WO2012049431A2 - Use of an anti-cd20 antibody for treating primary cerebral lymphoma - Google Patents

Use of an anti-cd20 antibody for treating primary cerebral lymphoma Download PDF

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WO2012049431A2
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Rémi Urbain
Sylvain Fisson
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    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered

Definitions

  • the present invention relates to the use of monoclonal antibodies for the treatment of primary cerebral lymphoma (also called "primary cerebral lymphoma").
  • the invention finds its industrial applications particularly in the medical field.
  • the CD20 antigen is a hydrophobic transmembrane protein with a molecular weight of 35-37 kDa present on the surface of mature B cells (Valentine et al (1987) Proc Natl Acad Sci U S A. 84 (22): 8085-9
  • the CD20 antigen is present on both normal B cells and malignant B cells. More particularly, the CD20 antigen is expressed on most B-cell lymphomas (80% of lymphomas): it is expressed for example on more than 90% of non-Hodgkin's lymphoma (NHL) of B lymphocytes.
  • NHL non-Hodgkin's lymphoma
  • CD20 The function of CD20 is not yet fully understood, but it could act as a calcium channel and intervene in the regulation of the first stages of differentiation (Golay et al (1985) J. Immunol .; 135 (6): 3795-801 [3]) and B cell proliferation (Tedder et al (1986) J. Immunol 1986 Aug; 16 (8): 881-7 [4]).
  • the CD20 antigen is, by its location, an important target for the treatment of pathologies involving tumor B cells, such as for example, NHL or B-CLL (chronic lymphocytic leukemia B) by antibodies specifically recognizing CD20.
  • this antigen is an ideal target because it is a membrane protein for which no modulation of expression or polymorphism is known.
  • rituximab A single radiolabelled anti-CD20 monoclonal antibody, rituximab (Genentech), is currently available on the market for the treatment of B-cell lymphoma. In NHL patients, it shows encouraging clinical results when combined with chemotherapy. However, its effectiveness remains variable and often modest when used as a single agent (Teeling et al (2004) Blood 104 (6) .- 1793-800, [5]).
  • PCL Primary brain lymphomas
  • LCPs More than 80% of the immunocompetent LCPs are non-Hodgkin's type B lymphomas with large malignancies (or large cells).
  • the different histological subtypes are very variable in the literature because of the polymorphic character of these tumors; however, they are classified in the context of diffuse large B cell lymphoma.
  • the LCP of immunocompetent patients are distinguished in the majority of cases from those of immunodeficient patients by the absence of necrosis and a histological type most often polymorphic centroblastic. LCP can occur in adults immunocompetent at any age but with a predilection in the elderly, the median age of onset is between 50 and 60 years. In immunocompromised patients, the median age is around 30 years.
  • Neurological manifestations are not specific to the disease.
  • the signs of diffuse brain pain, as well as focal deficit and epileptic seizures, are observed (J.
  • corticosteroids only when the diagnosis is certain, leads to a tumor melting in 50% of cases.
  • Radiotherapy remains the standard treatment and provides an excellent response, in almost all cases. However, relapses are often early.
  • rituximab a chimeric murine-human monoclonal antibody binding to human CD20-expressing B cells
  • intracerebral injection into a tumor Mineo et al., Using human CD20-transfected murine lymphomatous B cells to evaluate the efficacy intravitreal intracerebral rituximab injections in mice ", Invest Ophthalmol Screw Sci., 49 (1 1): 4738-4745, 2008, [7]) or intraventricularly
  • the antibodies according to the invention consist of two heavy chains and two light chains, linked together by disulfide bridges.
  • Each chain is constituted, in the N-terminal position, of a variable region (or domain) (encoded by the rearranged genes VJ for the light chains and VD-J for the heavy chains) specific for the antigen against which the antibody is directed, and in the C-terminal position, of a constant region consisting of a single CL domain for the light chains or of several domains for the heavy chains.
  • the term "monoclonal antibody” is intended to mean any preparation of antibody molecules having identical and unique specificity.
  • the antibodies of the invention can be constructed using standard techniques of recombinant DNA, which are well known to those skilled in the art, and more particularly by using the "chimeric" antibody construction techniques described for example in Morrison et al. .,
  • a first subject of the invention relates to a monoclonal antibody directed against the CD20 antigen, whose variable region of each of the light chains is encoded by the murine nucleic acid sequence SEQ ID NO: 1, whose variable region of each of the heavy chains is encoded by the murine nucleic acid sequence SEQ ID NO: 2, and whose constant regions of the light and heavy chains are from a non-murine species, for use in the treatment of primary brain lymphoma (LCP).
  • LCP primary brain lymphoma
  • the murine nucleic acid sequences SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 encode respectively for the variable domain of each of the light chains and the variable domain of each of the heavy chains of the antibody produced by the murine CAT-hybridoma. 13.6E12, available from the Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) under the number ACC 474.
  • This hybridoma produces a murine monoclonal antibody of type lgG2a, K directed against CD20.
  • sequence SEQ ID NO. 1 nevertheless has a nucleic acid residue which differs from the sequence coding for the variable region of the light chain of the antibody produced by the mouse hybridoma CAT-13.6E12.
  • variable regions of the antibodies according to the invention comprise at least 70% identity with the sequences SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2.
  • this sequence identity confers a specificity identity of the antibodies according to the invention with murine antibody CAT-
  • this sequence identity confers an identity target affinity between the antibody according to the invention and the murine antibody CAT-13.6E12.
  • the antibodies used in the first subject of the invention additionally possess constant regions of light and heavy chains belonging to a non-murine species.
  • non-murine mammals are likely to be used, and in particular humans, monkeys, murids (except the mouse), suids, cattle, equines, felids , canids, for example, and birds.
  • variable region of each of the light chains of the antibody used in the invention may be encoded by a sequence having at least 80% identity with the murine nucleic acid sequence SEQ ID NO: 1, and the variable region of each of the heavy chains of the antibody according to the invention may be coded by a sequence having at least 80% identity with the murine nucleic acid sequence SEQ ID NO: 2.
  • the variable region of each of the light chains of the antibody according to the invention may be encoded by a sequence having at least 90% identity with the murine nucleic acid sequence SEQ ID NO: 1, and the variable region of each of the heavy chains of the The antibody according to the invention may be encoded by a sequence having at least 90% identity with the murine nucleic acid sequence SEQ ID NO: 2.
  • variable region of each of the light chains of the antibody used in the invention may be encoded by a sequence having at least 95% identity with the murine nucleic acid sequence SEQ ID NO: 1
  • variable region of each of the heavy chains of the antibody according to the invention may be encoded by a sequence having at least 95% identity with the murine nucleic acid sequence SEQ ID NO: 2.
  • variable region of each of the light chains of the antibody used in the invention may be encoded by a sequence having at least 99% identity with the murine nucleic acid sequence SEQ ID NO: 1, and the variable region of each of the heavy chains of the antibody according to the invention may be coded by a sequence having at least 99% identity with the muhne nucleic acid sequence SEQ ID NO: 2.
  • any antibody having variable regions of their heavy and light chains presenting one or more substitution (s), insertion (s) or deletion (s) of one or more nucleic acids, these sequence modifications corresponding to the percentages of identities sequences as defined above, and not altering the specificity of the antibody for its target, nor its affinity for its target, can be used for the purposes of the invention.
  • the antibodies used in the invention also include any antibody having the CDR (Complementary Determining Region) regions of the CAT-13.6E12 antibody, associated with FR regions not belonging to CAT-13.6E12 (framework, regions very conserved variable regions, also called "framework").
  • CDR Complementary Determining Region
  • Such antibodies have a very comparable affinity and specificity, preferably identical to that of the murine antibody CAT-13.6E12.
  • the antibody is used for the manufacture of a drug, is a monoclonal antibody directed against the CD20 antigen, the variable region of each of the light chains is encoded by the sequence mu SEQ ID NO: 1, the variable region of each of the heavy chains is encoded by the murine nucleic acid sequence SEQ ID NO: 2, and the constant regions of the light and heavy chains are regions. constant from a non-murine species.
  • the term "directed against the CD20 antigen” is intended to mean the capacity of the monoclonal antibody to bind all or part of the CD20 antigen, and in particular the epitope recognized by the EMAB603 antibody, also called R603.
  • the constant regions of each of the light chains and each of the heavy chains of the antibody used in the invention are human constant regions.
  • This preferred embodiment of the invention makes it possible to reduce the immunogenicity of the antibody in humans and thereby improve its effectiveness during its therapeutic administration in humans.
  • the constant region of each of the light chains of the antibody according to the invention is of type K. Any allotype is suitable for carrying out the invention, for example Km (1), Km (1, 2), Km (1, 2, 3) or Km (3) but the preferred allotype is Km (3).
  • the constant region of each of the light chains of the antibody according to the invention is of type ⁇ .
  • the constant region of each of the heavy chains of the antibody is of type ⁇ .
  • the constant region of each of the heavy chains of the antibody may be of type ⁇ 1, of type ⁇ 2, of type ⁇ 3, these three types of constant regions having the particularity of fixing the human complement, or of type ⁇ 4 .
  • Antibodies possessing a constant region of each of the ⁇ heavy chains belong to the IgG class.
  • Immunoglobulin type G (IgG) are heterodimers consisting of 2 heavy chains and 2 light chains, linked together by disulfide bridges.
  • Each chain consists, in the N-terminal position, of a region or variable domain (encoded by the rearranged genes VJ for the light chain and VDJ for the heavy chain) specific for the antigen against which the antibody is directed, and in the C-terminal position of a constant region consisting of a single CL domain for the light chain or 3 domains (CH1, CH2 and CH3) for the heavy chain.
  • a region or variable domain encoded by the rearranged genes VJ for the light chain and VDJ for the heavy chain
  • variable domains and the CH1 and CL domains of the heavy and light chains forms the Fab parts, which are connected to the Fc region by a very flexible hinge region allowing each Fab to bind to its antigenic target while the region Fc, a mediator of the effector properties of the antibody, remains accessible to effector molecules such as the Fc ⁇ R and C1 q receptors.
  • the Fc region incorporated of the 2 globular domains CH2 and CH3, is glycosylated at the level of the CH2 domain with the presence, on each of the two chains, of a biantennary N-glycan of lactosaminic type, linked to Asn 297.
  • the constant region of each of the heavy chains of the antibody is of type ⁇ 1, since such an antibody shows an ability to generate ADCC activity in the largest number of (human) individuals.
  • any allotype is suitable for carrying out the invention, for example G1 m (3), G1m (1, 2, 17), G1m (1, 17) or Glm (1, 3).
  • the allotype is G1 m (1, 17).
  • the constant region of each of the heavy chains of the antibody is of type ⁇ 1, and it is encoded by the human nucleic acid sequence SEQ ID NO: 3, the constant region of each of its light chains being encoded by the human nucleic acid sequence SEQ ID NO: 4.
  • an antibody has a murine variable region and a human constant region, with heavy chains of ⁇ 1 type. This antibody therefore belongs to the subclass of IgG1.
  • the antibody has two light chains whose variable domain is encoded by the murine nucleic acid sequence SEQ ID NO: 1 and the human constant region is coded by the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 4, and two heavy chains whose variable domain is encoded by the murine nucleic acid sequence SEQ ID NO: 2 and the constant region is encoded by the human nucleic acid sequence SEQ ID NO: 3.
  • each of the light chains of the antibody according to the invention is encoded by the murine-human chimeric nucleic acid sequence SEQ ID NO: 5, and each of the heavy chains is encoded by the chimeric nucleic acid sequence.
  • murine-human SEQ ID NO: 6 The murine-human chimeric nucleic acid sequence SEQ ID NO: 5 encoding each of the light chains of the antibody is obtained by fusion of the murine nucleic acid sequence SEQ ID NO: 1 coding for the variable domain of each of the light chains of the antibody and the human nucleic acid sequence SEQ ID NO: 4 encoding the constant region of each of the light chains of the antibody.
  • the murine-human chimeric nucleic acid sequence SEQ ID NO: 6 coding for each of the heavy chains of the antibody is obtained by fusion of the murine nucleic acid sequence SEQ ID NO: 2 coding for the variable domain of each of the heavy chains of the antibody and the human nucleic acid sequence SEQ ID NO: 3 coding for the constant region of each of the heavy chains of the antibody.
  • each of the light chains of the antibody is encoded by the murine-human chimeric nucleic acid sequence SEQ ID NO: 5, and each of the heavy chains is encoded by the sequence of Murine human chimeric nucleic acid SEQ ID NO: 6,
  • the peptide sequence of each of the light chains, deduced from the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 5 is the sequence SEQ ID NO: 7
  • the peptide sequence of each of the heavy chains, deduced from the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 6 is the sequence SEQ ID NO: 8.
  • the amino acid located at position 106 is a lysine (K) in the sequence SEQ ID NO: 7.
  • the antibody used in the invention can be produced by a rat hybridoma cell line.
  • the line producing the antibody according to the invention is an important characteristic since it confers on the antibody some of its particular properties. Indeed, the means of expression of the antibodies is at the origin of the post-translational modifications, in particular modifications of the glycosylation, which may vary from one cell line to another, and thus confer different functional properties on antibodies having identical primary structures.
  • the antibody can be produced in the YB2 / 0 rat hybridoma (YB2 / 3HL.P2.G1.116Ag.20 cell, deposited at the American Type Culture Collection under number ATCC CRL -1662).
  • this line has the ability to produce antibodies with improved ADCC activity compared to antibodies of the same primary structure produced for example in CHO.
  • another antibody according to the invention is the antibody EMAB603 (also called R603) produced by the cell clone R603 deposited on November 29, 2005 under the registration number CNCM 1-3529 in the National Collection. Cultures of Microorganisms (CNCM, Pasteur Institute, 25 rue du Dondel Roux, 75724 Paris Cedex 15).
  • Each of the light chains of the EMAB603 antibody is encoded by the murine-human chimeric nucleic acid sequence SEQ ID NO: 5, and each of the heavy chains is encoded by the murine-human chimeric nucleic acid sequence SEQ ID NO: 6.
  • clone R603 produces an EMAB603 antibody composition having a fucose / galactose ratio of less than 0.6, for which it has been demonstrated in patent application FR 03 12229 that it is optimal for conferring strong ADCC activity to antibodies.
  • This antibody may be particularly useful as a therapeutic tool for the treatment of LCP.
  • An example of an expression vector of an antibody according to the invention is the vector of sequence SEQ ID NO: 17.
  • This vector is a vector allowing the expression of an antibody according to the invention whose light chain is coded by the nucleic acid sequence SED ID NO: 5, whose deduced peptide sequence is the sequence SEQ ID NO: 7, and whose heavy chain is encoded by the nucleic acid sequence SED ID NO: 6, whose sequence deduced peptide is the sequence SEQ ID NO: 8.
  • This vector is a nucleic acid molecule in which the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 5 coding for each of the light chains of the antibody and the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 6 encoding each of the heavy chains of the antibody were inserted, in order to introduce and maintain them in a host cell. It allows the expression of these foreign nucleic acid fragments in the host cell because it has essential sequences (promoter, polyadenylation sequence, selection gene) to this expression.
  • Such vectors are well known to those skilled in the art, and may be an adenovirus, a retrovirus, a plasmid or a bacteriophage, this list not being limiting.
  • the antibody of the invention may be produced by coexpression in a cell of two expression vectors, one for expression of the light chain, and one for expression of the light chain.
  • these vectors possess indispensable sequences (promoter, polyadenylation sequence, selection gene) for this expression.
  • the vectors may be, for example, a plasmid, an adenovirus, a retrovirus or a bacteriophage.
  • the stable cell line expressing an antibody used in the invention is selected from the group consisting of: SP2 / 0, YB2 / 0, IR983F, a human myeloma such as Namalwa or any other cell of human origin such as PERC6, CHO lines, in particular CHO-K-1, CHO-Lec10, CHO-Led, CHO-Lec13, CHO Pro-5, CHO dhfr- (CHO DX B11, CHO DG44), or other lines selected from Wil-2 , Jurkat, Vero, Molt-4, COS-7, 293-HEK, BHK, K6H6, NSO, SP2 / O-Ag 14 and P3X63Ag8.653.
  • SP2 / 0, YB2 / 0, IR983F a human myeloma such as Namalwa or any other cell of human origin such as PERC6, CHO lines, in particular CHO-K-1, CHO-Lec10, CHO-Le
  • the line used is the rat hybridoma YB2 / 0
  • the culture media adapted to these cells are well known to those skilled in the art, and the following are non-exhaustive: RPMI 1640 (The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967) [14]), Eagle's MEM (Science, 122, 501 (1952) [15]), Dulbecco's modified MEM (Virology, 8, 396 ( 1959) [16]), F12 Medium (Proc Natl Acad Sci USA, 53, 288 (1965) [17]), IMDM (J. Experimental Medicine, 147, 923 (1978) [18]), or still those described in EP1229125.
  • the mode of administration of the antibody used in the invention may be intracerebral, for example intratumoral, intrastriatal, intraventricular, intrathecal, or intravenous, intraperitoneal, or subcutaneous.
  • a second subject of the invention relates to a monoclonal antibody directed against an antigen present on the surface of primitive ceral lymphoma cells for its use by intrathecal administration in the treatment of primary brain lymphoma.
  • the term "antigen present on the surface of primary ceral lymphoma cells” is intended to mean any antigen expressed on the extracellular surface of primitive ceral lymphoma cells.
  • the antigen may be selected from CD15, CD19, CD20, CD22, CD30, CD45, CD79a, CD138, MIB-1, MUM-1, or membrane immunoglobulin idiotopes.
  • the term "intrathecal administration route” means any mode of administration allowing the antibody to be introduced into the theca. It may be an administration for example in the sub-rachidian space, in the intraspinal space, or in the cerebrospinal fluid.
  • the antibody of the second subject of the invention may be produced in a cell line as defined above.
  • the constant regions of each of the light chains and each of the heavy chains of the antibody used in the invention may be human constant regions.
  • this embodiment makes it possible to reduce the immunogenicity of the antibody in humans and thereby even to improve its effectiveness during its therapeutic administration in humans.
  • the constant region of each of the heavy chains of the antibody can be encoded by the human nucleic acid sequence SEQ ID NO: 3, and the constant region of each of its light chains. can be encoded by the human nucleic acid sequence SEQ ID NO: 4.
  • this antibody belongs to the subclass of IgG1.
  • the antibody of the second subject of the invention can be produced in the YB2 / 0 rat hybridoma (YB2 / 3HL.P2.G1.1.16Ag.20 cell, deposited at the American Type Culture Collection under number ATCC CRL -1662), as defined above.
  • the antibody of the second subject of the invention may be an antibody specifically to the CD20 antigen, in particular to a human anti-CD20.
  • variable region of each of the light chains of the antibody of the second subject of the invention may be encoded by the murine nucleic acid sequence SEQ ID NO: 1
  • variable region of each of its heavy chains may be coded by the murine nucleic acid sequence SEQ ID NO: 2.
  • the light chains of this antibody can be encoded by the murine-human chimeric nucleic acid sequence SEQ ID NO: 5, and the heavy chains be encoded by the chimeric murine-human nucleic acid sequence SEQ ID NO: 6 .
  • the antibody may thus consist of the amino acid sequence light chains SEQ ID NO: 7 and the amino acid sequence heavy chains SEQ ID NO: 8.
  • the antibody may be produced by the clone R603 deposited under registration number CNCM I-3529 in the National Collection of Cultures of Microorganisms (CNCM).
  • the antibody of the invention may be used in combination with one or more other antibodies, for example monoclonal antibodies (ux), directed against one or more other antigen (s) expressed on lymphoid cells, such as, but not limited to, CD1, CD2, CD3, CD4, CD8, CD1, CD15 antigens , CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD26, CD29, CD30, CD31, CD40, CD43, CD44, CD45, CD49, CD50, CD52, CD53, CD54, CD55, CD58, CD59, CD69 , CD70, CD71, CD79a, CD80, CD81, CD82, CD86, CD95, CD103, CD188, CD19, CD120, CD132, CD138, CD210, CD217.
  • ux monoclonal antibodies
  • the antibody according to the invention can be used in combination with cells expressing FcyRs such as NK cells, NKT cells (Natural Killers T), ⁇ lymphocytes, macrophages, monocytes or dendritic cells, i.e., in combination with cell therapy (Peller S, Kaufman S Blood 1991, 78: 1569 ([8]); E et al., 1989 Leukemia 3 (7): 501-504 ([9]), Soorskaar D et al., 1988 Int Arch Allery Appl Immunol 87 (2), 159-164 ([10]), Ziegler HW et al.
  • FcyRs such as NK cells, NKT cells (Natural Killers T), ⁇ lymphocytes, macrophages, monocytes or dendritic cells, i.e., in combination with cell therapy (Peller S, Kaufman S Blood 1991, 78: 1569 ([8]); E et al., 1989 Leukemia 3 (7): 501-50
  • the antibodies of the invention may allow the formation of memory T lymphocytes. These memory T cells may possess the ability to proliferate, and to reactivate rapidly upon second exposure to tumor cells.
  • the antibodies of the invention may allow infiltration of T cells into the tumor microenvironment, which may induce slowing of tumor growth, and / or better clearance of tumor cells.
  • the antibodies of the invention make it possible to avoid or delay a relapse.
  • a relapse may be the appearance of a second tumor of phenotype similar or identical to that of a first tumor, this first tumor having been treated with the antibodies of the invention.
  • the antibodies of the invention make it possible to avoid or delay a relapse when they are administered intrathecally.
  • such a monoclonal antibody can have a significant antitumor effect.
  • such an antibody may allow tumor cell replication inhibition of at least 20%, or at least 30%, or at least 50%, and preferably at least 60%, or 70% in subject with LCP to which it is administered.
  • the dose of antibody administered to patients may preferably be less than 375 mg / m 2 , 187.5 mg / m 2 , 75 mg / m 2 , at 37.5 mg / m 2 , 15 mg / m 2 , 7.5 mg / m 2 or particularly advantageously below 3.75 mg / m 2 or at 1 mg / m 2 or 0.5 mg / m 2 .
  • the dose administered is advantageously between 187.5 mg / m 2 and 75 mg / m 2 , or between 75 mg / m 2 and 37.5 mg / m 2 , between 75 mg / m 2 and 15 mg / m 2 , between 75 mg / m 2 and 7.5 mg / m 2 or between 75 mg / m 2 and 3.75 mg / m 2 .
  • the dose administered is between 3.75 mg / m 2 and 0.5 mg / m 2 , more particularly between 2 mg / m 2 and 1 mg / m 2 .
  • these doses are administered intravenously, subcutaneously, intracerebrally, for example intra-tumoral, intrastriatal, intraventricular, and / or intrathecal.
  • the amount of antibody administered to the patient may be between 0.001 g and 1000 of antibody, or between 0.001 g and 100 g of antibody, or between 10 g and 100 g of antibody.
  • g of antibody advantageously between 0.01 g and 10 g of antibody, or between 1 g and 10 g, or between 0.01 g and 1 or between 0.01 g and 0.1 g or between 0 0.2 g and 0.08 g of antibody.
  • the administration of the antibody can be done near the tumor, or in the tumor.
  • the administration can be done either at single dose (that is to say single administration), or by repeated injections. If the injections are repeated, each administration may be sufficiently spaced from the previous one for each administration to be considered as a single dose administration. For example, each administration may be spaced at least a week, or at least 2 weeks, at least 3 weeks, or at least 4 weeks, or at least 6 weeks, or at least 10 weeks, or at least 6 months of the previous administration.
  • the antibody can be administered as a medicament according to the standard rules, well known to those skilled in the art, for the treatment of lymphomas.
  • the antibodies used in the invention are cytotoxic.
  • Another object of the invention is the use of an antibody according to the invention, for the manufacture of a medicament for the treatment of LCP.
  • a particular object of the invention relates to a method of treatment using the previously described antibodies of the LCP.
  • the method of treatment comprises the step of administering the antibodies to a patient suffering from LCP, for example intrathecally.
  • the antibody used in the invention is administered with a pharmaceutically acceptable carrier, suitable for the expected therapeutic effect.
  • Another object of the invention is a process for preparing a medicament for the treatment of LCP comprising mixing the monoclonal antibody used in the invention with a pharmaceutically acceptable carrier, and then obtaining the drug.
  • Another object of the invention is a method of therapeutic treatment of LCP, comprising administering to a patient with the need, an antibody or a drug as described above.
  • the administration can be carried out intrathecally.
  • FIG. 1 is the schematic representation of the CKHu vector used for the chimaericization of the kappa light chain of the EMAB603 antibodies.
  • FIG. 2 is the schematic representation of the G1 Hu vector used for the chimericization of the heavy chain of the EMAB603 antibodies.
  • FIG. 3 is the schematic representation of the expression vector of the heavy and light chains used for the production of the R603 antibody.
  • FIG. 4 represents the schematic of intracerebral injections carried out as part of the study of the effect of the buffer containing R603 on tumor growth.
  • D-7 that is 7 days before the intracerebral injection of the treatments, the injection of 2 ⁇ of murine lymphoma B (A20.IIA-GFP-hCD20) tumor cells in suspension, ie 5 ⁇ 10 4 cells, is carried out. .
  • the intracerebral injection is made of 2 ⁇ l of 1 ⁇ PBS (experiment referenced PCL HO2), or 2 ⁇ l of irrelevant anti-P24 monoclonal antibody (experiment referenced PCL HO6), ie 2 ⁇ of R603 buffer.
  • FIG. 5 represents the survival monitoring, in days, for the 4 groups of animals after the implementation of the injection protocol defined above (FIG. 4).
  • Curve A represents the survival of mice treated with the R603 antibody
  • curve B represents the survival of the mice treated with the anti-P24 antibody ( TM * TM ⁇ )
  • curve C represents the mice treated with the antibody PBS 1 X ()
  • curve D represents the survival of the untreated mice ()
  • the statistical test is that of Kaplan-Meier The P value corresponds to the logrank value.
  • FIG. 6 represents the schematic of intracerebral injections carried out as part of the study of the efficacy of the anti-human CD20 antibodies in the mouse model of LCP, according to the experimental protocol n ° 1.
  • D-7 that is 7 days before the intracerebral injection of the treatments, the injection of 2 ⁇ of murine lymphoma B (A20.IIA-GFP-hCD20) tumor cells in suspension, ie 5 ⁇ 10 4 cells, is carried out. .
  • the intracerebral injection is carried out either with 1 ⁇ PBS or with buffer containing different amounts of R603 (ie 1 g, 5 g or 20 g), or rituximab (20 g).
