WO2012095804A1 - Means for reducing or eradicating the tumour capacity of cancer stem cells and/or metastatic stem cells. - Google Patents

Means for reducing or eradicating the tumour capacity of cancer stem cells and/or metastatic stem cells. Download PDF

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WO2012095804A1
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tumor
molecules
population
metastatic
stem cells
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PCT/IB2012/050144
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Cédric DARINI
Christian Dani
Milou Daniel DRICI
Annie Ladoux
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Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs)
Universite De Nice Sophia Antipolis
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Definitions

  • the invention aims to provide new CSC lines capable of forming metastases and their use for testing new anti-cancer molecules.
  • embryonic signature defined by the expression of Oct-4 and / or Nanog and / or Sox2, as well as other genes present in embryonic stem cells, but at very low levels compared to stem cells embryonic,
  • CXCR4 receptor involved in the migration of cancer stem cells, as well as other markers of tumor stem cells such as CD44 or CD133;
  • the cells were inoculated in the appropriate culture medium in the presence of 10% fetal calf serum and cultured at 37 ° C in a humid atmosphere containing 5% CO 2 . After 24 hours of culture allowing the cells to adhere to the walls of the culture dishes, the HIV protease inhibitors are added to the culture medium at the indicated concentrations and the cells are cultured for an additional 72 hours. The cells are then cleaved with trypsin and counted using a Coulter Beckman ZI counter.
  • the IC 50 values for this effect are 0.2 ⁇ g / ml, that is to say 0.3 ⁇ , and do not differ according to the origin of the tumor.
  • nelfinavir doses of nelfinavir that are effective in decreasing the proliferation of SCCs are of the same order of magnitude as the concentrations measured in the blood of treated patients.
  • Figure 3 shows that salinomycin, a molecule identified as being effective in decreasing breast cancer stem cell proliferation (WO 2009/126310 by Gupta et al), does not specifically target SCCs that express markers of embryonic stem cells. The effects of this molecule have been studied on the proliferation of SCCs and the total tumor population isolated from adenocarcinoma.
  • the HIV protease inhibitors are added to the culture medium at the indicated concentrations and the cells are cultured for an additional 48 hours. The cells are then cleaved with trypsin and analyzed by flow cytometry.
  • mice were injected with 250,000 cells in matrigel® subcutaneously in the back. They were treated (T) with two daily injections of Kaletra® which correspond to the following concentrations: LPV: 0.4 mg / mouse / injection & RTV: 0.1 mg / mouse / injection.
  • the control lot (C) receives an equivalent amount of glucose serum (5% w / v).
  • the presence of stem cells is analyzed after different days of treatment thanks to the light emission. After 55 days of treatment, the mice are sacrificed and the tumors are weighed.
  • mice per condition for each CSC line indicate that after 7 days of treatment, there is no significant difference between the development of tumors in control or treated mice. There is a decrease in tumor growth from 21 days if the cells are derived from adenocarcinoma and 34 days of treatment if the cells are derived from the intestinal tumor. After 55 days of treatment, tumor development is inhibited in 3 out of 4 mice and decreased for a single treated mouse.
  • Figure 7 shows the effect of molecules corresponding to modified lopinavir on the proliferation of cancer stem cells of adenocarcinoma (FIG. 7A) and intestinal tumor (FIG. 7B).
  • the compound of formula (V) does not inhibit the proliferation of SCCs at active concentrations for lopinavir in

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Abstract

The subject matter of the invention is molecules with anti-protease activity for preferentially targeting, in a tumour, the population of cancer stem cells, or CSCs, and/or the metastatic stem cells, expressing embryonic stem cell markers, including Oct-4 and/or Nanog and/or Sox2, defining an embryonic signature in order to reduce the tumour or metastatic capacity of said population, or even to eradicate same. (No figure to be published).

Description

Moyens pour réduire ou éradiquer le pouvoir tumoral de cellules souches cancéreuses et/ou métastasiques  Means for reducing or eradicating the tumor power of cancerous and / or metastatic stem cells
L'invention a pour objet des moyens, à savoir des molécules et des méthodes, pour réduire, voire éradiquer des cellules souches cancéreuses (CSC en abrégé) et/ou métastasiques. Elle concerne également des lignées de cellules souches métastasiques permettant la formation de tumeurs sur des modèles animaux constituant des outils de criblage pour ces molécules. The subject of the invention is means, namely molecules and methods, for reducing or even eradicating cancer stem cells (CSC abbreviated) and / or metastatic cells. It also relates to metastatic stem cell lines allowing the formation of tumors on animal models constituting screening tools for these molecules.
Les CSC comprennent des populations hétérogènes. Certaines de ces cellules sont capables de reformer la tumeur d'origine, alors que d'autres forment des récidives. Plusieurs types de CSC ont été isolés grâce à l'expression de marqueurs de surface, tels que le CD44 ou le CD 133 qui ne portent pas le pouvoir tumoral ou grâce à des enzymes spécifiques comme l'aldéhyde deshydrogénase à partir de différentes tumeurs.  CHCs include heterogeneous populations. Some of these cells are able to reform the original tumor, while others form recurrences. Several types of SCCs have been isolated by the expression of surface markers, such as CD44 or CD133 that do not carry tumor power or through specific enzymes such as aldehyde dehydrogenase from different tumors.
Peu nombreuses, mais très agressives, elles peuvent survivre aux traitements anticancéreux, dont la chimiothérapie, et reformer une tumeur ou des métastases si le traitement est inapproprié. Few, but very aggressive, can survive cancer treatments, including chemotherapy, and reform a tumor or metastases if the treatment is inappropriate.
En effet, les chimiothérapies conventionnelles proposées à ce jour s'attaquent à toute la population tumorale. Il s'ensuit que les réductions de taille des tumeurs résultent principalement de l'élimination des cellules qui ne portent pas le pouvoir tumoral.  Indeed, conventional chemotherapy proposed to date attack the entire tumor population. It follows that reductions in tumor size result mainly from the elimination of cells that do not carry tumor power.
II est donc important de valider de nouvelles thérapies qui s'attaquent spécifiquement à une population de CSC pour proposer des traitements efficaces pour soigner les cancers et empêcher leurs récidives. It is therefore important to validate new therapies that specifically target a population of SCC to offer effective treatments to treat cancers and prevent their recurrence.
Selon une approche originale, les inventeurs ont élaboré un modèle animal permettant d'isoler et de caractériser une population de CSC ayant un très fort potentiel tumoral, retrouvée dans des tumeurs solides d'origines diverses (tumeurs mésenchymateuses, adénocarcinomes, tumeurs intestinales et tumeurs du poumon). Le pouvoir antitumoral de composés à tester a été évalué sur des lignées d'une telle population et sur les populations cellulaires totales provenant des mêmes tumeurs, ce qui a permis aux inventeurs de mettre en évidence l'efficacité de composés tels que des antiprotéases , des molécules ayant la structure de base d' antiprotéases, pouvant être modifiées, notamment par délétion ou addition de groupes chimiques (IP) pour réduire la prolifération et la survie de populations spécifiques de CSC responsables du pouvoir tumoral et des récidives. According to an original approach, the inventors have developed an animal model that makes it possible to isolate and characterize a population of SCC with a very high tumor potential, found in solid tumors of various origins (mesenchymal tumors, adenocarcinomas, intestinal tumors and tumor tumors). lung). The antitumor power of test compounds was evaluated on lines of such a population and on the total cell populations from the same tumors, which allowed the inventors to demonstrate the effectiveness of compounds such as antiproteases, molecules having the basic structure of antiproteases, which can be modified, in particular by deletion or addition of chemical groups (IP) to reduce the proliferation and survival of specific populations of SCC responsible for tumor and recurrence.
