chromatographie Liquide Haute Performance (CLHP) sur colonne de silice greffée Cl 8 avec détection Ultra- Violet (UV), nous en préparons des solutions. Pour protéger les colonnes, celles-ci doivent d'abord être débarrassées de leurs particules solides, par passage au travers de filtres « compatibles » avec les solvants. Les inventeurs ont constaté que, pour une même solution, selon la nature du filtre utilisé, le pic correspondant à l'ε-viniférine pouvait refléter les teneurs évoquées ci-dessus, ou disparaître parfois totalement du chromatogramme. C'est le cas, notamment, quand il s'agit du poly(fluorure de vinylidène) ou PVDF. To perform the assay of the various stilbenoids present in these extracts, by high performance liquid chromatography (HPLC) on Cl 8 grafted silica column with ultraviolet (UV) detection, we prepare solutions. To protect the columns, they must first be cleared of their solid particles, by passing through filters "compatible" with solvents. The inventors have found that, for the same solution, depending on the nature of the filter used, the peak corresponding to the ε-viniferine could reflect the contents mentioned above, or sometimes disappear completely from the chromatogram. This is particularly the case when it is poly (vinylidene fluoride) or PVDF.
Ces observations ont été mises à profit pour rechercher les conditions d'un enrichissement des solutions en ε-viniférine.  These observations have been used to search for conditions for enrichment of ε-viniferine solutions.
La poursuite de ces travaux a montré qu'il était possible d'obtenir par extraction avec des solvants spécifiques des phases enrichies en ε-viniférine d'une part et des phases enrichies en resvératrol (Rv) d'autre part et d'opérer avec ou sans support solide de type PVDF.  Continuation of this work has shown that it is possible to obtain, by extraction with specific solvents, phases enriched in ε-viniferine on the one hand and resveratrol-enriched phases (Rv) on the other hand and to operate with or without a solid support of PVDF type.
L'invention a donc pour objet, selon un premier aspect, de fournir un procédé d'obtention d's-viniférine et/ou de resvératrol, mettant en œuvre du PVDF.  The object of the invention is therefore, according to a first aspect, to provide a process for obtaining s-viniferin and / or resveratrol, using PVDF.
Elle a également pour but, selon un second aspect, de fournir un procédé d'obtention de phases enrichies en ε-viniférine et de phases enrichies en resvératrol (appauvri en, voire exempt d's-viniférine), par partition avec l'acétate d'éthyle de solutions aqueuses d'extraits végétaux bruts de polyphénols de type stilbénoïde (EBPS- Sol).  It also aims, according to a second aspect, to provide a process for obtaining ε-viniferine enriched phases and resveratrol-enriched phases (depleted in or even free of s-viniferine), by partitioning with the acetate of ethyl of aqueous solutions of crude vegetable extracts of stilbenoid-type polyphenols (EBPS-Sol).
Elle vise également à fournir de Γε-viniférine de pureté élevée et/ou du resvératrol appauvri en, voire exempt d's-viniférine, et leurs applications en cosmétique et en thérapeutique.  It also aims to provide ε-viniferine of high purity and / or resveratrol depleted in or free of s-viniferine, and their applications in cosmetics and therapeutics.
Dans la suite de la description et dans les revendications, on entend par :  In the remainder of the description and in the claims, the following terms mean:
- EBPS : un extrait brut végétal riche en polyphénols de type stilbénoïde, EBPS: a crude plant extract rich in polyphenols of the stilbenoid type,
EBPS-Sec : l'EBPS obtenu à l'état sec par différents moyens (évaporation, lyophilisation,...), EBPS-Sec: EBPS obtained in the dry state by various means (evaporation, lyophilization, ...),
EBPS-Sol : la solution d'EBPS obtenue par solubilisation de l'EBPS-Sec ou obtenue directement à partir d'une matière végétale,  EBPS-Sol: the EBPS solution obtained by solubilization of EBPS-Sec or obtained directly from a plant material,
- Rv-Ads : la solution enrichie en resvératrol (Rv, ci-dessous) qui s'écoule lors de la phase d'adsorption sur le support solide d'une EBPS-Sol, selon le premier aspect,  Rv-Ads: the solution enriched in resveratrol (Rv, below) which flows during the adsorption phase on the solid support of an EBPS-Sol, according to the first aspect,
Rinc : les fractions obtenues lors du rinçage du support solide, selon le premier aspect,  Rinc: the fractions obtained during the rinsing of the solid support, according to the first aspect,
- Vf-Des : la solution enrichie en ε-viniférine qui s'écoule lors de l'étape de désorption du support solide, après l'étape de rinçage, selon le premier aspect, P-Aqu : la phase aqueuse résultant de la partition d'une EBPS-Sol, selon le deuxième aspect, - Vf-Des: the solution enriched in ε-viniferine which flows during the desorption step of the solid support, after the rinsing step, according to the first aspect, P-Aqu: the aqueous phase resulting from the partition of an EBPS-Sol, according to the second aspect,
P-Org : la phase organique résultant de la partition d'une EBPS-Sol, selon le deuxième aspect,  P-Org: the organic phase resulting from the partition of an EBPS-Sol, according to the second aspect,
- Vf-Sec: le concentrât obtenu par évaporation, lyophilisation des P-Aqu ou - Vf-Sec: the concentrate obtained by evaporation, lyophilization of P-Aqu or
Vf-Des, constitué d'ε-viniférine purifiée, Vf-Des, consisting of purified ε-viniferin,
Rv-Sec : les résidus d'évaporation des Rv-Ads, Rinc et/ou P-Org constitués majoritairement de resvératrol et pouvant comprendre des oligomères du resvératrol autres que l'ε-viniférine.  Rv-Sec: the evaporation residues of Rv-Ads, Rinc and / or P-Org mainly consisting of resveratrol and possibly including resveratrol oligomers other than ε-viniferine.
Conformément à l'invention, le procédé d'obtention d's-viniférine purifiée Vf- Sec et/ou de Rv-Sec est caractérisé en ce qu'il comprend au moins un cycle d'adsorption-désorption sur support solide de type poly(fluorure de vinylidène) ou PVDF, avec l'EBPS-Sol et/ou une partition de cette solution avec l'acétate d'éthyle. According to the invention, the process for obtaining purified s-viniferine Vf-Sec and / or Rv-Sec is characterized in that it comprises at least one adsorption-desorption cycle on a solid support of poly (fluoride type) vinylidene) or PVDF, with EBPS-Sol and / or a partition of this solution with ethyl acetate.
Le support PVDF utilisé est disponible sous diverses dénominations commerciales (Kynar®, Solef®, Floraflon®). Il s'agit toujours du perfluorure de vinylidène polymérisé (PVDF), donc possédant une grande inertie chimique. Le produit Kynar® tel que commercialisé se présente sous forme de poudre blanche, de densité de 1,78 g/cm3 à 25°C. The PVDF support used is available under various trade names (Kynar®, Solef®, Floraflon®). It is always polymerized vinylidene perfluoride (PVDF), thus having a high chemical inertness. The Kynar® product as sold is in the form of a white powder having a density of 1.78 g / cm 3 at 25 ° C.
Le PVDF est couramment utilisé pour filtrer des solutions et les débarrasser de leurs particules solides. Il a été observé dans quelques rares cas, une adsorption partielle de certains solutés, mais cette propriété n'a jamais été utilisée, à la connaissance des inventeurs, pour réaliser un enrichissement de lots de taille préparative. La sélectivité importante d'adsorption de la seule ε-viniférine est totalement inattendue et doit résulter de la structure particulière de ce dimère du resvératrol qui établit les interactions de type hydrophobes les plus fortes avec le polymère perfluoré.  PVDF is commonly used to filter solutions and rid them of their solid particles. It has been observed in a few rare cases, partial adsorption of certain solutes, but this property has never been used, to the knowledge of the inventors, to achieve enrichment of preparative size batches. The significant adsorption selectivity of ε-viniferine alone is totally unexpected and must result from the particular structure of this resveratrol dimer which establishes the strongest hydrophobic-type interactions with the perfluorinated polymer.
