WO2012104988A1 - 酵素及びその製造方法 - Google Patents

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WO2012104988A1
WO2012104988A1 PCT/JP2011/052005 JP2011052005W WO2012104988A1 WO 2012104988 A1 WO2012104988 A1 WO 2012104988A1 JP 2011052005 W JP2011052005 W JP 2011052005W WO 2012104988 A1 WO2012104988 A1 WO 2012104988A1
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enzyme
seq
plb
activity
amino acid
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PCT/JP2011/052005
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English (en)
French (fr)
Inventor
大助 杉森
優作 松本
Original Assignee
国立大学法人福島大学
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase

Definitions

  • the present invention relates to a novel phospholipase B and a method for producing the same.
  • Phospholipase B is an enzyme that acts on glycerol phospholipid to produce lysophospholipid or glycerol-3-phosphate ester compounds such as glycerol-3-phosphate or glycerol-3-phosphocholine.
  • C Known as 3.1.1.5.
  • Phospholipase is a general term for enzymes that hydrolyze phospholipids.
  • Phospholipids (glycerol phospholipids) have a fatty acid ester-bonded to one ⁇ -position (sn-1 position) and ⁇ -position (sn-2 position) of glycerol, and to the other ⁇ -position hydroxyl group. It is a compound in which choline, ethanolamine, inositol and the like are bonded via a phosphate group.
  • phospholipase A1 The enzyme that hydrolyzes the fatty acid ester bond at the ⁇ -position of the glycerol group in glycerol phospholipid is called phospholipase A1
  • phospholipase A2 The enzyme that hydrolyzes the fatty acid ester group at the ⁇ -position of the glycerol group is called phospholipase A2.
  • PLB phospholipase B
  • lysophospholipid a phospholipid from which only one of ⁇ -position or ⁇ -position fatty acyl group in phospholipid is removed is called lysophospholipid, and acts on lysophospholipid to hydrolyze the remaining fatty acid ester bond. Is also included in the PLB because the decomposition product is the same as in the case of the PLB. The action on lysophospholipid is called lysophospholipase activity.
  • PLC phospholipase C
  • PLD phospholipase D
  • PLB also has lysophospholipase activity, and its presence is known in animals and plants, Penicillium fungi, Escherichia coli, or yeast.
  • PLB has a strong activity against lysolecithin, but has a very weak effect on phospholipids, which are diacyl forms, and is not practical in terms of efficiently hydrolyzing ordinary phospholipids.
  • known PLB has only been reported to act widely on phospholipids such as phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine, or phosphatidylinositol, and has no substrate specificity (Non-patent Document 1). 2).
  • these known PLBs have extremely low productivity.
  • Non-patent Document High density lipoprotein cholesterol, generally referred to as good cholesterol
  • lysophosphatidylethanolamine has been reported to have a neuronal differentiation-inducing action and an action to protect neuronal cells from apoptosis (apoptosis suppression action) as a neuronal nutrient (Non-patent Document 5, 6).
  • apoptosis suppression action a neuronal nutrient
  • lysophosphatidylethanolamine has been found to have an activity of suppressing locomotor activity, a nerve activation effect, a cytoprotective effect, and a CNS calming effect. From these reports, lysophosphatidylethanolamine is expected to be used for the prevention and treatment of Alzheimer's disease that occurs after ischemic brain injury and neurological disorders such as neuronal cell death.
  • lysophosphatidylinositol has an antifungal action (Patent Document 1).
  • lysophosphatidic acid is known to have a vasoconstrictive action (Non-patent Document 7), a strong cell proliferation action and a DNA synthesis promoting action (Non-Patent Document 8).
  • lysophosphatidylserine has been reported to be involved in mast cell activation (allergy and atopic dermatitis) (Non-patent Document 7).
  • lysophosphatidylglycerol has been reported to have an excellent noodle modification action as a noodle modifier (Patent Document 2).
  • lysophosphatidylglycerol has a strong surface activity and is known to have a strong foaming action. For example, strengthening O / W emulsification with strong emulsifying power, improving thermal stability of O / W emulsions, forming emulsions with excellent storage stability, excellent binding properties with proteins and starches, antibacterial effects, excellent Moisturizing properties and antioxidative effects are known.
  • Soy lysolecithin has (1) strong O / W emulsifying properties, (2) high emulsion stability in the presence of acids and salts, and (3) excellent effect in binding to proteins and starch. It has been described that the demand has been increasing in recent years because it has such features as (4) excellent mold release action and the like (Patent Document 3).
  • Phosphatidylethanolamine is a component of phospholipids contained in soybean lecithin and egg yolk lecithin, and is known to have an emulsion stabilizing effect. Further, phosphatidylethanolamine present in egg yolk lecithin, in particular ⁇ -position (sn-2 position), is bound with a lot of unsaturated fatty acids, and when these unsaturated fatty acids are liberated, it becomes a source of bitterness. Therefore, in food processing, it can be said that it is desirable that hydrolysis of phosphatidylethanolamine does not occur. However, no enzyme suitable for this purpose has been found so far.
  • Patent Document 4 glycerol-3-phosphocholine is expected to prevent dementia.
  • Candida cylindrasse-derived phospholipase B is reported, and in this, the degradation action is due to lipase activity.
  • phospholipase B derived from Penicillium notatum and Dictiosrelium discoideum is also reported.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and an object thereof is to provide a novel PLB and a manufacturing method thereof.
  • the enzyme according to the present invention is selected from lysophospholipid, glycerol-3-phosphate, and glycerol-3-phosphate ester compounds by hydrolyzing the acyl groups at the sn-1 and sn-2 positions of the phospholipid.
  • polypeptides which is an enzyme that produces one or more of the following polypeptides (a) to (c): (A) a polypeptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2; (B) a polypeptide having an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, inserted, deleted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and exhibiting the hydrolysis activity; or ( c) A polypeptide having at least 75% homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and exhibiting the hydrolysis activity.
  • a preferred form of the above enzyme is that when dimyristoyl phosphatidic acid is used as a substrate, the hydrolysis activity under the condition of pH 8.4 and 37 ° C. for 5 minutes is 100%, and the pH is 7.2 to 10. It shows a hydrolysis activity of 50% or more within the range of 0.
  • a preferred form of the above enzyme is that when dimyristoyl phosphatidic acid is used as a substrate, the hydrolysis activity under the conditions of pH 8.4 and 50 ° C. for 5 minutes is 100%. Activity is 95% or more for phosphatidylcholine, 20% or more for phosphatidylinositol and phosphatidylglycerol, 25% or more for phosphatidylserine, and against sphingomyelin, phosphatidylethanolamine, tristearin and dipalmitoylglycerides It has a substrate specificity that is approximately 0%.
  • the isoelectric point calculated from the amino acid sequence is in the range of 6.2 to 6.6.
  • a preferred form of the above enzyme has a molecular weight in the range of 38,000 to 40,000 as measured by SDS-PAGE, and a molecular weight in the range of 41,000 to 43,000 as analyzed from the amino acid composition. It is.
  • the preferred form of the enzyme is derived from a microorganism belonging to the genus Streptomyces.
  • the polynucleotide according to the present invention is a polynucleotide encoding the above enzyme.
  • the preferable form of said polynucleotide contains the polynucleotide in any one of the following (a) to (c).
  • A a polynucleotide comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1;
  • B a polynucleotide that hybridizes with a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 1 under stringent conditions; or
  • the preferred form of the above polynucleotide is derived from a microorganism belonging to the genus Streptomyces.
  • the vector according to the present invention is a vector containing the above-described polynucleotide.
  • the transformant according to the present invention is one or more selected from phospholipids, lysophospholipids, glycerol-3-phosphate, and glycerol-3-phosphate compounds into which the above-described polynucleotide or the above-described vector is introduced. It is a transformant possessing the ability to produce an enzyme that produces.
  • a preferred form of the transformant is a microorganism in which the host of the transformant belongs to the genus Streptomyces.
  • the method for producing an enzyme according to the present invention acts on a phospholipid and hydrolyzes the phospholipid to select one or more selected from lysophospholipid, glycerol-3-phosphate, and glycerol-3-phosphate ester compound
  • a method for producing an enzyme that produces the enzyme wherein the polynucleotide or the vector described above is introduced into a host to obtain a transformant that produces the enzyme; And a step of producing an enzyme.
  • the host is a microorganism belonging to the genus Streptomyces.
  • a novel phospholipase B having a high enzyme activity Furthermore, a method for efficiently producing the enzyme by a microorganism can be provided. Thereby, a novel phospholipid processing agent having high PLB activity and having substrate specificity for phospholipid can be obtained without addition of a metal salt.
  • glycerol-3-phosphate compounds such as lysophospholipid, glycerol-3-phosphate, and glycerol-3-phosphocholine can be efficiently produced.
  • highly purified phosphatidylethanolamine, glycerol-3-phosphate, or glycerol-3-phosphocholine can be efficiently produced.
  • FIG. 2 is an electrophoresis photograph showing the results of SDS-PAGE analysis of a purified fraction obtained from a Streptomyces sp. Culture solution.
  • the enzyme is not limited to a purified enzyme, but includes a crude product, an immobilized product, and the like.
  • the enzyme is purified by a method well known to those skilled in the art, such as ammonium sulfate precipitation, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, etc., using a microorganism culture solution. Thereby, enzymes with various degrees of purification (including enzymes purified to approximately one) can be obtained.
  • microorganisms are wild strains, mutant strains (for example, those induced by ultraviolet irradiation, etc.), recombinants induced by genetic engineering techniques such as cell fusion or genetic recombination methods, etc. Any strain may be used.
  • Genetically engineered microorganisms such as recombinants are known to those skilled in the art, for example, as described in Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd edition (Sambrook, J. et al., Cold Spring Harbor Press, 1989). Can be easily created using various techniques.
  • the culture solution of microorganisms means both a culture solution containing microbial cells and a culture solution from which microbial cells have been removed by centrifugation or the like.
  • PLB phospholipase B
  • the enzyme that hydrolyzes the fatty acid ester bond at the ⁇ -position (sn-1 position) of the glycerol group in glycerol phospholipid is called phospholipase A1, and hydrolyzes the fatty acid ester group at the ⁇ -position (sn-2 position) of the glycerol group.
  • the enzyme is referred to as A2.
  • An enzyme having both phospholipase A1 activity and phospholipase A2 activity is referred to as phospholipase B (PLB). That is, PLB has enzyme activity at both the ⁇ -position and the ⁇ -position.
  • PLB is an enzyme that generates at least one, preferably all three of glycerol-3-phosphate compounds such as lysophospholipid, glycerol-3-phosphate, and glycerol-3-phosphocholine from phospholipid. It is.
  • the PLB activity can be confirmed, for example, as follows, but the confirmation method is not limited to this. Specifically, for example, PLB activity can be confirmed by measuring the amount of free fatty acid produced as a result of the enzyme reaction.
  • dimyristoyl phosphatidic acid manufactured by Funakoshi
  • 10 mL of 10% (w / v) Triton X-100 manufactured by Nacalai Tesque
  • 10% (w / V) Prepare dimyristoyl phosphatidic acid.
  • 0.025 mL of 0.2 M Tris-HCl buffer (pH 8.4) and 0.5 M EDTA disodium (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) )
  • Add 0.002 mL and 0.063 mL of distilled water 0.002 mL and 0.063 mL of distilled water.
  • the amount of free fatty acid contained in 5 ⁇ L of the reaction solution can be determined using, for example, “NEFA C Test Wako” (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), which is a free fatty acid measurement kit, according to the instructions attached to the kit. Measure as described.
  • the amount of enzyme that produces 1 ⁇ mol of free fatty acid per minute is defined as 1 unit.
  • the enzyme in the present invention is selected from lysophospholipid, glycerol-3-phosphate, and glycerol-3-phosphate ester compounds by hydrolyzing the acyl groups at the sn-1 and sn-2 positions of the phospholipid. It is an enzyme that produces one or more kinds, and includes the polypeptide described in any of (a) to (c) below.
  • A a polypeptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2;
  • B a polypeptide having an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, inserted, deleted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and exhibiting the hydrolysis activity; or
  • c A polypeptide having at least 75% homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and exhibiting the hydrolysis activity.
  • the above-mentioned enzymes include, as buffer solutions, acetic acid-sodium acetate buffer (pH 4.1-5.6), bistris-hydrochloric acid buffer (pH 5.6-7.2), Tris-hydrochloric acid buffer (pH 7. 2 to 8.8) and glycine-sodium hydroxide buffer (pH 8.8 to 10.5), when the above phosphatidic acid and the enzyme are put under reaction conditions, It may exhibit PLB activity at pH 4.1-10.5).
  • the optimum pH can be around pH 8 to 8.8.
  • the above enzyme is, for example, from pH 7.2 to pH 10 when the hydrolysis activity at pH 8.4 is 100% under the condition where dimyristoyl phosphatidic acid and enzyme are reacted at 37 ° C. for 5 minutes as described above. It is preferable that the activity is 50% or more within the range of 0.0.
  • the above enzyme can act at about 20 to 65 ° C. under the reaction conditions of dimyristoyl phosphatidic acid and the enzyme as described above, for example.
  • the optimum temperature can be within this range. Preferably it is in the range of about 37-60 ° C, more preferably in the range of 45-55 ° C, and even more preferably about 50 ° C.
  • the enzyme when the enzyme is treated with 160 mM Tris-hydrochloric acid buffer (pH 8.4) for 30 minutes, it can be stable with almost no decrease in activity from 4 ° C. to 45 ° C., and preferably, Even at 50 ° C., an activity of about 80% (for example, 75%) or more remains.
  • the enzyme when the above phospholipid and enzyme solution are placed under reaction conditions using Tris-HCl buffer (pH 8.4) as a buffer, the enzyme is not inhibited by 10 mM EDTA, and EDTA It is preferable to show almost the same activity as when no is added. Further, in the presence of 10 mM Ca 2+ , it is preferable to show about 90% activity (for example, about 85 to 95% activity). On the other hand, 10 mM Mg 2+ , Mn 2+ , Co 2+ , Cu 2+ , Zn 2+ , Fe 3+ , and Fe 2+ can inhibit the activity.
  • the enzyme When the enzyme and the substrate are reacted at 50 ° C. for 5 minutes under the condition of pH 8.4 as described above, the enzyme has a hydrolysis activity of 100% when dimyristoylphosphatidic acid is the substrate. Then, it has an activity of 95% or more for phosphatidylcholine (PC), 20% or more for phosphatidylinositol (PI) and phosphatidylglycerol (PG), and 25% or more for phosphatidylserine (PS). preferable.
  • PC phosphatidylcholine
  • PI phosphatidylinositol
  • PG phosphatidylglycerol
  • PS phosphatidylserine
  • the activity against sphingomyelin, phosphatidylethanolamine (PE), tristearin and dipalmitoyl glyceride is almost 0% (for example, 5% or less, 3% or less, or 1% or less, or below the detection limit). It is preferable. It is preferable to have such substrate specificity.
  • the above enzyme may vary slightly depending on electrophoresis conditions and the like, but the molecular weight in SDS-PAGE may be in the range of 38,000 to 40,000 (for example, about 39,000 or 38,900). preferable.
  • the enzyme preferably has a molecular weight calculated from the amino acid composition in the range of 41,000 to 43,000.
