WO2012074129A1 - 安定化された二次構造を有するペプチド、及びペプチドライブラリー、それらの製造方法 - Google Patents

安定化された二次構造を有するペプチド、及びペプチドライブラリー、それらの製造方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2012074129A1
WO2012074129A1 PCT/JP2011/078028 JP2011078028W WO2012074129A1 WO 2012074129 A1 WO2012074129 A1 WO 2012074129A1 JP 2011078028 W JP2011078028 W JP 2011078028W WO 2012074129 A1 WO2012074129 A1 WO 2012074129A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
peptide
group
amino acid
mrna
formula
Prior art date
Application number
PCT/JP2011/078028
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
裕明 菅
岳 樋口
Original Assignee
国立大学法人東京大学
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 国立大学法人東京大学 filed Critical 国立大学法人東京大学
Priority to US13/990,123 priority Critical patent/US9657289B2/en
Priority to JP2012546968A priority patent/JP6004399B2/ja
Priority to EP11845198.8A priority patent/EP2647721B1/en
Priority to CN201180058284.4A priority patent/CN103328648B/zh
Publication of WO2012074129A1 publication Critical patent/WO2012074129A1/ja
Priority to US15/489,618 priority patent/US10435439B2/en

Links

Images

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/001Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00Antineoplastic agents
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07CACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C229/00Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C229/02Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton
    • C07C229/04Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated
    • C07C229/06Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having only one amino and one carboxyl group bound to the carbon skeleton
    • C07C229/08Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having only one amino and one carboxyl group bound to the carbon skeleton the nitrogen atom of the amino group being further bound to hydrogen atoms
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K1/00General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2/00Peptides of undefined number of amino acids; Derivatives thereof
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1062Isolating an individual clone by screening libraries mRNA-Display, e.g. polypeptide and encoding template are connected covalently
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12PFERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P11/00Preparation of sulfur-containing organic compounds
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12PFERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6845Methods of identifying protein-protein interactions in protein mixtures
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00Medicinal preparations containing peptides
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C40COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40BCOMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/04Libraries containing only organic compounds
    • C40B40/10Libraries containing peptides or polypeptides, or derivatives thereof