Un enrichissement est observé dès le premier passage (voir figures 1 à 3). En soumettant l'extrait ainsi obtenu à un nouveau cycle d'adsorption-désorption (la même résine est avantageusement réutilisable sans perte d'activité, pour de nombreux cycles), le procédé permet d'obtenir l'ε-viniférine à l'état pratiquement pur. L'extrait brut végétal désigné par EBPS-Sol, est obtenu avantageusement à partir de sarments de vigne, de préférence sous forme de poudre, par macération dans l'éthanol suivie d'une fïltration. L'extrait brut végétal résultant est alors concentré et dissous dans l'eau, puis mis en œuvre dans le procédé de l'invention. Enrichment is observed from the first pass (see Figures 1 to 3). By subjecting the extract thus obtained to a new adsorption-desorption cycle (the same resin is advantageously reusable without loss of activity, for many cycles), the process makes it possible to obtain ε-viniferine in the state practically pure. The crude plant extract designated EBPS-Sol is advantageously obtained from vine shoots, preferably in the form of a powder, by maceration in ethanol followed by filtration. The resulting vegetable crude extract is then concentrated and dissolved in water and then used in the process of the invention.
En variante, l'extrait brut végétal (EBPS) est directement dissous dans un solvant capable de solubiliser la totalité des constituants de l'extrait et ne permettant pas la désorption de Γε-viniférine du PVDF, obtenant l'EBPS-Sol.  Alternatively, the crude vegetable extract (EBPS) is directly dissolved in a solvent capable of solubilizing all the constituents of the extract and not allowing the desorption of Γε-viniferine from PVDF, obtaining the EBPS-Sol.
Ce solvant est constitué notamment, soit par de l'acétate d'éthyle seul, soit par un mélange formant une seule phase, dans lequel l'eau est majoritaire, mais qui comprend également un ou plusieurs solvants organiques, miscible(s) à l'eau.  This solvent consists in particular of either ethyl acetate alone or a mixture forming a single phase, in which water is predominant, but which also comprises one or more organic solvents, miscible with 'water.
Des solvants organiques idoines comprennent Pacétonitrile, l'acétone, et/ou le méthanol. Leur proportion, au total, représente 0,2 à 30%, le reste étant de l'eau (99,8 à 70%).  Suitable organic solvents include acetonitrile, acetone, and / or methanol. Their proportion, in total, represents 0.2 to 30%, the rest being water (99.8 to 70%).
L'EBPS-Sol est soumis à une étape d'adsorption de Γε-viniférine par fïltration au travers du PVDF, lequel est rincé par plusieurs volumes du même solvant.  The EBPS-Sol is subjected to a step of adsorption of ε-viniferine by filtration through PVDF, which is rinsed with several volumes of the same solvent.
Les fractions obtenues, Rv-Ads et Rinc, sont rassemblées et concentrées par évaporation de la part organique, avantageusement sous pression réduite. S'il s'agit d'acétate d'éthyle seul, il est évaporé à siccité. Avec tout autre solvant, la solution aqueuse résiduelle, est séchée par lyophilisation et livre le resvératrol enrichi, Rv-Sec.  The fractions obtained, Rv-Ads and Rinc, are combined and concentrated by evaporation of the organic part, advantageously under reduced pressure. If it is ethyl acetate alone, it is evaporated to dryness. With any other solvent, the residual aqueous solution is dried by lyophilization and delivers the enriched resveratrol, Rv-Sec.
L'étape de désorption de Γε-viniférine est réalisée à l'aide d'un solvant comportant, par rapport à l'eau, une plus grande, voire égale, proportion de solvant organique miscible à l'eau. Il s'agira par exemple d'un mélange acétonitrile-eau (95:5), acétone-eau (90: 10), ou de méthanol-eau (50:50). Dans le cas où l'acétate d'éthyle est utilisé comme seul solvant dans l'étape d'adsorption, un solvant polaire sans eau sera avantageusement utilisé.  The ε-viniferine desorption step is carried out using a solvent comprising, with respect to water, a greater, or even equal, proportion of organic solvent miscible with water. This will be for example an acetonitrile-water (95: 5), acetone-water (90:10), or methanol-water (50:50). In the case where ethyl acetate is used as sole solvent in the adsorption step, a polar solvent without water will be advantageously used.
Les différents filtrats Vf-Des sont réunis et concentrés par évaporation de la part organique, avantageusement sous pression réduite. La phase aqueuse résultante est soumise à une lyophilisation et, dans le cas où l'acétate d'éthyle a été utilisé comme seul solvant dans la phase d'adsorption, à une évaporation à siccité, ce qui conduit, dans ces 2 cas, à un extrait sec enrichi en ε-viniférine Vf-Sec. Selon le second aspect, les phases renfermant Γε-viniférine purifiée P-Aqu et les phases enrichies en resvératrol P-Org sont obtenues par partition avec l'acétate d'éthyle, volume à volume, de la solution aqueuse d'EBPS-Sol. The various Vf-Des filtrates are combined and concentrated by evaporation of the organic part, advantageously under reduced pressure. The resulting aqueous phase is subjected to lyophilization and, in the case where ethyl acetate has been used as sole solvent in the adsorption phase, to evaporation to dryness, which leads, in these two cases, to a dry extract enriched in ε-viniferine Vf-Sec. According to the second aspect, the phases containing Γε-purified viniferine P-Aqu and the phases enriched in resveratrol P-Org are obtained by partitioning with ethyl acetate, volume to volume, of the aqueous solution of EBPS-Sol.
La répétition du procédé sur les Vf-Des ou les P-Aqu, permet d'augmenter la richesse en ε-viniférine jusqu'à des taux pratiquement de 100%.  The repetition of the process on Vf-Des or P-Aqu, makes it possible to increase the ε-viniferine richness up to almost 100% levels.
L'invention vise également, en tant que nouveaux produits, l'ε-viniférine et/ou le resvératrol tels qu'obtenus par les différentes dispositions du procédé défini ci-dessus.  The invention also aims, as new products, ε-viniferin and / or resveratrol as obtained by the different provisions of the process defined above.
L'ε- viniférine se distingue de celles précédemment décrites dans l'art antérieur par une pureté supérieure à 77% en masse et pouvant atteindre pratiquement 100%, par combinaison des différentes dispositions du procédé. En particulier, elle ne contient plus ou pratiquement plus les autres oligomères de resvératrol, initialement présents dans les extraits végétaux utilisés. Elle est également caractérisée par une activité inhibitrice de la tyrosinase au moins 4 fois plus forte que celle de l'acide kojique et plus de 60 fois plus importante que celle de l'acide ascorbique. On mesure ainsi l'intérêt de cette ε- viniférine en particulier dans les domaines cosmétique et thérapeutique.  The ε-viniferine is distinguished from those previously described in the prior art by a purity higher than 77% by weight and up to almost 100% by combination of the different provisions of the process. In particular, it contains no longer or virtually no other oligomers of resveratrol, initially present in the plant extracts used. It is also characterized by a tyrosinase inhibitory activity at least 4 times stronger than that of kojic acid and more than 60 times greater than that of ascorbic acid. The value of this ε-viniferine is thus measured in particular in the cosmetic and therapeutic fields.
Comme exposé ci-dessus, les différentes dispositions du procédé de l'invention permettent également d'obtenir du resvératrol (Rv) pratiquement débarrassé d's- viniférine, Rv-Sec.  As explained above, the various provisions of the process of the invention also make it possible to obtain resveratrol (Rv) substantially free of s-viniferin, Rv-Sec.
L'invention vise donc plus particulièrement les applications de ces produits dans les domaines indiqués ci-dessus.  The invention is therefore more particularly the applications of these products in the fields indicated above.
Elle vise spécialement les compositions cosmétiques contenant une quantité efficace d's- viniférine et/ou de Rv définis ci-dessus en association avec des excipients acceptables en cosmétologie.  It is especially directed to cosmetic compositions containing an effective amount of s-viniferin and / or Rv defined above in combination with cosmetically acceptable excipients.
Elle vise aussi bien des compositions renfermant des quantités efficaces d's- viniférine et/ou de Rv, utilisables pour leurs propriétés pharmacologiques, dans des pathologies liées directement à, ou qui ont comme corollaire, une production exagérée de mélanine (melasma, chloasma ou certains mélanomes, par exemple).  It also relates to compositions containing effective amounts of s-viniferin and / or Rv, which can be used for their pharmacological properties, in pathologies directly related to or which have as their corollary, an exaggerated production of melanin (melasma, chloasma or certain melanomas). , for example).
Les compositions pharmaceutiques de l'invention sont ainsi caractérisées en ce qu'elles renferment une quantité efficace d's- viniférine et/ou de Rv purifiés selon le procédé défini ci-dessus, en association avec des excipients acceptables pour une application topique ou pour un usage interne. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés dans les exemples qui suivent. The pharmaceutical compositions of the invention are thus characterized in that they contain an effective amount of s-viniferin and / or Rv purified according to the method defined above, in combination with excipients acceptable for topical application or for use. internal. Other features and advantages of the invention are given in the examples which follow.
