WO2012133048A1 - 生体分子検出装置および生体分子検出方法 - Google Patents

生体分子検出装置および生体分子検出方法 Download PDF

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    • G01N33/587—Nanoparticles

Definitions

  • the present invention relates to a technology for detecting a detection target substance in a solution, and in particular, a biomolecule detection apparatus capable of detecting biomolecules, viruses, DNA, proteins, bacteria, etc. in a specimen such as blood and urine, and the like
  • the present invention relates to a biomolecule detection method.
  • the biomolecule detection method is a method that selectively detects only a substance to be detected from a bodily fluid having a plurality of components such as blood, urine, and sweat by high selectivity using a specific reaction such as an antigen-antibody reaction. is there.
  • a specific reaction such as an antigen-antibody reaction.
  • it is widely used for detection, inspection, quantification, analysis, and the like of biomolecules such as viruses, DNA, proteins, and bacteria.
  • Patent Document 1 discloses an analysis chip in which a phenomenon in which the absorption wavelength of localized surface plasmon resonance of metal fine particles (gold nanorods) fixed on a substrate is shifted due to specific binding is applied to a sensing technique.
  • Patent Document 2 discloses a detection element that improves detection sensitivity by aligning gold nanorods and fixing them to a substrate.
  • Patent Document 1 and Patent Document 2 has a problem that the processing cost for fixing the metal fine particles is high.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and an object thereof is to provide a biomolecule detection apparatus and a biomolecule detection method capable of measuring with high sensitivity without fixing metal fine particles to a substrate.
  • a biomolecule detection apparatus includes a first complex having a first substance that can specifically bind to a specific site on a biomolecule, a metal particle, and a fluorescent molecule, And a container holding a solution containing a second complex having a second substance capable of specifically binding to a site on the biomolecule different from the specific site, a metal particle, and a fluorescent molecule, and the first A third complex in which a complex is bound to the biomolecule via the first substance and the second complex is bound to the biomolecule via the second substance in the solution.
  • Irradiating the solution with light that has an orientation control means for aligning in two directions and a linearly polarized light component in a specific direction, and causes surface plasmon resonance in the metal particles of the first complex and the second complex.
  • a light source, the first composite, and the first A light receiving part for detecting fluorescence emitted from the fluorescent molecules of the first complex and the second complex by an electric field generated by surface plasmon resonance of the metal particles of the composite, and fluorescence detected by the light receiving part
  • a synchronous component extracting means for extracting a component synchronized with the period in which the third complex is oriented.
  • the detection target substance can be measured with high sensitivity with a simple configuration.
  • the reaction with the biomolecule in the solution is fast.
  • the alignment control means includes an alignment control polarized light source that irradiates the solution with light that is different from the light emitted from the light source and is linearly polarized, and a polarization axis of the light emitted from the alignment control polarized light source. It is preferable to comprise polarization axis rotating means for orienting the third complex in at least two directions in the solution by rotating the.
  • orientation control means When the orientation control means orients the third composite using light, pretreatment for orientation is unnecessary for the third composite. For example, when orientation control is performed using magnetism, it is necessary to bind magnetic particles or the like to the third composite, but when orientation is performed using light, such pretreatment is unnecessary. Further, when the third complex is oriented in the solution by rotating the polarization axis of light, it is not necessary to switch the orientation direction of the third complex by irradiating light from a plurality of directions.
  • the optical system of the control means can be made compact.
  • the orientation control light source irradiates light that is different from the light emitted from the light source and is linearly polarized from a plurality of positions.
  • the orientation direction of the third complex existing at various positions in the solution can be easily controlled.
  • the orientation control means switches the orientation control light source that irradiates the solution with light different from the light emitted from the light source, and the irradiation direction of the light emitted from the orientation control light source.
  • the said orientation control light source irradiates the several position of the said solution with the light different from the light irradiated from the said light source.
  • the orientation control means includes a first direction in which a major axis direction of the third complex and a vibration direction of light emitted from the light source are parallel, and a major axis of the third complex. It is preferable to orient the third complex in a second direction in which the direction and the vibration direction of light emitted from the light source are perpendicular to each other.
  • the orientation control means changes the orientation direction of the third complex at a predetermined time interval
  • the synchronous component extraction means determines the intensity of the fluorescence generated from the solution containing the third complex. It is desirable to extract a component synchronized with the period in which the third complex is oriented by measuring multiple times.
  • the fluorescence intensity is measured a plurality of times while the orientation direction of the third complex is changed at a predetermined time interval, and the measured fluorescence intensity is added and averaged or the like, It is possible to reduce the influence on the measurement accuracy due to the variation in the amount of light reduction.
  • the predetermined time interval is preferably a time interval at which the orientation of all the third composites present in the solution is completed.
  • the measurement is not performed until after the orientation of all the third composites is completed, and therefore the measurement can be performed in the shortest time.
  • the wavelength of light emitted from the light source is preferably a wavelength that is not absorbed by the fluorescent molecule. If the wavelength of the light emitted from the light source is not absorbed by the fluorescent molecule, the fluorescent molecule is excited only by the electric field generated by the surface plasmon resonance, so that the change in the intensity of the electric field is accurately reflected in the change in the intensity of the fluorescence.
  • the synchronous component extraction means uses the fact that the amount of fluorescence generated from the third complex changes due to the change in the orientation direction of the third complex, thereby aligning the third complex. It is preferable to extract a component that is synchronized with the period to be performed.
  • the solution is held in a container holding part having a flat surface at least partially.
  • the orientation control polarized light source irradiates light that is different from the light emitted from the light source and is linearly polarized in a direction of exiting from the plane of the container holding part through the solution, and It is preferable to focus light that is different from the light emitted from the light source and is linearly polarized at the interface between the solution and the plane.
  • the orientation control light source irradiates light different from the light emitted from the light source in a direction of passing through the solution and exiting from the plane of the container holding unit, and is different from the light emitted from the light source.
  • the light is focused at the interface between the solution and the plane.
  • the third complex can be rotated while being pressed against the wall surface of the container holding portion. This makes it easy to control the orientation.
  • a biomolecule detection method includes a first substance that can specifically bind to a specific site on a biomolecule contained in a specimen, a metal particle, and a fluorescent molecule.
  • a solution containing a first complex and a second complex having a second substance capable of specifically binding to a site on the biomolecule different from the specific site, a metal particle, and a fluorescent molecule, and a specimen A third step in which the first complex is bound to the biomolecule via the first substance, and the second complex is bound to the biomolecule via the second substance.
  • FIG. 1A is a schematic diagram of a first complex used in Embodiment 1
  • FIG. 1B is a schematic diagram of a second complex used in Embodiment 1
  • FIG. 1C is a diagram of the first complex and the second complex. It is a figure which shows the state which the composite_body
  • 3 is a schematic diagram showing an outline of an antigen-antibody reaction of the biomolecule detection apparatus according to Embodiment 1.
  • FIG. 3A is a diagram showing the intensity of an electric field generated around gold nanoparticles when the first complex existing alone is irradiated with excitation light.
  • FIG. 3A is a diagram showing the intensity of an electric field generated around gold nanoparticles when the first complex existing alone is irradiated with excitation light.
  • FIG. 3B is a diagram showing the intensity of the electric field generated around the gold nanoparticles when the third complex having the long axis in the Y-axis direction is irradiated with excitation light, as a gray image.
  • FIG. 3C is a grayscale image showing the intensity of the electric field generated around the gold nanoparticles when the third complex having the long axis in the X-axis direction is irradiated with excitation light.
  • 4A is an external perspective view of the biomolecule detection apparatus according to Embodiment 1
  • FIG. 4B is a view in which the open / close cover of the biomolecule detection apparatus according to Embodiment 1 is opened.
  • 2 is a functional block diagram showing a main configuration of a biomolecule detection apparatus according to Embodiment 1.
  • FIG. 1 is an external perspective view of the biomolecule detection apparatus according to Embodiment 1
  • FIG. 4B is a view in which the open / close cover of the biomolecule detection apparatus according to Embodiment 1 is opened
  • FIG. 6A is a diagram illustrating the orientation direction of the third composite when the polarization direction control unit passes the orientation control light.
  • FIG. 6B is a diagram illustrating the behavior of the third composite when the vibration direction of the orientation control light is switched by 90 degrees.
  • FIG. 6C is a diagram illustrating the orientation direction of the third composite when the vibration direction of the orientation control light is switched by 90 degrees. It is a figure which shows the position of the focus of orientation control light.
  • FIG. 8A is a diagram showing the relationship between the orientation direction of the third complex and the vibration direction of the excitation light when the polarization direction control unit passes the orientation control light
  • FIG. 8B shows the vibration direction of the orientation control light by 90 degrees.
  • FIG. 6 is a graph depicting an orientation control signal output by an FG during measurement, a light receiving unit output output by a light receiving unit, and a lock-in amplifier output output by a lock-in amplifier.
  • 10A is a schematic diagram showing another structure of the first complex
  • FIG. 10B is a schematic diagram showing another structure of the second complex
  • FIG. 10C is a schematic diagram showing another structure of the third complex.
  • FIG. 11A is a schematic diagram showing still another structure of the first complex
  • FIG. 11B is a schematic diagram showing still another structure of the second complex
  • FIG. 11C shows still another structure of the third complex.
  • FIG. 12A is a schematic diagram of the fourth complex used in Embodiment 2
  • FIG. 12B is a schematic diagram of the fifth complex used in Embodiment 2 of the present invention
  • FIG. 12C is the fourth complex and It is a figure which shows the state which the 5th complex couple
  • 6 is a schematic diagram showing an outline of an antigen-antibody reaction of the biomolecule detection apparatus according to Embodiment 2.
  • FIG. FIG. 6 is a block diagram illustrating a main configuration of a biomolecule detection apparatus according to Embodiment 2.
  • 6 is a schematic diagram illustrating a detailed configuration of a light receiving unit in a biomolecule detection apparatus according to Embodiment 2.
  • FIG. 16A is a graph showing an orientation control signal, a light-receiving unit output, and a lock-in amplifier output in several cycles when the third complex is measured in the biomolecule detection apparatus according to Embodiment 2.
  • FIG. 16B is a graph showing several cycles of the orientation control signal, the light receiving unit output, and the lock-in amplifier output when the sixth complex is measured in the biomolecule detection apparatus according to the second embodiment. It is a figure which shows the case where orientation control light is irradiated to many points of a reagent container. It is a figure which shows the structure of the light source part for orientation control for making orientation control light inject into multiple points. It is a figure which shows an example of the optical system for making orientation control light inject into multiple points. It is a figure which shows another example of the optical system for making orientation control light inject into multiple points. It is a figure which shows a micro lens array.
  • Embodiment 1 of the present invention in order to detect an antigen present in a solution, two types of fluorescent labels 20a and 20b that can specifically bind to two specific locations of the antigen are synthesized separately.
  • 1A is a schematic diagram of the fluorescent label 20a
  • FIG. 1B is a schematic diagram of the fluorescent label 20b. Since the fluorescent labels 20a and 20b are synthesized so as to include metal particles, they emit fluorescence when surface plasmon resonance occurs. In the present embodiment, these two types of fluorescent labels are introduced into a uniform solution and bound to the antigen, thereby detecting one specific type of antigen that is a detection target substance.
  • the fluorescent label shown in FIG. 1A will be referred to as a first complex 20a.
  • the first complex 20a covers the entire surface of a substantially spherical gold nanoparticle 8 having a diameter of 20 nm with a 10 nm thick metal quenching prevention film made of SiO 2, and a plurality of first antibodies 12 a are formed on the surface of the metal quenching prevention film.
  • a plurality of fluorescent molecules 14 and a plurality of BSA (Bovine serum albumin) 24 are combined.
  • the gold nanoparticles 8 are core-shell particles having Au as a core and a SiO2 shell.
  • the metal quenching prevention film is provided to prevent so-called metal quenching, in which the gold nanoparticles 8 and the fluorescent molecules 14 are close to each other and the energy excited by the fluorescent molecules 14 is taken away by the gold nanoparticles 8.
  • the metal quenching prevention film is not particularly clearly illustrated, and is not particularly clearly illustrated in the following drawings.
  • the first antibody 12a, the fluorescent molecule 14 and the BSA 24 are arranged without bias on the entire surface of the metal quenching prevention film.
  • the BSA 24 is bonded to prevent nonspecific adsorption, and prevents nonspecific adsorption other than the binding between the detection target substance and the antibody 12a.
  • the fluorescent label shown in FIG. 1B is referred to as a second complex 20b.
  • the second complex 20b covers the entire surface of the gold nanoparticle 8 having a diameter of 20 nm with a 10 nm thick metal quenching prevention film made of SiO 2, and a plurality of second antibodies 12 b and a plurality of second antibodies 12 b are formed on the surface of the metal quenching prevention film.
  • This is a complex in which a fluorescent molecule 14 and a plurality of BSAs 24 are combined.
  • the second antibody 12b, the fluorescent molecule 14 and the BSA 24 are arranged without bias on the entire surface of the metal quenching prevention film.
  • the first composite body 20a and the second composite body 20b have a shapeally isotropic configuration.
  • the first antibody 12a and the second antibody 12b are antibodies that react with specific parts of the antigen that is the detection target substance and bind to different positions.
  • MAB1129 Human ErbB2 / Her2 Antibody
  • BAF1129 Human ErbB2 / Her2 Biotinylated Antibody
  • ErbB2 / Her2 protein in plasma is detected as a detection target substance.
  • the ErbB2 / Her2 protein that is the detection target substance is hereinafter referred to as “antigen 18”.
  • Alexa Fluor 568 (trade name of Molecular Probes) was used as the fluorescent molecule 14. Alexa Fluor 568 has a peak at a wavelength of about 600 nm and emits fluorescence having a wavelength of about 550 nm to 700 nm.
  • the first complex 20a and the second complex 20b have the same kind of fluorescent molecules 14.
  • a method for creating the first complex 20a will be described.
  • biotinylation of the first antibody 12a is performed.
  • One-Step Antibody Biotinylation Kit of Miltenyi Biotec is used.
  • Au colloidal solution-SC particle size 20 nm made by Tanaka Kikinzoku as gold nanoparticles 8
  • particles having a SiO2 shell with Au as a core are manufactured by a micromixer method.
  • core-shell particles in which the entire surface of the gold nanoparticle 8 is covered with the SiO2 film can be created.
  • Any known method can be used to fix avidin to SiO2.
  • the first antibody 12a is immobilized on the metal quenching prevention film via the avidin-biotin bond.
  • the molar concentrations of the particles and the antibody are mixed at an equal ratio and left for 1 hour.
  • fluorescent molecules are fixed on the metal quenching prevention film.
  • the fluorescent molecule is immobilized using the protocol attached to the succinimidyl ester reactive group dye kit of Molecular Probes.
  • A9418-10G manufactured by SIGMA-ALDRICH is used.
  • A9418-10G is adjusted to a concentration that is 100 times the molar concentration of gold nanoparticles 8 with MillQ, and A9418-10G and gold nanoparticles 8 are mixed and left for 1 hour, so that the surface of the metal quenching prevention film is formed by BSA24. Is blocked to complete the first composite 20a.
  • the second complex 20b is created in the same procedure.
  • the method of fixing the fluorescent dye on the surface of the gold nanoparticle having the shell of SiO 2 is shown.
  • gold nanoparticles labeled with avidin may be used.
  • the first antibody 12a and the second antibody 12b used in the present embodiment are antibodies for detecting the antigen 18 by performing a so-called sandwich method. Therefore, these antibodies recognize and bind to antigen 18 with different epitopes. That is, the first antibody 12a and the second antibody 12b specifically bind to different positions of the antigen 18. Further, the first antibody 12a and the second antibody 12b bind to distant positions on the steric structure of the antigen 18 so as not to cause steric hindrance.
  • the figure of the 1st antibody 12a and the 2nd antibody 12b in FIG. 1A and FIG. 1B represents having couple
  • FIG. 1C is a diagram showing a case where both the first complex 20a and the second complex 20b are bound to the antigen 18.
  • a complex in which both the first complex 20a and the second complex 20b are bound to the antigen 18 as shown in this figure is referred to as a third complex 22.
  • FIG. 1C in order to clearly show that the first antibody 12a and the second antibody 12b specifically bind to different positions of the antigen 18, each of the first antibody 12a and the second antibody 12b is shown.
  • Antigen 18 is shown by a figure having a convex shape matched with the concave shape. The actual antigen 18 does not have such a shape.
  • the first antibody 12a and the second antibody 12b are antibodies for performing a sandwich method with respect to the antigen 18, both the first complex 20a and the second complex 20b bind to the antigen 18.
  • the first complex 20a and the second complex 20b bind to the opposite positions with the antigen 18 in between. That is, the third complex 22 has a structure in which the first complex 20a, the antigen 18, and the second complex 20b are aligned in a straight line.
  • the third composite 22 is a composite having anisotropy in shape.
  • the direction in which the first complex 20a, the antigen 18, and the second complex 20b are arranged is referred to as the major axis direction, and the direction perpendicular to the major axis direction is referred to as the minor axis direction.
  • the distance between the gold nanoparticles 8 included in the first composite 22a and the gold nanoparticles 8 included in the second composite 22b is approximately 30 nm.
  • FIG. 2A and 2B are schematic diagrams showing an outline of an antigen-antibody reaction in the biomolecule detection apparatus according to the present embodiment.
  • FIG. 2A shows the state before the antigen-antibody reaction.
  • the reagent container 10 has a quadrangular prism-shaped outer shape, and has a reagent holding portion including a quadrangular prism-shaped concave portion having an open top surface.
  • the reagent holding part which is not exposed to the outside is indicated by a broken line.
  • a plurality of dried first composite bodies 20a and second composite bodies 20b are placed in the reagent holding section.
  • the specimen is plasma 16 separated from whole blood.
  • the plasma 16 is dispensed into the reagent container 10 and stirred, when the antigen 18 that specifically binds to the first antibody 12a and the second antibody 12b is present in the plasma 16, the first antibody 12a and the second antibody 12b are mixed.
  • the antigen-antibody reaction occurs between the second antibody 12b and the antigen 18, and a third complex 22 is formed as shown in FIG. 2B.
  • first complex 20a and the second complex 20b are contained in a sufficiently large amount with respect to the antigen 18, some of the first complex 20a and the second complex 20b are antigen antibodies. It remains in the plasma 16 without reacting. That is, the first complex 20a, the second complex 20b, and the third complex 22 are mixed in the plasma 16 mixed with the first complex 20a and the second complex 20b.
  • components other than the antigen 18 exist in the plasma 16, components other than the antigen 18 are omitted in FIGS. 2A and 2B for the sake of simplicity.
  • the biomolecule detection apparatus 100 excites the plasma 16 in which the first complex 20a, the second complex 20b, and the third complex 22 are mixed by being in a liquid phase. Irradiating light, generating surface plasmon resonance between the excitation light and the gold nanoparticle 8, causing the fluorescent molecule 14 to emit light by an electric field generated by the surface plasmon resonance, and measuring fluorescence generated from the plasma 16. To detect and quantify the antigen 18. Therefore, it is desirable to detect only the fluorescence generated from the third complex 22 including the antigen 18, but the first complex 20a, the second complex 20b, and the third complex 22 are contained in the plasma 16.
  • the biomolecule detection apparatus 100 detects the fluorescence while switching the orientation direction of the third complex 22 with light, and the third complex is selected from the total fluorescence data based on the change in the fluorescence intensity accompanying the switching of the orientation. The contribution of fluorescence generated from the fluorescent molecules associated with the body 22 is calculated.
  • FIGS. 3A to 3C are diagrams showing the intensity of an electric field generated by surface plasmon resonance between the excitation light 119 and the gold nanoparticle 8 by using gray images.
  • the X axis and the Y axis represent positions.
  • the concentration represents the strength of the electric field, and the higher the concentration, the stronger the electric field at that position.
  • FIG. 3A shows the intensity of the electric field generated around the gold nanoparticle 8 when the first composite 20a present alone is irradiated with the excitation light 119 traveling in the Y-axis direction while vibrating in the X-axis direction.
  • FIG. The first composite 20a exists at the center of the gray image.
  • an electric field is generated in the X-axis direction around the gold nanoparticle 8. That is, an electric field is generated in the same direction as the vibration direction of the excitation light 119 that generates surface plasmon resonance. This electric field is strongest in the vicinity of the surface of the gold nanoparticle 8 and becomes weaker as the distance from the gold nanoparticle 8 increases.
  • the fluorescent molecules 14 existing on the surface of the gold nanoparticles 8 are excited by the generated electric field to generate fluorescence.
  • the first composite 20a that exists alone has no anisotropy in shape, and the fluorescent molecules 14 are bonded to the entire surface of the metal quenching prevention film without bias, so that the fluorescence generated even when the orientation is changed. There is no big change in quantity.
  • complex 20b is not illustrated, it becomes the same intensity distribution as the 1st composite_body
  • FIG. 3B shows the periphery of the gold nanoparticle 8 when the third composite 22 having the major axis direction in the Y-axis direction is irradiated with the excitation light 119 that vibrates in the Y-axis direction while vibrating in the X-axis direction.
  • an electric field is generated in the X-axis direction around the gold nanoparticle 8.