Definitions

  • the present invention relates to peptide molecules in which the secondary structure induced by the introduction of a special amino acid is fixed, the synthesis thereof, a method for constructing a library comprising an assembly of such peptide molecules, the constructed library, and the library To an active peptide screening method.
  • a peptide having an ⁇ -helical secondary structure As an inhibitory molecular species for interactions between in vivo molecules, a peptide having an ⁇ -helical secondary structure has attracted attention mainly from three points. First, since many interactions via ⁇ -helix are observed in the interaction, it is possible to develop an inhibitor starting from the structure. Second, the peptide having a helix structure is permeable to the cell membrane. Peptide drug discovery targeting intracellular proteins can be developed due to the high possibility of having a protein, and thirdly, since it has acquired stability to proteases even though it is a peptide, it has longer blood than general peptides. It can be expected to have a medium half-life.
  • a design or low diversity focus library is constructed based on the sequence of the ⁇ -helix site of an existing protein. Drug candidate peptides have been found by evaluating the activity of individual peptides.
  • a method of screening from a random peptide library is widely used.
  • the most common technique is a peptide display method using a phage, but in recent years, a peptide display method that does not involve biological species such as Escherichia coli has been used. That is, various in vitro display methods such as a ribosome display method using mRNA and an mRNA display method are excellent in that a highly diverse library can be constructed and screened in a short time in a single tube.
  • the In vitro display method displays a phenotype as a genotype by linking the phenotype and the genotype encoding the sequence (genotype) by non-covalent or covalent bonds, and is reconstructed in a test tube.
  • This refers to a system that enables the active species to be concentrated and amplified (selected) using a replication system.
  • the greatest feature of this system is that it does not use prokaryotic and eukaryotic organisms as a medium. For this reason, highly active physiological substances can be isolated from a library with a great diversity. As a typical comparative example, selection of a 10 7 diversity library is possible with phage display using E.
  • in-vitro displays include ribosome display, mRNA display, RaPID display (PCT / JP2010 / 68549, an unpublished international patent application).
  • mRNA display will be described below as an example.
  • the mRNA display method is a technique for associating an amino acid sequence of a polypeptide with a nucleic acid sequence by binding the polypeptide and mRNA as its template.
  • puromycin the terminal analog of acylated tRNA
  • a peptide molecule as a translation product is linked to mRNA via puromycin (Patent Documents 1 to 3, Non-Patent Documents 1 and 2).
  • Non-patent Document 3 a method based on formation of alkene mainly by amide bond, disulfide bond and ring-closing metathesis reaction has been reported (Non-patent Document 3).
  • the introduction of these covalent bonds induces a helix structure, but generally there is a problem with in vivo stability. That is, the amide structure and disulfide structure are not easily used as an inhibitor because they are easily cleaved by protease or reducing conditions.
  • Non-patent Document 4 Currently, bioactive peptides using a cross-linked structure resulting from the formation of this alkene are being developed.
  • the cross-linking reaction must occur rapidly and highly selectively under the conditions of the translation system, and the formed cross-linked structure must be a structure that is not easily decomposed in vivo.
  • Patent No. 3683282 Publication WO98 / 16636
  • Patent No. 3683902 public information (International Publication WO98 / 31700)
  • Patent No. 3692542 Publication WO98 / 16636
  • the present invention provides a peptide having a stabilized secondary structure, which is obtained by translating a special amino acid designed to spontaneously form a crosslinked structure under translation synthesis conditions into a peptide chain. And so on.
  • a sequence of three bases (triplet) of mRNA designates one amino acid as one codon, and the corresponding peptide is synthesized.
  • the association between the codon and the amino acid is performed in the following two stages.
  • Aminoacyl-tRNA synthetase (ARS) connects the corresponding amino acid to the end of tRNA.
  • ARS Aminoacyl-tRNA synthetase
  • amino acids on tRNA are polymerized according to the information of mRNA, and a peptide is synthesized.
  • the correspondence between such codons and anticodons is almost universally determined, and any one of 20 amino acids is assigned to each of 64 types of codons.
  • the universal genetic code table is shown below.
  • this genetic code can be reprogrammed by using a reconstituted translation system and an artificial aminoacylated RNA-catalyzed flexizyme.
  • a reconstituted translation system is a translation system that isolates, purifies, and mixes factors involved in translation synthesis of proteins and peptides, such as ribosomes, translation factors, tRNAs, amino acids, and energy sources such as ATP and GTP. It is.
  • E. coli ribosomes H. F. Kung, B. Redfield, B. V. Treadwell, B. Eskin, C. Spears and H. Weissbach ( 1977) "DNA-directed in vitro synthesis of beta-galactosidase. Studies with purified factors" The Journal of Biological Chemistry Vol. 252, No. 19, 68896894; M. C. Gonza, C.
  • flexizyme is an artificial RNA catalyst (RNA catalyst having acyl-tRNA synthetase-like activity) that can link (acylate) any amino acid or hydroxy acid to any tRNA.
  • RNA catalyst having acyl-tRNA synthetase-like activity
  • those described in the following documents are known: H. Murakami, H. Saito, and H. Suga, (2003), Chemistry & Biology, Vol. 10, 655-662; H. Murakami, D. Kourouklis, and H. Suga, (2003), Chemistry & istBiology, Vol. 10, 1077-1084; H. Murakami, A. Ohta, H. Ashigai, H.
  • the flexizyme is also known by the name of the original flexizyme (Fx) and dinitrobenzyl flexizyme (dFx), enhanced flexizyme (eFx), amino flexizyme (aFx) and the like modified from the original flexizyme (Fx).
  • a translation system that can freely remove the components of the translation system according to the purpose and reconstruct only the necessary components. For example, when a translation system from which a specific amino acid is removed is reconfigured, the codon corresponding to the amino acid becomes an empty codon. Subsequently, using flexizyme (or chemical aminoacylation, or aminoacylation using a mutant protein enzyme), a special amino acid is linked to a tRNA having an anticodon complementary to the vacant codon and added. Translate. As a result, a special amino acid is encoded by the codon, and the peptide into which the special amino acid is introduced instead of the removed amino acid is translated.
  • a special peptide having a propargyl chloride structure in the side chain is synthesized by a reprogramming technique of the genetic code.
  • a cysteine residue is placed in the peptide with an appropriate number of residues from the position of the residue having the above side chain structure, it will spontaneously after translation on the propargyl position by the sulfanyl group.
  • the substitution reaction proceeds, and a crosslinked structure by thioether bonds is formed between the peptide side chains.
  • a bond can be formed between them to construct a crosslinked structure. It can.
  • This cross-linked structure assists position-specific hydrogen bonding, which is the key to helix formation, to induce a helix structure and give the peptide a desired secondary structure.
  • the pair of molecular structures capable of such bond formation is not limited to the propargyl chloride structure and cysteine. Details will be described later.
  • the present invention provides a technique for constructing a special peptide library using the above-described technique and obtaining an inhibitor of the interaction between molecules in vivo therefrom.
  • the gist of the present invention is as follows.
  • (A) represents a single bond or a linking group having 1-10 atoms in the main chain;
  • (B) represents a group containing at least one ⁇ bond;
  • X represents a group that can be substituted by a substitution reaction with a sulfanyl group;
  • the amino acid having a sulfanyl group in the side chain is a special amino acid encoded by a modified codon, and the translation synthesis step (i) has the special amino acid of formula (I) and the sulfanyl group in the side chain.
  • Preparing a library of designated mRNAs (Ii) translating the mRNA in a cell-free translation system comprising a tRNA linked to the special amino acid to obtain an aggregate of peptides in which the special amino acid is arranged in a random sequence; and (iii) a step of forming a crosslinked structure by bonding a sulfanyl group and a side chain of a special amino acid of formula (I) in each peptide;
  • a method comprising: [16] A method for constructing a peptide library according to [14] above: In the step (i) described in [15] above, further, a step of binding puromycin to the 3 ′ end of mRNA to obtain a puromycin-binding mRNA library; In step (ii), expressing the puromycin-binding mRNA library in a cell-free translation system to obtain a peptide-mRNA complex in which the special amino acid is arranged in a random sequence; and performing step (iii)
  • a method for selecting a peptide that binds to a target protein from the peptide library according to [13] or [14] above (i) contacting the peptide library with a target protein and incubating; and (ii) selecting a peptide molecule that binds to the target protein;
  • a method comprising: [20] A method for selecting a peptide having an inhibitory activity against an intermolecular interaction of a target protein from the peptide library according to [13] or [14] above, (A) A primary screening for selecting a peptide that binds to a target protein, including the steps (i) and (ii) described in [19] above, and (b) an intermolecular target protein molecule of the peptide selected in the primary screening.
  • a method for producing a peptide that binds to a target protein comprising: (i) contacting the peptide library according to [14] above with a target protein and incubating; (ii) selecting a peptide-mRNA complex that binds to the target protein; (iii) amplifying the mRNA of the selected peptide-mRNA complex to obtain a peptide-mRNA complex; (iv) repeating steps (i) to (iii) one or more times to concentrate the peptide-mRNA complex having high affinity; and (v) from the mRNA of the peptide-mRNA complex concentrated in (iv) Expressing the peptide, And [22] the method according to any one of [19] to [20] above, wherein the target protein is a molecule that suppresses a
  • a peptide having a stable secondary structure for example, an ⁇ helix structure
  • a crosslinked structure for example, an ⁇ helix structure
  • a peptide library in which the amino acid sequence is randomized in such a peptide, and a peptide having high affinity for the target protein or the like, or a peptide that inhibits the function of the target protein by performing screening using this library A peptide having physiological activity can be obtained.
  • the peptide and the nucleic acid encoding it can be linked and an in vitro display method can be applied to facilitate the enrichment and amplification of the selected peptide.
  • FIG. 1 shows an example of a special peptide to which an ⁇ -helix secondary structure is fixed.
  • FIG. 2 shows an arrangement example of the crosslinked structure precursor.
  • FIG. 3 shows the formation of a selective cross-linked structure.
  • FIG. 4 shows the concept of screening using a cross-linked peptide library by mRNA display.
  • FIG. 5 shows an example of construction of an mRNA library.
  • FIG. 6 shows the concept of translation using the modified genetic code table.
  • the present invention provides a novel peptide having a secondary structure stabilized by providing a crosslinked structure.
  • secondary structure refers to a special structure found in a relatively narrow range formed by hydrogen bonds in the peptide main chain, and means a helix or ⁇ structure.
  • alpha-helix, 3 10 is suitable for stabilization of the helical structure of helix structures, etc. may also stabilize other secondary structures.
  • stabilizing secondary structure of a peptide means that the secondary structure is stabilized to such an extent that the peptide can be bound to the target molecule with a certain degree of reproducibility.
  • the cross-linked structure formed in the peptide of the present invention is a structure that is not easily decomposed in vivo, and specifically, it can be enzymatically decomposed like an amide bond. It is not reduced like a disulfide bond.
  • the peptide of the present invention contains at least one pair of a special amino acid represented by the following formula (I) and an amino acid having a sulfanyl group in the side chain, and is based on a thioether bond between the side chain of the special amino acid and the sulfanyl group.
  • a crosslinked structure is formed.
  • (A) represents a site that functions as a spacer.
  • (A) is a single bond or a linking group having 1 to 10 atoms in the main chain, and any group as long as (B) a cross-linking reaction between CH 2 —X and a sulfanyl group described later suitably occurs.
  • a single bond an alkylene group having 1 to 10 carbon atoms, an alkenylene group having 2 to 10 carbon atoms, or an alkynylene group having 2 to 10 carbon atoms, which may be substituted with a substituent;
  • an alkynylene group but is not limited thereto.
  • (A) is preferable for the progress of the translation reaction.
  • (B) may be any group as long as it induces a substitution reaction of X with a sulfanyl group, but may be a group containing at least one ⁇ bond, for example.
  • the group containing a ⁇ bond includes an alkylene group, alkenylene group, alkynylene group optionally substituted with a substituent; a group containing at least one aromatic ring optionally substituted with a substituent; at least one ketone or
  • the group may include an amide.
  • the number of carbon atoms in (B) can be, for example, 1-10, 2-8, 2-5, and the like.
  • the number of atoms in the main chain can be, for example, 1-10, 2-8, 2-5, and the like.
  • the position of the ⁇ bond is not particularly limited as long as the substitution reaction of X by the sulfanyl group proceeds suitably, but at least one of the atoms constituting the ⁇ bond is bonded to the carbon atom on which the substitution reaction by the sulfanyl group is performed. Desirably, it is most preferable that a ⁇ bond is located directly from X to the CH 2 group.
  • Examples of (B) include —C ⁇ C—, —C ⁇ C—, —Ar—, —Ar—Ar—, —Ar—C ⁇ C—, —Ar—C ⁇ C—, —NHC (O )-, -C (O)-, -Ar-NHC (O)-, and -Ar-C (O)-.
  • Examples of a crosslinked structure by a thioether bond between the sulfanyl group and the side chain of the special amino acid represented by the formula (I) are shown below.
  • X is not particularly limited as long as it is an atom or group that can be eliminated by a substitution reaction with a sulfanyl group.
  • Cl, Br, I, —OSO 2 Me, —OSO 2 —Ar—R (wherein R is Represents a group selected from the group consisting of CH 3 , NO 2 , CF 3 and H).
  • (C) represents a hydrogen atom or an alkyl group which may be substituted with a substituent.
  • a substituent For example, it may be a methyl group, an ethyl group, a propyl group, a butyl group, or a pentyl group, which may be substituted with a substituent, and may be branched.
  • the alkenylene group refers to an alkylene group having 1-3 double bonds in the main chain
  • the alkynylene group refers to an alkylene group having 1-3 triple bonds in the main chain.
  • the position of the double bond or triple bond is not particularly limited as long as the peptide has the intended effect.
  • the substituent is not particularly limited, but may be a halogen atom, an optionally substituted alkyl group having 1-6 carbon atoms, an optionally substituted alkoxy group having 1-6 carbon atoms, or a cyano group. Nitro group, hydroxy group, carboxyl group, acyl group, amino group, aryl group, heteroaryl group, phenoxy group, non-aromatic heterocyclic group and the like.
  • the peptide of the present invention since a cross-linked structure is formed by the bond formation between the side chain portion of the special amino acid of formula (I) and the sulfanyl group, one amino acid residue which is an element constituting this peptide is converted into one unit.
  • the set of functional groups must exist on different constituent units and be arranged so that the secondary structure is stabilized when a cross-linked structure is formed.
  • the unit of such a component is referred to as an amino acid unit.
  • the amino acid unit (corresponding to a special amino acid) that is an electrophile and the amino acid unit having a sulfanyl group are (i, i + 3), (i, i + 4), (i, i + 7), or (i, It is preferably arranged at the position indicated by i + 11).
  • i is an arbitrary integer of 0 or more, and indicates the position of the amino acid unit counted from the N-terminal residue of the peptide containing the crosslinking precursor.
  • i 3, (i, i + 4) is an amino acid having an amino acid unit and a sulfanyl group as an electrophile at the position of 3 amino acid units and the position of 7 amino acid units counting from the N-terminus (0th). It indicates that the units are arranged and a crosslinked structure is formed.
  • i + 3 and i + 4 if it is an ⁇ helix, it will be bridged in 1 turn, and if it is i + 7 and i + 11, it will be bridged in 2 turns and 3 turns, respectively.
  • 2, 3, 6 or 10 amino acid units are preferably present between amino acid units forming a cross-linked structure.
  • Amino acid units located between and before and after the amino acid unit forming the crosslinked structure have two functional groups, an amino group (—NR 2 ) and a carboxyl group (—COOH), in the molecule, except for the N-terminal starting amino acid. It is preferably any amino acid that is a compound (aminocarboxylic acid), typically an ⁇ -aminocarboxylic acid, and more preferably a proteinaceous amino acid.
  • the arrangement of the amino acid unit serving as an electrophile and the amino acid unit having a sulfanyl group may be either N-terminal or C-terminal.
  • the special amino acid refers to all amino acids having different structures from the 20 protein amino acids used in natural translation, and may be artificially synthesized or may exist in nature. In other words, non-protein amino acids, artificial amino acids, D-form amino acids, N-methyl amino acids, N-acyl amino acids, ⁇ -amino acids, and amino acid skeletons in which part of the side chain structure of protein amino acids is chemically modified or modified And all derivatives having a structure in which the amino group or carboxyl group is substituted.
  • the special peptide refers to a peptide in which two or more amino acids including one or more special amino acids are bonded mainly by peptide bonds (a cyclic structure or an ester bond may be present).
  • a typical example of an amino acid having a sulfanyl group is cysteine or its analog (cysteine analog), and a typical example of an amino acid serving as an electrophile capable of reacting with this is a special amino acid of the formula (I).
  • a universal codon can be used when it is cysteine, but it is encoded with a modified codon when it is a non-protein amino acid.
  • the special amino acid of formula (I) is always encoded by a modified codon.
  • the starting amino acid that becomes the N-terminus of the peptide chain is not limited to methionine, and can be any proteinous amino acid other than methionine or any special amino acid.
  • methionine was removed from the usual 20 types of amino acids, and instead, translation was initiated using a starting tRNA linked to an N ⁇ -acetylated amino acid. Yes.
  • N-terminal modifications can be effective to maintain peptide stability.
  • one of the amino acids making up the cross-linking precursor can be the starting amino acid (ie when i is 0).
  • a more typical embodiment regarding the arrangement of amino acids constituting the crosslinking precursor is an embodiment in which all of these amino acids are introduced by an extension reaction and arranged inside the peptide chain, that is, when i is an integer of 1 or more. It is.
  • the size of the peptide to which the present invention is applied is not particularly limited, but in general, the present invention is preferably used for peptides having 25 amino acid residues or less that are difficult to maintain a helical structure.
  • Specific examples of the compound of formula (I) include, for example, formula (VII): The compound of this is mentioned. In the formula, m represents an integer of 1 to 10.
  • Specific examples of the compound of formula (VII) include a compound in which m is 1, and this compound can be produced, for example, with a high enantiomeric excess utilizing Schollkopf's asymmetric auxiliary group. .
  • Specific examples of the compound of formula (IX) include compounds of the following formula (X) in which m is 1.
  • specific examples of the compound in which (C) is an alkyl chain in formula (I) include formula (XI) corresponding to formula (VII) and formula (XII) corresponding to formula (X): The compound of this is mentioned.
  • cysteine analogs include compounds of formula (V) or formula (VI).
  • m is as defined above.
  • special amino acids having a sulfanyl group such as homocysteine and mercaptonorvaline can also be mentioned.
  • the peptide of the present invention can be produced by using various known methods such as a method by chemical synthesis and a method using a translational synthesis system or a method analogous thereto.
  • chemical synthesis special amino acids of formula (I) can be obtained by various methods such as liquid phase synthesis, solid phase synthesis using protecting groups such as Fmoc and Boc, and hybrid methods combining liquid phase synthesis and solid phase methods.
  • a peptide containing an amino acid having a sulfanyl group can be synthesized.
  • the method for producing the peptide of the present invention uses a highly selective intramolecular reaction involving a special amino acid contained in a translationally synthesized peptide to form a covalent bond between peptide side chains and to construct a cross-linked structure. The following steps are included.
  • Step (i) a step of synthesizing, by translation, a special peptide in which at least one amino acid group having a sulfanyl group in the side chain and a special amino acid group represented by formula (I) is arranged in the molecule; and (ii) including a step of forming a crosslinked structure by thioether bonding the sulfanyl group and the side chain of the special amino acid of formula (I) in each group.
  • Step (i) is referred to as a translation synthesis step
  • step (ii) is referred to as a crosslinked structure forming step.
  • step (i) the following two types of amino acids (a) amino acids having a sulfanyl group in the side chain and (a) a special amino acid represented by formula (I) are used as appropriate amino acid residues. Peptides spaced by the number of bases are obtained by translational synthesis.
  • a chemical structure including a set of functional groups composed of a sulfanyl group and a functional group of a special amino acid capable of reacting with the sulfanyl group is referred to as a crosslinking precursor.
  • a set of these amino acids (a) and (b) arranged apart by an appropriate number of amino acid residues constitutes a crosslinking precursor.
  • these amino acid sets are represented by a set of dark black circles arranged inside the peptide chain.
  • the cross-linking precursors that can be included in one peptide chain are not limited to a single set, and a plurality of cross-linking precursors can be arranged.
  • a plurality of crosslinking structures can be formed in the crosslinking structure forming step of step (ii).
  • the special amino acid of the formula (I) has a structure capable of forming a bond with a sulfanyl group (—SH), which is a nucleophilic functional group, as a side chain structure capable of forming a covalent bond for crosslinking.
  • —SH sulfanyl group
  • the peptide containing the cross-linking precursor is converted into a peptide having a cross-linked structure formed therein.
  • the formation of a crosslinked structure from a crosslinking precursor occurs spontaneously under translational synthesis conditions, and therefore does not require a chemical catalyst.
  • step (i) When step (i) is performed in a cell-free translation system, a special amino acid is artificially assigned to an existing codon using a genetic code reprogramming technique to introduce the peptide chain. Specifically, mRNA with a codon encoding a special amino acid is prepared, and this is translated under the modified genetic code table to introduce the special amino acid at the position specified by the modified codon (modified codon). Peptides can be obtained.
  • codon refers to both modified codons and universal codons used in natural translation.
  • the modified codon refers to a codon that is associated with a special amino acid after the association with the protein amino acid is eliminated by genetic code reprogramming. Special amino acids can only be encoded with modified codons.
  • a helix peptide compound is synthesized by introducing a crosslinked structure into the peptide compound synthesized as described above.
  • the reaction conditions for forming a cross-linked structure are set according to the type of functional group set, but in general, the reaction proceeds highly selectively under the conditions of a cell-free translation system for synthesizing this peptide compound. . Therefore, a bond is formed spontaneously and a crosslinked peptide compound can be obtained without adjusting special reaction conditions.
  • the cell-free (in vitro) translation system is a place for peptide translation synthesis, and is generally a concept including both a method and a kit (product).
  • As the cell-free translation system used in the present invention it is preferable to further subdivide a known reconstitution-type translation system and construct and use a system with fewer impurities.
  • the specific components of the translation system as a kit (product) that can be used in the present invention will be described while comparing with a conventional system.
  • components of the translation system include ribosome, IF group, EF group, RF group, RRF, a set of natural amino acids, tRNA, specific ARS protein enzymes required for the synthesis of the target peptide, translation reaction There are energy sources for, etc.
  • ribosome a ribosome isolated and purified from E. coli is preferably used.
  • translation initiation factors eg IF1, IF2, IF3
  • translation elongation factors eg EF-Tu, EF-Ts, EF-G
  • translation termination factors eg RF1, RF2, RF3, RRF
  • Enzymes for energy source regeneration eg creatine kinase, myokinase, pyrophosphatase, nucleotide-diphosphatase kinase
  • addition of an enzyme for regeneration of a translation termination factor / energy source is optional.
  • T7 RNA polymerase may be added to perform transcription from the template DNA, but RNA polymerase need not be added when pre-transcribed mRNA is added to the translation system.
  • NTPs as energy sources for translation reactions
  • CreatineCphosphate CreatineCphosphate
  • ribosome activation RNA stabilization
  • factors necessary for protein stabilization etc.
  • N-formylmethionine is defined in the start codon AUG by the start tRNA, so 10-formyl-5,6,7,8-tetrahydroforlic acid (Baggott et al., 1995)
  • a formyl donor is optional when a translation reaction is initiated with a special amino acid.
  • methionyl-tRNA-formyltransferase (MTF) is not essential.
  • corresponding natural tRNA and ARS can be used for natural proteinaceous amino acids as in the conventional system.
  • An example of a natural tRNA is a mixture obtained by collecting E. coli, crushing, and purifying a tRNA fraction therefrom, and a commercially available product is also available.
  • Certain A, U, C, and G in natural tRNA are chemically modified by enzymes.
  • an artificial tRNA that is a tRNA transcript as an orthologous tRNA instead of a natural tRNA.
  • Artificial tRNA can be prepared by in vitro transcription using DNA as a template and an appropriate RNA polymerase. There is no chemical modification in such artificial tRNA.
  • an ortho-tRNA previously acylated with a special amino acid is added to the translation system.
  • a tRNA acylated with a special amino acid is prepared by conjugating a special amino acid to the 3 ′ end of the isolated orthogonal tRNA using flexizyme in the absence of other tRNA or ARS. Is done. Alternatively, those obtained by chemically or enzymatically binding a special amino acid to tRNA can be used.
  • a peptide library refers to a library containing two or more peptides into which the above-mentioned cross-linked structure is introduced, that is, two or more peptides having different sequences.
  • an amino acid other than the amino acid having a sulfanyl group in the side chain and the special amino acid represented by the formula (I) can be any amino acid. Therefore, for example, when a peptide consisting of 25 amino acid residues contains only one set of an amino acid having a sulfanyl group and a special amino acid represented by the formula (I), it is theoretically 20 23 even if only 20 natural amino acids are used.