Il y est fait référence aux figures 1 à 13 qui représentent respectivement : Reference is made to FIGS. 1 to 13 which represent respectively:
- Figure 1 : un chromatogramme d'EBPS-Sol,  - Figure 1: a chromatogram of EBPS-Sol,
Figure 2 : un chromatogramme de la fraction A3-Rv-Sec riche en resvératrol lyophilisée,  2: a chromatogram of the A3-Rv-Sec fraction rich in freeze-dried resveratrol,
Figure 3 : un chromatogramme de la fraction A3-Vf-Sec riche en viniférine lyophilisée,  3: a chromatogram of the fraction A3-Vf-Sec rich in lyophilized viniferine,
- Figures 4-11, les histogrammes représentant les quantités en mg d's-viniférine et de resvératrol des fractions issues des exemples B1 à B8,  FIGS. 4-11, the histograms representing the amounts in mg of s-viniferine and of resveratrol of the fractions resulting from Examples B1 to B8,
Figures 12-13, les histogrammes représentant les quantités en mg d's-viniférine et de resvératrol des fractions issues des exemples C1 et C2. A : on rapporte ci-après à titre d'exemple, un mode opératoire général d'obtention d's- viniférine à partir d'un extrait d'EBPS provenant des rafles et sarments de vigne faisant usage du polymère PVDF.  Figures 12-13, the histograms representing the amounts in mg of s-viniferine and resveratrol fractions from Examples C1 and C2. A is reported hereinafter by way of example, a general procedure for obtaining s-viniferin from an EBPS extract from vine shoots and vine shoots making use of the PVDF polymer.
Procédé : Process :
1ère phase : adsorption de Ι'ε-viniférine 1st phase: adsorption Ι'ε-viniferin
• L'EBPS est tout d'abord dissous dans un solvant A. Celui-ci doit satisfaire les deux conditions :  • EBPS is first dissolved in a solvent A. It must meet both conditions:
1. Le solvant A doit solubiliser la totalité des constituants de l'EBPS.  1. Solvent A must solubilize all the constituents of the EBPS.
2. Il ne doit pas être capable d'éluer l'ε-viniférine du PVDF.  2. It must not be able to elute ε-viniferine from PVDF.
Le solvant A est un mélange binaire ou ternaire de solvants miscibles (formant une seule phase), dans lesquels, l'eau est majoritaire, ou de l'acétate d'éthyle, seul. Des solvants organiques idoines comprennent Pacétonitrile, l'acétone, et/ou le méthanol. Leur proportion, au total, représente 0,2 à 30%, le reste étant de l'eau (99,8 à 70%). Dans le cas des EBPS de sarments de vigne, de préférence, le solvant A est constitué de 3% d'acétonitrile + 97% d'eau ou 5% acétone + 95% eau. L'EBPS-Sol dans le solvant A est d'abord mis au contact du PVDF, à température ambiante. Elle est ensuite soumise à une fïltration au travers du PVDF, qui est alors rincé par plusieurs volumes de solvant A seul. Cette étape de contact adsorption/fîltration, peut avoir lieu de diverses manières, dès lors qu'elles permettent ce rinçage. On peut agiter de la résine PVDF en présence d'EBPS-Sol, suivie d'une fïltration et du rinçage sur un entonnoir filtrant (fritté de verre) ou garnir tout système muni d'une membrane filtrante (fritté de verre, d'inox ou de polyéthylène) de résine. Il peut s'agir d'une colonne basse pression ou d'une cartouche (type « SPE »), l'élution et le rinçage étant accélérés par le vide ou la pression du solvant A. Solvent A is a binary or ternary mixture of miscible (single-phase) solvents in which water is predominant, or ethyl acetate alone. Suitable organic solvents include acetonitrile, acetone, and / or methanol. Their proportion, in total, represents 0.2 to 30%, the rest being water (99.8 to 70%). In the case of EBPS of vine shoots, preferably, the solvent A consists of 3% acetonitrile + 97% water or 5% acetone + 95% water. The EBPS-Sol in the solvent A is first brought into contact with the PVDF at room temperature. It is then fi ltered through PVDF, which is then rinsed with several volumes of solvent A alone. This adsorption / filtration contacting step can take place in various ways, as long as they allow this rinsing. PVDF resin can be stirred in the presence of EBPS-Sol, followed by filtration and rinsing on a filter funnel (sintered glass) or garnish any system provided with a filter membrane (sintered glass, stainless steel or polyethylene) resin. It can be a low pressure column or a cartridge (type "SPE"), the elution and rinsing being accelerated by the vacuum or the pressure of the solvent A.
Après concentration de la part organique de ces filtrats Rv-Ads et Rinc, la solution aqueuse résiduelle est lyophilisée pour fournir le resvératrol enrichi ou purifié, Rv-Sec.  After concentration of the organic part of these Rv-Ads and Rinc filtrates, the residual aqueous solution is lyophilized to provide enriched or purified resveratrol, Rv-Sec.
Au cours de cette fïltration, Γε-viniférine reste sélectivement adsorbée sur le PVDF, tandis que le resvératrol enrichi est élué avec ses autres oligomères contenus dans l'EBPS-Sol.  During this filtration, ε-viniferin remains selectively adsorbed on the PVDF, while the enriched resveratrol is eluted with its other oligomers contained in the EBPS-Sol.
2eme phase : obtention de Ι'ε-viniférine 2nd phase obtaining Ι'ε-viniferin
L's-viniférine est alors désorbée par plusieurs volumes de solvant B. Pour être capable de désorber Γε-viniférine du PVDF, le solvant B doit comporter une plus grande, et au plus, une égale, proportion de solvant organique (miscible à l'eau). Il s'agira par exemple d'un mélange acétonitrile-eau (95:5), acétone-eau (90 : 10) ou de méthanol-eau (50:50).  The s-viniferine is then desorbed by several volumes of solvent B. To be able to desorb Γε-viniferine from PVDF, the solvent B must comprise a greater, and at most, equal, proportion of organic solvent (miscible with water ). This will be for example an acetonitrile-water (95: 5), acetone-water (90:10) or methanol-water (50:50).
La solution de désorption obtenue, Vf-Des est concentrée par évaporation sous pression réduite de sa part organique. La solution aqueuse résiduelle, est séchée par lyophilisation et abandonne Γε-viniférine enrichie ou purifiée, Vf-Sec.  The desorption solution obtained, Vf-Des is concentrated by evaporation under reduced pressure on its organic part. The residual aqueous solution is dried by lyophilization and abandons enriched or purified ε-viniferin, Vf-Sec.
Exemple Al : sur cartouche SPE Example Al: on SPE cartridge
Préparation du support  Preparation of the support
Le PVDF (33g/100ml) est conditionné avec une solution acétonitrile-eau (15:85) sous agitation pendant 30 minutes. Le PVDF utilisé ici est commercialisé par Alfa Aesar. Le support est ensuite introduit dans une cartouche SPE vide munie d'un fritté. Le solvant est éliminé, sans toutefois, sécher le PVDF. The PVDF (33 g / 100 ml) is conditioned with an acetonitrile-water solution (15:85) with stirring for 30 minutes. The PVDF used here is marketed by Alfa Aesar. The support is then introduced into an empty SPE cartridge with a sinter. The solvent is removed without, however, drying the PVDF.
Introduction d'EBPS-Sol et rinçage de la résine Introduction of EBPS-Sol and rinsing the resin
Après introduction d'un volume V = 30 ml d'EBPS-Sol à lmg/ml dans une solution acétonitrile-eau (5 :95), on effectue un rinçage de la colonne avec 5 fois le volume V (150 ml) avec le mélange acétonitrile-eau (5:95).  After introduction of a volume V = 30 ml of EBPS-Sol at 1 mg / ml in an acetonitrile-water solution (5: 95), the column is rinsed with 5 times the volume V (150 ml) with the acetonitrile-water mixture (5:95).
Les fractions rassemblées Rv-Ads et Rinc ainsi obtenues sont ensuite concentrées par évaporation sous vide. Elle renferme le resvératrol et les oligomères autres que Γε-viniférine, Rv-Sec.  The collected fractions Rv-Ads and Rinc thus obtained are then concentrated by evaporation in vacuo. It contains resveratrol and oligomers other than Γε-viniferine, Rv-Sec.