Selon un aspect de grand intérêt, ces effets sont obtenus en utilisant ces antiprotéases et les doses efficaces pour traiter les CSC sont plus faibles que celles efficaces pour traiter la population cellulaire issue de la tumeur totale.  According to one aspect of great interest, these effects are obtained by using these protease inhibitors and the effective doses for treating SCCs are lower than those effective for treating the cell population derived from the total tumor.
L'invention a donc pour but de fournir de nouvelles molécules pour réduire le pouvoir tumoral ou métastasique d'une population de CSC à fort pouvoir tumoral, cette utilisation correspondant à une nouvelle application thérapeutique de médicaments déjà utilisés comme antiviraux et possédant des propriétés anticancéreuses. Elle a également pour but de fournir des moyens pour mesurer l'efficacité de traitements anticancéreux sur la population responsable du pouvoir tumoral et permettre ainsi de développer de nouvelles stratégies de traitements anticancéreux. The object of the invention is therefore to provide novel molecules for reducing the tumoral or metastatic power of a high tumor population of CSC, this use corresponding to a new therapeutic application of drugs already used as antivirals and having anti-cancer properties. It also aims to provide means to measure the effectiveness of cancer treatments on the population responsible for tumor power and thus to develop new strategies for cancer treatments.
L'invention vise de plus à fournir des formulations de compositions pharmaceutiques les renfermant à faible dose.  The invention further aims to provide formulations of pharmaceutical compositions containing them in low doses.
Selon encore un autre but, l'invention vise à fournir de nouvelles lignées de CSC capables de former des métastases et leur utilisation pour tester des nouvelles molécules anti-cancéreuses.  According to yet another object, the invention aims to provide new CSC lines capable of forming metastases and their use for testing new anti-cancer molecules.
Selon un premier aspect, l'invention vise ainsi des molécules à activité anti-protéases ou des dérivés de ces molécules pour cibler préférentiellement, in vitro et in vivo, la population des cellules souches cancéreuses murines ou humaines, exprimant des marqueurs de cellules souches embryonnaires, dont Oct-4, et/ou Nanog et/ou Sox2, désignant une « signature embryonnaire » et/ou ayant un potentiel métastasique, afin de réduire le pouvoir tumoral de ladite population, voire de l'éradiquer. Il s'agit donc de molécules actives sur les cellules directement responsables du pouvoir tumoral. According to a first aspect, the invention thus targets molecules with anti-protease activity or derivatives of these molecules for targeting, preferably, in vitro and in vivo, the population of murine or human cancer stem cells, expressing embryonic stem cell markers. , including Oct-4, and / or Nanog and / or Sox2, designating an "embryonic signature" and / or having a metastatic potential, in order to reduce the tumor power of said population, or even to eradicate it. It is therefore active molecules on cells directly responsible for tumor power.
Lesdites CSC cancéreuses ou métastasiques peuvent exprimer en outre d'autres marqueurs de cellules souches dont CXCR4 et/ou CD44 et/ou CD133, cette These cancerous or metastatic CSCs may further express other stem cell markers including CXCR4 and / or CD44 and / or CD133, this
énumération ne présentant pas de caractère limitatif. Lesdites molécules sont plus spécialement des inhibiteurs de protéases et/ou sont capables d'induire un stress du réticulum endoplasmique ou un arrêt du cycle cellulaire ou encore d'induire une autophagie. Ces molécules diminuent la prolifération in vitro de ladite population de CSC avec une IC50 , vis-à-vis de ladite population de CSC ou de cellules souches métastasiques, signifîcativement inférieure par rapport à l'ICso vis-à-vis de la population tumorale totale. enumeration not limiting. Said molecules are more especially inhibitors of proteases and / or are capable of inducing endoplasmic reticulum stress or cell cycle arrest or inducing autophagy. These molecules decrease the in vitro proliferation of said CSC population with an IC 50 towards said population of CSC or metastatic stem cells, significantly lower than the IC 50 vis-à-vis the tumor population total.
Il s'agit avantageusement de molécules capables d'inhiber la prolifération cellulaire des CSC et/ou d'induire leur mort par apoptose ou par nécrose, ou d'inhiber l'expression de molécules anti- apoptotiques, à des doses n'affectant pas la population tumorale totale. De plus, elles s'avèrent capables de réduire in vivo la formation d'allogreffes ou de xénogreffes après injection de CSC dans des souris immunodéfïcientes. Des inhibiteurs de protéases de grand intérêt comprennent des inhibiteurs de la protéase du VIH à des doses thérapeutiquement acceptables ou à des doses leur conférant un effet de booster, ou de dérivés de ces inhibiteurs. These are advantageously molecules capable of inhibiting the cell proliferation of SCCs and / or of inducing their death by apoptosis or necrosis, or of inhibiting the expression of anti-apoptotic molecules, at doses which do not affect the total tumor population. In addition, they are found to be able to reduce in vivo the formation of allografts or xenografts after injection of CSC into immunodeficient mice. Protease inhibitors of high interest include HIV protease inhibitors at therapeutically acceptable doses or booster doses, or derivatives of these inhibitors.
On citera plus particulièrement les inhibiteurs du groupe comprenant le lopinavir, le nelfïnavir, le saquinavir, seuls ou en co-administration, une association de lopinavir et de ritonavir, et/ou des dérivés de ces molécules. In particular, the inhibitors of the group comprising lopinavir, nelfinavir, saquinavir, alone or in co-administration, a combination of lopinavir and ritonavir, and / or derivatives of these molecules.
Ces composés répondent aux formules (I) à (IV) ci-dessous : These compounds correspond to formulas (I) to (IV) below:
FF
Figure imgf000005_0001
Figure imgf000005_0001
Formule IV
Figure imgf000005_0002
Form IV
Figure imgf000005_0002
D'autres inhibiteurs comprennent des dérivés de composés à activité anti-protéase, notamment des composés ci-dessus. On citera les analogues du lopinavir de formules V et VI suivantes: Other inhibitors include derivatives of compounds with anti-protease activity, including compounds above. The following are the analogues of lopinavir of formulas V and VI:
Figure imgf000005_0003
Figure imgf000005_0003
Formule V Formule VI Les composés de formule (V) (CAS Registry number : 192726-05-9) et de formule (VI) (CAS Registry number : 192725-49-8) ont été utilisés pour déterminer l'importance de certains groupements chimiques pour l'efficacité de l'activité des IP sur les CSC. On notera que la tumeur a été développée dans les organes d'un modèle murin par injection par voie sous-cutanée ou par voie systémique de lignées de cellules souches cancéreuses métastasiques isolées selon l'expression de marqueurs de cellules souches embryonnaires désignant la « signature embryonnaire », dont Oct-4. Formula V Formula VI The compounds of formula (V) (CAS Registry number: 192726-05-9) and of formula (VI) (CAS Registry number: 192725-49-8) were used to determine the importance of certain chemical groups for the effectiveness of NP activity on CHCs. It should be noted that the tumor was developed in the organs of a murine model by subcutaneous or systemic injection of metastatic cancer stem cell lines isolated according to the expression of embryonic stem cell markers denoting the "embryonic signature. , Of which Oct-4.