  • the secondary structure of the peptide library of the present invention is stable due to cross-linking, it is also excellent in cell membrane permeability.
  • peptides and peptides that have high affinity for the target can be obtained. It is possible to obtain useful peptides such as peptides having physiological activity such as peptides that inhibit the function of the target protein.
  • each peptide may be linked to mRNA encoding it.
  • a library in which the phenotype (amino acid sequence of the peptide) is displayed as a genotype (nucleic acid sequence) can be applied to in-vitro display.
  • peptides are selected from a display library in which genetic information is presented (displayed) as peptides that are translation products.
  • a tag that can be amplified and read by a molecular biological technique is added to each random peptide molecule in the library.
  • An in vitro display is a peptide synthesized using a cell-free translation system (also called an in vitro translation system) in association with genetic information.
  • Ribosome display, mRNA display, DNA display, etc. are known. It is.
  • a RAPID display (unpublished) is also available.
  • Each display has a mechanism for associating genetic information recorded in mRNA or DNA with a peptide encoded by the genetic information to associate as a complex of [genetic information]-[translation product].
  • ribosome display mRNA, ribosome, and peptide form a complex.
  • mRNA display and RAPID display an mRNA-peptide complex is formed.
  • DNA display a DNA-peptide complex is formed.
  • any in-vitro display library can be used.
  • Method for producing peptide library The method for producing a library of peptides having a random sequence is not particularly limited.
  • a template nucleic acid mRNA or corresponding DNA
  • a template nucleic acid having a random sequence in a region encoding a peptide Can be obtained by performing a translational synthesis.
  • RNA encoding a random amino acid sequence each RNA has a codon designating an amino acid having a sulfanyl group in the side chain and a codon designating a special amino acid represented by formula (I), Live mRNAs in which the codons specifying amino acids with sulfanyl groups in the side chain and the codons specifying special amino acids of formula (I) are separated by 2, 3, 6, or 10 amino acid units.
  • a codon that designates a random sequence consisting of a plurality of triplet repeats and an amino acid that serves as a cross-linking precursor is arranged in a region encoding a peptide in an mRNA sequence.
  • a special amino acid having a propargyl chloride structure in the side chain is assigned to one of the extension codons, and from there an appropriate amino acid unit (for example, 2, 3, 6 or 10 amino acids as described above) Cysteine is introduced at a position spaced only by the codon base of the random sequence of (unit).
  • a template mRNA is constructed in which a random sequence codon base having an arbitrary length is arranged in addition to each codon and start codon assigned with these two amino acids.
  • a thioether bond is constructed by nucleophilic substitution reaction with propargyl chloride by a sulfanyl group located in the side chain of cysteine, and a crosslinked peptide library having a random sequence can be constructed.
  • NNK N is G, A, C or U from N, G, A, C, or U
  • K represents U or G
  • the special amino acid of formula (I) which is an electrophile for forming a cross-linked structure
  • AUG AUG
  • NNK live When a peptide library is constructed with a rally, AUG appears randomly as one of the codons represented by NNK, and thus the peptide library incorporates a plurality of the above-mentioned special amino acids.
  • a codon corresponding to an amino acid that does not appear when NNU or NNC is used is introduced at a specified position, another special amino acid for forming a cross-linked structure or a special amino acid having another additional function. It can also be used for this purpose. For example, in addition to AUG, it is possible to introduce such a special amino acid at a designated position using four codons of UGG, CAG, AAG, and GAG.
  • An mRNA containing NNU, NNC, or NNK can be obtained by, for example, synthesizing DNA containing NNT, NNC, or NNK using various DNA synthesizers and then transcribing it.
  • the special amino acid of formula (I) is introduced by a peptide chain elongation reaction with an elongation tRNA.
  • the start tRNA introduces the amino acid linked to the AUG codon at the translation start position into the peptide N-terminus, but the other AUG codon pairs with the extension tRNA having the CAU codon. To do.
  • two kinds of amino acids are associated with the AUG codon by two kinds of tRNAs.
  • the AUG codon paired with the start tRNA is referred to as start AUG
  • the AUG codon paired with the extension tRNA is simply referred to as AUG.
  • a cell-free translation system composed of components optimized for the purpose is used by adding a DNA or RNA molecule corresponding to a base sequence serving as a translation template.
  • the nucleic acid sequence may additionally contain a base sequence advantageous for translation in accordance with the translation system to be used, in addition to the region encoding the target amino acid sequence, in the same manner as the protein expression system using living cells. it can.
  • the efficiency of the translation reaction is increased by including a Shine-Dalgarno (SD) sequence or an epsilon sequence upstream of the initiation codon.
  • SD Shine-Dalgarno
  • initiation codon is placed at the N-terminus of the region encoding the peptide.
  • the start codon is usually the triplet sequence AUG.
  • the start codon can be reprogrammed by changing the anticodon sequence to any sequence in the start tRNA synthesized by the in vitro transcription reaction, other base sequences can be used as the start codon in addition to the AUG codon. it can.
  • the C-terminal side contains a sequence for linking the nucleic acid molecule and its translation product peptide for in vitro display.
  • a sequence for linking the nucleic acid molecule and its translation product peptide for in vitro display For example, when an mRNA display method using a puromycin linker is used, an mRNA-peptide complex library is formed by adding a puromycin linker previously linked to an mRNA library to the translation system. In order to efficiently incorporate puromycin into the A site of ribosome, a linker is usually inserted between the 3 ′ end of mRNA and puromycin. Puromycin functions as a substrate for peptide transfer reaction (aminoacyl-tRNA analog) on the ribosome, and binds the mRNA to the peptide by binding to the C-terminus of the extended peptide.
  • aminoacyl-tRNA analog aminoacyl-tRNA analog
  • the mRNA display method is a technology that integrates genotype and phenotype by linking mRNA and peptide via an appropriate linker in an in vitro translation system. As long as this purpose is achieved, puromycin Instead, it is within the purview of those skilled in the art that linkers containing other materials with similar functions can also be used.
  • an mRNA-peptide complex library can be formed by hybridization of linker and mRNA in an in vitro translation system, instead of using mRNA with a linker linked in advance.
  • a linker for example, a phenylalanine linker (3′-phenylalanine-ACCA-PEG- [base sequence complementary to the 3 ′ end region of mRNA library] -5 ′) prepared using flexizyme is used to connect the mRNA library and the complementary strand.
  • an mRNA-peptide complex library is formed (“RAPID display method” described in PCT / JP2010 / 68549, an unpublished application).
  • a base sequence for hybridization with the linker is included downstream of the region encoding the mRNA peptide (3 ′ end region).
  • an extended AUG codon that encodes a special amino acid of formula (I) after a random sequence corresponding to some amino acid residues in the middle of the starting AUG codon at the N-terminus of the peptide (Or a codon UGC encoding Cys) followed by a random sequence of appropriate amino acid units, followed by a codon UGC encoding Cys (or the above-mentioned codon encoding a special amino acid of formula (I)), A random sequence continues to the C-terminus.
  • a codon encoding GlySerGlySerGlySer serving as a linker is arranged to follow.
  • Flexizyme is an RNA catalyst (ARS ribozyme) having a function of acylating an amino acid substrate having a desired structure into an arbitrary tRNA.
  • ARS ribozyme RNA catalyst
  • flexizyme has no specificity for each amino acid and each tRNA, and can be aminoacylated using any amino acid other than the amino acid to be originally linked.
  • the ⁇ -position substituent is not included in the amino acid recognition site, it is not limited to L amino acids, but hydroxy acids ( ⁇ -position is a hydroxyl group), ⁇ -N-methylamino acids, ⁇ -N-acylamino acids D-amino acids can also be used as substrates.
  • amino acids that have undergone post-translational modifications such as ⁇ -N-acetyllysine and ⁇ -N-methyllysine can be used as substrates.
  • ⁇ -N-acetyllysine and ⁇ -N-methyllysine can be used as substrates.
  • a special amino acid is introduced into a peptide sequence by adding orthogonal tRNA acylated with a special amino acid using flexizyme to a cell-free translation system.
  • Orthogonal tRNA is not recognized by naturally-occurring ARS (for example, ARS protein enzyme derived from E. coli) inherent in the translation system, so that it is not aminoacylated in the translation system, but is efficient in peptide synthesis reactions on ribosomes. It is a tRNA capable of expressing a designated amino acid by pairing with a codon of mRNA.
  • ARS for example, ARS protein enzyme derived from E. coli
  • tRNA capable of expressing a designated amino acid by pairing with a codon of mRNA.
  • a natural suppressor tRNA derived from a different species or an artificially constructed tRNA is used.
  • what is preferably used for the introduction of a special amino acid in the present invention is an artificial tRNA which is an artificial transcription product.
  • Flexizyme uses an activated amino acid ester as a substrate, a carbonyl group that is an amino acid reaction point, an aromatic ring that is an amino acid side chain or a leaving group, and 5′-RCC-3 ′ present at the 3 ′ end of tRNA. Recognizes a sequence portion (R is A or G) and has a catalytic ability to acylate to adenosine at the 3 ′ end. Flexizyme has no specificity for the anticodon portion of tRNA. In other words, changing the anticodon portion of tRNA to any sequence does not affect the efficiency of aminoacylation. Since flexizyme can link any special amino acid to a tRNA having any anticodon sequence, any special amino acid can correspond to any codon. Therefore, it is possible to prepare a library into which any special amino acid has been introduced.
  • RNA sequence The structure (RNA sequence) of a known flexizyme is shown below.
  • Prototype Flexizyme Fx [GGAUCGAAAGAUUUCCGCAGGCCCGAAAGGGUAUUGGCGUUAGGU-3 ', 45nt]
  • Dinitrobenzyl flexizyme dFx [5'-GGAUCGAAAGAUUUCCGCAUCCCCGAAAGGGUACAUGGCGUUAGGU-3 ', 46nt]
  • Enhanced Flexizyme eFx [5'-GGAUCGAAAGAUUUCCGCGGCCCCGAAAGGGGAUUAGCGUUAGGU-3 ', 45nt]
  • Aminoflexizyme aFx [5'-GGAUCGAAAGAUUUCCGCACCCCCGAAAGGGGUAAGUGGCGUUAGGU-3 ', 47nt]
  • flexizyme skips the process of high-energy intermediate (aminoacylAMP), which is the first step of aminoacylation reaction, and only binds amino acid substrate to tRNA.
  • aminoacylAMP high-energy intermediate
  • activation of acyl groups can be achieved by ester linkage with electron-withdrawing groups, but esters with less strong electron-withdrawing groups will not only hydrolyze in water, but will also generate random RNA. Acylation occurs at the same time.
  • an amino acid substrate that is weakly activated so that such a side reaction hardly occurs in a non-catalytic state.
  • Such weak activation can be performed using, for example, AMP, cyanomethyl ester, thioester, or benzyl ester having a nitro group, fluorine, or other electron-withdrawing functional group.
  • an activated amino acid ester is an amino acid substrate having a weakly activated ester bond such as aminoacyl AMP in a natural aminoacylation reaction and having an aromatic ring in the amino acid side chain or leaving group.
  • suitable activated amino acid esters include aminoacyl-cyanomethyl ester (CME), aminoacyl-dinitrobenzyl ester (DNB: 3,5-dinitrobenzyl ester), or aminoacyl-4-chlorobenzylthioester (CBT: p-chloro-benzyl thioester) and the like, but is not limited thereto.
  • N ⁇ -acetyl-L-phenylalanine is linked to an artificially constructed start tRNA, introduced into the peptide N-terminus, and propargyl chloride in the side chain ( s) -2-amino-6-chlorohex-4-ionic acid, (s) -2-amino-7-chlorohept-5-ionic acid, (s) -2-amino-8-chlorohept-6-ionic acid
  • Three amino acids were each linked to an artificially constructed extended tRNA.
  • the acylation reaction with flexizyme may be carried out in a solution or may be carried out using a column using ARS ribozyme immobilized on a carrier.
  • a column using ARS ribozyme immobilized on a carrier For example, if the translation reaction scale is as small as 100 ⁇ l or less, tRNA is acylated with flexizyme in the solution, and the pellet obtained by ethanol precipitation of the reaction solution is added to an appropriate buffer (for example, 1 mM potassium acetate, pH 5). Etc.) and added to the translation system.
  • an appropriate buffer for example, 1 mM potassium acetate, pH 5). Etc.
  • Suitable reaction conditions may be selected as appropriate, but examples of small scale reaction conditions include 0.5-20 ⁇ M tRNA, 0.5-20 ⁇ M flexizyme, 2-10 mM amino acid substrate, 0.6 M A reaction buffer solution containing MgCl 2 at pH 7.5 and 0.1 M may be reacted at 0 ° C. for 1 to 24 hours.
  • the translation reaction scale exceeds 100 ⁇ l, it is more convenient to use flexizyme immobilized on a carrier in consideration of reuse of flexizyme.
  • the carrier for example, resin, agarose, sepharose, magnetic beads and the like can be used, but are not particularly limited.
  • the flexizyme is immobilized on a carrier, for example, Murakami, H., Bonzagni, N. J. and Suga, H. (2002). "Aminoacyl-tRNA synthesis by a resin-immobilized ribozyme.” J. Am. Chem. Soc. 124 (24): 6834-6835. Separation of the reaction product aminoacylated tRNA can be performed by various methods.
  • a method of eluting from a column with a buffer containing about 10 mM EDTA As an example, there is a method of eluting from a column with a buffer containing about 10 mM EDTA.
  • the resin on which the ARS ribozyme is immobilized can be recycled ten times or more by equilibrating with a reaction buffer, for example.
  • Initiation tRNA and extension tRNA In natural translation reactions, it is important that the initiation tRNA is used only for initiation of translation and not used in the extension reaction, and conversely, the elongation tRNA is not used in the initiation reaction. Such distinction between the initiation tRNA and the extension tRNA is the same in the present invention.
  • artificial tRNA is preferably used for acylating a special amino acid.
  • a non-limiting example of an artificial tRNA that is an extended tRNA is tRNA Asn-E2 .
  • the base sequence of this tRNA is based on natural tRNA Asn (5'-UCCUCUG s4 UAGUUCAGDCGGDAGAACGGCGGACUQUU t6 AAYCCGUAU m7 GUCACUGGTYCGAGUCCAGUCAGAGGAGCCA-3 '), which is an elongation reaction tRNA derived from E. coli ( s4 U: 4-thiouridine Dihydrouridine, Q: cuocin, t6 A: 6-threonylcarbamoyladenine, Y: wifein, m7 G: 7-methylguanosine, T: ribothymidine).
  • tRNA Asn- which is a tRNA for elongation reaction that is not subjected to aminoacylation by 20 types of aminoacylation enzymes of E. coli.
  • E2 was generated by in vitro transcription.
  • NNN corresponds to an anticodon and is changed to correspond to the codon.
  • tRNA fMet A non-limiting example of an artificial tRNA that is the starting tRNA is tRNA fMet .
  • the base sequence of this tRNA is the natural tRNA fMet of E. coli (5'-CGCGGGG s4 UGGAGCAGCCUGGDAGCUCGUCGGGCmU CAU AACCCGAAGAUCGUCGGTYCAAAUCCGGCCCCCGCAACCA-3 '). (Cm: 2'-O-methylcytidine).
  • the present inventors made tRNA fMet , which is a tRNA for initiation reaction in which the modified base was removed and the first C at the 5 ′ end was changed to G from this natural tRNA by in vitro transcription.
  • TRNA fMet used in this application 5'-GGCGGGGUGGAGCAGCCUGGUAGCUCGUCGGGCU CAU AACCCGAAGAUCGUCGGUUCAAAUCCGGCCCCCGCAACCA-3 ', [6 places in total, s4 U8U, D20U, Cm32C, T54U, Y55U, 1 place of mutation.] C1G]) the first base of the key locations in the initiation tRNA 5 'end (natural tRNA fMet at C, G) the application of tRNA fMet is, the 72 th base (the natural tRNA fMet and application of tRNA fMet a) The complementary strand is not assembled.
  • a formyl group is transferred to Met-tRNA fMet by methionylformyltransferase (MTF) (however, there is no meaning when using a special amino acid for initiation in this part), and EF-Tu And the binding with is suppressed.
  • MTF methionylformyltransferase
  • N ⁇ -acetyl-L-phenylalanine was linked to tRNA fMet CAU , introduced into the peptide N-terminal, and three special amino acids having propargyl chloride in the side chain were linked to tRNA AsnE2 CAU . . tRNA Asn-E2 NNN can be used with various changes in the anticodon sequence (NNN, N represents any base), but the modified codon that designates a special amino acid with a propargyl chloride structure in the side chain is AUG The anticodon sequence is CAU.
  • initiation and extension artificial tRNAs are orthogonal to natural ARS, so natural amino acids are not linked in the translation system, but translation initiation reactions and peptide chain elongation reactions on ribosomes It is accepted without any problem. It has been confirmed that these artificial tRNAs can actually be used in the specific cell-free translation system used in the Examples. However, the artificial tRNA that can be used in the present invention is not limited to this. Those skilled in the art will understand that the tRNA that can be used for introducing a special amino acid in the present invention can be appropriately selected according to the components of the cell-free translation system to be used.
  • a special peptide library constructed with a cell-free translation system is perfectly compatible with in vitro display technology including mRNA display, and thus has a high diversity of more than 10 13 types. It is possible to create peptide molecules that bind to a target from a special peptide library.
  • RNA library RNA population
  • peptide library peptide library
  • the peptide population can be poured into a column on which the target protein is immobilized, and a mixture of peptide molecules bound to the column can be recovered.
  • a nucleic acid molecule as a template is added to each peptide molecule like a tag by in vitro display technology.
  • mRNA is added to each peptide molecule. Therefore, after collecting the collected peptide-mRNA complex back to DNA using reverse transcriptase and amplifying it by PCR to obtain a biased library containing many clones having the desired phenotype, the same procedure was repeated. Conduct a selective experiment.
  • RNA aptamer in order to avoid the possibility of recovering the RNA aptamer, a reverse transcription reaction can be performed before selection for the purpose of making the nucleic acid portion into a double strand (DNA / RNA hybrid). By repeating this operation, clones having a desired phenotype are enriched in the population as the generation progresses.
  • an in vitro display library and a target substance are mixed, an association molecule (active species) that displays a peptide bound to the target substance is selected, and PCR is performed from the nucleic acid portion of the selected association molecule.
  • an association molecule active species
  • PCR is performed from the nucleic acid portion of the selected association molecule.
  • the target substance may be a protein, peptide, nucleic acid, carbohydrate, lipid, any complex thereof, or any other compound.
  • the [genetic information]-[peptide] complex is brought into contact with a target substance, and a complex that presents a peptide bound to the target substance can be selected from many other unbound target substances. It is necessary to separate and recover from the complex by an appropriate method. Many techniques are known as such recovery methods.
  • a polyhistidine tag can be linked to a target substance and recovered using specific binding of the polyhistidine tag to a carrier on which Ni-NTA is supported.
  • biotin binding protein avidin, streptavidin, etc.
  • Biotin avidin, streptavidin, etc.
  • maltose binding protein / maltose
  • glutathione-S -Combinations of transferase / glutathione, antibody / antigen (epitope), etc. can be used, but are not limited thereto.
  • a peptide library is brought into contact with a target substance, an active species presenting a peptide bound to the target substance is selected, a nucleic acid sequence of the selected active species is amplified, and the amplified nucleic acid sequence is used as a template. It involves creating a special peptide that binds to a target substance by repeating in vitro selection of selecting active species from a library of peptides synthesized again in a cell-free translation system.
  • a secondary structure-directed peptide which is a library aiming at the existence of many specific secondary structures called helix structures by incorporating a cross-linked structure into a linear peptide.
  • a special peptide compound that binds to the target substance involves collecting active species presenting peptides bound to the target substance, analyzing the nucleic acid sequence, determining the peptide sequence from the nucleic acid sequence, and based on the obtained peptide sequence It includes obtaining an amino acid sequence and a nucleic acid sequence of a special peptide that binds to a target substance by selecting an appropriate special peptide. Furthermore, based on the obtained sequence information, it is possible to synthesize, purify and isolate special peptides using any method. Using the obtained peptide, the target protein can be evaluated for binding and the inhibitory activity can be confirmed to obtain a highly active special peptide.
  • the present invention (A) a primary screening step for selecting peptides that bind to the target protein; (A) including a secondary screening step of evaluating the binding ability of the peptide selected in the primary screening, and determining that the peptide is a peptide exhibiting a certain binding force;
  • the primary screening step (i) preparing a library containing peptides having secondary structure directivity, (ii) contacting the peptide library with the target protein; and (iii) including a method of obtaining a peptide having an inhibitory activity against an intermolecular interaction of a target protein from a peptide library, comprising a step of selecting a peptide molecule that binds to the target protein.
  • Target protein Bcl-2 There are various pathways for apoptosis, which is the programmed death of cells, and one of them is a regulatory mechanism to which Bcl-2 protein contributes. Bcl-2 protein suppresses its activity by binding to a protein that induces apoptosis. It is known that Bcl-2 protein is highly expressed in cancerous cells and thus is less likely to induce apoptosis. Thus, if a molecule that binds to Bcl-2 with high selectivity and strength can be obtained, it can inhibit the binding between Bcl-2 and an apoptosis-inducing protein, leading to apoptosis in cancerous cells.
  • this inhibitory molecule has been intensively studied, but it has been difficult to develop a molecule that inhibits such interaction between proteins. Since this helix structure called BH3 domain contained in Bcl-2 protein is used for this intermolecular interaction, if a library of molecules with helix structure can be formed, it will be highly selective from that, In addition, it was considered possible to obtain a potent inhibitor, and a search from a chemical library using a cross-linked peptide by the above-described alkene formation was also conducted. However, no molecule having a strong inhibitory activity has been obtained.
  • an mRNA library as a template is prepared.
  • the length of the sequence of the translated part of mRNA is arbitrary.
  • the length may include 16 to 24 codons (for example, pools 16-1 to 24-4 in FIG. 5).
  • the N-terminus is the initiation AUG codon.
  • a codon encoding GlySerGlySerGlySer serving as a linker may be added to the C-terminal side.
  • the downstream of the start AUG codon can be a random codon sequence of NNU or NNC (N represents any one base of A, U, G, and C, respectively).
  • One specific codon in this random sequence is used as an AUG codon for introduction of the special amino acid of formula (I), and a codon UGC encoding Cys is arranged at a position 2, 3, 6 or 10 amino acid units away therefrom. (For example, FIGS. 2 and 5).
  • peptide library is translated under a modified genetic code table. For example, a translation system in which methionine is removed from 20 ordinary amino acids, instead of (i) tRNA fMet CAU linked to N ⁇ -acetylated amino acid, (ii) tRNA AsnE2 CAU propargyl
  • the template mRNA is translated using a special amino acid linked to the side chain of the chloride structure.
  • These two aminoacyl tRNAs can be prepared using flexizyme.
  • aminoacyl tRNA of (i) is recognized by the initiation factor and paired with the initiation AUG codon
  • aminoacyl tRNA of (ii) is recognized by the elongation factor and paired with the AUG codon.
  • a crosslinked structure is formed by a thioether bond obtained by the action of the sulfanyl group of cysteine on the propargyl chloride structure.
  • puromycin is bound to the 3 ′ end of each mRNA in the mRNA library, so that after translation, the C-terminus of the peptide is linked to mRNA via Pu (puromycin).
  • Pu puromycin
  • any special amino acid other than N ⁇ -acetyl-L-phenylalanine, or methionine or other 19 proteinaceous amino acids may be utilized.
  • the peptide library obtained is screened by various in vitro display methods such as mRNA display method and ribosome display method, and peptides that bind to Bcl-2 are selected.
  • the present invention is applied to screening targeting not only BCl-2 but also various molecules.
  • the target molecule one in which intermolecular interaction is performed by recognizing a helix structure is preferably selected.
  • Examples of molecules that recognize the helix structure and interact with each other include p53 and hDM2 (F. Bernal, AF Tyler, SJ Korsmeyer, LD Walensky, GL Verdine J. Am. Chem. Soc. 129). 2456-2457 (2007).), But not limited to these.
  • the present invention will be specifically described by way of examples. These examples are for explaining the present invention, and do not limit the scope of the present invention.
  • Peptide library with a cross-linked structure formed from a special amino acid and cysteine in the sequence to obtain a peptide that binds to the intermolecular interaction site by BH-2 domain of Bcl-2 and inhibits the intermolecular interaction was constructed and selected by the mRNA display method.
  • NNU mRNA library double-stranded DNA having the following sequence was prepared. (In the following, only the forward strand is listed in the order of 5 'to 3'.) TAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACAT (ATG) (NNT) s (ATG) (NNT) 3 (TGC) (NNT) t (GGT) (AGC) (GGC) (AGC) (GGC) (AGC) (TAG) GACGGGGGGCGGAAA In the translation region, one codon is enclosed by one (). N represents any one of A, T, G, and C.
  • s and t represent the number of triplet repeats, 2 and 8, or 6 and 4, or 2 and 12, or 6 and 8, or 10 and 4, or 2 and 16, or 6 and 12, or 10 respectively. And 8, or 14 and 4. Subsequently, this was transcribed using T7 RNA polymerase to obtain a library composed of mRNA pools represented by the following sequences (see the lower table in FIG. 5).
  • mRNA display By repeating the following cycle from “ligation with puromycin linker” to “amplification of sequence information of recovered peptide”, peptides that bind to Bcl-2 were selected from a random peptide library (FIG. 4).
  • the puromycin linker represented by the following sequence was annealed with the above mRNA library and ligated with T4 RNA ligase.
  • SPC18 represents PEG in which the total number of C and O is 18.
  • pdCTCCCGCCCCCCGTCC SPC18 5 CC (Pu)
  • the mRNA linked to the translation linker was translated under the modified genetic code table (FIG. 6).
  • a translation system in which methionine was removed from 20 kinds of normal amino acids was constructed, and instead, the following two kinds of aminoacyl-tRNAs (i) and (ii) prepared using flexizyme: (I) tRNA fMet CAU linked with N ⁇ -acetyl-L-phenylalanine, (Ii) tRNA AsnE2 CAU with (s) -2-amino-6-chlorohex-4-ionic acid (X 0 ), (s) -2-Amino-7-chlorohept-5-ionic acid (X 1 ), (s) -2-Amino-8-chlorohept-6-ionic acid (X 2 )
  • the translations were performed by adding those linked to each other.
  • the prepared cross-linked peptide library was mixed with Bcl-2 immobilized on TALON beads and stirred at 4 ° C for 30 minutes. The supernatant was removed using a magnet, and the remaining magnetic particles were washed with a buffer. The PCR solution was added to the beads and heated at 95 ° C. for 5 minutes to remove the peptide from the beads and collect the supernatant.
  • Amplification of sequence information of recovered peptide The peptide-mRNA recovered by binding to Bcl-2 was amplified as DNA by reverse transcription and PCR. The obtained DNA was transcribed into mRNA.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