Désorption de l 'ε-viniférine Desorption of ε-viniferine
Après l'étape de rinçage, on procède à l'étape de récupération des polyphénols adsorbés sur la résine, spécifiquement Γε-viniférine. Cette étape est effectuée en éluant Γε-viniférine avec un mélange acétonitrile-eau (95:5). Cette désorption peut-être également effectuée par un mélange méthanol-eau (50-50) ou acétone-eau (90 : 10). Le volume utilisé est 3 fois le volume V, soit ici 90 ml.  After the rinsing step, the step of recovering the polyphenols adsorbed on the resin, specifically Γε-viniferine, is carried out. This step is carried out eluting Γε-viniferine with an acetonitrile-water (95: 5) mixture. This desorption can also be carried out with a mixture of methanol-water (50-50) or acetone-water (90:10). The volume used is 3 times the volume V, here 90 ml.
Concentration Concentration
Les fractions Vf-Des sont réunies et concentrées par évaporation de l'acétonitrile sous vide, puis la phase aqueuse est lyophilisée pour livrer Γε-viniférine purifiée, Vf- Sec.  The fractions Vf-Des are combined and concentrated by evaporation of the acetonitrile under vacuum, then the aqueous phase is lyophilized to deliver purified viniferine, Vf-Sec.
Exemple A2 : filtration sur fritté Example A2: sintered filtration
Préparation du support  Preparation of the support
On conditionne le support PVDF (10g) dans 30 ml solvant CH3CN-H20 (15:85) sous agitation pendant 30 minutes. Le PVDF utilisé ici est commercialisé par Alfa Aesar. The PVDF support (10 g) is conditioned in 30 ml solvent CH 3 CN-H 2 O (15:85) with stirring for 30 minutes. The PVDF used here is marketed by Alfa Aesar.
Le support PVDF est filtré sur verre fritté n°4. Le support est ainsi prêt.  The PVDF support is filtered on sintered glass n ° 4. The support is thus ready.
On réalise une solution d' 1 mg/ml d'EBPS-Sol dans un mélange d' acétonitrile- eau (3:97).  A solution of 1 mg / ml EBPS-Sol is made in a mixture of acetonitrile-water (3:97).
Introduction d'EBPS-Sol et rinçage du support  Introduction of EBPS-Sol and rinsing of the support
30 ml d'EBPS-Sol sont mélangés avec le support PVDF (agitation mécanique : spatule, agitateur magnétique). Une fois que le mélange est bien homogène, le tout est filtré sur fritté n°4. Le support est ensuite rincé, avec dans cet exemple 30 ml du solvant A = CH3CN-H20 (3 :97). On réalise ce rinçage 5 fois pour bien éliminer les autres oligomères. 30 ml of EBPS-Sol are mixed with the PVDF support (mechanical stirring: spatula, magnetic stirrer). Once the mixture is homogeneous, the whole is filtered on sintered No. 4. The support is then rinsed with, in this example, 30 ml of the solvent A = CH 3 CN-H 2 O (3: 97). This rinsing is carried out 5 times in order to eliminate the other oligomers.
Les fractions Rv-Ads et Rinc ainsi obtenues sont rassemblées et concentrées par évaporation sous vide. La fraction obtenue renferme le resvératrol et les oligomères autres que Γε-viniférine, Rv-Sec.  The Rv-Ads and Rinc fractions thus obtained are combined and concentrated by evaporation under vacuum. The fraction obtained contains resveratrol and oligomers other than ε-viniferine, Rv-Sec.
Désorption de l 'ε-viniférine Desorption of ε-viniferine
Le support est ensuite agité avec dans cet exemple 30 ml du solvant B = CH3CN-H2O (95:5) avant d'être filtré. On réalise cette opération 3 fois. On récupère alors le dimère ε-viniférine Vf-Sec par évaporation du solvant B sous vide, ou après concentration partielle et lyophilisation de la solution aqueuse résultante. The support is then stirred with in this example 30 mL of the solvent B = CH 3 CN-H 2 O (95: 5) then filtered. This operation is carried out 3 times. The ε-viniferine Vf-Sec dimer is then recovered by evaporation of the solvent B under vacuum, or after partial concentration and lyophilization of the resulting aqueous solution.
Exemple A3 : filtration sur fritté Example A3: Sintered Filtration
Préparation du support  Preparation of the support
Le PVDF (400g/1000ml) est conditionné avec une solution acétone-eau (4:96) sous agitation pendant 30 minutes. Le PVDF utilisé ici est commercialisé par Alfa Aesar.  The PVDF (400 g / 1000 ml) is conditioned with an acetone-water solution (4:96) with stirring for 30 minutes. The PVDF used here is marketed by Alfa Aesar.
Le support PVDF est filtré sur verre fritté n°4. Le support est ainsi prêt.  The PVDF support is filtered on sintered glass n ° 4. The support is thus ready.
On réalise une solution d' 1 mg/ml d'EBPS-Sol dans un mélange d'acétone-eau (1 :99).  A solution of 1 mg / ml EBPS-Sol is prepared in a mixture of acetone-water (1: 99).
Introduction d'EBPS-Sol et rinçage du support  Introduction of EBPS-Sol and rinsing of the support
1000 ml d'EBPS-Sol sont mélangés avec le support PVDF (agitation mécanique : spatule, agitateur magnétique). Une fois que le mélange est bien homogène, le tout est filtré sur fritté n°4.  1000 ml of EBPS-Sol are mixed with the PVDF support (mechanical stirring: spatula, magnetic stirrer). Once the mixture is homogeneous, the whole is filtered on sintered No. 4.
Le support est ensuite rincé, avec dans cet exemple 1000 ml du solvant A = acétone-FLO (1 :99). On réalise ce rinçage 10 fois pour bien éliminer les autres oligomères.  The support is then rinsed, with in this example 1000 ml of solvent A = acetone-FLO (1: 99). This rinsing is carried out 10 times in order to eliminate the other oligomers.
Les fractions Rv-Ads et Rinc ainsi obtenues sont rassemblées et concentrées par évaporation sous vide. Elle renferme le resvératrol et les oligomères autres que Γε- viniférine, Rv-Sec Désorption de l 'ε-viniférine The Rv-Ads and Rinc fractions thus obtained are combined and concentrated by evaporation under vacuum. It contains resveratrol and oligomers other than Γε-viniferine, Rv-Sec Desorption of ε-viniferine
Le support est ensuite agité avec dans cet exemple 1000 ml du solvant B = acétone-H20 (90: 10) avant d'être filtré. On réalise cette opération 2 fois. On récupère alors le dimère ε-viniférine Vf-Sec par évaporation du solvant B sous vide, ou après concentration partielle et lyophilisation de la solution aqueuse résultante. The support is then stirred with in this example 1000 ml of solvent B = acetone-H 2 O (90:10) before being filtered. This operation is carried out twice. The ε-viniferine Vf-Sec dimer is then recovered by evaporation of the solvent B under vacuum, or after partial concentration and lyophilization of the resulting aqueous solution.
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La fraction A3-Rv-Sec renferme alors plus de 42% de la masse totale de resvératrol alors que la fraction A3-Vf-Sec contient plus de 51%> de la masse totale d's- viniférine. The A3-Rv-Sec fraction then contains more than 42% of the total mass of resveratrol whereas the A3-Vf-Sec fraction contains more than 51% of the total mass of s-viniferin.
Il en résulte un enrichissement supplémentaire en resvératrol dans la fraction A3-Rv-Sec avec un facteur de 4,5 ; et en ε-viniférine dans la fraction A3-Vf-Sec avec un facteur 6,8.  This results in additional enrichment of resveratrol in the A3-Rv-Sec fraction by a factor of 4.5; and ε-viniferin in the A3-Vf-Sec fraction with a factor of 6.8.
B : purification d'une phase aqueuse riche en polyphénols de type stilbénoïde : EBPS- Sol en utilisant de l'acétate d'éthyle comme solvant extractif. B: purification of an aqueous phase rich in polyphenols of stilbenoid type: EBPS-Sol using ethyl acetate as extractive solvent.