  • FIG. 7 represents the monitoring of the survival, in days, for the 5 groups of animals after the implementation of the injection protocol defined above (FIG. 6).
  • Curve A (- -) represents the survival of the mice treated with the antibody R603 1 g
  • the curve B (- - - -) represents the survival of the mice treated with the antibody R603 5 g
  • the curve C (- ⁇ *) represents the survival of mice treated with the R603 antibody 20 g
  • the D () curve represents the mice treated with the 1 X PBS
  • the E curve represents the survival of the mice treated with rituximab. that of Kaplan-Meier between the treated group and the 1X PBS control group
  • the P value corresponds to the logrank value.
  • FIG. 8 represents the percentage of CD19 + GFP + cells 15 days after the treatment according to experimental protocol No. 2, for the groups of mice treated with either 1 ⁇ PBS or with buffer containing different amounts of R603 (ie 1 g or 5 g, 20 g), or by rituximab (20 g).
  • FIG. 9 represents the survival monitoring, in days, for the 4 groups of animals after the implementation of the experimental protocol No. 3.
  • Curve A (--- ⁇ ⁇ -) represents survival of mice injected with A20.IIA-GFP cells, treated with 1X PBS
  • curve B () represents survival of mice injected with A20 cells.
  • .IIA-GFP-hCD20 treated with 1X PBS
  • curve C (- * -) represents the survival of the mice injected with the A20.IIA-GFP cells, treated with the LFB-R603 antibody 20 ⁇ g
  • the curve D () represents the mice injected with the A20.IIA-
  • FIG. 10 represents the survival monitoring, in days, for the 4 groups of animals after the implementation of experimental protocol No. 4.
  • Curve A represents the survival of the mice injected with A20.IIA-GFP-hCD20 cells, treated with 1 X PBS
  • curve B represents the survival of the mice injected with A20.IIA-GFP-hCD20 cells.
  • the curve C () represents the survival of the mice injected with the A20.IIA-GFP-hCD20 cells, treated with the LFB-R603 antibody 20 ⁇ g intrathecally
  • the D (- * -) curve represents the mice injected with the A20.IIA-GFP-hCD20 cells, treated with the LFB-R603 6.6 mg intravenously antibody.
  • FIG. 1 1 represents the survival monitoring, in days, for the 2 groups of animals after the implementation of the experimental protocol No. 5.
  • Curve A () represents the survival of mice treated with rituximab
  • FIG. 12 represents the follow-up of the survival of the mice after intrastriatal treatment or without intrastriatal treatment with the monoclonal antibody LFB-R603.
  • the result pool is obtained from two independent experiments (PCL_HO-24 and 25).
  • the statistical test is the Log-rank test between the treated group and the PBS 1 X control group.
  • ⁇ - represents the percentage of survival of mice treated with 10 g of LFB-R603 depending on the number of days after tumor implantation
  • the curve represents the percentage of survival of treated mice.
  • FIG. 13 represents the follow-up of the survival of the mice after intrastriatal treatment or without intrastriatal treatment with the rituximab antibody or the monoclonal antibody LFB-R603.
  • the result pool is obtained from two independent experiments (PCL_HO-14 and 15). The statistical test is the Log-rank test between the treated group and the PBS 1X control group.
  • the curve * * represents the percentage survival of the mice of the control group as a function of the number of days after the implantation of the tumor.
  • the curve " - represents the percentage of survival of the mice treated with 10 g / 2 ⁇ l of rituximab depending on the number of days after the implantation of the tumor.
  • the curve represents the percentage survival of the mice treated with 20 g / 2 ⁇ l of rituximab as a function of the number of days after tumor implantation.
  • the curve represents the percentage of survival of the mice treated with 50 g / 2 ⁇ l.
  • the * * * * curve represents the percentage of survival of the mice treated with 20 g of LFB-R603 as a function of the days after the implantation of the tumor.
  • FIG. 14 represents the monitoring of the survival of the mice after treatment or without treatment with the intrathecal monoclonal antibody LFB-R603.
  • the statistical test is the Log-rank test between the treated group and the PBS 1 X control group.
  • the curve * * represents the percentage survival of the mice of the control group as a function of the number of days after the implantation of the tumor.
  • the curve represents the percentage of survival of the mice treated with 10 g / 2 ⁇ l of the R603 antibody as a function of the number of days after the implantation of the tumor.
  • the curve represents the percentage of survival of the mice treated with 20 g / 2 ⁇ l of the antibody R603 as a function of the number of days after the implantation of the tumor.
  • the curve represents the percentage of survival of the mice treated with 20 ⁇ g / 5 ⁇ l of the antibody R603 as a function of the number of days after the implantation of the tumor.
  • the curve represents the percentage of survival of the mice treated with 50 ⁇ g / 5 ⁇ l of R603 in depending on the number of days after the implantation of the tumor.
  • * * * * * * represents the percentage of survival of the mice treated with 20 g of LFB-R603 in the tumor mass as a function of the number of days after the implantation of the tumor.
  • FIG. 15 represents the monitoring of the survival of the mice as a function of time (in days) after a re-administration to the mice of tumor cells.
  • the results are obtained from an independent experiment (PCL_HO21).
  • the stars represent the number of sick mice in each group at the time of the last analysis.
  • ⁇ * ⁇ curve represents the percentage of survival of PBS-treated mice according to the number of days after readministration.
  • the curve represents the percentage of survival of the mice treated with 20 g of LFB-R603 as a function of the number of days after the re-administration.
  • the curve represents the percentage survival of the mice treated with 50 g of rituximab as a function of the number of days after the re-administration.
  • FIG. 16 represents the monitoring of the survival of the mice as a function of time (in days) after a re-administration to the mice of tumor cells.
  • ITH means "intrathecal”
  • IST means "intrastriatal”.
  • the curve * * represents the percentage survival of the PBS-treated mice as a function of the number of days after re-administration.
  • the curve - represents the percentage of survival of the LFB-R603 treated mice in intrathecal as a function of the number of days.
  • the curve represents the percentage of survival of the mice treated with the R603 antibody intrastriatal as a function of the number of days after the implantation of the tumor.
  • the curve represents the percentage of survival of the treated mice. with intrathecal rituximab based on the number of days after tumor implantation.
  • FIG. 17 represents the measurement of the secretion of cytokines by the "cytokine beads array” test.
  • LPC were isolated 14 days after anti-hCD20 therapy and were stimulated (white circles) or not (black circles) with microbeads coated with anti-CD3 / CD28. The supernatants were then recovered and analyzed for the presence of IL-2, IFN ⁇ , IL-4, IL-10 and IL-17A. Each point represents a single brain. Discontinuous bars represent the basic rate for each cytokine.
  • FIG. 18 represents the determination of the luciferase activity of the different clones.
  • RNA of the murine hybridoma CAT-13.6E12 (supplier: DSMZ, ACC 474) producing lgG2a immunoglobulin type K was isolated (RNAeasy kit, Qiagen ref 74104). After reverse transcription, the variable domains of the light (VK) and heavy (VH) chains of the CAT-
  • Kappa specific antisense primer SEQ ID NO: 9
  • Murine G2a specific antisense primer (SEQ ID NO: 10) 5'-CTG AGG GTG TAG AGG TCA GAC TG -3 '
  • Kappa-specific antisense primer SEQ ID NO: 1
  • Murine G2a specific antisense primer SEQ ID NO: 12
  • VH and VK PCR products thus obtained were cloned into the pCR4Blunt-TOPO vector (Zero blunt TOPO PCR cloning kit, Invitrogen, K2875-20) and sequenced.
  • the nucleotide sequence of the VK region of the murine antibody CAT-13.6E12 is indicated under the sequence SEQ ID NO: 1, except the last nucleotide which is replaced by A (AAA instead of AAC).
  • the VK gene belongs to the VK4 family (Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", NIH Publication, 91-3242 (1991) [19]).
  • the nucleotide sequence of the VH region of CAT-13.6E12 is the sequence SEQ ID NO: 2.
  • the VH gene belongs to the VH1 family ([19]).
  • VK sequence cloned into the pCR4Blunt-TOPO sequencing vector was amplified using the following cloning primers: a) VK sense primer (SEQ ID NO: 13)
  • VK antisense primer (SEQ ID NO: 14)
  • This primer joins the murine VK (in italic) and human constant region (CK) sequences (in bold).
  • the underlined sequence corresponds to the Dra III restriction site.
  • This primer joins the murine VK (in italic) and human constant region (CK) sequences (in bold).
  • the underlined sequence corresponds to the Dra III restriction site.
  • the VK PCR product thus obtained contains the sequence coding for the natural signal peptide of the murine antibody CAT-13.6E12, with the mutation AA ⁇ ⁇ AAA (nucleotide framed in the sequence of the antisense primer SEQ ID NO: 14) which corresponds to the mutation N106K compared to the natural sequence VK of CAT-13.6E12.
  • sequence of the light chain of the chimeric antibody EMAB603 encoded by this vector is presented in SEQ ID NO: 5 for the nucleotide sequence and corresponds to the deduced peptide sequence SEQ ID NO: 7.
  • This VK PCR was then cloned between the Spe I and Dra III sites of the light chain chimeric vector (FIG 1) which corresponds to the sequence SEQ ID NO: 1, 5 'of the human CK constant region, whose sequence nucleic sequence is SEQ ID NO: 4.
  • the human CK sequence of this chimerization vector was previously modified by silent mutagenesis to create a Dra III restriction site to allow the cloning of murine VK sequences.
  • This chimerization vector contains an RSV promoter and a bGH (Growth Hormone) polyadenylation sequence as well as the dhfr (dihydrofolate reductase) selection gene.
  • VH sequence cloned into the pCR4Blunt-TOPO vector was first amplified using the following cloning primers:
  • VH antisense primer SEQ ID NO: 16
  • This primer joins the murine VH sequences (in italics) and the human Gl constant region (in bold).
  • the underlined sequence corresponds to the Apa I restriction site.
  • the amplified VH fragment contains the sequence encoding the natural signal peptide of the murine antibody CAT-13.6E12.
  • This VH PCR was then cloned between the Spe I and Apa I sites of the heavy chain chimeric vector (FIG 2) which corresponds to the sequence SEQ ID NO: 2, 5 'of the human ⁇ constant region whose nucleic sequence is the sequence SEQ ID NO: 3.
  • This chimerization vector contains an RSV promoter and a bGH (bovine Growth Hormone) polyadenylation sequence as well as the neo selection gene.
  • sequence of the heavy chain of the chimeric antibody EMAB603 encoded by this vector is presented in SEQ ID NO: 6 for the nucleotide sequence and in sequence SEQ ID NO: 8 for the deduced peptide sequence.
  • a single expression vector containing the two heavy chain and light chain transcription units of the anti-CD20 EMAB-603 antibody was constructed from both the light chain and the chain chimerization vectors.
  • HK463-25 FDA
  • the YB2 / 0 rat line (ATCC # CRL-1662) was cultured in EMS medium (Invitrogen, ref 041 -95181M) containing 5% fetal calf serum (JRH Biosciences, ref 12107). For transfection, 5 million cells were electroporated (Biorad electroporator, model 1652077) in Optimix medium (Equibio, reference EKITE 1) with 25 ⁇ g of light chain vector, pRSV-HL-EMAB-603 for the expression of EMAB603 antibody. The electroporation conditions applied were 230 volts and 960 microfarads for a 0.5 ml cuvette. Each electroporation cuvette was then distributed over
  • transfectants producing the most antibodies were amplified in P24 plates and their supernatant redosed by ELISA in order to estimate their productivity and to select the 3 best producers for limiting dilution cloning (40 cells / plate).
  • the R603 clone was selected for the production of the EMAB603 chimeric antibody and progressively adapted to the CD Hybridoma production medium (Invitrogen, ref 1 1279-023).
  • the production of chimeric EMAB603 antibodies was carried out by expansion of the adapted culture in CD Hybridoma medium, obtained by dilution at 3 ⁇ 10 5 cells / ml in flasks of 75 cm 2 and 175 cm 2 and then by dilution at 4.5 ⁇ 10 5 cells / ml. in roll-type bottle. After reaching maximum volume, culture was continued until cell viability was only 20%.
  • chimeric EMAB603 antibodies were purified by protein A affinity chromatography (purity estimated by HPLC ⁇ 95%) and monitored by polyacrylamide gel electrophoresis.
  • a murine B cell lymphoma cell transfected with a human CD20 fusion protein (previously cloned from the Raji cell line) and GFP (Green Fluorescent Protein) is used by a system. electroporation. These cells transfected with human CD20 are called A20.IIA-GFP-hCD20, whereas cells not transfected with human CD20 are called A20.IIA-GFP.
  • Adult mice are called A20.IIA-GFP-hCD20, whereas cells not transfected with human CD20.
  • mice (Charles River Laboratory, L'ArbresIe Cedex France), aged 6 to 8 weeks, are acclimated for at least one week after their date of reception. A first intracerebral injection is made between the seventh and eighth week after their reception. Sterile food and filtered water are administered ad libitum. Sterile litter cages are replaced weekly.
  • the antibody R603 in a batch solution G097 / CD20 / FC001 at 10 mg / ml. A dilution is carried out in the buffer 10808108.
  • the antibody R603 (also called EMAB603) is directed against human CD20 (anti-hCD20),
  • mice are anesthetized with an intraperitoneal injection of 60 ⁇ l of ketamine / xylazine diluted in sterile 1 ⁇ PBS (saline phosphate buffer or "Phosphate Buffer Saline").
  • the animals are then placed in a stereotactic frame (Kopf®), then an incision of the skin of the skull is made and the surface of the bone is wiped.
  • a perforation of the cranial bone is performed above the site chosen for injection of tumor cells (2 mm median right / 0.4 mm front bregma), then a needle gauge 26 is slowly introduced into the brain (2.5 mm deep from the surface of the brain).
  • A20.IIA-GFP-hCD20 tumor cells diluted in 2 ⁇ l with 1 X PBS are injected (0.5 ⁇ / min), then the needle is slowly withdrawn from the brain (0.5 mm / 30sec). Finally, the wound is sutured with Ethicon® thread and the skin is disinfected.
  • A20.IIA-GFP-hCD20 or A20.IIA-GFP tumor cells diluted in 2 ⁇ l with 1 X PBS are injected at a specific location of the brain: the right striatum of each adult mouse.
  • Each mouse is treated with one of the three antibodies seven days after the injection of tumor cells has been performed (see Figures 4, 6 and 8).
  • the animals are weighed twice a week, and their general behavior (after isolation of the group) and their appearance (bristly hair, visible tumor, cachexia) are observed.
  • mice For experiments designed to study the immunological microenvironment after the treatment of mice with antibodies directed against human CD20 (anti-hCD20) in the LCP model, the mice are sacrificed by cervical dislocation and several organs are removed.
  • anti-hCD20 human CD20
  • the brain is removed and placed in a receptacle containing 6 wells with RPMI medium (Roswell Park Memorial Institute medium). Brain cells are prepared by dissociation with surgical scissors. After dissociation, the cell suspension is dissociated every 30 minutes in 2 ml of RPMI medium at 0.4 ⁇ / ⁇ , containing Liberase® (Roche Diagnostics) at 0.1 ⁇ / ⁇ and DNase I, and filtered through a membrane 70 ⁇ (BD Falcon) for remove the largest contaminants. Then, in order to separate the cells from myelin, a Percoll gradient is made and the cells are placed on a 96-well plate for FACS analysis ("Fluorescence activated cell sorter").
  • FACS analysis Fluorescence activated cell sorter
  • the spleen is removed and placed in a 6-well receptacle containing 1X PBS.
  • the spleen cells are prepared by dissociation between two frozen microscope slides. After dissociation, the cell suspension is filtered through a 70 ⁇ membrane (BD Falcon) to remove the largest contaminants. The cells are then placed in a 96-well plate for FACS analysis.
  • the eyes are removed and cleaned by removal of the conjunctiva and optic nerve.
  • Each collected eye is placed in a 24-well receptacle containing 1X PBS. They are dissected to remove the lens. Then the eyes are placed in a new well containing 1X PBS.
  • the whole eye except the lens is preserved for dissociation for 30 minutes in 500 ⁇ l of RPMI medium at 0.4 ⁇ 9 / ⁇ l, containing Liberase. ® (Roche Diagnostics) at 0.1 ⁇ 9 / ⁇ and DNase I.
  • the cell suspension is filtered through a 70 ⁇ membrane (BD Falcon) to remove larger contaminants. Then the cells are placed on a 96-well plate for FACS analysis.
  • the cervical and inguinal ganglia are removed and placed in a 96-well receptacle containing 500 ⁇ l of 1 ⁇ PBS. They are dissociated for 30 minutes in 500 ⁇ l of PBS 1 ⁇ 0.4 ⁇ 9 / ⁇ l, containing Liberase® (Roche Diagnostics) at 0.1 ⁇ 9 / ⁇ and DNase I. After dissociation, the cell suspension is filtered through a membrane 70 ⁇ (BD Falcon) to remove the largest contaminants. Then the cells are placed on a 96-well plate for FACS analysis. FACS analysis
  • the data are acquired using the 1-color flow cytometer (LSRII, BD Biosciences) and the analyzes carried out with the associated software (Diva, BD Biosciences).
  • LSRII 1-color flow cytometer
  • the analyzes carried out with the associated software (Diva, BD Biosciences).
  • 10 6 cells from the previously prepared cell suspension are introduced into the 96-well plate.
  • the Fcy murine receptors are first saturated with the antibody 2.4G2 (anti-CD16 / CD32 monoclonal antibody).
  • the cells are then incubated with a mixture containing the following antibodies: the murine anti-CD19 / APC antibody (expressed by the tumor cells and the endogenous B lymphocytes) (6D5; e-Bioscience), the murine anti-CD4 antibody / PETR (expressed by CD4 + lymphocytes) (GK1.5, BD Biosciences), and murine anti-CD8 / AF400 antibody (expressed by CD8 + lymphocytes) (53-6.7, BD Biosciences).
  • Live cells are defined using the Cell Scatter (SSC) and Forward Scatter (FSC) cells, after exclusion of autofluorescence and cell doublets.
  • mice are compared by:
  • mice are compared by:
  • mice treated with 2 ⁇ l of 1X PBS,
  • mice treated with 2 ⁇ l of anti-P24 antibody.
  • mice receives a tumor injection followed 7 days later by an injection of 1X PBS (PCL HO2) or buffer containing the R603 antibody or the anti-P24 antibody (PCL HO6) (except for the non-group). treated) (see Figure 4).
  • FIG. 5 represents the monitoring of the survival for the 4 groups of animals after the implementation of the injection protocol defined above.
  • the results come from a pool of six independent experiments: PCL HO2, PCL HO3, PCL HO4, PCL HO6, PCL HO8 and PCL HO9.
  • mice are treated with 2 ⁇ l of 1 ⁇ PBS,
  • mice are treated with the antibody R603 at 1 Mg / 2 l,
  • mice are treated with the R603 antibody at 5 mg / 2 l,
  • mice are treated with the antibody R603 at 20 Mg / 2 l,
  • mice are treated with rituximab antibody at 20 g / 2 l.
  • Each group receives a tumor injection followed 7 days later by a therapeutic injection (see Figure 6).
  • mice are treated with 2 ⁇ l of 1 ⁇ PBS,
  • mice are treated with rituximab at 2 g / 2 l,
  • mice are treated with the antibody R603 at 20 Mg / 2 l,
  • mice are treated with rituximab at 5 mg / 2 l,
  • mice are treated with rituximab at 1 g / 2 l.
  • Each group receives a tumor injection followed by a single therapeutic injection 7 days later.
  • FIG. 8 represents the percentage of tumor cells 15 days after the treatment and according to the doses of human anti-CD20 antibodies injected.
  • FIG. 8 represents the percentage of tumor cells 15 days after the treatment and according to the doses of human anti-CD20 antibodies injected.
  • a very significant anti-tumor effect of R603 at 20 ⁇ g / 2 l is obtained
  • mice receive the A20.IIA-GFP-hCD20 tumor cells and are treated with PBS 1 X 2 ⁇
  • mice receive the A20.IIA-GFP tumor cells and are treated with 1 ⁇ 2 PBS ⁇
  • mice receive the A20.IIA-GFP tumor cells and are treated with 1 ⁇ 2 PBS ⁇
  • mice receive the A20.IIA-GFP-hCD20 tumor cells and are treated with the LFB-R603 antibody at 20 ⁇ g,
  • mice receive the A20.IIA-GFP-hCD20 tumor cells and are treated with 20 g of LFB-R603 antibody.
  • Each group receives the A20.IIA-GFP-hCD20 or A20.IIA-GFP tumor cells (2 ⁇ l of cell suspension at 5 ⁇ 10 4 cells) intracerebrally and then a single intracerebral therapeutic injection seven days later.
  • mice five mice are treated by intravenous injection with 2 ⁇ l of 1 ⁇ PBS,
  • mice five mice are treated by intracerebral injection with the LFB-R603 antibody at 20 ⁇ g,
  • mice are treated intrathecally with the LFB-R603 antibody at 20 ⁇ g,
  • mice are treated intravenously with the LFB-R603 antibody at 6.6 mg.
  • Each group receives a tumor injection of 2 ⁇ l of cell suspension with 5 ⁇ 10 4 of A20.IIA-GFP-hCD20 cells, followed seven days later by a single intracerebral, intrathecal or intravenous therapeutic injection.
  • Intracerebral (intrastriatal) administration and intrathecal administration of 20 g of LFB-R603 antibody showed a similar therapeutic effect up to 80 days of treatment. However, because of the low number of smiles in these groups (n ⁇ 5), the statistical test was not performed. Some animals treated with intrathecal or intravenous injection are included in another experiment to increase the total number of mice in each group.
  • mice For this experimental protocol, the following five mice are concerned:
  • mice treated with 20 g of LFB-R603 antibody. Each surviving mouse receives, after the hundredth day following the treatment, a new injection of 2 ⁇ l of cell suspension with 5 ⁇ 10 4 of A20.IIA-GFP-hCD20 tumor cells in the left contralateral striatum, without any further treatment.
  • mice treated with the LFB-R603 antibody An increased survival is obtained for the mice treated with the LFB-R603 antibody since 50% of these mice are still alive 60 days after the re-injection of A20.IIA-hCD20 tumor cells without new treatment.
  • the untreated control mice at the first injection die between 20 and 40 days after injection of the tumor cells.
  • the mouse treated with riruximab and re-injected with tumor cells died 48 days after re-injection of tumor cells without further treatment.
  • adaptive memory (on T and / or B cells) is observed and could be involved in the longer survival of the mice having undergone a second injection of tumor cells, without this hypothesis on the mechanism of action of the antibodies. binds the Claimant in some way.
  • Example 4 Dose-response experiments, intrathecal administration, effect of successive intrastriatal injections and on the immune memory response of LFB-R603
  • a murine B cell lymphoma cell transfected with a human CD20 fusion protein (previously cloned from the Raji cell line) and GFP (Green Fluorescent Protein) was used by an electroporation system. These cells transfected with human CD20 are called A20.IIA-GFP-hCD20, whereas cells not transfected with human CD20 are called A20.IIA-GFP.
  • mice expressing the highest levels of GFP and human CD20 are then sorted, subcloned by limiting dilution and a new A20.IIAGFP-hCD20 cell clone is generated and is called "A20.IIA-GFP-hCD20 (cl. .20) ".
  • Adult mice are then sorted, subcloned by limiting dilution and a new A20.IIAGFP-hCD20 cell clone is generated and is called "A20.IIA-GFP-hCD20 (cl. .20) ".
  • mice (Charles River Laboratory, L'ArbresIe Cedex France), aged 6 to 8 weeks, are acclimated for at least one week after their date of reception. A first intracerebral injection is made between the seventh and eighth week after their reception. Sterile food and filtered water are administered ad libitum. Sterile litter cages are replaced weekly.
  • Antibody The following four antibodies (LFB, Les Ulis, France) are used:
  • the antibody R603 in a stock solution G097 / CD20 / FC001 at 10 mg / ml or a batch solution at 125 g / l. A dilution is carried out in the buffer 10808108.
  • the antibody R603 (also called EMAB603) is directed against human CD20 (anti-hCD20),
  • the rituximab antibody (anti-hCD20), in batch M59753 and storage solution N40626 at a concentration of 10 mg / ml.
  • mice are anesthetized with an intraperitoneal injection of 60 ⁇ l of ketamine / xylazine diluted in sterile 1 ⁇ PBS (saline phosphate buffer or "Phosphate Buffer Saline").
  • the animals are then placed in a stereotactic frame (Kopf®), then an incision of the skin of the skull is made and the surface of the bone is wiped.
  • a perforation of the cranial bone is performed above the site chosen for the injection of the tumor cells (2 mm median right / 0.4 mm front bregma), then a gauge needle 26 is introduced slowly into the brain (2, 5 mm deep from the surface of the brain).
  • A20.IIA-GFP-hCD20 tumor cells diluted in 2 ⁇ l with 1 X PBS are injected (0.5 ⁇ / min), then the needle is slowly withdrawn from the brain (0.5 mm / 30sec). Finally, the wound is sutured with Ethicon® thread and the skin is disinfected.
  • mice are anesthetized with an intraperitoneal injection of 60 ⁇ l of ketamine / xylazine diluted in sterile 1 ⁇ PBS, and placed in a stereotactic frame. An incision of the skin is made above the cerebellum to the cervical region. The muscle fibers are gently displaced to reveal the cisterna magna. A gauge needle 26 is introduced into the cisterna and the solution, in a maximum volume of 5 ⁇ , is slowly injected. The needle is removed slowly, and the wound is sutured and disinfected.
  • mice For experiments designed to study the immunological microenvironment after the treatment of mice with antibodies directed against human CD20 (anti-hCD20) in the LCP model, the mice are sacrificed by cervical dislocation and several organs are removed.
  • anti-hCD20 human CD20
  • RPMI medium Roswell Park Memorial Institute medium
  • Brain cells are prepared by dissociation with surgical scissors. After dissociation, the cell suspension is dissociated every 30 minutes in 2 ml of RPMI medium at 0.4 ⁇ g / ⁇ l, containing Liberase® (Roche Diagnostics) at 0.1 g / ⁇ l and DNase I, and filtered through a 70 ⁇ (BD Falcon) membrane to remove larger contaminants. Then, in order to separate the cells from myelin, a Percoll gradient is made and the cells are placed on a 96-well plate for FACS analysis ("Fluorescence activated cell sorter"). Missed
  • the spleen is removed and placed in a 6-well receptacle containing 1X PBS.
