WO2012066827A1 - 生体試料調製方法 - Google Patents

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森本　伸彦
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オリンパス株式会社
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    • H04N7/00—Television systems
    • H04N7/18—Closed-circuit television [CCTV] systems, i.e. systems in which the video signal is not broadcast

Definitions

  • the present invention relates to a biological sample preparation method.
  • Non-Patent Document 1 a technique for collecting a fragment from a specific region of a tissue section of a living tissue by irradiating a high-power laser is known (for example, see Non-Patent Document 1).
  • the collected fragments are used for analysis of biomolecules such as nucleic acids and proteins existing in a specific region such as a lesion site.
  • the position of the fragment to be collected is accurately determined by staining the tissue section with a dye so that the tissue morphology can be identified with a microscope.
  • Leica MICROSYSTEMS "Laser Microdissection Leica LMD7000", [online], [October 5, 2010 search], Internet ⁇ URL: http://www.leica-microsystems.com/jp/products/light-microscopes / life-science-research / laser-microdissection / details / product / leica-lmd7000 />
  • the present invention has been made in view of the above-described circumstances, and provides a biological sample preparation method capable of collecting a sufficient amount of biomolecules from a desired region in a tissue section by a single operation. Objective.
  • the present invention relates to a slicing step for slicing a living tissue by a cross section, a staining step for staining one of two tissue sections sliced by the slicing step, and a tissue stained in the staining step.
  • a stained image capturing step for obtaining a stained image of a section, and a dividing line for dividing the tissue section into a plurality of fragments are defined for the other of the two tissue sections sliced by the slice section.
  • An unstained image capturing step for acquiring the unstained image, and an association step for associating the unstained image acquired in the unstained image capturing step with the stained image acquired in the stained image capturing step.
  • a biological sample preparation method is provided.
  • a fragment of a tissue section is prepared by dividing the other tissue section sliced in the slice section along the dividing line in the unstained image acquired in the unstained image photographing step. be able to.
  • one section in the stained image that was stained in the staining step and photographed in the stained image capturing step has the same tissue morphology as the other tissue section in the unstained image. Therefore, by referring to the part of one tissue section in the stained image that is associated with each fragment in the unstained image in the association step, the operator knows the tissue form that each fragment has, and Fragments of the desired region can be prepared or analyzed. Further, the tissue section from which the fragments are collected need not be thinned to a thickness suitable for staining. Therefore, a sufficient amount of biomolecules can be collected in a single operation by slicing the other tissue section thicker than one tissue section so that one fragment contains abundant biomolecules.
  • the unstained image capturing step may be performed by mounting the other tissue section on a substrate that can be divided along the dividing line. In this way, an unstained image in which a dividing line is defined for a tissue slice can be acquired simply by photographing a tissue slice mounted on the substrate.
  • the matching step matches the two contours extracted by the contour extraction step for extracting the contours of the two tissue sections from the unstained image and the stained image, respectively.
  • a superimposing step of superimposing the unstained image and the stained image may be included.
  • the matching step matches the feature point extraction step of extracting a plurality of the same feature points from the unstained image and the stained image, and the positions of the feature points extracted by the feature point extraction step.
  • the superimposing step of superimposing the unstained image and the stained image may be included. In this way, tissue sections in different images can be easily and more accurately associated.
  • a fragment designated by the operator can be selectively collected from a plurality of fragments.
  • the specifying step specifies a position to be collected from the tissue section based on the stained image, and specifies by the specifying step based on the unstained image. And determining a fragment associated with the position to be collected. By doing in this way, only the fragment
  • the tissue section may be divided into a plurality of pieces along the dividing line, and a collection step of collecting each piece by attaching position information on the tissue section may be included.
  • a collection step of collecting each piece by attaching position information on the tissue section may be included.
  • the biological sample preparation method according to the present embodiment includes a slicing step S1 for cutting two tissue sections 1 and 2 from a biological tissue, and a staining step S2 for staining one tissue section 1.
  • Contour extraction step (association step) S5 for extracting the contours 7 and 8 of the tissue sections 1 and 2 from the stained image 5 and the unstained image 6 respectively, and a superposition step for superimposing the stained image 5 and the unstained image 6 (Association step) S6, a designation step S7 for designating a position to be collected from the tissue section 2 based on the superimposed image, and a step for collecting the designated position from the other tissue section 2 And a step S8.
