WO2012127124A1 - Tests dedicated to oncology and to neuro-oncology - Google Patents

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WO2012127124A1
WO2012127124A1 PCT/FR2011/000155 FR2011000155W WO2012127124A1 WO 2012127124 A1 WO2012127124 A1 WO 2012127124A1 FR 2011000155 W FR2011000155 W FR 2011000155W WO 2012127124 A1 WO2012127124 A1 WO 2012127124A1
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    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G—PHYSICS
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Definitions

  • the present invention relates to the field of medicine and biology. It concerns a new screening test and therapeutic monitoring in oncology. More particularly, it relates to diagnostic and / or therapeutic tests in oncology and neurodegenerative diseases.
  • Molecular targeting with peptide vectors or siRNAs opens the door to a new understanding of the interdependence between diagnostic and therapeutic tools that now go hand in hand and open the way to pharmacodiagnostics.
  • the inventor highlights the mechanisms of molecular interactions and the interest of biochips dedicated to cancers with HAART plus therapeutic adjuvants to slow the formation of these lesions.
  • Age-related neurodegenerative diseases and cancers both involve a change in the physiological process of programmed cell death or apoptosis. Neuronal death is abnormally accelerated during neurodegenerative diseases such as Alzheimer's, Huntington's, Parkinson's etc. In contrast, the process of cancerization corresponds to a blockage of apoptosis leading to an uncontrolled multiplication of cells. The link between these two processes has now become a major field of research in aging research. Control of the balance between cell division (mitosis), differentiation, and programmed cell death (apoptosis) is fundamental during normal physiological processes, such as embryonic development, tissue fenescence, and aging. Alteration of this balance can lead to major pathological situations such as the formation of tumors or certain neurodegenerative diseases. Cancer is one of the leading causes of death worldwide. While over the last generation the percentage of deaths related to heart disease, cardiovascular disease and many other diseases have been declining, the number of deaths related to various forms of cancer is on the rise.
  • Colon cancer is the third leading cause of cancer-related mortality among men and women in North America (16,200 cases per year). Early detection, leading to early intervention, has shown that the success of treatment and survival rate. For example, the 5-year survival rate is 92% for a patient whose disease has been detected at an early stage, while the rate drops to about 60% in patients with localized cancer, and to about 6% in those with metastases. However, only one-third of colon cancers are detected at an early stage. One of the reasons for this delay in diagnosis is the lack of a sensitive, inexpensive and non-invasive screening test. Breast cancer is one of the most common in women with colon cancer. The death rate is the highest of all cancers affecting women. There are very few diagnostic markers that can detect breast cancer and they only have a predictive value of 20%. There are also no markers that can detect or determine the invasiveness and aggressiveness of metastatic cancer cells or that allow therapeutic monitoring.
  • Neuroblasts are neuronal precursors derived from the division of neuroepithelial cells. These are immature embryonic neurons that can still divide unlike mature neurons that can not enter into mitosis.
  • Neuroblastoma also called sympathoblastoma
  • sympathoblastoma is a malignant tumor developed at the expense of neural crest cells, which give rise to the sympathetic nervous system. It is the most common solid tumor in children (8 to 10% of cancers under 15 years of age) and in particular the very young child (average age 4 years with 90% who have less than 5 years years). Its incidence is 1 to 3 cases per 100,000 children aged 0 to 14 years. There are no recognized causes or factors that promote the occurrence of neuroblastoma. Neuroblastoma is discovered from symptoms due to the primary tumor
  • Neuroblastoma can develop from any part of the sympathetic nervous system, most commonly at the abdominal level.
  • the tumor can be localized at the level of a single organ, at the local or regional level, or be disseminated from the outset.
  • the most common metastatic sites are bone, bone marrow, liver and skin.
  • most localized tumors have an excellent prognosis. It is the same for those children under one year, regardless of the stage of the tumor. Some of these tumors regress even spontaneously. On the contrary, about 60% of children over one year of age have metastatic neuroblastoma, which has a poor prognosis.
  • the variety of the clinical presentation is related to the expression of certain biological and molecular markers (DNA ploidy, amplification of the n-myc oncogene, expression of Trk receptors, loss of chromosome lp, excess of 17q ).
  • DNA ploidy DNA ploidy
  • amplification of the n-myc oncogene expression of Trk receptors
  • loss of chromosome lp excess of 17q
  • 17q a poor prognosis
  • the expression of the TrkB and BDNF receptor allows an autocrine survival system of neuroblastic cells and induces neuritic growth.
  • TrkA receptors which induces neuroblastoma differentiation (Borrello et al., 1993, Eggert et al., 2000), and TrkC (Yamashiro et al., 1996) is rather associated with a good prognosis.
  • TrkA receptor is inversely correlated with the amplification of the n-myc oncogene.
  • glial precursors give rise to astrocytes, oligodendrocytes, microglial cells, choroidal cells and ependymal cells in the CNS, and to Schwann cells in the peripheral nervous system.
  • glial cells play a key role in differentiation (Lemke, 2001) and neuron survival (Bar, 2000). These cells ensure the nutrition of neurons, manage inter-neuronal connections, regulate neurotransmitters.
  • Glioblastomas are the most undifferentiated astrocytic malignancies (grade IV according to the World Health Organization's classification) and are most often found in the cerebral hemispheres. In adults, they are the most common brain tumors (20% of all intracranial tumors) with an incidence of about 3 new cases per year and per 100,000 inhabitants, or about 2,400 new cases per year in France . They occur at any age but in 70% of cases between 45 and 70 years old. Glioblastomas form soft masses, rich in blood vessels, 3 to 10 cm in diameter, vinous in color, heterogeneous with active compact areas and extensive areas of necrosis, interspersed with thrombosed vessels and infiltrating brain tissue. However, these tumors are almost never associated with the appearance of metastases. They surround themselves with edema that increases the suffering of the brain. Typically, they are expressed by signs of intracranial hypertension that is often associated with behavioral changes, seizures, focal neurological deficits.
  • This tumor evolves rapidly, in 2-3 months, and even after surgery, radiotherapy and then chemotherapy, its prognosis remains gloomy unless the glioblastoma comes from the tumor can be localized at the level of a single organ, at the local or regional level, or to be disseminated from the outset.
  • the most common metastatic sites are bone, bone marrow, liver and skin.
  • most localized tumors have an excellent prognosis. It is the same for those children under one year regardless of the stage of the tumor. Some of these tumors even regress spontaneously. On the contrary, about 60% of children over one year of age have metastatic neuroblastoma, which has a poor prognosis.
  • the variety of the clinical presentation is related to the expression of certain biological and molecular markers (DNA ploidy, amplification of the n-myc oncogene, expression of Trk receptors, loss of chromosome lp, excess of 17q ).
  • DNA ploidy DNA ploidy
  • amplification of the n-myc oncogene expression of Trk receptors
  • loss of chromosome lp excess of 17q
  • 17q a poor prognosis
  • the expression of the TrkB and BDNF receptor allows an autocrine survival system of neuroblastic cells and induces neuritic growth.
  • TrkA receptors which induces neuroblastoma differentiation (Borrello et al., 1993, Eggert et al., 2000), and TrkC (Yamashiro et al., 1996) is rather associated with a good prognosis.
  • TrkA receptor is inversely correlated with the amplification of the n-myc oncogene.
  • TNF-R superfamily receptors have been studied in neuroblastic cells.
  • the Fas receptor has been demonstrated in certain neuroblastic cells (Gross et al., 2001), cells that can be (Barthlen et al., 1999, Rifikin et al., 2001) or not (Bian et al. al., 2004) resistant to Fas-induced apoptosis.
  • the sensitivity of neuroblastic cells does not depend solely on the expression of the Fas receptor but on the presence or absence of caspase-8 in the cells (Kisenge et al., 2003).
  • TRAIL receptors are also expressed in neuroblastic cells.
  • Neuroblastoma is one of the most common in children. The death rate is the highest of all cancers affecting children.
  • E2F type transcription factors E2F1, E2F2, E2F3, E2F4 etc.
  • E2F1 E2F2, E2F3, E2F4 etc.
  • E2F3 E2F3 modulates Aurora's RNA expression during the cell cycle.
  • E2F transcription factors are critical for total activation and suppression of myc N in neuroblastomas.
  • HMGA1 Over-expression of the transcription factor E2F4 and the oncogene «-myc which induce apoptosis of post-mitotic cells by accumulation of oxygenated reagents (Tanaka, 2002) and N-Myc which is amplified in 35% of cases of neuroblastomas , AL gene, DDX1 and CRABP II too. HMGA1 and survivin too. Suppression of HMGA1 by RNA interference reduces cell proliferation of neuroblastoma. N myc induces the expression of FAK. N myc down regulates mRNA expression of many genes involved in cellular architecture.
  • the p53 gene belonging to the family of tumor suppressor genes, blocks the cell cycle in the event of DNA damage. It has now been shown that this gene is also involved in the course of apoptosis (Oren 1994, Yonish-Rouach 1996).
  • cyclin D1 one of the proteins constituting the regulatory subunits of the kinases of the cell cycle, essential for the progression of the cell cycle. This protein is also expressed during apoptosis in various cell types (Han et al, 1996, Pardo et al, 1996).
  • a Zinc Finger transcription factor can interrupt the activity of cyclin D1 and block the cycle.
  • the LIV21 complex will be studied by RT PCR and by biochip and its cytoplasmic markers of interest and the membrane protein of the Liv 21 complex as well.
  • the present invention relates to novel polypeptide, ribonucleotide and nucleotide sequences for inclusion in a new cell cycle reinduction screening test targeting oncology and the use of some of these same functionalized sequences as adjuvant treatment by molecular targeting. This is a major improvement without which the diagnosis and the pharmaco-diagnostic test could only be partial. The consequence would be a less effective treatment and less wide application depending on the heterogeneity of cancers. It is therefore a diagnostic test and a prognostic test for various cancers; More particularly, the invention relates to the use of genes or proteins of the LIV21 complex as well as their derivatives as therapeutic tools and as diagnostic and prognostic markers for cancers.
  • the invention therefore relates to the detection of the-gene or the ⁇ LIV21 protein with a kit comprising antibodies or probes specific for LIV21, but also the invention is to use all the markers of proliferations and factors. of transcription that play a role in the process of cancerization and neurodegeneration for some.
  • the invention lies in the use of RT PCR and quantitative PCR (Q PCR) combined with the manufacture of diagnostic DNA, protein and antibody chips comprising the known antibodies of the different proteins of the associated protein complexes according to the phases.
  • the chips with nucleotide sequences will make it possible to study the subexpressions or overexpressions of the genes and the ratio between genes and between proteins of the Liv21 complex and its associated partners in nuclear and, moreover, cytoplasmic or membrane cell extracts, the analysis of the interactions within the metabolic complexes is a key to the diagnosis and also goes through the study of functional areas.
  • a first objective of the present invention is to demonstrate a method for detecting and prognosing cancer and its metastatic potential that makes it possible to adjust a targeted combination therapy.
  • the cancer is selected from cerebral cancers, and more particularly glioblastoma, neuroblastoma, without being limited thereto.
  • One aspect of the present invention is the use of the novel LIV21 complex sequences as a cancer prognostic indicator and in its therapeutic monitoring. Indeed, when LIV21F is located in the cytoplasm, the cancer cells in the tissues are aggressive. Conversely, when the product of the expression of the LIV21F gene is preferentially localized in the cell nucleus, this is a prognostic indicator that the cells of the tissue are differentiated and quiescent and therefore non-invasive.
  • the LIV21 complex is defined by the extract of proteins and peptides studied in mass spectrometry type Maldi and ESI MSMS or Maldi Tof Tof. Which extract was obtained by attaching the Liv21 complex to one of these polyclonal antibodies LIV21
  • the Liv21 complex is also defined by its overall mass spectrometry profile (FIG. 5) and the number and the molecular weight of the protein extract bands obtained on the acrylamide gels of FIGS. and IB a function of the temperature to which the sample is subjected and the migration conditions described. Indeed, when, for example, the LIV21F peptide is located in the cytoplasm and is revealed directly by in situ hybridization, for example, or by biochip analysis, its highest expression in the cytoplasm, the cancer cells in the tissues are aggressive.
  • the detection of the protein kinase C epsilon (PKCe) is also interesting since it has been determined that PKCs phosphorylates the LIV21 protein to maintain it in the cytoplasm. Thus, a significant increase in PKCe is indicative of the presence of cancer cells.
  • the LIV21 / PKCe ratio increases in the cytoplasmic fraction of cancer cells.
  • HDAC1 which has been shown to be LIV21 as involved in PML / SUMO Rb / HDAC-1 complexes. More generally, the HDAC family plays a key role in the regulation of gene expression.
  • the LIV21 protein forms a complex with E2F4 which is capable of inhibiting the expression of the E2F1 gene in the nucleus, the expression of the E2F1 gene being a sign of cell proliferation.
  • a decrease in the association of LIV21 with the E2F4 protein is indicative of the presence of cancer cells.
  • the presence of the E2F1 protein in the nucleus is indicative of the presence of cancer cells.
  • the present invention relates to a method for the detection of cancer cells in a biological sample of tissue (for example, breast, ovary, endometrium, bladder, melanoma, prostate, glioblastoma, etc.) of patients, this method comprising the detection of the expression products of the LIV21 complex genes in the nucleus compared with these same products in the cytoplasm and cell membranes in the biological tissue sample of said patient, this method comprising the detection of the product of the expression of the LIV21F gene in the nucleus and / or the cytoplasm of the cells in the tissue biological sample of said patient, a location of said LIV21F gene expression product in the cytoplasm being indicative of the presence of cancer cells and a location of said product the expression of the LIV21F gene in the nucleus being indicative of the presence of non-cancerous cells.
  • tissue for example, breast, ovary, endometrium, bladder, melanoma, prostate, glioblastoma, etc.
  • a localization of said product of the expression of the LIV21F gene in the cytoplasm is indicative of the presence of invasive and / or metastatic cancer cells, the locations of the different expression products of the genes of the LIV21 complex and its associated partners described. in the examples of biochips indicate or not the presence of cancer cells.
  • the method according to the present invention further comprises the detection of the product of the expression of at least one gene selected from the group consisting of the protein kinase C epsilon (PKCs) gene, the E2F1 gene and the E2F4 gene. .
  • the method may include the detection of the product of the expression of two of these genes or three genes.
  • LIV21 / PKCe, LIV21 / E2F4 and LIV21 / E2F1 ratios can be determined in the present method.
  • This ratio can be determined in the cytoplasm and / or in the nucleus separately preferably.
  • these ratios are determined in the nucleus.
  • these ratios are compared to those obtained in a healthy cell.
  • the level of expression of each enzyme or polypeptide of the SUMO / Rb / HDAC complex or for certain cell types of the PML / SUMO / Rb / HDAC complex is an additional indicator of the proliferation state of the cell.
  • microarrays biochips
  • new hybridization automation tools such as US2004152212 and Yu Xinglong US 2005019828 and novel substrates for staining polypeptides (US 2008 213130 and US 2005/0157445 or US 2006 170925 or WO 2005 016515, Klages Claus Peter and example figure 20).
  • the biological sample can be in particular a sample of blood, serum, saliva, tissue, tumor, marrow bone, circulating cells of the patient.
  • This biological sample is available by any type of sampling known to those skilled in the art.
  • the term "biological material” means any material making it possible to detect the expression of a target gene.
  • the biological material may comprise, in particular, proteins, or nucleic acids such as in particular deoxyribonucleic acids (DNA) or ribonucleic acids (RNA).
  • the nucleic acid may in particular be an RNA (ribonucleic acid).
  • the biological material comprises nucleic acids, preferentially RNAs, and even more preferably total RNAs.
  • Total RNAs include transfer RNAs, messenger RNAs (mRNAs), such as mRNAs transcribed from the target gene, but also transcribed from any other gene and ribosomal RNAs.
  • mRNAs messenger RNAs
  • This biological material comprises material specific for a target gene, such as, in particular, the transcribed mRNAs of the target gene or the proteins derived from these mRNAs, but may also comprise non-specific material of a target gene, such as in particular the mRNAs.
  • the tRNAs, the R RNAs from genes other than the target gene and preferably the extracts to be studied will be analyzed when it comes to ceUular cultures directly on fetal cultures with or without prior treatment, they have undergone an extraction protocol separating the cell compartments.
  • This type of kit known to those skilled in the art allows by a subtle buffer set to extract only the membranes or only what is contained in the cytoplasm or the nucleus or the cytoskeleton and that of differential.
  • the other aspect of the present invention is the use of the above-mentioned genes and proteins as markers of the invasiveness and metastatic aggressiveness of cancer cancer cells in neurology, prostate cancer, colon cancer, bladder cancer and prostate cancer. , endometrium, cervix and cancers, or in ENT «Indeed successive pfaarmaco -diagnostics tests in the follow-up of a treatment will make it possible to observe by comparison over time the variations of the levels of gene expression or of their silencing and and better evaluate the effectiveness of treatments, readjust these treatments in the context of adapted combination therapy so that the physiological balance of different products of the genes involved in these metabolic complexes are maintained.
  • the gene expression product is detected at the level of the mRNA.
  • the mRNA can be detected by RT-PCR analysis (see examples attached). It can also be detected by Northern blot analysis or by SPR if the mRNAs and DNAs are functionalized on the surface of particles electrodeposited on a biochip support (techniques described inter alia in US 2008 213130 and US 2005/0157445 or US 2006 170925 or WO 2005 016515).
  • the MICAM technique uses the piezoelectric effect in its biochips can also be used for the aforementioned invention of diagnostic biochip dedicated to neuroblastoma and other brain cancers, diagnostic biochip dedicated to squamous cell cancers and more specifically dedicated breast, ovarian and prostate cancers . ⁇
  • the gene expression product is detected at the level of the protein or peptides characterizing the Liv21 complex and its interacting partners.
  • the protein and / or the associated LIV21 protein complex is detected with the aid of a specific antibody.
  • the protein can be detected by Western blot analysis and by SPR, by a biochip system using a transverse propagation wave (evanescent wave) of surface plasmon resonance (SPR).
  • SPR surface plasmon resonance
  • the interaction can be done with an electronic surface, the semiconductor surface creates an exiton by luminescence or fluorescence.
  • it is detected by immunohistochemistry, immunocytochemistry, microfluidics, radiography or by peroxidase labeling or by any other means of optical, sonic or spectroscopic imaging.
  • a significant increase in PKCe is indicative of the presence of cancer cells.
  • the method may also include determining the LIV21 / PKCe ratio in the nucleus and / or membranes and cytoplasm. This ratio can be compared to that observed in a healthy cell. An increase in the LIV21 / PKCe ratio in the cytoplasmic fraction is indicative of cancer cells.
  • the method comprises detecting the association of LIV21 with the E2F4 protein, and a decrease in this association in the cell nucleus being indicative of the presence of cancer cells.
  • the method may also include the determination of the ratio LIV21 / E2F4 in the nucleus and / or cytoplasm. This ratio can be compared to that observed in a healthy cell.
  • the method comprising detecting the expression product of the E2F1 gene
  • the presence of the E2F1 protein in the nucleus is indicative of the presence of cancer cells.
  • the method may also include determining the LIV21 / E2F1 ratio in the nucleus and / or the cytoplasm. This ratio can be compared to that observed in a healthy cell.
  • the method comprises detecting a labeled RNA so as to target the specific sequence that characterizes it and thus signal the place of expression of the messenger RNA of the gene of interest.
  • the specific RNA can be used as a diagnostic marker as would be an antibody and allow to locate in a particular case as extemporaneous or any type of sample taken from a patient for example sample of cancerous tissue, fluorescence for any other labeling used on the si RNA and found in a cell compartment on the sample, a si RNA gene E2F1 and E24 and PKC epsilon would allow a complementary diagnosis.
  • the method according to the present invention allows in particular the detection of metastasized cancer, therapeutic monitoring and / or treatment recurrences.
  • a second aspect of the invention relates to the human LIV21 protein as well as fragments thereof. More particularly, the present invention relates to an isolated, purified or recombinant human LIV21 protein comprising a peptide sequence selected from SEQ ID Nos. 1 to 5 or, more generally, from the peptide sequences characterizing it obtained by MALDI (FIGS. 3, 4 and 5). and NanoLC-ESI-MS.
  • the polypeptide comprises the three peptide sequences SEQ ID Nos. 1 and 2 and 3.
  • the LIV21F protein and certain proteins of the LIV21 complex comprise a leucine zipper motif, a basic domain characteristic of the DNA ( Figure 2), and a sequence of nuclearization.).
  • the present invention relates to polypeptides whose sequence consists of a peptide sequence characterized by the spectrograms of FIGS. 3,4,5 of gel bands 1,2 and 3, selected from SEQ ID Nos. 1 and 2. and 3 and 4 and 5 and the twenty or so additional unordered sequences (see sequences listed in the appendix), the other sequences of the protein being to be checked with respect to their homologies with contaminants and to be ordered during MSMS mass spectrometry on the unmatched fragments identified in MALDI TOF analyzes (see FIGS. 3,4,5), these unmatched fragments corresponding to unlabeled M (H +) masses characterize in part the LIV21 protein and certain elements of its protein complex.
  • a third aspect of the invention relates to an antibody that specifically binds to a polypeptide according to the present invention. More particularly, the antibody may specifically bind to a polypeptide comprising a peptide sequence selected from SEQ ID Nos 1-120 and preferably from SEQ ID No. 1 and 2 or 3 and / or 5 or 51 or a sequence exhibiting at least 80% identity with these.
  • the present invention relates in particular to an anti-LIV21 serum manufactured by immunizing an animal or a human with a polypeptide according to the present invention, in particular a polypeptide comprising a peptide sequence selected from SEQ ID Nos. 1-120, preferably from the sequences herein and Or a sequence having 70.80 or 90% identity therewith.
  • a fourth aspect of the invention relates to a kit for detecting cancer cells in a biological sample of a patient, the kit comprising one or more members selected from the group consisting of an antibody that specifically binds to human LIV21F. according to the present invention and an anti-LIV21F serum according to the present invention, an oligonucleotide probe specific for LIV21F mRNA (hybridization probe) and a primer pair specific for LIV21F mRNA.
  • the kit further comprises means for detecting the product of the expression of a gene or an oligonucleotide probe specific for P mRNA of factors selected from the group consisting of the gene of epsilon protein kinase C (PKCe), the E2F1 gene and the E2F4 gene.
  • PLCe epsilon protein kinase C
  • the invention relates to the use of an antibody specific for human LIV21 for the diagnosis of cancer and the antibodies of its protein complex, but also antibodies specific for RBP2, SUMO.HDAC, TNFalpha, crb2, cycE / cdk2, cdkl, CREB1 and p300, Rb, p107, p130, NFkB, cdc2A, mdm2, p21, p53, p65, p73.
  • the invention relates to the use of a primer or probe pair specific to LIV21 for the diagnosis of cancer.
  • the diagnosis is made ex vivo on? samples of a patient, (cerebrospinal fluid puncture, blood test, biopsy, cell matrix, bronchial aspirations, DNA chips, Proteins, antibodies, hydrophobic support, plasmionic (SPR) or metal ions etc .... )
  • nucleotide acid biochip or
  • the method is characterized in that said detecting step uses any optical imaging means, or any sonic means or any means of spectroscopy.
  • the method is characterized in that said protein biochip, or said antibody biochip, consists of a microfluidic biochip and for which said detection step consists of detection by SPR.
  • Method is characterized in that it comprises a step of amplification / retro-transcription by RT-PCR of at least one nucleotide sequence of said human Liv21 complex according to claim 1 or 2 or said Liv21 complex and its associated partners'
  • Method is characterized in that it comprises a pharmaco-diagnostic test for the diagnosis of cancer or the monitoring of the evolution of a cellular proliferation, said cancer being preferentially chosen from the group consisting of neuroblastomas, glioblastomas and other cancers affecting the tissues of the nervous system.
  • Figure 1A one-dimensional gel (gradient acrylamide 12%) revealing after three hours thirty of migration 11 bands with some triplets and doubled bands and a two-dimensional gel SDS Page of total cell extracts with spots between 15 and 20 KD and at 29 - 32kD and about 35 KD at basic pH and spots at 190 - 180 and 1 OOkD at acid PH. Spots between 49 and 51 KD and 64 KD.
  • Monodimensional About 180 kD (T0FC), 100 KD, 64 kD, SI at 49 kD, 49 kD, 35 kD, 29 kD, 15 to 17 kD bands.
  • FIG. 1B Biomarker interactions pattern of the LIV21 complex and surrounding metabolic pathways.
  • Figure 2 Scheme of nuclear protein interactions with the domain DNA binding and consequences on the study of the therapy targeting the nucleus and the cell cytoplasm.
  • Figure 3A List of monoisotopic peaks of band 1 at 50 kD and band 2 at 49-50 D
  • Figure 3B is the protein profile of LIV21 by Mass Spectrometry (Maldi) M (H +) for the one-dimensional gel band corresponding to the band 2 migrating at 49 - 50kD.
  • the peptides resulting from the digestion are solubilized in a solvent: Acetonitrile / water (1/1) containing 0.1% of TFA (trifluoroacetic acid), a saturated solution of the alpha cyano-4-hydroxycinnamic acid matrix is made in the same solvent. The same volume of the two solutions is taken, mixed and 1 microliter is deposited on the Maldi plate for analysis.
  • Figure 4 is a spectrogram profile of band 6 called 6FC
  • the monoisotopic peak 944.6 is a sequence: FAVAFPVGR
  • the protocol variation only takes three different steps: the first is the purification of the antibody used, the second is the separation of the cytoplasmic and nuclear fractions, the third is the heating for two minutes at 100 ° of the sample before migration on acrylamide gel.
  • Figure 5 is the third spectrogram corresponding to the 12% one-dimensional acrylamide gel band migrating at 51-52 KD and revealed by coumassie blue and LrV21 antibody.
  • Figure 5a is the list of the monoisotopic peaks of the third spectrogram corresponding to the 52 kD migrand one-dimensional acrylamide gel band and revealed by coumassie blue and LIV21 antibody.
  • Figures 3-5 describe the MALDI analyzes giving a set of polypeptide sequences assignable to LIV21. and its complex and sometimes different contaminants according to the observers of the different platforms of proteomics subcontractors. .
  • FIG. 6 analysis on the databases of the listing of monoisotopic peaks.
  • the Mascot search parameters are: trypsin enzyme, variable modifications: carbamethylation and oxidation of methionines, without limit of molecular weight, without restriction of rselectric point .
  • Figure 7 same but second example: Mass type: monoisotopic. Mass error (MS): depending on the observer 50 ppm or 100 ppm.
  • Non-tryptic cut 1 The masses entered are M (H +) / real masses. For spectrogram 1 the cysteines are blocked by iodoacetamide. The possibility of digestion of Proméga bovine trypsin may be incomplete with missed cut.
  • Gallus Gallus gi 50732569
  • mouse Syntaxin Histatin-3-2 variant (P15516-00-01-00)
  • ZN575-Human G6 P translocase
  • HSP60 chaperonine deaminase
  • ferredoxin-NADP (+) reductase pseudomonas polyribonucleotidyl transferase
  • chlathrin dehydrolipoamide dehydrogenase.
  • Figure 10 PCR with primers showing a 1400bp band
  • Figure 12 Gel 3 at 55 ° and molecular weight analysis
  • Figure 13 Gel 4 at 45 ° and 55 ° and molecular weight analysis
  • Figure 14 Ligation Strip Screening 400pb Bl Clones at B1 ⁇
  • Figure 16 Gel 5: screening ligation on the five new clones
  • Figure 17 Gel 6 Screening of recombinant clones S55T and S55M and
  • Figure 18 Examples of comparison of nucleotide sequences between the sequenced clones.
  • Figure 20 Protein chip with named peptides of the proteins of the complexes of interest studied in the invention.
  • Figure 21 Two microfluidic microarrays of four x2 wells with one control and three biomarkers.
  • FIG. 22 Biopuce example of 20 spots with 16 biomarkers of interest (and four controls) fixed on the sensorchip to see by SPR overexpression and under-expression of certain genes of Liv21 complex and its interaction partners for example.
  • the invention relates to the identification of antigens in cell lysates by immunoprecipitation.
  • the analysis of the physical interaction of different associated proteins in the Liv21 complex such as E2F4 and E2F1 was studied by co-immunoprecipitation of protein complexes. This analysis has highlighted new markers with a diagnostic and prognostic utility for cancer.
  • the protein samples corresponding to the putative protein and the elements of the complex were extracted from the gels and digested with trypsin (Proméga) in order to to be analyzed by MALDI mass spectrometry ( Figure 3 to 5) and ESI MS / MS.
  • proteomic data banks have made it possible to highlight several peptide sequences of interest, some of which are exemplary data (FIGS. 6 and 7), some of which are found in humans with very significant scores (splicing of the histatine etc ... Figure 8 and 9), these sequences served as primers (once retrotranscribed in cDNA) to screen a library made from MCF7 specific breast cancer cells ( Figures 10 to 17).
  • More than twenty characteristic clones on 150 clones were studied. .
  • the cDNA of these clones was used to screen a library prepared from total mRNA of MCF7 cells.
  • the sequence of these new products are new transcription factors whose nuclear translocation for some changes their role and function, this being correlated for some of them to the establishment of quiescence cell such as LIV21F, E2F4 .
  • LIV21F new transcription factors
  • E2F4 the expression of this new product during development, the embryonic stage. It has been observed that the amount of the LIV21 protein increases as the development progresses, that is, as the quiescent cell state is established.
  • the LrV21 / E2F4 complex was an inhibitor of E2F1 expression. This complex could correspond to a new checkpoint in the cell proliferation arrest.
  • the present invention is a.
  • Liv21F and LIV21K polypeptides as well as derivatives and fragments and isoforms thereof (SEQ ID NO: SEQ ID ⁇ 0 ⁇ / ⁇ ).
  • Human Liv21 complex characterized in that it comprises:
  • nucleotide sequences SEQ ID Nos. 171 to 175 and a siRNA sequence derived from one of the RNA sequences of SEQ ID No. 120 and SEQ ID No. 121, and 171 to 175.
  • a protein traction comprising at least the sequence SEQ ID No. 1 and 181 or a sequence having 90%, and preferably 80%, and more preferably 70% identity with said SEQ ID No. 1 and 181.
  • the human LIV21 complex characterized in that it comprises:
  • nucleotide sequences SEQ ID No. 171, 172, and the protein fractions comprising at least the sequence SEQ ID No. 1 or 181 or a sequence having 70, 80 or 90% identity with said SEQ ID No. 1 or 181 and the sequence SEQ ID No. 183 or a sequence having 70, 80 or 90% identity with said SEQ ID No. 183.
  • the human LIY21 complex characterized in that it also comprises:
  • nucleotide sequences SEQ No. 123, 124 and 127 and the protein fractions comprising at least the sequence SEQ ID No. 1 or a sequence having 70, 80 or 90% identity with said SEQ ID No. 1 and the sequences 181 to 185 or a sequence having 70, 80 or 90% identity with said SEQ ID No. 181 to 185.
  • the human Liv21 complex is characterized in that it further comprises:
  • nucleotide or ribonucleic sequences SEQ ID NO: 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 126 or 127.
  • siRNA sequences any of the following siRNA sequences:
  • Human Liv21 complex characterized in that it further comprises at least:
  • Human Liv21 complex characterized in that said protein fraction further comprises any of the following proteins: E2F1, E2F4, p130, p300, p107, Liv21F, HDAC-1, PML, SUMO and pKCepsilon.
  • Aurora A, Survivine, BCAS4, BCAS3, RFSH Human Liv21 complex characterized in that it interacts with at least one of its associated partners, said at least one of its associated partners being chosen from the group consisting of;
  • any of the following proteins RBP2, TNFalpha, crb2, cycE / cdk2, cdk1, CREB1, p300, p107, NFkB, cdc2A, mdm2, p21, p53, p65, p73 MYC, NMYC,
  • TGFbeta Chlatrin, Aurora, AKT, BRCA1, FOX04 or cyclin A and D1, CHUK, HMGA2, IKBKB
  • its acrylamide gel electrophoretic profile comprises at least the following three bands: the 50 kD band, the 51 kD band, and the 52 kD band.
  • Human Liv21 complex is also characterized in that after trypsin digestion, the MALDI mass spectrometry profile comprises at least the following mono isotopic peaks:
  • Method for detecting the human Liv21 complex characterized in that it comprises the implementation of at least one probe specific for at least one sequence of said Liv21 complexes according to claim 1 or 2.
  • Method for detecting the human Liv21 complex characterized in that it further comprises the implementation of at least one probe specific for at least one sequence Liv21 complex and its associated partners
  • Detection method of complex LIV21 and its partners is in that it comprises at least the following steps:
  • Detection method is also, characterized
  • said biological sample is taken from a patient with cancer and from a healthy patient
  • said biological material comprises
  • membrane cell extracts in that it further comprises a step of determining the under expression and overexpression of the gene products of said human Liv21 complexes or said human Liv21 complex and its associated partners of said biological extracts.
  • the method is characterized in that said specific probe comprises a rhodamine-labeled siRNA sequence.
  • a method according to any one of the above approaches is characterized in that it implements a biochip, on which at least one of the probes specific for the sequences of said human Liv21 complex is deposited.
  • the method is further characterized in that it implements at least one of the sequence-specific probes of said human Liv21 complex and its associated partners
  • nucleotide acid biochip or
  • RNA biochip an mRNA biochip, or a siRNA biochip.
  • the method is characterized in that said detecting step uses any optical imaging means, or any sonic means or any means of spectroscopy.
  • Figure 1 characterizing the protein complex, its PI and its PM is a function of temperature and migration conditions and its observation in total extracts or in extracts of cell compartments.
  • the gene for this protein is characterized by two main sequences (see sequences) and sequences representing alternative splicing.
  • Liv21 corresponds to a sequence of strong homology (more than 60%) with AD7cNTP, the neural thread protein in N terminal (position 193 to 299) of (060448_Human). SEQ N °
  • Liv21K is like that of AD7C NTP, that is to say repeated patterns that can also be analyzed in sub-patterns that correspond to functional areas.
  • LIV21I PEPTIDE FLYFPRQGFTVLARMVSISPRDPPASASQSVGIAYISN With variants in position:
  • LIV21 peptides are also described: the LIV21c peptide (SEQ ID No. 3) and the LIV21d peptide (SEQ ID No. 4).
  • the peptide LIV21e (SEQ ID No. 5) .KFFVFALILALMLSMCGADSHAKR whose end portion is homologous to a LIV21K sequence.
  • ZN575-Human Homology with a functional segment of zinc finger protein 575 (ZN575-Human): score 13 to 48 and up to 91% recovery
  • a preferred protein comprises at least one selected sequence
  • the present invention relates to an isolated, purified or recombinant human polypeptide having a sequence comprising the sequence SEQ ID No 1 and / or SEQ ID No 2 and / or SEQ ⁇ > No 3 and / or SEQ ID No 4 and / or SEQ ID No 5.
  • the LIV21F polypeptide comprises the sequences SEQ ID Nos. 1,2 and 5.
  • the LIV21 complex comprises a sequence selected from the peptide sequences characterizing it obtained by MALDI (FIG. ).
  • the invention also relates to the three peptides LIV21a (SEQ ID No. 1) and LIV21b (SEQ ID No. 2) and LrV21e (SEQ ID No. 5). It also relates to peptides comprising at least 10 consecutive amino acids of human LIV21, preferably at least 20, 30 or 50 consecutive amino acids of LIV21F (see sequence 1- in annex).
  • the present invention also relates to a polynucleotide encoding the human protein LIV21, LIV21a and / or LIV21b, more generally a polynucleotide encoding a polypeptide according to the present invention.
  • the polynucleotide encoding LIV21 F and that encoding LrV21K may be mRNA, cDNA or genomic DNA.
  • the polynucleotides according to the present invention can be isolated from cells, more particularly from human cells, or from human cDNA libraries. They can also be obtained by a polymerase chain reaction (PCR) carried out on the total DNA of the cells or by RT-PCR performed on the total RNA of the cells or by chemical synthesis.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the probes and primers described in the present application can be used to isolate and / or prepare a polynucleotide encoding LIV21F. It further relates to a cloning vector or expression comprising such a polynucleotide.
  • a vector may contain the elements necessary for the expression (expression vector) and optionally for the secretion of the protein in a host cell (secretory signal peptide).
  • the vectors preferably include: a promoter, translation initiation and termination signals, and appropriate transcriptional regulatory regions.
  • the vector may be a plasmid, a cosmid, a BAC, a phage, a virus or other.
  • the invention also relates to a transgenic non-human host cell or animal comprising a vector or polynucleotide according to the present invention.
  • the invention further relates to derivatives of interest of LIV21F or LIV21K which are for example fusion proteins in which LIV21 is fused to marker proteins such as GFP. Furthermore, the LIV21F and LIV21K protein and all the petids described (cf.patent in listing) can be labeled by any known means of
  • the present invention also relates to an antibody that specifically binds to a polypeptide according to the present invention, preferably human LIV21, a fragment or a derivative thereof.
  • the antibody specifically binds to an LrV21a or LFV21b peptide. or the LIV21F or LIV21K polypeptides.
  • the method may include the detection of the product of the expression of two of these genes or three genes. Furthermore, at least one of the LIV21 / PKCs, LIV21 / E2F4 and LIV21 / E2F1 ratios can be determined in the present method. This ratio can be determined in the cytoplasm and / or in the nucleus. Preferably, these ratios are determined in the nucleus. Preferably, these ratios are compared to those obtained in a healthy cell. In one embodiment, the gene expression product is detected at the level of the mRNA, mRNA can be detected by any means well known to those skilled in the art.
  • the method according to the present invention also relates to the detection of a polynucleotide encoding the human LIV21 protein or a fragment thereof, for example LIV21a and / or LIV21b.
  • the polynucleotide encoding LIV21 may be mRNA, cDNA or genomic DNA.
  • the polynucleotides can be isolated from cells of the biological sample. They can also be obtained by a polymerase chain reaction (PCR) carried out on the total DNA of the cells or by RT-PCR carried out on the total RNAs of the cells or polyA RNAs.
  • PCR polymerase chain reaction
  • MRNA can be detected by RT-PCR analysis.
  • the method uses a pair of primers specific for the expression product to be detected, in particular LIV21, PKCe, E2F1 or E2F4.
  • primers specific for the expression product to be detected, in particular LIV21, PKCe, E2F1 or E2F4.
  • specific primer pair is meant that at least one of the primers is specific for the expression product to be detected. That is, this primer pair specifically amplifies a fragment of the desired mRNA.
  • the RT-PCR analysis is carried out on nuclear and / or cytoplasmic extracts of the cells contained in the sample of the patient.
  • the RT-PCR assay can be a quatitative analysis.
  • a pair of specific LIV21 primers may be prepared based on the teachings of the present application.
  • the primer pair may comprise the primers described in SEQ ID Nos. 3 and 4, and further sequences in the patented list are therefore numbered from 119 to 149 and from 171 to 180 with optionally all the additional nucleotide sequences of the additional list.
  • the specific primer pairs of PKCs, E2F1 and E2F4 are well known to those skilled in the art (Caroll JS 2000, Mundle SD 2003, Stevaux O 2002, Cheng T 2002, Opalka B 2002). MRNA can also be detected by NoRthern blot analysis.
  • the method uses a specific probe of the expression product to detect, in particular LIV21, PKCs, E2F1 or E2F4.
  • a probe specific to LIV21 can be prepared based on the teachings of the present application.
  • An example of a specific probe comprises the sequence SEQ ID No. 5.
  • the Northern blot analysis is performed on nuclear and / or cytoplasmic extracts of the cells contained in the sample of the patient.
  • the nucleic probe is labeled.
  • the technique for labeling oligonucleotides is well known to those skilled in the art.
  • the labeling of the probes according to the invention can be carried out by radioactive elements or by non-radioactive molecules.
  • radioactive isotopes used, mention may be made of 32 P, 33 P or 3 H.
  • the non-radioactive entities are selected from ligands such as biotin, avidin, streptavidin, digoxygenin, haptens, dyes, luminescent agents such as radioluminescent, chemiluminescent, bioluminescent, fluorescent, phosphorescent agents.
  • the specific PKCs, E2F1 and E2F4 probes are well known to those skilled in the art.
  • the gene expression product is detected at the level of the protein.
  • the protein is detected using a specific antibody.
  • the method comprises a step of contacting the cells of the biological sample with an anti-human LIV21 antibody.
  • the antibodies can be monoclonal or polyclonal.
  • the anti-LIV21 antibody may for example be an anti-LIV21 serum.
  • the method can use antibodies specific for the PKCs, E2F1 and E2F4 proteins, respectively.
  • the polyclonal and monoclonal antibodies directed against PKCs, E2F1 and E2F4 are commercially available.
  • a rabbit polyclonal antibody (Santa Cruz Technology, sc-214) may be mentioned, for E2F1, a polyclonal antibody of rabbit (Santa Cruz Technology, sc-860), and for E2F4, a polyclonal rabbit antibody (Santa Cruz Technology, sc-866).
  • antibodies are labeled directly or through a secondary antibody.
  • Antibody labeling techniques are well known to those skilled in the art.
  • the protein can be detected by a Western blot analysis.
  • Western blot analysis can be performed on nuclear and / or cytoplasmic extracts of the cells contained in the patient's sample. Briefly, the proteins are migrated in a gel and then transferred to a membrane. Then, this membrane is incubated in the presence of antibodies and antibody binding is eventually revealed using labeled secondary antibodies.
  • the protein is detected by immunohistochemistry, immunocytochemistry or immunoradiography. These techniques are well known to those skilled in the art. Immunocytochemistry analysis can be performed on whole cells from or derived from the sample, for example by cell culture. It can also be performed on isolated nuclei. Immunohistochemistry analysis can be done on sections of breast tissue. n M ⁇ UM> efc * * f -
  • an immunocytochemical analysis may comprise the following steps. However, it is understood that other preparatory modes can be implemented. Cells from the biological sample are cultured, preferably on slides (Lab Tek, Nunc, Germany), then washed with buffer and fixed with paraformaldehyde (eg 4%). A saturation step is preferably performed by incubating the cells with S buffer (PBS-0.1% Triton X100 - 10% FCS).
  • S buffer PBS-0.1% Triton X100 - 10% FCS
  • the cells are then incubated with the primary antibody and then washed and incubated with a fluorescent secondary antibody, if necessary.
  • the nuclei can be labeled with propidium iodide (Sigma).
  • the slides are moviol mounted for observation by fluorescence microscopy.
  • isolated nuclei removed during nuclear extraction can be fixed with paraformaldehyde (e.g.
  • the suspensions of nuclei are deposited between blade and coverslip and the observation is made by fluorescence microscopy and confocal microscopy.
  • the primary antibodies are, for example, rabbit antibodies and the secondary antibodies are labeled antibodies directed against rabbit IgG.
  • the biological samples come from a patient potentially suffering from cancer or cancer in a proven way.
  • biological sample is meant in particular a sample of the biological fluid type, living tissue, tissue fragment, slime, organ or organ fragment, or any culture supernatant obtained using a sample.
  • the method according to the present invention may comprise a step of taking a biological sample from the patient.
  • the detection step can be performed directly on a section of tissue of the sample, on a culture of cells from the sample, on total cell extracts, nuclear and / or cytoplasmic extracts.
  • a significant increase in PKCe is indicative of the presence of cancer cells.
  • the amount of PKCe in healthy cells is compared to the amount of PKCe in the cells of the sample and the significant increase is determined by this comparison.
  • the method according to the present invention may optionally comprise the measurement of the LIV21 / PKCe rate. This LIV21 / PKCe ratio increases in the cytoplasmic fraction of cancer cells compared to healthy cells.
  • the method comprises the detection of the combination of LIV21 with the E2F4 protein, and a decrease in this association being indicative of the presence of cancer cells. Detection of the association of LIV21 with the E2F4 protein can be achieved by concomitant detection of LIV21 and E2F4.
  • the method according to the present invention may optionally include measuring the E2F4 / LIV21 rate. This ratio E2F4 / LIV21 decreases in the nucleus of cancer cells compared to healthy cells.
  • the presence of the E2F1 protein in the nucleus is indicative of the presence of cancer cells.
  • the method according to the present invention may optionally comprise the measurement of the E2F1 / LrV2l ratio and the E2F1 / LIV21 ratio increases in the nuclear fraction of cancer cells relative to healthy cells.
  • the method according to the present invention allows in particular the detection of metastasized cancer, therapeutic monitoring and / or treatment recurrences and to determine the degree of invasiveness of a cancer.
  • the specificity of the detection can be linked to the crossings of the information obtained by the existence and the topography of LIV21 by all the means of imaging and spectroscopy and obtained by the association with other known oncological indicators via protein chips or proteins. microarrays.
  • detection based on LIV21 may be associated with the detection of other cancer markers, particularly breast cancer, known to those skilled in the art.
  • the present invention also relates to a method for detecting recurrence following anti-cancer treatment of cancer in a patient comprising detecting cancer cells in a biological sample of the patient according to the method of the present invention.
  • the detection of cancer cells in a biological sample of the patient according to the method of the present invention can be carried out once or several times after the anti-cancer treatment.
  • the detection of cancer cells is indicative of recurrence.
  • the biological sample is from the tissue affected by the treated cancer.
