WO2012124798A1 - 試料中の総プロテインsの活性測定試薬及び活性測定方法 - Google Patents
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- G01N2800/22—Haematology
- G01N2800/226—Thrombotic disorders, i.e. thrombo-embolism irrespective of location/organ involved, e.g. renal vein thrombosis, venous thrombosis
Definitions
- the present invention relates to an activity measuring reagent and an activity measuring method capable of measuring the activity of total protein S in a sample.
- the present invention is particularly useful in the field of life science such as clinical examination, molecular biology, and medicine.
- Protein S is a plasma protein that functions centrally in the control mechanism of the blood coagulation system in the living body.
- This protein S is mainly present in blood and is a prosthetic factor (cofactor) of activated protein C, which can increase the activity of activated protein C, and is activated in blood. It is indispensable for the function of protein C.
- activated protein C decomposes activated blood coagulation factor V (factor Va; FVA) and activated blood coagulation factor VIII (factor VIIIa; FVIIIa) that promote blood coagulation in humans. It is a factor that plays a role in suppressing the blood coagulation reaction.
- Protein S specifically binds one-to-one with a C4b binding protein (complement factor 4b binding protein; C4bBP) to form a complex. That is, the C4b binding protein is a protein S ligand.
- C4b binding protein is a protein S ligand.
- This complex formation reaction between protein S and C4b binding protein is as shown below, but this reaction is a reversible reaction.
- C4b binding protein is usually smaller than that of protein S and the dissociation constant is small, “protein S” and “protein S-C4b binding protein complex” are present in blood. Only exists. In other words, the equilibrium of the above reaction is completely to the right.
- protein S-C4b binding protein complex ie, bound type
- protein S in free state S "(ie free). Only free protein S (that is, free form) exhibits a coenzyme activity for activated protein C and can increase the activity of activated protein C.
- protein S or C4b binding protein means that each of these substances, unless there is a description of complex (or binding type) or free (or free type). It shall mean the generic name of complex (or bound) and free (or free).
- the schematic diagram of the control mechanism of the blood coagulation system by protein C and protein S is shown below.
- protein C is limitedly decomposed by the thrombin / thrombomodulin complex and activated by releasing the activated peptide to become activated protein C.
- Activated protein C is a serine protease that plays a role in suppressing blood coagulation by degrading activated blood coagulation factor V and activated blood coagulation factor VIII that promote blood coagulation in humans.
- Protein S is a prosthetic factor (cofactor) of activated protein C, and the presence of protein S increases the activity of activated protein C, and the activated blood coagulation factor V degradation reaction by activated protein C and The degradation reaction of activated blood coagulation factor VIII is promoted.
- a decrease or abnormality in the activity of protein S which has a function of suppressing the blood coagulation reaction, can cause thrombosis in vivo.
- people with congenital anomalies of protein S frequently have arterial thrombosis such as deep vein thrombosis, venous thrombosis such as superficial phlebitis or pulmonary infarction, or coronary thrombosis causing heart failure. Will develop symptoms.
- a decrease or abnormality in protein S activity is also observed in disseminated intravascular coagulation syndrome (DIC), vitamin K deficiency, or hepatic hypofunction.
- DIC disseminated intravascular coagulation syndrome
- vitamin K deficiency or hepatic hypofunction
- the sample is incubated with protein C-activator from snake venom under the formation of activated protein C, and blood coagulation factor XII, blood coagulation factor VII or blood
- protein C-activator from snake venom under the formation of activated protein C
- blood coagulation factor XII, blood coagulation factor VII or blood A method of photometrically measuring the decrease in thrombin formation from prothrombin mediated by blood coagulation factor and its activator, using a chromogenic thrombin substrate, by adding an activator of coagulation factor II (prothrombin) Is disclosed (see Patent Document 1).
- a protein C activator or protein C activating protein C is added to a plasma sample, and then activated blood coagulation factor IX is added and incubated.
- the amount of thrombin produced is measured by a known method, and this is compared with the value obtained by measuring a sample with known protein S activity to measure the activity of protein S in the sample. It is disclosed (see Patent Document 2).
- the sample is incubated with activated protein C, blood coagulation factor VIII, phospholipids and calcium ions, and then this mixture is activated with blood coagulation.
- the components (factors) [for example, activated blood coagulation X
- the factor is deficient or decreased in the sample provider, at least one of the reaction components (factors) of the measurement reaction is not present in a sufficient amount, so the measurement reaction does not proceed sufficiently and the protein obtained
- the S activity value has a problem that it is far from the original value and includes an error. That is, there is a problem that the measured value is influenced by the amount (concentration) in the sample of the component (factor) related to the blood coagulation reaction or its variation.
- the present inventors are in a sample containing activated protein C, phospholipid, calcium ion, activated blood coagulation factor V, activated blood coagulation factor X, prothrombin and thrombin substrate that is not derived from the sample.
- a protein S activity measuring reagent, and activated protein C, phospholipid, calcium ion, activated blood coagulation factor V, activated blood coagulation factor X, prothrombin and thrombin substrate not derived from the sample Next, the amount of signal generated from the substrate of thrombin as a result of the reaction by each component described above is measured, and then the amount of signal whose generation is suppressed according to the activity of protein S contained in the sample is obtained.
- both the conventional method for measuring the activity of protein S and the reagent for measuring the activity of protein S include all the proteins S present in the sample (complexes of protein S and C4b binding protein (binding type), and free protein). S (free form)], that is, the activity of total protein S could not be measured.
- JP-A-62-212569 Japanese National Patent Publication No. 4-506603 JP-T 6-504682 JP 2004-337143 A
- the object of the present invention is to determine the activity of all protein S present in a sample [complex of protein S and C4b-binding protein (binding type) and free protein S (free type)], that is, total protein
- the present invention provides a reagent for measuring the activity of total protein S in a sample and a method for measuring the activity, which can measure the activity of S.
- the inventors of the present invention have studied the method for measuring the activity of total protein S and the reagent for measuring the activity of total protein in a sample, and can solve the above-mentioned problems by making a surfactant present during the measurement reaction of the total protein S activity. As a result, the present invention has been completed. That is, this invention consists of the following invention. (1) A method for measuring the activity of total protein S in a sample, wherein a surfactant is present during the measurement reaction of the total protein S activity. Method.
- Phospholipids comprising phosphatidylcholine, phosphatidylserine and phosphatidylethanolamine at the time of increased activity of activated protein C by protein S and at the time of degradation of activated blood coagulation factor V by activated protein C having increased activity.
- the method for measuring the activity of total protein S in a sample according to any one of (1) to (3), which is present.
- the measurement of total protein S activity in a sample is performed by a method including the following steps (a) to (c): (1) to (4) For measuring the activity of total protein S in the samples.
- Phospholipids composed of phosphatidylcholine, phosphatidylserine and phosphatidylethanolamine are activated during the activation reaction of activated protein C by protein S and during the degradation reaction of activated blood coagulation factor V by activated protein C having increased activity.
- the reagent for measuring the activity and the method for measuring the activity of total protein S in the sample of the present invention include all protein S [complex of protein S and C4b binding protein (bound type), free protein S ( The activity of free form)], that is, the activity of total protein S can be measured. That is, the reagent for measuring the activity and the method for measuring the activity of total protein S in the sample of the present invention include a complex of “protein S and C4b binding protein (binding) in addition to the activity of“ free protein S (free form) ”. The activity expressed when the protein S contained in the "type" becomes free protein S (free form) can also be measured.
- the reagent for measuring the activity of total protein S and the method for measuring the activity of the total protein S in the sample of the present invention can be used for all protein S [complex of protein S and C4b binding protein (bound type) and free For protein S (free form)], an activity value of protein S corresponding to the protein amount can be obtained.
- Method for measuring the activity of total protein S in a sample of the present invention is a method for measuring the activity of total protein S in a sample, wherein a surfactant is present during the measurement reaction of the total protein S activity. This is a method for measuring the activity of total protein S in a sample.
- the activation reaction of activated protein C by protein S and the degradation reaction of activated blood coagulation factor V by activated protein C having increased activity are performed. Sometimes it is preferred to have a surfactant present.
- a phospholipid composed of phosphatidylcholine, phosphatidylserine and phosphatidylethanolamine is present during the measurement reaction of the total protein S activity.
- the activation reaction of activated protein C by protein S and the degradation reaction of activated blood coagulation factor V by activated protein C having increased activity are performed.
- the measurement of the total protein S activity in the sample is performed by a method comprising the following steps (a) to (c): preferable.
- A) Contact activated protein C, surfactant, phospholipid, calcium ion, activated blood coagulation factor V, activated blood coagulation factor X, prothrombin and thrombin substrate with the sample.
- B) Next, the amount of signal generated from the substrate of thrombin as a result of the reaction by each component of (a) is measured.
- the activity value of the total protein S contained in the sample is obtained from the signal amount whose production is suppressed according to the activity of the total protein S contained in the sample.
- the measurement of the total protein S activity in the sample is carried out by a method comprising the following steps (a) to (e): Is preferred.
- the reagent for measuring the activity of total protein S in the sample of the present invention includes activated protein C, surfactant, phospholipid, calcium ion, activated blood coagulation factor V, activated blood coagulation factor X, prothrombin and thrombin. It is a reagent for measuring the activity of total protein S in a sample containing a substrate.
- the surfactant is used for the activated blood coagulation activity by activated protein C during the activation reaction of activated protein C by protein S and by the activated protein C having increased activity. It is preferably present during the factor V decomposition reaction.
- the phospholipid is preferably a phospholipid composed of phosphatidylcholine, phosphatidylserine and phosphatidylethanolamine.
- the phospholipid composed of phosphatidylcholine, phosphatidylserine and phosphatidylethanolamine is activated during the activity-increasing reaction of activated protein C by protein S and the activity increased.
- it is present during the decomposition reaction of activated blood coagulation factor V by activated protein C.
- the reagent for measuring the activity of total protein S in the sample of the present invention is preferably for measuring the total protein S activity in the sample including the following steps (a) to (c).
- A) Contact activated protein C, surfactant, phospholipid, calcium ion, activated blood coagulation factor V, activated blood coagulation factor X, prothrombin and thrombin substrate with the sample.
- B) Next, the amount of signal generated from the substrate of thrombin as a result of the reaction by each component of (a) is measured.
- the activity value of the total protein S contained in the sample is obtained from the signal amount whose production is suppressed according to the activity of the total protein S contained in the sample.
- the reagent for measuring the activity of total protein S in the sample of the present invention is preferably for measuring the total protein S activity in the sample including the following steps (a) to (e).
- the contact between these components and the sample may be performed with all the components at one time, and all the reactions in the following reaction system may be performed in one stage (one-step method).
- the reaction of the following reaction system may be performed in a plurality of stages by dividing the components and performing the contact in a plurality of stages (multi-step method).
- the amount of signal generated from the thrombin substrate by this series of reactions is then measured. That is, the thrombin substrate is subjected to an action such as degradation by thrombin by the series of reactions described above, and the amount of signal (for example, absorbance etc.) generated as a result is measured.
- the degree of inhibition of this signal generation increases according to the activity of total protein S contained in the sample.
- the amount of signal whose production is suppressed by the suppression of the reaction in (d) is measured. As described above, the amount of signal generated by the above reaction is measured, that is, the amount of signal whose generation is suppressed is measured, thereby obtaining the activity value of total protein S contained in the sample. 3. sample In the method and method for measuring the activity of total protein S in a sample of the present invention, the sample is a substance that may contain protein S. Examples of this sample include biological samples (samples derived from humans or animals).
- biological samples include blood, plasma, saliva, sweat, urine, tears, cerebrospinal fluid, ascites, amniotic fluid, and other biological fluids; liver, heart, brain, bone, hair, skin, nails, muscle, nerve tissue, etc. And extracts of organs, tissues, cells and the like. 4).
- Activated protein C The activated protein C used in the method for measuring the activity of total protein S and the reagent for measuring activity in the sample of the present invention can be used without particular limitation regardless of its origin (origin) and preparation method. For example, the thing derived from mammals, such as a human, a cow, or a pig, etc. can be mentioned.
- activated protein C is produced from protein C by a protein C activator or the like, and this is used as the activity in the present invention. It may be used as modified protein C.
- activated protein C is brought into contact with the sample, so that when protein S is contained in the sample, phospholipid and calcium In the presence of ions, the activity of this activated protein C increases.
- Activated protein C serves as a catalyst for a reaction that decomposes activated blood coagulation factor V in the presence of phospholipids and calcium ions.
- the presence of protein S promotes the reaction of activated protein C degrading activated blood coagulation factor V.
- Contacting the sample with activated protein C or the like and contacting activated protein C with activated blood coagulation factor V or the like may be performed simultaneously. Further, activated protein C is brought into contact with the sample together with phospholipid, and after being incubated at room temperature or 37 ° C. for at least 1 minute or more, preferably 5 minutes or more, then contacted with activated blood coagulation factor V and calcium ions, Incubation may be followed by a degradation reaction of activated blood coagulation factor V.
- the concentration of the activated protein C is contacted with the activated blood coagulation factor V, and when the activated blood coagulation factor V is decomposed in the presence of a surfactant, phospholipid and calcium ion, Usually, it is preferably 1 pM to 100 nM. However, in order to obtain high measurement sensitivity, it is preferable that the activated protein C concentration is high. Therefore, the activated protein C concentration is more preferably 10 pM to 10 nM, and more preferably 100 pM to 1 nM. Particularly preferred.
- the reagent for measuring the activity of total protein S in the sample of the present invention contains the activated protein C so that the concentration of the activated protein C becomes the above-mentioned concentration during the degradation reaction of the activated blood coagulation factor V. It is preferable to make it.
- activated protein C is preferably contained in an amount of 1 pM to 200 nM, more preferably 10 pM to 20 nM, and particularly preferably 100 pM to 2 nM. 5.
- Surfactant In the method for measuring the activity of total protein S of the present invention, a surfactant is present during the measurement reaction of the total protein S activity.
- the activated protein C phospholipid, calcium ion, activated blood coagulation factor V, activated blood coagulation factor X, prothrombin and thrombin substrate, Contains an active agent.
- the surfactant one or more kinds of various surfactants such as a nonionic surfactant, an amphoteric surfactant, an anionic surfactant or a cationic surfactant are appropriately present. You can do it.
- surfactant examples include sorbitan fatty acid ester, glycerin fatty acid ester, decaglycerin fatty acid ester, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, polyoxyethylene glycerin fatty acid ester, polyethylene glycol fatty acid ester, polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyethylene.
- Nonionic surfactants such as phytosterol, phytostanol, polyoxyethylene polyoxypropylene alkyl ether, polyoxyethylene alkylphenyl ether, polyoxyethylene castor oil, hydrogenated castor oil or polyoxyethylene lanolin; amphoteric interfaces such as betaine acetate An activator; or polyoxyethylene alkyl ether sulfate or polyoxyethylene alkyl ether acetate It may be mentioned an ionic surfactant or the like. When this surfactant is a nonionic surfactant, its HLB (Hydrophile-Lipophile Balance) is preferably in the range of 10 to 20, more preferably in the range of 12 to 18, and 13 to 16 The thing of the range of is especially preferable.
- HLB Hydrophile Balance
- AM-301 laauryl dimethylamino acetic acid betaine aqueous solution
- anionic surfactant sarcosinate LN [lauroyl sarcosine sodium] etc. are preferable.
- cationic surfactant CA-2350 [cetyltrimethylammonium chloride] and the like are preferable.
- the concentration of the surfactant in the reaction for measuring the total protein S activity is not particularly limited, but is preferably 0.00001-5% (W / V), 0.0001-1% (W / V) is more preferable, 0.001 to 0.1% (W / V) is further preferable, and 0.005 to 0.05% (W / V) is particularly preferable.
- 0.00001-5% (W / V) 0.0001-1% (W / V) is more preferable
- 0.001 to 0.1% (W / V) is further preferable
- 0.005 to 0.05% (W / V) is particularly preferable.
- For nonionic surfactants 0.001 to 0.01% (W / V) is very preferable, and for zwitterionic surfactants, 0.001 to 0.01% (W / V) is used.
- 0.001 to 0.1% (W / V) is highly preferred for anionic surfactants, and 0.00001 to 0.001% (W / V) for cationic surfactants
- this activity measuring reagent contains a surfactant so that the surfactant has the above-mentioned concentration during the measurement reaction of the total protein S activity.
- a surfactant so that the surfactant has the above-mentioned concentration during the measurement reaction of the total protein S activity.
- the activator is contained at a concentration of 0.001 to 0.2% (W / V), and the cationic surfactant is contained at a concentration of 0.00001 to 0.002% (W / V).
- the activated blood by activated protein C at the time of the activity of activated protein C by the protein S contained in the sample and at the increased activity of the protein C.
- Phospholipid (1) General In the method for measuring the activity of total protein S and the reagent for measuring activity of the present invention, phospholipid is present during the measurement reaction of the total protein S activity. This phospholipid can be used without particular limitation regardless of its origin (origin) and preparation method. Examples thereof include those derived from mammals such as humans, cows and pigs, those derived from other animals, those derived from plants, those derived from microorganisms, and those synthesized artificially.
- the concentration when phospholipid is present is usually preferably from 0.03 ⁇ M to 100 ⁇ M, more preferably from 0.3 ⁇ M to 50 ⁇ M, and from 3 ⁇ M to 30 ⁇ M. Is particularly preferred.
- the reagent for measuring the activity of total protein S in the sample of the present invention is preferably contained in the reagent for measuring activity so that the phospholipid has the aforementioned concentration during the measurement reaction of the total protein S activity.
- the activity measurement reagent preferably contains 0.03 ⁇ M to 200 ⁇ M of phospholipid, more preferably 0.3 ⁇ M to 100 ⁇ M, and particularly preferably 3 ⁇ M to 60 ⁇ M.
- the phospholipid examples include glycerophospholipids such as phosphatidylcholine, phosphatidylserine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylinositol, phosphatidylglycerol, and diphosphatidylglycerol, and sphingophospholipids such as sphingomyelin.
- glycerophospholipids such as phosphatidylcholine, phosphatidylserine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylinositol, phosphatidylglycerol, and diphosphatidylglycerol
- sphingophospholipids such as sphingomyelin.
- the composition of these three types of phospholipids is a composition ratio of phosphatidylethanolamine of 10% (W / V) or more, and The composition ratio of phosphatidylserine is preferably 20% (W / V) or more.
- the composition ratio of phosphatidylethanolamine is preferably 30% (W / V) or more, and the composition ratio of phosphatidylserine is preferably 30% (W / V) or more.
- the activated blood coagulation factor V at the time of the activity increase reaction of activated protein C by protein S contained in the sample and this activated protein C
- phospholipids necessary for the activation reaction of the activated protein C and the decomposition reaction of activated blood coagulation factor V are present.
- This phospholipid can be used without particular limitation regardless of its origin (origin) and preparation method. Examples thereof include those derived from mammals such as humans, cows and pigs, those derived from other animals, those derived from plants, those derived from microorganisms, and those synthesized artificially.
- the concentration of phospholipid in the presence of the activated protein C activity increasing reaction and the activated blood coagulation factor V decomposition reaction is usually preferably 0.1 ⁇ M to 100 ⁇ M, and preferably 1 ⁇ M to 50 ⁇ M. More preferably, it is more preferably 10 ⁇ M to 30 ⁇ M.
- the concentration of phospholipid is adjusted to the above-mentioned concentration at the time of activated protein C activity increasing reaction and activated blood coagulation factor V decomposition reaction. It is preferable to be contained in this activity measurement reagent.
- the activity measurement reagent preferably contains 0.1 ⁇ M to 200 ⁇ M of phospholipid, more preferably 1 ⁇ M to 100 ⁇ M, and particularly preferably 10 ⁇ M to 60 ⁇ M.
- the phospholipid include glycerophospholipids such as phosphatidylcholine, phosphatidylserine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylinositol, phosphatidylglycerol, and diphosphatidylglycerol, and sphingophospholipids such as sphingomyelin.
- the phospholipid As the phospholipid, the presence of a phospholipid composed of phosphatidylcholine, phosphatidylserine, and phosphatidylethanolamine at the time of the activity-increasing reaction of activated protein C and the decomposition reaction of activated blood coagulation factor V, Preferred for measuring the activity of total protein S in a sample.
- the composition of these three types of phospholipids is a composition ratio of phosphatidylethanolamine of 10% (W / V) or more, and The composition ratio of phosphatidylserine is preferably 20% (W / V) or more.
- the composition ratio of phosphatidylethanolamine is preferably 30% (W / V) or more, and the composition ratio of phosphatidylserine is preferably 30% (W / V) or more.
- Phospholipids used for catalytic reaction by activated blood coagulation factor X In the method for measuring the activity of total protein S and the reagent for measuring the activity of the present invention, in the reaction of generating thrombin from prothrombin catalyzed by activated blood coagulation factor X in the presence of activated blood coagulation factor V, the reaction is performed. Make the necessary phospholipids present.
- This phospholipid can be used without particular limitation regardless of its origin (origin) and preparation method. Examples thereof include those derived from mammals such as humans, cows and pigs, those derived from other animals, those derived from plants, those derived from microorganisms, and those synthesized artificially.
- the concentration when phospholipid is present during the reaction for generating thrombin from prothrombin is usually preferably 0.1 ⁇ M to 100 ⁇ M, more preferably 0.5 ⁇ M to 50 ⁇ M, and 1 ⁇ M to 10 ⁇ M. It is particularly preferred.
- the reagent for measuring the activity of total protein S in the sample of the present invention is preferably contained in this activity measuring reagent so that the phospholipid has the above-mentioned concentration during the reaction for generating thrombin from prothrombin.
- this activity measurement reagent preferably contains 0.1 ⁇ M to 200 ⁇ M of phospholipid, more preferably 0.5 ⁇ M to 100 ⁇ M, and particularly preferably 1 ⁇ M to 20 ⁇ M.
- the phospholipid examples include glycerophospholipids such as phosphatidylcholine, phosphatidylserine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylinositol, phosphatidylglycerol, and diphosphatidylglycerol, and sphingophospholipids such as sphingomyelin.
- glycerophospholipids such as phosphatidylcholine, phosphatidylserine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylinositol, phosphatidylglycerol, and diphosphatidylglycerol
- sphingophospholipids such as sphingomyelin.
- the phospholipid in the reaction for generating thrombin from the prothrombin, the presence of a phospholipid composed of phosphatidylcholine and phosphatidylserine, or phosphatidylcholine,
- the composition of these two types of phospholipids is a composition ratio of phosphatidylcholine of 85% (W / V) to 50% (W / V),
- the composition ratio of phosphatidylserine is preferably 15% (W / V) to 50% (W / V).
- the composition ratio of phosphatidylcholine is 80% (W / V) to 70% (W / V)
- the composition ratio of phosphatidylserine is 20% (W / V) to 30% (W / V). Is preferred.
- the composition of the three types of phospholipids is a composition ratio of phosphatidylethanolamine of 10% (W / V) or more, and The composition ratio of phosphatidylserine is preferably 20% (W / V) or more.
- the composition ratio of phosphatidylethanolamine is preferably 30% (W / V) or more, and the composition ratio of phosphatidylserine is preferably 30% (W / V) or more.
- the phospholipid used in the above-mentioned activity-increasing reaction of activated protein C and the decomposition reaction of activated blood coagulation factor V may be used as it is. it can.
- the composition of a suitable phospholipid differs depending on each reaction, and therefore it is preferable to use a phospholipid having a composition suitable for each reaction in the presence of the reaction.
- a phospholipid having a composition suitable for the activated protein C activity increase reaction and the activated blood coagulation factor V decomposition reaction previously added is the prothrombin.
- the activated blood coagulation process by activated protein C is performed during the reaction of increasing the activity of activated protein C by protein S contained in the sample. Calcium ions are present during the factor V degradation reaction and during the reaction of generating thrombin from prothrombin by activated blood coagulation factor X and activated blood coagulation factor V.
- calcium ion not only calcium ion itself but also a compound containing calcium ion such as calcium salt can be used without particular limitation.
- the compound containing calcium ions include calcium fluoride, calcium chloride, calcium bromide, calcium iodide, calcium sulfate, calcium nitrate, calcium acetate, calcium lactate, and calcium cyanide.
- the concentration of this calcium ion is determined during the activation reaction of activated protein C by protein S contained in the sample, during the degradation reaction of activated blood coagulation factor V by activated protein C, and In the reaction for generating thrombin from prothrombin by activated blood coagulation factor X and activated blood coagulation factor V, it is usually preferably 0.1 mM to 100 mM, particularly preferably 1 mM to 10 mM. .
- calcium ions are contained in the activated protein C activity increasing reaction, activated blood coagulation factor V decomposition reaction and thrombin generation reaction.
- this activity measurement reagent may contain so that it may become the density
- calcium ions or compounds containing calcium ions are preferably contained in the activity measuring reagent in an amount of 0.1 mM to 200 mM, and particularly preferably 1 mM to 20 mM. 8).
- Activated blood coagulation factor V The activated blood coagulation factor V (factor Va; FVa) used in the method for measuring the activity of total protein S and the reagent for measuring activity in the sample of the present invention is not particularly limited regardless of its origin (origin) and preparation method. Can be used. For example, the thing derived from mammals, such as a human, a cow, or a pig, etc. can be mentioned.
- activated blood coagulation factor V is degraded by activated protein C in the presence of a surfactant, phospholipid and calcium ion.
- Activated blood coagulation factor V promotes the reaction of generating thrombin from prothrombin catalyzed by activated blood coagulation factor X in the presence of phospholipids and calcium ions.
- activated blood coagulation factor V after contacting activated blood coagulation factor V with activated protein C together with surfactant, phospholipid and calcium ions and incubating at room temperature or at 37 ° C. for at least 1 minute, preferably 5 minutes or more, It is preferable to perform a reaction in which thrombin is generated from prothrombin by in contact with activated blood coagulation factor X, prothrombin, and the like.
- the concentration at which this activated blood coagulation factor V is used is brought into contact with activated protein C to cause a reaction to decompose the activated blood coagulation factor V in the presence of a surfactant, phospholipid and calcium ions. In general, it is preferably 0.5 pM to 5 nM.
- the activated blood coagulation factor V concentration is more preferably 5 pM to 500 pM, and particularly preferably 20 pM to 200 pM.
- the activity measuring reagent is used so that the activated blood coagulation factor V becomes the above concentration during the degradation reaction of the activated blood coagulation factor V. It is preferable to make it contain.
- the activated blood coagulation factor V is preferably contained in an amount of 0.5 pM to 10 nM, more preferably 5 pM to 2 nM, and particularly preferably 20 pM to 1 nM.
- the activated blood coagulation factor X (factor Xa; FXa) used in the method for measuring the activity of total protein S and the reagent for measuring activity in the sample of the present invention is not particularly limited, regardless of its origin (origin) or preparation method. Can be used. For example, the thing derived from mammals, such as a human, a cow, or a pig, etc. can be mentioned.
- activated blood coagulation factor X catalyzes a reaction for producing thrombin from prothrombin in the presence of phospholipid and calcium ion. This reaction of generating thrombin from prothrombin by activated blood coagulation factor X is promoted by the presence of activated blood coagulation factor V.
- the activity of activated protein C increases, thereby promoting the degradation reaction of activated blood coagulation factor V, and thus the activity. Since the effect of activating blood coagulation factor V on the reaction that generates thrombin catalyzed by activated blood coagulation factor X is reduced, the reaction that generates thrombin is suppressed.
- the concentration is usually in contact with activated blood coagulation factor V, prothrombin, etc., and when thrombin is produced from prothrombin in the presence of phospholipid and calcium ion, It is preferably 0.1 pM to 300 pM.
- the concentration of this activated blood coagulation factor X is high, the blood coagulation reaction by the component (factor) derived from the sample proceeds as in the case of the above-mentioned activated blood coagulation factor V, and fibrin Or a large amount of color develops and accurate measurement cannot be performed. Therefore, the activated blood coagulation factor X concentration is more preferably 1 pM to 100 pM, and particularly preferably 10 pM to 50 pM. preferable.
- the protein S activity measurement reagent in the sample of the present invention is preferably contained in the activity measurement reagent so that the activated blood coagulation factor X is at the above-mentioned concentration during the thrombin generation reaction.
- the activated blood coagulation factor X is preferably contained at 0.1 pM to 600 pM, more preferably 1 pM to 200 pM, and particularly preferably 10 pM to 100 pM.
- Prothrombin The prothrombin used in the method for measuring the activity of total protein S and the reagent for measuring activity in the sample of the present invention can be used without particular limitation regardless of its origin (origin) and preparation method. For example, the thing derived from mammals, such as a human, a cow, or a pig, etc. can be mentioned. Moreover, what was refine
- prothrombin becomes a substrate for the reaction catalyzed by activated blood coagulation factor X in the presence of phospholipid and calcium ion, and becomes thrombin.
- This reaction of generating thrombin from prothrombin by activated blood coagulation factor X is promoted by the presence of activated blood coagulation factor V. Therefore, as described above, when protein S is contained in the sample, the activity of activated protein C increases, thereby promoting the degradation reaction of activated blood coagulation factor V, and thus the activity.
- the concentration of prothrombin used is usually 1 nM when thrombin is produced from prothrombin in the presence of phospholipids and calcium ions in contact with activated blood coagulation factor V and activated blood coagulation factor X. It is preferably from ⁇ 50 ⁇ M, more preferably from 50 nM to 5 ⁇ M, and particularly preferably from 100 nM to 1 ⁇ M.
- the reagent for measuring the activity of total protein S in the sample of the present invention is preferably contained in this activity measuring reagent so that prothrombin has the aforementioned concentration during the thrombin generation reaction.
- thrombin substrate used in the method for measuring the activity of total protein S and the reagent for measuring activity in the sample of the present invention is one that generates some signal by receiving a catalytic action (as a thrombin substrate) of thrombin as a protease, or by thrombin Any other signal can be used as long as it produces some signal by continuing other reactions in addition to the catalytic reaction. This kind of signal is generated, but it is possible to detect the generation or change of a signal (signal) in optical, electrical, magnetic, or other energy by being catalyzed by thrombin. Means that.
- the absorbance, transmittance or fluorescence intensity changes due to the catalytic action of thrombin in which the light absorption curve changes, or in which light is emitted.
- this include peptides or proteins bound to compounds that change absorbance, transmittance or fluorescence intensity, or light absorption curves when released, or peptides bound to compounds that emit light when released or Examples thereof include proteins and the like, and substances that release the compound from the peptide or protein by the catalytic action of thrombin. In such substances, thrombin is catalyzed, and when the compound is liberated, it can be detected as absorbance, transmittance or fluorescence intensity, light absorption curve change or light emission, etc.
- the enzyme activity can be determined by measuring the amount of the generated signal (absorbance, transmittance or fluorescence intensity, change in light absorption curve or light emission, etc.).
- a substance for example, “HD-phenylalanyl-L-pipecolyl-L-arginyl-p-nitroanilide dihydrochloride” [Test Team (registered trademark) chromogenic substrate S-2238] (manufacturer : Chromogenix-Instrumentation Laboratories [Italy], distributor: Sekisui Medical [Japan]], “HD-hexahydrotyrosyl-L-alanyl-L-arginyl-p-nitroanilide diacetate” [SPECTROZYME (registered trademark) TH] (AMERICAN DIAGNOSTICA, Cosmo Bio), “Benzoyl-phenylalanyl-valinyl-arginyl-p-nitroanilide hydrochloride” [Thrombin Substrate I,
- “HD-phenylalanyl-L-pipecolyl-L-arginyl-p-nitroanilide dihydrochloride” is preferable.
- Contacting the activated blood coagulation factor V, activated blood coagulation factor X and prothrombin, etc., and contacting the generated thrombin with the substrate of this thrombin may be performed simultaneously or separately. The steps may be performed separately.
- the thrombin produced is brought into contact with a thrombin substrate and incubated at least at least 1 minute, preferably at least 5 minutes at room temperature or 37 ° C. to generate a signal from the thrombin substrate.
- the concentration when this thrombin substrate is used is usually preferably 5 ⁇ M to 100 mM, particularly preferably 50 ⁇ M to 10 mM, when the thrombin substrate is catalyzed by thrombin.
- the protein S activity measurement reagent in the sample of the present invention is preferably contained in the activity measurement reagent so that the thrombin substrate has the aforementioned concentration when it is catalyzed by thrombin.
- the thrombin substrate is preferably contained in an amount of 5 ⁇ M to 200 mM, particularly preferably 50 ⁇ M to 20 mM.
- the substrate for thrombin in the method for measuring the activity of total protein S and the reagent for measuring activity in the sample of the present invention generates a signal by being catalyzed by thrombin generated from prothrombin.
- the amount of signal generated from the thrombin substrate is measured.
- the amount of this signal is the amount of the signal whose production is suppressed according to the activity value of total protein S in the sample. Measurement of the generated signal amount (signal amount in which generation is suppressed) may be appropriately performed according to the signal.
- the substrate of thrombin is the aforementioned “HD-phenylalanyl-L-pipecolyl-L-arginyl-p-nitroanilide dihydrochloride”, “HD-hexahydrotyrosyl- “L-alanyl-L-arginyl-p-nitroanilide diacetate”, “benzoyl-phenylalanyl-valinyl-arginyl-p-nitroanilide hydrochloride” or “tosyl-glycyl-prolyl-arginyl-p-”
- the absorbance measurement may be a single wavelength measurement of only the main wavelength, or a two-wavelength measurement measured at the main wavelength and the sub wavelength.
- the absorbance measurement may be performed by the end point method or the rate method. 13.
- Activity value of total protein S contained in the sample In the method and reagent for measuring the activity of total protein S in the sample of the present invention, if protein S is contained in the sample, the activity of activated protein C increases, and activated blood coagulation factor V Is promoted, and the abundance (concentration) of activated blood coagulation factor V decreases.
- the amount of signal generated by contacting the sample with activated protein C or the like and carrying out the reaction as described above is measured. That is, by measuring the amount of signal whose production is suppressed, the activity value of total protein S contained in the sample is obtained.
- Obtaining the activity value of total protein S contained in the sample after measuring the amount of signal in which this generation is suppressed may be performed as appropriate. For example, it can be performed as follows. As described above, measurement operation is performed on at least one sample whose activity value of total protein S is known and a sample whose physiological protein S activity value is known to be “zero” (such as physiological saline or pure water).
- a calibration curve is created by expressing the relationship between the generated signal amount (signal amount whose generation is suppressed) and the activity value of the total protein S contained in the sample in a mathematical expression or a graph.
- This calibration curve represents the relationship between the degree of inhibition of signal generation and the activity value of total protein S contained in the sample.