  • a natural enzyme derived from Streptomyces sp. NA684 strain has a molecular weight of about 39,000, specifically 38,900 in SDS-PAGE. In the natural enzyme derived from this Streptomyces sp. NA684 strain, the molecular weight calculated from its amino acid composition is about 42,000.
  • the above enzyme preferably exhibits an isoelectric point within the range of 6.2 to 6.6 (for example, 6.4).
  • the isoelectric point of the enzyme can be calculated from the amino acid sequence by GENETYX.
  • phospholipase B consists of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2.
  • Phospholipase B preferably has an amino acid sequence from position 31 to position 412 of SEQ ID NO: 2 (also referred to herein as “amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2”).
  • one or more amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 are substituted, deleted, inserted, and It may also be an enzyme having an added amino acid sequence.
  • site-directed mutagenesis Nucleic Acid® Res., 1982, 10, pp. 6487; Methods in Enzymol., 1983, 100, pp. 448; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY 1989; PCR: APPROCICAL Approach, IRL Press, 1991, pp.
  • amino acid mutations include not only artificially mutated enzymes but also naturally mutated enzymes as long as they have PLB activity in the above-mentioned enzyme (PLB).
  • a protein having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence having homology to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is also included in the enzyme (PLB) as long as it has PLB activity.
  • the PLB is preferably at least 75%, preferably at least 80%, more preferably at least 85%, even more preferably at least 75% of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2. It may be a protein having an amino acid sequence with 90%, even more preferably at least 95%, even more preferably at least 99% homology.
  • Protein homology (homology) search for example, databases related to amino acid sequences of proteins such as SWISS-PROT, PIR, DAD, or DNA databases such as DDBJ, EMBL, Gene-Bank, etc. BLAST, FASTA, etc. This program can be used, for example, via the Internet. Confirmation of the activity of the protein can be performed using the procedure described above.
  • PLB can be obtained from living cells such as microorganisms.
  • microorganisms include microorganisms belonging to the genus Streptomyces.
  • Streptomyces sp., Streptomyces chattanoogensis and Streptomyces lydicus are used. Since these strains are closely related, it is considered that PLB having the same kind of activity can be obtained.
  • Streptomyces sp. NA684 secretes the enzyme out of the cells by liquid culture in an appropriate nutrient medium.
  • a product treated with lyophilization, salting out, an organic solvent or the like can be produced as a PLB enzyme preparation.
  • Streptomyces attachattanoogensis NBRC12754 has the same activity as NA684 strain. Therefore, Streptomyces sp. NA684 and Streptomyces chattanogensis show similar activities.
  • the microorganism that can be used for the production of the PLB enzyme preparation is not limited to Streptomyces sp. NA684, and may be a microorganism belonging to the genus Streptomyces and capable of producing PLB.
  • natural or artificial mutants of these species or gene fragments necessary for the expression of PLB activity can be artificially extracted and used to produce PLB even in other species incorporating them. .
  • it can also be used.
  • this bacterium is secreted out of the bacterium by liquid culture in a nutrient medium, the culture supernatant is treated with lyophilization, salting out, an organic solvent, or the treated product is immobilized.
  • a suitable medium for example, a medium containing a suitable carbon source, nitrogen source, and inorganic salts to secrete the enzyme.
  • the carbon source include starch and starch hydrolysate, sugars such as glucose and sucrose, alcohols such as glycerol, and organic acids (for example, acetic acid and citric acid) or salts thereof (for example, sodium salt).
  • the nitrogen source examples include organic nitrogen sources such as yeast extract, peptone, meat extract, corn steep liquor, soybean flour, and inorganic nitrogen compounds such as ammonium sulfate, ammonium nitrate, and urea.
  • inorganic salts include sodium chloride, monopotassium phosphate, magnesium sulfate, manganese chloride, calcium chloride, and ferrous sulfate.
  • the concentration of the carbon source is, for example, in the range of 1 to 20% (w / v), preferably 1 to 10% (w / v).
  • the concentration of the nitrogen source is, for example, in the range of 1 to 20% (w / v), preferably 1 to 10% (w / v).
  • the culture temperature is preferably a temperature at which the above enzyme is stable and the cultured microorganism can sufficiently grow, and is preferably 20 to 37 ° C., for example.
  • the culture time is preferably a time during which the enzyme is sufficiently produced, for example, about 1 to 7 days. Culturing can be preferably performed under aerobic conditions, for example, with aeration stirring or shaking.
  • PLB is fractionated by protein solubility (precipitation with organic solvents, salting out with ammonium sulfate, etc.); cation exchange, anion exchange, gel filtration, hydrophobic chromatography; affinity chromatography using chelates, dyes, antibodies, etc. It can be purified by appropriately combining known methods such as graphy. For example, after recovering the culture supernatant of the microorganism, it can be purified by ammonium sulfate precipitation, further anion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, and / or cation exchange chromatography. Thereby, it can be purified to almost a single band in polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). That is, the enzyme (PLB) can be estimated as a monomer by HPLC analysis and gel filtration chromatography analysis.
  • SDS-PAGE polyacrylamide gel electrophoresis
  • the known PLB and the PLB described in Patent Document 4 have extremely low productivity, and can reach only 0.2 U / ml in the culture supernatant in the case of the Candida sylindrasse described in Patent Document 4. .
  • the polynucleotide in the present invention encodes the above-mentioned PLB.
  • This polynucleotide preferably includes the polynucleotide described in any of (a) to (c) below.
  • the above polynucleotide may be an artificial molecule including an artificial nucleotide derivative in addition to a natural polynucleotide such as DNA or RNA.
  • the polynucleotide may be a DNA-RNA chimeric molecule.
  • the polynucleotide encoding the PLB has, for example, a base sequence from position 1 to position 1239 of SEQ ID NO: 1 (also referred to as “base sequence described in SEQ ID NO: 1” in this specification).
  • the base sequence described in SEQ ID NO: 1 encodes a protein including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2, and the protein including this amino acid sequence constitutes a preferred form of PLB.
  • the above-mentioned polynucleotide encoding PLB includes an amino acid in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted, and / or added to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 as described above, and has PLB activity. Also included are polynucleotides that encode the proteins they have. A person skilled in the art may introduce substitution, deletion, insertion, and / or addition mutation as appropriate into the polynucleotide having the base sequence described in SEQ ID NO: 1 using the site-specific mutagenesis method (described above). Thus, it is possible to obtain a homologue of a polynucleotide.
  • polynucleotide encoding PLB is also a protein that can hybridize under stringent conditions with a polynucleotide having a base sequence complementary to the polynucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and has PLB activity Also included are polynucleotides encoding.
  • the polynucleotide is used to convert the target gene into the above microorganism, preferably a microorganism belonging to the genus Streptomyces, more preferably Streptomyces. It can be obtained from SP (Streptomyces sp.) NA684. PCR or hybridization screening can be used for obtaining the gene.
  • Polynucleotides can also be obtained by chemically synthesizing the full length of a gene by DNA synthesis. Moreover, based on said base sequence information, the polynucleotide which codes said PLB originating in organisms other than the above can also be acquired. For example, by designing a probe using the above-mentioned base sequence or a part of the base sequence and performing hybridization under stringent conditions on DNA prepared from other organisms, PLBs derived from various organisms can be obtained. The encoding polynucleotide can be isolated.
  • PCR primers are designed from regions with high homology using sequence information registered in DNA databases such as DNA Databank of Japan (DDBJ), EMBL, and Gene-Bank. You can also By using such primers and performing PCR using chromosomal DNA or cDNA as a template, the polynucleotide encoding the PLB can also be isolated from various organisms. Similarly, the polynucleotide encoding the PLB can be isolated from various organisms by performing PCR using DNA or RNA extracted from the environment as a template.
  • the polynucleotide capable of hybridizing under stringent conditions is a sequence of at least 20, preferably at least 30, for example, 40, 60, or 100 consecutive sequences in the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
  • the probe is designed by selecting one or more, and includes the conditions described in the manual (for example, cleaning conditions: 42 ° C., 0.5 ⁇ SSC) using, for example, ECL directic acid labeling and detection system (manufactured by GE Healthcare) In primary wash buffer), it refers to a hybridizing polynucleotide.
  • the “stringent conditions” are usually conditions of 42 ° C., 2 ⁇ SSC, 0.1% SDS, preferably 50 ° C., 2 ⁇ SSC, 0.1% 0.1 SDS. More preferably, the conditions are 65 ° C., 0.1 ⁇ SSC, and 0.1% SDS, but are not particularly limited to these conditions.
  • the above-mentioned polynucleotide encoding PLB is at least 75%, preferably at least 80%, more preferably at least 85%, even more preferably at least 90%, even more preferably the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2.
  • the protein homology search is as described above.
  • the polynucleotide encoding the PLB is at least 75%, preferably at least 80%, more preferably at least 85%, even more preferably at least 90%, and even more preferably the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1. Also included are polynucleotides that have a base sequence with at least 95%, even more preferably at least 99% sequence identity, and encode a protein having PLB activity. The determination and search of the sequence identity of the base sequence is also as described above.
  • the polynucleotide encoding the above PLB can be expressed in the same or different host using genetic recombination technology.
  • the vector in the present invention contains the above-mentioned polynucleotide.
  • any of glycerol-3-phosphate ester compounds such as lysophospholipid, glycerol-3-phosphate, and glycerol-3-phosphocholine acts on phospholipids by introducing a polynucleotide or a vector into a host.
  • a transformant possessing the ability to produce an enzyme that produces one or more can be made.
  • the procedure for producing a transformant and the construction of a recombinant vector suitable for the host can be performed according to techniques commonly used in the fields of molecular biology, biotechnology, and genetic engineering (for example, Sambrook et al. , Molecular Cloning: Laboratory Manual 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989). In particular, for actinomycetes, it can be performed with reference to “PRACTICAL STREPTOMYCES GENETICS (Kieser et al., John Inns Foundation, 2000)”.
  • this DNA is first introduced into a plasmid vector or a phage vector stably existing in the microorganism, and the genetic information is transcribed and translated. Therefore, it is preferable to incorporate a promoter corresponding to a unit for controlling transcription / translation 5 'upstream of the DNA strand. Further, it is preferable to incorporate a terminator, which is a unit for controlling transcription / translation, downstream of the 3 ′ side of the DNA strand. More preferably, both the promoter and terminator are incorporated at each site. As the promoter and terminator, a promoter and terminator known to function in microorganisms used as hosts are used.
  • the host to be transformed is not particularly limited as long as it is an organism that can be transformed with a vector containing a polynucleotide encoding PLB and express PLB activity.
  • bacteria, actinomycetes, Bacillus subtilis, Escherichia coli, yeast, mold and the like can be mentioned.
  • the genus Escherichia the genus Bacillus, the genus Pseudomonas, the genus Serratia, the genus Brevibacterium, the genus Corynebacterium, Bacteria for which host vector systems such as Streptococcus and Lactobacillus are developed; Actinomycetes for which host vector systems such as Rhodococcus and Streptomyces are developed; Saccharomyces (Saccharomyces) Saccharomyces), Kluyveromyces, Shizosa S.
  • genus Schizosaccharomyces genus Zygosaccharomyces, genus Yarrowia, genus Trichosporon, genus Rhodosporidium, genus Rhodospodium, genus C And yeasts that have been developed for host vector systems such as the genus Neurospora, the genus Aspergillus, the genus Cephalosporum, the genus Trichoderma, and the like.
  • Escherichia coli is preferred for ease of gene recombination, and actinomycetes are preferred for ease of gene expression.
  • insects such as moths (Nature 315, 592-594 (1985)), rapeseed, corn, potatoes, and other plants in large quantities.
  • Systems for expressing heterologous proteins have been developed, and these may be used.
  • the obtained transformant can be used for production of an enzyme preparation (PLB) as described above. Specifically, the transformant is cultured in a liquid in an appropriate nutrient medium, the expressed PLB is secreted outside the cell, and the culture supernatant is treated with lyophilization, salting out, an organic solvent, etc. Can be manufactured.
  • PLB enzyme preparation
  • the culture conditions may vary, but the culture can be performed under conditions commonly used by those skilled in the art.
  • an actinomycete such as Streptomyces
  • a tryptic soy medium containing thiostrepton for example, manufactured by Becton Dickinson
  • the enzyme produced by the transformant can be further purified as described above.
  • PLB PLB manufactured by Asahi Kasei Pharmatech
  • PLB has lipase activity
  • the above-mentioned PLB does not have lipase activity. From this, it acts on neutral lipids (glycerides) contained in foods and the like, and does not deteriorate food quality, and can act only on phospholipids. As a result, it can be expected to further improve food quality.
  • the usable temperature range is wider than that of the conventional PLB.
  • a high temperature treatment is possible because it shows considerable activity even at 60 ° C. or higher. Therefore, reaction control is easy and a wide range of applications can be expected.
  • the above-mentioned PLB is not easily inhibited by a reducing agent, an inhibitor, a surfactant or the like. Therefore, it is easy to control the reaction.
  • the stable pH of the conventional PLB (PLB manufactured by Asahi Kasei Pharmatech) is pH 5 to 9, whereas the stable pH of the above-mentioned PLB is pH 4 to 10.5. Therefore, handling is easy.
  • the conventional PLB (PLB manufactured by Asahi Kasei Pharmatech) has a stable temperature of 55 ° C., whereas the above-mentioned PLB has a stable temperature of 45 to 50 ° C. Therefore, it is possible to deactivate the enzyme at a lower temperature.
  • PLB can decompose cell membranes. PLB then lyses the cells. Therefore, it can be used for cell degrading agents or cell lysing agents including detergents such as egg yolk stains and blood stains.
  • lysophospholipids are extremely excellent in emulsifying properties, they become emulsifiers or surfactants that can be used in various fields.
  • lysophospholipids have been discovered as various physiological functions in recent years, and thus can be used as pharmaceuticals and supplements. Therefore, various high-functional lysophospholipids can be produced using the above-mentioned PLB.
  • lysolecithin, glycerol-3-phosphocholine, or the like By adding PLB to flour such as bread dough or noodle dough, the phospholipid originally contained in the flour is converted to lysolecithin, glycerol-3-phosphocholine, or the like.
  • the formation of lysolecithin, glycerol-3-phosphocholine, etc. in the dough helps to form a gluten network structure by binding to proteins and starch, improves the physical properties of bread and noodles, and prevents aging.
  • Cyclic phosphatidic acid having excellent properties and effects as a cosmetic material can be produced from lysophospholipid. Therefore, cyclic phosphatidic acid can be efficiently produced by using the PLB.
  • Glycerol-3-phosphocholine is expected to prevent dementia.
  • Other glycerol-3-phosphate compounds can be expected to have high functions. Therefore, the above PLB can produce a highly functional glycerol-3-phosphate ester.
  • Glycerol-3-phosphate is a glycolytic metabolic intermediate. Therefore, the above PLB can produce glycerol-3-phosphate having a possibility of enhancing metabolism.
  • PLB activity standard measurement method This method illustrates the case where dimyristoyl phosphatidic acid is used as a substrate.
  • Dimyristoylphosphatidic acid 1 g (manufactured by Funakoshi) was dissolved in 10 mL of 10% (w / v) Triton X-100 (manufactured by Nacalai Tesque) to prepare 10% (w / v) dimyristoylphosphatidic acid. did. To 0.005 mL of this 10% (w / v) dimyristoylphosphatidic acid, 0.025 mL of 0.2 M Tris-HCl buffer (pH 8.4) and 0.5 M EDTA disodium (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) ) 0.002 mL and 0.063 mL of distilled water were added.