  • the present invention also describes a kit for implementing a method according to the invention. More particularly, the invention relates to a kit for the detection of cancer cells in a biological sample of a patient comprising one or more members selected from the group consisting of an antibody that specifically binds to human LIV21 according to the present invention. invention and an anti-LIV21 serum according to the present invention, an AR m of LIV21 specific oligonucleotide probe and a LIV21 specific PARNm primer pair.
  • the kit comprises antibodies that specifically bind to human LIV21.
  • the kit comprises an oligonucleotide probe specific for the LIV21 mRNA. It may also include a probe specific for a house-keeping gene.
  • the kit according to the present invention may comprise reagents allowing the detection of a LIV21 complex-an antibody produced during an immunological reaction.
  • the kit according to the present invention further comprises means for detecting the product of the expression of at least one gene selected from the group consisting of the protein kinase C epsilon (PKCe) gene, the E2F1 gene and the E2F4 gene.
  • PDCe protein kinase C epsilon
  • E2F1 gene the E2F4 gene.
  • These detection means may be protein-specific antibodies, oligonucleotide probes specific for the mRNA concerned and / or a primer pair specific for the mRNA.
  • the present invention also relates to a diagnostic composition
  • a diagnostic composition comprising one or more elements selected from the group consisting of an antibody according to The present invention and a serum according to the present invention, an oligonucleotide probe specific for LIV21 mRNA and a specific primer pair of LIV21 mRNA.
  • the LIV21F gene is located on the lp31 chromosome in the 30130K and 30132K region in the 30,081K and 30181K position between the TINAGL1 gene and LOC 284551 named for this exonic part NW 001838577.2 in 2009 (formerly referenced in March 2006 as a polypeptide derived from hsl 33153 , NT 032977.8) .Characterized by ring finger domains of Zn Finger type and a transduction signal.
  • LIV21 in the context of an anti-cancer therapy, one can consider increasing the amount of LIV21 present in the nucleus. For this, one could increase the expression of LIV21 in the nucleus of the cancer cells. LIV21 being capable of self-nuclearization, the production of an expression vector comprising a polynucleotide encoding human LIV21 could be envisaged with the aim of overexpressing this protein in the nucleus of the cells whose proliferation is to be regulated.
  • the human LIV21 coding expression vector The human LIV21 coding expression vector
  • the expression vector may be administered in the form of naked DNA (eg EP 465,529). Microinjection techniques, electroporation, calcium phosphate precipitation, nanocapsule or liposome formulations are other available techniques.
  • the expression vector may also be in the form of a recombinant virus comprising, inserted into its genome, a polynucleotide encoding human LIV21.
  • the viral vector may for example be chosen from an adenovirus, a retrovirus, in particular a lentivirus, as well as an adeno-associated virus (AAV), a herpesvirus (HSV), a cytomegalo virus (CMV), a vaccinia virus, etc.
  • the recombinant virus is a defective virus.
  • the expression vector allows cell targeting.
  • this vector could target cancer cells or the particular type of cancer that is affected by cancer. Targeting of a particular cell type can be achieved by placing the LIV21 coding polynucleotide under the control of a tissue-specific promoter.
  • the expression vector may be targeted, for example by associating it with a specific molecule of a particular tissue or cancer cells, for example an antibody specific for an expressed molecule. specifically by the particular tissue or cancer cells.
  • the choice of the expression vector can also influence the targeting. Indeed, if the expression vector is a virus, the tropism of the natural or modified virus may also allow some targeting.
  • the present invention therefore relates to a pharmaceutical composition comprising a polynucleotide encoding LIV21, more particularly an expression vector coding for LIV21. It also relates to the use of a pharmaceutical composition comprising a polynucleotide encoding LIV21, in particular an expression vector coding for LIV21, as a drug. Preferably, the present invention relates to the use of a pharmaceutical composition comprising a polynucleotide encoding LIV21, in particular an expression vector encoding LIV21, for the preparation of a medicament for treating cancer. The present invention further relates to a method of treating cancer in a patient comprising administering to cancer cells a polynucleotide encoding LIV21, the expression of LIV21 to reduce or abolish the cancerous phenotype /
  • the cancer is selected from breast, bladder, ovarian, lung, skin, prostate, colon, and glioblastoma cancers, without being limited thereto.
  • LIV21 nuclear localization of LIV21, for example by decreasing PKCe activity in cancer cells and using HDAC inhibitors.
  • PKCe activity in cancer cells can be achieved by decreasing the activity of the PKCe protein or by decreasing its expression.
  • a decrease in PKCe protein activity can be achieved by administering inhibitors of PKCe protein to cancer cells.
  • Inhibitors of PKCe protein are well known to those skilled in the art.
  • a decrease in PKCe protein expression can be achieved using antisense or siRNA specific for the PKCe gene. Kits are commercially available.
  • the techniques concerning inhibitions by antisense or siRNA are well known to those skilled in the art. (Arya R 2004, Lee W 2004, Sen A
  • RNAs can also be used:
  • the present invention therefore relates to a pharmaceutical composition comprising an inhibitor of the PKCe protein. It also relates to the use of a pharmaceutical composition comprising an inhibitor of the PKCe protein as a medicament, in particular for the preparation of a medicament for treating cancer. Finally, it relates to a method of treating cancer in a patient comprising the administration to the cancer cells of an inhibitor of the PKCe protein, the PKCe protein inhibitor making it possible to reduce or abolish the cancerous phenotype of the treated cells.
  • the inhibitor of the PKCe protein decreases the activity of the PKCe protein.
  • the inhibitor of the PKCe protein decreases the expression of the PKCe protein.
  • the cancer is selected from cancers of the breast, bladder, ovary, lung, skin, prostate, colon, liver, sarcoma, leukemia and glioblastoma, without being limited to these.
  • PKC epsilon inhibitors are published and used commercially for other applications.
  • LIV21 In the context of therapy of a neurodegenerative disease, it is possible to reduce the amount of LIV21 present in the nucleus. For this, one could reduce or block the expression of LIV21 in the nucleus of the cells affected by the neurodegenerative disease.
  • the cells affected by the neurodegenerative disease are generally neurons, motor neurons, etc.
  • the inhibition or blocking of LIV21 expression can be achieved by any means known to those skilled in the art.
  • an antisense oligonucleotide or an expression vector encoding this antisense oligonucleotide could be prepared and used to block the translation of vivo vivo LIV2 encoding mRNA.
  • a ribozyme can be prepared to cut and destroy the LIV21 coding mRNA in vivo. It is also possible to envisage a triple helix strategy in which an oligonucleotide is designed to hybridize with the gene encoding LIV21 and thus block the transcription of this gene.
  • LIV21 nuclear localization of LIV21, for example by increasing the activity of PKCe in the cells affected by the neurodegenerative disease.
  • PKCe activity in cells affected by neurodegenerative disease can be achieved by increasing the activity of the PKCe protein or by increasing its expression.
  • An increase in PKCe protein activity can be achieved by administering to the cells affected by the neurodegenerative disease activators of the PKCe protein.
  • Activators of the PKCe protein are well known to those skilled in the art (Toma O (2004), Activation of PKC by DAG, PUFA: oleic acid, linoleic acid, arachidonic acid, etc.
  • Activation and proteolysis of PKCs in gonadotropic cells Communication 2004 by Macciano H, Junoy B, Mas JL Drouva SV UMR6544 Marseille).
  • An increase in PKCe protease expression can be achieved by using expression vectors encoding the PKCe protein and allowing overexpression in cells affected by neurodegenerative disease.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition comprising an activator of the PKCe protein or an expression vector encoding the PKCe protein. It also relates to the use of a PKCe protein activator or an expression vector encoding the PKCe protein for the preparation of a medicament for the treatment of a neurodegenerative disease.
  • the invention relates to methods for the selection, identification, characterization or optimization of cell-depleting active compounds based on the measurement of the nuclear or cytoplasmic localization of LIV21, or the binding of LIV21 protein to the E2F4 protein.
  • the selection, identification, characterization or optimization of active compounds of therapeutic interest comprises contacting a candidate compound with a cell and determining the nuclear or cytoplasmic localization of the cell.
  • LIV21 expression product An increase in the nuclear localization of LIV21 indicates that the candidate compound is active to decrease or abolish cell proliferation.
  • a decline in the nuclear localization of LIV21 indicates that the candidate compound is active to treat or prevent a neurodegenerative disease.
  • the selection, identification, characterization or optimization of active compounds of therapeutic interest comprises contacting a candidate compound with a cell and determining the level of expression of the gene. encoding the PKCe protein. A decrease in PKCe expression indicates that the candidate compound is active to decrease or abolish cell proliferation. An increase in PKCe expression indicates that the candidate compound is active to treat or prevent a neurodegenerative disease.
  • the selection, identification, characterization or optimization of active compounds of therapeutic interest comprises contacting a candidate compound with a cell and determining the level of LIV21 / E2F4 complex.
  • An increase in the level of LIV21 / E2F4 complex indicates that the candidate compound is active to decrease or abolish cell proliferation.
  • a decrease in the level of LIV21 / E2F4 complex indicates that the candidate compound is active to treat or prevent a neurodegenerative disease.
  • the selection, identification, characterization or optimization of active compounds of therapeutic interest comprises contacting a candidate compound with a cell and determining the level of expression of the gene. encoding the E2F1 protein.
  • a decrease in E2F1 expression indicates that the candidate compound is active to decrease or abolish cell proliferation.
  • An increase in E2F1 expression indicates that the candidate compound is active to treat or prevent a neurodegenerative disease.
  • the subject of the invention is also a method for screening a compound capable of interacting in vitro, directly or indirectly, with LIV21, characterized in that: in a first step, the candidate compound is contacted with LIV21 and, in a second step, the complex formed between said candidate compound and L1Y21 is detected by any appropriate means.
  • the subject of the present invention is also a method for screening a compound capable of modulating (activating or inhibiting) the activity of the LIV21 protein, characterized in that: in a first step, cells of a biological sample expressing the LIV21 protein with a candidate compound, in a second step, the effect of said candidate compound on the activity of said LIV21 protein is measured by any appropriate means, and in a third step candidate compounds capable of modulating said activity.
  • the activity of LIV21 can for example be estimated through the evaluation of the ability of the cell to divide, by measuring the expression of the E2F1 gene, or by the cytoplasmic and / or nuclear localization of LIV21. .
  • the candidate compound can be a protein, a peptide, a nucleic acid (DNA or RNA), a lipid, an organic or inorganic compound.
  • the candidate compound could be an antibody, an antisense, a ribozyme or a siRNA.
  • the cell line MCF-7 The cell line MCF-7
  • the MCF-7 line is a non-clonal human breast adenocarcinoma cell line. During their differentiation induced by exogenous factors, these cells develop hypertrophy, membrane protrusions and a tendency to dissociate from each other. They acquire a secretory phenotype characterized by the appearance of numerous granules and secretory canaliculi. In vivo, these cells are not very metastatic and this reduced invasiveness is due to a low constitutive activity of protein kinases C (P Cs) and a low level of expression of protein kinase C alpha.
  • P Cs protein kinases C
  • TNF for the induction of apoptosis
  • TPA (12-O-tetradecanoyl phorbol-13-SUMOate)
  • Mass spectrometry was performed for LIV21 protein and its complex.
  • the LIV21 protein (LIV21F poly nucleotide) was digested with trypsin.
  • the peptides resulting from the digestion are solubilized in a solvent: acetonitrile / water (1/1) containing 0.1% TFA (trifluoroacetic acid).
  • a saturated solution of the alpha cyano-4-hydroxycinnarnic matrix was prepared in the same solvent. The same volume was taken from both solutions, 1 ⁇ M was mixed and deposited on the MALDI plate for analysis.
  • the inventor obtained a very significant score of 81, expected: 0.0012 for a variant of histatin 3-2 with 52% recovery of sequences between the tested sample and histatin, this sequence SEQ ID No 5 is common to LIV21 and fflS3-
  • RNAs were extracted from two pools of 50 million cells with the Nucleospin RNA L kit (Macherey Nagel) ref. 740,962.20 resulting in a pool 1 of 318 ⁇ g and a second pool of 182 ⁇ 3 ⁇ 4.
  • the poly A + RNAs were extracted from 313 ⁇ g of total pool 1 RNA using the kit oligo Tex m RNA Midi kit (Qiagen) ref. 70042.
  • RNAs were retro-transcribed with the Revert Aid H minus M-MuLV Reverse Transcriptase Fermentas Ref. EP0451 lot 1124 with 3.64 ⁇ g of total RNA and 0.45 ⁇ mRNA according to the supplier's conditions with an oligo dT primer. Reactions performed at 2 different temperatures at 45 ° C and 55 ° C so as to eliminate the structures of the RNA that may hinder retrotranscription.
  • PCRs were performed with the reverse transcripts as templates with primers Al + oligo dT at first. Nested ECRs were then carried out on these first PCRs with primers Al + Splicing, Al + GDBR1, or ATG + Splicing, ATG + GDBR1.
  • Enzyme Taq DNA polymerase polymerase Fermentas.
  • Thermocycler Bio-Rad iCycler.
  • the quality of the cDNAs was tested by amplification of household genes GAPDH, b-actin and Histone H3.3
  • Figure 17 Gel 6 Screening of the recombinant clones S55T and S55M and
  • PCRs made from PCR matrices carried out with the Al + oligo dT primers on the RTs carried out at 45 ° C. on the total and poly A + (messenger) RNAs.
  • the primers used for these PCRs are Al + G or Al + Splicing reverse).
  • PCRs made from PCR matrices carried out with the Al + oligo dT primers on the RTs carried out at 45 ° C. on the total and poly A + (messenger) RNAs.
  • the primers used for these PCRs are Al + GDBR1 or Al + Splicing reverse).
  • the recombinant clones obtained were screened (after extraction of the plasmid DNA) by restriction with the Eco RI enzyme whose sites flank the insertion site of the PCR products into the pGEMT Easy vector.
  • the first experiments were made from the ten B clones and ten C clones Figure 14 and 15 and the results of the B2 and C8 clone sequences are given in the following example and have by comparison of sequences between clones a great homology with the clones of the second series of experiments.
  • GDBR1 reverse 5 * - -3 'and GDBR1 reverse 5'- -3' inv comp 2 profiles are very sharp bands of 1900-2100 bp and 1000-1300 bp but of lower intensity than that of the 1500-1600 bp band.
  • the primers used for these PCRs are ATG + GDBR1 or ATG + Splicing reverse).
  • PCRs performed with the ATG + GDBR1 primers give 1213 bp (RT 45 ° C) and 1559 + 1315 bp (RT at 55 ° C) bands, the expected theoretical size is 1455 bp.
  • PCRs performed with the ATG + Splice reverse primers give more varied band profiles.
  • the profiles of the ATG + Splice reverse PCR carried out with total RNAs give a band of 424-437 bp of very strong intensity. There are also bands of 614 and 783 bp of very high intensity in the profile of the RT 45 and more numerous bands but of lower intensity in the profile of the RT 55 bands at 1118, 936 and 749 bp.
  • Example of 16 biomarkers of interest analyzed by RT PCR which cross-checks the results obtained by biochip on the sensorchip allowing SPR to see the overexpression and the under-expression of certain genes of the Liv21 complex and its interaction partners for example.
  • EXAMPLE 6 From the cloning of the LIV21 gene described above, the new sequences are studied to draw the si RNA (see listing of si RNA and Figure 19) the most specific and effective to create the "silencing" of the c gene. that is to say, to inhibit its expression. Knowing that the inhibition efficiency with each injection of siRNA remains short, that is to say most often less than one hour. The inventor has developed diagnostic products and therapeutic products from the same tool that is siRNA.
  • EXAMPLE 6.1 The inventor uses rhodamine or fluorescein-labeled RNAs or any other marker which can be revealed and monitored by optical observation, by a microscope in order to locate the place in the cells, tissues or labeled sample where will be directed if labeled RNA in order to cling to the specific sequence that characterizes it and thus signal the place of expression of the messenger RNA of the gene of interest
  • the specific if RNA can be used as a diagnostic marker as would be a antibodies and allow to locate in a particular case as on extemporaneous or any type of sample taken from a patient for example sample of cancerous tissue, the fluorescence for any other labeling used on the si RNA and found in a cell compartment on the sample.
  • EXAMPLE 6.2 for therapeutic products that directly result from observations made by biomarker expression results on biochips, the interest is well illustrated by the example of TGF beta and p27:
  • TGFBeta inhibits cell proliferation by increasing the level of p27 via the activation of smad 2/3 transcription factors.
  • TGFbeta increases the total level of translocation of p27 in the nucleus thus accumulates p27 in the cell nucleus through the activation of smad 2 and smad 3.
  • TGFbeta RI serine kinase SD208 new therapeutic axis targeted for carriers
  • TGFBeta decreases the level of skp2 components relative to the protein but not the level of mRNA.
  • TGFbeta can mediate the degradation of p27 in the proteasome, therefore at the protein level because it maintains it in the nucleus, but on the other hand the inhibition of p27 transcription with a specific siRNA blocks TGF beta.
  • TGFBeta prevents the proteasomal degradation of the p27 inhibitory cycle kinase inhibitor. (Alvarez Rodriguez R Pon SJ that sci 2009 March 1-122).
  • the expression of the proneural gene encoding Mash 1 suppresses MYCN (mitotic activity).
  • the inventor uses the if RNA of the complex LIV21 labeled in a first time to objectify their expected presence in the cell compartment and to visualize them then if RNA LIV21 unlabeled in a second time for their purely therapeutic action, in a particular case an injection of if RNA (FIG. 1) in a neurodegenerative tissue or by a pathway that allows if the RNA to reach the tissue in neurodegeneration (ex-ear, eye, etc.) and to act by allowing proliferation up to to apoptosis and thus the death of the cell in neurodegeneration.
  • FOG. 1 injection of if RNA (FIG. 1) in a neurodegenerative tissue or by a pathway that allows if the RNA to reach the tissue in neurodegeneration (ex-ear, eye, etc.) and to act by allowing proliferation up to to apoptosis and thus the death of the cell in neurodegeneration.
  • FIG. 1 An experiment on human cell cultures then on animal models with retinopathy generating vitreoretinal de
  • SiRNAs are also transfected into cells according to the Invitrogen protocol using lipofectamine 2000.
  • the study of the specific role of PKC epsilon on the nuclear translocation of Liv 21F can use a peptide that inhibits PKC epsilon function and translocation as previously described but also according to the PKC epsilon Si RNA reference protocol.
  • the expression profile observed corresponds to a doublet of bands in the cytoplasm at approximately SI K (and at a 64 kD band according to the siRNAs used) whereas it corresponds only to a single band at 50 kD in the nuclear fraction .
  • the siRNA molecules derived from the nucleotide sequences of the Liv21 complex may be selected from the group consisting of siRNA molecules comprising any one of SEQ ID NO: 19 to 126 and 171 to 175, and SEQ ID NO: 1. use of combination therapy based on the combination of several of these siRNAs for the treatment of cancer or neurodegenerative pathology.
  • siRNAs and the useful combination deduced from the results of over expression and under expression of biochips and RT PCR constitute an adjuvant treatment of the pathology and can to be combined with small doses of chemical molecules that have already been proven in the treatment of pathology.
  • the invention lies in the manufacture of DNA, protein and antibody diagnostic chips comprising the known antibodies of the various proteins of the associated complex according to the phases of the cell cycle at LIV21, that is to say the antibodies, peptides or nucleotide sequences of the genes: RBP2, E2F4, * E2F1, SUMO, INT2, CRB2, HDAC1, TGFbeta, integrin_alpha5 beta2, Myob, MyoD, cycE / cdk2, cdk1, chk1, chk2, T Falpha, CREB1 and p300, Rb, p107, p130 the families of the protein pockets.
  • the protein chips ( Figure 20) will be able to study the overexpression or expression of gene products, protein interactions and post-translational modifications, especially the phosphorylations and methylations of certain proteins, which signify a characteristic state of the diseased cell. different from protein interactions and healthy cell metabolism. The state of expression and silencing of certain genes being different.
  • EXAMPLE 7.1 Pharmaco Diagnostic Chip (FIG. 20) Designed on the basis of nucleotide or peptide sequences fixed on conventional supports and according to the known Agilent or Affymetrix or Caliper type techniques without restriction to them and corresponding to the known sequences of the following and listed genes Furthermore, in the patent, preferably using the sequences which in 3D analysis have a 3D structure, preferably of the loop (100bp) or helix loop helix or basic loop (approximately 400bp) or zinc finger type, or else a 3D conformation similar to a helix.
  • nucleotide sequences corresponding to a methylation zone of a cytosine, methylation of the promoter region of the gene resulting in a silcncing potential see general bibliography
  • sequences common to certain oncogenes and certain viruses that are thought to be involved particularly in breast cancer of Chinese populations:
  • SPR Technique Resonance Plasmon Surface
  • microfluidic liquid passing on these chips with a blade gold can be both a cellular extract (see selective only cell nuclei or only cellular cytoplasm or only cytosque proteins etc ... according to fraction extraction and separation techniques Calbiochem type: subcellular proteom extraction or else cellular or cellular extracts without preparation other than anti proteases or else cerebrospinal fluid or serum derived from a sample of a patient to study EXAMPLE 6
  • the new sequences are studied to draw the si RNA (see listing of si RNA and Figure 19) the most specific and effective to create the "silencing" of the c gene. that is to say, to inhibit its expression. Knowing that the effectiveness of the inhibition with each injection of siRNA remains short, that is to say most often less than one hour.
  • the inventor has developed diagnostic products and therapeutic products from the same tool that is siRNA.
  • EXAMPLE 6.1 The inventor uses rhodamine or fluorescein labeled siRNAs or any other marker that can be revealed and monitored by optical observation, by a microscope in order to locate the place in the cells, tissues or labeled sample where will be directed if labeled RNA in order to cling to the specific sequence that characterizes it and thus signal the place of expression of messenger RNA of the gene of interest.
  • the specific RNA can be used as a diagnostic marker as would be an antibody and allow to locate in a particular case as extemporaneous or any type of sample taken from a patient for example sample of cancerous tissue, fluorescence for any other labeling used on the si RNA and found in a cell compartment on the sample.
  • EXAMPLE 6.2 for the therapeutic products that result directly from observations made by biomarker expression results on biochips, the interest is well illustrated by the example of TGF beta and p27: The publication of Mr. Lecanda J and Gold Li of March 2009 is rich in teaching and illustrates very well the interest of pharmaco-diagnostic biochips as described above.
  • TGFBeta inhibits cell proliferation by increasing the level of p27 via the activation of smad 2/3 transcription factors.
  • TGFbeta increases the total level of translocation of p27 in the nucleus thus accumulates p27 in the cell nucleus through the activation of smad 2 and smad 3.
  • TGFbeta RI serine kinase SD208 new therapeutic axis targeted for carriers
  • TGFBeta decreases the level of skp2 components relative to the protein but not the level of mRNA.
  • TGFbeta can mediate the degradation of p27 in the proteasome, therefore at the protein level because it maintains it in the nucleus, but on the other hand the inhibition of p27 transcription with a specific siR A blocks TGF beta.
  • TGFBeta prevents the proteasomal degradation of the p27 inhibitory cycle kinase inhibitor.
  • the expression of the proneural gene encoding Mash 1 suppresses MYCN (mitotic activity).
  • RNA LIV21 labeled in a first time to objectify their expected presence in the cell compartment and to visualize them then if RNA LIV21 unlabeled in a second time for their purely therapeutic action, in a particular case an injection of if RNA (fig 19) in a neurodegenerative tissue or by an approach that allows if the RNA to reach the tissue neurodegeneration (ex-ear, eye etc. ..) and act by allowing proliferation until to apoptosis and thus the death of the cell in neurodegeneration.
  • An experiment on human cell cultures then on animal models with retinopathy giving rise to vitreoretinal degeneration (injection of direct siRNA into the eye) makes it possible to illustrate this method.
  • SiRNAs are also transfected into cells according to the Invitrogen protocol using lipofectamine 2000.
  • the study of the specific role of PKC epsilon on the nuclear translocation of Liv 21F can use a peptide that inhibits PKC epsilon function and translocation as previously described but also according to the PKC epsilon Si RNA reference protocol.
  • the expression profile observed corresponds to a doublet of bands in the cytoplasm at approximately 51 KD (and at a 64 kD band according to the siRNAs used) whereas it corresponds to a single band at 50 kD in the action nuclear.
  • the siRNA molecules derived from the nucleotide sequences of the Liv21 complex may be selected from the group consisting of siRNA molecules comprising any one of SEQ ID NO: 19 to 126 and 171 to 175, and SEQ ID NO: 1. use of combination therapy based on the combination of several of these siRNAs for the treatment of cancer or neurodegenerative pathology.
  • siRNAs and the useful combination deduced from the results of over expression and under expression of biochips and RT PCR constitute an adjuvant treatment of the pathology and can be combined with small doses of chemical molecules that have already been proven in the treatment of cancer. pathology.
  • the invention lies in the manufacture of DNA, protein and antibody diagnostic chips comprising the known antibodies of the various proteins of the associated complex according to the phases of the cell cycle at LIV21, that is to say the antibodies, peptides or nucleotide sequences of the genes: RBP2, E2F4, E2F1, SUMO, INT2, CRB2, HDAC1, TGFbeta, integrin_alpha5 beta2, Myob, MyoD, cycE / cdk2, cdk1, chk1, chk2, TNFalpha, CREB1 and p300, Rb, p107, p130 of families pockets of protein.
  • the protein chips ( Figure 20) will be able to study the overexpression or expression of gene products, protein interactions and post-translational modifications, especially the phosphorylations and methylations of certain proteins, which signify a characteristic state of the diseased cell. different from protein interactions and healthy cell metabolism. The state of expression and silencing of certain genes being different.
  • EXAMPLE 7.1 Pharmaco Diagnostic Flea (FIG. 20) Designed from Nucleotide or Peptide Sequences Fixed on the Traditional Supports and According to the Known Agilent or Afrymetrix or Caliper-type Techniques Without Restriction to Them and Corresponding to the Known Sequences of the Next and Listed Genes Furthermore, in the patent, preferably using the sequences which in 3D analysis have a 3D structure, preferably of the loop (100bp) or helix loop helix or basic loop (approximately 400bp) or zinc finger type, or else a 3D conformation similar to a helix.
  • nucleotide sequences corresponding to a methylation zone of a cytosine, methylation of the promoter region of the gene leading to a silencing potential see general bibliography
  • sequences of the LIV21F and LIV21K listed in the description and annex but also sequences common to certain oncogenes and some viruses that are thought to be involved especially in breast cancer of Chinese populations:
  • GAVTSSNIAA DLDQSV; EGF and HPV16; EWWRLD; KNSLD; MHIESLDS who can also be tested in microfluidics fixed on the gold slide to study the protein interactions with the cell extracts of the patient.
  • Example 7.2 Microfluidic test, for example Biacore type, using the SPR technique (plasmonic resonance surface) known to those skilled in the art based on a support fixed with a gold film allowing once the light beam sent towards the interface to obtain energy absorbed according to the presence and size of the protein complexes (if protein protein or antibody protein interaction) or protein complexes DNA (if DNA protein interaction), or RNA or protein or peptide, and an evanescent wave perpendicular to the axis of the interface (use of a prism).
  • SPR technique plasmonic resonance surface
  • the inventor fixes the chosen peptide or DNA sequences on the gold particles and calculates for each interaction complex studied, the number of rU depending on the size of the molecules mentioned in this patent.
  • the liquid passing on these gold-plated chips can be both a cellular extract (see only selective cell nuclei or only cellular cytoplasm or only cytoskeletal proteins, etc., according to extraction and separation fractionation type Calbiochem: subcellular proteom extraction or tissue or cell extracts without preparation other than anti proteases or even cerebrospinal fluid or serum from a sample of a patient to study the circulating marker (See list of the nucleotide or peptide sequences described and / or known sequences of the genes involved in the proliferation cycle listed.)
  • Figure 21 illustrates the presence and quantification of certain biomarkers present in the samples of patients tested in interaction with the antibodies.
  • the technique of fixing the RNAs on the supports differs according to the type of support, revelation and biochip used. For example, the RNA sequences quoted in biothynilated solution and then fixed on streptavidin receptor probes are used, if their interactions with cell or plasma extracts or cerebrospinal fluid passing through the (microfluidic) channels of an Al 00 or T100 are tested. .
  • the improvement of the invention is to standardize biopsies or punctures by a standardized and qualified sampling technique to then allow reliable comparisons between cell extracts of patients and controls or between cytoplasmic fractions and nuclear and membrane. This same standardization applied to samples allowing to compare the results of overexpression or under expressions of biomarkers by RTPCR is essential to obtain reliable and comparable results.
  • PKCs Inase protein C
  • TPA is a known activator of PKCs. It activates the growth of normal breast cells, does not alter the proliferation of benign tumor cells of the same tissue, but it drastically inhibits the proliferation of cells of human breast tumor lines such as the MCF-7 line. It reduces the cell growth of this line by positively controlling the c-erb-2 receptor and negatively controlling the retinoic acid receptor, both of which are expressed particularly prominently in these cells.
  • TPA strongly and rapidly inhibits the expression and function of estrogen receptors (ER) and induces the time-and dose-dependent translocation of cytosolic protein kinase C (PKCs) to membranes.
  • PKCs cytosolic protein kinase C
  • TPA increases the ability of MCF-7 cells to migrate in vitro and a short treatment of these cells by TPA induces cellular expansion and microtubule organization characteristic of their differentiation.
  • the inventor verified the expression of LIV21 in these cells, at the transcriptional level and at the protein level.
  • LIV21 mRNA Expression of LIV21 mRNA was demonstrated by RT-PCR (sense primer: CCTGACATCCCTACA (SEQ ID No. 3) and antisense primer: -TeCTAXGCTTGA (SEQ ID No. 4)) in these cells compared to tissue cells. mammary ( Figure 2A). MRNA of the same size as mRNA detected in breast tissue and specific to LIV21 was detected. However, the level of LIV21 expression in MCF-7 cells is lower than in breast tissue. This first result shows that the MCF-7 line expresses LIV21 mRNA.
  • the inventor has addressed the study of the expression of the LIV21 protein by the Western Mot technique, with an anti-LIV21 antibody, in the MCF-7 cells compared to the mammary tissues.
  • Anti-LIV21 antibodies were obtained by the described method.
  • LIV21 is expressed as well in mammary tissues as in MCF-7 cells, in the form of a doublet migrating at an apparent molecular weight of 51 kDa.
  • the specific peptide sequences are sequences No. 1 and No. 2 and No. 180
  • Immunocytochirnie At the same time, immunofluorescence experiments on treated or non-treated cultures made it possible to demonstrate this decrease in PKCe concomitant with the nuclear translocation of LIV21. It can be observed that PKCe disappears from the cytoplasm when the cells are treated with TPA and that LIV21 is detected in the nucleus. To conclude, it is interesting to note that PKCe is weakly expressed at 12h, the time when we observe the least number of S-phase cells and the maximum of nuclear translocation of LIV21.
  • This example describes the conditions used for Western Blot analysis of brain cancer cells.
  • the protein extracts are heated for 5 minutes at 80 ° C. in Laemmli buffer (pH 7.4, 0.06M Tris, 3% SDS, 10% glycerol, 1M PMSF, ⁇ -mercaptoethanol).
  • Laemmli buffer pH 7.4, 0.06M Tris, 3% SDS, 10% glycerol, 1M PMSF, ⁇ -mercaptoethanol.
  • SDS-PAGE sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. 10 to 20 ⁇ g of proteins migrate in a 12% polyacrylamide gel for 1 h under denaturing conditions (Migration buffer: 25 mM Tris base, 192 mM glycine, 1% SDS, pH 8.3).
  • the proteins are then transferred to a nitrocellulose membrane (Schleicher & Schuell) for one hour in liquid transfer, in a transfer buffer (25mM Tris, 192mM glycine, 20% methanol, pH 8.3).
  • the membranes saturated in 0.1% PBS-Tween 0.1% -Triton XI 00 -5% skimmed milk for one hour are brought into contact with the primary antibody diluted in PBS-0.1% Tween -Triton 0.1% -lait 1% at room temperature with gentle stirring for one hour to two hours. After washing, the secondary antibody coupled to the peroxidase is incubated with the membranes.
  • the revelation is by a cliimiluminescence reaction using the ECL kit according to the supplier's protocol (Amersham).
  • the primary antibodies used are:
  • Anti-LIV21 serum that was made using synthetic peptides based on the LIV21F sequence and PeptideLIV21a (SEQ ID No. 1 and LIV21b peptide (SEQ ID No. 2 and / or LIV21e peptide (SEQ ID NO: 51).
  • the peptides were coupled to the hemocyanin before being injected into rabbits for immunization
  • the polyclonal antibody was obtained from two of these peptides by immunizing two rabbits and blowing a rabbit to obtain a rabbit. preimmun serum (to be sure that this antibody did not already exist in this rabbit).
  • Rabbit anti-CDK2 polyclonal antibody (Santa-Cruz technology sc-163) diluted 1/200.
  • mice anti-p21 monoclonal antibody DAKO, M7202
  • Mouse anti-p27 monoclonal antibody diluted 1/100.
  • PML bodies In the proliferation stage, there are visualized changes in PML bodies because these PML bodies dissociate and degrade: (speekles), proteins are then available in the nucleus to ensure transcription, proliferation, immune responses and anything that requires gene transcription. It has been demonstrated that PML associates with SUMO and with HDAC-1 (histone deacetylase 1) and that its complex acts on the expression of E2F1 and PML thus acts on the stop of the proliferation by blocking E2F1. Thus the PML / HDAC-1 complex negatively regulates the expression of E2F1. PML associated with Rb (pl30) binds to histone deacetylases and blocks E2F1 by binding to chromatin.
  • HDAC-1 histone deacetylase 1
  • PML In acute promyelocytic leukemias, PML is truncated and becomes a fusion protein with the retinoic acid receptor. This fusion protein (PMLRARalpha) is due to a chromosomal translocation 15/17. It has been reported in the literature a new treatment of this disease by combination of arsenic and retinoic acid to induce cancer cells in apoptosis. The PML protein regulates proliferation in cancers and lymphomas. The inventor has shown by immunoprecipitation the SUMO-PML association in which LIV21 is located.
  • E2F4 After 48 hours when proliferation begins, E2F4 has a comparable location; but at 72 h, it disappears from the core (in favor of E2Fl).
  • co-localization is also observed between LrV21 and SUMO (The hypothesis is that SUMO, which binds to LIV21, actually addresses LIV21 in PML bodies and that L1Y21 is involved in PML / SUMO complexes.
  • Rb / Rb / HDAC-1 LIV21 is physically associated with PML and SUMO in nuclear bodies, by immunoprecipitation and by co-localization in immunocytochemistry ((Rb, pl30 and p107 are pocket proteins) which have the same site The Rb proteins suppress cell growth (Fabbro, Regazzi R Bioch BiophysResComm 1986 Feb 2; 135 (1): 65-73).
  • E2F family are transcription factors whose role has been widely described in the literature as key molecules in positive or negative control of the cell cycle (Slansky JE and Farnham PJ 1996, Helin K 1998 and Yamasaki L 1998), by their association with the protein pRb (WuCL, Zukerberg LR). Functional interaction of LIV21 with the proteins of the E2F family.

Abstract

The present invention relates to novel polypeptide, ribonucleotide and nucleotide sequences to be integrated into a novel test for screening for reinduction of the cell cycle targeting oncology, and to the use of some of these same functionalized sequences as an adjuvant treatment by molecular targeting. It is a major improvement without which the diagnosis and the pharmacodiagnostic test could only be partial. The consequence of this would be a less effective treatment with a narrower application according to the heterogeneity of cancers. It is therefore a diagnostic test and a prognostic test for various cancers. More particularly, the invention relates to the use of the genes or of the proteins of the LIV21 complex and also derivatives thereof as therapeutic tools and as diagnostic and prognostic markers for cancers. The invention therefore relates to the detection of the LIV21 gene or of the LIV21 protein with a kit comprising antibodies or probes specific for LIV21, but also the invention is the use of all the proliferation markers and transcription factors which play a role in the cancerization and, for some, neurodegeneration process. Therefore, the invention lies in the use of RT‑PCR and of quantitative PCR (Q PCR) twinned with the fabrication of diagnostic DNA chips, diagnostic protein chips and diagnostic antibody chips comprising the known antibodies for the various proteins of the protein complexes associated, according to the cell cycle phases, with the LIV21 complex, i.e., without restriction thereto: peptides of and antibodies for RBP2, E2F4, E2F1, SUMO, HDAC1, crb2, Int2, cmd2, cycE/cdk2, cdk1, CREB1 and p300, Rb, p107 and p130 of the pocket proteins family, but also NF-κB, cdc2A, mdm2, p21, p53, p65, BRCA1, TNFalpha and TGF beta. The novel sequences are the polynucleotide and polypeptide sequences of Liv21F, Liv21H, etc. (additional listing: SEQ ID No. 171 to 185 ...) and the sequences of corresponding genes, proteins and antibodies newly integrated into the pharmacodiagnostic biochips.

Description

TESTS DEDIES A L 1 ONCOLOGIE ET A LA NEURO ONCOLOGIE TESTING G 1 DEDICATED TO ONCOLOGY AND ONCOLOGY NEURO
DOMAINE DE L'INVENTION FIELD OF THE INVENTION
La présente invention se rapporte au domaine de la médecine et de la biologie. Elle concerne un nouveau test de dépistage et de suivi thérapeutique en oncologie. Plus particulièrement, elle se rapporte aux tests diagnostics et/ou thérapeutiques en oncologie et sur les maladies neurodégénératives. Le ciblage moléculaire par des vecteurs peptidiques ou des siRNA ouvre à une nouvelle conception de l'interdépendance qu'il y a entre outils diagnostiques et thérapeutiques qui maintenant vont de paire et ouvre la voie du pharmacodiagnostic.  The present invention relates to the field of medicine and biology. It concerns a new screening test and therapeutic monitoring in oncology. More particularly, it relates to diagnostic and / or therapeutic tests in oncology and neurodegenerative diseases. Molecular targeting with peptide vectors or siRNAs opens the door to a new understanding of the interdependence between diagnostic and therapeutic tools that now go hand in hand and open the way to pharmacodiagnostics.
L'inventeur met en évidence les mécanismes d'interactions moléculaires et l'intérêt de biopuces dédiées suivant les cancers avec une multithérapie additionnée d'adjuvants thérapeutiques pour ralentir la formation de ces lésions.  The inventor highlights the mechanisms of molecular interactions and the interest of biochips dedicated to cancers with HAART plus therapeutic adjuvants to slow the formation of these lesions.
La compréhension des jeux d'équilibre entre sous expression et surexpression des gènes suivant leur localisation dans un compartiment cellulaire permet d'ouvrir un champ d'analyse différentielle plus fine et d'adapté une multithérapie avec siRNA et peptides par ciblage moléculaire.  The understanding of the equilibrium between under expression and overexpression of genes according to their localization in a cellular compartment makes it possible to open up a finer differential analysis field and adapted a combination therapy with siRNA and peptides by molecular targeting.
DESCRIPTION DE L'ETAT DE L'ART  DESCRIPTION OF THE STATE OF ART
Les maladies neurodégénératives liées à l'âge et les cancers impliquent tous les deux une modification du processus physiologique de la mort cellulaire programmée ou apoptose. La mort neuronale est anormalement accélérée au cours des maladies neurodégénératives telles que les maladies d'Alzheimer, Huntington, Parkinson etc.. En revanche, le processus de cancérisation correspond à un blocage de l'apoptose conduisant à une multiplication incontrôlée des cellules. Le lien entre ces deux processus est actuellement devenu un champ d'investigation majeur de recherche sur le vieillissement. Le contrôle de l'équilibre entre division cellulaire (mitose), différenciation et mort cellulaire programmée (apoptose), est fondamental au cours de processus physiologiques .- normaux, comme le développement embryonnaire, la fégénération des tissus et le vieillissement. Une altération de cet équilibre peut conduite- à des situations pathologiques majeures comme la formation de tumeurs ou certaines , maladies neurodégénérativesr Le cancer est l'une des causes principales de mortalité à travers le monde. Alors que, au cours de la dernière génération, les pourcentages de décès reliés aux maladies cardiaques, cardiovasculaires et un bon nombre d'autres maladies sont à la baisse, le nombre de décès relié aux différentes formes de cancer est à la hausse. Age-related neurodegenerative diseases and cancers both involve a change in the physiological process of programmed cell death or apoptosis. Neuronal death is abnormally accelerated during neurodegenerative diseases such as Alzheimer's, Huntington's, Parkinson's etc. In contrast, the process of cancerization corresponds to a blockage of apoptosis leading to an uncontrolled multiplication of cells. The link between these two processes has now become a major field of research in aging research. Control of the balance between cell division (mitosis), differentiation, and programmed cell death (apoptosis) is fundamental during normal physiological processes, such as embryonic development, tissue fenescence, and aging. Alteration of this balance can lead to major pathological situations such as the formation of tumors or certain neurodegenerative diseases. Cancer is one of the leading causes of death worldwide. While over the last generation the percentage of deaths related to heart disease, cardiovascular disease and many other diseases have been declining, the number of deaths related to various forms of cancer is on the rise.
Malgré l'avancement rapide de notre compréhension des différentes formes de cancer, les faibles taux de survie sont généralement attribuables à un diagnostic et un traitement inadéquats. La plupart des tumeurs ne peuvent être détectées que lorsqu'elles atteignent une taille d'environ 1cm. Puisqu'il y a un laps de temps relativement court du développement continu d'une tumeur jusqu'à un stade devenant incompatible avec la survie, cela laisse peu de temps pour une intervention thérapeutique. Donc, le diagnostic précoce devient la clef du succès pour le traitement du cancer. Le cancer de la peau par exemple est le cancer le plus répandu au Canada. En 1992 uniquement, 50 300 nouveaux cas de cancer de la peau ont été rapportés, comparés aux 19 300 cas de cancer du poumon, aux 16 200 cas de cancer colorectal et aux 15 700 cas de cancer du sein. En d'autres mots, le cancer de la peau est aussi fréquent que les 3 principaux types de cancers réunis. Son incidence, continue de croître avec ses 64 200 nouveaux cas en 1997, soit une augmentation de 14 000 cas annuellement en 5 ans. En particulier, l'incidence du mélanome malin croît à un taux de 2% par année. Le diagnostic précoce demeure la clef d'un traitement efficace. Une tumeur maligne est facilement accessible et peut être enlevée à l'aide d'une chirurgie mineure. En fait, la guérison est de 100% si le cancer de la peau est détecté assez tôt. Le diagnostic précoce du cancer de la peau demeure toutefois difficile.. Il devient donc important d'être capable de distinguer ces 2 types de cancer de la peau. Un diagnostic définitif du cancer de la peau requiert une biopsie et une analyse histologique. Cependant, la décision d'envoyer une biopsie pour analyse (ou même si un patient doit être référé à un dermatologiste) devient très subjective. Il y a plusieurs biopsies qui ne sont pas prises alors qu'elles auraient dû l'être. Le cancer du colon est la troisième cause de mortalité reliée au cancer chez les hommes et les femmes en Amérique du Nord (16 200 cas par année). La détection précoce, menant à une intervention précoce, a démontré que l'on peut améliorer le succès du traitement et le taux de survie. Par exemple, le taux de survie sur 5 ans est de 92% pour un patient dont la maladie a été détectée à un stade précoce, alors que le taux descend à environ 60% chez les patients avec un cancer localisé, et à environ 6% chez ceux présentant des métastases. Cependant, seulement le tiers des cancers du colon est détecté à un stade précoce. Une des raisons de ce délai dans le diagnostic est l'absence d'un test de dépistage sensible, peu dispendieux et non-invasiLe cancer du sein est un des plus communs chez la femme avec le cancer du colon. Le taux de mortalité est le plus élevé de tous les cancers affectant les femmes. Il y a très peu de marqueurs diagnostics capables de détecter le cancer du sein et ils ont seulement une valeur prédictive de 20%. Il n'y a pas non plus de marqueurs qui puissent détecter ou déterminer l'invasivité et l'agressivité des cellules cancéreuses métastatiques ou qui permettent un suivi thérapeutique. Despite the rapid advancement of our understanding of different forms of cancer, low survival rates are generally attributable to inadequate diagnosis and treatment. Most tumors can only be detected when they reach a size of about 1cm. Since there is a relatively short period of time for the continuous development of a tumor to a stage that becomes incompatible with survival, this leaves little time for therapeutic intervention. So, early diagnosis becomes the key to success for cancer treatment. For example, skin cancer is the most common cancer in Canada. In 1992 alone, 50,300 new cases of skin cancer were reported, compared to 19,300 cases of lung cancer, 16,200 cases of colorectal cancer and 15,700 cases of breast cancer. In other words, skin cancer is as common as the top 3 types of cancers combined. Its incidence continues to grow with its 64,200 new cases in 1997, an increase of 14,000 cases annually in 5 years. In particular, the incidence of malignant melanoma is growing at a rate of 2% per year. Early diagnosis remains the key to effective treatment. A malignant tumor is easily accessible and can be removed with minor surgery. In fact, the cure is 100% if skin cancer is detected early enough. The early diagnosis of skin cancer remains difficult, however, so it becomes important to be able to distinguish these two types of skin cancer. A definitive diagnosis of skin cancer requires biopsy and histological analysis. However, the decision to send a biopsy for analysis (or even if a patient needs to be referred to a dermatologist) becomes very subjective. There are several biopsies that are not taken when they should have been. Colon cancer is the third leading cause of cancer-related mortality among men and women in North America (16,200 cases per year). Early detection, leading to early intervention, has shown that the success of treatment and survival rate. For example, the 5-year survival rate is 92% for a patient whose disease has been detected at an early stage, while the rate drops to about 60% in patients with localized cancer, and to about 6% in those with metastases. However, only one-third of colon cancers are detected at an early stage. One of the reasons for this delay in diagnosis is the lack of a sensitive, inexpensive and non-invasive screening test. Breast cancer is one of the most common in women with colon cancer. The death rate is the highest of all cancers affecting women. There are very few diagnostic markers that can detect breast cancer and they only have a predictive value of 20%. There are also no markers that can detect or determine the invasiveness and aggressiveness of metastatic cancer cells or that allow therapeutic monitoring.