- the measurement operation is performed in the same manner as described above for a sample whose activity value of total protein S is unknown, and the amount of signal generated (the amount of signal with suppressed generation) is obtained. This signal amount is applied to the calibration curve, and the corresponding activity value of total protein S is determined.
- the calibration curve represents the relationship between the amount of signal (the amount of signal with suppressed generation), that is, the degree of inhibition of signal generation, and the activity value of total protein S contained in the sample.
- the amount of signal in the calibration curve may be the measured signal amount itself, or may be a numerical value calculated based on the value of the signal amount. That is, the calibration curve may represent a relationship between a numerical value calculated based on the measured signal amount value and the activity value of total protein S contained in the sample.
- the numerical value calculated based on the value of the measured signal amount corresponds to the signal amount whose generation is suppressed.
- the numerical value calculated based on the measured signal amount value include, for example, a numerical value of a change amount of the measured signal amount per unit time, or a first derivative of the measured signal amount value with respect to time.
- a numerical value calculated by second-order differentiation For example, the amount of change per minute in the absorbance obtained by measurement, or the rate of change in absorbance obtained by first derivative of the absorbance obtained by measurement with respect to time, or the absorbance obtained by measurement in time
- the acceleration of the change in absorbance obtained by second-order differentiation can be exemplified.
- the protein such as albumin such as human serum albumin (HSA), bovine serum albumin (BSA) or ovalbumin, casein, or gelatin is used as described above. It is preferably present during the activity measurement reaction, or is preferably contained in the activity measurement reagent. The concentration at which this protein is present is usually preferably 0.1 ⁇ M to 1 mM. In the reagent for measuring the activity of total protein S in the sample of the present invention, it is preferable to contain the protein in the activity measuring reagent so that the protein has the aforementioned concentration. For example, this protein is preferably contained at 0.1 ⁇ M to 2 mM. 15.
- a salt such as a halogen element and an alkali metal salt or a halogen element and an alkaline earth metal salt is present during the activity measurement reaction. Or is preferably contained in the activity measuring reagent.
- the halogen element and alkali metal salt include sodium chloride, potassium chloride, sodium fluoride, potassium fluoride, sodium bromide, and potassium bromide.
- examples of the salt of a halogen element and an alkaline earth metal include magnesium chloride, magnesium fluoride, and magnesium bromide.
- the concentration at which this salt is present is usually preferably from 5 mM to 1 M, particularly preferably from 50 mM to 250 mM.
- this salt in the activity measuring reagent so as to have the aforementioned concentration.
- this salt is preferably contained in an amount of 5 mM to 2 M, particularly preferably 50 mM to 500 mM. 16. Diluted solution
- the activity measuring reagent in the reagent for measuring the activity of total protein S in the sample of the present invention, it is preferable for the activity measuring reagent to contain a diluent for measuring the activity of total protein S in the sample.
- the pH of this diluted solution is not particularly limited, but is preferably in the pH range of pH 6.0 to pH 10.0 (20 ° C.), preferably in the pH range of pH 6.5 to pH 8.5 (20 ° C.). More preferably.
- this dilution liquid in order to maintain pH in the said pH range, it is preferable to make this dilution liquid contain or contain the buffer which has a buffer capacity in the said pH range suitably.
- components such as proteins, salts, surfactants, preservatives, stabilizers, activators, or saccharides can be appropriately contained in the diluted solution as necessary.
- the diluent include water, physiological saline, phosphate buffered saline, and buffer solution. Although it is a dilution ratio when the sample is diluted with this diluent, there is no particular limitation, but for measuring the activity of total protein S in the sample, it is preferably 2 to 60 times, and preferably 5 to 40 times. More preferred is 10 to 20 times. 17.
- the above activity measurement reaction is preferably performed in the range of pH 6.0 to pH 10.0 (20 ° C.), and pH 6.5 to pH 8.5 ( It is particularly preferable to carry out in the range of 20 ° C.
- the pH is preferably such that the activity measurement reaction is carried out in the pH range of pH 6.0 to pH 10.0 (20 ° C.).
- the pH is particularly preferably such that it is carried out in the pH range of pH 6.5 to pH 8.5 (20 ° C.).
- the buffering capacity is set in the above pH range. It is preferable that the buffering agent to be present or contained appropriately. 18.
- Other ingredients In the method for measuring the activity of total protein S and the reagent for measuring the activity of the total protein S in the sample of the present invention, components other than the above-described components such as preservatives, stabilizers, activators, or saccharides are appropriately added as necessary. It can be present during the activity measurement reaction, or can be contained in the activity measurement reagent. 19.
- the activity of the total protein S in the sample may be measured by a method or using an apparatus such as an automatic analyzer. You may go. 20.
- Measurement stage In the method for measuring the activity of total protein S in the sample and the reagent for measuring the activity of the present invention, the activity measurement reaction described in detail above is performed by bringing all components into contact with the sample at one time. The activity measurement reaction may be performed in multiple stages (multi-step method) by dividing the components and contacting in multiple stages. When dividing into a plurality of stages, there is no particular limitation, but for example, it can be performed as follows.
- Two-step method-1 A sample, activated protein C, surfactant, phospholipid, calcium ion and activated blood coagulation factor V are contacted.
- activated blood coagulation factor X, prothrombin and a substrate of thrombin are brought into contact with the above-mentioned (a).
- Two-step method-2 A sample, activated protein C, surfactant, phospholipid, and calcium ion are contacted.
- composition of total protein S activity measurement reagent in sample In the reagent for measuring the activity of total protein S in the sample of the present invention, all the components of the activity measurement reaction described in detail above may be contained in one reagent (one reagent system). A plurality of reagents such as two or three reagents may be contained separately (multiple reagent system). When each component is contained separately in a plurality of reagents, there is no particular limitation, but for example, it can be contained as follows.
- Example 1 Method for measuring activity of total protein S in the sample of the present invention and reagent 1 for measuring activity
- the effect of the method for measuring the activity of total protein S in the sample of the present invention and the activity measuring reagent was confirmed.
- Total protein S activity measurement reagent (1) First reagent The following components were dissolved in pure water so as to have the respective concentrations described above, and the pH was adjusted to pH 7.5 (20 ° C.) to prepare the first reagent.
- Activated blood coagulation factor X (purified bovine activated blood coagulation factor X; New England Biolabs, Inc, USA) 100 pM Phospholipid Calcium chloride 10.0 mM Bovine serum albumin (BSA; Sigma-Aldrich, USA) 0.1% (W / V) Sodium chloride 0.15M Tris (hydroxymethyl) aminomethane 50 mM Phospholipids include phosphatidylserine (porcine brain phosphatidylserine; PS; DOOSAN Serial Research Laboratories, Korea) 0.6 mg, phosphatidylcholine (porcine liver phosphatidylcholine; PC; DOOSAN Serial Research Laboratories, Korea) 0.4 mg, 1.0 mg of ethanolamine (porcine liver phosphatidylethanolamine; PE; DOOSAN Serial Research Laboratories, Korea) was collected in a test tube, and after evaporation of chloroform as a solvent with an evaporator, distilled water was added for 1
- Phosphatidylserine prepared by vigorous stirring and sonication at 60 ° C. for 10 minutes Phospholipids having a composition ratio of phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine of 3: 2: 5 (ie, 30% (W / V): 20% (W / V): 50% (W / V)) and a concentration of 15 ⁇ M It was made to contain.
- Second reagent The following components were dissolved in pure water so that each concentration was as described, and the pH was adjusted to pH 7.5 (20 ° C.) to prepare a second reagent.
- Prothrombin purified human prothrombin; Enzyme Research Laboratories, Inc., USA
- Test Team registered trademark
- Chromogenic Substrate S-2238 Thrombin Substrate [Thrombin Chromogenic Substrate]; Manufacturer: Chromogenix-Instrumentation Laboratories [Italy], Distributor: Sekisui Medical [Japan]] 1.5 mM Bovine serum albumin (BSA; Sigma-Aldrich, USA) 0.1% (W / V) Sodium chloride 0.15M Tris (hydroxymethyl) aminomethane 50 mM
- Third reagent-a The following components were dissolved in pure water so as to have the respective concentrations described above, and the pH was adjusted to pH 8.0 (20 ° C.) to prepare the third reagent-a
- Phospholipid Calcium chloride 2.5 mM Bovine serum albumin (BSA; Sigma-Aldrich, USA) 0.1% (W / V) Sodium chloride 0.1M Tris (hydroxymethyl) aminomethane 50 mM Phospholipids include 0.5 mg of phosphatidylserine (porcine brain phosphatidylserine; PS; DOOSAN Serial Research Laboratories, Korea) and 0.5 mg of phosphatidylcholine (porcine liver phosphatidylcholine; PC; DOOSAN Serial Research Laboratories, Korea).
- composition of phosphatidylserine and phosphatidylcholine prepared by evaporating chloroform as a solvent with an evaporator, adding distilled water, stirring vigorously for 1 minute, and sonicating at 60 ° C. for 10 minutes.
- Phospholipids with a ratio of 1: 1 ie 50% (W / V): 50% (W / V)
- Phospholipid Calcium chloride 2.5 mM Bovine serum albumin (BSA; Sigma-Aldrich, USA) 0.1% (W / V) Sodium chloride 0.1M Tris (hydroxymethyl) aminomethane 50 mM Phospholipids include phosphatidylserine (porcine brain phosphatidylserine; PS; DOOSAN Serial Research Laboratories, Korea) 0.4 mg, phosphatidylcholine (porcine liver phosphatidylcholine; PC; DOOSAN Serial Research Laboratories, Korea) 0.4 mg, and phosphatidylserine.
- BSA Bovine serum albumin
- Sodium chloride 0.1M Tris (hydroxymethyl) aminomethane 50 mM Phospholipids include phosphatidylserine (porcine brain phosphatidylserine; PS; DOOSAN Serial Research Laboratories, Korea) 0.4 mg, phosphatidylcholine (porcine liver phosphatidylcho
- ethanolamine (porcine liver phosphatidylethanolamine; PE; DOOSAN Serial Research Laboratories, Korea) was collected in each test tube, and after evaporation of chloroform as a solvent with an evaporator, distilled water was added for 1 minute.
- Phosphatidylserine prepared by vigorous stirring and sonication at 60 ° C. for 10 minutes Phospholipids with a composition ratio of phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine of 1: 1: 1 (ie, 33.33% (W / V): 33.33% (W / V): 33.33% (W / V))) In a concentration of 24 ⁇ M.
- Activated protein C purified human activated protein C; Enzyme Research Laboratories, Inc., USA
- Fifth reagent The following components were dissolved in pure water so as to have the respective concentrations described above, and the pH was adjusted to pH 8.0 (20 ° C.) to prepare a fifth reagent.
- Activated blood coagulation factor V purified human activated blood coagulation factor V; Haematologic Technologies, Inc., USA
- sample The following (1) and (2) were used as samples.
- Sample having a total protein S activity value of 10 ⁇ g / mL equivalent prepared by mixing purified free protein S and purified free C4b-binding protein at a 1: 1 (molar ratio) (2) Sample having a total protein S activity value of 20 ⁇ g / mL equivalent prepared by mixing purified free protein S and purified free C4b-binding protein at 1: 1 (molar ratio) 3. Measurement of total protein S activity in samples The activity value of total protein S of each sample was measured as follows. (1) About each of said 2 samples, 0.5 microliters and 193.5 microliters of said 3rd reagent-a of said (3) were mixed.
- the acceleration of change in absorbance was obtained from the absorbance obtained by measurement, and applied to a calibration curve to calculate the activity value of total protein S in the sample.
- the total protein S activity value of 1 ⁇ g / mL of purified human protein S is expressed as the total protein S activity value of 1 ⁇ g / mL equivalent. Defined. Therefore, in the specification and drawings of this patent application, the activity of total protein S is expressed using “ ⁇ g / mL equivalent”. 5.
- Measurement result The results obtained by measuring the activity value of total protein S in the sample as described above are shown in Table 1.
- ratio (%) indicates the ratio of the measured value (total protein S activity value obtained by measuring the sample) to the total protein S activity value of the sample in percent. It is a thing. From this table, when the third reagent-a is used, that is, during the reaction of increasing the activity of activated protein C by protein S contained in the sample, and activated blood coagulation by the protein C having increased activity.
- the ratio [based on the total protein S activity value of the sample] is 0.8% in the sample having a total protein S activity value of 10 ⁇ g / mL equivalent, and the total protein S activity value is 20 ⁇ g / mL. It turns out that it is 33.2% in the sample of mL equivalent.
- the third reagent-b when used, that is, during the activity of the activated protein C by the protein S contained in the sample, and the activation by the protein C having the increased activity.
- the ratio [total protein S activity value of the sample] The ratio of the measured value (total protein S activity value obtained by measuring the sample) to 65.4% in the sample having a total protein S activity value of 10 ⁇ g / mL equivalent, and the total protein S activity value of 20 ⁇ g It turns out that it is 62.8% in the sample of / mL equivalent.
- the third reagent-c when used, that is, during the activity of the activated protein C by the protein S contained in the sample, and the activation by the protein C having the increased activity.
- the ratio [ The ratio of the measured value (total protein S activity value obtained by measuring the sample) to the total protein S activity value of the sample is 50.4% in the sample having a total protein S activity value of 10 ⁇ g / mL equivalent, and It can be seen that the total protein S activity value is 50.0% in the sample equivalent to 20 ⁇ g / mL.
- Example 2 (Method for measuring the activity of total protein S in the sample of the present invention and reagent 2 for measuring activity) The effect of the method for measuring the activity of total protein S in the sample of the present invention and the activity measuring reagent was confirmed. 1.
- Total protein S activity measurement reagent (1) First reagent As the first reagent, the first reagent (1) of Example 1 described above was used. (2) Second reagent As the second reagent, the second reagent (1) of Example 1 described above was used.
- Third reagent-1 The following components were dissolved in pure water so as to have the respective concentrations described above, and the pH was adjusted to pH 8.0 (20 ° C.) to prepare the third reagent-1.
- Phospholipid Calcium chloride 2.5 mM Bovine serum albumin (BSA; Sigma-Aldrich, USA) 0.1% (W / V) Sodium chloride 0.1M Tris (hydroxymethyl) aminomethane 50 mM
- the phospholipid (PS: PC: PE 1: 1: 1) was contained so that it might become a density
- the surfactants are nonionic surfactants Triton X-100, Triton X-114, NP-10, NP-11, NP-12, NP-13, BT-9 and BT-12, anion
- Each of the surfactants sarcosinate LN, the cationic surfactant CA-2350, and the amphoteric surfactant AM-301 was contained in each reagent so as to have the concentrations described below.
- Third reagent-2 Triton X-100 (Wako Pure Chemical Industries, Japan) 0.0050% (W / V)
- Third reagent-3 Triton X-100 (Wako Pure Chemical Industries, Japan) 0.0060% (W / V)
- Third Reagent-4 Triton X-100 (Wako Pure Chemical Industries, Japan) 0.0070% (W / V)
- Third Reagent-5 Triton X-114 (Wako Pure Chemical Industries, Japan) 0.0050% (W / V)
- Third reagent-6 NP-10 (Nikko Chemicals, Japan) 0.0025% (W / V)
- Third Reagent-7 NP-11 (Nikko Chemicals, Japan) 0.0025% (W / V)
- Third Reagent-8 NP-11 (Nikko Chemicals, Japan) 0.0050% (W / V)
- Third Reagent-9 NP-12 (Nikko Chemicals, Japan) 0.0025% (W / V)
- the first reagent (8) of Example 1 was used. 2. sample Each of the samples of (1) and (2) of Example 1 was used as a sample. 3. Measurement and calculation of the activity value of total protein S in the sample For each of the two samples, the activity value of total protein S was measured and calculated as described in 3 and 4 of Example 1 to obtain the activity value of total protein S for each sample. In addition, instead of the third reagent-a in 3 (1) of Example 1, the third reagent-1 in 1 (3) and the third reagent-2 in 1 (4) are used. Up to 3 reagents-19 were used in sequence. 4). Measurement result The results obtained by measuring the activity value of total protein S in the sample as described above are shown in Table 2.
- ratio (%) indicates the ratio of the measured value (total protein S activity value obtained by measuring the sample) to the total protein S activity value of the sample in percent. It is a thing. From this table, when the third reagent-1 was used, that is, during the reaction of increasing the activity of activated protein C by protein S contained in the sample, and activated blood coagulation by the protein C having increased activity.
- the ratio [ratio of the measured value (total protein S activity value obtained by measuring the sample) to the total protein S activity value of the sample]
- the sample with a total protein S activity value of 10 ⁇ g / mL equivalent is 50.4% and the sample with a total protein S activity value of 20 ⁇ g / mL equivalent is 52.0%.
- the ratio [measured value relative to the total protein S activity value of the sample (by measuring the sample Ratio of the total protein S activity value obtained) is 62.0% to 88.0% in the sample having a total protein S activity value of 10 ⁇ g / mL equivalent, and the sample having a total protein S activity value of 20 ⁇ g / mL equivalent It can be seen that it is 64.0% to 104.3%.
- Example 3 (Investigation of reproducibility of activity measuring reagent and method for measuring activity of total protein S in the sample of the present invention) The method for measuring the activity of total protein S in the sample of the present invention and the reproducibility of the measurement when measuring the total protein S activity value in the sample using the activity measuring reagent were examined.
- Triton X-100 (Wako Pure Chemical Industries, Japan) 0.06% (W / V) Bovine serum albumin (BSA) 0.1% (W / V) Sodium chloride 0.1M Trisodium citrate 10.6 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethane 50 mM
- BSA Bovine serum albumin
- Activated protein C purified human activated protein C; Enzyme Research Laboratories, Inc., USA
- Phospholipid Calcium chloride 2.5 mM Bovine serum albumin (BSA; Sigma-Aldrich, USA) 0.1% (W / V) Sodium chloride 0.1M Tris (hydroxymethyl) aminomethane 50 mM
- the surfactant contained Triton X-100 (Wako Pure Chemical Industries, Japan) to a concentration of 0.006% (W / V).
- the phospholipid (PS: PC: PE 1: 1: 1) was contained so that it might become a density
- Second reagent The following components were dissolved in pure water so as to have the stated concentrations, and the pH was adjusted to pH 8.0 (20 ° C.) to prepare a second reagent.
- Activated blood coagulation factor V purified human activated blood coagulation factor V; Haematologic Technologies, Inc., USA
- Surfactant Phospholipid Calcium chloride 2.5 mM Bovine serum albumin (BSA; Sigma-Aldrich, USA) 0.1% (W / V) Sodium chloride 0.1M Tris (hydroxymethyl) aminomethane 50 mM
- the surfactant contained Triton X-100 (Wako Pure Chemical Industries, Japan) to a concentration of 0.006% (W / V).
- Third reagent The following components were dissolved in pure water so as to have the respective concentrations described above, and the pH was adjusted to pH 7.5 (20 ° C.) to prepare a third reagent.
- Activated blood coagulation factor X purified bovine activated blood coagulation factor X; New England Biolabs, Inc, USA
- Prothrombin purified human prothrombin; Enzyme Research Laboratories, Inc., USA
- a sample with a known total protein S activity value is measured in advance as described above, and the amount of change in absorbance per minute of the measured absorbance change (reaction time course) after addition of the third reagent is measured as time.
- a linear equation (differential line) was obtained, and a calibration curve was prepared by plotting the slope of this straight line against this known total protein S activity value.
- the absorbance change amount per minute of the absorbance change (reaction time course) after the addition of the third reagent, obtained by measuring the sample of 2 as described in 3 above is expressed linearly (differentiated) with respect to time.
- a straight line) was obtained, and the slope of this straight line was applied to the calibration curve to calculate the activity value of total protein S in the sample.
- the coefficient of variation (CV) in the daily difference reproducibility is in the range of 2.8% to 5.6%, and even if the measurement days are different, the variation in the measured value is small and the measurement is accurate. I understand that I can do it. From these facts, it was confirmed that the method for measuring the activity of total protein S and the reagent for measuring the activity of the total protein S in the sample of the present invention have good reproducibility of measurement and can be measured accurately.
- Example 4 Method for measuring the amount of protein of total protein S in a sample by ELISA method and correlation with measurement reagent
- the correlation between the method for measuring the activity of total protein S and the reagent for measuring the total protein S in the sample of the present invention and the method for measuring the amount of protein of the total protein S in the sample by the ELISA method and the measuring reagent were examined.
- Total protein S activity measurement reagent (1) Diluent As the diluting solution, the diluting solution of (1) in Example 3 was used.
- (2) First reagent As the first reagent, the first reagent of (2) of Example 3 was used.
- Second reagent As the second reagent, the second reagent of (3) of Example 3 described above was used.
- Third reagent As the third reagent, the third reagent (1) (4) of Example 3 was used. 2. sample Plasma of 50 healthy people was used as a sample. 3. Measurement and calculation of the activity value of total protein S in the sample For each of the two samples, the activity value of total protein S was measured and calculated as described in 3 and 4 of Example 3 above, and the activity value of total protein S of each sample was obtained. The results obtained by measuring the activity value of total protein S in this sample are shown in FIG. II. Method for measuring the amount of total protein S in a sample by ELISA and measurement with a measuring reagent 1.
- Reagent for measuring protein amount of total protein S by ELISA As a reagent for measuring the amount of protein of total protein S by ELISA, commercially available “Acerachrome Total Protein S TMB” (manufacturer: DIAGNOSTICA STAGO, France; manufacturer / distributor: Roche Diagnostics, Japan) ) was used.
- This “Acerachrome Total Protein S TMB” is composed of the following: (A) Antibody-coated strip (anti-total protein S mouse monoclonal antibody) (B) Antibody conjugate (peroxidase-labeled anti-total protein S mouse monoclonal antibody) (C) Substrate solution (3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine and 30% aqueous hydrogen peroxide) (D) Dilution buffer (E) Cleaning fluid (F) Standard (Total Protein S / Calibrator) (G) Control (Total Protein S / Control) (H) Plate frame (I) Plate cover 2. sample The sample in I-2 above (plasma of 50 healthy people) was used as a sample. 3.
- a sample (citrate plasma) is diluted 101 times with a dilution buffer to prepare a sample.
- a standard prepared by diluting 101 times with a dilution buffer is diluted stepwise to prepare a dilution series.
- C Dispense 50 ⁇ L of antibody conjugate into each well of the antibody-coated strip.
- D Dispense 200 ⁇ L of each sample or diluted standard and incubate at 18-25 ° C. for 1 hour.
- Measurement result The measurement result of the activity value of the total protein S in the sample in the above I and the measurement result of the protein amount of the total protein S in the sample in the above II are shown in FIG.
- the horizontal axis (x) represents the measurement result of the amount of total protein S in the sample by the ELISA method of II. The unit of this measured value is “ ⁇ g / mL”.
- the vertical axis (y) represents the measurement result of the activity value of total protein S in the sample by the activity measurement method and activity measurement reagent of the present invention in I above. The unit of this measured value is “ ⁇ g / mL equivalent”.
- X measurement result of protein amount of total protein S by ELISA method of II
- y measurement result of activity value of total protein S according to the present invention of I
- the activity measuring reagent and activity measuring method for total protein S in the sample of the present invention are all present in the sample.
- the activity of protein S complex of protein S and C4b binding protein (bound type) and free protein S (free type)
- the activity of protein S can be measured. I understand.
- the reagent and method for measuring the activity of total protein S in the sample of the present invention are “free protein S (free protein S In addition to the activity of “type”, the activity expressed when protein S contained in “complex of protein S and C4b binding protein (binding type)” becomes free protein S (free type) is also combined It can be seen that it can be measured. That is, by showing a good correlation with the measurement value of the protein amount of total protein S in this way, the reagent for measuring the activity and the method for measuring the activity of total protein S in the sample of the present invention can be applied to all the samples present in the sample.
- Protein S [complex of protein S and C4b binding protein (binding type) and free protein S (free type)] can obtain the activity value of protein S corresponding to the protein amount. I understand. From these facts, it was confirmed that the reagent and method for measuring the activity of total protein S in the sample of the present invention can accurately measure the activity of total protein S in the sample.
- Example 5 Comparison of activity value of total protein S and protein amount of total protein S
- the activity value of total protein S obtained by the method for measuring the activity of total protein S in the sample of the present invention and the activity measuring reagent, and the method for measuring the amount of protein of the total protein S in the sample by latex nephelometry and the measuring reagent The total protein S was compared with the amount of protein.
- Plasma of 211 healthy people Plasma of 7 patients who have been found to be PS-K155E heterozygote (protein S Tokushima, which is one of the abnormalities of protein S), which is a genetic mutation of protein S (3)
- One plasma known to be PS-K155E homozygote protein S Tokushima, which is one of the abnormalities of protein S
- One plasma known to be a C206F heterozygote a protein S abnormality
- Measurement and calculation of the activity value of total protein S in the sample For each of the two samples, the activity value of total protein S was measured and calculated as described in 3 and 4 of Example 3 above, and the activity value of total protein S of each sample was obtained.
- FIG. II The results obtained by measuring the activity value of total protein S in this sample are shown in FIG. II.
- Reagent for measuring activity of total protein S by latex nephelometry (1) First reagent C4b binding protein was obtained from B. The method of Dahlbeack et al. [Biochem. J. et al. 209, 847-856, 1983]. Next, a 50 mM MES-hydrochloric acid buffer solution (pH 6.2 (20 ° C.)) containing 0.1% (W / V) BSA, 0.3 mol / L sodium chloride and 0.05% sodium azide was prepared. .
- the C4b binding protein prepared as described above was added to a concentration of 25 ⁇ g / mL, and used as the first reagent.
- Second reagent (A) Preparation of anti-protein S antibody The present inventors prepared anti-protein S antibody according to a conventional method using purified free protein S as an immunizing antigen. A hybridoma producing a monoclonal antibody that specifically binds to a site other than the binding site of protein S to the C4b binding protein was screened to obtain a mouse / mouse hybridoma (strain 9H6). 5 mg of mouse anti-protein S monoclonal antibody produced from this hybridoma (9H6 strain) was dissolved in 0.5 mL of sodium phosphate buffer (pH 7.5).
- N, N-dimethylformamide in which 0.6 mg of S-acetylmercaptosuccinic anhydride was dissolved was added and incubated at room temperature for 30 minutes.
- 0.02 mL of 0.1 M EDTA aqueous solution, 0.1 mL of 1 M tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer (pH 7.0), and 0 of 1 M hydroxylamine hydrochloride buffer (pH 7.0) were added thereto. Each 1 mL was added and incubated at 30 ° C. for 30 minutes.
- the mercapto-succinylated mouse anti-protein S monoclonal antibody prepared in (a) above was added at a concentration of 0.083 g / dL in 50 mM MES-HCl buffer.
- the liquid [pH 6.0 (20 degreeC)] 1.8mL mixed liquid was added, and it stirred at 4 degreeC overnight.
- the precipitate was suspended in 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0 (20 ° C.)) containing 0.8% BSA and left at 37 ° C. for 3 hours. The blocking process was performed.
- FIG. III is a diagram comparing the measurement result of the activity value of total protein S in the sample in I with the measurement result of the protein amount of total protein S in the sample in II.
- the horizontal axis (x) represents the measurement result of the protein amount of total protein S in the sample by the latex turbidimetric method of II.
- the unit of this measured value is “ ⁇ g / mL”.
- the vertical axis (y) represents the measurement result of the activity value of total protein S in the sample by the activity measurement method and activity measurement reagent of the present invention in I above.
- the unit of this measured value is “ ⁇ g / mL equivalent”. 2. Comparison of healthy subjects The measurement result of the activity value of the total protein S according to the present invention of I and the measurement result of the protein amount of the total protein S by the latex turbidimetry method of II were compared as follows. When the sample is the plasma of 211 healthy individuals, the specific activity of protein S (total protein S) was determined from the measurement result of the activity value of total protein S of I and the measurement result of the amount of protein of total protein S of II. Activity value / total protein S protein amount) was determined.
- the average value and standard deviation (hereinafter sometimes referred to as SD) of the protein S specific activity of the plasma samples of 211 healthy individuals were calculated, and the average ⁇ 2SD (0.98 ⁇ 0.26) range was determined. . Since there were 10 samples out of this range, 201 samples of healthy persons excluding these 10 samples were obtained again from the measurement result of the activity value of total protein S and the measurement result of the protein amount of total protein S.
- the average value and standard deviation of the specific activity of protein S (total protein S activity value / total protein S protein amount) were calculated, and the range of mean ⁇ 2SD (0.99 ⁇ 0.20) and mean ⁇ 3SD (0. 99 ⁇ 0.30).
- this figure also represents the specific activity which divided
- abnormalities of protein S such as mutations in the protein S gene can be detected by comparing the values obtained by, for example. 3. Comparison of samples that have been found to be protein S gene mutations (protein S abnormalities) For each of the samples (total of 9 samples) that have been found to be protein mutations (protein S abnormalities) in (2) to (4) of I-2, the present invention of I The measurement result of the activity value of total protein S according to II is compared with the measurement result of the protein amount of total protein S by the latex turbidimetric method of II. In FIG. 2, seven plasma samples that have been found to be PS-K155E heterozygotes (one of the abnormalities of protein S), which is a genetic mutation of protein S in 2 (2) of I above Is indicated by “ ⁇ ”.
- a plasma sample of one person who has been found to be a PS-K155E homozygote (one of protein S abnormalities), which is a protein S gene mutation of 2 (3) of I above, is referred to as “ ⁇ ".
- the reagent for measuring the activity and the method for measuring the activity of total protein S in the sample according to the present invention include all protein S present in the sample (complexes with C4b binding protein (bound type) and free protein S (free type)). ], That is, the activity of total protein S can be measured. Therefore, for the sample for which the total protein S activity value was obtained according to the present invention, the protein amount of the total protein S was separately obtained, and the specific activity (activity value / protein amount) of protein S in the sample was calculated. Abnormalities can be detected. That is, by using the total protein S activity measuring reagent and activity measuring method in the sample of the present invention, protein S abnormality can be detected and used for prevention, diagnosis and treatment of diseases such as thrombosis. .