Selon un deuxième aspect, l'invention vise des compositions pharmaceutiques renfermant une quantité thérapeutiquement efficace spécifiquement sur les CSC (sans lien obligatoire avec les concentrations thérapeutiques de l'activité antiprotéasique), d'au moins une molécule telle que définie ci-dessus en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, la concentration de la ou des molécules étant plus faible que celle efficace CSC sur la population cellulaire totale de la tumeur. Il est à noter que le composé (V) possède le groupement hydroxyle qui est important pour l'activité antiprotéase (commun à tous les IP) et que sa perte d'activité est liée à la perte d'un autre groupement (Voir exemple 4). According to a second aspect, the invention relates to pharmaceutical compositions containing a therapeutically effective amount specifically on SCCs (without any mandatory link with therapeutic concentrations of antiprotease activity), of at least one molecule as defined above in combination with a pharmaceutically acceptable vehicle, the concentration of the molecule (s) being lower than that effective CSC on the total cell population of the tumor. It should be noted that the compound (V) has the hydroxyl group which is important for the antiprotease activity (common to all PIs) and that its loss of activity is linked to the loss of another grouping (see Example 4). ).
Les doses de médicaments seront adaptées par le clinicien selon l'âge et l'état du patient. De manière générale, la dose pharmaceutiquement efficace correspond à la dose d'inhibiteur de principe actif qui donnera les résultats les plus efficaces en termes d'efficacité de traitement pour un sujet précis (aussi appelé patient) et dépendra de l'activité, de la pharmacocinétique, de la pharmacodynamique, de la condition physiologique du sujet (ce qui inclut l'âge, le sexe, le poids, la condition physique générale, la surface corporelle, la capacité de réponse à un dosage et à un type de traitement, la nature d'un excipient acceptable dans la formulation, la voie d'administration parmi des facteurs potentiels. Les personnes qualifiées dans l'art de la pharmacologie pourront déterminer ces facteurs au travers d'expérience de routine en surveillant les sujets et en adaptant les doses (Remington : The science and practice of phamacology (Gennaro ed. 20th édition Williams and Wilkins Pa, USA 2000). Les compositions pharmaceutiques se présentent sous toute forme appropriée, en particulier pour une administration par voie orale ou injectable. Drug doses will be adjusted by the clinician according to the age and condition of the patient. In general, the pharmaceutically effective dose corresponds to the dose of active ingredient inhibitor which will give the most effective results in terms of treatment efficacy for a specific subject (also called patient) and will depend on the activity, the pharmacokinetics, pharmacodynamics, physiological condition of the subject (including age, sex, weight, general physical condition, body surface area, ability to respond to a dosage and type of treatment, the nature of an acceptable excipient in the formulation, the route of administration among potential factors, those skilled in the art of pharmacology will be able to determine these factors through routine experience in monitoring subjects and adjusting doses (Remington: The Science and Practice of Phamacology (Gennaro ed., 20th edition Williams and Wilkins Pa, USA 2000). The pharmaceutical compositions are in any suitable form, particularly for oral or injectable administration.
Lesdites molécules ou compositions pharmaceutiques sont de grand intérêt pour le traitement de tumeurs issues des cellules germinales, des tumeurs de haut grade et de mauvais pronostic et/ou de tumeurs formant des métastases.  Said molecules or pharmaceutical compositions are of great interest for the treatment of germ cell tumors, high grade tumors and poor prognosis and / or tumors forming metastases.
Elles peuvent être utilisées en combinaison avec les traitements classiques de chirurgie ou de radiothérapie ou d'autres traitements de chimiothérapie, ou encore des traitements visant à réduire l'expression des gènes responsables de leur pouvoir tumoral et/ou métastasique comme l'ARM, en utilisant par exemple des siRNA ou des shRNA dirigés contre les marqueurs de cellules souches embryonnaires tels que Oct-4, Nanog, Sox2 ou CXCR4 ou CD44. They can be used in combination with conventional treatments for surgery or radiotherapy or other chemotherapy treatments, or treatments aimed at reducing the expression of the genes responsible for their tumor and / or metastatic power, such as MRA, in for example using siRNAs or shRNAs directed against embryonic stem cell markers such as Oct-4, Nanog, Sox2 or CXCR4 or CD44.
On notera que les populations de CSC exprimant des marqueurs de cellules souches embryonnaires désignant la « signature embryonnaire » dont Oct-4 sont présentes dans des tumeurs solides (sarcomes ou adénocarcinomes d'origines tissulaires différentes) comme les cancers de cellules souches germinales, sarcomes d'Ewing, ostéosarcomes, glioblastomes de haut grade, hépatocarcinomes, mélanomes, adénocarcinomes et cancers du sein, du colon, du rein, de la vessie et du poumon. It will be noted that CSC populations expressing embryonic stem cell markers designating the "embryonic signature" of which Oct-4 are present in solid tumors (sarcomas or adenocarcinomas of different tissue origins) such as germline stem cell cancers, Ewing, osteosarcomas, high-grade glioblastomas, hepatocarcinomas, melanomas, adenocarcinomas and cancers of the breast, colon, kidney, bladder and lung.
L'invention peut donc être mise en œuvre dans le traitement de plusieurs types de tumeurs primaires et/ou de leurs récidives. The invention can therefore be implemented in the treatment of several types of primary tumors and / or their recurrences.
De manière avantageuse, un modèle murin est utilisé pour isoler et caractériser, à partir de tumeurs d'origines différentes, des CSC exprimant les gènes impliqués dans Γ autorenouvellement des cellules souches embryonnaires dont le gène Oct-4 indispensable à Γ autorenouvellement des cellules souches embryonnaires murines ou humaines. Advantageously, a murine model is used to isolate and characterize, from tumors of different origins, CSCs expressing the genes involved in the self-renewal of embryonic stem cells, including the Oct-4 gene, which is essential for the self-renewal of embryonic stem cells. murine or human.
Les souris utilisées sont invalidées pour le gène suppresseur de tumeur p53 et expriment un transgène permettant l'expression de la GFP et un gène de résistance à la puromycine sous le contrôle du promoteur ^ Oct-4. Elles développent des tumeurs spontanément dans différents organes. De manière avantageuse, ce modèle reflète une grande partie des tumeurs humaines. Les mutations du gène p53 sont en effet à l'origine d'environ la moitié des cancers retrouvés chez l'Homme. The mice used are invalidated for the p53 tumor suppressor gene and express a transgene for expression of GFP and a puromycin resistance gene under the control of the Oct-4 promoter. They develop tumors spontaneously in different organs. Advantageously, this model reflects a much of human tumors. The mutations of the p53 gene are responsible for about half of the cancers found in humans.
Les cellules exprimant Oct-4 dans ces tumeurs sont détectées avec par exemple un gène rapporteur comme la Green Fluorescent Protein (GFP en abrégé) et possèdent un gène de résistance permettant leur sélection comme celui à la puromycine.  Cells expressing Oct-4 in these tumors are detected with for example a reporter gene such as Green Fluorescent Protein (GFP for short) and possess a resistance gene allowing their selection as that with puromycin.