  • the strength of each electric field is almost the same as the case where the first complex 20a or the second complex 20b is present alone. Therefore, the amount of fluorescence generated by the first complex 20a or the second complex 20b is also substantially the same as when the first complex 20a or the second complex 20b is present alone.
  • FIG. 3C shows the periphery of the gold nanoparticle 8 when the third complex 22 having the major axis direction in the X-axis direction is irradiated with the excitation light 119 that vibrates in the X-axis direction and proceeds in the Y-axis direction.
  • the intensity of this electric field is about 20 times that of FIG. 3B.
  • the fluorescent molecule 14 existing between the gold nanoparticle 8 included in the first composite 20a and the gold nanoparticle 8 included in the second composite 20b on the surface of the metal quenching prevention film is excited by a very strong electric field. And generate strong fluorescence. Therefore, the amount of fluorescence generated by the third complex 22 is increased as compared to the case of FIG. 3B. That is, when the excitation light 119 traveling in the Y-axis direction while oscillating in the X-axis direction is irradiated, the third complex 22 changes when the major axis direction of the third complex 22 changes from the Y-axis direction to the X-axis direction. The amount of fluorescence generated from 22 increases.
  • the biomolecule detection apparatus 100 periodically changes the orientation direction of the third molecule with light, and detects only the fluorescence signal synchronized with this period, whereby the third complex is detected.
  • the amount of fluorescence generated from 22 is calculated.
  • the first composite body 20a and the second composite body 20b do not have anisotropy in shape, so that they are not oriented even when irradiated with light.
  • the first complex 20a and the second complex 20b rotate by Brownian motion, but the amount of fluorescence emitted does not change even when the direction changes, and therefore the period for changing the orientation direction of the third molecule. Does not generate fluorescence synchronized with the. Therefore, even in the plasma 16 in which the first complex 20a, the second complex 20b, and the third complex 22 are mixed, the contribution of fluorescence generated from the third complex 22 can be calculated. it can.
  • FIG. 4A is an external perspective view of the biomolecule detection apparatus 100.
  • a display unit 102 On the side surface of the biomolecule detection apparatus 100, there are a display unit 102, a user input unit 104, and an open / close cover 106.
  • the display unit 102 displays measurement results and the like.
  • the user input unit 104 performs mode setting, sample information input, and the like.
  • the open / close cover 106 is configured to be openable and closable, and is opened when the sample is set and closed when the measurement is performed. With this configuration, external light is prevented from affecting the measurement.
  • FIG. 4B is an external perspective view of the biomolecule detection apparatus 100 when the opening / closing cover 106 is opened.
  • the reagent container 10 and the holding table 110 are inside.
  • the reagent container 10 is held on a holding table 110 and is detachable from the holding table 110.
  • the reagent container 10 is a quadrangular columnar container for containing a solution.
  • the user dispenses the sample into the reagent container 10 and closes the upper lid to perform measurement.
  • the biomolecule detection apparatus 100 has a reagent tank and a dispensing unit. When measurement is started, the dispensing unit sucks up the reagent from the reagent tank and dispenses it into the reagent container 10.
  • FIG. 5 is a functional block diagram for explaining the main configuration of the biomolecule detection apparatus 100.
  • the biomolecule detection apparatus 100 includes a display unit 102, a user input unit 104, a reagent container 10, a reagent tank 112, a dispensing unit 114, an orientation control light source unit 116, an excitation light source unit 118, a polarization direction control unit 120, an FG (Function).
  • the reagent container 10 is a container for reacting a reagent stored in the reagent tank 112 with a sample collected from a patient or the like.
  • the reagent container 10 is detachable from the biomolecule detection apparatus 100.
  • the capacity of the reagent container 10 is about 120 ⁇ L.
  • the reagent tank 112 is a tank that stores a plurality of types of reagents.
  • the first complex 20a and the second complex 20b are stored in the reagent tank 112 as reagents.
  • the dispensing unit 114 is configured by a detachable pipette or a suction device. In accordance with an instruction from the CPU 132, the dispensing unit 114 sucks up the reagent used for measurement from the reagent tank 112 with a pipette and dispenses it into the reagent container 10.
  • the orientation control light source unit 116 is a light source that irradiates the orientation control light 117 linearly polarized by an internal polarizer toward the polarization direction control unit 120.
  • linearly polarized light refers to light in which the vibration direction of light is constant and the plane of polarization does not change.
  • the plane in which the traveling direction and vibration direction of linearly polarized light exist is called a polarization plane, and the vibration direction of linearly polarized light is called a polarization axis.
  • the orientation control light source unit 116 orients the third complex 22 by applying an external force to the third complex 22 existing in the solution in the reagent container 10 with the orientation control light 117.
  • orientation control light 117 for example, a laser having a wavelength of 909 nm and an output of 700 mW is used.
  • the orientation control light 117 is a laser having a wavelength that the fluorescent molecule 14 does not absorb, and does not affect the pigment of the fluorescent molecule 14 being broken.
  • the orientation control light 117 has a width that illuminates the entire solution in the reagent container 10.
  • the external force due to the orientation control light 117 is generated as a reaction when the orientation control light 117 strikes the third composite 22 and is scattered.
  • the third composite 22 is a composite having anisotropy in shape. Therefore, when the alignment control light 117 hits the third complex 22, the third complex 22 rotates so that the reaction to the alignment control light 117 becomes smaller. As a result, the major axis direction of the third composite 22 and the vibration direction of the orientation control light 117 become parallel. Since the time when this parallel relationship is reached is the most stable state in terms of energy, the rotation of the third composite 22 stops here.
  • the third composite 22 is dispersed in a random direction in the solution when the orientation control light 117 is not irradiated, but rotates when the orientation control light 117 is irradiated. It stops at a position where the major axis direction is parallel to the vibration direction of the orientation control light 117.
  • the first composite 20a and the second composite 20b are not oriented because they do not have anisotropy in shape.
  • the polarization direction control unit 120 switches the orientation direction of the third complex 22 by switching the vibration direction of the orientation control light 117.
  • the polarization direction control unit 120 includes a ⁇ / 2 wavelength plate.
  • the ⁇ / 2 wavelength plate is a phase plate having a function of changing the optical path difference of polarized light oscillating in a vertical direction by 1 ⁇ 2 wavelength, and is used for rotating the polarization plane of light.
  • Light linearly polarized in a direction parallel to the optical axis direction of the ⁇ / 2 wavelength plate passes through the ⁇ / 2 wavelength plate, but is linearly polarized in a direction that forms an angle of 45 degrees with the optical axis direction of the ⁇ / 2 wavelength plate.
  • the vibration direction of light changes by 90 degrees.
  • the polarization direction control unit 120 receives the signal from the FG 122, rotates the ⁇ / 2 wavelength plate, and switches the vibration direction of the orientation control light 117 by 90 degrees. In other words, the vibration direction of the orientation control light 117 is determined by the voltage signal generated by the FG 122.
  • the polarization direction control unit 120 passes the orientation control light 117 when a 0V signal is output from the FG 122, and switches the vibration direction of the orientation control light 117 by 90 degrees when a 5V signal is output from the FG 122.
  • a signal output from the FG 122 to the orientation control unit 120 is referred to as an orientation control signal.
  • the excitation light source unit 118 is a light source that irradiates the excitation light 119 linearly polarized by a polarizer provided therein from the bottom surface of the reagent container 10 upward.
  • the excitation light source unit 118 irradiates the excitation light 119 to generate surface plasmon resonance between the excitation light 119 and the gold nanoparticles 8.
  • As the excitation light 119 light having a wavelength of 635 nm and an output of 10 mW is used.
  • the FG 122 is a device that can generate voltage signals having various frequencies and waveforms.
  • the FG 122 receives a command output from the CPU 132 and outputs a voltage signal to the polarization direction control unit 120, the lock-in amplifier 127, and the sampling clock generation unit 130.
  • the CPU 132 controls the timing at which the polarization direction control unit 120 switches the traveling direction of the orientation control light 117 by designating the orientation control signal output to the FG 122.
  • the light receiving unit 124 is configured by a filter, a photodiode, or the like.
  • the light receiving unit 124 is provided at the lower part of the reagent container 10, receives fluorescence 123 generated from the fluorescent molecules 14 in the reagent container 10 at the lower part of the reagent container 10, converts it into an analog electric signal, and outputs it to the amplification unit 126.
  • the filter inside the light receiving unit 124 is a filter that cuts light having a wavelength other than fluorescence generated from the fluorescent molecules 14.
  • the amplifying unit 126 amplifies the analog fluorescence data output from the light receiving unit 124 and outputs the amplified data to the lock-in amplifier 127.
  • the lock-in amplifier 127 converts the analog fluorescence data to a direct current.
  • the lock-in amplifier 127 receives a square wave as a reference signal from the FG 122.
  • the lock-in amplifier 127 detects a frequency component equal to the reference signal from the analog fluorescence data output from the amplification unit 126. Specifically, the lock-in amplifier 127 converts only a frequency component equal to the reference signal into a DC signal by synchronous detection, and passes only the DC signal through a low-pass filter provided therein.
  • the lock-in amplifier 127 outputs a DC signal to the A / D conversion unit 128.
  • the sampling clock generation unit 130 inputs a sampling clock that specifies the timing at which the A / D conversion unit 128 samples the analog fluorescence data to the A / D conversion unit 128 based on the voltage signal input from the FG 122.
  • the A / D converter 128 samples the analog fluorescence data output from the lock-in amplifier 127 based on the sampling clock output from the sampling clock generator 130, converts it to digital data, and outputs the digital data to the CPU 132.
  • the CPU 132 calculates the digital data output from the A / D conversion unit 128 and outputs the result to the display unit 102. Further, the CPU 132 receives an input from the user input unit 104 and issues an instruction command for operations of the orientation control light source unit 116, the excitation light source unit 118, the dispensing unit 114, and the FG 122. Specifically, an ON / OFF command for the orientation control light source unit 116 and the excitation light source unit 118, a command for specifying a reagent to be used and a dispensing operation start command for the dispensing unit 114, and an output for the FG 122 A command instruction and an output command for a signal waveform to be performed are performed.
  • FIGS. 6A to 6C are diagrams showing the orientation direction of the third composite 22 with respect to the vibration direction of the orientation control light 117.
  • FIG. The change in the orientation direction of the third composite 22 when the vibration direction of the orientation control light 117 is changed will be described with reference to these drawings.
  • the first composite 20a is omitted.
  • FIG. 6A is a diagram showing the orientation direction of the third composite 22 when the polarization direction control unit 120 passes the orientation control light 117.
  • the orientation control signal is 0 V and the orientation control light 117 oscillating in the vertical direction on the paper passes through the polarization direction control unit 120 and enters the reagent container 10, the third complex 22 is oriented in the major axis direction.
  • the control light 117 is oriented in the same direction as the vibration direction.
  • the first complex 20a and the second complex 20b mixed in the plasma 16 are not oriented because the shapes are isotropic.
  • FIG. 6B is a diagram illustrating the behavior of the third composite 22 when the vibration direction of the orientation control light 117 is switched by 90 degrees and the vibration direction of the orientation control light 117 is changed in a direction perpendicular to the paper surface.
  • the orientation control signal changes from 0V to 5V
  • the polarization direction control unit 120 switches the vibration direction of the orientation control light 117 from the vertical direction on the paper surface to the direction perpendicular to the paper surface.
  • the orientation control light 117 oscillating in a direction perpendicular to the paper surface is incident on the reagent container 10
  • the third complex 22 performs a rotational motion so that the major axis direction is parallel to the vibration direction of the orientation control light 117.
  • the first complex 20a and the second complex 20b that are mixed in the plasma 16 are isotropic in shape and therefore do not rotate.
  • FIG. 6C is a diagram illustrating the orientation direction of the third composite 22 when a 5V signal is output from the FG 122 and the polarization direction control unit 120 changes the vibration direction of the orientation control light 117 by 90 degrees. Also in this case, the third composite 22 is oriented with the major axis direction in the same direction as the vibration direction of the orientation control light 117. On the other hand, the first complex 20a and the second complex 20b mixed in the plasma 16 are not oriented because the shapes are isotropic.
  • the biomolecule detection apparatus 100 outputs the orientation control signal from the FG 122 to switch the direction of the ⁇ / 2 wavelength plate included in the polarization direction control unit 120, whereby the vibration direction of the orientation control light 117, that is, the third The orientation direction of the composite 22 can be switched between two directions that are 90 degrees different from each other.
  • FIG. 7 is a diagram showing the position of the focus of the orientation control light 117.
  • the orientation control light 117 enters the lens 108 and forms a focal point 117 a at the interface between the plasma 16 and the inner wall surface 10 a of the reagent container 10.
  • the position of the focus of the orientation control light orients the third composite 22 with the strongest force of the orientation control light. Accordingly, when the orientation control light is incident as shown in FIGS. 6A to 6C, the orientation control light 117 presses the third composite against the inner wall surface 10a at the position of the focal point 117a, and more efficiently the third composite.
  • the body 22 can be oriented.
  • the orientation direction of the third composite 22 can be changed at the position of the focal point 117a.
  • the second composite body 20b and the third composite body 22 are shown at positions away from the inner wall surface 10a for easy understanding.
  • the reagent holding portion does not necessarily have a quadrangular prism shape, and the same effect can be obtained as long as it has at least a flat surface. That is, if the alignment control light is irradiated so as to focus at the interface between the plane and the solution, the third composite moves sideways and does not come out of the alignment control light, but is pressed against the plane and aligned. Is done.
  • FIGS. 8A and 8B are diagrams showing the vibration direction of the excitation light 119 with respect to the orientation direction of the third complex 22.
  • FIG. 8A is a diagram showing a relationship between the orientation direction of the third complex and the vibration direction of the excitation light when the polarization direction control unit passes the orientation control light.
  • the excitation light 119 advances toward the upper side of the paper while oscillating in a direction perpendicular to the paper surface and enters the plasma 16.
  • the vibration direction of the excitation light 119 is the vertical direction of the page.
  • the relationship between the vibration direction of the excitation light 119 and the orientation direction of the third complex 22 is the same as that in FIG. 3B. Therefore, the intensity of the electric field generated by the surface plasmon resonance between the excitation light 119 and the third complex 22 is the same as that in FIG. 3B.
  • FIG. 8B is a diagram showing the relationship between the orientation direction of the third complex and the vibration direction of the excitation light when the vibration direction of the orientation control light is switched by 90 degrees.
  • the excitation light 119 advances toward the upper side of the paper while being oscillated in a direction perpendicular to the paper surface, and enters the plasma 16 relative to the side view of the reagent container 10.
  • the vibration direction of the excitation light 119 is the vertical direction of the paper surface.
  • the relationship between the vibration direction of the excitation light 119 and the orientation direction of the third complex 22 is the same as in FIG. 3C.
  • the intensity of the electric field generated by surface plasmon resonance between the excitation light 119 and the third complex 22 is the same as that in FIG. 3C. Therefore, when the orientation control signal changes from 0V to 5V, the amount of fluorescence generated from the third complex 22 increases. On the other hand, the amount of fluorescence generated from the first complex 20a and the second complex 20b is constant regardless of the orientation control signal. 8A to 8B, the second composite 20b and the third composite 22 are shown at positions away from the inner wall surface 10a for easy understanding.
  • the biomolecule detection apparatus 100 changes the orientation direction of the third complex 22 in synchronization with the orientation control signal, and changes the fluorescence intensity generated from the third complex 22 in synchronization with the orientation control signal. Let If the period of the reference signal input to the lock-in amplifier 127 is the same as that of the orientation control signal, the contribution of the fluorescence generated from the third complex 22 can be detected from the fluorescence generated from the whole plasma 16. it can.
  • FIG. 9 shows an example of the orientation control signal output by the FG 122 during measurement, the light receiving unit output output by the light receiving unit 124 during measurement, and the lock-in amplifier output output by the lock-in amplifier 127 during measurement.
  • graphs are schematically shown for the light receiving unit output and the lock-in amplifier output.
  • the orientation control signal output from the FG 122 is 0 V before measurement.
  • the orientation control signal is a square wave having a period of 2T that outputs a signal of 5 V from 0 to T (seconds) and outputs a 0 V signal from T to 2 T (seconds).
  • the biomolecule detection apparatus 100 sets the orientation control signal to 5 V at time T1 and irradiates the reagent container 10 with excitation light.
  • the orientation control signal is 5V
  • the polarization direction control unit 120 switches the vibration direction of the orientation control light 117.
  • the light receiving unit When the excitation light 119 is irradiated to the plasma 16 at time T1, the light receiving unit output outputs the value iz.
  • the light receiving unit output iz is a total sum of fluorescence generated by the fluorescent molecules 14 included in the first complex 20a, the second complex 20b, and the third complex 22 included in the plasma 16.
  • the vibration direction of the orientation control light 117 is switched at time T1
  • the orientation direction of the third composite 22 is switched, and the electric field between the two gold nanoparticles 8 included in the third composite 22 is enhanced.
  • the light receiving unit output also increases from iz.
  • the switching of the orientation direction of all the third complexes 22 in the plasma 16 is completed, the light receiving unit output is saturated at the value it.
  • the orientation control signal becomes 0V after the output of 5V continues for T seconds.
  • This T seconds takes a period longer than the switching of the orientation direction of at least all the third composites 22, that is, a period longer than the light receiving unit output is saturated at the value it.
  • the orientation control signal changes from 5V to 0V.
  • the orientation control signal changes from 5V to 0V, the orientation direction of the third composite 22 is switched, and the electric field between the two gold nanoparticles 8 included in the third composite 22 becomes weak. For this reason, the light receiving unit output gradually decreases to iz.
  • the light receiving unit output also increases and becomes saturated at the value it.
  • the period during which the orientation control signal was set to 0 V was set to the same T seconds as the period during which the orientation control signal was set to 5 V. This is because the time required to complete the switching of the orientation direction of the third complex 22 in the plasma 16 under the condition that the output of the orientation control light 117 is constant is when the orientation control signal is changed from 0V to 5V. This is because it takes almost the same time when the orientation control signal is changed from 5V to 0V.
  • the lock-in amplifier 127 detects a component that increases or decreases in synchronization with the reference signal from the input signal.
  • a signal having the same period as the orientation control signal is input to the lock-in amplifier 127 as a reference signal. That is, the lock-in amplifier 127 detects a component synchronized with the orientation control signal from the light receiving unit output.
  • the light receiving unit output is a periodic signal having a period of 2T as in the case of the orientation control signal. However, what contributes to the periodic component of the light receiving unit output is the third complex oriented by the orientation control signal. Fluorescent molecule 14 associated with 22.
  • the lock-in amplifier 127 when a component synchronized with the orientation control signal is detected by the lock-in amplifier 127, it is possible to detect the contribution by the third complex 22 from the light receiving unit output.
  • the lock-in amplifier output is initially an unstable output that repeatedly increases and decreases, but gradually converges to the value S.
  • the value S is the light receiving unit output based on the fluorescence generated by the fluorescent molecules 14 associated with all the third complexes 22 in the plasma 16.
  • the CPU 132 calculates the concentration C of the detection target substance from the lock-in amplifier output S. Specifically, it is obtained by the following equation (1).
  • C f (S) (1)
  • f (S) is a calibration curve function.
  • the biomolecule detection apparatus 100 has a calibration curve function different for each measurement item in advance, and converts the measurement value S into a diagnostic value C.
  • the CPU 132 outputs the obtained diagnostic value C to the display unit 102.
  • the orientation direction of the third complex 22 existing in the plasma 16 by switching the vibration direction of the orientation control light 117 It was set as the structure which can be switched.
  • the orientation directions of the third complex 22 by the orientation control light 117 are two directions in which the strength of the electric field generated between the two gold nanoparticles 8 included in the third complex 22 by surface plasmon resonance is greatly different. . Therefore, the intensity of the fluorescence generated from the third complex 22 varies greatly depending on the change in the orientation direction of the third complex 22.
  • Is detected by the lock-in amplifier 127, and the fluorescence contribution accompanying the third complex aligned by the alignment control light 117 can be calculated, and the concentration of the detection target substance can be accurately measured with a simple configuration. can do.
  • the biomolecule detection apparatus 100 uses the random motion called Brownian motion for measurement because the orientation of the third complex 22 is controlled in the same direction by the external force by the orientation control light 117. Compared to the case, it is possible to perform highly sensitive measurement.
  • the orientation direction of the third complex 22 starts to change due to switching of the vibration direction of the orientation control light, and the time required to complete the change is the volume of the third complex 22, the viscosity of the solvent, the solution And the ease of rotation of the third composite 22 in the solution.
  • the time required to complete the switching of the orientation direction of the third complex 22 becomes longer.
  • the time required to complete the switching of the orientation direction of the third composite 22 can be determined based on the light receiving unit output. For example, in FIG. 9, the third complex 22 is obtained by subtracting the time T1 when the orientation control signal is first set to 5 V from the time T2 when the light receiving unit output reaches the maximum value, that is, performing T2-T1. The time required to complete the switching of the orientation direction can be obtained.
  • a laser having a wavelength of 909 nm and an output of 700 mW is used as the orientation control light 117, but the orientation control light 117 is not limited to this laser. It is desirable to determine the wavelength and output intensity of the orientation control light 117 based on the volume, mass, etc., of the third composite 22 and the ease of rotation in the solution caused by these.