Pour une multitude de raisons, le diagnostic précoce demeure illusoire pour la plupart des formes de cancer. Pour certaines formes de cancer, des marqueurs spécifiques de la maladie ne sont pas disponibles ou ne le sont seulement qu'à un stade avancé de la maladie, rendant le diagnostic difficile. Pour certaines autres formes de cancer, les marqueurs sont disponibles mais ne sont pas toujours spécifiques à la maladie ou ils peuvent être associés à sa forme bénigne.  For a multitude of reasons, early diagnosis remains illusory for most forms of cancer. For some forms of cancer, disease-specific markers are either unavailable or only available at an advanced stage of the disease, making diagnosis difficult. For some other forms of cancer, markers are available but are not always specific to the disease or they may be associated with its benign form.
Un espoir cette année avec le marqueur qui est le récepteur a la FSH est possible. Comme un de nos marqueurs du complexe LIV21 (cf Figure ) il est commun a plusieurs cancers et permet un diagnostic précoce, il se manifeste aussi dans les vaisseaux comme le notre qu'on peut voir en alexa révélé au niveau des cellules endotheliales, mais en plus nous observons un marquage des globules rouges et aussi du collagene. Au cours des dernières années, des progrès considérables ont été faits dans la compréhension des moyens mis en œuvre par les oncogènes et les gènes suppresseurs de tumeurs pour réguler la prolifération cellulaire et l'apoptose. L'une des cibles principales de ces régulateurs est la famille des facteurs de transcription de type E2F dans la voie de signalisation des protéines E2Fs et RB  Hope this year with the marker that is the receptor for FSH is possible. As one of our markers of complex LIV21 (cf Figure) it is common to several cancers and allows an early diagnosis, it is also manifested in the vessels like ours that can be seen in alexa revealed at the level of the endothelial cells, but in the more we observe a marking of red blood cells and also of collagen. In recent years, considerable progress has been made in understanding the means implemented by oncogenes and tumor suppressor genes to regulate cell proliferation and apoptosis. One of the main targets of these regulators is the family of E2F-like transcription factors in the E2Fs and RB protein signaling pathway
Dans d'autres cas encore, les techniques existent mais le coût prohibitif pour les appliquer à la population en général les rend inappropriées. techniques existent mais le coût prohibitif pour les appliquer à la population en général les rend inappropriées. In still other cases, the techniques exist but the prohibitive cost of applying them to the general population renders them inappropriate. techniques exist but the prohibitive cost of applying them to the general population makes them inappropriate.
Ces cancers ont un intérêt à être étudiés et diagnostiqués par biopuce incluant les biomarqueurs des pathways majeurs de régulation pour permettre un ajustement de la multithérapie fonction des résultats de sous expression et de surexpression des gènes du complexe Liv21. Ainsi le traitement par ciblage moléculaire type siRNA ou anticorps monoclonaux combiné ou non avec des actifs thérapeutiques chimiques est d'une plus grande efficacité. Les neuroblastes sont des précurseurs neuronaux issus de la division des cellules neuroépithéliales. Ce sont des neurones embryonnaires immatures qui peuvent encore se diviser contrairement aux neurones matures qui ne peuvent entrer en mitose.  These cancers are of interest to be studied and diagnosed by biochip including the biomarkers of the major pathways of regulation to allow an adjustment of the combination therapy according to the results of under expression and overexpression of the Liv21 complex genes. Thus treatment with molecular targeting type siRNA or monoclonal antibodies combined or not with therapeutic therapeutic assets is of greater efficiency. Neuroblasts are neuronal precursors derived from the division of neuroepithelial cells. These are immature embryonic neurons that can still divide unlike mature neurons that can not enter into mitosis.
Le neuroblastome, également appelé sympathoblastome, est une tumeur maligne développée aux dépens des cellules de la crête neurale, qui donnent naissance au système nerveux sympathique. Il s'agit de la tumeur solide la plus fréquente chez l'enfant (8 à 10 % des cancers avant 15 ans) et en particulier de l'enfant très jeune (moyenne d'âge 4 ans avec 90 % qui ont moins de 5 ans). Son incidence est de 1 à 3 cas pour 100 000 enfants âgés de 0 à 14 ans. Il n'y a pas de causes ni de facteurs reconnus qui favorisent la survenue d'un neuroblastome. Le neuroblastome est découvert à partir de symptômes dus à la tumeur primitiveNeuroblastoma, also called sympathoblastoma, is a malignant tumor developed at the expense of neural crest cells, which give rise to the sympathetic nervous system. It is the most common solid tumor in children (8 to 10% of cancers under 15 years of age) and in particular the very young child (average age 4 years with 90% who have less than 5 years years). Its incidence is 1 to 3 cases per 100,000 children aged 0 to 14 years. There are no recognized causes or factors that promote the occurrence of neuroblastoma. Neuroblastoma is discovered from symptoms due to the primary tumor
(masse tumorale, en particulier abdominale, ou compression d'un organe voisin, telle la moelle épinière), à des métastases ou à une sécrétion endocrine (altération de l'état général, diarrhée, hypertension artérielle...). Le neuroblastome peut se développer à partir d'une quelconque partie du système nerveux sympathique, le plus souvent au niveau abdominal. Au moment du diagnostic, la tumeur peut être localisée au niveau d'un seul organe, au niveau local ou régional, ou être d'emblée disséminée. Les sites métastatiques les plus fréquents sont l'os, la moelle osseuse, le foie et la peau. Ainsi, la plupart des tumeurs localisées ont un pronostic excellent. Il en est de même pour celles des enfants de moins d'un an, indépendamment du stade de la tumeur. Certaines de ces tumeurs régressent même spontanément. Au contraire, environ 60 % des enfants de plus de un an présentent un neuroblastome d'emblée métastatique de mauvais pronostic. (tumor mass, especially abdominal, or compression of a nearby organ, such as the spinal cord), metastases or endocrine secretion (deterioration of the general state, diarrhea, arterial hypertension ...). Neuroblastoma can develop from any part of the sympathetic nervous system, most commonly at the abdominal level. At the time of diagnosis, the tumor can be localized at the level of a single organ, at the local or regional level, or be disseminated from the outset. The most common metastatic sites are bone, bone marrow, liver and skin. Thus, most localized tumors have an excellent prognosis. It is the same for those children under one year, regardless of the stage of the tumor. Some of these tumors regress even spontaneously. On the contrary, about 60% of children over one year of age have metastatic neuroblastoma, which has a poor prognosis.
La variété de la présentation clinique est en relation avec l'expression de certains marqueurs biologiques et moléculaires (ADN ploïdie, amplification de l'oncogène n- myc, expression des récepteurs Trk, perte du chromosome lp, excès du 17q...). Ainsi, les tumeurs diffuses survenant chez l'enfant de plus d'I an et surexprimant l'oncogène myc sont souvent chimiorésistantes et ont un mauvais pronostic (Berthold et al., 1990 ; Schweigerer et al., 1990). De même, l'expression du récepteur TrkB et de BDNF permet un système de survie autocrine des cellules neuroblastiques et induit la croissance neuritique. Elle est également associée à l'amplification de N-MYC et donc à un mauvais pronostic (Nakagawara et al., 1994). Au contraire, l'expression des récepteurs TrkA, qui induit la différenciation des neuroblastomes (Borrello et al., 1993 ; Eggert et al., 2000), et TrkC (Yamashiro et al., 1996) est plutôt associée à un bon pronostic. Ainsi, il est commun de dire que l'expression du récepteur TrkA est inversement corrélée à l'amplification de l'oncogène n-myc. The variety of the clinical presentation is related to the expression of certain biological and molecular markers (DNA ploidy, amplification of the n-myc oncogene, expression of Trk receptors, loss of chromosome lp, excess of 17q ...). Thus, diffuse tumors occurring in children over 1 year old and overexpressing the myc oncogene are often chemoresistant and have a poor prognosis (Berthold et al., 1990, Schweigerer et al., 1990). Similarly, the expression of the TrkB and BDNF receptor allows an autocrine survival system of neuroblastic cells and induces neuritic growth. It is also associated with amplification of N-MYC and therefore poor prognosis (Nakagawara et al., 1994). In contrast, the expression of TrkA receptors, which induces neuroblastoma differentiation (Borrello et al., 1993, Eggert et al., 2000), and TrkC (Yamashiro et al., 1996) is rather associated with a good prognosis. Thus, it is common to say that the expression of the TrkA receptor is inversely correlated with the amplification of the n-myc oncogene.
Les glioblastomes  Glioblastomas
Au cours du développement, les précurseurs gliaux donnent naissance aux astrocytes, oligodendrocytes, cellules microgliales, cellules choroïdiennes et cellules épendymaires dans le SNC, et aux cellules de Schwann dans le système nerveux périphérique. Ainsi, les cellules gliales jouent un rôle essentiel dans la différenciation (Lemke, 2001) et la survie des neurones (Bar, 2000). Ces cellules assurent la nutrition des neurones, gèrent les connections inter-neuronales, régulent les neurotransmetteurs. During development, glial precursors give rise to astrocytes, oligodendrocytes, microglial cells, choroidal cells and ependymal cells in the CNS, and to Schwann cells in the peripheral nervous system. Thus, glial cells play a key role in differentiation (Lemke, 2001) and neuron survival (Bar, 2000). These cells ensure the nutrition of neurons, manage inter-neuronal connections, regulate neurotransmitters.
Les glioblastomes sont les tumeurs astrocytaires malignes (grade IV selon la classification de l'Organisation Mondiale de la Santé) les plus indifférenciées du SNC et ils sont retrouvés le plus souvent au niveau des hémisphères cérébraux. Chez l'adulte, ce sont les tumeurs cérébrales les plus fréquentes (20 % de toutes les tumeurs intracrâniennes) avec une incidence de l'ordre de 3 nouveaux cas par an et pour 100 000 habitants, soit environ 2400 nouveaux cas par an en France. Ils surviennent à tout âge mais dans 70 % des cas entre 45 et 70 ans. Les glioblastomes forment des masses molles, riches en vaisseaux sanguins, de 3 à 10 cm de diamètre, de couleur vineuse, hétérogènes avec des zones compactes actives et des zones de nécrose étendues, parsemées de vaisseaux thrombosés et qui infiltrent le tissu cérébral. Cependant, ces tumeurs ne sont pratiquement jamais associées à l'apparition de métastases. Ils s'entourent d'un oedème qui augmente la souffrance du cerveau. Typiquement, ils s'expriment par des signes d'hypertension intracrânienne qui s'associe souvent à des changements du comportement, à des crises comitiales, à des déficits neurologiques focaux. Glioblastomas are the most undifferentiated astrocytic malignancies (grade IV according to the World Health Organization's classification) and are most often found in the cerebral hemispheres. In adults, they are the most common brain tumors (20% of all intracranial tumors) with an incidence of about 3 new cases per year and per 100,000 inhabitants, or about 2,400 new cases per year in France . They occur at any age but in 70% of cases between 45 and 70 years old. Glioblastomas form soft masses, rich in blood vessels, 3 to 10 cm in diameter, vinous in color, heterogeneous with active compact areas and extensive areas of necrosis, interspersed with thrombosed vessels and infiltrating brain tissue. However, these tumors are almost never associated with the appearance of metastases. They surround themselves with edema that increases the suffering of the brain. Typically, they are expressed by signs of intracranial hypertension that is often associated with behavioral changes, seizures, focal neurological deficits.
Cette tumeur évolue rapidement, en 2-3 mois, et même après chirurgie, radiothérapie puis chimiothérapie, son pronostic reste sombre sauf si le glioblastome provient de la tumeur peut être localisée au niveau d'un seul organe, au niveau local ou régional, ou être d'emblée disséminée. Les sites métastatiques les plus fréquents sont l'os, la moelle osseuse, le foie et la peau. Ainsi, la plupart des tumeurs localisées ont un pronostic excellent. Il en est de même pour celles des enfants de moins d'un an indépendamment du stade de la tumeur. Certaines de ces tumeurs régressent même spontanément. Au contraire, environ 60 % des enfants de plus de un an présentent un neuroblastome d'emblée métastatique de mauvais pronostic. This tumor evolves rapidly, in 2-3 months, and even after surgery, radiotherapy and then chemotherapy, its prognosis remains gloomy unless the glioblastoma comes from the tumor can be localized at the level of a single organ, at the local or regional level, or to be disseminated from the outset. The most common metastatic sites are bone, bone marrow, liver and skin. Thus, most localized tumors have an excellent prognosis. It is the same for those children under one year regardless of the stage of the tumor. Some of these tumors even regress spontaneously. On the contrary, about 60% of children over one year of age have metastatic neuroblastoma, which has a poor prognosis.
La variété de la présentation clinique est en relation avec l'expression de certains marqueurs biologiques et moléculaires (ADN ploïdie, amplification de l'oncogène n- myc, expression des récepteurs Trk, perte du chromosome lp, excès du 17q...). Ainsi, les tumeurs diffuses survenant chez l'enfant de plus d'I an et surexprimant l'oncogène myc sont souvent chimiorésistantes et ont un mauvais pronostic (Berthold et al., 1990 ; Schweigerer et al., 1990). De même, l'expression du récepteur TrkB et de BDNF permet un système de survie autocrine des cellules neuroblastiques et induit la croissance neuritique. Elle est également associée à l'amplification de N-MYC et donc à un mauvais pronostic (Nakagawara et al., 1994). Au contraire, l'expression des récepteurs TrkA, qui induit la différenciation des neuroblastomes (Borrello et al., 1993 ; Eggert et al., 2000), et TrkC (Yamashiro et al., 1996) est plutôt associée à un bon pronostic. Ainsi, il est commun de dire que l'expression du récepteur TrkA est inversement corrélée à l'amplification de l'oncogène n-myc. The variety of the clinical presentation is related to the expression of certain biological and molecular markers (DNA ploidy, amplification of the n-myc oncogene, expression of Trk receptors, loss of chromosome lp, excess of 17q ...). Thus, diffuse tumors occurring in children over 1 year old and overexpressing the myc oncogene are often chemoresistant and have a poor prognosis (Berthold et al., 1990, Schweigerer et al., 1990). Similarly, the expression of the TrkB and BDNF receptor allows an autocrine survival system of neuroblastic cells and induces neuritic growth. It is also associated with amplification of N-MYC and therefore poor prognosis (Nakagawara et al., 1994). In contrast, the expression of TrkA receptors, which induces neuroblastoma differentiation (Borrello et al., 1993, Eggert et al., 2000), and TrkC (Yamashiro et al., 1996) is rather associated with a good prognosis. Thus, it is common to say that the expression of the TrkA receptor is inversely correlated with the amplification of the n-myc oncogene.
Les récepteurs de la superfamille des TNF-R ont été étudiés dans les cellules neuroblastiques. Ainsi, le récepteur Fas a pu être mis en évidence au niveau de certaines cellules neuroblastiques (Gross et al., 2001), cellules qui peuvent être (Barthlen et al., 1999 ; Rifïkin et al., 2001) ou non (Bian et al., 2004) résistantes à l'apoptose induite par Fas. La sensibilité des cellules neuroblastiques ne dépend pas uniquement de l'expression du récepteur Fas mais de la présence ou non de la caspase-8 dans les cellules (Kisenge et al., 2003). Les récepteurs de TRAIL sont également exprimés dans les cellules neuroblastiques. TNF-R superfamily receptors have been studied in neuroblastic cells. Thus, the Fas receptor has been demonstrated in certain neuroblastic cells (Gross et al., 2001), cells that can be (Barthlen et al., 1999, Rifikin et al., 2001) or not (Bian et al. al., 2004) resistant to Fas-induced apoptosis. The sensitivity of neuroblastic cells does not depend solely on the expression of the Fas receptor but on the presence or absence of caspase-8 in the cells (Kisenge et al., 2003). TRAIL receptors are also expressed in neuroblastic cells.
Le neuroblastome est un des plus communs chez l'enfant. Le taux de mortalité est le plus élevé de tous les cancers affectant les enfants. Neuroblastoma is one of the most common in children. The death rate is the highest of all cancers affecting children.
Il y a très peu de marqueurs diagnostics capables de détecter les neuroblastomes . Il n'y a pas non plus de marqueurs qui puissent détecter ou déterminer l'invasivité et l'agressivité des cellules cancéreuses métastatiques ou qui permettent un suivi thérapeutique. There are very few diagnostic markers that can detect neuroblastomas. There are also no markers that can detect or determine the invasiveness and aggressiveness of metastatic cancer cells or that allow therapeutic monitoring.
Au cours des dernières années, des progrès considérables ont été faits dans la compréhension des moyens mis en œuvre par les oncogènes et les gènes suppresseurs de tumeurs pour réguler la prolifération cellulaire et l'apoptose. L'une des cibles principales de ces régulateurs est la famille des facteurs de transcription de type E2F (E2F1, E2F2, E2F3, E2F4 etc..) dans la voie de signalisation des protéines E2Fs et RB. Ces protéines jouent un rôle central dans le contrôle de la division cellulaire en couplant la régulation des gènes nécessaires à la progression du cycle cellulaire aux signaux extracellulaires (mitogènes, inhibiteurs de la prolifération). Elle se comporte comme un oncogène en stimulant la prolifération des cellules tumorales. Myc N et PAurora kinase A sont aussi des oncogenes impliqués dans la prolifération du neuroblastome. E2F3 module l'expression de TARN m d'Aurora pendant le cycle cellulaire. Par ailleurs certaines données suggèrent que les facteurs de transcription E2F sont critiques pour Factivation totale et la répression de myc N dans les neuroblastomes. La combinaison des dosages des gènes In recent years, considerable progress has been made in understanding the means implemented by oncogenes and tumor suppressor genes to regulate cell proliferation and apoptosis. One of the main targets of these regulators is the family of E2F type transcription factors (E2F1, E2F2, E2F3, E2F4 etc.) in the signaling pathway of E2Fs and RB proteins. These proteins play a central role in the control of cell division by coupling the regulation of genes required for cell cycle progression to extracellular signals (mitogens, proliferation inhibitors). She behaves like a oncogene by stimulating the proliferation of tumor cells. Myc N and PAurora kinase A are also oncogenes involved in the proliferation of neuroblastoma. E2F3 modulates Aurora's RNA expression during the cell cycle. In addition, some data suggest that E2F transcription factors are critical for total activation and suppression of myc N in neuroblastomas. The combination of gene dosages
De Myc N et de la survivin par RTPCR est corrélée au stade d'évolution clinique du neuroblastome.  Myc N and RTPCR survivin correlate with the clinical stage of neuroblastoma.
Parmi les gènes exprimés, on trouve :  Among the genes expressed, we find:
- La sur-expression du facteur de transcription E2F4 et l'oncogène «-myc qui induisent l'apoptose des cellules post mitotiques par accumulation de réactif oxygénés (Tanaka, 2002) et le N Myc qui est amplifié dans 35% des cas de neuroblastomes, le gène AL , DDX1 et CRABP II aussi . HMGA1 et la survivine également. La répression d'HMGAl par RNA interférence réduit la prolifération cellulaire du neuroblastome. N myc induit l'expression de FAK. N myc down régule l'expression mRNA de nombreux gènes ayant un rôle dans rarchitecture cellulaire. - Over-expression of the transcription factor E2F4 and the oncogene «-myc which induce apoptosis of post-mitotic cells by accumulation of oxygenated reagents (Tanaka, 2002) and N-Myc which is amplified in 35% of cases of neuroblastomas , AL gene, DDX1 and CRABP II too. HMGA1 and survivin too. Suppression of HMGA1 by RNA interference reduces cell proliferation of neuroblastoma. N myc induces the expression of FAK. N myc down regulates mRNA expression of many genes involved in cellular architecture.
- le gène p53, appartenant à la famille des gènes suppresseurs de tumeur, bloque le cycle cellulaire en cas de lésion de l'ADN. Il est maintenant démontré que ce gène est aussi impliqué dans le déroulement de l'apoptose (Oren, 1994 ; Yonish-Rouach, 1996).  the p53 gene, belonging to the family of tumor suppressor genes, blocks the cell cycle in the event of DNA damage. It has now been shown that this gene is also involved in the course of apoptosis (Oren 1994, Yonish-Rouach 1996).
- la cycline Dl, une des protéines constituant les sous-unités régulatrices des kinases du cycle cellulaire, indispensable à la progression du cycle cellulaire. Cette protéine est aussi exprimée au cours de l'apoptose dans divers types cellulaires (Han et al, 1996 ; Pardo et al, 1996). Un facteur de transcription Zinc finger peut interompre l'activité de la cycline Dl et bloquer le cycle. cyclin D1, one of the proteins constituting the regulatory subunits of the kinases of the cell cycle, essential for the progression of the cell cycle. This protein is also expressed during apoptosis in various cell types (Han et al, 1996, Pardo et al, 1996). A Zinc Finger transcription factor can interrupt the activity of cyclin D1 and block the cycle.
Des données suggèrent que les facteurs de transcription E2F sont critiques pour l'activation totale et la repression de MYCN dans les neuroblastomes. Evidence suggests that E2F transcription factors are critical for total activation and repression of MYCN in neuroblastomas.
- chkl et 2, crb2, p21 et autres oncogènes et cytokines comme le TNF alpha etc.  - chk1 and 2, crb2, p21 and other oncogenes and cytokines such as TNF alpha etc.
Il serait souhaitable de disposer de nouvelles méthodes diagnostic qui détecterait la présence de cancer avec plus de spécificité et qui permettrait la distinction entre les cellules cancéreuses agressives ayant une tendance à métastaser par rapport à celles plus localisées qui ont une faible probabilité de métastaser. Un marqueur qui puisse donc révéler la prolifération cellulaire serait d'une grande utilité. Les travaux du professeur Jean Louis Mendel sur les marqueurs gliaux et en particulier sur le GFAP et le NF70 ont fait avancer le diagnostic, l'expression de la synemine dans les tumeurs gliales est une voie de recherche importante comme l'est l'étude des mutations de la voie Ras MAPK. La délétion du chromosome 1 dans la région lp36 et l'amplification du gène MYC N signent l'état de prolifération, un pronostic de neuroblastome et une histologie défavorable. Dans 35% des cas MYC N est amplifié, dans 58% des cas c'est le chromosome 17 en q23 et dans 35% des cas le chromosme 1 en p36 est délété. It would be desirable to have new diagnostic methods which would detect the presence of cancer with more specificity and which would allow the distinction between Aggressive cancer cells with a tendency to metastasize compared to more localized ones that have a low probability of metastasis. A marker that can therefore reveal cell proliferation would be very useful. The work of Professor Jean Louis Mendel on glial markers and in particular on GFAP and NF70 have advanced the diagnosis, the expression of synemine in glial tumors is an important research path as is the study of mutations of the Ras MAPK pathway. The deletion of chromosome 1 in the lp36 region and the amplification of the MYC N gene signify the state of proliferation, a prognosis of neuroblastoma and an unfavorable histology. In 35% of cases MYC N is amplified, in 58% of cases it is chromosome 17 in q23 and in 35% of cases chromosome 1 in p36 is deleted.
Le complexe LIV21 sera étudié par RT PCR et par biopuce et ses marqueurs cytoplasmiques d'intérêt et la protéine membranaire du complex Liv 21 aussi.  The LIV21 complex will be studied by RT PCR and by biochip and its cytoplasmic markers of interest and the membrane protein of the Liv 21 complex as well.
21 marqueurs supplémentaires et de nouvelles séquences du complexe LIV21 par rapport au premier et au deuxième brevet déposés vont permettre une amélioration notable et un perfectionnement des tests pharmaco diagnostiques que nous proposons. C'est grâce à ce perfectionnement que l'ajustement thérapeutique en multithérapie pourra permettre une plus grande efficacité de traitement et aussi c'est grâce à ce perfectionnement que le diagnostic des tumeurs gliales se fera plus précisément avec une connaissance plus approfondie sur le pronostic, le grade et l'évolution de ces rumeurs. Un autre perfectionnement a permis d'avoir une précision plus grande dans l'étude des niveaux d'expression des différents gènes importants pour le diagnostic de tumeur gliale, il s'agit de la mise au point d'une normalisation des prélèvements de tissus comme des onctions du liquide céphalo rachidien. Ainsi les comparaisons de profils d'expression sont plus fiables et subissent moins de fluctuations dûes à des biais d'observation. Tous ces nouveaux paramètres qui n'augmentent pas le nombre de variables mais qui diminuent le bruit de fond améliorent grandement le diagnostic et les traitements des tumeurs gliales. RESUME DE L'INVENTION 21 additional markers and new sequences of the LIV21 complex compared to the first and second patents filed will allow a significant improvement and improvement of the pharmaco diagnostic tests that we propose. It is thanks to this improvement that the therapeutic adjustment in HAART will allow a greater effectiveness of treatment and also it is thanks to this improvement that the diagnosis of glial tumors will be made more precisely with a more thorough knowledge on the prognosis, the grade and evolution of these rumors. Another improvement has made it possible to have a greater precision in the study of the expression levels of the various genes important for the diagnosis of glial tumor, it is the development of a standardization of the tissue samples as cerebrospinal fluid anointing. Thus the comparisons of expression profiles are more reliable and undergo fewer fluctuations due to observation bias. All of these new parameters that do not increase the number of variables but reduce background noise greatly improve the diagnosis and treatment of glial tumors. SUMMARY OF THE INVENTION
La présente invention concerne de nouvelles séquences polypeptidiques, ribonucléotidiques et nucléotidiques à intégrer à un nouveau test de dépistage de la réinduction du cycle cellulaire ciblant l'oncologie et l'utilisation de certaines de ces mêmes séquences fonctionnalisées comme traitement adjuvant par ciblage moléculaire. Il s'agit d'un perfectionnement majeur sans lequel le diagnostic et le test pharmaco diagnostique ne pourrait être que partiel. La conséquence en serait un traitement moins efficace et d'application moins large suivant l'hétérogénéité des cancers. Il s'agit donc d'un test diagnostic et d'un test pronostic-pour différents cancers ; £ Plus particulièrement, l'invention concerne l'utilisation du gènes ou des protéines du complexe LIV21 ainsi que leurs dérivés comme outils thérapeutiques et comme marqueurs diagnostics et pronostic des cancers. L'invention concerne donc la détection du-gène ou-de-la-protéine~LIV21 avec un kit comprenant des anticorps ou des sondes spécifiques de LIV21.mais aussi l'invention est d'utiliser l'ensemble des marqueurs de proliférations et facteurs de transcription qui jouent un rôle dans le processus de cancérisation et de neurodégénerescence pour certains. Donc l'invention réside dans l'utilisation de la RT PCR et de la PCR quantitative ( Q PCR) jumelée à la fabrication de puces diagnostiques à ADN, protéines et à anticorps comprenant les anticorps connus des différentes protéines des complexes protéiques associés suivant les phases du cycle cellulaire au complexe LIV21 c'est-à-dire sans restriction à celles là : peptides et anticorps de RBP2, E2F4, E2F1, SUMO, HDAC1, crb2, Int2,cmd2, cycE/cdk2,cdkl, CREB1 et p300, Rb, pl07, pl30 de la familles des pockets protéines. Mais aussi NFkB ,cdc2A, mdm2, p21, p53, p65, BRCAl, TNFalpha , TGF beta. Les séquences nouvelles sont les séquences polynucléotidiques et polypeptidiques de Liv21F , Liv 21H etc.. (liste additionnelle : SEQ N°171 à 185) ) et les séquences de gènes, protéines et anticorps correspondants nouvellement intégrés dans les biopuces pharmaco diagnostiques sont :  The present invention relates to novel polypeptide, ribonucleotide and nucleotide sequences for inclusion in a new cell cycle reinduction screening test targeting oncology and the use of some of these same functionalized sequences as adjuvant treatment by molecular targeting. This is a major improvement without which the diagnosis and the pharmaco-diagnostic test could only be partial. The consequence would be a less effective treatment and less wide application depending on the heterogeneity of cancers. It is therefore a diagnostic test and a prognostic test for various cancers; More particularly, the invention relates to the use of genes or proteins of the LIV21 complex as well as their derivatives as therapeutic tools and as diagnostic and prognostic markers for cancers. The invention therefore relates to the detection of the-gene or the ~ LIV21 protein with a kit comprising antibodies or probes specific for LIV21, but also the invention is to use all the markers of proliferations and factors. of transcription that play a role in the process of cancerization and neurodegeneration for some. Thus the invention lies in the use of RT PCR and quantitative PCR (Q PCR) combined with the manufacture of diagnostic DNA, protein and antibody chips comprising the known antibodies of the different proteins of the associated protein complexes according to the phases. from the cell cycle to the LIV21 complex, that is to say without restriction to those: peptides and antibodies of RBP2, E2F4, E2F1, SUMO, HDAC1, crb2, Int2, cmd2, cycE / cdk2, cdk1, CREB1 and p300, Rb , pl07, pl30 of the pocket protein family. But also NFkB, cdc2A, mdm2, p21, p53, p65, BRCA1, TNFalpha, TGF beta. The new sequences are the polynucleotide and polypeptide sequences of Liv21F, Liv 21H and the like (additional list: SEQ Nos. 171 to 185) and the corresponding gene, protein and antibody sequences newly integrated into pharmaco diagnostic microarrays are:
Myc N, ALK, HMGAl, DDXl, GFAP, NF70, AD7cNTP, FAB3, Serin C2, Synemine, PDXl, HDAC6, TPX2, DKKl, DKK3, HUD, ID2, SKP2, TP53INP1, VEGF, NLRRl, PAX3-FKHR, NDP kinase A, Bora ?, Aurora A, Survivine Les puces à protéines permettront d'étudier les mteractic½ protéiques et les modifications post traductionnelles, plus particulièrement les fifcosphorylations et méthylations de certaines protéines, qui signent un état caractéristique de la cellule malade différent des interactions protéiques et du métabolisme de la cellule saine. L'état d'expression et de silencing de certains gènes étant différent. Le taux d'expression de chaque biomolécule devant être observée distinctement dans chaque compartiment cellulaire pour pouvoir dans un second temps être régulé (sous exprimé ou sur exprimé par un traitement adjuvant type biomolécule ou siRNA ou peptides vectorisés. Myc N, ALK, HMGA1, DDX1, GFAP, NF70, AD7cNTP, FAB3, Serin C2, Synemine, PDX1, HDAC6, TPX2, DKK1, DKK3, HUD, ID2, SKP2, TP53INP1, VEGF, NLRR1, PAX3-FKHR, NDP kinase A, Bora?, Aurora A, Survivine Protein chips will be used to study protein metabolisms and post translational modifications, especially the phosphorylations and methylations of certain proteins, which signify a characteristic state of the diseased cell different from protein interactions and healthy cell metabolism. The state of expression and silencing of certain genes being different. The level of expression of each biomolecule to be observed distinctly in each cell compartment to be able in a second time to be regulated (under expressed or expressed by an adjuvant type biomolecule or siRNA or vectorized peptides.
Les puces à séquences nucléotidiques permettront d'étudier dans des extraits cellulaires nucléaires et par ailleurs cytoplasmique ou membranaires les sous expressions ou les surexpressions des gènes et les ratio entre gènes comme entre protéines du complexe Liv21 et de ses partenaires associés, l'analyse des interactions au sein des complexes métaboliques est une clé du diagnostic et passe aussi par l'étude des domaines fonctionnels. The chips with nucleotide sequences will make it possible to study the subexpressions or overexpressions of the genes and the ratio between genes and between proteins of the Liv21 complex and its associated partners in nuclear and, moreover, cytoplasmic or membrane cell extracts, the analysis of the interactions within the metabolic complexes is a key to the diagnosis and also goes through the study of functional areas.
Un premier objectif de la présente invention est de mettre en évidence une méthode de détection et de pronostic du cancer et de son potentiel métastatique qui permette d'ajuster une multithérapie ciblée. De préférence, le cancer est sélectionné parmi les cancers cérébraux, et plus particulièrement le glioblastome, le neuroblastome, sans être limité à ceux-ci. A first objective of the present invention is to demonstrate a method for detecting and prognosing cancer and its metastatic potential that makes it possible to adjust a targeted combination therapy. Preferably, the cancer is selected from cerebral cancers, and more particularly glioblastoma, neuroblastoma, without being limited thereto.
Un aspect de la présente invention consiste en l'utilisation des nouvelles séquences du complexe LIV21 comme indicateur pronostic du cancer et dans son suivi thérapeutique. En effet, lorsque LIV21F est localisé dans le cytoplasme, les cellules cancéreuses dans les tissus sont agressives. Inversement, lorsque le produit de l'expression du gène LIV21F est localisé préférentiellement dans le noyau cellulaire, ceci est un indicateur pronostic que les cellules du tissu sont différentiées et quiescentes et donc non invasives. On définit le complexe LIV21 par l'extrait de protéines et peptides étudiés en spectrométrie de masse type Maldi et ESI MSMS ou Maldi Tof Tof. Lequel extrait a été obtenu par l'accrochage du complexe Liv21 à un de ces anticorps polyclonaux de LIV21 One aspect of the present invention is the use of the novel LIV21 complex sequences as a cancer prognostic indicator and in its therapeutic monitoring. Indeed, when LIV21F is located in the cytoplasm, the cancer cells in the tissues are aggressive. Conversely, when the product of the expression of the LIV21F gene is preferentially localized in the cell nucleus, this is a prognostic indicator that the cells of the tissue are differentiated and quiescent and therefore non-invasive. The LIV21 complex is defined by the extract of proteins and peptides studied in mass spectrometry type Maldi and ESI MSMS or Maldi Tof Tof. Which extract was obtained by attaching the Liv21 complex to one of these polyclonal antibodies LIV21
il décrit dans le brevet (PCT/FR2006/000510). Le complexe Liv21 se définit aussi par son profil global de spectrométrie de masse (Fig 5) et le nombre et le Poids moléculaire des bandes d'extraits protéiques obtenus sur les gels d'acrylamide des figures LA. et IB fonction de la température à laquelle est soumis l'échantillon et des conditions de migration décrites. En effet, lorsque par exemple le peptide LIV21F est localisé dans le cytoplasme et qu'on révèle directement par hybridation in situ par exemple ou par analyse de biopuce sa plus forte expression dans le cytoplasme, les cellules cancéreuses dans les tissus sont agressives. Inversement, lorsque le produit de l'expression du gène LIV21F ou l'expression d'un peptide comme LIV21F est localisé préférentiellement dans le noyau cellulaire, ceci est un indicateur pronostic que les cellules du tissu sont différentiées et quiescentes et donc non invasives. Cette observation associée à l'étude d'expression, de phosphorylation et de localisation des autres facteurs du complexe LIV21 et de ces partenaires d'interaction L'efficacité d'un traitement du cancer peut également être suivie par la traçabilité de ces nouvelles séquences et de ces protéines LIV21F et LIV21K, de son complexe LIV21, de ses dérivés et des ratios avec les protéines associées. Mais aussi par diagmicroarray et sensorchip contenant entre autre cette protéine et son complexe Liv21 associé ( Figures 12 à 14 ) he described in the patent (PCT / FR2006 / 000510). The Liv21 complex is also defined by its overall mass spectrometry profile (FIG. 5) and the number and the molecular weight of the protein extract bands obtained on the acrylamide gels of FIGS. and IB a function of the temperature to which the sample is subjected and the migration conditions described. Indeed, when, for example, the LIV21F peptide is located in the cytoplasm and is revealed directly by in situ hybridization, for example, or by biochip analysis, its highest expression in the cytoplasm, the cancer cells in the tissues are aggressive. Conversely, when the product of the expression of the LIV21F gene or the expression of a peptide such as LIV21F is preferentially localized in the cell nucleus, this is a prognostic indicator that the cells of the tissue are differentiated and quiescent and therefore non-invasive. This observation associated with the study of expression, phosphorylation and localization of the other factors of the LIV21 complex and of these interaction partners The efficacy of a cancer treatment can also be followed by the traceability of these new sequences and of these LIV21F and LIV21K proteins, its LIV21 complex, its derivatives and ratios with associated proteins. But also by diagmicroarray and sensorchip containing, among other things, this protein and its associated Liv21 complex (FIGS. 12 to 14)
Par ailleurs, la détection de la protéine kinase C epsilon (PKCe) est également intéressante puisqu'il a été déterminé que PKCs phosphoryle la protéine LIV21 pour la maintenir dans le cytoplasme. Ainsi, une augmentation significative de PKCe est indicative de la présence de cellules cancéreuses. Par ailleurs, le rapport LIV21/ PKCe augmente dans la fraction cytoplasmique de cellules cancéreuses. Il en est de même de la détection de HDAC1 qui a été montré comme LIV21 comme impliqué dans les complexes PML/SUMO Rb/HDAC-1 De façon plus générale la famille des HDACs joue un rôle clé dans la régulation de l'expression des gènes, quand elles sont surexprimées elles entraînent le silencing des gènes suppresseurs de tumeurs d'où l'intérêt d'utiliser des inhibiteurs HDAC en thérapie associés à d'autres inhibiteurs régulant la cascade métabolique impliquant le complexe protéique qui contient LPV21. En outre, la détection des protéines E2F1, E2F2, E2F3 et/ou E2F4 présente un intérêt. En effet* La protéine LIV21 forme un complexe avec E2F4 qui est capable d'inhiber l'expression du gène E2F1 dans le noyau, l'expression du gène E2F1 étant un signe de prolifération cellulaire. Ainsi, une diminution de l'association de LIV21 avec la protéine E2F4 est indicative de la présence de cellules cancéreuses. De même, la présence de la protéine E2F1 dans le noyau est indicative de la présence de cellules cancéreuses. Moreover, the detection of the protein kinase C epsilon (PKCe) is also interesting since it has been determined that PKCs phosphorylates the LIV21 protein to maintain it in the cytoplasm. Thus, a significant increase in PKCe is indicative of the presence of cancer cells. In addition, the LIV21 / PKCe ratio increases in the cytoplasmic fraction of cancer cells. The same is true of the detection of HDAC1 which has been shown to be LIV21 as involved in PML / SUMO Rb / HDAC-1 complexes. More generally, the HDAC family plays a key role in the regulation of gene expression. when they are overexpressed, they result in the silencing of tumor suppressor genes, hence the interest of using HDAC inhibitors in therapy associated with other inhibitors regulating the metabolic cascade involving the protein complex that contains LPV21. In addition, the detection of E2F1, E2F2, E2F3 and / or E2F4 proteins is of interest. Indeed, the LIV21 protein forms a complex with E2F4 which is capable of inhibiting the expression of the E2F1 gene in the nucleus, the expression of the E2F1 gene being a sign of cell proliferation. Thus, a decrease in the association of LIV21 with the E2F4 protein is indicative of the presence of cancer cells. Similarly, the presence of the E2F1 protein in the nucleus is indicative of the presence of cancer cells.
En conséquence, la présente invention concerne une méthode pour la détection de cellules cancéreuses dans un échantillon biologique de tissu (par exemple, sein, ovaire, endomètre, vessie, mélanome, prostate, glioblastome etc....) de patients, cette méthode comprenant la détection des produits de l'expression des gènes du complexe LIV21 dans le noyau comparativement à ces mêmes produits dans le cytoplasme et les membranes des cellules dans l'échantillon biologique de tissu dudit patient, cette méthode comprenant la détection du produit de l'expression du gène LIV21F dans le noyau et/ou le cytoplasme des cellules dans l'échantillon biologique de tissu dudit patient, une localisation dudit produit de l'expression du gène LIV21F dans le cytoplasme étant indicative de la présence de cellules cancéreuses et une localisation dudit produit de l'expression du gène LIV21F dans le noyau étant indicative de la présence de cellules non-cancéreuses. De préférence, une localisation dudit produit de l'expression du gène LIV21F dans le cytoplasme est indicative de la présence de cellules cancéreuses invasives et/ou métastatiques, les localisations des différents produits d'expressions des gènes du complexe LIV21 et de ses partenaires associés décrites dans les exemples de biopuces indiquent ou non la présence de cellules cancéreuses. Facultativement, la méthode selon la présente invention comprend en outre la détection du produit de l'expression d'au moins un gène sélectionné parmi le groupe consistant en le gène de la protéine kinase C epsilon (PKCs), le gène E2F1 et le gène E2F4. La méthode peut notamment comprendre la détection du produit de l'expression de deux de ces gènes ou des trois gènes. Par ailleurs, au moins un des rapports LIV21 / PKCe, LIV21 / E2F4 et LIV21 / E2F1 peut être déterminé dans la présente méthode. Ce rapport peut être déterminé dans le cytoplasme et/ou dans le noyau séparément de préférence. De préférence, ces rapports sont déterminés dans le noyau. De préférence, ces rapports sont comparés à ceux obtenus dans une cellule saine. Le niveau d'expression de chaque enzyme ou polypeptide du complexe SUMO/Rb/HDAC ou pour certains types cellulaires du complexe PML/ SUMO/Rb/HDAC est un indicateur supplémentaire de l'état de prolifération de la cellule. Accordingly, the present invention relates to a method for the detection of cancer cells in a biological sample of tissue (for example, breast, ovary, endometrium, bladder, melanoma, prostate, glioblastoma, etc.) of patients, this method comprising the detection of the expression products of the LIV21 complex genes in the nucleus compared with these same products in the cytoplasm and cell membranes in the biological tissue sample of said patient, this method comprising the detection of the product of the expression of the LIV21F gene in the nucleus and / or the cytoplasm of the cells in the tissue biological sample of said patient, a location of said LIV21F gene expression product in the cytoplasm being indicative of the presence of cancer cells and a location of said product the expression of the LIV21F gene in the nucleus being indicative of the presence of non-cancerous cells. Preferably, a localization of said product of the expression of the LIV21F gene in the cytoplasm is indicative of the presence of invasive and / or metastatic cancer cells, the locations of the different expression products of the genes of the LIV21 complex and its associated partners described. in the examples of biochips indicate or not the presence of cancer cells. Optionally, the method according to the present invention further comprises the detection of the product of the expression of at least one gene selected from the group consisting of the protein kinase C epsilon (PKCs) gene, the E2F1 gene and the E2F4 gene. . The method may include the detection of the product of the expression of two of these genes or three genes. Furthermore, at least one of the LIV21 / PKCe, LIV21 / E2F4 and LIV21 / E2F1 ratios can be determined in the present method. This ratio can be determined in the cytoplasm and / or in the nucleus separately preferably. Preferably, these ratios are determined in the nucleus. Preferably, these ratios are compared to those obtained in a healthy cell. The level of expression of each enzyme or polypeptide of the SUMO / Rb / HDAC complex or for certain cell types of the PML / SUMO / Rb / HDAC complex is an additional indicator of the proliferation state of the cell.