  • tissue sections 1 and 2 cut by a cross section are created. That is, the two tissue sections 1 and 2 have a cross section of a common tissue form.
  • One tissue section (hereinafter referred to as a section for staining) 1 is sliced into a thickness of about 1 to 10 ⁇ m, which is a thickness suitable for observation of a stained image.
  • the other tissue section (hereinafter referred to as analysis section) 2 is thicker than the staining section 1, and is sliced into a thickness of, for example, about 50 to 100 ⁇ m.
  • the staining section 1 is stained.
  • Staining refers to treatment for visualizing biomolecules with various microscopes, such as treatment with an enzyme in addition to staining with pigments, and appropriate determination according to the biomolecule to be analyzed. Can do.
  • the stained image 5 is obtained by enlarging and photographing the staining section 1 stained in the staining step S2 with a microscope.
  • substrate 4 should just have a plane which can affix the section
  • the substrate 4 is preferably made of a material transparent to visible light such as glass so that a transmitted light image can be observed with a microscope.
  • the substrate 4 may be made of a material that is translucent or opaque to visible light such as resin or metal.
  • the analysis section 2 is enlarged and photographed by a bright field microscope.
  • the dividing line 3 formed on the substrate 4 together with the analysis section 2 is also displayed. Thereby, the unstained image 6 in which the position of the dividing line 3 is defined with respect to the analysis section 2 can be easily acquired.
  • the dividing line 3 is configured so that the operator can divide the substrate 4 at the position, and is, for example, a groove formed in the substrate 4.
  • the groove can be formed manually by an operator using laser processing, chemical etching, dicing, glass cutting, or the like.
  • the analysis section 2 attached on the substrate 4 can also be divided into a plurality of pieces 2 a along the dividing line 3 together with the substrate 4.
  • the interval between the dividing lines 3 can be appropriately changed according to the size of the fragment 2a to be collected from the analysis section 2.
  • the interval between the dividing lines 3 is 0 so that a sufficient amount of biomolecules are contained in the collected fragment 2a while collecting the fragment 2a in a desired region from the analysis section 2 with sufficiently fine positional accuracy. .05 to 5.0 mm is preferred.
  • the method of pulling the substrate 4 is not particularly limited.
  • the substrate 4 is bonded onto a pressure-sensitive adhesive sheet that can be extended in the direction along the surface, and the substrate 4 is easily divided by pulling the pressure-sensitive adhesive sheet in the direction along the surface. be able to.
  • the dividing line 3 may be configured by, for example, gaps between a plurality of small pieces 4a that are divided in advance and aligned on the adhesive sheet. By doing so, the substrate 4 can be more reliably divided when the operator pulls the substrate 4 in the surface direction.
  • the contour 7 of the staining section 1 is extracted from the stained image 5 as shown in FIG. 3, and the contour 8 of the analytical section 2 is extracted from the unstained image 6 as shown in FIG. And the dividing line 3 is extracted.
  • a well-known method such as a method using a difference in brightness or differentiation between adjacent pixels can be used.
  • Image processing may be performed as appropriate so that the contours 7 and 8 are extracted more clearly. Examples of image processing include gamma curve correction, brightness adjustment, contrast enhancement, binarization of luminance, inversion of brightness, noise removal by a median filter, and the like.
  • the stained image 5 and the unstained image 6 are superimposed and displayed so that the positions of the extracted two contours 7 and 8 are matched.
  • the two images 5 and 6 may be superimposed at a relative position where the cross-correlation value between the contours 7 and 8 is the largest.
  • the positions of the staining section 1 and the analysis section 2 are associated with each other and stained in the same positional relationship as that defined for the analysis section 2 in the superimposed image.
  • a dividing line 3 is also defined for the section 1 for use.
  • the sections 1 and 2 in the stained image 5 and the unstained image 6 may have different orientations and front and back, or may have different magnifications due to being photographed with different microscopes and cameras. Accordingly, the images 5 and 6 may be appropriately operated such that one image is rotated, reversed, or reduced or enlarged so that the extracted contours 7 and 8 are more accurately matched.
  • the operator determines a region to be collected by observing the tissue form of the stained image 5 among the images displayed in a superimposed manner, and a fragment arranged at a position that matches the determined region Specify 2a.
  • the fragments 2a partitioned by the dividing line 3 are given row numbers A, B, C, D and column numbers 1, 2, 3,... And fragments to be collected using combinations of row numbers and column numbers. Specify the position of 2a.