Les cellules détectées sont isolées, sélectionnées par la puromycine et amplifiées. Ces CSC peuvent induire des allogreffes après injection sous-cutanée ou des métastases par injection intrapéritonéale ou par voie systémique dans des souris immunodéfïcientes. Les cellules souches cancéreuses, telles qu'isolées et amplifiées à partir de tumeurs d'origines différentes comme défini ci-dessus, constituent des outils de grand intérêt pour le criblage de molécules capables de cibler préférentiellement dans une tumeur la population des CSC exprimant des marqueurs de cellules souches embryonnaires dont Oct-4 et/ou Nanog et/ou Sox2. Comme types de tumeur, on citera des tumeurs mésenchymateuses sous-cutanées des adénocarcinomes sous-cutanés, des tumeurs de l'intestin et des tumeurs pulmonaires.  Detected cells are isolated, selected by puromycin and amplified. These SCCs can induce allografts after subcutaneous injection or metastasis by intraperitoneal injection or systemic injection in immunodeficient mice. The cancer stem cells, as isolated and amplified from tumors of different origins as defined above, constitute tools of great interest for the screening of molecules capable of preferentially targeting in a tumor the population of SCC expressing markers. embryonic stem cells including Oct-4 and / or Nanog and / or Sox2. Tumor types include subcutaneous mesenchymal tumors of subcutaneous adenocarcinomas, tumors of the intestine and lung tumors.
Ces cellules sont caractérisées en ce que These cells are characterized in that
elles expriment une « signature embryonnaire » définie par l'expression d' Oct-4 et/ou Nanog et/ou Sox2, ainsi que d'autres gènes présents dans les cellules souches embryonnaires, mais à des niveaux très bas par rapport aux cellules souches embryonnaires,  they express an "embryonic signature" defined by the expression of Oct-4 and / or Nanog and / or Sox2, as well as other genes present in embryonic stem cells, but at very low levels compared to stem cells embryonic,
- elles expriment aussi le récepteur CXCR4 impliqué dans la migration des cellules souches cancéreuses, ainsi que d'autres marqueurs de cellules souches tumorales comme le CD44 ou le CD133;  they also express the CXCR4 receptor involved in the migration of cancer stem cells, as well as other markers of tumor stem cells such as CD44 or CD133;
leur pouvoir tumoral mesuré par la formation d' allogreffes dans des souris immunodéfïcientes est de 25 à 250 fois plus important que celui de la population tumorale totale. Elles forment des tumeurs transplantables en série chez l'animal.  their tumor power measured by the formation of allografts in immunodeficient mice is 25 to 250 times greater than that of the total tumor population. They form serial transplantable tumors in animals.
- ces cellules sont capables de s'autorenouveler et de se différencier en ostéoblastes in vitro.  these cells are able to self-renew and to differentiate into osteoblasts in vitro.
les tumeurs obtenues in vivo contiennent toutes des zones avec des cellules osseuses immatures tumors obtained in vivo all contain areas with cells immature bone
- une régression du développement des allogreffes est observée si on diminue l'expression d'Oct-4 par AR avec des siRNA et/ou des shRNA.  a regression of the development of allografts is observed if the expression of Oct-4 by AR with siRNAs and / or shRNAs is decreased.
lorsqu'elles sont injectées en intrapéritonéal ou dans la circulation sanguine de souris immunodéfïcientes, des métastases sont formées.  when injected intraperitoneally or into the bloodstream of immunodeficient mice, metastases are formed.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés dans les exemples qui suivent aux fins d'illustration de l'invention. Dans ces exemples, il est fait référence aux figures 1 à 7, qui représentent respectivement, Other features and advantages of the invention are given in the examples which follow for purposes of illustration of the invention. In these examples, reference is made to FIGS. 1 to 7, which represent, respectively,
l'effet, sur la prolifération des cellules tumorales issues d'un adénocarcinome, du lopinavir seul (Figure 1 A) et d'un mélange lopinavir + ritonavir (Figure 1B), l'effet, sur des cellules tumorales d'une tumeur intestinale, du lopinavir seul (Figure 1C) et d'un mélange de lopinavir + ritonavir (Figure 1D);  the effect on the proliferation of tumor cells derived from an adenocarcinoma, lopinavir alone (FIG. 1 A) and a lopinavir + ritonavir mixture (FIG. 1B), the effect on tumor cells of an intestinal tumor , lopinavir alone (Figure 1C) and a mixture of lopinavir + ritonavir (Figure 1D);
l'effet, sur la prolifération des cellules tumorales issues d'un adénocarcinome, du nelfïnavir (Figure 2A), du saquinavir (Figure 2B) et du ritonavir (Figure 2C) ; l'effet, sur la prolifération des cellules tumorales issues d'un adénocarcinome, de la salinomycine, une molécule déjà décrite pour diminuer la prolifération de CSC isolées à partir de tumeur du sein en utilisant d'autres critères. (Figure 3) ; l'induction de la mort cellulaire par les IP dans les CSC : Figures 4A à 4D chez un adénocarcinome ; Figures 4E à 4H chez une tumeur intestinale ; l'induction de l'apparition de la forme clivée de la caspase 3 en traitant des CSC issues d'un adénocarcinome par des doses croissantes de lopinavir (Figure 41).  the effect on proliferation of tumor cells derived from adenocarcinoma, nelfinavir (Figure 2A), saquinavir (Figure 2B) and ritonavir (Figure 2C); the effect, on the proliferation of tumor cells derived from an adenocarcinoma, of salinomycin, a molecule already described for decreasing the proliferation of CSCs isolated from breast tumor using other criteria. (Figure 3); induction of cell death by PIs in CSC: Figures 4A to 4D in adenocarcinoma; Figures 4E to 4H in an intestinal tumor; the induction of the appearance of the cleaved form of caspase 3 by treating adenocarcinoma SCCs with increasing doses of lopinavir (Figure 41).
- l'analyse dans des souris contrôles ou traitées 2 fois par jour par du Kaletra® de la progression tumorale induite par les CSC d'un adénocarcinome (Figures 5A à 5D) et d'une tumeur intestinale (Figures 5E à 5H) ;  the analysis in control mice or treated twice daily with Kaletra® of the CSC-induced tumor progression of an adenocarcinoma (FIGS. 5A to 5D) and of an intestinal tumor (FIGS. 5E to 5H);
l'effet du lopinavir sur la clonogénécité des CSC d'un adénocarcinome (Figure the effect of lopinavir on the clonogenicity of SCC in adenocarcinoma (Figure
6) ; 6);
- l'effet de molécules correspondant à du lopinavir modifié sur la prolifération de the effect of molecules corresponding to modified lopinavir on the proliferation of
CSC d'un adénocarcinome (Figure 7A) et d'une tumeur intestinale (Figure 7B) et l'effet de ces composés sur la population tumorale totale d'un adénocarcinome (Figures 7C et 7D). SCC of an adenocarcinoma (Figure 7A) and an intestinal tumor (Figure 7B) and the effect of these compounds on the total tumor population of a adenocarcinoma (Figures 7C and 7D).
Exemple 1 : Etude de l'effet des IP sur la prolifération de la population des CSC par rapport à la population tumorale totale de la tumeur d'origine. Example 1: Study of the effect of PIs on the proliferation of the population of SCC with respect to the total tumor population of the original tumor.