Ces rapports d'expression ou de silencing peuvent être détectés via le niveau d'expression ou d'inhibition des protéines elles même dans des microarrays (biopuces) fabriqués selon les méthodes classiques décrites (Lubman David M,QIAO TIECHENG Alex,Mathew ABY J etc..) ou de nouveaux outils d'automatisation d'hybridation comme de lecture US2004152212 et Yu Xinglong US 2005019828 et de nouveaux supports accrochant les polypeptides ( brevets US 2008 213130 et US 2005/0157445 ou US 2006 170925 ou WO 2005 016515 , Klages Claus Peter et exemple figure 20). Avant de redécrire le principe de ces biopuces qui sont bien connues de l'homme de métier, on redonnera les définitions suivantes : L'échantillon biologique peut être notamment un échantillon de sang, de sérum, de salive, tissu, de tumeur, de moelle osseuse, de cellules circulantes du patient. On dispose de cet échantillon biologique par tout type de prélèvement connu de l'homme du métier. Au sens de la présente invention, on entend par matériel biologique, tout matériel permettant de détecter l'expression d'un gène cible. Le matériel biologique peut comprendre notamment des protéines, ou des acides nucléiques tels que notamment les acides desoxyribonucléiques (ADN) ou les acides ribonucléiques (ARN). L'acide nucléique peut être notamment un ARN (acide ribonucléique). Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le matériel biologique comprend des acides nucléiques, préférentiellement, des ARN, et encore plus préférentiellement des ARN totaux. Les ARN totaux comprennent les ARN de transfert, les ARN messagers (ARNm), tel que les ARNm transcrits du gène cible, mais également transcrits de tout autre gène et les ARN ribosomaux. Ce matériel biologique comprend du matériel spécifique d'un gène cible, tel que notamment les ARNm transcrits du gène cible ou les protéines issues de ces ARNm mais peut comprendre également du matériel non spécifique d'un gène cible, tel que notamment les ARNm transcrits d'un gène autre que le gène cible, les ARNt, les ARN r issus d'autres gènes que le gène cible et de préférence les extraits à étudier seront analysés quand il s'agit de cultures ceUulaires directement sur cultures f aîches avec ou sans traitement préalable aynt subies un prtocole d'extraction séparant les compartiments cellulaires. Ce type de kit connu de l'homme de métier permet par un jeu de tampon subtils d'extraire uniquement les membranes ou seulement ce qui est contenu dans le cytoplasme ou le noyau ou le cytosquelette et cela de açon différentielle. On peut utiliser le k Proteo extract (ref 539790) de calbiochem par exemple. L'autre aspect de la présente invention est l'utilisation des gènes et des protéines citées ci dessus comme marqueurs de l'invasivité et de l'agressivité métastatique des cellules cancéreuses de cancers en neurologie^de cancers prostate, colon, de vessie, vaire, endomètre, col et cancers, ou en ORL «En effet des tests pfaarmaco -diagnostics successifs dans le suivi d'un traitement permettront d'observer par comparaison au fil du temps les variations des taux d'expression des gènes ou de leur silencing et ainsi de mieux évaluer l'efficacité des traitements, de réajuster ces traitements dans le cadre de multithérapie adaptée afin que l'équilibre physiologique des différents produits des gènes impliqués dans ces complexes métaboliques soient maintenus. These expression or silencing ratios can be detected via the level of expression or inhibition of the proteins themselves in microarrays (biochips) made according to the conventional methods described (Lubman David M, Qiao Tiecheng Alex, Mathew ABY J etc. ..) or new hybridization automation tools such as US2004152212 and Yu Xinglong US 2005019828 and novel substrates for staining polypeptides (US 2008 213130 and US 2005/0157445 or US 2006 170925 or WO 2005 016515, Klages Claus Peter and example figure 20). Before redescribing the principle of these biochips which are well known to those skilled in the art, the following definitions will be given again: The biological sample can be in particular a sample of blood, serum, saliva, tissue, tumor, marrow bone, circulating cells of the patient. This biological sample is available by any type of sampling known to those skilled in the art. For the purposes of the present invention, the term "biological material" means any material making it possible to detect the expression of a target gene. The biological material may comprise, in particular, proteins, or nucleic acids such as in particular deoxyribonucleic acids (DNA) or ribonucleic acids (RNA). The nucleic acid may in particular be an RNA (ribonucleic acid). According to a preferred embodiment of the invention, the biological material comprises nucleic acids, preferentially RNAs, and even more preferably total RNAs. Total RNAs include transfer RNAs, messenger RNAs (mRNAs), such as mRNAs transcribed from the target gene, but also transcribed from any other gene and ribosomal RNAs. This biological material comprises material specific for a target gene, such as, in particular, the transcribed mRNAs of the target gene or the proteins derived from these mRNAs, but may also comprise non-specific material of a target gene, such as in particular the mRNAs. transcribed from a gene other than the target gene, the tRNAs, the R RNAs from genes other than the target gene and preferably the extracts to be studied will be analyzed when it comes to ceUular cultures directly on fetal cultures with or without prior treatment, they have undergone an extraction protocol separating the cell compartments. This type of kit known to those skilled in the art allows by a subtle buffer set to extract only the membranes or only what is contained in the cytoplasm or the nucleus or the cytoskeleton and that of differential. We can use the k Proteo extract (ref 539790) of calbiochem for example. The other aspect of the present invention is the use of the above-mentioned genes and proteins as markers of the invasiveness and metastatic aggressiveness of cancer cancer cells in neurology, prostate cancer, colon cancer, bladder cancer and prostate cancer. , endometrium, cervix and cancers, or in ENT «Indeed successive pfaarmaco -diagnostics tests in the follow-up of a treatment will make it possible to observe by comparison over time the variations of the levels of gene expression or of their silencing and and better evaluate the effectiveness of treatments, readjust these treatments in the context of adapted combination therapy so that the physiological balance of different products of the genes involved in these metabolic complexes are maintained.
La plasticité de ces équilibres justifie qu'on utilise des biopuces diagnostiques et pour le suivi thérapeutique avec les gènes les plus pertinents des complexes métaboliques impliqués dans la physiologie de la prolifération anarchique dans le cas du cancer du sein qui est très hétérogène. Donc chaque individu ou chaque sous groupe phénotypique d'individus va montrer un profil de sous expressions et de sur expressions des gènes des complexes métaboliques impliqués qui lui est spécifique.  The plasticity of these equilibria justifies the use of diagnostic biochips and for therapeutic monitoring with the most relevant genes of the metabolic complexes involved in the physiology of anarchic proliferation in the case of breast cancer, which is very heterogeneous. So each individual or each phenotypic subgroup of individuals will show a profile of subexpressions and expressions of the genes involved in the metabolic complexes involved.
Dans un mode de réalisation, le produit d'expression des gènes est détecté au niveau de l'ARNm. L'ARNm peut être détecté par une analyse RT-PCR (cf exemples ci-joint). Il peut également être détecté par une analyse Northern blot ou par SPR si les ARNm et ADN sont fonctionnalisés à la surface de particules electrodéposées sur un support biopuce, (techniques décrites entre autre dans les brevets US 2008 213130 et US 2005/0157445 ou US 2006 170925 ou WO 2005 016515). La technique MICAM qui utilise l'effet piezo électrique dans ses biopuces peut être aussi utilisée pour l'invention précitée de biopuce pharmaco diagnostiques dédiées aux neuroblastomes et autres cancers cérébraux, de biopuce diagnostiques dédiées aux cancers épidermoïdes et plus spécifiquement dédiés les cancers du sein, ovarien et de prostate. ■ In one embodiment, the gene expression product is detected at the level of the mRNA. The mRNA can be detected by RT-PCR analysis (see examples attached). It can also be detected by Northern blot analysis or by SPR if the mRNAs and DNAs are functionalized on the surface of particles electrodeposited on a biochip support (techniques described inter alia in US 2008 213130 and US 2005/0157445 or US 2006 170925 or WO 2005 016515). The MICAM technique uses the piezoelectric effect in its biochips can also be used for the aforementioned invention of diagnostic biochip dedicated to neuroblastoma and other brain cancers, diagnostic biochip dedicated to squamous cell cancers and more specifically dedicated breast, ovarian and prostate cancers . ■
5 Dans un mode de réalisation alternatif, le produit d'expression des gènes est détecté au niveau de la protéine ou des peptides caractérisant le complexe Liv21 et ses partenairesd'interaction. De préférence, la protéine et / ou le complexe protéique LIV21 associé est détectée à l'aide d'un anticorps spécifique. Par exemple, la protéine peut être détectée par une analyse Western blot et par SPR, par un système de biopuce utilisant 0 une onde de propagation transversale (onde évanescente) de surface plasmon résonance (SPR). L'interaction peut se faire avec une surface électronique, la surface semi conductrice crée un exiton par luminescence ou par fluorescence. Dans un mode de réalisation préféré, elle est détectée par immuno histochimie, immuno cytochimie, micro fluidique, radiographie ou par marquage à la peroxydase ou par tout autre moyen S d'imagerie optique, sonique ou de spectroscopie. In an alternative embodiment, the gene expression product is detected at the level of the protein or peptides characterizing the Liv21 complex and its interacting partners. Preferably, the protein and / or the associated LIV21 protein complex is detected with the aid of a specific antibody. For example, the protein can be detected by Western blot analysis and by SPR, by a biochip system using a transverse propagation wave (evanescent wave) of surface plasmon resonance (SPR). The interaction can be done with an electronic surface, the semiconductor surface creates an exiton by luminescence or fluorescence. In a preferred embodiment, it is detected by immunohistochemistry, immunocytochemistry, microfluidics, radiography or by peroxidase labeling or by any other means of optical, sonic or spectroscopic imaging.
Dans un mode de réalisation particulier de la méthode comprenant la détection du produit d'expression du gène PKCe, une augmentation significative de PKCe est indicative de la présence de cellules cancéreuses. Par ailleurs, la méthode peut0 également comprendre la détermination du rapport LIV21/ PKCe dans le noyau et ou, les membranes et le cytoplasme. Ce rapport peut être comparé à celui observé dans une cellule saine. Une augmentation du rapport LIV21/ PKCe dans la fraction cytoplasmique est indicative de cellules cancéreuses. 5 Dans un autre mode de réalisation particulier de la méthode comprenant la détection du produit d'expression du gène E2F4, la méthode comprend la détection de l'association de LIV21 avec la protéine E2F4, et une diminution de cette association dans le noyau cellulaire étant indicative de la présence de cellules cancéreuses. Par ailleurs, la méthode peut également comprendre la détermination du rapport LIV21/ E2F4 dans le noyau et/ou le cytoplasme. Ce rapport peut être comparé à celui observé dans une cellule saine. In a particular embodiment of the method comprising the detection of the expression product of the PKCe gene, a significant increase in PKCe is indicative of the presence of cancer cells. In addition, the method may also include determining the LIV21 / PKCe ratio in the nucleus and / or membranes and cytoplasm. This ratio can be compared to that observed in a healthy cell. An increase in the LIV21 / PKCe ratio in the cytoplasmic fraction is indicative of cancer cells. In another particular embodiment of the method comprising detecting the expression product of the E2F4 gene, the method comprises detecting the association of LIV21 with the E2F4 protein, and a decrease in this association in the cell nucleus being indicative of the presence of cancer cells. In addition, the method may also include the determination of the ratio LIV21 / E2F4 in the nucleus and / or cytoplasm. This ratio can be compared to that observed in a healthy cell.
Dans un mode de réalisation supplémentaire de la méthode comprenant la détection du produit d'expression du gène E2F1, la présence de la protéine E2F1 dans le noyau est indicative de la présence de cellules cancéreuses. Par ailleurs, la méthode peut également comprendre la détermination du rapport LIV21/ E2F1 dans le noyau et/ou le cytoplasme. Ce rapport peut être comparé à celui observé dans une cellule saine. In a further embodiment of the method comprising detecting the expression product of the E2F1 gene, the presence of the E2F1 protein in the nucleus is indicative of the presence of cancer cells. In addition, the method may also include determining the LIV21 / E2F1 ratio in the nucleus and / or the cytoplasm. This ratio can be compared to that observed in a healthy cell.
Dans un mode de réalisation particulier, la méthode comprend la détection d'un si RNA marqué afin de cibler la séquence spécifique qui le caractérise et ainsi signaler le lieu de l'expression de l'ARN messager du gène d'intérêt. Ainsi le si RNA spécifique peut être utilisé comme marqueur diagnostic comme le serait un anticorps et permettre de localiser dans un cas particulier comme sur des extemporanés ou tout type d'échantillon prélevé sur un patient par exemple échantillon de tissu cancéreux, la fluorescence pour tout autre marquage utilisé sur le si RNA et retrouvé dans un compartiment cellulaire sur l'échantillon, un si RNA du gène E2F1 et E24 et PKC epsilon permettrait un diagnostic complémentaire. In a particular embodiment, the method comprises detecting a labeled RNA so as to target the specific sequence that characterizes it and thus signal the place of expression of the messenger RNA of the gene of interest. Thus, if the specific RNA can be used as a diagnostic marker as would be an antibody and allow to locate in a particular case as extemporaneous or any type of sample taken from a patient for example sample of cancerous tissue, fluorescence for any other labeling used on the si RNA and found in a cell compartment on the sample, a si RNA gene E2F1 and E24 and PKC epsilon would allow a complementary diagnosis.
La méthode selon la présente invention permet notamment la détection de cancer métastasé, le suivi thérapeutique et/ou les récidives de traitement. The method according to the present invention allows in particular the detection of metastasized cancer, therapeutic monitoring and / or treatment recurrences.
Un deuxième aspect de l'invention concerne la protéine LIV21 humaine ainsi que les fragments de celle-ci. Plus particulièrement, la présente invention concerne une protéine LIV21 humaine isolée, purifiée ou recombinante comprenant une séquence peptidique sélectionnée parmi SEQ ID Nos 1 à 5 ou de façon plus générale parmi les séquences peptidiques le caractérisant obtenues par MALDI (Figure 3,4 et 5) et NanoLC-ESI-MS. Dans un mode de réalisation préféré, le polypeptide comprend les trois séquences peptidiques SEQ ID Nos 1 et 2 et 3. De préférence, la protéine LIV21F et certaines protéines du complexe LIV21 comprennent un motif leucine zipper, un domaine basique caractéristique des domaines de liaison à l'ADN (figure2), et une séquence de nucléarisation.). Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne des polypeptides dont la séquence consiste en une séquence peptidique caractérisée par les spectrogrammes des figures 3,4,5 des bandes de gels 1,2 et 3, sélectionnée parmi SEQ ID Nos 1 et 2 et 3 et 4 et 5 et la vingtaine de séquences supplémentaires non ordonnées (cf. séquences listées en annexe), les autres séquences de la protéine étant à vérifier par rapport à leurs homologies avec des contaminants et à ordonner lors des spectrométries de masse MSMS sur les fragments unmatched repérés dans les analyses MALDI TOF (cf. figures 3,4,5), ces fragments unmatched correspondant à des masses M (H+) non étiquetées caractérisent en partie la protéine LIV21 et certains éléments de son complexe protéique. A second aspect of the invention relates to the human LIV21 protein as well as fragments thereof. More particularly, the present invention relates to an isolated, purified or recombinant human LIV21 protein comprising a peptide sequence selected from SEQ ID Nos. 1 to 5 or, more generally, from the peptide sequences characterizing it obtained by MALDI (FIGS. 3, 4 and 5). and NanoLC-ESI-MS. In a preferred embodiment, the polypeptide comprises the three peptide sequences SEQ ID Nos. 1 and 2 and 3. Preferably, the LIV21F protein and certain proteins of the LIV21 complex comprise a leucine zipper motif, a basic domain characteristic of the DNA (Figure 2), and a sequence of nuclearization.). In a particular embodiment, the present invention relates to polypeptides whose sequence consists of a peptide sequence characterized by the spectrograms of FIGS. 3,4,5 of gel bands 1,2 and 3, selected from SEQ ID Nos. 1 and 2. and 3 and 4 and 5 and the twenty or so additional unordered sequences (see sequences listed in the appendix), the other sequences of the protein being to be checked with respect to their homologies with contaminants and to be ordered during MSMS mass spectrometry on the unmatched fragments identified in MALDI TOF analyzes (see FIGS. 3,4,5), these unmatched fragments corresponding to unlabeled M (H +) masses characterize in part the LIV21 protein and certain elements of its protein complex.
Un troisième aspect de l'invention concerne un anticorps qui se lie spécifiquement à un polypeptide selon la présente invention. Plus particulièrement, l'anticorps peut se lier spécifiquement à un polypeptide comprenant une séquence peptidique sélectionnée parmi SEQ ID Nos 1-120 et de préférence parmi SEQ ID N° 1 et 2 ou 3 et/ou 5 ou 51 ou une séquence présentant au moins 80% d'identité avec celles ci. La présente invention concerne notamment un sérum anti-LIV21 fabriqué en immunisant un animal ou un humain avec un polypeptide selon la présente invention, notamment un polypeptide comprenant une séquence peptidique sélectionnée parmi SEQ ID Nos 1- 120, de préférence parmi les séquences là 5 et 51 ou une séquence présentant 70,80 ou 90% d'identité avec celles-ci. A third aspect of the invention relates to an antibody that specifically binds to a polypeptide according to the present invention. More particularly, the antibody may specifically bind to a polypeptide comprising a peptide sequence selected from SEQ ID Nos 1-120 and preferably from SEQ ID No. 1 and 2 or 3 and / or 5 or 51 or a sequence exhibiting at least 80% identity with these. The present invention relates in particular to an anti-LIV21 serum manufactured by immunizing an animal or a human with a polypeptide according to the present invention, in particular a polypeptide comprising a peptide sequence selected from SEQ ID Nos. 1-120, preferably from the sequences herein and Or a sequence having 70.80 or 90% identity therewith.
Un quatrième aspect de l'invention concerne un kit permettant la détection de cellules cancéreuses dans un échantillon biologique d'un patient, ce kit comprenant un ou des éléments sélectionné(s) parmi le groupe consistant en un anticorps qui se lie spécifiquement à LIV21F humaine selon la présente invention et un sérum anti-LIV21F selon la présente invention, une sonde oligonucléotidique spécifique de i'ARNm de LIV21F ( sonde d'hybridation) et une paire d'amorces spécifique de l'ARNm de LIV21F. Dans un mode particulier de l'invention, le kit comprend en outre des moyens de détection du produit de l'expression d'un gène ou une sonde oligonucléotidique spécifique de P ARNm des facteurs sélectionné parmi le groupe consistant en le gène de la protéine kinase C epsilon (PKCe), le gène E2F1 et le gène E2F4. Mais aussi les anticorps sous forme de microarray d'anticorps de RBP2, SUMO,HDAC, TNFalpha , crb2, cycE/cdk2,cdkl, ,CREB1 et p300, Rb, pl07, pl30, NFkB ,cdc2A, mdm2, p21, p53, p65 et microarray avec des peptides caractéristiques connus de l'homme de métier des protéines citées ci-dessus, leurs antigènes étant référencés. C'est la combinaison de ces différents peptides correspondant aux interactions spécifiques des complexes protéiques qui interviennent dans la dysrégulation du métabolisme qui engendre la prolifération anarchique spécifique du cancer ou la neurodégénerescence. L'invention concerne l'utilisation d'un anticorps spécifique de LIV21 humain pour le diagnostic du cancer et les anticorps de son complexe protéique mais aussi des anticorps spécifiques de RBP2, SUMO.HDAC, TNFalpha , crb2, cycE/cdk2,cdkl, ,CREB1 et p300, Rb, pl07, pl30, NFkB ,cdc2A, mdm2, p21, p53, p65, p73. De même, l'invention concerne l'utilisation d'une paire d'amorces ou d'une sonde spécifiques de LIV21 pour le diagnostic du cancer. De préférence, le diagnostic est effectué ex vivo sur des ? échantillons d'un patient, (ponction du liquide céphalorachidien, prise de sang, biopsie, broyats cellulaires, aspirations bronchiques, puces à ADN, à Protéines, à anticorps, support hydrophobes, plasmioniques (SPR) ou à ions métalliques etc....) A fourth aspect of the invention relates to a kit for detecting cancer cells in a biological sample of a patient, the kit comprising one or more members selected from the group consisting of an antibody that specifically binds to human LIV21F. according to the present invention and an anti-LIV21F serum according to the present invention, an oligonucleotide probe specific for LIV21F mRNA (hybridization probe) and a primer pair specific for LIV21F mRNA. In a particular embodiment of the invention, the kit further comprises means for detecting the product of the expression of a gene or an oligonucleotide probe specific for P mRNA of factors selected from the group consisting of the gene of epsilon protein kinase C (PKCe), the E2F1 gene and the E2F4 gene. But also antibodies in the form of antibody microarray of RBP2, SUMO, HDAC, TNFalpha, crb2, cycE / cdk2, cdk1, CREB1 and p300, Rb, p107, p130, NFkB, cdc2A, mdm2, p21, p53, p65 and microarray with characteristic peptides known to those skilled in the art of the proteins mentioned above, their antigens being referenced. It is the combination of these different peptides corresponding to the specific interactions of the protein complexes which intervene in the dysregulation of the metabolism which generates the anarchic specific proliferation of the cancer or the neurodegeneration. The invention relates to the use of an antibody specific for human LIV21 for the diagnosis of cancer and the antibodies of its protein complex, but also antibodies specific for RBP2, SUMO.HDAC, TNFalpha, crb2, cycE / cdk2, cdkl, CREB1 and p300, Rb, p107, p130, NFkB, cdc2A, mdm2, p21, p53, p65, p73. Similarly, the invention relates to the use of a primer or probe pair specific to LIV21 for the diagnosis of cancer. Preferably, the diagnosis is made ex vivo on? samples of a patient, (cerebrospinal fluid puncture, blood test, biopsy, cell matrix, bronchial aspirations, DNA chips, Proteins, antibodies, hydrophobic support, plasmionic (SPR) or metal ions etc .... )
, - Méthode selon la revendication 15, caractérisée en ce qu'en outre, elle met en oeuvre au moins l'une quelconque des sondes spécifiques des séquences dudit complexe Liv21 humain et de ses partenaires associés  - Method according to claim 15, characterized in that in addition, it implements at least one of the probes specific sequences of said human Liv21 complex and its associated partners
Méthode est caractérisée en ce que ladite biopuce est: Method is characterized in that said biochip is:
une biopuce à protéine, ou  a protein biochip, or
une biopuce à anticorps, ou  an antibody biochip, or
une biopuce à acide nucléotidiques, ou  a nucleotide acid biochip, or
une biopuce à ARNm, ou  an mRNA biochip, or
une biopuce à siRNA. Méthode est caractérisée en ce que ladite étape de détection met en oeuvre tout moyen d'imagerie optique, ou tout moyen sonique ou tout moyen de spectroscopie. a siRNA biochip. The method is characterized in that said detecting step uses any optical imaging means, or any sonic means or any means of spectroscopy.
Méthode est caractérisée en ce que ladite biopuce à protéine, ou ladite biopuce à anticorps, est constituée d'une biopuce de micro fluidique et pour laquelle ladite étape de détection consiste en une détection par SPR. The method is characterized in that said protein biochip, or said antibody biochip, consists of a microfluidic biochip and for which said detection step consists of detection by SPR.
Méthode est caractérisée en ce qu'elle comprend une étape d'amplification / rétro- transcription par RT-PCR d'au moins une séquence nucléotidique dudit complexe Liv21 humain selon la revendication 1 ou 2 ou dudit complexe Liv21 et de ses partenaires associés' Method is characterized in that it comprises a step of amplification / retro-transcription by RT-PCR of at least one nucleotide sequence of said human Liv21 complex according to claim 1 or 2 or said Liv21 complex and its associated partners'
Méthode est caractérisée en ce qu'elle comprend un test pharmaco-diagnostique pour le diagnostic du cancer ou le suivi de l'évolution d'une prolifération cellulaire, ledit cancer étant préférentiellement choisit dans le groupe constitué par les neuroblastomes, les glioblastomes et autres cancers touchant les tissus du système nerveux. Method is characterized in that it comprises a pharmaco-diagnostic test for the diagnosis of cancer or the monitoring of the evolution of a cellular proliferation, said cancer being preferentially chosen from the group consisting of neuroblastomas, glioblastomas and other cancers affecting the tissues of the nervous system.
DESCRIPTION DES FIGURES DESCRIPTION OF THE FIGURES
La Figure 1 A: gel monodimensionnel (gradient acrylamide 12%) révélant après trois heures trente de migration 11 bandes avec certains triplets et doublés de bandes et un gel bidimensionnel SDS Page d'extraits cellulaires totaux avec des spots entre 15 et 20 KD et à 29 - 32kD et 35 KD environ à PH basique et des spots à 190 - 180 et à 1 OOkD à PH acide. Des spots entre 49 et 51 KD et à 64 KD. En monodimensionnel : Des bandes à 180 kD environ (T0FC), 100 KD, 64 kD, SI à 49 kD, 49 kD, 35 kD, 29 kD, 15 à l7 kD.  Figure 1A: one-dimensional gel (gradient acrylamide 12%) revealing after three hours thirty of migration 11 bands with some triplets and doubled bands and a two-dimensional gel SDS Page of total cell extracts with spots between 15 and 20 KD and at 29 - 32kD and about 35 KD at basic pH and spots at 190 - 180 and 1 OOkD at acid PH. Spots between 49 and 51 KD and 64 KD. Monodimensional: About 180 kD (T0FC), 100 KD, 64 kD, SI at 49 kD, 49 kD, 35 kD, 29 kD, 15 to 17 kD bands.
Figure 1B : schéma des interactions des biomarqueurs du complexe LIV21 et des pathways métaboliques environnants.  Figure 1B: Biomarker interactions pattern of the LIV21 complex and surrounding metabolic pathways.
Figure 2 : schéma des interactions protéiques nucléaires avec le domain DNA binding et conséquences sur l'étude de la thérapeutique ciblant le noyau et le cytoplasme cellulaire. Figure 3A: liste des pics monoisotopiques de la bande 1 à 50 kD et de la bande 2 a entre 49 et 50 D Figure 2: Scheme of nuclear protein interactions with the domain DNA binding and consequences on the study of the therapy targeting the nucleus and the cell cytoplasm. Figure 3A: List of monoisotopic peaks of band 1 at 50 kD and band 2 at 49-50 D
Figure 3B :est le profil des protéines de LIV21 par Spectrométrie de masse (Maldi) M (H+) pour la bande de gel monodimensionnel correspondant à la bande 2 migrant à 49 - 50kD. les peptides issus de la digestion sont solubilisés dans un solvant : Acetonitrile/eau (l/l)contenant 0,1% de TFA (acide trifluoro acétique), une solution saturée de la matrice acide alpha cyano-4-hydroxycinnamique est faite dans le même solvant. On prélève un même volume des deux solutions, on mélange et on dépose 1 microlitre sur la plaque du Maldi pour analyse.  Figure 3B: is the protein profile of LIV21 by Mass Spectrometry (Maldi) M (H +) for the one-dimensional gel band corresponding to the band 2 migrating at 49 - 50kD. the peptides resulting from the digestion are solubilized in a solvent: Acetonitrile / water (1/1) containing 0.1% of TFA (trifluoroacetic acid), a saturated solution of the alpha cyano-4-hydroxycinnamic acid matrix is made in the same solvent. The same volume of the two solutions is taken, mixed and 1 microliter is deposited on the Maldi plate for analysis.
La Figure 4 est un profil du spectrogramme de la bande 6 appelée 6FC  Figure 4 is a spectrogram profile of band 6 called 6FC
L'analyse de novo MS MS Maldi TOF TOF permet de proposer les séquences : The de novo analysis MS MS Maldi TOF TOF makes it possible to propose the sequences:
RYLVTPVNA, RYVPSSNLP, RYVLSPVK, RYVPSSNPL, RYLPSANPD ' Figure 4bis : analyse MSMS du pic monoisotopic 1032.58 : YRPGTVALR, RYLVTPVNA, RYVPSSNLP, RYVLSPVK, RYVPSSNPL, RYLPSANPD Figure 4bis: MSMS analysis of monoisotopic peak 1032.58: YRPGTVALR,
RYVPSSNPL RYVPSSNPL
Le pic monoisotopique 944.6 est une séquence : FAVAFPVGR  The monoisotopic peak 944.6 is a sequence: FAVAFPVGR
Le pic monoisotopique 1603.7 : KPSHPKPSTK The monoisotopic peak 1603.7: KPSHPKPSTK
Le pic 1328.69 : AH LF T , TFKNLC The peak 1328.69: AH LF T, TFKNLC
Les pics monoisotopiques communs entre le premier spectro 2004 (230304 imagenium 03_H1 l_a_001 et le pic 6FC de 2008 sont :  The common monoisotopic peaks between the first spectro 2004 (230304 imagenium 03_H1 l_a_001 and the peak 6FC of 2008 are:
Les pics monoisotopiques suivants : 1135.563 ; 1151.545 ; 1167.604 ; 1206.589 ; The following monoisotopic peaks: 1135,563; 1151,545; 1167,604; 1206,589;
1324.634 ; 1336.658 ; 1507.735 ; 1604.710 ; 1800.940 ; 2087.034. 1324,634; 1336,658; 1507,735; 1604.710; 1800,940; 2087,034.
La variation de protocole tient uniquement à trois étapes différentes : la première est la purification de l'anticorps utilisé, la seconde est la séparation des fractions cytoplasmiques et nucléaires, la troisième est le chauffage deux minutes à 100° de l'échantillon avant migration sur gel d'acrylamide.  The protocol variation only takes three different steps: the first is the purification of the antibody used, the second is the separation of the cytoplasmic and nuclear fractions, the third is the heating for two minutes at 100 ° of the sample before migration on acrylamide gel.
Figure 5 est le troisième spectrogramme correspondant à la bande de gel d'acrylamide 12% monodimensionnel migrant a 51- 52 KD et révélée par le bleu de coumassie et l'anticorps de LrV21. La figure 5bis est la liste des pics monoisotopiques du troisième spectrogramme correspondant à la bande de gel d'acrylamide monodimensionnel migrand à 52 kD et révélée par le bleu de coumassie et l'anticorps de LIV21. Figure 5 is the third spectrogram corresponding to the 12% one-dimensional acrylamide gel band migrating at 51-52 KD and revealed by coumassie blue and LrV21 antibody. Figure 5a is the list of the monoisotopic peaks of the third spectrogram corresponding to the 52 kD migrand one-dimensional acrylamide gel band and revealed by coumassie blue and LIV21 antibody.
Les pics monoisotopiques avec une valeur M H+. Les masses sont données avec trois chiffres derrière la virgule par les plateformes protéomiques car  Monoisotopic peaks with an M H + value. The masses are given with three digits behind the comma by the proteomic platforms because
Ils estiment que c'est la limite de la précision d'acquisition des machines MALDI TOF. Les figures 3-5 décrivent les analyses en MALDI donnant un jeu de séquences polypeptidiques assignables à LIV21. et son complexe et des contaminants parfois différents suivant les observateurs des différentes plateformes de protéomiques sous traitantes. .  They believe that this is the limit of the acquisition accuracy of MALDI TOF machines. Figures 3-5 describe the MALDI analyzes giving a set of polypeptide sequences assignable to LIV21. and its complex and sometimes different contaminants according to the observers of the different platforms of proteomics subcontractors. .
Figure 6 : analyse sur les banques de données des listing de pics monoisotopiques.Exemple de Phistatine 3. Les paramètres de recherche Mascot sont : enzyme trypsine, modifications variables : carbamethylation et oxydation des methionines, sans limite de masse moléculaire, sans restriction de point rsoelectrique. Figure 7 : idem mais deuxième exemple : Type de masse : monoisotopique. Erreur de masse (MS) : suivant l'observateur 50 ppm ou lOOppm. Non coupure trypsique :1 Les masses saisies sont M (H+)/ masses réelles. Pour le spectrogramme 1 les cystéines sont bloquées par iodoacétamide. La possibilité de digestion de la trypsine bovine Proméga peut être incomplète avec oubli de coupure.  Figure 6: analysis on the databases of the listing of monoisotopic peaks. Example of Phistatin 3. The Mascot search parameters are: trypsin enzyme, variable modifications: carbamethylation and oxidation of methionines, without limit of molecular weight, without restriction of rselectric point . Figure 7: same but second example: Mass type: monoisotopic. Mass error (MS): depending on the observer 50 ppm or 100 ppm. Non-tryptic cut: 1 The masses entered are M (H +) / real masses. For spectrogram 1 the cysteines are blocked by iodoacetamide. The possibility of digestion of Proméga bovine trypsin may be incomplete with missed cut.
Séquences communes avec Gallus Gallus (gi 50732569), la Syntaxine de souris, Le variant d'histatin-3-2 (P15516-00-01-00), la ZN575-Human, la G6 P translocase, la HSP60 chaperonine, la déaminase, ferredoxin-NADP(+) réductase, la polyribonucléotidyl transférase de pseudomonas,chlathrin, la déhydrolipoamide déshydrogénase.  Common sequences with Gallus Gallus (gi 50732569), mouse Syntaxin, Histatin-3-2 variant (P15516-00-01-00), ZN575-Human, G6 P translocase, HSP60 chaperonine, deaminase , ferredoxin-NADP (+) reductase, pseudomonas polyribonucleotidyl transferase, chlathrin, dehydrolipoamide dehydrogenase.
Figure 8 : pool d'ARN Figure 8: RNA pool
Figure 9 : PCR avec les gènes de ménage et Analyse des masses moléculaires  Figure 9: PCR with Household Genes and Molecular Weight Analysis
Figure 10 : PCR avec les amorces montrant une bande à 1400pb Figure 10: PCR with primers showing a 1400bp band
Figure 11 : Gel 2 avec analyse des masses moléculaires Figure 11: Gel 2 with molecular weight analysis
Figure 12 :Gel 3 à 55° et analyse des masses moléculaires Figure 12: Gel 3 at 55 ° and molecular weight analysis
Figure 13 : Gel 4 à 45° et à 55° et analyse des masses moléculaires Figure 14 : criblage ligature bande 400pb clones Bl à B1Ô Figure 13: Gel 4 at 45 ° and 55 ° and molecular weight analysis Figure 14: Ligation Strip Screening 400pb Bl Clones at B1Ô
Figure 15 : criblage ligature bande 1400 pb clones Cl à C10  Figure 15: Ligation band ligation 1400 bp clones C1 to C10
Figure 16 : Gel 5 : ligature criblage sur les cinq nouveaux clones  Figure 16: Gel 5: screening ligation on the five new clones
Figure 17 : Gel 6 Criblage des clones rècombinants S55T et S55M et  Figure 17: Gel 6 Screening of recombinant clones S55T and S55M and
analyses des masses moléculaires.  molecular weight analyzes.
Figure 18 : exemples de comparaison de séquences nucléotidiques entre les clones séquencés.  Figure 18: Examples of comparison of nucleotide sequences between the sequenced clones.
Figure 19 : si RNA design  Figure 19: if RNA design
La Figure 20 puce à protéines avec nommés les peptides des protéines des complexes d'intérêt étudié dans l'invention.  Figure 20 Protein chip with named peptides of the proteins of the complexes of interest studied in the invention.
La Figure 21 Deux Biopuces type microfluidique de quatre puits x2 avec un contrôle et trois biomarqueurs.  Figure 21 Two microfluidic microarrays of four x2 wells with one control and three biomarkers.
On observe une surexpression de DDX1, MYCN et CRABPII alors qu'on observe en testant le deuxième sensorchip une sous expression de HUD, TP53 INP1 et une sous expression majeure de p21  Overexpression of DDX1, MYCN and CRABPII is observed while the second sensorchip is under-expressed by HUD, TP53 INP1 and a major under-expression of p21.
La Figure 22 Exemple de Biopuce de 20 spots avec 16 biomarqueurs d'intérêt (et quatre contrôles) fixés sur le sensorchip permettant de voir par SPR la surexpression et la sousexpression de certains gènes du complexe Liv21 et de ses partenaires d'interaction pour exemple.  Figure 22 Biopuce example of 20 spots with 16 biomarkers of interest (and four controls) fixed on the sensorchip to see by SPR overexpression and under-expression of certain genes of Liv21 complex and its interaction partners for example.
On observe une sous expression de DK 1, SKP2,DKK3, ID2, p21, SKP2/TP53INP1, ID2.P73 alors qu'on observe une sur expression de MYCN, ALK, NLRRl (le neuronal leucine rich repeat est transactivé), CRABPII, DDX1, LIV21K, AURORA kinase A. Les Figures 23 Biopuce à ARN permettant d'explorer les miniARN du complexe Liv21 et plus particulièrement ceux issus des gènes des polypeptides LïSfà F et LIV21K additionnés aux Mir RNA, microARN connus pour être impliqués dans la pathologie ((miR (=MIR) 34A. MIR 9. MIR 125A .125B. MIR 128 MIR 184MIR 221)). DK1, SKP2, DKK3, ID2, p21, SKP2 / TP53INP1, and ID2.P73 under expression are observed, while on expression of MYCN, ALK, NLRR1 (the leucine rich repeat neuronal is transactivated), CRABPII, is observed. DDX1, LIV21K, AURORA kinase A. Figures 23 RNA microarray for exploring the miniRNAs of the Liv21 complex and more particularly those derived from the genes of the polypeptides LïSfà F and LIV21K added to the Mir RNAs, microRNAs known to be involved in the pathology ( (miR (= MIR) 34A MIR 9. MIR 125A .125B, MIR 128 MIR 184MIR 221)).
On étudie aussi PTEN régulateur et les facteurs TR AIL We also study PTEN regulator and TR AIL factors
La Figure 24 Exemple de Biopuce à ADN issus des gènes d'intérêt précités ciblant la pathologie. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION Figure 24 Example of a DNA microarray from the aforementioned genes of interest targeting the pathology. DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
L'invention est relative à l'identification d'antigènes dans des lysats cellulaires par immunoprécipitation. L'analyse de l'interaction physique de différentes protéines associées dans le complexe Liv21 comme E2F4 et E2F1 a été étudiée par co- immunoprécipitation de complexes protéiques. Cette analyse a permis de mettre en évidence de nouveaux marqueurs présentant une utilité diagnostique et pronostique pour le cancer. A partir de l'analyse monodimensionnelle et bidimensionnelle de gel d'electrophorèse (Figure 1 et 2), les échantillons protéiques correspondant à la protéine putative et aux éléments du complexe ont été extraits des gels et digérés par de la trypsine (Proméga ) afin d'être analysés par spectrométrie de masse type MALDI (Figure 3 à 5) et ESI MS/MS. Les résultats confrontés aux banques de données de protéomiques ont permis de mettre en évidence plusieurs séquences peptidiques d'intérêts dont certaines données en exemple (Figure 6 et 7), certaines étant retrouvées chez l'humain avec des scores très significatifs ( splicing de l'histatine etc... Figure 8 et 9), ces séquences ont servies d'amorces (une fois retrotranscrites en cDNA) pour cribler une banque constituée à partir de cellules MCF7 spécifiques des cancers mammaires (Figures 10 à 17).  The invention relates to the identification of antigens in cell lysates by immunoprecipitation. The analysis of the physical interaction of different associated proteins in the Liv21 complex such as E2F4 and E2F1 was studied by co-immunoprecipitation of protein complexes. This analysis has highlighted new markers with a diagnostic and prognostic utility for cancer. From the one-dimensional and two-dimensional gel electrophoresis analysis (Figure 1 and 2), the protein samples corresponding to the putative protein and the elements of the complex were extracted from the gels and digested with trypsin (Proméga) in order to to be analyzed by MALDI mass spectrometry (Figure 3 to 5) and ESI MS / MS. The results confronted with proteomic data banks have made it possible to highlight several peptide sequences of interest, some of which are exemplary data (FIGS. 6 and 7), some of which are found in humans with very significant scores (splicing of the histatine etc ... Figure 8 and 9), these sequences served as primers (once retrotranscribed in cDNA) to screen a library made from MCF7 specific breast cancer cells (Figures 10 to 17).
Le clonage a permis de mettre en évidence une vingtaine de clones sur les 150 clones obtenus dont dix clones ont été séquencés et caractérisent le nouveau gène LIV21 LIV21F et le gène LIV21K (Figure 17 et Figure ). A partir de ces séquences, des siRNA ont été déterminer afin de permettre une régulation type silencing au sein de ce complexe métabolique d'intérêt pour développer des applications thérapeutiques (Figure 18). Chez les cellules post-mitotiques, l'apoptose pourrait correspondre à une tentative avortée de mitose. C'est dans ce contexte qu'a été développée application_de_LIV2L L'inventeur a identifié des séquences du gène LIV21. En utilisant l'anticorps LIV21 liur colonnes d'affinité il a pu extraire des peptides de la protéine LIV21, il a également utilisé une seconde approche par kit de coimmunoprécipitation (Pierce) pour avoir de plus grandes quantités de protéines (exemple 1) A partir de séquences peptidiques de la protéine LIV21 obtenues par spectrométrie de masse (exemple 2), une conception d'amorces permettant d'amplifier un fragment d'ADNc a été réalisée (exemple 3). Après culture et amplification de cellules de lignées MCF7, extraction et purification des ARN, des RT PCR et le clonage en vecteur navette ont été réalisés puis un criblage des colonies résistantes et un séquençage ont permis de révéler des séquences caractérisant le gène LIV21F et LFV21K (exemples 4 et 5). Plus de vingt clones caractéristiques sur 150 clones ont été étudiés. . L' ADNc de ces clones a été utilisé pour cribler une banque préparée à partir de Γ ARNm total de cellules MCF7. La séquence de ces nouveaux produits sont des nouveaux facteurs de transcription dont la translocation nucléaire pour certains changent leur rôle et leur fonction, celle-ci étant corrélée pour certains d'entre eux à l'établissement de la quiescence cellulaire comme par exemple LIV21F, E2F4. D'autre part, il forme des hétérodimères avec d'autres facteurs de transcription, et il se lie à P ADN. L'inventeur a alors suivi, à l'aide de transferts de Northern Blot, l'expression de ce nouveau produit au cours du développement, du stade embryonnaire. Il a été observé que la quantité de la protéine LIV21 augmente au fur et à mesure du développement, c'est à dire au fur et à mesure de l'établissement d'un état cellulaire quiescent. Par la même stratégie, il a montré que le complexe LrV21/E2F4 était inhibiteur de l'expression de E2F1. Ce complexe pourrait correspondre à un nouveau point de contrôle dans l'arrêt de prolifération cellulaire. Cloning made it possible to reveal about 20 clones out of the 150 clones obtained, of which ten clones were sequenced and characterized the new LIV21 LIV21F gene and the LIV21K gene (FIG. 17 and FIG. From these sequences, siRNAs were determined to allow a silencing-type regulation within this metabolic complex of interest to develop therapeutic applications (Figure 18). In postmitotic cells, apoptosis could be an aborted attempt at mitosis. It is in this context that LIV2L application was developed. The inventor has identified sequences of the LIV21 gene. Using the LIV21 antibody in affinity columns he was able to extract peptides from LIV21 protein, he also used a second approach by coimmunoprecipitation kit (Pierce) to have larger amounts of proteins (Example 1) from of peptide sequences from the protein LIV21 obtained by mass spectrometry (Example 2), a primer design for amplifying a cDNA fragment was performed (Example 3). After culturing and amplification of cells of MCF7 lines, extraction and purification of the RNAs, RT PCR and cloning in a shuttle vector were carried out then a screening of the resistant colonies and sequencing made it possible to reveal sequences characterizing the LIV21F and LFV21K gene ( Examples 4 and 5). More than twenty characteristic clones on 150 clones were studied. . The cDNA of these clones was used to screen a library prepared from total mRNA of MCF7 cells. The sequence of these new products are new transcription factors whose nuclear translocation for some changes their role and function, this being correlated for some of them to the establishment of quiescence cell such as LIV21F, E2F4 . On the other hand, it forms heterodimers with other transcription factors, and binds to DNA. The inventor then followed, using Northern blot, the expression of this new product during development, the embryonic stage. It has been observed that the amount of the LIV21 protein increases as the development progresses, that is, as the quiescent cell state is established. By the same strategy, he showed that the LrV21 / E2F4 complex was an inhibitor of E2F1 expression. This complex could correspond to a new checkpoint in the cell proliferation arrest.
Le complexe LrV21 et ses complexes métaboliques associés : > The LrV21 complex and its associated metabolic complexes:>
La présente invention The present invention
nucléotidiques SEQ ID nucleotides SEQ ID
d'entre elles sous forme
Figure imgf000027_0001
of them in form
Figure imgf000027_0001
et aussi les polypeptides Liv21F et LIV21K ainsi que des dérivés et des fragments et isoformes de celle-ci (SEQ ID N° à SEQ ID Ν0^/Γ). and also the Liv21F and LIV21K polypeptides as well as derivatives and fragments and isoforms thereof (SEQ ID NO: SEQ ID Ν 0 ^ / Γ).
Complexe Liv21 humain, caractérisé en ce qu'il comprend : Human Liv21 complex, characterized in that it comprises:
- les séquences nucléotidiques SEQ ID N° 171 à 175, et - une séquence siRNA dérivée de l'une des séquences d'ARN de SEQ ID N° 120 et SEQ ID N° 121, et 171 à 175. the nucleotide sequences SEQ ID Nos. 171 to 175, and a siRNA sequence derived from one of the RNA sequences of SEQ ID No. 120 and SEQ ID No. 121, and 171 to 175.
- une traction protéique comprenant au moins la séquence SEQ ID N° 1 et 181 ou une séquence présentant 90%, et préférentiellement 80%, et plus préférentiellement 70% d'identité avec ladite SEQ ID N° 1 et 181. a protein traction comprising at least the sequence SEQ ID No. 1 and 181 or a sequence having 90%, and preferably 80%, and more preferably 70% identity with said SEQ ID No. 1 and 181.
Figure imgf000028_0001
Figure imgf000028_0001
Le complexe LIV21 humain, caractérisé en ce qu'il comprend : The human LIV21 complex, characterized in that it comprises:
-les séquences nucléotidiques SEQ ID N° 171, 172, et les fractions protéiques comprenant au moins la séquence SEQ ID N° l ou 181 ou une séquence présentant 70, 80 ou 90% d'identité avec ladite SEQ ID N° 1 ou 181et la séquence SEQ ID N° 183 ou une séquence présentant 70, 80 ou 90% d'identité avec ladite SEQ ID N° 183. the nucleotide sequences SEQ ID No. 171, 172, and the protein fractions comprising at least the sequence SEQ ID No. 1 or 181 or a sequence having 70, 80 or 90% identity with said SEQ ID No. 1 or 181 and the sequence SEQ ID No. 183 or a sequence having 70, 80 or 90% identity with said SEQ ID No. 183.
Le complexe LIY21 humain, caractérisé en ce qu'il comprend également: The human LIY21 complex, characterized in that it also comprises:
-les séquences nucléotidiques SEQ Π N° 123, 124 et 127, et les fractions protéiques comprenant au moins la séquence SEQ ID N° 1 ou une séquence présentant 70, 80 ou 90% d'identité avec ladite SEQ ID N° 1 et les séquences 181 à 185 ou une séquence présentant 70, 80 ou 90% d'identité avec ladite SEQ ID N° 181 à 185. the nucleotide sequences SEQ No. 123, 124 and 127, and the protein fractions comprising at least the sequence SEQ ID No. 1 or a sequence having 70, 80 or 90% identity with said SEQ ID No. 1 and the sequences 181 to 185 or a sequence having 70, 80 or 90% identity with said SEQ ID No. 181 to 185.