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Abstract
試料中に存在する全てのプロテインSの活性を、すなわち、総プロテインSの活性を測定することが 出来る、試料中の総プロテインSの活性測定試薬及び活性測定方法を提供する。 本発明の試料中の総プロテインSの活性測定試薬は、活性化プロテインC、界面活性剤、リン脂質、 カルシウムイオン、活性化血液凝固第V因子、活性化血液凝固第X因子、プロトロンビン及びトロンビ ンの基質を含有するものである。 また、本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法は、試料中の総プロテインSの活性を測定する方法であって、当該総プロテインS活性の測定反応時に、界面活性剤を存在させることを特徴とするものである。
Description
本発明は、試料中の総プロテインSの活性を測定することができる活性測定試薬及び活性測定方法に関するものである。
本発明は、特に、臨床検査、分子生物学、及び医学などの生命科学分野等において有用なものである。
本発明は、特に、臨床検査、分子生物学、及び医学などの生命科学分野等において有用なものである。
プロテインSは、生体内の血液凝固系の制御機構において中心的に機能する血漿タンパク質である。
このプロテインSは、主に血液中に存在するものであって、活性化プロテインCの補欠因子(補助因子)であり、活性化プロテインCの活性を上昇させることができ、血液中での活性化プロテインCの働きに欠かせないものである。
なお、活性化プロテインCは、ヒトにおける血液凝固を促進する活性化血液凝固第V因子(第Va因子;FVa)、及び活性化血液凝固第VIII因子(第VIIIa因子;FVIIIa)を分解することにより、血液凝固反応を抑制する役割を担った因子である。
プロテインSは、C4b結合タンパク質(補体第4因子b結合タンパク質;C4bBP)と1対1で特異的に結合し、複合体を形成する。つまり、C4b結合タンパク質は、プロテインSのリガンドとなる。
このプロテインSとC4b結合タンパク質との複合体形成反応は、下に示した通りであるが、この反応は可逆反応である。
そして、ヒト血液中においては、通常、プロテインSに比べてC4b結合タンパク質のモル濃度は小さく、また解離定数も小さいため、血液中には「プロテインS」及び「プロテインS−C4b結合タンパク質複合体」のみ存在する。つまり、上記の反応の平衡は、完全に右に寄っていることになる。
通常、健常者の血液中(血漿中)のプロテインSは、その約60%が「プロテインS−C4b結合タンパク質複合体」(すなわち、結合型)であり、その約40%は「遊離状態のプロテインS」(すなわち、遊離型)である。
なお、遊離のプロテインS(すなわち、遊離型)のみが、活性化プロテインCに対する補酵素活性を示し、活性化プロテインCの活性を上昇させることができるのである。
なお、本明細書において、「プロテインS」又は「C4b結合タンパク質」等の語は、特に複合体(若しくは結合型)又は遊離(若しくは遊離型)等の記載が無い場合は、それぞれこれらの物質の複合体(又は結合型)及び遊離状態(又は遊離型)のものの総称を意味するものとする。
下に、プロテインC及びプロテインSによる血液凝固系の制御機構の模式図を示した。
プロテインCは生体内において、トロンビン・トロンボモジュリン複合体により限定分解され活性化ペプチドが遊離することにより活性化され、活性化プロテインCとなる。
活性化プロテインCは、ヒトおける血液凝固を促進する活性化血液凝固第V因子、及び活性化血液凝固第VIII因子を分解することにより、血液凝固反応を抑制する役割を担ったセリンプロテアーゼである。
プロテインSは、活性化プロテインCの補欠因子(補助因子)であり、プロテインSの存在により、活性化プロテインCの活性は上昇し、活性化プロテインCによる活性化血液凝固第V因子の分解反応及び活性化血液凝固第VIII因子の分解反応は促進される。
血液凝固反応を抑制する働きを持つプロテインSの活性の低下又は異常は、生体内において血栓症を引き起こす原因となりうる。
実際、プロテインSの先天性異常症者は、高い頻度で深部静脈血栓症、表在性静脈炎若しくは肺梗塞などの静脈性血栓症、又は心不全の原因となる冠状動脈血栓症などの動脈性血栓症等を発症することになる。
また、播種性血管内凝固症候群(DIC)、ビタミンK欠乏症又は肝機能低下症等においても、プロテインSの活性の低下又は異常が認められる。
即ち、血漿等の試料中のプロテインSの活性を測定することにより、プロテインSの活性の低下又は異常を把握することができ、引いては血栓症等の疾患の発症の予測、早期発見及び治療効果の判定等に重要な役割を果たすものである。
試料中のプロテインSの活性を測定する方法として、試料を蛇毒からのプロテインC−活性化剤と共に、活性化プロテインCの形成下にインキュベートし、血液凝固第XII因子、血液凝固第VII因子又は血液凝固第II因子(プロトロンビン)の活性化剤を添加し、かつ血液凝固因子及びその活性剤により媒介される、プロトロンビンからのトロンビンの形成の減少を、色素原トロンビン基質を使用して測光測定する方法が開示されている(特許文献1参照。)。
別の試料中のプロテインSの活性を測定する方法として、血漿試料にプロテインCを活性化するプロテインC活性化物質又は活性化プロテインCを添加し、次に活性化血液凝固第IX因子を加えインキュベートし、生成するトロンビンの量を知られた方法で測定し、これをプロテインS活性が既知の標品を測定して得た値と比較して、試料中のプロテインSの活性を測定する方法が開示されている(特許文献2参照。)。
また、別の試料中のプロテインSの活性を測定する方法として、試料を、活性化プロテインC、血液凝固第VIII因子、リン脂質及びカルシウムイオンとインキュベートし、次にこの混合物を、活性化血液凝固第II因子(トロンビン)、活性化血液凝固第IX因子及び活性化血液凝固第X因子とインキュベートし、次にこのインキュベーション混合物へ活性化血液凝固第X因子特異性基質を添加し、この基質の開裂によって生成したシグナルの量を測定することよりなる、試料中のプロテインSの活性を測定する方法が開示されている(特許文献3参照。)。
これら従来の試料中のプロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬においては、その測定反応に使用する血液凝固反応の成分(因子)の少なくとも一つは、試料に含まれている成分(因子)をそのまま用いているものであった。すなわち、試料に含まれている成分に依存しているものであった。
従って、このような試料に含まれている成分(因子)をそのまま用いる従来の試料中のプロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬においては、その成分(因子)〔例えば、活性化血液凝固第X因子〕がその試料提供者において欠損又は低下しているときには、前記測定反応の反応成分(因子)の少なくとも一つが十分量存在しない訳であるから、測定反応は十分に進行せず、得られるプロテインS活性値は、場合により本来の値よりかい離し、誤差を含むものになるという問題を有するものであった。
すなわち、測定値が、血液凝固反応に係わる成分(因子)の試料中の存在量(濃度)又はその変異により、影響を受けてしまうことが起こるという問題を有するものであった。
そこで、本発明者らは、試料に由来しない、活性化プロテインC、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第V因子、活性化血液凝固第X因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質を含有する試料中のプロテインSの活性測定試薬、並びに、試料に由来しない、活性化プロテインC、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第V因子、活性化血液凝固第X因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質を試料と接触させ、次に、前記の各成分による反応の結果トロンビンの基質から生成されるシグナル量を測定し、次に、試料に含まれるプロテインSの活性に応じて生成が抑制されたシグナル量を求めることにより、試料中に含まれていたプロテインSの活性値を得る試料中のプロテインSの活性測定方法を発明し、開示した(特許文献4及び非特許文献1参照。)。
しかしながら、従来の試料中のプロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬は、いずれも遊離のプロテインS(遊離型)の活性を測定するものであった。
つまり、従来の試料中のプロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬はいずれも、試料中に存在する全てのプロテインS〔プロテインSとC4b結合タンパク質との複合体(結合型)、及び遊離のプロテインS(遊離型)〕を、すなわち、総プロテインSの活性を測定することは出来ないものであった。
このプロテインSは、主に血液中に存在するものであって、活性化プロテインCの補欠因子(補助因子)であり、活性化プロテインCの活性を上昇させることができ、血液中での活性化プロテインCの働きに欠かせないものである。
なお、活性化プロテインCは、ヒトにおける血液凝固を促進する活性化血液凝固第V因子(第Va因子;FVa)、及び活性化血液凝固第VIII因子(第VIIIa因子;FVIIIa)を分解することにより、血液凝固反応を抑制する役割を担った因子である。
プロテインSは、C4b結合タンパク質(補体第4因子b結合タンパク質;C4bBP)と1対1で特異的に結合し、複合体を形成する。つまり、C4b結合タンパク質は、プロテインSのリガンドとなる。
このプロテインSとC4b結合タンパク質との複合体形成反応は、下に示した通りであるが、この反応は可逆反応である。
通常、健常者の血液中(血漿中)のプロテインSは、その約60%が「プロテインS−C4b結合タンパク質複合体」(すなわち、結合型)であり、その約40%は「遊離状態のプロテインS」(すなわち、遊離型)である。
なお、遊離のプロテインS(すなわち、遊離型)のみが、活性化プロテインCに対する補酵素活性を示し、活性化プロテインCの活性を上昇させることができるのである。
なお、本明細書において、「プロテインS」又は「C4b結合タンパク質」等の語は、特に複合体(若しくは結合型)又は遊離(若しくは遊離型)等の記載が無い場合は、それぞれこれらの物質の複合体(又は結合型)及び遊離状態(又は遊離型)のものの総称を意味するものとする。
下に、プロテインC及びプロテインSによる血液凝固系の制御機構の模式図を示した。
活性化プロテインCは、ヒトおける血液凝固を促進する活性化血液凝固第V因子、及び活性化血液凝固第VIII因子を分解することにより、血液凝固反応を抑制する役割を担ったセリンプロテアーゼである。
プロテインSは、活性化プロテインCの補欠因子(補助因子)であり、プロテインSの存在により、活性化プロテインCの活性は上昇し、活性化プロテインCによる活性化血液凝固第V因子の分解反応及び活性化血液凝固第VIII因子の分解反応は促進される。
血液凝固反応を抑制する働きを持つプロテインSの活性の低下又は異常は、生体内において血栓症を引き起こす原因となりうる。
実際、プロテインSの先天性異常症者は、高い頻度で深部静脈血栓症、表在性静脈炎若しくは肺梗塞などの静脈性血栓症、又は心不全の原因となる冠状動脈血栓症などの動脈性血栓症等を発症することになる。
また、播種性血管内凝固症候群(DIC)、ビタミンK欠乏症又は肝機能低下症等においても、プロテインSの活性の低下又は異常が認められる。
即ち、血漿等の試料中のプロテインSの活性を測定することにより、プロテインSの活性の低下又は異常を把握することができ、引いては血栓症等の疾患の発症の予測、早期発見及び治療効果の判定等に重要な役割を果たすものである。
試料中のプロテインSの活性を測定する方法として、試料を蛇毒からのプロテインC−活性化剤と共に、活性化プロテインCの形成下にインキュベートし、血液凝固第XII因子、血液凝固第VII因子又は血液凝固第II因子(プロトロンビン)の活性化剤を添加し、かつ血液凝固因子及びその活性剤により媒介される、プロトロンビンからのトロンビンの形成の減少を、色素原トロンビン基質を使用して測光測定する方法が開示されている(特許文献1参照。)。
別の試料中のプロテインSの活性を測定する方法として、血漿試料にプロテインCを活性化するプロテインC活性化物質又は活性化プロテインCを添加し、次に活性化血液凝固第IX因子を加えインキュベートし、生成するトロンビンの量を知られた方法で測定し、これをプロテインS活性が既知の標品を測定して得た値と比較して、試料中のプロテインSの活性を測定する方法が開示されている(特許文献2参照。)。
また、別の試料中のプロテインSの活性を測定する方法として、試料を、活性化プロテインC、血液凝固第VIII因子、リン脂質及びカルシウムイオンとインキュベートし、次にこの混合物を、活性化血液凝固第II因子(トロンビン)、活性化血液凝固第IX因子及び活性化血液凝固第X因子とインキュベートし、次にこのインキュベーション混合物へ活性化血液凝固第X因子特異性基質を添加し、この基質の開裂によって生成したシグナルの量を測定することよりなる、試料中のプロテインSの活性を測定する方法が開示されている(特許文献3参照。)。
これら従来の試料中のプロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬においては、その測定反応に使用する血液凝固反応の成分(因子)の少なくとも一つは、試料に含まれている成分(因子)をそのまま用いているものであった。すなわち、試料に含まれている成分に依存しているものであった。
従って、このような試料に含まれている成分(因子)をそのまま用いる従来の試料中のプロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬においては、その成分(因子)〔例えば、活性化血液凝固第X因子〕がその試料提供者において欠損又は低下しているときには、前記測定反応の反応成分(因子)の少なくとも一つが十分量存在しない訳であるから、測定反応は十分に進行せず、得られるプロテインS活性値は、場合により本来の値よりかい離し、誤差を含むものになるという問題を有するものであった。
すなわち、測定値が、血液凝固反応に係わる成分(因子)の試料中の存在量(濃度)又はその変異により、影響を受けてしまうことが起こるという問題を有するものであった。
そこで、本発明者らは、試料に由来しない、活性化プロテインC、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第V因子、活性化血液凝固第X因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質を含有する試料中のプロテインSの活性測定試薬、並びに、試料に由来しない、活性化プロテインC、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第V因子、活性化血液凝固第X因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質を試料と接触させ、次に、前記の各成分による反応の結果トロンビンの基質から生成されるシグナル量を測定し、次に、試料に含まれるプロテインSの活性に応じて生成が抑制されたシグナル量を求めることにより、試料中に含まれていたプロテインSの活性値を得る試料中のプロテインSの活性測定方法を発明し、開示した(特許文献4及び非特許文献1参照。)。
しかしながら、従来の試料中のプロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬は、いずれも遊離のプロテインS(遊離型)の活性を測定するものであった。
つまり、従来の試料中のプロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬はいずれも、試料中に存在する全てのプロテインS〔プロテインSとC4b結合タンパク質との複合体(結合型)、及び遊離のプロテインS(遊離型)〕を、すなわち、総プロテインSの活性を測定することは出来ないものであった。
Clin Chem Lab Med,2004,Vol.42,No.3,p.350−352
本発明の課題は、試料中に存在する全てのプロテインS〔プロテインSとC4b結合タンパク質との複合体(結合型)、及び遊離のプロテインS(遊離型)〕についてその活性を、すなわち、総プロテインSの活性を測定することが出来る、試料中の総プロテインSの活性測定試薬及び活性測定方法を提供することである。
本発明者らは、試料中の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬について検討を重ねたところ、総プロテインS活性の測定反応時に、界面活性剤を存在させることにより、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の発明よりなる。
(1) 試料中の総プロテインSの活性を測定する方法であって、当該総プロテインS活性の測定反応時に、界面活性剤を存在させることを特徴とする、試料中の総プロテインSの活性測定方法。
(2) プロテインSによる活性化プロテインCの活性上昇反応時及び当該活性上昇した活性化プロテインCによる活性化血液凝固第V因子の分解反応時に、界面活性剤を存在させる、前記(1)記載の試料中の総プロテインSの活性測定方法。
(3) 総プロテインS活性の測定反応時に、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンよりなるリン脂質を存在させる、前記(1)又は(2)記載の試料中の総プロテインSの活性測定方法。
(4) プロテインSによる活性化プロテインCの活性上昇反応時及び当該活性上昇した活性化プロテインCによる活性化血液凝固第V因子の分解反応時に、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンよりなるリン脂質を存在させる、前記(1)~(3)のいずれか1項に記載の試料中の総プロテインSの活性測定方法。
(5) 試料中の総プロテインS活性の測定が、次の(a)~(c)の工程を含む方法により行われるものである、前記(1)~(4)のいずれか1項に記載の試料中の総プロテインSの活性測定方法。
(a) 活性化プロテインC、界面活性剤、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第V因子、活性化血液凝固第X因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質を試料と接触させる。
(b) 次に、前記(a)の各成分による反応の結果トロンビンの基質から生成されるシグナル量を測定する。
(c) 次に、この試料に含まれる総プロテインSの活性に応じて生成が抑制されたシグナル量より、試料中に含まれていた総プロテインSの活性値を得る。
(6) 試料中の総プロテインS活性の測定が、次の(a)~(e)の工程を含む方法により行われるものである、前記(1)~(5)のいずれか1項に記載の試料中の総プロテインSの活性測定方法。
(a) 試料と、少なくとも活性化プロテインC、界面活性剤、リン脂質及びカルシウムイオンを接触させることにより、試料にプロテインSが含まれる場合には活性化プロテインCが活性上昇する。
(b) 次に、前記(a)の成分及び活性化血液凝固第V因子の存在下、活性化プロテインCが触媒する活性化血液凝固第V因子の分解反応が、前記(a)における活性化プロテインCの活性上昇により、促進される。
(c) 次に、活性化血液凝固第V因子により促進される、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下に活性化血液凝固第X因子が触媒するプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応が、前記(b)における活性化血液凝固第V因子の分解反応が促進されることにより抑制されて、トロンビンの生成が低減される。
(d) 次に、前記(c)におけるトロンビンの生成の低減により、トロンビンが触媒するトロンビンの基質からシグナルを生じさせる反応が抑制される。
(e) 次に、前記(d)における反応の抑制により生成が抑制されたシグナル量を測定することにより、試料中に含まれていた総プロテインSの活性値を得る。
(7) 活性化プロテインC、界面活性剤、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第V因子、活性化血液凝固第X因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質を含有する試料中の総プロテインSの活性測定試薬。
(8) 界面活性剤が、プロテインSによる活性化プロテインCの活性上昇反応時及び当該活性上昇した活性化プロテインCによる活性化血液凝固第V因子の分解反応時に存在させるものである、前記(7)記載の試料中の総プロテインSの活性測定試薬。
(9) リン脂質が、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンよりなるリン脂質である、前記(7)又は(8)記載の試料中の総プロテインSの活性測定試薬。
(10) ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンよりなるリン脂質が、プロテインSによる活性化プロテインCの活性上昇反応時及び当該活性上昇した活性化プロテインCによる活性化血液凝固第V因子の分解反応時に存在させるものである、前記(7)~(9)のいずれか1項に記載の試料中の総プロテインSの活性測定試薬。
(11) 次の(a)~(c)の工程を含む試料中の総プロテインS活性の測定のためのものである、前記(7)~(10)のいずれか1項に記載の試料中の総プロテインSの活性測定試薬。
(a) 活性化プロテインC、界面活性剤、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第V因子、活性化血液凝固第X因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質を試料と接触させる。
(b) 次に、前記(a)の各成分による反応の結果トロンビンの基質から生成されるシグナル量を測定する。
(c) 次に、この試料に含まれる総プロテインSの活性に応じて生成が抑制されたシグナル量より、試料中に含まれていた総プロテインSの活性値を得る。
(12) 次の(a)~(e)の工程を含む試料中の総プロテインS活性の測定のためのものである、前記(7)~(11)のいずれか1項に記載の試料中の総プロテインSの活性測定試薬。
(a) 試料と、少なくとも活性化プロテインC、界面活性剤、リン脂質及びカルシウムイオンを接触させることにより、試料にプロテインSが含まれる場合には活性化プロテインCが活性上昇する。
(b) 次に、前記(a)の成分及び活性化血液凝固第V因子の存在下、活性化プロテインCが触媒する活性化血液凝固第V因子の分解反応が、前記(a)における活性化プロテインCの活性上昇により、促進される。
(c) 次に、活性化血液凝固第V因子により促進される、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下に活性化血液凝固第X因子が触媒するプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応が、前記(b)における活性化血液凝固第V因子の分解反応が促進されることにより抑制されて、トロンビンの生成が低減される。
(d) 次に、前記(c)におけるトロンビンの生成の低減により、トロンビンが触媒するトロンビンの基質からシグナルを生じさせる反応が抑制される。
(e) 次に、前記(d)における反応の抑制により生成が抑制されたシグナル量を測定することにより、試料中に含まれていた総プロテインSの活性値を得る。
すなわち、本発明は、以下の発明よりなる。
(1) 試料中の総プロテインSの活性を測定する方法であって、当該総プロテインS活性の測定反応時に、界面活性剤を存在させることを特徴とする、試料中の総プロテインSの活性測定方法。
(2) プロテインSによる活性化プロテインCの活性上昇反応時及び当該活性上昇した活性化プロテインCによる活性化血液凝固第V因子の分解反応時に、界面活性剤を存在させる、前記(1)記載の試料中の総プロテインSの活性測定方法。
(3) 総プロテインS活性の測定反応時に、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンよりなるリン脂質を存在させる、前記(1)又は(2)記載の試料中の総プロテインSの活性測定方法。
(4) プロテインSによる活性化プロテインCの活性上昇反応時及び当該活性上昇した活性化プロテインCによる活性化血液凝固第V因子の分解反応時に、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンよりなるリン脂質を存在させる、前記(1)~(3)のいずれか1項に記載の試料中の総プロテインSの活性測定方法。
(5) 試料中の総プロテインS活性の測定が、次の(a)~(c)の工程を含む方法により行われるものである、前記(1)~(4)のいずれか1項に記載の試料中の総プロテインSの活性測定方法。
(a) 活性化プロテインC、界面活性剤、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第V因子、活性化血液凝固第X因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質を試料と接触させる。
(b) 次に、前記(a)の各成分による反応の結果トロンビンの基質から生成されるシグナル量を測定する。
(c) 次に、この試料に含まれる総プロテインSの活性に応じて生成が抑制されたシグナル量より、試料中に含まれていた総プロテインSの活性値を得る。
(6) 試料中の総プロテインS活性の測定が、次の(a)~(e)の工程を含む方法により行われるものである、前記(1)~(5)のいずれか1項に記載の試料中の総プロテインSの活性測定方法。
(a) 試料と、少なくとも活性化プロテインC、界面活性剤、リン脂質及びカルシウムイオンを接触させることにより、試料にプロテインSが含まれる場合には活性化プロテインCが活性上昇する。
(b) 次に、前記(a)の成分及び活性化血液凝固第V因子の存在下、活性化プロテインCが触媒する活性化血液凝固第V因子の分解反応が、前記(a)における活性化プロテインCの活性上昇により、促進される。
(c) 次に、活性化血液凝固第V因子により促進される、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下に活性化血液凝固第X因子が触媒するプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応が、前記(b)における活性化血液凝固第V因子の分解反応が促進されることにより抑制されて、トロンビンの生成が低減される。
(d) 次に、前記(c)におけるトロンビンの生成の低減により、トロンビンが触媒するトロンビンの基質からシグナルを生じさせる反応が抑制される。
(e) 次に、前記(d)における反応の抑制により生成が抑制されたシグナル量を測定することにより、試料中に含まれていた総プロテインSの活性値を得る。
(7) 活性化プロテインC、界面活性剤、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第V因子、活性化血液凝固第X因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質を含有する試料中の総プロテインSの活性測定試薬。
(8) 界面活性剤が、プロテインSによる活性化プロテインCの活性上昇反応時及び当該活性上昇した活性化プロテインCによる活性化血液凝固第V因子の分解反応時に存在させるものである、前記(7)記載の試料中の総プロテインSの活性測定試薬。
(9) リン脂質が、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンよりなるリン脂質である、前記(7)又は(8)記載の試料中の総プロテインSの活性測定試薬。
(10) ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンよりなるリン脂質が、プロテインSによる活性化プロテインCの活性上昇反応時及び当該活性上昇した活性化プロテインCによる活性化血液凝固第V因子の分解反応時に存在させるものである、前記(7)~(9)のいずれか1項に記載の試料中の総プロテインSの活性測定試薬。
(11) 次の(a)~(c)の工程を含む試料中の総プロテインS活性の測定のためのものである、前記(7)~(10)のいずれか1項に記載の試料中の総プロテインSの活性測定試薬。
(a) 活性化プロテインC、界面活性剤、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第V因子、活性化血液凝固第X因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質を試料と接触させる。
(b) 次に、前記(a)の各成分による反応の結果トロンビンの基質から生成されるシグナル量を測定する。
(c) 次に、この試料に含まれる総プロテインSの活性に応じて生成が抑制されたシグナル量より、試料中に含まれていた総プロテインSの活性値を得る。
(12) 次の(a)~(e)の工程を含む試料中の総プロテインS活性の測定のためのものである、前記(7)~(11)のいずれか1項に記載の試料中の総プロテインSの活性測定試薬。
(a) 試料と、少なくとも活性化プロテインC、界面活性剤、リン脂質及びカルシウムイオンを接触させることにより、試料にプロテインSが含まれる場合には活性化プロテインCが活性上昇する。
(b) 次に、前記(a)の成分及び活性化血液凝固第V因子の存在下、活性化プロテインCが触媒する活性化血液凝固第V因子の分解反応が、前記(a)における活性化プロテインCの活性上昇により、促進される。
(c) 次に、活性化血液凝固第V因子により促進される、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下に活性化血液凝固第X因子が触媒するプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応が、前記(b)における活性化血液凝固第V因子の分解反応が促進されることにより抑制されて、トロンビンの生成が低減される。
(d) 次に、前記(c)におけるトロンビンの生成の低減により、トロンビンが触媒するトロンビンの基質からシグナルを生じさせる反応が抑制される。
(e) 次に、前記(d)における反応の抑制により生成が抑制されたシグナル量を測定することにより、試料中に含まれていた総プロテインSの活性値を得る。
本発明の試料中の総プロテインSの活性測定試薬及び活性測定方法は、試料中に存在する全てのプロテインS〔プロテインSとC4b結合タンパク質との複合体(結合型)、及び遊離のプロテインS(遊離型)〕についてその活性を、すなわち、総プロテインSの活性を測定することが出来るものである。
つまり、本発明の試料中の総プロテインSの活性測定試薬及び活性測定方法は、「遊離のプロテインS(遊離型)」の活性に加えて、「プロテインSとC4b結合タンパク質との複合体(結合型)」に含まれるプロテインSが遊離のプロテインS(遊離型)となった場合に発現する活性もあわせて測定することが出来るものである。
これにより、本発明の試料中の総プロテインSの活性測定試薬及び活性測定方法は、試料中に存在する全てのプロテインS〔プロテインSとC4b結合タンパク質との複合体(結合型)、及び遊離のプロテインS(遊離型)〕について、そのタンパク質量に相応するプロテインSの活性値を得ることが出来る。
つまり、本発明の試料中の総プロテインSの活性測定試薬及び活性測定方法は、「遊離のプロテインS(遊離型)」の活性に加えて、「プロテインSとC4b結合タンパク質との複合体(結合型)」に含まれるプロテインSが遊離のプロテインS(遊離型)となった場合に発現する活性もあわせて測定することが出来るものである。
これにより、本発明の試料中の総プロテインSの活性測定試薬及び活性測定方法は、試料中に存在する全てのプロテインS〔プロテインSとC4b結合タンパク質との複合体(結合型)、及び遊離のプロテインS(遊離型)〕について、そのタンパク質量に相応するプロテインSの活性値を得ることが出来る。
1.総論
(1)試料中の総プロテインSの活性測定方法
本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法は、試料中の総プロテインSの活性を測定する方法であって、当該総プロテインS活性の測定反応時に、界面活性剤を存在させることを特徴とする、試料中の総プロテインSの活性測定方法である。
なお、本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法においては、プロテインSによる活性化プロテインCの活性上昇反応時及び当該活性上昇した活性化プロテインCによる活性化血液凝固第V因子の分解反応時に、界面活性剤を存在させることが好ましい。
また、本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法においては、総プロテインS活性の測定反応時に、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンよりなるリン脂質を存在させることが好ましい。
そして、本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法においては、プロテインSによる活性化プロテインCの活性上昇反応時及び当該活性上昇した活性化プロテインCによる活性化血液凝固第V因子の分解反応時に、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンよりなるリン脂質を存在させることが好ましい。
更に、本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法は、試料中の総プロテインS活性の測定が、次の(a)~(c)の工程を含む方法により行われるものであることが好ましい。
(a) 活性化プロテインC、界面活性剤、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第V因子、活性化血液凝固第X因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質を試料と接触させる。
(b) 次に、前記(a)の各成分による反応の結果トロンビンの基質から生成されるシグナル量を測定する。
(c) 次に、この試料に含まれる総プロテインSの活性に応じて生成が抑制されたシグナル量より、試料中に含まれていた総プロテインSの活性値を得る。
また、本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法においては、試料中の総プロテインS活性の測定が、次の(a)~(e)の工程を含む方法により行われるものであることが好ましい。
(a) 試料と、少なくとも活性化プロテインC、界面活性剤、リン脂質及びカルシウムイオンを接触させることにより、試料にプロテインSが含まれる場合には活性化プロテインCの活性が上昇する。
(b) 次に、前記(a)の成分及び活性化血液凝固第V因子の存在下、活性化プロテインCが触媒する活性化血液凝固第V因子の分解反応が、前記(a)における活性化プロテインCの活性の上昇により、促進される。
(c) 次に、活性化血液凝固第V因子により促進される、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下に活性化血液凝固第X因子が触媒するプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応が、前記(b)における活性化血液凝固第V因子の分解反応が促進されることにより抑制されて、トロンビンの生成が低減される。
(d) 次に、前記(c)におけるトロンビンの生成の低減により、トロンビンが触媒するトロンビンの基質からシグナルを生じさせる反応が抑制される。
(e) 次に、前記(d)における反応の抑制により生成が抑制されたシグナル量を測定することにより、試料中に含まれていた総プロテインSの活性値を得る。
(2)試料中の総プロテインSの活性測定試薬
本発明の試料中の総プロテインSの活性測定試薬は、活性化プロテインC、界面活性剤、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第V因子、活性化血液凝固第X因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質を含有する試料中の総プロテインSの活性測定試薬である。
なお、本発明の試料中の総プロテインSの活性測定試薬においては、界面活性剤が、プロテインSによる活性化プロテインCの活性上昇反応時及び当該活性上昇した活性化プロテインCによる活性化血液凝固第V因子の分解反応時に存在させるものであることが好ましい。
また、本発明の試料中の総プロテインSの活性測定試薬においては、リン脂質が、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンよりなるリン脂質であることが好ましい。
そして、本発明の試料中の総プロテインSの活性測定試薬においては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンよりなるリン脂質が、プロテインSによる活性化プロテインCの活性上昇反応時及び当該活性上昇した活性化プロテインCによる活性化血液凝固第V因子の分解反応時に存在させるものであることが好ましい。
更に、本発明の試料中の総プロテインSの活性測定試薬は、次の(a)~(c)の工程を含む試料中の総プロテインS活性の測定のためのものであることが好ましい。
(a) 活性化プロテインC、界面活性剤、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第V因子、活性化血液凝固第X因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質を試料と接触させる。
(b) 次に、前記(a)の各成分による反応の結果トロンビンの基質から生成されるシグナル量を測定する。
(c) 次に、この試料に含まれる総プロテインSの活性に応じて生成が抑制されたシグナル量より、試料中に含まれていた総プロテインSの活性値を得る。
また、本発明の試料中の総プロテインSの活性測定試薬は、次の(a)~(e)の工程を含む試料中の総プロテインS活性の測定のためのものであることが好ましい。
(a) 試料と、少なくとも活性化プロテインC、界面活性剤、リン脂質及びカルシウムイオンを接触させることにより、試料にプロテインSが含まれる場合には活性化プロテインCの活性が上昇する。
(b) 次に、前記(a)の成分及び活性化血液凝固第V因子の存在下、活性化プロテインCが触媒する活性化血液凝固第V因子の分解反応が、前記(a)における活性化プロテインCの活性の上昇により、促進される。
(c) 次に、活性化血液凝固第V因子により促進される、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下に活性化血液凝固第X因子が触媒するプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応が、前記(b)における活性化血液凝固第V因子の分解反応が促進されることにより抑制されて、トロンビンの生成が低減される。
(d) 次に、前記(c)におけるトロンビンの生成の低減により、トロンビンが触媒するトロンビンの基質からシグナルを生じさせる反応が抑制される。
(e) 次に、前記(d)における反応の抑制により生成が抑制されたシグナル量を測定することにより、試料中に含まれていた総プロテインSの活性値を得る。
2.試料中の総プロテインSの活性測定の方法
本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法における測定の方法、及び本発明の試料中の総プロテインSの活性測定試薬を用いる測定の方法として、次の(1)又は(2)に記載の方法等を挙げることができ、これらの方法等により行うことが好ましい。
(1)
(a) 活性化プロテインC、界面活性剤、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第V因子(第Va因子;FVa)、活性化血液凝固第X因子(第Xa因子;FXa)、プロトロンビン及びトロンビンの基質を試料と接触させる。
なお、これらの成分と試料との接触は、1回に全ての成分との接触を行わせて、下記の反応系の全ての反応を1段階に行ってもよく(1ステップ法)、また、前記成分を分け、接触を複数段階に分けて行うことにより下記の反応系の反応を複数段階に分けて行ってもよい(多ステップ法)。
(b) 前記(a)における接触により、前記の各成分による下記の反応が進行する。
そして、この一連の反応によりトロンビンの基質から生成されるシグナル量を測定する。
即ち、前記の一連の反応により、トロンビンの基質がトロンビンにより分解等の作用を受け、この結果生じるシグナルの量(例えば、吸光度等)を測定する。
(c) 試料にプロテインSが含まれている場合には、活性化プロテインCがリン脂質及びカルシウムイオンの存在下に活性が上昇し、これにより活性化血液凝固第V因子の分解が促進されるので、その結果トロンビンが触媒するトロンビンの基質からシグナルを生じさせる反応が抑制されて、シグナルの生成が抑制される。
このシグナル生成の抑制度は、試料に含まれていた総プロテインSの活性値に応じて大きくなる。
従って、前記(b)においてシグナル量を測定することにより、生成が抑制されたシグナル量を測定することになり、これにより試料中に含まれていた総プロテインSの活性値を得ることができる。
(2)
活性化プロテインC、界面活性剤、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第V因子(第Va因子;FVa)、活性化血液凝固第X因子(第Xa因子;FXa)、プロトロンビン及びトロンビンの基質より構成される次の反応系を用いて試料中のプロテインSの活性値を測定する方法であって、
(a) 試料と、少なくとも活性化プロテインC、界面活性剤、リン脂質及びカルシウムイオンを接触させる。
これにより、試料にプロテインSが含まれる場合にはリン脂質及びカルシウムイオンの存在下に活性化プロテインCの活性が上昇する。
(b) 活性化プロテインCの前記(a)における活性の上昇により、活性化プロテインCがリン脂質及びカルシウムイオンの存在下に触媒する活性化血液凝固第V因子の分解反応が、界面活性剤の共存下で促進される。