  • the wavelength of the orientation control light 117 may be anything as long as it does not affect the third composite 22 fluorescence measurement.
  • the output of the orientation control light 117 is desirably set to an output that does not adversely affect the complex such as the third complex 22.
  • the orientation control light 117 does not necessarily have to be output to orient the third composite.
  • the third complex and the sixth complex have Brownian motion in the solution, and the intensity of the generated fluorescence changes even when the orientation direction is not switched.
  • the orientation control light 117 having such intensity that the third complex or the sixth complex is not oriented is irradiated, the third complex or the sixth complex is inhibited from Brownian motion.
  • the excitation light 119 light having a wavelength of 635 nm and an output of 10 mW is used as the excitation light 119, but the light used for the excitation light 119 is not limited to this light.
  • the wavelength of the excitation light 119 may be any wavelength that causes surface plasmon resonance with the gold nanoparticles 8, but it is desirable to use light in a wavelength band that does not directly excite the fluorescent molecules 14.
  • the output of the excitation light 119 may be anything as long as it causes surface plasmon resonance with the gold nanoparticle 8 and the fluorescence generated by the generated electric field has an intensity that can be detected by the light receiving unit 124. . On the other hand, it is desirable that the output does not adversely affect the third composite 22 or the like.
  • the excitation light source unit 118 may be configured by a combination of a lamp and an interference filter.
  • the first complex 20a has a structure in which the first antibody 12a, the fluorescent molecule 14, and the BSA 24 are bonded to the entire surface of the metal quenching prevention film without any deviation.
  • One complex does not necessarily have such a structure.
  • the second complex does not necessarily have a structure as described in Embodiment Mode 1.
  • the third complex generated by combining the first complex and the second complex with the detection target substance does not necessarily have the structure described in the first embodiment.
  • FIG. 10A is a schematic diagram showing another structure of the first complex.
  • the first complex 26a includes a BSA 24 that is uniformly bonded to the entire gold nanoparticle 8, a first antibody 12a that is singly bonded to the gold nanoparticle 8, and a plurality of fluorescence that is bonded to the first antibody 12a. It is composed of molecules 14. Such an antibody labeled with a fluorescent molecule is called a fluorescent dye-labeled antibody.
  • the difference between the first complex 26a and the first complex 20a is that the first antibody 12a bound to the gold nanoparticle 8 is singular, and the fluorescent molecule 14 is bound to the first antibody 12a. And that no metal quenching prevention film is provided on the gold nanoparticle 8.
  • the distance between the gold nanoparticle and the fluorescent dye can be separated by several nm to 15 nm, so that the metal quenching of some of the fluorescent dyes labeled with the antibody is prevented.
  • particles having a special structure such as a SiO2 shell.
  • the number of gold nanoparticles 8 and the number of the fluorescent dye-labeled antibodies are mixed in substantially the same number. Then, only one fluorescent dye-labeled antibody binds to the gold nanoparticle 8.
  • FIG. 10B is a schematic diagram showing another structure of the second complex.
  • the second composite 26b includes gold nanoparticles 8, the BSA 24 that is uniformly bonded to the entire surface of the gold nanoparticles 8, the second antibody 12b that is bonded alone to the gold nanoparticles 8, and the second antibody. And a plurality of fluorescent molecules 14 bonded to 12b.
  • the difference between the first complex 26b and the first complex 20b is that the second antibody 12b bound to the gold nanoparticle 8 is single, and the fluorescent molecule 14 is bound to the second antibody 12b. And that no metal quenching prevention film is provided on the gold nanoparticle 8.
  • the first complex 26a and the second complex 26b are obtained by using a fluorescent-labeled antibody instead of a normal antibody as gold nanoparticles 8 and a 20-nm diameter nanoparticulate nanoparts 20 nanoparts. If -PN-20 is used, it can be prepared by the same procedure as the first complex 20a.
  • the fluorescently labeled antibody is prepared using an Alexa protein labeling kit manufactured by Molecular Probes.
  • FIG. 10C is a schematic diagram showing another structure of the third complex.
  • a third complex 28 is generated. Since the fluorescent molecules 14 of the first complex 26a and the second complex 26b are respectively bound to the first antibody 12a or the second antibody 12b, in the third complex 28, the first molecule The fluorescent molecules 14 exist only between the gold nanoparticles 8 included in the composite 26a and the gold nanoparticles 8 included in the second composite 26b.
  • the absolute amount of the fluorescent molecule 14 is reduced as compared with the third complex 22. Therefore, the amount of fluorescence generated by a single third complex is also reduced.
  • the electric field generated along with the surface plasmon resonance is mainly caused by the change in the orientation direction of the third complex, and the gold nanoparticles 8 and the first complex included in the first complex.
  • the third complex 28 is accompanied by surface plasmon resonance. Only the intensity of fluorescence reflecting the intensity of the generated electric field is generated. That is, since the change in the orientation direction of the third complex 28 is more accurately reflected on the fluorescence intensity, the measurement accuracy can be improved.
  • FIGS. 11A and 11B show another example of the first complex and the second complex that form the third complex in which the fluorescent molecule exists only at the position where the intensity of the electric field changes with the change in the orientation direction.
  • FIG. 11A is a schematic diagram showing another structure of the first complex.
  • the first complex 32a is bonded to the gold nanorod 30, the BSA 24 bonded to the entire surface of the gold nanorod 30 without bias, the first antibody 12a bonded to the gold nanorod 30 alone, and the first antibody 12a.
  • a plurality of fluorescent molecules 14 formed.
  • the difference between the first composite 32 a and the first composite 26 a is that the gold nanorod 30 is used instead of the gold nanoparticle 8.
  • the gold nanorod 30 is a gold nanoparticle having a columnar shape.
  • the gold nanorods 30 having a minor axis of about 10 nm and a major axis of about 50 nm are used.
  • FIG. 11B is a schematic diagram showing another structure of the second complex.
  • the second complex 32b is bonded to the gold nanorod 30, the BSA 24 bonded to the entire surface of the gold nanorod 30 without bias, the second antibody 12b bonded to the gold nanorod 30 alone, and the second antibody 12b. And a plurality of fluorescent molecules 14 formed.
  • the difference between the second composite 32b and the second composite 26b is that the gold nanorod 30 is used instead of the gold nanoparticle 8.
  • the first complex 32a and the second complex 32b can be obtained by using a fluorescently labeled antibody instead of a normal antibody, and using a gold nanorod labeled with avidin instead of a gold nanoparticle. The same procedure can be used.
  • FIG. 11C is a schematic diagram showing another structure of the third complex.
  • a third complex 34 is generated. Since the fluorescent molecules 14 of the first complex 32a and the second complex 32b are bound to the first antibody 12a or the second antibody 12b, respectively, in the third complex 32, the first The fluorescent molecules 14 exist only between the gold nanoparticles 8 included in the complex 32a and the gold nanoparticles 8 included in the second complex 32b. Even if the same measurement as in Embodiment 1 is performed using the first complex 32a and the second complex 32b having such a configuration, the first complex 28a and the second complex 28b are used. Similar to the case where measurement is performed, the accuracy of measurement can be improved.
  • the fluorescent molecule 14 is sufficiently separated from the surface of the gold nanorod 30, so that a metal quenching prevention film or the like is provided on the gold nanorod 30. Metal quenching can be prevented.
  • Embodiment 2 In Embodiment 2, four types of complexes are used to detect two specific types of antigens that are detection target substances in a uniform solution. Two of the four types of composites are the same as the first composite 20a and the second composite 20b described in Embodiment 1, and thus the description thereof is omitted. The remaining two types of complexes used in the present embodiment, the fourth complex and the fifth complex, will be described.
  • FIG. 12A is a schematic diagram of the fourth composite 20c.
  • the fourth complex 20c covers the entire surface of a substantially spherical gold nanoparticle 8 having a diameter of 20 nm with a 10 nm thick metal quenching prevention film made of SiO 2, and has a plurality of third antibodies 12 c on the surface of the metal quenching prevention film.
  • a plurality of fluorescent molecules 36 and a plurality of BSAs 24 are combined.
  • the third antibody 12c, the fluorescent molecule 36, and the BSA 24 are uniformly bonded to the entire surface of the metal quenching prevention film included in the fourth complex 20c. That is, the fourth complex 20c is different from the first complex 20a in the types of antibodies and fluorescent molecules.
  • FIG. 12B is a schematic diagram of the fifth complex 20d used in Embodiment 1 of the present invention.
  • the fifth complex 20d covers the entire surface of the gold nanoparticle 8 having a diameter of 20 nm with a metal quenching prevention film made of SiO 2 and having a thickness of 10 nm, and the surface of the metal quenching prevention film includes a plurality of fourth antibodies 12d and a plurality of antibodies.
  • a fluorescent molecule 36 and a plurality of BSAs 24 are combined.
  • the fourth antibody 12d fluorescent molecule 36 and the BSA 24 are uniformly bonded to the entire surface of the metal quenching prevention film included in the fifth complex 20d. That is, the fifth complex 20d is different from the first complex 20a in the types of antibodies and fluorescent molecules.
  • the fourth complex 20c and the fifth complex 20d have an isotropic shape in the same manner as the first complex 20a and the second complex 20b.
  • the third antibody 12c and the fourth antibody 12d are antibodies that react with specific parts of the antigen that is the detection target substance and bind to different positions.
  • MAB4128 Human CEACAM-5 Antibody manufactured by R & D SYSTEMS was used as the third antibody 12c
  • MAB4128 Human CEACAM-5 manufactured by R & D SYSTEMS was used as the fourth antibody 12d.
  • two kinds of antigens of ErbB2 / Her2 protein and CEA protein in plasma are detected as detection target substances.
  • the ErbB2 / Her2 protein which is the detection target substance
  • the CEA protein which is the detection target substance
  • antigen 40 the CEA protein, which is the detection target substance.
  • the first antibody 12a, the second antibody 12b, the third antibody 12c, and the fourth antibody 12d used in the present embodiment are antibodies for detecting an antigen by performing a so-called sandwich method. Therefore, these antibodies recognize and bind to antigens with different epitopes. That is, the first antibody 12a and the second antibody 12b specifically bind to different positions of the antigen 18. The third antibody 12c and the fourth antibody 12d specifically bind to different positions of the antigen 40.
  • the first antibody 12a and the second antibody 12b, and the third antibody 12c and the fourth antibody 12d bind to distant positions on the three-dimensional structure of the antigen so as not to be sterically hindered from each other.
  • the third antibody 12c and the fourth antibody 12d in FIG. 12A and FIG. 12B show different concavo-convex shapes to indicate that they bind to different positions of the antigen.
  • the 12c and the fourth antibody 12d do not necessarily have such a shape.
  • Alexa Fluor 647 (trade name of Molecular Probes) was used as the fluorescent molecule 36. Alexa Fluor 647 has a peak at a wavelength of about 670 nm and emits fluorescence having a wavelength of about 620 nm-750 nm.
  • the fourth complex 20c and the fifth complex 20d have the same kind of fluorescent molecules 36. The fourth complex 20c and the fifth complex 20d are created by the same procedure as that for the first complex 20a.
  • FIG. 12C is a diagram showing a case where both the fourth complex 20 c and the fifth complex 20 d are bound to the antigen 40.
  • a complex in which both the fourth complex 20c and the fifth complex 20d are bound to the antigen 40 as shown in this figure is referred to as a sixth complex 38.
  • the uneven shapes of the third antibody 12c and the fourth antibody 12d respectively.
  • the antigen 40 is shown by the figure which has the uneven
  • the sixth complex 38 has a structure in which the fourth complex 20c, the antigen 40, and the fifth complex 20d are arranged in a straight line.
  • the direction in which the fourth complex 20c, the antigen 40, and the fifth complex 20d are arranged is referred to as the major axis direction, and the direction perpendicular to the major axis direction is referred to as the minor axis direction.
  • the distance between the gold nanoparticles 8 included in the fourth composite 22c and the gold nanoparticles 8 included in the fifth composite 22d is approximately 30 nm.
  • FIGS. 13A and 13B are schematic diagrams showing an outline of an antigen-antibody reaction in the biomolecule detection apparatus according to the present embodiment.
  • FIG. 13A shows the state before the antigen-antibody reaction.
  • the reagent holding part which is not exposed to the outside is indicated by a broken line.
  • a plurality of dried first composite body 20a, second composite body 20b, fourth composite body 20c, and fifth composite body 20d are placed in the reagent holding unit.
  • the sample is plasma 16 separated from whole blood as in the first embodiment.
  • the plasma 16 is dispensed into the reagent container 10 and stirred, when the antigen 18 that specifically binds to the first antibody 12a and the second antibody 12b is present in the plasma 16, the first antibody 12a and the second antibody 12b are mixed.
  • the antigen-antibody reaction occurs between the second antibody 12b and the antigen 18, and a third complex 22 is formed as shown in FIG. 2B.
  • the antigen 40 that specifically binds to the third antibody 12c and the fourth antibody 12d is present in the plasma 16, the antigen between the third antibody 12c and the fourth antibody 12d and the antigen 40
  • An antibody reaction occurs and a sixth complex 38 is formed as shown in FIG. 2B.
  • the first complex 20a, the second complex 20b, the fourth complex 20c, and the fifth complex 20d are contained in a sufficiently large amount with respect to the antigen 18 and the antigen 40.
  • Part of the first complex 20a, the second complex 20b, the fourth complex 20c, and the fifth complex 20d remains in the plasma 16 without undergoing an antigen-antibody reaction. That is, in the plasma 16 mixed with the first complex 20a, the second complex 20b, the fourth complex 20c, and the fifth complex 20d, the first complex 20a and the second complex 20b, the third complex 22, the fourth complex 20c, the fifth complex 20d, and the sixth complex 38 are mixed.
  • components other than antigen 18 and antigen 40 are also present in plasma 16, components other than antigen 18 and antigen 40 are omitted in FIGS. 13A and 13B for the sake of simplicity.
  • the biomolecule detection apparatus 200 Since the biomolecule detection apparatus 200 according to the present embodiment is in a liquid phase, the first complex 20a, the second complex 20b, the third complex 22, the fourth complex 20c, and the fifth
  • the plasma 16 in which the complex 20d and the sixth complex 38 are mixed is irradiated with excitation light, and surface plasmon resonance is generated between the excitation light and the gold nanoparticle 8 and is generated by surface plasmon resonance.
  • the fluorescent molecule 14 and the fluorescent molecule 36 are caused to emit light by an electric field, and the fluorescence generated from the plasma 16 is measured to detect and quantify the antigen 18 or the antigen 40.
  • FIG. 14 is a functional block diagram for explaining the main configuration of the biomolecule detection apparatus 200.
  • symbol is attached
  • the biomolecule detection apparatus 200 is mainly different from the configuration of the biomolecule detection apparatus 100 in a CPU 202 and a light receiving unit 204.
  • the CPU 202 calculates the digital data sent from the A / D conversion unit 128 and outputs the result to the display unit 102. In addition, the CPU 202 receives an input from the user input unit 104 and issues an instruction command for operations of the orientation control light source unit 116, the excitation light source unit 118, the dispensing unit 114, the FG 122, and the light receiving unit 204.
  • an ON / OFF command for the orientation control light source unit 116 and the excitation light source unit 118 a command for specifying a reagent to be used and a dispensing operation start command for the dispensing unit 114, and an output for the FG 122
  • a signal switching instruction is issued to the signal waveform instruction command and output command, and the light receiving unit 204.
  • the light receiving unit 204 is a light receiving unit that detects fluorescence generated from the fluorescent molecules in the reagent container 10.
  • the light receiving unit 204 is configured to receive the fluorescent light of the fluorescent molecules 14 and the fluorescent molecules 36 by receiving a command (S1) from the CPU 208.
  • FIG. 15 is a schematic diagram illustrating a detailed configuration of the light receiving unit 204 in the biomolecule detection apparatus 200 according to the second embodiment.
  • the light receiving unit 204 includes a lens 206, a lens 216, a filter switching unit 208, and a polarizer 214.
  • the fluorescence generated from the fluorescent molecules 14 and the fluorescent molecules 36 in the reagent container 10 is collected by the lens 206, and enters the photodiode 218 through the filter switching unit 208, the polarizer 214, and the lens 216.
  • the filter switching unit 208 includes two types of filters, a filter 210 and a filter 212.
  • the two types of filters are movable, and the filter through which the fluorescence condensed by the lens 206 passes can be switched.
  • the filter switching unit 208 receives a command S1 from the CPU 202 and switches a filter through which fluorescence passes.
  • the filter 210 is a band-pass filter that transmits only light in the wavelength band where the fluorescent molecules 14 are generated.
  • the filter 212 is a band-pass filter that transmits only light in the wavelength band generated by the fluorescent molecules 36.
  • the filter switching unit 208 performs the measurement by positioning the filter 210 in the fluorescence optical path when measuring the antigen 18 in accordance with the instruction S1 from the CPU 202, and positions the filter 212 in the fluorescence optical path when measuring the antigen 40. And measure.
  • the light receiving unit 204 prevents light generated from other than the complex including the detection target substance from reaching the photodiode 218. Note that it is not always necessary to use a filter. For example, spectroscopy may be performed using a diffraction grating or the like.
  • the polarizer 214 transmits only light polarized in the same direction as the polarization direction of the excitation light 119.
  • the excitation light 119 scattered in the reagent container 10 and the fluorescence emitted from the fluorescent molecule 14 or the fluorescent molecule 36 in the middle of switching the orientation direction are different in polarization direction from the polarization direction of the original excitation light. 146 cannot be transmitted.
  • the PD 218 is configured by an APD (Avalanche Photodiode), receives the fluorescence collected by the lens 216, generates a charge corresponding to the intensity of the fluorescence, and outputs it to the amplification unit 126.
  • APD Anavalanche Photodiode
  • the measurement operation of the biomolecule detection apparatus 200 is basically the same as the measurement operation of the biomolecule detection apparatus 100 described in the first embodiment, but differs in small points. Since the reason why only the fluorescence generated from the complex containing the detection target substance can be separated has been described in the first embodiment, here, the third complex 22 and the sixth complex each containing two kinds of detection target substances. 38 will be described separately.
  • the biomolecule detection apparatus 200 first determines whether to detect the antigen 18 or the antigen 40 first. This can be arbitrarily determined by the user through the user input unit 104 or the like. Here, the third complex 22 having the antigen 18 is detected first.
  • the CPU 202 issues a command to instruct the filter switching unit 208 in the light receiving unit 204 to use the filter 210.
  • the filter switching unit 208 receives a command from the CPU 202 and moves the filter 210 to a position where the light collected by the lens 206 passes.
  • the orientation control signal changes to 5 V and the excitation light 119 is irradiated toward the reagent container 10
  • the fluorescent molecules 14 and the fluorescent molecules 36 in the solution generate fluorescence.
  • the fluorescence generated from the fluorescent molecules 14 and the fluorescent molecules 36 is collected by the lens 206 and enters the filter 210. Since the filter 210 transmits only light in the wavelength band generated by the fluorescent molecules 14, almost all the fluorescence generated from the fluorescent molecules 36 is blocked. In this way, the light receiving unit 204 can detect only the fluorescence generated from the fluorescent molecules 14.
  • FIG. 16A shows the output of the light receiving unit as a result of measuring the number of cycles of the orientation control signal by the biomolecule detection apparatus 200 and detecting the fluorescence generated from the fluorescent molecules 14.
  • the light receiving unit output outputs a signal having the same cycle as the orientation control signal.
  • the lock-in amplifier detects a component synchronized with the orientation control signal from the light receiving unit output, and outputs a value S1.
  • the CPU 202 calculates the concentration of the antigen 18 from the obtained value S1. Specifically, the measured value S1 is converted to the concentration C1 using the calibration curve function f1 (S) as in the first embodiment. The CPU 202 outputs the obtained density C1 to the display unit 102.
  • the biomolecule detection apparatus 200 measures the sixth complex 38 having the antigen 40.
  • the CPU 202 issues a command to instruct the filter switching unit 208 in the light receiving unit 204 to use the filter 212.
  • the filter switching unit 208 receives a command from the CPU 202 and moves the filter 212 to a position where the light collected by the lens 206 passes. Since the filter 212 transmits only light in the wavelength band generated by the fluorescent molecules 36, almost all the fluorescence generated from the fluorescent molecules 14 is blocked. In this way, the light receiving unit 204 can detect only the fluorescence generated from the fluorescent molecules 36.
  • FIG. 16B shows the light receiving unit output as a result of the measurement of several cycles of the orientation control signal by the biomolecule detection apparatus 200 and the detection of the fluorescence generated from the fluorescent molecule 36.
  • FIGS. 16A and 16B graphs are schematically shown for easy calculation.
  • the light receiving unit output outputs a signal having the same cycle as the orientation control signal.
  • the switching timing of the orientation control signal when measuring the sixth complex 38 is different from that when measuring the third complex 22. This is because the volume and mass of the third complex 22 and the sixth complex 38 are different, and the time required for each complex to complete alignment is different.
  • the maximum value and the minimum value of the light receiving unit output are different between the case where the third complex 22 is measured and the case where the sixth complex 38 is measured. This is due to the difference in the concentration of the third complex 22 and the sixth complex 38 in the solution.