La solution aqueuse d'un extrait brut végétal de polyphénols de type stilbénoïde The aqueous solution of a crude vegetable extract of polyphenols of the stilbenoid type
EBPS-Sol est extraite par l'acétate d'éthyle. Il en résulte un enrichissement supplémentaire en resvératrol dans la phase acétate d'éthyle avec un facteur 4, et en ε- viniférine dans la phase aqueuse, avec un facteur 3. Exemple Bl : séparation liquide-liquide EBPS-Sol is extracted with ethyl acetate. This results in additional enrichment of resveratrol in the ethyl acetate phase with a factor of 4, and in ε-viniferine in the aqueous phase with a factor of 3. Example B1: liquid-liquid separation
lg d'extrait d'EBPS est dissous dans 500 ml d'une solution d'acétone-eau (2:98). On effectue ensuite une extraction liquide-liquide par l'acétate d'éthyle (AcOEt ci-après) (2 fois 500 ml). Les deux phases obtenues sont concentrées par évaporation sous vide et lyophilisées. La fraction organique obtenue Bl -Rv-Sec renferme alors plus de 56% de la masse totale de resvératrol alors que la fraction aqueuse obtenue Bl-Vf- Sec contient plus de 79% de la masse totale d'ε-viniférine. 1 g of EBPS extract is dissolved in 500 ml of acetone-water solution (2:98). Liquid-liquid extraction is then carried out with ethyl acetate (AcOEt hereinafter) (2 times 500 ml). The two phases obtained are concentrated by evaporation in vacuo and lyophilized. The organic fraction obtained Bl -Rv-Sec then contains more than 56% of the total mass of resveratrol while the aqueous fraction obtained Bl-Vf-Sec contains more than 79% of the total mass of ε-viniferine.
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Il en résulte un enrichissement supplémentaire en resvératrol dans la fraction Bl- Rv-Sec avec un facteur de 4,6 ; et en ε-viniférine dans la fraction Bl-Vf-Sec avec un facteur 1,8. Exemple B2 : séparation liquide-liquide This results in further enrichment of resveratrol in the Bl-Rv-Sec fraction by a factor of 4.6; and ε-viniferin in the Bl-Vf-Sec fraction with a factor of 1.8. Example B2: liquid-liquid separation
lg d'extrait d'EBPS est dissous dans 500 ml d'une solution d'éthanol-eau (2:98). On effectue ensuite une séparation liquide-liquide par l'acétate d'éthyle (2 fois 500 ml). Les deux phases obtenues sont concentrées par évaporation sous vide et lyophilisées. La fraction organique obtenue B2-Rv-Sec renferme alors plus de 55% de la masse totale de resvératrol alors que la phase aqueuse obtenue B2-Vf-Sec contient plus 70%) de la masse totale d'ε-viniférine.  1 g of EBPS extract is dissolved in 500 ml of an ethanol-water solution (2:98). Liquid-liquid separation is then carried out with ethyl acetate (2 times 500 ml). The two phases obtained are concentrated by evaporation in vacuo and lyophilized. The organic fraction obtained B2-Rv-Sec then contains more than 55% of the total mass of resveratrol while the aqueous phase obtained B2-Vf-Sec contains more than 70% of the total mass of ε-viniferine.
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Il en résulte un enrichissement supplémentaire en resvératrol dans la fraction B2- Rv-Sec avec un facteur de 4,6 ; et en ε-viniférine dans la fraction B2-Vf-Sec avec un facteur 2,2. Exemple B3 : séparation liquide-liquide
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This results in additional enrichment of resveratrol in the B2-Rv-Sec fraction with a factor of 4.6; and ε-viniferine in the B2-Vf-Sec fraction with a factor of 2.2. Example B3: liquid-liquid separation
lg d'extrait d'EBPS est dissous dans 500 ml d'une solution d'acétone-eau (2:98). On effectue ensuite une séparation liquide-liquide par l'acétate d'éthyle (2 fois 500 ml). Les deux phases organiques sont évaporées sous vide séparément et lyophilisées. La phase aqueuse obtenue est concentrée par évaporation sous vide et lyophilisée. La première fraction organique B3-Rv-Secl renferme alors plus de 43% de la masse totale de resvératrol alors que la phase aqueuse B3-Vf-Sec contient plus 67% de la masse totale d's-viniférine. La deuxième fraction organique B3-Rv-Sec2 ne renferme seulement que 4,6% de la masse totale d'EBPS déposé.  1 g of EBPS extract is dissolved in 500 ml of acetone-water solution (2:98). Liquid-liquid separation is then carried out with ethyl acetate (2 times 500 ml). The two organic phases are evaporated under vacuum separately and lyophilized. The aqueous phase obtained is concentrated by evaporation under vacuum and freeze-dried. The first organic fraction B3-Rv-Secl then contains more than 43% of the total mass of resveratrol while the aqueous phase B3-Vf-Sec contains more than 67% of the total mass of s-viniferine. The second organic fraction B3-Rv-Sec2 contains only 4.6% of the total mass of EBPS deposited.
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Il en résulte un enrichissement supplémentaire en resvératrol dans la fraction B3- Rv-Secl avec un facteur de 4 et dans la fraction B3-Rv-Sec2 avec un facteur de 2,7 ; et en ε-viniférine dans la fraction B3-Vf-Sec avec un facteur 3,2. This results in additional enrichment of resveratrol in the B3-Rv-Secl fraction by a factor of 4 and in the B3-Rv-Sec2 fraction by a factor of 2.7; and ε-viniferine in the B3-Vf-Sec fraction with a factor of 3.2.
Exemple B4 : séparation liquide-liquide Example B4: liquid-liquid separation
lg d'extrait d'EBPS est dissous dans 500 ml d'une solution d'acétone-eau (2:98). On effectue ensuite une séparation liquide-liquide par l'acétate d'éthyle (2 fois 500 ml). Les deux phases organiques, rassemblées sont évaporées sous vide et re- dissous dans 100ml d'une solution d'acétone-eau (2 :98). La solution est ensuite extraite par l'acétate d'éthyle. La fraction organique ainsi que les 2 phases aqueuses sont évaporées sous vide et lyophilisées. La fraction organique obtenue B4-Rv-Sec renferme plus de 50% de la masse totale de resvératrol alors que la phase aqueuse 1 obtenue, B4- Vf-Secl contient plus 57%> de la masse totale d's-viniférine. La phase aqueuse 2 obtenue, B4-Vf-Sec2 ne renferme moins de 1,6% de la masse totale d'EBPS déposé. 1 g of EBPS extract is dissolved in 500 ml of acetone-water solution (2:98). Liquid-liquid separation is then carried out with ethyl acetate (2 times 500 ml). The two combined organic phases are evaporated under vacuum and redissolved in 100 ml of a solution of acetone-water (2: 98). The solution is then extracted with ethyl acetate. The organic fraction as well as the 2 aqueous phases are evaporated under vacuum and lyophilized. The organic fraction obtained B4-Rv-Sec contains more than 50% of the total mass of resveratrol while the aqueous phase 1 obtained, B4-Vf-Secl contains more than 57%> of the total mass of s-viniferine. The aqueous phase 2 obtained, B4-Vf-Sec2 contains less than 1.6% of the total mass of EBPS deposited.
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Il en résulte un enrichissement supplémentaire en resvératrol dans la fraction B4- Rv-Sec avec un facteur de 3,7 ; et en ε-viniférine dans la fraction B4-Vf-Secl avec un facteur de 3,1 et dans la fraction B4-Vf-Sec2 avec un facteur de 5,4. Exemple B5 : séparation liquide-liquide
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This results in additional enrichment of resveratrol in the B4-Rv-Sec fraction by a factor of 3.7; and ε-viniferine in the B4-Vf-Secl fraction with a factor of 3.1 and in the B4-Vf-Sec2 fraction with a factor of 5.4. Example B5: liquid-liquid separation
lg d'extrait d'EBPS est dissous dans 500 ml d'une solution d'acétone-eau (2:98). On effectue ensuite une séparation liquide-liquide par l'acétate d'éthyle (4 fois 500 ml). Chacune des phases organiques ainsi que la phase aqueuse sont évaporées sous vide et lyophilisées. La première fraction organique obtenue, B5-Rv-Secl renferme plus de 45% de la masse totale de resvératrol alors que les trois autres phases organiques ne contiennent seulement au total 11% de la masse totale de resvératrol. La phase aqueuse B5-Vf-Sec contient plus 65%> de la masse totale d's-viniférine.  1 g of EBPS extract is dissolved in 500 ml of acetone-water solution (2:98). A liquid-liquid separation is then carried out with ethyl acetate (4 times 500 ml). Each of the organic phases as well as the aqueous phase are evaporated under vacuum and lyophilized. The first organic fraction obtained, B5-Rv-Sec1 contains more than 45% of the total mass of resveratrol while the other three organic phases contain only a total of 11% of the total mass of resveratrol. The aqueous phase B5-Vf-Sec contains more than 65% of the total mass of s-viniferine.
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II en résulte un enrichissement supplémentaire en resvératrol dans la fraction B5-
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This results in additional enrichment of resveratrol in the B5-
Rv-Secl avec un facteur de 3,4 ; et en ε-viniférine dans la fraction B5-Vf-Sec avec un facteur de 4,1. Rv-Secl with a factor of 3.4; and ε-viniferine in the B5-Vf-Sec fraction with a factor of 4.1.