Le complexe Liv21 humain est caractérisé en ce qu'il comprend en outre : The human Liv21 complex is characterized in that it further comprises:
L'une quelconque des séquences nucléotidiques ou ribonucléiques SEQ ID N° 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 126 ou 127. Any of the nucleotide or ribonucleic sequences SEQ ID NO: 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 126 or 127.
ou une séquence présentant 90%, et préférentiellement 80%, et plus préférentiellement 70% d'identité avec lesdites séquences SEQ ID N° 119 à 127, ou UUGGUAACGACCAUGCCAC, ou UUCACUUAGAAUAAUGUCC, ou UCUUUGUGAAUUUGACAAC, ou UCAAGGUCCAGGCUACAAC, ou or a sequence having 90%, and preferably 80%, and more preferably 70% identity with said sequences SEQ ID No. 119 to 127, or UUGGUAACGACCAUGCCAC, or UUCACUUAGAAUAAUGUCC, or UCUUUGUGAAUUUGACAAC, or UCAAGGUCCAGGCUACAAC, or
- l'une quelconque des séquences siRNA suivantes : any of the following siRNA sequences:
GUGGCAUGGUCGUUACCAA dTdT  GUGGCAUGGUCGUUACCAA dTdT
dTdT CACCGUACCAGCAAUGGUU dTdT CACCGUACCAGCAAUGGUU
GGACAUUAUUCUAAGUGAA dTdT  GGACAUUAUUCUAAGUGAA dTdT
dTdT CCUGUAAUAAGAUUCACUU GGAAGAAUCUCAUCUCAGAUUCAA ) dTdT CCUGUAAUAAGAUUCACUU GGAAGAAUCUCAUCUCAGAUUCAA)
UUCCUUCUUAGAGUAGAGUCUAGAG-  UUCCUUCUUAGAGUAGAGUCUAGAG-
GAGAGUCAUCUUACUCAGAUUCAA )GAGAGUCAUCUUACUCAGAUUCAA)
GCAGAUCAUGAGGUCAAGAUUCAA ) UUCUCUCAGUAGAAUGAGUCUAGAG- UUCGUCUAGUACUCCAGUUCUAGAG-GCAGAUCAUGAGGUCAAGAUUCAA) UUCUCUCAGUAGAAUGAGUCUAGAG- UUCGUCUAGUACUCCAGUUCUAGAG-
GCUGGGUGUGGUAGUGCAUUUCAA ) UUCGACCCACACCAUCACGUAAGAG-GCUGGGUGUGGUAGUGCAUUUCAA) UUCGACCCACACCAUCACGUAAGAG-
GAAGAAUCUCAUCUCAGAAUUCAA ) GAAGAAUCUCAUCUCAGAAUUCAA)
UUCUUCUUAGAGUAGAGUCUUAGAG- UUCUUCUUAGAGUAGAGUCUUAGAG-
GUCAAGAGAUCGAGACCAUUUCAA ) UUCAGUUCUCUAGCUCUGGUAAGAG-GUCAAGAGAUCGAGACCAUUUCAA) UUCAGUUCUCUAGCUCUGGUAAGAG-
GUGUGAGACUCCAUCUGAAUUCAA ) GUGUGAGACUCCAUCUGAAUUCAA)
UUCACACUCUGAGGUAGACUUAGAG- UUCACACUCUGAGGUAGACUUAGAG-
GUCAUCUUACUCAGAGCAUUUCAA ) UUCAGUAGAAUGAGUCUCGUAAGAG-GUCAUCUUACUCAGAGCAUUUCAA) UUCAGUAGAAUGAGUCUCGUAAGAG-
GAUCAUGAGGUCAAGAGAUUUCAA ) GAUCAUGAGGUCAAGAGAUUUCAA)
UUCUAGUACUCCAGUUCUCUAAGAG- UUCUAGUACUCCAGUUCUCUAAGAG-
GGAGUAUAGGAAUCUCCUAUUCAA ) UUCCUCAUAUCCUUAGAGGAUAGAG-GGAGUAUAGGAAUCUCCUAUUCAA) UUCCUCAUAUCCUUAGAGGAUAGAG-
GGCUGAGGCAGGCAGAUCAUUCAA ) GGCUGAGGCAGGCAGAUCAUUCAA)
UUCCGACUCCGUCCGUCUAGUAGAG- UUCCGACUCCGUCCGUCUAGUAGAG-
GCCUGGCGACAGUGUGAGAUUCAA ) UUCGGACCGCUGUCACACUCUAGAG-GCCUGGCGACAGUGUGAGAUUCAA) UUCGGACCGCUGUCACACUCUAGAG-
GGUAGUGCAUGCCUGUAGUUUCAA ) GGUAGUGCAUGCCUGUAGUUUCAA)
UUCCAUCACGUACGGACÂUCAÂGAG- UUCCAUCACGUACGGACÂUCAÂGAG-
GCCUGUAGUCCCAGCUACUUUCAA ) UUCGGACAUCAGGGUCGAUGAAGAG-GCCUGUAGUCCCAGCUACUUUCAA) UUCGGACAUCAGGGUCGAUGAAGAG-
GAGAUGGCGCCACUGUACUUUCAA ) GAGAUGGCGCCACUGUACUUUCAA)
UUCUCUACCGCGGUGACAUGAAGAG-  UUCUCUACCGCGGUGACAUGAAGAG-
3. Complexe Liv21 humain ,, caractérisé en ce qu'il comprend en outre au moins :
Figure imgf000029_0001
3. Human Liv21 complex, characterized in that it further comprises at least:
Figure imgf000029_0001
- l'une quelconque des séquences nucléotidiques SEQ ID N° 123, SEQ ID N° 124 et SEQ ID N0 127 à 149, ou A IT - any one of the nucleotide sequences SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO 124 and SEQ ID NO 0127 to 149, or A IT
- l'une quelconque des séquences d'acides aminés SEQ ID N° 1 à 1 h et SEQ ID N°150 à 170 et SEQ ID N°180 à 185, ou une séquence présentant 90%, et préférentiellement 80%, et plus préférentiellement 70% d'identité avec lesdites séquences SEQ ID N°180 à 185 et SEQ ID 1, 2 et 5. - ^ 2 A any one of the amino acid sequences SEQ ID No. 1 to 1 h and SEQ ID No. 150 to 170 and SEQ ID No. 180 to 185, or a sequence having 90%, and preferably 80%, and more preferably 70% identity with said sequences SEQ ID No. 180 to 185 and SEQ ID 1, 2 and 5. - ^ 2 A
Complexe Liv21 humain caractérisé en ce que ladite fraction protéique comprend en outre l'une quelconque des protéines suivantes : E2F1, E2F4, pl30, p300, pl07, Liv21F, HDAC-1, PML, SUMO et pKCepsilon. Human Liv21 complex characterized in that said protein fraction further comprises any of the following proteins: E2F1, E2F4, p130, p300, p107, Liv21F, HDAC-1, PML, SUMO and pKCepsilon.
Aurora A, Survivine, BCAS4, BCAS3, RFSH Complexe Liv21 humain caractérisé en ce qu'il interagit avec au moins un de ses partenaires associés, ledit au moins un de ses partenaires associés étant choisit dans le groupe constitué de ; Aurora A, Survivine, BCAS4, BCAS3, RFSH Human Liv21 complex characterized in that it interacts with at least one of its associated partners, said at least one of its associated partners being chosen from the group consisting of;
- l'une quelconque des protéines suivantes : RBP2, TNFalpha, crb2, cycE/cdk2, cdkl, CREB1, p300, pl07, NFkB, cdc2A, mdm2, p21, p53, p65, p73 MYC, NMYC, any of the following proteins: RBP2, TNFalpha, crb2, cycE / cdk2, cdk1, CREB1, p300, p107, NFkB, cdc2A, mdm2, p21, p53, p65, p73 MYC, NMYC,
TGFbéta, Chlatrin, Aurora, AKT, BRCA1, FOX04 ou cyclin A et Dl, CHUK, HMGA2, IKBKB TGFbeta, Chlatrin, Aurora, AKT, BRCA1, FOX04 or cyclin A and D1, CHUK, HMGA2, IKBKB
- un anticorps de l'une quelconque des protéines suivantes : RBP2, E2F4 , E2F1, SUMO, HDAC-1, crb2, Int2,cmd2, cycE/cdk2, cdkl, ,CREB1 et p300, Rb, p 107, p 130 de la familles des pockets protéines NFkB, cdc2A, mdm2, p21, p53, p65, p73, la cycline A et DI, CHUK, MYC, NMYC, TGFbéta, Chlatrin (2), Aurora, AKT, BRCA1, FOX04, HMGA2, (bc S-y. âCfrS t, „ L Jr *srùe~ - an antibody of any one of the following proteins: RBP2, E2F4, E2F1, SUMO, HDAC-1, crb2, Int2, cmd2, cycE / cdk2, cdk1,, CREB1 and p300, Rb, p 107, p 130 of the protein pocket families NFkB, cdc2A, mdm2, p21, p53, p65, p73, cyclin A and DI, CHUK, MYC, NMYC, TGFbeta, Chlatrin (2), Aurora, AKT, BRCA1, FOX04, HMGA2, (bc Sy .Chars t, "LJr * srùe ~ -
- en ce qu'il comprend un extrait de protéines et de peptides obtenus par accrochage à un anticorps polyclonal de la protéine Liv21, et in that it comprises an extract of proteins and peptides obtained by attachment to a polyclonal antibody of the Liv21 protein, and
- en ce que son profil électrophorétique sur gel d'acrylamide comprend au moins les trois bandes suivantes : la bande de 50 kD, la bande de 51 kD, et la bande de 52 kD. in that its acrylamide gel electrophoretic profile comprises at least the following three bands: the 50 kD band, the 51 kD band, and the 52 kD band.
Complexe Liv21 humain est caractérisé aussi en ce qu'après digestion à la trypsine, le profil de spectrométrie de masse MALDI comprend au moins les pics mono isotopiques suivants: Human Liv21 complex is also characterized in that after trypsin digestion, the MALDI mass spectrometry profile comprises at least the following mono isotopic peaks:
1135.563 ; 1151.545 ; 1167.604 ; 1206.589 ; 1324.634 ; 1336.658 ; 1507.735 ; 1604.710 ; 1800.940 ; 2087.034.  1135,563; 1151,545; 1167,604; 1206,589; 1324,634; 1336,658; 1507,735; 1604.710; 1800,940; 2087,034.
Méthode de détection du complexe Liv21 humain, caractérisée en ce qu'elle comprend la mise en œuvre d'au moins une sonde spécifique d'au moins une séquence dudit complexes Liv21 selon la revendication 1 ou 2. Method for detecting the human Liv21 complex, characterized in that it comprises the implementation of at least one probe specific for at least one sequence of said Liv21 complexes according to claim 1 or 2.
Méthode de détection du complexe Liv21 humain, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre la mise en œuvre d'au moins une sonde spécifique d'au moins une séquence dudit complexe Liv21 et de ses partenaires associés Method for detecting the human Liv21 complex, characterized in that it further comprises the implementation of at least one probe specific for at least one sequence Liv21 complex and its associated partners
Méthode de détection du complexe LIV21 et de ses partenaires est en ce qu'elle comprend au moins les étapes suivantes: Detection method of complex LIV21 and its partners is in that it comprises at least the following steps:
- une étape d'extraction du matériel biologique d'un échantillon biologique prélevé chez un patient,  a step of extracting the biological material from a biological sample taken from a patient,
- une étape de mise en contact dudit matériel biologique avec  a step of bringing said biological material into contact with
au moins ladite sonde spécifique de l'une quelconque des séquences dudit complexe Liv21 humain ou dudit complexe Liv21 et de ses partenaires associés, et at least said probe specific for any of the sequences of said human Liv21 complex or Liv21 complex and its associated partners, and
au moins un contrôle, et at least one check, and
- une étape de détection de l'expression des produits d'expression des gènes dudit complexe Liv21 humain ou dudit complexe Liv21 et de ses partenaires associés, lesdits produits d'expression étant constitués par des ARN messagers, ou des peptides, ou des protéines.  a step of detecting the expression of gene expression products of said human Liv21 complex or of said Liv21 complex and its associated partners, said expression products being constituted by messenger RNAs, or peptides, or proteins.
Méthode de détection est également, caractérisée Detection method is also, characterized
en ce qu'elle vise en outre à cribler un composé candidat, ledit composé candidat étant capable de moduler l'activité dudit complexe Liv21 humain, et en ce qu' elle comprend en outre : in that it further seeks to screen a candidate compound, said candidate compound being capable of modulating the activity of said human Liv21 complex, and in that it further comprises:
une étape de mise en contact dudit matériel biologique avec ledit composé candidat, et une étape de sélection dudit composé candidat. a step of contacting said biological material with said candidate compound, and a step of selecting said candidate compound.
Méthode est caractérisée Method is characterized
en ce que ledit échantillon biologique est prélevé chez un patient atteint du cancer et chez un patient sain, et in that said biological sample is taken from a patient with cancer and from a healthy patient, and
en ce que ledit matériel biologique comprend in that said biological material comprises
des extraits cellulaires nucléaires, et nuclear cell extracts, and
des extraits cellulaires cytoplasmiques, ou cytoplasmic cell extracts, or
des extraits cellulaires membranaires, et en ce qu'elle comprend en outre une étape de détermination de la sous expression et de la surexpression des produits des gènes dudit complexes Liv21 humain ou dudit complexe Liv21 humain et de ses partenaires associés desdits extraits biologiques. Méthode est caractérisée membrane cell extracts, and in that it further comprises a step of determining the under expression and overexpression of the gene products of said human Liv21 complexes or said human Liv21 complex and its associated partners of said biological extracts. Method is characterized
en ce qu'elle comprend en outre une étape de détermination des ratios desdites sous expression et surexpression desdits produits des gènes: in that it further comprises a step of determining the ratios of said under-expression and overexpression of said gene products:
des extraits cellulaires nucléaires, et nuclear cell extracts, and
des extraits cellulaires cytoplasmiques, ou cytoplasmic cell extracts, or
des extraits cellulaires membranaires, et membrane cell extracts, and
en ce qu'elle comprend en outre une étape d'analyse jumelée desdits ratios dudit matériel biologique prélevé chez un patient atteint du cancer et chez un patient sain. in that it further comprises a step of paired analysis of said ratios of said biological material taken from a patient with cancer and from a healthy patient.
Méthode est caractérisée en ce que ladite sonde spécifique comprend une séquence siRNA marquée à la rhodamine. The method is characterized in that said specific probe comprises a rhodamine-labeled siRNA sequence.
Méthode selon l'une quelconque des approches ci-dessus est, caractérisée en ce qu'elle met en œuvre une biopuce, sur laquelle est déposée au moins l'une quelconque des sondes spécifiques des séquences dudit complexe Liv21 humain A method according to any one of the above approaches is characterized in that it implements a biochip, on which at least one of the probes specific for the sequences of said human Liv21 complex is deposited.
Méthode est caractérisée en ce qu'en outre, elle met en œuvre au moins l'une quelconque des sondes spécifiques des séquences dudit complexe Liv21 humain et de ses partenaires associés The method is further characterized in that it implements at least one of the sequence-specific probes of said human Liv21 complex and its associated partners
Méthode est caractérisée en ce que ladite biopuce est: Method is characterized in that said biochip is:
une biopuce à protéine, ou a protein biochip, or
une biopuce à anticorps, ou an antibody biochip, or
une biopuce à acide nucléotidiques, ou a nucleotide acid biochip, or
une biopuce à ARNm, ou une biopuce à siRNA. an mRNA biochip, or a siRNA biochip.
Méthode est caractérisée en ce que ladite étape de détection met en oeuvre tout moyen d'imagerie optique, ou tout moyen sonique ou tout moyen de spectroscopie. The method is characterized in that said detecting step uses any optical imaging means, or any sonic means or any means of spectroscopy.
La figure 1 caractérisant le complexe protéique,Son PI et son PM sont fonction de la température et des conditions de migration et de son observation dans des extraits totaux ou dans des extraits de compartiments cellulaires. Figure 1 characterizing the protein complex, its PI and its PM is a function of temperature and migration conditions and its observation in total extracts or in extracts of cell compartments.
Figure 1,2,3). Elle donne plus de 54 peptides suite à une digestion par la trypsine Proméga (Figure 7). Les caractéristiques de la protéine LIV21F sont également décrites dans les figures 1 ,2, 3 ,4. Vingt peptides particuliers de LIV21 sont décrits : LIV21a (SEQ ID No 1) et LIV21b (SEQ ID No 2) à la séquence 180.  Figure 1,2,3). It gives more than 54 peptides following digestion with the Proméga trypsin (Figure 7). The characteristics of the LIV21F protein are also described in FIGS. 1, 2, 3, 4. Twenty particular peptides of LIV21 are described: LIV21a (SEQ ID No. 1) and LIV21b (SEQ ID No. 2) at sequence 180.
Le gène de cette protéine est caractérisé par deux séquences principales (cf.liste des séquences) et des séquences représentant un épissage alternatif.  The gene for this protein is characterized by two main sequences (see sequences) and sequences representing alternative splicing.
Liv21 correspond a une séquence de forte homologie (plus de 60%)avec AD7cNTP, la neural thread protéine en N terminal (position 193 à 299)de (060448_Human). SEQ N° Liv21 corresponds to a sequence of strong homology (more than 60%) with AD7cNTP, the neural thread protein in N terminal (position 193 to 299) of (060448_Human). SEQ N °
SVAQAGVQWRNLGSLQALPPGFMPFSCLSLLSSWDYRRLPPRPATFLYFPRQGF SVAQAGVQWRNLGSLQALPPGFMPFSCLSLLSSWDYRRLPPRPATFLYFPRQGF
T^ARMVSISPRDPPASASQSVGIAYISNFFFFEMESRSVAQAGVQWHNLGSLQ T ^ ARMVSISPRDPPASASQSVGIAYISNFFFFEMESRSVAQAGVQWHNLGSLQ
ALPPGFMPFSCLSLLSSWDYRRLPPRPATFLYFPR ALPPGFMPFSCLSLLSSWDYRRLPPRPATFLYFPR
Avec des variantes au sein du peptide en position (cf : figure ...):  With variants within the peptide in position (cf: figure ...):
La structure de Liv21K est comme celle de AD7C NTP c'est-à-dire des motifs répétés qu'on peut aussi analyser en sous motifs qui correspondent à des domaines fonctionnels.The structure of Liv21K is like that of AD7C NTP, that is to say repeated patterns that can also be analyzed in sub-patterns that correspond to functional areas.
SVXQAGVQWXNLGSLQXLPPGXXXFSCLSLXSSWDYXXLPPXPAXFSVXQAGVQWXNLGSLQXLPPGXXXFSCLSLXSSWDYXXLPPXPAXF
OU UNE VARIANTE/ OR A VARIANT /
SVXQAGVQWXNLGSLQXLPPGFXXFSCXSLSSWDYRRXPPRXA Entre ces deux motifs répétés un peptide de 40 acides aminés avec un motif conservé aussi : SVXQAGVQWXNLGSLQXLPPGFXXFSCXSLSSWDYRRXPPRXA Between these two repeated motifs a peptide of 40 amino acids with a conserved motif also:
ISPXDXPASASQSXGIXXXSX ISPXDXPASASQSXGIXXXSX
LE PEPTIDE LIV21I : FLYFPRQGFTVLARMVSISPRDPPASASQSVGIAYISN Avec des variantes en position : THE LIV21I PEPTIDE: FLYFPRQGFTVLARMVSISPRDPPASASQSVGIAYISN With variants in position:
Par exemple pour LIV21I For example for LIV21I
En position 31 un A au lieu du V et en position 34 un T au lieu de l'acide aminé A. In position 31 an A instead of V and in position 34 a T instead of amino acid A.
Donc : l'extrémité PASASQSAGIT mais aussi une variante ou le A devient T en position 25 : ...DPPTSASQSVGI So: the PASASQSAGIT end but also a variant where the A becomes T in position 25: ... DPPTSASQSVGI
Idem pour LIV21F ou : Ditto for LIV21F or:
SEQ ID N° :FSCLSL L SSWDYRR L PPRPA T FLYF où l'acide aminé en position 7 ici devient une proline ( P au lieu de L) et / ou en position 15 aussi (avec la possibilité d'une variante alanine ; parfois la position 14 change d'un R en H et /ou en position 21 un acide aminé T devient N.  SEQ ID NO: FSCLSL L SSWDYRR L PPRPA T FLYF where the amino acid in position 7 here becomes proline (P instead of L) and / or position 15 too (with the possibility of an alanine variant; position 14 changes from R to H and / or position 21 an amino acid T becomes N.
SEQ ID N° : FSCLSL P SSWDYRR P PPRPA N FLYF SEQ ID NO: FSCLSL P SSWDYRR P PPRPA N FLYF
. Par ailleurs, deux autres peptides de LIV21 sont également décrits : le peptide LIV21c (SEQ ID No 3) et le peptide LIV21d (SEQ ID No 4). Le peptide LIV21e (SEQ ID N° 5).KFFVFALILALMLSMCGADSHAKR dont la partie terminale est homologue a une séquence de LIV21K. . Moreover, two other LIV21 peptides are also described: the LIV21c peptide (SEQ ID No. 3) and the LIV21d peptide (SEQ ID No. 4). The peptide LIV21e (SEQ ID No. 5) .KFFVFALILALMLSMCGADSHAKR whose end portion is homologous to a LIV21K sequence.
D'autres peptides particuliers de LIV 21 sont décrits dans LA LISTE ADDITIONNELLE.  Other particular peptides of LIV 21 are described in the ADDITIONAL LIST.
Une homologie avec un segment fonctionnel de la protéine zinc finger 575 (ZN575- Human) :score 13 à 48 et jusqu'à 91% de recouvrement  Homology with a functional segment of zinc finger protein 575 (ZN575-Human): score 13 to 48 and up to 91% recovery
Une homologie de la séquence 6 et 56 et avec le domaine Homology of the sequence 6 and 56 and with the domain
MF MR qui est le domaine bzip d'un facteur de transcription contenant un signal de localisation nucléaire et une activité transregulatrice dans TAF1 Au sens de l'invention, une protéine préférée comprend au moins une séquence choisie MF MR which is the bzip domain of a transcription factor containing a nuclear localization signal and a transregulatory activity in TAF1 Within the meaning of the invention, a preferred protein comprises at least one selected sequence
80% ou, de préférence, 3D en hélice qui ont un
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80% or, preferably, 3D helix that have a
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rôle fonctionnel majeur pour ses interactions entre partenaires de ce complexe LFV21, major functional role for its interactions between partners of this LFV21 complex,
La présente invention concerne un polypeptide humain isolé, purifié ou recombinant présentant une séquence comprenant la séquence SEQ ID No 1 et/ou SEQ ID No 2 et/ou SEQ Π> No 3 et/ou SEQ ID No 4 et/ou SEQ ID No 5. De préférence, le polypeptide LIV21F comprend les séquences SEQ ID Nos 1,2 et 5. Dans un mode de réalisation particulier, le complexe LIV21 comprend une séquence sélectionnée parmi les séquences peptidiques le caractérisant obtenues par MALDI (Figure 3,4 et 5). L'invention concerne également les trois peptides LIV21a (SEQ ID No 1) et LIV21b (SEQ ID No 2) et LrV21e (SEQ JD No 5). Elle concerne également des peptides comprenant au moins 10 acides aminés consécutifs de LIV21 humain, de préférence au moins 20, 30 ou 50 acides aminés consécutifs de LIV21F (cf.liste des séquences 1-
Figure imgf000035_0002
en annexe). The present invention relates to an isolated, purified or recombinant human polypeptide having a sequence comprising the sequence SEQ ID No 1 and / or SEQ ID No 2 and / or SEQ Π> No 3 and / or SEQ ID No 4 and / or SEQ ID No 5. Preferably, the LIV21F polypeptide comprises the sequences SEQ ID Nos. 1,2 and 5. In a particular embodiment, the LIV21 complex comprises a sequence selected from the peptide sequences characterizing it obtained by MALDI (FIG. ). The invention also relates to the three peptides LIV21a (SEQ ID No. 1) and LIV21b (SEQ ID No. 2) and LrV21e (SEQ ID No. 5). It also relates to peptides comprising at least 10 consecutive amino acids of human LIV21, preferably at least 20, 30 or 50 consecutive amino acids of LIV21F (see sequence 1-
Figure imgf000035_0002
in annex).
La présente invention concerne également un polynucléotide codant pour la protéine humaine LIV21, LIV21a et/ou LIV21b, plus généralement un polynucléotide codant pour un polypeptide selon la présente invention. Le polynucléotide codant pour LIV21 F et celui codant pour LrV21K peuvent être un ARNm, un ADNc ou un ADN génomique. Les polynucléotides selon la présente invention peuvent être isolés à partir de cellules, plus particulièrement de cellules humaines, ou à partir de banques d'ADNc humains. Ils peuvent également être obtenus par une réaction de polymérisation en chaîne (PCR) effectuée sur l'ADN total des cellules ou encore par RT-PCR effectuée sur les ARN totaux des cellules ou par synthèse chimique. Les sondes et amorces décrites dans la présente demande peuvent être utilisées pour isoler et/ou préparer un polynucléotide codant pour LIV21F. Elle concerne en outre un vecteur de clonage ou d'expression comprenant un tel polynucléotide. Un tel vecteur peut contenir les éléments nécessaires à l'expression (vecteur d'expression) et éventuellement à la sécrétion de la protéine dans une cellule hôte (peptide signal de sécrétion). Lesdits vecteurs comportent de préférence: un promoteur, des signaux d'initiation et de terminaison de la traduction, ainsi que des régions appropriées de régulation de la transcription. Le vecteur peut être un plasmide, un cosmide, un BAC, un phage, un virus ou autre. L'invention concerne également une cellule hôte ou un animal non-humain transgénique comprenant un vecteur ou un polynucléotide selon la présente invention. The present invention also relates to a polynucleotide encoding the human protein LIV21, LIV21a and / or LIV21b, more generally a polynucleotide encoding a polypeptide according to the present invention. The polynucleotide encoding LIV21 F and that encoding LrV21K may be mRNA, cDNA or genomic DNA. The polynucleotides according to the present invention can be isolated from cells, more particularly from human cells, or from human cDNA libraries. They can also be obtained by a polymerase chain reaction (PCR) carried out on the total DNA of the cells or by RT-PCR performed on the total RNA of the cells or by chemical synthesis. The probes and primers described in the present application can be used to isolate and / or prepare a polynucleotide encoding LIV21F. It further relates to a cloning vector or expression comprising such a polynucleotide. Such a vector may contain the elements necessary for the expression (expression vector) and optionally for the secretion of the protein in a host cell (secretory signal peptide). The vectors preferably include: a promoter, translation initiation and termination signals, and appropriate transcriptional regulatory regions. The vector may be a plasmid, a cosmid, a BAC, a phage, a virus or other. The invention also relates to a transgenic non-human host cell or animal comprising a vector or polynucleotide according to the present invention.
L'invention concerne en outre des dérivés d'intérêt de LIV21F ou LIV21K qui sont par exemple des protéines de fusion dans lesquelles LIV21 est fusionnée à des protéines marqueurs comme la GFP. Par ailleurs, la protéine LIV21F et LIV21K et tous les petides décrits (cf.patent in listing) peuvent être marqués par tout moyen connu de
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The invention further relates to derivatives of interest of LIV21F or LIV21K which are for example fusion proteins in which LIV21 is fused to marker proteins such as GFP. Furthermore, the LIV21F and LIV21K protein and all the petids described (cf.patent in listing) can be labeled by any known means of
Figure imgf000036_0001
La présente invention concerne également un anticorps qui se lie spécifiquement à un polypeptide selon la présente invention, de préférence LIV21 humaine, un fragment ou un dérivé de celle-ci. Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps se lie spécifiquement à un peptide LrV21a ou LFV21b. ou les polypeptides LIV21F ou LIV21K.  The present invention also relates to an antibody that specifically binds to a polypeptide according to the present invention, preferably human LIV21, a fragment or a derivative thereof. In a particular embodiment, the antibody specifically binds to an LrV21a or LFV21b peptide. or the LIV21F or LIV21K polypeptides.
La méthode peut notamment comprendre la détection du produit de l'expression de deux de ces gènes ou des trois gènes. Par ailleurs, au moins un des rapports LIV21 / PKCs, LIV21 / E2F4 et LIV21 / E2F1 peut être déterminé dans la présente méthode. Ce rapport peut être déterminé dans le cytoplasme et/ou dans le noyau. De préférence, ces rapports sont déterminés dans le noyau. De préférence, ces rapports sont comparés à ceux obtenus dans une cellule saine. Dans un mode de réalisation, le produit d'expression des gènes est détecté au niveau de l'ARNm, PARNm pouvant être détecté par tout moyen bien connu de l'homme du métier. Ainsi, la méthode selon la présente invention concerne également la détection d'un polynucléotide codant pour la protéine LIV21 humaine ou un fragment de celle-ci, par exemple LIV21a et/ou LIV21b. Le polynucléotide codant pour LIV21 peut être un ARNm, un ADNc ou un ADN génomique. Les polynucléotides peuvent être isolés à partir de cellules de l'échantillon biologique. Ils peuvent également être obtenus par une réaction de polymérisation en chaîne (PCR) effectuée sur l'ADN total des cellules ou encore par RT-PCR effectuée sur les ARN totaux des cellules ou des ARN polyA. The method may include the detection of the product of the expression of two of these genes or three genes. Furthermore, at least one of the LIV21 / PKCs, LIV21 / E2F4 and LIV21 / E2F1 ratios can be determined in the present method. This ratio can be determined in the cytoplasm and / or in the nucleus. Preferably, these ratios are determined in the nucleus. Preferably, these ratios are compared to those obtained in a healthy cell. In one embodiment, the gene expression product is detected at the level of the mRNA, mRNA can be detected by any means well known to those skilled in the art. Thus, the method according to the present invention also relates to the detection of a polynucleotide encoding the human LIV21 protein or a fragment thereof, for example LIV21a and / or LIV21b. The polynucleotide encoding LIV21 may be mRNA, cDNA or genomic DNA. The polynucleotides can be isolated from cells of the biological sample. They can also be obtained by a polymerase chain reaction (PCR) carried out on the total DNA of the cells or by RT-PCR carried out on the total RNAs of the cells or polyA RNAs.
L'ARNm peut être détecté par une analyse RT-PCR. Pour cela, la méthode met en oeuvre une paire d'amorces spécifique du produit d'expression à détecter, notamment LIV21, PKCe, E2F1 ou E2F4. Par « paire d'amorces spécifique » est entendu qu'un moins une des amorces est spécifique du produit d'expression à détecter. C'est-à-dire que cette paire d'amorces permet d'amplifier spécifiquement un fragment de l'ARNm désiré. De préférence, l'analyse par RT-PCR est effectuée sur des extraits nucléaires et/ou cytoplasmiques des cellules contenues dans l'échantillon de la patiente. Facultativement, l'analyse par RT-PCR peut être une analyse quatitative. Une paire d'amorces spécifiques de LIV21 peut être préparée sur la base des enseignements de la- présente demande. Par exemple, la paire d'amorces peut comprendre les amorcés décrites dans les séquences SEQ ID Nos 3 et 4.et séquences supplémentaires de la liste patent in donc numérotées de 119 à 149 et de 171 à 180 avec facultativement toutes les séquences nucléotidiques supplémentaires de la liste additionnelle.MRNA can be detected by RT-PCR analysis. For this purpose, the method uses a pair of primers specific for the expression product to be detected, in particular LIV21, PKCe, E2F1 or E2F4. By "specific primer pair" is meant that at least one of the primers is specific for the expression product to be detected. That is, this primer pair specifically amplifies a fragment of the desired mRNA. Preferably, the RT-PCR analysis is carried out on nuclear and / or cytoplasmic extracts of the cells contained in the sample of the patient. Optionally, the RT-PCR assay can be a quatitative analysis. A pair of specific LIV21 primers may be prepared based on the teachings of the present application. For example, the primer pair may comprise the primers described in SEQ ID Nos. 3 and 4, and further sequences in the patented list are therefore numbered from 119 to 149 and from 171 to 180 with optionally all the additional nucleotide sequences of the additional list.
Figure imgf000037_0001
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Les paires d'amorce spécifiques de PKCs, E2F1 et E2F4 sont bien connues par l'homme du métier (Caroll JS 2000 ; Mundle SD 2003 ; Stevaux O 2002 ;Cheng T 2002 ; Opalka B 2002). L'ARNm peut également être détecté par une analyse NoRthern blot. Pour cela, la méthode met en oeuvre une sonde spécifique du produit d'expression à détecta notamment LIV21, PKCs, E2F1 ou E2F4. Une sonde spécifique de LIV21 peut être préparée sur la base des enseignements de la présente demande. Un exemple de sonde spécifique comprend la séquence SEQ ID No 5. De préférence, l'analyse Northern blot est effectuée sur des extraits nucléaires et/ou cytoplasmiques des cellules contenues dans l'échantillon de la patiente. La sonde nucléique est marquée. La technique de marquage des oligonucléotides est bien connue de l'homme du métier. Le marquage des sondes selon l'invention peut être réalisé par des éléments radioactifs ou par des molécules non radioactives Parmi les isotopes radioactifs utilisés, on peut citer le 32P, le 33P, ou le 3H. Les entités non radioactives sont sélectionnées parmi les ligands tels que la biotine, l'avidine, la streptavidine, la digoxygénine, les haptènes, les colorants, les agents luminescents tels que les agents radioluminescents, chémoluminescents, bioluminescents, fluorescents, phosphorescents. Les sondes spécifiques de PKCs, E2F1 et E2F4 sont bien connues par l'homme du métier. The specific primer pairs of PKCs, E2F1 and E2F4 are well known to those skilled in the art (Caroll JS 2000, Mundle SD 2003, Stevaux O 2002, Cheng T 2002, Opalka B 2002). MRNA can also be detected by NoRthern blot analysis. For this purpose, the method uses a specific probe of the expression product to detect, in particular LIV21, PKCs, E2F1 or E2F4. A probe specific to LIV21 can be prepared based on the teachings of the present application. An example of a specific probe comprises the sequence SEQ ID No. 5. Preferably, the Northern blot analysis is performed on nuclear and / or cytoplasmic extracts of the cells contained in the sample of the patient. The nucleic probe is labeled. The technique for labeling oligonucleotides is well known to those skilled in the art. The labeling of the probes according to the invention can be carried out by radioactive elements or by non-radioactive molecules. Among the radioactive isotopes used, mention may be made of 32 P, 33 P or 3 H. The non-radioactive entities are selected from ligands such as biotin, avidin, streptavidin, digoxygenin, haptens, dyes, luminescent agents such as radioluminescent, chemiluminescent, bioluminescent, fluorescent, phosphorescent agents. The specific PKCs, E2F1 and E2F4 probes are well known to those skilled in the art.
Dans un mode de réalisation alternatif, le produit d'expression des gènes est détecté au niveau de la protéine. De préférence, la protéine est détectée à l'aide d'un anticorps spécifique. Ainsi, la méthode comprend une étape de mise en contact des cellules de l'échantillon biologique avec un anticorps anti-LIV21 humaine. Les anticorps peuvent être monoclonaux ou polyclonaux. L'anticorps anti-LIV21 peut par exemple être un sérum anti-LIV21. In an alternative embodiment, the gene expression product is detected at the level of the protein. Preferably, the protein is detected using a specific antibody. Thus, the method comprises a step of contacting the cells of the biological sample with an anti-human LIV21 antibody. The antibodies can be monoclonal or polyclonal. The anti-LIV21 antibody may for example be an anti-LIV21 serum.
Lorsque le produit de l'expression d'un des gènes PKCs, E2F1 et E2F4 doit être détecté, la méthode peut utiliser des anticorps spécifiques des protéines PKCs, E2F1 et E2F4, respectivement. Les anticorps polyclonaux et monoclonaux dirigés contre PKCs, E2F1 et E2F4 sont disponibles commercialement A titre d'exemple, on peut citer, pour PKCs, un anticorps polyclonal de lapin (Santa Cruz Technology, sc-214), pour E2F1, un anticorps polyclonal de lapin (Santa Cruz Technology, sc-860), et pour E2F4, un anticorps polyclonal de lapin (Santa Cruz Technology, sc-866). De préférence, les anticorps sont marqués, directement ou par l'intermédiaire d'un anticorps secondaire. When the product of the expression of one of the PKCs, E2F1 and E2F4 genes is to be detected, the method can use antibodies specific for the PKCs, E2F1 and E2F4 proteins, respectively. The polyclonal and monoclonal antibodies directed against PKCs, E2F1 and E2F4 are commercially available. By way of example, for PKCs, a rabbit polyclonal antibody (Santa Cruz Technology, sc-214) may be mentioned, for E2F1, a polyclonal antibody of rabbit (Santa Cruz Technology, sc-860), and for E2F4, a polyclonal rabbit antibody (Santa Cruz Technology, sc-866). Preferably, antibodies are labeled directly or through a secondary antibody.
Les techniques de marquage des anticorps sont bien connues de l'homme du métier.  Antibody labeling techniques are well known to those skilled in the art.
Dans un mode de réalisation particulier, la protéine peut être détectée par une analyse d'immûnobuvardage (Western blot). L'analyse Western blot peut être réalisée sur des extraits nucléaires et/ou cytoplasmiques des cellules contenues dans l'échantillon de la patiente. Brièvement, les protéines sont mises à migrer dans un gel puis transférer sur une membrane. Ensuite, cette membrane est incubée en présence des anticorps et la fixation des anticorps est éventuellement révélée à l'aide d'anticorps secondaires marqués. In a particular embodiment, the protein can be detected by a Western blot analysis. Western blot analysis can be performed on nuclear and / or cytoplasmic extracts of the cells contained in the patient's sample. Briefly, the proteins are migrated in a gel and then transferred to a membrane. Then, this membrane is incubated in the presence of antibodies and antibody binding is eventually revealed using labeled secondary antibodies.
Dans un autre mode de réalisation, la protéine est détectée par immunohistochimie, immunocytochimie ou immunoradiographie. Ces techniques sont bien connues de l'homme du métier. L'analyse d' immunocytochimie peut être effectué sur des cellules entières provenant de l'échantillon ou étant dérivées de celui-ci, par exemple par culture cellulaire. Elle peut également être réalisée sur des noyaux isolés. L'analyse d'immunohistochimie peut être faite sur des coupes de tissu mammaire. n M~ UM> êfc * *f - In another embodiment, the protein is detected by immunohistochemistry, immunocytochemistry or immunoradiography. These techniques are well known to those skilled in the art. Immunocytochemistry analysis can be performed on whole cells from or derived from the sample, for example by cell culture. It can also be performed on isolated nuclei. Immunohistochemistry analysis can be done on sections of breast tissue. n M ~ UM> efc * * f -
A titre d'illustration, une analyse par immunocytochimie peut comprendre les étapes suivantes. Cependant, il est entendu que d'autres modes préparatoires peuvent être mis en oeuvre. Des cellules provenant de l'échantillon biologique sont cultivées, de préférence sur des lames (Lab Tek,Nunc, Allemagne), puis lavées avec du tampon et fixées avec du paraformaldéhyde (par ex. 4%). Une étape de saturation est de préférence réalisée en incubant les cellules avec du tampon S (PBS-Triton X100 0,1% - SVF 10%). By way of illustration, an immunocytochemical analysis may comprise the following steps. However, it is understood that other preparatory modes can be implemented. Cells from the biological sample are cultured, preferably on slides (Lab Tek, Nunc, Germany), then washed with buffer and fixed with paraformaldehyde (eg 4%). A saturation step is preferably performed by incubating the cells with S buffer (PBS-0.1% Triton X100 - 10% FCS).
Les cellules sont ensuite incubées avec l'anticorps primaire et sont ensuite lavées et incubées avec un anticorps secondaire fluorescent, si nécessaire. Les noyaux peuvent être marqués à l'iodure de propidium (Sigma). Les lames sont montées au moviol pour l'observation en microscopie à fluorescence. Par ailleurs, des noyaux isplées prélevés au cours d'une extraction nucléaire peuvent être fixés avec du paraformaldéhyde (par ex. The cells are then incubated with the primary antibody and then washed and incubated with a fluorescent secondary antibody, if necessary. The nuclei can be labeled with propidium iodide (Sigma). The slides are moviol mounted for observation by fluorescence microscopy. In addition, isolated nuclei removed during nuclear extraction can be fixed with paraformaldehyde (e.g.
4%). Les suspensions de noyaux sont déposées entre lame et lamelle et l'observation est faite en microscopie à fluorescence et en microscopie confocale. Les anticorps primaires sont par exemple des anticorps de lapin et les anticorps secondaires sont des anticorps marqués dirigés contre les IgG de lapin. Les échantillons biologiques proviennent d'un patient potentiellement atteint de cancer ou atteint de cancer de manière avérée. Par "échantillon biologique", on entend notamment un prélèvement du type fluide biologique, tissu vivant, fragment de tissu, mucosité, organe ou fragment d'organe, ou tout surnageant de culture obtenu à l'aide d'un prélèvement. La méthode selon la présente invention peut comprendre une étape de prélèvement d'un échantillon biologique du patient. L'étape de détection peut être effectuée directement sur une coupe de tissu de l'échantillon, sur une culture de cellules provenant de l'échantillon, sur des extraits cellulaires totaux, des extraits nucléaires et/ou cytoplasmiques. Dans un mode de réalisation particulier de la méthode comprenant la détection du produit d'expression du gène PKCe, une augmentation significative de PKCe est indicative de la présence de cellules cancéreuses. Plus précisément, la quantité de PKCe dans des cellules saines est comparée à la quantité de PKCe dans les cellules de l'échantillon et l'augmentation significative est détenninée par cette comparaison. La méthode selon la présente invention peut éventuellement comprendre la mesure du taux LIV21 / PKCe. Ce rapport LIV21 / PKCe augmente dans la fraction cytoplasmique des cellules cancéreuses par rapport à des cellules saines. 4%). The suspensions of nuclei are deposited between blade and coverslip and the observation is made by fluorescence microscopy and confocal microscopy. The primary antibodies are, for example, rabbit antibodies and the secondary antibodies are labeled antibodies directed against rabbit IgG. The biological samples come from a patient potentially suffering from cancer or cancer in a proven way. By "biological sample" is meant in particular a sample of the biological fluid type, living tissue, tissue fragment, slime, organ or organ fragment, or any culture supernatant obtained using a sample. The method according to the present invention may comprise a step of taking a biological sample from the patient. The detection step can be performed directly on a section of tissue of the sample, on a culture of cells from the sample, on total cell extracts, nuclear and / or cytoplasmic extracts. In a particular embodiment of the method comprising the detection of the expression product of the PKCe gene, a significant increase in PKCe is indicative of the presence of cancer cells. Specifically, the amount of PKCe in healthy cells is compared to the amount of PKCe in the cells of the sample and the significant increase is determined by this comparison. The method according to the present invention may optionally comprise the measurement of the LIV21 / PKCe rate. This LIV21 / PKCe ratio increases in the cytoplasmic fraction of cancer cells compared to healthy cells.
Dans un autre mode de réalisation particulier de la méthode comprenant la détection du produit d'expression du gène E2F4, la méthode comprend la détection de l'association de LIV21 avec la protéine E2F4, et une diminution de cette association étant indicative de la présence de cellules cancéreuses. La détection de l'association de LIV21 avec la protéine E2F4 peut être réalisée par une détection concomitante de LIV21 et de E2F4. La méthode selon la présente invention peut éventuellement comprendre la mesure du taux E2F4 / LIV21. Ce rapport E2F4 / LIV21 diminue dans le noyau des cellules cancéreuses par rapport à des cellules saines. In another particular embodiment of the method comprising the detection of the expression product of the E2F4 gene, the method comprises the detection of the combination of LIV21 with the E2F4 protein, and a decrease in this association being indicative of the presence of cancer cells. Detection of the association of LIV21 with the E2F4 protein can be achieved by concomitant detection of LIV21 and E2F4. The method according to the present invention may optionally include measuring the E2F4 / LIV21 rate. This ratio E2F4 / LIV21 decreases in the nucleus of cancer cells compared to healthy cells.
Dans un mode de réalisation supplémentaire de la méthode comprenant la détection du produit d'expression du gène E2F1, la présence de la protéine E2F1 dans le noyau est indicative de la présence de cellules cancéreuses. La méthode selon la présente invention peut éventuellement comprendre la mesure du taux E2F1 / LrV2lf£e rapport E2F1 / LIV21 augmente dans la fraction nucléaire des cellules cancéreuses par rapport à des cellules saines. In a further embodiment of the method comprising detecting the expression product of the E2F1 gene, the presence of the E2F1 protein in the nucleus is indicative of the presence of cancer cells. The method according to the present invention may optionally comprise the measurement of the E2F1 / LrV2l ratio and the E2F1 / LIV21 ratio increases in the nuclear fraction of cancer cells relative to healthy cells.