 本発明は、安定化された二次構造をもつペプチドを提供すること等を課題とする。 本発明は、架橋構造により安定化された二次構造を有するペプチドであって、以下の式(I)で表される特殊アミノ酸と、側鎖にスルファニル基を有するアミノ酸との組を少なくとも1つを含み、 【化1】 〔式中、(A)は、単結合、又は主鎖の原子数が1-10である連結基を示し;(B)は、少なくとも一つのπ結合を含む基を示し;(C)は、水素原子、又は置換基で置換されていてもよいアルキル基を示し;Xは、スルファニル基による置換反応で置換されうる基を示す。〕 前記特殊アミノ酸残基の側鎖と、前記スルファニル基とのチオエーテル結合による架橋構造が形成されている、ペプチドを提供する。

Description

安定化された二次構造を有するペプチド、及びペプチドライブラリー、それらの製造方法
 本発明は、特殊アミノ酸の導入により誘導される二次構造を固定したペプチド分子、その合成、そのようなペプチド分子の集合体からなるライブラリーを構築する方法、構築されたライブラリー、並びにライブラリーから活性ペプチドをスクリーニングする方法等に関する。
 生体内分子間の相互作用に対する阻害分子種として、αヘリックス二次構造を有するペプチドが主に3つの点から注目されている。1つに、その相互作用にはαヘリックスを介したものが多く見受けられるためにその構造を起点とした阻害剤の開発が見込めること、2つに、ヘリックス構造が形成されたペプチドは細胞膜透過性を有する可能性が高いことから細胞内タンパクを標的としたペプチド創薬が展開できること、3つに、ペプチドでありながらもプロテアーゼへの安定性を獲得していることから一般のペプチドよりも長い血中半減期をもつことが期待できることである。しかし、αヘリックスを構成するアミノ酸配列情報に基づいて単純にペプチドを調製したのではこれらの優位性を獲得できない場合が多い。短鎖ペプチドでは3次元構造を有したタンパク質と異なりヘリックスを取り巻く環境が溶媒に曝露されているが故にその影響を強く受けることから、構造が維持できないからである。その解決策として、このヘリックス構造を形成している特異的な水素結合を補助する目的で適切な位置のアミノ酸側鎖同士を共有結合で架橋することよって、水溶液中であってもヘリックス構造を維持させるあるいは固定させる数多くの試みがなされてきた。しかしながら、このようなアプローチの多くは、ペプチド鎖に組み込まれた人工アミノ酸に対し化学触媒を用いて共有結合を形成させるため、ペプチド合成も含め全行程を化学合成に依存する。したがって、αヘリックス二次構造を固定した特殊ペプチドに生理活性を求める場合の多くは、既存のタンパク質のαへリックス部位の配列をもとに、デザインあるいは低多様性のフォーカスライブラリーを構築し、個々のペプチドの活性を評価することで薬剤候補ペプチドを見いだしてきた。
 一方、特定の標的に結合するペプチド性の分子を取得する際には、ランダムなペプチドライブラリーからスクリーニングを行う手法が広く使われている。最も一般的な手法はファージを用いるペプチドディスプレイ方法であるが、近年、大腸菌等の生物種を介さないペプチドディスプレイ法が用いられるようになった。すなわち、翻訳を利用したリボソームディスプレイ法やmRNAディスプレイ法などの各種in vitroディスプレイ法は、1本のチューブ内で短期間に高多様性のライブラリーを構築・スクリーニングできる点で優れている。In vitroディスプレイ法とは、表現型(phenotype)とその配列をコードした遺伝型(genotype)を非共有結合あるいは共有結合で連結することで表現型を遺伝型にディスプレイし、試験管に再構築された複製システムを用いて活性種を濃縮、増幅(セレクション)することを可能にするシステムを指す。本システムの最大の特徴は、原核・真核生命体を媒体としない点であり、このために非常に大きな多様性をもったライブラリーから、高活性の生理物質を単離することができる。その典型的な比較例としては、大腸菌を複製媒体とするファージディスプレイでは10の7乗の多様性ライブラリーのセレクションが可能であるが、 in vitroディスプレイでは10の12乗に及ぶ多様性ライブラリーの探索が可能となる。in vitroディスプレイには、リボソームディスプレイ、mRNAディスプレイ、RaPIDディスプレイ(未公開国際特許出願であるPCT/JP2010/68549)等がある。その一例として、mRNAディスプレイを例に挙げ下記に説明する。
 mRNAディスプレイ法は、ポリペプチドとその鋳型であるmRNAを結合させることにより、ポリペプチドのアミノ酸配列と核酸配列を対応付ける技術である。そのために、アシル化tRNAの末端アナログであるピューロマイシンを適当なリンカーを介してmRNAの3’末端に結合させ、これを翻訳反応に加えることで、ピューロマイシンがリボソームのA部位に入り込み、伸長中のペプチドと共有結合を形成し、結果として翻訳産物であるペプチド分子がピューロマイシンを介してmRNAと連結する(特許文献1~3、非特許文献1、2)。
 このようにIn vitroディスプレイでは、10の12乗もの多様性を持つペプチドライブラリーをスクリーニングすることが可能であるが、生体の機能を利用してペプチドライブラリーを構築するために、従来はタンパク質性アミノ酸のみから構成されているペプチドライブラリーしか構築されていなかった。この構成要素の低さを乗り越え、天然にはない新たな機能をアミノ酸構造中に組み込むことで、通常では不安定なαヘリックス二次構造を安定化できる新規な骨格をもったペプチドライブラリーを構築してスクリーニングを行うことができれば、天然に存在するような単純なペプチド鎖では達成できない高い阻害能や選択性、安定性等を示すペプチドを獲得することが可能になると期待できる。
 近年、「遺伝暗号の拡張」や「遺伝暗号のリプログラミング」と呼ばれる技術の発展に伴い、実際にファージディスプレイを含む各種ディスプレイ法によって特殊なアミノ酸を有するペプチドライブラリーを調製・スクリーニングすることが可能となってきた。
 遺伝暗号の拡張では、天然の翻訳系でアミノ酸の指定に使われていない終止コドンや人工4塩基コドンを利用し、それらのコドンに特殊アミノ酸を割り当てることで、特殊アミノ酸を含むタンパク質・ペプチドの合成を可能にした。しかし、停止コドンや利用可能な4塩基コドンの数に限りがあるため、同時に利用可能な特殊アミノ酸の数に上限があった(実質3種類以下)。
 αヘリックスの安定化を目的とした架橋構造が導入されたペプチドに関する研究も精力的におこなわれている。現在、主としてアミド結合、ジスルフィド結合、そして、閉環メタセシス反応によるアルケンの形成による方法が報告されている(非特許文献3)。これらの共有結合の導入によりヘリックス構造が誘起されるのだが、一般に生体内での安定性に問題がある。すなわち、アミド構造やジスルフィド構造では、プロテアーゼや還元条件により容易に切断されてしまうため、阻害剤としての利用には不利であった。その点を克服したのがアルケンの形成による方法であり、この架橋構造が導入されたペプチドは生体内において活性を有することが分っている(非特許文献4)。現在、このアルケンの形成による架橋構造を用いた生理活性ペプチドの開発がおこなわれている。
 しかし、既知のアミノ酸配列から化学合成によってフォーカスライブラリーを構築した後、生理活性が失われない架橋構造位置を精査していく必要があることから、その開発には多大な労力を要する。さらに、上記のようなデザインによるフォーカスライブラリーの探索では、必ずしも得られたペプチド配列が最善の配列であり得る確証はない。残念ながら、上記のアルケン形成による架橋反応は、化学触媒を用いるため、in vitroディスプレイ法に適応する事が極めて難しい。すなわち、翻訳反応に必要なリボソームやタンパク質、ATP等の因子が共存した状態でアルケン形成を行わねばならないためにその反応効率の低下が危惧され、高品質のライブラリーを構築する事が困難である。したがって、より広範囲な標的に対し、αへリックス構造を固定させた生理活性特殊ペプチドを発見するためには、in vitroディスプレイ法に適用可能な架橋法の開発が不可欠である。その架橋法は、翻訳系の条件下で架橋反応が迅速かつ高選択的に起き、またその形成された架橋構造は生体内で容易に分解されない構造でなければならない。
特許第3683282号広報(国際公開WO98/16636) 特許第3683902号広報(国際公開WO98/31700) 特許第3692542号広報
Roberts et al., Proc. Natl. Acd. Sci. USA, 1997, 94, 12297-12302、 Nemoto et al., FEBS Lett., 1997, 414, 405-408、 Taylor, W., J., Baum, J.et al., J. Am. Chem. Soc., Vol. 116, p.6431-6432 (1994), Schultz, P.G. et al., J. Am. Chem. Soc., Vol. 113, p.9391-9392 (1991), Phelan, J. C. et al., J. Am. Chem. Soc., Vol. 119, p.455-460 (1197), Grubbs, R.H., Blackwell, H. E. ,Angew. Chem. Int. Ed. Vol. 37, p.3281-3284 (1998) Verdine, G. L., Korsmeyer, S. J. et al., Science, Vol 305, p.1466-1470 (2004)
 本発明は、翻訳合成条件下で架橋構造形成が自発的に起きるように設計された特殊アミノ酸をペプチド鎖に翻訳導入することで得られる、安定化された二次構造をもつペプチドを提供すること等を課題とする。
 本発明者らにより近年開発された遺伝暗号のリプログラミングによる特殊ペプチド合成技術を利用して、スルファニル基(-SH基)を側鎖にもつシステインあるいはその類縁体と反応し得る側鎖をもつ特殊ペプチドを合成し、目的の二次構造を固定した特殊ペプチドを翻訳合成する(図1)。
 本発明について詳述する前に、以下ではまず背景技術となる「遺伝暗号のリプログラミング」について概説する。
 生体の翻訳では、mRNAの3つの塩基の並び(トリプレット)が一つのコドンとして一つのアミノ酸を指定しており、その並びに対応するペプチドが合成される。このとき、コドンとアミノ酸との対応付けは、以下の2段階で行われる。(i) tRNA の末端にアミノアシル tRNA 合成酵素(aminoacyl-tRNA synthetase:ARS)が対応するアミノ酸を連結する。 (ii) tRNA のアンチコドンが対応する mRNA のコドンと対合することにより、mRNA の情報に沿って tRNA 上のアミノ酸が重合されペプチドが合成される。
 こうしたコドンとアンチコドンとの対応関係は、ほとんど普遍的に決定されており、64種類のコドンそれぞれに、20種類のアミノ酸のいずれか一つが割り当てられている。普遍遺伝暗号表を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
 しかしながら、再構成型の翻訳系と人工アミノアシル化RNA触媒フレキシザイムを利用することで、この遺伝暗号をリプログラミングすることができる。
 再構成型の翻訳系とは、リボソーム、翻訳因子、tRNA、アミノ酸、およびATPやGTP等のエネルギーソースなど、タンパク質やペプチドの翻訳合成に関わる因子をそれぞれ単離・精製し、混ぜ合わせた翻訳系である。例えば、大腸菌のリボソームを用いる系として次の文献に記載された技術が公知である:H. F. Kung, B. Redfield, B. V. Treadwell, B. Eskin, C. Spears and H. Weissbach (1977) "DNA-directed in vitro synthesis of beta-galactosidase. Studies with purified factors" The Journal of Biological Chemistry Vol. 252, No. 19, 68896894 ; M. C. Gonza, C. Cunningham and R. M. Green (1985) "Isolation and point of action of a factor from Escherichia coli required to reconstruct translation" Proceeding of National Academy of Sciences of the United States of AmericaVol. 82, 1648-1652 ; M. Y. Pavlov and M. Ehrenberg (1996) "Rate of translation of natural mRNAs in an optimized in Vitro system" Archives of Biochemistry and Biophysics Vol. 328, No. 1, 9-16 ; Y. Shimizu, A. Inoue, Y. Tomari, T. Suzuki, T. Yokogawa, K. Nishikawa and T. Ueda (2001) "Cell-free translation reconstituted with purified components" Nature Biotechnology Vol. 19, No. 8, 751-755;H. Ohashi, Y. Shimizu, B. W. Ying, and T. Ueda (2007) “Efficient protein selection based on ribosome display system with purified components” Biochemical and Biophysical Research Communications Vol. 352, No. 1, 270-276。
 一方、フレキシザイム(flexizyme)は、任意のtRNAに任意のアミノ酸またはヒドロキシ酸を連結(アシル化)することのできる人工RNA触媒(アシルtRNA合成酵素様活性を持つRNA触媒)である。例えば、以下の文献に記載されたものが公知である:H. Murakami, H. Saito, and H. Suga, (2003), Chemistry & Biology, Vol. 10, 655-662; H. Murakami, D. Kourouklis, and H. Suga, (2003), Chemistry & Biology, Vol. 10, 1077-1084; H. Murakami, A. Ohta, H. Ashigai, H. Suga (2006) Nature Methods 3, 357-359 "The flexizyme system: a highly flexible tRNA aminoacylation tool for the synthesis of nonnatural peptides";N. Niwa, Y. Yamagishi, H. Murakami, H. Suga (2009) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 19, 3892-3894 "A flexizyme that selectively charges amino acids activated by a water-friendly leaving group";及びWO2007/066627「多目的化アシル化触媒とその用途」)。フレキシザイムは、原型のフレキシザイム(Fx)、及び、これから改変されたジニトロベンジルフレキシザイム(dFx)、エンハンスドフレキシザイム(eFx)、アミノフレキシザイム(aFx)等の呼称でも知られる。
 あるいは、任意のtRNAに任意のアミノ酸を連結可能な方法の変法として、化学的アミノアシル化等の他の方法を用いることもできる。
 遺伝暗号のリプログラミングには、翻訳系の構成因子を目的に合わせて自由に取り除き、必要な成分だけを再構成してできる翻訳系を利用する。例えば、特定のアミノ酸を除去した翻訳系を再構成すると、当該アミノ酸に対応するコドンが空きコドンになる。続いて、フレキシザイム(あるいは化学的アミノアシル化、あるいは変異タンパク質酵素を用いたアミノアシル化)を利用して、その空きコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAに特殊なアミノ酸を連結し、これを加えて翻訳を行う。これによって、特殊なアミノ酸がそのコドンでコードされることになり、除去したアミノ酸の代わりに特殊なアミノ酸が導入されたペプチドが翻訳される。
 本発明における限定を意図しない一つの態様として、遺伝暗号のリプログラミング技術により、例えば、側鎖にプロパルギルクロリド構造を有する特殊なペプチドを合成する。このとき、ペプチド中に、上記側鎖構造を持つ残基の位置から適切な残基数を挟んでシステイン残基を配置しておくと、翻訳後に自発的にそのスルファニル基によるプロパルギル位上での置換反応が進行し、ペプチド側鎖間にチオエーテル結合による架橋構造が形成される。すなわち、求電子剤としてはプロパルギルクロリド構造を、求核剤としてはスルファニル基という結合形成が可能な一組の構造をアミノ酸内へ組み込むことにより、その間に結合を形成させ架橋構造を構築することができる。この架橋構造がヘリックス形成の鍵となる位置特異的な水素結合を補助してヘリックス構造を誘導させ、ペプチドに所望の二次構造を与える。このような結合形成が可能な分子構造の対は、プロパルギルクロリド構造とシステインに限定されない。詳細は後述する。
 さらに、本発明では、上記の技術を利用して特殊なペプチドライブラリーを構築し、そこから生体内分子間相互作用の阻害剤を獲得する技術を提供する。
 本発明の要旨は以下の通りである。
〔1〕架橋構造により安定化された二次構造を有するペプチドであって、
 以下の式(I)で表される特殊アミノ酸と、側鎖にスルファニル基を有するアミノ酸との組を少なくとも1つを含み、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
〔式中、(A)は、単結合、又は主鎖の原子数が1-10である連結基を示し;(B)は、少なくとも一つのπ結合を含む基を示し;(C)は、水素原子、又は置換基で置換されていてもよいアルキル基を示し;Xは、スルファニル基による置換反応で置換されうる基を示す。〕
 前記特殊アミノ酸残基の側鎖と、前記スルファニル基とのチオエーテル結合による架橋構造が形成されている、ペプチド;
〔2〕前記式(I)において、
 (A)は、単結合;置換基で置換されていてもよい、炭素数1-10のアルキレン基、炭素数2-10のアルケニレン基、又は炭素数2-10のアルキニレン基;主鎖の1-2個の炭素原子が、酸素原子、窒素原子、若しくは硫黄原子に置換された、置換基で置換されていてもよい、主鎖の原子数が10以下のアルキレン基、アルケニレン基、及びアルキニレン基からなる群より選択され、
 (B)は、-C≡C-、-C=C-、-Ar-、-Ar-Ar-、-Ar-C≡C-、-Ar-C=C-、-NHC(O)-、-C(O)-、-Ar-NHC(O)-、-Ar-C(O)-からなる群より選択され、
 (C)は、水素、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、及びペンチル基からなる群より選択され、
 Xは、Cl、Br、I、-OSO2Me、トシル基、ノシル基、-OSO2-Ar-R(式中、RはCH3、NO2、CF3及びHからなる群より選択される基を表す。)からなる
群より選択される、上記〔1〕に記載のペプチド;
〔3〕前記式(I)の特殊アミノ酸が、以下の式(II)~(IV)のいずれかで示される、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
〔式中、mは1~10から選択される整数を示し、Cl、Br、I、-OSO2Me、トシル基、ノシル基、-OSO2-Ar-R(式中、RはCH3、NO2、CF3及びHからなる群より選択される基を表す。)からなる群より選択される。〕
 上記〔1〕又は〔2〕に記載のペプチド;
〔4〕前記スルファニル基を有するアミノ酸が、システイン、並びに以下の式(V)及び(VI)で表されるシステインアナログからなる群より選択される、上記〔1〕から〔3〕のいずれか1項に記載のペプチド;
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
〔5〕前記特殊アミノ酸残基と、前記側鎖にスルファニル基を有するアミノ酸残基とが、各組において、2、3、6又は10アミノ酸残基隔てて配置されている、上記〔1〕から〔4〕のいずれか1項に記載のペプチド;
〔6〕架橋構造により安定化された二次構造を有するペプチドの製造方法であって、
(i)スルファニル基を側鎖に持つアミノ酸、および、以下の式(I)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
〔式中、(A)は、単結合、又は主鎖の原子数が1-10である連結基を示し;(B)は、少なくとも一つのπ結合を含む基を示し;(C)は、水素原子、又は置換基で置換されていてもよいアルキル基を示し;Xは、スルファニル基による置換反応で置換されうる基を示す。〕
で表される特殊アミノ酸の組が、少なくとも1つ分子内に配置された特殊ペプチドを翻訳によって合成する工程;及び
(ii)前記各組において前記スルファニル基と式(I)の特殊アミノ酸の側鎖をチオエーテル結合させて架橋構造を形成する工程、
を含む前記方法;
〔7〕前記スルファニル基を側鎖に持つアミノ酸と式(I)の特殊アミノ酸が、各組において、2、3、6、または10アミノ酸残基隔てて配置される、上記〔6〕に記載の方法;
〔8〕前記(i)の翻訳合成工程が、式(I)の特殊アミノ酸をtRNAに連結して得られるアミノアシルtRNAを利用して、該特殊アミノ酸をコードする改変コドンを有する鋳型mRNAを翻訳することを含む、上記〔6〕又は〔7〕に記載の方法;
〔9〕前記スルファニル基を側鎖に持つアミノ酸が改変コドンでコードされる特殊アミノ酸であり、前記(i)の翻訳合成工程が、式(I)の特殊アミノ酸及び該スルファニル基を側鎖に持つ特殊アミノ酸をそれぞれtRNAに連結して得られるアミノアシルtRNAを利用して、それぞれの特殊アミノ酸をコードする改変コドンを有する鋳型mRNAを翻訳することを含む、上記〔8〕に記載の方法;
〔10〕前記アミノアシルtRNAは、アシルtRNA合成酵素様活性を持つRNA触媒を用いて特殊アミノ酸をtRNAに連結して得られたものである、上記〔8〕または〔9〕に記載の方法;
〔11〕前記式(I)で示される特殊アミノ酸が、以下の式(II)~(IV)のいずれかで示される、上記〔6〕~〔10〕のいずれか1項に記載の方法;
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
〔12〕前記スルファニル基を有するアミノ酸が、システイン、並びに以下の式(V)及び(VI)で示されるシステインアナログからなる群より選択される、上記〔6〕~〔11〕のいずれか1項に記載の方法;
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
〔13〕上記〔1〕から〔5〕のいずれか1項に記載のペプチドを2種以上含む、ペプチドライブラリー;
〔14〕前記各ペプチドが、それをコードするmRNAと連結されている、上記〔13〕に記載のペプチドライブラリー;
〔15〕上記〔13〕に記載のペプチドライブラリーを構築する方法であって:
(i)ランダムなアミノ酸配列をコードするRNA中に、スルファニル基を側鎖に持つアミノ酸を指定するコドン、および、上記〔1〕に記載の式(I)で表される特殊アミノ酸を指定するコドンの組を少なくとも一つ含み、各組においてスルファニル基を側鎖に持つアミノ酸を指定するコドンと式(I)の特殊アミノ酸を指定するコドンが、2、3、6、または10アミノ酸単位隔てて配置されているmRNAのライブラリーを調製する工程;
(ii)前記特殊アミノ酸を連結したtRNAを含む無細胞翻訳系で前記mRNAを翻訳して、ランダム配列中に前記特殊アミノ酸が配置されたペプチドの集合体を得る工程;及び
(iii)各ペプチドにおいてスルファニル基と式(I)の特殊アミノ酸の側鎖を結合させて架橋構造を形成する工程、
を含む方法;
〔16〕上記〔14〕に記載のペプチドライブラリーを構築する方法であって:
 上記〔15〕に記載の工程(i)において、さらに、mRNAの3’末端にピューロマイシン
を結合させ、ピューロマイシン結合mRNAライブラリーを得る工程;、
 工程(ii)において、前記ピューロマイシン結合mRNAライブラリーを無細胞翻訳系で発現させ、ランダム配列中に前記特殊アミノ酸が配置されたペプチド-mRNA複合体を得る工程;及び
 工程(iii)を行う工程、
を含む方法;
〔17〕式(I)の特殊アミノ酸を指定する改変コドンがAUGコドンであり、mRNAランダム配列が、NNCまたはNNU配列(NはA,U,G,Cのいずれか一つの塩基を表す。)のいずれかのトリプレットの繰り返しからなる、上記〔15〕又は〔16〕に記載の方法;
〔18〕以下の式(I)で表される特殊アミノ酸;
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
〔式中、(A)は、単結合、又は主鎖の原子数が1-10である連結基を示し;(B)は、少なくとも1つの炭素原子間の二重結合を含む基、少なくとも1つの炭素原子間の三重結合を含む基、又は少なくとも1つの芳香環を含む基を示し;(C)は、水素原子又は炭素数が1-3である置換基を有していてもよいアルキル基を示し;Xは、スルファニル基による置換反応で置換されうる基を示す。〕
〔19〕上記〔13〕又は〔14〕に記載のペプチドライブラリーから標的タンパク質に結合するペプチドを選択する方法であって、
 (i)ペプチドライブラリーを標的タンパク質に接触させ、インキュベートする工程;及び
 (ii)標的タンパク質に結合するペプチド分子を選択する工程、
を含む方法;
〔20〕上記〔13〕又は〔14〕に記載のペプチドライブラリーから標的タンパク質の分子間相互作用に対する阻害活性を有するペプチドを選択する方法であって、
 (ア)上記〔19〕に記載の工程(i)及び(ii)を含む、標的タンパク質に結合するペプチドを選択する一次スクリーニング、および
 (イ)一次スクリーニングで選択されたペプチドの標的タンパク質の分子間相互作用に対する阻害活性を評価し、前記ペプチドが標的タンパク質の分子間相互作用に対する阻害活性を有するペプチドであることを決定する二次スクリーニング、
を含む方法;
〔21〕標的タンパク質に結合するペプチドの製造方法であって:
 (i)上記〔14〕に記載のペプチドライブラリーを標的タンパク質に接触させ、インキュベートする工程;
 (ii)標的タンパク質に結合するペプチド-mRNA複合体を選択する工程;
 (iii)選択されたペプチド-mRNA複合体のmRNAを増幅し、ペプチド-mRNA複合体を得る工程;
 (iv)(i)~(iii)を1回以上繰り返して、親和性の高いペプチド-mRNA複合体を濃縮する工程;及び
 (v)(iv)で濃縮されたペプチド-mRNA複合体のmRNAからペプチドを発現させる工程、
を含む方法;及び
〔22〕標的タンパク質がアポトーシスを抑制する分子である、上記〔19〕~〔20〕のいずれか1項記載の方法、
に関する。
 本発明により、所望の位置に架橋構造が導入され、安定した二次構造(例えばαヘリックス構造)を持つペプチドを得ることが可能となる。かかるペプチドは、安定した二次構造を有するので、通常のペプチドでは持ち得ない機能、例えば標的に対する高親和性、高選択性、細胞膜透過性、安定性に優れる。
 また、かかるペプチドにおいてアミノ酸配列をランダムにしたペプチドライブラリーを作製し、これを用いてスクリーニングを行うことにより、標的タンパク質等に対して高親和性を有するペプチドや、標的タンパク質の機能を阻害するペプチドなど生理活性を有するペプチドを得ることができる。
 さらに、ペプチドライブラリーにおいて、ペプチドとこれをコードする核酸を連結させてin vitroディスプレイ法を適用することにより、選択されたペプチドの濃縮及び増幅を容易にすることができる。
図1は、αヘリックス二次構造を固定した特殊ペプチドの一例を示す。 図2は、架橋構造前駆体の配置例を示す。 図3は、選択的な架橋構造の形成を示す。 図4は、mRNAディスプレイによる架橋ペプチドライブラリーを用いたスクリーニングの概念を示す。 図5は、mRNAライブラリーの構築例を示す。 図6は、改変遺伝暗号表による翻訳の概念を示す。
架橋構造が導入されたペプチド
 本発明は、架橋構造を備えることにより安定化した二次構造を有する新規なペプチドを提供する。本明細書において、「二次構造」とは、ペプチド主鎖中の水素結合によって形成される比較的狭い範囲にみられる特殊な構造をいい、ヘリックスやβ構造を意味する。本発明は、αヘリックス、310ヘリックス構造等のヘリックス構造の安定化に適しているが、他の二次構造も安定化しうる。
 また、本明細書において、ペプチドの「二次構造を安定化する」とは、ペプチドが標的分子にある程度の再現性をもって結合できる程度に二次構造が安定化されることを意味する。
 ペプチドに架橋構造を付与して二次構造を安定化させると、(i)プロテアーゼ耐性が向上する、(ii)膜透過性が向上する。(iii)標的タンパク質との親和性が向上する、と考えられている。背景技術で述べたように、これまでも、アミノ酸側鎖間をアミド結合やジスルフィド結合で架橋することにより、ペプチド二次構造を安定化させる試みがなされてきた。また、化学触媒を用いたアルケン形成による架橋反応も報告されている。
 しかしながら、これまでの方法と異なり、本発明のペプチドに形成された架橋構造は生体内で容易に分解されない構造であり、具体的には、アミド結合のように酵素的に分解されることも、ジスルフィド結合のように還元されてしまうこともない。