Les cellules ont été ensemencées dans le milieu de culture approprié en présence de 10% de sérum de veau fœtal et cultivées à 37°C dans une atmosphère humide contenant 5% de C02. Après 24 heures de culture permettant l'adhésion de cellules aux parois des boîtes de culture, les inhibiteurs de la protéase du VIH sont ajoutés dans le milieu de culture aux concentrations indiquées et les cellules sont cultivées pendant 72 heures supplémentaires. Les cellules sont ensuite dissociées par de la trypsine et dénombrées grâce à un compteur Coulter Beckman ZI . The cells were inoculated in the appropriate culture medium in the presence of 10% fetal calf serum and cultured at 37 ° C in a humid atmosphere containing 5% CO 2 . After 24 hours of culture allowing the cells to adhere to the walls of the culture dishes, the HIV protease inhibitors are added to the culture medium at the indicated concentrations and the cells are cultured for an additional 72 hours. The cells are then cleaved with trypsin and counted using a Coulter Beckman ZI counter.
Les graphes des figures 1, 2, 3 représentent le pourcentage de cellules adhérentes dans la boîte de culture comparé à celui obtenu pour des cellules qui n'ont pas été traitées par les IP. Les IP utilisées sont les suivantes, lopinavir (LPV), ritonavir (RTV), nelfmavirThe graphs in FIGS. 1, 2, 3 represent the percentage of adherent cells in the culture dish compared to that obtained for cells that have not been treated by the PIs. The PIs used are lopinavir (LPV), ritonavir (RTV), nelfmavir
(NVF), saquinavir (SQV) et un mélange de lopinavir/ritonavir dans les proportions (4/1 (p/p)) correspondant à la spécialité pharmaceutique Kaletra®, une des spécialités les plus prescrites dans l'infection du VIH. L'examen de la Figure 1 montre que le lopinavir inhibe préférentiellement la prolifération des CSC issues de deux tumeurs d'origines différentes. (NVF), saquinavir (SQV) and a mixture of lopinavir / ritonavir in the proportions (4/1 (w / w)) corresponding to the pharmaceutical specialty Kaletra®, one of the most prescribed specialties in HIV infection. The examination of Figure 1 shows that lopinavir preferentially inhibits the proliferation of SCC from two tumors of different origins.
Les IC50 pour cet effet sont de 0,2 μg/ml, c'est-à-dire 0,3 μΜ, et ne différent pas selon l'origine de la tumeur. The IC 50 values for this effect are 0.2 μg / ml, that is to say 0.3 μΜ, and do not differ according to the origin of the tumor.
En revanche les concentrations nécessaires pour inhiber la prolifération de la population cellulaire totale sont plus élevées et sont comprises entre 5 et 12 μg/ml (soit entre 8 et 20 μΜ) selon la tumeur. Un résultat analogue est obtenu si un mélange lopinavir/ritonavir (4/l(p/p)) est utilisé. Dans ce dernier cas, le ritonavir n'augmente pas les effets du lopinavir in vitro. Les concentrations de lopinavir présentes dans le sérum de patients traités sont de l'ordre de 2 à 12 μg/ml et sont indiquées sur les différents graphes de la figure 1 en gris. Elles sont supérieures aux concentrations efficaces pour diminuer la prolifération des CSC, ce qui indique que les doses administrées à l'homme sont compatibles avec un traitement visant les CSC. In contrast, the concentrations necessary to inhibit the proliferation of the total cell population are higher and are between 5 and 12 μg / ml (ie between 8 and 20 μΜ) depending on the tumor. A similar result is obtained if lopinavir / ritonavir (4/1 (w / w)) is used. In the latter case, ritonavir does not increase the effects of lopinavir in vitro. The concentrations of lopinavir present in the serum of treated patients are of the order of 2 to 12 μg / ml and are indicated on the different graphs of FIG. 1 in gray. They are higher than effective concentrations to decrease the proliferation of SCCs, indicating that human doses are compatible with treatment for SCC.
La Figure 2 montre que le ritonavir seul cible préférentiellement la population de CSC. Figure 2 shows that ritonavir alone preferentially targets the CSC population.
L'IC5o obtenue sur la population des CSC est de 2 μg/ml, soit 2,7 μΜ, et de 12 μg/ml soit 16,6 μΜ, sur la population tumorale totale. The CI 5 o obtained on the CSC population is 2 μg / ml, ie 2.7 μΜ, and 12 μg / ml or 16.6 μΜ, on the total tumor population.
Le nelfïnavir et le saquinavir ciblent les populations de CSC avec des IC50 du même ordre de grandeur que celle du ritonavir (2 et 3 μΜ respectivement). Les inhibiteurs de la protéase du VIH utilisés dans ces expériences sont des IC50 du même ordre de grandeur sur la population tumorale totale (comprises entre 8 et 20 μΜ). Les doses d'IP efficaces sur les cellules tumorales d'origines diverses sont généralement comprises entre 20 et 50 μΜ, donc du même ordre de grandeur que celles efficaces sur les populations tumorales totales étudiées. Nelfinavir and saquinavir target CSC populations with IC 50s of the same order of magnitude as ritonavir (2 and 3 μΜ, respectively). The HIV protease inhibitors used in these experiments are IC 50 of the same order of magnitude on the total tumor population (between 8 and 20 μΜ). Effective doses of IP on tumor cells of various origins are generally between 20 and 50 μΜ, therefore of the same order of magnitude as those effective on the total tumor populations studied.
Comme pour le lopinavir, les doses de nelfïnavir efficaces pour diminuer la prolifération des CSC sont du même ordre de grandeur que les concentrations mesurées dans le sang des patients traités. La Figure 3 montre que la salinomycine, une molécule identifiée comme étant efficace pour diminuer la prolifération de cellules souches de cancer de sein (WO 2009/126310 de Gupta et al), ne cible pas spécifiquement les CSC qui expriment des marqueurs de cellules souches embryonnaires. Les effets de cette molécule ont été étudiés sur la prolifération des CSC et de la population tumorale totale isolée à partir de l'adénocarcinome. As with lopinavir, doses of nelfinavir that are effective in decreasing the proliferation of SCCs are of the same order of magnitude as the concentrations measured in the blood of treated patients. Figure 3 shows that salinomycin, a molecule identified as being effective in decreasing breast cancer stem cell proliferation (WO 2009/126310 by Gupta et al), does not specifically target SCCs that express markers of embryonic stem cells. The effects of this molecule have been studied on the proliferation of SCCs and the total tumor population isolated from adenocarcinoma.
La Figure 3 montre que la salinomycine bloque la prolifération des CSC avec une IC50 de 0,2 μΜ, et son efficacité est du même ordre de grandeur sur la population tumorale totale (IC50 = 0,1 μΜ). Figure 3 shows that salinomycin blocks the proliferation of SCC with an IC 50 of 0.2 μΜ, and its efficiency is of the same order of magnitude on the total tumor population (IC 50 = 0.1 μΜ).
Ce résultat indique que les différents types de CSC ont des sensibilités différentes vis-à-vis des molécules à potentiel thérapeutique, et que les traitements efficaces pour éliminer les unes peuvent être moins efficaces pour les autres.  This result indicates that different types of SCC have different sensitivities to molecules with therapeutic potential, and that effective treatments to eliminate one may be less effective for the others.