  • the substrate 4 and the analysis section 2 are divided along the dividing line 3, and the fragment 2a at the position designated by the operator is selected and collected in the designated step S7.
  • the fragment 2 a having the same tissue form as the region determined based on the stained image 5 can be collected from the analysis section 2 in a state of being attached to the small piece 4 a of the substrate 4.
  • nucleic acids, proteins, sugar chains, lipids and the like can be analyzed as biomolecules.
  • a sufficient amount of biomolecules are contained in the fragment 2a collected from the analysis section 2 that is thicker than the thin section 1 for staining. Therefore, in order to collect a sufficient amount of biomolecules for analysis, the work that has been required to repeatedly collect fragments many times using a large number of sections for staining can be done in one or several times. There is an advantage that you can.
  • a method of associating the positions of the staining section 1 and the analysis section 2 a method of attaching a marker to the corresponding position of each tissue section 1 or 2 can be considered.
  • this method it is necessary to compare the two tissue sections 1 and 2 in detail in order to determine the position where the marker is attached, and attach the marker with high positional accuracy. Therefore, the work is complicated and the number of processes is increased.
  • the correspondence between the two tissue sections 1 and 2 can be easily performed. There is an advantage that it can be applied.
  • the analysis section 2 is divided and the desired fragment 2a is selectively recovered.
  • the stained image 5 was photographed to find the position of each fragment 2a and the stained sections. The position of 1 may be associated.
  • each fragment 2a is collected with its position information in the section 2 for analysis.
  • the row number and column number, which are the positional information of each fragment 2a, and the position of the well of the destination multi-plate 9 are collected.
  • Corresponding records are recorded in the list 10. As a result, it is possible to know which position the fragment 2a is housed in which position after the recovery.
  • each analysis result is obtained from the fragment 2a having any tissue form. It can be determined by searching and referring to the position of the section 1 for staining corresponding to each fragment 2a from the position information of each fragment 2a. As a result, the time from the preparation of the analysis section 2 to the analysis of the biomolecule is shortened. For example, even a biomolecule that is easily degraded, such as mRNA, can be analyzed quickly while it is fresh. To obtain accurate analysis results.
  • the contours 7 and 8 of the tissue sections 1 and 2 are extracted from the images 5 and 6 in order to superimpose the stained image 5 and the unstained image 6, but instead of this, A plurality of the same feature points may be extracted from the images 5 and 6, and these images 5 and 6 may be superimposed so that the positions of the extracted feature points coincide. In this way, the images 5 and 6 can be superimposed so that the two tissue sections 1 and 2 are exactly overlapped.
  • the feature point for example, a sharp pointed portion of the tissue sections 1 and 2 or a luminal structure can be used.
  • the extraction of the feature points is performed, for example, when the user inputs in each of the images 5 and 6.
  • the number of feature points specified at this time may be two or more, but is preferably three or more in order to improve the position accuracy when superimposing.
  • the division line 3 on which the analysis section 2 is divided is defined with respect to the analysis section 2.
  • the dividing line may be defined when the operator inputs the unstained image 6 or may be defined by image processing.
  • the fragment 2a to be collected is designated in a state where the stained image 5 and the unstained image 6 are superimposed. Instead, the stained image 5 and the unstained image 6 are designated.
  • the fragments 2a to be collected may be designated by displaying them side by side and comparing the two images 5 and 6. In this case, first, the position to be collected is specified by observing the stained image 5 (specifying step), the tissue sections 1 and 2 in the two images 5 and 6 are compared, and a fragment at a position corresponding to the specified position. 2a is determined (decision step). Even in this case, it is possible to specify and extract the fragment 2a of the region having a desired tissue form from the analysis section 2.
  • the unstained image 6 is photographed before the analysis section 2 is divided. Instead, the unstained image 6 of each fragment 2a is photographed after the segmentation and image processing is performed.
  • the piece 2a for analysis before the division may be reproduced by connecting the pieces 2a at the position of the dividing line 3. Even in this case, the positions of the analysis section 2 and the staining section 1 can be correlated as in the above-described embodiment.