 本発明のペプチドは、以下の式(I)で表される特殊アミノ酸と、側鎖にスルファニル基を有するアミノ酸との組を少なくとも1つ含み、特殊アミノ酸の側鎖とスルファニル基とのチオエーテル結合による架橋構造が形成されている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
 式中、(A)は、スペーサーとして機能を果たす部位を示す。(A)は、単結合又は主鎖の原子数が1-10の連結基であって、後述する(B)CH2-Xとスルファニル基との架橋反応が好適に生じる限り、どのような基であってもよいが、例えば、単結合;置換基で置換されていてもよい、炭素数1-10のアルキレン基、炭素数2-10のアルケニレン基、又は炭素数2-10のアルキニレン基;主鎖の1-2個の炭素原子が、酸素原子、窒素原子、若しくは硫黄原子に置換された、置換基で置換されていてもよい、主鎖の原子数が10以下のアルキレン基、アルケニレン基、又はアルキニレン基、等が挙げられるがこれらに限定されない。
 なお、本発明のペプチドを翻訳合成法により合成する場合、(A)があることが翻訳反応の進行に好ましいという利点もある。
 (B)は、スルファニル基によるXの置換反応を誘起させる限り、どのような基であってもよいが、例えば、少なくとも一つのπ結合を含む基とすることができる。π結合を含む基としては、置換基で置換されていてもよい、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基;置換基で置換されていてもよい少なくとも一つの芳香環を含む基;少なくとも一つのケトン又はアミドを含む基とすることができる。(B)の炭素数は、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基の場合、例えば1-10個、2-8個、2-5個等とすることができる。少なくとも一つの芳香環を含む基、少なくとも一つのケトン又アミドを含む基の場合、主鎖の原子数を例えば1-10個、2-8個、2-5個等とすることができる。π結合の位置は、スルファニル基によるXの置換反応が好適に進む限り特に限定されないが、π結合を構成している原子の少なくとも1つがスルファニル基による置換反応が行われる炭素原子と結合していることが望ましく、XからCH2基を挟んで直接π結合が位置していることが最も好ましい。
 (B)の例としては、-C≡C-、-C=C-、-Ar-、-Ar-Ar-、-Ar-C≡C-、-Ar-C=C-、-NHC(O)-、-C(O)-、-Ar-NHC(O)-、-Ar-C(O)-が挙げられるがこれらに限定されない。
 スルファニル基と、式(I)で表される特殊アミノ酸の側鎖とのチオエーテル結合による架橋構造の例を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
 Xは、スルファニル基による置換反応により脱離されうる原子又は基であれば特に限定されないが、例えば、Cl、Br、I、-OSO2Me、-OSO2-Ar-R(式中、RはCH3、NO2、CF3及びHからなる群より選択される基を表す。)であり得る。
 (C)は、水素原子、又は置換基で置換されていてもよいアルキル基を示す。例えば、置換基で置換されていてもよいメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基であり、分岐していてもよい。
 本明細書において、アルケニレン基とは、主鎖中に1-3個の二重結合を有するアルキレン基をいい、アルキニレン基とは、主鎖中に1-3個の三重結合を有するアルキレン基をいう。二重結合又は三重結合の位置は、ペプチドが目的とする効果を奏する限り特に限定されない。
 本明細書において、置換基とは、特に限定されないが、ハロゲン原子、置換されていてもよい炭素数1-6のアルキル基、置換されていてもよい炭素数1-6のアルコキシ基、シアノ基、ニトロ基、ヒドロキシ基、カルボキシル基、アシル基、アミノ基、アリール基、ヘテロアリール基、フェノキシ基、非芳香族複素環基等が挙げられる。
 本発明のペプチドにおいては、式(I)の特殊アミノ酸の側鎖部分とスルファニル基との結合形成によって架橋構造が形成されるため、このペプチドを構成する要素であるアミノ酸一残基を一つの単位として、これらの一組の官能基は、異なった構成要素の単位上に存在し、架橋構造が形成された際に二次構造が安定化されるように配置されることが必要である。説明の便宜のため、そのような構成要素の単位をアミノ酸単位と称する。
 求電子剤となるアミノ酸単位(特殊アミノ酸に相当)とスルファニル基を有するアミノ酸単位は、(i, i+3)、(i, i+4)、(i, i+7)、又は(i, i+11)で示される位置に配置されることが好ましい。図2を参照されたい。ここで、iは0以上の任意の整数であり、架橋前駆体を含むペプチドのN末端の残基から数えたアミノ酸単位の位置を示す。たとえばi=3の場合、(i, i+4)はN末端(0番目)から数えて3アミノ酸単位の位置と7アミノ酸単位の位置に、求電子剤となるアミノ酸単位とスルファニル基を有するアミノ酸単位が配置され、架橋構造が形成されることを示す。
 i+3やi+4の場合、αヘリックスであれば1ターンで架橋させることになり、i+7やi+11になると、それぞれ2ターン、3ターンで架橋させることになる。言い換えると、例えば、2、3、6又は10アミノ酸単位が架橋構造を形成するアミノ酸単位の間に存在することが好ましい。
 架橋構造を形成するアミノ酸単位の間および前後に位置するアミノ酸単位は、N末端の開始アミノ酸を除き、分子内にアミノ基(-NR2)とカルボキシル基(-COOH)の二つの官能基を持つ化合物(アミノカルボン酸)である任意のアミノ酸であることが好ましく、典型的にはα-アミノカルボン酸であり、より好ましくはタンパク質性アミノ酸である。求電子剤となるアミノ酸単位とスルファニル基を有するアミノ酸単位の配置は、いずれがN末側でもC末側でも構わない。
 特殊アミノ酸とは、天然の翻訳で使用される20種類のタンパク質性アミノ酸とは構造の異なるアミノ酸全般を指し、人工的に合成したものであっても、自然界に存在するものであってもよい。つまり、タンパク質性アミノ酸の側鎖構造の一部が化学的に変更・修飾された非タンパク質性アミノ酸や人工アミノ酸、D体アミノ酸、N-メチルアミノ酸、N-アシルアミノ酸、β-アミノ酸、アミノ酸骨格上のアミノ基やカルボキシル基が置換された構造を有する誘導体等が全て含まれる。特殊ペプチドは、特殊アミノ酸を一つ以上含む、2個以上のアミノ酸が主にペプチド結合(環状構造やエステル結合が存在することもある)によって結合したものを指す。
 本発明において、スルファニル基を有するアミノ酸の代表例はシステインまたはその類縁体(システインアナログ)であり、これと反応しうる求電子剤となるアミノ酸の代表例は式(I)の特殊アミノ酸である。後述のとおり、スルファニル基を有するアミノ酸について、これがシステインである場合は普遍コドンを使用できるが、非タンパク質性アミノ酸である場合は改変コドンでコードされる。一方、式(I)の特殊アミノ酸は、常に改変コドンによりコードされる。
 また、本発明においては、ペプチド鎖N末端となる開始アミノ酸もメチオニンに限定されず、メチオニン以外の任意のタンパク質性アミノ酸あるいは任意の特殊アミノ酸であることができる。例えば、後述の実施例では、通常の20種類のアミノ酸からメチオニンが除去された翻訳系を構築し、代わりに、開始tRNAにNα-アセチル化アミノ酸を連結させたものを用いて翻訳を開始している。このようなN末端修飾はペプチドの安定性を保つために有効であり得る。あるいは、架橋前駆体を構成するアミノ酸の一方が開始アミノ酸であることも可能である(すなわち、iが0の場合)。
 架橋前駆体を構成するアミノ酸の配置に関してより典型的な態様は、これらのアミノ酸がいずれも伸長反応により導入され、ペプチド鎖内部に配置される態様であり、すなわちiが1以上の整数である場合である。また、本発明が適用されるペプチドの大きさには特に制限はないが、一般的に、ヘリックス構造を保ちにくい25アミノ酸残基以下のペプチドに対して、本発明は好適に使用される。
 式(I)の化合物の具体例としては、例えば、式(VII):
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
の化合物が挙げられる。式中、mは1乃至10の整数を表す。式(VII)の化合物の具体例としては、mが1の化合物を挙げることができ、この化合物は、例えば、Schollkopfの不斉補助基を利用して高い鏡像体過剰率で製造することができる。
 また、式(VIII):
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
の化合物も挙げられる。式中、mは前記と同義である。
 また、式(IX):
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
の化合物も挙げられる。式中、mは前記と同義である。式(IX)の化合物の具体例としては、mが1になる下記の式(X)の化合物が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
 さらに、式(I)において(C)がアルキル鎖である化合物の具体例としては、式(VII)に対応する式(XI)、式(X)に対応する式(XII):
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
の化合物が挙げられる。
 一方、システインアナログの具体例としては、例えば、式(V)または式(VI)の化合物を挙げることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
 式(V)、(VI)中、mは前記と同義である。
 また、ホモシステインやメルカプトノルバリン等のスルファニル基を有する特殊アミノ酸を挙げることもできる。
架橋構造が導入されたペプチドの製造方法
 次に、本発明のペプチドの製造方法を説明する。
 本発明のペプチドは、化学合成による方法や、翻訳合成系を用いる方法等、種々の公知の方法又はそれに準ずる方法を利用して製造することができる。例えば、化学合成の場合、液相合成、FmocやBoc等の保護基を用いた固相合成、液相合成と固相法を組み合わせたハイブリッド法等各種の方法で、式(I)の特殊アミノ酸と、スルファニル基を有するアミノ酸を含むペプチドを合成することができる。ペプチドを合成すると、後述のように、酵素等を用いることなく、式(I)の特殊アミノ酸の側鎖とスルファニル基との間にチオエーテル結合が自発的に形成され、架橋ペプチドを得ることができる。
 本発明のぺプチドの製造方法の一例として、無細胞翻訳合成系を用いて製造する方法を以下に説明する。当該方法は、翻訳合成されたペプチド内に含まれる特殊アミノ酸が関与する高選択的な分子内反応を利用して、ペプチド側鎖間に共有結合を形成させ、架橋構造を構築するものであって、以下の工程を含む。
(i)スルファニル基を側鎖に持つアミノ酸、および、式(I)で表される特殊アミノ酸の組が、少なくとも1つ分子内に配置された特殊ペプチドを翻訳によって合成する工程;及び
(ii)前記各組において前記スルファニル基と式(I)の特殊アミノ酸の側鎖をチオエーテル結合させて架橋構造を形成する工程、を含む。
 工程(i)を翻訳合成工程、工程(ii)を架橋構造形成工程と呼ぶ。
 工程(i)である翻訳合成工程においては、以下の二種類のアミノ酸
(ア)スルファニル基を側鎖に持つアミノ酸、及び
(イ)式(I)で表される特殊アミノ酸
が、適切なアミノ酸残基数だけ離れて配置されたペプチドを、翻訳合成によって得る。
 以降、工程(i)で合成される特殊ペプチドにおいて、スルファニル基及びこれと反応し得る特殊アミノ酸の官能基からなる一組の官能基を含む化学構造を架橋前駆体と呼ぶ。すなわち、適切なアミノ酸残基数だけ離れて配置された、これら(ア)及び(イ)のアミノ酸の組が架橋前駆体を構成する。
 例えば図2の模式図を参照されたい。図2においては、これらのアミノ酸の組が、ペプチド鎖内部に配置された一組の濃い黒丸で表されている。また、一個のペプチド鎖に含まれることができる架橋前駆体は一組だけではなく、複数個の架橋前駆体を配置することもできる。複数個の架橋前駆体を含むペプチド鎖が翻訳合成された場合は、工程(ii)の架橋構造形成工程において複数個の架橋構造を形成することが可能である。
 式(I)の特殊アミノ酸は、架橋のための共有結合の形成が可能な側鎖構造として、求核性官能基であるスルファニル基(-SH)と結合形成反応が可能な構造を有する。この反応の結果として、工程(ii)である架橋構造形成工程において、架橋前駆体を含むペプチドは架橋構造が形成されたペプチドへ変換される。本発明において、架橋前駆体からの架橋構造形成は、翻訳合成条件下で自発的に起きるため、化学触媒を必要としない。
 工程(i)を無細胞翻訳系で行う場合、遺伝暗号リプログラミング技術を利用して既存コドンに特殊アミノ酸を人為的に割り当てることによりペプチド鎖に導入する。具体的には、特殊アミノ酸をコードするコドンを有するmRNAを調製し、これを改変遺伝暗号表の下で翻訳することにより、改変されたコドン(改変コドン)で指定された位置に特殊アミノ酸が導入されたペプチドを得ることができる。
 本願において、コドンとは、改変コドンおよび天然の翻訳で使用される普遍コドンの両方を指す。改変コドンとは、遺伝暗号リプログラミングによってタンパク質性アミノ酸との対応付けが解消され、特殊アミノ酸と対応づけられたコドンを指す。特殊アミノ酸は、改変コドンでのみコードされ得る。
 上述のようにして合成されたペプチド化合物に架橋構造を導入することによってヘリックスペプチド化合物が合成される。架橋構造形成のための反応の条件は官能基の組の種類に応じて設定されるが、一般に、このペプチド化合物を合成するための無細胞翻訳系の条件下において高選択的に反応は進行する。したがって、特段の反応条件の調整を行うことなく、自発的に結合が形成され、架橋ペプチド化合物を得ることができる。
 例えば、図3を参照されたい。ホルミルメチオニンで翻訳を開始し、伸長コドンで導入された様々なアミノ酸の組合せが(i,i+4)の位置関係で配置されたペプチド鎖を合成したところ、式(I)の特殊アミノ酸XおよびシステインCの組のみがチオエーテル結合で架橋構造を形成している。
 同様に、後述の実施例においては、アミノ酸側鎖に配置されたプロパルギルクロリドを含む特殊アミノ酸とシステインを配置したペプチド配列を翻訳合成して得られる、架橋前駆体を含むペプチドが記載されている。例示された態様では、翻訳後にプロパルギル位へのスルファニル基による置換反応が自発的に進行し、チオエーテル結合が形成されることにより架橋構造が完成する。
無細胞(in vitro)翻訳系
 翻訳系とは、ペプチド翻訳合成のための場であり、一般的には方法及びキット(物)の両方を含む概念である。本発明において使用される無細胞翻訳系は、公知の再構成型の翻訳系をさらに細分化し、より不純物の少ない系を構築して利用することが好ましい。従来の系と対比させながら、本発明で利用可能なキット(物)としての翻訳系の具体的な構成成分について説明する。
 翻訳系の構成成分の具体例としては、リボソーム、IF群、EF群、RF群、RRF、目的のペプチド合成に最低限必要となる天然アミノ酸・tRNA・特異的なARSタンパク質酵素のセット、翻訳反応のためのエネルギーソース、などがある。
 リボソームとしては、大腸菌から単離され、精製されたリボソームが好適に利用される。
 タンパク質類では、翻訳開始因子(例えば、IF1、IF2、IF3)、翻訳伸長因子(例えばEF-Tu、EF-Ts、EF-G)、翻訳終結因子(例えば、RF1、RF2、RF3、RRF)、エネルギーソース再生のための酵素(例えばcreatine kinase, myokinase, pyrophosphatase, nucleotide-diphosphatase kinase)を使用する。この中で、翻訳終結因子・エネルギーソース再生のための酵素の添加は任意である。鋳型DNAからの転写を行うためにT7 RNA polymeraseを加えることもあるが、あらかじめ転写したmRNAを翻訳系に加える場合、RNA polymeraseの添加は不要である。
 その他、従来の系と同様、適当な緩衝溶液、翻訳反応のエネルギーソースとしてのNTP類、Creatine phosphate、リボソーム活性化、RNA安定化、タンパク質安定化のために必要な因子等を適宜使用することができる。また、通常の翻訳反応では、開始コドンAUGには、開始tRNAにより、N-ホルミルメチオニンが規定されるため、10-formyl-5,6,7,8-tetrahydroforlic acid(Baggott et al., 1995)のようなホルミルドナーが必須であるが、本発明において特殊アミノ酸で翻訳反応を開始する場合は、ホルミルドナーは任意である。同様の理由で、methionyl-tRNA formyltransferase(MTF)も必須でない。
 本発明で利用される翻訳系において、天然のタンパク質性アミノ酸に対しては、従来の系と同様に、対応する天然のtRNA及びARSを利用することができる。天然tRNAの例は、大腸菌を集め、破砕し、そこからtRNA画分を精製した混合物であり、市販品も入手可能である。天然tRNA中の特定のA、U、C、Gは、酵素によって化学修飾を受けている。あるいは、試験管内で転写した天然配列をもつtRNAの使用も可能である。
 一方、特殊アミノ酸に対しては、天然tRNAではなく、オルソゴナルtRNAとしてtRNA転写産物である人工tRNAを利用することが好ましい。人工tRNAは、DNAを鋳型として適当なRNAポリメラーゼを用いたin vitro転写反応で調製可能である。このような人工tRNAには、化学修飾は全く存在しない。
 翻訳産物であるペプチドに特殊アミノ酸を導入するためには、予め特殊アミノ酸でアシル化されたオルソゴナルtRNAを翻訳系に加える。好ましい態様において、特殊アミノ酸でアシル化されたtRNAは、他のtRNAやARSが存在しない条件で、フレキシザイムを用いて、単離されたオルソゴナルtRNAの3'末端に特殊アミノ酸を結合することにより調製される。あるいは、化学的あるいは酵素的に特殊アミノ酸をtRNAに結合したものも使用可能である。
ペプチドライブラリー
 本明細書において、ペプチドライブラリーとは、上述した架橋構造が導入されたペプチドを2種以上含む、すなわち配列が異なる2種以上のペプチドを含むライブラリーをいう。ペプチドライブラリーを構成する各ペプチドにおいては、側鎖にスルファニル基を有するアミノ酸と式(I)で表される特殊アミノ酸以外のアミノ酸を、任意のアミノ酸とすることができる。したがって、例えば25アミノ酸残基からなるペプチドは、スルファニル基を有するアミノ酸と式(I)で表される特殊アミノ酸を一組のみ含む場合、天然のアミノ酸20種のみ使用するとしても理論的に2023種あることになり、ライブラリーとしては十分なサイズとなる。
 本発明のペプチドライブラリーは架橋により二次構造が安定していることから、細胞膜透過性にも優れており、これを用いてスクリーニングを行うことによって、標的に対して高い親和性を用いるペプチドや、標的タンパク質の機能を阻害するペプチドなど生理活性を有するペプチド等、有用なペプチドを得ることが可能である。
 また、ペプチドライブラリーの一態様として、各ペプチドがそれをコードするmRNAと連結されていてもよい。これにより、表現型(ペプチドのアミノ酸配列)が遺伝型(核酸配列)にディスプレイされたライブラリーとなり、in vitroディスプレイに応用することができる。言い換えると、遺伝情報が、その翻訳産物であるペプチドとして提示(ディスプレイ)されているディスプレイライブラリーから、ペプチドの選択を行う。これにより、ライブラリー中のそれぞれのランダムペプチド分子に、分子生物学的手法により増幅及び読み取りが可能なタグが付加されている事になる。
 in vitro ディスプレイとは、無細胞翻訳系(in vitro翻訳系ともいう)を用いて合成されたペプチドが遺伝情報と対応付けて提示されたものであり、リボソームディスプレイ、mRNAディスプレイ、DNAディスプレイ等が公知である。また、RAPIDディスプレイ(未公開)も利用可能である。いずれのディスプレイも、mRNAもしくはDNAに記録された遺伝情報と、その遺伝情報によってコードされるペプチドを連結することにより、[遺伝情報]-[翻訳産物]の複合体として対応付けるメカニズムを有する。リボソームディスプレイにおいては、mRNA-リボソーム-ペプチドの3者が複合体を形成する。mRNAディスプレイ及びRAPIDディスプレイにおいては、mRNA-ペプチドの複合体が形成される。DNAディスプレイにおいては、DNA-ペプチドの複合体が形成される。本発明においては任意のin vitro ディスプレイライブラリーの利用が可能である。
ペプチドライブラリーの製造方法
 ランダム配列を持つペプチドのライブラリーの製造方法は特に限定されないが、例えば、無細胞翻訳系において、ペプチドをコードする領域にランダム配列を持つ鋳型核酸(mRNAもしくは対応するDNA)から翻訳合成を行うことにより得ることができる。
 したがって、ペプチドライブラリーの製造方法の一態様は、
(i)ランダムなアミノ酸配列をコードするRNA中に、スルファニル基を側鎖に持つアミノ酸を指定するコドン、および、式(I)で表される特殊アミノ酸を指定するコドンの組を有し、各組においてスルファニル基を側鎖に持つアミノ酸を指定するコドンと式(I)の特殊アミノ酸を指定するコドンの位置が、2、3、6、または10アミノ酸単位隔てて配置されている、mRNAのライブラリーを調製する工程;
(ii)前記特殊アミノ酸を連結したtRNAを含む無細胞翻訳系で前記mRNAを翻訳して、ランダム配列中に前記特殊アミノ酸が配置されたペプチドの集合体を得る工程;及び
(iii)各ペプチドにおいてスルファニル基と式(I)の特殊アミノ酸の側鎖を結合させて架橋構造を形成する工程、を含む。
 ランダム配列を持つ架橋ペプチドライブラリーを構築するためには、mRNA配列中のペプチドをコードする領域中に、複数のトリプレットの繰り返しからなるランダム配列および架橋前駆体となるアミノ酸を指定するコドンが配置される。例えば、図5に示すように、プロパルギルクロリド構造を側鎖に持つ特殊アミノ酸を伸長コドンのひとつに割り当て、そこから適切なアミノ酸単位(上述で説明したように、例えば2、3、6又は10アミノ酸単位)のランダム配列のコドン塩基だけ間を置いた位置へシステインを導入する。
 さらに、これら二つのアミノ酸が割り当てられた各コドンおよび開始コドン以外に、任意の長さのランダム配列のコドン塩基を配置した鋳型mRNAを構築する。このmRNAを翻訳することにより、システインの側鎖に位置するスルファニル基によるプロパルギルクロリドとの求核置換反応によってチオエーテル結合が構築され、ランダム配列を持った架橋ペプチドライブラリーの構築が可能となる。
 ランダム配列をもつライブラリーを構築するためには、20種類全てのタンパク質性アミノ酸が無作為に出現するように、その鋳型となるmRNAのコドン配列をNNK(NはG,A,CあるいはUから選択される任意の塩基、KはUあるいはGを示す)にするのが一般的である。しかし、架橋構造を形成させるための求電子剤となる式(I)の特殊アミノ酸を伸張コドンのひとつ、例えばAUG(AUGは開始コドンと伸張コドンの両方に使える)に当てはめた場合、NNKのライブラリーでペプチドライブラリーを構築すると、NNKが表すコドンの一つとしてAUGが無作為に出現するために、ペプチドライブラリーには複数の上記の特殊アミノ酸が組み込まれる。
 そこで、式(I)の特殊アミノ酸を指定するコドンをAUGとする場合、ランダム配列としてNNCもしくはNNU(NはA、U、G、Cのいずれか一つの塩基を表す)配列からなるトリプレットの繰り返しを用いる場合は、ランダム配列中にAUGが出現しないようにすることが可能となり、ランダム配列中の指定された位置にだけ式(I)の特殊アミノ酸を導入することができる。
 NNUあるいはNNCのランダム配列の塩基のライブラリーを用いた場合は、5つのアミノ酸(Met, Trp, Gln, Lys, Glu)は出現しなくなる。これらを出現させることによるメリットが、本特殊アミノ酸が所望の位置以外に配置されることによるデメリットを超える場合などは、NNU、NNCに加えて、NNKを用いてもよい。
 また、NNU又はNNCを用いた場合に出現しないアミノ酸に対応するコドンを、架橋構造を形成させるための別の特殊アミノ酸、あるいは別の付加的な機能を有する特殊アミノ酸を指定された位置に導入するために利用することも可能である。例えば、AUGに加えUGG, CAG, AAG, GAGの4つのコドンを利用して、かかる特殊アミノ酸を指定された位置に導入することも可能である。
 NNU、NNC、NNKを含むmRNAは、例えば各種のDNA合成装置によって、NNT、NNC、NNKを含むDNAを合成し、これを転写することによって得ることができる。
 上述の例示的な一態様において、式(I)の特殊アミノ酸は伸長用tRNAによりペプチド鎖伸長反応で導入される。ここで、開始tRNAは翻訳開始位置のAUGコドンに対合して連結されているアミノ酸をペプチドN-末端に導入するが、それ以外の位置のAUGコドンはCAUコドンを有する伸長用tRNAと対合する。このため、AUGコドンには2種類のtRNAによって2種類のアミノ酸が対応づけられる。本明細書では、開始tRNAと対合するAUGコドンを開始AUG、伸長用tRNAに対合するAUGコドンを単にAUGと呼ぶ。
 本発明では、目的に合わせて最適化された成分からなる無細胞翻訳系に、翻訳の鋳型となる塩基配列に対応するDNAまたはRNA分子を加えて利用する。核酸配列には、生細胞を利用したタンパク質発現系と同様に、目的のアミノ酸配列をコードする領域に加えて、使用する翻訳系に合わせて、翻訳に有利な塩基配列を付加的に含むことができる。例えば、大腸菌由来のリボソームを利用する系の場合は、開始コドンの上流にShine-Dalgarno(SD)配列やイプシロン配列などを含むことにより翻訳反応の効率が上昇する。
 ペプチドをコードする領域のN末端には、開始コドンが配置される。開始コドンは通常はトリプレット配列AUGである。しかしながら、in vitro転写反応により合成された開始tRNAにおいてアンチコドン配列を任意の配列とすることで、開始コドンのリプログラミングが可能であるので、AUGコドンに加えて、他の塩基配列も開始コドンとして利用できる。
 C末端側には、in vitroディスプレイ用に、核酸分子とその翻訳産物であるペプチドを連結するための配列が含まれる。例えば、ピューロマイシンリンカーを用いたmRNAディスプレイ法を利用する場合、mRNAライブラリーにピューロマイシンリンカーが予め連結されたものを翻訳系に加えることにより、mRNA-ペプチドの複合体ライブラリーが形成される。ピューロマイシンをリボソームのAサイトに効率良く取り込ませるために、通常、mRNAの3’末端側とピューロマイシンの間にリンカーが挿入される。
 ピューロマイシンはリボソーム上でペプチド転移反応の基質(アミノアシルtRNA類似体)として機能し、伸長ペプチドのC末端に結合することにより、mRNAとペプチドを連結する。mRNAディスプレイ法は、in vitro翻訳系でmRNAとペプチドを適当なリンカーを介して連結することにより遺伝子型と表現型を一体化させる技術であり、このような目的が達成される限り、ピューロマイシンに代えて他の同様の機能を有する物質を含むリンカーも利用可能であることは当業者の認識の範囲内である。
 また別の方法として、リンカーを予め連結したmRNAを用いるのではなく、in vitro翻訳系内でのリンカーとmRNAのハイブリダイゼーションにより、mRNA-ペプチドの複合体ライブラリーを形成する方法も利用可能である。例えば、フレキシザイムを利用して調製したフェニルアラニンリンカー(3'-フェニルアラニン-ACCA-PEG-[mRNAライブラリーの3'末端領域と相補的な塩基配列]-5')をmRNAライブラリーと相補鎖を組ませることで、mRNA-ペプチドの複合体ライブラリーが形成される(未公開出願であるPCT/JP2010/68549に記載される「RAPIDディスプレイ法」)。この場合、mRNAのペプチドをコードする領域の下流(3'末端領域)に、リンカーとハイブリダイゼーションするための塩基配列が含まれる。
 後述の具体的な実施例においては、ペプチドのN末端に開始AUGコドンが、途中のいくつかのアミノ酸残基に相当するランダム配列のあとに、式(I)の特殊アミノ酸をコードする伸長AUGコドン(もしくはCysをコードするコドンUGC)が、さらに適切なアミノ酸単位のランダム配列が続いた後、CysをコードするコドンUGC(もしくは式(I)の特殊アミノ酸をコードする前述のコドン)が配置され、さらにランダム配列がC末端まで続く。図2および図5を参照されたい。その直後、リンカーとなるGlySerGlySerGlySerをコードするコドンが続くように配置される。
フレキシザイムによるアミノアシル化反応
 フレキシザイムは、所望の構造を持つアミノ酸基質を任意のtRNAにアシル化する機能を有するRNA触媒(ARSリボザイム)である。フレキシザイムは、天然のARSタンパク質酵素とは異なり、各アミノ酸及び各tRNAに対して特異性を持たず、本来連結すべきアミノ酸以外の任意のアミノ酸を用いたアミノアシル化が可能である。具体的には、アミノ酸の認識部位にα位の置換基が含まれていないため、Lアミノ酸に限らず、ヒドロキシ酸(α位が水酸基)、α-N-メチルアミノ酸、α-N-アシルアミノ酸、D-アミノ酸なども基質とすることができる。また、ε-N-アセチルリシンやε-N-メチルリシンなどの翻訳後修飾を受けたようなアミノ酸も基質とすることが可能である。詳細については、前述のフレキシザイムに関する文献に加え、Y. Goto, H. Suga (2009) "Translation initiation with initiator tRNA charged with exotic peptides" Journal of the American Chemical Society, Vol. 131, No. 14, 5040-5041、WO2008/059823「N末端に非天然骨格をもつポリペプチドの翻訳合成とその応用」、Goto et al., ACS Chem. Biol., 2008, 3, 120-129、T. J. Kang, et al., Chem. Biol., 2008, 15, 1166-1174 "Expression of histone H3 tails with combinatorial lysine modifications under the reprogrammed genetic code for the investigation on epigenetic markers"、WO2008/117833「環状ペプチド化合物の合成方法」などにも記載されている。