  • the spleen cells are prepared by dissociation between two frozen microscope slides. After dissociation, the cell suspension is filtered through a 70 ⁇ membrane (BD Falcon) to remove the largest contaminants. The cells are then placed in a 96-well plate for FACS analysis. eyes
  • the eyes are removed and cleaned by removal of the conjunctiva and optic nerve.
  • Each collected eye is placed in a 24-well receptacle containing 1X PBS. They are dissected to remove the lens. Then the eyes are placed in a new well containing 1 X PBS.
  • the entire eye except the lens is preserved for dissociation for 30 minutes in 500 ⁇ l of RPMI medium at 0.4 ⁇ / ⁇ l, containing Liberase. ® (Roche Diagnostics) at 0.1 ⁇ / ⁇ and DNase I.
  • the cell suspension is filtered through a 70 ⁇ membrane (BD Falcon) to remove larger contaminants. Then the cells are placed on a 96-well plate for FACS analysis.
  • the cervical and inguinal ganglia are removed and placed in a 96-well receptacle containing 500 ⁇ l of 1 ⁇ PBS. They are dissociated for 30 minutes in 500 ⁇ l of PBS 1 ⁇ 0.4 ⁇ 9 / ⁇ l, containing Liberase® (Roche Diagnostics) at 0.1 ⁇ 9 / ⁇ and DNase I. After dissociation, the cell suspension is filtered through a 70 ⁇ membrane (BD Falcon) to remove the largest contaminants. Then the cells are placed on a 96-well plate for FACS analysis.
  • the data are acquired using the FACSCalibur flow cytometer (BD Biosciences) and the analyzes performed with the accompanying software (CelIQuest Pro, BD Biosciences).
  • the markings are carried out in 96-well plates. About 10 6 cells per well are incubated with a 2.4G2 antibody (anti-CD16 / CD32 mAb) to saturate the Fcy murine receptors. The cells are then incubated with one of the following antibodies: a human anti-CD20 mouse antibody coupled to R-PE (R-Phycoerythrin) or APC (Allophycocyanin) clone 2H7, BD Biosciences), or their respective control isotype (isotype of mouse lgG2b control, BD). Live cells are defined using the Side Scatter detector (SSC) and Forward Scatter (FSC), after exclusion of autofluorescent / doublet cells.
  • SSC Side Scatter detector
  • FSC Forward Scatter
  • tumor cells A20.IIA-GFP-hCD20 or A20.IIA-GFP or A20.IIA-GFP-hCD20 cl. Diluted in 2 ⁇ l with 1 X PBS are injected at a specific brain location: the right striatum of each adult mouse.
  • Each mouse is treated with one of the three antibodies seven days after the injection of tumor cells has been performed (see Figures 4, 6 and 8), unless otherwise indicated.
  • the animals are weighed twice a week, and their general behavior (after isolation of the group) and their appearance (bristly hair, visible tumor, cachexia) are observed every day.
  • the brain cells are collected, cultured for 36 hours (10 5 cells in 200 ⁇ l) and stimulated or not with anti-CD3 / CD28 microbeads (Dynabeads Dynal). The supernatants are then analyzed for the simultaneous presence of eleven murine cytokines ( ⁇ -1 ⁇ , IL-2, IL-4, IL-6, IL-9, IL-10, IL-12p70, IL-17A, IFN ⁇ , TNF ⁇ ). , GM-CSF) by flow cytometry as recommended by the manufacturer (CBA, BD Biosciences). Data acquisition is done on an LSR II flow cytometer using Diva software (BD Biosciences).
  • mice are compared by the Kaplan-Meier test using the Log-rank statistical test. 4.3.1 Study of the efficacy of high doses of LFB-R603 antibodies in the LCP murine model
  • Each group is injected with tumor cells (except the control group), followed 7 days later by injection of 1X PBS (control and untreated group) or LFB-R603 mAB.
  • mice treated with 10 g of LFB-R603 mAb and 30% of mice treated with 20 g of LFB-R603 mAb show no signs of disease and are still alive. 100 days after the implantation of the tumor.
  • mice treated with 2 ⁇ l of 1X PBS,
  • mice treated with LFB-R603 at 20 g / 2 ⁇ l
  • mice treated with LFB-R603 at 50 g / 5 ⁇ l
  • mice For untreated groups, all animals died 52 days after tumor implantation. At doses of 20 to 100 g, 18%, or 5 of 27 mice (two treated with 20 g or 100 g and one treated with 50 g) reject their tumor and are still alive 90 days after implantation of the tumor. No statistical difference can be measured between the 3 groups, suggesting that the 20g dose of LFB-R603 gives the highest effect against brain tumor of mice.
  • mice treated with 2 ⁇ l of 1X PBS,
  • mice treated with rituximab at 20 g / 2 ⁇ _,
  • mice treated with rituximab at 50 g / 5 ⁇ l 5 mice treated with rituximab at 50 g / 5 ⁇ l
  • mice treated with LFB-R603 at 20 g / 2 ⁇ l.
  • Each group is injected with A20.IIA-GFP-hCD20 cells (except the control group), followed seven days later by 1X PBS (control group and untreated group) or therapeutic injection.
  • Each group receives an intratumoral injection followed seven days later by a single therapeutic injection. Except for the last group receiving the antibodies directly into the tumor mass, all the other mice are treated by injection into cisterna magna (intrathecal injection) A group of control mice injected with PBS in place of the tumor cells and treated with PBS is also included.
  • mice 40% of the mice (2/5) treated with 10 g of antibody showed no sign of disease on day 1 10.
  • all the mice in a final volume of 2 ⁇ _ died on day 77 whereas those treated with a final volume of 5 ⁇ _, 20% survived.
  • two mice (40%) receiving 50 g of LFB-R603 appear to have rejected their tumor.
  • mice injected with 20 g of intracerebral therapeutic antibody showed no significantly improved survival time compared to the intrathecal group, but 40% of mice also shed their tumor.
  • R603 is able to eliminate intracerebral lymphoma after intrathecal injection.
  • a volume of 5 ⁇ _ is more effective than a volume of 2 ⁇ _, which may be due to the reflux observed during the injection of China ink.
  • Each group received a tumor injection followed seven days later by a single therapeutic injection in cisterna magna (intrathecal injection) in a final volume of 2 ⁇ l (PCL_HO26) or 5 ⁇ l (PCL_HO27).
  • PCL_HO26 2 ⁇ l
  • PCL_HO27 5 ⁇ l
  • Each treated group receives a tumor injection followed by a single intrathecal therapeutic injection seven days later, as for the other experiments, a group of five control mice is included.
  • mice In comparison with the different groups treated with rituximab, in the group treated with LFB-R603, all the mice are still alive 55 days after the tumor implantation. Two mice died on days 57 and 61, and one mouse 66 days after tumor implantation.
  • Each group receives a tumor injection followed by a single therapeutic intrathecal injection seven days later.
  • a group of five control mice receiving an injection with PBS alone is included.
  • mice treated once with 20 g / 2 ⁇ l LFB-R603 and then with PBS
  • mice of the previous experiments are as follows:
  • Each surviving mouse receives 100 days after the first tumor implantation, a new implantation of A20.IIA-GFP-hCD20 tumor cells injected into the left contralateral striatum, without any new treatment.
  • mice treated intrathecally with LFB-R603 from the PCL_HO16 experiment (1 mouse with 10 g, 1 mouse with 20 g and 2 mice with 50 g of antibody)
  • mice treated intratumorally with LFB-R603 from experiment PCL_HO16 (20 ⁇ g of antibody)
  • mice treated intratumorally with LFB-R603 from experiment PCL_HO17 (1 with 10 ⁇ g and 2 with 20 ⁇ g of antibody)
  • mice treated intratumorously with LFB-R603 from experiment PCL_HO18 (1 with 20 g of antibody then PBS and the other mouse treated twice with 20 g of antibody)
  • mice treated in intrathecal with rituximab of the PCL_HO16 experiment (3 mice at 10 g and 1 mouse at 20 g of antibody)
  • Each surviving mouse receives 120 days after their first tumor implantation a new injection of A20.IIA-GFP-hCD20 tumor cells (key 20) into the left contralateral striatum, without any new treatment.
  • mice 3 groups of 5 mice per group are included. All mice receive the tumor on day 1 and are treated 7 days later as follows:
  • the brains are collected and the brain cells isolated and each sample divided into 2.
  • the cells are cultured for 36 hours with (first half) or without (second half) anti-CD3 / CD28 stimulation.
  • the presence of different cytokines is evaluated in the supernatants by a cytokine bead assay.
  • Figure 17 shows cytokine secretion by brain cells 14 days after anti-hCD20 therapy.
  • all cytokines can be detected but at a low level, showing the tumor-inhibiting environment.
  • NL-2 and inflammatory cytokines IFNg and IL-17A are greatly increased, reflecting infiltration by Th1 and / or Th17 phenotype T cells. Stimulation is almost identical in animals treated with rituximab.
  • animals treated with LFB-R603 do not give the same results: in these animals, no cytokine can be measured at a high level, and anti-CD3 / CD28 stimulation does not make it possible to increase the concentration.
  • the surviving cells are cultured under selection pressure.
  • the resistant cells are cloned by limiting dilution. 42 clones are obtained and are tested for their expression of the hCD20 antigen by flow cytometry.
  • the 10 clones tested expressing the high levels of hCD20 are selected and analyzed for the presence of the luciferase protein by luminescence analysis.
  • Figure 18 shows the luciferase activity of clones obtained after transfection of A20.IIA-GFP-hCD20 cells (cl.20) with a vector coding for the Iuc2 gene. 2 clones undoubtedly express the luciferase gene.

Abstract

The present invention relates to a monoclonal antibody directed against the CD20 antigen, the variable region of each of the light chains of which is encoded by the murine nucleic acid sequence SEQ ID NO: 1, the variable region of each of the heavy chains of which is encoded by the murine nucleic acid sequence SEQ ID NO: 2, and the constant regions of the light chains and of the heavy chains of which come from a nonmurine species, for use thereof in the treatment of primary cerebral lymphoma. The present invention also relates to an antibody directed against an antigen present at the surface of primary cerebral lymphoma cells, for use thereof via intrathecal administration in the treatment of primary cerebral lymphoma.

Description

UTILISATION D'UN ANTICORPS ANTI-CD20 POUR LE TRAITEMENT DU LYMPHOME CÉRÉBRAL PRIMITIF DESCRIPTION  USE OF ANTI-CD20 ANTIBODY FOR THE TREATMENT OF BRAIN LYMPHOMA PRIMITIVE DESCRIPTION
Domaine technique Technical area
La présente invention se rapporte à l'utilisation d'anticorps monoclonaux pour le traitement du lymphome cérébral primitif (également appelé « lymphome cérébral primaire »).  The present invention relates to the use of monoclonal antibodies for the treatment of primary cerebral lymphoma (also called "primary cerebral lymphoma").
L'invention trouve ses applications industrielles notamment dans le domaine médical.  The invention finds its industrial applications particularly in the medical field.
Dans la description ci-dessous, les références entre crochets ([ ]) renvoient à la liste des références présentée après les exemples. In the description below, references in brackets ([]) refer to the list of references after the examples.
Etat de la technique State of the art
L'antigène CD20 est une protéine transmembranaire hydrophobe d'un poids moléculaire de 35-37 kDa présente à la surface des lymphocytes B matures (Valentine et al. (1987) Proc Natl Acad Sci U S A. 84 (22) : 8085-9  The CD20 antigen is a hydrophobic transmembrane protein with a molecular weight of 35-37 kDa present on the surface of mature B cells (Valentine et al (1987) Proc Natl Acad Sci U S A. 84 (22): 8085-9
[1]; Valentine et al. (1989) J.Biol. Chem. 264 (19) : 1 1282-1 1287 [2]). Il est exprimé au cours du développement des lymphocytes B dès le stade pré-B précoce et ce jusqu'à la différenciation en plasmocyte, stade où cette expression disparaît. L'antigène CD20 est présent à la fois sur les lymphocytes B normaux et sur les cellules B malignes. Plus particulièrement, l'antigène CD20 est exprimé sur la plupart des lymphomes de phénotype B (80% des lymphomes) : il est exprimé par exemple sur plus de 90% des lymphomes non-Hodgkiniens (NHL) de lymphocytes B. [1]; Valentine et al. (1989) J. Biol. Chem. 264 (19): 1282-1 1287 [2]). It is expressed during the development of B lymphocytes from the early pre-B stage to differentiation into a plasmocyte, a stage in which this expression disappears. The CD20 antigen is present on both normal B cells and malignant B cells. More particularly, the CD20 antigen is expressed on most B-cell lymphomas (80% of lymphomas): it is expressed for example on more than 90% of non-Hodgkin's lymphoma (NHL) of B lymphocytes.
La fonction du CD20 n'est pas encore totalement élucidée, mais il pourrait agir comme un canal calcique et intervenir dans la régulation des premières étapes de la différenciation (Golay et al. (1985) J. Immunol.; 135(6) :3795-801 [3]) et de la prolifération des lymphocytes B (Tedder et al. (1986) Sur J. Immunol . 1986 Aug;16(8) :881 -7 [4]). The function of CD20 is not yet fully understood, but it could act as a calcium channel and intervene in the regulation of the first stages of differentiation (Golay et al (1985) J. Immunol .; 135 (6): 3795-801 [3]) and B cell proliferation (Tedder et al (1986) J. Immunol 1986 Aug; 16 (8): 881-7 [4]).
Ainsi, bien qu'il subsiste des incertitudes quant à son rôle dans l'activation et la prolifération des lymphocytes B, l'antigène CD20 est, de par sa localisation, une cible importante pour le traitement des pathologies impliquant des lymphocytes B tumoraux, comme par exemple les NHL ou la LLC-B (leucémie lymphoïde chronique B) par des anticorps reconnaissant spécifiquement le CD20. De plus, cet antigène est une cible idéale car il s'agit d'une protéine membranaire pour laquelle on ne connaît pas de modulation d'expression ou de polymorphisme.  Thus, although there is still uncertainty as to its role in the activation and proliferation of B lymphocytes, the CD20 antigen is, by its location, an important target for the treatment of pathologies involving tumor B cells, such as for example, NHL or B-CLL (chronic lymphocytic leukemia B) by antibodies specifically recognizing CD20. In addition, this antigen is an ideal target because it is a membrane protein for which no modulation of expression or polymorphism is known.
Un seul anticorps monoclonal anti-CD20 non radiomarqué, le rituximab (Genentech), est actuellement disponible sur le marché, pour le traitement des lymphomes de cellules B. Il montre chez les patients atteints de NHL des résultats cliniques encourageants lorsqu'il est associé à une chimiothérapie. Toutefois, son efficacité reste variable et souvent modeste lorsqu'il est utilisé comme agent unique (Teeling et al. (2004) Blood 104(6).-1793-800, [5]).  A single radiolabelled anti-CD20 monoclonal antibody, rituximab (Genentech), is currently available on the market for the treatment of B-cell lymphoma. In NHL patients, it shows encouraging clinical results when combined with chemotherapy. However, its effectiveness remains variable and often modest when used as a single agent (Teeling et al (2004) Blood 104 (6) .- 1793-800, [5]).
Les lymphomes cérébraux primitifs (LCP) sont des lymphomes non hodgkiniens se développant dans le cerveau, éventuellement dans la moelle épinière, les méninges et l'œil, en l'absence de toute autre localisation systémique. Les LCP représentent environ 1 % des lymphomes non hodgkininens et 5% de l'ensemble des tumeurs cérébrales. L'existence d'une immunodépression est un facteur favorisant, qu'elle soit congénitale ou acquise.  Primary brain lymphomas (PCL) are non-Hodgkin's lymphomas that develop in the brain, possibly in the spinal cord, meninges and the eye, in the absence of any other systemic location. PCL accounts for about 1% of non-Hodgkin's lymphomas and 5% of all brain tumors. The existence of immunosuppression is a contributing factor, whether congenital or acquired.
Les LCP de l'immunocompétent sont, dans plus de 80% des cas, des lymphomes non hodgkiniens de type B et de grande malignité (ou à grandes cellules). Les différents sous-types histologiques sont de fréquence très variables dans la littérature en raison du caractère polymorphe de ces tumeurs ; ils sont toutefois classés dans le cadre des lymphomes B diffus à grandes cellules. Les LCP des patients immunocompétents se distinguent dans la majorité des cas de ceux des patients immunodéficients par l'absence de nécrose et un type histologique le plus souvent centroblastique polymorphe. Les LCP peuvent survenir chez l'adulte immunocompétent à tout âge mais avec une prédilection chez le sujet âgé, l'âge médian de survenue se situant entre 50 et 60 ans. Chez l'immunodéprimé, l'âge médian se situe autour de 30 ans. More than 80% of the immunocompetent LCPs are non-Hodgkin's type B lymphomas with large malignancies (or large cells). The different histological subtypes are very variable in the literature because of the polymorphic character of these tumors; however, they are classified in the context of diffuse large B cell lymphoma. The LCP of immunocompetent patients are distinguished in the majority of cases from those of immunodeficient patients by the absence of necrosis and a histological type most often polymorphic centroblastic. LCP can occur in adults immunocompetent at any age but with a predilection in the elderly, the median age of onset is between 50 and 60 years. In immunocompromised patients, the median age is around 30 years.
Les manifestations neurologiques ne sont pas spécifiques de la maladie. A la phase diagnostique, les signes de souffrance cérébrale diffuse, ainsi qu'un déficit focal et des crises d'épilepsie, sont observées (J. Neurological manifestations are not specific to the disease. In the diagnostic phase, the signs of diffuse brain pain, as well as focal deficit and epileptic seizures, are observed (J.
Philippon, « Tumeurs cérébrales : du diagnostique au traitement », Masson,Philippon, "Brain tumors: from diagnosis to treatment", Masson,
Paris, 2004, 267-270, [6]). Paris, 2004, 267-270, [6]).
L'administration de corticoïdes, seulement lorsque le diagnostic est certain, entraîne une fonte tumorale dans 50% des cas.  The administration of corticosteroids, only when the diagnosis is certain, leads to a tumor melting in 50% of cases.
La radiothérapie reste le traitement de référence et amène une excellente réponse, pratiquement dans tous les cas. Cependant, les rechutes sont souvent précoces.  Radiotherapy remains the standard treatment and provides an excellent response, in almost all cases. However, relapses are often early.
Si une chimiothérapie associée (Méthotrexate par exemple) améliore le pronostic, celui-ci reste sombre.  If an associated chemotherapy (Methotrexate for example) improves the prognosis, it remains dark.
Chez le sidéen, le traitement reste la radiothérapie, ce qui n'empêche pas, malheureusement, la survenue d'une maladie opportuniste le plus souvent fatale.  In the AIDS patient, the treatment remains radiotherapy, which does not prevent, unfortunately, the occurrence of an opportunistic disease most often fatal.
Récemment, le rituximab, un anticorps monoclonal chimérique murin- humain se liant aux cellules B expirmant le CD20 humain, a été testé par injection intracérébrale dans une tumeur (Mineo et al. « Using human CD20- transfected murine lymphomatous B cells to evaluate the efficacy of intravitreal an intracerebral rituximab injections in mice », Invest Ophtalmol Vis Sci., 49 (1 1 ) :4738-4745, 2008, [7]) ou par voie intraventriculaire Recently, rituximab, a chimeric murine-human monoclonal antibody binding to human CD20-expressing B cells, has been tested by intracerebral injection into a tumor (Mineo et al., Using human CD20-transfected murine lymphomatous B cells to evaluate the efficacy intravitreal intracerebral rituximab injections in mice ", Invest Ophthalmol Screw Sci., 49 (1 1): 4738-4745, 2008, [7]) or intraventricularly
(Rubenstein et al. « Phase I study of intraventricular administration of rituximab in patients with récurrent CNS and intraocular lymphoma », J Clin Oncol., 25 (1 1 ) : 1350-1356, 2007, [20], Hong et al., « A successful treatment of relapsed primary CNS lymphoma patient with intraventricular rituximab followed by high-dose chemotherapy with autologous stem cell rescue »,(Rubenstein et al., "Phase I study of intraventricular administration of rituximab in patients with recurrent CNS and intraocular lymphoma", J Clin Oncol., 25 (11): 1350-1356, 2007, [20], Hong et al., "A successful treatment of CNS relapsed primary lymphoma patient with intraventricular rituximab followed by high-dose chemotherapy with autologous stem cell rescue,"
Yonsei Med J., 50 (2): 280-283, 2009 [21]), et a montré une activité sur un LCP. Au contraire, une injection intraveineuse de rituximab a montré des résultats contradictoires sur l'évolution du LCP (Feugier et al. « Incidence and risk factors for central nervous System occurrence in elderly patients with diffuse large-B-cell lymphoma: influence of rituximab », Ann Oncol, 15:129:133, 2004, [22], Rubenstein et al. [20], Jahnke et al. « Efficacy and MRI of rituximab and methotrexate treatment in a nude rat model of CNS lymphoma, Neuro Oncol., 1 1 (5):503-513, 2009, [23]). Yonsei Med J., 50 (2): 280-283, 2009 [21]), and showed activity on a LCP. In contrast, an intravenous injection of rituximab has shown Contradictory Results on the Evolution of LCP (Feugier et al., "Incidence and Risk Factors for Central Nervous System Occurrence in Elderly Patients with Wide Diffuse-B-cell Lymphoma: Influence of Rituximab," Ann Oncol, 15: 129: 133, 2004 , [22], Rubenstein et al [20], Jahnke et al., "Efficacy and MRI of Rituximab and Methotrexate Treatment in a Rat Model of CNS Lymphoma, Neuro Oncol., 1 (5): 503-513, 2009. , [23]).
Il existe donc un réel besoin d'un outil thérapeutique palliant ces inconvénients et obstacles quant au traitement du lymphome cérébral primitif. There is therefore a real need for a therapeutic tool overcoming these disadvantages and obstacles as regards the treatment of primary cerebral lymphoma.
Description de l'invention Description of the invention
Après d'importantes recherches, la Demanderesse est parvenue à fournir des anticorps monoclonaux pouvant être utilisés dans le traitement du lymphome cérébral primitif.  After extensive research, the Applicant has succeeded in providing monoclonal antibodies that can be used in the treatment of primary brain lymphoma.
Les anticorps selon l'invention sont constitués de deux chaînes lourdes et de deux chaînes légères, liées entre elles par des ponts disulfures. Chaque chaîne est constituée, en position N- terminale, d'une région (ou domaine) variable (codée par les gènes réarrangés V-J pour les chaînes légères et V-D- J pour les chaînes lourdes) spécifique de l'antigène contre lequel l'anticorps est dirigé, et en position C- terminale, d'une région constante, constituée d'un seul domaine CL pour les chaînes légères ou de plusieurs domaines pour les chaînes lourdes .  The antibodies according to the invention consist of two heavy chains and two light chains, linked together by disulfide bridges. Each chain is constituted, in the N-terminal position, of a variable region (or domain) (encoded by the rearranged genes VJ for the light chains and VD-J for the heavy chains) specific for the antigen against which the antibody is directed, and in the C-terminal position, of a constant region consisting of a single CL domain for the light chains or of several domains for the heavy chains.
On entend par « anticorps monoclonal », au sens de la présente invention, toute préparation de molécules d'anticorps possédant une spécificité identique et unique.  For the purposes of the present invention, the term "monoclonal antibody" is intended to mean any preparation of antibody molecules having identical and unique specificity.
Les anticorps de l'invention peuvent être construits en utilisant les techniques standard de l'ADN recombinant, bien connues de l'homme du métier, et plus particulièrement en utilisant les techniques de construction des anticorps " chimériques " décrites par exemple dans Morrison et al., The antibodies of the invention can be constructed using standard techniques of recombinant DNA, which are well known to those skilled in the art, and more particularly by using the "chimeric" antibody construction techniques described for example in Morrison et al. .,
Proc. Natl . Acad. Sci . U.S.A., 81 , pp. 6851 -55 (1984), où la technologie de l'ADN recombinant est utilisée pour remplacer la région constante d'une chaîne lourde et/ou la région constante d'une chaîne légère d'un anticorps provenant d'un mammifère non-humain avec les régions correspondantes d'une immunoglobuline humaine. Un mode de réalisation particulier sera illustré plus loin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, pp. 6851-55 (1984), where recombinant DNA technology is used to replace the constant region of a heavy chain and / or the constant region of a light chain of an antibody from a non-human mammal with the corresponding regions of a human immunoglobulin. A particular embodiment will be illustrated below.
Un premier objet de l'invention se rapporte à un anticorps monoclonal dirigé contre l'antigène CD20, dont la région variable de chacune des chaînes légères est codée par la séquence d'acides nucléiques murine SEQ ID NO : 1 , dont la région variable de chacune des chaînes lourdes est codée par la séquence d'acides nucléiques murine SEQ ID NO : 2, et dont les régions constantes des chaînes légères et des chaînes lourdes proviennent d'une espèce non murine, pour son utilisation dans le traitement du lymphome cérébral primitif (LCP).  A first subject of the invention relates to a monoclonal antibody directed against the CD20 antigen, whose variable region of each of the light chains is encoded by the murine nucleic acid sequence SEQ ID NO: 1, whose variable region of each of the heavy chains is encoded by the murine nucleic acid sequence SEQ ID NO: 2, and whose constant regions of the light and heavy chains are from a non-murine species, for use in the treatment of primary brain lymphoma (LCP).
Les séquences d'acide nucléique murines SEQ ID NO : 1 et SEQ ID NO : 2 codent respectivement pour le domaine variable de chacune des chaînes légères et le domaine variable de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps produit par l'hybridome murin CAT-13.6E12, disponible à la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) sous le numéro ACC 474. Cet hybridome produit un anticorps monoclonal murin de type lgG2a,K dirigé contre le CD20.  The murine nucleic acid sequences SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 encode respectively for the variable domain of each of the light chains and the variable domain of each of the heavy chains of the antibody produced by the murine CAT-hybridoma. 13.6E12, available from the Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) under the number ACC 474. This hybridoma produces a murine monoclonal antibody of type lgG2a, K directed against CD20.
La séquence SEQ ID NO. 1 comporte néanmoins un résidus d'acide nucléique qui diffère par rapport à la séquence codant pour la région variable de la chaîne légère de l'anticorps produit par l'hybridome murin CAT- 13.6E12.  The sequence SEQ ID NO. 1 nevertheless has a nucleic acid residue which differs from the sequence coding for the variable region of the light chain of the antibody produced by the mouse hybridoma CAT-13.6E12.