La diminution de la prolifération cellulaire s'accompagne d'une diminution de l'aptitude des cellules à proliférer à l'état clonal. La figure 6 montre que lorsque les CSC d'un adénocarcinome sont cultivées en milieu semi solide, le lopinavir diminue la formation de colonies de manière dose-dépendante pour des concentrations similaires à celles inhibant la prolifération des CSC.  The decrease in cell proliferation is accompanied by a decrease in the ability of cells to proliferate at the clonal state. Figure 6 shows that when adenocarcinoma SCCs are cultured in a semi-solid medium, lopinavir decreases colony formation in a dose-dependent manner at concentrations similar to those inhibiting the proliferation of SCCs.
Exemple 2 : Mesure de l'induction de la mort cellulaire par les IP dans la population de CSC. Example 2: Measurement of the induction of cell death by PIs in the CSC population.
L'induction de la mort cellulaire a été mesurée par marquage avec de l'annexine V qui se fixe sur les phosphatidyl-serines de la membrane plasmique lorsque celle-ci est désorganisée et avec de l'iodure de propidium, un intercalant de l'ADN qui pénètre dans les cellules très endommagées. The induction of cell death was measured by labeling with annexin V which binds to the phosphatidyl serines of the plasma membrane when it is disorganized and with propidium iodide, an intercalator of the plasma membrane. DNA that enters the highly damaged cells.
Après 24 heures de culture, les inhibiteurs de la protéase du VIH sont ajoutés dans le milieu de culture aux concentrations indiquées et les cellules sont cultivées pendant 48 heures supplémentaires. Les cellules sont ensuite dissociées par de la trypsine et analysées par cytométrie en flux. After 24 hours of culture, the HIV protease inhibitors are added to the culture medium at the indicated concentrations and the cells are cultured for an additional 48 hours. The cells are then cleaved with trypsin and analyzed by flow cytometry.
La Figure 4 montre les effets des IP sur la population de CSC pour deux tumeurs différentes. Le marquage de l'annexine V est reporté en abscisse, celui de l'iodure de propidium en ordonnées. Les résultats obtenus indiquent que les inhibiteurs de la protéase du VIH induisent une apoptose des cellules souches cancéreuses à des concentrations comparables avec celles qui inhibent la prolifération. Ces concentrations n'induisent pas d' apoptose dans la population tumorale totale. Figure 4 shows the effects of PIs on the CSC population for two different tumors. The labeling of annexin V is plotted on the abscissa, that of propidium iodide on the ordinate. The results indicate that HIV protease inhibitors induce apoptosis of cancer stem cells at concentrations comparable to those that inhibit proliferation. These concentrations do not induce apoptosis in the total tumor population.
Comme pour la prolifération, le lopinavir est l'un des IP les plus efficaces pour induire la mort cellulaire des CSC. As with proliferation, lopinavir is one of the most effective PIs for inducing cell death in SCC.
L'induction du processus apoptotique a été confirmée en mesurant l'activation de caspases effectrices comme la caspase 3.  Induction of the apoptotic process was confirmed by measuring the activation of effector caspases such as caspase 3.
Méthode : Method:
La caspase 3 a été détectée par Western Blot.  Caspase 3 was detected by Western Blot.
Après 24h de culture, le lopinavir est ajouté dans le milieu de culture aux concentrations indiquées et les cellules sont cultivées pendant 24h supplémentaires. Les cellules ont été rincées dans du PBS refroidi par de la glace et solubilisées dans un tampon (Peraldi et al,  After 24 hours of culture, lopinavir is added to the culture medium at the indicated concentrations and the cells are cultured for an additional 24 hours. The cells were rinsed in ice-cold PBS and solubilized in buffer (Peraldi et al,
1997, J clin Invest, 1001863-1869) en présence d'un cocktail d'inhibiteurs de proteases (Roche Diagnostics, Meylan, France).  1997, J. Clin Invest, 1001863-1869) in the presence of a cocktail of protease inhibitors (Roche Diagnostics, Meylan, France).
60 μg de protéines ont été résolus par 15% SDS-PAGE en utilisant des conditions réductrices et transférées sur des membranes Immobilon-P (Millipore, Molshiem, France). Les anticorps suivants ont été utilisés pour les immunoblots: anti-caspase 3 clivée (Référence 9664 Cell Signaling Technology, Danvers, MA) et anti-tubuline βΐ (Référence T7816 Sigma, Saint Quentin Fallavier, France).  60 μg of proteins were resolved by 15% SDS-PAGE using reducing conditions and transferred to Immobilon-P membranes (Millipore, Molshiem, France). The following antibodies were used for immunoblots: cleaved anti-caspase 3 (Reference 9664 Cell Signaling Technology, Danvers, MA) and anti-tubulin βΐ (Reference T7816 Sigma, Saint Quentin Fallavier, France).
Au cours de ce processus, la caspase 3 (35 kDa) est clivée pour donner une forme active (17kDa). La présence de caspase 3 clivée a été analysée par la technique de Western Blot sur des extraits protéiques de cellules traitées par différentes doses de lopinavir pendant 24 heures. Un anticorps spécifique de la forme clivée de la caspase 3 a été utilisé pour la détection (référence #9664, Cell Signaling Technology, Danvers, MA). La détection de la tubuline permet de normaliser les différences de charge entre les puits (anticorps anti tubuline βΐ SIGMA, Saint Quentin Fallavier, France). Les anticorps secondaires utilisés pour la détection sont couplés à la peroxidase et le signal de chimiluminescence est analysé et enregistré par un imageur ChemiDoc XRS System (Bio-Rad).During this process, caspase 3 (35 kDa) is cleaved to give an active form (17kDa). The presence of cleaved caspase 3 was analyzed by the Western Blot technique on protein extracts of cells treated with different doses of lopinavir for 24 hours. An antibody specific for the cleaved form of caspase 3 was used for detection (ref. # 9664, Cell Signaling Technology, Danvers, MA). The detection of tubulin makes it possible to normalize the charge differences between the wells (anti-tubulin antibodies βΐ SIGMA, Saint Quentin Fallavier, France). Secondary antibodies used for detection are coupled to peroxidase and the chemiluminescence signal is analyzed and recorded by a ChemiDoc XRS System imager (Bio-Rad).
La figure 41 montre que le traitement des CSC issues d'un adénocarcinome par des doses croissantes de lopinavir (0.1 à 20 μg/ml) induit l'apparition de la forme clivée de la caspase 3. Figure 41 shows that the treatment of SCC from adenocarcinoma with increasing doses of lopinavir (0.1 to 20 μg / ml) induces the appearance of the cleaved form of caspase 3.
Exemple 3 : In vivo, le lopinavir induit une régression du développement d'allogreffes induites par les CSC isolées à partir d'un adénocarcinome ou d'une tumeur intestinale. Example 3 In vivo, lopinavir induces a regression of the development of allografts induced by CSCs isolated from an adenocarcinoma or an intestinal tumor.