  • Example 1 Purification of an enzyme derived from Streptomyces sp.
  • A Culture NB medium “1% peptone (Becton Dinkinson), 1% meat extract (Kyokuto Pharmaceutical Co., Ltd.), 0.5% sodium chloride (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) , PH 7.2 ", 300 mL, dispense 100 ml into a 500 mL Erlenmeyer flask, add 1% soybean lecithin and 0.1% Tween 80, and steam sterilize at 121 ° C for 15 minutes. went. A suitable amount of a colony of Streptomyces sp.
  • NA684 previously grown on a flat plate medium was taken and placed in a ⁇ 18 test tube (18 ⁇ 180 mm) containing 5 mL of tryptic soy medium (Becton Dinkinson). Inoculated and cultured with shaking at 28 ° C. until good growth was obtained. 1 ml of this culture solution was inoculated into 100 mL of the previously sterilized medium and cultured with shaking at 28 ° C. for 108 hours. The supernatant was recovered from this culture using a centrifuge.
  • FIG. 1 is an electrophoresis photograph showing the results of analysis by SDS-PAGE of the eluted fraction.
  • Lane 1 (left side of the figure) is a molecular weight marker, and lane 2 (right side of the figure) shows a band of the eluted fraction. As shown in FIG. 1, a single band was observed in the elution fraction.
  • an electrophoretically purified enzyme was obtained from the Streptomyces sp. NA684 strain.
  • This enzyme was estimated to be a monomer by HPLC analysis and gel filtration chromatography analysis.
  • Example 2 Measurement of properties of enzyme derived from Streptomyces sp.] (PLB activity)
  • the purified enzyme obtained in Example 1 and 1-palmitoyl-2-oleoylphosphatidinecholine as a substrate were subjected to an enzymatic reaction under the reaction conditions of “PLB activity standard measurement method”.
  • reaction solution was extracted with chloroform / methanol (2/1, v / v).
  • the extract was analyzed by gas chromatography and the fatty acid produced by hydrolysis was quantitatively analyzed to confirm that it had PLB activity.
  • FIG. 2 is a graph showing enzyme activities at various reaction pHs as relative activities based on the enzyme activity when the reaction pH is 8.4 (100%). As can be seen from the graph of FIG. 2, this enzyme showed an activity having a relative activity of 50% or more with respect to the maximum activity (100%) in a wide range from pH 7.2 to pH 10.0.
  • FIG. 3 is a graph showing enzyme activities at various reaction temperatures as relative activities based on the activity (100%) when the reaction temperature is 50 ° C. As shown in the graph of FIG. 3, this enzyme exhibited activity at 20 to 65 ° C., and the optimum temperature for the reaction was around 50 ° C. (eg, 45 to 55 ° C.).
  • FIG. 4 is a graph showing the residual activity of the enzyme after treatment at various temperatures. As shown in the graph of FIG. 4, after the treatment at a temperature from 4 ° C. to 45 ° C., 90% or more of the enzyme remained before the treatment. After the treatment at 50 ° C., an activity of about 80% (about 75 to 80%) before the treatment remained.
  • the remaining activity during the treatment of the purified enzyme obtained in Example 1 in 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.4) at 37 ° C. for 60 minutes was determined according to the method of “PLB activity standard measurement method” described above. Dimyristoyl phosphatidic acid was used as a substrate and measured at 50 ° C. for 5 minutes at pH 8.4. Based on the enzyme activity before the temperature treatment (100%) as a reference (100%), the residual activity was shown as the residual ratio of the enzyme activity after each time treatment (every 10 minutes).
  • FIG. 5 is a graph showing the residual activity of the enzyme after treatment at various times. As shown in the graph of FIG. 5, this enzyme remained at the same level of activity as before the treatment even at the temperature of 37 ° C. even after the treatment for 60 minutes.
  • FIG. 6 is a graph showing the residual activity of the enzyme after treatment at various pHs. As shown in the graph of FIG. 6, this enzyme remained active from pH 4.1 to 10.5.
  • Table 1 shows the results of relative activities with various additives added, assuming that the condition with 10 mM EDTA added is 100%.
  • the enzyme obtained in Example 1 has 10 mM EDTA, 2 mM iodoacetamide, 2-mercaptoethanol, PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride), and almost the same activity as when not added without being inhibited by SDS. Indicated. In addition, in the presence of calcium ions (10 mM Ca 2+ ), the activity was about 90%.
  • Substrate specificity PLB activity was measured according to the method of “PLB activity standard measurement method” described above, except that various phospholipids were used as substrates instead of dimyristoylphosphatidic acid.
  • Table 2 shows the results of relative activity when dimyristoylphosphatidic acid is used as a substrate and the hydrolysis activity at 100 ° C. for 5 minutes at 50 ° C. at pH 8.4.
  • the enzyme obtained in Example 1 exhibited substrate specificity as shown in Table 2.
  • Example 3 Analysis of N-terminal amino acid sequence of enzyme derived from Streptomyces sp.
  • the N-terminal amino acid sequence was analyzed with a protein sequencer.
  • the internal amino acid sequence was analyzed by nanoLC-MS / MS. From the analysis, it was confirmed that the N-terminal amino acid sequence of this purified enzyme was as shown in SEQ ID NO: 3.
  • the internal amino acid sequences were confirmed to be those shown in SEQ ID NOs: 4, 5, and 6.
  • SEQ ID NO: 3 is a sequence shown from position 31 of SEQ ID NO: 2 (positions 1 to 30 are secretory signal sequences that have been removed by the mature (purified) enzyme).
  • SEQ ID NO: 4 is the sequence shown from position 187 of SEQ ID NO: 2.
  • SEQ ID NO: 5 is the sequence shown from position 327 of SEQ ID NO: 2.
  • the amino acid at position 335 in SEQ ID NO: 2, that is, the amino acid at position 9 in SEQ ID NO: 5 does not match because Leu and Ile could not be distinguished by de novo amino acid sequence analysis by nanoLC-MS / MS.
  • SEQ ID NO: 6 is the sequence shown from position 145 of SEQ ID NO: 2.
  • Streptomyces sp. NA684 is added to YEME medium (0.3% yeast extract, 0.5% peptone, 0.3% malt extract, 1% glucose, 34% sucrose, 5 mM MgCl 2 , 0 0.5% glycine) was cultured at 28 ° C. for 4 days and collected.
  • the cells were then suspended in 5 ml of a solution consisting of 75 mM NaCl, 25 mM EDTA, 20 mM Tris-hydrochloric acid (pH 7.5) and 1 mg / ml lysozyme and treated at 37 ° C. overnight.
  • 750 ⁇ l of 10% (w / v) SDS and 5 mg of proteinase K were added and treated at 55 ° C. for 2 hours.
  • 7.5 ml of chloroform was added and stirred, and 5 ml of the aqueous phase was collected by centrifugation.
  • the DNA fraction was collected by adding 3 ml of isopropanol to this aqueous phase, and dissolved in 500 ⁇ l of a solution consisting of 10 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) and 1 mM EDTA.
  • RNase A was added to 20 ⁇ g / ml, treated at 37 ° C. for 1 hour, 500 ⁇ l of 13% PEG solution containing 0.8 M NaCl was added and stirred, and 500 ⁇ l of the aqueous phase was collected by centrifugation. did. 500 ⁇ l of a phenol / chloroform mixed solution was added thereto and stirred, and 500 ⁇ l of an aqueous phase was collected by centrifugation.
  • This DNA was immersed in 70% (v / v) ethanol for 10 minutes, and then dissolved in 200 ⁇ l of a solution composed of 10 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) and 1 mM EDTA.
  • Example 5 Cloning of core region of PLB gene derived from Streptomyces sp. NA684
  • degenerate oligonucleotide primer for PCR S1 sense primer “primer S1” (SEQ ID NO: 7)
  • A1 antisense primers “Primer A1-1” (SEQ ID NO: 8), “primer A1-2” (SEQ ID NO: 9), and “primer A1-3” (SEQ ID NO: 10) were designed.
  • s in the sequence represents c or g
  • w represents a or t
  • k represents g or t.
  • the PCR reaction solution composition is as follows.
  • Distilled water was added to 50 ⁇ l of template chromosomal DNA 50 ng, 2 ⁇ MightyAmp Buffer 25 ⁇ L obtained in Example 4, 300 nM of each primer, and MightyAmp DNA Polymerase 1.25 unit.
  • PCR reaction conditions are as follows.
  • Step 1 98 ° C., 2 minutes
  • Step 2 98 ° C., 10 seconds
  • Step 3 66 ° C., 30 seconds
  • Step 4 66 ° C., 1 minute 30 seconds.
  • a specific amplification product of about 500 bp was obtained by PCR using SEQ ID NOs: 7 to 10.
  • the PCR reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, and the target 500 bp band was excised and bound to pGEM-T Easy Vector using pGEM-T Easy Vector System I (Promega) to transform E. coli.
  • the transformed strain is cultured in LB medium (tryptone 1%, yeast extract 0.5%, sodium chloride 0.4%, pH 7.2) containing ampicillin 50 ⁇ g / ml, and using Miniprep DNA Purification Kit (TaKaRa). Plasmid for DNA sequencing was extracted and purified.
  • the base sequence of the inserted fragment was determined by an automatic sequencer using T7 primer and SP6 primer derived from a vector (pGEM-T Easy Vector). This base sequence is shown in SEQ ID NO: 11.
  • Example 6 Cloning around the core region of the PLB gene derived from Streptomyces sp.
  • a DNA fragment including the upstream side and the downstream side was amplified by inverse PCR.
  • the chromosomal DNA obtained in Example 4 was completely digested with SalI, and Ligation high Ver. 2 (manufactured by Toyobo Co., Ltd.). Using this as a template, Inverse PCR using sense primer SE1 “primer SE1” (SEQ ID NO: 12) and antisense primer AN1 “primer AN1” (SEQ ID NO: 13) prepared based on the partial gene sequence of phospholipase B Went.
  • the PCR reaction solution composition is as follows.
  • Distilled water was added to a template DNA of 200 ng, 2 ⁇ MightyAmp Buffer 25 ⁇ l, each primer 300 nM, and MightyAmp DNA Polymerase 1.25 unit to a total volume of 50 ⁇ l.
  • PCR reaction conditions are as follows.
  • Step 1 98 ° C., 2 minutes
  • Step 2 98 ° C., 10 seconds
  • Step 3 68 ° C., 5 minutes
  • Step 4 68 ° C., 2 minutes.
  • the base sequence of the region containing the Streptomyces sp.-derived PLB gene was determined (upper sequence number 14). . Further, the amino acid sequence of the structural gene portion was deduced from the base sequence (lower part of SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15).
  • FIG. 7A and FIG. 7B (hereinafter collectively referred to as FIG. 7) show the determined nucleotide sequence of the region containing the PLB gene and the deduced amino acid sequence of the structural gene deduced from this nucleotide sequence.
  • the base sequence and the deduced amino acid sequence are shown at the bottom. 7 is the DDBJ ACCESSION No. It has been registered privately as AB602789.
  • the structural gene encoding PLB consists of 1,146 bp nucleotides (1,149 bp including the stop codon) and encodes 382 amino acids. It was. These 382 residues are positions 31 to 412 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 (FIG. 7). Positions 1 to 30 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 (FIG. 7) are a secretory signal sequence.
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 is the sequence shown from position 31 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 (FIG. 7).
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 is the sequence shown from position 187 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 (FIG. 7).
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 is the sequence shown from position 327 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 (FIG. 7).
  • the amino acid “Ile” at position 335 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 (FIG. 7) is “Leu” at the amino acid at position 9 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 is the sequence shown from position 145 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 (FIG. 7).
  • sequence similarity search programs BLAST and FASTA the above-mentioned deduced amino acid sequences were compared with sequences in four protein sequence databases (PTR, PRF, UNI-PROT and SWISS-PROT).
  • PTR, PRF, UNI-PROT and SWISS-PROT sequence similarity search programs
  • the deduced amino acid sequence was 44% identical with Streptomyces sp.
  • C Putative uncharacterized protein (DDBJ ACCESSION No. D9VPC7).
  • the purified enzyme derived from Streptomyces sp. (Ie, PLB) was calculated based on the amino acid composition of this deduced amino acid sequence, and was estimated to have a molecular weight of about 42,000.
  • Example 7 Production of recombinant plasmid containing PLB gene derived from Streptomyces sp.
  • a recombinant plasmid used for transformation was prepared.
  • a sense primer S2 “primer S2” (SEQ ID NO: 16) in which an NheI site is added to the upstream region of the structural gene of Streptomyces sp. Derived PLB, and the downstream region of this structural gene
  • An antisense primer A2 “primer A2” (SEQ ID NO: 17) to which a BglII site was added was designed.
  • PCR was performed using these primers with the chromosomal DNA obtained in Example 4 as a template.
  • the PCR reaction solution composition is as follows.
  • Template chromosomal DNA 200 ng, 10 ⁇ PCR buffer 15 ⁇ l, primer 500 nM each, dNTP mixture 0.3 mM, MgCl 2 1.25 mM, DMSO 3%, and KOD DNA Polymerase 2.5 units so that the total volume of distilled water is 50 ⁇ l Added to.
  • PCR reaction conditions are as follows.
  • Step 1 98 ° C., 2 minutes; Step 2: 98 ° C., 15 seconds; Step 3: 65 ° C., 2 seconds; Step 4: 74 ° C., 30 seconds; Repeat steps 2 to 4 for 30 cycles; Step 5: 74 ° C., 1 minute 30 seconds.
  • a specific amplification product of about 1200 bp was obtained by this PCR.
  • the amplified fragment was digested with NheI and BglII and inserted into the NheI-BglII site of the actinomycete plasmid as an expression vector to obtain a recombinant plasmid.
  • the signal sequence and terminator are those of the phospholipase enzyme gene, but those derived from other genes may be used in appropriate combination.
  • Example 8 Production of recombinant actinomycetes expressing PLB gene derived from Streptomyces sp.
  • Example 9 Measurement of enzyme activity of recombinant actinomycetes expressing phospholipase B gene derived from Streptomyces sp.
  • the recombinant actinomycete obtained in Example 8 was cultured in 100 mL tryptic soy medium (Becton Dickinson) containing 20 ⁇ g / mL thiostrepton. The supernatant was collected from the obtained culture broth by centrifugation (15000 rpm, 5 minutes, 4 ° C.), and ammonium sulfate was added so as to be 80% (w / v) saturation. The mixture was left at 4 ° C.
  • the enzyme activity of this enzyme solution was measured at 50 ° C. at pH 8.4 using dimyristoyl phosphatidic acid as a substrate according to the enzyme activity measurement method described in “PLB activity standard measurement method” above. As a result, a culture supernatant showing strong activity exceeding 100 U / ml (lower limit is 60 U / ml) was obtained. Moreover, the enzyme activity (15 ml) after dialysis showed a stronger activity (more than 770 U / ml). In addition, PLB activity was not detected in actinomycetes transformed using the plasmid as a vector as it was.
  • Streptomyces sp. NA684 used in the above Examples was identified by the results of physiological property tests and 16S rDNA base sequence analysis based on the base sequence.