Ces séquences murines ont été choisies pour dériver les séquences des régions variables des anticorps selon l'invention en raison de la spécificité de l'anticorps murin CAT-13.6E12 pour l'antigène CD20. Les régions variables des anticorps selon l'invention comportent au moins 70% d'identité avec les séquences SEQ ID NO : 1 et SEQ ID NO : 2. Avantageusement, cette identité de séquences confère une identité de spécificité des anticorps selon l'invention avec l'anticorps murin CAT- These murine sequences were chosen to derive the variable region sequences of the antibodies according to the invention because of the specificity of the murine antibody CAT-13.6E12 for the CD20 antigen. The variable regions of the antibodies according to the invention comprise at least 70% identity with the sequences SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2. Advantageously, this sequence identity confers a specificity identity of the antibodies according to the invention with murine antibody CAT-
13.6E12. Avantageusement, cette identité de séquences confère une identité d'affinité pour la cible entre l'anticorps selon l'invention et l'anticorps murin CAT-13.6E12. 13.6E12. Advantageously, this sequence identity confers an identity target affinity between the antibody according to the invention and the murine antibody CAT-13.6E12.
Les anticorps utilisés dans le premier objet de l'invention possèdent en outre des régions constantes des chaînes légères et lourdes appartenant à une espèce non-murine. A cet égard, toutes les familles et espèces de mammifères non-murins sont susceptibles d'être utilisées, et en particulier l'homme, le singe, les muridés (sauf la souris), les suidés, les bovidés, les équidés, les félidés, les canidés, par exemple, ainsi que les oiseaux.  The antibodies used in the first subject of the invention additionally possess constant regions of light and heavy chains belonging to a non-murine species. In this respect, all families and species of non-murine mammals are likely to be used, and in particular humans, monkeys, murids (except the mouse), suids, cattle, equines, felids , canids, for example, and birds.
La région variable de chacune des chaînes légères de l'anticorps utilisés dans l'invention peut être codée par une séquence possédant au moins 80% d'identité avec la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 1 , et la région variable de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps selon l'invention peut être codée par une séquence possédant au moins 80% d'identité avec la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 2. De manière avantageuse, la région variable de chacune des chaînes légères de l'anticorps selon l'invention peut être codée par une séquence possédant au moins 90% d'identité avec la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 1 , et la région variable de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps selon l'invention peut être codée par une séquence possédant au moins 90% d'identité avec la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 2.  The variable region of each of the light chains of the antibody used in the invention may be encoded by a sequence having at least 80% identity with the murine nucleic acid sequence SEQ ID NO: 1, and the variable region of each of the heavy chains of the antibody according to the invention may be coded by a sequence having at least 80% identity with the murine nucleic acid sequence SEQ ID NO: 2. Advantageously, the variable region of each of the light chains of the antibody according to the invention may be encoded by a sequence having at least 90% identity with the murine nucleic acid sequence SEQ ID NO: 1, and the variable region of each of the heavy chains of the The antibody according to the invention may be encoded by a sequence having at least 90% identity with the murine nucleic acid sequence SEQ ID NO: 2.
La région variable de chacune des chaînes légères de l'anticorps utilisés dans l'invention peut être codée par une séquence possédant au moins 95% d'identité avec la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 1 , et la région variable de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps selon l'invention peut être codée par une séquence possédant au moins 95% d' identité avec la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 2.  The variable region of each of the light chains of the antibody used in the invention may be encoded by a sequence having at least 95% identity with the murine nucleic acid sequence SEQ ID NO: 1, and the variable region of each of the heavy chains of the antibody according to the invention may be encoded by a sequence having at least 95% identity with the murine nucleic acid sequence SEQ ID NO: 2.
De manière avantageuse, la région variable de chacune des chaînes légères de l'anticorps utilisées dans l'invention peut être codée par une séquence possédant au moins 99% d'identité avec la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 1 , et la région variable de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps selon l'invention peut être codée par une séquence possédant au moins 99% d'identité avec la séquence d'acide nucléique muhne SEQ ID NO : 2. Advantageously, the variable region of each of the light chains of the antibody used in the invention may be encoded by a sequence having at least 99% identity with the murine nucleic acid sequence SEQ ID NO: 1, and the variable region of each of the heavy chains of the antibody according to the invention may be coded by a sequence having at least 99% identity with the muhne nucleic acid sequence SEQ ID NO: 2.
Avantageusement, tout anticorps possédant des régions variables de leur chaînes lourdes et légères présentant une ou plusieurs substitution(s), insertion(s) ou délétion(s) d'un ou plusieurs acides nucléiques, ces modifications de séquences répondant aux pourcentages d'identités de séquences tels que définis ci-dessus, et n'altérant ni la spécificité de l'anticorps pour sa cible, ni son affinité pour sa cible, peut être utilisé aux fins de l'invention.  Advantageously, any antibody having variable regions of their heavy and light chains presenting one or more substitution (s), insertion (s) or deletion (s) of one or more nucleic acids, these sequence modifications corresponding to the percentages of identities sequences as defined above, and not altering the specificity of the antibody for its target, nor its affinity for its target, can be used for the purposes of the invention.
Les anticorps utilisés dans l'invention s'entendent aussi de tout anticorps possédant les régions CDR (Complementary Determining Région) de l'anticorps CAT-13.6E12, associées à des régions FR n'appartenant pas à CAT-13.6E12 (framework, régions très conservées des régions variables, nommées aussi "charpente"). De tels anticorps possèdent une affinité et une spécificité très comparable, de préférence identique, à celle de l'anticorps murin CAT-13.6E12.  The antibodies used in the invention also include any antibody having the CDR (Complementary Determining Region) regions of the CAT-13.6E12 antibody, associated with FR regions not belonging to CAT-13.6E12 (framework, regions very conserved variable regions, also called "framework"). Such antibodies have a very comparable affinity and specificity, preferably identical to that of the murine antibody CAT-13.6E12.
Dans le premier mode de réalisation de l'invention, l'anticorps est utilisé pour la fabrication d'un médicament, est donc un anticorps monoclonal dirigé contre l'antigène CD20, dont la région variable de chacune des chaînes légères est codée par la séquence d'acide nucléique mu ne SEQ ID NO : 1 , la région variable de chacune des chaînes lourdes est codée par la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 2, et les régions constantes des chaînes légères et des chaînes lourdes sont des régions constantes provenant d'une espèce non-murine.  In the first embodiment of the invention, the antibody is used for the manufacture of a drug, is a monoclonal antibody directed against the CD20 antigen, the variable region of each of the light chains is encoded by the sequence mu SEQ ID NO: 1, the variable region of each of the heavy chains is encoded by the murine nucleic acid sequence SEQ ID NO: 2, and the constant regions of the light and heavy chains are regions. constant from a non-murine species.
On entend par « dirigé contre l'antigène CD20 », au sens de la présente invention, la capacité de l'anticorps monoclonal à lier tout ou partie de l'antigène CD20, et notamment l'épitope reconnu par l'anticorps EMAB603, également appelé R603.  For the purpose of the present invention, the term "directed against the CD20 antigen" is intended to mean the capacity of the monoclonal antibody to bind all or part of the CD20 antigen, and in particular the epitope recognized by the EMAB603 antibody, also called R603.
De manière préférée, les régions constantes de chacune des chaînes légères et de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps utilisés dans l'invention sont des régions constantes humaines. Ce mode de réalisation préféré de l'invention permet de diminuer l'immunogénicité de l'anticorps chez l'homme et par là même d'améliorer son efficacité lors de son administration thérapeutique chez l'homme. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, la région constante de chacune des chaînes légères de l'anticorps selon l'invention est de type K. Tout allotype convient à la réalisation de l'invention, par exemple Km(1 ), Km(1 , 2), Km(1 , 2, 3) ou Km(3) mais l'allotype préféré est Km(3) . Preferably, the constant regions of each of the light chains and each of the heavy chains of the antibody used in the invention are human constant regions. This preferred embodiment of the invention makes it possible to reduce the immunogenicity of the antibody in humans and thereby improve its effectiveness during its therapeutic administration in humans. In a preferred embodiment of the invention, the constant region of each of the light chains of the antibody according to the invention is of type K. Any allotype is suitable for carrying out the invention, for example Km (1), Km (1, 2), Km (1, 2, 3) or Km (3) but the preferred allotype is Km (3).
Dans un autre mode de réalisation complémentaire, la région constante de chacune des chaînes légères de l'anticorps selon l'invention est de type λ.  In another complementary embodiment, the constant region of each of the light chains of the antibody according to the invention is of type λ.
Dans un aspect particulier de l'invention, et notamment lorsque les régions constantes de chacune des chaînes légères et de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps utilisés dans l'invention sont des régions humaines, la région constante de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps est de type γ. Selon cette variante, la région constante de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps peut être de type γ1 , de type γ2, de type γ3, ces trois types de régions constantes présentant la particularité de fixer le complément humain, ou encore de type γ4. Les anticorps possédant une région constante de chacune des chaînes lourdes de type γ appartiennent à la classe des IgG. Les immunoglobulines de type G (IgG), sont des hétérodimères constitués de 2 chaînes lourdes et de 2 chaînes légères, liées entre elles par des ponts disulfures. Chaque chaîne est constituée, en position N-terminale, d'une région ou domaine variable (codée par les gènes réarrangés V-J pour la chaîne légère et V-D-J pour la chaîne lourde) spécifique de l'antigène contre lequel l'anticorps est dirigé, et en position C- terminale, d'une région constante, constituée d'un seul domaine CL pour la chaîne légère ou de 3 domaines (CH1 , CH2 et CH3) pour la chaîne lourde. L'association des domaines variables et des domaines CH1 et CL des chaînes lourdes et légères forme les parties Fab, qui sont connectées à la région Fc par une région charnière très flexible permettant à chaque Fab de se fixer à sa cible antigénique tandis que la région Fc, médiatrice des propriétés effectrices de l'anticorps, reste accessible aux molécules effectrices telles que les récepteurs FcyR et le C1 q. La région Fc, constituée des 2 domaines globulaires CH2 et CH3, est glycosylée au niveau du domaine CH2 avec la présence, sur chacune des 2 chaînes, d'un N-glycanne biantenné de type lactosaminique, lié à l'Asn 297. In a particular aspect of the invention, and especially when the constant regions of each of the light chains and each of the heavy chains of the antibody used in the invention are human regions, the constant region of each of the heavy chains of the antibody is of type γ. According to this variant, the constant region of each of the heavy chains of the antibody may be of type γ1, of type γ2, of type γ3, these three types of constant regions having the particularity of fixing the human complement, or of type γ4 . Antibodies possessing a constant region of each of the γ heavy chains belong to the IgG class. Immunoglobulin type G (IgG) are heterodimers consisting of 2 heavy chains and 2 light chains, linked together by disulfide bridges. Each chain consists, in the N-terminal position, of a region or variable domain (encoded by the rearranged genes VJ for the light chain and VDJ for the heavy chain) specific for the antigen against which the antibody is directed, and in the C-terminal position of a constant region consisting of a single CL domain for the light chain or 3 domains (CH1, CH2 and CH3) for the heavy chain. The combination of the variable domains and the CH1 and CL domains of the heavy and light chains forms the Fab parts, which are connected to the Fc region by a very flexible hinge region allowing each Fab to bind to its antigenic target while the region Fc, a mediator of the effector properties of the antibody, remains accessible to effector molecules such as the FcγR and C1 q receptors. The Fc region, incorporated of the 2 globular domains CH2 and CH3, is glycosylated at the level of the CH2 domain with the presence, on each of the two chains, of a biantennary N-glycan of lactosaminic type, linked to Asn 297.
De manière préférée, la région constante de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps est de type γ1 , car un tel anticorps montre une capacité à engendrer une activité ADCC chez le plus grand nombre d'individus (humains). A cet égard, tout allotype convient à la réalisation de l'invention, par exemple G1 m(3), G1 m (1 , 2, 17), G1 m(1 , 17) ou Glm(1 , 3) . De manière préférentielle, l'allotype est G1 m(1 , 17) .  Preferably, the constant region of each of the heavy chains of the antibody is of type γ1, since such an antibody shows an ability to generate ADCC activity in the largest number of (human) individuals. In this respect, any allotype is suitable for carrying out the invention, for example G1 m (3), G1m (1, 2, 17), G1m (1, 17) or Glm (1, 3). Preferably, the allotype is G1 m (1, 17).
Dans un aspect particulier de l'invention, la région constante de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps est de type γ1 , et elle est codée par la séquence d'acide nucléique humaine SEQ ID NO : 3, la région constante de chacune de ses chaînes légères étant codée par la séquence d'acide nucléique humaine SEQ ID NO : 4. Ainsi, un tel anticorps possède une région variable murine et une région constante humaine, avec des chaînes lourdes de type γ1 . Cet anticorps appartient donc à la sous-classe des lgG1 . Selon le mode de réalisation de l'anticorps utilisé dans l'invention, l'anticorps possède deux chaînes légères dont le domaine variable est codé par la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 1 et la région constante humaine est codée par la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 4, et deux chaînes lourdes dont le domaine variable est codé par la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 2 et la région constante est codée par la séquence d'acide nucléique humaine SEQ ID NO : 3.  In a particular aspect of the invention, the constant region of each of the heavy chains of the antibody is of type γ1, and it is encoded by the human nucleic acid sequence SEQ ID NO: 3, the constant region of each of its light chains being encoded by the human nucleic acid sequence SEQ ID NO: 4. Thus, such an antibody has a murine variable region and a human constant region, with heavy chains of γ1 type. This antibody therefore belongs to the subclass of IgG1. According to the embodiment of the antibody used in the invention, the antibody has two light chains whose variable domain is encoded by the murine nucleic acid sequence SEQ ID NO: 1 and the human constant region is coded by the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 4, and two heavy chains whose variable domain is encoded by the murine nucleic acid sequence SEQ ID NO: 2 and the constant region is encoded by the human nucleic acid sequence SEQ ID NO: 3.
De manière préférentielle, chacune des chaînes légères de l'anticorps selon l'invention est codée par la séquence d'acide nucléique chimérique murine-humaine SEQ ID NO : 5, et chacune des chaînes lourdes est codée par la séquence d'acide nucléique chimérique murine-humaine SEQ ID NO : 6. La séquence d'acide nucléique chimérique murine-humaine SEQ ID NO : 5 codant pour chacune des chaînes légères de l'anticorps est obtenue par fusion de la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 1 codant pour le domaine variable de chacune des chaînes légères de l'anticorps et de la séquence d'acide nucléique humaine SEQ ID NO : 4 codant pour la région constante de chacune des chaînes légères de l'anticorps. Preferably, each of the light chains of the antibody according to the invention is encoded by the murine-human chimeric nucleic acid sequence SEQ ID NO: 5, and each of the heavy chains is encoded by the chimeric nucleic acid sequence. murine-human SEQ ID NO: 6. The murine-human chimeric nucleic acid sequence SEQ ID NO: 5 encoding each of the light chains of the antibody is obtained by fusion of the murine nucleic acid sequence SEQ ID NO: 1 coding for the variable domain of each of the light chains of the antibody and the human nucleic acid sequence SEQ ID NO: 4 encoding the constant region of each of the light chains of the antibody.
La séquence d'acide nucléique chimérique murine-humaine SEQ ID NO : 6 codant pour chacune des chaînes lourdes de l'anticorps est obtenue par fusion de la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 2 codant pour le domaine variable de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps et de la séquence d'acide nucléique humaine SEQ ID NO : 3 codant pour la région constante de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps.  The murine-human chimeric nucleic acid sequence SEQ ID NO: 6 coding for each of the heavy chains of the antibody is obtained by fusion of the murine nucleic acid sequence SEQ ID NO: 2 coding for the variable domain of each of the heavy chains of the antibody and the human nucleic acid sequence SEQ ID NO: 3 coding for the constant region of each of the heavy chains of the antibody.
Dans un aspect particulier de l'invention, lorsque chacune des chaînes légères de l'anticorps est codée par la séquence d'acide nucléique chimérique murine-humaine SEQ ID NO : 5, et que chacune des chaînes lourdes est codée par la séquence d'acide nucléique chimère murine- humaine SEQ ID NO : 6, la séquence peptidique de chacune des chaînes légères, déduite de la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 5, est la séquence SEQ ID NO : 7 et la séquence peptidique de chacune des chaînes lourdes, déduite de la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 6, est la séquence SEQ ID NO : 8.  In a particular aspect of the invention, when each of the light chains of the antibody is encoded by the murine-human chimeric nucleic acid sequence SEQ ID NO: 5, and each of the heavy chains is encoded by the sequence of Murine human chimeric nucleic acid SEQ ID NO: 6, the peptide sequence of each of the light chains, deduced from the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 5, is the sequence SEQ ID NO: 7 and the peptide sequence of each of the heavy chains, deduced from the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 6, is the sequence SEQ ID NO: 8.
L'acide aminé situé en position 106 est une lysine (K) dans la séquence SEQ ID NO : 7.  The amino acid located at position 106 is a lysine (K) in the sequence SEQ ID NO: 7.
L'anticorps utilisé dans l'invention peut être produit par une lignée cellulaire d'hybridome de rat. La lignée productrice de l'anticorps selon l'invention est une caractéristique importante puisqu'elle confère à l'anticorps certaines de ses propriétés particulières. En effet, le moyen d'expression des anticorps est à l'origine des modifications post-traductionnelles, notamment des modifications de la glycosylation, qui peuvent varier d'une lignée cellulaire à l'autre, et ainsi conférer des propriétés fonctionnelles différentes à des anticorps ayant pourtant des structures primaires identiques.  The antibody used in the invention can be produced by a rat hybridoma cell line. The line producing the antibody according to the invention is an important characteristic since it confers on the antibody some of its particular properties. Indeed, the means of expression of the antibodies is at the origin of the post-translational modifications, in particular modifications of the glycosylation, which may vary from one cell line to another, and thus confer different functional properties on antibodies having identical primary structures.
Dans un mode de réalisation préféré, l'anticorps peut être produit dans l'hybridome de rat YB2/0 (cellule YB2/3HL.P2.G1 1 .16Ag.20, déposée à l'American Type Culture Collection sous le numéro ATCC CRL-1662). In a preferred embodiment, the antibody can be produced in the YB2 / 0 rat hybridoma (YB2 / 3HL.P2.G1.116Ag.20 cell, deposited at the American Type Culture Collection under number ATCC CRL -1662).
Avantageusement, cette lignée présente la capacité de produire des anticorps présentant une activité ADCC améliorée par rapport à des anticorps de même structure primaire produits par exemple dans CHO. Advantageously, this line has the ability to produce antibodies with improved ADCC activity compared to antibodies of the same primary structure produced for example in CHO.
Dans un autre mode de réalisation particulier, un autre anticorps selon l'invention est l'anticorps EMAB603 (également appelé R603) produit par le clone cellulaire R603 déposé le 29 novembre 2005 sous le numéro d'enregistrement CNCM 1-3529 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15). Chacune des chaînes légères de l'anticorps EMAB603 est codée par la séquence d'acide nucléique chimérique murine-humaine SEQ ID NO : 5, et chacune des chaînes lourdes est codée par la séquence d'acide nucléique chimérique murine-humaine SEQ ID NO : 6. Cet anticorps chimérique entre en compétition avec l'anticorps murin CAT-13.6E12 pour la fixation du CD20 et possède une activité cytotoxique très supérieure à celle du rituximab, qui peut être attribuée pour partie à la glycosylation particulière du N-glycanne de la chaîne lourde de ces anticorps. Avantageusement, le clone R603 produit une composition d'anticorps EMAB603 possédant un ratio taux de fucose/taux de galactose inférieur à 0,6, pour lequel il a été démontré dans la demande de brevet FR 03 12229 qu'il est optimal pour conférer une forte activité ADCC aux anticorps. Cet anticorps peut être particulièrement intéressant comme outil thérapeutique pour le traitement du LCP.  In another particular embodiment, another antibody according to the invention is the antibody EMAB603 (also called R603) produced by the cell clone R603 deposited on November 29, 2005 under the registration number CNCM 1-3529 in the National Collection. Cultures of Microorganisms (CNCM, Pasteur Institute, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15). Each of the light chains of the EMAB603 antibody is encoded by the murine-human chimeric nucleic acid sequence SEQ ID NO: 5, and each of the heavy chains is encoded by the murine-human chimeric nucleic acid sequence SEQ ID NO: 6. This chimeric antibody competes with murine CAT-13.6E12 for binding CD20 and has a much higher cytotoxic activity than rituximab, which can be attributed in part to the particular glycosylation of N-glycan heavy chain of these antibodies. Advantageously, clone R603 produces an EMAB603 antibody composition having a fucose / galactose ratio of less than 0.6, for which it has been demonstrated in patent application FR 03 12229 that it is optimal for conferring strong ADCC activity to antibodies. This antibody may be particularly useful as a therapeutic tool for the treatment of LCP.
De tels anticorps, ainsi qu'un procédé permettant leur fabrication, sont décrits dans le document WO 2006/064121 .  Such antibodies, as well as a method for their manufacture, are described in WO 2006/064121.
Un exemple de vecteur d'expression d'un anticorps selon l'invention, est le vecteur de séquence SEQ ID NO : 17. Ce vecteur est un vecteur permettant l'expression d'un anticorps selon l'invention dont la chaîne légère est codée par la séquence d'acide nucléique SED ID NO : 5, dont la séquence peptidique déduite est la séquence SEQ ID NO : 7, et dont la chaîne lourde est codée par la séquence d'acide nucléique SED ID NO : 6, dont la séquence peptidique déduite est la séquence SEQ ID NO : 8. Ce vecteur est une molécule d'acide nucléique dans laquelle la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 5 codant pour chacune des chaînes légères de l'anticorps et la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 6 codant chacune des chaînes lourdes de l'anticorps ont été insérées, afin de les introduire et de les maintenir dans une cellule hôte. Il permet l'expression de ces fragments d'acide nucléique étrangers dans la cellule hôte car il possède des séquences indispensables (promoteur, séquence de polyadénylation, gène de sélection) à cette expression. De tels vecteurs sont bien connus de l'homme du métier, et peuvent être un adénovirus, un rétrovirus, un plasmide ou un bactériophage, cette liste n'étant pas limitative. An example of an expression vector of an antibody according to the invention is the vector of sequence SEQ ID NO: 17. This vector is a vector allowing the expression of an antibody according to the invention whose light chain is coded by the nucleic acid sequence SED ID NO: 5, whose deduced peptide sequence is the sequence SEQ ID NO: 7, and whose heavy chain is encoded by the nucleic acid sequence SED ID NO: 6, whose sequence deduced peptide is the sequence SEQ ID NO: 8. This vector is a nucleic acid molecule in which the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 5 coding for each of the light chains of the antibody and the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 6 encoding each of the heavy chains of the antibody were inserted, in order to introduce and maintain them in a host cell. It allows the expression of these foreign nucleic acid fragments in the host cell because it has essential sequences (promoter, polyadenylation sequence, selection gene) to this expression. Such vectors are well known to those skilled in the art, and may be an adenovirus, a retrovirus, a plasmid or a bacteriophage, this list not being limiting.
Dans un autre mode de réalisation, l'anticorps de l'invention peut être produit par co-expression dans une cellule de deux vecteurs d'expression, l'un premettant l'expression de la chaîne légère, et l'autre celle de la chaîne lourde de l'anticorps.Tout comme indiqué précédemment, ces vecteurs possèdent des séquences indispensables (promoteur, séquence de polyadénylation, gène de sélection) à cette expression. Tout comme indiqué précédemment, les vecteurs peuvent être par exemple un plasmide, un adénovirus, un rétrovirus ou un bactériophage.  In another embodiment, the antibody of the invention may be produced by coexpression in a cell of two expression vectors, one for expression of the light chain, and one for expression of the light chain. As indicated above, these vectors possess indispensable sequences (promoter, polyadenylation sequence, selection gene) for this expression. As indicated above, the vectors may be, for example, a plasmid, an adenovirus, a retrovirus or a bacteriophage.
De manière avantageuse, la lignée cellulaire stable exprimant un anticorps utilisé dans l'invention est choisie parmi le groupe consistant en : SP2/0, YB2/0, IR983F, un myélome humain comme Namalwa ou toute autre cellule d'origine humaine comme PERC6, les lignées CHO, notamment CHO-K-1 , CHO-Lec10, CHO-Led , CHO-Lec13, CHO Pro-5, CHO dhfr- (CHO DX Bll, CHO DG44), ou d'autres lignées choisies parmi Wil-2, Jurkat, Vero, Molt-4, COS-7, 293- HEK, BHK, K6H6, NSO, SP2/0-Ag 14 et P3X63Ag8.653.  Advantageously, the stable cell line expressing an antibody used in the invention is selected from the group consisting of: SP2 / 0, YB2 / 0, IR983F, a human myeloma such as Namalwa or any other cell of human origin such as PERC6, CHO lines, in particular CHO-K-1, CHO-Lec10, CHO-Led, CHO-Lec13, CHO Pro-5, CHO dhfr- (CHO DX B11, CHO DG44), or other lines selected from Wil-2 , Jurkat, Vero, Molt-4, COS-7, 293-HEK, BHK, K6H6, NSO, SP2 / O-Ag 14 and P3X63Ag8.653.
De manière préférée, la lignée utilisée est l'hybridome de rat YB2/0 Preferably, the line used is the rat hybridoma YB2 / 0
(cellule YB2/3HL.P2.G1 1 .Ag.20, déposée à l'American Type Culture Collection sous le numéro ATCC CRL-1662). Cette lignée a été choisie en raison de sa capacité à produire des anticorps présentant une activité ADCC améliorée par rapport à des anticorps de même structure primaire produits par exemple dans CHO. (YB2 / 3HL.P2.G1 1 .Ag.20 cell, deposited at the American Type Culture Collection under number ATCC CRL-1662). This line was chosen because of its ability to produce antibodies with improved ADCC activity compared to antibodies of the same primary structure produced for example in CHO.