(c) 活性化血液凝固第V因子により促進される、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下に活性化血液凝固第X因子が触媒するプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応が、前記(b)における活性化血液凝固第V因子の分解反応が促進されることにより抑制されて、トロンビンの生成が低減する。
(d) 前記(c)におけるトロンビンの生成の低減により、トロンビンが触媒するトロンビンの基質からシグナルを生じさせる反応が抑制される。
なお、このシグナル生成の抑制度は、試料に含まれていた総プロテインSの活性に応じて大きくなる。
(e) 前記(d)における反応の抑制により生成が抑制されたシグナル量を測定する。
以上の通り前記の反応により生成したシグナル量を測定し、すなわち生成が抑制されたシグナル量を測定することにより、試料中に含まれていた総プロテインSの活性値を得る。
3.試料
本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬において、試料とは、プロテインSを含有する可能性がある物質である。
この試料として、例えば、生体試料(ヒト又は動物などに由来する試料)等を挙げることができる。
生体試料としては、例えば、血液、血漿、唾液、汗、尿、涙、髄液、腹水、羊水などの生体の液体;肝臓、心臓、脳、骨、毛髪、皮膚、爪、筋肉、神経組織などの臓器、組織、細胞などの抽出液等を挙げることができる。
4.活性化プロテインC
本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬において用いる活性化プロテインCは、その由来(起源)や調製方法によらず、特に制限なく用いることができる。
例えば、ヒト、ウシ又はブタ等の哺乳動物由来のもの等を挙げることができる。また、血漿等の体液若しくは臓器などから精製し調製したものや、又は遺伝子工学操作、細胞工学操作若しくは細胞培養操作などにより調製したもの等を挙げることができる。
また、本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬における測定反応中に、プロテインC活性化物質等によりプロテインCより活性化プロテインCを生成させて、これを本発明における活性化プロテインCとして用いてもよい。
本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬において、活性化プロテインCは、試料と接触することにより、試料中にプロテインSが含まれている場合には、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下、この活性化プロテインCの活性が上昇する。
そして、活性化プロテインCは、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下、活性化血液凝固第V因子を分解する反応の触媒となる。
よって、プロテインSが存在することにより、活性化プロテインCが活性化血液凝固第V因子を分解する反応は促進される。
前記の活性化プロテインC等と試料を接触させることと、活性化プロテインCを活性化血液凝固第V因子等と接触させることは、同時に行ってもよい。
また、活性化プロテインCをリン脂質とともに試料と接触させ、少なくとも1分間以上、好ましくは5分間以上、室温又は37℃等においてインキュベートした後に、活性化血液凝固第V因子及びカルシウムイオンと接触させ、インキュベートして、活性化血液凝固第V因子の分解反応を行わせてもよい。
この活性化プロテインCを用いる際の濃度は、活性化血液凝固第V因子と接触させ、界面活性剤、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下に活性化血液凝固第V因子を分解させる際には、通常、1pM~100nMにあることが好ましい。
しかしながら、測定の感度を高く得るには、活性化プロテインC濃度が高い方が好ましいので、前記の活性化プロテインC濃度としては、10pM~10nMにあることがより好ましく、100pM~1nMにあることが特に好ましい。
また、本発明の試料中の総プロテインSの活性測定試薬においては、前記の活性化血液凝固第V因子の分解反応時に活性化プロテインCが前記の濃度となるように、この活性測定試薬に含有させることが好ましい。
例えば、活性化プロテインCを、1pM~200nM含有させることが好ましく、10pM~20nM含有させることがより好ましく、100pM~2nM含有させることが特に好ましい。
5.界面活性剤
本発明の総プロテインSの活性測定方法においては、当該総プロテインS活性の測定反応時に、界面活性剤を存在させる。
また、本発明の総プロテインSの活性測定試薬においては、活性化プロテインC、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第V因子、活性化血液凝固第X因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質とともに、界面活性剤を含有する。
この界面活性剤は、非イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤又は陽イオン性界面活性剤などの各種界面活性剤等の1種又は2種以上を適宜存在させればよい。
この界面活性剤としては、例えば、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、デカグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンフィトステロール、フィトスタノール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ油、硬化ヒマシ油若しくはポリオキシエチレンラノリンなどの非イオン性界面活性剤;酢酸ベタインなどの両性界面活性剤;又は、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩若しくはポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸塩などの陰イオン性界面活性剤等を挙げることができる。
なお、この界面活性剤が非イオン性界面活性剤の場合、そのHLB(Hydrophile−Lipophile Balance)は、10~20の範囲のものが好ましく、12~18の範囲のものがより好ましく、13~16の範囲のものが特に好ましい。
この界面活性剤は、非イオン性界面活性剤としては、Triton X−100〔ポリオキシエチレン(n=9,10)p−t−オクチルフェニルエーテル、HLB:13.5〕、Triton X−114〔ポリオキシエチレン(n=7,8)p−t−オクチルフェニルエーテル、HLB:12.4〕、NP−10〔ポリオキシエチレン(n=10)ノニルフェニルエーテル、HLB:16.5〕、NP−11〔ポリオキシエチレン(n=11)ノニルフェニルエーテル〕、NP−12〔ポリオキシエチレン(n=12)ノニルフェニルエーテル〕、NP−13〔ポリオキシエチレン(n=13)ノニルフェニルエーテル〕、NP−15〔ポリオキシエチレン(n=15)ノニルフェニルエーテル、HLB:18.0〕、BT−9〔ポリオキシエチレン(n=9)2級アルキルエーテル、HLB:13.5〕、又はBT−12〔ポリオキシエチレン(n=12)2級アルキルエーテル、HLB:14.5〕等が好ましい。
また、両イオン性界面活性剤としては、AM−301〔ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン水溶液〕等が好ましい。
そして、陰イオン性界面活性剤としては、サルコシネート LN〔ラウロイルサルコシンナトリウム〕等が好ましい。
更に、陽イオン性界面活性剤としては、CA−2350〔塩化セチルトリメチルアンモニウム〕等が好ましい。
なお、総プロテインS活性の測定反応時に界面活性剤を存在させる際の濃度は、特に限定されるものではないが、0.00001~5%(W/V)が好ましく、0.0001~1%(W/V)がより好ましく、0.001~0.1%(W/V)が更に好ましく、0.005~0.05%(W/V)が特に好ましい。
そして、非イオン性界面活性剤においては0.001~0.01%(W/V)が非常に好ましく、両イオン性界面活性剤においては0.001~0.01%(W/V)が非常に好ましく、陰イオン性界面活性剤においては0.001~0.1%(W/V)が非常に好ましく、陽イオン性界面活性剤においては0.00001~0.001%(W/V)が非常に好ましい。
そして、本発明の試料中の総プロテインSの活性測定試薬においては、総プロテインS活性の測定反応時に界面活性剤が前記の濃度となるように、この活性測定試薬に界面活性剤を含有させることが好ましい。
例えば、この活性測定試薬に界面活性剤を0.00001~10%(W/V)含有させることが好ましく、0.0001~2%(W/V)含有させることがより好ましく、0.001~0.2%(W/V)含有させることが更に好ましく、0.005~0.1%(W/V)含有させることが特に好ましい。
そして、非イオン性界面活性剤においては0.001~0.02%(W/V)、両イオン性界面活性剤においては0.001~0.02%(W/V)、陰イオン性界面活性剤においては0.001~0.2%(W/V)、陽イオン性界面活性剤においては0.00001~0.002%(W/V)の濃度で含有させることが非常に好ましい。
なお、本発明の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬においては、試料中に含まれていたプロテインSによる活性化プロテインCの活性上昇反応時、及び当該活性上昇したプロテインCによる活性化血液凝固第V因子の分解反応時に、界面活性剤を存在させることが、試料中の総プロテインSの活性測定のために好ましい。
6.リン脂質
(1)総論
本発明の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬においては、総プロテインS活性の測定反応時に、リン脂質を存在させる。
このリン脂質は、その由来(起源)や調製方法によらず、特に制限なく用いることができる。
例えば、ヒト、ウシ又はブタ等の哺乳動物由来のもの、その他の動物由来のもの、植物由来のもの、微生物由来のもの又は人工的に合成したもの等を挙げることができる。
総プロテインS活性の測定反応時に、リン脂質を存在させる際の濃度は、通常、0.03μM~100μMにあることが好ましく、0.3μM~50μMにあることがより好ましく、3μM~30μMにあることが特に好ましい。
そして、本発明の試料中の総プロテインSの活性測定試薬においては、総プロテインS活性の測定反応時に、リン脂質が前記の濃度となるように、この活性測定試薬に含有させることが好ましい。
例えば、この活性測定試薬にリン脂質を0.03μM~200μM含有させることが好ましく、0.3μM~100μM含有させることがより好ましく、3μM~60μM含有させることが特に好ましい。
このリン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール若しくはジホスファチジルグリセロールなどのグリセロリン脂質や、又はスフィンゴミエリンなどのスフィンゴリン脂質等を挙げることができる。
なお、このリン脂質としては、総プロテインS活性の測定反応時に、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンよりなるリン脂質を存在させることが、試料中の総プロテインSの活性測定のために好ましい。
また、このホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンよりなるリン脂質を存在させる場合、この3種類のリン脂質の組成としては、ホスファチジルエタノールアミンの組成比が10%(W/V)以上であり、かつホスファチジルセリンの組成比が20%(W/V)以上であることが好ましい。
特に、ホスファチジルエタノールアミンの組成比が30%(W/V)以上であり、かつホスファチジルセリンの組成比が30%(W/V)以上であることが好ましい。
(2)活性化プロテインCによる触媒反応に用いるリン脂質
本発明の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬においては、試料中に含まれていたプロテインSによる活性化プロテインCの活性上昇反応時、及びこの活性化プロテインCによる活性化血液凝固第V因子の分解反応時には、その活性化プロテインCの活性上昇反応及び活性化血液凝固第V因子の分解反応に必要なリン脂質を存在させる。
このリン脂質は、その由来(起源)や調製方法によらず、特に制限なく用いることができる。
例えば、ヒト、ウシ又はブタ等の哺乳動物由来のもの、その他の動物由来のもの、植物由来のもの、微生物由来のもの又は人工的に合成したもの等を挙げることができる。
前記の活性化プロテインCの活性上昇反応時及び活性化血液凝固第V因子の分解反応時にリン脂質を存在させる際の濃度は、通常、0.1μM~100μMにあることが好ましく、1μM~50μMにあることがより好ましく、10μM~30μMにあることが特に好ましい。
そして、本発明の試料中の総プロテインSの活性測定試薬においては、活性化プロテインCの活性上昇反応時及び活性化血液凝固第V因子の分解反応時に、リン脂質が前記の濃度となるように、この活性測定試薬に含有させることが好ましい。
例えば、この活性測定試薬にリン脂質を0.1μM~200μM含有させることが好ましく、1μM~100μM含有させることがより好ましく、10μM~60μM含有させることが特に好ましい。
このリン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール若しくはジホスファチジルグリセロールなどのグリセロリン脂質や、又はスフィンゴミエリンなどのスフィンゴリン脂質等を挙げることができる。
なお、このリン脂質としては、前記の活性化プロテインCの活性上昇反応時及び活性化血液凝固第V因子の分解反応時に、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンよりなるリン脂質を存在させることが、試料中の総プロテインSの活性測定のために好ましい。
また、このホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンよりなるリン脂質を存在させる場合、この3種類のリン脂質の組成としては、ホスファチジルエタノールアミンの組成比が10%(W/V)以上であり、かつホスファチジルセリンの組成比が20%(W/V)以上であることが好ましい。
特に、ホスファチジルエタノールアミンの組成比が30%(W/V)以上であり、かつホスファチジルセリンの組成比が30%(W/V)以上であることが好ましい。
(3)活性化血液凝固第X因子による触媒反応に用いるリン脂質
本発明の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬においては、活性化血液凝固第V因子の存在下に活性化血液凝固第X因子が触媒するプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応時には、その反応に必要なリン脂質を存在させる。
このリン脂質は、その由来(起源)や調製方法によらず、特に制限なく用いることができる。
例えば、ヒト、ウシ又はブタ等の哺乳動物由来のもの、その他の動物由来のもの、植物由来のもの、微生物由来のもの又は人工的に合成したもの等を挙げることができる。
前記のプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応時にリン脂質を存在させる際の濃度は、通常、0.1μM~100μMにあることが好ましく、0.5μM~50μMにあることがより好ましく、1μM~10μMにあることが特に好ましい。
そして、本発明の試料中の総プロテインSの活性測定試薬においては、プロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応時に、リン脂質が前記の濃度となるように、この活性測定試薬に含有させることが好ましい。
例えば、この活性測定試薬にリン脂質を0.1μM~200μM含有させることが好ましく、0.5μM~100μM含有させることがより好ましく、1μM~20μM含有させることが特に好ましい。
このリン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール若しくはジホスファチジルグリセロールなどのグリセロリン脂質や、又はスフィンゴミエリンなどのスフィンゴリン脂質等を挙げることができる。
なお、このリン脂質としては、前記のプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応時に、ホスファチジルコリン及びホスファチジルセリン、又はホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンよりなるリン脂質を存在させることが、前記反応の促進の効果が高くなるため好ましい。
また、このホスファチジルコリン及びホスファチジルセリンよりなるリン脂質を存在させる場合、この2種類のリン脂質の組成としては、ホスファチジルコリンの組成比が85%(W/V)~50%(W/V)であり、かつホスファチジルセリンの組成比が15%(W/V)~50%(W/V)であることが好ましい。
特に、ホスファチジルコリンの組成比が80%(W/V)~70%(W/V)であり、かつホスファチジルセリンの組成比が20%(W/V)~30%(W/V)であることが好ましい。
あるいは、このホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンよりなるリン脂質を存在させる場合、この3種類のリン脂質の組成としては、ホスファチジルエタノールアミンの組成比が10%(W/V)以上であり、かつホスファチジルセリンの組成比が20%(W/V)以上であることが好ましい。
特に、ホスファチジルエタノールアミンの組成比が30%(W/V)以上であり、かつホスファチジルセリンの組成比が30%(W/V)以上であることが好ましい。
なお、このプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応の際のリン脂質としては、前記の活性化プロテインCの活性上昇反応時及び活性化血液凝固第V因子の分解反応時に用いたリン脂質をそのまま用いることができる。
しかしながら、先に述べたとおり、適したリン脂質の組成がそれぞれの反応により異なるので、各々の反応に適した組成のリン脂質をその反応時に存在させて用いることが好ましい。
なお、このプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応の際に、先に加えた前記の活性化プロテインCの活性上昇反応及び活性化血液凝固第V因子の分解反応に適した組成のリン脂質が、このプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応に適した組成のリン脂質と共存したとしても、本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬においては全く支障はない。
7.カルシウムイオン
本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬においては、試料中に含まれていたプロテインSによる活性化プロテインCの活性上昇反応時、活性化プロテインCによる活性化血液凝固第V因子の分解反応時、及び活性化血液凝固第X因子及び活性化血液凝固第V因子によるプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応時には、カルシウムイオンを存在させる。
このカルシウムイオンとしては、カルシウムイオン自体はもちろんのこと、又はカルシウムの塩等のカルシウムイオンを含む化合物であれば、特に制限なく用いることができる。
このカルシウムイオンを含む化合物としては、例えば、フッ化カルシウム、塩化カルシウム、臭化カルシウム、ヨウ化カルシウム、硫酸カルシウム、硝酸カルシウム、酢酸カルシウム、乳酸カルシウム又はシアン化カルシウム等を挙げることができる。
このカルシウムイオンを用いる際の濃度は、試料中に含まれていたプロテインSによる活性化プロテインCの活性上昇反応の際、活性化プロテインCによる活性化血液凝固第V因子の分解反応の際、そして活性化血液凝固第X因子及び活性化血液凝固第V因子によるプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応の際には、通常、0.1mM~100mMにあることが好ましく、1mM~10mMにあることが特に好ましい。
そして、本発明の試料中の総プロテインSの活性測定試薬においては、前記の活性化プロテインCの活性上昇反応時、活性化血液凝固第V因子の分解反応時及びトロンビン生成反応時にカルシウムイオンが前記の濃度となるように、この活性測定試薬に含有させることが好ましい。
例えば、カルシウムイオン又はカルシウムイオンを含む化合物を、この活性測定試薬に0.1mM~200mM含有させることが好ましく、1mM~20mM含有させることが特に好ましい。
8.活性化血液凝固第V因子
本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬において用いる活性化血液凝固第V因子(第Va因子;FVa)は、その由来(起源)や調製方法によらず、特に制限なく用いることができる。
例えば、ヒト、ウシ又はブタ等の哺乳動物由来のもの等を挙げることができる。
また、血漿等の体液若しくは臓器などから精製し調製したものや、又は遺伝子工学操作、細胞工学操作若しくは細胞培養操作などにより調製したもの等を挙げることができる。
本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬において、活性化血液凝固第V因子は、界面活性剤、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下、活性化プロテインCにより分解される。
そして、試料中にプロテインSが含まれている場合そのプロテインSの存在により、活性化プロテインCの活性が上昇して、この分解反応は促進される。
また、活性化血液凝固第V因子は、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下に活性化血液凝固第X因子が触媒する、プロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応を促進するものである。
よって、試料中にプロテインSが含まれていると、活性化プロテインCの活性が上昇して、活性化血液凝固第V因子の分解反応が促進されて、活性化血液凝固第V因子の存在量(濃度)は少なくなる。
そうすると、活性化血液凝固第X因子が触媒するプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応に対する活性化血液凝固第V因子の促進効果が小さくなるので、前記のプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応は抑制される。
前記の活性化血液凝固第V因子と活性化プロテインC等とを接触させることと、活性化血液凝固第V因子と活性化血液凝固第X因子及びプロトロンビン等とを接触させることは、同時に行ってもよい。
しかしながら、活性化血液凝固第V因子を、界面活性剤、リン脂質及びカルシウムイオンとともに活性化プロテインCと接触させ、少なくとも1分間以上、好ましくは5分間以上、室温又は37℃等においてインキュベートした後に、活性化血液凝固第X因子及びプロトロンビン等と接触させ、インキュベートして、プロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応を行わせることが好ましい。
この活性化血液凝固第V因子を用いる際の濃度は、活性化プロテインCと接触させ、界面活性剤、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下に活性化血液凝固第V因子を分解する反応を行わせる際には、通常、0.5pM~5nMにあることが好ましい。
しかしながら、この活性化血液凝固第V因子の濃度が高いと、試料に由来する成分(因子)等による血液凝固反応が進行してしまい、フィブリンが析出したり又は多大な発色が生じて正確な測定が行えなくなるので、前記の活性化血液凝固第V因子濃度としては、5pM~500pMにあることがより好ましく、20pM~200pMにあることが特に好ましい。
また、本発明の試料中の総プロテインSの活性測定試薬においては、前記の活性化血液凝固第V因子の分解反応時に活性化血液凝固第V因子が前記の濃度となるように、活性測定試薬に含有させることが好ましい。
例えば、活性化血液凝固第V因子を、0.5pM~10nM含有させることが好ましく、5pM~2nM含有させることがより好ましく、20pM~1nM含有させることが特に好ましい。
9.活性化血液凝固第X因子
本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬において用いる活性化血液凝固第X因子(第Xa因子;FXa)は、その由来(起源)や調製方法によらず、特に制限なく用いることができる。
例えば、ヒト、ウシ又はブタ等の哺乳動物由来のもの等を挙げることができる。
また、血漿等の体液若しくは臓器などから精製し調製したものや、又は遺伝子工学操作、細胞工学操作若しくは細胞培養操作などにより調製したもの等を挙げることができる。
本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬において、活性化血液凝固第X因子は、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下、プロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応を触媒する。
この活性化血液凝固第X因子によるプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応は、活性化血液凝固第V因子の存在により促進される。
よって、先に述べたように、試料中にプロテインSが含まれていると、活性化プロテインCの活性が上昇し、これにより活性化血液凝固第V因子の分解反応が促進され、このため活性化血液凝固第X因子が触媒するトロンビンを生成させる反応に対する活性化血液凝固第V因子の促進効果が小さくなるので、前記のトロンビンを生成させる反応は抑制される。
この活性化血液凝固第X因子を用いる際の濃度は、活性化血液凝固第V因子及びプロトロンビン等と接触させ、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下、プロトロンビンよりトロンビンを生成させる際には、通常、0.1pM~300pMにあることが好ましい。
しかしながら、この活性化血液凝固第X因子の濃度が高いと、先の活性化血液凝固第V因子の場合と同様、試料に由来する成分(因子)等による血液凝固反応が進行してしまい、フィブリンが析出したり又は多大な発色が生じて正確な測定が行えなくなるので、前記の活性化血液凝固第X因子濃度としては、1pM~100pMにあることがより好ましく、10pM~50pMにあることが特に好ましい。
また、本発明の試料中のプロテインSの活性測定試薬においては、前記のトロンビン生成反応時に活性化血液凝固第X因子が前記の濃度となるように、活性測定試薬に含有させることが好ましい。
例えば、活性化血液凝固第X因子を、0.1pM~600pM含有させることが好ましく、1pM~200pM含有させることがより好ましく、10pM~100pM含有させることが特に好ましい。
10.プロトロンビン
本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬において用いるプロトロンビンは、その由来(起源)や調製方法によらず、特に制限なく用いることができる。
例えば、ヒト、ウシ又はブタ等の哺乳動物由来のもの等を挙げることができる。
また、血漿等の体液若しくは臓器などから精製し調製したものや、又は遺伝子工学操作、細胞工学操作若しくは細胞培養操作などにより調製したもの等を挙げることができる。
本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬において、プロトロンビンは、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下、活性化血液凝固第X因子が触媒する反応の基質となり、トロンビンになる。
この活性化血液凝固第X因子によるプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応は、活性化血液凝固第V因子の存在により促進される。
よって、先に述べたように、試料中にプロテインSが含まれていると、活性化プロテインCの活性が上昇し、これにより活性化血液凝固第V因子の分解反応が促進され、このため活性化血液凝固第X因子が触媒するプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応に対する活性化血液凝固第V因子の促進効果が小さくなるので、前記のプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応は抑制され、生成されるトロンビンの量(濃度)は低減される。
このプロトロンビンを用いる際の濃度は、活性化血液凝固第V因子及び活性化血液凝固第X因子と接触させ、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下、プロトロンビンよりトロンビンを生成させる際には、通常、1nM~50μMにあることが好ましく、50nM~5μMにあることがより好ましく、そして100nM~1μMにあることが特に好ましい。
また、本発明の試料中の総プロテインSの活性測定試薬においては、前記のトロンビン生成反応時にプロトロンビンが前記の濃度となるように、この活性測定試薬に含有させることが好ましい。
例えば、プロトロンビンを、この活性測定試薬に1nM~100μM含有させることが好ましく、50nM~10μM含有させることがより好ましく、100nM~2μM含有させることが特に好ましい。
11.トロンビンの基質
本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬において用いるトロンビンの基質は、トロンビンのプロテアーゼとしての触媒作用を(トロンビンの基質として)受けることにより何らかのシグナルを生じるもの、又はトロンビンによる触媒反応に加え更に他の反応を続けることにより何らかのシグナルが生じるものであれば、特に制限なく用いることができる。
この何らかのシグナルが生じるということであるが、これはトロンビンの触媒作用を受けることにより光学的、電気的、磁気的若しくは他のエネルギー等におけるシグナル(信号)の生成又は変化を検出することができるということを意味する。
例えば、トロンビンの触媒作用を受けることにより、吸光虔、透過率若しくは蛍光強度が変化するもの、光の吸収曲線が変化するもの、又は発光するもの等を挙げることができる。
この一例としては、遊離したときに吸光度、透過率若しくは蛍光強度、又は光の吸収曲線が変化するような化合物を結合したペプチド又はタンパク質、或いは遊離したときに発光するような化合物を結合したペプチド又はタンパク質等であって、トロンビンの触媒作用により前記の化合物が前記のペプチド又はタンパク質より遊離するような物質等を挙げることができる。
このような物質においては、トロンビンの触媒作用を受け、前記化合物が遊離することにより、吸光度、透過率若しくは蛍光強度又は光の吸収曲線の変化或いは発光等として検出できるので、トロンビンの触媒作用すなわちトロンビンの酵素活性を、生成したシグナル(吸光度、透過率若しくは蛍光強度又は光の吸収曲線の変化或いは発光等)の量を測定することにより求めることができる。
このような物質としては、例えば、「H−D−フェニルアラニル−L−ピペコリル−L−アルギニル−p−ニトロアニリド・二塩酸塩」〔テストチーム(登録商標)発色基質S−2238〕(製造元:Chromogenix−Instrumentation Laboratory社〔イタリア国〕、販売元:積水メディカル社〔日本国〕)、「H−D−ヘキサハイドロチロシル−L−アラニル−L−アルギニル−p−ニトロアニリド・二酢酸塩」〔SPECTROZYME(登録商標)TH〕(AMERICAN DIAGNOSTICA社・コスモバイオ社)、「ベンゾイル−フェニルアラニル−バリニル−アルギニル−p−ニトロアニリド・塩酸塩」〔Thrombin Substrate I,Colorimetric〕(CALBIOCHEM社・コスモバイオ社)、「トシル−グリシル−プロリル−アルギニル−p−ニトロアニリド」〔CHROMOZYME TH〕(PENTAPHARM社)、「H−D−フェニルアラニル−プロリル−アルギニル−3−カルボキシ−4−ヒドロキシ−アニリン」(第一三共社)、「ベンゾイル−フェニルアラニル−バリニル−アルギニル−AMC・塩酸塩」〔Thrombin Substrate III,Fluorogenic〕(CALBIOCHEM社・コスモバイオ社)、「t−ブトキシカルボニル−アスパラギル(O−ベンジル)−プロリル−アルギニル−MCA」(ペプチド研究所)、又は「t−ブトキシカルボニル−バリニル−プロリル−アルギニル−MCA」(ペプチド研究所)等を挙げることができる。なお、特に「H−D−フェニルアラニル−L−ピペコリル−L−アルギニル−p−ニトロアニリド・二塩酸塩」が好ましい。
前記の活性化血液凝固第V因子と活性化血液凝固第X因子とプロトロンビン等とを接触させることと、生成したトロンビンとこのトロンビンの基質とを接触させることは、同時に行ってもよいし、別々の段階として分けて行ってもよい。
なお、いずれにしても、生成したトロンビンにトロンビンの基質を接触させ、少なくとも1分間以上、好ましくは5分間以上、室温又は37℃等においてインキュベートして、トロンビンの基質からシグナルを生じさせる。
このトロンビンの基質を用いる際の濃度は、このトロンビンの基質がトロンビンの触媒作用を受ける際に、通常、5μM~100mMにあることが好ましく、50μM~10mMにあることが特に好ましい。
そして、本発明の試料中のプロテインSの活性測定試薬においては、トロンビンの触媒作用を受ける際にこのトロンビンの基質が前記の濃度となるように、この活性測定試薬に含有させることが好ましい。
例えば、このトロンビンの基質を、5μM~200mM含有させることが好ましく、50μM~20mM含有させることが特に好ましい。
12.シグナル量の測定
本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬におけるトロンビンの基質は、プロトロンビンより生成したトロンビンの触媒作用を受けることによりシグナルを生じる。
本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬においては、このトロンビンの基質より生成したシグナルの量を測定する。
なお、試料中にプロテインSが含まれている場合、このシグナルの量は、試料中の総プロテインSの活性値に応じて生成が抑制されたシグナルの量である。
この生成したシグナル量(生成が抑制されたシグナル量)の測定は、そのシグナルに応じて適宜行えばよい。
例えば、シグナルが、吸光度、透過率若しくは蛍光強度又は光の吸収曲線の変化或いは発光等である場合には、吸光度、透過率、蛍光強度又は発光強度などを測定する等により行う。
より具体的には、トロンビンの基質が、前記の「H−D−フェニルアラニル−L−ピペコリル−L−アルギニル−p−ニトロアニリド・二塩酸塩」、「H−D−ヘキサハイドロチロシル−L−アラニル−L−アルギニル−p−ニトロアニリド・二酢酸塩」、「ベンゾイル−フェニルアラニル−バリニル−アルギニル−p−ニトロアニリド・塩酸塩」、又は「トシル−グリシル−プロリル−アルギニル−p−ニトロアニリド」等の、ペプチドにp−ニトロアニリンを結合させた物質である場合には、トロンビンの触媒作用により遊離したp−ニトロアニリンが波長405nm近辺に有する光の吸収を、波長405nm又はその近辺の波長において吸光度を測定することにより行う。
この場合、吸光度の測定は、主波長のみの一波長測定でもよいし、又は主波長と副波長において測定する二波長測定でもよい。
そして、この吸光度の測定は、エンドポイント法でもよいし、又はレート法でもよい。
13.試料中に含まれていた総プロテインSの活性値
本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬においては、試料中にプロテインSが含まれていると、活性化プロテインCの活性が上昇して、活性化血液凝固第V因子の分解反応が促進されて、活性化血液凝固第V因子の存在量(濃度)は少なくなる。
そうすると、活性化血液凝固第X因子が触媒するプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応に対する活性化血液凝固第V因子の促進効果が小さくなるので、前記のプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応は抑制される。
これにより、トロンビンの生成が低減するので、このトロンビンが触媒するトロンビンの基質からシグナルを生じさせる反応も抑制されて、生成するシグナルの量は抑制される。
すなわち、試料中に含まれる総プロテインSの活性値に応じて、このシグナル生成の抑制度は大きくなる。
従って、本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬においては、試料と活性化プロテインC等とを接触させ前記の通りの反応を行わせることによって生成したシグナル量を測定して、すなわち生成が抑制されたシグナル量を測定することにより、試料中に含まれていた総プロテインSの活性値を得る。
この生成が抑制されたシグナル量を測定した後、試料中に含まれていた総プロテインSの活性値を得ることは、適宜行えばよいが、例えば以下のようにして行うことができる。
総プロテインSの活性値が分かっている試料の少なくとも一つと、総プロテインSの活性値が「ゼロ」であることが分かっている試料(生理食塩水又は純水等)について、前記の通り測定操作を行い、生成したシグナル量(生成が抑制されたシグナル量)を求める。
そして、この生成したシグナル量(生成が抑制されたシグナル量)と試料中に含まれる総プロテインSの活性値との関係を、数式又はグラフ等に表して、検量線を作成する。
この検量線は、すなわち、シグナル生成の抑制度と試料中に含まれる総プロテインSの活性値との関係を表したものである。
次に、総プロテインSの活性値が未知の試料について、前記の通り同様に測定操作を行い、生成したシグナル量(生成が抑制されたシグナル量)を求める。
このシグナル量を前記の検量線に当てはめ、相当する総プロテインSの活性値を求める。
これにより、総プロテインSの活性値が未知の試料における生成したシグナル量(生成が抑制されたシグナル量)より、その試料の総プロテインSの活性値を得ることができる。
なお、前記の検量線は、シグナル量(生成が抑制されたシグナル量)すなわちシグナル生成の抑制度と、試料中に含まれる総プロテインSの活性値との関係を表したものであるが、この検量線におけるシグナル量(生成が抑制されたシグナル量)は、測定されたシグナル量そのものでもよいが、そのシグナル量の値を基に算出した数値であってもよい。
つまり、前記の検量線は、測定されたシグナル量の値を基に算出した数値と、試料中に含まれる総プロテインSの活性値との関係を表したものであってもよい。
なお、この場合であっても、測定されたシグナル量の値を基に算出した数値は、生成が抑制されたシグナル量に対応したものである。
この測定されたシグナル量の値を基に算出した数値としては、例えば、測定されたシグナル量の単位時間当たりの変化量の数値、又は測定されたシグナル量の値を時間に対して一次微分して算出した数値、若しくは二次微分して算出した数値等を挙げることができる。
例として、測定により得られた吸光度の1分間当たりの変化量、又は測定により得られた吸光度を時間に対して一次微分して得た吸光度変化の速度、若しくは測定により得られた吸光度を時間に対して二次微分して得た吸光度変化の加速度等を挙げることができる。
14.タンパク質
本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬においては、ヒト血清アルブミン(HSA)、ウシ血清アルブミン(BSA)若しくは卵白アルブミンなどのアルブミン、カゼイン、又はゼラチン等のタンパク質を前記の活性測定反応時に存在させることが好ましく、又は前記の活性測定試薬に含有させることが好ましい。
このタンパク質を存在させる濃度は、通常、0.1μM~1mMにあることが好ましい。
そして、本発明の試料中の総プロテインSの活性測定試薬においては、このタンパク質が前記の濃度となるように、この活性測定試薬に含有させることが好ましい。
例えば、このタンパク質を、0.1μM~2mM含有させることが好ましい。
15.塩
本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬においては、ハロゲン元素とアルカリ金属の塩又はハロゲン元素とアルカリ土類金属の塩等の塩を前記の活性測定反応時に存在させることが好ましく、又は前記の活性測定試薬に含有させることが好ましい。
ハロゲン元素とアルカリ金属の塩としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、フッ化ナトリウム、フッ化カリウム、臭化ナトリウム又は臭化カリウム等を挙げることができる。
また、ハロゲン元素とアルカリ土類金属の塩としては、例えば、塩化マグネシウム、フッ化マグネシウム又は臭化マグネシウム等を挙げることができる。
この塩を存在させる濃度は、通常、5mM~1Mにあることが好ましく、50mM~250mMにあることが特に好ましい。
そして、本発明の試料中の総プロテインSの活性測定試薬においては、この塩が前記の濃度となるように、この活性測定試薬に含有させることが好ましい。
例えば、この塩を、5mM~2M含有させることが好ましく、50mM~500mM含有させることが特に好ましい。
16.希釈液
本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法においては、試料を希釈液により希釈した後に、前記の活性測定反応を行わせることが、試料中の総プロテインSの活性測定のために好ましい。
また、本発明の試料中の総プロテインSの活性測定試薬においては、希釈液を前記の活性測定試薬に含有させることが、試料中の総プロテインSの活性測定のために好ましい。
この希釈液のpHは、特に限定はないが、pH6.0~pH10.0(20℃)のpH範囲のものであることが好ましく、pH6.5~pH8.5(20℃)のpH範囲のものであることがより好ましい。
なお、この希釈液には、pHを前記のpH範囲に保つため、前記のpH範囲に緩衝能を有する緩衝剤を適宜存在させ又は含有させることが好ましい。