  • Glycerol-3-phosphate compounds such as lysophospholipid, glycerol-3-phosphate, and glycerol-3-phosphocholine produced by allowing PLB to act on phospholipids are useful as a base material for food and cosmetics.
  • the enzyme according to the present invention can act well on phospholipids other than PE, particularly on PA and PC. If the property that hardly acts on PE is used, it is possible to leave only PE from the crude phospholipid and increase its purity. As a result, it can be expected to produce highly pure PE.
  • lysophosphatidylinositol is an antifungal agent
  • lysophosphoglycerol LPG
  • LPG lysophosphoglycerol
  • LPE lysophosphatidylethanolamine
  • LPA lysophosphatidic acid
  • LPS lysophosphatidylserine
  • Glycerol-3-phosphocholine that can be produced using the enzyme according to the present invention is expected to prevent dementia.
  • Glycerol-3-phosphoinositol can be expected to be useful because it has an effect of increasing good cholesterol.
  • NITE BP-1015 National Institute for Product Evaluation Technology Patent Microorganism Depositary (NPMD) Name of depositary institution: Japan 2-5-8 Kazusa Kamashitsu, Kisarazu City, Chiba Prefecture 292-0818, Japan Date of deposit: January 26, 2011 Deposit number: NITE BP-1015

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Abstract

　新規なＰＬＢおよびその製造方法を提供する。　リン脂質のｓｎ－１位およびｓｎ－２位のアシル基を加水分解して、リゾリン脂質、グリセロール－３－リン酸、及び、グリセロール－３－リン酸エステル化合物から選ばれる１種以上を生成する酵素であって、次の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のポリペプチドを含む酵素である。（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド；（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列を有し、かつ該加水分解活性を示すポリペプチド；または、（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも７５％の相同性を有し、かつ該加水分解活性を示すポリペプチド。酵素活性の高い新規なホスホリパーゼＢを提供できる。リン脂質に対して基質特異性を有する。

Description

酵素及びその製造方法
　本発明は、新規なホスホリパーゼＢおよびその製造方法に関する。
　ホスホリパーゼＢは、グリセロールリン脂質に作用し、リゾリン脂質あるいはグリセロール－３－リン酸ないしグリセロール－３－ホスホコリンなどのグリセロール－３－リン酸エステル化合物を生成する酵素であり、酵素番号Ｅ．Ｃ．３．１．１．５として知られている。ホスホリパーゼはリン脂質を加水分解する酵素の総称である。リン脂質（グリセロールリン脂質）は、グリセロールの一方のα位（ｓｎ－１位）及びβ位（ｓｎ－２位）のヒドロキシル基に脂肪酸がエステル結合しており、他方のα位のヒドロキシル基にリン酸基を介してコリン、エタノールアミン、イノシトール等が結合している化合物である。
　グリセロールリン脂質におけるグリセロール基のα位の脂肪酸エステル結合を加水分解する酵素をホスホリパーゼＡ１と称し、グリセロール基のβ位の脂肪酸エステル基を加水分解する酵素をホスホリパーゼＡ２と称する。また、ホスホリパーゼＡ１活性及びホスホリパーゼＡ２活性を併有する酵素をホスホリパーゼＢ（ＰＬＢ）と称する。
　また、リン脂質中のα位又はβ位の脂肪酸アシル基のうち、一方のみが除去されたリン脂質をリゾリン脂質と称し、リゾリン脂質に作用して、残っている脂肪酸エステル結合を加水分解する酵素も、分解生成物が前記ＰＬＢの場合と同じであるため、ＰＬＢに含められる。なお、リゾリン脂質への作用は、リゾホスホリパーゼ活性と称せられる。
　他方、リン脂質のグリセロール基とリン酸基との間のエステル結合を加水分解する酵素をホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）と称する。また、リン酸基とコリンやエタノールアミン等との間の結合を加水分解する酵素をホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）と称する。
　上記のようにＰＬＢはリゾホスホリパーゼ活性も併せ持っており、動植物やペニシリウム属の糸状菌、大腸菌、又は酵母などにその存在が知られている。しかしながら、ＰＬＢは、リゾレシチンに対する活性は強い一方でジアシル体であるリン脂質に対する作用は極めて弱く、通常のリン脂質を効率よく加水分解する点においては実用的でなかった。また、公知のＰＬＢはホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、又はホスファチジルイノシトール等のリン脂質に幅広く作用することが報告されているのみであり、基質特異性を有するものではなかった（非特許文献１、２）。さらに、これら既知のＰＬＢは生産性が極めて低いものであった。
　ホスファチジルイノシトールは、大豆レシチンに含まれるものであり、細胞の情報伝達と深く関与していることが数多く報告されてきた。近年、ホスファチジルイノシトールの摂取が血中のトリアシルグリセロール（ＴＧ）濃度を減少させ、ＨＤＬ－Ｃ（高比重リポタンパク質コレステロール、一般に言う善玉コレステロール）濃度を上昇させることが報告されている（非特許文献３、４）。そのため、その代謝誘導体であるリゾホスファチジルイノシトールおよびグリセリルホスフォリルイノシトールと共にその生理作用が注目されている。
　また、リゾホスファチジルエタノールアミンは、神経細胞栄養物質として、神経細胞の分化誘導作用、および、神経細胞をアポトーシスから保護する作用（アポトーシス抑制作用）を持つことが報告されている（非特許文献５、６）。この他にも、リゾホスファチジルエタノールアミンには、移所運動活性抑制作用、神経活性化作用、細胞保護作用、中枢神経沈静化作用が認められたことが報告されている（非特許文献６）。これらの報告より、リゾホスファチジルエタノールアミンは、虚血性脳障害後に起こるアルツハイマー病や、神経細胞死のような脳神経系の障害に対する予防や治療に期待されている。
　さらに、リゾホスファチジルイノシトールは抗カビ作用を持つことも報告されている（特許文献１）。また、リゾホスファチジン酸は、血管収縮作用（非特許文献７）や、強い細胞増殖作用とＤＮＡ合成促進作用があることが知られている（非特許文献８）。また、リゾホスファチジルセリンは、肥満細胞の活性化（アレルギーやアトピー性皮膚炎）に関与していることが報告されている（非特許文献７）。また、リゾホスファチジルグリセロールは、麺類改質剤として優れた麺の改質作用を有することが報告されている（特許文献２）。この他にも、リゾホスファチジルグリセロールには強い界面活性作用があり、強い起泡作用を有することが知られている。例えば、強力な乳化力によるＯ／Ｗ乳化の強化、Ｏ／Ｗ系エマルションの熱安定性の向上、保存性に優れたエマルションの形成、蛋白質や澱粉との優れた結合性、抗菌効果、優れた保湿性、抗酸化作用が知られている。
　大豆リゾレシチンは、（１）Ｏ／Ｗ乳化性が強い、（２）酸性下及び塩類存在下でのエマルジョン安定性が高い、（３）蛋白質との結合や澱粉との結合能で優れた効果を発揮する、（４）離型作用が優れている、等の特徴を有しているところから、近年、その需要が高まっていることが記載されている（特許文献３）。
　ホスファチジルエタノールアミンは、大豆レシチンや卵黄レシチンなどに含まれるリン脂質の一成分であり、乳化物の安定化作用があることが知られている。また、卵黄レシチンに存在するホスファチジルエタノールアミンの、特にβ位（ｓｎ－２位）には、不飽和脂肪酸が多く結合しており、この不飽和脂肪酸が遊離すると苦みの素となる。したがって、食品加工においては、特にホスファチジルエタノールアミンの加水分解は生じないことが望ましいと言える。しかしながら、これまでにこの目的に適した酵素は見出されていない。
　また、グリセロール－３－ホスホコリンは、認知症予防などが期待されている（特許文献４）。この特許文献４では、キャンディダ・シリンドラッセ由来ホスホリパーゼＢが報告されているが、このものにおいて分解作用はリパーゼ活性によるものである。また、この文献で、その他に、ペニシリウム・ノタツムとジクティオスレリウム・ディスコイデウム由来のホスホリパーゼＢも報告されている。
　しかしながら、これらのホスホリパーゼＢはすべて糸状菌由来のもので、培養液中への酵素生産に時間を要するといった問題点や、得られる酵素の力価（生産量）が低いなどの問題点がある。さらに、これらの酵素は糸状菌由来であるが故に、その作用ｐＨが酸性域に偏っているため、食品工業などの分野への利用に適していない。
特開平６－２５６３６６号公報 特開２００８－１１７４５号公報 特開平１０－２８７６８６号公報 国際公開第２００７／０１０８９２号
Biochimica BiophysicaActa (1974) 369, 245-253 Biochimica BiophysicaActa (1975) 403, 412-424 Biochem. J (2004) 382, 441-449 Jim W. Burgessら、Journal of Lipid Research(46) 350-355 関口昭博、仁科淳良、群馬産業技術センター研究報告23-28（２００６） 関口昭博、仁科淳良、群馬産業技術センター研究報告29-34（２００６） 小林哲幸、室伏きみ子、蛋白質　核酸　酵素（１９９９）44, 1118-1125 室伏きみ子、蛋白質　核酸　酵素（１９９３）38, 1396-1401
　本発明は、上記の事情に鑑みてなされたものであり、新規なＰＬＢおよびその製造方法を提供することを目的とするものである。
　本発明者らは、新規なＰＬＢ（酵素）を得ることを目的として、該酵素を生産する微生物を検索した結果、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物から新規な性質を有するＰＬＢを見出した。
　［酵素］
　本発明に係る酵素は、リン脂質のｓｎ－１位およびｓｎ－２位のアシル基を加水分解して、リゾリン脂質、グリセロール－３－リン酸、及び、グリセロール－３－リン酸エステル化合物から選ばれる１種以上を生成する酵素であって、以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のポリペプチドを含む酵素である。
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列を有し、かつ該加水分解活性を示すポリペプチド；または
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも７５％の相同性を有し、かつ該加水分解活性を示すポリペプチド。
　上記の酵素の好ましい形態は、ジミリストイルホスファチジン酸を基質としたときに、ｐＨ８．４で３７℃にて５分間の条件での加水分解活性を１００％とした場合に、ｐＨ７．２からｐＨ１０．０の範囲内で５０％以上の加水分解活性を示す。
　上記の酵素の好ましい形態は、ジミリストイルホスファチジン酸を基質としたときに、ｐＨ８．４で５０℃にて５分間の条件での加水分解活性を１００％とした場合に、該条件での加水分解活性が、ホスファチジルコリンに対して９５％以上、ホスファチジルイノシトール及びホスファチジルグリセロールに対して２０％以上、ホスファチジルセリンに対して２５％以上であり、スフィンゴミエリン、ホスファチジルエタノールアミン、トリステアリンおよびジパルミトイルグリセリドに対してほぼ０％である基質特異性を有する。
　上記の酵素の好ましい形態は、アミノ酸配列から算出した等電点が６．２～６．６の範囲内である。
　上記の酵素の好ましい形態は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで測定した場合の分子量が３８，０００～４０，０００の範囲内であり、アミノ酸組成より分析した場合の分子量が４１，０００～４３，０００の範囲内である。
　上記の酵素の好ましい形態は、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物に由来する。
　［ポリヌクレオチド］
　本発明に係るポリヌクレオチドは、上記の酵素をコードするポリヌクレオチドである。
　上記のポリヌクレオチドの好ましい形態は、以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド；または
（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド。
　上記のポリヌクレオチドの好ましい形態は、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物に由来する。
　［ベクター］
　本発明に係るベクターは、上記のポリヌクレオチドを含むベクターである。
　［形質転換体］
　本発明に係る形質転換体は、上記のポリヌクレオチドまたは上記のベクターが導入され、リン脂質からリゾリン脂質、グリセロール－３－リン酸、及び、グリセロール－３－リン酸エステル化合物から選ばれる１種以上を生成する酵素を産生する能力を保有する形質転換体である。
　上記の形質転換体の好ましい形態は、前記形質転換体の宿主が、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物である。
　［酵素の製造方法］
　本発明に係る酵素の製造方法は、リン脂質に作用し、該リン脂質を加水分解してリゾリン脂質、グリセロール－３－リン酸、及び、グリセロール－３－リン酸エステル化合物から選ばれる１種以上を生成する酵素を製造する方法であって、上記のポリヌクレオチドまたは上記のベクターを宿主に導入して、該酵素を産生する形質転換体を得る工程；および、該形質転換体を培養して該酵素を産生させる工程；を含む製造方法である。
　上記の酵素の製造方法の好ましい形態は、前記宿主が、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物である。
　本発明によれば、酵素活性の高い新規なホスホリパーゼＢを提供することが可能になる。さらに、該酵素を微生物によって効率よく生産する方法を提供することができる。それにより、金属塩の添加なしでも高いＰＬＢ活性を有し、リン脂質に対して基質特異性を有する新規なリン脂質加工剤を得ることができる。また、リゾリン脂質、グリセロール－３－リン酸、及び、グリセロール－３－ホスホコリンなどのグリセロール－３－リン酸エステル化合物を、効率良く製造することができる。また、純度の高い、ホスファチジルエタノールアミン、グリセロール－３－リン酸、又は、グリセロール－３－ホスホコリンを効率良く製造することができる。
ストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp.）培養液から得られた精製画分についてのＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析の結果を示す電気泳動写真である。 ｐＨが８．４である場合の酵素活性を基準（１００％）とした、種々のｐＨでのストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp.）由来の精製酵素についてのホスホリパーゼＢの相対活性を示すグラフである。 反応温度が５０℃である場合の酵素活性を基準（１００％）とした、種々の温度でのストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp.）由来の精製酵素についてのホスホリパーゼＢの相対活性を示すグラフである。 ｐＨが８．４、３０分間の条件で、種々の温度での処理後のストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp.）由来の精製酵素についての残存活性を示すグラフである。 ｐＨが８．４、温度が３７℃の条件で処理した後のストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp.）由来の精製酵素についての時間ごとの残存活性を示すグラフである。 ４℃で３時間の条件で、種々のｐＨでの処理後のストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp.）由来の精製酵素についての残存活性を示すグラフである。 ストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp.）由来のホスホリパーゼＢ遺伝子を含む領域の塩基配列および構造遺伝子についての推定アミノ酸配列の一部を示す図である。 ストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp.）由来のホスホリパーゼＢ遺伝子を含む領域の塩基配列および構造遺伝子についての推定アミノ酸配列の一部（図７Ａの続き）を示す図である。
　［酵素］