Les milieux de culture adaptés à ces cellules sont bien connus de l'homme du métier, et on peut citer de manière non exhaustives les milieux de culture RPMI 1640 (The Journal of the American Médical Association, 199, 519 (1967) [14]), Eagle's MEM (Science, 122, 501 (1952) [15]), Dulbecco's modified MEM (Virology, 8, 396 (1959) [16]), F12 Médium (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 53, 288 (1965) [17]), IMDM (J. Expérimental Medicine, 147, 923 (1978) [18]), ou encore ceux décrits dans le document EP1229125. The culture media adapted to these cells are well known to those skilled in the art, and the following are non-exhaustive: RPMI 1640 (The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967) [14]), Eagle's MEM (Science, 122, 501 (1952) [15]), Dulbecco's modified MEM (Virology, 8, 396 ( 1959) [16]), F12 Medium (Proc Natl Acad Sci USA, 53, 288 (1965) [17]), IMDM (J. Experimental Medicine, 147, 923 (1978) [18]), or still those described in EP1229125.
Pour ce premier objet de l'invention, le mode d'administration de l'anticorps utilisé dans l'invention peut être intracérébral, par exemple intratumorale, intrastriatal, intraventriculaire, intrathécal, ou par voie intraveineuse, intrapéritonéale, ou sous-cutanée.  For this first subject of the invention, the mode of administration of the antibody used in the invention may be intracerebral, for example intratumoral, intrastriatal, intraventricular, intrathecal, or intravenous, intraperitoneal, or subcutaneous.
Un deuxième objet de l'invention se rapporte à un anticorps monoclonal dirigé contre un antigène présent à la surface des cellules de lymphome cérébal primitif pour son utilisation par voie d'administration intrathécale dans le traitement du lymphome cérébral primitif.  A second subject of the invention relates to a monoclonal antibody directed against an antigen present on the surface of primitive ceral lymphoma cells for its use by intrathecal administration in the treatment of primary brain lymphoma.
On entend par « antigène présent à la surface des cellules de lymphome cérébal primitif », au sens de la présente invention, tout antigène exprimé à la surface extracellulaire des cellules de lymphome cérébal primitif. L'antigène peut être choisi parmi les molécules CD15, CD19, CD20, CD22, CD30, CD45, CD79a, CD138, MIB-1 , MUM-1 , ou des idiotopes d'immunoglobulines membranaires.  For the purposes of the present invention, the term "antigen present on the surface of primary ceral lymphoma cells" is intended to mean any antigen expressed on the extracellular surface of primitive ceral lymphoma cells. The antigen may be selected from CD15, CD19, CD20, CD22, CD30, CD45, CD79a, CD138, MIB-1, MUM-1, or membrane immunoglobulin idiotopes.
On entend par « voie d'administration intrathécale », au sens de la présente invention, tout mode d'administration permettant à l'anticorps d'être introduit dans la thèque. Il peut s'agir d'une administration par exemple dans l'espace sous-rachidien, dans l'espace intra-rachidien, ou dans le liquide céphalo-rachidien.  For the purposes of the present invention, the term "intrathecal administration route" means any mode of administration allowing the antibody to be introduced into the theca. It may be an administration for example in the sub-rachidian space, in the intraspinal space, or in the cerebrospinal fluid.
L'anticorps du deuxième objet de l'invention peut être produit dans une lignée cellulaire telle que définie ci-avant.  The antibody of the second subject of the invention may be produced in a cell line as defined above.
Les régions constantes de chacune des chaînes légères et de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps utilisés dans l'invention peuvent être des régions constantes humaines. Avantageusement, ce mode de réalisation permet de diminuer l'immunogénicité de l'anticorps chez l'homme et par là même d'améliorer son efficacité lors de son administration thérapeutique chez l'homme. The constant regions of each of the light chains and each of the heavy chains of the antibody used in the invention may be human constant regions. Advantageously, this embodiment makes it possible to reduce the immunogenicity of the antibody in humans and thereby even to improve its effectiveness during its therapeutic administration in humans.
Avantageusement, pour ce deuxième objet de l'invention, la région constante de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps peut être codée par la séquence d'acide nucléique humaine SEQ ID NO : 3, et la région constante de chacune de ses chaînes légères peut être codée par la séquence d'acide nucléique humaine SEQ ID NO : 4. Avantageusement, cet anticorps appartient à la sous-classe des lgG1 .  Advantageously, for this second subject of the invention, the constant region of each of the heavy chains of the antibody can be encoded by the human nucleic acid sequence SEQ ID NO: 3, and the constant region of each of its light chains. can be encoded by the human nucleic acid sequence SEQ ID NO: 4. Advantageously, this antibody belongs to the subclass of IgG1.
L'anticorps du deuxième objet de l'invention peut être produit dans l'hybridome de rat YB2/0 (cellule YB2/3HL.P2.G1 1 .16Ag.20, déposée à l'American Type Culture Collection sous le numéro ATCC CRL-1662), telle que définie ci-avant.  The antibody of the second subject of the invention can be produced in the YB2 / 0 rat hybridoma (YB2 / 3HL.P2.G1.1.16Ag.20 cell, deposited at the American Type Culture Collection under number ATCC CRL -1662), as defined above.
L'anticorps du deuxième objet de l'invention peut être un anticorps spécifiquement à l'antigène CD20, notamment à un anti-CD20 humain.  The antibody of the second subject of the invention may be an antibody specifically to the CD20 antigen, in particular to a human anti-CD20.
La région variable de chacune des chaînes légères de l'anticorps du deuxième objet de l'invention peut être codée par la séquence d'acides nucléiques murine SEQ ID NO : 1 , la région variable de chacune de ses chaînes lourdes peut être codée par la séquence d'acides nucléiques murine SEQ ID NO : 2.  The variable region of each of the light chains of the antibody of the second subject of the invention may be encoded by the murine nucleic acid sequence SEQ ID NO: 1, the variable region of each of its heavy chains may be coded by the murine nucleic acid sequence SEQ ID NO: 2.
Ainsi, les chaînes légères de cet anticorps peuvent être codées par la séquence d'acides nucléiques chimérique murine-humaine SEQ ID NO : 5, et les chaînes lourdes être codée par la séquence d'acides nucléiques chimérique murine- humaine SEQ ID NO : 6.  Thus, the light chains of this antibody can be encoded by the murine-human chimeric nucleic acid sequence SEQ ID NO: 5, and the heavy chains be encoded by the chimeric murine-human nucleic acid sequence SEQ ID NO: 6 .
L'anticorps peut ainsi être constitué des chaînes légères de séquence en acides aminés SEQ ID NO : 7 et des chaînes lourdes de séquence en acides aminés SEQ ID NO : 8.  The antibody may thus consist of the amino acid sequence light chains SEQ ID NO: 7 and the amino acid sequence heavy chains SEQ ID NO: 8.
L'anticorps peut être produit par le clone R603 déposé sous le numéro d'enregistrement CNCM I-3529 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM).  The antibody may be produced by the clone R603 deposited under registration number CNCM I-3529 in the National Collection of Cultures of Microorganisms (CNCM).
Que ce soit pour le premier objet de l'invention ou pour le deuxième objet de l'invention, l'anticorps de l'invention peut être utilisé en combinaison avec un ou plusieurs autre(s) anticorps, par exemple monoclonal(ux), dirigé(s) contre un ou plusieurs autre(s) antigène(s) exprimé(s) sur les cellules lymphoides, comme par exemple, de façon non limitative, les antigènes CD1 , CD2, CD3, CD4, CD8, CD1 1 , CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21 , CD22, CD23, CD25, CD26, CD29, CD30, CD31 , CD40, CD43, CD44, CD45, CD49, CD50, CD52, CD53, CD54, CD55, CD58, CD59, CD69, CD70, CD71 , CD79a, CD80, CD81 , CD82, CD86, CD95, CD103, CD1 18, CD1 19, CD120, CD132, CD138, CD210, CD217. Whether for the first subject of the invention or for the second subject of the invention, the antibody of the invention may be used in combination with one or more other antibodies, for example monoclonal antibodies (ux), directed against one or more other antigen (s) expressed on lymphoid cells, such as, but not limited to, CD1, CD2, CD3, CD4, CD8, CD1, CD15 antigens , CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD26, CD29, CD30, CD31, CD40, CD43, CD44, CD45, CD49, CD50, CD52, CD53, CD54, CD55, CD58, CD59, CD69 , CD70, CD71, CD79a, CD80, CD81, CD82, CD86, CD95, CD103, CD188, CD19, CD120, CD132, CD138, CD210, CD217.
Que ce soit pour le premier objet de l'invention ou pour le deuxième objet de l'invention, l'anticorps selon l'invention peut être utilisé en association avec des cellules exprimant des FcyR telles que les cellules NK, les cellules NKT (Natural Killers T) , les lymphocytes Τγδ, les macrophages, les monocytes ou les cellules dendritiques, c'est-à-dire en association avec une thérapie cellulaire (Peller S, Kaufman S Blood 1991 , 78:1569 ([8]) ; Kimby E et al. 1989 Leukemia 3 (7) :501 -504 ([9]); Soorskaar D et al. 1988 Int Arch Allery Appl Immunol 87(2) ;159-164 ([10]) ; Ziegler HW et al. 1981 Int J Cancer 27(3) ;321 -327 ([11]) ; Chaperot L et al. 2000 Leukemia 14 (9) :1667-77 ([12]) ; Vuillier F, Dighiero G 2003 Bull Cancer. 90 (8-9) :744-50 ([13])) .  Whether for the first subject of the invention or for the second subject of the invention, the antibody according to the invention can be used in combination with cells expressing FcyRs such as NK cells, NKT cells (Natural Killers T), γγδ lymphocytes, macrophages, monocytes or dendritic cells, i.e., in combination with cell therapy (Peller S, Kaufman S Blood 1991, 78: 1569 ([8]); E et al., 1989 Leukemia 3 (7): 501-504 ([9]), Soorskaar D et al., 1988 Int Arch Allery Appl Immunol 87 (2), 159-164 ([10]), Ziegler HW et al. 1981 Int J Cancer 27 (3); 321-327 ([11]), Chaperot L et al., 2000 Leukemia 14 (9): 1667-77 ([12]), Vuillier F, Dighiero G, 2003 Bull Cancer. 8-9): 744-50 ([13])).
Avantageusement, les anticorps de l'invention peuvent permettre la formation de lymphocytes T mémoires. Ces lymphocytes T mémoires peuvent posséder la capacité de proliférer, et de se réactiver de manière rapide lors d'une deuxième exposition aux cellules tumorales.  Advantageously, the antibodies of the invention may allow the formation of memory T lymphocytes. These memory T cells may possess the ability to proliferate, and to reactivate rapidly upon second exposure to tumor cells.
Avantageusement, les anticorps de l'invention peuvent permettre une infiltration de cellules T dans le microenvironnement tumoral, ce qui peut induire un ralentissement de la croissance tumorale, et/ou une meilleure clairance des cellules tumorales.  Advantageously, the antibodies of the invention may allow infiltration of T cells into the tumor microenvironment, which may induce slowing of tumor growth, and / or better clearance of tumor cells.
Avantageusement, les anticorps de l'invention permettent d'éviter ou de retarder une rechute. Une rechute peut être l'apparition d'une deuxième tumeur de phénotype similaire ou identique à celui d'une première tumeur, cette première tumeur ayant été traitée avec les anticorps de l'invention. Avantageusement, les anticorps de l'invention permettent d'éviter ou de retarder une rechute lorsqu'ils sont administrés par voie intrathécale. Advantageously, the antibodies of the invention make it possible to avoid or delay a relapse. A relapse may be the appearance of a second tumor of phenotype similar or identical to that of a first tumor, this first tumor having been treated with the antibodies of the invention. Advantageously, the antibodies of the invention make it possible to avoid or delay a relapse when they are administered intrathecally.
Avantageusement, un tel anticorps monoclonal peut avoir un effet antitumoral significatif. Par exemple, un tel anticorps peut permettre une inhibition de la réplication des cellules tumorales d'au moins 20%, ou au moins 30 %, ou encore au moins 50%, et de préférence d'au moins 60%, ou 70% chez le sujet atteint de LCP auquel il est administré.  Advantageously, such a monoclonal antibody can have a significant antitumor effect. For example, such an antibody may allow tumor cell replication inhibition of at least 20%, or at least 30%, or at least 50%, and preferably at least 60%, or 70% in subject with LCP to which it is administered.
Que ce soit pour le premier objet de l'invention ou pour le deuxième objet de l'invention, la dose d'anticorps administrée aux patients peut être de préférence inférieure à 375 mg/m2, 187,5 mg/m2, à 75 mg/m2, à 37,5 mg/m2, 15 mg/m2, 7,5 mg/m2 ou de manière particulièrement avantageuse inférieure à 3,75 mg/m2 ou encore à 1 mg/m2 ou à 0,5 mg/m2. La dose administrée est avantageusement comprise entre 187,5 mg/m2 et 75 mg/m2, ou entre 75 mg/m2 et 37,5 mg/m2, entre 75 mg/m2 et 15 mg/m2, entre 75 mg/m2 et 7,5 mg/m2 ou encore entre 75 mg/m2 et 3,75 mg/m2. De préférence, la dose administrée est comprise entre 3,75 mg/m2 et 0,5 mg/m2, plus particulièrement comprise entre 2 mg/m2 et 1 mg/m2. Avantageusement, ces doses sont administrées par voie intraveineuse, sous-cutanée, intracérébrale, par exemple intra-tumorale, intrastriatale, intraventriculaire, et/ou intrathécale. Whether for the first subject of the invention or for the second subject of the invention, the dose of antibody administered to patients may preferably be less than 375 mg / m 2 , 187.5 mg / m 2 , 75 mg / m 2 , at 37.5 mg / m 2 , 15 mg / m 2 , 7.5 mg / m 2 or particularly advantageously below 3.75 mg / m 2 or at 1 mg / m 2 or 0.5 mg / m 2 . The dose administered is advantageously between 187.5 mg / m 2 and 75 mg / m 2 , or between 75 mg / m 2 and 37.5 mg / m 2 , between 75 mg / m 2 and 15 mg / m 2 , between 75 mg / m 2 and 7.5 mg / m 2 or between 75 mg / m 2 and 3.75 mg / m 2 . Preferably, the dose administered is between 3.75 mg / m 2 and 0.5 mg / m 2 , more particularly between 2 mg / m 2 and 1 mg / m 2 . Advantageously, these doses are administered intravenously, subcutaneously, intracerebrally, for example intra-tumoral, intrastriatal, intraventricular, and / or intrathecal.
Quand l'anticorps est administré par voie intracérébrale, la quantité d'anticorps administrée au patient peut être comprise entre 0,001 g et 1000 d'anticorps, ou encore entre 0,001 g et 100 g d'anticorps, ou encore comprise entre 10 g et 100 g d'anticorps, avantageusement comprise entre 0,01 g et 10 g d'anticorps, ou entre 1 g et 10 g, ou entre 0,01 g et 1 ou entre 0,01 g et 0,1 g ou encore entre 0,02 g et 0,08 g d'anticorps.  When the antibody is administered intracerebrally, the amount of antibody administered to the patient may be between 0.001 g and 1000 of antibody, or between 0.001 g and 100 g of antibody, or between 10 g and 100 g of antibody. g of antibody, advantageously between 0.01 g and 10 g of antibody, or between 1 g and 10 g, or between 0.01 g and 1 or between 0.01 g and 0.1 g or between 0 0.2 g and 0.08 g of antibody.
Avantageusement, l'administration de l'anticorps peut se faire près de la tumeur, ou dans la tumeur.  Advantageously, the administration of the antibody can be done near the tumor, or in the tumor.
Que ce soit pour le premier objet de l'invention ou pour le deuxième objet de l'invention, l'administration peut se faire soit à dose unique (c'est-à- dire administration unique), soit en injections répétées. Si les injections sont répétées, chaque administration peut être suffisamment espacée de la précédente pour que chaque administration soit considérée comme une administration en dose unique. Par exemple, chaque administration peut être espacée d'au moins une semaine, ou d'au moins 2 semaines, d'au ou moins 3 semaines, ou d'au mois 4 semaines, ou d'au moins 6 semaines, ou d'au moins 10 semaines, ou d'au moins 6 mois de l'administration précédente. Whether for the first subject of the invention or for the second subject of the invention, the administration can be done either at single dose (that is to say single administration), or by repeated injections. If the injections are repeated, each administration may be sufficiently spaced from the previous one for each administration to be considered as a single dose administration. For example, each administration may be spaced at least a week, or at least 2 weeks, at least 3 weeks, or at least 4 weeks, or at least 6 weeks, or at least 10 weeks, or at least 6 months of the previous administration.
Que ce soit pour le premier objet de l'invention ou pour le deuxième objet de l'invention, l'anticorps peut être administré comme médicament selon les règles standard, bien connues de l'homme du métier, de traitement des lymphomes.  Whether for the first subject of the invention or for the second subject of the invention, the antibody can be administered as a medicament according to the standard rules, well known to those skilled in the art, for the treatment of lymphomas.
Avantageusement, les anticorps utilisés dans l'invention sont cytotoxiques.  Advantageously, the antibodies used in the invention are cytotoxic.
Un autre objet de l'invention est l'utilisation d'un anticorps selon l'invention, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement du LCP.  Another object of the invention is the use of an antibody according to the invention, for the manufacture of a medicament for the treatment of LCP.
Un objet particulier de l'invention se rapporte à une méthode de traitement au moyen des anticorps précédemment décrits du LCP.  A particular object of the invention relates to a method of treatment using the previously described antibodies of the LCP.
Avantageusement, la méthode de traitement comprend l'étape d'administration des anticorps à un patient atteint de LCP, par exemple par voie intrathécale.  Advantageously, the method of treatment comprises the step of administering the antibodies to a patient suffering from LCP, for example intrathecally.
Avantageusement, l'anticorps utilisé dans l'invention est administré avec un support pharmaceutiquement acceptable, approprié pour l'effet thérapeutique attendu.  Advantageously, the antibody used in the invention is administered with a pharmaceutically acceptable carrier, suitable for the expected therapeutic effect.
Un autre objet de l'invention est un procédé de préparation d'un médicament destiné au traitement du LCP, consistant à mélanger l'anticorps monoclonal utilisé dans l'invention avec un support pharmaceutiquement acceptable, puis à obtenir le médicament.  Another object of the invention is a process for preparing a medicament for the treatment of LCP comprising mixing the monoclonal antibody used in the invention with a pharmaceutically acceptable carrier, and then obtaining the drug.
Un autre objet de l'invention est une méthode de traitement thérapeutique du LCP, comprenant l'administration, à un patient en présentant le besoin, d'un anticorps ou d'un médicament tel que décrit ci- avant. Avantageusement, l'administration peut être effectuée par voie intrathécale. D'autres avantages pourront encore apparaître à l'homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous, illustrés par les figures annexées, donnés à titre illustratif. Brève description des figures Another object of the invention is a method of therapeutic treatment of LCP, comprising administering to a patient with the need, an antibody or a drug as described above. Advantageously, the administration can be carried out intrathecally. Other advantages may still appear to those skilled in the art on reading the examples below, illustrated by the appended figures, given for illustrative purposes. Brief description of the figures
- La figure 1 est la représentation schématique du vecteur CKHu utilisé pour la chimérisation de la chaîne légère kappa des anticorps EMAB603.  FIG. 1 is the schematic representation of the CKHu vector used for the chimaericization of the kappa light chain of the EMAB603 antibodies.
- La figure 2 est la représentation schématique du vecteur G1 Hu utilisé pour la chimérisation de la chaîne lourde des anticorps EMAB603.  FIG. 2 is the schematic representation of the G1 Hu vector used for the chimericization of the heavy chain of the EMAB603 antibodies.
- La figure 3 est la représentation schématique du vecteur d'expression des chaînes lourdes et légères utilisé pour la production de l'anticorps R603.  FIG. 3 is the schematic representation of the expression vector of the heavy and light chains used for the production of the R603 antibody.
- La figure 4 représente le schéma des injections intracérébrales réalisées dans le cadre de l'étude de l'effet du tampon contenant le R603 sur la croissance tumorale. On réalise à D-7, soit 7 jours avant l'injection intracérébrale des traitements, l'injection de 2 μΙ de cellules tumorales lymphomateuses B murines (H2d) A20.IIA-GFP-hCD20 en suspension, soit 5.104 cellules, est réalisée. On réalise à D1 , soit 7 jours après l'injection intracérébrale des cellules tumorales, l'injection intracérébrale soit de 2 μΙ de PBS 1 X (expérience référencée PCL HO2), soit de 2 μΙ d'anticorps monoclonal irrelevant anti-P24 (expérience référencée PCL HO6), soit de 2 μΙ de tampon du R603. FIG. 4 represents the schematic of intracerebral injections carried out as part of the study of the effect of the buffer containing R603 on tumor growth. At D-7, that is 7 days before the intracerebral injection of the treatments, the injection of 2 μΙ of murine lymphoma B (A20.IIA-GFP-hCD20) tumor cells in suspension, ie 5 × 10 4 cells, is carried out. . At D1, 7 days after the intracerebral injection of the tumor cells, the intracerebral injection is made of 2 μl of 1 × PBS (experiment referenced PCL HO2), or 2 μl of irrelevant anti-P24 monoclonal antibody (experiment referenced PCL HO6), ie 2 μΙ of R603 buffer.
- La figure 5 représente le suivi de la survie, en jours, pour les 4 groupes d'animaux après la mise en œuvre du protocole d'injection défini ci- dessus (figure 4). La courbe A (représente la survie des souris traitées avec l'anticorps R603 ( ), la courbe B représente la survie des souris traitées avec l'anticorps anti-P24 ( ™*™·), la courbe C représente les souris traitées avec le PBS 1 X ( ), et la courbe D représente la survie des souris non traitées ( ). Le test statistique est celui de Kaplan-Meier. La valeur P correspond à la valeur logrank. FIG. 5 represents the survival monitoring, in days, for the 4 groups of animals after the implementation of the injection protocol defined above (FIG. 4). Curve A (represents the survival of mice treated with the R603 antibody), curve B represents the survival of the mice treated with the anti-P24 antibody ( ™ * ™ · ), curve C represents the mice treated with the antibody PBS 1 X (), and curve D represents the survival of the untreated mice () The statistical test is that of Kaplan-Meier The P value corresponds to the logrank value.
- La figure 6 représente le schéma des injections intracérébrales réalisées dans le cadre de l'étude de l'efficacité des anticorps anti-CD20 humain dans le modèle murin de LCP, selon le protocole expérimental n°1 . On réalise à D-7, soit 7 jours avant l'injection intracérébrale des traitements, l'injection de 2 μΙ de cellules tumorales lymphomateuses B murines (H2d) A20.IIA-GFP-hCD20 en suspension, soit 5.104 cellules, est réalisée. On réalise à D1 , soit 7 jours après l'injection intracérébrale des cellules tumorales, l'injection intracérébrale soit de PBS 1 X, soit de tampon contenant différentes quantité de R603 (soit 1 g, soit 5 g, soit 20 g), soit de rituximab (20 g). FIG. 6 represents the schematic of intracerebral injections carried out as part of the study of the efficacy of the anti-human CD20 antibodies in the mouse model of LCP, according to the experimental protocol n ° 1. At D-7, that is 7 days before the intracerebral injection of the treatments, the injection of 2 μΙ of murine lymphoma B (A20.IIA-GFP-hCD20) tumor cells in suspension, ie 5 × 10 4 cells, is carried out. . At D1, 7 days after the intracerebral injection of the tumor cells, the intracerebral injection is carried out either with 1 × PBS or with buffer containing different amounts of R603 (ie 1 g, 5 g or 20 g), or rituximab (20 g).
- La figure 7 représente le suivi de la survie, en jours, pour les 5 groupes d'animaux après la mise en œuvre du protocole d'injection défini ci- dessus (figure 6). La courbe A ( —— -) représente la survie des souris traitées avec l'anticorps R603 1 g, la courbe B ( - -■-) représente la survie des souris traitées avec l'anticorps R603 5 g, la courbe C (—■ * ) représente la survie des souris traitées avec l'anticorps R603 20 g, la courbe D ( ) représente les souris traitées avec le PBS 1 X, et la courbe E ( représente la survie des souris traitées avec rituximab. Le test statistique est celui de Kaplan-Meier entre le groupe traité et le groupe contrôle PBS 1X. La valeur P correspond à la valeur logrank. FIG. 7 represents the monitoring of the survival, in days, for the 5 groups of animals after the implementation of the injection protocol defined above (FIG. 6). Curve A (- -) represents the survival of the mice treated with the antibody R603 1 g, the curve B (- - - -) represents the survival of the mice treated with the antibody R603 5 g, the curve C (- ■ *) represents the survival of mice treated with the R603 antibody 20 g, the D () curve represents the mice treated with the 1 X PBS, and the E curve (represents the survival of the mice treated with rituximab. that of Kaplan-Meier between the treated group and the 1X PBS control group The P value corresponds to the logrank value.
- La figure 8 représente le pourcentage de cellules CD19+ GFP+ 15 jours après le traitement selon le protocole expérimental n°2, pour les groupes de souris traitées soit par PBS 1 X, soit par tampon contenant différentes quantités de R603 (soit 1 g, soit 5 g, soit 20 g), soit par rituximab (20 g). Le test statistique est celui de Mann-Whitney. NS= non significatif.  FIG. 8 represents the percentage of CD19 + GFP + cells 15 days after the treatment according to experimental protocol No. 2, for the groups of mice treated with either 1 × PBS or with buffer containing different amounts of R603 (ie 1 g or 5 g, 20 g), or by rituximab (20 g). The statistical test is that of Mann-Whitney. NS = not significant.
- La figure 9 représente le suivi de la survie, en jours, pour les 4 groupes d'animaux après la mise en œuvre du protocole expérimental N°3. FIG. 9 represents the survival monitoring, in days, for the 4 groups of animals after the implementation of the experimental protocol No. 3.