  • the CPU 202 obtains the concentration of the antigen 40 from the obtained value S2. Specifically, the measured value S2 is converted into the concentration C2 using the calibration curve function f2 (S). The CPU 202 outputs the obtained density C2 to the display unit 102.
  • the biomolecule detection apparatus 200 in addition to the configuration of the biomolecule detection apparatus 100 described in Embodiment 1, it specifically binds to the detection target substance.
  • Four types of complexes and two types of fluorescent molecules were used as substances, and the filter switching unit 208 was configured to be able to switch between two types of filters. Therefore, by using a filter corresponding to the fluorescent molecule attached to the complex containing the detection target substance, only the fluorescence generated from the fluorescent molecule attached to the complex containing the detection target substance can be detected. It is possible to accurately measure the concentrations of the two types of detection target substances contained in the specimen.
  • Alexa Fluor 568 and Alexa Fluor 647 are used as fluorescent molecules, but the fluorescent molecules to be used are not limited to these. If a complex that specifically binds to multiple detection target substances is labeled with a different fluorescent molecule, and each fluorescent wavelength, excitation wavelength, or fluorescent lifetime is separated to the extent that it can be separated by a filter, good.
  • the sandwich method is performed with two types of complexes that specifically bind to each detection target substance, labeled with different fluorescent molecules, and the fluorescence generated from each fluorescent molecule is converted into each fluorescence.
  • each detection target substance can be separated and detected.
  • the types of fluorescent molecules increase, and the fluorescence generated from a plurality of fluorescent molecules is mixed. Therefore, by using a bandpass filter having a narrower pass band, the target fluorescent molecules can be obtained. The generated fluorescence can be easily detected.
  • the switching of the orientation of the third complex 22 or the sixth complex 38 in the solution is not limited to that by laser, and a magnetic method or an electrical method may be used as long as these complexes can be oriented. .
  • the orientation direction of the third composite 22 or the sixth composite 38 does not necessarily have to be switched by the ⁇ / 2 wavelength plate.
  • the orientation direction may be switched by switching the irradiation direction of the orientation control light 117 by AOD (Acoust Optical Defect).
  • AOD Acoustic Optical Defect
  • a plurality of orientation control light alignment control light source units may be provided to switch the direction in which the orientation control light is irradiated.
  • a plurality of alignment control light source units may be provided to irradiate a plurality of alignment control lights in the same direction.
  • a plurality of alignment control light source units may be provided to irradiate a plurality of alignment control lights in the same direction.
  • nine orientation control lights respectively corresponding to nine points 42a to 42i may be incident.
  • the orientation control light is irradiated from a plurality of positions as described above, the third complex 22 or the sixth complex 38 positioned at the center of the polarization axis of the orientation control light increases. The center of the polarization axis of the orientation control light can rotate the third complex 22 or the sixth complex 36 most efficiently.
  • the number of points on which the orientation control light is incident is not limited to nine points, and may be more or less than nine points. It is desirable to make the light incident on more points as the orientation control light is narrowed down. Thereby, the 3rd complex 22 or the 6th complex 38 can be rotated synchronizing with orientation in a plurality of places. As a result, sudden fluctuations in fluorescence intensity can be reduced, and the coefficient of variation (Coefficient of Variation), which is an index representing relative scattering, can be improved. Also in this case, it is desirable that each orientation control light is irradiated so as to be focused on the end face exiting the reagent container 10.
  • FIG. 18 shows the structure of the orientation control light source unit for making the orientation control light incident at multiple points.
  • the orientation control light source unit 230 is a 3 ⁇ 3 two-dimensional laser array.
  • the orientation control light source unit 230 emits light from nine light emitting points 44a to 44i.
  • the size of the light emitting point is 1 ⁇ m in the vertical direction and 100 ⁇ m in the horizontal direction.
  • An example of an optical system using the alignment control light source unit 230 is shown in FIG. In FIG. 19, the optical system other than the optical system related to the orientation control light is omitted.
  • the linearly polarized orientation control light 240 emitted from the orientation control light source unit 230 passes through the collimator lens 232 and becomes a parallel light beam at the focal point.
  • the orientation control light 240 that has passed through the collimator lens 232 passes through the beam expander 234 and the beam expander 236 and enters the polarization direction controller 238 having a ⁇ / 2 wavelength plate.
  • the orientation control light 240 that has passed through the beam expander 234 and the beam expander 236 is spread into a parallel light beam having a specific magnification.
  • the ⁇ / 2 wave plate is on a rotary stage and is rotatable. Thereby, the polarization axis of the orientation control light 240 can be rotated.
  • the orientation control light 240 transmitted through the ⁇ / 2 wavelength plate is collected by the lens 242 and enters the side surface of the reagent container 10.
  • the size of the orientation control light 240 is about 1.3 ⁇ m ⁇ 130 ⁇ m, and the pitch is about 129 ⁇ m.
  • FIG. 20 shows an example of another optical system that makes the orientation control light incident at multiple points.
  • components other than the optical system of the orientation control light are omitted.
  • symbol is attached
  • the orientation control light source 116 is the same as that in the first embodiment.
  • the orientation control light 246 passes through the collimator lens 406, the beam expander 408, and the beam expander 410 and enters the microlens array 242.
  • the microlens array 242 includes a plurality of microlenses 248 arranged in a lattice pattern.
  • the orientation control light 246 that has passed through the microlens array 248 becomes a plurality of light beams that are focused at different positions like light emitted from a plurality of light sources.
  • the orientation control light 246 is narrowed down by the pinhole array 244, passes through the polarization direction control unit 238, is collected by the lens 242, and enters the side surface of the reagent container 10. Even when the microlens array is used as described above, the orientation control light can be incident on multiple points.
  • a plurality of optical systems may be prepared in order to irradiate the alignment light at multiple points.
  • the alignment control light is irradiated from three alignment control light source units and can be incident on the reagent container 10 from three points.
  • the orientation control light can be irradiated from multiple points, and the third complex 22 or the sixth complex 38 can be rotated at a plurality of locations.
  • the vibration direction of the orientation control light 117 is switched between two orthogonal directions, but it is not always necessary to switch between the two orthogonal directions.
  • the third complex 22 or the sixth complex is different in the direction in which the intensity of the fluorescence generated from the third complex 22 or the sixth complex 38 is changed.
  • the composite 38 may be oriented.
  • the vibration direction of the orientation control light 117 is switched between two orthogonal directions, the time required to complete the orientation of the third composite 22 or the sixth composite 38 is maximized, and the most S / N gets better.
  • the angle formed by the two directions in which the orientation control light 117 travels is 60 degrees
  • the third composite 22 or the sixth composite is compared with the case where the travel directions of the orientation control light 117 are orthogonal.
  • the time required to complete the switching of the 38 orientations is shortened, and the time required for measurement is also shortened.
  • the angle formed by the two directions in which the orientation control light 117 travels is smaller than 90 degrees, the time required to complete the switching of the orientation of the third composite 22 or the sixth composite 38 is shortened. Measurement time is also shortened.
  • the number of reagent containers 10 is not necessarily one, and a plurality of reagent containers are provided in the apparatus.
  • a configuration in which a plurality of specimens can be set is also possible. In that case, if the apparatus is configured to perform the measurement by sequentially moving the reagent containers to the measurement position, a plurality of specimens can be automatically measured.
  • the measurement was performed using the first complex 20a, the second complex 20b, the fourth complex 20c, or the fifth complex 20d that was already generated.
  • the generation of the first complex 20a, the second complex 20b, the fourth complex 20c, or the fifth complex 20d may be performed in the reagent container 10.
  • the user prepares the gold nanoparticles, the antibody, and the fluorescent molecule in separate reagent tanks, and the biomolecule detection device at the time of the measurement supplies the gold nanoparticle, the antibody, the fluorescent molecule, and the specimen to the reagent container 10 respectively. Dispense and react.
  • gold nanoparticles are used as particles that cause surface plasmon resonance with excitation light.
  • they are not necessarily gold nanoparticles.
  • silver nanoparticles or copper nanoparticles may be used.
  • orientation control light source unit 116 and the excitation light source unit 118 may be detachable and may be replaced with appropriate ones according to the detection target substance, fluorescent molecules, and the like.