　本明細書において、酵素とは、精製酵素に限定されず、粗精製物、固定化物なども含む。酵素の精製は、例えば、微生物の培養液を用いて、硫安沈澱、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィーなどの、当業者に周知の方法を用いて行われる。それにより、種々の精製度の酵素（ほぼ単一までに精製された酵素を含む）が得られ得る。
　本明細書において、微生物とは、野性株、変異株（例えば、紫外線照射などにより誘導されたもの）、あるいは、細胞融合もしくは遺伝子組換え法などの遺伝子工学的手法により誘導される組換え体などのいずれの株であってもよい。組換え体などの遺伝子操作された微生物は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら編、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載されるような、当業者に公知な技術を用いて容易に作成され得る。微生物の培養液とは、微生物菌体を含む培養液、および遠心分離などにより微生物菌体を除いた培養液の両方を意味する。
　［ホスホリパーゼＢ］
　グリセロールリン脂質中のグリセロール基のα位（ｓｎ－１位）の脂肪酸エステル結合を加水分解する酵素をホスホリパーゼＡ１と称し、グリセロール基のβ位（ｓｎ－２位）の脂肪酸エステル基を加水分解する酵素をＡ２と称する。また、ホスホリパーゼＡ１活性及びホスホリパーゼＡ２活性を併有する酵素をホスホリパーゼＢ（ＰＬＢ）と称する。すなわち、ＰＬＢは、α位とβ位の両方に酵素活性を有する。
　したがって、ＰＬＢは、リン脂質からリゾリン脂質、グリセロール－３－リン酸、及び、グリセロール－３－ホスホコリンなどのグリセロール－３－リン酸エステル化合物の少なくとも１種以上、好ましくは３種全てを生成する酵素である。
　ＰＬＢ活性は、例えば、以下のようにして確認され得るが、確認方法はこれに限定されるものではない。具体的には、例えば、酵素反応の結果、生成する遊離脂肪酸量を測定することにより、ＰＬＢ活性を確認することができる。
　具体的な手法としては、まず、１０％（ｗ／ｖ）トライトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ－１００（ナカライテスク（株）製）１０ｍＬにジミリストイルホスファチジン酸１ｇ（フナコシ製）を溶解し、１０％（ｗ／ｖ）ジミリストイルホスファチジン酸を調製する。この１０％（ｗ／ｖ）ジミリストイルホスファチジン酸０．００５ｍＬに、０．２Ｍ　トリス－塩酸緩衝液（ｐＨ８．４）０．０２５ｍＬと、０．５Ｍ　ＥＤＴＡ二ナトリウム（和光純薬工業（株）製）０．００２ｍＬと、蒸留水０．０６３ｍＬとを加える。そして、３７℃で５分間予備加温した後、酵素活性を確認する試料０．００５ｍＬを添加し、３７℃で５分間反応させる。酵素反応後、１００℃で５分間加熱し、反応を停止させる。反応停止後、反応液５μＬ中に含まれる遊離脂肪酸量を、例えば遊離脂肪酸測定キットである「ＮＥＦＡ　Ｃテストワコー」（和光純薬工業（株）製）を用いて、キットに添付の指示書に記載のとおりに測定する。１分間に１μｍｏｌの遊離脂肪酸を生成する酵素量を、１単位とする。
　本発明における酵素は、リン脂質のｓｎ－１位およびｓｎ－２位のアシル基を加水分解して、リゾリン脂質、グリセロール－３－リン酸、及び、グリセロール－３－リン酸エステル化合物から選ばれる１種以上を生成する酵素であって、以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のポリペプチドを含むものである。
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列を有し、かつ該加水分解活性を示すポリペプチド；または
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも７５％の相同性を有し、かつ該加水分解活性を示すポリペプチド。
　上記の酵素は、例えば、緩衝液として、酢酸－酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．１～５．６）、ビストリス－塩酸緩衝液（ｐＨ５．６～７．２）、トリス－塩酸緩衝液（ｐＨ７．２～８．８）、および、グリシン－水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．８～１０．５）、を用いて、上記のホスファチジン酸と酵素とを反応条件下におくと、そのｐＨ範囲内（ｐＨ４．１～１０．５）でＰＬＢ活性を示し得る。至適ｐＨは、ｐＨ８～８．８付近とすることができる。
　上記の酵素は、例えば、上記のようにジミリストイルホスファチジン酸と酵素とを３７℃にて５分間反応させた条件下でｐＨ８．４における加水分解活性を１００％とした場合、ｐＨ７．２からｐＨ１０．０の範囲内で５０％以上の活性を示すことが好ましい。
　上記の酵素は、例えば、上記のようにジミリストイルホスファチジン酸と酵素との反応条件下においては、約２０～６５℃で作用し得る。至適温度は、この範囲内にあり得る。好ましくは約３７～６０℃の範囲内であり、より好ましくは４５～５５℃の範囲内であり、さらにより好ましくは約５０℃である。
　上記の酵素は、例えば、１６０ｍＭ　トリス－塩酸緩衝液（ｐＨ８．４）で３０分間処理した場合、４℃から４５℃まででは、ほぼ活性の低下が見られず安定であり得、そして好ましくは、５０℃でも８０％程度（例えば７５％）以上の活性が残存している。
　上記の酵素は、例えば、緩衝液としてトリス－塩酸緩衝液（ｐＨ８．４）を用いて、上記のリン脂質と酵素溶液とを反応条件下におくと、１０ｍＭのＥＤＴＡによって阻害を受けず、ＥＤＴＡを添加しない場合とほぼ同一の活性を示すことが好ましい。また、１０ｍＭ　Ｃａ２＋の存在下では、約９０％の活性（例えば８５～９５％程度の活性）を示すことが好ましい。一方、１０ｍＭのＭｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ｆｅ３＋、Ｆｅ２＋では活性が阻害され得るものである。
　上記の酵素は、ｐＨ８．４の条件下で上記のように該酵素と基質とを５０℃にて５分間反応させた場合、ジミリストイルホスファチジン酸が基質である場合に対する加水分解活性を１００％とすると、ホスファチジルコリン（ＰＣ）に対して９５％以上、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、及び、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）に対して２０％以上、ホスファチジルセリン（ＰＳ）に対して２５％以上の活性を有することが好ましい。また、同じ条件において、スフィンゴミエリン、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、トリステアリンおよびジパルミトイルグリセリドに対する活性がほぼ０％（例えば５％以下、３％以下、又は１％以下、あるいは検出限界以下）であることが好ましい。このような基質特異性を有することが好ましいものである。
　上記の酵素は、電気泳動条件などにより若干変化し得るが、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにおける分子量が３８，０００～４０，０００の範囲内（例えば、約３９，０００、又は、３８，９００）を示すことが好ましい。また、上記の酵素は、アミノ酸組成から計算した分子量が、４１，０００～４３，０００の範囲内であることが好ましい。例えば、ストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp.）ＮＡ６８４株由来の天然の酵素では、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにおける分子量が約３９，０００、具体的には３８，９００を示す。このストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp.）ＮＡ６８４株由来の天然の酵素では、そのアミノ酸組成から計算した分子量は約４２，０００である。
　上記の酵素は、６．２～６．６の範囲内（例えば６．４）の等電点を示すことが好ましい。酵素の等電点は、そのアミノ酸配列から、ＧＥＮＥＴＹＸにより算出され得る。
　上記の酵素、すなわちホスホリパーゼＢの一態様は、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるものである。ホスホリパーゼＢは、好ましくは配列番号２の３１位から４１２位までのアミノ酸配列（本明細書では、「配列番号２に記載内のアミノ酸配列」ともいう）を有する。
　上記の酵素は、ＰＬＢ活性を有する限り、配列番号２に記載のアミノ酸配列、又は、配列番号２に記載内のアミノ酸配列に対して、１または複数のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有する酵素であっても良い。当業者であれば、例えば、部位特異的変異導入法（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９８２年，１０巻，ｐｐ．６４８７；Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌ．，１９８３年，１００巻，ｐｐ．４４８；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，第２版，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．１９８９年；ＰＣＲ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ，１９９１年，ｐｐ．２００）などを用いて、適宜置換、欠失、挿入、および／または付加変異を導入することにより、タンパク質の構造を改変することができる。本明細書において、置換、欠失、挿入、および／または付加することができるアミノ酸残基数は、通常５０以下、例えば３０以下、あるいは２０以下、好ましくは１６以下、より好ましくは５以下、さらに好ましくは０～３である。また、アミノ酸の変異は、人工的に変異させた酵素のみならず、自然界において変異した酵素も、ＰＬＢ活性を有する限り、上記の酵素（ＰＬＢ）に含まれる。
　配列番号２に記載のアミノ酸配列、又は、配列番号２に記載内のアミノ酸配列に対して、相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質も、ＰＬＢ活性を有する限り、上記の酵素（ＰＬＢ）に含まれる。ＰＬＢは、好ましくは、配列番号２に記載のアミノ酸配列、又は、配列番号２に記載内のアミノ酸配列と、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、なおより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であり得る。
　タンパク質の相同性の（ホモロジー）検索は、例えばＳＷＩＳＳ－ＰＲＯＴ、ＰＩＲ、ＤＡＤなどのタンパク質のアミノ酸配列に関するデータベース、またはＤＤＢＪ、ＥＭＢＬ、あるいはＧｅｎｅ－ＢａｎｋなどのＤＮＡデータベースなどを対象に、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどのプログラムを利用して、例えば、インターネットを通じて行うことができる。タンパク質の活性の確認は、上記に記載の手順を利用して行い得る。
　ＰＬＢの供給源は特に限定されるものではないが、ＰＬＢは、微生物などの生体細胞から得ることができる。そのような微生物としては、例えば、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物が挙げられる。好ましくは、ストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp.）、ストレプトマイセス・チャッタノゲンシス（Streptomyces chattanoogensis）およびストレプトマイセス・リディカス（Streptomyces lydicus）が挙げられる。これらの菌株は近縁であることから同種の活性のＰＬＢが得られると考えられる。
　例えば、上記ストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp.）ＮＡ６８４（受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－１０１５）は適当な栄養培地で液体培養することにより該酵素を菌体外に分泌するので、その培養上清を凍結乾燥、塩析、有機溶媒などにより処理したものをＰＬＢ酵素製剤として製造することができる。
　また、ストレプトマイセス・チャッタノゲンシス（Streptomyces chattanoogensis）ＮＢＲＣ１２７５４でもＮＡ６８４株と同様の活性が得られることを実験で確認している。したがって、ストレプトマイセス・エスピーＮＡ６８４とストレプトマイセス・チャッタノゲンシスとは同様の活性を示すものである。
　ＰＬＢ酵素製剤の製造に用い得る微生物はストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp.）ＮＡ６８４に限られるものではなく、ストレプトマイセス属に属し、かつ、ＰＬＢを生産し得る微生物であってもよい。また、それらの生物種の天然または人為的変異株や、ＰＬＢ活性の発現に必要な遺伝子断片を人為的に取り出し、それを組み入れた他の生物種であってもＰＬＢの製造に用いることができる。また、ストレプトマイセス属に属さなくても、上記のＰＬＢを生産し得る微生物であれば、それを用いることもできる。
　ストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp.）ＮＡ６８４を用いたＰＬＢ酵素製剤を例に挙げて、その製造について説明する。
　この菌は栄養培地で液体培養することにより該酵素を菌体外に分泌するので、その培養上清を凍結乾燥、塩析、有機溶媒などにより処理する、あるいはこの処理物を固定化するなどして酵素製剤を製造することができる。さらに具体的に説明すると、まず、この菌を適当な培地、例えば適当な炭素源、窒素源、無機塩類を含む培地中で培養し、該酵素を分泌させる。ここで炭素源としては、澱粉および澱粉加水分解物、グルコース、シュークロースなどの糖類、グリセロールなどのアルコール類、および有機酸（例えば、酢酸およびクエン酸）またはその塩（例えば、ナトリウム塩）などが挙げられる。窒素源としては、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスチープリカー、大豆粉などの有機窒素源および硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素などの無機窒素化合物挙げられる。無機塩類としては、塩化ナトリウム、リン酸１カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マンガン、塩化カルシウム、硫酸第１鉄などが挙げられる。炭素源の濃度は、例えば１～２０％（ｗ／ｖ）、好ましくは１～１０％（ｗ／ｖ）の範囲である。窒素源の濃度は、例えば１～２０％（ｗ／ｖ）、好ましくは１～１０％（ｗ／ｖ）の範囲である。培養温度は、上記の酵素が安定であり、そして培養される微生物が十分に生育できる温度であることが好ましく、例えば、２０～３７℃であることが好ましい。培養時間は、上記酵素が十分に生産される時間であることが好ましく、例えば、１～７日間程度であることが好ましい。培養は、好ましくは、好気的な条件下で、例えば、通気攪拌または振とうしながら行うことができる。
　ＰＬＢは、タンパク質の溶解度による分画（有機溶媒による沈殿や硫安などによる塩析など）；陽イオン交換、陰イオン交換、ゲルろ過、疎水性クロマトグラフィー；キレート、色素、抗体などを用いたアフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適当に組み合わせることにより精製することができる。例えば、上記微生物の培養上清を回収した後、硫安沈殿、さらに陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、及び／又は、陽イオン交換クロマトグラフィーを行うことにより精製することができる。これにより、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）において、ほぼ単一バンドにまで精製することができる。すなわち、上記酵素（ＰＬＢ）は、ＨＰＬＣ分析およびゲル濾過クロマトグラフィー分析により、単量体と推定できる。
　ところで、既知のＰＬＢおよび前記の特許文献４にあるＰＬＢは生産性が極めて低く、特許文献４に記載のキャンディダ・シリンドラッセに至っては培養上清中に０．２Ｕ／ｍｌしか生産することができない。一方、上記のＰＬＢによれば、１３．７Ｕ／ｍｌ以上（ジミリストイルホスファチジン酸に対して）という極めて高い酵素活性を示す培養上清および新規なホスホリパーゼＢを提供することが可能になる。
　［ＰＬＢをコードするポリヌクレオチド］
　本発明におけるポリヌクレオチドは、上記のＰＬＢをコードするものである。このポリヌクレオチドは、好ましくは、以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド；または
（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド。
　上記のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡなどの天然のポリヌクレオチドに加え、人工的なヌクレオチド誘導体を含む人工的な分子であり得る。また、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ－ＲＮＡのキメラ分子であり得る。上記のＰＬＢをコードするポリヌクレオチドは、例えば、配列番号１の１位から１２３９位までの塩基配列（本明細書では、「配列番号１に記載の塩基配列」ともいう）を有する。配列番号１に記載の塩基配列は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードしており、このアミノ酸配列を含むタンパク質は、ＰＬＢの好ましい形態を構成する。
　上記のＰＬＢをコードするポリヌクレオチドとしては、上記のような配列番号２に記載のアミノ酸配列に１または複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸を含み、かつＰＬＢ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドもまた挙げられる。当業者であれば、配列番号１に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドに部位特異的変異導入法（上述）などを用いて、適宜置換、欠失、挿入、および／または付加変異を導入することによりポリヌクレオチドのホモログを得ることが可能である。