La courbe A ( ---·■■■■- ) représente la survie des souris injectées avec les cellules A20.IIA-GFP, traitées avec le PBS 1X, la courbe B ( ) représente la survie des souris injectées avec les cellules A20.IIA-GFP-hCD20, traitées avec le PBS 1 X, la courbe C (— *— ) représente la survie des souris injectées avec les cellules A20.IIA-GFP, traitées avec l'anticorps LFB-R603 20 pg, la courbe D ( ) représente les souris injectées avec les cellules A20.IIA-Curve A (--- · ■■■■ -) represents survival of mice injected with A20.IIA-GFP cells, treated with 1X PBS, curve B () represents survival of mice injected with A20 cells. .IIA-GFP-hCD20, treated with 1X PBS, curve C (- * -) represents the survival of the mice injected with the A20.IIA-GFP cells, treated with the LFB-R603 antibody 20 μg, the curve D () represents the mice injected with the A20.IIA-
GFP-hCD20, traitées avec l'anticorps LFB-R603 20 pg. - La figure 10 représente le suivi de la survie, en jours, pour les 4 groupes d'animaux après la mise en œuvre du protocole expérimental N°4. La courbe A ( ) représente la survie des souris injectées avec les cellules A20.IIA-GFP-hCD20, traitées avec le PBS 1 X, la courbe B ( ) représente la survie des souris injectées avec les cellules A20.IIA-GFP- hCD20, traitées avec l'anticorps LFB-R603 20 g en intracérébral, la courbe C ( ) représente la survie des souris injectées avec les cellules A20.IIA- GFP-hCD20, traitées avec l'anticorps LFB-R603 20 pg en intrathécale, la courbe D (— *— ) représente les souris injectées avec les cellules A20.IIA- GFP-hCD20, traitées avec l'anticorps LFB-R603 6,6 mg en intraveineuse. GFP-hCD20, treated with LFB-R603 antibody 20 μg. FIG. 10 represents the survival monitoring, in days, for the 4 groups of animals after the implementation of experimental protocol No. 4. Curve A () represents the survival of the mice injected with A20.IIA-GFP-hCD20 cells, treated with 1 X PBS, curve B () represents the survival of the mice injected with A20.IIA-GFP-hCD20 cells. , treated with the LFB-R603 antibody 20 g intracerebrally, the curve C () represents the survival of the mice injected with the A20.IIA-GFP-hCD20 cells, treated with the LFB-R603 antibody 20 μg intrathecally, the D (- * -) curve represents the mice injected with the A20.IIA-GFP-hCD20 cells, treated with the LFB-R603 6.6 mg intravenously antibody.
- La figure 1 1 représente le suivi de la survie, en jours, pour les 2 groupes d'animaux après la mise en œuvre du protocole expérimental N°5. - Figure 1 1 represents the survival monitoring, in days, for the 2 groups of animals after the implementation of the experimental protocol No. 5.
La courbe A ( ) représente la survie des souris traitées avec le rituximabCurve A () represents the survival of mice treated with rituximab
20 ig (n=1 ), la courbe B ( ) représente la survie des souris traitées avec l'anticorps LFB-R603 20 pg (n=4). Ig (n = 1), curve B () represents the survival of mice treated with LFB-R603 antibody 20 μg (n = 4).
- La figure 12 représente le suivi de la survie des souris après traitement intrastriatal ou sans traitement intrastriatal avec l'anticorps monoclonal LFB-R603. Le pool de résultats est obtenu à partir de deux expériences indépendantes (PCL_HO-24 et 25). Le test statistique est le test Log-rank entre le groupe traité et le groupe contrôle PBS 1 X. La courbe FIG. 12 represents the follow-up of the survival of the mice after intrastriatal treatment or without intrastriatal treatment with the monoclonal antibody LFB-R603. The result pool is obtained from two independent experiments (PCL_HO-24 and 25). The statistical test is the Log-rank test between the treated group and the PBS 1 X control group.
· * " représente le pourcentage de survie des souris traitées avec le PBS en fonction du nombre de jours après l'implantation de la tumeur. La courbe* * "Represents the percentage survival of the mice treated with the PBS as a function of the number of days after the implantation of the tumor.
"^- représente le pourcentage de survie des souris traitées avec 10 g de LFB-R603 en fonction du nombre de jours après l'implantation de la tumeur. La courbe représente le pourcentage de survie des souris traitées avec "^ - represents the percentage of survival of mice treated with 10 g of LFB-R603 depending on the number of days after tumor implantation The curve represents the percentage of survival of treated mice.
20 g de LFB-R603 en fonction du nombre de après l'implantation de la tumeur. La courbe "^" représente le pourcentage de survie des souris traitées avec 50 g de LFB-R603 en fonction du nombre de jours après l'implantation de la tumeur. La courbe * *** représente le pourcentage de survie des souris traitées avec 100 g de LFB-R603 en fonction des jours après l'implantation de la tumeur. - La figure 13 représente le suivi de la survie des souris après traitement intrastriatal ou sans traitement intrastriatal avec l'anticorps rituximab ou l'anticorps monoclonal LFB-R603. Le pool de résultats est obtenu à partir de deux expériences indépendantes (PCL_HO-14 et 15). Le test statistique est le test Log-rank entre le groupe traité et le groupe contrôle PBS 1X. La courbe ·* " représente le pourcentage de survie des souris du groupe contrôle en fonction du nombre de jours après l'implantation de la tumeur. La courbe "^- représente le pourcentage de survie des souris traitées avec 10 g/2 μί de rituximab en fonction du nombre de jours après l'implantation de la tumeur. La courbe "^ représente le pourcentage de survie des souris traitées avec 20 g/2 μί de rituximab en fonction du nombre de jours après l'implantation de la tumeur. La courbe représente le pourcentage de survie des souris traitées avec 50 g/2 μί de rituximab en fonction du nombre de jours après l'implantation de la tumeur. La courbe * *** représente le pourcentage de survie des souris traitées avec 20 g de LFB-R603 en fonction des jours après l'implantation de la tumeur. 20 g of LFB-R603 as a function of the number after tumor implantation. Curve "^" represents the percentage of survival of the mice treated with 50 g of LFB-R603 as a function of the number of days after the implantation of the tumor. The * * * * curve represents the percentage survival of the mice treated with 100 g of LFB-R603 as a function of the days after the implantation of the tumor. FIG. 13 represents the follow-up of the survival of the mice after intrastriatal treatment or without intrastriatal treatment with the rituximab antibody or the monoclonal antibody LFB-R603. The result pool is obtained from two independent experiments (PCL_HO-14 and 15). The statistical test is the Log-rank test between the treated group and the PBS 1X control group. The curve * * "represents the percentage survival of the mice of the control group as a function of the number of days after the implantation of the tumor.The curve " - represents the percentage of survival of the mice treated with 10 g / 2 μl of rituximab depending on the number of days after the implantation of the tumor. The curve represents the percentage survival of the mice treated with 20 g / 2 μl of rituximab as a function of the number of days after tumor implantation.The curve represents the percentage of survival of the mice treated with 50 g / 2 μl. The * * * * curve represents the percentage of survival of the mice treated with 20 g of LFB-R603 as a function of the days after the implantation of the tumor.
- La figure 14 représente le suivi de la survie des souris après traitement ou sans traitement avec l'anticorps monoclonal intrathécal LFB- R603. Le test statistique est le test Log-rank entre le groupe traité et le groupe contrôle PBS 1 X. La courbe · * " représente le pourcentage de survie des souris du groupe contrôle en fonction du nombre de jours après l'implantation de la tumeur. La courbe représente le pourcentage de survie des souris traitées avec 10 g/2 μί de l'anticorps R603 en fonction du nombre de jours après l'implantation de la tumeur. La courbe FIG. 14 represents the monitoring of the survival of the mice after treatment or without treatment with the intrathecal monoclonal antibody LFB-R603. The statistical test is the Log-rank test between the treated group and the PBS 1 X control group. The curve * * "represents the percentage survival of the mice of the control group as a function of the number of days after the implantation of the tumor. The curve represents the percentage of survival of the mice treated with 10 g / 2 μl of the R603 antibody as a function of the number of days after the implantation of the tumor.
"^- représente le pourcentage de survie des souris traitées avec 20 g/2 μί de l'anticorps R603 en fonction du nombre de jours après l'implantation de la tumeur. La courbe représente le pourcentage de survie des souris traitées avec 20 pg/5 μί de l'anticorps R603 en fonction du nombre de jours après l'implantation de la tumeur. La courbe représente le pourcentage de survie des souris traitées avec 50 pg/5 μί de R603 en fonction du nombre de jours après l'implantation de la tumeur. La courberepresents the percentage of survival of the mice treated with 20 g / 2 μl of the antibody R603 as a function of the number of days after the implantation of the tumor.The curve represents the percentage of survival of the mice treated with 20 μg / 5 μl of the antibody R603 as a function of the number of days after the implantation of the tumor The curve represents the percentage of survival of the mice treated with 50 μg / 5 μl of R603 in depending on the number of days after the implantation of the tumor. The curve
* *** représente le pourcentage de survie des souris traitées avec 20 g de LFB-R603 dans la masse tumorale en fonction du nombre de jours après l'implantation de la tumeur. * * * * represents the percentage of survival of the mice treated with 20 g of LFB-R603 in the tumor mass as a function of the number of days after the implantation of the tumor.
- La figure 15 représente le suivi de la survie des souris en fonction du temps (en jours) après une ré-administration aux souris de cellules tumorales. Les résultats sont obtenus à partir d'une expérience indépendante (PCL_HO21 ). Les étoiles représentent le nombre de souris malades dans chaque groupe au moment de la dernière analyse. La courbe ·*■ représente le pourcentage de survie des souris traitées par PBS en fonction du nombre de jours après la ré-administration. La courbe — représente le pourcentage de survie des souris traitées par 20 g de LFB-R603 en fonction du nombre de jours après la ré-administration. La courbe représente le pourcentage de survie des souris traitées par 50 g de rituximab en fonction du nombre de jours après la ré-administration. FIG. 15 represents the monitoring of the survival of the mice as a function of time (in days) after a re-administration to the mice of tumor cells. The results are obtained from an independent experiment (PCL_HO21). The stars represent the number of sick mice in each group at the time of the last analysis. · * ■ curve represents the percentage of survival of PBS-treated mice according to the number of days after readministration. The curve represents the percentage of survival of the mice treated with 20 g of LFB-R603 as a function of the number of days after the re-administration. The curve represents the percentage survival of the mice treated with 50 g of rituximab as a function of the number of days after the re-administration.
- La figure 16 représente le suivi de la survie des souris en fonction du temps (en jours) après une ré-administration aux souris de cellules tumorales. Les résultats sont obtenus à partir d'une expérience indépendante (PCL_HO23). ITH signifie « intrathécal », IST signifie « intrastriatal ». La courbe · * " représente le pourcentage de survie des souris traitées par PBS en fonction du nombre de jours après la ré-administration. La courbe — représente le pourcentage de survie des souris traitées par LFB-R603 in intrathécal en fonction du nombre de jours après la ré-administration. La courbe ~*~ représente le pourcentage de survie des souris traitées avec l'anticorps R603 en intrastriatal en fonction du nombre de jours après l'implantation de la tumeur. La courbe représente le pourcentage de survie des souris traitées avec le rituximab en intrathécal en fonction du nombre de jours après l'implantation de la tumeur.  FIG. 16 represents the monitoring of the survival of the mice as a function of time (in days) after a re-administration to the mice of tumor cells. The results are obtained from an independent experiment (PCL_HO23). ITH means "intrathecal", IST means "intrastriatal". The curve * * "represents the percentage survival of the PBS-treated mice as a function of the number of days after re-administration.The curve - represents the percentage of survival of the LFB-R603 treated mice in intrathecal as a function of the number of days. after the re-administration, the curve represents the percentage of survival of the mice treated with the R603 antibody intrastriatal as a function of the number of days after the implantation of the tumor.The curve represents the percentage of survival of the treated mice. with intrathecal rituximab based on the number of days after tumor implantation.
- La figure 17 représente la mesure de la sécrétion de cytokines par le test « cytokine beads array ». Les cellules du cerveau de souris portant un FIG. 17 represents the measurement of the secretion of cytokines by the "cytokine beads array" test. The cells of the mouse brain carrying a
LPC ont été isolées 14 jours après une thérapie anti-hCD20 et ont été stimulées (cercles blancs) ou pas (cercles noirs) avec des microbilles coatées avec des anti-CD3/CD28. Les surnageants ont ensuite été récupérés et analysés pour la présence d'IL-2, IFNy, IL-4, IL-10 et IL-17A. Chaque point représente un seul cerveau. Les barres discontinues représentent le taux basique pour chaque cytokine. LPC were isolated 14 days after anti-hCD20 therapy and were stimulated (white circles) or not (black circles) with microbeads coated with anti-CD3 / CD28. The supernatants were then recovered and analyzed for the presence of IL-2, IFNγ, IL-4, IL-10 and IL-17A. Each point represents a single brain. Discontinuous bars represent the basic rate for each cytokine.
- La figure 18 représente la détermination de l'activité luciférase des différents clones.  FIG. 18 represents the determination of the luciferase activity of the different clones.
EXEMPLES EXAMPLES
Exemple 1 : Construction des vecteurs d'expression de l'anticorps chimériques anti-CD20 EMAB603 Example 1 Construction of chimeric anti-CD20 EMAB603 expression vectors
A. Détermination de la séquence des régions variables de l'anticorps murin CAT-13.6E12 A. Determination of Variable Region Sequence of Mouse CAT-13.6E12
L'ARN total de l'hybridome murin CAT-13.6E12 (fournisseur : DSMZ, réf. ACC 474) produisant une immunoglobuline de type lgG2a,K a été isolé (kit RNAeasy, Qiagen réf. 74104). Après transcription inverse, les domaines variables des chaînes légères (VK) et lourdes (VH) de l'anticorps CAT-The total RNA of the murine hybridoma CAT-13.6E12 (supplier: DSMZ, ACC 474) producing lgG2a immunoglobulin type K was isolated (RNAeasy kit, Qiagen ref 74104). After reverse transcription, the variable domains of the light (VK) and heavy (VH) chains of the CAT-
13.6E12 ont été amplifiées par la technique de 5'RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) (kit GeneRacer, Invitrogen réf. L1500-01 ). Les amorces utilisées pour ces deux étapes sont les suivantes : 1 . amorces de transcription inverse 13.6E12 were amplified by the 5'RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) technique (GeneRacer kit, Invitrogen ref.L1500-01). The primers used for these two steps are as follows: 1. reverse transcription primers
a. Amorce antisens spécifique Kappa murin (SEQ ID NO : 9) at. Kappa specific antisense primer (SEQ ID NO: 9)
5' - ACT GCC ATC AAT CTT CCA CTT GAC -3' b. Amorce antisens spécifique G2a murin (SEQ ID NO : 10) 5'- CTG AGG GTG TAG AGG TCA GAC TG -3' 5 '- ACT GCC ATC AAT CTT CCA CTT GAC -3' b. Murine G2a specific antisense primer (SEQ ID NO: 10) 5'-CTG AGG GTG TAG AGG TCA GAC TG -3 '
2. amorces de PCR 5'RACE 2. PCR primers 5'RACE
a. Amorce antisens spécifique Kappa murin (SEQ ID NO : 1 1 ) at. Kappa-specific antisense primer (SEQ ID NO: 1 1)
5'- TTGTTCAAGAAGCACACGACTGAGGCAC -3' 5'- TTGTTCAAGAAGCACACGACTGAGGCAC -3 '
b. Amorce antisens spécifique G2a murin (SEQ ID NO : 12) b. Murine G2a specific antisense primer (SEQ ID NO: 12)
5'- GAGTTCCAG GTC AAG GTCACTG GCTCAG -3' Les produits de PCR VH et VK ainsi obtenus ont été clonés dans le vecteur pCR4Blunt-TOPO (Zéro blunt TOPO PCR cloning kit, Invitrogen, réf. K2875-20) puis séquencés. La séquence nucléotidique de la région VK de l'anticorps murin CAT-13.6E12 est indiquée sous la séquence SEQ ID NO : 1 , hormis le dernier nucléotide qui est remplacé par A (AAA au lieu de AAC) . Le gène VK appartient à la famille VK4 (Kabat et al., "Séquences of Proteins of Immunological Interest", NIH Publication, 91 -3242 (1991 ) [19]). La séquence nucléotidique de la région VH de CAT-13.6E12 est la séquence SEQ ID NO : 2. Le gène VH appartient à la famille VH1 ([19]). B. Construction des vecteurs d'expression des chaînes lourdes et des chaînes légères des anticorps chimériques EMAB603 5'-GAGTTCCAG GTC AAG GTCACTG GCTCAG -3 'The VH and VK PCR products thus obtained were cloned into the pCR4Blunt-TOPO vector (Zero blunt TOPO PCR cloning kit, Invitrogen, K2875-20) and sequenced. The nucleotide sequence of the VK region of the murine antibody CAT-13.6E12 is indicated under the sequence SEQ ID NO: 1, except the last nucleotide which is replaced by A (AAA instead of AAC). The VK gene belongs to the VK4 family (Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", NIH Publication, 91-3242 (1991) [19]). The nucleotide sequence of the VH region of CAT-13.6E12 is the sequence SEQ ID NO: 2. The VH gene belongs to the VH1 family ([19]). B. Construction of Expression Vectors for Heavy and Light Chains of Chimeric Antibodies EMAB603
1 . Vecteur chaîne légère Kappa de l'anticorps EMAB603 1. Kappa light chain vector of the EMAB603 antibody
La séquence VK clonée dans le vecteur de séquençage pCR4Blunt-TOPO a été amplifiée à l'aide des amorces de clonage suivantes : a) amorce sens VK (SEQ ID NO : 13) The VK sequence cloned into the pCR4Blunt-TOPO sequencing vector was amplified using the following cloning primers: a) VK sense primer (SEQ ID NO: 13)
5'-CTCAGTACTAGTGCCGCCACC/4rGGATTTTCAAGTGCAGATTTTC AG -3' La séquence soulignée correspond au site de restriction Spe I, la séquence en gras correspond à une séquence de Kozak consensus, l'ATG initiateur est en italiques. b) amorce antisens VK: (SEQ ID NO : 14) 5'-CTCAGTACTAGTGCCGCCACC / 4rGGATTTTCAAGTGCAGATTTTC AG -3 ' The underlined sequence corresponds to the Spe I restriction site, the bold sequence corresponds to a consensus Kozak sequence, the initiator ATG is in italics. b) VK antisense primer: (SEQ ID NO: 14)
5'- TGAAGACACTTGGTGCAGCCACAGTCCG[¾7TL4 TTTCCAGCCTGGT - 3'  5'- TGAAGACACTTGGTGCAGCCACAGTCCG [¾7TL4 TTTCCAGCCTGGT - 3 '
Cette amorce réalise la jonction des séquences VK murine (en italique) et région constante (CK) humaine (en gras). La séquence soulignée correspond au site de restriction Dra III. This primer joins the murine VK (in italic) and human constant region (CK) sequences (in bold). The underlined sequence corresponds to the Dra III restriction site.
Cette amorce réalise la jonction des séquences VK murine (en italique) et région constante (CK) humaine (en gras). La séquence soulignée correspond au site de restriction Dra III.  This primer joins the murine VK (in italic) and human constant region (CK) sequences (in bold). The underlined sequence corresponds to the Dra III restriction site.
Le produit de PCR VK ainsi obtenu contient la séquence codant le peptide signal naturel de l'anticorps murin CAT-13.6E12, avec la mutation AAÇ -> AAA (nucléotide encadré dans la séquence de l'amorce antisens SEQ ID NO : 14) qui correspond à la mutation N106K par rapport à la séquence naturelle VK de CAT-13.6E12. The VK PCR product thus obtained contains the sequence coding for the natural signal peptide of the murine antibody CAT-13.6E12, with the mutation AAÇ → AAA (nucleotide framed in the sequence of the antisense primer SEQ ID NO: 14) which corresponds to the mutation N106K compared to the natural sequence VK of CAT-13.6E12.
La séquence de la chaîne légère de l'anticorps chimérique EMAB603 codée par ce vecteur est présentée en SEQ ID NO : 5 pour la séquence nucléotidique et correspond à la séquence peptidique déduite SEQ ID NO : 7. The sequence of the light chain of the chimeric antibody EMAB603 encoded by this vector is presented in SEQ ID NO: 5 for the nucleotide sequence and corresponds to the deduced peptide sequence SEQ ID NO: 7.
Cette PCR VK a été ensuite clonée entre les sites Spe I et Dra III du vecteur de chimérisation chaîne légère (Fig. 1 ) qui correspond à la séquence SEQ ID NO : 1 , en 5' de la région constante CK humaine, dont la séquence nucléique est la séquence SEQ ID NO : 4. La séquence CK humaine de ce vecteur de chimérisation avait été préalablement modifiée par mutagénèse silencieuse afin de créer un site de restriction Dra III pour permettre le clonage de séquences VK murines. Ce vecteur de chimérisation contient un promoteur RSV et une séquence de polyadénylation bGH (bovine Growth Hormone) ainsi que le gène de sélection dhfr (dihydrofolate reductase) . 2. Vecteur chaîne lourde This VK PCR was then cloned between the Spe I and Dra III sites of the light chain chimeric vector (FIG 1) which corresponds to the sequence SEQ ID NO: 1, 5 'of the human CK constant region, whose sequence nucleic sequence is SEQ ID NO: 4. The human CK sequence of this chimerization vector was previously modified by silent mutagenesis to create a Dra III restriction site to allow the cloning of murine VK sequences. This chimerization vector contains an RSV promoter and a bGH (Growth Hormone) polyadenylation sequence as well as the dhfr (dihydrofolate reductase) selection gene. 2. Vector heavy chain
Une démarche similaire a été appliquée pour la chimérisation de la chaîne lourde de l'anticorps EMAB603. La séquence VH clonée dans le vecteur pCR4Blunt-TOPO a été tout d'abord amplifiée à l'aide des amorces de clonage suivantes : A similar approach has been applied for the chimericization of the heavy chain of the EMAB603 antibody. The VH sequence cloned into the pCR4Blunt-TOPO vector was first amplified using the following cloning primers:
a) amorce sens VH (SEQ ID NO :15) a) sense primer VH (SEQ ID NO: 15)
5'- CTCAGTACTAGTGCCGCCACC/47GGGATTCAGCAGGATCTTTCTC -3 La séquence soulignée correspond au site de restriction Spe I, la séquence en gras correspond à une séquence de Kozak consensus, l'ATG initiateur est en italique. b) amorce antisens VH (SEQ ID NO :16)  5'- CTCAGTACTAGTGCCGCCACC / 47GGGATTCAGCAGGATCTTTCTC -3 The underlined sequence corresponds to the Spe I restriction site, the bold sequence corresponds to a consensus Kozak sequence, the initiator ATG is in italic. b) VH antisense primer (SEQ ID NO: 16)
5'-5'-
GACCGATGGGÇÇÇTTGGTGGAGGCTGAGGAGACGGTGACTGAGGTTC GACCGATGGGÇÇÇTTGGTGGAGGCTGAGGAGACGGTGACTGAGGTTC
C -3'  C -3 '
Cette amorce réalise la jonction des séquences VH murine (en italique) et région constante Gl humaine (en gras). La séquence soulignée correspond au site de restriction Apa I . This primer joins the murine VH sequences (in italics) and the human Gl constant region (in bold). The underlined sequence corresponds to the Apa I restriction site.
Le fragment VH amplifié contient la séquence codant le peptide signal naturel de l'anticorps murin CAT-13.6E12. Cette PCR VH a été ensuite clonée entre les sites Spe I et Apa I du vecteur de chimérisation chaîne lourde (Fig. 2) qui correspond à la séquence SEQ ID NO : 2, en 5' de la région constante γΙ humaine dont la séquence nucléique est la séquence SEQ ID NO : 3. Ce vecteur de chimérisation contient un promoteur RSV et une séquence de polyadénylation bGH (bovine Growth Hormone) ainsi que le gène de sélection néo. The amplified VH fragment contains the sequence encoding the natural signal peptide of the murine antibody CAT-13.6E12. This VH PCR was then cloned between the Spe I and Apa I sites of the heavy chain chimeric vector (FIG 2) which corresponds to the sequence SEQ ID NO: 2, 5 'of the human γΙ constant region whose nucleic sequence is the sequence SEQ ID NO: 3. This chimerization vector contains an RSV promoter and a bGH (bovine Growth Hormone) polyadenylation sequence as well as the neo selection gene.
La séquence de la chaîne lourde de l'anticorps chimérique EMAB603 codée par ce vecteur est présenté en SEQ ID NO : 6 pour la séquence nucléotidique et en séquence SEQ ID NO : 8 pour la séquence peptidique déduite.  The sequence of the heavy chain of the chimeric antibody EMAB603 encoded by this vector is presented in SEQ ID NO: 6 for the nucleotide sequence and in sequence SEQ ID NO: 8 for the deduced peptide sequence.
3. Vecteurs d'expression finaux 3. Final expression vectors
Vecteur d'expression de l'anticorps EMAB603 Expression vector of the EMAB603 antibody
Un vecteur d'expression unique contenant les deux unités de transcription chaîne lourde et chaîne légère de l'anticorps anti-CD20 EMAB- 603 a été construit à partir des deux vecteurs de chimérisation de la chaîne légère et de la chaîne Ce vecteur d'expression HK463-25(FDA) présente deux gènes de sélection, néo (neo-phosphotransphérase II) et dhfr (dihydrofolate reductase) ainsi que deux unités de transcription chaîne lourde et chaîne légère sous le contrôle d'un promoteur RSV (Figure 3). Exemple 2 : Création de lignées cellulaires dérivées de la lignée A single expression vector containing the two heavy chain and light chain transcription units of the anti-CD20 EMAB-603 antibody was constructed from both the light chain and the chain chimerization vectors. HK463-25 (FDA) has two selection genes, neo (neo-phosphotranspherase II) and dhfr (dihydrofolate reductase), as well as two heavy chain and light chain transcription units under the control of an RSV promoter (Figure 3). Example 2 Creation of Cell Lines Derived from the Line
YB2/0 productrices de l'anticorps chimérique anti-CD20 EMAB603 YB2 / 0 producers of chimeric anti-CD20 antibody EMAB603
La lignée de rat YB2/0 (ATCC # CRL-1662) a été cultivée en milieu EMS (Invitrogen, réf. 041 -95181 M) contenant 5% de sérum de veau foetal (JRH Biosciences, réf. 12107). Pour la transfection, 5 millions de cellules ont été électroporées (électroporateur Biorad, modèle 1652077) en milieu Optimix (Equibio, réf. EKITE 1 ) avec 25 μg de vecteur chaîne légère, pRSV- HL-EMAB-603 pour l'expression de l'anticorps EMAB603. Les conditions d'électroporation appliquées étaient de 230 volts et 960 microfarads pour une cuvette de 0,5 ml. Chaque cuvette d'électroporation a été ensuite répartie surThe YB2 / 0 rat line (ATCC # CRL-1662) was cultured in EMS medium (Invitrogen, ref 041 -95181M) containing 5% fetal calf serum (JRH Biosciences, ref 12107). For transfection, 5 million cells were electroporated (Biorad electroporator, model 1652077) in Optimix medium (Equibio, reference EKITE 1) with 25 μg of light chain vector, pRSV-HL-EMAB-603 for the expression of EMAB603 antibody. The electroporation conditions applied were 230 volts and 960 microfarads for a 0.5 ml cuvette. Each electroporation cuvette was then distributed over
5 plaques P96 avec une densité de 5000 cellules/puits. La mise en milieu sélectif RPMI (Invitrogen, ref 21875- 034) contenant 5% de sérum dialyse (Invitrogen, réf. 10603-017), 500 μς/ιτιΙ de G418 (Invitrogen, réf. 10131 - 027) et 25 nM de methotrexate (Sigma, réf. M8407), a été réalisée 3 jours après la transfection. 5 P96 plates with a density of 5000 cells / well. Putting in selective RPMI medium (Invitrogen, ref 21875-034) containing 5% dialysis serum (Invitrogen, Cat # 10603-017), 500 μg / μl of G418 (Invitrogen, Cat # 10131-027) and 25nM of methotrexate (Sigma, Cat # M8407) was performed 3 days post-transfection.