  • the time interval for switching the orientation direction is based on the mass or volume of the detection target substance, the third complex 22, and the sixth complex 38, the strength of the external force by the orientation control means, etc. It is desirable to determine the time required for 22 or the sixth composite 38 to complete the switching of the orientation. That is, it is desirable to switch the orientation direction every time it takes for all the third composites 22 or the sixth composites 38 to complete the switching of the orientation. If the time for switching the orientation direction is determined in this way, the orientation control light 117 is not irradiated in the same direction even after all the third composites 22 or the sixth composites 38 have completed the orientation. Electric power can be reduced. Further, the measurement is not continued until unnecessary, and the measurement time can be shortened.
  • the time required for all the third composites 22 or the sixth composites 38 to complete the switching of the orientation may be obtained based on the light receiving unit output and the A / D conversion unit output. For example, if you repeat the measurement for several cycles, you can roughly know how long it will take for each output to saturate. The time interval may be determined.
  • the sample is not limited to plasma separated from whole blood, and detection target substances such as urine and saliva are used. Can be used as a specimen.
  • the case where an antigen-antibody reaction is used has been described as an example.
  • the combination of a detection target substance and a substance that specifically binds to the detection target substance is not limited to an antigen and an antibody.
  • detecting an antibody using an antigen detecting a DNA that hybridizes to the DNA using a specific DNA, binding a DNA-binding protein using DNA, a receptor using a ligand
  • detecting lectin in the case of detecting lectin using sugar, in the case of using protease detection, in the case of using higher order structural change, etc.
  • the present embodiment The concentration of the detection target substance can be measured by the biomolecule detection apparatus according to the embodiment.
  • the antigen 18, the antigen 40, the first complex 20a, the second complex 20b, the fourth complex 20c, and the fifth complex 20d are dispersed in the liquid. Since the measurement can be performed in the liquid phase, there is an advantage that the pretreatment is simpler than the measurement in the solid phase in which the antibody is fixed to the reaction layer and the measurement is performed. In addition, there is an advantage that these antigens and complexes can freely move around in the solution, and the reaction is faster than the solid phase.
  • each embodiment according to the present invention does not examine changes in the degree of polarization of fluorescence due to changes in Brownian motion as in the conventional fluorescence polarization method, so that the components of the specimen affect the fluorescence lifetime of the fluorescent molecule. Even if given, it has little effect on the measurement.
  • the reagent holding portion in the reagent container 10 has a quadrangular prism shape, but the reagent holding portion does not necessarily have to be a quadrangular prism shape, and may have a cylindrical shape.
  • the biomolecule detection apparatus and the biomolecule detection method according to the present invention perform detection or quantification of a detection target substance using, for example, an interaction between a detection target substance and a substance that specifically binds to the detection target substance. It can be used for a device to perform.

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Abstract

高感度な測定が可能な生体分子検出装置を提供する。配向制御光117の振動方向の切り替えにより、血漿16の内部に含まれる第３の複合体22の配向方向を切り替える。第３の複合体22の配向方向は、表面プラズモン共鳴により第３の複合体22が有する２つの銀ナノ粒子８の間に発生する電場の強度が大きく異なる２つの方向の間で切り替える。そのため、第３の複合体22の配向方向の変化により、第３の複合体22から発生する蛍光の強度は大きく変化する。そして、第３の複合体22の配向方向を周期的に変化させながら表面プラズモン共鳴を起こさせ、血漿16から発生した全蛍光量から第３の複合体の配向方向が変化する周期と同期する成分を検出するため、検出対象物質を含む第３の複合体に付随した蛍光の寄与分を算出することができ、簡便な構成で検出対象物質の濃度を正確に測定することができる。

Description

生体分子検出装置および生体分子検出方法
　本発明は、溶液中の検出対象物質を検出する技術に係り、特に、血液や尿等の検体内の生体分子、ウイルス、ＤＮＡ、蛋白質、細菌等を検出することが可能な生体分子検出装置および生体分子検出方法に関する。
　近年、医師や技師等が診療の現場で生体分子検出を行い、その場で測定結果を得て診断や治療に役立てる生体分子検出法が注目されている。生体分子検出法は、抗原抗体反応等の特異的な反応を利用した高い選択性により、血液、尿、汗といった複数成分を有する体液の中から、検出対象物質だけを選択的に検出する方法である。特に、ウイルス、ＤＮＡ、蛋白質、細菌等の生体分子の微量検出、検査、定量、分析などに広く用いられている。
　近年、生体分子を高感度に検出する方法として、金属微粒子のプラズモンと光の相互作用を利用したプラズモンセンサの研究が進められている。
　特許文献１には、基板に固定した金属微粒子（金ナノロッド）の局在表面プラズモン共鳴の吸収波長が特異的結合によりシフトする現象をセンシング技術に応用した分析チップが開示されている。
　特許文献２には、金ナノロッドを配向させて基板に固定することにより、検出感度を向上させる検知素子が開示されている。
特開２００９－２６５０６２号公報 特開２００７－２４８２８４号公報
　しかしながら、特許文献１および特許文献２のような金属微粒子を固定した基板を利用した検知素子は、金属微粒子を固定する際の加工コストが高いという問題がある。
　本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、金属微粒子を基板に固定することなく高感度で測定可能な生体分子検出装置および生体分子検出方法を提供することを目的とする。
　上記目的を達成するために、本発明に係る生体分子検出装置は、生体分子上の特定部位に特異的に結合し得る第１の物質と金属粒子と蛍光分子とを有する第１の複合体、および上記特定部位と異なる上記生体分子上の部位に特異的に結合し得る第２の物質と金属粒子と蛍光分子とを有する第２の複合体を含む溶液を保持する容器と、上記第１の複合体が上記第１の物質を介して上記生体分子に結合し、上記第２の複合体が上記第２の物質を介して上記生体分子に結合した第３の複合体を上記溶液中で少なくとも２つの方向へ配向させる配向制御手段と、特定方向の直線偏光成分を有し、上記第１の複合体および上記第２の複合体の金属粒子に表面プラズモン共鳴を引き起こす光を上記溶液に照射する光源と、上記第１の複合体および上記第２の複合体の金属粒子の表面プラズモン共鳴により発生する電場により上記第１の複合体および上記第２の複合体の蛍光分子から発せられた蛍光を検出する受光部と、上記受光部が検出した蛍光の内、上記第３の複合体が配向する周期に同期する成分を抽出する同期成分抽出手段と、を具備する。
　このような構成にすると、簡便な構成で検出対象物質を高感度に測定することができる。また、上記第１の複合体および上記第２の複合体が固定されていないため、溶液中での生体分子との反応が早い。
　また、上記配向制御手段は、上記光源から照射される光と異なる光であって直線偏光した光を上記溶液に照射する配向制御偏光光源と、該配向制御偏光光源から照射される光の偏光軸を回動させることにより、上記第３の複合体を上記溶液中で少なくとも２つの方向へ配向させる偏光軸回動手段と、を具備することが好ましい。
　配向制御手段が光を用いて第３の複合体を配向させると、第３の複合体に対して配向のための前処理が不要となる。例えば、磁気を用いて配向制御を行う場合には、第３の複合体に磁性粒子等を結合させる必要があるが、光を用いて配向させると、そのような前処理が不要である。また、光の偏光軸を回動させることにより第３の複合体を溶液中で配向させると、複数の方向から光を照射して第３の複合体の配向方向を切り替える必要がないため、配向制御手段の光学系をコンパクトにすることができる。
　また、上記配向制御光源は、上記光源から照射される光と異なる光であって直線偏光した光を上記溶液に対して複数の位置から照射することが好ましい。
　溶液に対して複数の位置から光を照射して第３の複合体を配向させると、溶液内の様々な位置に存在する第３の複合体の配向方向を制御しやすくなる。
　また、上記配向制御手段は、上記光源から照射される光と異なる光を上記溶液に照射する配向制御光源と、該配向制御光源から照射される光の照射方向を切り替えることにより、上記第３の複合体を上記溶液中で少なくとも２つの方向へ配向させる切替手段と、を具備してもよい。また、上記配向制御光源は、上記光源から照射される光と異なる光を上記溶液の複数の位置に照射することが好ましい。
　また、上記配向制御手段は、上記第３の複合体の長軸方向と上記光源から照射される光の振動方向とが平行となる第１の方向、および、上記第３の複合体の長軸方向と上記光源から照射される光の振動方向とが垂直となる第２の方向、へ上記第３の複合体を配向させることが好ましい。
　このように分子の配向を制御すると、上記第３の複合体の配向方向の切り替えに伴う蛍光強度の変化が最大となる。そのため、第３の複合体の配向方向の切り替えに伴う蛍光強度の変化をより高精度に測定することができる。
　また、上記配向制御手段は、上記第３の複合体の配向方向を所定の時間間隔で変化させ、上記同期成分抽出手段は、上記第３の複合体が含まれる溶液から発生する蛍光の強度を複数回測定して上記第３の複合体が配向する周期に同期する成分を抽出することが望ましい。
　このように上記第３の複合体の配向方向を所定の時間間隔で変化させながら、蛍光の強度を複数回測定し、測定した複数の蛍光強度を加算平均等すれば、ノイズ等による測定毎の減光量のばらつきによる測定精度への影響を減少させることができる。
　さらに、上記所定の時間間隔は、上記溶液中に存在する全ての上記第３の複合体の配向が完了する時間間隔であることが好ましい。
　このように所定の時間間隔を決定すると、全ての上記第３の複合体の配向が完了した後まで測定を行うことがないため、最短の時間で測定を行うことができる。
　また、上記光源から照射される光の波長は、上記蛍光分子により吸収されない波長であることが好ましい。光源から照射される光の波長が蛍光分子により吸収されない波長であれば、蛍光分子は表面プラズモン共鳴によって発生する電場によってのみ励起されるため、電場の強度変化が蛍光の強度変化に的確に反映される。
　また、上記同期成分抽出手段は、上記第３の複合体の配向方向の変化により、上記第３の複合体から発生する蛍光量が変化することを利用して、記第３の複合体が配向する周期に同期する成分を抽出することが好ましい。
　また、上記溶液は、少なくとも一部に平面を有する容器保持部に保持されることが好ましい。さらに、上記配向制御偏光光源は、上記光源から照射される光と異なる光であって直線偏光した光を、前記溶液を通って前記容器保持部の平面から出射する方向に照射し、かつ、前記光源から照射される光と異なる光であって直線偏光した光を、前記溶液と前記平面との界面において焦点を結ばせることが好ましい。また、上記配向制御光源は、上記光源から照射される光と異なる光を、前記溶液を通って前記容器保持部の平面から出射する方向に照射し、かつ、前記光源から照射される光と異なる光を、前記溶液と前記平面との界面において焦点を結ばせることが好ましい。
　このように配向制御偏光光源または上記配向制御光源が容器保持部から出射する位置において焦点を結ぶように光を照射すると、第３の複合体を容器保持部の壁面に押しつけながら回動させることができるため、配向制御しやすくなる。
　また、上記目的を達成するために、本発明に係る生体分子検出方法は、検体に含まれる生体分子上の特定部位に特異的に結合し得る第１の物質と金属粒子と蛍光分子とを有する第１の複合体、および上記特定部位と異なる上記生体分子上の部位に特異的に結合し得る第２の物質と金属粒子と蛍光分子とを有する第２の複合体を含む溶液と検体とを混合するステップと、上記第１の複合体が上記第１の物質を介して上記生体分子に結合し、上記第２の複合体が上記第２の物質を介して上記生体分子に結合した第３の複合体を上記溶液中で少なくとも２つの方向へ配向させるステップと、特定方向の直線偏光成分を有し、上記第１の複合体および上記第２の複合体の金属粒子に表面プラズモン共鳴を引き起こす光を上記溶液に照射するステップと、上記第１の複合体および上記第２の複合体の金属粒子の表面プラズモン共鳴により発生する電場により上記第１の複合体および上記第２の複合体の蛍光分子から発せられた蛍光を検出するステップと、上記受光部が検出した蛍光の内、上記第３の複合体が配向する周期に同期する成分を抽出するステップと、を具備する。
　本発明によれば、固相を用いないため抗原抗体反応が早く、表面プラズモン共鳴によって発生した電場を利用して蛍光検出を行うため、高感度な生体分子検出を行うことができる。
図１Ａは実施の形態１において使用する第１の複合体の模式図、図１Ｂは実施の形態１において使用する第２の複合体の模式図、図１Ｃは、第１の複合体および第２の複合体が抗原と結合した状態を示す図である。 実施の形態１に係る生体分子検出装置の抗原抗体反応の概要を示した模式図である。 図３Ａは、単独で存在する第１の複合体に励起光を照射した際に金ナノ粒子の周囲に発生する電場の強さを表した図である。図３Ｂは、Ｙ軸方向に長軸を向けた第３の複合体に励起光を照射した際に金ナノ粒子の周囲に発生する電場の強さを濃淡画像によって表した図である。図３Ｃは、Ｘ軸方向に長軸を向けた第３の複合体に励起光を照射した際に金ナノ粒子の周囲に発生する電場の強さを濃淡画像によって表した図である。 図４Ａは実施の形態１に係る生体分子検出装置の外観斜視図、図４Ｂは実施の形態１に係る生体分子検出装置の開閉カバーを開けた図である。 実施の形態１に係る生体分子検出装置の主要な構成を示す機能ブロック図である。 図６Ａは偏光方向制御部が配向制御光を素通りさせた場合における第３の複合体の配向方向を示す図である。図６Ｂは、配向制御光の振動方向を９０度切り替えた場合における第３の複合体の挙動を示す図である。図６Ｃは、配向制御光の振動方向を９０度切り替えた場合における第３の複合体の配向方向を示す図である。 配向制御光の焦点の位置を示す図である。 図８Ａは偏光方向制御部が配向制御光を素通りさせた場合における第３の複合体の配向方向と励起光の振動方向との関係を示す図、図８Ｂは配向制御光の振動方向を９０度切り替えた場合における第３の複合体の配向方向と励起光の振動方向との関係を示す図である。 測定の際にＦＧが出力する配向制御信号、受光部が出力する受光部出力およびロックインアンプが出力するロックインアンプ出力を描いたグラフである。 図１０Ａは第１の複合体の別の構造を示す模式図、図１０Ｂは第２の複合体の別の構造を示す模式図、図１０Ｃは第３の複合体の別の構造を示す模式図である。 図１１Ａは第１の複合体のさらに別の構造を示す模式図、図１１Ｂは第２の複合体のさらに別の構造を示す模式図、図１１Ｃは第３の複合体のさらに別の構造を示す模式図である。 図１２Ａは実施の形態２において使用する第４の複合体の模式図、図１２Ｂは本発明の実施の形態２において使用する第５の複合体の模式図、図１２Ｃは第４の複合体および第５の複合体が抗原と結合した状態を示す図である。 実施の形態２に係る生体分子検出装置の抗原抗体反応の概要を示した模式図である。 実施の形態２に係る生体分子検出装置の主要な構成を示すブロック図である。 実施の形態２に係る生体分子検出装置における受光部の詳細な構成を表した模式図である。 図１６Ａは実施の形態２に係る生体分子検出装置において第３の複合体を測定する場合における数周期の配向制御信号、受光部出力およびロックインアンプ出力を示したグラフである。図１６Ｂは実施の形態２に係る生体分子検出装置において第６の複合体を測定する場合における数周期の配向制御信号、受光部出力およびロックインアンプ出力を示したグラフである。 試薬容器の多点に配向制御光を照射する場合を示す図である。 配向制御光を多点に入射させるための配向制御用光源部の構造を示す図である。 配向制御光を多点に入射させるための光学系の一例を示す図である。 配向制御光を多点に入射させるための光学系の別の例を示す図である。 マイクロレンズアレイを示す図である。
　以下、添付図面を参照しながら本発明の実施の形態について説明する。
　（実施の形態１）
　本発明の実施の形態１では、溶液中に存在する抗原を検出するために、この抗原の特定の２箇所に特異的に結合し得る２種類の蛍光標識２０ａ、２０ｂを別途合成する。図１Ａは蛍光標識２０ａの模式図、図１Ｂは蛍光標識２０ｂの模式図である。蛍光標識２０ａ、２０ｂは、金属粒子が含まれるように合成されるので、表面プラズモン共鳴が起こると蛍光を発する。本実施の形態では、これら２種類の蛍光標識を均一溶液中に導入して抗原と結合させることにより、検出対象物質である特定の１種類の抗原を検出する。
　図１Ａに示した蛍光標識を以下第１の複合体２０ａと呼ぶこととする。第１の複合体２０ａは、直径が２０ｎｍの略球形の金ナノ粒子８の表面全体をＳｉＯ２からなる厚み１０ｎｍの金属消光防止膜で覆い、金属消光防止膜の表面に複数の第１の抗体１２ａと複数の蛍光分子１４と複数のＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ　ａｌｂｕｍｉｎ）２４とが結合した複合体である。金ナノ粒子８は、ＡｕをコアとしてＳｉＯ２のシェルを有するコアシェル粒子である。金属消光防止膜は、金ナノ粒子８と蛍光分子１４とが近接して蛍光分子１４が励起されたエネルギーが金ナノ粒子８に奪われる、いわゆる金属消光を防止するために設けられている。なお、金属消光防止膜は特に明確には図示しておらず、以降の図においても特に明確には図示しない。第１の抗体１２ａ、蛍光分子１４およびＢＳＡ２４は、金属消光防止膜の表面全体に偏りなく配置される。ＢＳＡ２４は、非特異吸着防止のために結合されており、検出対象物質と抗体１２ａの結合以外の非特異的な吸着を防いでいる。
　図１Ｂに示した蛍光標識を以下第２の複合体２０ｂと呼ぶこととする。第２の複合体２０ｂは、直径が２０ｎｍの金ナノ粒子８の表面全体をＳｉＯ２からなる厚み１０ｎｍの金属消光防止膜で覆い、金属消光防止膜の表面に複数の第２の抗体１２ｂと複数の蛍光分子１４と複数のＢＳＡ２４とが結合した複合体である。第２の抗体１２ｂ、蛍光分子１４およびＢＳＡ２４は、金属消光防止膜の表面全体に偏りなく配置される。このように、第１の複合体２０ａおよび第２の複合体２０ｂは、形状的に等方的な構成を採る。
　第１の抗体１２ａおよび第２の抗体１２ｂは、検出対象物質である抗原の特定部位と反応し、それぞれ異なる位置に結合する抗体である。本実施の形態においては、第１の抗体１２ａとしてＲ＆ＤＳＹＳＴＥＭＳ社のＭＡＢ１１２９（Ｈｕｍａｎ　ＥｒｂＢ２／Ｈｅｒ２　Ａｎｔiｂｏｄｙ）を用い、第２の抗体１２ｂとして同社のＢＡＦ１１２９（Ｈｕｍａｎ　ＥｒｂＢ２／Ｈｅｒ２　Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ）を用いた。本実施の形態では、検出対象物質として血漿中のＥｒｂＢ２／Ｈｅｒ２タンパク質を検出する。検出対象物質であるＥｒｂＢ２／Ｈｅｒ２タンパク質を以下では抗原１８と呼ぶ。
　蛍光分子１４には、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　５６８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ社の商品名）を用いた。Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　５６８は、波長６００ｎｍ程度にピークを有し、５５０ｎｍ－７００ｎｍ程度の波長を持った蛍光を発光する。第１の複合体２０ａおよび第２の複合体２０ｂは同種の蛍光分子１４を有する。