Pour analyser l'effet du lopinavir sur la progression tumorale in vivo, les cellules ont été modifiées en leur conférant la capacité à exprimer de la luciférase pour pouvoir les repérer in situ dans les souris vivantes. En présence de substrat : la luciférine injectée en intrapéritonéal à raison de 150 mg/kg, seules les cellules exprimant la luciférase pourront émettre de la lumière qui sera enregistrée grâce à un appareillage approprié (XENOGEN IVIS®100, Xenogen Biosciences, Cranbury NJ). L'enregistrement est effectué sur des souris anesthésiées avec un mélange isofurane/air 1,5% (v/v). Le signal émis par les cellules est enregistré, analysé, puis restitué sur une échelle proportionnellement à la quantité de lumière émise. To analyze the effect of lopinavir on tumor progression in vivo, the cells were modified by conferring on them the capacity to express luciferase in order to locate them in situ in living mice. In the presence of substrate: luciferin injected intraperitoneally at a rate of 150 mg / kg, only the cells expressing luciferase will be able to emit light which will be recorded using appropriate equipment (Xenogen IVIS®100, Xenogen Biosciences, Cranbury NJ). Registration is performed on mice anesthetized with an isofuran / air mixture 1.5% (v / v). The signal emitted by the cells is recorded, analyzed and then rendered on a scale in proportion to the amount of light emitted.
Ces expériences ont été réalisées dans des locaux agréés par la Direction des Services Vétérinaires (A 06-088-11) et conduites sous la direction et par des expérimentateurs titulaires d'une autorisation d'expérimenter sur des animaux vertébrés vivants en cours de validité (06-044 et 06-177) selon la réglementation en vigueur.  These experiments were carried out in premises approved by the Directorate of Veterinary Services (A 06-088-11) and conducted under the direction and by experimenters holding an authorization to test live vertebrate living animals ( 06-044 and 06-177) according to the regulations in force.
Les souris ont reçu une injection de 250 000 cellules dans du matrigel® en sous- cutané dans le dos. Elles ont été traitées (T) par deux injections quotidiennes de Kalétra® qui correspondent aux concentrations suivantes : LPV : 0,4 mg/souris/injection & RTV : 0,lmg/souris/injection. Le lot contrôle (C) reçoit une quantité équivalente de sérum glucosé (5% p/v). La présence de cellules souches est analysée après différents jours de traitement grâce à l'émission de lumière. Après 55 jours de traitement, les souris sont sacrifiées et les tumeurs sont pesées. The mice were injected with 250,000 cells in matrigel® subcutaneously in the back. They were treated (T) with two daily injections of Kaletra® which correspond to the following concentrations: LPV: 0.4 mg / mouse / injection & RTV: 0.1 mg / mouse / injection. The control lot (C) receives an equivalent amount of glucose serum (5% w / v). The presence of stem cells is analyzed after different days of treatment thanks to the light emission. After 55 days of treatment, the mice are sacrificed and the tumors are weighed.
Les résultats obtenus, qui portent sur cinq souris par condition pour chaque lignée de CSC, indiquent, qu'après 7 jours de traitement, il n'y a pas de différence significative entre le développement des tumeurs dans les souris contrôles ou traitées. On note une diminution de la croissance tumorale à partir de 21 jours si les cellules sont issues de l'adénocarcinome et de 34 jours de traitement si les cellules sont issues de la tumeur intestinale. Après 55 jours de traitement, le développement tumoral est inhibé dans 3 souris sur 4 et diminué pour une seule souris traitée. The results obtained, which relate to five mice per condition for each CSC line, indicate that after 7 days of treatment, there is no significant difference between the development of tumors in control or treated mice. There is a decrease in tumor growth from 21 days if the cells are derived from adenocarcinoma and 34 days of treatment if the cells are derived from the intestinal tumor. After 55 days of treatment, tumor development is inhibited in 3 out of 4 mice and decreased for a single treated mouse.
Le poids des tumeurs est moins important dans les souris ayant reçu un traitement par rapport aux souris contrôles.  Tumor weight is less important in mice treated than control mice.
Ces résultats indiquent que le traitement des souris par le Kaletra® est efficace pour réduire le développement tumoral induit par des cellules souches cancéreuses exprimant des marqueurs de cellules souches embryonnaires in vivo.  These results indicate that treatment of mice with Kaletra® is effective in reducing tumor development induced by cancer stem cells expressing embryonic stem cell markers in vivo.
Exemple 4 : Effet des molécules de formule (V) et de formule (VI) sur la prolifération des CSC d'un adénocarcinome et d'une tumeur intestinale. EXAMPLE 4 Effect of the Molecules of Formula (V) and of Formula (VI) on the Proliferation of SCCs of an Adenocarcinoma and an Intestinal Tumor
Les résultats sont illustrés, respectivement, par les Figures 7 A et 7B.  The results are illustrated, respectively, in Figures 7A and 7B.
La Figure 7 montre l'effet de molécules correspondant à du lopinavir modifié sur la prolifération des cellules souches cancéreuses d'un adénocarcinome (FIG 7A) et d'une tumeur intestinale (FIG 7B). Le composé de formule (V) n'inhibe pas la prolifération des CSC aux concentrations actives pour le lopinavir dans lesFigure 7 shows the effect of molecules corresponding to modified lopinavir on the proliferation of cancer stem cells of adenocarcinoma (FIG. 7A) and intestinal tumor (FIG. 7B). The compound of formula (V) does not inhibit the proliferation of SCCs at active concentrations for lopinavir in
2 lignées de CSC. Ce résultat indique que le groupement qui a été enlevé est très important pour l'activité du lopinavir sur les CSC et ce pour des concentrations de 20μg/ml, soit 45 μgM. Il n'a pas d'effet inhibiteur de la prolifération sur les cellules de la population tumorale totale (Fig.7C). 2 lines of SCC. This result indicates that the group which has been removed is very important for the activity of lopinavir on SCCs for concentrations of 20 μg / ml, ie 45 μgM. It has no inhibitory effect of proliferation on the cells of the total tumor population (FIG. 7C).
Le composé de formule(VI) inhibe la prolifération des CSC à des concentrations du même ordre de grandeur que le lopinavir. Toutefois, sa toxicité est plus importante car un traitement des cellules par des concentrations supérieures à 3μ§/ι 1 (soit 6.72 μΜ) entraîne leur mort en quelques heures. The compound of formula (VI) inhibits the proliferation of SCCs at concentrations of the same order of magnitude as lopinavir. However, its toxicity is more important because a treatment of the cells by concentrations higher than 3μ§ / ι 1 (or 6.72 μΜ) causes their death in a few hours.
Comparé au lopinavir, le composé de la formule (V) n'a pas d'effet inhibiteur significatif de la prolifération sur la population tumorale totale d'un adénocarcinome (Fig.7C). En revanche le composé de la formule (VI) inhibe la prolifération de ces cellules à des doses du même ordre de grandeur que celles efficaces sur les CSC. Ce composé a perdu la capacité de discriminer les CSC et les cellules tumorales totales (Fig 7C et 7D). La structure enlevée est donc elle aussi importante car elle conduit à la formation d'un composé qui ne possède pas l'un des critères requis pour l'application selon l'invention bien qu'il soit efficace pour tuer les cellules à faible dose. Compared with lopinavir, the compound of formula (V) has no significant inhibitory effect of proliferation on the total tumor population of an adenocarcinoma (FIG. 7C). On the other hand, the compound of formula (VI) inhibits the proliferation of these cells at doses of the same order of magnitude as those effective on SCCs. This compound lost the ability to discriminate between SCCs and total tumor cells (Figs. 7C and 7D). The removed structure is therefore also important because it leads to the formation of a compound which does not have one of the criteria required for the application according to the invention although it is effective for killing low dose cells.