また、この希釈液には、必要に応じて適宜、タンパク質、塩、界面活性剤、防腐剤、安定化剤、活性化剤、又は糖類等の成分を含有させることができる。
この希釈液としては、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、又は緩衝液等を挙げることができる。
この希釈液により試料を希釈する際の希釈倍率であるが、特に限定はないものの、試料中の総プロテインSの活性測定のためには、2倍~60倍が好ましく、5倍~40倍がより好ましく、10倍~20倍が特に好ましい。
17.pH
本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法においては、前記の活性測定反応を、pH6.0~pH10.0(20℃)の範囲で行うことが好ましく、pH6.5~pH8.5(20℃)の範囲で行うことが特に好ましい。
また、本発明の試料中の総プロテインSの活性測定試薬においては、前記の活性測定反応が、pH6.0~pH10.0(20℃)のpH範囲で行われるようなpHであることが好ましく、pH6.5~pH8.5(20℃)のpH範囲で行われるようなpHであることが特に好ましい。
なお、本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬においては、活性測定反応におけるpH又は活性測定試薬のpHを前記のpH範囲に保つため、前記のpH範囲に緩衝能を有する緩衝剤を適宜存在させ又は含有させることが好ましい。
18.他の成分
本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬においては、必要に応じて適宜、防腐剤、安定化剤、活性化剤、又は糖類等の前記記載した成分以外の成分を前記の活性測定反応時に存在させ、又は前記の活性測定試薬に含有させることができる。
19.測定手法
本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬における、試料中の総プロテインSの活性の測定は、用手法により行ってもよく、又は自動分析装置等の装置を使用して行ってもよい。
20.測定段階
本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬おいて、前記詳述した活性測定反応は、1回に全ての成分と試料との接触を行わせて、全ての反応を1段階に行ってもよく(1ステップ法)、また、成分を分け、接触を複数段階に分けて行うことにより活性測定反応を複数段階に分けて行ってもよい(多ステップ法)。
複数段階に分ける場合、特に制限はないが、例えば次のように行うことができる。
(1)2ステップ法−1
(a) 試料、活性化プロテインC、界面活性剤、リン脂質、カルシウムイオン及び活性化血液凝固第V因子を接触させる。
(b) 次に、前記(a)のものに、活性化血液凝固第X因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質を接触させる。
(2)2ステップ法−2
(a) 試料、活性化プロテインC、界面活性剤、リン脂質及びカルシウムイオンを接触させる。
(b) 次に、前記(a)のものに、活性化血液凝固第V因子、活性化血液凝固第X因子、プロトロンビン、トロンビンの基質及びリン脂質を接触させる。
(3)3ステップ法
(a) 試料、活性化プロテインC、界面活性剤、リン脂質及びカルシウムイオンを接触させる。
(b) 次に、前記(a)のものに、活性化血液凝固第V因子を接触させる。
(c) 更に、前記(b)のものに、活性化血液凝固第X因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質を接触させる。
21.試料中の総プロテインSの活性測定試薬
本発明の試料中のプロテインSの活性測定試薬は、活性化プロテインC、界面活性剤、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第V因子、活性化血液凝固第X因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質を含有するものである。
必要に応じて前記成分以外の成分を含んでいても構わない。
22.試料中の総プロテインSの活性測定試薬の構成
本発明の試料中の総プロテインSの活性測定試薬おいて、前記詳述した活性測定反応の各成分は、全て一つの試薬中に含有させてもよく(1試薬系)、また、各成分を2試薬又は3試薬等の複数の試薬に分けて含有させてもよい(複数試薬系)。
各成分を複数の試薬に分けて含有させる場合、特に制限はないが、例えば次のように含有させることができる。
(1)2試薬系−1
(a)第1試薬:活性化プロテインC、界面活性剤、リン脂質、カルシウムイオン及び活性化血液凝固第V因子
(b)第2試薬:活性化血液凝固第X因子、プロトロンビン、トロンビンの基質及びリン脂質
(2)2試薬系−2
(a)第1試薬:活性化プロテインC、界面活性剤、リン脂質及びカルシウムイオン
(b)第2試薬:活性化血液凝固第V因子、活性化血液凝固第X因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質
(3)3試薬系
(a)第1試薬:活性化プロテインC、界面活性剤、リン脂質及びカルシウムイオン
(b)第2試薬:活性化血液凝固第V因子
(c)第3試薬:活性化血液凝固第X因子、プロトロンビン、トロンビンの基質及びリン脂質
(4)4試薬系
(a)第1試薬:活性化プロテインC、界面活性剤、リン脂質及びカルシウムイオン
(b)第2試薬:活性化血液凝固第V因子
(c)第3試薬:活性化血液凝固第X因子
(d)第4試薬:プロトロンビン及びトロンビンの基質
(1)試料中の総プロテインSの活性測定方法
本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法は、試料中の総プロテインSの活性を測定する方法であって、当該総プロテインS活性の測定反応時に、界面活性剤を存在させることを特徴とする、試料中の総プロテインSの活性測定方法である。
なお、本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法においては、プロテインSによる活性化プロテインCの活性上昇反応時及び当該活性上昇した活性化プロテインCによる活性化血液凝固第V因子の分解反応時に、界面活性剤を存在させることが好ましい。
また、本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法においては、総プロテインS活性の測定反応時に、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンよりなるリン脂質を存在させることが好ましい。
そして、本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法においては、プロテインSによる活性化プロテインCの活性上昇反応時及び当該活性上昇した活性化プロテインCによる活性化血液凝固第V因子の分解反応時に、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンよりなるリン脂質を存在させることが好ましい。
更に、本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法は、試料中の総プロテインS活性の測定が、次の(a)~(c)の工程を含む方法により行われるものであることが好ましい。
(a) 活性化プロテインC、界面活性剤、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第V因子、活性化血液凝固第X因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質を試料と接触させる。
(b) 次に、前記(a)の各成分による反応の結果トロンビンの基質から生成されるシグナル量を測定する。
(c) 次に、この試料に含まれる総プロテインSの活性に応じて生成が抑制されたシグナル量より、試料中に含まれていた総プロテインSの活性値を得る。
また、本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法においては、試料中の総プロテインS活性の測定が、次の(a)~(e)の工程を含む方法により行われるものであることが好ましい。
(a) 試料と、少なくとも活性化プロテインC、界面活性剤、リン脂質及びカルシウムイオンを接触させることにより、試料にプロテインSが含まれる場合には活性化プロテインCの活性が上昇する。
(b) 次に、前記(a)の成分及び活性化血液凝固第V因子の存在下、活性化プロテインCが触媒する活性化血液凝固第V因子の分解反応が、前記(a)における活性化プロテインCの活性の上昇により、促進される。
(c) 次に、活性化血液凝固第V因子により促進される、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下に活性化血液凝固第X因子が触媒するプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応が、前記(b)における活性化血液凝固第V因子の分解反応が促進されることにより抑制されて、トロンビンの生成が低減される。
(d) 次に、前記(c)におけるトロンビンの生成の低減により、トロンビンが触媒するトロンビンの基質からシグナルを生じさせる反応が抑制される。
(e) 次に、前記(d)における反応の抑制により生成が抑制されたシグナル量を測定することにより、試料中に含まれていた総プロテインSの活性値を得る。
(2)試料中の総プロテインSの活性測定試薬
本発明の試料中の総プロテインSの活性測定試薬は、活性化プロテインC、界面活性剤、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第V因子、活性化血液凝固第X因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質を含有する試料中の総プロテインSの活性測定試薬である。
なお、本発明の試料中の総プロテインSの活性測定試薬においては、界面活性剤が、プロテインSによる活性化プロテインCの活性上昇反応時及び当該活性上昇した活性化プロテインCによる活性化血液凝固第V因子の分解反応時に存在させるものであることが好ましい。
また、本発明の試料中の総プロテインSの活性測定試薬においては、リン脂質が、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンよりなるリン脂質であることが好ましい。
そして、本発明の試料中の総プロテインSの活性測定試薬においては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンよりなるリン脂質が、プロテインSによる活性化プロテインCの活性上昇反応時及び当該活性上昇した活性化プロテインCによる活性化血液凝固第V因子の分解反応時に存在させるものであることが好ましい。
更に、本発明の試料中の総プロテインSの活性測定試薬は、次の(a)~(c)の工程を含む試料中の総プロテインS活性の測定のためのものであることが好ましい。
(a) 活性化プロテインC、界面活性剤、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第V因子、活性化血液凝固第X因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質を試料と接触させる。
(b) 次に、前記(a)の各成分による反応の結果トロンビンの基質から生成されるシグナル量を測定する。
(c) 次に、この試料に含まれる総プロテインSの活性に応じて生成が抑制されたシグナル量より、試料中に含まれていた総プロテインSの活性値を得る。
また、本発明の試料中の総プロテインSの活性測定試薬は、次の(a)~(e)の工程を含む試料中の総プロテインS活性の測定のためのものであることが好ましい。
(a) 試料と、少なくとも活性化プロテインC、界面活性剤、リン脂質及びカルシウムイオンを接触させることにより、試料にプロテインSが含まれる場合には活性化プロテインCの活性が上昇する。
(b) 次に、前記(a)の成分及び活性化血液凝固第V因子の存在下、活性化プロテインCが触媒する活性化血液凝固第V因子の分解反応が、前記(a)における活性化プロテインCの活性の上昇により、促進される。
(c) 次に、活性化血液凝固第V因子により促進される、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下に活性化血液凝固第X因子が触媒するプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応が、前記(b)における活性化血液凝固第V因子の分解反応が促進されることにより抑制されて、トロンビンの生成が低減される。
(d) 次に、前記(c)におけるトロンビンの生成の低減により、トロンビンが触媒するトロンビンの基質からシグナルを生じさせる反応が抑制される。
(e) 次に、前記(d)における反応の抑制により生成が抑制されたシグナル量を測定することにより、試料中に含まれていた総プロテインSの活性値を得る。
2.試料中の総プロテインSの活性測定の方法
本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法における測定の方法、及び本発明の試料中の総プロテインSの活性測定試薬を用いる測定の方法として、次の(1)又は(2)に記載の方法等を挙げることができ、これらの方法等により行うことが好ましい。
(1)
(a) 活性化プロテインC、界面活性剤、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第V因子(第Va因子;FVa)、活性化血液凝固第X因子(第Xa因子;FXa)、プロトロンビン及びトロンビンの基質を試料と接触させる。
なお、これらの成分と試料との接触は、1回に全ての成分との接触を行わせて、下記の反応系の全ての反応を1段階に行ってもよく(1ステップ法)、また、前記成分を分け、接触を複数段階に分けて行うことにより下記の反応系の反応を複数段階に分けて行ってもよい(多ステップ法)。
(b) 前記(a)における接触により、前記の各成分による下記の反応が進行する。
そして、この一連の反応によりトロンビンの基質から生成されるシグナル量を測定する。
即ち、前記の一連の反応により、トロンビンの基質がトロンビンにより分解等の作用を受け、この結果生じるシグナルの量(例えば、吸光度等)を測定する。
(c) 試料にプロテインSが含まれている場合には、活性化プロテインCがリン脂質及びカルシウムイオンの存在下に活性が上昇し、これにより活性化血液凝固第V因子の分解が促進されるので、その結果トロンビンが触媒するトロンビンの基質からシグナルを生じさせる反応が抑制されて、シグナルの生成が抑制される。
このシグナル生成の抑制度は、試料に含まれていた総プロテインSの活性値に応じて大きくなる。
従って、前記(b)においてシグナル量を測定することにより、生成が抑制されたシグナル量を測定することになり、これにより試料中に含まれていた総プロテインSの活性値を得ることができる。
活性化プロテインC、界面活性剤、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第V因子(第Va因子;FVa)、活性化血液凝固第X因子(第Xa因子;FXa)、プロトロンビン及びトロンビンの基質より構成される次の反応系を用いて試料中のプロテインSの活性値を測定する方法であって、
(a) 試料と、少なくとも活性化プロテインC、界面活性剤、リン脂質及びカルシウムイオンを接触させる。
これにより、試料にプロテインSが含まれる場合にはリン脂質及びカルシウムイオンの存在下に活性化プロテインCの活性が上昇する。
(b) 活性化プロテインCの前記(a)における活性の上昇により、活性化プロテインCがリン脂質及びカルシウムイオンの存在下に触媒する活性化血液凝固第V因子の分解反応が、界面活性剤の共存下で促進される。
(c) 活性化血液凝固第V因子により促進される、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下に活性化血液凝固第X因子が触媒するプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応が、前記(b)における活性化血液凝固第V因子の分解反応が促進されることにより抑制されて、トロンビンの生成が低減する。
(d) 前記(c)におけるトロンビンの生成の低減により、トロンビンが触媒するトロンビンの基質からシグナルを生じさせる反応が抑制される。
なお、このシグナル生成の抑制度は、試料に含まれていた総プロテインSの活性に応じて大きくなる。
(e) 前記(d)における反応の抑制により生成が抑制されたシグナル量を測定する。
以上の通り前記の反応により生成したシグナル量を測定し、すなわち生成が抑制されたシグナル量を測定することにより、試料中に含まれていた総プロテインSの活性値を得る。
本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬において、試料とは、プロテインSを含有する可能性がある物質である。
この試料として、例えば、生体試料(ヒト又は動物などに由来する試料)等を挙げることができる。
生体試料としては、例えば、血液、血漿、唾液、汗、尿、涙、髄液、腹水、羊水などの生体の液体;肝臓、心臓、脳、骨、毛髪、皮膚、爪、筋肉、神経組織などの臓器、組織、細胞などの抽出液等を挙げることができる。
4.活性化プロテインC
本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬において用いる活性化プロテインCは、その由来(起源)や調製方法によらず、特に制限なく用いることができる。
例えば、ヒト、ウシ又はブタ等の哺乳動物由来のもの等を挙げることができる。また、血漿等の体液若しくは臓器などから精製し調製したものや、又は遺伝子工学操作、細胞工学操作若しくは細胞培養操作などにより調製したもの等を挙げることができる。
また、本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬における測定反応中に、プロテインC活性化物質等によりプロテインCより活性化プロテインCを生成させて、これを本発明における活性化プロテインCとして用いてもよい。
本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬において、活性化プロテインCは、試料と接触することにより、試料中にプロテインSが含まれている場合には、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下、この活性化プロテインCの活性が上昇する。
そして、活性化プロテインCは、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下、活性化血液凝固第V因子を分解する反応の触媒となる。
よって、プロテインSが存在することにより、活性化プロテインCが活性化血液凝固第V因子を分解する反応は促進される。
前記の活性化プロテインC等と試料を接触させることと、活性化プロテインCを活性化血液凝固第V因子等と接触させることは、同時に行ってもよい。
また、活性化プロテインCをリン脂質とともに試料と接触させ、少なくとも1分間以上、好ましくは5分間以上、室温又は37℃等においてインキュベートした後に、活性化血液凝固第V因子及びカルシウムイオンと接触させ、インキュベートして、活性化血液凝固第V因子の分解反応を行わせてもよい。
この活性化プロテインCを用いる際の濃度は、活性化血液凝固第V因子と接触させ、界面活性剤、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下に活性化血液凝固第V因子を分解させる際には、通常、1pM~100nMにあることが好ましい。
しかしながら、測定の感度を高く得るには、活性化プロテインC濃度が高い方が好ましいので、前記の活性化プロテインC濃度としては、10pM~10nMにあることがより好ましく、100pM~1nMにあることが特に好ましい。
また、本発明の試料中の総プロテインSの活性測定試薬においては、前記の活性化血液凝固第V因子の分解反応時に活性化プロテインCが前記の濃度となるように、この活性測定試薬に含有させることが好ましい。
例えば、活性化プロテインCを、1pM~200nM含有させることが好ましく、10pM~20nM含有させることがより好ましく、100pM~2nM含有させることが特に好ましい。
5.界面活性剤
本発明の総プロテインSの活性測定方法においては、当該総プロテインS活性の測定反応時に、界面活性剤を存在させる。
また、本発明の総プロテインSの活性測定試薬においては、活性化プロテインC、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第V因子、活性化血液凝固第X因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質とともに、界面活性剤を含有する。
この界面活性剤は、非イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤又は陽イオン性界面活性剤などの各種界面活性剤等の1種又は2種以上を適宜存在させればよい。
この界面活性剤としては、例えば、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、デカグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンフィトステロール、フィトスタノール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ油、硬化ヒマシ油若しくはポリオキシエチレンラノリンなどの非イオン性界面活性剤;酢酸ベタインなどの両性界面活性剤;又は、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩若しくはポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸塩などの陰イオン性界面活性剤等を挙げることができる。
なお、この界面活性剤が非イオン性界面活性剤の場合、そのHLB(Hydrophile−Lipophile Balance)は、10~20の範囲のものが好ましく、12~18の範囲のものがより好ましく、13~16の範囲のものが特に好ましい。
この界面活性剤は、非イオン性界面活性剤としては、Triton X−100〔ポリオキシエチレン(n=9,10)p−t−オクチルフェニルエーテル、HLB:13.5〕、Triton X−114〔ポリオキシエチレン(n=7,8)p−t−オクチルフェニルエーテル、HLB:12.4〕、NP−10〔ポリオキシエチレン(n=10)ノニルフェニルエーテル、HLB:16.5〕、NP−11〔ポリオキシエチレン(n=11)ノニルフェニルエーテル〕、NP−12〔ポリオキシエチレン(n=12)ノニルフェニルエーテル〕、NP−13〔ポリオキシエチレン(n=13)ノニルフェニルエーテル〕、NP−15〔ポリオキシエチレン(n=15)ノニルフェニルエーテル、HLB:18.0〕、BT−9〔ポリオキシエチレン(n=9)2級アルキルエーテル、HLB:13.5〕、又はBT−12〔ポリオキシエチレン(n=12)2級アルキルエーテル、HLB:14.5〕等が好ましい。
また、両イオン性界面活性剤としては、AM−301〔ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン水溶液〕等が好ましい。
そして、陰イオン性界面活性剤としては、サルコシネート LN〔ラウロイルサルコシンナトリウム〕等が好ましい。
更に、陽イオン性界面活性剤としては、CA−2350〔塩化セチルトリメチルアンモニウム〕等が好ましい。
なお、総プロテインS活性の測定反応時に界面活性剤を存在させる際の濃度は、特に限定されるものではないが、0.00001~5%(W/V)が好ましく、0.0001~1%(W/V)がより好ましく、0.001~0.1%(W/V)が更に好ましく、0.005~0.05%(W/V)が特に好ましい。
そして、非イオン性界面活性剤においては0.001~0.01%(W/V)が非常に好ましく、両イオン性界面活性剤においては0.001~0.01%(W/V)が非常に好ましく、陰イオン性界面活性剤においては0.001~0.1%(W/V)が非常に好ましく、陽イオン性界面活性剤においては0.00001~0.001%(W/V)が非常に好ましい。
そして、本発明の試料中の総プロテインSの活性測定試薬においては、総プロテインS活性の測定反応時に界面活性剤が前記の濃度となるように、この活性測定試薬に界面活性剤を含有させることが好ましい。
例えば、この活性測定試薬に界面活性剤を0.00001~10%(W/V)含有させることが好ましく、0.0001~2%(W/V)含有させることがより好ましく、0.001~0.2%(W/V)含有させることが更に好ましく、0.005~0.1%(W/V)含有させることが特に好ましい。
そして、非イオン性界面活性剤においては0.001~0.02%(W/V)、両イオン性界面活性剤においては0.001~0.02%(W/V)、陰イオン性界面活性剤においては0.001~0.2%(W/V)、陽イオン性界面活性剤においては0.00001~0.002%(W/V)の濃度で含有させることが非常に好ましい。
なお、本発明の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬においては、試料中に含まれていたプロテインSによる活性化プロテインCの活性上昇反応時、及び当該活性上昇したプロテインCによる活性化血液凝固第V因子の分解反応時に、界面活性剤を存在させることが、試料中の総プロテインSの活性測定のために好ましい。
6.リン脂質
(1)総論
本発明の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬においては、総プロテインS活性の測定反応時に、リン脂質を存在させる。
このリン脂質は、その由来(起源)や調製方法によらず、特に制限なく用いることができる。
例えば、ヒト、ウシ又はブタ等の哺乳動物由来のもの、その他の動物由来のもの、植物由来のもの、微生物由来のもの又は人工的に合成したもの等を挙げることができる。
総プロテインS活性の測定反応時に、リン脂質を存在させる際の濃度は、通常、0.03μM~100μMにあることが好ましく、0.3μM~50μMにあることがより好ましく、3μM~30μMにあることが特に好ましい。
そして、本発明の試料中の総プロテインSの活性測定試薬においては、総プロテインS活性の測定反応時に、リン脂質が前記の濃度となるように、この活性測定試薬に含有させることが好ましい。
例えば、この活性測定試薬にリン脂質を0.03μM~200μM含有させることが好ましく、0.3μM~100μM含有させることがより好ましく、3μM~60μM含有させることが特に好ましい。
このリン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール若しくはジホスファチジルグリセロールなどのグリセロリン脂質や、又はスフィンゴミエリンなどのスフィンゴリン脂質等を挙げることができる。
なお、このリン脂質としては、総プロテインS活性の測定反応時に、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンよりなるリン脂質を存在させることが、試料中の総プロテインSの活性測定のために好ましい。
また、このホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンよりなるリン脂質を存在させる場合、この3種類のリン脂質の組成としては、ホスファチジルエタノールアミンの組成比が10%(W/V)以上であり、かつホスファチジルセリンの組成比が20%(W/V)以上であることが好ましい。
特に、ホスファチジルエタノールアミンの組成比が30%(W/V)以上であり、かつホスファチジルセリンの組成比が30%(W/V)以上であることが好ましい。
(2)活性化プロテインCによる触媒反応に用いるリン脂質
本発明の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬においては、試料中に含まれていたプロテインSによる活性化プロテインCの活性上昇反応時、及びこの活性化プロテインCによる活性化血液凝固第V因子の分解反応時には、その活性化プロテインCの活性上昇反応及び活性化血液凝固第V因子の分解反応に必要なリン脂質を存在させる。
このリン脂質は、その由来(起源)や調製方法によらず、特に制限なく用いることができる。
例えば、ヒト、ウシ又はブタ等の哺乳動物由来のもの、その他の動物由来のもの、植物由来のもの、微生物由来のもの又は人工的に合成したもの等を挙げることができる。
前記の活性化プロテインCの活性上昇反応時及び活性化血液凝固第V因子の分解反応時にリン脂質を存在させる際の濃度は、通常、0.1μM~100μMにあることが好ましく、1μM~50μMにあることがより好ましく、10μM~30μMにあることが特に好ましい。
そして、本発明の試料中の総プロテインSの活性測定試薬においては、活性化プロテインCの活性上昇反応時及び活性化血液凝固第V因子の分解反応時に、リン脂質が前記の濃度となるように、この活性測定試薬に含有させることが好ましい。
例えば、この活性測定試薬にリン脂質を0.1μM~200μM含有させることが好ましく、1μM~100μM含有させることがより好ましく、10μM~60μM含有させることが特に好ましい。
このリン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール若しくはジホスファチジルグリセロールなどのグリセロリン脂質や、又はスフィンゴミエリンなどのスフィンゴリン脂質等を挙げることができる。
なお、このリン脂質としては、前記の活性化プロテインCの活性上昇反応時及び活性化血液凝固第V因子の分解反応時に、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンよりなるリン脂質を存在させることが、試料中の総プロテインSの活性測定のために好ましい。
また、このホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンよりなるリン脂質を存在させる場合、この3種類のリン脂質の組成としては、ホスファチジルエタノールアミンの組成比が10%(W/V)以上であり、かつホスファチジルセリンの組成比が20%(W/V)以上であることが好ましい。
特に、ホスファチジルエタノールアミンの組成比が30%(W/V)以上であり、かつホスファチジルセリンの組成比が30%(W/V)以上であることが好ましい。
(3)活性化血液凝固第X因子による触媒反応に用いるリン脂質
本発明の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬においては、活性化血液凝固第V因子の存在下に活性化血液凝固第X因子が触媒するプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応時には、その反応に必要なリン脂質を存在させる。
このリン脂質は、その由来(起源)や調製方法によらず、特に制限なく用いることができる。
例えば、ヒト、ウシ又はブタ等の哺乳動物由来のもの、その他の動物由来のもの、植物由来のもの、微生物由来のもの又は人工的に合成したもの等を挙げることができる。
前記のプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応時にリン脂質を存在させる際の濃度は、通常、0.1μM~100μMにあることが好ましく、0.5μM~50μMにあることがより好ましく、1μM~10μMにあることが特に好ましい。
そして、本発明の試料中の総プロテインSの活性測定試薬においては、プロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応時に、リン脂質が前記の濃度となるように、この活性測定試薬に含有させることが好ましい。
例えば、この活性測定試薬にリン脂質を0.1μM~200μM含有させることが好ましく、0.5μM~100μM含有させることがより好ましく、1μM~20μM含有させることが特に好ましい。
このリン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール若しくはジホスファチジルグリセロールなどのグリセロリン脂質や、又はスフィンゴミエリンなどのスフィンゴリン脂質等を挙げることができる。
なお、このリン脂質としては、前記のプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応時に、ホスファチジルコリン及びホスファチジルセリン、又はホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンよりなるリン脂質を存在させることが、前記反応の促進の効果が高くなるため好ましい。
また、このホスファチジルコリン及びホスファチジルセリンよりなるリン脂質を存在させる場合、この2種類のリン脂質の組成としては、ホスファチジルコリンの組成比が85%(W/V)~50%(W/V)であり、かつホスファチジルセリンの組成比が15%(W/V)~50%(W/V)であることが好ましい。
特に、ホスファチジルコリンの組成比が80%(W/V)~70%(W/V)であり、かつホスファチジルセリンの組成比が20%(W/V)~30%(W/V)であることが好ましい。
あるいは、このホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンよりなるリン脂質を存在させる場合、この3種類のリン脂質の組成としては、ホスファチジルエタノールアミンの組成比が10%(W/V)以上であり、かつホスファチジルセリンの組成比が20%(W/V)以上であることが好ましい。
特に、ホスファチジルエタノールアミンの組成比が30%(W/V)以上であり、かつホスファチジルセリンの組成比が30%(W/V)以上であることが好ましい。
なお、このプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応の際のリン脂質としては、前記の活性化プロテインCの活性上昇反応時及び活性化血液凝固第V因子の分解反応時に用いたリン脂質をそのまま用いることができる。
しかしながら、先に述べたとおり、適したリン脂質の組成がそれぞれの反応により異なるので、各々の反応に適した組成のリン脂質をその反応時に存在させて用いることが好ましい。
なお、このプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応の際に、先に加えた前記の活性化プロテインCの活性上昇反応及び活性化血液凝固第V因子の分解反応に適した組成のリン脂質が、このプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応に適した組成のリン脂質と共存したとしても、本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬においては全く支障はない。
7.カルシウムイオン
本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬においては、試料中に含まれていたプロテインSによる活性化プロテインCの活性上昇反応時、活性化プロテインCによる活性化血液凝固第V因子の分解反応時、及び活性化血液凝固第X因子及び活性化血液凝固第V因子によるプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応時には、カルシウムイオンを存在させる。
このカルシウムイオンとしては、カルシウムイオン自体はもちろんのこと、又はカルシウムの塩等のカルシウムイオンを含む化合物であれば、特に制限なく用いることができる。
このカルシウムイオンを含む化合物としては、例えば、フッ化カルシウム、塩化カルシウム、臭化カルシウム、ヨウ化カルシウム、硫酸カルシウム、硝酸カルシウム、酢酸カルシウム、乳酸カルシウム又はシアン化カルシウム等を挙げることができる。
このカルシウムイオンを用いる際の濃度は、試料中に含まれていたプロテインSによる活性化プロテインCの活性上昇反応の際、活性化プロテインCによる活性化血液凝固第V因子の分解反応の際、そして活性化血液凝固第X因子及び活性化血液凝固第V因子によるプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応の際には、通常、0.1mM~100mMにあることが好ましく、1mM~10mMにあることが特に好ましい。
そして、本発明の試料中の総プロテインSの活性測定試薬においては、前記の活性化プロテインCの活性上昇反応時、活性化血液凝固第V因子の分解反応時及びトロンビン生成反応時にカルシウムイオンが前記の濃度となるように、この活性測定試薬に含有させることが好ましい。
例えば、カルシウムイオン又はカルシウムイオンを含む化合物を、この活性測定試薬に0.1mM~200mM含有させることが好ましく、1mM~20mM含有させることが特に好ましい。
8.活性化血液凝固第V因子
本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬において用いる活性化血液凝固第V因子(第Va因子;FVa)は、その由来(起源)や調製方法によらず、特に制限なく用いることができる。
例えば、ヒト、ウシ又はブタ等の哺乳動物由来のもの等を挙げることができる。
また、血漿等の体液若しくは臓器などから精製し調製したものや、又は遺伝子工学操作、細胞工学操作若しくは細胞培養操作などにより調製したもの等を挙げることができる。
本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬において、活性化血液凝固第V因子は、界面活性剤、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下、活性化プロテインCにより分解される。
そして、試料中にプロテインSが含まれている場合そのプロテインSの存在により、活性化プロテインCの活性が上昇して、この分解反応は促進される。
また、活性化血液凝固第V因子は、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下に活性化血液凝固第X因子が触媒する、プロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応を促進するものである。
よって、試料中にプロテインSが含まれていると、活性化プロテインCの活性が上昇して、活性化血液凝固第V因子の分解反応が促進されて、活性化血液凝固第V因子の存在量(濃度)は少なくなる。
そうすると、活性化血液凝固第X因子が触媒するプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応に対する活性化血液凝固第V因子の促進効果が小さくなるので、前記のプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応は抑制される。
前記の活性化血液凝固第V因子と活性化プロテインC等とを接触させることと、活性化血液凝固第V因子と活性化血液凝固第X因子及びプロトロンビン等とを接触させることは、同時に行ってもよい。
しかしながら、活性化血液凝固第V因子を、界面活性剤、リン脂質及びカルシウムイオンとともに活性化プロテインCと接触させ、少なくとも1分間以上、好ましくは5分間以上、室温又は37℃等においてインキュベートした後に、活性化血液凝固第X因子及びプロトロンビン等と接触させ、インキュベートして、プロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応を行わせることが好ましい。
この活性化血液凝固第V因子を用いる際の濃度は、活性化プロテインCと接触させ、界面活性剤、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下に活性化血液凝固第V因子を分解する反応を行わせる際には、通常、0.5pM~5nMにあることが好ましい。
しかしながら、この活性化血液凝固第V因子の濃度が高いと、試料に由来する成分(因子)等による血液凝固反応が進行してしまい、フィブリンが析出したり又は多大な発色が生じて正確な測定が行えなくなるので、前記の活性化血液凝固第V因子濃度としては、5pM~500pMにあることがより好ましく、20pM~200pMにあることが特に好ましい。
また、本発明の試料中の総プロテインSの活性測定試薬においては、前記の活性化血液凝固第V因子の分解反応時に活性化血液凝固第V因子が前記の濃度となるように、活性測定試薬に含有させることが好ましい。
例えば、活性化血液凝固第V因子を、0.5pM~10nM含有させることが好ましく、5pM~2nM含有させることがより好ましく、20pM~1nM含有させることが特に好ましい。
9.活性化血液凝固第X因子
本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬において用いる活性化血液凝固第X因子(第Xa因子;FXa)は、その由来(起源)や調製方法によらず、特に制限なく用いることができる。
例えば、ヒト、ウシ又はブタ等の哺乳動物由来のもの等を挙げることができる。
また、血漿等の体液若しくは臓器などから精製し調製したものや、又は遺伝子工学操作、細胞工学操作若しくは細胞培養操作などにより調製したもの等を挙げることができる。
本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬において、活性化血液凝固第X因子は、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下、プロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応を触媒する。
この活性化血液凝固第X因子によるプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応は、活性化血液凝固第V因子の存在により促進される。
よって、先に述べたように、試料中にプロテインSが含まれていると、活性化プロテインCの活性が上昇し、これにより活性化血液凝固第V因子の分解反応が促進され、このため活性化血液凝固第X因子が触媒するトロンビンを生成させる反応に対する活性化血液凝固第V因子の促進効果が小さくなるので、前記のトロンビンを生成させる反応は抑制される。
この活性化血液凝固第X因子を用いる際の濃度は、活性化血液凝固第V因子及びプロトロンビン等と接触させ、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下、プロトロンビンよりトロンビンを生成させる際には、通常、0.1pM~300pMにあることが好ましい。