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Abstract

　組織切片内の所望の領域から一度の操作で十分な量の生体分子を採取する。生体組織を一切断面によって薄切する薄切ステップ（Ｓ１）と、該薄切ステップ（Ｓ１）により薄切された２つの組織切片の内の一方を染色する染色ステップ（Ｓ２）と、染色された組織切片の染色画像を取得する染色画像撮影ステップ（Ｓ３）と、薄切ステップ（Ｓ１）により薄切された他方の組織切片に対して、該組織切片を複数の断片に分割する分割線が定義付けられた無染色画像を取得する無染色画像撮影ステップ（Ｓ４）と、無染色画像と染色画像とを対応付ける対応付けステップ（Ｓ５，Ｓ６）とを含む生体試料調製方法を提供する。

Description

生体試料調製方法
　本発明は、生体試料調製方法に関するものである。
　従来、高出力のレーザを照射することにより生体組織の組織切片の特定の領域から断片を採取する技術が知られている（例えば、非特許文献１参照。）。採取された断片は、病変部位などの特定の領域に存在する核酸やタンパク質などの生体分子の解析に使用される。このときに、組織切片を色素で染色して組織形態を顕微鏡で識別可能にすることにより、採取すべき断片の位置が正確に判断される。
Ｌｅｉｃａ　ＭＩＣＲＯＳＹＳＴＥＭＳ、"レーザマイクロダイセクション　Ｌｅｉｃａ　ＬＭＤ７０００"、［ｏｎｌｉｎｅ］、［平成２２年１０月５日検索］、インターネット＜URL：http://www.leica-microsystems.com/jp/products/light-microscopes/life-science-research/laser-microdissection/details/product/leica-lmd7000/＞
　しかしながら、組織切片の染色画像で組織形態を詳細に識別するためには、組織切片を数から１０μｍ程度まで薄くする必要がある。したがって、採取した１つの断片に含まれる生体分子は少量であり、解析に十分な量の生体分子を集めるためには、多数の組織切片を用いて何度も断片の採取を繰り返さなければならないという不都合がある。一方、組織切片を厚くすることにより１つの断片から得られる生体分子の量を増やすことができる。しかし、その場合には細胞や組織が厚さ方向に重なるため組織切片全体が略均一に染色される。したがって、採取すべき断片の位置を染色画像から正確に判断できなくなるという問題がある。
　本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、組織切片内の所望の領域から一度の操作で十分な量の生体分子を採取することができる生体試料調製方法を提供することを目的とする。
　上記目的を達成するため、本発明は以下の手段を提供する。
　本発明は、生体組織を一切断面によって薄切する薄切ステップと、該薄切ステップにより薄切された２つの組織切片の内の一方を染色する染色ステップと、該染色ステップにおいて染色された組織切片の染色画像を取得する染色画像撮影ステップと、前記薄切ステップにより薄切された２つの前記組織切片の内の他方に対して、該組織切片を複数の断片に分割する分割線が定義付けられた無染色画像を取得する無染色画像撮影ステップと、該無染色画像撮影ステップにおいて取得された無染色画像と、前記染色画像撮影ステップにおいて取得された染色画像とを対応付ける対応付けステップとを含む生体試料調製方法を提供する。
　本発明によれば、薄切ステップにおいて薄切した他方の組織切片を、無染色画像撮影ステップにおいて取得された無染色画像内の分割線に沿って分割することにより、組織切片の断片を調製することができる。
　この場合に、染色ステップにおいて染色し、染色画像撮影ステップにおいて撮影した染色画像内の一方の切片は、無染色画像内の他方の組織切片と同一の組織形態を有する。したがって、対応付けステップにおいて無染色画像内の各断片と対応付けられた染色画像内の一方の組織切片の部位を参照することにより、操作者は、各断片が有する組織形態を知り、組織切片の所望の領域の断片を調製または解析することができる。また、断片を採取する方の組織切片は、染色に適した薄さまで薄くする必要がない。したがって、１つの断片に生体分子が豊富に含まれるように、他方の組織切片を一方の組織切片よりも厚く薄切して、一度の操作で十分な量の生体分子を採取することができる。
　上記発明においては、前記無染色画像撮影ステップが、前記分割線に沿って分割可能な基板上に前記他方の組織切片を搭載して撮影してもよい。