Claims

REVENDICATIONS
1- Molécules à activité anti-protéases ou dérivés de ces molécules pour cibler préférentiellement, , in vitro et in vivo la population de CSC murines ou humaines exprimant des marqueurs de cellules souches embryonnaires dont Oct-4 et/ou Nanog et/ou Sox2 désignant une « signature embryonnaire » et/ou ayant un potentiel métastasique, afin de réduire le pouvoir tumoral ou métastasique de ladite population, voire de l'éradiquer. 1- Molecules with anti-protease activity or derivatives of these molecules for targeting preferentially, in vitro and in vivo the population of murine or human CSCs expressing embryonic stem cell markers, of which Oct-4 and / or Nanog and / or Sox2 designating an "embryonic signature" and / or having a metastatic potential, in order to reduce the tumor or metastatic power of said population, or even to eradicate it.
2 - Molécules selon la revendication 1, caractérisées en ce que lesdites cellules souches cancéreuses ou métastasiques expriment en outre d'autres marqueurs de cellules souches dont CD44, et/ou CD 133 et/ou CXCR4. 3 - Molécules selon la revendication 1 ou 2, caractérisées en ce qu'il s'agit d'inhibiteurs de protéases ayant une IC50, vis-à-vis de ladite population de CSC ou des cellules souches métastasiques, signifïcativement inférieure par rapport à l'ICso vis-à-vis de la population tumorale totale. 4 - Molécules selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisées en ce qu'elles inhibent la prolifération cellulaire des CSC et/ou induisent la mort cellulaire des CSC par un mécanisme d'apoptose, ou de nécrose ou qu'elles inhibent l'expression de molécules anti apoptotiques à des doses n'affectant pas celle de la population tumorale totale et qu'elles réduisent in vivo la formation d'allogreffes ou de xenogreffes après injection des CSC dans des souris immunodéfïcientes. 2 - Molecules according to claim 1, characterized in that said cancerous or metastatic stem cells further express other stem cell markers including CD44, and / or CD 133 and / or CXCR4. 3 - Molecules according to claim 1 or 2, characterized in that they are inhibitors of proteases having an IC 50 , vis-à-vis said population of CSC or metastatic stem cells, significantly lower compared to the ICso vis-à-vis the total tumor population. 4 - Molecules according to any one of claims 1 to 3, characterized in that they inhibit the cell proliferation of SCCs and / or induce the cell death of SCCs by a mechanism of apoptosis, or necrosis or they inhibit the expression of anti-apoptotic molecules at doses not affecting that of the total tumor population and that they reduce in vivo the formation of allografts or xenografts after injection of CSC in immunodeficient mice.
5 - Molécules selon la revendication 3 ou 4, caractérisées en ce qu'il s'agit d'inhibiteurs de la protéase du VIH à des doses thérapeutiquement acceptables ou à des doses leur conférant un effet de booster, ou de dérivés de ces derniers. 6- Molécules selon la revendication 5, caractérisées en ce que lesdits inhibiteurs sont choisis parmi le lopinavir, le nelfmavir, le saquinavir, seuls ou en co-administration, une association de lopinavir et de ritonavir, et/ou des dérivés de ces molécules. 5 - Molecules according to claim 3 or 4, characterized in that they are inhibitors of HIV protease at therapeutically acceptable doses or doses giving them a booster effect, or derivatives thereof. 6. Molecules according to claim 5, characterized in that said inhibitors are chosen from lopinavir, nelfmavir, saquinavir, alone or in co-administration, a combination of lopinavir and ritonavir, and / or derivatives of these molecules.
7 - Molécules selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisées en ce que la tumeur a été développée dans les organes d'un modèle murin par injection par voie sous-cutanée ou par voie systémique de lignées de cellules souches cancéreuses métastasiques isolées selon l'expression de marqueurs de cellules souches embryonnaires désignant la « signature embryonnaire », dont Oct-4. 7 - Molecules according to any one of claims 1 to 6, characterized in that the tumor has been developed in the organs of a murine model by injection subcutaneously or systemically of isolated metastatic cancer stem cell lines according to the expression of embryonic stem cell markers designating the "embryonic signature", of which Oct-4.
8 - Compositions pharmaceutiques renfermant une quantité thérapeutiquement efficace spécifiquement sur les CSC, sans lien obligatoire avec les concentrations thérapeutiques nécessaires à l'activité antiprotéasique, d'au moins une molécule selon l'une quelconque des revendications 1 à Ί, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, la concentration de la ou des molécules étant plus faible que celle efficace sur la population cellulaire totale de la tumeur. 9 - Compositions pharmaceutiques selon la revendication 8, pour le traitement de tumeurs issues des cellules germinales et des tumeurs de haut grade et de mauvais pronostic et de tumeurs formant des métastases. 8 - Pharmaceutical compositions containing a therapeutically effective amount specifically on SCCs, without any mandatory link with the therapeutic concentrations necessary for the antiprotease activity, of at least one molecule according to any one of claims 1 to 3, in association with a vehicle pharmaceutically acceptable, the concentration of the molecule or molecules being lower than that effective on the total cell population of the tumor. 9 - Pharmaceutical compositions according to claim 8 for the treatment of tumors from germ cells and high grade tumors and poor prognosis and tumors forming metastases.
10— Compositions pharmaceutiques selon la revendication 9, caractérisées en ce qu'elles sont utilisées en combinaison avec de la chirurgie ou de la radiothérapie ou avec d'autres traitements de chimiothérapie ou encore avec des traitements visant à réduire l'expression des gènes responsables de leur pouvoir tumoral et/ou métastasique comme l'ARM en utilisant par exemple des siRNA ou des shRNA dirigés contre les marqueurs de cellules souches embryonnaires comme Oct-4, Nanog, ou Sox2, ou CXCR4 ou CD44. 10- Pharmaceutical compositions according to claim 9, characterized in that they are used in combination with surgery or radiotherapy or with other chemotherapy treatments or with treatments intended to reduce the expression of genes responsible for their tumor and / or metastatic potency, such as MRA, using, for example, siRNAs or shRNAs directed against embryonic stem cell markers such as Oct-4, Nanog, or Sox2, or CXCR4 or CD44.
11 - Compositions pharmaceutiques selon la revendication 9 ou 10„ caractérisées en ce que les populations de CSC exprimant des marqueurs de cellules souches embryonnaires désignant la « signature embryonnaire » dont Oct-4 sont présentes dans des tumeurs solides (sarcomes ou adénocarcinomes d'origines tissulaires différentes) comme les cancers de cellules souches germinales, sarcomes d'Ewing, ostéosarcomes, glioblastomes de haut grade, hépatocarcinomes, mélanomes, adénocarcinomes et cancers du sein, du colon, du rein, de la vessie et du poumon. 11 - Pharmaceutical compositions according to claim 9 or 10 "characterized in that that CSC populations expressing embryonic stem cell markers denoting the "embryonic signature" of which Oct-4 are present in solid tumors (sarcomas or adenocarcinomas of different tissue origins) such as germline stem cell cancers, Ewing's sarcomas , osteosarcomas, high grade glioblastomas, hepatocarcinomas, melanomas, adenocarcinomas and breast, colon, kidney, bladder and lung cancers.
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