しかしながら、この活性化血液凝固第X因子の濃度が高いと、先の活性化血液凝固第V因子の場合と同様、試料に由来する成分(因子)等による血液凝固反応が進行してしまい、フィブリンが析出したり又は多大な発色が生じて正確な測定が行えなくなるので、前記の活性化血液凝固第X因子濃度としては、1pM~100pMにあることがより好ましく、10pM~50pMにあることが特に好ましい。
また、本発明の試料中のプロテインSの活性測定試薬においては、前記のトロンビン生成反応時に活性化血液凝固第X因子が前記の濃度となるように、活性測定試薬に含有させることが好ましい。
例えば、活性化血液凝固第X因子を、0.1pM~600pM含有させることが好ましく、1pM~200pM含有させることがより好ましく、10pM~100pM含有させることが特に好ましい。
10.プロトロンビン
本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬において用いるプロトロンビンは、その由来(起源)や調製方法によらず、特に制限なく用いることができる。
例えば、ヒト、ウシ又はブタ等の哺乳動物由来のもの等を挙げることができる。
また、血漿等の体液若しくは臓器などから精製し調製したものや、又は遺伝子工学操作、細胞工学操作若しくは細胞培養操作などにより調製したもの等を挙げることができる。
本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬において、プロトロンビンは、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下、活性化血液凝固第X因子が触媒する反応の基質となり、トロンビンになる。
この活性化血液凝固第X因子によるプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応は、活性化血液凝固第V因子の存在により促進される。
よって、先に述べたように、試料中にプロテインSが含まれていると、活性化プロテインCの活性が上昇し、これにより活性化血液凝固第V因子の分解反応が促進され、このため活性化血液凝固第X因子が触媒するプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応に対する活性化血液凝固第V因子の促進効果が小さくなるので、前記のプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応は抑制され、生成されるトロンビンの量(濃度)は低減される。
このプロトロンビンを用いる際の濃度は、活性化血液凝固第V因子及び活性化血液凝固第X因子と接触させ、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下、プロトロンビンよりトロンビンを生成させる際には、通常、1nM~50μMにあることが好ましく、50nM~5μMにあることがより好ましく、そして100nM~1μMにあることが特に好ましい。
また、本発明の試料中の総プロテインSの活性測定試薬においては、前記のトロンビン生成反応時にプロトロンビンが前記の濃度となるように、この活性測定試薬に含有させることが好ましい。
例えば、プロトロンビンを、この活性測定試薬に1nM~100μM含有させることが好ましく、50nM~10μM含有させることがより好ましく、100nM~2μM含有させることが特に好ましい。
11.トロンビンの基質
本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬において用いるトロンビンの基質は、トロンビンのプロテアーゼとしての触媒作用を(トロンビンの基質として)受けることにより何らかのシグナルを生じるもの、又はトロンビンによる触媒反応に加え更に他の反応を続けることにより何らかのシグナルが生じるものであれば、特に制限なく用いることができる。
この何らかのシグナルが生じるということであるが、これはトロンビンの触媒作用を受けることにより光学的、電気的、磁気的若しくは他のエネルギー等におけるシグナル(信号)の生成又は変化を検出することができるということを意味する。
例えば、トロンビンの触媒作用を受けることにより、吸光虔、透過率若しくは蛍光強度が変化するもの、光の吸収曲線が変化するもの、又は発光するもの等を挙げることができる。
この一例としては、遊離したときに吸光度、透過率若しくは蛍光強度、又は光の吸収曲線が変化するような化合物を結合したペプチド又はタンパク質、或いは遊離したときに発光するような化合物を結合したペプチド又はタンパク質等であって、トロンビンの触媒作用により前記の化合物が前記のペプチド又はタンパク質より遊離するような物質等を挙げることができる。
このような物質においては、トロンビンの触媒作用を受け、前記化合物が遊離することにより、吸光度、透過率若しくは蛍光強度又は光の吸収曲線の変化或いは発光等として検出できるので、トロンビンの触媒作用すなわちトロンビンの酵素活性を、生成したシグナル(吸光度、透過率若しくは蛍光強度又は光の吸収曲線の変化或いは発光等)の量を測定することにより求めることができる。
このような物質としては、例えば、「H−D−フェニルアラニル−L−ピペコリル−L−アルギニル−p−ニトロアニリド・二塩酸塩」〔テストチーム(登録商標)発色基質S−2238〕(製造元:Chromogenix−Instrumentation Laboratory社〔イタリア国〕、販売元:積水メディカル社〔日本国〕)、「H−D−ヘキサハイドロチロシル−L−アラニル−L−アルギニル−p−ニトロアニリド・二酢酸塩」〔SPECTROZYME(登録商標)TH〕(AMERICAN DIAGNOSTICA社・コスモバイオ社)、「ベンゾイル−フェニルアラニル−バリニル−アルギニル−p−ニトロアニリド・塩酸塩」〔Thrombin Substrate I,Colorimetric〕(CALBIOCHEM社・コスモバイオ社)、「トシル−グリシル−プロリル−アルギニル−p−ニトロアニリド」〔CHROMOZYME TH〕(PENTAPHARM社)、「H−D−フェニルアラニル−プロリル−アルギニル−3−カルボキシ−4−ヒドロキシ−アニリン」(第一三共社)、「ベンゾイル−フェニルアラニル−バリニル−アルギニル−AMC・塩酸塩」〔Thrombin Substrate III,Fluorogenic〕(CALBIOCHEM社・コスモバイオ社)、「t−ブトキシカルボニル−アスパラギル(O−ベンジル)−プロリル−アルギニル−MCA」(ペプチド研究所)、又は「t−ブトキシカルボニル−バリニル−プロリル−アルギニル−MCA」(ペプチド研究所)等を挙げることができる。なお、特に「H−D−フェニルアラニル−L−ピペコリル−L−アルギニル−p−ニトロアニリド・二塩酸塩」が好ましい。
前記の活性化血液凝固第V因子と活性化血液凝固第X因子とプロトロンビン等とを接触させることと、生成したトロンビンとこのトロンビンの基質とを接触させることは、同時に行ってもよいし、別々の段階として分けて行ってもよい。
なお、いずれにしても、生成したトロンビンにトロンビンの基質を接触させ、少なくとも1分間以上、好ましくは5分間以上、室温又は37℃等においてインキュベートして、トロンビンの基質からシグナルを生じさせる。
このトロンビンの基質を用いる際の濃度は、このトロンビンの基質がトロンビンの触媒作用を受ける際に、通常、5μM~100mMにあることが好ましく、50μM~10mMにあることが特に好ましい。
そして、本発明の試料中のプロテインSの活性測定試薬においては、トロンビンの触媒作用を受ける際にこのトロンビンの基質が前記の濃度となるように、この活性測定試薬に含有させることが好ましい。
例えば、このトロンビンの基質を、5μM~200mM含有させることが好ましく、50μM~20mM含有させることが特に好ましい。
12.シグナル量の測定
本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬におけるトロンビンの基質は、プロトロンビンより生成したトロンビンの触媒作用を受けることによりシグナルを生じる。
本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬においては、このトロンビンの基質より生成したシグナルの量を測定する。
なお、試料中にプロテインSが含まれている場合、このシグナルの量は、試料中の総プロテインSの活性値に応じて生成が抑制されたシグナルの量である。
この生成したシグナル量(生成が抑制されたシグナル量)の測定は、そのシグナルに応じて適宜行えばよい。
例えば、シグナルが、吸光度、透過率若しくは蛍光強度又は光の吸収曲線の変化或いは発光等である場合には、吸光度、透過率、蛍光強度又は発光強度などを測定する等により行う。
より具体的には、トロンビンの基質が、前記の「H−D−フェニルアラニル−L−ピペコリル−L−アルギニル−p−ニトロアニリド・二塩酸塩」、「H−D−ヘキサハイドロチロシル−L−アラニル−L−アルギニル−p−ニトロアニリド・二酢酸塩」、「ベンゾイル−フェニルアラニル−バリニル−アルギニル−p−ニトロアニリド・塩酸塩」、又は「トシル−グリシル−プロリル−アルギニル−p−ニトロアニリド」等の、ペプチドにp−ニトロアニリンを結合させた物質である場合には、トロンビンの触媒作用により遊離したp−ニトロアニリンが波長405nm近辺に有する光の吸収を、波長405nm又はその近辺の波長において吸光度を測定することにより行う。
この場合、吸光度の測定は、主波長のみの一波長測定でもよいし、又は主波長と副波長において測定する二波長測定でもよい。
そして、この吸光度の測定は、エンドポイント法でもよいし、又はレート法でもよい。
13.試料中に含まれていた総プロテインSの活性値
本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬においては、試料中にプロテインSが含まれていると、活性化プロテインCの活性が上昇して、活性化血液凝固第V因子の分解反応が促進されて、活性化血液凝固第V因子の存在量(濃度)は少なくなる。
そうすると、活性化血液凝固第X因子が触媒するプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応に対する活性化血液凝固第V因子の促進効果が小さくなるので、前記のプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応は抑制される。
これにより、トロンビンの生成が低減するので、このトロンビンが触媒するトロンビンの基質からシグナルを生じさせる反応も抑制されて、生成するシグナルの量は抑制される。
すなわち、試料中に含まれる総プロテインSの活性値に応じて、このシグナル生成の抑制度は大きくなる。
従って、本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬においては、試料と活性化プロテインC等とを接触させ前記の通りの反応を行わせることによって生成したシグナル量を測定して、すなわち生成が抑制されたシグナル量を測定することにより、試料中に含まれていた総プロテインSの活性値を得る。
この生成が抑制されたシグナル量を測定した後、試料中に含まれていた総プロテインSの活性値を得ることは、適宜行えばよいが、例えば以下のようにして行うことができる。
総プロテインSの活性値が分かっている試料の少なくとも一つと、総プロテインSの活性値が「ゼロ」であることが分かっている試料(生理食塩水又は純水等)について、前記の通り測定操作を行い、生成したシグナル量(生成が抑制されたシグナル量)を求める。
そして、この生成したシグナル量(生成が抑制されたシグナル量)と試料中に含まれる総プロテインSの活性値との関係を、数式又はグラフ等に表して、検量線を作成する。
この検量線は、すなわち、シグナル生成の抑制度と試料中に含まれる総プロテインSの活性値との関係を表したものである。
次に、総プロテインSの活性値が未知の試料について、前記の通り同様に測定操作を行い、生成したシグナル量(生成が抑制されたシグナル量)を求める。
このシグナル量を前記の検量線に当てはめ、相当する総プロテインSの活性値を求める。
これにより、総プロテインSの活性値が未知の試料における生成したシグナル量(生成が抑制されたシグナル量)より、その試料の総プロテインSの活性値を得ることができる。
なお、前記の検量線は、シグナル量(生成が抑制されたシグナル量)すなわちシグナル生成の抑制度と、試料中に含まれる総プロテインSの活性値との関係を表したものであるが、この検量線におけるシグナル量(生成が抑制されたシグナル量)は、測定されたシグナル量そのものでもよいが、そのシグナル量の値を基に算出した数値であってもよい。
つまり、前記の検量線は、測定されたシグナル量の値を基に算出した数値と、試料中に含まれる総プロテインSの活性値との関係を表したものであってもよい。
なお、この場合であっても、測定されたシグナル量の値を基に算出した数値は、生成が抑制されたシグナル量に対応したものである。
この測定されたシグナル量の値を基に算出した数値としては、例えば、測定されたシグナル量の単位時間当たりの変化量の数値、又は測定されたシグナル量の値を時間に対して一次微分して算出した数値、若しくは二次微分して算出した数値等を挙げることができる。
例として、測定により得られた吸光度の1分間当たりの変化量、又は測定により得られた吸光度を時間に対して一次微分して得た吸光度変化の速度、若しくは測定により得られた吸光度を時間に対して二次微分して得た吸光度変化の加速度等を挙げることができる。
14.タンパク質
本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬においては、ヒト血清アルブミン(HSA)、ウシ血清アルブミン(BSA)若しくは卵白アルブミンなどのアルブミン、カゼイン、又はゼラチン等のタンパク質を前記の活性測定反応時に存在させることが好ましく、又は前記の活性測定試薬に含有させることが好ましい。
このタンパク質を存在させる濃度は、通常、0.1μM~1mMにあることが好ましい。
そして、本発明の試料中の総プロテインSの活性測定試薬においては、このタンパク質が前記の濃度となるように、この活性測定試薬に含有させることが好ましい。
例えば、このタンパク質を、0.1μM~2mM含有させることが好ましい。
15.塩
本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬においては、ハロゲン元素とアルカリ金属の塩又はハロゲン元素とアルカリ土類金属の塩等の塩を前記の活性測定反応時に存在させることが好ましく、又は前記の活性測定試薬に含有させることが好ましい。
ハロゲン元素とアルカリ金属の塩としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、フッ化ナトリウム、フッ化カリウム、臭化ナトリウム又は臭化カリウム等を挙げることができる。
また、ハロゲン元素とアルカリ土類金属の塩としては、例えば、塩化マグネシウム、フッ化マグネシウム又は臭化マグネシウム等を挙げることができる。
この塩を存在させる濃度は、通常、5mM~1Mにあることが好ましく、50mM~250mMにあることが特に好ましい。
そして、本発明の試料中の総プロテインSの活性測定試薬においては、この塩が前記の濃度となるように、この活性測定試薬に含有させることが好ましい。
例えば、この塩を、5mM~2M含有させることが好ましく、50mM~500mM含有させることが特に好ましい。
16.希釈液
本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法においては、試料を希釈液により希釈した後に、前記の活性測定反応を行わせることが、試料中の総プロテインSの活性測定のために好ましい。
また、本発明の試料中の総プロテインSの活性測定試薬においては、希釈液を前記の活性測定試薬に含有させることが、試料中の総プロテインSの活性測定のために好ましい。
この希釈液のpHは、特に限定はないが、pH6.0~pH10.0(20℃)のpH範囲のものであることが好ましく、pH6.5~pH8.5(20℃)のpH範囲のものであることがより好ましい。
なお、この希釈液には、pHを前記のpH範囲に保つため、前記のpH範囲に緩衝能を有する緩衝剤を適宜存在させ又は含有させることが好ましい。
また、この希釈液には、必要に応じて適宜、タンパク質、塩、界面活性剤、防腐剤、安定化剤、活性化剤、又は糖類等の成分を含有させることができる。
この希釈液としては、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、又は緩衝液等を挙げることができる。
この希釈液により試料を希釈する際の希釈倍率であるが、特に限定はないものの、試料中の総プロテインSの活性測定のためには、2倍~60倍が好ましく、5倍~40倍がより好ましく、10倍~20倍が特に好ましい。
17.pH
本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法においては、前記の活性測定反応を、pH6.0~pH10.0(20℃)の範囲で行うことが好ましく、pH6.5~pH8.5(20℃)の範囲で行うことが特に好ましい。
また、本発明の試料中の総プロテインSの活性測定試薬においては、前記の活性測定反応が、pH6.0~pH10.0(20℃)のpH範囲で行われるようなpHであることが好ましく、pH6.5~pH8.5(20℃)のpH範囲で行われるようなpHであることが特に好ましい。
なお、本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬においては、活性測定反応におけるpH又は活性測定試薬のpHを前記のpH範囲に保つため、前記のpH範囲に緩衝能を有する緩衝剤を適宜存在させ又は含有させることが好ましい。
18.他の成分
本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬においては、必要に応じて適宜、防腐剤、安定化剤、活性化剤、又は糖類等の前記記載した成分以外の成分を前記の活性測定反応時に存在させ、又は前記の活性測定試薬に含有させることができる。
19.測定手法
本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬における、試料中の総プロテインSの活性の測定は、用手法により行ってもよく、又は自動分析装置等の装置を使用して行ってもよい。
20.測定段階
本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬おいて、前記詳述した活性測定反応は、1回に全ての成分と試料との接触を行わせて、全ての反応を1段階に行ってもよく(1ステップ法)、また、成分を分け、接触を複数段階に分けて行うことにより活性測定反応を複数段階に分けて行ってもよい(多ステップ法)。
複数段階に分ける場合、特に制限はないが、例えば次のように行うことができる。
(1)2ステップ法−1
(a) 試料、活性化プロテインC、界面活性剤、リン脂質、カルシウムイオン及び活性化血液凝固第V因子を接触させる。
(b) 次に、前記(a)のものに、活性化血液凝固第X因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質を接触させる。
(2)2ステップ法−2
(a) 試料、活性化プロテインC、界面活性剤、リン脂質及びカルシウムイオンを接触させる。
(b) 次に、前記(a)のものに、活性化血液凝固第V因子、活性化血液凝固第X因子、プロトロンビン、トロンビンの基質及びリン脂質を接触させる。
(3)3ステップ法
(a) 試料、活性化プロテインC、界面活性剤、リン脂質及びカルシウムイオンを接触させる。
(b) 次に、前記(a)のものに、活性化血液凝固第V因子を接触させる。
(c) 更に、前記(b)のものに、活性化血液凝固第X因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質を接触させる。
21.試料中の総プロテインSの活性測定試薬
本発明の試料中のプロテインSの活性測定試薬は、活性化プロテインC、界面活性剤、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第V因子、活性化血液凝固第X因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質を含有するものである。
必要に応じて前記成分以外の成分を含んでいても構わない。
22.試料中の総プロテインSの活性測定試薬の構成
本発明の試料中の総プロテインSの活性測定試薬おいて、前記詳述した活性測定反応の各成分は、全て一つの試薬中に含有させてもよく(1試薬系)、また、各成分を2試薬又は3試薬等の複数の試薬に分けて含有させてもよい(複数試薬系)。
各成分を複数の試薬に分けて含有させる場合、特に制限はないが、例えば次のように含有させることができる。
(1)2試薬系−1
(a)第1試薬:活性化プロテインC、界面活性剤、リン脂質、カルシウムイオン及び活性化血液凝固第V因子
(b)第2試薬:活性化血液凝固第X因子、プロトロンビン、トロンビンの基質及びリン脂質
(2)2試薬系−2
(a)第1試薬:活性化プロテインC、界面活性剤、リン脂質及びカルシウムイオン
(b)第2試薬:活性化血液凝固第V因子、活性化血液凝固第X因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質
(3)3試薬系
(a)第1試薬:活性化プロテインC、界面活性剤、リン脂質及びカルシウムイオン
(b)第2試薬:活性化血液凝固第V因子
(c)第3試薬:活性化血液凝固第X因子、プロトロンビン、トロンビンの基質及びリン脂質
(4)4試薬系
(a)第1試薬:活性化プロテインC、界面活性剤、リン脂質及びカルシウムイオン
(b)第2試薬:活性化血液凝固第V因子
(c)第3試薬:活性化血液凝固第X因子
(d)第4試薬:プロトロンビン及びトロンビンの基質
以下、本発明を実施例により更に説明する。なお、本発明はこれらにより限定されるものではない。
〔実施例1〕(本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬−1)
本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬の効果を確認した。
1.総プロテインSの活性測定試薬
(1)第1試薬
下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、pHをpH7.5(20℃)に調整して、第1試薬を調製した。
活性化血液凝固第X因子(精製ウシ活性化血液凝固第X因子;New England Biolabs,Inc社、米国) 100pM
リン脂質
塩化カルシウム 10.0mM
ウシ血清アルブミン(BSA;Sigma−Aldrich社、米国)0.1%(W/V)
塩化ナトリウム 0.15M
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン 50mM
なお、リン脂質は、ホスファチジルセリン(ブタ脳ホスファチジルセリン;PS;DOOSAN Serdary Research Laboratories社、韓国)0.6mg、ホスファチジルコリン(ブタ肝臓ホスファチジルコリン;PC;DOOSAN Serdary Research Laboratories社、韓国)0.4mg、及びホスファチジルエタノールアミン(ブタ肝臓ホスファチジルエタノールアミン;PE;DOOSAN Serdary Research Laboratories社、韓国)1.0mgをそれぞれ試験管に採取し、エバポレーターにて溶媒であるクロロフォルムを蒸発させた後、蒸留水を添加し1分間激しく撹拌した後、60℃で10分間超音波処理を行って調製したホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミンの組成比が3:2:5(すなわち、30%(W/V):20%(W/V):50%(W/V))のリン脂質を、15μMの濃度となるように含有させた。〔なお、このホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミンの組成比が3:2:5のリン脂質を、以下「リン脂質(PS:PC:PE=3:2:5)」ということがある。〕
(2)第2試薬
下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、pHをpH7.5(20℃)に調整して、第2試薬を調製した。
プロトロンビン(精製ヒトプロトロンビン;Enzyme Research Laboratories,Inc社、米国) 1.5μM
テストチーム(登録商標)発色基質S−2238(トロンビンの基質〔トロンビンの発色基質〕;製造元:Chromogenix−Instrumentation Laboratory社〔イタリア国〕、販売元:積水メディカル社〔日本国〕) 1.5mM
ウシ血清アルブミン(BSA;Sigma−Aldrich社、米国)0.1%(W/V)
塩化ナトリウム 0.15M
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン 50mM
(3)第3試薬−a
下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、pHをpH8.0(20℃)に調整して、第3試薬−aを調製した。
リン脂質
塩化カルシウム 2.5mM
ウシ血清アルブミン(BSA;Sigma−Aldrich社、米国)0.1%(W/V)
塩化ナトリウム 0.1M
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン 50mM
なお、リン脂質は、ホスファチジルセリン(ブタ脳ホスファチジルセリン;PS;DOOSAN Serdary Research Laboratories社、韓国)0.5mg、及びホスファチジルコリン(ブタ肝臓ホスファチジルコリン;PC;DOOSAN Serdary Research Laboratories社、韓国)0.5mgをそれぞれ試験管に採取し、エバポレーターにて溶媒であるクロロフォルムを蒸発させた後、蒸留水を添加し1分間激しく撹拌した後、60℃で10分間超音波処理を行って調製したホスファチジルセリン及びホスファチジルコリンの組成比が1:1(すなわち、50%(W/V):50%(W/V))のリン脂質を、20μMの濃度となるように含有させた。〔なお、このホスファチジルセリン及びホスファチジルコリンの組成比が1:1のリン脂質を、以下「リン脂質(PS:PC=1:1)」ということがある。〕
(4)第3試薬−b
下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、pHをpH8.0(20℃)に調整して、第3試薬−bを調製した。
界面活性剤
リン脂質
塩化カルシウム 2.5mM
ウシ血清アルブミン(BSA;Sigma−Aldrich社、米国)0.1%(W/V)
塩化ナトリウム 0.1M
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン 50mM
なお、界面活性剤は、Triton X−100(和光純薬工業社、日本国)を0.006%(W/V)の濃度となるように含有させた。
また、リン脂質は、前記のリン脂質(PS:PC=1:1)を、20μMの濃度となるように含有させた。
(5)第3試薬−c
下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、pHをpH8.0(20℃)に調整して、第3試薬−cを調製した。
リン脂質
塩化カルシウム 2.5mM
ウシ血清アルブミン(BSA;Sigma−Aldrich社、米国)0.1%(W/V)
塩化ナトリウム 0.1M
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン 50mM
なお、リン脂質は、ホスファチジルセリン(ブタ脳ホスファチジルセリン;PS;DOOSAN Serdary Research Laboratories社、韓国)0.4mg、ホスファチジルコリン(ブタ肝臓ホスファチジルコリン;PC;DOOSAN Serdary Research Laboratories社、韓国)0.4mg、及びホスファチジルエタノールアミン(ブタ肝臓ホスファチジルエタノールアミン;PE;DOOSAN Serdary Research Laboratories社、韓国)0.4mgをそれぞれ試験管に採取し、エバポレーターにて溶媒であるクロロフォルムを蒸発させた後、蒸留水を添加し1分間激しく撹拌した後、60℃で10分間超音波処理を行って調製したホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミンの組成比が1:1:1(すなわち、33.33%(W/V):33.33%(W/V):33.33%(W/V))のリン脂質を、24μMの濃度となるように含有させた。〔なお、このホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミンの組成比が1:1:1のリン脂質を、以下「リン脂質(PS:PC:PE=1:1:1)」ということがある。〕
(6)第3試薬−d
下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、pHをpH8.0(20℃)に調整して、第3試薬−dを調製した。
界面活性剤
リン脂質
塩化カルシウム 2.5mM
ウシ血清アルブミン(BSA;Sigma−Aldrich社、米国)0.1%(W/V)
塩化ナトリウム 0.1M
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン 50mM
なお、界面活性剤は、Triton X−100(和光純薬工業社、日本国)を0.006%(W/V)の濃度となるように含有させた。
また、リン脂質は、前記のリン脂質(PS:PC:PE=1:1:1)を、24μMの濃度となるように含有させた。
(7)第4試薬
下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、pHをpH8.0(20℃)に調整して、第4試薬を調製した。
活性化プロテインC(精製ヒト活性化プロテインC;Enzyme Research Laboratories,Inc社、米国) 16.5nM
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン 50mM
(8)第5試薬
下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、pHをpH8.0(20℃)に調整して、第5試薬を調製した。
活性化血液凝固第V因子(精製ヒト活性化血液凝固第V因子;Haematologic Technologies,Inc社、米国)6.0nM
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン 50mM
2.試料
次の(1)及び(2)をそれぞれ試料として用いた。
(1) 精製された遊離のプロテインSと精製された遊離のC4b結合タンパク質とを1:1(モル比)で混合して調製した総プロテインS活性値が10μg/mL当量の試料
(2) 精製された遊離のプロテインSと精製された遊離のC4b結合タンパク質とを1:1(モル比)で混合して調製した総プロテインS活性値が20μg/mL当量の試料
3.試料中の総プロテインSの活性値の測定
各試料の総プロテインSの活性値の測定を、次のようにして行った。
(1) 前記2の試料のそれぞれについて、その0.5μLと前記1の(3)の第3試薬−aの193.5μLを混合した。
(2) 次に、これに前記1の(7)の第4試薬の4μLを添加混合し、37℃で5分間インキュベートした。
(3) 次に、これに前記1の(8)の第5試薬の2μLを添加混合し、37℃で10分間インキュベートした。
(4) 次に、この180μLを分取し、前記1の(1)の第1試薬の180μL及び前記1の(2)の第2試薬の180μLを入れて37℃でインキュベートしておいたキュベットに添加混合して、37℃でインキュベートした。
(5) 前記(4)における添加混合の後、波長405nmにおける吸光度の変化を測定した。
(6) なお、前記(1)において、前記1の(3)の第3試薬−aに替えて、前記1の(4)の第3試薬−bを用いること以外は、前記(1)~(5)の通りに操作を行い、第3試薬−bを用いた場合の波長405nmにおける吸光度の変化を測定した。
(7) また、前記(1)において、前記1の(3)の第3試薬−aに替えて、前記1の(5)の第3試薬−cを用いること以外は、前記(1)~(5)の通りに操作を行い、第3試薬−cを用いた場合の波長405nmにおける吸光度の変化を測定した。
(8) そして、前記(1)において、前記1の(3)の第3試薬−aに替えて、前記1の(6)の第3試薬−dを用いること以外は、前記(1)~(5)の通りに操作を行い、第3試薬−dを用いた場合の波長405nmにおける吸光度の変化を測定した。
4.試料中の総プロテインSの活性値の算出
前記3において測定した波長405nmにおける吸光度の変化(反応のタイムコース)の値を微分して、試料中の総プロテインSの活性値を求めた。
なお、予め、総プロテインS活性値が既知の試料について、前記3の通り測定を行い、測定した波長405nmにおける吸光度の変化(反応のタイムコース)の1分間当りの吸光度変化量を時間に対して直線式(微分直線)を求め、この直線の傾きをこの既知の総プロテインS活性値に対してプロットして検量線を作成した。
そして、前記2の試料を前記3の通り測定を行って得た、波長405nmにおける吸光度の変化(反応のタイムコース)の1分間当りの吸光度変化量を、時間に対して直線式(微分直線)を求め、この直線の傾きを前記の検量線に当てはめて、試料中の総プロテインSの活性値を算出した。
すなわち、測定により得られた吸光度より吸光度変化の加速度(吸光度の二次微分値)を求め、検量線に当てはめることにより、試料中の総プロテインSの活性値を算出した。
なお、本特許出願の明細書及び図面においては、精製ヒトプロテインS(Enzyme Research Laboratories,Inc社、米国)の1μg/mLが有する総プロテインS活性値を、総プロテインS活性値1μg/mL当量と定義した。
よって、本特許出願の明細書及び図面においては、総プロテインSの活性は、「μg/mL当量」を用いて表している。
5.測定結果
前記の通りに試料中の総プロテインSの活性値の測定を行って得られた結果を表1に示した。
なお、この表において、「比率(%)」として表した値は、試料の総プロテインS活性値に対する、測定値(試料を測定して得た総プロテインS活性値)の比率をパーセント表示で示したものである。
この表より、第3試薬−aを用いた場合には、すなわち、試料中に含まれていたプロテインSによる活性化プロテインCの活性上昇反応時、及び当該活性上昇したプロテインCによる活性化血液凝固第V因子の分解反応時に、界面活性剤を存在させず、かつホスファチジルコリン及びホスファチジルセリン(1:1)よりなるリン脂質を存在させた場合には、前記の比率〔試料の総プロテインS活性値に対する、測定値(試料を測定して得た総プロテインS活性値)の比率〕が、総プロテインS活性値が10μg/mL当量の試料においては0.8%、そして総プロテインS活性値が20μg/mL当量の試料においては33.2%であることが分かる。
また、この表より、第3試薬−bを用いた場合には、すなわち、試料中に含まれていたプロテインSによる活性化プロテインCの活性上昇反応時、及び当該活性上昇したプロテインCによる活性化血液凝固第V因子の分解反応時に、界面活性剤を存在させ、かつホスファチジルコリン及びホスファチジルセリン(1:1)よりなるリン脂質を存在させた場合には、前記の比率〔試料の総プロテインS活性値に対する、測定値(試料を測定して得た総プロテインS活性値)の比率〕が、総プロテインS活性値が10μg/mL当量の試料においては65.4%、そして総プロテインS活性値が20μg/mL当量の試料においては62.8%であることが分かる。
また、この表より、第3試薬−cを用いた場合には、すなわち、試料中に含まれていたプロテインSによる活性化プロテインCの活性上昇反応時、及び当該活性上昇したプロテインCによる活性化血液凝固第V因子の分解反応時に、界面活性剤を存在させず、かつホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミン(1:1:1)よりなるリン脂質を存在させた場合には、前記の比率〔試料の総プロテインS活性値に対する、測定値(試料を測定して得た総プロテインS活性値)の比率〕が、総プロテインS活性値が10μg/mL当量の試料においては50.4%、そして総プロテインS活性値が20μg/mL当量の試料においては50.0%であることが分かる。
また、この表より、第3試薬−dを用いた場合には、すなわち、試料中に含まれていたプロテインSによる活性化プロテインCの活性上昇反応時、及び当該活性上昇したプロテインCによる活性化血液凝固第V因子の分解反応時に、界面活性剤を存在させ、かつホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミン(1:1:1)よりなるリン脂質を存在させた場合には、前記の比率〔試料の総プロテインS活性値に対する、測定値(試料を測定して得た総プロテインS活性値)の比率〕が、総プロテインS活性値が10μg/mL当量の試料においては78.7%、そして総プロテインS活性値が20μg/mL当量の試料においては89.1%であることが分かる。
これらのことより、試料中に含まれていたプロテインSによる活性化プロテインCの活性上昇反応時、及び当該活性上昇したプロテインCによる活性化血液凝固第V因子の分解反応時に、界面活性剤を存在させることにより、試料中の総プロテインS活性を、より正確に測定することができることが確かめられた。
すなわち、本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬の効果が確かめられた。
また、試料中に含まれていたプロテインSによる活性化プロテインCの活性上昇反応時、及び当該活性上昇したプロテインCによる活性化血液凝固第V因子の分解反応時に存在させるリン脂質が、ホスファチジルコリン及びホスファチジルセリンよりなるリン脂質よりも、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンよりなるリン脂質の方が、より正確に試料中の総プロテインS活性を測定することができることが確かめられた。
〔実施例2〕(本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬−2)
本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬の効果を確認した。
1.総プロテインSの活性測定試薬
(1)第1試薬
第1試薬として、前記の実施例1の1の(1)の第1試薬を用いた。
(2)第2試薬
第2試薬として、前記の実施例1の1の(2)の第2試薬を用いた。
(3)第3試薬−1
下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、pHをpH8.0(20℃)に調整して、第3試薬−1を調製した。
リン脂質
塩化カルシウム 2.5mM
ウシ血清アルブミン(BSA;Sigma−Aldrich社、米国)0.1%(W/V)
塩化ナトリウム 0.1M
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン 50mM
なお、リン脂質は、前記のリン脂質(PS:PC:PE=1:1:1)を、24μMの濃度となるように含有させた。
(4)第3試薬−2~第3試薬−19
下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、pHをpH8.0(20℃)に調整して、第3試薬−2から第3試薬−19までを調製した。
界面活性剤
リン脂質
塩化カルシウム 2.5mM
ウシ血清アルブミン(BSA;Sigma−Aldrich社、米国)0.1%(W/V)
塩化ナトリウム 0.1M
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン 50mM
なお、リン脂質は、前記のリン脂質(PS:PC:PE=1:1:1)を、24μMの濃度となるように含有させた。
また、界面活性剤は、非イオン性界面活性剤のTriton X−100、Triton X−114、NP−10、NP−11、NP−12、NP−13、BT−9及びBT−12、陰イオン性界面活性剤のサルコシネート LN、陽イオン性界面活性剤のCA−2350、並びに両性界面活性剤のAM−301のそれぞれを、次の通り記載の濃度となるように各々の試薬に含有させた。
第3試薬−2: Triton X−100(和光純薬工業社、日本国) 0.0050%(W/V)
第3試薬−3: Triton X−100(和光純薬工業社、日本国) 0.0060%(W/V)
第3試薬−4: Triton X−100(和光純薬工業社、日本国) 0.0070%(W/V)
第3試薬−5: Triton X−114(和光純薬工業社、日本国) 0.0050%(W/V)
第3試薬−6: NP−10(日光ケミカルズ社、日本国) 0.0025%(W/V)
第3試薬−7: NP−11(日光ケミカルズ社、日本国) 0.0025%(W/V)
第3試薬−8: NP−11(日光ケミカルズ社、日本国) 0.0050%(W/V)
第3試薬−9: NP−12(日光ケミカルズ社、日本国) 0.0025%(W/V)
第3試薬−10: NP−13(日光ケミカルズ社、日本国) 0.0050%(W/V)
第3試薬−11: BT−9(日光ケミカルズ社、日本国) 0.003%(W/V)
第3試薬−12: BT−9(日光ケミカルズ社、日本国) 0.006%(W/V)
第3試薬−13: BT−12(日光ケミカルズ社、日本国) 0.006%(W/V)
第3試薬−14: サルコシネート LN(日光ケミカルズ社、日本国) 0.006%(W/V)
第3試薬−15: サルコシネート LN(日光ケミカルズ社、日本国) 0.010%(W/V)
第3試薬−16: CA−2350(日光ケミカルズ社、日本国) 0.0001%(W/V)
第3試薬−17: CA−2350(日光ケミカルズ社、日本国) 0.0003%(W/V)
第3試薬−18: AM−301(日光ケミカルズ社、日本国) 0.003%(W/V)
第3試薬−19: AM−301(日光ケミカルズ社、日本国) 0.006%(W/V)
(5)第4試薬
第4試薬として、前記の実施例1の1の(7)の第4試薬を用いた。
(6)第5試薬
第5試薬として、前記の実施例1の1の(8)の第5試薬を用いた。
2.試料
前記の実施例1の2の(1)及び(2)の各試料を、試料として用いた。
3.試料中の総プロテインSの活性値の測定及び算出
前記2の試料のそれぞれについて、前記の実施例1の3及び4の記載の通りに総プロテインSの活性値の測定及び算出を行い、各試料の総プロテインSの活性値を得た。
なお、前記の実施例1の3の(1)の第3試薬−aに替えて、前記1の(3)の第3試薬−1及び前記1の(4)の第3試薬−2から第3試薬−19までを順々に用いた。
4.測定結果