　このようにすることで、基板上に搭載された組織切片を撮影するだけで、組織切片に対して分割線が定義付けられた無染色画像を取得することができる。
　上記発明においては、前記対応付けステップが、前記無染色画像および前記染色画像から２つの前記組織切片の輪郭をそれぞれ抽出する輪郭抽出ステップと、該輪郭抽出ステップにより抽出された２つの前記輪郭を一致させるように前記無染色画像と前記染色画像とを重畳する重畳ステップとを含んでもよい。
　上記発明においては、前記対応付けステップが、前記無染色画像および前記染色画像から、同一の特徴点を複数抽出する特徴点抽出ステップと、該特徴点抽出ステップにより抽出された特徴点の位置を一致させるように前記無染色画像と前記染色画像を重畳する重畳ステップとを含んでもよい。
　このようにすることで、別々の画像内の組織切片を容易にかつより正確に対応付けることができる。
　上記発明においては、前記対応付けステップの後に、前記組織切片から採取すべき前記断片を指定する指定ステップと、前記組織切片を前記分割線に沿って複数の断片に分割し、前記指定ステップにおいて指定された前記断片を回収する回収ステップとを含む構成であってもよい。
　このようにすることで、複数の断片の中から、例えば操作者によって指定された断片を選択的に回収することができる。
　上記の指定ステップを含む構成においては、前記指定ステップが、前記染色画像に基づいて、前記組織切片から採取すべき位置を特定する特定ステップと、前記無染色画像に基づいて、該特定ステップにより特定された採取すべき位置に対応付けられた断片を決定する決定ステップとを含んでもよい。
　このようにすることで、染色画像から判断した所望の組織形態を有する断片のみを選択的に回収することができる。
　上記発明においては、前記組織切片を前記分割線に沿って複数の断片に分割し、その前記組織切片における位置情報を付して各前記断片を回収する回収ステップを含んでもよい。
　このようにすることで、他方の組織切片を分割して回収した後であっても、染色ステップ、染色画像撮影ステップおよび対応付けステップを行うことにより、回収された各断片がどのような組織形態を有するかを、位置情報に基づいて染色画像を参照して知ることができる。これにより、例えば、変性しやすい生体分子を解析したい場合など、他方の組織切片の処理を一方の組織切片の処理よりも優先して迅速に進めることができる。
　本発明によれば、組織切片内の所望の領域から一度の操作で十分な量の生体分子を採取することができるという効果を奏する。
本発明の一実施形態に係る生体試料調製方法の手順を示すフローチャートである。 無染色画像撮影ステップを説明する図であり、解析用切片を分割する前を示している。 無染色画像撮影ステップを説明する図であり、解析用切片を分割した後を示している。 染色用切片の輪郭が抽出された染色画像を示す図である。 解析用切片の輪郭と分割線とが抽出された無染色画像を示す図である。 染色画像と無染色画像を重畳して表示した状態を示す図である。 本実施形態に係る生体試料調製方法の変形例を示すフローチャートである。 図６の生体試料調製方法において各断片にその位置情報を付す方法の一例を説明する図である。
　以下に、本発明の一実施形態に係る生体試料調製方法について図面を参照して説明する。
　本実施形態に係る生体試料調製方法は、図１に示されるように、生体組織から２枚の組織切片１，２を切り出す薄切ステップＳ１と、一方の組織切片１を染色する染色ステップＳ２と、染色された一方の組織切片１を撮影する染色画像撮影ステップＳ３と、分割線３を有する基板４上に他方の組織切片２を貼り付けた状態で撮影する無染色画像撮影ステップＳ４と、取得された染色画像５および無染色画像６のそれぞれから組織切片１，２の輪郭７，８を抽出する輪郭抽出ステップ（対応付けステップ）Ｓ５と、染色画像５および無染色画像６を重畳する重畳ステップ（対応付けステップ）Ｓ６と、重畳された画像に基づいて組織切片２から採取すべき位置を指定する指定ステップＳ７と、他方の組織切片２から指定された位置を回収する回収ステップＳ８とを備えている。
　薄切ステップＳ１においては、一切断面によって切断された２枚の組織切片１，２を作成する。すなわち、２枚の組織切片１，２は、共通の組織形態の断面を有する。一方の組織切片（以下、染色用切片と言う。）１は、染色画像の観察に適した厚さである１から１０μｍ程度の厚さに薄切する。他方の組織切片（以下、解析用切片と言う。）２は、染色用切片１より厚く、例えば、５０から１００μｍ程度の厚さに薄切する。