Exemple B6 : séparation liquide-liquide à partir de sarments Example B6: liquid-liquid separation from shoots
Préparation de l 'extrait brut de sarments  Preparation of the raw extract of shoots
150g de sarments broyés de Vitis vinifera, cépage Merlot, récoltés dans le sud de la France (Gard, Languedoc Roussillon) en décembre 2011 sur des parcelles exploitées en agriculture biologique, sont macérés dans 1,2 litres d'éthanol (EtOH ci-après) distillé et agités à l'abri de la lumière pendant 1 nuit. Après fïltration, cette opération est réalisée 2 autres fois. Les 3 fractions sont rassemblées et le milieu est divisé en deux. La première partie est concentrée sous vide et lyophilisée, obtenant la fraction B6a-EBPS- Sec.  150g crushed shoots of Vitis vinifera, Merlot grape, harvested in the south of France (Gard, Languedoc Roussillon) in December 2011 on plots exploited in organic farming, are macerated in 1.2 liters of ethanol (EtOH below) ) distilled and stirred in the dark for 1 night. After filtration, this operation is performed 2 more times. The 3 fractions are pooled and the medium is divided in half. The first part is concentrated under vacuum and lyophilized, obtaining the fraction B6a-EBPS-Sec.
Partition de la phase aqueuse par l'acétate d'éthyle  Partition of the aqueous phase with ethyl acetate
Sur la deuxième partie, après évaporation sous vide de l'éthanol puis ajout d'eau, on effectue une séparation liquide- liquide par l'acétate d'éthyle (2 fois 250 ml). Les deux phases organiques, rassemblées sont évaporées sous vide, obtenant la fraction B6b-Rv-Sec, la phase eau est lyophilisée. La fraction organique B6b-Rv-Sec renferme plus de 60% de la masse totale de resvératrol alors que la fraction aqueuse B6b- contient plus 42% de la masse totale d'ε-viniférine. In the second part, after vacuum evaporation of the ethanol and addition of water, a liquid-liquid separation is carried out with ethyl acetate (twice 250 ml). The two organic phases, combined are evaporated under vacuum, obtaining the B6b-Rv-Sec fraction, the water phase is lyophilized. The organic fraction B6b-Rv-Sec contains more than 60% of the total mass of resveratrol whereas the aqueous fraction B6b- contains more than 42% of the total mass of ε-viniferine.
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Il en résulte un enrichissement supplémentaire en resvératrol dans la fraction B6b-Rv-Sec avec un facteur de 1,9 ; et en ε-viniférine dans la fraction B6b-Vf-Sec avec un facteur de 2,5. Exemple B7 : séparation liquide-liquide à partir de sarments
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This results in additional enrichment of resveratrol in the B6b-Rv-Sec fraction by a factor of 1.9; and ε-viniferine in the B6b-Vf-Sec fraction with a factor of 2.5. Example B7: liquid-liquid separation from shoots
Préparation de l 'extrait brut de sarments  Preparation of the raw extract of shoots
150g de sarments broyés de Vitis vinifera, cépage Ugni Blanc, récoltés dans le sud de la France (Gard, Languedoc Roussillon) en décembre 2011 sur des parcelles exploitées en agriculture biologique, sont macérés dans 1 litre d'éthanol absolu et agités, à l'abri de la lumière pendant 72 heures. Après fïltration sur coton, le milieu est divisé en deux. La première partie est concentrée sous vide et lyophilisée, obtenant la fraction B7a-EBPS-Sec.  150g crushed shoots of Vitis vinifera, grape Ugni Blanc, harvested in the south of France (Gard, Languedoc Roussillon) in December 2011 on plots exploited in organic farming, are macerated in 1 liter of absolute ethanol and agitated, protected from light for 72 hours. After filtration on cotton, the medium is divided in two. The first part is concentrated under vacuum and lyophilized, obtaining the fraction B7a-EBPS-Sec.
Partition de la phase aqueuse par l'acétate d'éthyle  Partition of the aqueous phase with ethyl acetate
Sur la deuxième partie, après évaporation sous vide de l'éthanol puis ajout d'eau, on effectue une séparation liquide- liquide par l'acétate d'éthyle (2 fois 250 ml). Les deux phases organiques, rassemblées sont évaporées sous vide, obtenant la fraction B7b-Rv-Sec, la phase eau est lyophilisée. La fraction organique B7b-Rv-Sec renferme plus de 68% de la masse totale de resvératrol alors que la fraction aqueuse B7b-Vf-Sec contient plus 58% de la masse totale d's-viniférine. In the second part, after vacuum evaporation of the ethanol and addition of water, a liquid-liquid separation is carried out with ethyl acetate (twice 250 ml). The two organic phases, combined are evaporated under vacuum, obtaining the B7b-Rv-Sec fraction, the water phase is lyophilized. The organic fraction B7b-Rv-Sec contains more than 68% of the total mass of resveratrol whereas the aqueous fraction B7b-Vf-Sec contains more than 58% of the total mass of s-viniferine.
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Il en résulte un enrichissement supplémentaire en resvératrol dans la fraction B7b-Rv-Sec avec un facteur de 2,2 ; et en ε-viniférine dans la fraction B7b-Vf-Sec avec un facteur de 1,8.
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This results in additional enrichment of resveratrol in the B7b-Rv-Sec fraction with a factor of 2.2; and ε-viniferin in the B7b-Vf-Sec fraction with a factor of 1.8.
Exemple B8 : séparation liquide-liquide à partir de sarments Example B8: liquid-liquid separation from shoots
Préparation de l 'extrait brut de sarments  Preparation of the raw extract of shoots
150g de sarments broyés de Vitis vinifera, cépage Merlot, récoltés dans le sud de la France (Gard, Languedoc Roussillon) en décembre 2011 sur des parcelles exploitées en agriculture biologique, sont macérés dans 1 ,2 litres d'éthanol distillé et agités, sous ultra-sons, à l'abri de la lumière pendant 15 minutes. Après fïltration, cette opération est réalisée 2 autres fois. Les 3 fractions sont rassemblées et le milieu est divisé en deux. La première partie est concentrée sous vide et lyophilisée, obtenant la fraction B8a-EBPS- Sec.  150g crushed shoots of Vitis vinifera, Merlot grape, harvested in the south of France (Gard, Languedoc Roussillon) in December 2011 on plots exploited in organic farming, are macerated in 1, 2 liters of ethanol distilled and agitated, under ultrasounds, protected from light for 15 minutes. After filtration, this operation is performed 2 more times. The 3 fractions are pooled and the medium is divided in half. The first part is concentrated under vacuum and lyophilized, obtaining the B8a-EBPS-Sec fraction.
Partition de la phase aqueuse par l'acétate d'éthyle  Partition of the aqueous phase with ethyl acetate
Sur la deuxième partie, après évaporation sous vide de l'éthanol puis ajout d'eau, on effectue une séparation liquide- liquide par l'acétate d'éthyle (2 fois 250 ml). Les deux phases organiques, rassemblées sont évaporées sous vide, obtenant la fraction B8b-Rv-Sec, la phase eau est lyophilisée. La fraction organique B8b-Rv-Sec renferme plus de 70% de la masse totale de resvératrol alors que la fraction aqueuse B8b-Vf-Sec contient plus 56% de la masse totale d's-viniférine. In the second part, after vacuum evaporation of the ethanol and addition of water, a liquid-liquid separation is carried out with ethyl acetate (twice 250 ml). The two organic phases, combined are evaporated under vacuum, obtaining the B8b-Rv-Sec fraction, the water phase is lyophilized. The organic fraction B8b-Rv-Sec contains more than 70% of the total mass of resveratrol while the aqueous fraction B8b-Vf-Sec contains more than 56% of the total mass of s-viniferine.
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Il en résulte un enrichissement supplémentaire en resvératrol dans la fraction B8b-Rv-Sec avec un facteur de 2,1 ; et en ε-viniférine dans la fraction B8b-Vf-Sec avec un facteur de 2,9. C : purification d'une phase aqueuse riche en polyphénols de type stilbénoïde : solution issue de la mise en œuvre du procédé faisant usage du polymère PVDF, en utilisant de l'acétate d'éthyle comme solvant extractif. This results in additional enrichment of resveratrol in the B8b-Rv-Sec fraction by a factor of 2.1; and ε-viniferin in the B8b-Vf-Sec fraction with a factor of 2.9. C: purification of an aqueous phase rich in polyphenols of the stilbenoid type: solution resulting from the implementation of the process making use of the PVDF polymer, using ethyl acetate as the extractive solvent.