Les surnageants des puits de transfection résistants ont été criblés pour la présence d'immunoglobulines (Ig) chimériques par dosage ELISA spécifique des séquences Ig humaines.  Supernatants from the resistant transfection wells were screened for the presence of chimeric immunoglobulins (Ig) by ELISA assay specific for human Ig sequences.
Les 10 transfectants produisant le plus d'anticorps ont été amplifiés en plaques P24 et leur surnageant redosé par ELISA afin d'estimer leur productivité et de sélectionner les 3 meilleurs producteurs pour le clonage par dilution limite (40 cellules/plaque) .  The transfectants producing the most antibodies were amplified in P24 plates and their supernatant redosed by ELISA in order to estimate their productivity and to select the 3 best producers for limiting dilution cloning (40 cells / plate).
A l'issue du clonage, le clone R603 a été sélectionné pour la production de l'anticorps chimérique EMAB603 et adaptés progressivement au milieu de production CD Hybridoma (Invitrogen, réf. 1 1279-023). La production des anticorps chimériques EMAB603 a été réalisée par expansion de la culture adaptée en milieu CD Hybridoma, obtenue par dilution à 3xl05 cellules/ml en flacons de 75 cm2 et 175 cm2 puis par dilution à 4,5x105 cellules/ml en flacon de type roller. Après avoir atteint le volume maximal, la culture a été poursuivie jusqu'à ce que la viabilité cellulaire ne soit plus que de 20%. Après production, les anticorps chimériques EMAB603 ont été purifiés par chromatographie d'affinité sur protéine A (pureté estimée par HPLC < 95 %) et contrôlés par électrophorèse en gel de polyacrylamide. After cloning, the R603 clone was selected for the production of the EMAB603 chimeric antibody and progressively adapted to the CD Hybridoma production medium (Invitrogen, ref 1 1279-023). The production of chimeric EMAB603 antibodies was carried out by expansion of the adapted culture in CD Hybridoma medium, obtained by dilution at 3 × 10 5 cells / ml in flasks of 75 cm 2 and 175 cm 2 and then by dilution at 4.5 × 10 5 cells / ml. in roll-type bottle. After reaching maximum volume, culture was continued until cell viability was only 20%. After production, chimeric EMAB603 antibodies were purified by protein A affinity chromatography (purity estimated by HPLC <95%) and monitored by polyacrylamide gel electrophoresis.
Exemple 3 : Démonstration et caractérisation de l'effet de R603 dans un modèle murin de lymphome cérébral primitif Example 3 Demonstration and Characterization of the Effect of R603 in a Murine Model of Primary Cerebral Lymphoma
3.1 Matériels Lignée cellulaire 3.1 Materials Cell line
On utilise une cellule de lymphome B murin transfectée avec une protéine de fusion du CD20 humain (cloné préalablement à partir de la lignée cellulaire Raji) et la GFP (Green Fluorescent Protein) par un système d'électroporation. Ces cellules transfectées avec le CD20 humain sont appelées A20.IIA-GFP-hCD20, tandis que les cellules non transfectées avec le CD20 humain sont appelées A20.IIA-GFP. Souris adultes A murine B cell lymphoma cell transfected with a human CD20 fusion protein (previously cloned from the Raji cell line) and GFP (Green Fluorescent Protein) is used by a system. electroporation. These cells transfected with human CD20 are called A20.IIA-GFP-hCD20, whereas cells not transfected with human CD20 are called A20.IIA-GFP. Adult mice
Des souris adultes BALB/c ByJ (H2 d) (Charles River Laboratory, L'ArbresIe Cedex France), âgées de 6 à 8 semaines, sont acclimatées pendant au moins une semaine après leur date de réception. On réalise une première injection intracérébrale entre la septième et la huitième semaine après leur réception. De la nourriture stérile et de l'eau filtrée leur sont administrées ad libitum. Les littières stériles des cages sont remplacées toutes les semaines. Adult BALB / c ByJ (H 2 d ) mice (Charles River Laboratory, L'ArbresIe Cedex France), aged 6 to 8 weeks, are acclimated for at least one week after their date of reception. A first intracerebral injection is made between the seventh and eighth week after their reception. Sterile food and filtered water are administered ad libitum. Sterile litter cages are replaced weekly.
Anticorps Antibody
Les 3 anticorps (LFB, Les Ulis, France) suivants sont utilisés :  The following 3 antibodies (LFB, Les Ulis, France) are used:
- l'anticorps R603, dans une solution batch G097/CD20/FC001 à 10 mg/ml. Une dilution est réalisée dans le tampon 10808108. L'anticorps R603 (également appelé EMAB603) est dirigé contre le CD20 humain (anti-hCD20),  the antibody R603, in a batch solution G097 / CD20 / FC001 at 10 mg / ml. A dilution is carried out in the buffer 10808108. The antibody R603 (also called EMAB603) is directed against human CD20 (anti-hCD20),
- l'anticorps anti-P24 comme contrôle négatif, dans le batch 829 the anti-P24 antibody as a negative control, in batch 829
09/020. 09/020.
- L'anticorps rituximab (anti-hCD20), dans le batch M59753 et la solution de stockage N40626 à une concentration de 10 mg/ml. 3.2 Méthodes  - The rituximab antibody (anti-hCD20), in batch M59753 and storage solution N40626 at a concentration of 10 mg / ml. 3.2 Methods
Injections intracérébrales Intracerebral injections
Les souris sont anesthésiées avec une injection intrapéritonéale de 60 μΙ de kétamine/xylazine diluée dans du PBS (tampon phosphate salin ou « Phosphate Buffer Saline ») stérile 1X. Les animaux sont ensuite placés dans un cadre stéréotaxique (Kopf®), puis une incision de la peau du crâne est réalisée et la surface de l'os est essuyée. Une perforation de l'os crânien est réalisé au-dessus du site choisi pour l'injection des cellules tumorales (2 mm médiane droite/ 0,4 mm front bregma), puis une aiguille gauge 26 est introduite lentement dans le cerveau (2,5 mm de profondeur depuis la surface du cerveau). 5.104 cellules tumorales A20.IIA-GFP-hCD20 diluées dans 2 μΙ avec du PBS 1 X sont injectées (0,5 μΙ/min), puis l'aiguille est retirée lentement du cerveau (0,5 mm/30secondes). Enfin, la plaie est suturée avec du fil Ethicon® et la peau est désinfectée. The mice are anesthetized with an intraperitoneal injection of 60 μl of ketamine / xylazine diluted in sterile 1 × PBS (saline phosphate buffer or "Phosphate Buffer Saline"). The animals are then placed in a stereotactic frame (Kopf®), then an incision of the skin of the skull is made and the surface of the bone is wiped. A perforation of the cranial bone is performed above the site chosen for injection of tumor cells (2 mm median right / 0.4 mm front bregma), then a needle gauge 26 is slowly introduced into the brain (2.5 mm deep from the surface of the brain). 5.10 4 A20.IIA-GFP-hCD20 tumor cells diluted in 2 μl with 1 X PBS are injected (0.5 μΙ / min), then the needle is slowly withdrawn from the brain (0.5 mm / 30sec). Finally, the wound is sutured with Ethicon® thread and the skin is disinfected.
Première injection First injection
5.104 cellules tumorales A20.IIA-GFP-hCD20 ou A20.IIA-GFP diluées dans 2 μΙ avec du PBS 1 X sont injectées à une localisation spécifique du cerveau : le striatum droit de chaque souris adulte. 5.10 4 A20.IIA-GFP-hCD20 or A20.IIA-GFP tumor cells diluted in 2 μl with 1 X PBS are injected at a specific location of the brain: the right striatum of each adult mouse.
Injections du traitement  Treatment injections
Chaque souris est traitée avec un des trois anticorps sept jours après que l'injection de cellules tumorales ait été réalisée (cf. Figures 4, 6 et 8).  Each mouse is treated with one of the three antibodies seven days after the injection of tumor cells has been performed (see Figures 4, 6 and 8).
Suivi de la survie Survival tracking
Après la chirurgie, les animaux sont pesés deux fois par semaine, et leur comportement général (après isolation du groupe) ainsi que leur aspect (poil hérissé, tumeur visible, cachexie) sont observés.  After the surgery, the animals are weighed twice a week, and their general behavior (after isolation of the group) and their appearance (bristly hair, visible tumor, cachexia) are observed.
Prélèvement des cellules Collection of cells
Pour les expérimentations destinées à l'étude du microenvironnement immunologique après le traitement des souris par anticorps dirigés contre le CD20 humain (anti-hCD20) dans le modèle LCP, les souris sont sacrifiées par dislocation cervicale et plusieurs organes sont prélevés.  For experiments designed to study the immunological microenvironment after the treatment of mice with antibodies directed against human CD20 (anti-hCD20) in the LCP model, the mice are sacrificed by cervical dislocation and several organs are removed.
Cerveau Brain
Le cerveau est prélevé et placé dans un réceptacle contenant 6 puits avec du milieu RPMI (Roswell Park Mémorial Institute médium). Les cellules cérébrales sont préparées par dissociation avec des ciseaux chirurgicaux. Après la dissociation, la suspension cellulaire est dissociée toutes les 30 minutes dans 2 ml de milieu RPMI à 0,4 μς/μΙ, contenant de la Liberase® (Roche Diagnostics) à 0,1 μς/μΙ et de la DNase I, et filtrée à travers une membrane 70 μιτι (BD Falcon) pour éliminer les contaminants les plus gros. Puis, afin de séparer les cellules de la myéline, un gradient de Percoll est réalisé et les cellules sont placées sur une plaque de 96 puits pour une analyse par FACS (« Fluorescence activated cell sorter »). The brain is removed and placed in a receptacle containing 6 wells with RPMI medium (Roswell Park Memorial Institute medium). Brain cells are prepared by dissociation with surgical scissors. After dissociation, the cell suspension is dissociated every 30 minutes in 2 ml of RPMI medium at 0.4 μς / μΙ, containing Liberase® (Roche Diagnostics) at 0.1 μς / μΙ and DNase I, and filtered through a membrane 70 μιτι (BD Falcon) for remove the largest contaminants. Then, in order to separate the cells from myelin, a Percoll gradient is made and the cells are placed on a 96-well plate for FACS analysis ("Fluorescence activated cell sorter").
Rate Missed
La rate est prélevée et placée dans un réceptacle de 6 puits contenant du PBS 1 X. Les cellules de la rate sont préparées par dissociation entre deux lamelles de microscope gelées. Après la dissociation, la suspension cellulaire est filtrée à travers une membrane de 70 μιτι (BD Falcon) pour éliminer les contaminants les plus gros. Puis les cellules sont placées dans une plaque de 96 puits pour une analyse par FACS.  The spleen is removed and placed in a 6-well receptacle containing 1X PBS. The spleen cells are prepared by dissociation between two frozen microscope slides. After dissociation, the cell suspension is filtered through a 70 μιτι membrane (BD Falcon) to remove the largest contaminants. The cells are then placed in a 96-well plate for FACS analysis.
Yeux eyes
Les yeux sont prélevés et nettoyés par retrait de la conjonctive et du nerf optique. Chaque œil collecté est placé dans un réceptacle de 24 puits contenant du PBS 1 X. Ils sont disséqués pour enlever le cristallin. Puis les yeux sont placés dans un nouveau puits contenant du PBS 1 X. L'œil entier à l'exception du cristallin est conservé pour être dissocié 30 minutes dans 500 μΙ de milieu RPMI à 0,4 μ9/μΙ, contenant de la Liberase® (Roche Diagnostics) à 0,1 μ9/μΙ et de la DNase I. Après dissociation, la suspension cellulaire est filtrée à travers une membrane 70 μιτι (BD Falcon) pour éliminer les contaminants les plus gros. Puis les cellules sont placées sur une plaque de 96 puits pour une analyse par FACS.  The eyes are removed and cleaned by removal of the conjunctiva and optic nerve. Each collected eye is placed in a 24-well receptacle containing 1X PBS. They are dissected to remove the lens. Then the eyes are placed in a new well containing 1X PBS. The whole eye except the lens is preserved for dissociation for 30 minutes in 500 μl of RPMI medium at 0.4 μ9 / μl, containing Liberase. ® (Roche Diagnostics) at 0.1 μ9 / μΙ and DNase I. After dissociation, the cell suspension is filtered through a 70 μιτι membrane (BD Falcon) to remove larger contaminants. Then the cells are placed on a 96-well plate for FACS analysis.
Ganglions cervicaux et inguinaux Cervical and inguinal ganglions
Les ganglions cervicaux et inguinaux sont prélevés et placés dans un réceptacle de 96 puits contenant 500 μΙ de PBS 1 X. Ils sont dissociés pendant 30 minutes dans 500 μΙ de PBS 1 X 0,4 μ9/μΙ, contenant de la Liberase® (Roche Diagnostics) à 0,1 μ9/μΙ et de la DNase I. Après dissociation, la suspension cellulaire est filtrée à travers une membrane 70 μιτι (BD Falcon) pour éliminer les contaminants les plus gros. Puis les cellules sont placées sur une plaque de 96 puits pour une analyse par FACS. Analyse par FACS The cervical and inguinal ganglia are removed and placed in a 96-well receptacle containing 500 μl of 1 × PBS. They are dissociated for 30 minutes in 500 μl of PBS 1 × 0.4 μ9 / μl, containing Liberase® (Roche Diagnostics) at 0.1 μ9 / μΙ and DNase I. After dissociation, the cell suspension is filtered through a membrane 70 μιτι (BD Falcon) to remove the largest contaminants. Then the cells are placed on a 96-well plate for FACS analysis. FACS analysis
Les données sont acquises au moyen du cytomètre de flux à 1 1 couleurs (LSRII, BD Biosciences) et les analyses réalisées avec le logiciel associé (Diva, BD Biosciences). Pour les cellules restantes, 106 cellules provenant de la suspension cellulaire préalablement préparée sont introduites dans la plaque de 96 puits. Les récepteurs murins Fcy sont d'abord saturés avec l'anticorps 2.4G2 (anticorps monoclonal anti- CD16/CD32). Puis les cellules sont incubées avec un mélange contenant les anticorps suivants : l'anticorps murin anti-CD19/APC (exprimé par les cellules tumorales et les lymphocytes B endogènes) (6D5; e-Bioscience), l'anticorps murin anti-CD4/PETR (exprimé par les lymphocytes CD4+) (GK1 .5; BD Biosciences), et l'anticorps murin anti-CD8/AF400 (exprimé par les lymphocytes CD8+) (53-6.7; BD Biosciences). Les cellules vivantes sont définies au moyen du détecteur de granulosité et de réfringence des cellules (Side scatter : SSC) et du détecteur de taille (Forward scatter : FSC) des cellules, après exclusion de l'autofluorescence et des doublets cellulaires. The data are acquired using the 1-color flow cytometer (LSRII, BD Biosciences) and the analyzes carried out with the associated software (Diva, BD Biosciences). For the remaining cells, 10 6 cells from the previously prepared cell suspension are introduced into the 96-well plate. The Fcy murine receptors are first saturated with the antibody 2.4G2 (anti-CD16 / CD32 monoclonal antibody). The cells are then incubated with a mixture containing the following antibodies: the murine anti-CD19 / APC antibody (expressed by the tumor cells and the endogenous B lymphocytes) (6D5; e-Bioscience), the murine anti-CD4 antibody / PETR (expressed by CD4 + lymphocytes) (GK1.5, BD Biosciences), and murine anti-CD8 / AF400 antibody (expressed by CD8 + lymphocytes) (53-6.7, BD Biosciences). Live cells are defined using the Cell Scatter (SSC) and Forward Scatter (FSC) cells, after exclusion of autofluorescence and cell doublets.
3.3 Résultats 3.3 Results
Les groupes de souris sont comparés par :  The groups of mice are compared by:
- le test de Kaplan-Meier (expériences PCL HO2, HO3, HO4 et HO6) - le test non paramétrique de Mann Whitney (expérience PCL HO5).  - the Kaplan-Meier test (PCL experiments HO2, HO3, HO4 and HO6) - the non-parametric Mann Whitney test (PCL HO5 experiment).
3.3 Résultats 3.3 Results
Les groupes de souris sont comparés par : The groups of mice are compared by:
- le test de Kaplan-Meier (expériences PCL HO2, HO3, HO4 et HO6) - le test non paramétrique de Mann Whitney (expérience PCL HO5). 3.3.1 Etude de l'effet de l'anticorps R603 sur la croissance tumorale Pour ces expériences, les groupes testés sont les suivants : - the Kaplan-Meier test (PCL experiments HO2, HO3, HO4 and HO6) - the non-parametric Mann Whitney test (PCL HO5 experiment). 3.3.1 Study of the effect of the R603 antibody on tumor growth For these experiments, the groups tested are as follows:
- 9 souris n'ayant subi aucun traitement,  - 9 mice not undergoing any treatment,
- 5 souris traitées avec 2 μΙ de PBS 1X,  5 mice treated with 2 μl of 1X PBS,
- 7 souris traitées avec 2 μΙ de tampon de l'anticorps R603,  7 mice treated with 2 μl of R603 antibody buffer,
- 4 souris traiées avec 2 μΙ d'anticorps anti-P24.  4 mice treated with 2 μl of anti-P24 antibody.
Chaque groupe de souris reçoit une injection tumorale suivie 7 jours plus tard d'une injection de PBS 1 X (PCL HO2) ou de tampon contenant l'anticorps R603 ou l'anticorps anti-P24 (PCL HO6) (excepté pour le groupe non traité) (cf. Figure 4).  Each group of mice receives a tumor injection followed 7 days later by an injection of 1X PBS (PCL HO2) or buffer containing the R603 antibody or the anti-P24 antibody (PCL HO6) (except for the non-group). treated) (see Figure 4).
Les résultats obtenus sont montrés sur la figure 5, qui représente le suivi de la survie pour les 4 groupes d'animaux après la mise en œuvre du protocole d'injection défini ci-dessus. Les résultats proviennent d'un pool de six expériences indépedantes : PCL HO2, PCL HO3, PCL HO4, PCL HO6, PCL HO8 et PCL HO9. Quand les 4 groupes sont comparés, aucune différence significative n'est observée entre le groupe non traité et le groupe traité avec l'anticorps monoclonal anti-P24, ni entre le groupe non traité avec le groupe traité avec le tampon de l'anticorps LFB-R603.  The results obtained are shown in FIG. 5, which represents the monitoring of the survival for the 4 groups of animals after the implementation of the injection protocol defined above. The results come from a pool of six independent experiments: PCL HO2, PCL HO3, PCL HO4, PCL HO6, PCL HO8 and PCL HO9. When the 4 groups were compared, no significant difference was observed between the untreated group and the anti-P24 monoclonal antibody treated group, or between the non-treated group with the LFB antibody buffer -R603.
3.3.2 Etude de l'efficacité dose-réponse des anticorps anti-CD20 humain dans le modèle de LCP murin et comparaison avec le rituximab: protocole expérimental n°1 3.3.2 Study of the dose-response efficacy of human anti-CD20 antibodies in the murine LCP model and comparison with rituximab: experimental protocol n ° 1
Pour ce protocole expérimental, 5 groupes de souris sont testés et cette expérience est répétée 2 fois :  For this experimental protocol, 5 groups of mice are tested and this experiment is repeated twice:
- 10 souris sont traitées avec 2 μΙ de PBS 1 X,  10 mice are treated with 2 μl of 1 × PBS,
- 10 souris sont traitées avec l'anticorps R603 à 1 Mg/2 l,  10 mice are treated with the antibody R603 at 1 Mg / 2 l,
- 10 souris sont traitées avec l'anticorps R603 à 5 Mg/2 l,  10 mice are treated with the R603 antibody at 5 mg / 2 l,
- 10 souris sont traitées avec l'anticorps R603 à 20 Mg/2 l,  - 10 mice are treated with the antibody R603 at 20 Mg / 2 l,
- 10 souris sont traitées avec l'anticorps rituximab à 20 g/2 l.  10 mice are treated with rituximab antibody at 20 g / 2 l.
Chaque groupe reçoit une injection tumorale suivie 7 jours plus tard par une injection thérapeutique (cf. figure 6). Each group receives a tumor injection followed 7 days later by a therapeutic injection (see Figure 6).
Les résultats obtenus sont rapportés à la figure 7, qui représente le suivi de la survie des 5 groupes testés suivant le protocole n° 1 . Les résultats proviennent d'un pool de 2 expériences indépedantes : PCL HO3 et PCL HO4. The results obtained are reported in FIG. 7, which represents the monitoring of the survival of the 5 groups tested according to protocol No. 1. The results come from a pool of 2 independent experiments: PCL HO3 and PCL HO4.
Des différences significatives sont observées entre le groupe contrôle PBS 1 X et les groupes traités avec un des anticorps anti-CD20 humains suivants : R603 à 20 pg (P<0,001 ), R603 à 5 pg (P<0,024), rituximab à 20 pg (P<0,0028). Aucune différence significative n'est observée entre le groupe contrôle PBS 1 X et le groupe traité avec R603 à 1 pg. De plus, comme des différences significatives sont observées entre les groupes R603 à 20 pg et R603 à 1 pg (P<0,001 ) et entre les groupes R603 à 20 pg et R603 à 5 pg (P=0,0033), on conclut à un effet dose-réponse du traitement au moyen de l'anticorps R603. Aucune différence significative n'est constatée entre le groupe R603 àSignificant differences were observed between the 1X PBS control group and the groups treated with one of the following human anti-CD20 antibodies: R603 at 20 μg (P <0.001), R603 at 5 μg (P <0.024), rituximab at 20 μg (P <0.0028). No significant difference was observed between the 1X PBS control group and the 1μg R603 treated group. In addition, since significant differences were observed between the R603 groups at 20 μg and R603 at 1 μg (P <0.001) and between the R603 at 20 μg and R603 at 5 μg (P = 0.0033), it was concluded that a dose-response effect of the treatment using the R603 antibody. No significant difference is found between the R603 group at
20 g et le groupe rituximab à 20 g (P=0,074) en utilisant le test statistique Kaplan-Meyer. Toutefois, en comparaison avec le groupe contrôle PBS 1 X, l'anticorps R603 à 20 g (P<0,001 ) montre une survie accrue et une mortalité retardée des souris non survivantes au regard de celles obtenues avec le rituximab à 20 pg (P=0,028). De plus, la survie globale de ces 2 groupes traités est clairement différente : 50% de survie (5/10) des souris traitées avec le R603 à 20 pg, contre 10% de survie (1/10) des souris traitées avec rituximab à 20 pg. 20 g and rituximab group at 20 g (P = 0.074) using the Kaplan-Meyer statistical test. However, in comparison with the 1X PBS control group, the R603 antibody at 20 g (P <0.001) showed increased survival and delayed mortality of the non-surviving mice compared to those obtained with rituximab at 20 μg (P = 0.028). In addition, the overall survival of these 2 treated groups is clearly different: 50% survival (5/10) of the R603-treated mice at 20 μg compared to 10% survival (1/10) of the mice treated with rituximab at 20 pg.
3.3.3 Etude du microenvironnement après le traitement avec les anticorps anti-CD20 humain dans le modèle murin de LCP : protocole expérimental n°2 Pour ce protocole expérimental, 5 groupes de souris sont testés une fois de la manière suivante : 3.3.3 Microenvironmental study after treatment with human anti-CD20 antibodies in the LCP murine model: Experimental Protocol No. 2 For this experimental protocol, 5 groups of mice are tested once as follows:
- 10 souris sont traitées avec 2 μΙ de PBS 1 X, 10 mice are treated with 2 μl of 1 × PBS,
- 10 souris sont traitées avec rituximab à 2 g/2 l,  10 mice are treated with rituximab at 2 g / 2 l,
- 10 souris sont traitées avec l'anticorps R603 à 20 Mg/2 l,  - 10 mice are treated with the antibody R603 at 20 Mg / 2 l,
- 10 souris sont traitées avec rituximab à 5 Mg/2 l,  10 mice are treated with rituximab at 5 mg / 2 l,
- 10 souris sont traitées avec rituximab à 1 g/2 l.  - 10 mice are treated with rituximab at 1 g / 2 l.
Chaque groupe reçoit une injection tumorale suivie d'une injection thérapeutique unique 7 jours après. Pour chaque souris 15 jours après le traitement, le cerveau, les 2 yeux, la rate et les ganglions cervicaux et inguinaux sont prélevés et une analyse par FACS est réalisée. Each group receives a tumor injection followed by a single therapeutic injection 7 days later. For each mouse 15 days after treatment, brain, eyes, spleen and cervical and inguinal ganglia are removed and FACS analysis is performed.
Les résultats obtenus sont montrés sur la figure 8, qui représente le pourcentage de cellules tumorales 15 jours après le traitement et selon les doses d'anticorps anti-CD20 humain injectées. Un effet anti-tumoral très significatif du R603 à 20 pg/2 l est obtenuThe results obtained are shown in FIG. 8, which represents the percentage of tumor cells 15 days after the treatment and according to the doses of human anti-CD20 antibodies injected. A very significant anti-tumor effect of R603 at 20 μg / 2 l is obtained
(P=0,009) à un niveau cellulaire en comparaison avec le groupe contrôle PBS 1 X. Les doses les plus faibles testées (1 g et 5 g) n'ont pas permis d'observer un effet significatif. Un effet significatif, mais moindre (P=0,047) a été observé sur le groupe traité avec le rituximab à 20 g. (P = 0.009) at a cellular level compared with the PBS 1 X control group. The lowest doses tested (1 g and 5 g) failed to observe a significant effect. A significant but lesser effect (P = 0.047) was observed on the rituximab-treated group at 20 g.