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La méthode selon la présente invention permet notamment la détection de cancer métastasé, le suivi thérapeutique et/ou les récidives de traitement et de déterminer le degré d'invasivité d'un cancer. La spécificité de la détection peut être liée aux croisements des informations obtenues par l'existence et la topographie de LIV21 par tous les moyens d'imagerie et de spectroscopie et obtenues par l'association aux autres indicateurs cancérologiques connus via des puces à protéines ou des microarrays. Ainsi, i détection basée sur LIV21 peut être associée à la détection d'autres marqueurs du cancer, en particulier du cancer du sein, connus de l'homme du métier.^- ca*^ > En effet, la présente invention concerne une méthode de suivi thérapeutique d'un traitement anti-cancéreux chez un patient souffrant d'un cancer comprenant, l'administration du traitement anti-cancéreux au dit patient et la détection de cellules cancéreuses dans un échantillon biologique du patient selon la méthode de la présente invention. Une diminution des cellules cancéreuses sera indicative de l'efficacité du traitement. La détection de cellules cancéreuses dans un échantillon biologique du patient selon la méthode de la présente invention peut être effectuée une fois ou plusieurs fois au cours du traitement anti-cancéreux ou après le traitement anticancéreux. De préférence, l'échantillon biologique provient du tissu touché par le cancer traité. Par ailleurs, la présente invention concerne également une méthode de détection des récidives suite à un traitement anti-cancéreux d'un cancer chez un patient comprenant, la détection de cellules cancéreuses dans un échantillon biologique du patient selon la méthode de la présente invention. La détection de cellules cancéreuses dans un échantillon biologique du patient selon la méthode de la présente invention peut être effectuée une fois ou plusieurs fois après le traitement anti-cancéreux. La détection de cellules cancéreuses est indicative de récidives. De préférence, l'échantillon biologique provient du tissu touché par le cancer traité. The method according to the present invention allows in particular the detection of metastasized cancer, therapeutic monitoring and / or treatment recurrences and to determine the degree of invasiveness of a cancer. The specificity of the detection can be linked to the crossings of the information obtained by the existence and the topography of LIV21 by all the means of imaging and spectroscopy and obtained by the association with other known oncological indicators via protein chips or proteins. microarrays. Thus, detection based on LIV21 may be associated with the detection of other cancer markers, particularly breast cancer, known to those skilled in the art. therapeutic monitoring of an anti-cancer treatment in a patient suffering from a cancer comprising administering the anti-cancer treatment to said patient and detecting cancer cells in a biological sample of the patient according to the method of the present invention . A decrease in cancer cells will be indicative of the effectiveness of the treatment. The detection of cancer cells in a biological sample of the patient according to the method of the present invention may be carried out once or several times during the anti-cancer treatment or after the anticancer treatment. Preferably, the biological sample is from the tissue affected by the treated cancer. Furthermore, the present invention also relates to a method for detecting recurrence following anti-cancer treatment of cancer in a patient comprising detecting cancer cells in a biological sample of the patient according to the method of the present invention. The detection of cancer cells in a biological sample of the patient according to the method of the present invention can be carried out once or several times after the anti-cancer treatment. The detection of cancer cells is indicative of recurrence. Preferably, the biological sample is from the tissue affected by the treated cancer.
La présente invention décrit également un kit pour la mise en œuvre d'une méthode selon l'invention. Plus particulièrement, l'invention concerne un kit permettant la détection de cellules cancéreuses dans un échantillon biologique d'un patient comprenant un ou des éléments sélectionné(s) parmi le groupe consistant en un* anticorps qui se lie spécifiquement à LIV21 humaine selon la présente invention et un sérum anti-LIV21 selon la présente invention, une sonde oligonucléotidique spécifique de l'AR m de LIV21 et une paire d'amorces spécifique de PARNm de LIV21. Dans un mode de réalisation préféré, le kit comprend des anticorps qui se lient spécifiquement à LIV21 humaine. Dans un autre mode de réalisation préféré, le kit comprend une sonde oligonucléotidique spécifique de l'ARNm de LIV21. Il peut également comprendre une sonde spécifique d'un gène « house-keeping ». Le kit selon la présente invention peut comprendre des réactifs permettant la détection d'un complexe LIV21 -anticorps produit lors d'une réaction immunologique. Facultativement, le kit selon la présente invention comprend en outre des moyens de détection du produit de l'expression d'au moins un gène sélectionné parmi le groupe consistant en le gène de la protéine kinase C epsilon (PKCe), le gène E2F1 et le gène E2F4. Ces moyens de détection peuvent être des anticorps spécifiques de la protéine, des sondes oligonucléotidiques spécifiques de l'ARNm concerné et/ou une paire d'amorces spécifique de l'ARNm. The present invention also describes a kit for implementing a method according to the invention. More particularly, the invention relates to a kit for the detection of cancer cells in a biological sample of a patient comprising one or more members selected from the group consisting of an antibody that specifically binds to human LIV21 according to the present invention. invention and an anti-LIV21 serum according to the present invention, an AR m of LIV21 specific oligonucleotide probe and a LIV21 specific PARNm primer pair. In a preferred embodiment, the kit comprises antibodies that specifically bind to human LIV21. In another preferred embodiment, the kit comprises an oligonucleotide probe specific for the LIV21 mRNA. It may also include a probe specific for a house-keeping gene. The kit according to the present invention may comprise reagents allowing the detection of a LIV21 complex-an antibody produced during an immunological reaction. Optionally, the kit according to the present invention further comprises means for detecting the product of the expression of at least one gene selected from the group consisting of the protein kinase C epsilon (PKCe) gene, the E2F1 gene and the E2F4 gene. These detection means may be protein-specific antibodies, oligonucleotide probes specific for the mRNA concerned and / or a primer pair specific for the mRNA.
La présente invention concerne également une composition diagnostique comprenant un ou des éléments sélectionné(s) parmi le groupe consistant en un anticorps selon la présente invention et un sérum selon la présente invention, une sonde oligonucléotidique spécifique de l'ARNm de LIV21 et une paire d'amorces spécifique de l'ARNm de LIV21. The present invention also relates to a diagnostic composition comprising one or more elements selected from the group consisting of an antibody according to The present invention and a serum according to the present invention, an oligonucleotide probe specific for LIV21 mRNA and a specific primer pair of LIV21 mRNA.
Le gène de LIV21F est localisé sur le chromosome lp31 dans la région 30130K et 30132K en position 30,081K et 30181K entre le gène TINAGL1 et LOC 284551 nommé pour cette partie exonique NW 001838577.2 en 2009 (anciennement référencé en Mars 2006 comme polypeptide issu de hsl 33153, NT 032977.8).Caractérisé par des domaines ring finger de type Zn Finger et un signal de transduction.  The LIV21F gene is located on the lp31 chromosome in the 30130K and 30132K region in the 30,081K and 30181K position between the TINAGL1 gene and LOC 284551 named for this exonic part NW 001838577.2 in 2009 (formerly referenced in March 2006 as a polypeptide derived from hsl 33153 , NT 032977.8) .Characterized by ring finger domains of Zn Finger type and a transduction signal.
Thérapie Anti-cancereuse Anti-cancer therapy
Dans le contexte d'une thérapie anti-cancéreuses, on peut envisager d'augmenter la quantité de LIV21 présente dans le noyau. Pour cela, on pourrait augmenter l'expression de LIV21 dans le noyau des cellules cancéreuses. LIV21 étant capable de s'auto-nucléariser, la réalisation d'un vecteur d'expression comprenant un polynucléotide codant pour LIV21 humaine pourrait être envisagée dans le but de faire surexprimer cette protéine dans le noyau des cellules dont on souhaite réguler la prolifération.In the context of an anti-cancer therapy, one can consider increasing the amount of LIV21 present in the nucleus. For this, one could increase the expression of LIV21 in the nucleus of the cancer cells. LIV21 being capable of self-nuclearization, the production of an expression vector comprising a polynucleotide encoding human LIV21 could be envisaged with the aim of overexpressing this protein in the nucleus of the cells whose proliferation is to be regulated.
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Le vecteur d'expression codant LIV21 humain The human LIV21 coding expression vector
par tout moyen connu de l'homme du métier.by any means known to those skilled in the art.
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Par exemple, le vecteur d'expression peut être administré sous forme d'ADN nu (par exemple EP 465 529). Des techniques de microinjection, électroporation, précipitation au phosphate de calcium, formulations à l'aide de nanocapsules ou de liposomes sont d'autres techniques disponibles. li Le vecteur d'expression peut également être sous la forme d'un virus recombinant comprenant, insérée dans son génome, un polynucléotide codant pour LIV21 humaine. Le vecteur viral peut être par exemple choisi parmi un adénovirus, un rétrovirus, en particulier un lentivirus, ainsi qu'un virus adéno-associé (AAV), un virus de l'herpès (HSV), un cytomégalo virus (CMV), un virus de la vaccine, etc. De manière avantageuse, le virus recombinant est un virus défectif. For example, the expression vector may be administered in the form of naked DNA (eg EP 465,529). Microinjection techniques, electroporation, calcium phosphate precipitation, nanocapsule or liposome formulations are other available techniques. li The expression vector may also be in the form of a recombinant virus comprising, inserted into its genome, a polynucleotide encoding human LIV21. The viral vector may for example be chosen from an adenovirus, a retrovirus, in particular a lentivirus, as well as an adeno-associated virus (AAV), a herpesvirus (HSV), a cytomegalo virus (CMV), a vaccinia virus, etc. Advantageously, the recombinant virus is a defective virus.
De préférence, le vecteur d'expression permet un ciblage cellulaire. Ainsi, ce vecteur pourrait cibler les cellules cancéreuses ou le type ceJhilaire particulier qui est affect par le cancer. Le ciblage d'un type cellulaire particulier peut être réalisé en plaçant le polynucléotide codant LIV21 sous le contrôle d'un promoteur tissu-spécifique. Dans une autre alternative, le vecteur d'expression peut faire l'objet d'un ciblage, par exemple en l'associant à une molécule spécifique d'un tissu particulier ou des cellules cancéreuses, par exemple un anticorps spécifique d'une molécule exprimée spécifiquement par le tissu particulier ou les cellules cancéreuses. Par ailleurs, le choix du vecteur d'expression peut influencer également le ciblage. En effet, si le vecteur d'expression est un virus, le tropisme du virus naturel ou modifié peut également permettre un certain ciblage.Preferably, the expression vector allows cell targeting. Thus, this vector could target cancer cells or the particular type of cancer that is affected by cancer. Targeting of a particular cell type can be achieved by placing the LIV21 coding polynucleotide under the control of a tissue-specific promoter. In another alternative, the expression vector may be targeted, for example by associating it with a specific molecule of a particular tissue or cancer cells, for example an antibody specific for an expressed molecule. specifically by the particular tissue or cancer cells. Moreover, the choice of the expression vector can also influence the targeting. Indeed, if the expression vector is a virus, the tropism of the natural or modified virus may also allow some targeting.
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La présente invention concerne donc une composition pharmaceutique comprenant un polynucléotide codant pour LIV21, plus particulièrement un vecteur d'expression codant pour LIV21. Elle concerne également l'utilisation d'une composition pharmaceutique comprenant un polynucléotide codant pour LIV21, en particulier un vecteur d'expression codant pour LIV21, comme médicament. De préférence, la présente invention concerne l'utilisation d'une composition pharmaceutique comprenant un polynucléotide codant pour LIV21, en particulier un vecteur d'expression codant pour LIV21, pour la préparation d'un médicament destiné à traiter un cancer. La présente invention concerne enfin une méthode de traitement du cancer chez un patient comprenant l'administration aux cellules cancéreuses d'un polynucléotide codant pour LIV21, l'expression de LIV21 permettant de réduire ou d'abolir le phénotype cancéreux / The present invention therefore relates to a pharmaceutical composition comprising a polynucleotide encoding LIV21, more particularly an expression vector coding for LIV21. It also relates to the use of a pharmaceutical composition comprising a polynucleotide encoding LIV21, in particular an expression vector coding for LIV21, as a drug. Preferably, the present invention relates to the use of a pharmaceutical composition comprising a polynucleotide encoding LIV21, in particular an expression vector encoding LIV21, for the preparation of a medicament for treating cancer. The present invention further relates to a method of treating cancer in a patient comprising administering to cancer cells a polynucleotide encoding LIV21, the expression of LIV21 to reduce or abolish the cancerous phenotype /
des cellules traitées. De préférence, le cancer est sélectionné parmi les cancers du sein, de la vessie, de l'ovaire, du poumon, de la peau, de la prostate, du colon, et le glioblastome, sans être limité à ceux-ci.  treated cells. Preferably, the cancer is selected from breast, bladder, ovarian, lung, skin, prostate, colon, and glioblastoma cancers, without being limited thereto.
Par ailleurs, on pourrait également favoriser la localisation nucléaire de LIV21, par exemple en diminuant l'activité de PKCe dans les cellules cancéreuses et en utilisant les inhibiteurs d'HDAC. In addition, one could also promote the nuclear localization of LIV21, for example by decreasing PKCe activity in cancer cells and using HDAC inhibitors.
Dans un autre mode particulier de thérapie anti-cancéreuse, on peut envisager de diminuer l'activité de PKCe dans les cellules cancéreuses. Cette diminution d'activité peut être réalisée en diminuant l'activité de la protéine PKCe ou en diminuant son expression. Une diminution de l'activité de la protéine PKCe peut être obtenue en administrant aux cellules cancéreuses des inhibiteurs de la protéine PKCe. Les inhibiteurs de la protéine PKCe sont bien connus de l'homme du métier. Une diminution de l'expression de la protéine PKCe peut être obtenue en utilisant des antisens ou des siRNA spécifiques du gène PKCe. Des kits sont commercialement disponibles. Par ailleurs, les techniques concernant les inhibitions par anti-sens ou siRNA sont bien connues de l'homme du métier. (Arya R 2004, Lee W 2004, Sen AIn another particular mode of anti-cancer therapy, one may consider decreasing PKCe activity in cancer cells. This decrease in activity can be achieved by decreasing the activity of the PKCe protein or by decreasing its expression. A decrease in PKCe protein activity can be achieved by administering inhibitors of PKCe protein to cancer cells. Inhibitors of PKCe protein are well known to those skilled in the art. A decrease in PKCe protein expression can be achieved using antisense or siRNA specific for the PKCe gene. Kits are commercially available. Moreover, the techniques concerning inhibitions by antisense or siRNA are well known to those skilled in the art. (Arya R 2004, Lee W 2004, Sen A
2004, Platet N 1998, Hughes 1987). 2004, Platet N 1998, Hughes 1987).
Les si RNA suivants peuvent aussi être utilisés :  The following if RNAs can also be used:
GCUGAGGCAGGCAGAUCAUUUCAA )  GCUGAGGCAGGCAGAUCAUUUCAA)
UUCGACUCCGUCCGUCUAGUAAGAG-
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UUCGACUCCGUCCGUCUAGUAAGAG-
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GUACCAUUUCACAACAACUUUCAA )  GUACCAUUACACAACAACUUUCAA)
UUCAUGGUAAAGUGUUGUUGAAGAG-  UUCAUGGUAAAGUGUUGUUGAAGAG-
La présente invention concerne donc une composition pharmaceutique comprenant un inhibiteur de la protéine PKCe. Elle concerne également l'utilisation d'une composition pharmaceutique comprenant un inhibiteur de la protéine PKCe comme médicament, en particulier pour la préparation d'un médicament destiné à traiter un cancer. Elle concerne enfin une méthode de traitement du cancer chez un patient comprenant l'administration aux cellules cancéreuses d'un inhibiteur de la protéine PKCe, l'inhibiteur de la protéine PKCe permettant de réduire ou d'abolir le phénotype cancéreux des cellules traitées. Dans un premier mode de réalisation, l'inhibiteur de la protéine PKCe diminue l'activité de la protéine PKCe. Dans un deuxième mode de réalisation, l'inhibiteur de la protéine PKCe diminue l'expression de la protéine PKCe. De préférence, le cancer est sélectionné parmi les cancers du sein, de la vessie, de l'ovaire, du poumon, de la peau, de la prostate, du colon, du foie, un sarcome, une leucémie et le glioblastome, sans être limité à ceux-ci. Les inhibiteurs de PKC epsilon sont publiés et utilisés dans le commerce pour d'autres applications. The present invention therefore relates to a pharmaceutical composition comprising an inhibitor of the PKCe protein. It also relates to the use of a pharmaceutical composition comprising an inhibitor of the PKCe protein as a medicament, in particular for the preparation of a medicament for treating cancer. Finally, it relates to a method of treating cancer in a patient comprising the administration to the cancer cells of an inhibitor of the PKCe protein, the PKCe protein inhibitor making it possible to reduce or abolish the cancerous phenotype of the treated cells. In a first embodiment, the inhibitor of the PKCe protein decreases the activity of the PKCe protein. In a second embodiment, the inhibitor of the PKCe protein decreases the expression of the PKCe protein. Preferably, the cancer is selected from cancers of the breast, bladder, ovary, lung, skin, prostate, colon, liver, sarcoma, leukemia and glioblastoma, without being limited to these. PKC epsilon inhibitors are published and used commercially for other applications.
Dans le contexte d'une thérapie d'une maladie neurodégénérative, on peut envisager de diminuer la quantité de LIV21 présente dans le noyau. Pour cela, on pourrait diminuer ou bloquer l'expression de LIV21 dans le noyau des cellules touchées par la maladie neurodégénérative. Les cellules touchées par la maladie neurodégénérative sont généralement des neurones, des motoneurones, etc.. L'inhibition ou le blocage de l'expression de LIV21 peut être réalisé par tout moyen connu de l'homme du métier. Notamment, à titre d'illustration, on peut citer la stratégie antisens, siRNA, et les ribozymes. Ainsi, un oligonucléotide antisens ou un vecteur d'expression codant pour cet oligonucléotide antisens pourrait être préparé et utilisé pour bloquer la traduction de l'ARNm codant LIV2lfin vivo. Par ailleurs, un ribozyme peut être préparé pour couper et détruire in vivo l'ARNm codant LIV21. On peut également envisager une stratégie en triple hélice dans laquelle un oligonucléotide est conçu pour s'hybrider avec le gène codant LIV21 et bloquer ainsi la transcription de ce gène. In the context of therapy of a neurodegenerative disease, it is possible to reduce the amount of LIV21 present in the nucleus. For this, one could reduce or block the expression of LIV21 in the nucleus of the cells affected by the neurodegenerative disease. The cells affected by the neurodegenerative disease are generally neurons, motor neurons, etc. The inhibition or blocking of LIV21 expression can be achieved by any means known to those skilled in the art. In particular, by way of illustration, mention may be made of the antisense strategy, siRNA, and ribozymes. Thus, an antisense oligonucleotide or an expression vector encoding this antisense oligonucleotide could be prepared and used to block the translation of vivo vivo LIV2 encoding mRNA. In addition, a ribozyme can be prepared to cut and destroy the LIV21 coding mRNA in vivo. It is also possible to envisage a triple helix strategy in which an oligonucleotide is designed to hybridize with the gene encoding LIV21 and thus block the transcription of this gene.
Par ailleurs, Pour cela, on pourrait également défavoriser la localisation nucléaire de LIV21, par exemple en augmentant l'activité de PKCe dans les cellules touchées par la maladie neurodégénérative. Moreover, for this, one could also disadvantage the nuclear localization of LIV21, for example by increasing the activity of PKCe in the cells affected by the neurodegenerative disease.
Dans un autre mode particulier de thérapie contre une maladie neurodégénérative, on peut envisager d'augmenter l'activité de PKCe dans les cellules touchées par la maladie neurodégénérative. Cette augmentation d'activité peut être réalisée en augmentant l'activité de la protéine PKCe ou en augmentant son expression. Une augmentation de l'activité de la protéine PKCe peut être obtenue en administrant aux cellules touchées par la maladie neurodégénérative des activateurs de la protéine PKCe. Les activateurs de la protéine PKCe sont bien connus de l'homme du métier (Toma O (2004), Activation des PKC par DAG, AGPI : acide oléique, linoléique, arachidonique etc ... Activation et protéolyse des PKC dans les cellules gonadotropes :Communication 2004 de Macciano H, Junoy B, Mas JL Drouva SV UMR6544 Marseille). Une augmentation de l'expression de la protéme PKCe peut être obtenue en utilisant des vecteurs d'expression codant pour la protéine PKCe et permettant de la surexprimer dans les cellules touchées par la maladie neurodégénérative. In another particular mode of therapy against a neurodegenerative disease, one may consider increasing PKCe activity in cells affected by neurodegenerative disease. This increase in activity can be achieved by increasing the activity of the PKCe protein or by increasing its expression. An increase in PKCe protein activity can be achieved by administering to the cells affected by the neurodegenerative disease activators of the PKCe protein. Activators of the PKCe protein are well known to those skilled in the art (Toma O (2004), Activation of PKC by DAG, PUFA: oleic acid, linoleic acid, arachidonic acid, etc. Activation and proteolysis of PKCs in gonadotropic cells: Communication 2004 by Macciano H, Junoy B, Mas JL Drouva SV UMR6544 Marseille). An increase in PKCe protease expression can be achieved by using expression vectors encoding the PKCe protein and allowing overexpression in cells affected by neurodegenerative disease.
Ainsi, la présente invention concerne une composition pharmaceutique comprenant un activateur de la protéine PKCe ou un vecteur d'expression codant pour la protéine PKCe. Elle concerne en outre l'utilisation d'un activateur de la protéine PKCe ou d'un vecteur d'expression codant pour la protéine PKCe pour la préparation d'un médicament destiné au traitement d'une maladie neurodégénérative. Thus, the present invention relates to a pharmaceutical composition comprising an activator of the PKCe protein or an expression vector encoding the PKCe protein. It also relates to the use of a PKCe protein activator or an expression vector encoding the PKCe protein for the preparation of a medicament for the treatment of a neurodegenerative disease.
Méthode de criblage Screening method
L'invention concerne des méthodes pour la sélection, l'identification, la caractérisation ou l'optimisation de composés actifs diminuant la prolifération cellulaire, basées sur la mesure de la localisation nucléaire versus cytoplasmique de LIV21, ou de la liaison de la protéine LIV21 à la protéine E2F4.  The invention relates to methods for the selection, identification, characterization or optimization of cell-depleting active compounds based on the measurement of the nuclear or cytoplasmic localization of LIV21, or the binding of LIV21 protein to the E2F4 protein.
Dans un premier mode de réalisation, la sélection, l'identification, la caractérisation ou l'optimisation de composés actifs d'intérêt thérapeutique comprend la mise en contact d'un composé candidat avec une cellule et la détermination de la localisation nucléaire versus cytoplasmique du produit d'expression de LIV21. Une augmentation de la localisation nucléaire de LIV21 indique que le composé candidat est actif pour diminuer ou abolir la prolifération cellulaire. Une dirninution de la localisation nucléaire de LIV21 indique que le composé candidat est actif pour traiter ou prévenir une maladie neurodégénérative. In a first embodiment, the selection, identification, characterization or optimization of active compounds of therapeutic interest comprises contacting a candidate compound with a cell and determining the nuclear or cytoplasmic localization of the cell. LIV21 expression product. An increase in the nuclear localization of LIV21 indicates that the candidate compound is active to decrease or abolish cell proliferation. A decline in the nuclear localization of LIV21 indicates that the candidate compound is active to treat or prevent a neurodegenerative disease.
Dans un deuxième mode de réalisation, la sélection, l'identification, la caractérisation ou l'optimisation de composés actifs d'intérêt thérapeutique comprend la mise en contact d'un composé candidat avec une cellule et la détermination du niveau d'expression du gène codant pour la protéine PKCe. Une diminution de l'expression de PKCe indique que le composé candidat est actif pour diminuer ou d'abolir la prolifération cellulaire. Une augmentation de l'expression de PKCe indique que le composé candidat est actif pour traiter ou prévenir une maladie neurodégénérative. In a second embodiment, the selection, identification, characterization or optimization of active compounds of therapeutic interest comprises contacting a candidate compound with a cell and determining the level of expression of the gene. encoding the PKCe protein. A decrease in PKCe expression indicates that the candidate compound is active to decrease or abolish cell proliferation. An increase in PKCe expression indicates that the candidate compound is active to treat or prevent a neurodegenerative disease.
Dans un troisième mode de réalisation, la sélection, l'identification, la caractérisation ou Γ optimisation de composés actifs d'intérêt thérapeutique comprend la mise en contact d'un composé candidat avec une cellule et la détermination du niveau de complexe LIV21/E2F4. Une augmentation du niveau de complexe LIV21/E2F4 indique que le composé candidat est actif pour diminuer ou d'abolir la prolifération cellulaire. Une diminution du niveau de complexe LIV21/E2F4 indique que le composé candidat est actif pour traiter ou prévenir une maladie neurodégénérative. Dans un quatrième mode de réalisation, la sélection, l'identification, la caractérisation ou l'optimisation de composés actifs d'intérêt thérapeutique comprend la mise en contact d'un composé candidat avec une cellule et la détermination du niveau d'expression du gène codant pour la protéine E2F1. Une diminution de l'expression de E2F1 indique que le composé candidat est actif pour diminuer ou d'abolir la prolifération cellulaire. Une augmentation de l'expression de E2F1 indique que le composé candidat est actif pour traiter ou prévenir une maladie neurodégénérative. In a third embodiment, the selection, identification, characterization or optimization of active compounds of therapeutic interest comprises contacting a candidate compound with a cell and determining the level of LIV21 / E2F4 complex. An increase in the level of LIV21 / E2F4 complex indicates that the candidate compound is active to decrease or abolish cell proliferation. A decrease in the level of LIV21 / E2F4 complex indicates that the candidate compound is active to treat or prevent a neurodegenerative disease. In a fourth embodiment, the selection, identification, characterization or optimization of active compounds of therapeutic interest comprises contacting a candidate compound with a cell and determining the level of expression of the gene. encoding the E2F1 protein. A decrease in E2F1 expression indicates that the candidate compound is active to decrease or abolish cell proliferation. An increase in E2F1 expression indicates that the candidate compound is active to treat or prevent a neurodegenerative disease.
L'invention a encore pour objet une méthode de criblage d'un composé capable d'interagir in vitro, directement ou indirectement, avec LIV21 caractérisée en ce que: dans une première étape, on met en contact le composé candidat et LIV21 et, dans une deuxième étape, on détecte par tout moyen approprié le complexe formé entre ledit composé candidat et L1Y21. The subject of the invention is also a method for screening a compound capable of interacting in vitro, directly or indirectly, with LIV21, characterized in that: in a first step, the candidate compound is contacted with LIV21 and, in a second step, the complex formed between said candidate compound and L1Y21 is detected by any appropriate means.
La présente invention a également pour objet une méthode de criblage d'un composé capable de moduler (activer ou inhiber) l'activité de la protéine LIV21, caractérisée en ce que: dans une première étape, on met en contact des cellules d'un échantillon biologique exprimant la protéine LIV21 avec un composé candidat, dans une deuxième étape, on mesure par tout moyen approprié l'effet dudit composé candidat sur l'activité de ladite protéine LIV21, et dans une troisième étape on sélectionne des composés candidats capables de moduler ladite activité. L'activité de LIV21 peut par exemple être estimée par l'intermédiaire de l'évaluation de la capacité de la cellule à se diviser, par la mesure de l'expression du gène E2F1, ou par la localisation cytoplasmique et/ou nucléaire de LIV21. Le composé candidat peut être une protéine, un peptide, un acide nucléique (ADN ou ARN), un lipide, un composé organique ou inorganique. Notamment, le composé candidat pourrait être un anticorps, un anti-sens, un ribozyme ou un siRNA. The subject of the present invention is also a method for screening a compound capable of modulating (activating or inhibiting) the activity of the LIV21 protein, characterized in that: in a first step, cells of a biological sample expressing the LIV21 protein with a candidate compound, in a second step, the effect of said candidate compound on the activity of said LIV21 protein is measured by any appropriate means, and in a third step candidate compounds capable of modulating said activity. The activity of LIV21 can for example be estimated through the evaluation of the ability of the cell to divide, by measuring the expression of the E2F1 gene, or by the cytoplasmic and / or nuclear localization of LIV21. . The candidate compound can be a protein, a peptide, a nucleic acid (DNA or RNA), a lipid, an organic or inorganic compound. In particular, the candidate compound could be an antibody, an antisense, a ribozyme or a siRNA.
D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront dans les exemples et les figures qui suivent, donnés à titre non limitatif. Other advantages and features of the invention will appear in the examples and figures which follow, given in a non-limiting manner.
EXEMPLESEXAMPLES
EXEMPLE 1 EXAMPLE 1
Extraction des protéines du complexe LIV21  Extraction of LIV21 complex proteins
La lignée des cellules MCF-7 The cell line MCF-7
La lignée MCF-7 est une lignée humaine non clonale de cellules d'adénocarcinome du sein. Lors de leur différenciation induite par des facteurs exogènes, ces cellules développent une hypertrophie, des protrusions membranaires et une tendance à se dissocier les unes des autres. Elles acquièrent un phénotype sécrétoire se caractérisant par l'apparition de nombreux granules et de canalicules sécrétoires. In vivo, ces cellules sont peu métastasiques et cette invasivité réduite serait due à une faible activité constitutive des protéines kinases C (P Cs) et à un taux peu élevé de l'expression de la protéine kinase C alpha. The MCF-7 line is a non-clonal human breast adenocarcinoma cell line. During their differentiation induced by exogenous factors, these cells develop hypertrophy, membrane protrusions and a tendency to dissociate from each other. They acquire a secretory phenotype characterized by the appearance of numerous granules and secretory canaliculi. In vivo, these cells are not very metastatic and this reduced invasiveness is due to a low constitutive activity of protein kinases C (P Cs) and a low level of expression of protein kinase C alpha.
Cette lignée est utilisée dans de nombreuses études sur la prolifération, la différenciation et l'apoptose. Ces études utilisent des drogues appropriées comme le TNF pour l'induction de l'apoptose, ou le TPA (12 -0 -tetradecanoyl phorbol-13 - SUMOate) pour l'induction de la différenciation et donc pour l'étude de la sortie du cycle cellulaire. This line is used in many studies on proliferation, differentiation and apoptosis. These studies use appropriate drugs such as TNF for the induction of apoptosis, or TPA (12-O-tetradecanoyl phorbol-13-SUMOate) for the induction of differentiation and thus for the study of the cell cycle.
Extraction des protéines du complexe LIV21 Extraction of LIV21 complex proteins
Après culture de cellules MCF7 ( ATCC passage 15) et extraction cellulaire, 5 mg de protéines sont centrifugées après homogénéisation dans 10 ml de tampon RIPA additionné d'antiprotéase. Ces extraits protéiques sont passés en boucle pendant 7 heures à la pompe péristaltique sur une colonne d'affinité ( HITRAP NHS ACTTV HP 1x5 ml : article et catalogue 17071701) où a été fixé l'anticorps LIV 21. Lavages 3 fois 10 ml dans du tampon RIPA puis élution d'une quinzaine de fractions de 500 ni dans du tampon glycine PH2/ HCL, puis contrôle sur gel SDS Page 10% (dépôt de 25 ni de la fraction) suivi d'un immunobuvardage (western blot) de vérification. Révélation d'une bande sur gel à 51 kD encadrée par deux autres bandes à 50 et 52 kD respectivement et trace d'une bande à 80 et lOOkD plus faibles en gel monodimensionnel fig 1A). Par ailleurs révélation de 12 spots entre 50 kD et 70kD en gel bidimensionnel (fig 1B et 2 )
Figure imgf000050_0001
EXEMPLE 2 : Spectrométrie de masse After culturing MCF7 cells (ATCC passage 15) and cell extraction, 5 mg of proteins are centrifuged after homogenization in 10 ml of RIPA buffer supplemented with antiprotease. These protein extracts were looped for 7 hours at the peristaltic pump on an affinity column (HITRAP NHS ACTTV HP 1x5 ml: article and catalog 17071701) where the LIV 21 antibody was fixed. RIPA buffer then elution of fifteen fractions of 500 n in PH2 / HCL glycine buffer, then control on SDS gel (deposition of 25 μl of the fraction) followed by an immunoblotting (western blot) verification. Revelation of a band at 51 kD framed by two other bands at 50 and 52 kD respectively and trace a band at 80 and 100 kD lower in one-dimensional gel fig 1A). In addition, 12 spots between 50 kD and 70 kD in two-dimensional gel are revealed (FIGS. 1B and 2)
Figure imgf000050_0001
EXAMPLE 2 Mass Spectrometry
Une spectrométrie de masse (MALDI) a été réalisée pour la protéine LIV21 et son complexe. La protéine LIV21 (poly nucléotide LIV21F) a été digérée par la trypsine. Les peptides issus de la digestion sont solubilisés dans un solvant : acétonitrile/eau (1/1) contenant 0,1 % TFA (acide trifluoro acétique). Une solution saturée de la matrice alpha cyano-4-hydroxycinnarnique a été préparée dans le même solvant. On a prélevé un même volume des deux solutions, on a mélangé et déposé 1 μΐ sur la plaque de MALDI pour analyse. La spectrométrie de masse a montré que la protéine LIV21 et son complexe digérés par la trypsine met en évidence une centaine de peptides suivant la bande de gel extraite entre 49 et 54 KD et étudiée(cf. Figure 3 à 5). La protéine LIV21 a été caractérisée par un poids moléculaire de 50 kD, mise en évidence par Western Blot et par gel bidimensionnel SDS PAGE (Figure 2). Mais on trouve un produit de lOOkD à 130 kD qui pourrait être un dimère de LIV21.  Mass spectrometry (MALDI) was performed for LIV21 protein and its complex. The LIV21 protein (LIV21F poly nucleotide) was digested with trypsin. The peptides resulting from the digestion are solubilized in a solvent: acetonitrile / water (1/1) containing 0.1% TFA (trifluoroacetic acid). A saturated solution of the alpha cyano-4-hydroxycinnarnic matrix was prepared in the same solvent. The same volume was taken from both solutions, 1 μM was mixed and deposited on the MALDI plate for analysis. Mass spectrometry showed that the LIV21 protein and its complex digested with trypsin revealed a hundred peptides following the band of gel extracted between 49 and 54 KD and studied (see Figure 3 to 5). The LIV21 protein was characterized by a molecular weight of 50 kD, evidenced by Western Blot and two-dimensional gel SDS PAGE (Figure 2). But there is a product of 100kD at 130 kD which could be a dimer of LIV21.
Lorsqu'elle change de compartiment cellulaire et qu'elle est sumoylée, elle a un poids moléculaire de 60kD environ. Lorsqu'elle est phosphorylée dans le cytoplasme, elle présente deux formes différant de quelques kilobases. On observe alors un doublon. When it changes cell compartment and is sumoylated, it has a molecular weight of about 60kD. When it is phosphorylated in the cytoplasm, it presents two forms differing from a few kilobases. We then observe a duplicate.
EXEMPLE 3 : Analyse des séquences dans les bases de données de protéomiqueEXAMPLE 3 Sequence Analysis in the Proteomics Databases
Plusieurs peptides listés dans la demande de brevet la caractérisent : Several peptides listed in the patent application characterize it:
PeptideLIV21b FVFALILALMLSMCG SEQ ID No 51  PeptideLIV21b FVFALILALMLSMCG SEQ ID No 51
PeptideLIV21 b KFFVF ALILALMLSMCGADSHAKR SEQ ID No 5  PeptideLIV21 b KFFVF ALILALMLSMCGADSHAKR SEQ ID NO 5
Par exemple, l'inventeur a obtenu un score très significatif de 81, espéré :0,0012 pour un variant de l'histatine 3-2 avec 52% de recouvrement de séquences entre l'échantillon testé et l'histatine, cette séquence SEQ ID No 5 est commune à LIV21 et à fflS3- For example, the inventor obtained a very significant score of 81, expected: 0.0012 for a variant of histatin 3-2 with 52% recovery of sequences between the tested sample and histatin, this sequence SEQ ID No 5 is common to LIV21 and fflS3-
HUMAN (Figure 6 et 7). En Utilisant une banque différente et un ppm qui diffère de 20 à 50 ppm on obtient la séquence identique pour leur partie commune : SEQ ID No 51 EXEMPLE 4 : HUMAN (Figure 6 and 7). Using a different bank and a ppm that differs from 20 to 50 ppm we obtain the identical sequence for their common part: SEQ ID No 51 EXAMPLE 4
Transcriptions réverses : Reverse transcriptions:
Après décongélation de cellules MCF7 (ATCC passage 15) et culture des cellules jusqu'à 200 Millions, les cellules ont été trypsinées et congelées à - 80°C. Les ARN ont été extraits à partir de deux pools de 50 millions de cellules avec le kit Nucleospin RNA L (Macherey Nagel) réf. 740.962.20 aboutissant à un pool 1 de 318 μg et un deuxième de 182 μ¾.  After thawing MCF7 cells (ATCC passage 15) and culturing cells up to 200 Million cells were trypsinized and frozen at -80 ° C. The RNAs were extracted from two pools of 50 million cells with the Nucleospin RNA L kit (Macherey Nagel) ref. 740,962.20 resulting in a pool 1 of 318 μg and a second pool of 182 μ¾.
Les ARN poly A+ ont été extraits à partir de 313 μg d'ARN totaux du pool 1 à l'aide du kit oligo Tex m RNA Midi kit (Qiagen) réf. 70042.  The poly A + RNAs were extracted from 313 μg of total pool 1 RNA using the kit oligo Tex m RNA Midi kit (Qiagen) ref. 70042.
I Retrotranscriprion : I Retrotranscriprion:
Les ARN ont été rétro transcrits avec la Revert Aid H minus M-MuLV Reverse Transcriptase Fermentas Réf. EP0451 lot 1124 avec 3,64 μg d'ARN totaux et 0,45μ§ ARNm selon les conditions du fournisseur avec une amorce oligo dT. Réactions réalisées à 2 températures différentes à 45°C et 55°C de façon à éliminer les structures des ARN pouvant gêner la rétrotranscription.  The RNAs were retro-transcribed with the Revert Aid H minus M-MuLV Reverse Transcriptase Fermentas Ref. EP0451 lot 1124 with 3.64 μg of total RNA and 0.45 μ mRNA according to the supplier's conditions with an oligo dT primer. Reactions performed at 2 different temperatures at 45 ° C and 55 ° C so as to eliminate the structures of the RNA that may hinder retrotranscription.
II PCR  II PCR
Les PCR ont été effectuées avec les transcriptions réverses comme matrices avec les amorces Al + oligo dT dans un premier temps. Des nested ECR ont été ensuite réalisées sur ces premières PCR avec les amorces Al + Splicing, Al + GDBR1, ou ATG + Splicing, ATG + GDBR1.  The PCRs were performed with the reverse transcripts as templates with primers Al + oligo dT at first. Nested ECRs were then carried out on these first PCRs with primers Al + Splicing, Al + GDBR1, or ATG + Splicing, ATG + GDBR1.
Amplification par PCR avec les amorces spécifiques des gènes à détecter à partir des ADNc obtenus après RT oligo dT.  Amplification by PCR with the specific primers of the genes to be detected from the cDNAs obtained after RT oligo dT.
Enzyme : polymérase Taq DNA polymerase Fermentas. Thermocycler : Bio-Rad iCycler.  Enzyme: Taq DNA polymerase polymerase Fermentas. Thermocycler: Bio-Rad iCycler.
La qualité des ADNc a été testée par une amplification de gènes de ménage GAPDH, b- actine et Histone H3.3  The quality of the cDNAs was tested by amplification of household genes GAPDH, b-actin and Histone H3.3
TABLEAU 1 TABLE 1
Amorces
Figure imgf000052_0001
Figure 16 : Gel 5 : ligature criblage sur les cinq nouveaux clones primers
Figure imgf000052_0001
Figure 16: Gel 5: screening ligation on the five new clones
Figure 17 : Gel 6 Criblage des clones recombinants S55T et S55M et  Figure 17: Gel 6 Screening of the recombinant clones S55T and S55M and
anal ses des masses moléculaires.
Figure imgf000053_0001
analgesics of molecular masses.
Figure imgf000053_0001
Gel 2 : Gel 2:
PCR réalisées à partir de matrices PCR effectuées avec les amorces Al + oligo dT sur les RT réalisées à 45°C sur les ARN totaux et poly A+ (messagers). Les amorces utilisées pour ces PCR sont Al + G ou Al + Splicing reverse). PCRs made from PCR matrices carried out with the Al + oligo dT primers on the RTs carried out at 45 ° C. on the total and poly A + (messenger) RNAs. The primers used for these PCRs are Al + G or Al + Splicing reverse).
. Sur les RT effectuées à partir des ARN totaux, il y a une amplification d'une bande de 1178-1253 pb avec les amorces Al + G et Al + Splicing reverse. Les ARN poly A ont été utilisés pour réaliser là RT et sont faiblement observés à la taille (figure 10) de 1400 pb pour une amplification avec les amorces A1+ G et de 415 pb avec les amorces Al + Splicing reverse. Dans le produit PCR Al + splicing il y a d'autres bandes de 860 et 233 pb (figure 11). Gel 3 :  . On the RTs carried out from the total RNAs, there is an amplification of a band of 1178-1253 bp with primers Al + G and Al + Splicing reverse. Poly A RNAs were used to carry out RT and are poorly observed at size (FIG. 10) of 1400 bp for amplification with A1 + G primers and 415 bp with Al + Splicing reverse primers. In the PCR product Al + splicing there are other bands of 860 and 233 bp (FIG. 11). Gel 3:
PCR réalisées à partir de matrices PCR effectuées avec les amorces Al + oligo dT sur les RT réalisées à 45 °C sur les ARN totaux et poly A+ (messagers). Les amorces utilisées pour ces PCR sont Al + GDBR1 ou Al + Splicing reverse).Figure 12  PCRs made from PCR matrices carried out with the Al + oligo dT primers on the RTs carried out at 45 ° C. on the total and poly A + (messenger) RNAs. The primers used for these PCRs are Al + GDBR1 or Al + Splicing reverse).
Pour les PCR réalisées à partir de RT faites à 55°C on retrouve globalement le même pattern de bandes que celui obtenu à partir des RT faites à 45 °C. For the PCRs made from RT made at 55 ° C we find generally the same band pattern as that obtained from the RTs made at 45 ° C.
On n'observe pas d'amplification spécifique lorsque les ARN poly A ont été utilisés pour réaliser la RT. Sur les RT effectuées à partir des ARN totaux, on trouve une bande majeure de 1554-1609 pb avec les amorces Al + GDBR1 et Al + Splicing reverse. Specific amplification was not observed when poly A RNAs were used to perform RT. On the RTs made from the total RNAs, there is a major band of 1554-1609 bp with primers Al + GDBR1 and Al + Splicing reverse.
Nous attendons une bande à la taille théorique de 1455 pb pour une amplification avec les amorces A1+ GDBR1 et de 415 pb avec les amorces Al + Splicing reverse. Dans les Piste 8 : ligatures S55T We expect a band at the theoretical size of 1455 bp for amplification with primers A1 + GDBR1 and 415 bp with primers Al + Splicing reverse. In the Track 8: S55T ligatures
Les clones recombinants obtenus ont été criblés (après extraction de l'ADN plasmidique) par restriction avec l'enzyme Eco RI dont les sites encadrent le site d'insertion des produits PCR dans le vecteur pGEMT Easy. The recombinant clones obtained were screened (after extraction of the plasmid DNA) by restriction with the Eco RI enzyme whose sites flank the insertion site of the PCR products into the pGEMT Easy vector.
Criblages des clones recombinants : Screening of recombinant clones:
Les premières expériences avaient été faites à partir des dix clones B et des dix clones C Figure 14 et 15 et les résultats des séquences du clone B2 et C8 sont donnés dans l'exemple suivant et ont par comparaison de séquences entre clones une grande homologie avec les clones de la deuxième série d'expériences.  The first experiments were made from the ten B clones and ten C clones Figure 14 and 15 and the results of the B2 and C8 clone sequences are given in the following example and have by comparison of sequences between clones a great homology with the clones of the second series of experiments.
Gel 5 : criblage des clones recombinants S45 Tet G45 T Gel 5: Screening of the S45 Tet G45 T recombinant clones
Analyse des masses moléculaires Molecular weight analysis
Le criblage des clones par Eco RI montre que sur les 9 clones S45T, 3 possèdent des inserts de lOOpb, 216 pb et 410 pb.  The screening of the clones by Eco RI shows that of the 9 clones S45T, 3 have inserts of 100bp, 216bp and 410bp.
Sur les clones G45T, sur les 6 clones testés, 3 possèdent des inserts de 57, 71 et 148 pb. Figure 17 : Criblage des clones recombinants S55T et S55M  On the G45T clones, of the 6 clones tested, 3 have inserts of 57, 71 and 148 bp. Figure 17: Screening of the S55T and S55M recombinant clones
Analyse des masses moléculaires Molecular weight analysis
Le criblage par Eco RI montre que sur les 13 clones criblés, 7 possèdent des inserts de tailles comprises entre 239 et 637 pb.  Screening with Eco RI shows that of the 13 clones screened, 7 have inserts of sizes between 239 and 637 bp.
Les clones G45T5 (148 pb), S45T9 (410 pb), S45T3 (100 pb), S55M1 (491 pb), S55T6 (251 pb) et S55T9 (637 pb) ont été extraits pour être séquencés.  Clones G45T5 (148bp), S45T9 (410bp), S45T3 (100bp), S55M1 (491bp), S55T6 (251bp) and S55T9 (637bp) were extracted for sequencing.