 本発明では、フレキシザイムを用いて特殊アミノ酸でアシル化された直交性(オルソゴナル)tRNAを、無細胞翻訳系に添加することにより、ペプチド配列に特殊アミノ酸が導入される。
 オルソゴナルtRNAとは、翻訳系に内在する天然由来のARS(例えば大腸菌由来のARSタンパク質酵素)によって認識されないので、翻訳系内でアミノアシル化されることはないが、リボソーム上のペプチド合成反応では効率よくmRNAのコドンと対合して指定されたアミノ酸を発現させ得るtRNAである。オルソゴナルtRNAとして、例えば、異なる種に由来する天然のサプレッサーtRNA、あるいは、人工的に構築したtRNAが使用される。上述のように、本発明において特殊アミノ酸の導入のために好適に使用されるものは、人工的な転写産物であるオルソゴナルtRNAである。
 フレキシザイムは、活性化アミノ酸エステルを基質として、アミノ酸の反応点であるカルボニル基、及びアミノ酸側鎖あるいは脱離基である芳香環、並びにtRNAの3’末端に存在する5'-RCC-3'配列部分(R は A 又は G)を認識して、3’末端のアデノシンにアシル化する触媒能を有する。フレキシザイムは、tRNAのアンチコドン部分に対して特異性がない。つまり、tRNAのアンチコドン部分をどのような配列に変えても、アミノアシル化の効率には影響がない。フレキシザイムにより、任意の特殊アミノ酸を任意のアンチコドン配列を持つtRNAに連結することができるので、任意の特殊アミノ酸を任意のコドンに対応させることができる。従って、任意の特殊アミノ酸を導入したライブラリーの調製が可能である。
 公知のフレキシザイムの構造(RNA配列)を以下に示す。
原型のフレキシザイム Fx
[GGAUCGAAAGAUUUCCGCAGGCCCGAAAGGGUAUUGGCGUUAGGU-3', 45nt]
ジニトロベンジルフレキシザイム dFx
[5'-GGAUCGAAAGAUUUCCGCAUCCCCGAAAGGGUACAUGGCGUUAGGU-3',46nt]
エンハンスドフレキシザイム eFx
[5'-GGAUCGAAAGAUUUCCGCGGCCCCGAAAGGGGAUUAGCGUUAGGU-3',45nt]
アミノフレキシザイム aFx
[5'-GGAUCGAAAGAUUUCCGCACCCCCGAAAGGGGUAAGUGGCGUUAGGU-3',47nt]
 フレキシザイムは、天然のARSタンパク質酵素とは異なり、アミノアシル化反応の第1段階目である高エネルギー中間体(アミノアシルAMP)の生成の過程をスキップしてアミノ酸基質のtRNAへの結合の過程のみを触媒するため、アミノ酸基質としてはあらかじめ弱活性化されたアミノ酸を用いる必要がある。つまり、アミノ酸のアデニル化をスキップする代わりに、アシル化が進行するカルボニル基において弱活性化されたエステル結合を持つアミノ酸誘導体を使用する。一般にアシル基の活性化は電子求引性基を備えたエステル結合させることで達成できるが、あまり強力な電子求引性基を有するエステルでは水中で加水分解が起きるばかりか、ランダムなRNAへのアシル化が併発してしまう。したがって、アミノ酸基質としては無触媒状態でこのような副反応が起きにくいように弱活性化したものを用いる必要がある。このような弱活性化は、例えば、AMP、シアノメチルエステル、チオエステル、又はニトロ基やフッ素その他の電子求引性の官能基をもったベンジルエステル等を使用して行うことができる。
 また、アミノ酸基質は、フレキシザイムで認識されるように、アミノ酸側鎖または脱離基内に芳香環を有していなければならない。活性化アミノ酸エステルは、天然のアミノアシル化反応におけるアミノアシルAMPのような弱活性化されたエステル結合を持ち、且つアミノ酸側鎖または脱離基内に芳香環を有するアミノ酸基質のことである。好適な活性化アミノ酸エステルの例としては、アミノアシル-シアノメチルエステル(CME:cyanomethyl ester)、アミノアシル-ジニトロベンジルエステル(DNB:3,5-dinitrobenzyl ester)、又はアミノアシル-4-クロロベンジルチオエステル(CBT:p-chloro-benzyl thioester)等が挙げられるが、これらに限定されない。
 例えば、後述の実施例では、Nα-アセチル- L-フェニルアラニン(Ac-F)を人工的に構築された開始tRNAに連結させ、ペプチドN末端に導入を行うとともに、プロパルギルクロリドを側鎖に持つ (s)-2-アミノ-6-クロロヘキシ-4-イオニック酸、(s)-2-アミノ-7-クロロヘプト-5-イオニック酸、(s)-2-アミノ-8-クロロヘプト-6-イオニック酸の3つのアミノ酸(実施例中の表1下の構造式を参照されたい)をそれぞれ人工的に構築された伸長tRNAに連結させた。これら3つの化合物の場合、(s)-2-アミノ-6-クロロヘキシ-4-イオニック酸DNB、(s)-2-アミノ-7-クロロヘプト-5-イオニック酸DNB、(s)-2-アミノ-8-クロロヘプト-6-イオニック酸DNB、をそれぞれ基質として用いることで、dFx と tRNA を混合し、これらの結合されたtRNAを調製できる。一方、Nα-アセチル- L-フェニルアラニンの場合は、Nα-アセチル- L-フェニルアラニンCMEを基質として用いることで、eFxとtRNAを混合し、Nα-アセチル- L-フェニルアラニン結合 tRNA を調製することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
 フレキシザイムによるアシル化反応は、溶液中で行ってもよいし、担体に固定化したARSリボザイムを用いたカラムを用いて反応させてもよい。例えば、もし翻訳の反応スケールが100μl以下の少ない量であれば、溶液中でフレキシザイムによるtRNAのアシル化を行い、反応溶液をエタノール沈殿したペレットを適当な緩衝液(例えば1mMの酢酸カリウム、pH5等)に溶解し、翻訳系に添加すれば良い。反応の条件は適宜好適な条件を選べばよいが、少量スケールの反応条件の一例としては、最終濃度で0.5~20μMのtRNA、0.5~20μMのフレキシザイム、2~10mMのアミノ酸基質、0.6MのMgCl2を含むpH7.5、0.1Mの反応緩衝液を、0度(℃)で1時間~24時間、反応させるとよい。
 翻訳の反応スケールが100μlを超える場合は、フレキシザイムの再利用を考慮し、担体に固定化したフレキシザイムを用いたほうが好都合である。担体として、例えば、樹脂、アガロース、セファロース、磁気ビーズなどを用いることもできるが、特に限定されない。フレキシザイムを担体に固定化して反応を行わせる場合は、例えば、Murakami, H., Bonzagni, N. J. and Suga, H. (2002). "Aminoacyl-tRNA synthesis by a resin-immobilized ribozyme." J. Am. Chem. Soc. 124(24): 6834-6835に記載の方法に従って行うことができる。反応産物であるアミノアシル化tRNAの分離は、様々な方法で行える。一例としては、10mM程度のEDTAを含有する緩衝液でカラムから溶出する方法がある。ARSリボザイムを固定化した樹脂は、例えば反応バッファーで平衡化することにより、十数回リサイクルすることができる。
開始tRNAと伸長tRNA
 天然の翻訳反応において、開始tRNAは翻訳開始のみに用いられ、伸長反応では使用されず、反対に、伸長用tRNAは開始反応には使用されないことは重要である。このような開始tRNAと伸長用tRNAの区別は本願発明においても同様である。
 本願では、特殊アミノ酸をアシル化するために人工tRNAが好適に用いられる。伸長tRNAである人工tRNAの非限定的な一例がtRNAAsn-E2である。このtRNAの塩基配列は、大腸菌由来の伸長反応用tRNAである天然tRNAAsn(5'-UCCUCUGs4UAGUUCAGDCGGDAGAACGGCGGACUQUUt6AAYCCGUAUm7GUCACUGGTYCGAGUCCAGUCAGAGGAGCCA-3') がベースになっている(s4U:4-チオウリジン、D:ジヒドロウリジン、Q:キューオシン、t6A:6-スレオニルカルバモイルアデニン、Y:ワイブシン、m7G:7-メチルグアノシン、T:リボチミジン)。本発明者らは、この天然tRNAに対して、修飾塩基を無くし、かつ変異を導入することで、大腸菌の20種類のアミノアシル化酵素によってアミノアシル化を受けない伸長反応用のtRNAであるtRNAAsn-E2をin vitro転写によって作製した。NNNの箇所がアンチコドンに相当し、コドンに対応するように変化させる。
(tRNAAsn-E2: 5'-GGCUCUGUAGUUCAGUCGGUAGAACGGCGGACUNNNAAUCCGUAUGUCACUGGUUCGAGUCCAGUCAGAGCCGCCA-3'、[修飾を無くした箇所、合計8カ所。s4U8U、D16U、D20U、t6A37A、Y39U、m7G46G、T54U、Y55U。34番目のQに関しては、アンチコドンなので、コドンに対応して
変化させる。][変異の箇所 、合計4カ所。U1G、C2G、G71C、G72C])
 開始tRNAである人工tRNAの非限定的な一例がtRNAfMetである。このtRNAの塩基配列は、大腸菌の天然tRNAfMet
(5'-CGCGGGGs4UGGAGCAGCCUGGDAGCUCGUCGGGCmUCAUAACCCGAAGAUCGUCGGTYCAAAUCCGGCCCCCGCAACCA-3' )がベースになっている。(Cm:2'-O-メチルシチジン)。本発明者らは、この天然tRNAに対して、修飾塩基を無くし、5'末端最初のCをGに変化させた開始反応用のtRNAであるtRNAfMetをin vitro転写によって作製した。CAUの箇所がアンチコドンに相当し、開始AUGコドンに対応する。(本願で使用したtRNAfMet: 5'-GGCGGGGUGGAGCAGCCUGGUAGCUCGUCGGGCUCAUAACCCGAAGAUCGUCGGUUCAAAUCCGGCCCCCGCAACCA-3'、[修飾を無くした箇所、合計6カ所。s4U8U、D20U、Cm32C、T54U、Y55U。][変異の箇所 、合計1カ所。C1G])開始tRNAにおいて重要な箇所は5'末端の最初の塩基(天然tRNAfMetではC、本願のtRNAfMetではG)が、72番目の塩基(天然tRNAfMet及び本願のtRNAfMetではA)と相補鎖を組まないことである。この非相補鎖によって、メチオニルホルミルトランスフェラーゼ(MTF)によりMet-tRNAfMetにホルミル基が転移されたり(但し、この部分に開始用特殊アミノ酸を利用する場合は、意味は無い)、またEF-Tuとの結合が抑制されたりする。
 後述の実施例では、Nα-アセチル- L-フェニルアラニンをtRNAfMet CAUに連結させ、ペプチドN末端に導入を行うとともに、プロパルギルクロリドを側鎖に持つ3つの特殊アミノ酸をそれぞれtRNAAsnE2 CAUに連結させた。tRNAAsn-E2 NNNは、アンチコドン配列(NNN、Nは任意の塩基を表す)を様々に変化させて用いることができるが、プロパルギルクロリド構造を側鎖に備えた特殊アミノ酸を指定する改変コドンがAUGである場合、アンチコドン配列はCAUとなる。
 これらの開始用及び伸長用の人工tRNAは天然のARSに対して直交性を持つため、翻訳系中で天然のアミノ酸が連結されることがないが、翻訳開始反応、リボソーム上のペプチド鎖伸長反応に際しては問題なく受け入れられる。これらの人工tRNAは実施例で使用された具体的な無細胞翻訳系において実際に使用可能であることが確認されている。しかしながら、本発明で使用可能な人工tRNAはこれに限定されない。当業者であれば、本発明において特殊アミノ酸を導入するために利用可能なtRNAは、使用する無細胞翻訳系の成分に合わせて適宜に選択可能であることが理解できるであろう。
in vitroセレクション
 本発明において、無細胞翻訳系で構築される特殊ペプチドライブラリーは、mRNAディスプレイを始めとするin vitroディスプレイ技術と完全に適合可能であるため、1013種類以上の高い多様性からなる特殊ペプチドライブラリーから、標的に結合するペプチド分子の創出が可能である。
 in vitroディスプレイ技術は、進化分子工学のツールとして利用される。進化分子工学では、所望の機能や性質を持つタンパク質やペプチドを創製することを目的として、可能性のある遺伝子を大規模に準備し、その中から所望の表現型を有するクローンを選択する。基本的には、最初にDNA集団(DNAライブラリー)を調製し、in vitro転写産物としてRNA集団(RNAライブラリー)を得て、in vitro翻訳産物としてペプチド集団(ペプチドライブラリー)を得る。このペプチドライブラリーから、所望の機能や性質を持つものを何らかのスクリーニング系で選択することになる。
 例えば、特定のタンパク質に結合するペプチド分子を得たい場合は、標的タンパク質を固相化したカラムにペプチド集団を流し込み、カラムに結合したペプチド分子の混合物を回収することができる。このとき、in vitroディスプレイ技術により、各ペプチド分子には、その鋳型である核酸分子がタグのように付加されている。mRNAディスプレイライブラリーであれば、各ペプチド分子にはmRNAが付加されている。そこで、回収したペプチド-mRNA複合体の集団から逆転写酵素でDNAに戻し、PCRで増幅して所望の表現型を有するクローンが多く含まれるバイアスのかかったライブラリーを得た後に、再度同じような選択実験を行う。
 あるいは、RNAアプタマーを回収してしまう可能性を回避するため、核酸部分を2本鎖(DNA/RNAハイブリッド)にする目的で、選択前に逆転写反応を行うことも可能である。この操作を繰り返すことで、世代の経過とともに所望の表現型を有するクローンが集団中で濃縮されていく。
 ペプチドアプタマーを同定する場合、in vitro ディスプレイライブラリーと標的物質を混合し、標的物質に結合したペプチドを提示する対応付け分子(活性種)を選択し、選択された対応付け分子の核酸部分からPCRにより核酸ライブラリーを調製する工程を繰り返すことで、標的物質に結合するペプチドアプタマーの遺伝子をクローニングできる。
 標的物質としては、一般的には、タンパク質、ペプチド、核酸、糖質、脂質、これらのいずれかの複合体、その他どのような化合物でもよい。
 活性種を選択するためには、[遺伝情報]-[ペプチド]複合体を標的物質と接触させ、標的物質に結合したペプチドを提示する複合体を、標的物質に結合していない他の多数の複合体から適当な方法で分離して回収する必要がある。このような回収の方法としては多くの技術が公知である。
 例えば、標的物質に、固相への結合により回収可能な修飾を施しておくと便利である。例えば、標的物質にポリヒスチジンタグを連結しておき、Ni-NTA が担持された担体へのポリヒスチジンタグの特異的な結合を利用して回収することができる。このような特異的な結合としてはポリヒスチジンペプチド/金属イオン(ニッケル、コバルトなど)の組合せの他にも、ビオチン結合タンパク質(アビジン、ストレプトアビジンなど)/ビオチン、マルトース結合タンパク質/マルトース、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ/グルタチオン、抗体/抗原(エピトープ)などの組み合わせが、利用可能であるが、これらに限定されるものではない。
 本発明は、ペプチドライブラリーを標的物質と接触させ、標的物質に結合したぺプチドを提示する活性種を選択し、選択された活性種の核酸配列を増幅し、増幅された核酸配列を鋳型として無細胞翻訳系で再び合成されたペプチドのライブラリーから活性種を選択するというin vitroセレクションを繰り返すことにより、標的物質に結合する特殊ペプチドを創製することを含む。特に、直鎖状ペプチドへ架橋構造を組み込むことにより、ヘリックス構造という特定の二次構造を多く存在させることを目指したライブラリーである、二次構造指向性のペプチドを含むライブラリーを用いることで、分子間相互作用に適切と考えられる3次元構造が備わることから、単に標的タンパク質に結合しやすい分子が得られるのではなく、その分子間相互作用に関与する部位に結合して阻害活性を示すペプチドの獲得が可能である。
 標的物質に結合する特殊ペプチド化合物の創製は、標的物質に結合したぺプチドを提示する活性種を回収して核酸配列を解析し、核酸配列からペプチド配列を決定し、得られたペプチド配列に基づき適当な特殊ペプチドを選択することにより、標的物質に結合する特殊ペプチドのアミノ酸配列及び核酸配列を得ることを含む。さらに、得られた配列情報に基づき、任意の方法を用いて、特殊ペプチドを合成、精製及び単離することが可能である。得られたペプチドを用いて、標的タンパク質の結合評価や阻害活性の確認を行い、活性の高い特殊ペプチドを得ることができる。
 したがって、本発明は、
(ア)標的タンパク質に結合するペプチドを選択する一次スクリーニング段階と、
(イ)一次スクリーニングで選択されたペプチドの結合能力を評価し、前記ペプチドが確かな結合力を示すペプチドであることを決定する二次スクリーニング段階を含み、
前記一次スクリーニング段階が
(i)二次構造指向性を有するペプチドを含むライブラリーを用意し、
(ii)ペプチドライブラリーを標的タンパク質に接触させ;そして
(iii)標的タンパク質に結合するペプチド分子を選択する工程
を含む、ペプチドライブラリーから標的タンパク質の分子間相互作用に対する阻害活性を有するペプチドを得る方法を含む。
Bcl-2を標的とした場合のヘリックス含有ライブラリーの構築法とそこからの分子間相互作用を阻害するペプチドの取得法
 以下では、後述の実施例の項で取り上げるBcl-2を標的タンパク質とした場合のペプチドライブラリーの構築法とそこからの阻害ペプチド取得法について述べる(図4)。ここで説明される態様はあくまで例示であり、本発明はこの態様に限定されない。
標的タンパク質Bcl-2
 細胞のプログラムされた死であるアポトーシスにはさまざまな経路があるが、その1つとしてBcl-2タンパク質が寄与している制御機構が存在する。Bcl-2タンパク質はアポトーシスを誘導するタンパク質と結合することでその活性を抑制する。Bcl-2タンパク質は、癌化した細胞中では多く発現しているために、アポトーシスが誘導されにくくなっていることが知られている。
 そこで、Bcl-2に高選択的かつ強力に結合する分子が獲得できれば、それがBcl-2とアポトーシス誘導タンパク質との結合を阻害し、癌化した細胞にアポトーシスを導くことが可能となる。したがって、近年この阻害分子が精力的に研究されてきたが、このようなタンパク質同士の相互作用を阻害する分子の開発は難しかった。この分子間相互作用にはBcl-2タンパク質に含まれるBH3ドメインと呼ばれるヘリックス構造が利用されていることから、ヘリックス構造を持つ分子のライブラリーを形成させることが出来れば、そこから高選択的、かつ強力な阻害剤を得ることが可能であると考えられ、前述のアルケン形成による架橋ペプチドによる化学ライブラリーからの探索もおこなわれた。しかし、強力な阻害活性を有する分子は得られていない。
mRNA ライブラリーの構築
 まず、ペプチドライブラリーを翻訳で構築するために、鋳型となるmRNA ライブラリーを調製する。mRNA の翻訳される部分の配列の長さは、任意である。例えば、16~24コドンを含む長さのものとすることができる(例えば、図5のpool 16-1から24-4)。このうち、N末端は開始AUGコドンである。また、C末端側にはリンカーとなるGlySerGlySerGlySerをコードするコドンが付加してもよい。開始AUGコドンの下流は、NNUもしくはNNCのランダムなコドン配列とすることができる(Nは A, U, G, C のいずれか一つの塩基をそれぞれ表す。)。このランダム配列中の特定の1コドンを、式(I)の特殊アミノ酸導入用にAUGコドンとし、そこから2、3、6、又は10アミノ酸単位離れた位置にCysをコードするコドンUGCを配置する(例えば、図2及び図5)。
ペプチドライブラリーの構築
 得られたmRNAライブラリーを改変された遺伝暗号表の下で翻訳する。例えば、通常の20種類のアミノ酸からメチオニンが除去された翻訳系を構築し、代わりに、(i)tRNAfMet CAUにNα-アセチル化アミノ酸を連結させたもの、(ii)tRNAAsnE2 CAUにプロパルギルクロリド構造を側鎖に持つ特殊アミノ酸を連結させたものを利用して鋳型mRNAを翻訳する。これら2つのアミノアシルtRNAは、フレキシザイムを用いて調製することができる。
 ここで、(i)のアミノアシルtRNAは開始因子に認識されて開始AUGコドンに対合するのに対し、(ii)のアミノアシルtRNAは伸長因子に認識されてAUGコドンと対合する。このために、メチオニンを除去するだけで、AUGコドンに2種類のアミノ酸を導入することが可能である。翻訳されたペプチドにおいては、プロパルギルクロリド構造にシステインのスルファニル基が作用して得られるチオエーテル結合により、架橋構造が形成される。
 さらに、mRNAライブラリーの各mRNAの3'末端にピューロマイシンを結合させておくことにより、翻訳後、ペプチドのC末端がPu(ピューロマイシン)を介してmRNAと連結される。開始には、Nα-アセチル- L-フェニルアラニン以外の任意の特殊アミノ酸、又はメチオニン若しくは他の19種類のタンパク質性アミノ酸を利用してもよい。
阻害ペプチドの獲得
 得られたペプチドライブラリーをmRNA ディスプレイ法やリボソームディスプレイ法などの各種in vitro ディスプレイ法によりスクリーニングし、Bcl-2に結合するペプチドを選択する。
 標的タンパク質と相互作用するBH3ドメインのようなヘリックス構造が翻訳ペプチド中で安定に形成されるように設計された、二次構造指向性のペプチドライブラリーを用いているので、結合だけを指標にスクリーニングを行っても、得られたペプチドは標的タンパク質の分子認識部位に結合し、その分子間相互作用を阻害する可能性が高い。
異なる標的に対するペプチドライブラリーの構築
 本発明は、BCl-2に限らず、種々の分子を標的とするスクリーニングに応用される。標的分子としては、分子間相互作用がヘリックス構造を認識して行われるものが好ましく選択される。ヘリックス構造を認識して分子間相互作用をする分子としては、例えば、p53やhDM2が挙げられるが(F. Bernal, A. F. Tyler, S. J. Korsmeyer, L. D. Walensky, G. L. Verdine J. Am. Chem. Soc. 129 2456-2457 (2007).)、これらに限定されない。
 以下、本発明を実施例によって具体的に説明する。なお、これらの実施例は、本発明を説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
 Bcl-2のBH3ドメインによる分子間相互作用部位に結合しその分子間相互作用を阻害するペプチドを獲得するために、配列中に特殊アミノ酸とシステインから形成される架橋構造を備えたペプチドライブラリー(NNU mRNAライブラリー)を構築し、mRNA ディスプレイ法によって選択を行った。
NNU mRNAライブラリー
 まず、下記の配列を有する二本鎖DNAを調製した。(以下では、Forward 鎖のみを 5'→ 3'の順で記載する。)
TAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACAT(ATG)(NNT)s(ATG)(NNT)3(TGC)(NNT)t(GGT)(AGC)(GGC)(AGC)(GGC)(AGC)(TAG)GACGGGGGGCGGAAA 
 翻訳領域は一つのコドンを一つの( )で括った。Nは A, T, G, C のいずれか一つを表す。sとtはトリプレットの繰り返しの数を表し、それぞれ、2と8、あるいは6と4、あるいは2と12、あるいは6と8、あるいは10と4、あるいは2と16、あるいは6と12、あるいは10と8、あるいは14と4、に相当する。
 続いてこれをT7 RNA ポリメラーゼを用いて転写し、下記の配列で表される mRNA プールからなるライブラリーを得た(図5の下の表を参照されたい。)。
GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAU(AUG)(NNU)s(AUG)(NNU)3(UGC)(NNU)t(GGU)(AGC)(GGC)(AGC)(GGC)(AGC)(UAG)GACGGGGGGCGGAAA 
 上記の転写産物を等量ずつ混合し、下記の実験に使用した。
mRNA display
 以下の「ピューロマイシンリンカーとの連結」から「回収したペプチドの配列情報の増幅」までのサイクルを繰り返すことで、ランダムなペプチドライブラリーからBcl-2に結合するペプチドを選択した(図4)。
ピューロマイシンリンカーとの連結
 下記の配列で表されるピューロマイシンリンカーを上記の mRNA ライブラリーとアニールさせ、T4 RNA ligase で連結した。SPC18 はCとOの総数が18であるPEGを表す。
pdCTCCCGCCCCCCGTCC(SPC18)5CC(Pu)
翻訳
 リンカーと連結された mRNA を改変された遺伝暗号表の下で翻訳した(図6)。本実施例では、通常の20種類のアミノ酸からメチオニンを除去した翻訳系を構築し、代わりに、フレキシザイムを用いて調製された、以下の(i)及び(ii)の2種類のアミノアシルtRNA:
(i)tRNAfMet CAUにNα-アセチル- L-フェニルアラニンを連結させたもの、
(ii)tRNAAsnE2 CAU
 (s)-2-アミノ-6-クロロヘキシ-4-イオニック酸(X0)、
 (s)-2-アミノ-7-クロロヘプト-5-イオニック酸(X1)、
 (s)-2-アミノ-8-クロロヘプト-6-イオニック酸(X2)
をそれぞれ連結させたものを添加して翻訳を行った。
 翻訳に続き、これらの特殊アミノ酸に含まれるプロパルギルクロリド構造とシステインのスルファニル基との間でチオエーテル結合が形成され、架橋ペプチドライブラリーが合成され、ペプチドのC末端にPuを介してmRNAが結合した複合体が構築された。
Bcl-2に結合するペプチドの取得
 TALONビーズに固定化したBcl-2に、調製した架橋ペプチドライブラリーを混合し、4°Cで30分間撹拌した。磁石を利用して上澄みを除去し、残った磁性粒子をバッファーで洗浄した。ビーズにPCR用の溶液を加えて95°Cで5分間加熱し、ペプチドをビーズからはずし、上澄みを回収した。
回収したペプチドの配列情報の増幅
 Bcl-2に結合して回収されてきたペプチド-mRNAを、逆転写・PCRによってDNAとして増幅した。得られたDNAを転写してmRNAとした。
選択されたペプチド配列の同定
 上記の一連の操作を繰り返し、ペプチド-mRNAの回収率が飽和したところで、増幅されたDNAを用いてTAクローニングを行い、得られたペプチドの配列を同定した。
結果
 NNU mRNAライブラリーを翻訳すると、ランダム配列中のAUGコドンが側鎖にプロパルギルクロリドを備えた特殊アミノ酸分子に翻訳され、そこから4アミノ酸単位はなれた位置にコードされたシステインのスルファニル基との間に共有結合が形成され、架橋ペプチドライブラリーが生成する。このペプチドライブラリーを用いてmRNA ディスプレイを行ったところ、プロパルギルクロリドとアミノ酸主鎖構造の間のリンカー長の異なる3種類、すなわち、(s)-2-アミノ-6-クロロヘキシ-4-イオニック酸(X0)、(s)-2-アミノ-7-クロロヘプト-5-イオニック酸(X1)、(s)-2-アミノ-8-クロロヘプト-6-イオニック酸(X2)の3つの特殊アミノ酸のうち、いずれを用いたペプチドライブラリーにおいても、7ラウンド目でmRNAの回収率が飽和した。
 そこで、6ラウンド後のペプチド配列を同定したところ、大部分の配列が架橋構造をもち、その配列の中央付近に2つのアスパラギン酸を有するペプチドが得られていることが分った(表1)。濃縮されたペプチド配列において、2つのアスパラギン酸を有する共通の構造が見られたことは、mRNAディスプレイ法により、Bcl-2との相互作用を阻害する分子が期待通り得られたことを示唆する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
 以上の結果から、ペプチドの架橋構造を含むペプチドを用いて、in vitro ディスプレイが有効に機能することが確認できた。
選択されたペプチドのBcl-2結合能力評価
 次に、上表に示されたアミノ酸配列を有する架橋ペプチドをFmoc固相法により合成し、SPR(Surface Plasmon Resonance)を利用した評価法によって解離定数(KD)を算出することにより、結合能力を評価した。
 具体的にはまず、Niを結合できる基板にNiCl2を含む溶液を流してから、His tagをC末端側に備えたBcl-2タンパク質を流すことによって基板上にタンパク質を固定化させた。その後、固相合成したペプチドを含む溶液を適切な濃度で順次加えていき、そのときに基板上の重さに依存した屈折率の変化を読み取ることによってそのペプチドの結合速度と解離速度を算出することによって結合力を評価した。結果を下表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000026
 合成したペプチド全てがKD=1 nMより小さな値を示す強力な結合能を示すことが分った。
配列番号1 フレキシザイム Fx
配列番号2 ジニトロベンジルフレキシザイムdFx
配列番号3 エンハンスドフレキシザイムeFx
配列番号4 アミノフレキシザイム aFx
配列番号5 tRNAAsn-E2
配列番号6 tRNAfMet
配列番号7 大腸菌のtRNAAsn
配列番号8 大腸菌のtRNAfMet