Dans l'exemple Cl, la phase aqueuse issue d'une extraction liquide liquide par l'acétate d'éthyle (P-Aqu) est traitée par la mise en œuvre du procédé faisant usage du polymère PVDF. Il en résulte un enrichissement supplémentaire en ε-viniférine dans la phase aqueuse, avec un facteur 10.  In Example C1, the aqueous phase resulting from a liquid liquid extraction with ethyl acetate (P-Aqu) is treated by the implementation of the process making use of the PVDF polymer. This results in additional enrichment of ε-viniferine in the aqueous phase by a factor of 10.
Dans l'exemple C2, la phase aqueuse issue de la mise en œuvre du procédé faisant usage du polymère PVDF (Vf-Des) subit ensuite une extraction liquide liquide par l'acétate d'éthyle. Il en résulte un enrichissement supplémentaire en ε-viniférine dans la phase aqueuse, avec un facteur 14.  In Example C2, the aqueous phase resulting from the implementation of the process making use of the PVDF polymer (Vf-Des) is then subjected to a liquid liquid extraction with ethyl acetate. This results in additional enrichment of ε-viniferine in the aqueous phase by a factor of 14.
Exemple Cl : séparation liquide-liquide suivie d'une purification par PVDF sur fritté Example C1: liquid-liquid separation followed by purification by PVDF on sintered
Préparation du support  Preparation of the support
On conditionne le support PVDF (35g) dans 100 ml d'acétone-H20 (2:98) sous agitation pendant 30 minutes. Le PVDF utilisé ici est commercialisé par Alfa Aesar. Le support PVDF est filtré sur verre fritté n°4. Le support est ainsi prêt. The PVDF support (35 g) is conditioned in 100 ml of acetone-H 2 O (2:98) with stirring for 30 minutes. The PVDF used here is marketed by Alfa Aesar. The PVDF support is filtered on sintered glass n ° 4. The support is thus ready.
Préparation de la solution d'EBPS-Sol Preparation of the EBPS-Sol solution
lg d'extrait d'EBPS est dissous dans 500 ml d'une solution d'acétone-eau (2:98). 1 g of EBPS extract is dissolved in 500 ml of acetone-water solution (2:98).
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Partition de la phase aqueuse par l'acétate d'éthyle  Partition of the aqueous phase with ethyl acetate
L'EBPS-Sol est extraite 2 fois par un volume équivalent d'acétate d'éthyle. La phase acétate d'éthyle est concentrée sous vide et lyophilisée ou évaporée à siccité (Cl- Rv-Sec), alors que la phase aqueuse (Cl-P-Aqu) est traitée sur le support PVDF comme suit.  EBPS-Sol is extracted twice with an equivalent volume of ethyl acetate. The ethyl acetate phase is concentrated under vacuum and freeze-dried or evaporated to dryness (Cl-Rv-Sec), while the aqueous phase (Cl-P-Aqu) is treated on the PVDF support as follows.
Adsorption de la phase aqueuse sur la résine  Adsorption of the aqueous phase on the resin
La phase aqueuse (180ml) est mélangée avec le support PVDF (agitation mécanique). Une fois que le mélange est bien homogène, le tout est filtré sur fritté n°4. The aqueous phase (180 ml) is mixed with the PVDF support (mechanical stirring). Once the mixture is homogeneous, the whole is filtered on sintered No. 4.
Le support est ensuite rincé avec 2 fois 100 ml acétone-eau (2:98). The support is then rinsed with 2 times 100 ml acetone-water (2:98).
Désorption de l ' ε-viniférine  Desorption of ε-viniferine
Le support est ensuite agité avec 100 ml d'acétone-eau (90: 10) avant d'être filtré. On réalise une autre fois cette opération. On récupère alors une fraction riche en dimère ε-viniférine par évaporation du solvant sous vide, ou après concentration partielle et lyophilisation de la solution aqueuse résultante, notée Clc-Vf-Sec. Dans la phase organique (Cl-Rv-Sec), plus de 57% de la masse totale de resvératrol sont récupérés, alors que dans la fraction Clc-Vf-Sec, on isole plus de 47% de la masse totale de Γε-viniférine. The support is then stirred with 100 ml of acetone-water (90:10) before being filtered. This operation is performed again. A fraction rich in ε-viniferine dimer is then recovered by evaporation of the solvent under vacuum, or after partial concentration and lyophilization of the resulting aqueous solution, denoted Clc-Vf-Sec. In the organic phase (Cl-Rv-Sec), more than 57% of the total mass of resveratrol is recovered, whereas in the Clc-Vf-Sec fraction, more than 47% of the total mass of Γε-viniferine is isolated. .
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Il en résulte un enrichissement supplémentaire en resvératrol dans la fraction Cl- Rv-Sec avec un facteur de 3,5 ; et en ε-viniférine dans la fraction Clc-Vf-Sec avec un facteur de 9,7. This results in further enrichment of resveratrol in the Cl-Rv-Sec fraction by a factor of 3.5; and ε-viniferin in the Clc-Vf-Sec fraction with a factor of 9.7.
Exemple C2 : purification par PVDF sur fritté d'un extrait EBPS, suivi d'une séparation liquide-liquide de la phase aqueuse Example C2: Sintered PVDF purification of an EBPS extract, followed by a liquid-liquid separation of the aqueous phase
Préparation du support  Preparation of the support
On conditionne le support PVDF (50g) dans 500 ml d'acétone-H20 (2:98) sous agitation pendant 30 minutes. Le PVDF utilisé ici est commercialisé par Alfa Aesar. Le support PVDF est filtré sur verre fritté n°4. Le support est ainsi prêt. The PVDF support (50 g) is conditioned in 500 ml of acetone-H 2 O (2:98) with stirring for 30 minutes. The PVDF used here is marketed by Alfa Aesar. The PVDF support is filtered on sintered glass n ° 4. The support is thus ready.
Introduction d'EBPS-Sol et rinçage de la résine  Introduction of EBPS-Sol and rinsing the resin
Après introduction d'un volume V = 500 ml d'une solution d'EBPS-Sol à 2 mg/ml dans une solution acétone-eau (2:98), le milieu est mélangé avec le support PVDF (agitation mécanique). Une fois que le mélange est bien homogène, le tout est filtré sur fritté n°4 (fraction C2a-Rv-Ads). Le support est ensuite rincé avec 5 fois 100 ml acétone-eau (2:98) (fraction C2b-Rinc). Les fractions C2a-Rv-Ads et C2b-Rinc ainsi obtenues sont concentrées par évaporation sous vide. Elles renferment le resvératrol et les oligomères autres que Γε-viniférine, Rv-Sec. After introducing a volume V = 500 ml of a solution of EBPS-Sol at 2 mg / ml in an acetone-water solution (2:98), the medium is mixed with the PVDF support (mechanical stirring). Once the mixture is homogeneous, the whole is filtered on sinter No. 4 (fraction C2a-Rv-Ads). The support is then rinsed with 5 times 100 ml acetone-water (2:98) (C2b-Rinc fraction). The C2a-Rv-Ads and C2b-Rinc fractions thus obtained are concentrated by evaporation under vacuum. They contain resveratrol and oligomers other than Γε-viniferine, Rv-Sec.
Désorption de l ' ε-viniférine  Desorption of ε-viniferine
Le support est ensuite agité avec 100 ml d'acétone-eau (90: 10) avant d'être filtré. On réalise une autre fois cette opération. On récupère alors la fraction aqueuse riche en dimère ε-viniférine.  The support is then stirred with 100 ml of acetone-water (90:10) before being filtered. This operation is performed again. The aqueous fraction rich in ε-viniferine dimer is then recovered.
La fraction aqueuse est divisé en deux. La première partie est concentrée et lyophilisée (C2c-Vf-Sec). La deuxième partie subit une extraction liquide- liquide par l'acétate d'éthyle.  The aqueous fraction is divided in two. The first part is concentrated and lyophilized (C2c-Vf-Sec). The second part undergoes a liquid-liquid extraction with ethyl acetate.
Partition de la phase aqueuse par l'acétate d'éthyle  Partition of the aqueous phase with ethyl acetate
Sur la deuxième partie de la phase aqueuse, après évaporation sous vide de l'acétone, on effectue une séparation liquide- liquide par l'acétate d'éthyle (2 fois 100 ml). Les deux phases sont évaporées sous vide et lyophilisées, obtenant la fraction C2d, et la fraction C2d-Vf-Sec.  On the second part of the aqueous phase, after evaporation in vacuo of acetone, a liquid-liquid separation is carried out with ethyl acetate (twice 100 ml). The two phases are evaporated under vacuum and lyophilized, obtaining the C2d fraction, and the C2d-Vf-Sec fraction.