Amorces utilisées pour trouver les Séquences des différents clones sont décrites dans le patent in listing: Primers used to find sequences of different clones are described in the patent in listing:
ATG galgal 5'-atgtatattatatatctaa-3' INV COMP ttagatatataatatacat  ATG galgal 5'-atgtatattatatatctaa-3 'INV COMP ttagatatataatatacat
Splicing reverse 5'- -3' et Splicing reverse 5'- -3* inv comp Splicing reverse 5'- -3 'and Splicing reverse 5'- -3 * inv comp
GDBR1 reverse 5*- -3' et GDBR1 reverse 5'- -3' inv comp 2 profils on trouve des bandes très nettes de 1900-2100 pb et de 1000-1300 pb mais d'intensité inférieure à celle de la bande de 1500-1600 pb. GDBR1 reverse 5 * - -3 'and GDBR1 reverse 5'- -3' inv comp 2 profiles are very sharp bands of 1900-2100 bp and 1000-1300 bp but of lower intensity than that of the 1500-1600 bp band.
Dans le produit PCR Al + splicing reverse il y a une autre bande majeure de 263 pb. Gel 4 :  In the PCR product Al + splicing reverse there is another major band of 263 bp. Gel 4:
Nested PCR réalisées à partir des matrices PCR effectuées avec les amorces Al + GDBRl ou Al + Splicing reverse) sur les RT réalisées à 45°C sur les ARN totaux et poly A+ (messagers). Les amorces utilisées pour ces PCR sont ATG + GDBRl ou ATG + Splicing reverse). Figure 13 Nested PCRs made from the PCR matrices performed with primers Al + GDBR1 or Al + Splicing reverse) on RTs performed at 45 ° C on total RNA and poly A + (messengers). The primers used for these PCRs are ATG + GDBR1 or ATG + Splicing reverse). Figure 13
Les nested PCR réalisées avec les amorces ATG + GDBRl donnent des bandes à 1213 pb (RT 45°C) et 1559 + 1315 pb (RT à 55°C) la taille théorique attendue est de 1455 pb. Les PCR effectuées avec les amorces ATG + Splice reverse donnent des profils de bandes plus variés.  The nested PCRs performed with the ATG + GDBR1 primers give 1213 bp (RT 45 ° C) and 1559 + 1315 bp (RT at 55 ° C) bands, the expected theoretical size is 1455 bp. PCRs performed with the ATG + Splice reverse primers give more varied band profiles.
Ces PCR réalisées à partir d'autres PCR faites avec les amorces Al + GDBRl ou Al + Splicing reverse.  These PCRs made from other PCRs made with primers Al + GDBRl or Al + Splicing reverse.
On note la présence d'une bande de 400 pb dans les profils obtenus à partir d'ARN messagers (la bande obtenue à partir de la transcription réverse réalisée à 55°C est de plus forte intensité). The presence of a 400 bp band in the profiles obtained from messenger RNAs is noted (the band obtained from the reverse transcription carried out at 55 ° C. is of higher intensity).
Les profils des PCR ATG + Splice reverse réalisées avec au départ des ARN totaux donnent une bande de 424-437 pb d'intensité très forte. On y trouve également de bandes de 614 et 783 pb de très forte intensité dans le profil de la RT 45 et des bandes plus nombreuses mais d'intensité moindre dans le profil de la RT 55 bandes à 1118, 936 et 749 pb.  The profiles of the ATG + Splice reverse PCR carried out with total RNAs give a band of 424-437 bp of very strong intensity. There are also bands of 614 and 783 bp of very high intensity in the profile of the RT 45 and more numerous bands but of lower intensity in the profile of the RT 55 bands at 1118, 936 and 749 bp.
On a cloné et séquencé les produits de ces différentes PCR.  The products of these different PCRs were cloned and sequenced.
EXEMPLE 5 : EXAMPLE 5
Les produits PCR des pistes 2, 4, 6, 7 et 8 ont été ligaturés avec le plasmide pGEMTThe PCR products of lanes 2, 4, 6, 7 and 8 were ligated with plasmid pGEMT
Easy Promega et criblage des clones recombinants.Figure 16 Easy Promega and screening of recombinant clones.Figure 16
Piste 2 : ligatures G45T  Track 2: G45T ligatures
Piste 4 : ligatures S45T  Lane 4: S45T ligatures
Piste 6 : ligatures G55T  Track 6: ligatures G55T
Piste 7 : ligatures S55M fragments clones. Track 7: ligatures S55M cloned fragments.
Le test des biomarqueurs sur des extraits de neuroblastomes et de cultures cellulaires SHS Y révèle par RT PCR le jeu de sous expression et de sur expression suivant dans cet exemple d'analyse : The biomarker test on extracts of neuroblastomas and SHS Y cell cultures reveals by RT PCR the following expression and expression set in this analysis example:
Exemple de 16 biomarqueurs d'intérêt analysés par RT PCR qui recoupe les résultats obtenus par biopuce sur le sensorchip permettant de voir par SPR la surexpression et la sousexpression de certains gènes du complexe Liv21 et de ses partenaires d'interaction pour exemple. Example of 16 biomarkers of interest analyzed by RT PCR which cross-checks the results obtained by biochip on the sensorchip allowing SPR to see the overexpression and the under-expression of certain genes of the Liv21 complex and its interaction partners for example.
On observe une sous expression de D K1, SKP2.DKK3, ID2, p21, SKP2.TP53INP1, ED2JP73 alors qu'on observe une sur expression de MYCN, AL , NLRR1 (le neuronal leucine rich repeat est transactivé), CRABPII, DDX1, LIV21K, AURORA kinase A.  Under-expression of DK1, SKP2.DKK3, ID2, p21, SKP2.TP53INP1, ED2JP73 is observed while over-expression of MYCN, AL, NLRR1 (the leucine rich repeat neural is transactivated), CRABPII, DDX1, is observed. LIV21K, AURORA kinase A.
EXEMPLE 6 : A partir du clonage du gène LIV21 décrit ci-dessus, les séquences nouvelles sont étudiées pour dessiner les si RNA (cf. listing des si RNA et figure 19) les plus spécifiques et efficaces pour créer le « silencing » du gène c'est-à-dire inhiber son expression. Sachant que l'efficacité de inhibition à chaque injection de siRNA reste courte c'est-à-dire le plus souvent moins d'une heure. L'inventeur a développé des produits diagnostiques et des produits thérapeutiques à partir de ce même outil qu'est le siRNA. EXAMPLE 6 From the cloning of the LIV21 gene described above, the new sequences are studied to draw the si RNA (see listing of si RNA and Figure 19) the most specific and effective to create the "silencing" of the c gene. that is to say, to inhibit its expression. Knowing that the inhibition efficiency with each injection of siRNA remains short, that is to say most often less than one hour. The inventor has developed diagnostic products and therapeutic products from the same tool that is siRNA.
EXEMPLE 6.1 : L'inventeur utilise des si RNA marqués à la rhodamine ou fJuoresceine ou tout autre marqueur pouvant être révélé et suivi par observation optique, par un microscope afin de localiser l'endroit dans les cellules, tissus ou échantillon marqué où va se diriger le si RNA marqué afin de s'accrocher à la séquence spécifique qui le caractérise et ainsi signaler le lieu de l'expression de l'ARN messager du gène d'intérêt Ainsi le si RNA spécifique peut être utilisé comme marqueur diagnostic comme le serait un anticorps et permettre de localiser dans un cas particulier comme sur des extemporanés ou tout type d'échantillon prélevé sur un patient par exemple échantillon de tissu cancéreux, la fluorescence pou tout autre marquage utilisé sur le si RNA et retrouvé dans un compartiment cellulaire sur l'échantillon. EXAMPLE 6.1: The inventor uses rhodamine or fluorescein-labeled RNAs or any other marker which can be revealed and monitored by optical observation, by a microscope in order to locate the place in the cells, tissues or labeled sample where will be directed if labeled RNA in order to cling to the specific sequence that characterizes it and thus signal the place of expression of the messenger RNA of the gene of interest Thus the specific if RNA can be used as a diagnostic marker as would be a antibodies and allow to locate in a particular case as on extemporaneous or any type of sample taken from a patient for example sample of cancerous tissue, the fluorescence for any other labeling used on the si RNA and found in a cell compartment on the sample.
Ainsi un si RNA marqué de LIV21 (figure 19) se trouvant dans les noyaux cellulaires sous microscope à la périphérie d'une exérèse chirurgicale signerait un diagnostic Thus, if a labeled RNA of LIV21 (FIG. 19) found in the cell nuclei under a microscope at the periphery of a surgical excision would sign a diagnosis
5 d'exérèse totale du tissu cancéreux, en revanche, ce même marqueur retrouvé dans le cytoplasme ou les membranes de ce même échantillon obligerait le chirurgien à faire une exérèse élargie dans l'immédiat si ce test peut être pratiqué en salle d'opération en direct ce qui serait le meilleur cas pour retirer toutes les cellules cancéreuses visibles seulement à cette échelle moléculaire et cellulaire grâce à ce marqueur siRNA. CeHowever, the same marker found in the cytoplasm or the membranes of this same sample would require the surgeon to perform an immediate enlarged excision if this test can be performed in the operating room. direct which would be the best case to remove all visible cancer cells only at this molecular and cellular level thanks to this siRNA marker. This
) pourrait être une alternative plus rapide d'exécution que l'autre application que l'inventeur a développée avec l'anticorps ou le peptide LIV21 qui peut être utilisé de la même manière. ) could be a faster execution alternative than the other application that the inventor developed with the LIV21 antibody or peptide that can be used in the same way.
EXEMPLE 6.2 : pour les produits thérapeutiques qui découlent directement des observations faites grâce aux résultats d'expression des biomarqueurs sur les biopuces , ί l'intérêt est bien illustré par l'exemple du TGF Béta et de p27 :  EXAMPLE 6.2: for therapeutic products that directly result from observations made by biomarker expression results on biochips, the interest is well illustrated by the example of TGF beta and p27:
La publication de Mr. Lecanda J et Gold Li de Mars 2009 est riche d'enseignement et illustre très bien tout l'intérêt des biopuces pharmaco diagnostiques telles que décrites ci-dessus.  The publication of Mr. Lecanda J and Gold Li of March 2009 is rich in teaching and illustrates very well the interest of pharmaco-diagnostic biochips as described above.
TGFBéta inhibe la prolifération cellulaire en augmentant le niveau de p27 via i l'activation des facteurs de transcription smad 2/3.  TGFBeta inhibits cell proliferation by increasing the level of p27 via the activation of smad 2/3 transcription factors.
Le TGFbéta augmente le niveau total de translocation de p27 dans le noyau donc accumule p27dans le noyau cellulaire a travers l'activation de smad 2 et smad 3.  TGFbeta increases the total level of translocation of p27 in the nucleus thus accumulates p27 in the cell nucleus through the activation of smad 2 and smad 3.
Tous ces événements sont bloqués par un inhibiteur de TGFbeta RI: serine kinase SD208 nouvel axe thérapeutique ciblée pour les porteurs  All these events are blocked by an inhibitor of TGFbeta RI: serine kinase SD208 new therapeutic axis targeted for carriers
TGFBeta diminue le niveau des composants skp2 par rapport à la protéine mais pas le niveau de mRNA.  TGFBeta decreases the level of skp2 components relative to the protein but not the level of mRNA.
TGFbeta peut médier la dégradation de p27 dans le protéasome donc au niveau protéique car il le maintient dans le noyau mais en revanche l'inhibition de la transcription de p27 avec un siRNA spécifique bloque TGF beta. TGFBeta prévient la dégradation proteasomale de la kinase cycle dépendante inhibiteur de p27. (Alvarez Rodriguez R Pon S J celle sci 2009 Mars 1-122). TGFbeta can mediate the degradation of p27 in the proteasome, therefore at the protein level because it maintains it in the nucleus, but on the other hand the inhibition of p27 transcription with a specific siRNA blocks TGF beta. TGFBeta prevents the proteasomal degradation of the p27 inhibitory cycle kinase inhibitor. (Alvarez Rodriguez R Pon SJ that sci 2009 March 1-122).
L'expression du gène proneural codant pour Mash 1 supprime MYCN (activité mitotique).  The expression of the proneural gene encoding Mash 1 suppresses MYCN (mitotic activity).
(2009 Liu W Wuz Guan M, Lu Y.)  (Liu Wu Wuz Guan M, 2009, Lu Y.)
L'inventeur utilise les si RNA du complexe LIV21 marqués dans un premier temps pour objectiver leur présence attendue dans le compartiment cellulaire et les visualiser puis les si RNA LIV21 non marqués dans un deuxième temps pour leur action purement thérapeutique, dans un cas particulier une injection de si RNA (fig 1 ) dans un tissu en neurodégenerescence ou par une voie d'abord qui permette au si RNA d'atteindre le tissu en neurodégénerescence (ex oreille, oeil etc..) et d'agir en permettant la prolifération jusqu'à l'apoptose et donc la mort de la cellule en neurodégénerescence. Une expérience sur cultures cellulaires humaines puis sur modèles animaux ayant une rétinopathie engendrant une dégénérescence vitréorétinienne (injection du siRNA directe dans l'œil) permet d'illustrer cette méthode.  The inventor uses the if RNA of the complex LIV21 labeled in a first time to objectify their expected presence in the cell compartment and to visualize them then if RNA LIV21 unlabeled in a second time for their purely therapeutic action, in a particular case an injection of if RNA (FIG. 1) in a neurodegenerative tissue or by a pathway that allows if the RNA to reach the tissue in neurodegeneration (ex-ear, eye, etc.) and to act by allowing proliferation up to to apoptosis and thus the death of the cell in neurodegeneration. An experiment on human cell cultures then on animal models with retinopathy generating vitreoretinal degeneration (injection of direct siRNA in the eye) can illustrate this method.
Les siRNA sont aussi transfectés dans les cellules selon le protocole Invitrogen utilisant la lipofectamine 2000.  SiRNAs are also transfected into cells according to the Invitrogen protocol using lipofectamine 2000.
L'étude du rôle spécifique des PKC epsilon sur la translocation nucléaire de Liv 21F peut utiliser un peptide qui inhibe la fonction PKC epsilon et la translocation comme précédemment décrit mais aussi selon le protocole de référence des Si RNA de PKC epsilon. Le profil d'expression observé correspond à un doublet de bandes dans le cytoplasme à environ SI K (et à une bande de 64 kD suivant les siRNA utilisés) alors qu'il ne correspond qu'à une simple bande à 50kD dans la fraction nucléaire.  The study of the specific role of PKC epsilon on the nuclear translocation of Liv 21F can use a peptide that inhibits PKC epsilon function and translocation as previously described but also according to the PKC epsilon Si RNA reference protocol. The expression profile observed corresponds to a doublet of bands in the cytoplasm at approximately SI K (and at a 64 kD band according to the siRNAs used) whereas it corresponds only to a single band at 50 kD in the nuclear fraction .
Les molécules de siRNA issues des séquences nucléotidiques du complexe Liv21 peuvent êtr choisies dans le groupe constitué des molécules de siRNA comprenant l'une quelconque des séquences SEQ ID N°l 19 à 126 et 171 à 175, et SEQ ID N° - l'utilisation d'une multithérapie basée sur la combinaison de plusieurs de ces siRNA pour le traitement de la pathologie cancéreuse ou neurodégénérative. Ces siRNA et la combinaison utile déduite des résultats de sur expression et de sous expression des biopuces et des RT PCR constituent un traitement adjuvant de la pathologie et peuvent être combinés à de petites doses de molécules chimiques ayant déjà fait leurs preuves dans le traitement de la pathologie. The siRNA molecules derived from the nucleotide sequences of the Liv21 complex may be selected from the group consisting of siRNA molecules comprising any one of SEQ ID NO: 19 to 126 and 171 to 175, and SEQ ID NO: 1. use of combination therapy based on the combination of several of these siRNAs for the treatment of cancer or neurodegenerative pathology. These siRNAs and the useful combination deduced from the results of over expression and under expression of biochips and RT PCR constitute an adjuvant treatment of the pathology and can to be combined with small doses of chemical molecules that have already been proven in the treatment of pathology.
EXEMPLE 7 : test pharmaco diagnostique EXAMPLE 7 Pharmaco Diagnostic Test
A partir des observations qui suivent en annexe à la fin de la description de l'exemple sur les propriétés du complexe LIV21 , un design de test pharmaco -diagnostic applicable en clinique a été conçu par l'inventeur avec des moyens techniques connus qui peuvent être déclinés différemment suivant les utilisateurs et correspondre pour chaque mode a un produit nouveau. L'invention réside dans la fabrication de puces diagnostiques à ADN, protéines et à anticorps comprenant les anticorps connus des différentes protéines du complexe associé suivant les phases du cycle cellulaire à LIV21 c'est-à-dire les anticorps,peptides ou séquences nucléotidiques des gènes : de RBP2, E2F4, * E2Fl,SUMO, INT2, CRB2, HDAC1, TGFbeta, integrine_alpha5 beta2,Myob, MyoD, cycE/cdk2,cdkl, chkl , chk2, T Falpha,CREBl et p300, Rb, pl07, pl30 de la familles des pockets protéines. Mais aussi NFkB , cdc2A, mdm2, p21, p53, p65,p 73 RAS,Ki67, CAF1. Les puces à protéines (figure 20) permettront d'étudier les surexpressions ou sous expressions des produits des gènes, les interactions protéiques et les modifications post traductionnelles, plus particulièrement les phosphorylations et méthylations de certaines protéines, qui signent un état caractéristique de la cellule malade différent des interactions protéiques et du métabolisme de la cellule saine. L'état d'expression et de silencing de certains gènes étant différent.  From the observations which follow in the appendix at the end of the description of the example on the properties of the LIV21 complex, a clinically applicable pharmaco-diagnostic test design has been designed by the inventor with known technical means which can be differed according to the users and correspond for each mode to a new product. The invention lies in the manufacture of DNA, protein and antibody diagnostic chips comprising the known antibodies of the various proteins of the associated complex according to the phases of the cell cycle at LIV21, that is to say the antibodies, peptides or nucleotide sequences of the genes: RBP2, E2F4, * E2F1, SUMO, INT2, CRB2, HDAC1, TGFbeta, integrin_alpha5 beta2, Myob, MyoD, cycE / cdk2, cdk1, chk1, chk2, T Falpha, CREB1 and p300, Rb, p107, p130 the families of the protein pockets. But also NFkB, cdc2A, mdm2, p21, p53, p65, p 73 RAS, Ki67, CAF1. The protein chips (Figure 20) will be able to study the overexpression or expression of gene products, protein interactions and post-translational modifications, especially the phosphorylations and methylations of certain proteins, which signify a characteristic state of the diseased cell. different from protein interactions and healthy cell metabolism. The state of expression and silencing of certain genes being different.
Exemple 7.1 : puce pharmaco diagnostic (Figure 20) conçue à partir de séquences nucléotidiques ou peptidiques fixées sur les supports classiques et selon les techniques connues type Agilent ou Affymetrix ou Caliper sans restriction à celles-ci et correspondant aux séquences connues des gènes suivant et listés par ailleurs dans le brevet en utilisant de préférence les séquences qui en analyse 3D présentent une structure 3D de préférence type loop (lOOpb) ou hélix loop hélix ou loop basique (environ 400pb) ou doigt de zinc ou encore une conformation 3D similaire à une hélice correspondant le plus souvent à des sites fonctionnels, ou encore des séquences nucléotidiques correspondant à une zone de méthylation d'une cytosine, méthylation de la région promotrice du gène entraînant un potentiel silcncing (cf bibliographie générale) ainsi qu'aux séquences nouvelles des gènes de LIV21F et LIV21 listées dans la description et en annexe mais aussi des séquences communes à certains oncogènes et à certains virus qu'on pense impliqués en particulier dans le cancer du sein des populations chinoises :EXAMPLE 7.1 Pharmaco Diagnostic Chip (FIG. 20) Designed on the basis of nucleotide or peptide sequences fixed on conventional supports and according to the known Agilent or Affymetrix or Caliper type techniques without restriction to them and corresponding to the known sequences of the following and listed genes Furthermore, in the patent, preferably using the sequences which in 3D analysis have a 3D structure, preferably of the loop (100bp) or helix loop helix or basic loop (approximately 400bp) or zinc finger type, or else a 3D conformation similar to a helix. most often corresponding to functional sites, or nucleotide sequences corresponding to a methylation zone of a cytosine, methylation of the promoter region of the gene resulting in a silcncing potential (see general bibliography) as well as to new sequences of the genes of LIV21F and LIV21 listed in the description and in the appendix, but also sequences common to certain oncogenes and certain viruses that are thought to be involved, particularly in breast cancer of Chinese populations:
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G A VTSSNIAA ; DLDQS V ; EGF et HPV 16 ; EW RLD ; KNSLD ; MfflESLDS 9ôfrÇ Qui pourront aussi être testées en microfluidique fixés sur la lame d'or pour étudier les interactions protéiques avec les extraits cellulaires de la patiente.  G A VTSSNIAA; DLDQS V; EGF and HPV 16; EW RLD; KNSLD; MfflESLDS 9ôfrÇ Who can also be tested in microfluidics fixed on the gold slide to study the protein interactions with the cell extracts of the patient.
Mais qui peuvent aussi être étudiées par une technique MICAM appliquée à des biopuces qui maintiennent sur leur surface (cavités) les biomarqueurs par effet piezo électrique et non pas par fixation physico chimique. But which can also be studied by a MICAM technique applied to biochips that maintain on their surface (cavities) the biomarkers by electric piezo effect and not by physicochemical fixation.
Exemple 7.2 : test en microfluidique, par exemple type Biacore, utilisant la technique S.P.R. (surface plasmonique résonance) connue de l'homme de métier à base d'un support fixé avec une pellicule d'or permettant une fois le faisceau lumineux envoyé vers l'interface d'obtenir une énergie absorbée fonction de la présence et de la taille des complexes protéiques (si interaction protéine protéine ou protéine anticorps) ou des complexes protéiques ADN (si interaction protéine ADN), ou ARN ou protéine ou peptide, et une onde évanescente perpendiculaire à l'axe de l'interface (utilisation d'un prisme). L'inventeur fixe les séquences choisies peptide ou ADN sur les particules d'or et calcule pour chaque complexe d'interaction étudié, le nombre de rU fonction de la taille des molécules citées dans ce brevet En microfluidique le liquide passant sur ces puces à lame d'or peut être aussi bien un extrait cellulaire (voir sélectif c'est-à-dire uniquement noyaux cellulaires ou uniquement cytoplasmes cellulaires ou uniquement protéines du cytosqueiette etc... suivant des techniques d'extraction et de séparation de fractionnement type Calbiochem :subcellular proteom extraction ou bien des extraits ùssulaires ou cellulaires sans préparation autre que des anti protéases ou bien encore du liquide céphalo rachidien ou du sérum issu d'un prélèvement d'un patient pour étudier EXEMPLE 6 : A partir du clonage du gène LIV21 décrit ci-dessus, les séquences nouvelles sont étudiées pour dessiner les si RNA (cf. listing des si RNA et figure 19) les plus spécifiques et efficaces pour créer le « silencing » du gène c'est-à-dire inhiber son expression. Sachant que l'efficacité de l'inhibition à chaque injection de siRNA reste courte c'est-à-dire le plus souvent moins d'une heure. L'inventeur a développé des produits diagnostiques et des produits thérapeutiques à partir de ce même outil qu'est le siRNA. EXAMPLE 7.2 Microfluidic Test, for example Biacore Type, Using the SPR Technique (Resonance Plasmon Surface) Known to a person skilled in the art based on a support fixed with a gold film allowing once the light beam sent to the interface to obtain energy absorbed depending on the presence and size of the protein complexes (whether protein protein or antibody protein interaction) or protein complexes DNA (if DNA protein interaction), or RNA or protein or peptide, and a wave evanescent perpendicular to the axis of the interface (use of a prism). The inventor fixes the chosen peptide or DNA sequences on the gold particles and calculates for each interaction complex studied, the number of rU depending on the size of the molecules mentioned in this patent. In microfluidic liquid passing on these chips with a blade gold can be both a cellular extract (see selective only cell nuclei or only cellular cytoplasm or only cytosque proteins etc ... according to fraction extraction and separation techniques Calbiochem type: subcellular proteom extraction or else cellular or cellular extracts without preparation other than anti proteases or else cerebrospinal fluid or serum derived from a sample of a patient to study EXAMPLE 6 From the cloning of the LIV21 gene described above, the new sequences are studied to draw the si RNA (see listing of si RNA and Figure 19) the most specific and effective to create the "silencing" of the c gene. that is to say, to inhibit its expression. Knowing that the effectiveness of the inhibition with each injection of siRNA remains short, that is to say most often less than one hour. The inventor has developed diagnostic products and therapeutic products from the same tool that is siRNA.
EXEMPLE 6.1 : L'inventeur utilise des si RNA marqués à la rhodamine ou fluoresceine ou tout autre marqueur pouvant être révélé et suivi par observation optique, par un microscope afin de localiser l'endroit dans les cellules, tissus ou échantillon marqué où va se diriger le si RNA marqué afin de s'accrocher à la séquence spécifique qui le caractérise et ainsi signaler le lieu de l'expression de TARN messager du gène d'intérêt. Ainsi le si RNA spécifique peut être utilisé comme marqueur diagnostic comme le serait un anticorps et permettre de localiser dans un cas particulier comme sur des extemporanés ou tout type d'échantillon prélevé sur un patient par exemple échantillon de tissu cancéreux, la fluorescence pou tout autre marquage utilisé sur le si RNA et retrouvé dans un compartiment cellulaire sur l'échantillon.  EXAMPLE 6.1: The inventor uses rhodamine or fluorescein labeled siRNAs or any other marker that can be revealed and monitored by optical observation, by a microscope in order to locate the place in the cells, tissues or labeled sample where will be directed if labeled RNA in order to cling to the specific sequence that characterizes it and thus signal the place of expression of messenger RNA of the gene of interest. Thus, if the specific RNA can be used as a diagnostic marker as would be an antibody and allow to locate in a particular case as extemporaneous or any type of sample taken from a patient for example sample of cancerous tissue, fluorescence for any other labeling used on the si RNA and found in a cell compartment on the sample.
Ainsi un si RNA marqué de LIY21 (figure 19) se trouvant dans les noyaux cellulaires sous microscope à la périphérie d'une exérèse chirurgicale signerait un diagnostic d'exérèse totale du tissu cancéreux, en revanche, ce même marqueur retrouvé dans le cytoplasme ou les membranes de ce même échantillon obligerait le chirurgien à faire une exérèse élargie dans l'immédiat si ce test peut être pratiqué en salle d'opération en direct ce qui serait le meilleur cas pour retirer toutes les cellules cancéreuses visibles seulement à cette échelle moléculaire et cellulaire grâce à ce marqueur siRNA. Ce pourrait être une alternative plus rapide d'exécution que l'autre application que l'inventeur a développée avec l'anticorps ou le peptide LIV21 qui peut être utilisé de la même manière.  Thus, if a labeled RNA of LIY21 (FIG. 19) found in the cell nuclei under a microscope at the periphery of a surgical excision would signify a diagnosis of total excision of the cancerous tissue, on the other hand, this same marker found in the cytoplasm or Membranes of this same sample would require the surgeon to perform an immediate expanded resection if this test can be performed in the live operating room which would be the best case to remove all visible cancer cells only at this molecular and cellular level thanks to this siRNA marker. This could be a faster alternative of performance than the other application that the inventor developed with the LIV21 antibody or peptide that can be used in the same way.
EXEMPLE 6.2 : pour les produits thérapeutiques qui découlent directement des observations faites grâce aux résultats d'expression des biomarqueurs sur les biopuces , l'intérêt est bien illustré par l'exemple du TGF Béta et de p27 : La publication de Mr. Lecanda J et Gold Li de Mars 2009 est riche d'enseignement et illustre très bien tout l'intérêt des biopuces pharmaco diagnostiques telles que décrites ci-dessus. EXAMPLE 6.2: for the therapeutic products that result directly from observations made by biomarker expression results on biochips, the interest is well illustrated by the example of TGF beta and p27: The publication of Mr. Lecanda J and Gold Li of March 2009 is rich in teaching and illustrates very well the interest of pharmaco-diagnostic biochips as described above.
TGFBéta inhibe la prolifération cellulaire en augmentant le niveau de p27 via l'activation des facteurs de transcription smad 2/3.  TGFBeta inhibits cell proliferation by increasing the level of p27 via the activation of smad 2/3 transcription factors.
Le TGFbéta augmente le niveau total de translocation de p27 dans le noyau donc accumule p27dans le noyau cellulaire a travers l'activation de smad 2 et smad 3.  TGFbeta increases the total level of translocation of p27 in the nucleus thus accumulates p27 in the cell nucleus through the activation of smad 2 and smad 3.
Tous ces événements sont bloqués par un inhibiteur de TGFbeta RI: serine kinase SD208 nouvel axe thérapeutique ciblée pour les porteurs All these events are blocked by an inhibitor of TGFbeta RI: serine kinase SD208 new therapeutic axis targeted for carriers
TGFBeta diminue le niveau des composants skp2 par rapport à la protéine mais pas le niveau de mRNA. TGFBeta decreases the level of skp2 components relative to the protein but not the level of mRNA.
TGFbeta peut médier la dégradation de p27 dans le protéasome donc au niveau protéique car il le maintient dans le noyau mais en revanche l'inhibition de la transcription de p27 avec un siR A spécifique bloque TGF beta.  TGFbeta can mediate the degradation of p27 in the proteasome, therefore at the protein level because it maintains it in the nucleus, but on the other hand the inhibition of p27 transcription with a specific siR A blocks TGF beta.
TGFBeta prévient la dégradation proteasomale de la kinase cycle dépendante inhibiteur de p27. (Alvarez Rodriguez R Pon S J celle sci 2009 Mars 1-122). TGFBeta prevents the proteasomal degradation of the p27 inhibitory cycle kinase inhibitor. (Alvarez Rodriguez R Pon S J that sci 2009 March 1-122).
L'expression du gène proneural codant pour Mash 1 supprime MYCN (activité mitotique). The expression of the proneural gene encoding Mash 1 suppresses MYCN (mitotic activity).
(2009 Liu W Wuz Guan M, Lu Y.)  (Liu Wu Wuz Guan M, 2009, Lu Y.)
L'inventeur utilise les si RNA du complexe LIV21 marqués dans un premier temps pour objectiver leur présence attendue dans le compartiment cellulaire et les visualiser puis les si RNA LIV21 non marqués dans un deuxième temps pour leur action purement thérapeutique, dans un cas particulier une injection de si RNA (fig 19) dans un tissu en neurodégenerescence ou par une voie d'abord qui permette au si RNA d'atteindre le tissu en neurodégénerescence (ex oreille, oeil etc..) et d'agir en permettant la prolifération jusqu'à l'apoptose et donc la mort de la cellule en neurodégénerescence. Une expérience sur cultures cellulaires humaines puis sur modèles animaux ayant une rétinopathie engendrant une dégénérescence vitréorétinienne (injection du siRNA directe dans l'oeil) permet d'illustrer cette méthode. Les siRNA sont aussi transfectés dans les cellules selon le protocole Invitrogen utilisant }a lipofectamine 2000. The inventor uses the if RNA of the complex LIV21 labeled in a first time to objectify their expected presence in the cell compartment and to visualize them then if RNA LIV21 unlabeled in a second time for their purely therapeutic action, in a particular case an injection of if RNA (fig 19) in a neurodegenerative tissue or by an approach that allows if the RNA to reach the tissue neurodegeneration (ex-ear, eye etc. ..) and act by allowing proliferation until to apoptosis and thus the death of the cell in neurodegeneration. An experiment on human cell cultures then on animal models with retinopathy giving rise to vitreoretinal degeneration (injection of direct siRNA into the eye) makes it possible to illustrate this method. SiRNAs are also transfected into cells according to the Invitrogen protocol using lipofectamine 2000.
L'étude du rôle spécifique des PKC epsilon sur la translocation nucléaire de Liv 21F peut utiliser un peptide qui inhibe la fonction PKC epsilon et la translocation comme précédemment décrit mais aussi selon le protocole de référence des Si RNA de PKC epsilon. Le profil d'expression observé correspond à un doublet de bandes dans le cytoplasme à environ 51 KD (et à une bande de 64 kD suivant les siRNA utilisés) alors qu'il ne correspond qu'à une simple bande à 50kD dans la f action nucléaire.  The study of the specific role of PKC epsilon on the nuclear translocation of Liv 21F can use a peptide that inhibits PKC epsilon function and translocation as previously described but also according to the PKC epsilon Si RNA reference protocol. The expression profile observed corresponds to a doublet of bands in the cytoplasm at approximately 51 KD (and at a 64 kD band according to the siRNAs used) whereas it corresponds to a single band at 50 kD in the action nuclear.
Les molécules de siRNA issues des séquences nucléotidiques du complexe Liv21 peuvent être choisies dans le groupe constitué des molécules de siRNA comprenant l'une quelconque des séquences SEQ ID N°l 19 à 126 et 171 à 175, et SEQ ID N° - l'utilisation d'une multithérapie basée sur la combinaison de plusieurs de ces siRNA pour le traitement de la pathologie cancéreuse ou neurodégénérative. Ces siRNA et la combinaison utile déduite des résultats de sur expression et de sous expression des biopuces et des RT PCR constituent un traitement adjuvant de la pathologie et peuvent être combinés à de petites doses de molécules chimiques ayant déjà fait leurs preuves dans le traitement de la pathologie. The siRNA molecules derived from the nucleotide sequences of the Liv21 complex may be selected from the group consisting of siRNA molecules comprising any one of SEQ ID NO: 19 to 126 and 171 to 175, and SEQ ID NO: 1. use of combination therapy based on the combination of several of these siRNAs for the treatment of cancer or neurodegenerative pathology. These siRNAs and the useful combination deduced from the results of over expression and under expression of biochips and RT PCR constitute an adjuvant treatment of the pathology and can be combined with small doses of chemical molecules that have already been proven in the treatment of cancer. pathology.
EXEMPLE 7 : test pharmaco diagnostique EXAMPLE 7 Pharmaco Diagnostic Test
A partir des observations qui suivent en annexe à la fin de la description de l'exemple sur les propriétés du complexe LIV21, un design de test pharmaco-diagnostic applicable en clinique a été conçu par l'inventeur avec des moyens techniques connus qui peuvent être déclinés différemment suivant les utilisateurs et correspondre pour chaque mode a un produit nouveau. L'invention réside dans la fabrication de puces diagnostiques à ADN, protéines et à anticorps comprenant les anticorps connus des différentes protéines du complexe associé suivant les phases du cycle cellulaire à LIV21 c'est-à-dire les anticorps,peptides ou séquences nucléotidiques des gènes : de RBP2, E2F4, E2Fl,SUMO, INT2, CRB2, HDAC1, TGFbeta, integrine_alpha5 beta2,Myob, MyoD, cycE/cdk2,cdkl, chkl , chk2, TNFalpha,CREB 1 et p300, Rb, pl07, pl30 de la familles des pockets protéines. Mais aussi NFkB , cdc2A, mdm2, p21, p53, p65,p 73 RAS, i67, CAF1. Les puces à protéines (figure 20) permettront d'étudier les surexpressions ou sous expressions des produits des gènes, les interactions protéiques et les modifications post traductionnelles, plus particulièrement les phosphorylations et méthylations de certaines protéines, qui signent un état caractéristique de la cellule malade différent des interactions protéiques et du métabolisme de la cellule saine. L'état d'expression et de silencing de certains gènes étant différent. From the observations which follow in the appendix at the end of the description of the example on the properties of the LIV21 complex, a clinically applicable pharmaco-diagnostic test design has been devised by the inventor with known technical means which can be differed according to the users and correspond for each mode to a new product. The invention lies in the manufacture of DNA, protein and antibody diagnostic chips comprising the known antibodies of the various proteins of the associated complex according to the phases of the cell cycle at LIV21, that is to say the antibodies, peptides or nucleotide sequences of the genes: RBP2, E2F4, E2F1, SUMO, INT2, CRB2, HDAC1, TGFbeta, integrin_alpha5 beta2, Myob, MyoD, cycE / cdk2, cdk1, chk1, chk2, TNFalpha, CREB1 and p300, Rb, p107, p130 of families pockets of protein. But also NFkB, cdc2A, mdm2, p21, p53, p65, p 73 RAS, i67, CAF1. The protein chips (Figure 20) will be able to study the overexpression or expression of gene products, protein interactions and post-translational modifications, especially the phosphorylations and methylations of certain proteins, which signify a characteristic state of the diseased cell. different from protein interactions and healthy cell metabolism. The state of expression and silencing of certain genes being different.
Exemple 7.1 : puce pharmaco diagnostic (Figure 20) conçue à partir de séquences nucléotidiques ou peptidiques fixées sur les supports classiques et selon les techniques connues type Agilent ou Afrymetrix ou Caliper sans restriction à celles-ci et correspondant aux séquences connues des gènes suivant et listés par ailleurs dans le brevet en utilisant de préférence les séquences qui en analyse 3D présentent une structure 3D de préférence type loop (lOOpb) ou hélix loop hélix ou loop basique (environ 400pb) ou doigt de zinc ou encore une conformation 3D similaire à une hélice correspondant le plus souvent à des sites fonctionnels, ou encore des séquences nucléotidiques correspondant à une zone de méthylation d'une cytosine, méthylation de la région promotrice du gène entraînant un potentiel silencing (cf bibliographie générale) ainsi qu'aux séquences nouvelles des gènes de LIV21F et LIV21K listées dans la description et en annexe mais aussi des séquences communes à certains oncogènes et à certains virus qu'on pense impliqués en particulier dans le cancer du sein des populations chinoises : EXAMPLE 7.1 Pharmaco Diagnostic Flea (FIG. 20) Designed from Nucleotide or Peptide Sequences Fixed on the Traditional Supports and According to the Known Agilent or Afrymetrix or Caliper-type Techniques Without Restriction to Them and Corresponding to the Known Sequences of the Next and Listed Genes Furthermore, in the patent, preferably using the sequences which in 3D analysis have a 3D structure, preferably of the loop (100bp) or helix loop helix or basic loop (approximately 400bp) or zinc finger type, or else a 3D conformation similar to a helix. most often corresponding to functional sites, or nucleotide sequences corresponding to a methylation zone of a cytosine, methylation of the promoter region of the gene leading to a silencing potential (see general bibliography) as well as to new sequences of the LIV21F and LIV21K listed in the description and annex but also sequences common to certain oncogenes and some viruses that are thought to be involved especially in breast cancer of Chinese populations:
Mdm2 et HIVl : Mdm2 and HIVl:
GAVTSSNIAA ; DLDQSV ; EGF et HPV16 ; EWWRLD ; KNSLD ; MHIESLDS Qui pourront aussi être testées en microfluidique fixés sur la lame d'or pour étudier les interactions protéiques avec les extraits cellulaires de la patiente.  GAVTSSNIAA; DLDQSV; EGF and HPV16; EWWRLD; KNSLD; MHIESLDS Who can also be tested in microfluidics fixed on the gold slide to study the protein interactions with the cell extracts of the patient.
Mais qui peuvent aussi être étudiées par une technique MICAM appliquée à des biopuces qui maintiennent sur leur surface (cavités) les biomarqueurs par effet piezo électrique et non pas par fixation physico chimique. Exemple 7,2 : test en microfluidique, par exemple type Biacore, utilisant la technique S.P.R. (surface plasmonique résonance) connue de l'homme de métier à base d'un support fixé avec une pellicule d'or permettant une fois le faisceau lumineux envoyé vers l'interface d'obtenir une énergie absorbée fonction de la présence et de la taille des complexes protéiques (si interaction protéine protéine ou protéine anticorps) ou des complexes protéiques ADN (si interaction protéine ADN), ou ARN ou protéine ou peptide, et une onde évanescente perpendiculaire à l'axe de l'interface (utilisation d'un prisme). L'inventeur fixe les séquences choisies peptide ou ADN sur les particules d'or et calcule pour chaque complexe d'interaction étudié, le nombre de rU fonction de la taille des molécules citées dans ce brevet. En microfluidique le liquide passant sur ces puces à lame d'or peut être aussi bien un extrait cellulaire (voir sélectif c'est-à-dire uniquement noyaux cellulaires ou uniquement cytoplasmes cellulaires ou uniquement protéines du cytosquelette etc.. suivant des techniques d'extraction et de séparation de fractionnement type Calbiochem :subcellular proteom extraction ou bien des extraits tissulaires ou cellulaires sans préparation autre que des anti protéases ou bien encore du liquide céphalo rachidien ou du sérum issu d'un prélèvement d'un patient pour étudier le marqueur circulant(cf. liste des séquences nucléotidiques ou peptidiques décrite et / ou séquences connues des gènes impliqués dans le cycle de prolifération listés). La figure 21 illustre la présence et la quantification de certains biomarqueurs présents dans les échantillons de patients testés en interaction avec les anticorps fixés sur les biochips. EXEMPLE 8 : Biopuce d'ARN des séquences SEQ Π) N° 119 à 127 et 180 à combinés aux séquences de microRNA d'intérêt dans le cancer étudié : mir 21, mir 34a etc... sans que la biopuce soit limités à ceux là. La technique de fixation des ARN sur les supports diffère suivant le type de support, de révélation et de biopuce utilisée. Par exemple on utilise les séquences ARN citées en solution biothynilées puis fixées sur des sensorchips à la streptavidine, si on teste leurs interactions avec les extraits cellulaires ou plasmatiques ou du liquide céphalo rachidien passant dans les canaux (microfluidique) d'un Al 00 ou T100. On peut utiliser aussi comme décrit dans le brevet US 2008 045418 Al des ARN bloqués en extrémité 3' et ajouter une ligase T4 RNA et un « labeled nucleic acid adaptor » ayant un résidu 5' phosphate. EXEMPLE 9 : Etude de l'expression de LIV21 dans les biopsies de^BHMMk Pour déterminer si les observations obtenues précédemment sont applicables aux tissus humains, un grand nombre de biopsies de cancer obtenues de patients ont été étudié par réaction d'immunohistochimie avec des anticorps spécifiques du complexe LIV21. La détermination immunomstochimique de l'expression des protéines du complexe LIV21 a porté sur plusieurs biopsies de patients. Par ailleurs quelques lames paraffinées de patients atteints de cancer dmtB ont aussi étaient étudiées. Le perfectionnement de l'invention tient au fait de normaliser les biopsies ou les ponctions par une technique de prélèvement standardisée et qualibrée afin de permettre ensuite des comparaisons fiables entre extraits cellulaires de patients et de témoins ou entre fractions cytoplasmiques et nucléaires et membranaires. Cette même standardisation appliquée aux prélèvements permettant de comparer les résultats de surexpression ou de sous expressions des biomarqueurs par RTPCR est indispensable pour obtenir des résultats fiables et comparables. But which can also be studied by a MICAM technique applied to biochips that maintain on their surface (cavities) the biomarkers by electric piezo effect and not by physicochemical fixation. Example 7.2: Microfluidic test, for example Biacore type, using the SPR technique (plasmonic resonance surface) known to those skilled in the art based on a support fixed with a gold film allowing once the light beam sent towards the interface to obtain energy absorbed according to the presence and size of the protein complexes (if protein protein or antibody protein interaction) or protein complexes DNA (if DNA protein interaction), or RNA or protein or peptide, and an evanescent wave perpendicular to the axis of the interface (use of a prism). The inventor fixes the chosen peptide or DNA sequences on the gold particles and calculates for each interaction complex studied, the number of rU depending on the size of the molecules mentioned in this patent. In microfluidics, the liquid passing on these gold-plated chips can be both a cellular extract (see only selective cell nuclei or only cellular cytoplasm or only cytoskeletal proteins, etc., according to extraction and separation fractionation type Calbiochem: subcellular proteom extraction or tissue or cell extracts without preparation other than anti proteases or even cerebrospinal fluid or serum from a sample of a patient to study the circulating marker (See list of the nucleotide or peptide sequences described and / or known sequences of the genes involved in the proliferation cycle listed.) Figure 21 illustrates the presence and quantification of certain biomarkers present in the samples of patients tested in interaction with the antibodies. fixed on the biochips EXAMPLE 8 RNA biochip SEQ sequences Π) N 119 to 127 and 180 to combined with the microRNA sequences of interest in the studied cancer: mir 21, mir 34a etc ... without the biochip being limited to those there. The technique of fixing the RNAs on the supports differs according to the type of support, revelation and biochip used. For example, the RNA sequences quoted in biothynilated solution and then fixed on streptavidin receptor probes are used, if their interactions with cell or plasma extracts or cerebrospinal fluid passing through the (microfluidic) channels of an Al 00 or T100 are tested. . Alternatively, as described in US Pat. No. 2008,045,418 A1, 3 'end-blocked RNAs can be used and a T4 RNA ligase and a labeled nucleic acid adaptor having a 5' phosphate residue can be added. EXAMPLE 9 Study of the Expression of LIV21 in the BHMMk Biopsies To determine whether the observations obtained previously are applicable to human tissues, a large number of cancer biopsies obtained from patients were studied by immunohistochemistry reaction with antibodies. specific to the LIV21 complex. The immunomstochemical determination of LIV21 complex protein expression involved several patient biopsies. In addition, some paraffinic blades of dmtB cancer patients were also studied. The improvement of the invention is to standardize biopsies or punctures by a standardized and qualified sampling technique to then allow reliable comparisons between cell extracts of patients and controls or between cytoplasmic fractions and nuclear and membrane. This same standardization applied to samples allowing to compare the results of overexpression or under expressions of biomarkers by RTPCR is essential to obtain reliable and comparable results.