　染色ステップＳ２においては、染色用切片１を染色する。染色とは、色素による染色の他に、酵素と反応させて生体分子を発光させる処理など、生体分子を各種の顕微鏡で可視化するための処理を示し、解析すべき生体分子に応じて適宜決めることができる。
　染色画像撮影ステップＳ３においては、染色ステップＳ２において染色された染色用切片１を顕微鏡で拡大して撮影することにより染色画像５を取得する。基板４は、染色用切片１を貼り付け可能な平面を有するものであればよい。基板４は、好ましくは、顕微鏡で透過光像を観察できるようにガラスなどの可視光に透明な材料からなるものが用いられる。基板４は、樹脂や金属などの可視光に対して半透明または不透明な材料からなるものが用いられてもよい。
　無染色画像撮影ステップＳ４においては、例えば、明視野顕微鏡によって解析用切片２を拡大して撮影する。取得された無染色画像６内には、図２Ａに示されるように、解析用切片２とともに基板４に形成された分割線３も表示される。これにより、解析用切片２に対して分割線３の位置が定義付けられた無染色画像６を容易に取得することができる。
　分割線３は、その位置において操作者が基板４を分割することができるように構成されたものであり、例えば、基板４に形成された溝である。溝は、レーザ加工や化学エッチング、ダイシング、または、ガラス切りなどを用いた操作者の手作業により形成することができる。これにより、操作者が基板４を表面方向に引っ張ることにより、図２Ｂに示されるように、分割線３の位置において基板４を複数の小片４ａに分割することができる。このときに、基板４上に貼り付けられた解析用切片２も、基板４とともに分割線３に沿って複数の断片２ａに分割することができる。分割線３の間隔は、解析用切片２から採取すべき断片２ａの大きさによって適宜変更可能である。分割線３の間隔は、解析用切片２内から十分に細かい位置精度で所望の領域の断片２ａを採取しつつ、採取した断片２ａに十分な量の生体分子が含まれているように、０．０５から５．０ｍｍが好ましい。
　基板４を引っ張る方法に特に限定はないが、例えば、表面に沿う方向に伸展可能な粘着シート上に基板４を接着し、粘着シートを表面に沿う方向に引っ張ることにより基板４を容易に分割することができる。
　分割線３は、例えば、予め分割されて粘着シート上に整列された複数の小片４ａ同士の隙間によって構成されていてもよい。このようにすることで、操作者が基板４を表面方向に引っ張ったときにより確実に基板４を分割することができる。
　輪郭抽出ステップＳ５においては、図３に示されるように、染色画像５から染色用切片１の輪郭７を抽出し、図４に示されるように、無染色画像６から解析用切片２の輪郭８および分割線３を抽出する。輪郭７，８および分割線３を抽出する方法としては、例えば、隣り合った画素間の明度の差分または微分を利用する方法など、周知の方法を用いることができる。輪郭７，８がより鮮明に抽出されるように適宜画像処理を施してもよい。画像処理としては、例えば、ガンマカーブ補正、明暗調整、コントラスト強調、輝度の２値化、明度の反転、メジアンフィルタ等によるノイズ除去などが挙げられる。
　重畳ステップＳ６においては、図５に示されるように、抽出した２つの輪郭７，８の位置を一致させるように染色画像５および無染色画像６を重畳して表示する。２つ輪郭７，８を一致させるためには、例えば、輪郭７，８の相互相関値がもっとも大きくなる相対位置において２つの画像５，６を重畳すればよい。これにより、染色用切片１と解析用切片２との各位置が対応づけられるとともに、重畳して表示された画像内において、解析用切片２に対して定義されたのと同様の位置関係で染色用切片１に対しても分割線３が定義される。
　ここで、染色画像５および無染色画像６内の各切片１，２は、向きや表裏が異なったり異なる顕微鏡やカメラで撮影されたことにより倍率が異なったりすることがある。したがって、抽出した輪郭７，８がより正確に一致するように、一方の画像を回転、反転または縮小拡大させるなど、適宜画像５，６を操作してもよい。
　指定ステップＳ７においては、操作者が、重畳して表示された画像のうち染色画像５の組織形態を観察することにより採取すべき領域を決定し、決定した領域と一致する位置に配された断片２ａを指定する。例えば、分割線３によって区画された断片２ａに行番号Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄと列番号１，２，３，…とを付し、行番号および列番号の組み合わせを用いて採取すべき断片２ａの位置を指定する。