前記の通りに試料中の総プロテインSの活性値の測定を行って得られた結果を表2に示した。
なお、この表において、「比率(%)」として表した値は、試料の総プロテインS活性値に対する、測定値(試料を測定して得た総プロテインS活性値)の比率をパーセント表示で示したものである。
この表より、第3試薬−1を用いた場合には、すなわち、試料中に含まれていたプロテインSによる活性化プロテインCの活性上昇反応時、及び当該活性上昇したプロテインCによる活性化血液凝固第V因子の分解反応時に、界面活性剤を存在させない場合には、前記の比率〔試料の総プロテインS活性値に対する、測定値(試料を測定して得た総プロテインS活性値)の比率〕が、総プロテインS活性値が10μg/mL当量の試料においては50.4%、そして総プロテインS活性値が20μg/mL当量の試料においては52.0%であることが分かる。
また、この表より、第3試薬−2から第3試薬−19までをそれぞれ用いた場合には、すなわち、試料中に含まれていたプロテインSによる活性化プロテインCの活性上昇反応時、及び当該活性上昇したプロテインCによる活性化血液凝固第V因子の分解反応時に、界面活性剤を存在させた場合には、前記の比率〔試料の総プロテインS活性値に対する、測定値(試料を測定して得た総プロテインS活性値)の比率〕が、総プロテインS活性値が10μg/mL当量の試料においては62.0%~88.0%、そして総プロテインS活性値が20μg/mL当量の試料においては64.0%~104.3%であることが分かる。
これらのことより、試料中に含まれていたプロテインSによる活性化プロテインCの活性上昇反応時、及び当該活性上昇したプロテインCによる活性化血液凝固第V因子の分解反応時に、界面活性剤を存在させることにより、試料中の総プロテインS活性を、より正確に測定することができることが確かめられた。
すなわち、本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬の効果が確かめられた。
そして、非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、及び両性界面活性剤の全てのタイプの界面活性剤において、この本発明の効果を確かめることができた。
〔実施例3〕(本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬の再現性の検討)
本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬により試料中の総プロテインS活性値を測定する際の測定の再現性について検討した。
1.総プロテインSの活性測定試薬
(1)希釈液
下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、pHをpH8.0(20℃)に調整して、希釈液を調製した。
Triton X−100(和光純薬工業社、日本国) 0.06%(W/V)
ウシ血清アルブミン(BSA) 0.1%(W/V)
塩化ナトリウム 0.1M
クエン酸三ナトリウム 10.6mM
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン 50mM
(2)第1試薬
下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、pHをpH8.0(20℃)に調整して、第1試薬を調製した。
活性化プロテインC(精製ヒト活性化プロテインC;Enzyme Research Laboratories,Inc社、米国) 397pM
界面活性剤
リン脂質
塩化カルシウム 2.5mM
ウシ血清アルブミン(BSA;Sigma−Aldrich社、米国)0.1%(W/V)
塩化ナトリウム 0.1M
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン 50mM
なお、界面活性剤は、Triton X−100(和光純薬工業社、日本国)を0.006%(W/V)の濃度となるように含有させた。
また、リン脂質は、前記のリン脂質(PS:PC:PE=1:1:1)を、24μMの濃度となるように含有させた。
(3)第2試薬
下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、pHをpH8.0(20℃)に調整して、第2試薬を調製した。
活性化血液凝固第V因子(精製ヒト活性化血液凝固第V因子;Haematologic Technologies,Inc社、米国)357pM
界面活性剤
リン脂質
塩化カルシウム 2.5mM
ウシ血清アルブミン(BSA;Sigma−Aldrich社、米国)0.1%(W/V)
塩化ナトリウム 0.1M
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン 50mM
なお、界面活性剤は、Triton X−100(和光純薬工業社、日本国)を0.006%(W/V)の濃度となるように含有させた。
また、リン脂質は、前記のリン脂質(PS:PC:PE=1:1:1)を、24μMの濃度となるように含有させた。
(4)第3試薬
下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、pHをpH7.5(20℃)に調整して、第3試薬を調製した。
活性化血液凝固第X因子(精製ウシ活性化血液凝固第X因子;New England Biolabs,Inc社、米国) 50pM
プロトロンビン(精製ヒトプロトロンビン;Enzyme Research Laboratories,Inc社、米国) 738nM
テストチーム(登録商標)発色基質S−2238(トロンビンの基質〔トロンビンの発色基質〕;製造元:Chromogenix−Instrumentation Laboratory社〔イタリア国〕、販売元:積水メディカル社〔日本国〕) 750μM
リン脂質
塩化カルシウム 5.0mM
ウシ血清アルブミン(BSA;Sigma−Aldrich社、米国)0.1%(W/V)
塩化ナトリウム 0.15M
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン 50mM
なお、リン脂質は、前記のリン脂質(PS:PC:PE=3:2:5)を、7.5μMの濃度となるように含有させた。
2.試料
ヒトの血漿の4検体を、試料として用いた。
3.試料中の総プロテインSの活性値の測定
各試料の総プロテインSの活性値の測定は、日立ハイテクノロジーズ社(日本国)の7170S形汎用自動分析装置を使用して行った。
(1) 前記2の試料それぞれについて、前記1の(1)の希釈液により希釈倍率15倍で希釈を行った。
(2) 前記(1)で希釈した試料2.0μLに、前記1の(2)の第1試薬の98μLを添加し、37℃で1.4分間反応させた。
(3) 次に、前記1の(3)の第2試薬の20μLを添加し、37℃で8.3分間反応させた。
(4) 次に、前記1の(4)の第3試薬の236μLを添加し、37℃で反応させた。
(5) 前記(4)における第3試薬の添加の後、主波長405nm及び副波長505nmにおける吸光度の変化を12.3分間測定した。
(6) 前記(1)~(5)の操作を繰り返して計5回行い、同時再現性の検討を行なった。
(7) また、前記(1)~(5)の操作を連続する3日間のそれぞれの日に行い、日差再現性の検討を行なった。
4.試料中の総プロテインSの活性値の算出
前記3の(5)において測定した第3試薬添加後の吸光度変化(反応のタイムコース)の値を微分して、試料中の総プロテインSの活性値を求めた。
なお、予め、総プロテインS活性値が既知の試料について、前記3の通り測定を行い、測定した第3試薬添加後の吸光度変化(反応のタイムコース)の1分間当りの吸光度変化量を時間に対して直線式(微分直線)を求め、この直線の傾きをこの既知の総プロテインS活性値に対してプロットして検量線を作成した。
そして、前記2の試料を前記3の通り測定を行って得た、第3試薬添加後の吸光度変化(反応のタイムコース)の1分間当りの吸光度変化量を、時間に対して直線式(微分直線)を求め、この直線の傾きを前記の検量線に当てはめて、試料中の総プロテインSの活性値を算出した。
すなわち、測定により得られた吸光度より吸光度変化の加速度(吸光度の二次微分値)を求め、検量線に当てはめてることにより、試料中の総プロテインSの活性値を算出した。
5.測定結果
前記の通りに試料中の総プロテインSの活性値の測定を行って得られた結果を表3に示した。
この表において、同時再現性のデータ、及び日差再現性のデータとも、それぞれの試料毎に、「平均値±標準偏差(SD)」及び「変動係数(CV)」を示した。
この表より、同時再現性における変動係数(CV)は1.4%~4.5%の範囲のものであり、測定値のバラツキが小さく、精密に測定できていることが分かる。
また、日差再現性における変動係数(CV)は2.8%~5.6%の範囲のものであり、例え測定を行う日が異なったとしてもその測定値のバラツキは小さく、精密に測定できることが分かる。
これらのことより、本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬は測定の再現性がよく、精密に測定が行えるものであることが確かめられた。
〔実施例4〕(ELISA法による試料中の総プロテインSのタンパク質量の測定方法及び測定試薬との相関)
本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬と、ELISA法による試料中の総プロテインSのタンパク質量の測定方法及び測定試薬との相関を検討した。
I.本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬による測定
1.総プロテインSの活性測定試薬
(1)希釈液
希釈液として、前記の実施例3の1の(1)の希釈液を用いた。
(2)第1試薬
第1試薬として、前記の実施例3の1の(2)の第1試薬を用いた。
(3)第2試薬
第2試薬として、前記の実施例3の1の(3)の第2試薬を用いた。
(4)第3試薬
第3試薬として、前記の実施例3の1の(4)の第3試薬を用いた。
2.試料
健常人50名の血漿を、試料として用いた。
3.試料中の総プロテインSの活性値の測定及び算出
前記2の試料のそれぞれについて、前記の実施例3の3及び4の記載の通りに総プロテインSの活性値の測定及び算出を行い、各試料の総プロテインSの活性値を得た。
この試料中の総プロテインSの活性値の測定を行って得られた結果を図1に示した。
II.ELISA法による試料中の総プロテインSのタンパク質量の測定方法及び測定試薬による測定
1.ELISA法による総プロテインSのタンパク質量の活性測定試薬
ELISA法による総プロテインSのタンパク質量の活性測定試薬として、市販の「アセラクロム トータルプロテイン S TMB」(製造者:DIAGNOSTICA STAGO社、フランス国;製造販売者:ロシュ・ダイアグノスティックス社、日本国)を用いた。
なお、この「アセラクロム トータルプロテイン S TMB」は次のものより構成される。
(a) 抗体コーティングストリップ(抗総プロテインSマウスモノクローナル抗体)
(b) 抗体コンジュゲート(ペルオキシダーゼ標識抗総プロテインSマウスモノクローナル抗体)
(c)基質液(3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン、及び30%過酸化水素水)
(d)希釈緩衝液
(e)洗浄液
(f)スタンダード(総プロテインS・キャリブレーター)
(g)コントロール(総プロテインS・コントロール)
(h)プレートフレーム
(i)プレートカバー
2.試料
前記のIの2における試料(健常人50名の血漿)を、試料として用いた。
3.試料中の総プロテインSのタンパク質量の測定及び算出
「アセラクロム トータルプロテイン S TMB」の添付文書の記載に従い、試料中の総プロテインSのタンパク質量の測定及び算出を行った。
なお、この「アセラクロム トータルプロテイン S TMB」における操作方法は次の通りである。
(a) 検体(クエン酸血漿)を希釈緩衝液で101倍に希釈し、試料とする。
(b) 希釈緩衝液で101倍に希釈して調製したスタンダードを段階的に希釈し、希釈系列を作成する。
(c) 抗体コーティングストリップの各ウェルに抗体コンジュゲートを50μL分注する。
(d) 試料又は希釈したスタンダード200μLをそれぞれ分注し、18~25℃で1時間インキュベーションする。
(e) 各ウェルの内容液を吸引除去し、洗浄液で5回洗浄する。
(f) 洗浄液を吸引除去した後、各ウェルに基質液200μLを分注し、18~25℃で5分間インキュベーションする。
(g) 1M硫酸50μLを分注し、プレートを穏やかに揺らして内容物を混和する。15分間放置した後、1時間以内に波長450nmにおける吸光度を測定する。
(h) スタンダードの吸光度と試料の吸光度を比較し、試料中の総プロテインS濃度を求める。
このようにして、前記2の各試料の総プロテインSのタンパク質量を得た。
この試料中の総プロテインSのタンパク質量の測定を行って得られた結果を図1に示した。
III.測定結果
前記Iにおける試料中の総プロテインSの活性値の測定結果と、前記IIにおける試料中の総プロテインSのタンパク質量の測定結果とを、これらの相関の図として図1に示した。
この図において、横軸(x)は前記IIのELISA法による試料中の総プロテインSのタンパク質量の測定結果を表す。この測定値の単位は「μg/mL」である。
また、この図において、縦軸(y)は前記Iにおける本発明の活性測定方法及び活性測定試薬による試料中の総プロテインSの活性値の測定結果を表す。この測定値の単位は「μg/mL当量」である。
この相関の回帰式を求めた結果、回帰式はy=0.959x−0.860であり、相関係数はr=0.93であった。(x:前記IIのELISA法による総プロテインSのタンパク質量の測定結果、y:前記Iの本発明による総プロテインSの活性値の測定結果)
この図、そして相関の回帰式より、本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬による活性値は、試料中の総プロテインSのタンパク質量と良好な相関性を示すことが分かる。
このように総プロテインSのタンパク質量の測定値と良好な相関性を示すことより、本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬により得られる活性値が、正確なものであることが分かる。すなわち、試料中の総プロテインSの活性を正確に測定出来ている。
そして、このように総プロテインSのタンパク質量の測定値と良好な相関性を示すことより、本発明の試料中の総プロテインSの活性測定試薬及び活性測定方法が、試料中に存在する全てのプロテインS〔プロテインSとC4b結合タンパク質との複合体(結合型)、及び遊離のプロテインS(遊離型)〕についてその活性を、すなわち、総プロテインSの活性を測定することが出来るものであることが分かる。
つまり、このように総プロテインSのタンパク質量の測定値と良好な相関性を示すことより、本発明の試料中の総プロテインSの活性測定試薬及び活性測定方法が、「遊離のプロテインS(遊離型)」の活性に加えて、「プロテインSとC4b結合タンパク質との複合体(結合型)」に含まれるプロテインSが遊離のプロテインS(遊離型)となった場合に発現する活性もあわせて測定することが出来るものであることが分かる。
すなわち、このように総プロテインSのタンパク質量の測定値と良好な相関性を示すことより、本発明の試料中の総プロテインSの活性測定試薬及び活性測定方法が、試料中に存在する全てのプロテインS〔プロテインSとC4b結合タンパク質との複合体(結合型)、及び遊離のプロテインS(遊離型)〕について、そのタンパク質量に相応するプロテインSの活性値を得ることが出来るものであることが分かる。
これらのことより、本発明の試料中の総プロテインSの活性測定試薬及び活性測定方法が、試料中の総プロテインSの活性を正確に測定することが出来るものであることが確かめられた。
〔実施例5〕(総プロテインSの活性値と総プロテインSのタンパク質量との比較)
本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬により得た総プロテインSの活性値と、ラテックス比濁法による試料中の総プロテインSのタンパク質量の測定方法及び測定試薬により得た総プロテインSのタンパク質量とを比較した。
I.本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬による測定
1.総プロテインSの活性測定試薬
(1)希釈液
希釈液として、前記の実施例3の1の(1)の希釈液を用いた。
(2)第1試薬
第1試薬として、前記の実施例3の1の(2)の第1試薬を用いた。
(3)第2試薬
第2試薬として、前記の実施例3の1の(3)の第2試薬を用いた。
(4)第3試薬
第3試薬として、前記の実施例3の1の(4)の第3試薬を用いた。
2.試料
次の(1)~(4)をそれぞれ試料として用いた。
(1) 健常人211名の血漿
(2) プロテインSの遺伝子変異であるPS−K155Eヘテロ接合体(プロテインSの異常症の一つであるプロテインS徳島)であることが判明している7名の血漿
(3) プロテインSの遺伝子変異であるPS−K155Eホモ接合体(プロテインSの異常症の一つであるプロテインS徳島)であることが判明している1名の血漿
(4) プロテインSの遺伝子変異であるC206Fヘテロ接合体(プロテインSの異常症の一つ)であることが判明している1名の血漿
3.試料中の総プロテインSの活性値の測定及び算出
前記2の試料のそれぞれについて、前記の実施例3の3及び4の記載の通りに総プロテインSの活性値の測定及び算出を行い、各試料の総プロテインSの活性値を得た。
この試料中の総プロテインSの活性値の測定を行って得られた結果を図2に示した。
II.ラテックス比濁法による試料中の総プロテインSのタンパク質量の測定方法及び測定試薬による測定
1.ラテックス比濁法による総プロテインSのタンパク質量の活性測定試薬
(1)第1試薬
C4b結合タンパク質を、B.Dahlbeackらの方法〔Biochem.J.,209巻,847~856頁,1983年〕に基づいて、ヒト血漿より調製した。
次に、0.1%(W/V)BSA、0.3mol/L塩化ナトリウム及び0.05%アジ化ナトリウムを含有する50mM MES−塩酸緩衝液〔pH6.2(20℃)〕を調製した。
ここに、前記の通り調製したC4b結合タンパク質を25μg/mLの濃度となるように添加し、第1試薬とした。
(2)第2試薬
(a)抗プロテインS抗体の調製
本発明者らが、精製した遊離状態のプロテインSを免疫抗原として、常法に従って抗プロテインS抗体の調製を行った。
プロテインSのC4b結合タンパク質との結合部位以外の部位に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングを行い、マウス/マウスのハイブリドーマ(9H6株)を得た。
このハイブリドーマ(9H6株)より産生されたマウス抗プロテインS・モノクローナル抗体の5mgを、0.5mLのリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)に溶解した。
これに、0.6mgのS−アセチルメルカプトコハク酸無水物を溶解した0.01mLのN,N−ジメチルホルムアミドを加え、室温で30分間インキュベートした。
次に、これに、0.1M EDTA水溶液の0.02mL、1Mトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン緩衝液(pH7.0)の0.1mL、及び1Mヒドロキシルアミン塩酸緩衝液(pH7.0)の0.1mLをそれぞれ加え、30℃で30分間インキュベートした。
その後、これを、5mM EDTAを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)で平衡化しておいた、セファデックスG−25カラムでゲルろ過を行い、メルカプト・サクシニル化したマウス抗プロテインSモノクローナル抗体を得た。
(b)抗プロテインS抗体固定化ラテックス粒子懸濁液の調製
平均粒径0.192μmのラテックス粒子の10%懸濁液1.0mLと50mM MES−塩酸緩衝液〔pH6.0(20℃)〕1.0mLとを混和し、更に320mMカルボジイミド(同仁化学研究所;製品番号:348−03631)水溶液32μLを添加して混和し、氷上で10分間放置した。
前記の氷上で10分間放置したラテックス粒子懸濁液1.2mLに、前記(a)で調製したメルカプト・サクシニル化したマウス抗プロテインSモノクローナル抗体を0.083g/dLの濃度で50mM MES−塩酸緩衝液〔pH6.0(20℃)〕に混和した液1.8mLを加え、4℃で一晩攪拌した。
次に、遠心分離により上清を除去した後、沈殿部を0.8%BSAを含む50mM Tris−塩酸緩衝液〔pH8.0(20℃)〕にて懸濁し、37℃で3時間放置し、ブロッキング処理を行った。
次に、遠心分離により沈殿部を回収した後、これを0.1%BSAを含む0.05%アジ化ナトリウム水溶液で再分散し、波長700nmにおける吸光度が15.0ODとなるように懸濁した。
これを抗プロテインS抗体固定化ラテックス粒子懸濁液とした。
(c)第2試薬の調製
前記(b)で調製した抗プロテインS抗体固定化ラテックス粒子懸濁液を、0.1%BSAを含む0.05%アジ化ナトリウム水溶液で10倍希釈し、0.1%の「抗プロテインS抗体固定化ラテックス粒子」を含有する懸濁液を調製した。
これを第2試薬とした。
2.試料
前記のIの2の(1)~(4)の各試料を、試料として用いた。
3.試料中の総プロテインSのタンパク質量の測定及び算出
(1)測定手順
(a)測定は、東芝−120FR自動分析装置(東芝メディカルシステムズ社製)を使用して行った。
まず、測定用セル(キュベット)に、前記2の試料の3μLを添加した。
次に、これらの測定用セル(キュベット)に、前記1の(1)の第1試薬の100μLを添加し、混合した。
そして、これらの測定用セル(キュベット)を、37℃で静置した。
これにより、前記の試料に含まれていた遊離のプロテインSと、前記の第1試薬中のC4b結合タンパク質との複合体を形成させた。すなわち、試料に含まれていたプロテインSは、全て「プロテインSとC4b結合タンパク質との複合体(結合型)」となった。
(b)前記の第1試薬の添加後4分40秒目(16ポイント目)に、これらの測定用セル(キュベット)内の混合液に、更に、前記1の(2)の(c)の第2試薬の100μLを添加し、混合した。
(c)前記の第1試薬の添加後5分35秒目(19ポイント目)に、これらの測定用セル(キュベット)内の混合液の吸光度(波長700nm)を試料盲検として測定した。
そして、これらの測定用セル(キュベット)を、37℃で静置して、反応を行わせた。
これにより、前記のラテックス粒子に固定化された抗プロテインS抗体と、前記の試料に含まれていたプロテインSとの抗原抗体反応を行わせ、ラテックス粒子の凝集塊を生成させた。
(d)前記の第1試薬の添加後9分47秒目(33ポイント目)に、この測定用セル(キュベット)内の反応混合液の吸光度(波長700nm)を、前記試料の測定値として測定した。
(e)前記(d)において測定した吸光度(測定値)から前記(c)において測定した吸光度(試料盲検)を差し引き、吸光度差を得た。
なお、この吸光度差は試料に含まれる総プロテインSタンパク質量(濃度)に比例したものである。
これらの試料の吸光度差より検量線を作成し、実検体(3.2%クエン酸血漿)を同様の方法で測定した際の吸光度差を検量線に当てはめて、試料中の総プロテインSタンパク質濃度を求めた。
このようにして、前記2の各試料の総プロテインSのタンパク質量を得た。
この試料中の総プロテインSのタンパク質量の測定を行って得られた結果を図2に示した。
III.測定結果
1.図の説明
前記Iにおける試料中の総プロテインSの活性値の測定結果と、前記IIにおける試料中の総プロテインSのタンパク質量の測定結果とを比較する図を、図2として示した。
この図において、横軸(x)は前記IIのラテックス比濁法による試料中の総プロテインSのタンパク質量の測定結果を表す。この測定値の単位は「μg/mL」である。
また、この図において、縦軸(y)は前記Iにおける本発明の活性測定方法及び活性測定試薬による試料中の総プロテインSの活性値の測定結果を表す。この測定値の単位は「μg/mL当量」である。
2.健常人の試料の比較
前記Iの本発明による総プロテインSの活性値の測定結果と、前記IIのラテックス比濁法による総プロテインSのタンパク質量の測定結果との比較を、次のようにして行った。
試料が健常人211名の血漿である場合について、前記Iの総プロテインSの活性値の測定結果と、前記IIの総プロテインSのタンパク質量の測定結果より、プロテインSの比活性(総プロテインS活性値/総プロテインSタンパク質量)を求めた。
この健常人211名の血漿試料のプロテインSの比活性の平均値と標準偏差(以下、SDということがある)を算出し、平均±2SD(0.98±0.26)の範囲を求めた。
この範囲を外れる試料が10あったので、この10の試料を除外した健常人201名の試料について、再度、総プロテインSの活性値の測定結果と、総プロテインSのタンパク質量の測定結果より求めたプロテインSの比活性(総プロテインS活性値/総プロテインSタンパク質量)の平均値と標準偏差を算出し、平均±2SD(0.99±0.20)の範囲と平均±3SD(0.99±0.30)の範囲を求めた。
なお、この図は、各々の試料について、試料中の総プロテインSの活性値を総プロテインSのタンパク質量で除した比活性を表すものでもある。
この図において、比活性の平均値であるy=0.99xの式の線を実線で表した。
また、この式y=0.99xの線の上及び下に、平均±2SDを示す線(y=1.19x、及びy=0.79x)を破線でこの図に表した。
そして、この式y=0.99xの線の上に平均+3SDを示す線(y=1.29x)を点線で、またこの式y=0.99xの線の下に平均−3SDを示す線(y=0.69x)を実線でこの図に表した。
健常人211名の血漿の試料の測定結果において、この図2で、前記のy=0.69x(平均−3SD)の線よりも下に外れるものが、7つ認められた。
すなわち、総プロテインSの活性値を総プロテインSのタンパク質量で除した比活性が0.69以下の試料が、7つ認められた。
これらの比活性が0.69以下の7つの試料のうち、すなわち総プロテインSの活性値と総プロテインSのタンパク質量が大きく乖離している7つの試料のうち、同意が得られた3つの試料についてプロテインS遺伝子の塩基配列を調べたところ、これらの3つの試料のいずれもプロテインS遺伝子のPS−K155E変異(プロテインSの異常症の一つ)であることが判明した。〔図2において、これらの3つの試料に矢印(↓又は↑)を付した。〕
このことより、試料中の総プロテインSの活性値及び試料中の総プロテインSのタンパク質量を測定し、この測定により得た総プロテインSの活性値と総プロテインSのタンパク質量とを、比活性を求める等により比較することにより、プロテインSの遺伝子の変異等のプロテインSの異常症を検出することが出来ることが確かめられた。
3.プロテインSの遺伝子変異(プロテインSの異常症)であることが判明している試料の比較
前記Iの2の(2)~(4)のプロテインSの遺伝子変異(プロテインSの異常症)であることが判明している試料(計9名の試料)のそれぞれについて、前記Iの本発明による総プロテインSの活性値の測定結果と、前記IIのラテックス比濁法による総プロテインSのタンパク質量の測定結果との比較を行う。
図2において、前記Iの2の(2)のプロテインSの遺伝子変異であるPS−K155Eヘテロ接合体(プロテインSの異常症の一つ)であることが判明している7名の血漿の試料を「●」で示した。
また、前記Iの2の(3)のプロテインSの遺伝子変異であるPS−K155Eホモ接合体(プロテインSの異常症の一つ)であることが判明している1名の血漿の試料を「◆」で示した。
そして、前記Iの2の(4)のプロテインSの遺伝子変異であるC206Fヘテロ接合体(プロテインSの異常症の一つ)であることが判明している1名の血漿の試料を「□」で示した。
プロテインSの遺伝子変異であることが判明しているこれらの9つの試料(●、◆及び□)はいずれも、前記の図2におけるy=0.69x(平均−3SD)の線よりも下に外れていることが分かる。
すなわち、プロテインSの遺伝子変異であることが判明しているこれらの9つの試料(●、◆及び□)はいずれも、総プロテインSの活性値を総プロテインSのタンパク質量で除した比活性が0.69以下であることが分かる。
つまり、これらの9つの試料は、総プロテインSの活性値と総プロテインSのタンパク質量が大きく乖離していることが分かる。
よって、試料中の総プロテインSの活性値及び試料中の総プロテインSのタンパク質量を測定し、この測定により得た総プロテインSの活性値と総プロテインSのタンパク質量とを、比活性を求める等により比較することにより、プロテインSの遺伝子の変異等のプロテインSの異常症を検出することが出来ることが、これらのプロテインSの遺伝子変異の9つの試料の比較結果からも確かめられた。
〔実施例1〕(本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬−1)
本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬の効果を確認した。
1.総プロテインSの活性測定試薬
(1)第1試薬
下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、pHをpH7.5(20℃)に調整して、第1試薬を調製した。
活性化血液凝固第X因子(精製ウシ活性化血液凝固第X因子;New England Biolabs,Inc社、米国) 100pM
リン脂質
塩化カルシウム 10.0mM
ウシ血清アルブミン(BSA;Sigma−Aldrich社、米国)0.1%(W/V)
塩化ナトリウム 0.15M
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン 50mM
なお、リン脂質は、ホスファチジルセリン(ブタ脳ホスファチジルセリン;PS;DOOSAN Serdary Research Laboratories社、韓国)0.6mg、ホスファチジルコリン(ブタ肝臓ホスファチジルコリン;PC;DOOSAN Serdary Research Laboratories社、韓国)0.4mg、及びホスファチジルエタノールアミン(ブタ肝臓ホスファチジルエタノールアミン;PE;DOOSAN Serdary Research Laboratories社、韓国)1.0mgをそれぞれ試験管に採取し、エバポレーターにて溶媒であるクロロフォルムを蒸発させた後、蒸留水を添加し1分間激しく撹拌した後、60℃で10分間超音波処理を行って調製したホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミンの組成比が3:2:5(すなわち、30%(W/V):20%(W/V):50%(W/V))のリン脂質を、15μMの濃度となるように含有させた。〔なお、このホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミンの組成比が3:2:5のリン脂質を、以下「リン脂質(PS:PC:PE=3:2:5)」ということがある。〕
(2)第2試薬
下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、pHをpH7.5(20℃)に調整して、第2試薬を調製した。
プロトロンビン(精製ヒトプロトロンビン;Enzyme Research Laboratories,Inc社、米国) 1.5μM
テストチーム(登録商標)発色基質S−2238(トロンビンの基質〔トロンビンの発色基質〕;製造元:Chromogenix−Instrumentation Laboratory社〔イタリア国〕、販売元:積水メディカル社〔日本国〕) 1.5mM
ウシ血清アルブミン(BSA;Sigma−Aldrich社、米国)0.1%(W/V)
塩化ナトリウム 0.15M
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン 50mM
(3)第3試薬−a
下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、pHをpH8.0(20℃)に調整して、第3試薬−aを調製した。
リン脂質
塩化カルシウム 2.5mM
ウシ血清アルブミン(BSA;Sigma−Aldrich社、米国)0.1%(W/V)
塩化ナトリウム 0.1M
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン 50mM
なお、リン脂質は、ホスファチジルセリン(ブタ脳ホスファチジルセリン;PS;DOOSAN Serdary Research Laboratories社、韓国)0.5mg、及びホスファチジルコリン(ブタ肝臓ホスファチジルコリン;PC;DOOSAN Serdary Research Laboratories社、韓国)0.5mgをそれぞれ試験管に採取し、エバポレーターにて溶媒であるクロロフォルムを蒸発させた後、蒸留水を添加し1分間激しく撹拌した後、60℃で10分間超音波処理を行って調製したホスファチジルセリン及びホスファチジルコリンの組成比が1:1(すなわち、50%(W/V):50%(W/V))のリン脂質を、20μMの濃度となるように含有させた。〔なお、このホスファチジルセリン及びホスファチジルコリンの組成比が1:1のリン脂質を、以下「リン脂質(PS:PC=1:1)」ということがある。〕
(4)第3試薬−b
下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、pHをpH8.0(20℃)に調整して、第3試薬−bを調製した。
界面活性剤
リン脂質
塩化カルシウム 2.5mM
ウシ血清アルブミン(BSA;Sigma−Aldrich社、米国)0.1%(W/V)
塩化ナトリウム 0.1M
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン 50mM
なお、界面活性剤は、Triton X−100(和光純薬工業社、日本国)を0.006%(W/V)の濃度となるように含有させた。
また、リン脂質は、前記のリン脂質(PS:PC=1:1)を、20μMの濃度となるように含有させた。
(5)第3試薬−c
下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、pHをpH8.0(20℃)に調整して、第3試薬−cを調製した。
リン脂質
塩化カルシウム 2.5mM
ウシ血清アルブミン(BSA;Sigma−Aldrich社、米国)0.1%(W/V)
塩化ナトリウム 0.1M
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン 50mM
なお、リン脂質は、ホスファチジルセリン(ブタ脳ホスファチジルセリン;PS;DOOSAN Serdary Research Laboratories社、韓国)0.4mg、ホスファチジルコリン(ブタ肝臓ホスファチジルコリン;PC;DOOSAN Serdary Research Laboratories社、韓国)0.4mg、及びホスファチジルエタノールアミン(ブタ肝臓ホスファチジルエタノールアミン;PE;DOOSAN Serdary Research Laboratories社、韓国)0.4mgをそれぞれ試験管に採取し、エバポレーターにて溶媒であるクロロフォルムを蒸発させた後、蒸留水を添加し1分間激しく撹拌した後、60℃で10分間超音波処理を行って調製したホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミンの組成比が1:1:1(すなわち、33.33%(W/V):33.33%(W/V):33.33%(W/V))のリン脂質を、24μMの濃度となるように含有させた。〔なお、このホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミンの組成比が1:1:1のリン脂質を、以下「リン脂質(PS:PC:PE=1:1:1)」ということがある。〕
(6)第3試薬−d
下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、pHをpH8.0(20℃)に調整して、第3試薬−dを調製した。
界面活性剤
リン脂質
塩化カルシウム 2.5mM
ウシ血清アルブミン(BSA;Sigma−Aldrich社、米国)0.1%(W/V)
塩化ナトリウム 0.1M
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン 50mM
なお、界面活性剤は、Triton X−100(和光純薬工業社、日本国)を0.006%(W/V)の濃度となるように含有させた。
また、リン脂質は、前記のリン脂質(PS:PC:PE=1:1:1)を、24μMの濃度となるように含有させた。
(7)第4試薬
下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、pHをpH8.0(20℃)に調整して、第4試薬を調製した。
活性化プロテインC(精製ヒト活性化プロテインC;Enzyme Research Laboratories,Inc社、米国) 16.5nM
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン 50mM
(8)第5試薬
下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、pHをpH8.0(20℃)に調整して、第5試薬を調製した。
活性化血液凝固第V因子(精製ヒト活性化血液凝固第V因子;Haematologic Technologies,Inc社、米国)6.0nM
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン 50mM
2.試料
次の(1)及び(2)をそれぞれ試料として用いた。
(1) 精製された遊離のプロテインSと精製された遊離のC4b結合タンパク質とを1:1(モル比)で混合して調製した総プロテインS活性値が10μg/mL当量の試料
(2) 精製された遊離のプロテインSと精製された遊離のC4b結合タンパク質とを1:1(モル比)で混合して調製した総プロテインS活性値が20μg/mL当量の試料
3.試料中の総プロテインSの活性値の測定
各試料の総プロテインSの活性値の測定を、次のようにして行った。
(1) 前記2の試料のそれぞれについて、その0.5μLと前記1の(3)の第3試薬−aの193.5μLを混合した。
(2) 次に、これに前記1の(7)の第4試薬の4μLを添加混合し、37℃で5分間インキュベートした。
(3) 次に、これに前記1の(8)の第5試薬の2μLを添加混合し、37℃で10分間インキュベートした。
(4) 次に、この180μLを分取し、前記1の(1)の第1試薬の180μL及び前記1の(2)の第2試薬の180μLを入れて37℃でインキュベートしておいたキュベットに添加混合して、37℃でインキュベートした。
(5) 前記(4)における添加混合の後、波長405nmにおける吸光度の変化を測定した。
(6) なお、前記(1)において、前記1の(3)の第3試薬−aに替えて、前記1の(4)の第3試薬−bを用いること以外は、前記(1)~(5)の通りに操作を行い、第3試薬−bを用いた場合の波長405nmにおける吸光度の変化を測定した。
(7) また、前記(1)において、前記1の(3)の第3試薬−aに替えて、前記1の(5)の第3試薬−cを用いること以外は、前記(1)~(5)の通りに操作を行い、第3試薬−cを用いた場合の波長405nmにおける吸光度の変化を測定した。
(8) そして、前記(1)において、前記1の(3)の第3試薬−aに替えて、前記1の(6)の第3試薬−dを用いること以外は、前記(1)~(5)の通りに操作を行い、第3試薬−dを用いた場合の波長405nmにおける吸光度の変化を測定した。
4.試料中の総プロテインSの活性値の算出
前記3において測定した波長405nmにおける吸光度の変化(反応のタイムコース)の値を微分して、試料中の総プロテインSの活性値を求めた。
なお、予め、総プロテインS活性値が既知の試料について、前記3の通り測定を行い、測定した波長405nmにおける吸光度の変化(反応のタイムコース)の1分間当りの吸光度変化量を時間に対して直線式(微分直線)を求め、この直線の傾きをこの既知の総プロテインS活性値に対してプロットして検量線を作成した。
そして、前記2の試料を前記3の通り測定を行って得た、波長405nmにおける吸光度の変化(反応のタイムコース)の1分間当りの吸光度変化量を、時間に対して直線式(微分直線)を求め、この直線の傾きを前記の検量線に当てはめて、試料中の総プロテインSの活性値を算出した。
すなわち、測定により得られた吸光度より吸光度変化の加速度(吸光度の二次微分値)を求め、検量線に当てはめることにより、試料中の総プロテインSの活性値を算出した。
なお、本特許出願の明細書及び図面においては、精製ヒトプロテインS(Enzyme Research Laboratories,Inc社、米国)の1μg/mLが有する総プロテインS活性値を、総プロテインS活性値1μg/mL当量と定義した。
よって、本特許出願の明細書及び図面においては、総プロテインSの活性は、「μg/mL当量」を用いて表している。
5.測定結果
前記の通りに試料中の総プロテインSの活性値の測定を行って得られた結果を表1に示した。
なお、この表において、「比率(%)」として表した値は、試料の総プロテインS活性値に対する、測定値(試料を測定して得た総プロテインS活性値)の比率をパーセント表示で示したものである。
また、この表より、第3試薬−bを用いた場合には、すなわち、試料中に含まれていたプロテインSによる活性化プロテインCの活性上昇反応時、及び当該活性上昇したプロテインCによる活性化血液凝固第V因子の分解反応時に、界面活性剤を存在させ、かつホスファチジルコリン及びホスファチジルセリン(1:1)よりなるリン脂質を存在させた場合には、前記の比率〔試料の総プロテインS活性値に対する、測定値(試料を測定して得た総プロテインS活性値)の比率〕が、総プロテインS活性値が10μg/mL当量の試料においては65.4%、そして総プロテインS活性値が20μg/mL当量の試料においては62.8%であることが分かる。
また、この表より、第3試薬−cを用いた場合には、すなわち、試料中に含まれていたプロテインSによる活性化プロテインCの活性上昇反応時、及び当該活性上昇したプロテインCによる活性化血液凝固第V因子の分解反応時に、界面活性剤を存在させず、かつホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミン(1:1:1)よりなるリン脂質を存在させた場合には、前記の比率〔試料の総プロテインS活性値に対する、測定値(試料を測定して得た総プロテインS活性値)の比率〕が、総プロテインS活性値が10μg/mL当量の試料においては50.4%、そして総プロテインS活性値が20μg/mL当量の試料においては50.0%であることが分かる。