Claims (22)

  1.  架橋構造により安定化された二次構造を有するペプチドであって、
     以下の式(I)で表される特殊アミノ酸と、側鎖にスルファニル基を有するアミノ酸との組を少なくとも1つを含み、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
    〔式中、(A)は、単結合、又は主鎖の原子数が1-10である連結基を示し;(B)は、少なくとも一つのπ結合を含む基を示し;(C)は、水素原子、又は置換基で置換されていてもよいアルキル基を示し;Xは、スルファニル基による置換反応で置換されうる基を示す。〕
     前記特殊アミノ酸残基の側鎖と、前記スルファニル基とのチオエーテル結合による架橋構造が形成されている、ペプチド。
  2.  前記式(I)において、
     (A)は、単結合;置換基で置換されていてもよい、炭素数1-10のアルキレン基、炭素数2-10のアルケニレン基、又は炭素数2-10のアルキニレン基;主鎖の1-2個の炭素原子が、酸素原子、窒素原子、若しくは硫黄原子に置換された、置換基で置換されていてもよい、主鎖の原子数が10以下のアルキレン基、アルケニレン基、及びアルキニレン基からなる群より選択され、
     (B)は、-C≡C-、-C=C-、-Ar-、-Ar-Ar-、-Ar-C≡C-、-Ar-C=C-、-NHC(O)-、-C(O)-、-Ar-NHC(O)-、-Ar-C(O)-からなる群より選択され、
     (C)は、水素、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、及びペンチル基からなる群より選択され、
     Xは、Cl、Br、I、-OSO2Me、トシル基、ノシル基、-OSO2-Ar-R(式中、RはCH3、NO2、CF3及びHからなる群より選択される基を表す。)からなる群より選択される、請求項1に記載のペプチド。
  3.  前記式(I)の特殊アミノ酸が、以下の式(II)~(IV)のいずれかで示される、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
    〔式中、mは1~10から選択される整数を示し、Cl、Br、I、-OSO2Me、トシル基、ノシル基、-OSO2-Ar-R(式中、RはCH3、NO2、CF3及びHからなる群より選択される基を表す。)からなる群より選択される。〕
     請求項1又は2に記載のペプチド。
  4.  前記スルファニル基を有するアミノ酸が、システイン、並びに以下の式(V)及び(VI)で表されるシステインアナログからなる群より選択される、請求項1から3のいずれか1項に記載のペプチド。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
  5.  前記特殊アミノ酸残基と、前記側鎖にスルファニル基を有するアミノ酸残基とが、各組において、2、3、6又は10アミノ酸残基隔てて配置されている、請求項1から4のいずれか1項に記載のペプチド。
  6.  架橋構造により安定化された二次構造を有するペプチドの製造方法であって、
    (i)スルファニル基を側鎖に持つアミノ酸、および、以下の式(I)
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
    〔式中、(A)は、単結合、又は主鎖の原子数が1-10である連結基を示し;(B)は、少なくとも一つのπ結合を含む基を示し;(C)は、水素原子、又は置換基で置換されていてもよいアルキル基を示し;Xは、スルファニル基による置換反応で置換されうる基を示す。〕
    で表される特殊アミノ酸の組が、少なくとも1つ分子内に配置された特殊ペプチドを翻訳によって合成する工程;及び
    (ii)前記各組において前記スルファニル基と式(I)の特殊アミノ酸の側鎖をチオエーテル結合させて架橋構造を形成する工程、
    を含む前記方法。
  7.  前記スルファニル基を側鎖に持つアミノ酸と式(I)の特殊アミノ酸が、各組において、2、3、6、または10アミノ酸残基隔てて配置される、請求項6に記載の方法。
  8.  前記(i)の翻訳合成工程が、式(I)の特殊アミノ酸をtRNAに連結して得られるアミノアシルtRNAを利用して、該特殊アミノ酸をコードする改変コドンを有する鋳型mRNAを翻訳することを含む、請求項6又は7に記載の方法。
  9.  前記スルファニル基を側鎖に持つアミノ酸が改変コドンでコードされる特殊アミノ酸であり、前記(i)の翻訳合成工程が、式(I)の特殊アミノ酸及び該スルファニル基を側鎖に持つ特殊アミノ酸をそれぞれtRNAに連結して得られるアミノアシルtRNAを利用して、それぞれの特殊アミノ酸をコードする改変コドンを有する鋳型mRNAを翻訳することを含む、請求項8に記載の方法。
  10.  前記アミノアシルtRNAは、アシルtRNA合成酵素様活性を持つRNA触媒を用いて特殊アミノ酸をtRNAに連結して得られたものである、請求項8または9に記載の方法。
  11.  前記式(I)で示される特殊アミノ酸が、以下の式(II)~(IV)のいずれかで示される、請求項6~10のいずれか1項に記載の方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
  12.  前記スルファニル基を有するアミノ酸が、システイン、並びに以下の式(V)及び(VI)で示されるシステインアナログからなる群より選択される、請求項6~11のいずれか1項に記載の方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
  13.  請求項1から5のいずれか1項に記載のペプチドを2種以上含む、ペプチドライブラリー。
  14.  前記各ペプチドが、それをコードするmRNAと連結されている、請求項13に記載のペプチドライブラリー。
  15.  請求項13に記載のペプチドライブラリーを構築する方法であって:
    (i)ランダムなアミノ酸配列をコードするRNA中に、スルファニル基を側鎖に持つアミノ酸を指定するコドン、および、請求項1に記載の式(I)で表される特殊アミノ酸を指定するコドンの組を少なくとも一つ含み、各組においてスルファニル基を側鎖に持つアミノ酸を指定するコドンと式(I)の特殊アミノ酸を指定するコドンが、2、3、6、または10アミノ酸単位隔てて配置されているmRNAのライブラリーを調製する工程;
    (ii)前記特殊アミノ酸を連結したtRNAを含む無細胞翻訳系で前記mRNAを翻訳して、ランダム配列中に前記特殊アミノ酸が配置されたペプチドの集合体を得る工程;及び
    (iii)各ペプチドにおいてスルファニル基と式(I)の特殊アミノ酸の側鎖を結合させて架橋構造を形成する工程、
    を含む方法。
  16.  請求項14に記載のペプチドライブラリーを構築する方法であって:
     請求項15に記載の工程(i)において、さらに、mRNAの3’末端にピューロマイシンを結合させ、ピューロマイシン結合mRNAライブラリーを得る工程;、
     工程(ii)において、前記ピューロマイシン結合mRNAライブラリーを無細胞翻訳系で発現させ、ランダム配列中に前記特殊アミノ酸が配置されたペプチド-mRNA複合体を得る工程;及び
     工程(iii)を行う工程、
    を含む方法。
  17.  式(I)の特殊アミノ酸を指定する改変コドンがAUGコドンであり、mRNAランダム配列が、NNCまたはNNU配列(NはA,U,G,Cのいずれか一つの塩基を表す。)のいずれかのトリプレットの繰り返しからなる、請求項15又は16に記載の方法。
  18.  以下の式(I)で表される特殊アミノ酸。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
    〔式中、(A)は、単結合、又は主鎖の原子数が1-10である連結基を示し;(B)は、少なくとも1つの炭素原子間の二重結合を含む基、少なくとも1つの炭素原子間の三重結合を含む基、又は少なくとも1つの芳香環を含む基を示し;(C)は、水素原子又は炭素数が1-3である置換基を有していてもよいアルキル基を示し;Xは、スルファニル基による置換反応で置換されうる基を示す。〕
  19.  請求項13又は14に記載のペプチドライブラリーから標的タンパク質に結合するペプチドを選択する方法であって、
     (i)ペプチドライブラリーを標的タンパク質に接触させ、インキュベートする工程;及び
     (ii)標的タンパク質に結合するペプチド分子を選択する工程、
    を含む方法。
  20.  請求項13又は14に記載のペプチドライブラリーから標的タンパク質の分子間相互作用に対する阻害活性を有するペプチドを選択する方法であって、
     (ア)請求項19に記載の工程(i)及び(ii)を含む、標的タンパク質に結合するペプチドを選択する一次スクリーニング、および
     (イ)一次スクリーニングで選択されたペプチドの標的タンパク質の分子間相互作用に対する阻害活性を評価し、前記ペプチドが標的タンパク質の分子間相互作用に対する阻害活性を有するペプチドであることを決定する二次スクリーニング、
    を含む方法。
  21.  標的タンパク質に結合するペプチドの製造方法であって:
     (i)請求項14に記載のペプチドライブラリーを標的タンパク質に接触させ、インキュベートする工程;
     (ii)標的タンパク質に結合するペプチド-mRNA複合体を選択する工程;
     (iii)選択されたペプチド-mRNA複合体のmRNAを増幅し、ペプチド-mRNA複合体を得る工程;
     (iv)(i)~(iii)を1回以上繰り返して、親和性の高いペプチド-mRNA複合体を濃縮する工程;及び
     (v)(iv)で濃縮されたペプチド-mRNA複合体のmRNAからペプチドを発現させる工程、
    を含む方法。
  22.  標的タンパク質がアポトーシスを抑制する分子である、請求項19~20のいずれか1項記載の方法。
PCT/JP2011/078028 2010-12-03 2011-12-05 安定化された二次構造を有するペプチド、及びペプチドライブラリー、それらの製造方法 WO2012074129A1 (ja)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US13/990,123 US9657289B2 (en) 2010-12-03 2011-12-05 Peptide with safer secondary structure, peptide library, and production methods for same
JP2012546968A JP6004399B2 (ja) 2010-12-03 2011-12-05 安定化された二次構造を有するペプチド、及びペプチドライブラリー、それらの製造方法
EP11845198.8A EP2647721B1 (en) 2010-12-03 2011-12-05 Peptide with safer secondary structure, peptide library, and production methods for same
CN201180058284.4A CN103328648B (zh) 2010-12-03 2011-12-05 具有稳定的二级结构的肽和肽库以及它们的制造方法
US15/489,618 US10435439B2 (en) 2010-12-03 2017-04-17 Peptide with safer secondary structure, peptide library, and production methods for same