　第１の複合体２０ａの作成方法について説明する。まず、第１の抗体１２ａのビオチン化を行う。具体的には、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ社のＯｎｅ-Ｓｔｅｐ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用する。例えば、金ナノ粒子８として、田中貴金属製のＡｕコロイド溶液－ＳＣ　粒径２０ｎｍを用いて、マイクロミキサー法によりＡｕをコアとしたＳｉＯ２シェルを有する粒子を製造する。このようにして、金ナノ粒子８の表面全体がＳｉＯ２膜で覆われたコアシェル粒子を作成することができる。ＳｉＯ２へのアビジンの固定は、公知の任意の方法を用いることができる。そして、アビジンービオチン結合を介して金属消光防止膜上に第１の抗体１２ａを固定する。具体的には、粒子と抗体とのモル濃度を等しい割合で混合し、１時間放置する。続いて、金属消光防止膜上に蛍光分子を固定する。蛍光分子の固定方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ社のサクシニミジルエステル反応基色素キットに付属しているプロトコルに従ってを用いて行う。ＢＳＡ２４は、ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ社のＡ９４１８－１０Ｇを用いる。まず、Ａ９４１８－１０ＧをＭｉｌｌＱで金ナノ粒子８のモル濃度の１００倍になる濃度とし、Ａ９４１８－１０Ｇと金ナノ粒子８とを混合し、１時間放置することでＢＳＡ２４によって金属消光防止膜の表面がブロッキングされて第１の複合体２０ａは完成する。第２の複合体２０ｂも同様の手順で作成する。本実施例では、ＳｉＯ２のシェルを有する金ナノ粒子の表面に蛍光色素を固定する方法を示したが、シェルであるＳｉＯ２の膜厚を２０ｎｍ程度に厚くして膜内に蛍光色素を含有する方法もある。また、金属消光防止膜を設けない場合は、アビジン標識された金ナノ粒子を用いれば良い。
　本実施の形態で用いた第１の抗体１２ａおよび第２の抗体１２ｂは、いわゆるサンドイッチ法を行って抗原１８を検出するための抗体である。従って、これらの抗体は、抗原１８をそれぞれ異なるエピトープで認識して結合する。すなわち、第１の抗体１２ａおよび第２の抗体１２ｂは、抗原１８のそれぞれ異なる位置に特異的に結合する。また、第１の抗体１２ａおよび第２の抗体１２ｂは、互いに立体障害とならないように抗原１８の立体構造上の遠い位置に結合する。なお、図１Ａおよび図１Ｂにおける第１の抗体１２ａと第２の抗体１２ｂの図は、それぞれ異なる凹形状で図示することにより、抗原１８の異なる位置に結合することを表している。そのため、第１の抗体１２ａおよび第２の抗体１２ｂは必ずしもこのような形状ではない。
　図１Ｃは、第１の複合体２０ａおよび第２の複合体２０ｂの双方が抗原１８と結合した場合を示す図である。以下、この図のように第１の複合体２０ａおよび第２の複合体２０ｂの双方が抗原１８に結合した複合体を第３の複合体２２と呼ぶ。図１Ｃにおいては、第１の抗体１２ａおよび第２の抗体１２ｂが抗原１８のそれぞれ異なる位置に特異的に結合することをわかり易く示すために、第１の抗体１２ａおよび第２の抗体１２ｂのそれぞれの凹形状と適合した凸形状を有する図により抗原１８を示している。実際の抗原１８がこのような形状を有しているわけではない。
　第１の抗体１２ａおよび第２の抗体１２ｂは抗原１８に対してサンドイッチ法を行うための抗体であるため、第１の複合体２０ａおよび第２の複合体２０ｂの双方が抗原１８と結合した場合には、図１Ｃのように第１の複合体２０ａと第２の複合体２０ｂが抗原１８を挟んで向かい合った位置に結合する。すなわち、第３の複合体２２においては、第１の複合体２０ａ、抗原１８および第２の複合体２０ｂが一直線上に並んだ構造となる。このように、第３の複合体２２は、形状に異方性を有する複合体となる。以下、第３の複合体２２において、第１の複合体２０ａ、抗原１８および第２の複合体２０ｂが並んだ方向を長軸方向といい、長軸方向に垂直な方向を短軸方向という。第３の複合体２２において、第１の複合体２２ａが有する金ナノ粒子８と第２の複合体２２ｂが有する金ナノ粒子８との距離は、約３０ｎｍとなる。
　図２Ａおよび図２Ｂは、本実施の形態に係る生体分子検出装置における抗原抗体反応の概要を示した模式図である。図２Ａは抗原抗体反応前の状態を表す。試薬容器１０は、四角柱状の外形を有し、上面が開口した四角柱状の凹部からなる試薬保持部を内部に有する。図２Ａおよび図２Ｂにおいては、外部に露出していない試薬保持部を破線によって示してある。試薬保持部の中には、乾燥した複数の第１の複合体２０ａおよび第２の複合体２０ｂが入れられている。
　本実施の形態においては、検体は全血から分離した血漿１６である。試薬容器１０に血漿１６を分注して撹拌すると、第１の抗体１２ａおよび第２の抗体１２ｂと特異的に結合する抗原１８が血漿１６中に存在する場合は、第１の抗体１２ａおよび第２の抗体１２ｂと抗原１８との間で抗原抗体反応が起こり、図２Ｂに示すように第３の複合体２２が形成される。
　第１の複合体２０ａおよび第２の複合体２０ｂは抗原１８に対して十分に多い量が入れられているため、第１の複合体２０ａおよび第２の複合体２０ｂの一部は、抗原抗体反応をしないまま血漿１６内に残る。すなわち、第１の複合体２０ａおよび第２の複合体２０ｂと混合された血漿１６内には第１の複合体２０ａ、第２の複合体２０ｂおよび第３の複合体２２が混在している。
　なお、血漿１６中には抗原１８以外の成分も存在するが、説明を簡単にするため、図２ＡおよびＢにおいては抗原１８以外の成分は省略して示してある。
　本実施の形態に係る生体分子検出装置１００は、液相であることにより第１の複合体２０ａ、第２の複合体２０ｂおよび第３の複合体２２が混在している血漿１６に対して励起光を照射し、励起光と金ナノ粒子８との間で表面プラズモン共鳴を発生させ、表面プラズモン共鳴により発生する電場によって蛍光分子１４を発光させ、当該血漿１６内から発生する蛍光を測定することにより抗原１８の検出および定量を行う。
　従って、抗原１８を含む第３の複合体２２から発生する蛍光のみを検出することが望ましいが、第１の複合体２０ａ、第２の複合体２０ｂおよび第３の複合体２２は血漿１６内に混在しているため、血漿１６に励起光を照射すると、第１の複合体２０ａおよび第２の複合体２０ｂに付随している蛍光分子１４も蛍光を発生して不要成分となる。そこで、生体分子検出装置１００は、第３の複合体２２の配向方向を光により切り替えつつ蛍光を検出し、配向の切り替えに伴う蛍光強度の変化に基づいて全蛍光データの中から第３の複合体２２に付随する蛍光分子から発生する蛍光の寄与分を算出する。
　生体分子検出装置１００において、第３の複合体２２に付随する蛍光分子１４から発生する蛍光の寄与分と、第１の複合体２０ａおよび第２の複合体２０ｂに付随する蛍光分子１４から発生する蛍光の寄与分とを算出する原理を図３Ａ～図３Ｃを用いて説明する。図３Ａ～図３Ｃは、励起光１１９と金ナノ粒子８との表面プラズモン共鳴により発生する電場の強さを濃淡画像により表した図である。図３Ａ～図３ＣにおいてＸ軸およびＹ軸は位置を表す。また、濃度は電場の強さを表し、濃度が濃いほどその位置における電場が強いことを表す。
　図３Ａは、単独で存在する第１の複合体２０ａに対してＸ軸方向に振動しながらＹ軸方向に進行する励起光１１９を照射した際、金ナノ粒子８の周囲に発生する電場の強さを濃淡画像によって表した図である。濃淡画像の中心には第１の複合体２０ａが存在する。この場合、金ナノ粒子８を中心としてＸ軸方向に電場が発生する。つまり、表面プラズモン共鳴を発生させる励起光１１９の振動方向と同方向に電場が発生する。この電場は、金ナノ粒子８の表面近傍において最も強く、金ナノ粒子８から離れるほど弱くなる。金ナノ粒子８表面に存在する蛍光分子１４は発生した電場によって励起され蛍光を発生する。
　単独で存在する第１の複合体２０ａについては、形状に異方性がなく、蛍光分子１４は金属消光防止膜の表面全体に偏りなく結合しているため、向きが変わっても発生する蛍光の量に大きな変化はない。なお、第２の複合体２０ｂの表面プラズモン共鳴による強度分布は図示しないが、第１の複合体２０ａと同様の強度分布となる。
　一方、形状に異方性を有する第３の複合体２２は、配向を制御することが可能である。図３Ｂは、Ｙ軸方向に長軸方向を向けた第３の複合体２２に対してＸ軸方向に振動しながらＹ軸方向に進行する励起光１１９を照射した際、金ナノ粒子８の周囲に発生する電場の強さを濃淡画像によって表した図である。この場合においても、金ナノ粒子８を中心としてＸ軸方向に電場が発生する。それぞれの電場の強さは、第１の複合体２０ａまたは第２の複合体２０ｂが単独で存在する場合とほぼ同じである。従って、第１の複合体２０ａまたは第２の複合体２０ｂが発生する蛍光の量も第１の複合体２０ａまたは第２の複合体２０ｂが単独で存在する場合とほぼ同じとなる。
　図３Ｃは、Ｘ軸方向に長軸方向を向けた第３の複合体２２に対してＸ軸方向に振動しながらＹ軸方向に進行する励起光１１９を照射した際、金ナノ粒子８の周囲に発生する電場の強さを濃淡画像によって表した図である。この場合、第１の複合体２０ａが有する金ナノ粒子８と第２の複合体２０ｂが有する金ナノ粒子８との間の領域において、それぞれが有する金ナノ粒子８により発生した表面プラズモン共鳴による電場が重なり、非常に強い電場を発生する。この電場の強度は、図３Ｂの場合と比べて約２０倍程である。そのため、金属消光防止膜の表面かつ第１の複合体２０ａが有する金ナノ粒子８と第２の複合体２０ｂが有する金ナノ粒子８との間に存在する蛍光分子１４は非常に強い電場により励起され、強い蛍光を発生する。従って、第３の複合体２２が発生する蛍光の量は、図３Ｂの場合と比べて増加する。つまり、Ｘ軸方向に振動しながらＹ軸方向に進行する励起光１１９を照射した場合、第３の複合体２２の長軸方向がＹ軸方向からＸ軸方向に変化すると、第３の複合体２２から発生する蛍光の量が増加する。
　そこで、本実施の形態に係る生体分子検出装置１００は、光により第３の分子の配向方向を周期的に変化させ、この周期に同期した蛍光信号のみを検出することにより、第３の複合体２２から発生する蛍光の量の算出を行う。一方、第１の複合体２０ａおよび第２の複合体２０ｂは、形状に異方性がないため光を照射しても配向しない。第１の複合体２０ａおよび第２の複合体２０ｂは、ブラウン運動により回転運動するが、向きが変化しても発光する蛍光の量は変化しないため、第３の分子の配向方向を変化させる周期に同期した蛍光を発生しない。従って、第１の複合体２０ａ、第２の複合体２０ｂおよび第３の複合体２２が混在している血漿１６においても、第３の複合体２２から発生する蛍光の寄与分を算出することができる。
　このような処理を行う生体分子検出装置１００の構成について説明する。図４Ａは、生体分子検出装置１００の外観斜視図である。生体分子検出装置１００の側面には、表示部１０２、ユーザー入力部１０４および開閉カバー１０６がある。表示部１０２は、測定結果等を表示する。ユーザー入力部１０４は、モードの設定および検体情報の入力等を行う。開閉カバー１０６は、開閉が可能な構成となっており、検体のセット時には開け、測定時には閉じる。この構成により、外部の光が測定に影響を与えることを防いでいる。
　図４Ｂは、開閉カバー１０６を開いた場合における生体分子検出装置１００の外観斜視図である。開閉カバー１０６を開くと、中には試薬容器１０および保持台１１０がある。試薬容器１０は、保持台１１０に保持されており、保持台１１０から着脱可能となっている。試薬容器１０は、溶液を入れる四角柱状の容器である。ユーザーは、試薬容器１０に検体を分注し、上蓋を閉じて測定を行う。図示しないが、生体分子検出装置１００内には試薬タンクおよび分注部があり、測定が開始されると、分注部は試薬タンク内から試薬を吸い上げて試薬容器１０内に分注する。
　図５は、生体分子検出装置１００の主要な構成を説明するための機能ブロック図である。生体分子検出装置１００は、表示部１０２、ユーザー入力部１０４、試薬容器１０、試薬タンク１１２、分注部１１４、配向制御用光源部１１６、励起光源部１１８、偏光方向制御部１２０、ＦＧ（Ｆｕｎｃｔｉｏｎ　Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ）１２２、受光部１２４、増幅部１２６、ロックインアンプ１２７、Ａ／Ｄ変換部１２８、サンプリングクロック発生部１３０、およびＣＰＵ１３２を有する。
　試薬容器１０は、試薬タンク１１２に保存してある試薬と患者等から採取した検体とを反応させる容器である。試薬容器１０は、生体分子検出装置１００から着脱可能となっている。試薬容器１０の容量は、約１２０μＬである。
　試薬タンク１１２は複数種類の試薬を貯めておくタンクである。第１の複合体２０ａおよび第２の複合体２０ｂは試薬タンク１１２中に試薬として保存されている。
　分注部１１４は、着脱可能なピペットや吸引器によって構成される。分注部１１４は、ＣＰＵ１３２からの命令に従い、測定に使用する試薬を試薬タンク１１２からピペットで吸い上げ、試薬容器１０へ分注する。
　配向制御用光源部１１６は、内部の偏光子により直線偏光した配向制御光１１７を偏光方向制御部１２０に向けて照射する光源である。ここで、直線偏光とは、光の振動方向が一定であり、偏光面が変化しない光を指す。直線偏光した光の進行方向および振動方向が存在する面を偏光面といい、直線偏光した光の振動方向を偏光軸という。配向制御用光源部１１６は、配向制御光１１７により試薬容器１０内の溶液中に存在する第３の複合体２２に外力を加えて第３の複合体２２を配向させる。配向制御光１１７には、例えば、波長９０９ｎｍ、出力７００ｍＷのレーザーを用いる。配向制御光１１７は、蛍光分子１４が吸収しない波長のレーザーであり、蛍光分子１４の色素が壊れる等の影響を与えない。配向制御光１１７は、試薬容器１０の溶液全体を照らす程度の幅を有している。
　配向制御光１１７による外力は、配向制御光１１７が第３の複合体２２に当たって散乱する際の反作用として生じるものである。第３の複合体２２は、図１Ｃに示したように、形状に異方性を有した複合体となっている。従って、配向制御光１１７第３の複合体２２に当たった場合、配向制御光１１７に対する反作用がより小さくなるように第３の複合体２２は回動する。その結果、第３の複合体２２の長軸方向と配向制御光１１７の振動方向とが平行となる。この平行関係となったときがエネルギー的に最も安定した状態であるため、第３の複合体２２の回動はここで停止する。換言すると、第３の複合体２２は、配向制御光１１７が照射されていないときは溶液中でランダムな方向を向いて分散しているが、配向制御光１１７が照射されると回動し、長軸方向が配向制御光１１７の振動方向と平行になる位置で停止する。一方、第１の複合体２０ａおよび第２の複合体２０ｂは、形状に異方性を有しないため、配向されない。
　偏光方向制御部１２０は、配向制御光１１７の振動方向を切り替えることで、第３の複合体２２の配向方向を切り替える。偏光方向制御部１２０は、λ／２波長板を有する。λ／２波長板は、垂直な方向に振動する偏光の光路差を１／２波長変化させる機能を有する位相板であり、光の偏光面を回転操作するために用いられる。λ／２波長板の光学軸方向と平行な方向に直線偏光した光はλ／２波長板を素通りするが、λ／２波長板の光学軸方向と４５度の角度をなす方向に直線偏光した光は振動方向が９０度変化する。つまり、直線偏光した光に対するλ／２波長板の角度を切り替えることで、光を素通りさせる場合と、光の振動方向を９０度変化させる場合とを切り替えることができる。偏光方向制御部１２０は、ＦＧ１２２からの信号を受けてλ／２波長板を回転し、配向制御光１１７の振動方向を９０度切り替える。換言すれば、配向制御光１１７の振動方向は、ＦＧ１２２が発生する電圧信号によって決まる。偏光方向制御部１２０は、ＦＧ１２２から０Ｖの信号が出力されている場合は配向制御光１１７を素通りさせ、ＦＧ１２２から５Ｖの信号が出力されている場合は配向制御光１１７の振動方向を９０度切り替える。以下、ＦＧ１２２から配向制御部１２０へ出力される信号を配向制御信号という。
　励起光源部１１８は、内部に備えた偏光子により直線偏光した励起光１１９を、試薬容器１０の底面から上方に向けて照射する光源である。励起光源部１１８は、励起光１１９を照射して励起光１１９と金ナノ粒子８との間で表面プラズモン共鳴を発生させる。励起光１１９には、波長６３５ｎｍ、出力１０ｍＷの光を用いる。
　ＦＧ１２２は、様々な周波数と波形をもった電圧信号を発生させることのできる装置である。ＦＧ１２２は、ＣＰＵ１３２から出力される命令を受けて、偏光方向制御部１２０、ロックインアンプ１２７およびサンプリングクロック発生部１３０へ電圧信号を出力する。
　ＣＰＵ１３２は、ＦＧ１２２に対して出力する配向制御信号を指定することで、偏光方向制御部１２０が配向制御光１１７の進行方向を切り替えるタイミングを制御する。
　受光部１２４は、フィルタやフォトダイオード等によって構成される。受光部１２４は、試薬容器１０の下部に設けられ、試薬容器１０内の蛍光分子１４から発生する蛍光１２３を試薬容器１０の下部で受光し、アナログ電気信号に変換して増幅部１２６へ出力する。受光部１２４の内部のフィルタは、蛍光分子１４から発生する蛍光以外の波長の光をカットするフィルタである。
　増幅部１２６は、受光部１２４から出力されるアナログ蛍光データを増幅してロックインアンプ１２７へ出力する。
　ロックインアンプ１２７は、アナログ蛍光データを直流に周波数変換する。ロックインアンプ１２７には、ＦＧ１２２から参照信号である方形波が入力される。ロックインアンプ１２７は、増幅部１２６から出力されたアナログ蛍光データから、参照信号と等しい周波数成分の検出を行う。具体的には、ロックインアンプ１２７は、参照信号と等しい周波数成分のみを同期検波により直流信号に変換し、内部に設けられたローパスフィルタにより直流信号のみを通過させる。ロックインアンプ１２７は、直流信号をＡ／Ｄ変換部１２８へ出力する。
　サンプリングクロック発生部１３０は、ＦＧ１２２から入力される電圧信号に基づいて、Ａ／Ｄ変換部１２８がアナログ蛍光データをサンプリングするタイミングを指定するサンプリングクロックをＡ／Ｄ変換部１２８に入力する。
　Ａ／Ｄ変換部１２８は、サンプリングクロック発生部１３０から出力されるサンプリングクロックに基づいて、ロックインアンプ１２７から出力されたアナログ蛍光データのサンプリングを行い、デジタルデータに変換してＣＰＵ１３２へ出力する。
　ＣＰＵ１３２は、Ａ／Ｄ変換部１２８から出力されたデジタルデータの演算を行い、その結果を表示部１０２へ出力する。また、ＣＰＵ１３２は、ユーザー入力部１０４から入力を受けて、配向制御用光源部１１６、励起光源部１１８、分注部１１４およびＦＧ１２２の動作の指示命令を行う。具体的には、配向制御用光源部１１６および励起光源部１１８のＯＮ、ＯＦＦ命令、分注部１１４に対して、使用する試薬を指定する命令および分注動作開始命令、ＦＧ１２２に対して、出力する信号波形の指示命令および出力命令を行う。
　図６Ａ～図６Ｃは、配向制御光１１７の振動方向に対する第３の複合体２２の配向方向を表した図である。これらの図を用いて配向制御光１１７の振動方向が変化した場合における第３の複合体２２の配向方向の変化について説明する。なお、図６Ａ～図６Ｃにおいては、第１の複合体２０ａを省略して描いてある。
　図６Ａは、偏光方向制御部１２０が配向制御光１１７を素通りさせた場合における第３の複合体２２の配向方向を示す図である。配向制御信号が０Ｖであり、紙面上下方向に振動している配向制御光１１７が偏光方向制御部１２０を素通りして試薬容器１０に入射すると、第３の複合体２２は、長軸方向を配向制御光１１７の振動方向と同一方向に向けて配向する。一方、血漿１６内に混在している第１の複合体２０ａおよび第２の複合体２０ｂは、形状が等方的なため配向しない。
　図６Ｂは、配向制御光１１７の振動方向を９０度切り替え、配向制御光１１７の振動方向が紙面に垂直な方向に変化した場合における第３の複合体２２の挙動を示す図である。配向制御信号が０Ｖから５Ｖに変化すると、偏光方向制御部１２０は、配向制御光１１７の振動方向を紙面上下方向から紙面に垂直な方向に切り替える。紙面に垂直な方向に振動する配向制御光１１７が試薬容器１０に入射すると、第３の複合体２２は、長軸方向が配向制御光１１７の振動方向と平行となるように回転運動を行う。一方、血漿１６内に混在している第１の複合体２０ａおよび第２の複合体２０ｂは、形状が等方的なため回転運動も行わない。
　図６Ｃは、ＦＧ１２２から５Ｖの信号が出力され、偏光方向制御部１２０が配向制御光１１７の振動方向を９０度変化させた場合における第３の複合体２２の配向方向を示す図である。この場合においても、第３の複合体２２は、長軸方向を配向制御光１１７の振動方向と同一方向に向けて配向する。一方、血漿１６内に混在している第１の複合体２０ａおよび第２の複合体２０ｂは、形状が等方的なため配向しない。
　このように生体分子検出装置１００は、ＦＧ１２２から配向制御信号を出力することにより偏光方向制御部１２０が有するλ／２波長板の向きを切り替えることで、配向制御光１１７の振動方向、すなわち第３の複合体２２の配向方向を、角度が９０度異なる２つの方向に切り替えることができる。
　図７は、配向制御光１１７の焦点の位置を示す図である。配向制御光１１７は、レンズ１０８に入射し、血漿１６と試薬容器１０の内壁面１０ａとの界面において焦点１１７ａを結ぶ。配向制御光の焦点の位置は、配向制御光が最も強い力で第３の複合体２２を配向させる。従って、図６Ａ～図６Ｃのように配向制御光を入射させると、配向制御光１１７は、焦点１１７ａの位置において第３の複合体を内壁面１０ａに押しつけつつ、より効率的に第３の複合体２２を配向させることができる。配向制御光１１７の振動方向を回動させることで、第３の複合体２２の配向方向を焦点１１７ａの位置において変化させることができる。なお、図６Ａ～図６Ｃにおいては、説明を分かりやすくするために第２の複合体２０ｂおよび第３の複合体２２を内壁面１０ａと離れた位置において示した。なお、試薬保持部は必ずしも四角柱状の形状を有している必要はなく、少なくとも一部に平面を有していれば同様の効果が得られる。すなわち、その平面と溶液との界面において焦点を結ぶように配向制御光を照射すれば第３の複合体は横に移動して配向制御光の外に出ることがなく、平面に押しつけられて配向される。
　図８Ａおよび図８Ｂは、第３の複合体２２の配向方向に対する励起光１１９の振動方向を示す図である。
　図８Ａは偏光方向制御部が配向制御光を素通りさせた場合における第３の複合体の配向方向と励起光の振動方向との関係を示す図である。図８Ａに示す試薬容器１０の側面図に対し、励起光１１９は紙面に垂直な方向に振動しながら紙面上方に向かって進行して血漿１６中に入射する。図８Ａに示す試薬容器１０の上面図に対しては、励起光１１９の振動方向は紙面の上下方向となる。この場合、励起光１１９の振動方向と第３の複合体２２の配向方向との関係は、図３Ｂと同様になる。従って、励起光１１９と第３の複合体２２との表面プラズモン共鳴により発生する電場の強度は図３Ｂと同様になる。
　図８Ｂは、配向制御光の振動方向を９０度切り替えた場合における第３の複合体の配向方向と励起光の振動方向との関係を示す図である。図８Ｂにおいても、試薬容器１０の側面図に対し、励起光１１９は紙面に垂直な方向に振動しながら紙面上方に向かって進行して血漿１６中に入射する。図８Ｂに示す試薬容器１０の上面図に対しても、励起光１１９の振動方向は紙面の上下方向となる。この場合、励起光１１９の振動方向と第３の複合体２２の配向方向との関係は、図３Ｃと同様になる。従って、励起光１１９と第３の複合体２２との表面プラズモン共鳴により発生する電場の強度は図３Ｃと同様になる。そのため、配向制御信号が０Ｖから５Ｖに変化すると、第３の複合体２２から発生する蛍光の量が増加する。一方、第１の複合体２０ａおよび第２の複合体２０ｂから発生する蛍光の量は、配向制御信号に依らず一定である。なお、図８Ａ～図８Ｂにおいても、説明を分かりやすくするために第２の複合体２０ｂおよび第３の複合体２２を内壁面１０ａと離れた位置において示した。
　このように生体分子検出装置１００は、第３の複合体２２の配向方向を配向制御信号に同期して変化させ、第３の複合体２２から発生する蛍光強度を配向制御信号に同期して変化させる。ロックインアンプ１２７に入力する参照信号の周期を配向制御信号と同一のものとすれば、血漿１６全体から発生する蛍光から、第３の複合体２２から発生する蛍光の寄与分を検出することができる。
　測定の際にＦＧ１２２が出力する配向制御信号、測定の際に受光部１２４が出力する受光部出力および測定の際にロックインアンプ１２７が出力するロックインアンプ出力の例を図９に示す。なお、ここでは説明を容易にするため、受光部出力およびロックインアンプ出力については、グラフを模式的に示してある。