　上記のＰＬＢをコードするポリヌクレオチドとしてはまた、配列番号１に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドに相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズでき、かつＰＬＢ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドもまた挙げられる。
　ポリヌクレオチドは、本明細書中に記載した塩基配列情報に基づいて、目的とする遺伝子を、上記の微生物、好ましくは、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物、さらに好ましくは、ストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp.）ＮＡ６８４から取得することができる。遺伝子の取得には、ＰＣＲやハイブリダイズスクリーニングを用いることができる。
　また、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ合成によって遺伝子の全長を化学的に合成して得ることもできる。また、上記の塩基配列情報に基づいて、上記以外の生物に由来する上記ＰＬＢをコードするポリヌクレオチドを取得することもできる。例えば、上記塩基配列もしくはその一部の塩基配列を用いてプローブを設計し、他の生物から調製したＤＮＡに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションを行うことにより、種々の生物由来のＰＬＢをコードするポリヌクレオチドを単離することができる。
　さらに、上記の塩基配列情報に基づいて、ＤＮＡ　Ｄａｔａｂａｎｋ　ｏｆ　Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）、ＥＭＢＬ、Ｇｅｎｅ－ＢａｎｋなどのＤＮＡに関するデータベースに登録されている配列情報を用いてホモロジーの高い領域からＰＣＲ用のプライマーを設計することもできる。このようなプライマーを用い、染色体ＤＮＡもしくはｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことにより、上記ＰＬＢをコードするポリヌクレオチドを種々の生物から単離することもできる。同様に、環境中から抽出したＤＮＡあるいはＲＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことにより、上記ＰＬＢをコードするポリヌクレオチドを種々の生物から単離することもできる。
　ストリンジェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチドとは、配列番号１に記載の塩基配列中の少なくとも２０個、好ましくは少なくとも３０個、例えば、４０個、６０個、または１００個の連続した配列を１つまたは複数選択してプローブを設計し、例えばＥＣＬ　ｄｉｒｅｃｔｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　ｌａｂｅｌｉｎｇ　ａｎｄ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて、マニュアルに記載の条件（例えば、洗浄条件：４２℃、０．５×ＳＳＣを含むｐｒｉｍａｒｙ　ｗａｓｈ　ｂｕｆｆｅｒ）において、ハイブリダイズするポリヌクレオチドを指す。
　より具体的には、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、通常、４２℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件であり、好ましくは５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳの条件であり、さらに好ましくは６５℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳの条件であるが、これらの条件に特に制限されるものではない。
　ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては、温度や塩濃度など複数の要素があり、当業者であればこれら要素を適宜選択することで最適なストリンジェンシーを実現することが可能である。
　さらに、上記のＰＬＢをコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、なおより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつＰＬＢ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。タンパク質の相同性（ホモロジー）検索は、上記で説明したとおりである。
　また、上記のＰＬＢをコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号１に記載の塩基配列と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、なおより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する塩基配列を有し、かつＰＬＢ活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチドもまた挙げられる。塩基配列の配列同一性の決定および検索についても、上記で説明したとおりである。
　上記のＰＬＢをコードするポリヌクレオチドは、遺伝子組換え技術を用いて、同種もしくは異種の宿主中で発現され得る。
　［ベクターおよび形質転換体］
　本発明におけるベクターは、上記のポリヌクレオチドを含むものである。また、ポリヌクレオチド又はベクターを宿主に導入することにより、リン脂質に作用し、リゾリン脂質、グリセロール－３－リン酸、及び、グリセロール－３－ホスホコリンなどのグリセロール－３－リン酸エステル化合物のいずれか１種以上を生成する酵素を産生する能力を保有する形質転換体を作製することができる。
　形質転換体の作製のための手順および宿主に適合した組換えベクターの構築は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ第２版、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９年参照）。特に放線菌に関しては、「ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ　ＳＴＲＥＰＴＯＭＹＣＥＳ　ＧＥＮＥＴＩＣＳ（Ｋｉｅｓｅｒら、Ｊｏｈｎ　Ｉｎｎｅｓ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、２０００年）」を参照して行うことができる。
　微生物中で、ＰＬＢをコードするポリヌクレオチドを発現させるためには、まず微生物中で安定に存在するプラスミドベクターやファージベクターにこのＤＮＡを導入し、その遺伝情報を転写・翻訳させる。そのために、転写・翻訳を制御するユニットにあたるプロモーターをＤＮＡ鎖の５’側上流に組み込むことが好ましい。また、転写・翻訳を制御するユニットにあたるターミネーターをＤＮＡ鎖の３’側下流に組み込むことが好ましい。より好ましくは、上記プロモーターとターミネーターの両方をそれぞれの部位に組み込む。このプロモーターおよびターミネーターとしては、宿主として利用される微生物中において機能することが知られているプロモーターおよびターミネーターが用いられる。これらの各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター、ターミネーターなどに関しては、「微生物学基礎講座８　遺伝子工学、共立出版」、特に放線菌に関しては、「ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ　ＳＴＲＥＰＴＯＭＹＣＥＳ　ＧＥＮＥＴＩＣＳ（Ｋｉｅｓｅｒら、ＪｏｈｎＩｎｎｅｓ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、２０００年）」などに詳細に記述されており、その方法を利用することが可能である。また、必要に応じてシグナル配列を用いることで細胞外に効率的に分泌生産させることができる。この時使用するシグナル配列は上記のＰＬＢのものでもその他のものでも良い。
　形質転換の対象となる宿主は、上記のＰＬＢをコードするポリヌクレオチドを含むベクターにより形質転換されて、ＰＬＢ活性を発現することができる生物であれば特に制限はない。例えば、細菌、放線菌、枯草菌、大腸菌、酵母、カビなどが挙げられる。より具体的には、例えば、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属など宿主ベクター系の開発がされている細菌；ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属など宿主ベクター系の開発がされている放線菌；サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クライベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、チゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属などの宿主ベクター系の開発がされている酵母；ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属などの宿主ベクター系の開発がされているカビなどが挙げられる。遺伝子組換えの操作の容易性からは大腸菌が好ましく、遺伝子の発現の容易性からは放線菌が好ましい。
　また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が開発されており、例えば、蚕などの昆虫（Ｎａｔｕｒｅ３１５，５９２－５９４（１９８５））や菜種、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物中に大量に異種蛋白質を発現させる系が開発されており、これらを利用してもよい。
　得られた形質転換体は、上記のように酵素製剤（ＰＬＢ）の製造に用いることができる。具体的には、形質転換体を適当な栄養培地で液体培養して、発現したＰＬＢを細胞外に分泌させ、その培養上清を凍結乾燥、塩析、有機溶媒などにより処理してＰＬＢ酵素製剤を製造することができる。
　宿主細胞に依存して培養条件は変動し得るが、培養は、同業者が通常用いる条件下で行われ得る。例えば、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属のような放線菌を宿主として用いる場合、チオストレプトンを含むトリプチックソイ培地（例えば、ベクトン・ディッキンソン社製）が用いられ得る。形質転換体により産生された酵素は、上述のようにしてさらに精製され得る。
　［ＰＬＢの利点］
　以上のようにして生産され得るＰＬＢの好ましい形態の利点について、以下、説明する。
　（１）従来のＰＬＢ（旭化成ファーマテック社製ＰＬＢ）はリパーゼ活性を有するのに対し、上記のＰＬＢはリパーゼ活性を有していない。このことから、食品などに含まれる中性脂質（グリセリド）に作用して食品品質を低下させることがなく、リン脂質のみに作用させることができる。その結果、食品品質をより向上させることが期待できる。
　（２）上記の手法で製造する場合、培養日数が短期間ですみ、かつ高活性を示すことから、生産性が高い。
　（３）従来のＰＬＢはカルシウムイオンなどの金属イオンが無いと触媒活性が低いために、食品加工においては食品素材に金属塩を添加して酵素処理する必要があった。これに対して、上記のＰＬＢでは、酵素反応に金属塩の添加が不要である。そのため、そのまま食品素材を加工することができ、使用範囲が広がるとともに金属塩による食品品質の劣化の防止、安全性の向上が期待できる。さらに、反応器を用いて酵素処理を行う場合、金属塩の添加が不要なため反応器に缶石が付着することがなく、メンテナンスが容易でランニングコストが低く抑えられる。
　（４）従来のＰＬＢ（旭化成ファーマテック社製ＰＬＢ）はＰＩ（ホスファチジルイノシトール）に作用しないのに対し、上記のＰＬＢはＰＩに作用可能である。このように、上記のＰＬＢは、ＰＥ（ホスファチジルエタノールアミン）以外のリン脂質にも作用することが可能で、特に、ＰＡ（ホスファチジン酸）とＰＣ（ホスファチジルコリン）によく作用する。特徴的なのは、ＰＥに作用しない点であり、この性質を利用すれば粗リン脂質からＰＥのみを残存させ、その純度を高めることが可能である。これによって、高純度のＰＥを製造することが可能である。また、多くの様々なリン脂質（例えば大豆レシチンなど）に作用することから、使用範囲が広く、さまざまなグリセロール－３－リン酸エステル化合物の製造が可能となる。
　（５）上記のＰＬＢは、ｐＨ７．２～１０．０の範囲において最大活性に対して５０％以上の活性を示すことから、従来のＰＬＢに比べて使用できるｐＨ範囲が極めて広く、中性からアルカリ性の条件下で使用できる。そのため、反応制御がしやすく、広範な応用範囲が期待できる。
　（６）上記のＰＬＢは、３７～６０℃の範囲を超える範囲で５０％以上の活性を示すことから、従来のＰＬＢに比べて使用できる温度範囲が広い。特に、６０℃以上でも相当の活性を示すことから高温処理も可能である。したがって、反応制御がしやすく、広範な応用範囲が期待できる。
　（７）上記のＰＬＢは、還元剤や阻害剤、界面活性剤などによって阻害を受けにくい。そのため、反応制御がしやすい。
　（８）従来のＰＬＢ（旭化成ファーマテック社製ＰＬＢ）の安定ｐＨはｐＨ５～９であるのに対し、上記のＰＬＢの安定ｐＨはｐＨ４～１０．５である。したがって、取り扱いが容易である。
　（９）従来のＰＬＢ（旭化成ファーマテック社製ＰＬＢ）の安定温度は５５℃であるのに対し、上記のＰＬＢの安定温度は４５～５０℃である。したがって、より低温で酵素を失活させることが可能である。
　（１０）ＮＢＲＣ標準株（ストレプトマイセス・チャッタノゲンシス（Streptomyces chattanoogensis）ＮＢＲＣ１２７５４）でも活性が認められた。そのため、種レベルでの請求が可能である。
　［ＰＬＢの利用］
　以下に、ＰＬＢの好ましい形態についての利用方法を説明する。
　（１）ＰＬＢは、細胞膜を分解できる。そして、ＰＬＢは、細胞を溶解させる。したがって、卵黄汚れや血液汚れなどの洗浄剤をはじめとする細胞分解剤あるいは細胞溶解剤に利用できる。
　（２）リゾリン脂質は極めて乳化特性に優れているため、様々な分野に利用できる乳化剤あるいは界面活性剤となる。また、リゾリン脂質は、近年様々な生理作用が発見されているため医薬品やサプリメントとして利用可能性がある。したがって、上記のＰＬＢを利用して、様々な高機能リゾリン脂質が製造可能である。
　（３）油脂の精製において、不純物となるリン脂質を上記ＰＬＢを利用して効率良く分解し、油脂からの物理的な分離を可能にする。
　（４）ＰＬＢをパン生地や麺生地などの小麦粉に加えることで、小麦粉中に元々含まれているリン脂質をリゾレシチンやグリセロール－３－ホスホコリン等に変換する。生地中でリゾレシチンやグリセロール－３－ホスホコリン等が生成することで、蛋白質や澱粉と結合してグルテンの網目構造の形成を助け、パンや麺の物性を改善したり、老化を防止したりする。
　（５）化粧品材料として優れた特性、効果を示す環状ホスファチジン酸はリゾリン脂質から製造することが可能である。したがって、上記ＰＬＢを利用すれば、効率的に環状ホスファチジン酸が製造可能になる。
　（６）グリセロール－３－ホスホコリンは、認知症予防などが期待される。その他のグリセロール－３－リン酸エステル化合物にも高機能が期待できる。よって、上記のＰＬＢでは高機能のグリセロール－３－リン酸エステルを製造できる。
　（７）グリセロール－３－リン酸は、解糖系の代謝中間体である。そのため、上記のＰＬＢでは、代謝を亢進する可能性を有するグリセロール－３－リン酸を製造することができる。
　以下、実施例により、本発明をさらに詳細に説明する。本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
　［ＰＬＢの酵素活性の測定方法］
　本実施例において、酵素活性の測定は、基本的には、以下のように行った。この方法を、以下、「ＰＬＢ活性標準測定方法」という。この方法では、ジミリストイルホスファチジン酸を基質として用いた場合を例示する。
　１０％（ｗ／ｖ）トライトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ－１００（ナカライテスク（株）製）１０ｍＬにジミリストイルホスファチジン酸１ｇ（フナコシ製）を溶解し、１０％（ｗ／ｖ）ジミリストイルホスファチジン酸を調製した。この１０％（ｗ／ｖ）ジミリストイルホスファチジン酸０．００５ｍＬに、０．２Ｍ　トリス－塩酸緩衝液（ｐＨ８．４）０．０２５ｍＬと、０．５Ｍ　ＥＤＴＡ二ナトリウム（和光純薬工業（株）製）０．００２ｍＬと、蒸留水０．０６３ｍＬとを加えた。そして、３７℃で５分間予備加温した後、酵素を含む試料０．００５ｍＬを添加し、３７℃で５分反応させた。酵素反応後、１００℃で５分間加熱し、酵素反応を停止させた。反応停止後、反応液５μＬ中に含まれる遊離脂肪酸量を、遊離脂肪酸測定キットである「ＮＥＦＡ　Ｃテストワコー」（和光純薬工業（株）製）を用いて、キットに添付の指示書に記載のとおりに測定した。１分間に１μｍｏｌの遊離脂肪酸を生成する酵素量を、１単位とした。
　［実施例１：ストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp.）由来酵素の精製］
　（ａ）培養
　ＮＢ培地「１％ ペプトン（べクトン・ディンキンソン社製）、１％肉エキス（極東製薬工業（株）製）、０．５％ 塩化ナトリウム（和光純薬工業（株）製）、ｐＨ７．２」３００ｍＬを調製し、５００ｍＬ容三角フラスコに１００ｍｌずつ分注して、さらに１％大豆レシチンと０．１％ツィーン（Ｔｗｅｅｎ）８０を添加した後、１２１℃で１５分間蒸気殺菌を行った。予め平板培地に生育したストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp.）ＮＡ６８４のコロニーを適当量とり、トリプチックソイ培地（べクトン・ディンキンソン社製）５ｍＬを入れたφ１８試験管（１８×１８０ｍｍ）に接種し、２８℃で良好な生育が得られるまで振とう培養した。この培養液を先の滅菌した培地１００ｍＬに１ｍｌずつ接種し、２８℃で１０８時間振とう培養した。遠心分離機を用いて、この培養液から上清を回収した。