Protocole d'analyse par Immunocytochimie : Protocol of analysis by Immunocytochemistry:
1) Déparâffiner les lames, Réhydrater les tissus  1) Deparaffect the slides, rehydrate the tissues
2) Saturer les sites non spécifiques et perméabiliser les membranes  2) Saturate non-specific sites and permeabilize membranes
3) Ajouter l'anticorps en chambre humide, Révéler l'anticorps  3) Add the antibody in a humid chamber, Reveal the antibody
Déparâffiner les lames sous hotte  Deparaffect the blades under a hood
Deux bains successifs de toluène (rectapur Prolabo) 2x30' ou 2x20min ; puis déshydrater les tissus du rectapur alcool à 100% 15 min ; puis rectapur éthanol à 95% pendant 10 min ; puis rectapur 70% pendant encore lOmn.  Two successive baths of toluene (Prolabo rectapur) 2x30 'or 2x20min; then dehydrate the tissues of the rectal alcohol 100% 15 min; then 95% ethanol rectapur for 10 min; then 70% rectapur for another 10 minutes.
Décongeler l'anticorps pendant le même temps, Réhydrater les tissus  Defrost the antibody at the same time, rehydrate the tissues
Doucement dans du PBS additionné de 10% de sérum de veau foetal et 0,1% de Triton.  Gently in PBS supplemented with 10% fetal calf serum and 0.1% Triton.
Saturer les sites non spécifiques (par exemple avec de l'ovalbvimine) et perméabiliser les membranes., Réhydrater pendant une heure.  Saturate the non-specific sites (eg with ovalbvimine) and permeabilize the membranes., Rehydrate for one hour.
Déposer un ml de ce « PBS » par coupe afin de recouvrir la lame sans qu'elle sèche à aucun moment (quand il s'agit de lame avec des cellules et non pas des tissus, une demi heure suffit). Mettre la vitre et le couvercle en inox et de l'eau en contrebas pour créer une chambre humide. Ajouter l'anticorps en chambre humide. Place one ml of this "PBS" per cut to cover the blade without drying at any time (when it comes to the blade with cells and not tissue, half an hour is enough). Put the glass and the stainless steel lid and the water below to create a humid chamber. Add the antibody in a humid chamber.
Diluer au 200ème le sérum du lapin dans 4 ml de PBS triton pour continuer à perméabiliser les membranes et S VF.  Dilute the rabbit serum in 200 ml in 4 ml of PBS triton to continue permeabilizing the membranes and S VF.
Mettre 1ml sur chaque lame et éviter la lumière et l'évaporation. Laisser toute la nuit ou au minimum trois heures. Put 1ml on each slide and avoid light and evaporation. Leave all night or at least three hours.
Puis rincer au PBS normal IX PH 7, faire deux lavages de 5 à 10 mn pour qu'il ne reste aucune trace du premier anticorps.  Then rinse with normal PBS IX PH 7, wash twice for 5 to 10 minutes so that no trace remains of the first antibody.
Pendant qu'on prépare la sonde Alexa 488 verte (au froid à 4° à l'abri de la lumière) au 250e donc 10 μΐίίτβ dans 2,5ml de PBS avec toujours 10%SVF et 0 ,1% Triton, While preparing the Alexa 488 probe green (cold at 4 protected from light) at 250th therefore μΐίίτβ 10 in 2.5 ml of PBS with always 10% FCS and 0, 1% Triton,
Reposer les lames sur la plaque. Recouvrir la coupe avec 2,5ml pour garder une chambre humide pendant une heure puis lavage au PBS IX PH 7.  Refit the blades on the plate. Cover the cup with 2.5ml to keep a humid chamber for one hour then wash with PBS IX PH 7.
Lavage au Iodure de Propidium à 0,5 microgramme par microlitre à diluer à 20 microgramme par ml puis encore au 50e mais cette fois, dilué dans du PBS seul IX ( 50 microlitre pour 2,5 ml de PBS). Egoutter en les sortant du PBS puis 2,5 ml de iodure de propidium reparti sur les quatre lames pendant une minute puis deux rinçage au PBS simple. Montage des lames au Moviol avant lecture. Washing with propidium iodide 0.5 microgram per microliter diluted to 20 microgram per ml and then again at the 50th but this time diluted in PBS alone IX (50 microliter per 2.5 ml PBS). Drain by removing them from the PBS and then 2.5 ml of propidium iodide distributed over the four slides for one minute and then two rinsing with simple PBS. Slide the slides to the Moviol before reading.
Pour un immuno marquage à la peroxydase il est indispensable de masquer les sites antigèniques par une étape au bain marie de 20 minutes afin d'avoir des résultats intéressants quand on travaille sur des lames paraffinées.Ces résultats montrent que ia localisation cytoplasmique de LIV21 est un indicateur de l'agressivité et du potentiel métastatique du cancer. La détection de l'expression de LIV21 indique la présence de cellules cancéreuses invasives, agressives et métastatiques. Ces résultats montrent également que la localisation nucléaire de LIV21 est un indicateur de cellules quiescentes saines soit de tissus bien différentiés. Annexe : For an immuno labeling with peroxidase, it is essential to mask the antigenic sites by a step in a 20-minute waterbath in order to obtain interesting results when working on paraffinic slides. These results show that the cytoplasmic localization of LIV21 is a indicator of aggressiveness and the metastatic potential of cancer. The detection of LIV21 expression indicates the presence of invasive, aggressive and metastatic cancer cells. These results also show that the nuclear localization of LIV21 is an indicator of healthy quiescent cells of well differentiated tissues. Annex :
Etude de la translocation nucléaire de LIV21 dans les cellules MCF-7 et SH5YH  Study of the nuclear translocation of LIV21 in MCF-7 and SH5YH cells
L'étude de la distribution sub-cellulaire de LIV21 dans différentes lignées tumorales d'origines diverses a montré une localisation exclusivement cytoplasmique de cette protéine.  The study of the sub-cellular distribution of LIV21 in different tumor lines of various origins showed an exclusively cytoplasmic localization of this protein.
La présence de sites putatifs de phosphorylation par les Protéines inases C (PKCs) dans la séquence de LIV21 traduit une implication de ces protéines sur sa translocation nucléaire. La lignée MCF-7 traitée par le TPA, module les PKCs et est utilisée ici.  The presence of putative phosphorylation sites by Inase protein C (PKCs) in the LIV21 sequence reflects an implication of these proteins on its nuclear translocation. MCF-7 treated with TPA, modulates PKCs and is used here.
L'effet du TPA sur la lignée MCF-7  The effect of TPA on the MCF-7 line
Le TPA est un activateur connu des PKCs. Il active la croissance des cellules normales du sein, ne modifie pas la prolifération des cellules de tumeurs bénignes de ce même tissu, mais il inhibe de manière drastique la prolifération des cellules de lignées de tumeurs mammaires humaines telles que la lignée MCF-7. Il réduit la croissance cellulaire de cette lignée en contrôlant positivement le récepteur c-erb-2 et en contrôlant négativement le récepteura de l'acide rétinoïque, qui sont tous deux exprimés de manière particulièrement importante dans ces cellules. Le TPA inhibe fortement et rapidement l'expression et la fonction des récepteurs aux œstrogènes (ER) et il induit la translocation, temps- et dose-dépendante, des protéines kinase C (PKCs) du cytosol vers les membranes.D'autre part, le TPA augmente la capacité de migration des cellules MCF-7 in vitro et un court traitement de ces cellules par le TPA induit une expansion cellulaire et une organisation des microtubules caractéristiques de leur différenciation.  TPA is a known activator of PKCs. It activates the growth of normal breast cells, does not alter the proliferation of benign tumor cells of the same tissue, but it drastically inhibits the proliferation of cells of human breast tumor lines such as the MCF-7 line. It reduces the cell growth of this line by positively controlling the c-erb-2 receptor and negatively controlling the retinoic acid receptor, both of which are expressed particularly prominently in these cells. TPA strongly and rapidly inhibits the expression and function of estrogen receptors (ER) and induces the time-and dose-dependent translocation of cytosolic protein kinase C (PKCs) to membranes.On the other hand, TPA increases the ability of MCF-7 cells to migrate in vitro and a short treatment of these cells by TPA induces cellular expansion and microtubule organization characteristic of their differentiation.
Expression de LIV21 dans les cellules MCF-7 et dans les cellules SH5YH Expression of LIV21 in MCF-7 cells and in SH5YH cells
Dans un premier temps, l'inventeur a vérifié l'expression de LIV21 dans ces cellules, au niveau transcriptionnel et au niveau protéique.  In a first step, the inventor verified the expression of LIV21 in these cells, at the transcriptional level and at the protein level.
L'expression de l'ARNm de LIV21 a été mis en évidence par RT-PCR (amorce sens : CCTGACATCCCTACA (SEQ ID No 3) et amorce antisens :-TeCTAXGCTTGA (SEQ ID No 4)) dans ces cellules comparativement aux cellules des tissus mammaires (figure 2A). Un ARNm de même taille que l'ARNm détecté dans les tissus mammaires et spécifique de LIV21 a été détecté. Cependant, le niveau d'expression de LIV21 dans les cellules MCF-7 est plus faible que dans les tissus mammaires. Ce premier résultat montre que la lignée MCF-7 exprime l'ARNm LIV21. Expression of LIV21 mRNA was demonstrated by RT-PCR (sense primer: CCTGACATCCCTACA (SEQ ID No. 3) and antisense primer: -TeCTAXGCTTGA (SEQ ID No. 4)) in these cells compared to tissue cells. mammary (Figure 2A). MRNA of the same size as mRNA detected in breast tissue and specific to LIV21 was detected. However, the level of LIV21 expression in MCF-7 cells is lower than in breast tissue. This first result shows that the MCF-7 line expresses LIV21 mRNA.
L'inventeur a abordé l'étude de l'expression de la protéine LIV21 par la technique du western Mot, avec un anticorps anti-LIV21, dans les cellules MCF-7 par rapport aux tissus mammaires. Les anticorps anti-LIV21 ont été obtenues par la méthode décrite . Dans cette lignée, LIV21 s'exprime aussi bien dans les tissus mammaires que dans les cellules MCF-7, sous la forme d'un doublet migrant à un poids moléculaire apparent de 51 kDa . The inventor has addressed the study of the expression of the LIV21 protein by the Western Mot technique, with an anti-LIV21 antibody, in the MCF-7 cells compared to the mammary tissues. Anti-LIV21 antibodies were obtained by the described method. In this line, LIV21 is expressed as well in mammary tissues as in MCF-7 cells, in the form of a doublet migrating at an apparent molecular weight of 51 kDa.
Production du sérum purifié anti-LIV21 Production of purified anti-LIV21 serum
Les séquences peptidiques spécifiques sont les séquences n°l et n°2 et N° 180  The specific peptide sequences are sequences No. 1 and No. 2 and No. 180
Ces peptides ont été injectés aux lapins (NZ W ESD 75 femelle 2,3kg au jour 0) These peptides were injected into rabbits (NZ W ESD 75 female 2.3kg at day 0)
En accord avec les procédures d'immunisation standard, In accordance with standard immunization procedures,
L'effet des inhibiteurs sur dans les cellules de neuroblastomes The effect of inhibitors on in neuroblastoma cells
Etude de l'influence des PKC sur la translocation nucléaire de LIV21 Study of the influence of PKC on the nuclear translocation of LIV21
Effet du TPA sur l'expression de PKCe Effect of TPA on PKCe expression
Étude en Western Blot : Étant donné que la séquence protéique de LIV21 possède des sites putatifs de phosphorylation par les PKCs dont deux spécifiques de la PKCe , l'inventeur a testé la variation de l'expression de cette PKC en fonction de la durée de traitement par le TPA. Il a été observé que le TPA agit très rapidement sur l'expression de PKCs, qui diminue dès 30 min . L'expression de la PKCzeta ÇPKCQ est utilisée en tant que contrôle interne car elle n'est pas sensible au TPA.  Western Blot Study: Since the LIV21 protein sequence has putative PKC phosphorylation sites, two of which are specific for PKCe, the inventor tested the variation of the expression of this PKC as a function of the duration of treatment. by the TPA. It has been observed that TPA acts very rapidly on the expression of PKCs, which decreases as early as 30 min. The expression PKCzeta ÇPKCQ is used as an internal control because it is not sensitive to TPA.
Immunocytochirnie : Parallèlement, des expériences d'immunofluorescence sur des cultures traitées ou non ont permis de mettre en évidence cette diminution de la PKCe concomitante à la translocation nucléaire de LIV21 . On peut observer que PKCe disparait du cytoplasme lorsque les cellules sont traitées au TPA et que LIV21 est détectée dans le noyau. Pour conclure, il est intéressant de noter que la PKCe est faiblement exprimée à 12h, temps où on observe le moins de cellules en phase S et le maximum de translocation nucléaire de LIV21. Immunocytochirnie: At the same time, immunofluorescence experiments on treated or non-treated cultures made it possible to demonstrate this decrease in PKCe concomitant with the nuclear translocation of LIV21. It can be observed that PKCe disappears from the cytoplasm when the cells are treated with TPA and that LIV21 is detected in the nucleus. To conclude, it is interesting to note that PKCe is weakly expressed at 12h, the time when we observe the least number of S-phase cells and the maximum of nuclear translocation of LIV21.
Etude du rôle spécifique de PKCe sur la translocation nucléaire de LIV21 à l'aide d'un peptide inhibiteur de la fonction et de la translocation de PKCe . Study of the specific role of PKCe on the nuclear translocation of LIV21 using a peptide inhibiting the function and translocation of PKCe.
Pour déterminer l'action spécifique de PKCe sur la translocation de LIV21, les cultures ont été traitées avec un peptide, antagoniste sélectif de la fonction et de la translocation de cette PKC (EAVSLKPT (SEQ ID No 6), et les résultats ont été comparés avec ceux obtenus par traitement au TPA. Ce peptide est reconnu par l'enzyme et se lie en tant que substrat modifié au niveau de son site catalytique. Non phosphorylable, il agit en tant qu'inhibiteur spécifique de l'activité de PKCe. L'effet de inhibition sélective de l'activité de la PKCe sur la translocation nucléaire de LIV21 a été étudié par immunocytochimie. Ces expériences ont été réalisées sur des cultures traitées ou non pendant 12h, avec du TPA à 25 nM ou avec le peptide à deux concentrations différentes, 1 et 2 uM (. Le peptide utilisé à la concentration de 2 uM a un effet identique à celui du TPA sur la translocation nucléaire de LIV21. To determine the specific action of PKCe on translocation of LIV21, the cultures were treated with a peptide, selective antagonist of the function and translocation of this PKC (EAVSLKPT (SEQ ID No. 6), and the results were compared with those obtained by TPA treatment.This peptide is recognized by the enzyme and binds as a modified substrate at its catalytic site.Non-phosphorylatable, it acts as a specific inhibitor of PKCe activity. Selective inhibition of PKCe activity on the LIV21 nuclear translocation was investigated by immunocytochemistry.These experiments were performed on cultures treated or untreated for 12h, with 25 nM TPA or with the two-peptide peptide. different concentrations, 1 and 2 μM (The peptide used at the concentration of 2 μM has an effect identical to that of TPA on the nuclear translocation of LIV21.
Ces résultats ont été confortés par des expériences de fractionnement cellulaire sur des cultures traitées par le peptide inhibiteur de PKCe à 2 μΜ comparées à des cultures traitées par le TPA (. Le même profil d'expression de LIV21 a été observé sous la forme d'un doublet dans le cytoplasme et d'une bande unique dans la fraction nucléaire. These results were supported by cell fractionation experiments on cultures treated with 2 μC PKCe inhibitory peptide compared to TPA-treated cultures (the same expression pattern of LIV21 was observed in the form of a doublet in the cytoplasm and a single band in the nuclear fraction.
L'inhibition spécifique de la PKCe induit une translocation nucléaire de LIV21, ce qui suggère que LIV21 pourrait être la cible de la PKCe, qui le maintiendrait dans le cytoplasme sous une forme phosphorylée. EXEMPLE : Analyse par Western Blot The specific inhibition of PKCe induces a nuclear translocation of LIV21, suggesting that LIV21 could be the target of PKCe, which would maintain it in the cytoplasm in a phosphorylated form. EXAMPLE: Western Blot Analysis
Cet exemple décrit les conditions utilisées pour une analyse par Western Blot de cellules cancéreuses de cerveau.  This example describes the conditions used for Western Blot analysis of brain cancer cells.
Les extraits protéiques sont chauffés 5 minutes à 80°C dans le tampon Laemmli (pH 7.4, Tris 0,06M, SDS 3%, glycerol 10%, PMSF ImM, β-mercaptoéthanol). La migration est effectuée en SDS-PAGE (Sodium dodécyl sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophorèsis). 10 à 20 μg de protéines migrent dans un gel de polyacrylamide 12% pendant lh dans des conditions dénaturantes (Tampon de migration : Tris base 25mM, glycine 192mM, SDS 1%, pH 8.3). Les protéines sont ensuite transférées sur membrane de nitrocellulose (Schleicher & Schuell) pendant une heure en transfert liquide, dans un tampon de transfert (Tris 25mM, glycine 192mM, méthanol 20%, pH 8.3). Les membranes, saturées dans du PBS-Tween 0,1% -Triton XI 00 0,1%-lait écrémé 5% pendant une heure sont mises en contact avec l'anticorps primaire dilué dans du PBS- Tween 0,1% -Triton XI 00 0,1%-lait 1% à température ambiante sous agitation douce pendant une heure à deux heures. Après lavage, l'anticorps secondaire couplé à la péroxydase est incubé lh avec les membranes. La révélation se fait par une réaction de cliimioluminescence grâce au kit ECL selon le protocole du fournisseur (Amersham). The protein extracts are heated for 5 minutes at 80 ° C. in Laemmli buffer (pH 7.4, 0.06M Tris, 3% SDS, 10% glycerol, 1M PMSF, β-mercaptoethanol). The migration is carried out in SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis). 10 to 20 μg of proteins migrate in a 12% polyacrylamide gel for 1 h under denaturing conditions (Migration buffer: 25 mM Tris base, 192 mM glycine, 1% SDS, pH 8.3). The proteins are then transferred to a nitrocellulose membrane (Schleicher & Schuell) for one hour in liquid transfer, in a transfer buffer (25mM Tris, 192mM glycine, 20% methanol, pH 8.3). The membranes, saturated in 0.1% PBS-Tween 0.1% -Triton XI 00 -5% skimmed milk for one hour are brought into contact with the primary antibody diluted in PBS-0.1% Tween -Triton 0.1% -lait 1% at room temperature with gentle stirring for one hour to two hours. After washing, the secondary antibody coupled to the peroxidase is incubated with the membranes. The revelation is by a cliimiluminescence reaction using the ECL kit according to the supplier's protocol (Amersham).
Les anticorps primaires utilisés sont : The primary antibodies used are:
Le sérum anti-LIV21 qui a été fabriqué en utilisant des peptides synthétiques basés sur la séquence de LIV21F et des PeptideLIV21a (SEQ ID No 1 et le peptide LIV21b (SEQ ID No 2 et/ou peptide LIV21e (SEQ ID N°51). Les peptides ont été couplés à l'hémocyanine avant d'être injectés à des lapins pour l'immunisation. L'anticorps polyclonal a été obtenu à partir de deux de ces peptides en ayant immunisé deux lapins et en ayant saigné un lapin pour avoir un sérum préimmun (afin d'être sûr que cet anticorps n'existait pas déjà chez ce lapin).  Anti-LIV21 serum that was made using synthetic peptides based on the LIV21F sequence and PeptideLIV21a (SEQ ID No. 1 and LIV21b peptide (SEQ ID No. 2 and / or LIV21e peptide (SEQ ID NO: 51). The peptides were coupled to the hemocyanin before being injected into rabbits for immunization The polyclonal antibody was obtained from two of these peptides by immunizing two rabbits and blowing a rabbit to obtain a rabbit. preimmun serum (to be sure that this antibody did not already exist in this rabbit).
L'anticorps polyclonal anti-CDK2 de lapin (Santa-Cruz technology sc-163) dilué au 1/200.  Rabbit anti-CDK2 polyclonal antibody (Santa-Cruz technology sc-163) diluted 1/200.
L'anticorps monoclonal anti-p21 de Souris ( DAKO, M7202) dilué au 1/150. L'anticorps monoclonal anti-p27 de souris (Santa-Cruz technology sc-1641) dilué au 1/100. The mouse anti-p21 monoclonal antibody (DAKO, M7202) diluted 1/150. Mouse anti-p27 monoclonal antibody (Santa-Cruz technology sc-1641) diluted 1/100.
Il a été démontré auparavant que la protéine LIV21 est associée aux corps PML et que, lors de la sumoylation, LIV21 passe d'un poids moléculaire de 50kd à 60kd. Par immunoprécipitation, l'inventeur a montré une co-localisation de LIV21 avec SUMO dans le complexe PML - SUMO/LIV21. (Figure 12)  It has previously been shown that the LIV21 protein is associated with the PML bodies and that, during sumoylation, LIV21 goes from a molecular weight of 50kd to 60kd. By immunoprecipitation, the inventor showed co-localization of LIV21 with SUMO in the PML-SUMO / LIV21 complex. (Figure 12)
Rôle antitumoral des corps PML : Au stade de prolifération, il y a dans les corps PML des modifications visualisées car ces corps PML se dissocient et se dégradent :(speekles), des protéines se mettent alors à disposition dans le noyau pour assurer la transcription, la prolifération, les réactions immunitaires et tout ce qui nécessite la transcription de gènes. Il a été démontré que PML s'associe à SUMO et à HDAC-1 (histone déacétylase 1) et que son complexe agit sur l'expression d'E2Fl et PML agit ainsi sur l'arrêt de la prolifération en bloquant E2F1. Ainsi le complexe PML/ HDAC-1 régule négativement l'expression d'E2Fl. PML associé à Rb (pl30) se fixe aux histones désacétylases et bloque E2F1 en se fixant sur la chromatine. Antitumor role of PML bodies: In the proliferation stage, there are visualized changes in PML bodies because these PML bodies dissociate and degrade: (speekles), proteins are then available in the nucleus to ensure transcription, proliferation, immune responses and anything that requires gene transcription. It has been demonstrated that PML associates with SUMO and with HDAC-1 (histone deacetylase 1) and that its complex acts on the expression of E2F1 and PML thus acts on the stop of the proliferation by blocking E2F1. Thus the PML / HDAC-1 complex negatively regulates the expression of E2F1. PML associated with Rb (pl30) binds to histone deacetylases and blocks E2F1 by binding to chromatin.
Dans les leucémies promyélocytaires aiguës, PML est tronquée et devient une protéine de fusion avec le récepteur de l'acide rétinoïque. Cette protéine de fusion (PMLRARalpha) est due à une translocation chromosomique 15/17. Il a été rapporté dans la littérature un nouveau traitement de cette maladie par association d'arsenic et d'acide rétinoique pour induire les cellules cancéreuses en apoptose. La protéine PML régulerait la prolifération dans les cancers et les lymphomes. L'inventeur a montré par immunoprécipitation l'association SUMO-PML dans lequel est localisé LIV21. In acute promyelocytic leukemias, PML is truncated and becomes a fusion protein with the retinoic acid receptor. This fusion protein (PMLRARalpha) is due to a chromosomal translocation 15/17. It has been reported in the literature a new treatment of this disease by combination of arsenic and retinoic acid to induce cancer cells in apoptosis. The PML protein regulates proliferation in cancers and lymphomas. The inventor has shown by immunoprecipitation the SUMO-PML association in which LIV21 is located.
Il a été montré auparavant que LIV21 est phosphorylée par PKCs et que le TPA est un inhibiteur des PKC. Les lignées MCF7 traitées par TPA montrent une inhibition de la prolifération cancéreuse et une différentiation cellulaire et LIV21 est transloquée dans le noyau. Si on a utilisé un peptide inhibiteur spécifique de P CE, c'est l'activité et non pas l'expression de P Cs qui a été inhibée. Lors de ce traitement lorsque l'on a étudié E2F4, pl30 et LIV21 (fluorescence verte) dans les noyaux marqués (ADN) au iodure de propidium (fluorescence rouge) , on a observé : It has been shown previously that LIV21 is phosphorylated by PKCs and that TPA is a PKC inhibitor. MCF7 lines treated with TPA show inhibition of cancer proliferation and cell differentiation and LIV21 is translocated into the nucleus. If an EC-specific inhibitory peptide was used, it is the activity and not the expression of P Cs that was inhibited. In this treatment, when E2F4, p130 and LIV21 (green fluorescence) were studied in propidium iodide labeled nuclei (DNA) (red fluorescence), we observed:
Au bout de 12h des signaux de fluorescence verte intranucléaire de même pattem pour E2F4, pl30 et LIV21 ; After 12h, intranuclear green fluorescence signals of the same pattem for E2F4, p130 and LIV21;
Au bout de 48 h quand la prolifération commence, E2F4 a une localisation comparable ; mais à 72 h, il disparaît du noyau (au profit d'E2Fl). En observant la co-localisation par double marquage de PML et de LIV21 à 24 h de traitement par PKC (cf. merge : fluorescence jaune), on a observé qu'ils sont colocalisés dans les noyaux. A 48h, la co-localisation est aussi constatée entre LrV21 et SUMO (cf. . L'hypothèse est que SUMO, qui se fixe sur LIV21, adresse en fait LIV21 dans les corps PML et que L1Y21 est impliqué dans les complexes PML/SUMO/Rb/HDAC-1. LIV21 est physiquement associé à PML et SUMO dans les corps nucléaires, par immunoprécipitation et par co-localisation en immunocytochimie ((Rb, pl30 et p 107 sont des protéines poches (pocket proteins) qui ont le même site de fixation). Les protéines Rb répriment la croissance cellulaire (Fabbro, Regazzi R Bioch BiophysResComm 1986 Feb 2 ;135 (1) :65-73).  After 48 hours when proliferation begins, E2F4 has a comparable location; but at 72 h, it disappears from the core (in favor of E2Fl). By observing the co-localization by double labeling of PML and LIV21 at 24 h of PKC treatment (see merge: yellow fluorescence), it was observed that they are colocalized in the nuclei. At 48h, co-localization is also observed between LrV21 and SUMO (The hypothesis is that SUMO, which binds to LIV21, actually addresses LIV21 in PML bodies and that L1Y21 is involved in PML / SUMO complexes. / Rb / HDAC-1 LIV21 is physically associated with PML and SUMO in nuclear bodies, by immunoprecipitation and by co-localization in immunocytochemistry ((Rb, pl30 and p107 are pocket proteins) which have the same site The Rb proteins suppress cell growth (Fabbro, Regazzi R Bioch BiophysResComm 1986 Feb 2; 135 (1): 65-73).
Interaction physique de LrV21 avec les protéines de la famille E2F Physical interaction of LrV21 with proteins of the E2F family
Des expériences de co-immunoprécipitations réalisées à l'aide d'anticorps anti-LIV21, anti-E2Fl et anti-E2F4 ont permis de mettre en évidence que LIV21 s'associe à E2F4. Il a été démontré que BRCA1 rentrait aussi en interaction avec les membres de la famille E2F et donc le complexe LiV21. En effet E2F1 interagit avec BRCA1 et Brcal interagit avec MYC, ESR1, CHEK1 et MAP3K3.  Co-immunoprecipitation experiments carried out using antibodies against LIV21, anti-E2F1 and anti-E2F4 made it possible to demonstrate that LIV21 associates with E2F4. It has been shown that BRCA1 also interacts with members of the E2F family and thus the LiV21 complex. Indeed E2F1 interacts with BRCA1 and Brcal interacts with MYC, ESR1, CHEK1 and MAP3K3.
Les membres de la famille E2F sont des facteurs de transcription dont le rôle a largement été décrit dans la littérature comme étant des molécules-clés dans le contrôle positif ou négatif du cycle cellulaire (Slansky JE et Farnham PJ 1996 ; Helin K 1998 et Yamasaki L. 1998), de par leur association avec la protéine pRb (WuCL, Zukerberg LR) . Interaction fonctionnelle de LIV21 avec les protéines de la famille E2F. Members of the E2F family are transcription factors whose role has been widely described in the literature as key molecules in positive or negative control of the cell cycle (Slansky JE and Farnham PJ 1996, Helin K 1998 and Yamasaki L 1998), by their association with the protein pRb (WuCL, Zukerberg LR). Functional interaction of LIV21 with the proteins of the E2F family.
Il a été mis en évidence que le blocage de l'expression de la protéine LIV21 était corrélé à une diminution de l'expression d'E2F4 et à une augmentation de l'expression d'E2Fl . 5 Parallèlement, l'aspect fonctionnel de l'augmentation d'E2Fl a été vérifié par l'étude de la transcription de deux de ses gènes cibles, la DHFR et la ADN polymérase a.  It has been demonstrated that the blocking of LIV21 protein expression is correlated with a decrease in E2F4 expression and an increase in E2F1 expression. In parallel, the functional aspect of the E2F1 increase was verified by studying the transcription of two of its target genes, DHFR and DNA polymerase a.
En conclusion, ces résultats suggèrent que le complexe LIV21/E2F4 agit comme un complexe inhibiteur de l'expression du gène E2F1. Ce complexe pourrait correspondre à un nouveau point de contrôle dans l'arrêt de prolifération cellulaire.  In conclusion, these results suggest that the LIV21 / E2F4 complex acts as an inhibitory complex of E2F1 gene expression. This complex could correspond to a new checkpoint in the cell proliferation arrest.
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Claims

REVENDICATIONS
1. Les nouvelles séquences du Complexe Liv21 humain, caractérisé en ce qu'il comprend :  1. The new sequences of the human Liv21 complex, characterized in that it comprises:
- les séquences nucléotidiques SEQ ID N° 171 à 175, et S' F< té 2.4 - ~ the nucleotide sequences SEQ ID Nos. 171 to 175 and S ' F <té 2.4 - ~
- une séquence siRNA dérivée de l'une des séquences d'ARN de SEQ ID N° 120 et SEQ ID N° 121, et 171 à 175. SiRNA des séquences SEQ N° 91 à 1 18  an siRNA sequence derived from one of the RNA sequences of SEQ ID No. 120 and SEQ ID No. 121, and 171 to 175. SiRNA sequences SEQ ID Nos. 91 to 1 18
- une fraction protéique comprenant au moins la séquence SEQ ID N° 1 et 18.1 ou une séquence présentant 90%, et préférentiellement 80%, et plus préférentiellement 70% d'identité avec ladite SEQ ID N° 1 et 181et la séquence SEQ ID N° 183 ou une séquence présentant 70, 80 ou 90% d'identité avec ladite SEQ ID N° 183.*»*- Çé¾ " \ Ç a protein fraction comprising at least the sequence SEQ ID No. 1 and 18 . 1 or a sequence having 90%, and preferably 80%, and more preferably 70% identity with said SEQ ID No. 1 and 181 and the sequence SEQ ID No. 183 or a sequence having 70, 80 or 90% identity with said SEQ ID NO: 183. * "* - Çé¾ " \ Ç
2. Complexe Liv21 humain selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend en outre : 2. Human Liv21 complex according to claim 1, characterized in that it further comprises:
-les séquences nucléotidiques SEQ ID N° 123, 124 et 127, et les fractions protéiques comprenant au moins la séquence SEQ ID N° 1 ou une séquence présentant 70, 80 ou 90% d'identité avec ladite SEQ ID N° 1 et les séquences 181 à 185 ou une séquence présentant 70, 80 ou 90% d'identité avec ladite SEQ ID N° 181 à 185.  the nucleotide sequences SEQ ID No. 123, 124 and 127, and the protein fractions comprising at least the sequence SEQ ID No. 1 or a sequence having 70, 80 or 90% identity with said SEQ ID No. 1 and the sequences 181 to 185 or a sequence having 70, 80 or 90% identity with said SEQ ID No. 181 to 185.
Le complexe Liv21 humain est caractérisé en ce qu'il comprend en outre : The human Liv21 complex is characterized in that it further comprises:
L'une quelconque des séquences nucléotidiques ou ribonucléiques SEQ ID N° 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 126 ou 127.  Any of the nucleotide or ribonucleic sequences SEQ ID NO: 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 126 or 127.
ou une séquence présentant 90%, et préférentiellement 80%, et plus préférentiellement 70% d'identité avec lesdites séquences SEQ ID N° 119 à 127, ou UUGGUAACGACCAUGCCAC, ou UUCACUUAGAAUAAUGUCC, ou UCUUUGUGAAUUUGACAAC, ou UCAAGGUCCAGGCUACAAC, ou or a sequence having 90%, and preferably 80%, and more preferably 70% identity with said sequences SEQ ID No. 119 to 127, or UUGGUAACGACCAUGCCAC, or UUCACUUAGAAUAAUGUCC, or UCUUUGUGAAUUUGACAAC, or UCAAGGUCCAGGCUACAAC, or
- l'une quelconque des séquences siRNA suivantes :  any of the following siRNA sequences:
GUGGCAUGGUCGUUACCAA dTdT  GUGGCAUGGUCGUUACCAA dTdT
dTdT CACCGUACCAGCAAUGGUU dTdT CACCGUACCAGCAAUGGUU
GGACAUUAUUCUAAGUGAA dTdT GAGCUAAUAGUCAAGCAUAUUCAA ) GGAAGAAUCUCAUCUCAGAUUCAA ) UUCUCGAUUAUCAGUUCGUAUAGAG- UUCCUUCUUAGAGUAGAGUCUAGAG- GGACAUUAUUCUAAGUGAA dTdT GAGCUAAUAGUCAAGCAUAUUCAA) GGAAGAAUCUCAUCUCAGAUUCAA) UUCUCGAUUAUCAGUUCGUAUAGAG- UUCCUUCUUAGAGUAGAGUCUAGAG-
GAGAGUCAUCUUACUCAGAUUCAA )GAGAGUCAUCUUACUCAGAUUCAA)
GCAGAUCAUGAGGUCAAGAUUCAA ) UUCUCUCAGUAGAAUGAGUCUAGAG- UUCGUCUAGUACUCCAGUUCUAGAG-GCAGAUCAUGAGGUCAAGAUUCAA) UUCUCUCAGUAGAAUGAGUCUAGAG- UUCGUCUAGUACUCCAGUUCUAGAG-
GCUGGGUGUGGUAGUGCAUUUCAA ) UUCGACCCACACCAUCACGUAAGAG-GCUGGGUGUGGUAGUGCAUUUCAA) UUCGACCCACACCAUCACGUAAGAG-
G AAG AA UCUCAUCU C AG AA U U C A A ) G AAG AA UCUCAUCU C AG AA U U C A A)
UUCUUCUUAGAGUAGAGUCUUAGAG- UUCUUCUUAGAGUAGAGUCUUAGAG-
GUCAAGAGAUCGAGACCAUUUCAA ) UUCAGUUCUCUAGCUCUGGUAAGAG-GUCAAGAGAUCGAGACCAUUUCAA) UUCAGUUCUCUAGCUCUGGUAAGAG-
GUGUGAGACUCCAUCUGAAUUCAA ) GUGUGAGACUCCAUCUGAAUUCAA)
UUCACACUCUGAGGUAGACUUAGAG- UUCACACUCUGAGGUAGACUUAGAG-
GUCAUCUUACUCAGAGCAUUUCAA ) UUCAGUAGAAUGAGUCUCGUAAGAG-GUCAUCUUACUCAGAGCAUUUCAA) UUCAGUAGAAUGAGUCUCGUAAGAG-
GAUCAUGAGGUCAAGAGAUUUCAA ) GAUCAUGAGGUCAAGAGAUUUCAA)
UUCUAGUACUCCAGUUCUCUAAGAG- UUCUAGUACUCCAGUUCUCUAAGAG-
GGAGUAUAGGAAUCUCCUAUUCAA ) UUCCUCAUAUCCUUAGAGGAUAGAG-GGAGUAUAGGAAUCUCCUAUUCAA) UUCCUCAUAUCCUUAGAGGAUAGAG-
GGCUGAGGCAGGCAGAUCAUUCAA ) GGCUGAGGCAGGCAGAUCAUUCAA)
UUCCGACUCCGUCCGUCUAGUAGAG- UUCCGACUCCGUCCGUCUAGUAGAG-
GCCUGGCGACAGUGUGAGAUUCAA ) UUCGGACCGCUGUCACACUCUAGAG-GCCUGGCGACAGUGUGAGAUUCAA) UUCGGACCGCUGUCACACUCUAGAG-
GGUAGUGCAUGCCUGUAGUUUCAA ) GGUAGUGCAUGCCUGUAGUUUCAA)
UUCCAUCACGUACGGACAUCAAGAG- UUCCAUCACGUACGGACAUCAAGAG-
GCCUGUAGUCCCAGCUACUUUCAA ) UUCGGACAUCAGGGUCGAUGAAGAG- GAGAUGGCGCCACUGUACUUUCAA ) GCCUGUAGUCCCAGCUACUUUCAA) UUCGGACAUCAGGGUCGAUGAAGAG- GAGAUGGCGCCACUGUACUUUCAA)
UUCUCUACCGCGGUGACAUGAAGAG-  UUCUCUACCGCGGUGACAUGAAGAG-
3. Complexe Liv21 humain selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il comprend en outre au moins : 3. Human Liv21 complex according to claim 1 or 2, characterized in that it further comprises at least:
- l'une quelconque des séquences nucléotidiques SEQ ID N° 123, SEQ ID N° 124 et SEQ ID N° 127 à 149, ou  any one of the nucleotide sequences SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 124 and SEQ ID NO: 127 to 149, or
- l'une quelconque des séquences d'acides aminés SEQ ID N° 1 à 118 et SEQ ID N°150 à 170 et 180 à 185, ou une séquence présentant 90%, et préférentiellement 80%, et plus préférentiellement 70% d'identité avec lesdites séquences SEQ ID N° 1 à 185.  any one of the amino acid sequences SEQ ID No. 1 to 118 and SEQ ID No. 150 to 170 and 180 to 185, or a sequence having 90%, and preferably 80%, and more preferably 70% of identity with said sequences SEQ ID NO: 1 to 185.
4. Complexe Liv21 humain selon l'une quelconque des 4. Human Liv21 complex according to any one of
revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il interagit avec au moins un de ses partenaires associés, ledit au moins un de ses partenaires associés étant choisit dans le groupe constitué de ; claims 1 to 3, characterized in that it interacts with at least one of its associated partners, said at least one of its associated partners being chosen from the group consisting of;
- l'une quelconque des protéines suivantes : RBP2, TNFalpha, crb2, cycE/cdk2, cdkl, CREBl, p300, pl07, NFkB, cdc2A, mdm2, p21, p53, p65, p73 BCAS4 , BCAS3 Ov - un anticorps de l'une quelconque des protéines suivantes : RBP2, E2F4 , E2F1, SUMO, HDAC-1, crb2, Int2,cmd2, cycE/cdk2, cdkl, ,CREB1 et p300, Rb, p 107, pi 30 de la familles des pockets protéines NFkBJLcdc2A, mdm2, p21, p53, p65, Ki67, CAF1, la cycline A et Dl, CHUK. BCAS3 BCAS4 soluté carrier any one of the following proteins: RBP2, TNFalpha, crb2, cycE / cdk2, cdk1, CREB1, p300, p107, NFkB, cdc2A, mdm2, p21, p53, p65, p73 BCAS4, BCAS 3 Ov an antibody of any one of the following proteins: RBP2, E2F4, E2F1, SUMO, HDAC-1, crb2, Int2, cmd2, cycE / cdk2, cdk1,, CREB1 and p300, Rb, p 107, pi 30 of the families of protein pockets NFkB JL cdc2A, mdm2, p21, p53, p65, Ki67, CAF1, cyclin A and D1, CHUK. BCAS3 BCAS4 carrier solute
5. Méthode de détection du complexe Liv21 humain, caractérisée en ce qu'elle comprend la mise en œuvre d'au moins une sonde spécifique d'au moins une séquence dudit complexes Liv21 selon la revendication 1 ou 2. 5. Method for detecting the human Liv21 complex, characterized in that it comprises the implementation of at least one probe specific for at least one sequence of said Liv21 complexes according to claim 1 or 2.
6. Méthode de détection du complexe Liv21 humain selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre la mise en uvre d'au moins une sonde spécifique d'au moins une séquence dudit complexe Liv21 et de ses partenaires associés selon l'une quelconques des revendications 3 à 4. 6. Method for detecting the human Liv21 complex according to claim 5, characterized in that it further comprises the implementation of at least one probe specific for at least one sequence of said Liv21 complex and its associated partners according to the invention. any of claims 3 to 4.
7. Méthode de détection selon la revendication 5 ou 6, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins les étapes suivantes: 7. Method of detection according to claim 5 or 6, characterized in that it comprises at least the following steps:
- une étape d'extraction du matériel biologique d'un échantillon biologique prélevé chez un patient,  a step of extracting the biological material from a biological sample taken from a patient,
- une étape de mise en contact dudit matériel biologique avec  a step of bringing said biological material into contact with
au moins ladite sonde spécifique de l'une quelconque des séquences dudit complexe Liv21 humain ou dudit complexe Liv21 et de ses partenaires associés, et at least said probe specific for any of the sequences of said human Liv21 complex or Liv21 complex and its associated partners, and
au moins un contrôle, et at least one check, and
- une étape de détection de l'expression des produits d'expression des gènes dudit complexe Liv21 humain ou dudit complexe Liv21 et de ses partenaires associés, lesdits produits d'expression étant constitués par des ARN messagers, ou des peptides, ou des protéines.  a step of detecting the expression of gene expression products of said human Liv21 complex or of said Liv21 complex and its associated partners, said expression products being constituted by messenger RNAs, or peptides, or proteins.
8. Méthode de détection selon la revendication 7, caractérisée en ce qu'elle vise en outre à cribler un composé candidat, ledit composé candidat étant capable de moduler l'activité dudit complexe Liv21 humain, et en ce qu' elle comprend en outre : 8. Detection method according to claim 7, characterized in that it further seeks to screen a candidate compound, said candidate compound being capable of modulating the activity of said human Liv21 complex, and in that it further comprises:
une étape de mise en contact dudit matériel biologique avec ledit composé candidat, et une étape de sélection dudit composé candidat. a step of contacting said biological material with said candidate compound, and a step of selecting said candidate compound.
9. Méthode selon la revendication 7, caractérisée 9. Method according to claim 7, characterized
en ce que ledit échantillon biologique est prélevé chez un patient atteint du cancer et chez un patient sain, et in that said biological sample is taken from a patient with cancer and from a healthy patient, and
en ce que ledit matériel biologique comprend in that said biological material comprises
des extraits cellulaires nucléaires, et nuclear cell extracts, and
des extraits cellulaires cytoplasmiques, ou cytoplasmic cell extracts, or
des extraits cellulaires membranaires, et membrane cell extracts, and
en ce qu'elle comprend en outre une étape de détermination de la sous expression et de la surexpression des produits des gènes dudit complexes Liv21 humain ou dudit complexe Liv21 humain et de ses partenaires associés desdits extraits biologiques. in that it further comprises a step of determining the under expression and overexpression of the gene products of said human Liv21 complexes or said human Liv21 complex and its associated partners of said biological extracts.
10. Méthode selon la revendication 9, caractérisée 10. Method according to claim 9, characterized
en ce qu'elle comprend en outre une étape de détermination des ratios desdites sous expression et surexpression desdits produits des gènes: in that it further comprises a step of determining the ratios of said under-expression and overexpression of said gene products:
des extraits cellulaires nucléaires, et nuclear cell extracts, and
des extraits cellulaires cytoplasmiques, ou cytoplasmic cell extracts, or
des extraits cellulaires membranaires, et membrane cell extracts, and
en ce qu'elle comprend en outre une étape d'analyse jumelée desdits ratios dudit matériel biologique prélevé chez un patient atteint du cancer et chez un patient, sain.in that it further comprises a step of paired analysis of said ratios of said biological material taken from a patient with cancer and from a patient, healthy.
11. Méthode selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, caractérisée en ce qu'elle met en œuvre une biopuce, sur laquelle est déposée au moins l'une quelconque des sondes spécifiques des séquences dudit complexe Liv21 humain selon la revendication 1 ou 2 et 3 ou 4. 11. Method according to any one of claims 8 to 10, characterized in that it implements a biochip, on which is deposited at least one of the probes specific sequences of said human Liv21 complex according to claim 1 or 2 and 3 or 4.
12. Méthode selon les revendications 1 à 11 caractérisées en ce qu'elle s'appliquent aux cancers du cerveau, neuroblastome, glioblastome, sans être limité à ceux là et 12. Method according to claims 1 to 11 characterized in that it applies to brain cancers, neuroblastoma, glioblastoma, without being limited to those there and
et le cancer du sein, de la vessie, de la peau et de la prostate  and breast, bladder, skin and prostate cancer
13. Méthode selon les revendications 1 à 5 caractérisées en ce qu'elles s ' appliquent  13. Method according to claims 1 to 5 characterized in that they apply
à traiter les cancers en utilisant des siRNA (SEQ ID N° 91 à 118) .  treating cancers using siRNAs (SEQ ID NOS: 91-118).
14. Méthode d'approche thérapeutique par injection d'un peptide vectorisé comme par exemple le peptide SEQ ID N° 215.  14. Method of therapeutic approach by injection of a vectorized peptide such as for example the peptide SEQ ID No. 215.
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