　回収ステップＳ８においては、基板４および解析用切片２を分割線３に沿って分割し、指定ステップＳ７において操作者により指定された位置の断片２ａを選択して回収する。これにより、染色画像５に基づいて決定した領域と同様の組織形態を有する断片２ａを、基板４の小片４ａに貼り付けられた状態で解析用切片２から採取することができる。回収した断片２ａからは、生体分子として、例えば、核酸、タンパク質、糖鎖、脂質などを解析することができる。
　この場合に、本実施形態によれば、薄い染色用切片１に比べて厚い解析用切片２から採取された断片２ａには十分な量の生体分子が含まれている。したがって、解析に十分な量の生体分子を収集するために従来多数の染色用切片を用いて断片の採取を何度も繰り返す必要があった作業を、１回または数回の作業で済ますことができるという利点がある。
　また、このように厚い解析用切片２の場合、厚さ方向に細胞や組織が重なっているため、染色したときに全体が略均一に染まってしまい、組織形態を顕微鏡で識別することが困難である。そこで、解析用切片２と同一の組織形態を有する薄い染色用切片１を作成し、染色用切片１の染色画像５と解析用切片２の無染色画像６とを対応付けることにより、染色用切片１を参照して解析用切片２の各位置における詳細な組織形態を知ることが可能となる。これにより、解析用切片２からであっても所望の部位の断片２ａを採取することができるという利点がある。
　また、染色用切片１と解析用切片２との位置を対応付ける方法として、それぞれの組織切片１，２の対応する位置にマーカを付す方法が考えられる。この方法の場合、マーカを付す位置を決めるために２つの組織切片１，２を詳細に比較し、高い位置精度でマーカを付す必要がある。したがって、作業が煩雑である上に工程数が増えるという不都合があった。これに対して、本実施形態によれば、２つの組織切片１，２を撮影してそれらの画像を重畳して表示するだけでよいので、簡便な作業で２つの組織切片１，２の対応付けを行うことができるという利点がある。
　なお、本実施形態においては、解析用切片２の断片２ａの位置と染色用切片１の位置とを対応付けた後に、解析用切片２を分割して所望の断片２ａを選択的に回収することとしたが、これに代えて、図６に示されるように、解析用切片２を分割して全ての断片２ａを回収した後に、染色画像５を撮影して各断片２ａの位置と染色用切片１の位置とを対応付けてもよい。
　この場合に、各断片２ａを、解析用切片２内におけるその位置情報を付して回収する。例えば、図７に示されるように、断片２ａをマルチウェルプレート９に回収するときには、各断片２ａの位置情報である行番号および列番号と、回収する先のマルチプレート９のウェルの位置とを対応付けてリスト１０に記録しておく。これにより、どの位置のウェルにどの位置の断片２ａが収容されているかを回収した後でも知ることができる。
　このようにすることで、解析用切片２を用いた処理を優先して進めて各断片２ａに含まれる生体分子の解析を行った後に、各解析結果がどのような組織形態の断片２ａから得られたものであるのかを、各断片２ａの位置情報からその各断片２ａと対応する染色用切片１の部位を探して参照することにより知ることができる。これにより、解析用切片２を作成してから生体分子が解析されるまでの時間が短縮されるので、例えば、ｍＲＮＡのように分解されやすい生体分子であっても新鮮なうちに迅速に解析を行って正確な解析結果を得ることができる。
　また、本実施形態においては、染色画像５と無染色画像６を重畳させるために各画像５，６から組織切片１，２の輪郭７，８を抽出することとしたが、これに代えて、各画像５，６から同一の特徴点を複数抽出し、抽出した特徴点の位置が一致するようにこれらの画像５，６を重畳してもよい。このようにしても、２つの組織切片１，２がぴったり重なるように画像５，６を重畳させることができる。
　特徴点としては、例えば、組織切片１，２の鋭くとがった箇所や、管腔構造などを用いることができる。特徴点の抽出は、例えば、ユーザが各画像５，６内に入力することにより行われる。このときに指定する特徴点の数は２つ以上であればよいが、重畳するときの位置精度を向上するために３つ以上であることが好ましい。
　また、４つ以上の特徴点を抽出し、４つ以上の中から３つの特徴点を採用し、採用した３つの特徴点が一致するときの２つの画像５，６の相互相関値を算出し、最も相互相関値が高かったときの特徴点の組み合わせを最終的に採用することとしてもよい。このようにすることで、例えば、ユーザが指定した特徴点のうち、位置が２つの画像５，６間でずれている特徴点が存在しても、２つの組織切片１，２がより正確に一致するように２つの画像５，６を重畳することができる。