　ＦＧ１２２から出力される配向制御信号は、測定前は０Ｖとなっている。配向制御信号は、０～Ｔ（秒）までの間は５Ｖの信号を出力し、Ｔ～２Ｔ（秒）までの間は０Ｖの信号を出力する周期２Ｔの方形波である。
　生体分子検出装置１００は、時刻Ｔ１で配向制御信号を５Ｖにすると共に、励起光を試薬容器１０に向けて照射する。配向制御信号を５Ｖとすると、偏光方向制御部１２０が配向制御光１１７の振動方向を切り替える。
　時刻Ｔ１において励起光１１９が血漿１６に照射されると受光部出力はｉｚの値を出力する。受光部出力ｉｚは、血漿１６中に含まれる第１の複合体２０ａ、第２の複合体２０ｂおよび第３の複合体２２が有する蛍光分子１４が発生する蛍光の総和である。
　時刻Ｔ１において配向制御光１１７の振動方向が切り替わったことに伴い、第３の複合体２２の配向方向が切り替わり、第３の複合体２２が有する２つの金ナノ粒子８の間の電場が増強される。第３の複合体２２が有する２つの金ナノ粒子８の間の電場が増強されたことに伴い、受光部出力もｉｚから増加していく。血漿１６中の全ての第３の複合体２２の配向方向の切り替えが完了すると、受光部出力は値ｉｔで飽和する。
　配向制御信号は、５Ｖの出力がＴ秒間続いた後０Ｖとなる。このＴ秒は、少なくとも全ての第３の複合体２２の配向方向の切り替えが完了する以上の期間、すなわち受光部出力が値ｉｔで飽和をする以上の期間を取る。全ての第３の複合体２２の配向の切り替えが完了し、時刻Ｔ２になると配向制御信号が５Ｖから０Ｖに変わる。配向制御信号が５Ｖから０Ｖに変わると、第３の複合体２２の配向方向が切り替わり、第３の複合体２２が有する２つの金ナノ粒子８の間の電場が弱くなる。そのため、受光部出力は徐々に減少してｉｚとなる。
　時刻Ｔ２から時間Ｔが経過し、時刻Ｔ３で再び配向制御信号が５Ｖとなると、受光部出力も増加して値ｉｔで飽和する。ここで、配向制御信号を０Ｖとする期間は、配向制御信号を５Ｖとしていた期間と同じＴ秒とした。これは、配向制御光１１７の出力が一定という条件下では、血漿１６中の第３の複合体２２の配向方向の切り替えが完了するまでに要する時間は、配向制御信号を０Ｖから５Ｖとした場合と、配向制御信号を５Ｖから０Ｖにした場合とで、ほぼ同じ時間がかかるためである。
　時刻Ｔ３から時間Ｔが経過し、時刻Ｔ４で配向制御信号が０Ｖとなることに伴い、受光部出力も減少して値ｉｚとなる。なお、配向制御信号の１周期は２Ｔであるため、Ｔ４－Ｔ３＝Ｔ３－Ｔ２＝Ｔ２－Ｔ１＝Ｔである。つまり、受光部出力は配向制御信号と同様に周期２Ｔで値の増減を繰り返す周期的な出力となる。
　ロックインアンプ１２７は、入力された信号から参照信号と同期して増減する成分を検出する。生体分子検出装置１００では、配向制御信号と同じ周期を有する信号が参照信号としてロックインアンプ１２７に入力されている。すなわち、ロックインアンプ１２７は、受光部出力から配向制御信号に同期した成分を検出する。受光部出力は、配向制御信号と同様に周期２Ｔの周期的な信号であるが、受光部出力の周期的な成分に寄与しているものは、配向制御信号により配向される第３の複合体２２に付随した蛍光分子１４である。従って、ロックインアンプ１２７により、配向制御信号と同期した成分を検出すると、受光部出力の中から第３の複合体２２による寄与分を検出することができる。ロックインアンプ出力は、当初は増減を繰り返す不安定な出力であるが、徐々に値Ｓに収束する。値Ｓは、血漿１６中の全ての第３の複合体２２に付随した蛍光分子１４が発生した蛍光に基づく受光部出力である。
　ＣＰＵ１３２は、ロックインアンプ出力Ｓから検出対象物質の濃度Ｃを算出する。具体的には、次式（１）によって求める。
　Ｃ＝ｆ（Ｓ）・・・（１）
　ここで、ｆ（Ｓ）は、検量線関数である。生体分子検出装置１００は、あらかじめ測定項目ごとに異なる検量線関数を持っておき、測定値Ｓを診断値Ｃに変換する。ＣＰＵ１３２は、得られた診断値Ｃを表示部１０２へ出力する。
　以上説明したように、本発明の実施の形態１に係る生体分子検出装置１００によれば、配向制御光１１７の振動方向の切り替えにより、血漿１６内に存在する第３の複合体２２の配向方向を切り替えることが可能な構成とした。配向制御光１１７による第３の複合体２２の配向方向は、表面プラズモン共鳴により第３の複合体２２が有する２つの金ナノ粒子８の間に発生する電場の強度が大きく異なる２つの方向である。そのため、第３の複合体２２の配向方向の変化により、第３の複合体２２から発生する蛍光の強度は大きく異なる。そして、第３の複合体２２の配向方向を周期的に変化させながら表面プラズモン共鳴を起こさせ、血漿１６から発生した全蛍光量から第３の複合体の配向方向が変化する周期と同期する成分をロックインアンプ１２７によって検出するため、配向制御光１１７により配向される第３の複合体に付随した蛍光の寄与分を算出することができ、簡便な構成で検出対象物質の濃度を正確に測定することができる。
　また、以上の構成において、生体分子検出装置１００は、配向制御光１１７による外力によって、第３の複合体２２の配向を全て同一方向に制御するため、ブラウン運動というランダムな運動を利用して測定する場合に比べて、高感度な測定をすることができる。
　また、配向制御信号を５Ｖと０Ｖとの間で切り替える際の時間間隔は、第３の複合体２２の質量や体積、溶媒の粘度、溶液の温度等に基づいて変化させることが望ましい。すなわち、配向制御光の振動方向の切り替わりにより第３の複合体２２が配向方向が変化し始め、その変化が完了するまでに要する時間は、第３の複合体２２の体積、溶媒の粘度、溶液の温度、溶液中における第３の複合体２２の回転しやすさ等によって決まる。例えば、検体の粘度が高い場合等、第３の複合体２２が溶液中で回転しにくい場合は、第３の複合体２２の配向方向の切り替えが完了するまでに要する時間が長くなるため、配向制御信号を５Ｖまたは０Ｖとする期間を、第３の複合体２２の配向方向の切り替えが完了する程度まで長くすることが望ましい。ここで、第３の複合体２２の配向方向の切り替えが完了するまでに要する時間は、受光部出力に基づいて決定することができる。例えば、図９においては、受光部出力が最大値となった時刻Ｔ２から初めに配向制御信号を５Ｖにした時刻Ｔ１を減算すること、すなわちＴ２－Ｔ１を行うことにより、第３の複合体２２の配向方向の切り替えが完了するまでに要する時間を求めることができる。
　また、本実施の形態では、配向制御光１１７として波長９０９ｎｍ、出力７００ｍＷのレーザー用いたが、配向制御光１１７はこのレーザーに限られない。配向制御光１１７の波長および出力強度は、第３の複合体２２の体積、質量等、これらに起因する溶液中での回転しやすさに基づいて決定することが望ましい。配向制御光１１７の波長は、第３の複合体２２蛍光測定に影響を与えない波長であれば何でも良い。また、配向制御光１１７の出力は、第３の複合体２２等の複合体に悪影響を与えない程度の出力とすることが望ましい。また、配向制御光１１７は、必ずしも第３の複合体を配向させる程度の出力である必要はない。第３の複合体および第６の複合体は、溶液中でブラウン運動をしており、配向方向を切り替えていない場合においても発生する蛍光の強度は変化している。第３の複合体または第６の複合体が配向しない程度の強度の配向制御光１１７を照射すると、第３の複合体または第６の複合体は、ブラウン運動を阻害される。
　また、本実施の形態では、励起光１１９として波長６３５ｎｍ、出力１０ｍＷの光を用いたが、励起光１１９に用いる光はこの光に限られない。励起光１１９の波長は、金ナノ粒子８との間で表面プラズモン共鳴を起こす波長であれば良いが、蛍光分子１４を直接励起しない波長帯の光を用いることが望ましい。また、励起光１１９の出力は、金ナノ粒子８との間で表面プラズモン共鳴を起こし、発生した電場によって発生する蛍光が受光部１２４によって検出可能な程度の強度となる出力以上であれば何でも良い。一方、第３の複合体２２等に悪影響を与えない程度の出力であることが望ましい。また、励起光源部１１８は、ランプと干渉フィルタの組み合わせによって構成しても良い。
　なお、実施の形態１においては、第１の複合体２０ａは、第１の抗体１２ａ、蛍光分子１４およびＢＳＡ２４が金属消光防止膜の表面全体に偏りなく結合している構造であったが、第１の複合体は必ずしもこのような構造である必要はない。また、第２の複合体も必ずしも実施の形態１で説明したような構造である必要はない。同様に、第１の複合体および第２の複合体が検出対象物質と結合して生成される第３の複合体も必ずしも実施の形態１で説明したような構造である必要は無い。
　図１０Ａは、第１の複合体の別の構造を示す模式図である。第１の複合体２６ａは、金ナノ粒子８全体に偏りなく結合したＢＳＡ２４と、金ナノ粒子８に単独で結合された第１の抗体１２ａと、第１の抗体１２ａに結合された複数の蛍光分子１４とによって構成される。このように蛍光分子が標識された抗体を蛍光色素標識抗体という。第１の複合体２６ａと第１の複合体２０ａとの違いは、金ナノ粒子８に結合されている第１の抗体１２ａが単数であること、蛍光分子１４が第１の抗体１２ａに結合されていること、および金ナノ粒子８上に金属消光防止膜が設けられていないことである。抗体に蛍光色素を標識することで、金ナノ粒子と蛍光色素の間の距離を数ｎｍ～１５ｎｍ程度離すことができるため、抗体に標識されている蛍光色素の一部については金属消光が防止され、ＳｉＯ２シェルのような特別な構造を有する粒子を用いる必要がないというメリットがある。
　このような構造を作成するため、金ナノ粒子８と蛍光色素標識抗体とを結合させる際は、金ナノ粒子８の数と蛍光色素標識抗体の数をほぼ同数混合する。すると、蛍光色素標識抗体は、金ナノ粒子８に単数のみ結合する。
　図１０Ｂは、第２の複合体の別の構造を示す模式図である。第２の複合体２６ｂは、金ナノ粒子８と、金ナノ粒子８の表面全体に偏りなく結合したＢＳＡ２４と、金ナノ粒子８に単独で結合された第２の抗体１２ｂと、第２の抗体１２ｂに結合された複数の蛍光分子１４とによって構成される。第１の複合体２６ｂと第１の複合体２０ｂとの違いは、金ナノ粒子８に結合されている第２の抗体１２ｂが単数であること、蛍光分子１４が第２の抗体１２ｂに結合されていること、および金ナノ粒子８上に金属消光防止膜が設けられていないことである。
　第１の複合体２６ａおよび第２の複合体２６ｂは、通常の抗体の代わりに蛍光標識抗体を用いて、金ナノ粒子８として、アビジン標識された直径２０ｎｍの金ナノ粒子であるＮａｎｏｐａｒｔｓ社の２０－ＰＮ―２０を用いれば、第１の複合体２０ａと同様の手順により作成することができる。蛍光標識抗体は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ社のＡｌｅｘａたんぱく質標識キットを用いて作成する。
　図１０Ｃは、第３の複合体の別の構造を示す模式図である。第１の複合体２６ａおよび第２の複合体２６ｂが抗原１８に結合すると、第３の複合体２８が生成される。第１の複合体２６ａおよび第２の複合体２６ｂの蛍光分子１４は、それぞれ第１の抗体１２ａまたは第２の抗体１２ｂに結合されているため、第３の複合体２８においては、第１の複合体２６ａが有する金ナノ粒子８と第２の複合体２６ｂが有する金ナノ粒子８との間にのみ蛍光分子１４が存在することになる。
　このような構造の第３の複合体２８は、第３の複合体２２に比べ蛍光分子１４の絶対量は減少する。そのため、単一の第３の複合体が発生する蛍光の量も減少する。しかし、表面プラズモン共鳴に伴って発生する電場は、図３Ｂ、図３Ｃに示したように第３の複合体の配向方向の変化により、主に第１の複合体が有する金ナノ粒子８と第２の複合体が有する金ナノ粒子８との間において強度が変化する。すなわち、第３の複合体２８が有する蛍光分子１４は、第３の複合体２８の配向方向の変化に伴い電場の強度が変わる位置にのみ存在する。そのため、このような構成の第１の複合体２６ａおよび第２の複合体２６ｂを用いて実施の形態１と同様の測定を行うと、第３の複合体２８からは、表面プラズモン共鳴に伴って発生する電場の強度を反映した強さの蛍光のみが発生する。つまり、第３の複合体２８の配向方向の変化が、より蛍光の強度に的確に反映されるため、測定の精度を向上させることができる。
　また、配向方向の変化に伴い電場の強度が変わる位置にのみ蛍光分子が存在する第３の複合体を形成する第１の複合体および第２の複合体の別の例を図１１Ａおよび図１１Ｂに示す。図１１Ａは、第１の複合体の別の構造を示す模式図である。第１の複合体３２ａは、金ナノロッド３０と、金ナノロッド３０の表面全体に偏りなく結合したＢＳＡ２４と、金ナノロッド３０に単独で結合された第１の抗体１２ａと、第１の抗体１２ａに結合された複数の蛍光分子１４とによって構成される。第１の複合体３２ａと第１の複合体２６ａとの違いは、金ナノ粒子８の代わりに金ナノロッド３０を用いたことである。金ナノロッド３０は、柱状の形状を有する金ナノ粒子である。金ナノロッド３０は、短軸１０ｎｍ、長軸５０ｎｍ程度の大きさのものを使用する。
　図１１Ｂは、第２の複合体の別の構造を示す模式図である。第２の複合体３２ｂは、金ナノロッド３０と、金ナノロッド３０の表面全体に偏りなく結合したＢＳＡ２４と、金ナノロッド３０に単独で結合された第２の抗体１２ｂと、第２の抗体１２ｂに結合された複数の蛍光分子１４とによって構成される。第２の複合体３２ｂと第２の複合体２６ｂとの違いは、金ナノ粒子８の代わりに金ナノロッド３０を用いたことである。
　第１の複合体３２ａおよび第２の複合体３２ｂは、通常の抗体の代わりに蛍光標識抗体を用いて、金ナノ粒子の代わりにアビジン標識された金ナノロッドを用いれば、第１の複合体２０ａと同様の手順により作成することができる。
　図１１Ｃは、第３の複合体の別の構造を示す模式図である。第１の複合体３２ａおよび第２の複合体３２ｂが抗原１８に結合すると、第３の複合体３４が生成される。第１の複合体３２ａおよび第２の複合体３２ｂの蛍光分子１４は、それぞれ第１の抗体１２ａまたは第２の抗体１２ｂに結合されているため、第３の複合体３２においてに、第１の複合体３２ａが有する金ナノ粒子８と第２の複合体３２ｂが有する金ナノ粒子８との間にのみ蛍光分子１４が存在することになる。このような構成の第１の複合体３２ａおよび第２の複合体３２ｂを用いて実施の形態１と同様の測定を行っても、第１の複合体２８ａおよび第２の複合体２８ｂを用いて測定を行った場合と同様に、測定の精度を向上させることができる。また、このような構成の第１の複合体３２ａおよび第２の複合体３２ｂを用いても、蛍光分子１４が金ナノロッド３０の表面から十分離れるため、金ナノロッド３０に金属消光防止膜等をもうけることなく金属消光を防止することができる。
　（実施の形態２）
　実施の形態２では、４種類の複合体を使用し、均一溶液中で検出対象物質である特定の２種類の抗原を検出する。４種類の複合体の内２種類は、実施の形態１で示した第１の複合体２０ａおよび第２の複合体２０ｂと同一のものであるため説明を省略する。本実施の形態で使用する残りの２種類の複合体である第４の複合体および第５の複合体について説明する。
　図１２Ａは、第４の複合体２０ｃの模式図である。第４の複合体２０ｃは、直径が２０ｎｍの略球形の金ナノ粒子８の表面全体をＳｉＯ２からなる厚み１０ｎｍの金属消光防止膜で覆い、金属消光防止膜の表面複数の第３の抗体１２ｃと複数の蛍光分子３６と複数のＢＳＡ２４とが結合されている。第３の抗体１２ｃ、蛍光分子３６およびＢＳＡ２４は、第４の複合体２０ｃが有する金属消光防止膜の表面全体に偏りなく結合している。すなわち、第４の複合体２０ｃは、第１の複合体２０ａと比べ、抗体と蛍光分子の種類が異なる。
　図１２Ｂは、本発明の実施の形態１において使用する第５の複合体２０ｄの模式図である。第５の複合体２０ｄは、直径が２０ｎｍの金ナノ粒子８の表面全体をＳｉＯ２からなる厚み１０ｎｍの金属消光防止膜で覆い、金属消光防止膜の表面に複数の第４の抗体１２ｄと複数の蛍光分子３６と複数のＢＳＡ２４とが結合されている。第４の抗体１２ｄ蛍光分子３６およびＢＳＡ２４は、第５の複合体２０ｄが有する金属消光防止膜の表面全体に偏りなく結合している。すなわち、第５の複合体２０ｄは、第１の複合体２０ａと比べ、抗体と蛍光分子の種類が異なる。このように、第４の複合体２０ｃおよび第５の複合体２０ｄは、第１の複合体２０ａおよび第２の複合体２０ｂと同様に等方的な形状を有する。
　第３の抗体１２ｃおよび第４の抗体１２ｄは、検出対象物質である抗原の特定部位と反応し、それぞれ異なる位置に結合する抗体である。本実施の形態においては、第３の抗体１２ｃとしてＲ＆ＤＳＹＳＴＥＭＳ社のＭＡＢ４１２８（Ｈｕｍａｎ ＣＥＡＣＡＭ-５　Ａｎｔiｂｏｄｙ）を用い、第４の抗体１２ｄとしてＲ＆ＤＳＹＳＴＥＭＳ社のＭＡＢ４１２８（Ｈｕｍａｎ ＣＥＡＣＡＭ-５）を用いた。本実施の形態では、検出対象物質として血漿中のＥｒｂＢ２／Ｈｅｒ２タンパク質およびＣＥＡたんぱく質の２種類の抗原を検出する。以下では、検出対象物質であるＥｒｂＢ２／Ｈｅｒ２タンパク質を以下では抗原１８と呼び、検出対象物質であるＣＥＡたんぱく質を抗原４０と呼ぶ。本実施の形態で用いた第１の抗体１２ａ、第２の抗体１２ｂ、第３の抗体１２ｃおよび第４の抗体１２ｄは、いわゆるサンドイッチ法を行って抗原を検出するための抗体である。従って、これらの抗体は、抗原をそれぞれ異なるエピトープで認識して結合する。すなわち、第１の抗体１２ａおよび第２の抗体１２ｂは、抗原１８のそれぞれ異なる位置に特異的に結合する。第３の抗体１２ｃおよび第４の抗体１２ｄは、抗原４０のそれぞれ異なる位置に特異的に結合する。また、第１の抗体１２ａおよび第２の抗体１２ｂならびに第３の抗体１２ｃおよび第４の抗体１２ｄは、互いに立体障害とならないように抗原の立体構造上の遠い位置に結合する。なお、図１２Ａおよび図１２Ｂにおける第３の抗体１２ｃと第４の抗体１２ｄの図は、それぞれ異なる凹凸形状を示すことにより、抗原の異なる位置に結合することを表しているが、第３の抗体１２ｃおよび第４の抗体１２ｄは必ずしもこのような形状をしているわけではない。
　蛍光分子３６には、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　６４７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ社の商品名）を用いた。Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　６４７は、波長６７０ｎｍ程度にピークを持ち、６２０ｎｍ－７５０ｎｍ程度の波長を持った蛍光を発光する。第４の複合体２０ｃおよび第５の複合体２０ｄは同種の蛍光分子３６を有する。第４の複合体２０ｃおよび第５の複合体２０ｄは、第１の複合体２０ａと同様の手順により作成する。
　図１２Ｃは、第４の複合体２０ｃおよび第５の複合体２０ｄの双方が抗原４０と結合した場合を示す図である。以下、この図のように第４の複合体２０ｃおよび第５の複合体２０ｄの双方が抗原４０に結合した複合体を第６の複合体３８と呼ぶ。図１２Ｃにおいては、第３の抗体１２ｃおよび第４の抗体１２ｄが抗原４０のそれぞれ異なる位置に特異的に結合することを示すため、第３の抗体１２ｃおよび第４の抗体１２ｄのそれぞれの凹凸形状と合った凹凸形状を有する図により抗原４０を示している。そのため、実際の抗原１８は必ずしもこのような形状ではない。
　第３の抗体１２ｃおよび第４の抗体１２ｄは抗原４０に対してサンドイッチ法を行うための抗体であるため、第４の複合体２０ｃおよび第５の複合体２０ｄの双方が抗原４０と結合した場合には、図１２Ｃのように第４の複合体２０ｃと第５の複合体２０ｄが抗原４０を挟んで向かい合った位置に結合する。すなわち、第６の複合体３８においては、第４の複合体２０ｃ、抗原４０および第５の複合体２０ｄが直線上に並んだ構造となる。以下、第６の複合体３８において、第４の複合体２０ｃ、抗原４０および第５の複合体２０ｄが並んだ方向を長軸方向といい、長軸方向に垂直な方向を短軸方向という。第６の複合体３８において、第４の複合体２２ｃが有する金ナノ粒子８と第５の複合体２２ｄが有する金ナノ粒子８との距離は、約３０ｎｍとなる。
　図１３Ａおよび図１３Ｂは、本実施の形態に係る生体分子検出装置における抗原抗体反応の概要を示した模式図である。図１３Ａは抗原抗体反応前の状態を表す。図１３Ａおよび図１３Ｂにおいては、外部に露出していない試薬保持部を破線によって示してある。試薬保持部の中には、乾燥した複数の第１の複合体２０ａ、第２の複合体２０ｂ、第４の複合体２０ｃおよび第５の複合体２０ｄが入れられている。
　本実施の形態においても、実施の形態１と同様に検体は全血から分離した血漿１６である。試薬容器１０に血漿１６を分注して撹拌すると、第１の抗体１２ａおよび第２の抗体１２ｂと特異的に結合する抗原１８が血漿１６中に存在する場合は、第１の抗体１２ａおよび第２の抗体１２ｂと抗原１８との間で抗原抗体反応が起こり、図２Ｂに示すように第３の複合体２２が形成される。また、第３の抗体１２ｃおよび第４の抗体１２ｄと特異的に結合する抗原４０が血漿１６中に存在する場合は、第３の抗体１２ｃおよび第４の抗体１２ｄと抗原４０との間で抗原抗体反応が起こり、図２Ｂに示すように第６の複合体３８が形成される。
　図示しないが、第１の複合体２０ａ、第２の複合体２０ｂ、第４の複合体２０ｃおよび第５の複合体２０ｄは抗原１８および抗原４０に対して十分に多い量が入れられているため、第１の複合体２０ａ、第２の複合体２０ｂ、第４の複合体２０ｃおよび第５の複合体２０ｄの一部は、抗原抗体反応をしないまま血漿１６内に残る。すなわち、第１の複合体２０ａ、第２の複合体２０ｂ、第４の複合体２０ｃおよび第５の複合体２０ｄと混合された血漿１６内には第１の複合体２０ａ、第２の複合体２０ｂ、第３の複合体２２、第４の複合体２０ｃ、第５の複合体２０ｄおよび第６の複合体３８が混在している。
　なお、血漿１６中には抗原１８および抗原４０以外の成分も存在するが、説明を簡単にするため、図１３ＡおよびＢにおいては抗原１８および抗原４０以外の成分は省略して示してある。
　本実施の形態に係る生体分子検出装置２００は、液相であることにより第１の複合体２０ａ、第２の複合体２０ｂ、第３の複合体２２、第４の複合体２０ｃ、第５の複合体２０ｄおよび第６の複合体３８が混在している血漿１６に対して励起光を照射し、励起光と金ナノ粒子８との間で表面プラズモン共鳴を発生させ、表面プラズモン共鳴により発生する電場によって蛍光分子１４および蛍光分子３６を発光させ、当該血漿１６内から発生する蛍光を測定することにより抗原１８または抗原４０の検出および定量を行う。
　図１４は、生体分子検出装置２００の主要な構成を説明するための機能ブロック図である。なお、実施の形態１と同一の構成要素には同一の符号を付し、その説明を省略する。生体分子検出装置２００は、生体分子検出装置１００の構成に対して、ＣＰＵ２０２および受光部２０４が主に異なる。
　ＣＰＵ２０２は、Ａ／Ｄ変換部１２８から送られたデジタルデータの演算を行い、その結果を表示部１０２へ出力する。また、ＣＰＵ２０２は、ユーザー入力部１０４から入力を受けて、配向制御用光源部１１６、励起光源部１１８、分注部１１４、ＦＧ１２２および受光部２０４の動作の指示命令を行う。具体的には、配向制御用光源部１１６および励起光源部１１８のＯＮ、ＯＦＦ命令、分注部１１４に対して、使用する試薬を指定する命令および分注動作開始命令、ＦＧ１２２に対して、出力する信号波形の指示命令および出力命令、受光部２０４に対して、フィルタの切り替え命令を行う。
　受光部２０４は、試薬容器１０内の蛍光分子から発生した蛍光を検出する受光部である。受光部２０４は、ＣＰＵ２０８からの命令（Ｓ１）を受けて、蛍光分子１４と蛍光分子３６との蛍光を分離して受光できるように構成されている。
　受光部２０４の構成について、図１５を用いて具体的に説明する。図１５は、実施の形態２に係る生体分子検出装置２００における受光部２０４の詳細な構成を表した模式図である。受光部２０４は、レンズ２０６、レンズ２１６、フィルタ切り替え部２０８および偏光子２１４を有する。試薬容器１０内の蛍光分子１４および蛍光分子３６から発生した蛍光は、レンズ２０６によって集光され、フィルタ切り替え部２０８、偏光子２１４およびレンズ２１６を通ってフォトダイオード２１８へ入射する。
　フィルタ切替部２０８は、フィルタ２１０およびフィルタ２１２の２種類のフィルタを備えている。２種類のフィルタは可動式となっており、レンズ２０６によって集光された蛍光が通過するフィルタを切り替えることができる。フィルタ切替部２０８は、ＣＰＵ２０２からの命令Ｓ１を受けて、蛍光が通過するフィルタを切り替える。