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uant t tota e , mg  uant t tota e, mg
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Il en résulte un enrichissement supplémentaire en resvératrol dans les fractions C2a-Rv-Sec et C2b-Rv-Sec avec un facteur, respectivement de 1,8 ; 3,2; et en ε- viniférine dans la fraction C2c-Vf-Sec avec un facteur de 5 et dans la fraction C2d-Vf- Sec de 17,2. This results in additional enrichment of resveratrol in the fractions C2a-Rv-Sec and C2b-Rv-Sec with a factor of 1.8, respectively; 3.2; and in ε- viniferine in the C2c-Vf-Sec fraction with a factor of 5 and in the C2d-Vf-Sec fraction of 17.2.
Application : Application :
L's- viniférine ainsi purifiée, dans le test de l'activité inhibitrice de la tyrosinase, s'est révélée être beaucoup plus active qu'elle ne l'avait été dans les conditions du brevet EP 1 519 709 de la Demanderesse portant sur des applications cosmétiques de polyphénols et de leurs dérivés.  The viniferin thus purified, in the test for tyrosinase inhibitory activity, has proved to be much more active than it had been under the conditions of the Applicant's patent EP 1 519 709 relating to applications polyphenol cosmetics and their derivatives.
L's- viniférine purifiée s'avère 4 fois plus active que l'acide kojique et 62 fois plus active que la vitamine C.  Purified viniferine is 4 times more active than kojic acid and 62 times more active than vitamin C.
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Les conditions expérimentales utilisées sont identiques à celles décrites précédemment dans le brevet EP mentionné plus haut.  The experimental conditions used are identical to those described previously in the EP patent mentioned above.

Claims

Revendications claims
1/ Procédé d'obtention d's-viniférine purifiée (Vf-Sec) et/ou de resvératrol appauvri voire exempt en ε-viniférine (Rv-Sec), à partir d'un extrait, brut (EBPS), sec (EBPS-sec), ou en solution (EBPS-Sol) d'une matière végétale riche en polyphénols de type stilbénoïde, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un cycle d'adsorption- désorption sur support solide de type poly(fluorure de vinylidène) ou PVDF avec EBPS-Sol, et/ou une partition de cette solution EBPS-Sol avec l'acétate d'éthyle. 1 / Process for obtaining purified s-viniferine (Vf-Sec) and / or resveratrol depleted or even free in ε-viniferine (Rv-Sec), from an extract, crude (EBPS), dry (EBPS-sec ), or in solution (EBPS-Sol) of a plant material rich in polyphenols of the stilbenoid type, characterized in that it comprises at least one adsorption-desorption cycle on a solid support of poly (vinylidene fluoride) type or PVDF with EBPS-Sol, and / or a partition of this EBPS-Sol solution with ethyl acetate.
21 Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que la solution EPBS-Sol utilisée dans l'étape d'adsorption sur ledit support solide est obtenue par dissolution de l'extrait sec (EBPS-Sec) dans un solvant capable de solubiliser la totalité des constituants et ne permettant pas la désorption de Γε-viniférine du PVDF.  Method according to claim 1, characterized in that the EPBS-Sol solution used in the adsorption step on said solid support is obtained by dissolving the dry extract (EBPS-Sec) in a solvent capable of solubilizing the totality constituents and not permitting the desorption of ε-viniferine from PVDF.
3/ Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le solvant est constitué uniquement par de l'acétate d'éthyle seul ou par un mélange dans lequel l'eau est majoritaire qui comprend un ou plusieurs solvants organiques, miscibles à l'eau, formant une seule phase.  3 / A method according to claim 2, characterized in that the solvent consists solely of ethyl acetate alone or by a mixture in which the majority of water comprises one or more organic solvents, miscible with water , forming a single phase.
4/ Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que des solvants appropriés comprennent l'acétonitrile, l'acétone, et/ou le méthanol.  4 / A method according to claim 3, characterized in that suitable solvents include acetonitrile, acetone, and / or methanol.
5/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, caractérisé en ce que lesdits solvants représentent au total 0,2 à 30%, le reste étant de l'eau.  5 / A method according to any one of claims 2 to 4, characterized in that said solvents represent in total 0.2 to 30%, the balance being water.
6/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la solution (EBBS-Sol) obtenue est soumise à une étape d'adsorption de Γε-viniférine par fïltration au travers du PVDF, lequel est rincé par plusieurs volumes du même solvant, les fractions de rinçage avec le filtrat constituant la solution enrichie en resvératrol (Rv-Ads et Rv-Rinc).  6 / A method according to any one of claims 1 to 5, characterized in that the solution (EBBS-Sol) obtained is subjected to a step of adsorption of Γε-viniferine by filtration through PVDF, which is rinsed by several volumes of the same solvent, the rinsing fractions with the filtrate constituting the solution enriched with resveratrol (Rv-Ads and Rv-Rinc).
7/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'étape de désorption de Γε-viniférine est réalisée à l'aide d'un solvant comportant, par rapport à l'eau, une plus grande proportion de solvant organique miscible à l'eau.  7 / A method according to any one of claims 1 to 6, characterized in that the deε-viniferine desorption step is carried out using a solvent having, with respect to water, a greater proportion of organic solvent miscible with water.
8/ Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le solvant utilisé pour la désorption est un mélange acétonitrile-eau (95:5), acétone-eau (90 : 10), ou de méthanol-eau (50:50) et dans le cas où l'acétate d'éthyle est utilisé comme seul solvant dans la phase d'adsorption, par un solvant polaire sans eau. 91 Procédé selon la revendication 7 ou 8, caractérisé en ce que les différents filtrats (Vf-Des) sont réunis et concentrés par évaporation de la part organique, ces étapes étant suivies d'une lyophilisation de la phase aqueuse, et dans le cas où l'acétate d'éthyle est utilisé comme seul solvant dans la phase d'adsorption, par évaporation à siccité, ce qui conduit, dans ces deux cas, à un extrait sec enrichi en ε-viniférine (Vf- Sec). 8 / A method according to claim 7, characterized in that the solvent used for the desorption is an acetonitrile-water mixture (95: 5), acetone-water (90:10), or methanol-water (50:50) and in the case where the ethyl acetate is used as sole solvent in the adsorption phase, by a polar solvent without water. Process according to Claim 7 or 8, characterized in that the various filtrates (Vf-Des) are combined and concentrated by evaporation from the organic part, these stages being followed by freeze-drying of the aqueous phase, and in the case where ethyl acetate is used as sole solvent in the adsorption phase, by evaporation to dryness, which leads, in these two cases, to a dry extract enriched in ε-viniferine (Vf-Sec).
10/ Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que par partition avec l'acétate d'éthyle, volume à volume de la solution aqueuse de l'extrait sec ou de l'extrait brut de polyphénols de type stilbénoïde, l'ε-viniférine est obtenue purifiée dans la phase aqueuse (P-Aqu) et le resvératrol dans la phase organique (P-Org).  10 / A method according to claim 1, characterized in that partitioning with ethyl acetate, volume to volume of the aqueous solution of dry extract or crude extract of stilbenoid type polyphenols, ε- viniferine is obtained purified in the aqueous phase (P-Aqu) and resveratrol in the organic phase (P-Org).
11/ En tant que nouveaux produits, l'ε-viniférine Vf et/ou le resvératrol Rv tels qu'obtenus par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, l'ε- viniférine présentant une pureté supérieure à 77%, en masse et pouvant atteindre pratiquement 100%), avec une activité inhibitrice de la tyrosine plus de 4 fois supérieure à celle de l'acide kojique et plus de 60 fois supérieure à celle de l'acide ascorbique, et resvératrol pratiquement pur à 100%.  11 / As new products, ε-viniferine Vf and / or resveratrol Rv as obtained by the method according to any one of claims 1 to 10, the ε-viniferine having a purity greater than 77% , by mass and up to almost 100%), with a tyrosine inhibitory activity more than 4 times greater than that of kojic acid and more than 60 times greater than that of ascorbic acid, and almost 100% pure resveratrol %.
12/ Application de l'ε-viniférine et /ou du resvératrol selon la revendication 11 en cosmétique ou en thérapeutique.  12 / Application of ε-viniferine and / or resveratrol according to claim 11 in cosmetics or in therapy.
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