　（ｂ）硫安分画
　上記（ａ）で回収した培養上清に、８０％（ｗ／ｖ）飽和となるように硫酸アンモニウムを添加し、生じた沈殿を遠心分離（１０,０００ｒｐｍ、３０分、４℃）により回収した。この沈殿を可溶化し、２０ｍＭトリス－塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）で透析し、粗酵素液を得た。
　（ｃ）ＤＥＡＥ－Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムクロマトグラフィー
　上記（ｂ）で得られた粗酵素液を、２０ｍＭ　トリス－塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）で予め平衡化した「ＤＥＡＥ－Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ　６５０Ｍカラム」（内径２６ｍｍ、高さ５５ｍｍ、東ソー社製）にアプライした。同緩衝液でカラムを洗浄した後、塩化ナトリウム（０Ｍから１Ｍまで）のリニアグラジェントにより、活性画分を溶出させた。
　（ｄ）ＨｉＴｒａｐ　Ｑカラムクロマトグラフィー
　上記（ｃ）で得られた活性画分を集め、Ｖｉｖａ　ｓｐｉｎ（ザルトリウス社製）を用い濃縮脱塩した。これに、２０ｍＭ　トリス－塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）を加えた。これを、２０ｍＭトリス－塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）で予め平衡化した「ＨｉＴｒａｐ　Ｑ」（５ｍｌ）カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）にアプライし、同緩衝液でカラムを洗浄した後、塩化ナトリウム（０Ｍから１Ｍまで）のリニアグラジェントにより、活性画分を溶出させた。
　（ｅ）ＲＥＳＯＵＲＣＥ　ＰＨＥカラムクロマトグラフィー
　上記（ｄ）で得られた活性画分を集め、Ｖｉｖａ　ｓｐｉｎを用い濃縮脱塩した。これに、１Ｍ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭ　トリス－塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を加えた。１Ｍ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭ　トリス－塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で予め平衡化した「ＲＥＳＯＵＲＣＥ　ＰＨＥ」（１ｍｌ）カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）にアプライし、同緩衝液でカラムを洗浄した後、硫酸アンモニウム（１Ｍから０Ｍまで）のリニアグラジェントにより、活性画分を溶出させた。
　（ｆ）Ｍｏｎｏ　Ｓカラムクロマトグラフィー
　上記（ｅ）で得られた活性画分を集め、Ｖｉｖａ　ｓｐｉｎを用い濃縮脱塩した。これに、２０ｍＭ　メス－水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を加えた。２０ｍＭ　メス－水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で予め平衡化した「Ｍｏｎｏ　Ｓ」（１ｍｌ）カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）にアプライし、同緩衝液でカラムを洗浄した後、塩化ナトリウム（０Ｍから０．５Ｍまで）のリニアグラジェントにより、活性画分を溶出させた。
　（ｇ）ＳＤＳ－ＰＡＧＥ
　上記（ｅ）で溶出した活性画分を集めてＳＤＳ－ＰＡＧＥ（１２％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲル）により解析した。
　図１は、この溶出画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥによる解析の結果を示す電気泳動写真である。レーン１（図の左側）は、分子量マーカーであり、レーン２（図の右側）は、溶出画分のバンドを示す。図１に示すように、溶出画分において、単一のバンドが観察された。
　以上のようにして、ストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp.）ＮＡ６８４株より、電気泳動的に単一に精製された酵素を得た。
　この酵素は、ＨＰＬＣ分析およびゲル濾過クロマトグラフィー分析により、単量体と推定された。
　［実施例２：ストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp.）由来酵素の性質の測定］
　（ＰＬＢ活性）
　実施例１で得た精製酵素と、基質として１－パルミトイル－２－オレオイルホスファチジンコリンとを「ＰＬＢ活性標準測定方法」の反応条件で酵素反応を行った。
　その後、反応液をクロロホルム／メタノール（２／１，ｖ／ｖ）で抽出した。抽出液をガスクロマトグラフィー分析して、加水分解により生じた脂肪酸を定量分析することで、ＰＬＢ活性を有することを確認した。
　（酵素学的性質）
　実施例１で得た精製酵素の酵素学的性質について検討した。
　（１）作用ｐＨ
　緩衝液として酢酸－酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．１～５．６）、ビストリス－塩酸緩衝液（ｐＨ５．６～７．２）、トリス－塩酸緩衝液（ｐＨ７．２～８．８）、又は、グリシン－水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．８～１０．５）、を用いてｐＨを変化させたこと以外は、上記「ＰＬＢ活性標準測定方法」の方法に従って、ジミリストイルホスファチジン酸を基質として用い、ＰＬＢ活性を測定した。その結果、実施例１で得た酵素は、反応の至適ｐＨが８～８．８であることが分かった。
　図２は、種々の反応ｐＨでの酵素活性を、反応ｐＨが８．４である場合の酵素活性を基準（１００％）とする相対活性として示したグラフである。図２のグラフから分かるように、この酵素は、ｐＨ７．２からｐＨ１０．０という広い範囲で最大活性（１００％）に対して相対的な活性が５０％以上の活性を示した。
　（２）作用温度
　酵素反応の際の反応温度を変化させたこと以外は、上記「ＰＬＢ活性標準測定方法」の方法に従って、ジミリストイルホスファチジン酸を基質として用い、ＰＬＢ活性を測定した。
　図３は、種々の反応温度での酵素活性を、反応温度が５０℃である場合の活性を基準（１００％）とする相対活性として示したグラフである。図３のグラフに示されるように、この酵素は、２０～６５℃で活性を発揮し、そして反応の至適温度は５０℃付近（例えば４５～５５℃）であった。
　（３）温度安定性
　実施例１で得た精製酵素を１６０ｍＭ　トリス－塩酸緩衝液（ｐＨ８．４）中で、種々の温度で３０分間処理した後の残存活性を、上記「ＰＬＢ活性標準測定方法」の方法に従って、ジミリストイルホスファチジン酸を基質として用い、ｐＨ８．４で５０℃にて５分間で測定した。温度処理前の酵素活性を基準（１００％）として、各温度処理後の酵素活性の残存割合として残存活性を示した。
　図４は、種々の温度での処理後の酵素の残存活性を示すグラフである。図４のグラフに示されるように、この酵素は、４℃から４５℃までの温度での処理後では、処理前の９０％以上の活性が残存していた。５０℃の処理後では、処理前の８０％程度（約７５～８０％）の活性が残存していた。
　また、実施例１で得た精製酵素を５０ｍＭ　トリス－塩酸緩衝液（ｐＨ８．４）中で、３７℃で６０分まで処理する間の残存活性を、上記「ＰＬＢ活性標準測定方法」の方法に従って、ジミリストイルホスファチジン酸を基質として用い、ｐＨ８．４で５０℃にて５分間で測定した。温度処理前の酵素活性を基準（１００％）として、各時間処理後（１０分ごと）の酵素活性の残存割合として残存活性を示した。
　図５は、種々の時間での処理後の酵素の残存活性を示すグラフである。図５のグラフに示されるように、この酵素は、温度３７℃では６０分の処理後でも、処理前と同程度の活性が残存していた。
　（４）ｐＨ安定性
　実施例１で得た精製酵素を４０ｍＭの各緩衝液（「作用ｐＨ」の欄参照）中で、種々のｐＨで４℃、３時間処理した後の残存活性を、上記「ＰＬＢ活性標準測定方法」の方法に従って、ジミリストイルホスファチジン酸を基質として用い、ｐＨ８．４で５０℃にて５分間で測定した。処理前の酵素活性を基準（１００％）として、各処理後の酵素活性の残存割合として残存活性を示した。
　図６は、種々のｐＨでの処理後の酵素の残存活性を示すグラフである。図６のグラフに示されるように、この酵素は、ｐＨ４．１から１０．５まで活性が残存していた。
　（５）各種金属塩およびＥＤＴＡ等の化学物質の影響
　酵素反応の際に、各種金属イオン又はＥＤＴＡを添加して、上記「ＰＬＢ活性標準測定方法」の方法に従って、ジミリストイルホスファチジン酸を基質として用い、ｐＨ８．４で５０℃にて５分間でＰＬＢ活性を測定した。
　表１は、１０ｍＭのＥＤＴＡを添加した条件を１００％としたときの、各種添加物を添加した相対活性の結果である。実施例１で得た酵素は、１０ｍＭのＥＤＴＡ、並びに、２ｍＭのヨードアセタミド、２－メルカプトエタノール、ＰＭＳＦ（フッ化フェニルメチルスルホニル）、及び、ＳＤＳによって阻害を受けず添加しない場合とほぼ同一の活性を示した。また、カルシウムイオン（１０ｍＭ　Ｃａ２＋）存在下では、約９０％の活性を示した。一方、１０ｍＭのＭｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ｆｅ３＋、Ｆｅ２＋、および、２ｍＭのジチオトレイトールで活性が阻害され得ることが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
  
　（６）基質特異性
　ジミリストイルホスファチジン酸の代わりに各種リン脂質を基質として用いたこと以外は、上記「ＰＬＢ活性標準測定方法」の方法に従って、ＰＬＢ活性を測定した。
　表２は、ジミリストイルホスファチジン酸を基質としてｐＨ８．４で５０℃にて５分間での加水分解活性を１００％とした場合の相対活性の結果である。実施例１で得た酵素は、表２に示すような基質特異性を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
  
　（７）分子量
　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法（１２％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲル）に従って、実施例１で得た精製酵素の分子量を測定した結果、精製酵素の分子量は約３９，０００であった（図１）。なお、単位はＤａ（ダルトン）である。
　（８）等電点
　Ｇｅｎｅｔｙｘを用いて酵素のアミノ酸配列に基づいて酵素の等電点を予測した結果、酵素の等電点は６．４であった。
　［実施例３：ストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp.）由来酵素のＮ末端アミノ酸配列の解析］
　実施例１で得た精製酵素を用いて、プロテインシーケンサーによりＮ末端アミノ酸配列の解析を行った。また、ｎａｎｏＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより内部アミノ酸配列の解析を行った。解析から、この精製酵素のＮ末端アミノ酸配列は、配列番号３に示すものであることが確認された。また、内部アミノ酸配列は、配列番号４、５、６に示すものであることが確認された。なお、配列番号３は、配列番号２の３１位からに示される配列となっている（１～３０位が分泌シグナル配列で成熟（精製）酵素では除去されている）。また、配列番号４は、配列番号２の１８７位からに示される配列となっている。また、配列番号５は、配列番号２の３２７位からに示される配列となっている。なお、配列番号２における３３５位のアミノ酸、すなわち、配列番号５の９位のアミノ酸が一致していないのは、ｎａｎｏＬＣ－ＭＳ／ＭＳによるデノボアミノ酸配列解析ではＬｅｕとＩｌｅが判別できなかったためである。また、配列番号６は、配列番号２の１４５位からに示される配列となっている。
　［実施例４：ストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp.）ＮＡ６８４の染色体ＤＮＡの分離］
　ストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp.）ＮＡ６８４を、ＹＥＭＥ培地（０．３％酵母エキス、０．５％ペプトン、０．３％麦芽エキス、１％グルコース、３４％シュークロース、５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．５％グリシン）３０ｍｌを用いて２８℃で４日間培養し、集菌した。
　 次いで、この菌体を、７５ｍＭ　ＮａＣｌ、２５ｍＭ　ＥＤＴＡ、２０ｍＭ　トリス－塩酸（ｐＨ７．５）および１ｍｇ／ｍｌリゾチームからなる溶液５ｍｌに懸濁し、３７℃で一晩処理した。これに、１０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを７５０μｌ、ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋを５ｍｇ添加し、５５℃で２時間処理した。この溶液にクロロホルム７．５ｍｌを加えて攪拌し、遠心分離により水相を５ｍｌ分取した。
　この水相に３ｍｌのイソプロパノールを添加混合してＤＮＡ画分を回収し、１０ｍＭ　トリス－塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）および１ｍＭ　ＥＤＴＡからなる溶液５００μｌに溶解した。これに、ＲＮａｓｅＡを２０μｇ／ｍｌとなるように加え、３７℃で１時間処理した後、０．８ＭのＮａＣｌを含む１３％ＰＥＧ溶液を５００μｌ加え攪拌し、遠心分離により、水相を５００μｌ分取した。これにフェノール／クロロホルム混合液５００μｌを加えて攪拌し、遠心分離により、水相を５００μｌ分取した。
　この水相に３Ｍ　酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）５０μＬおよびエタノール１ｍｌを添加混合し、ＤＮＡを回収した。
　このＤＮＡを７０％（ｖ／ｖ）エタノールに１０分間浸漬した後、１０ｍＭ　トリス－塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）および１ｍＭ　ＥＤＴＡからなる溶液２００μｌに溶解した。
　［実施例５：ストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp.）ＮＡ６８４由来ＰＬＢ遺伝子のコア領域のクローニング］
　ＰＬＢのＮ末端および内部アミノ酸配列とストレプトマイセス属の使用コドンに基づいて、ＰＣＲ用の縮重オリゴヌクレオチドプライマーＳ１センスプライマー「ｐｒｉｍｅｒ　Ｓ１」（配列番号７）、及び、３種のＡ１アンチセンスプライマーとして「ｐｒｉｍｅｒ　Ａ１－１」（配列番号８）、「ｐｒｉｍｅｒ　Ａ１－２」（配列番号９）、「ｐｒｉｍｅｒ　Ａ１－３」（配列番号１０）を設計した。ここで、配列中のｓはｃまたはｇを表し、ｗはａまたはｔを表し、ｋはｇまたはｔを表している。
　ＰＣＲの反応液組成は次のとおりである。
　実施例４で得た鋳型染色体ＤＮＡ５０ｎｇ、２×ＭｉｇｈｔｙＡｍｐ　Ｂｕｆｆｅｒ　２５μＬ、プライマー各３００ｎＭ、およびＭｉｇｈｔｙＡｍｐ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　１．２５ユニットに、蒸留水を全量５０μｌとなるように添加した。
　ＰＣＲ反応条件は次のとおりである。
　　ステップ１：９８℃、２分；
　　ステップ２：９８℃、１０秒；
　　ステップ３：６６℃、３０秒；
　　ステップ２からステップ３を３０サイクル繰り返す；
　　ステップ４：６６℃、１分３０秒。
　配列番号７～１０を用いたＰＣＲによって、約５００ｂｐの特異的な増幅産物を得た。
　このＰＣＲ反応液についてアガロースゲル電気泳動を行い、目的の５００ｂｐのバンド部分を切り出し、ｐＧＥＭ－Ｔ　Ｅａｓｙ　Ｖｅｃｔｏｒ　ＳｙｓｔｅｍＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、ｐＧＥＭ－Ｔ　Ｅａｓｙ　Ｖｅｃｔｏｒに結合させ、大腸菌を形質転換した。形質転換株をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地（トリプトン１％、酵母エキス０．５％、塩化ナトリウム０．４％、ｐＨ７．２）で培養し、Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　ＤＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ製）を用いてＤＮＡシーケンス用のプラスミドを抽出・精製した。
　続いて、ベクター（ｐＧＥＭ－Ｔ　Ｅａｓｙ　Ｖｅｃｔｏｒ）に由来するＴ７プライマーおよびＳＰ６プライマーを用いて自動シークエンサーによって、挿入断片の塩基配列を決定した。この塩基配列を、配列番号１１に示す。
　［実施例６：ストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp.）由来ＰＬＢ遺伝子のコア領域周辺のクローニング］
　実施例５で決定した遺伝子配列の周辺領域の配列を明らかにするために、インバースＰＣＲによりその上流側と下流側を含むＤＮＡ断片を増幅した。
　実施例４で得た染色体ＤＮＡをＳａｌＩで完全消化し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｈｉｇｈ　 Ｖｅｒ．２（Ｔｏｙｏｂｏ社製）により自己閉環化させた。これを鋳型にして、ホスホリパーゼＢの部分遺伝子配列に基づいて作製したセンスプライマーＳＥ１「ｐｒｉｍｅｒ　ＳＥ１」（配列番号１２）とアンチセンスプライマーＡＮ１「ｐｒｉｍｅｒ　ＡＮ１」（配列番号１３）とを用いて、Ｉｎｖｅｒｓｅ　ＰＣＲを行った。
　ＰＣＲの反応液組成は次のとおりである。
　鋳型ＤＮＡ ２００ｎｇ、２×ＭｉｇｈｔｙＡｍｐ　Ｂｕｆｆｅｒ　２５μｌ、プライマー各３００ｎＭ、およびＭｉｇｈｔｙＡｍｐ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　１．２５ユニットに、蒸留水を全量５０μｌとなるように添加した。
　ＰＣＲ反応条件は次のとおりである。
　　ステップ１：９８℃、２分；