　フィルタ２１０は、蛍光分子１４が発生する波長帯の光のみを透過するバンドパスフィルタである。フィルタ２１２は、蛍光分子３６が発生する波長帯の光のみを透過するバンドパスフィルタである。フィルタ切り替え部２０８はＣＰＵ２０２からの命令Ｓ１に従い、抗原１８の測定を行う際はフィルタ２１０を蛍光の光路に位置させて測定を行い、抗原４０の測定を行う際はフィルタ２１２を蛍光の光路に位置させて測定を行う。このような構成により、受光部２０４は、検出対象物質を含む複合体以外から発生する光がフォトダイオード２１８に到達することを防いでいる。なお、必ずしもフィルタを用いる必要はなく、例えば回折格子等を用いて分光してもよい。
　偏光子２１４は、励起光１１９の偏光方向と同じ方向に偏光した光のみを透過する。試薬容器１０内で散乱された励起光１１９や配向方向を切り替えている途中の蛍光分子１４または蛍光分子３６から発光した蛍光は、偏光方向が元々の励起光の偏光方向と異なっているため偏光子１４６を透過できない。
　ＰＤ２１８は、ＡＰＤ（Ａｖａｌａｎｃｈｅ　Ｐｈｏｔｏｄｉｏｄｅ）によって構成され、レンズ２１６によって集光された蛍光を受光し、蛍光の強度に応じた電荷を発生させて増幅部１２６へ出力する。
　続いて生体分子検出装置２００の測定動作について説明する。生体分子検出装置２００の測定動作は、基本的には実施の形態１で説明した生体分子検出装置１００の測定動作と同じであるが、細かな点で異なる。検出対象物質を含む複合体から発生する蛍光のみを分離可能な理由については実施の形態１で説明したため、ここでは２種類の検出対象物質をそれぞれ含む第３の複合体２２と第６の複合体３８とを分離して検出する方法を説明する。
　生体分子検出装置２００は、まず抗原１８または抗原４０のどちらを先に検出するか決定する。これは、ユーザーが、ユーザー入力部１０４を通して入力する等して任意に決定することができる。ここでは、抗原１８を有する第３の複合体２２から先に検出する。ＣＰＵ２０２は、受光部２０４内のフィルタ切替部２０８に、フィルタ２１０の使用を指示する命令を出す。フィルタ切替部２０８は、ＣＰＵ２０２からの命令を受け、レンズ２０６により集光された光が通る位置にフィルタ２１０を移動させる。配向制御信号が５Ｖに変わり、試薬容器１０に向けて励起光１１９が照射されると、溶液内の蛍光分子１４および蛍光分子３６は、蛍光を発生する。蛍光分子１４および蛍光分子３６から発生した蛍光は、レンズ２０６によって集光され、フィルタ２１０へ入射する。フィルタ２１０は、蛍光分子１４が発生するの波長帯の光のみを透過するため、蛍光分子３６から発生した蛍光は、ほぼ全て遮断する。このようにして受光部２０４は、蛍光分子１４から発生した蛍光のみを検出することができる。
　実施の形態１と同様に、生体分子検出装置２００によって配向制御信号の数周期分の測定を行い、蛍光分子１４から発生した蛍光の検出を行った結果の受光部出力を、図１６Ａに示す。受光部出力は、配向制御信号と同じ周期を有する信号を出力する。ロックインアンプは、受光部出力の中から配向制御信号に同期した成分を検出して、値Ｓ１を出力する。
　続いて、ＣＰＵ２０２は、得られた値Ｓ１から、抗原１８の濃度を算出する。具体的には、実施の形態１と同様に検量線関数ｆ１（Ｓ）を用いて、測定値Ｓ１から濃度Ｃ１に変換する。ＣＰＵ２０２は、得られた濃度Ｃ１を表示部１０２へ出力する。
　次に、生体分子検出装置２００は、抗原４０を有する第６の複合体３８の測定を行う。ＣＰＵ２０２は、受光部２０４内のフィルタ切替部２０８に、フィルタ２１２の使用を指示する命令を出す。フィルタ切替部２０８は、ＣＰＵ２０２からの命令を受け、レンズ２０６で集光された光が通る位置にフィルタ２１２を移動させる。フィルタ２１２は、蛍光分子３６が発生する波長帯の光のみを透過するため、蛍光分子１４から発生した蛍光は、ほぼ全て遮断する。このようにして、受光部２０４は、蛍光分子３６から発生した蛍光のみを検出することができる。
　生体分子検出装置２００によって配向制御信号の数周期分の測定を行い、蛍光分子３６から発生した蛍光の検出を行った結果の受光部出力を、図１６Ｂに示す。なお、図１６Ａおよび図１６Ｂにおいては、計算を容易にするためグラフを模式的に示してある。受光部出力は、配向制御信号と同じ周期を有する信号を出力する。
　第６の複合体３８を測定する場合の配向制御信号の切り替えタイミングは、第３の複合体２２を測定する場合と異なる。これは、第３の複合体２２および第６の複合体３８の体積および質量が異なるため、それぞれの複合体が配向を完了するまでに要する時間が異なるためである。
　図１６Ａおよび図１６Ｂに示したように、第３の複合体２２を測定する場合と、第６の複合体３８を測定する場合とでは、受光部出力の最大値および最小値は異なる。これは、第３の複合体２２と第６の複合体３８との溶液中での濃度の違いに起因する。
　続いて、ＣＰＵ２０２は、得られた値Ｓ２から抗原４０の濃度を求める。具体的には、検量線関数ｆ２（Ｓ）を用いて、測定値Ｓ２から濃度Ｃ２に変換する。ＣＰＵ２０２は、得られた濃度Ｃ２を表示部１０２へ出力する。
　以上説明したように、本発明の実施の形態２に係る生体分子検出装置２００によれば、実施の形態１で説明した生体分子検出装置１００の構成に加え、検出対象物質と特異的に結合する物質として４種類の複合体および２種類の蛍光分子を用い、フィルタ切替部２０８を２種類のフィルタの切り替えが可能な構成とした。そのため、検出対象物質を含む複合体に付随した蛍光分子に対応したフィルタを使用することで、検出対象物質を含む複合体に付随した蛍光分子から発生する蛍光のみを検出することができ、一の検体に含まれる２種類の検出対象物質の濃度を正確に測定することができる。
　なお、本実施の形態では、蛍光分子としてＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ５６８およびＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ６４７を使用したが、使用する蛍光分子はこれらに限られない。複数の検出対象物質のそれぞれ特異的に結合する複合体を、それぞれ異なった蛍光分子で標識し、フィルタで分離できる程度にそれぞれの蛍光波長、励起波長または蛍光寿命が離れている蛍光分子を用いれば良い。
　また、本実施の形態では検出対象物質が２種類の場合について説明したが、検出対象物質は、それより多くても良い。その場合においても、それぞれの検出対象物質と特異的に結合する２種類の複合体でサンドイッチ法を行い、それぞれ異なった蛍光分子で標識し、それぞれの蛍光分子から発生する蛍光を、それぞれの蛍光に対応したフィルタで分離して検出することで、それぞれの検出対象物質を分離して検出することができる。
　なお、検出対象物質が増えるほど蛍光分子の種類も増え、複数の蛍光分子から発生する蛍光が混在することになるため、より狭い通過帯域を持つバンドパスフィルタを用いることで、目的の蛍光分子が発生する蛍光を検出しやすくすることができる。
　なお、溶液中の第３の複合体２２または第６の複合体３８の配向の切り替えはレーザーによるものに限られず、それらの複合体を配向できれば、磁気的な方法や電気的な方法としても良い。
　光により分子の配向制御を行うと、磁力等によって分子の配向を制御する場合に比べ複雑な機構が必要ない。例えば、磁力を用いて分子の配向を制御するためには、それぞれの分子が磁性を持ったものであるか、磁性を持った分子を用意して、配向を制御したい分子に結合させる必要があり、測定にあたって準備が煩雑となる。
　また、第３の複合体２２または第６の複合体３８の配向方向は、必ずしもλ／２波長板によって切り替える必要はない。例えば、配向制御光１１７の振動方向を切り替える代わりに、配向制御光１１７の照射方向をＡＯＤ（Ａｃｏｕｓｔｏ　Ｏｐｔｉｃ　Ｄｅｆｌｅｃｔｏｒ）により切り替えることで配向方向を切り替えても良い。また、配向制御光１１７の照射方向を切り替えることで配向方向を切り替える場合、配向制御光配向制御用光源部を複数設けて配向制御光を照射する方向を切り替えても良い。
　また、配向制御用光源部は必ずしも１つのみを設ける必要はなく、複数の配向制御用光源部を設けて、同一方向に複数の配向制御光を照射しても良い。例えば、図１７（試薬容器１０の側面図）に示すように、４２ａ～４２ｉの９点にそれぞれ対応した９本の配向制御光を入射させるような態様でも良い。このように複数の位置から配向制御光を照射すると、配向制御光の偏光軸の中心に位置する第３の複合体２２または第６の複合体３８が増える。配向制御光の偏光軸の中心は、最も効率良く第３の複合体２２または第６の複合体３６を回動させることができる。なお、ここでは９点に配向制御光を入射させる例を示したが、配向制御光を入射させる点は９点に限られず、９点より多くても少なくても良い。配向制御光を細く絞るほど、多くの点に入射させることが望ましい。これにより、複数箇所で配向に同期して第３の複合体２２または第６の複合体３８を回動させることができる。その結果、突発的な蛍光強度の変動を低下させることができ、相対的な散らばりを表す指標である変動係数（Ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｏｆ　Ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を改善させることができる。この場合においても、それぞれの配向制御光は試薬容器１０を出射する端面において焦点を結ぶように照射されることが望ましい。
　このように、配向制御光を多点に入射させるための配向制御用光源部の構造について図１８に示す。配向制御用光源部２３０は、３×３の２次元レーザーアレイである。配向制御用光源部２３０は、発光点４４ａ～４４ｉの９点が発光する。発光点の大きさは縦が１μｍで横が１００μｍである。配向制御用光源部２３０を用いた光学系の例について図１９に示す。なお、図１９においては、配向制御光に係わる光学系以外は省略して示してある。
　配向制御用光源部２３０から照射された直線偏光した配向制御光２４０は、コリメータレンズ２３２を通って焦点において平行光線となる。コリメータレンズ２３２を通った配向制御光２４０は、ビームエキスパンダ２３４およびビームエキスパンダ２３６を通ってλ／２波長板を有する偏光方向制御部２３８へ入射する。ビームエキスパンダ２３４およびビームエキスパンダ２３６を通った配向制御光２４０は、特定の倍率の平行光束に広げられる。λ／２波長板は、回転ステージ上にあり回転可能となっている。これにより配向制御光２４０の偏光軸を回動することができる。λ／２波長板を透過した配向制御光２４０は、レンズ２４２により集光されて試薬容器１０の側面へ入射する。
　図１９に示す光学系において、コリメータレンズ２３２の焦点距離を３．１ｍｍ、レンズ２４２の焦点距離を４ｍｍとすると、倍率は１．２９倍となる。そのため、試薬容器１０の側面において、配向制御光２４０の大きさは約１．３μｍ×１３０μｍとなり、ピッチは約１２９μｍとなる。
　配向制御光を多点に入射させる別の光学系の例について図２０に示す。なお図２０においても、配向制御光の光学系以外は省略して描いてある。また、図１９と同一の構成要素には同一の符号を付し、その説明を省略する。
　図２０に示す光学系において、配向制御用光源部１１６は実施の形態１と同様のものである。配向制御光２４６は、コリメータレンズ４０６、ビームエキスパンダ４０８およびビームエキスパンダ４１０を通り、マイクロレンズアレイ２４２へ入射する。マイクロレンズアレイ２４２は、図２１に示すように、複数のマイクロレンズ２４８を格子状に並べたものである。マイクロレンズアレイ２４８を通った配向制御光２４６は、複数の光源から照射された光のように、異なる位置で焦点を結ぶ複数の光束となる。配向制御光２４６は、ピンホールアレイ２４４によって絞られ、偏光方向制御部２３８を通り、レンズ２４２により集光されて試薬容器１０の側面へ入射する。このようにマイクロレンズアレイを用いても、配向制御光を多点に入射させることができる。
　また、実施の形態１のような配向制御光を照射する方向を変える光学系においては、配向光を多点に照射するために、光学系を複数段用意しても良い。例えば、同様の光学系を３段重ねれば、３つの配向制御用光源部から配向制御光が照射され、試薬容器１０へ３点から入射させることができる。このようにしても、配向制御光を多点から照射することができ、複数箇所で第３の複合体２２または第６の複合体３８を回動させることができる。
　また、本発明に係る各実施の形態では、配向制御光１１７の振動方向を２つの直交する方向の間で切り替えたが、必ずしも２つの直交する方向の間で切り替える必要はない。例えば、検出対象物質の検出のみを行いたい場合は、第３の複合体２２または第６の複合体３８から発生する蛍光の強度が変わる程度だけ異なる方向に第３の複合体２２または第６の複合体３８を配向させれば良い。
　配向制御光１１７の振動方向を２つの直交する方向の間で切り替えれば、第３の複合体２２または第６の複合体３８の配向が完了するまでに要する時間が最大となって、最もＳ／Ｎが良くなる。一方で、例えば配向制御光１１７が進行する２つの方向の成す角度が６０度であれば、配向制御光１１７の進行方向が直交する場合と比べ、第３の複合体２２または第６の複合体３８の配向の切り替えが完了するまでに要する時間が短くなり、測定に要する時間も短くなる。このように配向制御光１１７が進行する２つの方向の成す角度が９０度より小さいほど、第３の複合体２２または第６の複合体３８の配向の切り替えが完了するまでに要する時間が短くなり、測定時間も短くなる。
　なお、上記各実施の形態では、生体分子検出装置内に試薬容器１０を１つ設ける場合を説明したが、必ずしも試薬容器１０は１つである必要はなく、装置内に複数の試薬容器を設けて複数の検体をセットできる構成としても良い。その場合は、装置が試薬容器を順に測定位置に移動させて測定を行う構成とすれば、自動で複数の検体を測定することができる。
　なお、上記各実施の形態では、既に生成された第１の複合体２０ａ、第２の複合体２０ｂ、第４の複合体２０ｃまたは第５の複合体２０ｄを用いて測定を行ったが、第１の複合体２０ａ、第２の複合体２０ｂ、第４の複合体２０ｃまたは第５の複合体２０ｄの生成を試薬容器１０内で行っても良い。この場合、ユーザーは、金ナノ粒子、抗体および蛍光分子をそれぞれ別の試薬タンクに用意しておき、測定時に生体分子検出装置が、金ナノ粒子、抗体、蛍光分子および検体をそれぞれ試薬容器１０へ分注して、反応させる。
　なお、上記各実施の形態においては、励起光と表面プラズモン共鳴を起こす粒子として金のナノ粒子を用いたが、必ずしも金ナノ粒子である必要はない。例えば、銀ナノ粒子や、銅ナノ粒子を用いても良い。
　また、配向制御用光源部１１６や励起光源部１１８は、着脱可能な構成として、検出対象物質および蛍光分子等に応じて、適切なものに交換できるような構成としても良い。
　配向方向を切り替える時間間隔は、検出対象物質、第３の複合体２２、第６の複合体３８の質量または体積と、配向制御手段による外力の強度等に基づいて、全ての第３の複合体２２または第６の複合体３８が配向の切り替えを完了するまでに要する時間によって決定することが望ましい。すなわち、全ての第３の複合体２２または第６の複合体３８が配向の切り替えを完了するまでに要する時間毎に配向方向を切り替えることが望ましい。このように配向方向を切り替える時間を決定すれば、全ての第３の複合体２２または第６の複合体３８が配向を完了した後も同一方向に配向制御光１１７を照射することがなくなり、消費電力を削減することができる。また、不要な時まで測定を続けることがなくなり、測定時間を短くすることができる。
　全ての第３の複合体２２または第６の複合体３８が配向の切り替えを完了するまでに要する時間は、受光部出力やＡ／Ｄ変換部出力に基づいて求めてもよい。例えば、測定を何周期か繰り返せば、それぞれの出力が飽和するまでにどのくらいの時間を要するかおおよそ分かるため、それぞれの出力が飽和するまでに要する時間を加算平均等して、算出した時間を所定の時間間隔として決めれば良い。
　なお、本発明に係る各実施の形態では、検体として全血から分離した血漿を用いる場合を例にとって説明したが、検体は全血から分離した血漿に限られず、尿や唾液等、検出対象物質が溶液中に分散していれば検体とすることができる。
　なお、上記各実施の形態では、抗原抗体反応を利用する場合を例にとって説明したが、検出対象物質と、検出対象物質に特異的に結合する物質との組み合わせは、抗原、抗体に限られず、例えば、抗原を用いて抗体を検出する場合や、特定のＤＮＡを用いて当該ＤＮＡとハイブリダイゼーションをするＤＮＡを検出する場合、ＤＮＡを用いてＤＮＡ結合性たんぱく質を結合する場合、リガンドを用いてレセプターを検出する場合、糖を用いてレクチンを検出する場合、プロテアーゼ検出を利用する場合、高次構造変化を用いる場合等がある。検出対象物質と検出対象物質に特異的に結合する物質の組み合わせが、抗原と抗体以外の場合においても、検出対象物質の異なる部位に特異的に結合する２種類の物質と金属ナノ粒子とをそれぞれ結合させて第１の複合体および第２の複合体２を構成し、第１の複合体および第２の複合体と検出対象物質を結合させて第３の複合体を構成すれば、本実施の形態に係る生体分子検出装置により検出対象物質の濃度を測定することができる。
　また、本発明に係る各実施の形態では、抗原１８、抗原４０、第１の複合体２０ａ、第２の複合体２０ｂ、第４の複合体２０ｃおよび第５の複合体２０ｄが液体中に分散している液相で測定ができるため、抗体等を反応層に固定して測定を行う固相での測定に比べ、前処理が簡単であるという利点がある。また、これらの抗原や複合体が溶液中を自由に動き回ることができ、固相に比べて反応が早いという利点もある。
　また、本発明に係る各実施の形態は、従来の蛍光偏光法のようにブラウン運動の変化による蛍光の偏光度の変化を調べるものではないため、検体の成分が蛍光分子の蛍光寿命に影響を与えたとしても測定に与える影響は少ない。
　なお、以上説明した本発明に係る各実施の形態は、本発明の一例を示すものであり、本発明の構成を限定するものではない。本発明に係る生体分子検出装置は、上記各実施の形態に限定されず、本発明の目的を逸脱しない範囲で種々変更して実施することが可能である。
　また、上記各実施の形態では試薬容器１０内の試薬保持部を四角柱状の形状としたが、試薬保持部は必ずしも四角柱状の形状とする必要は無く、円柱状の形状であっても良い。
　本発明に係る生体分子検出装置および生体分子検出方法は、例えば、検出対象物質と、その検出対象物質に特異的に結合する物質との相互作用を利用して、検出対象物質の検出又は定量を行う装置に利用することができる。
　　８　金ナノ粒子
　１２ａ　第１の抗体
　１２ｂ　第２の抗体
　１４、３６　蛍光分子
　１６　血漿
　１８、４０　抗原
　２０ａ、２６ａ、３２ａ　第１の複合体
　２０ｂ、２６ｂ、３２ｂ　第２の複合体
　２０ｃ　第４の複合体
　２０ｄ　第５の複合体
　２２、２８、３４　第３の複合体
　２４　ＢＳＡ
　３０　金ナノロッド
　３８　第６の複合体
　１００、２００　生体分子検出装置
　１１６、２３０　配向制御用光源部
　１１８　励起光源部
　１２０、２３８　偏向方向制御部
　１２４、２０４　受光部
　２０８　フィルタ切替部
　２１０、２１２　フィルタ
　２１４　偏光子
　２１８　フォトダイオード

Claims (15)

  1. 　生体分子上の特定部位に特異的に結合し得る第１の物質と金属粒子と蛍光分子とを有する第１の複合体、および前記特定部位と異なる前記生体分子上の部位に特異的に結合し得る第２の物質と金属粒子と蛍光分子とを有する第２の複合体を含む溶液を保持する容器と、
    　前記第１の複合体が前記第１の物質を介して前記生体分子に結合し、前記第２の複合体が前記第２の物質を介して前記生体分子に結合した第３の複合体を前記溶液中で少なくとも２つの方向へ配向させる配向制御手段と、
    　特定方向の直線偏光成分を有し、前記第１の複合体および前記第２の複合体の金属粒子に表面プラズモン共鳴を引き起こす光を前記溶液に照射する光源と、
    　前記第１の複合体および前記第２の複合体の金属粒子の表面プラズモン共鳴により発生する電場により前記第１の複合体および前記第２の複合体の蛍光分子から発せられた蛍光を検出する受光部と、
    　前記受光部が検出した蛍光の内、前記第３の複合体が配向する周期に同期する成分を抽出する同期成分抽出手段と、
    　を具備する生体分子検出装置。
  2. 　前記配向制御手段は、
    　前記光源から照射される光と異なる光であって直線偏光した光を前記溶液に照射する配向制御偏光光源と、
    　該配向制御偏光光源から照射される光の偏光軸を回動させることにより、前記第３の複合体を前記溶液中で少なくとも２つの方向へ配向させる偏光軸回動手段と、
    　を具備する請求項１の生体分子検出装置。
  3. 　前記配向制御光源は、前記光源から照射される光と異なる光であって直線偏光した光を前記溶液に対して複数の位置から照射する請求項２の生体分子検出装置。
  4. 　前記配向制御手段は、
    　前記光源から照射される光と異なる光を前記溶液に照射する配向制御光源と、
    　該配向制御光源から照射される光の照射方向を切り替えることにより、前記第３の複合体を前記溶液中で少なくとも２つの方向へ配向させる切替手段と、
    　を具備する請求項１の生体分子検出装置。
  5. 　前記光源から照射される光と異なる光を前記溶液の複数の位置に照射する配向制御光源を具備する請求項４の生体分子検出装置。
  6. 　前記配向制御手段は、
    　前記第３の複合体の長軸方向と前記光源から照射される光の振動方向とが平行となる第１の方向、および、
    　前記第３の複合体の長軸方向と前記光源から照射される光の振動方向とが垂直となる第２の方向、
    　へ前記第３の複合体を配向させる請求項１乃至５のいずれか１項に記載の生体分子検出装置。
  7. 　前記配向制御手段は、前記第３の複合体の配向方向を所定の時間間隔で変化させ、
    　前記同期成分抽出手段は、前記第３の複合体が含まれる溶液から発生する蛍光の強度を複数回測定して前記第３の複合体が配向する周期に同期する成分を抽出請求項１乃至６のいずれか１項の生体分子検出装置。
  8. 　前記所定の時間間隔は、前記溶液中に存在する全ての前記第３の複合体の配向が完了する時間間隔である請求項７の生体分子検出装置。
  9. 　前記光源から照射される光の波長は、前記蛍光分子により吸収されない波長である請求項１乃至８のいずれか１項の生体分子検出装置。
  10. 　前記同期成分抽出手段は、
    　前記第３の複合体の配向方向の変化により、前記第３の複合体から発生する蛍光量が変化することを利用して、記第３の複合体が配向する周期に同期する成分を抽出する請求項１乃至９のいずれか１項に記載の生体分子検出装置。
  11. 　前記溶液は、少なくとも一部に平面を有する容器保持部に保持される請求項２または３に記載の生体分子検出装置。
  12. 　前記配向制御偏光光源は、
    　前記光源から照射される光と異なる光であって直線偏光した光を、前記溶液を通って前記容器保持部の平面から出射する方向に照射し、
    　かつ、前記光源から照射される光と異なる光であって直線偏光した光を、前記溶液と前記平面との界面において焦点を結ばせる請求項１１の生体分子検出装置。
  13. 　前記溶液は、少なくとも一部に平面を有する容器保持部に保持される請求項４または５に記載の生体分子検出装置。
  14. 　前記配向制御光源は、
    　前記光源から照射される光と異なる光を、前記溶液を通って前記容器保持部の平面から出射する方向に照射し、
    　かつ、前記光源から照射される光と異なる光を、前記溶液と前記平面との界面において焦点を結ばせる請求項１３の生体分子検出装置。
  15. 　検体に含まれる生体分子上の特定部位に特異的に結合し得る第１の物質と金属粒子と蛍光分子とを有する第１の複合体、および前記特定部位と異なる前記生体分子上の部位に特異的に結合し得る第２の物質と金属粒子と蛍光分子とを有する第２の複合体を含む溶液と検体とを混合するステップと、
    　前記第１の複合体が前記第１の物質を介して前記生体分子に結合し、前記第２の複合体が前記第２の物質を介して前記生体分子に結合した第３の複合体を前記溶液中で少なくとも２つの方向へ配向させるステップと、
    　特定方向の直線偏光成分を有し、前記第１の複合体および前記第２の複合体の金属粒子に表面プラズモン共鳴を引き起こす光を前記溶液に照射するステップと、
    　前記第１の複合体および前記第２の複合体の金属粒子の表面プラズモン共鳴により発生する電場により前記第１の複合体および前記第２の複合体の蛍光分子から発せられた蛍光を検出するステップと、
    　前記受光部が検出した蛍光の内、前記第３の複合体が配向する周期に同期する成分を抽出するステップと、
    　を具備する生体分子検出方法。
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