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2010-270958 2010-12-03
JP2010270958 2010-12-03
JP2011-113527 2011-05-20
JP2011113527 2011-05-20

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US13/990,123 A-371-Of-International US9657289B2 (en) 2010-12-03 2011-12-05 Peptide with safer secondary structure, peptide library, and production methods for same
US15/489,618 Division US10435439B2 (en) 2010-12-03 2017-04-17 Peptide with safer secondary structure, peptide library, and production methods for same

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2012074129A1 true WO2012074129A1 (ja) 2012-06-07

Family

ID=46172045

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2011/078028 WO2012074129A1 (ja) 2010-12-03 2011-12-05 安定化された二次構造を有するペプチド、及びペプチドライブラリー、それらの製造方法

Country Status (5)

Country Link
US (2) US9657289B2 (ja)
EP (1) EP2647721B1 (ja)
JP (1) JP6004399B2 (ja)
CN (1) CN103328648B (ja)
WO (1) WO2012074129A1 (ja)

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014034922A1 (ja) 2012-09-03 2014-03-06 国立大学法人東京大学 血管内皮細胞増殖因子受容体阻害ペプチド
WO2014136971A1 (ja) 2013-03-07 2014-09-12 国立大学法人東京大学 ヘテロ環を含む化合物の製造方法
WO2015030014A1 (ja) 2013-08-26 2015-03-05 国立大学法人東京大学 大環状ペプチド、その製造方法、及び大環状ペプチドライブラリを用いるスクリーニング方法
WO2015056713A1 (ja) 2013-10-15 2015-04-23 国立大学法人東京大学 c-Metタンパク質アゴニスト
WO2015115661A1 (ja) 2014-02-03 2015-08-06 国立大学法人東京大学 アゾール誘導体骨格を有するペプチドの製造方法
JP2017051143A (ja) * 2015-09-10 2017-03-16 国立大学法人埼玉大学 機能性ペプチドをコードするdnaの探索方法及び機能性ペプチドの調製方法
WO2018225864A1 (ja) 2017-06-09 2018-12-13 中外製薬株式会社 膜透過性の高い環状ペプチド化合物、及びこれを含むライブラリ
WO2019026920A1 (ja) 2017-07-31 2019-02-07 国立大学法人東京大学 環状ペプチドをタンパク質構造に提示させる超汎用法
WO2019077887A1 (ja) 2017-10-16 2019-04-25 国立大学法人東京大学 D-アミノ酸及びβ-アミノ酸の取り込みを増強するtRNAのD及びTアームの改変
WO2020027224A1 (ja) 2018-07-31 2020-02-06 国立大学法人東京大学 新たな結合特異性を抗体に付与する超汎用法
WO2021100833A1 (ja) 2019-11-19 2021-05-27 国立大学法人東京大学 N-メチルアミノ酸の取り込みを増強するtRNAのTステムの改変
WO2021117848A1 (ja) 2019-12-12 2021-06-17 中外製薬株式会社 非天然アミノ酸を含むペプチドの製造方法
WO2022009992A1 (ja) 2020-07-10 2022-01-13 国立大学法人東京大学 環状ペプチド、ペプチド複合体、並びに、当該環状ペプチド及び/又は当該ペプチド複合体を含む医薬組成物

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3087088B1 (en) * 2013-12-23 2022-05-25 University Of Rochester Methods and compositions for ribosomal synthesis of macrocyclic peptides
WO2017170469A1 (ja) * 2016-03-30 2017-10-05 池田食研株式会社 アミノ酸定量方法及びアミノ酸定量用キット
US20190284249A1 (en) * 2016-04-25 2019-09-19 Evorx Technologies, Inc. Beta-catenin barcoded peptides
AU2018236568B2 (en) * 2017-03-17 2021-07-01 Cubicstars, Inc. Method for producing complex of RNA molecule and peptide, and utilization thereof
US11814621B2 (en) 2018-06-01 2023-11-14 Northwestern University Expanding the chemical substrates for genetic code reprogramming
JP7477182B2 (ja) 2019-10-08 2024-05-01 ジーンフロンティア株式会社 Ctla-4阻害活性を有する環状ペプチド、及びその用途

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998016636A1 (fr) 1996-10-17 1998-04-23 Mitsubishi Chemical Corporation Molecule permettant d'homologuer un genotype et un phenotype, et utilisation de celle-ci
WO1998031700A1 (en) 1997-01-21 1998-07-23 The General Hospital Corporation Selection of proteins using rna-protein fusions
JP3683902B2 (ja) 1996-10-17 2005-08-17 三菱化学株式会社 遺伝子型と表現型の対応付け分子及びその利用
WO2007066627A1 (ja) 2005-12-06 2007-06-14 The University Of Tokyo 多目的アシル化触媒とその用途
WO2008059823A1 (fr) 2006-11-17 2008-05-22 The University Of Tokyo Traduction et synthèse de polypeptides ayant une structure non naturelle au niveau de l'extrémité n et leur application
WO2008073184A2 (en) * 2006-10-18 2008-06-19 The Scripps Research Institute Genetic incorporation of unnatural amino acids into proteins in mammalian cells
WO2008117833A1 (ja) 2007-03-26 2008-10-02 The University Of Tokyo 環状ペプチド化合物の合成方法

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998016636A1 (fr) 1996-10-17 1998-04-23 Mitsubishi Chemical Corporation Molecule permettant d'homologuer un genotype et un phenotype, et utilisation de celle-ci
JP3683282B2 (ja) 1996-10-17 2005-08-17 三菱化学株式会社 遺伝子型と表現型の対応付け分子及びその利用
JP3683902B2 (ja) 1996-10-17 2005-08-17 三菱化学株式会社 遺伝子型と表現型の対応付け分子及びその利用
WO1998031700A1 (en) 1997-01-21 1998-07-23 The General Hospital Corporation Selection of proteins using rna-protein fusions
JP3692542B2 (ja) 1997-01-21 2005-09-07 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレーション Rna−蛋白質の融合体を用いた蛋白質の選抜
WO2007066627A1 (ja) 2005-12-06 2007-06-14 The University Of Tokyo 多目的アシル化触媒とその用途
WO2008073184A2 (en) * 2006-10-18 2008-06-19 The Scripps Research Institute Genetic incorporation of unnatural amino acids into proteins in mammalian cells
WO2008059823A1 (fr) 2006-11-17 2008-05-22 The University Of Tokyo Traduction et synthèse de polypeptides ayant une structure non naturelle au niveau de l'extrémité n et leur application
WO2008117833A1 (ja) 2007-03-26 2008-10-02 The University Of Tokyo 環状ペプチド化合物の合成方法

Non-Patent Citations (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHOUIKHI, DALILA ET AL.: "Clickable peptide nucleic acids (cPNA) with tunable affinity", CHEM. COMMUN., vol. 46, 2010, pages 5476 - 5478, XP055069474 *
EIJI NAKAJIMA ET AL.: "Tokushu Peptide no Hon'yaku Program Gosei to Chemical Biology eno Tenkai", KAGAKU TO SEIBUTSU, vol. 47, no. 5, 2009, pages 353 - 360, XP008167833 *
F. BERNAL; A. F. TYLER; S. J. KORSMEYER; L. D. WALENSKY; G. L. VERDINE, J. AM. CHEM. SOC., vol. 129, 2007, pages 2456 - 2457
GOPI, HOSAHUDYA N. ET AL.: "Click Chemistry on Azidoproline: High-Affinity Dual Antagonist for HIV-1 Envelope Glycoprotein gp120", CHEMMEDCHEM, vol. 1, 2006, pages 54 - 57, XP055069468 *
GOTO ET AL.: "Translation and synthesis of polypeptide having nonnative structure at n-terminus and application thereof", ACS CHEM. BIOL., vol. 3, 2008, pages 120 - 129
GOTO, YUKI ET AL.: "Reprogramming the Translation Initiation for the Synthesis of Physiologically Stable Cyclic Peptides.", ACS CHEMICAL BIOLOGY, vol. 3, no. 2, 2008, pages 120 - 129, XP002564832 *
GRUBBS, R.H.; BLACKWELL, H. E., ANGEW. CHEM. INT. ED., vol. 37, 1998, pages 3281 - 3284
H. F. KUNG; B. REDFIELD; B. V. TREADWELL; B. ESKIN; C. SPEARS; H. WEISSBACH: "DNA-directed in vitro synthesis of beta-galactosidase. Studies with purified factors", THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 252, no. 19, 1977, pages 6889 - 6894
H. MURAKAMI; A. OHTA; H. ASHIGAI; H. SUGA: "The flexizyme system: a highly flexible tRNA aminoacylation tool for the synthesis of nonnatural peptides", NATURE METHODS, vol. 3, 2006, pages 357 - 359
H. MURAKAMI; D. KOUROUKLIS; H. SUGA, CHEMISTRY & BIOLOGY, vol. 10, 2003, pages 1077 - 1084
H. MURAKAMI; H. SAITO; H. SUGA, CHEMISTRY & BIOLOGY, vol. 10, 2003, pages 655 - 662
H. OHASHI; Y. SHIMIZU; B. W. YING; T. UEDA: "Efficient protein selection based on ribosome display system with purified components", BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, vol. 352, no. 1, 2007, pages 270 - 276, XP005727956, DOI: doi:10.1016/j.bbrc.2006.11.017
HIROSHI MURAKAMI ET AL.: "Flexizyme -Iden Ango no Kakucho to Reprogramming eno Oyo", BIOTECHNOLOGY JOURNAL, vol. 6, no. 6, 2006, pages 734 - 737, XP008169209 *
M. C. GONZA; C. CUNNINGHAM; R. M. GREEN: "Isolation and point of action of a factor from Escherichia coli required to reconstruct translation", PROCEEDING OF NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA, vol. 82, 1985, pages 1648 - 1652, XP055124549, DOI: doi:10.1073/pnas.82.6.1648
M. Y. PAVLOV; M. EHRENBERG: "Rate of translation of natural mRNAs in an optimized in vitro system", ARCHIVES OF BIOCHEMISTRY AND BIOPHYSICS, vol. 328, no. 1, 1996, pages 9 - 16, XP001066398, DOI: doi:10.1006/abbi.1996.0136
MURAKAMI, H.; BONZAGNI, N. J.; SUGA, H.: "Aminoacyl-tRNA synthesis by a resin- immobilized ribozyme", J. AM. CHEM. SOC., vol. 124, no. 24, 2002, pages 6834 - 6835
N. NIWA; Y. YAMAGISHI; H. MURAKAMI; H. SUGA: "A flexizyme that selectively charges amino acids activated by a water-friendly leaving group", BIOORGANIC & MEDICINAL CHEMISTRY LETTERS, vol. 19, 2009, pages 3892 - 3894
NEMOTO ET AL., FEBS LETT., vol. 414, 1997, pages 405 - 408
PHELAN, J. C. ET AL., J. AM. CHEM. SOC., vol. 119, no. 1197, pages 455 - 460
ROBERTS ET AL., PROC. NATL. ACD. SCI. USA, vol. 94, 1997, pages 12297 - 12302
SCHULTZ, P.G. ET AL., J. AM. CHEM. SOC., vol. 113, 1991, pages 9391 - 9392
T. J. KANG ET AL., CHEM. BIOL., vol. 15, 2008, pages 1166 - 1174
TAYLOR, W., J.; BAUM, J. ET AL., J. AM. CHEM. SOC., vol. 116, 1994, pages 6431 - 6432
VERDINE, G. L.; KORSMEYER, S. J. ET AL., SCIENCE, vol. 305, 2004, pages 1466 - 1470
Y. GOTO; H. SUGA: "Translation initiation with initiator tRNA charged with exotic peptides", JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, vol. 131, no. 14, 2009, pages 5040 - 5041, XP002564833, DOI: doi:10.1021/ja900597d
Y. SHIMIZU; A. INOUE; Y. TOMARI; T. SUZUKI; T. YOKOGAWA; K. NISHIKAWA; T. UEDA: "Cell-free translation reconstituted with purified components", NATURE BIOTECHNOLOGY, vol. 19, no. 8, 2001, pages 751 - 755, XP002677144, DOI: doi:10.1038/90802
YUKI GOTO ET AL.: "Ribosomal synthesis of combinatorial polypeptides containing unusual amino acid blocks", KAGAKU KOGYO, vol. 58, no. 4, 2007, pages 255 - 262, XP008169057 *

Cited By (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014034922A1 (ja) 2012-09-03 2014-03-06 国立大学法人東京大学 血管内皮細胞増殖因子受容体阻害ペプチド
WO2014136971A1 (ja) 2013-03-07 2014-09-12 国立大学法人東京大学 ヘテロ環を含む化合物の製造方法
WO2015030014A1 (ja) 2013-08-26 2015-03-05 国立大学法人東京大学 大環状ペプチド、その製造方法、及び大環状ペプチドライブラリを用いるスクリーニング方法
US9994616B2 (en) 2013-10-15 2018-06-12 The University Of Tokyo c-Met protein agonist
WO2015056713A1 (ja) 2013-10-15 2015-04-23 国立大学法人東京大学 c-Metタンパク質アゴニスト
WO2015115661A1 (ja) 2014-02-03 2015-08-06 国立大学法人東京大学 アゾール誘導体骨格を有するペプチドの製造方法
JP7049756B2 (ja) 2015-09-10 2022-04-07 国立大学法人埼玉大学 機能性ペプチドをコードするdnaの探索方法及び機能性ペプチドの調製方法
JP2017051143A (ja) * 2015-09-10 2017-03-16 国立大学法人埼玉大学 機能性ペプチドをコードするdnaの探索方法及び機能性ペプチドの調製方法
WO2018225864A1 (ja) 2017-06-09 2018-12-13 中外製薬株式会社 膜透過性の高い環状ペプチド化合物、及びこれを含むライブラリ
WO2019026920A1 (ja) 2017-07-31 2019-02-07 国立大学法人東京大学 環状ペプチドをタンパク質構造に提示させる超汎用法
WO2019077887A1 (ja) 2017-10-16 2019-04-25 国立大学法人東京大学 D-アミノ酸及びβ-アミノ酸の取り込みを増強するtRNAのD及びTアームの改変
JPWO2019077887A1 (ja) * 2017-10-16 2021-01-14 国立大学法人 東京大学 D−アミノ酸及びβ−アミノ酸の取り込みを増強するtRNAのD及びTアームの改変
US11946042B2 (en) 2017-10-16 2024-04-02 The University Of Tokyo Modification of D- and T-arms of tRNA enhancing D-amino acid and β-amino acid uptake
JP7079018B6 (ja) 2017-10-16 2024-01-31 国立大学法人 東京大学 D-アミノ酸及びβ-アミノ酸の取り込みを増強するtRNAのD及びTアームの改変
JP7079018B2 (ja) 2017-10-16 2022-06-01 国立大学法人 東京大学 D-アミノ酸及びβ-アミノ酸の取り込みを増強するtRNAのD及びTアームの改変
WO2020027224A1 (ja) 2018-07-31 2020-02-06 国立大学法人東京大学 新たな結合特異性を抗体に付与する超汎用法
EP4063377A1 (en) 2019-11-19 2022-09-28 The University of Tokyo Modification of trna t-stem for enhancing n-methyl amino acid incorporation
WO2021100833A1 (ja) 2019-11-19 2021-05-27 国立大学法人東京大学 N-メチルアミノ酸の取り込みを増強するtRNAのTステムの改変
WO2021117848A1 (ja) 2019-12-12 2021-06-17 中外製薬株式会社 非天然アミノ酸を含むペプチドの製造方法
WO2022009992A1 (ja) 2020-07-10 2022-01-13 国立大学法人東京大学 環状ペプチド、ペプチド複合体、並びに、当該環状ペプチド及び/又は当該ペプチド複合体を含む医薬組成物

Also Published As

Publication number Publication date
US20130316910A1 (en) 2013-11-28
EP2647721B1 (en) 2019-02-27
CN103328648A (zh) 2013-09-25
CN103328648B (zh) 2015-11-25
US10435439B2 (en) 2019-10-08
JPWO2012074129A1 (ja) 2014-05-19
US20170247416A1 (en) 2017-08-31
JP6004399B2 (ja) 2016-10-05
US9657289B2 (en) 2017-05-23
EP2647721A4 (en) 2017-04-26
EP2647721A1 (en) 2013-10-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6004399B2 (ja) 安定化された二次構造を有するペプチド、及びペプチドライブラリー、それらの製造方法
JP6206943B2 (ja) ペプチドライブラリーの製造方法、ペプチドライブラリー、及びスクリーニング方法
US11970694B2 (en) Rapid display method in translational synthesis of peptide
JP5818237B2 (ja) N−メチルアミノ酸およびその他の特殊アミノ酸を含む特殊ペプチド化合物ライブラリーの翻訳構築と活性種探索法
JP5725467B2 (ja) 新規人工翻訳合成系
JP5200241B2 (ja) N末端に非天然骨格をもつポリペプチドの翻訳合成とその応用
WO2013183707A1 (ja) pH依存的に標的分子に結合するペプチドのスクリーニング方法
WO2014181888A1 (ja) ペプチドライブラリの製造方法、ペプチドライブラリ、及びスクリーニング方法
Harrison et al. Synthesis and applications of mirror-image proteins
WO2014119600A1 (ja) Flexible Display法
Katoh et al. Development of bioactive foldamers using ribosomally synthesized nonstandard peptide libraries
JPWO2015115661A1 (ja) アゾール誘導体骨格を有するペプチドの製造方法
KR20240042497A (ko) 폴리펩타이드의 제작 방법, 태그, 발현 벡터, 폴리펩타이드의 평가 방법, 핵산 디스플레이 라이브러리의 제작 방법 및 스크리닝 방법
Murakami et al. High-affinity mirror-image monobody targeting MCP-1 generated via TRAP display and chemical protein synthesis

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 11845198

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2012546968

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2011845198

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 13990123

Country of ref document: US