　また、本実施形態においては、分割線３が形成された基板４に解析用切片２を貼り付けることにより、解析用切片２に対して該解析用切片２が分割される分割線３を定義づけることとしたが、これに代えて、解析用切片２を撮影した後に撮影された無染色画像６内で分割線を定義し、この定義された分割線に従って解析用切片２を分割することとしてもよい。分割線は、操作者が無染色画像６に入力することにより定義されてもよく、画像処理によって定義されてもよい。
　また、本実施形態においては、染色画像５と無染色画像６とを重畳した状態で採取すべき断片２ａを指定することとしたが、これに代えて、染色画像５と無染色画像６とを並べて別々に表示し、２つの画像５，６を比較することにより採取すべき断片２ａを指定してもよい。この場合、まず、染色画像５を観察して採取すべき位置を特定し（特定ステップ）、２つの画像５，６内の組織切片１，２を見比べて、特定した位置と対応する位置の断片２ａを決定する（決定ステップ）。このようにしても、解析用切片２から、所望の組織形態を有する領域の断片２ａを指定して採取することができる。
　また、本実施形態においては、解析用切片２の分割前に無染色画像６を撮影することとしたが、これに代えて、分割後に各断片２ａの無染色画像６を撮影し、画像処理によって分割線３の位置において各断片２ａをつなぎ合わせることにより、分割前の状態の解析用切片２を再現してもよい。このようにしても、上述した実施形態と同様にして、解析用切片２と染色用切片１との位置の対応付けを行うことができる。
　１　染色用切片
　２　解析用切片
　２ａ　断片
　３　分割線
　４　基板
　４ａ　小片
　５　染色画像
　６　無染色画像
　７，８　輪郭
　９　マルチウェルプレート
　１０　リスト
　Ｓ１　薄切ステップ
　Ｓ２　染色ステップ
　Ｓ３　染色画像撮影ステップ
　Ｓ４　無染色画像撮影ステップ
　Ｓ５　輪郭抽出ステップ（対応付けステップ）
　Ｓ６　重畳ステップ（対応付けステップ）
　Ｓ７　指定ステップ
　Ｓ８　回収ステップ

Claims (7)

  1. 　生体組織を一切断面によって薄切する薄切ステップと、
    　該薄切ステップにより薄切された２つの組織切片の内の一方を染色する染色ステップと、
    　該染色ステップにおいて染色された組織切片の染色画像を取得する染色画像撮影ステップと、
    　前記薄切ステップにより薄切された２つの前記組織切片の内の他方に対して、該組織切片を複数の断片に分割する分割線が定義付けられた無染色画像を取得する無染色画像撮影ステップと、
    　該無染色画像撮影ステップにおいて取得された無染色画像と、前記染色画像撮影ステップにおいて取得された染色画像とを対応付ける対応付けステップとを含む生体試料調製方法。
  2. 　前記無染色画像撮影ステップが、前記分割線に沿って分割可能な基板上に前記他方の組織切片を搭載して撮影する請求項１に記載の生体試料調製方法。
  3. 　前記対応付けステップが、前記無染色画像および前記染色画像から２つの前記組織切片の輪郭をそれぞれ抽出する輪郭抽出ステップと、該輪郭抽出ステップにより抽出された２つの前記輪郭を一致させるように前記無染色画像と前記染色画像とを重畳する重畳ステップとを含む請求項１または請求項２に記載の生体試料調製方法。
  4. 　前記対応付けステップが、前記無染色画像および前記染色画像から、同一の特徴点を複数抽出する特徴点抽出ステップと、該特徴点抽出ステップにより抽出された特徴点の位置を一致させるように前記無染色画像と前記染色画像を重畳する重畳ステップとを含む請求項１または請求項２に記載の生体試料調製方法。
  5. 　前記対応付けステップの後に、前記組織切片から採取すべき前記断片を指定する指定ステップと、
    　前記組織切片を前記分割線に沿って複数の断片に分割し、前記指定ステップにおいて指定された前記断片を回収する回収ステップとを含む請求項１から請求項４のいずれかに記載の生体試料調製方法。
  6. 　前記指定ステップが、前記染色画像に基づいて、前記組織切片から採取すべき位置を特定する特定ステップと、前記無染色画像に基づいて、該特定ステップにより特定された採取すべき位置に対応付けられた断片を決定する決定ステップとを含む請求項５に記載の生体試料調製方法。
  7. 　前記組織切片を前記分割線に沿って複数の断片に分割し、その前記組織切片における位置情報を付して各前記断片を回収する回収ステップを含む請求項１から請求項４のいずれかに記載の生体試料調製方法。
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