また、この表より、第3試薬−dを用いた場合には、すなわち、試料中に含まれていたプロテインSによる活性化プロテインCの活性上昇反応時、及び当該活性上昇したプロテインCによる活性化血液凝固第V因子の分解反応時に、界面活性剤を存在させ、かつホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミン(1:1:1)よりなるリン脂質を存在させた場合には、前記の比率〔試料の総プロテインS活性値に対する、測定値(試料を測定して得た総プロテインS活性値)の比率〕が、総プロテインS活性値が10μg/mL当量の試料においては78.7%、そして総プロテインS活性値が20μg/mL当量の試料においては89.1%であることが分かる。
これらのことより、試料中に含まれていたプロテインSによる活性化プロテインCの活性上昇反応時、及び当該活性上昇したプロテインCによる活性化血液凝固第V因子の分解反応時に、界面活性剤を存在させることにより、試料中の総プロテインS活性を、より正確に測定することができることが確かめられた。
すなわち、本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬の効果が確かめられた。
また、試料中に含まれていたプロテインSによる活性化プロテインCの活性上昇反応時、及び当該活性上昇したプロテインCによる活性化血液凝固第V因子の分解反応時に存在させるリン脂質が、ホスファチジルコリン及びホスファチジルセリンよりなるリン脂質よりも、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンよりなるリン脂質の方が、より正確に試料中の総プロテインS活性を測定することができることが確かめられた。
〔実施例2〕(本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬−2)
本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬の効果を確認した。
1.総プロテインSの活性測定試薬
(1)第1試薬
第1試薬として、前記の実施例1の1の(1)の第1試薬を用いた。
(2)第2試薬
第2試薬として、前記の実施例1の1の(2)の第2試薬を用いた。
(3)第3試薬−1
下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、pHをpH8.0(20℃)に調整して、第3試薬−1を調製した。
リン脂質
塩化カルシウム 2.5mM
ウシ血清アルブミン(BSA;Sigma−Aldrich社、米国)0.1%(W/V)
塩化ナトリウム 0.1M
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン 50mM
なお、リン脂質は、前記のリン脂質(PS:PC:PE=1:1:1)を、24μMの濃度となるように含有させた。
(4)第3試薬−2~第3試薬−19
下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、pHをpH8.0(20℃)に調整して、第3試薬−2から第3試薬−19までを調製した。
界面活性剤
リン脂質
塩化カルシウム 2.5mM
ウシ血清アルブミン(BSA;Sigma−Aldrich社、米国)0.1%(W/V)
塩化ナトリウム 0.1M
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン 50mM
なお、リン脂質は、前記のリン脂質(PS:PC:PE=1:1:1)を、24μMの濃度となるように含有させた。
また、界面活性剤は、非イオン性界面活性剤のTriton X−100、Triton X−114、NP−10、NP−11、NP−12、NP−13、BT−9及びBT−12、陰イオン性界面活性剤のサルコシネート LN、陽イオン性界面活性剤のCA−2350、並びに両性界面活性剤のAM−301のそれぞれを、次の通り記載の濃度となるように各々の試薬に含有させた。
第3試薬−2: Triton X−100(和光純薬工業社、日本国) 0.0050%(W/V)
第3試薬−3: Triton X−100(和光純薬工業社、日本国) 0.0060%(W/V)
第3試薬−4: Triton X−100(和光純薬工業社、日本国) 0.0070%(W/V)
第3試薬−5: Triton X−114(和光純薬工業社、日本国) 0.0050%(W/V)
第3試薬−6: NP−10(日光ケミカルズ社、日本国) 0.0025%(W/V)
第3試薬−7: NP−11(日光ケミカルズ社、日本国) 0.0025%(W/V)
第3試薬−8: NP−11(日光ケミカルズ社、日本国) 0.0050%(W/V)
第3試薬−9: NP−12(日光ケミカルズ社、日本国) 0.0025%(W/V)
第3試薬−10: NP−13(日光ケミカルズ社、日本国) 0.0050%(W/V)
第3試薬−11: BT−9(日光ケミカルズ社、日本国) 0.003%(W/V)
第3試薬−12: BT−9(日光ケミカルズ社、日本国) 0.006%(W/V)
第3試薬−13: BT−12(日光ケミカルズ社、日本国) 0.006%(W/V)
第3試薬−14: サルコシネート LN(日光ケミカルズ社、日本国) 0.006%(W/V)
第3試薬−15: サルコシネート LN(日光ケミカルズ社、日本国) 0.010%(W/V)
第3試薬−16: CA−2350(日光ケミカルズ社、日本国) 0.0001%(W/V)
第3試薬−17: CA−2350(日光ケミカルズ社、日本国) 0.0003%(W/V)
第3試薬−18: AM−301(日光ケミカルズ社、日本国) 0.003%(W/V)
第3試薬−19: AM−301(日光ケミカルズ社、日本国) 0.006%(W/V)
(5)第4試薬
第4試薬として、前記の実施例1の1の(7)の第4試薬を用いた。
(6)第5試薬
第5試薬として、前記の実施例1の1の(8)の第5試薬を用いた。
2.試料
前記の実施例1の2の(1)及び(2)の各試料を、試料として用いた。
3.試料中の総プロテインSの活性値の測定及び算出
前記2の試料のそれぞれについて、前記の実施例1の3及び4の記載の通りに総プロテインSの活性値の測定及び算出を行い、各試料の総プロテインSの活性値を得た。
なお、前記の実施例1の3の(1)の第3試薬−aに替えて、前記1の(3)の第3試薬−1及び前記1の(4)の第3試薬−2から第3試薬−19までを順々に用いた。
4.測定結果
前記の通りに試料中の総プロテインSの活性値の測定を行って得られた結果を表2に示した。
なお、この表において、「比率(%)」として表した値は、試料の総プロテインS活性値に対する、測定値(試料を測定して得た総プロテインS活性値)の比率をパーセント表示で示したものである。
また、この表より、第3試薬−2から第3試薬−19までをそれぞれ用いた場合には、すなわち、試料中に含まれていたプロテインSによる活性化プロテインCの活性上昇反応時、及び当該活性上昇したプロテインCによる活性化血液凝固第V因子の分解反応時に、界面活性剤を存在させた場合には、前記の比率〔試料の総プロテインS活性値に対する、測定値(試料を測定して得た総プロテインS活性値)の比率〕が、総プロテインS活性値が10μg/mL当量の試料においては62.0%~88.0%、そして総プロテインS活性値が20μg/mL当量の試料においては64.0%~104.3%であることが分かる。
これらのことより、試料中に含まれていたプロテインSによる活性化プロテインCの活性上昇反応時、及び当該活性上昇したプロテインCによる活性化血液凝固第V因子の分解反応時に、界面活性剤を存在させることにより、試料中の総プロテインS活性を、より正確に測定することができることが確かめられた。
すなわち、本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬の効果が確かめられた。
そして、非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、及び両性界面活性剤の全てのタイプの界面活性剤において、この本発明の効果を確かめることができた。
〔実施例3〕(本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬の再現性の検討)
本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬により試料中の総プロテインS活性値を測定する際の測定の再現性について検討した。
1.総プロテインSの活性測定試薬
(1)希釈液
下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、pHをpH8.0(20℃)に調整して、希釈液を調製した。
Triton X−100(和光純薬工業社、日本国) 0.06%(W/V)
ウシ血清アルブミン(BSA) 0.1%(W/V)
塩化ナトリウム 0.1M
クエン酸三ナトリウム 10.6mM
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン 50mM
(2)第1試薬
下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、pHをpH8.0(20℃)に調整して、第1試薬を調製した。
活性化プロテインC(精製ヒト活性化プロテインC;Enzyme Research Laboratories,Inc社、米国) 397pM
界面活性剤
リン脂質
塩化カルシウム 2.5mM
ウシ血清アルブミン(BSA;Sigma−Aldrich社、米国)0.1%(W/V)
塩化ナトリウム 0.1M
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン 50mM
なお、界面活性剤は、Triton X−100(和光純薬工業社、日本国)を0.006%(W/V)の濃度となるように含有させた。
また、リン脂質は、前記のリン脂質(PS:PC:PE=1:1:1)を、24μMの濃度となるように含有させた。
(3)第2試薬
下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、pHをpH8.0(20℃)に調整して、第2試薬を調製した。
活性化血液凝固第V因子(精製ヒト活性化血液凝固第V因子;Haematologic Technologies,Inc社、米国)357pM
界面活性剤
リン脂質
塩化カルシウム 2.5mM
ウシ血清アルブミン(BSA;Sigma−Aldrich社、米国)0.1%(W/V)
塩化ナトリウム 0.1M
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン 50mM
なお、界面活性剤は、Triton X−100(和光純薬工業社、日本国)を0.006%(W/V)の濃度となるように含有させた。
また、リン脂質は、前記のリン脂質(PS:PC:PE=1:1:1)を、24μMの濃度となるように含有させた。
(4)第3試薬
下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、pHをpH7.5(20℃)に調整して、第3試薬を調製した。
活性化血液凝固第X因子(精製ウシ活性化血液凝固第X因子;New England Biolabs,Inc社、米国) 50pM
プロトロンビン(精製ヒトプロトロンビン;Enzyme Research Laboratories,Inc社、米国) 738nM
テストチーム(登録商標)発色基質S−2238(トロンビンの基質〔トロンビンの発色基質〕;製造元:Chromogenix−Instrumentation Laboratory社〔イタリア国〕、販売元:積水メディカル社〔日本国〕) 750μM
リン脂質
塩化カルシウム 5.0mM
ウシ血清アルブミン(BSA;Sigma−Aldrich社、米国)0.1%(W/V)
塩化ナトリウム 0.15M
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン 50mM
なお、リン脂質は、前記のリン脂質(PS:PC:PE=3:2:5)を、7.5μMの濃度となるように含有させた。
2.試料
ヒトの血漿の4検体を、試料として用いた。
3.試料中の総プロテインSの活性値の測定
各試料の総プロテインSの活性値の測定は、日立ハイテクノロジーズ社(日本国)の7170S形汎用自動分析装置を使用して行った。
(1) 前記2の試料それぞれについて、前記1の(1)の希釈液により希釈倍率15倍で希釈を行った。
(2) 前記(1)で希釈した試料2.0μLに、前記1の(2)の第1試薬の98μLを添加し、37℃で1.4分間反応させた。
(3) 次に、前記1の(3)の第2試薬の20μLを添加し、37℃で8.3分間反応させた。
(4) 次に、前記1の(4)の第3試薬の236μLを添加し、37℃で反応させた。
(5) 前記(4)における第3試薬の添加の後、主波長405nm及び副波長505nmにおける吸光度の変化を12.3分間測定した。
(6) 前記(1)~(5)の操作を繰り返して計5回行い、同時再現性の検討を行なった。
(7) また、前記(1)~(5)の操作を連続する3日間のそれぞれの日に行い、日差再現性の検討を行なった。
4.試料中の総プロテインSの活性値の算出
前記3の(5)において測定した第3試薬添加後の吸光度変化(反応のタイムコース)の値を微分して、試料中の総プロテインSの活性値を求めた。
なお、予め、総プロテインS活性値が既知の試料について、前記3の通り測定を行い、測定した第3試薬添加後の吸光度変化(反応のタイムコース)の1分間当りの吸光度変化量を時間に対して直線式(微分直線)を求め、この直線の傾きをこの既知の総プロテインS活性値に対してプロットして検量線を作成した。
そして、前記2の試料を前記3の通り測定を行って得た、第3試薬添加後の吸光度変化(反応のタイムコース)の1分間当りの吸光度変化量を、時間に対して直線式(微分直線)を求め、この直線の傾きを前記の検量線に当てはめて、試料中の総プロテインSの活性値を算出した。
すなわち、測定により得られた吸光度より吸光度変化の加速度(吸光度の二次微分値)を求め、検量線に当てはめてることにより、試料中の総プロテインSの活性値を算出した。
5.測定結果
前記の通りに試料中の総プロテインSの活性値の測定を行って得られた結果を表3に示した。
この表において、同時再現性のデータ、及び日差再現性のデータとも、それぞれの試料毎に、「平均値±標準偏差(SD)」及び「変動係数(CV)」を示した。
また、日差再現性における変動係数(CV)は2.8%~5.6%の範囲のものであり、例え測定を行う日が異なったとしてもその測定値のバラツキは小さく、精密に測定できることが分かる。
これらのことより、本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬は測定の再現性がよく、精密に測定が行えるものであることが確かめられた。
〔実施例4〕(ELISA法による試料中の総プロテインSのタンパク質量の測定方法及び測定試薬との相関)
本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬と、ELISA法による試料中の総プロテインSのタンパク質量の測定方法及び測定試薬との相関を検討した。
I.本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬による測定
1.総プロテインSの活性測定試薬
(1)希釈液
希釈液として、前記の実施例3の1の(1)の希釈液を用いた。
(2)第1試薬
第1試薬として、前記の実施例3の1の(2)の第1試薬を用いた。
(3)第2試薬
第2試薬として、前記の実施例3の1の(3)の第2試薬を用いた。
(4)第3試薬
第3試薬として、前記の実施例3の1の(4)の第3試薬を用いた。
2.試料
健常人50名の血漿を、試料として用いた。
3.試料中の総プロテインSの活性値の測定及び算出
前記2の試料のそれぞれについて、前記の実施例3の3及び4の記載の通りに総プロテインSの活性値の測定及び算出を行い、各試料の総プロテインSの活性値を得た。
この試料中の総プロテインSの活性値の測定を行って得られた結果を図1に示した。
II.ELISA法による試料中の総プロテインSのタンパク質量の測定方法及び測定試薬による測定
1.ELISA法による総プロテインSのタンパク質量の活性測定試薬
ELISA法による総プロテインSのタンパク質量の活性測定試薬として、市販の「アセラクロム トータルプロテイン S TMB」(製造者:DIAGNOSTICA STAGO社、フランス国;製造販売者:ロシュ・ダイアグノスティックス社、日本国)を用いた。
なお、この「アセラクロム トータルプロテイン S TMB」は次のものより構成される。
(a) 抗体コーティングストリップ(抗総プロテインSマウスモノクローナル抗体)
(b) 抗体コンジュゲート(ペルオキシダーゼ標識抗総プロテインSマウスモノクローナル抗体)
(c)基質液(3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン、及び30%過酸化水素水)
(d)希釈緩衝液
(e)洗浄液
(f)スタンダード(総プロテインS・キャリブレーター)
(g)コントロール(総プロテインS・コントロール)
(h)プレートフレーム
(i)プレートカバー
2.試料
前記のIの2における試料(健常人50名の血漿)を、試料として用いた。
3.試料中の総プロテインSのタンパク質量の測定及び算出
「アセラクロム トータルプロテイン S TMB」の添付文書の記載に従い、試料中の総プロテインSのタンパク質量の測定及び算出を行った。
なお、この「アセラクロム トータルプロテイン S TMB」における操作方法は次の通りである。
(a) 検体(クエン酸血漿)を希釈緩衝液で101倍に希釈し、試料とする。
(b) 希釈緩衝液で101倍に希釈して調製したスタンダードを段階的に希釈し、希釈系列を作成する。
(c) 抗体コーティングストリップの各ウェルに抗体コンジュゲートを50μL分注する。
(d) 試料又は希釈したスタンダード200μLをそれぞれ分注し、18~25℃で1時間インキュベーションする。
(e) 各ウェルの内容液を吸引除去し、洗浄液で5回洗浄する。
(f) 洗浄液を吸引除去した後、各ウェルに基質液200μLを分注し、18~25℃で5分間インキュベーションする。
(g) 1M硫酸50μLを分注し、プレートを穏やかに揺らして内容物を混和する。15分間放置した後、1時間以内に波長450nmにおける吸光度を測定する。
(h) スタンダードの吸光度と試料の吸光度を比較し、試料中の総プロテインS濃度を求める。
このようにして、前記2の各試料の総プロテインSのタンパク質量を得た。
この試料中の総プロテインSのタンパク質量の測定を行って得られた結果を図1に示した。
III.測定結果
前記Iにおける試料中の総プロテインSの活性値の測定結果と、前記IIにおける試料中の総プロテインSのタンパク質量の測定結果とを、これらの相関の図として図1に示した。
この図において、横軸(x)は前記IIのELISA法による試料中の総プロテインSのタンパク質量の測定結果を表す。この測定値の単位は「μg/mL」である。
また、この図において、縦軸(y)は前記Iにおける本発明の活性測定方法及び活性測定試薬による試料中の総プロテインSの活性値の測定結果を表す。この測定値の単位は「μg/mL当量」である。
この相関の回帰式を求めた結果、回帰式はy=0.959x−0.860であり、相関係数はr=0.93であった。(x:前記IIのELISA法による総プロテインSのタンパク質量の測定結果、y:前記Iの本発明による総プロテインSの活性値の測定結果)
この図、そして相関の回帰式より、本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬による活性値は、試料中の総プロテインSのタンパク質量と良好な相関性を示すことが分かる。
このように総プロテインSのタンパク質量の測定値と良好な相関性を示すことより、本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬により得られる活性値が、正確なものであることが分かる。すなわち、試料中の総プロテインSの活性を正確に測定出来ている。
そして、このように総プロテインSのタンパク質量の測定値と良好な相関性を示すことより、本発明の試料中の総プロテインSの活性測定試薬及び活性測定方法が、試料中に存在する全てのプロテインS〔プロテインSとC4b結合タンパク質との複合体(結合型)、及び遊離のプロテインS(遊離型)〕についてその活性を、すなわち、総プロテインSの活性を測定することが出来るものであることが分かる。
つまり、このように総プロテインSのタンパク質量の測定値と良好な相関性を示すことより、本発明の試料中の総プロテインSの活性測定試薬及び活性測定方法が、「遊離のプロテインS(遊離型)」の活性に加えて、「プロテインSとC4b結合タンパク質との複合体(結合型)」に含まれるプロテインSが遊離のプロテインS(遊離型)となった場合に発現する活性もあわせて測定することが出来るものであることが分かる。
すなわち、このように総プロテインSのタンパク質量の測定値と良好な相関性を示すことより、本発明の試料中の総プロテインSの活性測定試薬及び活性測定方法が、試料中に存在する全てのプロテインS〔プロテインSとC4b結合タンパク質との複合体(結合型)、及び遊離のプロテインS(遊離型)〕について、そのタンパク質量に相応するプロテインSの活性値を得ることが出来るものであることが分かる。
これらのことより、本発明の試料中の総プロテインSの活性測定試薬及び活性測定方法が、試料中の総プロテインSの活性を正確に測定することが出来るものであることが確かめられた。
〔実施例5〕(総プロテインSの活性値と総プロテインSのタンパク質量との比較)
本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬により得た総プロテインSの活性値と、ラテックス比濁法による試料中の総プロテインSのタンパク質量の測定方法及び測定試薬により得た総プロテインSのタンパク質量とを比較した。
I.本発明の試料中の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬による測定
1.総プロテインSの活性測定試薬
(1)希釈液
希釈液として、前記の実施例3の1の(1)の希釈液を用いた。
(2)第1試薬
第1試薬として、前記の実施例3の1の(2)の第1試薬を用いた。
(3)第2試薬
第2試薬として、前記の実施例3の1の(3)の第2試薬を用いた。
(4)第3試薬
第3試薬として、前記の実施例3の1の(4)の第3試薬を用いた。
2.試料
次の(1)~(4)をそれぞれ試料として用いた。
(1) 健常人211名の血漿
(2) プロテインSの遺伝子変異であるPS−K155Eヘテロ接合体(プロテインSの異常症の一つであるプロテインS徳島)であることが判明している7名の血漿
(3) プロテインSの遺伝子変異であるPS−K155Eホモ接合体(プロテインSの異常症の一つであるプロテインS徳島)であることが判明している1名の血漿
(4) プロテインSの遺伝子変異であるC206Fヘテロ接合体(プロテインSの異常症の一つ)であることが判明している1名の血漿
3.試料中の総プロテインSの活性値の測定及び算出
前記2の試料のそれぞれについて、前記の実施例3の3及び4の記載の通りに総プロテインSの活性値の測定及び算出を行い、各試料の総プロテインSの活性値を得た。
この試料中の総プロテインSの活性値の測定を行って得られた結果を図2に示した。
II.ラテックス比濁法による試料中の総プロテインSのタンパク質量の測定方法及び測定試薬による測定
1.ラテックス比濁法による総プロテインSのタンパク質量の活性測定試薬
(1)第1試薬
C4b結合タンパク質を、B.Dahlbeackらの方法〔Biochem.J.,209巻,847~856頁,1983年〕に基づいて、ヒト血漿より調製した。
次に、0.1%(W/V)BSA、0.3mol/L塩化ナトリウム及び0.05%アジ化ナトリウムを含有する50mM MES−塩酸緩衝液〔pH6.2(20℃)〕を調製した。
ここに、前記の通り調製したC4b結合タンパク質を25μg/mLの濃度となるように添加し、第1試薬とした。
(2)第2試薬
(a)抗プロテインS抗体の調製
本発明者らが、精製した遊離状態のプロテインSを免疫抗原として、常法に従って抗プロテインS抗体の調製を行った。
プロテインSのC4b結合タンパク質との結合部位以外の部位に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングを行い、マウス/マウスのハイブリドーマ(9H6株)を得た。
このハイブリドーマ(9H6株)より産生されたマウス抗プロテインS・モノクローナル抗体の5mgを、0.5mLのリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)に溶解した。
これに、0.6mgのS−アセチルメルカプトコハク酸無水物を溶解した0.01mLのN,N−ジメチルホルムアミドを加え、室温で30分間インキュベートした。
次に、これに、0.1M EDTA水溶液の0.02mL、1Mトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン緩衝液(pH7.0)の0.1mL、及び1Mヒドロキシルアミン塩酸緩衝液(pH7.0)の0.1mLをそれぞれ加え、30℃で30分間インキュベートした。
その後、これを、5mM EDTAを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)で平衡化しておいた、セファデックスG−25カラムでゲルろ過を行い、メルカプト・サクシニル化したマウス抗プロテインSモノクローナル抗体を得た。
(b)抗プロテインS抗体固定化ラテックス粒子懸濁液の調製
平均粒径0.192μmのラテックス粒子の10%懸濁液1.0mLと50mM MES−塩酸緩衝液〔pH6.0(20℃)〕1.0mLとを混和し、更に320mMカルボジイミド(同仁化学研究所;製品番号:348−03631)水溶液32μLを添加して混和し、氷上で10分間放置した。
前記の氷上で10分間放置したラテックス粒子懸濁液1.2mLに、前記(a)で調製したメルカプト・サクシニル化したマウス抗プロテインSモノクローナル抗体を0.083g/dLの濃度で50mM MES−塩酸緩衝液〔pH6.0(20℃)〕に混和した液1.8mLを加え、4℃で一晩攪拌した。
次に、遠心分離により上清を除去した後、沈殿部を0.8%BSAを含む50mM Tris−塩酸緩衝液〔pH8.0(20℃)〕にて懸濁し、37℃で3時間放置し、ブロッキング処理を行った。
次に、遠心分離により沈殿部を回収した後、これを0.1%BSAを含む0.05%アジ化ナトリウム水溶液で再分散し、波長700nmにおける吸光度が15.0ODとなるように懸濁した。
これを抗プロテインS抗体固定化ラテックス粒子懸濁液とした。
(c)第2試薬の調製
前記(b)で調製した抗プロテインS抗体固定化ラテックス粒子懸濁液を、0.1%BSAを含む0.05%アジ化ナトリウム水溶液で10倍希釈し、0.1%の「抗プロテインS抗体固定化ラテックス粒子」を含有する懸濁液を調製した。
これを第2試薬とした。
2.試料
前記のIの2の(1)~(4)の各試料を、試料として用いた。
3.試料中の総プロテインSのタンパク質量の測定及び算出
(1)測定手順
(a)測定は、東芝−120FR自動分析装置(東芝メディカルシステムズ社製)を使用して行った。
まず、測定用セル(キュベット)に、前記2の試料の3μLを添加した。
次に、これらの測定用セル(キュベット)に、前記1の(1)の第1試薬の100μLを添加し、混合した。
そして、これらの測定用セル(キュベット)を、37℃で静置した。
これにより、前記の試料に含まれていた遊離のプロテインSと、前記の第1試薬中のC4b結合タンパク質との複合体を形成させた。すなわち、試料に含まれていたプロテインSは、全て「プロテインSとC4b結合タンパク質との複合体(結合型)」となった。
(b)前記の第1試薬の添加後4分40秒目(16ポイント目)に、これらの測定用セル(キュベット)内の混合液に、更に、前記1の(2)の(c)の第2試薬の100μLを添加し、混合した。
(c)前記の第1試薬の添加後5分35秒目(19ポイント目)に、これらの測定用セル(キュベット)内の混合液の吸光度(波長700nm)を試料盲検として測定した。
そして、これらの測定用セル(キュベット)を、37℃で静置して、反応を行わせた。
これにより、前記のラテックス粒子に固定化された抗プロテインS抗体と、前記の試料に含まれていたプロテインSとの抗原抗体反応を行わせ、ラテックス粒子の凝集塊を生成させた。
(d)前記の第1試薬の添加後9分47秒目(33ポイント目)に、この測定用セル(キュベット)内の反応混合液の吸光度(波長700nm)を、前記試料の測定値として測定した。
(e)前記(d)において測定した吸光度(測定値)から前記(c)において測定した吸光度(試料盲検)を差し引き、吸光度差を得た。
なお、この吸光度差は試料に含まれる総プロテインSタンパク質量(濃度)に比例したものである。
これらの試料の吸光度差より検量線を作成し、実検体(3.2%クエン酸血漿)を同様の方法で測定した際の吸光度差を検量線に当てはめて、試料中の総プロテインSタンパク質濃度を求めた。
このようにして、前記2の各試料の総プロテインSのタンパク質量を得た。
この試料中の総プロテインSのタンパク質量の測定を行って得られた結果を図2に示した。
III.測定結果
1.図の説明
前記Iにおける試料中の総プロテインSの活性値の測定結果と、前記IIにおける試料中の総プロテインSのタンパク質量の測定結果とを比較する図を、図2として示した。
この図において、横軸(x)は前記IIのラテックス比濁法による試料中の総プロテインSのタンパク質量の測定結果を表す。この測定値の単位は「μg/mL」である。
また、この図において、縦軸(y)は前記Iにおける本発明の活性測定方法及び活性測定試薬による試料中の総プロテインSの活性値の測定結果を表す。この測定値の単位は「μg/mL当量」である。
2.健常人の試料の比較
前記Iの本発明による総プロテインSの活性値の測定結果と、前記IIのラテックス比濁法による総プロテインSのタンパク質量の測定結果との比較を、次のようにして行った。
試料が健常人211名の血漿である場合について、前記Iの総プロテインSの活性値の測定結果と、前記IIの総プロテインSのタンパク質量の測定結果より、プロテインSの比活性(総プロテインS活性値/総プロテインSタンパク質量)を求めた。
この健常人211名の血漿試料のプロテインSの比活性の平均値と標準偏差(以下、SDということがある)を算出し、平均±2SD(0.98±0.26)の範囲を求めた。
この範囲を外れる試料が10あったので、この10の試料を除外した健常人201名の試料について、再度、総プロテインSの活性値の測定結果と、総プロテインSのタンパク質量の測定結果より求めたプロテインSの比活性(総プロテインS活性値/総プロテインSタンパク質量)の平均値と標準偏差を算出し、平均±2SD(0.99±0.20)の範囲と平均±3SD(0.99±0.30)の範囲を求めた。
なお、この図は、各々の試料について、試料中の総プロテインSの活性値を総プロテインSのタンパク質量で除した比活性を表すものでもある。
この図において、比活性の平均値であるy=0.99xの式の線を実線で表した。
また、この式y=0.99xの線の上及び下に、平均±2SDを示す線(y=1.19x、及びy=0.79x)を破線でこの図に表した。
そして、この式y=0.99xの線の上に平均+3SDを示す線(y=1.29x)を点線で、またこの式y=0.99xの線の下に平均−3SDを示す線(y=0.69x)を実線でこの図に表した。
健常人211名の血漿の試料の測定結果において、この図2で、前記のy=0.69x(平均−3SD)の線よりも下に外れるものが、7つ認められた。
すなわち、総プロテインSの活性値を総プロテインSのタンパク質量で除した比活性が0.69以下の試料が、7つ認められた。
これらの比活性が0.69以下の7つの試料のうち、すなわち総プロテインSの活性値と総プロテインSのタンパク質量が大きく乖離している7つの試料のうち、同意が得られた3つの試料についてプロテインS遺伝子の塩基配列を調べたところ、これらの3つの試料のいずれもプロテインS遺伝子のPS−K155E変異(プロテインSの異常症の一つ)であることが判明した。〔図2において、これらの3つの試料に矢印(↓又は↑)を付した。〕
このことより、試料中の総プロテインSの活性値及び試料中の総プロテインSのタンパク質量を測定し、この測定により得た総プロテインSの活性値と総プロテインSのタンパク質量とを、比活性を求める等により比較することにより、プロテインSの遺伝子の変異等のプロテインSの異常症を検出することが出来ることが確かめられた。
3.プロテインSの遺伝子変異(プロテインSの異常症)であることが判明している試料の比較
前記Iの2の(2)~(4)のプロテインSの遺伝子変異(プロテインSの異常症)であることが判明している試料(計9名の試料)のそれぞれについて、前記Iの本発明による総プロテインSの活性値の測定結果と、前記IIのラテックス比濁法による総プロテインSのタンパク質量の測定結果との比較を行う。
図2において、前記Iの2の(2)のプロテインSの遺伝子変異であるPS−K155Eヘテロ接合体(プロテインSの異常症の一つ)であることが判明している7名の血漿の試料を「●」で示した。
また、前記Iの2の(3)のプロテインSの遺伝子変異であるPS−K155Eホモ接合体(プロテインSの異常症の一つ)であることが判明している1名の血漿の試料を「◆」で示した。
そして、前記Iの2の(4)のプロテインSの遺伝子変異であるC206Fヘテロ接合体(プロテインSの異常症の一つ)であることが判明している1名の血漿の試料を「□」で示した。
プロテインSの遺伝子変異であることが判明しているこれらの9つの試料(●、◆及び□)はいずれも、前記の図2におけるy=0.69x(平均−3SD)の線よりも下に外れていることが分かる。
すなわち、プロテインSの遺伝子変異であることが判明しているこれらの9つの試料(●、◆及び□)はいずれも、総プロテインSの活性値を総プロテインSのタンパク質量で除した比活性が0.69以下であることが分かる。
つまり、これらの9つの試料は、総プロテインSの活性値と総プロテインSのタンパク質量が大きく乖離していることが分かる。
よって、試料中の総プロテインSの活性値及び試料中の総プロテインSのタンパク質量を測定し、この測定により得た総プロテインSの活性値と総プロテインSのタンパク質量とを、比活性を求める等により比較することにより、プロテインSの遺伝子の変異等のプロテインSの異常症を検出することが出来ることが、これらのプロテインSの遺伝子変異の9つの試料の比較結果からも確かめられた。
本発明の試料中の総プロテインSの活性測定試薬及び活性測定方法は、試料中に存在する全てのプロテインS〔C4b結合タンパク質との複合体(結合型)、及び遊離のプロテインS(遊離型)〕についてその活性を、すなわち、総プロテインSの活性を測定することが出来るものである。
よって、本発明により総プロテインS活性値を求めた試料について、別途総プロテインSのタンパク質量を求め、その試料におけるプロテインSの比活性(活性値/タンパク質量)を算出することにより、プロテインSの異常症を検出することができる。
すなわち、本発明の試料中の総プロテインSの活性測定試薬及び活性測定方法を用いることにより、プロテインSの異常症を検出し、血栓症等の疾患の予防、診断及び治療等に役立てることができる。
よって、本発明により総プロテインS活性値を求めた試料について、別途総プロテインSのタンパク質量を求め、その試料におけるプロテインSの比活性(活性値/タンパク質量)を算出することにより、プロテインSの異常症を検出することができる。
すなわち、本発明の試料中の総プロテインSの活性測定試薬及び活性測定方法を用いることにより、プロテインSの異常症を検出し、血栓症等の疾患の予防、診断及び治療等に役立てることができる。
Claims (12)
- 試料中の総プロテインSの活性を測定する方法であって、当該総プロテインS活性の測定反応時に、界面活性剤を存在させることを特徴とする、試料中の総プロテインSの活性測定方法。
- プロテインSによる活性化プロテインCの活性上昇反応時及び当該活性上昇した活性化プロテインCによる活性化血液凝固第V因子の分解反応時に、界面活性剤を存在させる、請求項1記載の試料中の総プロテインSの活性測定方法。
- 総プロテインS活性の測定反応時に、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンよりなるリン脂質を存在させる、請求項1又は請求項2記載の試料中の総プロテインSの活性測定方法。
- プロテインSによる活性化プロテインCの活性上昇反応時及び当該活性上昇した活性化プロテインCによる活性化血液凝固第V因子の分解反応時に、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンよりなるリン脂質を存在させる、請求項1~請求項3のいずれか1項に記載の試料中の総プロテインSの活性測定方法。
- 試料中の総プロテインS活性の測定が、次の(a)~(c)の工程を含む方法により行われるものである、請求項1~請求項4のいずれか1項に記載の試料中の総プロテインSの活性測定方法。
(a) 活性化プロテインC、界面活性剤、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第V因子、活性化血液凝固第X因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質を試料と接触させる。
(b) 次に、前記(a)の各成分による反応の結果トロンビンの基質から生成されるシグナル量を測定する。
(c) 次に、この試料に含まれる総プロテインSの活性に応じて生成が抑制されたシグナル量より、試料中に含まれていた総プロテインSの活性値を得る。 - 試料中の総プロテインS活性の測定が、次の(a)~(e)の工程を含む方法により行われるものである、請求項1~請求項5のいずれか1項に記載の試料中の総プロテインSの活性測定方法。
(a) 試料と、少なくとも活性化プロテインC、界面活性剤、リン脂質及びカルシウムイオンを接触させることにより、試料にプロテインSが含まれる場合には活性化プロテインCが活性上昇する。
(b) 次に、前記(a)の成分及び活性化血液凝固第V因子の存在下、活性化プロテインCが触媒する活性化血液凝固第V因子の分解反応が、前記(a)における活性化プロテインCの活性上昇により、促進される。
(c) 次に、活性化血液凝固第V因子により促進される、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下に活性化血液凝固第X因子が触媒するプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応が、前記(b)における活性化血液凝固第V因子の分解反応が促進されることにより抑制されて、トロンビンの生成が低減される。
(d) 次に、前記(c)におけるトロンビンの生成の低減により、トロンビンが触媒するトロンビンの基質からシグナルを生じさせる反応が抑制される。
(e) 次に、前記(d)における反応の抑制により生成が抑制されたシグナル量を測定することにより、試料中に含まれていた総プロテインSの活性値を得る。 - 活性化プロテインC、界面活性剤、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第V因子、活性化血液凝固第X因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質を含有する試料中の総プロテインSの活性測定試薬。
- 界面活性剤が、プロテインSによる活性化プロテインCの活性上昇反応時及び当該活性上昇した活性化プロテインCによる活性化血液凝固第V因子の分解反応時に存在させるものである、請求項7記載の試料中の総プロテインSの活性測定試薬。
- リン脂質が、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンよりなるリン脂質である、請求項7又は請求項8記載の試料中の総プロテインSの活性測定試薬。
- ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンよりなるリン脂質が、プロテインSによる活性化プロテインCの活性上昇反応時及び当該活性上昇した活性化プロテインCによる活性化血液凝固第V因子の分解反応時に存在させるものである、請求項7~請求項9のいずれか1項に記載の試料中の総プロテインSの活性測定試薬。
- 次の(a)~(c)の工程を含む試料中の総プロテインS活性の測定のためのものである、請求項7~請求項10のいずれか1項に記載の試料中の総プロテインSの活性測定試薬。
(a) 活性化プロテインC、界面活性剤、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第V因子、活性化血液凝固第X因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質を試料と接触させる。
(b) 次に、前記(a)の各成分による反応の結果トロンビンの基質から生成されるシグナル量を測定する。
(c) 次に、この試料に含まれる総プロテインSの活性に応じて生成が抑制されたシグナル量より、試料中に含まれていた総プロテインSの活性値を得る。 - 次の(a)~(e)の工程を含む試料中の総プロテインS活性の測定のためのものである、請求項7~請求項11のいずれか1項に記載の試料中の総プロテインSの活性測定試薬。
(a) 試料と、少なくとも活性化プロテインC、界面活性剤、リン脂質及びカルシウムイオンを接触させることにより、試料にプロテインSが含まれる場合には活性化プロテインCが活性上昇する。
(b) 次に、前記(a)の成分及び活性化血液凝固第V因子の存在下、活性化プロテインCが触媒する活性化血液凝固第V因子の分解反応が、前記(a)における活性化プロテインCの活性上昇により、促進される。
(c) 次に、活性化血液凝固第V因子により促進される、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下に活性化血液凝固第X因子が触媒するプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応が、前記(b)における活性化血液凝固第V因子の分解反応が促進されることにより抑制されて、トロンビンの生成が低減される。
(d) 次に、前記(c)におけるトロンビンの生成の低減により、トロンビンが触媒するトロンビンの基質からシグナルを生じさせる反応が抑制される。
(e) 次に、前記(d)における反応の抑制により生成が抑制されたシグナル量を測定することにより、試料中に含まれていた総プロテインSの活性値を得る。
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