　　ステップ２：９８℃、１０秒；
　　ステップ３：６８℃、５分；
　　ステップ２からステップ３を２０サイクル繰り返す；
　　ステップ４：６８℃、２分。
　このＰＣＲによって、約４，０００ｂｐの特異的な増幅産物が得られ、これをｐＭＤ２０－Ｔベクター（ＴａＫａＲａ製）にてクローニングし、塩基配列を決定した。
　実施例５で決定した塩基配列と併せて上記で決定した塩基配列に基づいて、ストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp.）由来ＰＬＢ遺伝子を含む領域の塩基配列を決定した（配列番号１４の上段）。さらに、構造遺伝子部分についてその塩基配列からアミノ酸配列を推定した（配列番号１４の下段、及び、配列番号１５）。
　図７Ａ及び図７Ｂ（以下、まとめて図７という）は、この決定したＰＬＢ遺伝子を含む領域の塩基配列、および、この塩基配列から推定される構造遺伝子の推定アミノ酸配列を示しており、上段に塩基配列、下段に推定アミノ酸配列を示している。なお、図７の配列は、ＤＤＢＪ　ACCESSION　Ｎｏ．AB602789として非公開登録済みである。
　図７に示す配列解析の結果から、ＰＬＢをコードする構造遺伝子は１，１４６ｂｐのヌクレオチド（終止コドンを含めると１，１４９ｂｐ）からなり、３８２残基のアミノ酸をコードしていることが明らかとなった。この３８２残基は、配列番号１４（図７）のアミノ酸配列の３１位～４１２位である。配列番号１４（図７）のアミノ酸配列の１～３０位が分泌シグナル配列である。
　実施例３にて決定したストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp.）由来の精製酵素のＮ末端および内部アミノ酸配列が、上記の推定アミノ酸配列中に存在し、ほぼ完全に一致していた（図７中に下線で示す）。
　すなわち、配列番号３のアミノ酸配列は、配列番号１４（図７）のアミノ酸配列の３１位からに示される配列となっている。また、配列番号４のアミノ酸配列は、配列番号１４（図７）のアミノ酸配列の１８７位からに示される配列となっている。また、配列番号５のアミノ酸配列は、配列番号１４（図７）のアミノ酸配列の３２７位からに示される配列となっている。ただし、配列番号１４（図７）のアミノ酸配列における３３５位のアミノ酸「Ｉｌｅ」は、配列番号５のアミノ酸配列の９位のアミノ酸では「Ｌｅｕ」となっている。これは、ｎａｎｏＬＣ－ＭＳ／ＭＳではＬｅｕとＩｌｅが判別できないために、Ｌｅｕと判定されたためである。また、配列番号６のアミノ酸配列は、配列番号１４（図７）のアミノ酸配列の１４５位からに示される配列となっている。

　配列類似性検索プログラムＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡを用いることにより、上記の推定アミノ酸配列を４種類のタンパク質配列データベース（ＰＴＲ、ＰＲＦ、 ＵＮＩ－ＰＲＯＴおよびＳＷＩＳＳ－ＰＲＯＴ）内の配列と比較した。その結果、上記推定アミノ酸配列は、Streptomyces sp. C.のPutative uncharacterized protein（ＤＤＢＪ　ACCESSION　Ｎｏ．D9VPC7）と４４％一致した。　また、ストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp.）由来の精製酵素（すなわちＰＬＢ）は、この推定アミノ酸配列のアミノ酸組成に基づいて計算したところ、約４２，０００の分子量を有することが推定された。
　［実施例７：ストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp.）由来ＰＬＢ遺伝子を含む組換えプラスミドの作製］
　放線菌においてストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp.）由来ＰＬＢを発現させるために、形質転換に用いる組換えプラスミドを作製した。
　まず、ストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp.）由来ＰＬＢの構造遺伝子の上流域配列にＮｈｅＩ部位を付加したセンスプライマーＳ２「ｐｒｉｍｅｒ　Ｓ２」（配列番号１６）、および、この構造遺伝子の下流域配列にＢｇｌＩＩ部位を付加したアンチセンスプライマーＡ２「ｐｒｉｍｅｒ　Ａ２」（配列番号１７）を設計した。次いで、これらのプライマーを用いて、実施例４で得た染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。
　ＰＣＲの反応液組成は次のとおりである。
　鋳型染色体ＤＮＡ　２００ｎｇ、１０×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ　１５μｌ、プライマー 各５００ｎＭ、ｄＮＴＰ混合物　各０．３ｍＭ、ＭｇＣｌ２　１．２５ｍＭ、ＤＭＳＯ　３％、およびＫＯＤ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　２．５ユニットに、蒸留水を全量５０μｌとなるように添加した。
　ＰＣＲ反応条件は次のとおりである。
　　ステップ１：９８℃、２分；
　　ステップ２：９８℃、１５秒；
　　ステップ３：６５℃、２秒；
　　ステップ４：７４℃、３０秒；
　　ステップ２からステップ４を３０サイクル繰り返す；
　　ステップ５：７４℃、１分３０秒。
　このＰＣＲにより約１２００ｂｐの特異的な増幅産物が得られた。
　この増幅された断片をＮｈｅＩとＢｇｌＩＩで消化し、発現ベクターである放線菌プラスミドのＮｈｅＩ－ＢｇｌＩＩ部位に挿入して、組換えプラスミドを得た。ここで、シグナル配列とターミネーターは、ホスホリパーゼ酵素遺伝子のものを用いたが、別の遺伝子由来のものを適宜組み合わせて用いても良い。
　［実施例８：ストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp.）由来ＰＬＢ遺伝子を発現する組換え放線菌の作製］
　実施例７で得た組換えプラスミドを用いて、「ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ　ＳＴＲＥＰＴＯＭＹＣＥＳ　ＧＥＮＥＴＩＣＳ（Ｋｉｅｓｅｒら、Ｊｏｈｎ　Ｉｎｎｅｓ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、２０００年）」に記載の方法に従い、プロトプラスト化された放線菌ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌｉｖｉｄａｎｓ）１３２６を形質転換し、組換え放線菌を得た。
　［実施例９：ストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp.）由来ホスホリパーゼＢ遺伝子を発現する組換え放線菌の酵素活性測定］
　実施例８で得た組換え放線菌を、２０μｇ／ｍＬのチオストレプトンを含む１００ｍＬのトリプチックソイ培地（ベクトン・ディッキンソン社製）で培養した。得られた培養液から遠心分離（１５０００ｒｐｍ、５分、４℃）にて上清を回収し、８０％（ｗ／ｖ）飽和となるように硫酸アンモニウムを加えた。４℃で１６時間放置し、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１５分、４℃）にて、沈殿を回収した。回収した沈殿を１０ｍｌの２０ｍＭトリス－塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、２０ｍＭ　トリス－塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を外液として透析を行い、１５ｍｌの酵素溶液を得た。
　この酵素溶液の酵素活性を、上記「ＰＬＢ活性標準測定方法」に記載した酵素活性の測定方法に従って、ジミリストイルホスファチジン酸を基質として用い、ｐＨ８．４で５０℃で酵素活性を測定した。その結果、１００Ｕ／ｍｌ（下限は６０Ｕ／ｍｌ）を超える強い活性を示す培養上清が得られた。また、透析後の酵素溶液（１５ｍｌ）の酵素活性はさらに強い活性（７７０Ｕ／ｍｌ以上）を示した。なお、ベクターであるプラスミドをそのまま用いて形質転換した放線菌では、ＰＬＢ活性は検出されなかった。
　［菌種の特定］
　上記の実施例で用いたストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp.）ＮＡ６８４は、生理性状試験と、塩基配列に基いた１６Ｓ　ｒＤＮＡ塩基配列解析との結果によって、菌種が特定された。
　本発明によれば、新規なＰＬＢおよびその製造方法が提供される。ＰＬＢをリン脂質に作用させて生成されるリゾリン脂質、グリセロール－３－リン酸、及び、グリセロール－３－ホスホコリンなどのグリセロール－３－リン酸エステル化合物は、食品および化粧品の基材などとして有用である。本発明による酵素は、ＰＥ以外のリン脂質によく作用することが可能で、特に、ＰＡとＰＣによく作用する。ＰＥにほとんど作用しない性質を利用すれば粗リン脂質からＰＥのみを残存させ、その純度を高めることが可能である。これによって、高純度のＰＥを製造することが期待できる。また、リゾホスファチジルイノシトール（ＬＰＩ）は抗カビ剤、リゾホスホグリセロール（ＬＰＧ）は起泡力安定剤、澱粉の老化防止剤、麺類の改質剤、リゾホスファチジルエタノールアミン（ＬＰＥ）：神経栄養作用（ストレス、うつ、認知症など）、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）：受精卵着床の促進（着床改善薬）、毛の形成（育毛）、強い細胞増殖作用、リゾホスファチジルセリン（ＬＰＳ）：肥満細胞の活性化を促進（アレルギーやアトピーに関与）など多くの生理活性を示すリゾレシチンを製造するのに有効である。さらに、食品素材に本発明による酵素を混合し、素材中に存在するリン脂質を加水分解することでその素材の機能性を高めたり、物性を改良することが可能となる。
　本発明による酵素を用いて製造可能なグリセロール－３－ホスホコリン（ＧＰＣ）は認知症予防などが期待されている。また、グリセロール－３－ホスホイノシトール（ＧＰＩ）は善玉コレステロール増加効果が認められるなど有用性が期待できる。
寄託機関の名称：独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）
寄託機関のあて名：日本国 〒292-0818 千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8
寄託の日付：２０１１年１月２６日
受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－１０１５
配列番号１：ＰＬＢ（ポリペプチド）
配列番号２：ＰＬＢ発現遺伝子
配列番号３：ＰＬＢのＮ末端配列
配列番号４：ＰＬＢの内部配列
配列番号５：ＰＬＢの内部配列
配列番号６：ＰＬＢの内部配列
配列番号７：プライマーＳ１
配列番号８：プライマーＡ１－１
配列番号９：プライマーＡ１－２
配列番号１０：プライマーＡ１－３
配列番号１１：ＰＬＢ発現遺伝子の内部配列
配列番号１２：プライマーＳＥ１
配列番号１３：プライマーＡＮ１
配列番号１４：ＰＬＢ発現遺伝子
配列番号１５：ＰＬＢ（ポリペプチド）
配列番号１６：プライマーＳ２
配列番号１７：プライマーＡ２

Claims (14)

  1. 　リン脂質のｓｎ－１位およびｓｎ－２位のアシル基を加水分解して、リゾリン脂質、グリセロール－３－リン酸、及び、グリセロール－３－リン酸エステル化合物から選ばれる１種以上を生成する酵素であって、以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のポリペプチドを含む、酵素：
    （ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
    （ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列を有し、かつ該加水分解活性を示すポリペプチド；または
    （ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも７５％の相同性を有し、かつ該加水分解活性を示すポリペプチド。
  2. 　ジミリストイルホスファチジン酸を基質としたときに、ｐＨ８．４で３７℃にて５分間の条件での加水分解活性を１００％とした場合に、ｐＨ７．２からｐＨ１０．０の範囲内で５０％以上の加水分解活性を示す、請求項１に記載の酵素。
  3. 　ジミリストイルホスファチジン酸を基質としたときに、ｐＨ８．４で５０℃にて５分間の条件での加水分解活性を１００％とした場合に、該条件での加水分解活性が、ホスファチジルコリンに対して９５％以上、ホスファチジルイノシトール及びホスファチジルグリセロールに対して２０％以上、ホスファチジルセリンに対して２５％以上であり、スフィンゴミエリン、ホスファチジルエタノールアミン、トリステアリンおよびジパルミトイルグリセリドに対してほぼ０％である基質特異性を有する、請求項１または２に記載の酵素。
  4. 　アミノ酸配列から算出した等電点が６．２～６．６の範囲内である、請求項１から３のいずれかに記載の酵素。
  5. 　ＳＤＳ－ＰＡＧＥで測定した場合の分子量が３８，０００～４０，０００の範囲内であり、アミノ酸組成より分析した場合の分子量が４１，０００～４３，０００の範囲内である、請求項１から４のいずれかに記載の酵素。
  6. 　ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物に由来する、請求項１から５のいずれかに記載の酵素。
  7. 　請求項１から６のいずれかに記載の酵素をコードする、ポリヌクレオチド。
  8. 　以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む、請求項７に記載のポリヌクレオチド：
    （ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
    （ｂ）配列番号１に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド；または
    （ｃ）配列番号１に記載の塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド。
  9. 　ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物に由来する、請求項７または８に記載のポリヌクレオチド。
  10. 　請求項７から９のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
  11. 　請求項７から９のいずれかに記載のポリヌクレオチドまたは請求項１０に記載のベクターが導入され、リン脂質からリゾリン脂質、グリセロール－３－リン酸、及び、グリセロール－３－リン酸エステル化合物から選ばれる１種以上を生成する酵素を産生する能力を保有する、形質転換体。
  12. 　前記形質転換体の宿主が、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物である、請求項１１に記載の形質転換体。
  13. 　リン脂質に作用し、該リン脂質を加水分解してリゾリン脂質、グリセロール－３－リン酸、及び、グリセロール－３－リン酸エステル化合物から選ばれる１種以上を生成する酵素を製造する方法であって、
    　請求項７から９のいずれかに記載のポリヌクレオチドまたは請求項１０に記載のベクターを宿主に導入して、該酵素を産生する形質転換体を得る工程；および
    　該形質転換体を培養して該酵素を産生させる工程；
    　を含む、製造方法。
  14. 　前記宿主が、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物である、請求項１３に記載の製造方法。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ABDELKAFI S ET AL.: "Identification and biochemical characterizaion of a GDSL-motif carboxyester hydrolase from Carica papaya latex", BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA, vol. 1791, 2009, pages 1048 - 1056 *
AKOH CC ET AL.: "GDSL family of serine esterases/lipases", PROGRESS IN LIPID RESEARCH, vol. 43, 2004, pages 534 - 552 *
ASLER IL ET AL.: "Probing Enzyme Promiscuity of SGNH Hydrolases", CHEMBIOCHEM, vol. 11, 2010, pages 2158 - 2167 *
BANERJI S ET AL.: "The manifold phospholipases A of Legionella pneumophila- Identification, export, regulation, and their link to bacterial virulence", INT J MED MICROBIOL., vol. 298, 2008, pages 169 - 181 *
CRUZ H ET AL.: "Sequence of the Streptomyces albus G lipase-encoding gene reveals the presence of a prokaryotic lipase family", GENE, vol. 144, 1994, pages 141 - 142 *
VERMA JN ET AL.: "Characterization of phospholipase A in Streptomyces griseus", INDIAN J MED RES., vol. 72, 1980, pages 487 - 491 *
VUJAKLIJA D ET AL.: "A novel streptomycete lipase: cloning, sequencing and high-level expression of the Streptomyces rimosus GDS(L)- lipase gene", ARCH MICROBIOL., vol. 178, 2002, pages 124 - 130 *

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