3.3.4 Etude de la spécificité anti-hCD20 de l'anticorps monoclonal LFB- R603 comparant l'efficacité sur les cellules tumorales A20.IIA-GFP et A20.IIA-GFP-hCD20 dans le modèle PCL : protocole expérimental n° 3 3.3.4 Study of the anti-hCD20 specificity of the monoclonal antibody LFB-R603 comparing the efficacy on the A20.IIA-GFP and A20.IIA-GFP-hCD20 tumor cells in the PCL model: experimental protocol no.3
Pour ce protocole expérimental, quatre groupes sont testés une fois : - cinq souris reçoivent les cellules tumorales A20.IIA-GFP-hCD20 et sont traitées avec le PBS 1 X 2 μί, - cinq souris reçoivent les cellules tumorales A20.IIA-GFP et sont traitées avec le PBS 1X 2 μΙ_, For this experimental protocol, four groups are tested once: - five mice receive the A20.IIA-GFP-hCD20 tumor cells and are treated with PBS 1 X 2 μί, five mice receive the A20.IIA-GFP tumor cells and are treated with 1 × 2 PBS μΙ,
- quatorze souris reçoivent les cellules tumorales A20.IIA-GFP- hCD20 et sont traitées avec l'anticorps LFB-R603 à 20 pg,  fourteen mice receive the A20.IIA-GFP-hCD20 tumor cells and are treated with the LFB-R603 antibody at 20 μg,
- trois souris reçoivent les cellules tumorales A20.IIA-GFP-hCD20 et sont traitées avec 20 g d'anticorps LFB-R603.  three mice receive the A20.IIA-GFP-hCD20 tumor cells and are treated with 20 g of LFB-R603 antibody.
Chaque groupe reçoit les cellules tumorales A20.IIA-GFP-hCD20 ou A20.IIA-GFP (2 μΙ de suspension cellulaire à 5.104 cellules) en intracérébral puis une unique injection thérapeutique intracérébrale sept jours plus tard. Each group receives the A20.IIA-GFP-hCD20 or A20.IIA-GFP tumor cells (2 μl of cell suspension at 5 × 10 4 cells) intracerebrally and then a single intracerebral therapeutic injection seven days later.
Résultats Results
Les résultats sont illustrés par la figure 9, qui représente le suivi de la survie des quatre groupes testés. The results are shown in Figure 9, which shows the survival of the four groups tested.
Quand les quatre groupes sont comparés, il est clair que le groupe ayant subi l'injection des cellules tumorales A20.IIA-GFP-hCD20 et le traitement avec l'anticorps LFB-R603 à 20 g présente une meilleure survie comparé aux autres groupes. When all four groups are compared, it is clear that the group injected with A20.IIA-GFP-hCD20 tumor cells and treatment with LFB-R603 antibody at 20 g has better survival compared to other groups.
Une différence significative est observée entre les souris ayant subi une injection avec les cellules tumorales A20.IIA-GFP-hCD20 et le traitement avec l'anticorps LFB-R603 à 20 g et le groupe ayant subi une injection avec les cellules tumorales A20.IIA-GFP et le traitement avec l'anticorps LFB- R603 en intracérébral. A significant difference is observed between the mice injected with the A20.IIA-GFP-hCD20 tumor cells and the treatment with the LFB-R603 antibody at 20 g and the group injected with the A20.IIA tumor cells. -GFP and treatment with LFB-R603 antibody intracerebrally.
De plus, une différence significative (P<0,0001 ) est constatée entre le groupe de souris ayant subi une injection avec les cellules tumorales A20.IIA-GFP-hCD20 et le traitement avec PBS 1X et le groupe de souris ayant subi une injection avec les cellules tumorales A20.IIA-GFP-hCD20 et l'anticorps LFB-R603 à 20 g en intracérébral. Ces résultats montrent bien que l'anticorps monoclonal R603 a un effet spécifique anti-hCD20. In addition, a significant difference (P <0.0001) was observed between the group of injected mice with A20.IIA-GFP-hCD20 tumor cells and treatment with PBS 1X and the group of injected mice. with the A20.IIA-GFP-hCD20 tumor cells and the LFB-R603 antibody at 20 g intracerebrally. These results clearly show that the monoclonal antibody R603 has a specific anti-hCD20 effect.
3.3.5 Etude de l'efficacité des anticorps anti-hCD20 par des essais avec différentes voies d'injections dans le modèles murin de LCP : protocole expérimental n° 4 3.3.5 Study of the efficacy of anti-hCD20 antibodies by assays with different injection routes in the LCP mouse model: Experimental Protocol No. 4
Pour ce protocol, quatre groupes sont testés et cette expérience est répétée deux fois : For this protocol, four groups are tested and this experiment is repeated twice:
- cinq souris sont traitées en injection intraveineuse avec 2 μΙ_ de PBS 1 X, five mice are treated by intravenous injection with 2 μl of 1 × PBS,
- cinq souris sont traitées en injection intracérébrale avec l'anticorps LFB-R603 à 20 pg,  five mice are treated by intracerebral injection with the LFB-R603 antibody at 20 μg,
- cinq souris sont traitées en intrathécale avec l'anticorps LFB-R603 à 20 ig,  five mice are treated intrathecally with the LFB-R603 antibody at 20 μg,
- quatre souris sont traitées en intraveineuse avec l'anticorps LFB- R603 à 6,6 mg.  four mice are treated intravenously with the LFB-R603 antibody at 6.6 mg.
Chaque groupe reçoit une injection tumorale de 2 μΙ_ de suspension cellulaire à 5.104 de cellules A20.IIA-GFP-hCD20, suivie sept jours plus tard par une injection unique thérapeutique intracérébrale, intrathécale ou intraveineuse. Each group receives a tumor injection of 2 μl of cell suspension with 5 × 10 4 of A20.IIA-GFP-hCD20 cells, followed seven days later by a single intracerebral, intrathecal or intravenous therapeutic injection.
Résultats Results
Les résultats obtenus sont représentés sur la figure 10. The results obtained are shown in FIG.
Des différences significatives sont observées entre le groupe traité avec le PBS 1 X en intraveineuse et le groupe traité avec l'anticorps LFB-R603 à 20 g en intraveineuse (P=0,0198). L'administration intracérébrale (intrastriatale) et l'administration intrathécale de 20 g d'anticorps LFB-R603 montrent un effet thérapeutique similaire jusqu'à 80 jours de traitement. Toutefois, en raison du faible nombre de sourir dans ces groupes (n<5), le test statistique n'a pas été réalisé. Certains animaux traités par injection intrathécale ou intraveineuse sont inclues dans une autre expérience pour augmenter le nombre totale de souris dans chaque groupe. Significant differences were observed between the intravenous 1X PBS group and the LFB-R603 antibody group at 20g intravenously (P = 0.0198). Intracerebral (intrastriatal) administration and intrathecal administration of 20 g of LFB-R603 antibody showed a similar therapeutic effect up to 80 days of treatment. However, because of the low number of smiles in these groups (n <5), the statistical test was not performed. Some animals treated with intrathecal or intravenous injection are included in another experiment to increase the total number of mice in each group.
3.3.6 Etude de la génération d'une réponse mémoire adaptative parmis les souris survivantes : protocole expérimental n° 5 3.3.6 Study of the Generation of an Adaptive Memory Response Among Surviving Mice: Experimental Protocol No. 5
Pour ce protocole expérimental, les cinq souris suivantes sont concernées : For this experimental protocol, the following five mice are concerned:
- une souris survivante traitée avec 20 g de rituximab, a surviving mouse treated with 20 g of rituximab,
- quatre souris survivantes traitées avec 20 g d'anticorps LFB-R603. Chaque souris survivante reçoit après le centième jour consécutif au traitement une nouvelle injection de 2 μΙ de suspension cellulaire à 5.104 de cellules tumorales A20.IIA-GFP-hCD20 dans le striatum controlatéral gauche, sans autre nouveau traitement. four surviving mice treated with 20 g of LFB-R603 antibody. Each surviving mouse receives, after the hundredth day following the treatment, a new injection of 2 μl of cell suspension with 5 × 10 4 of A20.IIA-GFP-hCD20 tumor cells in the left contralateral striatum, without any further treatment.
Résultats Results
Les résultats du suivi de la survie des souris obtenus sont présentés en figure 1 1 . The results of monitoring the survival of the mice obtained are presented in FIG.
Une survie augmentée est obtenue pour les souris traitées avec l'anticorps LFB-R603 puisque 50% de ces souris sont encore en vie 60 jours après la ré-injection de cellules tumorales A20.IIA-hCD20 sans nouveau traitement. En effet, les souris contrôle non traitées à la première injection meurent entre 20 et 40 jours après l'injection des cellules tumorales. Au contraire, la souris traitée avec riruximab et ayant subi une nouvelle injection de cellules tumorale est morte 48 jours après avoir subi une nouvelle injection de cellules tumorales, sans nouveau traitement. An increased survival is obtained for the mice treated with the LFB-R603 antibody since 50% of these mice are still alive 60 days after the re-injection of A20.IIA-hCD20 tumor cells without new treatment. In fact, the untreated control mice at the first injection die between 20 and 40 days after injection of the tumor cells. In contrast, the mouse treated with riruximab and re-injected with tumor cells died 48 days after re-injection of tumor cells without further treatment.
Ainsi, une mémoire adaptive (sur aux cellules T et/ou B) est observée et pourrait être impliquée dans la survie plus longue des souris ayant subi une deuxième injection de cellules tumorales, sans que cette hypothèse sur le mécanisme d'action des anticorps ne lie la Demanderesse d'une façon quelconque. Thus, adaptive memory (on T and / or B cells) is observed and could be involved in the longer survival of the mice having undergone a second injection of tumor cells, without this hypothesis on the mechanism of action of the antibodies. binds the Claimant in some way.
Conclusions conclusions
Dans les différents protocoles expérimentaux testés, il a été démontré que : - une injection intratumorale de tampon de l'anticorps R603 n'influence pas la croissance tumorale, In the various experimental protocols tested, it has been demonstrated that: an intratumoral injection of buffer of the R603 antibody does not influence the tumor growth,
- une injection d'anticorps anti-CD20 humain R603 dans le site de la tumeur induit efficacement un effet anti-tumoral dose-réponse, constaté à la fois sur le suivi de la survie et au niveau cellulaire, associé à un taux de survie élevé de 50%,  an injection of human R603 anti-CD20 antibody into the tumor site effectively induces a dose-response anti-tumor effect, found on both survival and cell level monitoring, associated with a high survival rate 50%,
- une injection d'anticorps anti-CD20 humain rituximab (20 g) dans le site de la tumeur induit un effet anti-tumoral constaté à la fois sur le suivi de la survie et au niveau cellulaire, mais associé à un taux de survie beaucoup plus faible (10%) qu'avec l'anticorps LFB-R603, - l'effet spécifique anti-hCD20 de l'anticorps LFB-R603 est confirmé avec les cellules A20.IIA-GFP,  - An injection of human anti-CD20 rituximab antibody (20 g) into the tumor site induces an anti-tumor effect observed both on survival monitoring and at the cellular level, but associated with a very high survival rate. lower (10%) than with the LFB-R603 antibody, - the anti-hCD20 specific effect of the LFB-R603 antibody is confirmed with the A20.IIA-GFP cells,
- une expérience consistant en une ré-injection des souris survivantes avec des cellules A20.IIA-GFP-hCD20 pourrait permettre de penser qu'une réponse adaptive a été générée par le traitement au moyen de l'anticorps LFB-R603. an experiment consisting of re-injection of the surviving mice with A20.IIA-GFP-hCD20 cells could make it possible to think that an adaptive response has been generated by treatment with the LFB-R603 antibody.
Exemple 4 : Expériences de dose-réponse, administration par voie intrathécale, effet d'injections successives intrastriatales et sur la réponse immune mémoire de LFB-R603 Example 4: Dose-response experiments, intrathecal administration, effect of successive intrastriatal injections and on the immune memory response of LFB-R603
4.1 Matériels 4.1 Materials
Lignée cellulaire Cell line
On utilise une cellule de lymphome B murin transfectée avec une protéine de fusion du CD20 humain (cloné préalablement à partir de la lignée cellulaire Raji) et la GFP (Green Fluorescent Protein) par un système d'électroporation. Ces cellules transfectées avec le CD20 humain sont appelées A20.IIA-GFP-hCD20, tandis que les cellules non transfectées avec le CD20 humain sont appelées A20.IIA-GFP.  A murine B cell lymphoma cell transfected with a human CD20 fusion protein (previously cloned from the Raji cell line) and GFP (Green Fluorescent Protein) was used by an electroporation system. These cells transfected with human CD20 are called A20.IIA-GFP-hCD20, whereas cells not transfected with human CD20 are called A20.IIA-GFP.
Les cellules exprimant les taux les plus élevés de GFP et de CD20 humain sont ensuite triées, sous-clonées par dilution limite et un nouveau clone des cellules A20.IIAGFP-hCD20 est généré et est appelé « A20.IIA- GFP-hCD20 (cl.20) ». Souris adultes  The cells expressing the highest levels of GFP and human CD20 are then sorted, subcloned by limiting dilution and a new A20.IIAGFP-hCD20 cell clone is generated and is called "A20.IIA-GFP-hCD20 (cl. .20) ". Adult mice
Des souris adultes BALB/c ByJ (H2 d) (Charles River Laboratory, L'ArbresIe Cedex France), âgées de 6 à 8 semaines, sont acclimatées pendant au moins une semaine après leur date de réception. On réalise une première injection intracérébrale entre la septième et la huitième semaine après leur réception. De la nourriture stérile et de l'eau filtrée leur sont administrées ad libitum. Les littières stériles des cages sont remplacées toutes les semaines. Adult BALB / c ByJ (H 2 d ) mice (Charles River Laboratory, L'ArbresIe Cedex France), aged 6 to 8 weeks, are acclimated for at least one week after their date of reception. A first intracerebral injection is made between the seventh and eighth week after their reception. Sterile food and filtered water are administered ad libitum. Sterile litter cages are replaced weekly.
Anticorps Les quatre anticorps (LFB, Les Ulis, France) suivants sont utilisés :Antibody The following four antibodies (LFB, Les Ulis, France) are used:
- l'anticorps R603, dans une solution stock G097/CD20/FC001 à 10 mg/ml ou une solution batch à 125 g/L. Une dilution est réalisée dans le tampon 10808108. L'anticorps R603 (également appelé EMAB603) est dirigé contre le CD20 humain (anti-hCD20), the antibody R603, in a stock solution G097 / CD20 / FC001 at 10 mg / ml or a batch solution at 125 g / l. A dilution is carried out in the buffer 10808108. The antibody R603 (also called EMAB603) is directed against human CD20 (anti-hCD20),
- l'anticorps anti-P24 comme contrôle négatif, dans le batch 829 09/020.  the anti-P24 antibody as a negative control, in batch 829 09/020.
- L'anticorps rituximab (anti-hCD20), dans le batch M59753 et la solution de stockage N40626 à une concentration de 10 mg/ml.  - The rituximab antibody (anti-hCD20), in batch M59753 and storage solution N40626 at a concentration of 10 mg / ml.
4.2 Méthodes 4.2 Methods
4.2.1 Injections intrastriales et intrathécales Injections intrastriatales 4.2.1 Intrastrial and Intrathecal Injections Intrastriatal Injections
Les souris sont anesthésiées avec une injection intrapéritonéale de 60 μΙ de kétamine/xylazine diluée dans du PBS (tampon phosphate salin ou « Phosphate Buffer Saline ») stérile 1X. Les animaux sont ensuite placés dans un cadre stéréotaxique (Kopf®), puis une incision de la peau du crâne est réalisée et la surface de l'os est essuyée. Une perforation de l'os crânien est réalisé au-dessus du site choisi pour l'injection des cellules tumorales (2 mm médiane droite/ 0,4 mm front bregma), puis une aiguille gauge 26 est introduite lentement dans le cerveau (2,5 mm de profondeur depuis la surface du cerveau). 5.104 cellules tumorales A20.IIA-GFP-hCD20 diluées dans 2 μΙ avec du PBS 1 X sont injectées (0,5 μΙ/min), puis l'aiguille est retirée lentement du cerveau (0,5 mm/30secondes). Enfin, la plaie est suturée avec du fil Ethicon® et la peau est désinfectée. The mice are anesthetized with an intraperitoneal injection of 60 μl of ketamine / xylazine diluted in sterile 1 × PBS (saline phosphate buffer or "Phosphate Buffer Saline"). The animals are then placed in a stereotactic frame (Kopf®), then an incision of the skin of the skull is made and the surface of the bone is wiped. A perforation of the cranial bone is performed above the site chosen for the injection of the tumor cells (2 mm median right / 0.4 mm front bregma), then a gauge needle 26 is introduced slowly into the brain (2, 5 mm deep from the surface of the brain). 5.10 4 A20.IIA-GFP-hCD20 tumor cells diluted in 2 μl with 1 X PBS are injected (0.5 μΙ / min), then the needle is slowly withdrawn from the brain (0.5 mm / 30sec). Finally, the wound is sutured with Ethicon® thread and the skin is disinfected.
Injections intrathécales Intrathecal injections
Les souris sont anesthésiées avec une injection intrapéritonéale de 60 μΙ de kétamine/xylazine diluée dans du PBS stérile 1 X, et sont placées dans un cadre stéréotaxique. Une incision de la peau est réalisée au-dessus du cervelet jusqu'à la région cervicale. Les fibres musculaires sont doucement déplacées pour révéler la cisterna magna. Une aiguille gauge 26 est introduite dans la cisterna et la solution, dans un volume maximal de 5 μί, est lentement injectée. L'aiguille est retirée lentement, et la plaie est suturée et désinfectée. The mice are anesthetized with an intraperitoneal injection of 60 μl of ketamine / xylazine diluted in sterile 1 × PBS, and placed in a stereotactic frame. An incision of the skin is made above the cerebellum to the cervical region. The muscle fibers are gently displaced to reveal the cisterna magna. A gauge needle 26 is introduced into the cisterna and the solution, in a maximum volume of 5 μί, is slowly injected. The needle is removed slowly, and the wound is sutured and disinfected.
Prélèvement des cellules Collection of cells
Pour les expérimentations destinées à l'étude du microenvironnement immunologique après le traitement des souris par anticorps dirigés contre le CD20 humain (anti-hCD20) dans le modèle LCP, les souris sont sacrifiées par dislocation cervicale et plusieurs organes sont prélevés.  For experiments designed to study the immunological microenvironment after the treatment of mice with antibodies directed against human CD20 (anti-hCD20) in the LCP model, the mice are sacrificed by cervical dislocation and several organs are removed.
Cerveau Brain
Le cerveau est prélevé et placé dans un réceptacle contenant 6 puits avec du milieu RPMI (Roswell Park Mémorial Institute médium). Les cellules cérébrales sont préparées par dissociation avec des ciseaux chirurgicaux. Après la dissociation, la suspension cellulaire est dissociée toutes les 30 minutes dans 2 ml de milieu RPMI à 0,4 pg/μΙ, contenant de la Liberase® (Roche Diagnostics) à 0,1 g/μΙ et de la DNase I, et filtrée à travers une membrane 70 μιτι (BD Falcon) pour éliminer les contaminants les plus gros. Puis, afin de séparer les cellules de la myéline, un gradient de Percoll est réalisé et les cellules sont placées sur une plaque de 96 puits pour une analyse par FACS (« Fluorescence activated cell sorter »). Rate  The brain is removed and placed in a receptacle containing 6 wells with RPMI medium (Roswell Park Memorial Institute medium). Brain cells are prepared by dissociation with surgical scissors. After dissociation, the cell suspension is dissociated every 30 minutes in 2 ml of RPMI medium at 0.4 μg / μl, containing Liberase® (Roche Diagnostics) at 0.1 g / μl and DNase I, and filtered through a 70 μιτι (BD Falcon) membrane to remove larger contaminants. Then, in order to separate the cells from myelin, a Percoll gradient is made and the cells are placed on a 96-well plate for FACS analysis ("Fluorescence activated cell sorter"). Missed
La rate est prélevée et placée dans un réceptacle de 6 puits contenant du PBS 1 X. Les cellules de la rate sont préparées par dissociation entre deux lamelles de microscope gelées. Après la dissociation, la suspension cellulaire est filtrée à travers une membrane de 70 μιτι (BD Falcon) pour éliminer les contaminants les plus gros. Puis les cellules sont placées dans une plaque de 96 puits pour une analyse par FACS. Yeux The spleen is removed and placed in a 6-well receptacle containing 1X PBS. The spleen cells are prepared by dissociation between two frozen microscope slides. After dissociation, the cell suspension is filtered through a 70 μιτι membrane (BD Falcon) to remove the largest contaminants. The cells are then placed in a 96-well plate for FACS analysis. eyes
Les yeux sont prélevés et nettoyés par retrait de la conjonctive et du nerf optique. Chaque œil collecté est placé dans un réceptacle de 24 puits contenant du PBS 1 X. Ils sont disséqués pour enlever le cristallin. Puis les yeux sont placés dans un nouveau puits contenant du PBS 1 X. L'œil entier à l'exception du cristallin est conservé pour être dissocié 30 minutes dans 500 μΙ de milieu RPMI à 0,4 μς/μΙ, contenant de la Liberase® (Roche Diagnostics) à 0,1 μς/μΙ et de la DNase I. Après dissociation, la suspension cellulaire est filtrée à travers une membrane 70 μιτι (BD Falcon) pour éliminer les contaminants les plus gros. Puis les cellules sont placées sur une plaque de 96 puits pour une analyse par FACS.  The eyes are removed and cleaned by removal of the conjunctiva and optic nerve. Each collected eye is placed in a 24-well receptacle containing 1X PBS. They are dissected to remove the lens. Then the eyes are placed in a new well containing 1 X PBS. The entire eye except the lens is preserved for dissociation for 30 minutes in 500 μl of RPMI medium at 0.4 μς / μl, containing Liberase. ® (Roche Diagnostics) at 0.1 μς / μΙ and DNase I. After dissociation, the cell suspension is filtered through a 70 μιτι membrane (BD Falcon) to remove larger contaminants. Then the cells are placed on a 96-well plate for FACS analysis.
Ganglions cervicaux et inguinaux Cervical and inguinal ganglions
Les ganglions cervicaux et inguinaux sont prélevés et placés dans un réceptacle de 96 puits contenant 500 μΙ de PBS 1 X. Ils sont dissociés pendant 30 minutes dans 500 μΙ de PBS 1 X 0,4 μ9/μΙ, contenant de la Liberase® (Roche Diagnostics) à 0,1 μ9/μΙ et de la DNase I. Après dissociation, la suspension cellulaire est filtrée à travers une membrane 70 μιτι (BD Falcon) pour éliminer les contaminants les plus gros. Puis les cellules sont placées sur une plaque de 96 puits pour une analyse par FACS.  The cervical and inguinal ganglia are removed and placed in a 96-well receptacle containing 500 μl of 1 × PBS. They are dissociated for 30 minutes in 500 μl of PBS 1 × 0.4 μ9 / μl, containing Liberase® (Roche Diagnostics) at 0.1 μ9 / μΙ and DNase I. After dissociation, the cell suspension is filtered through a 70 μιτι membrane (BD Falcon) to remove the largest contaminants. Then the cells are placed on a 96-well plate for FACS analysis.
Analyse par FACS FACS analysis
Les données sont acquises au moyen du cytomètre de flux FACSCalibur (BD Biosciences) et les analyses réalisées avec le logiciel l'accompagnant (CelIQuest Pro, BD Biosciences). Les marquages sont réalisées dans des plaques de 96 puits. Environ 106 cellules par puits sont incubées avec un anticorps 2.4G2 (anti-CD16/CD32 mAb) pour saturer les récepteurs murins Fcy. Les cellules sont ensuite incubées avec un des anticorps suivants : un anticorps de souris anti-CD20 humain couplé à R-PE (R-Phycoerythrin) ou APC (Allophycocyanin) clone 2H7, BD Biosciences), ou leur isotype de contrôle respectifs (isotype de souris lgG2b contrôle, BD). Les cellules vivantes sont définies au moyen du détecteur Side Scatter (SSC) et Forward Scatter (FSC), après exclusion des cellules autofluorescentes/doublet. The data are acquired using the FACSCalibur flow cytometer (BD Biosciences) and the analyzes performed with the accompanying software (CelIQuest Pro, BD Biosciences). The markings are carried out in 96-well plates. About 10 6 cells per well are incubated with a 2.4G2 antibody (anti-CD16 / CD32 mAb) to saturate the Fcy murine receptors. The cells are then incubated with one of the following antibodies: a human anti-CD20 mouse antibody coupled to R-PE (R-Phycoerythrin) or APC (Allophycocyanin) clone 2H7, BD Biosciences), or their respective control isotype (isotype of mouse lgG2b control, BD). Live cells are defined using the Side Scatter detector (SSC) and Forward Scatter (FSC), after exclusion of autofluorescent / doublet cells.
Première injection First injection
5.104 cellules tumorales A20.IIA-GFP-hCD20 ou A20.IIA-GFP ou A20.IIA-GFP-hCD20 cl. 20 diluées dans 2 μΙ avec du PBS 1 X sont injectées à une localisation spécifique du cerveau : le striatum droit de chaque souris adulte. 5.10 4 tumor cells A20.IIA-GFP-hCD20 or A20.IIA-GFP or A20.IIA-GFP-hCD20 cl. Diluted in 2 μl with 1 X PBS are injected at a specific brain location: the right striatum of each adult mouse.
Injections du traitement Treatment injections
Chaque souris est traitée avec un des trois anticorps sept jours après que l'injection de cellules tumorales ait été réalisée (cf. Figures 4, 6 et 8), sauf indication contraire.  Each mouse is treated with one of the three antibodies seven days after the injection of tumor cells has been performed (see Figures 4, 6 and 8), unless otherwise indicated.
Suivi de la survie Survival tracking
Après la chirurgie, les animaux sont pesés deux fois par semaine, et leur comportement général (après isolation du groupe) ainsi que leur aspect (poil hérissé, tumeur visible, cachexie) sont observés chaque jour.  After the surgery, the animals are weighed twice a week, and their general behavior (after isolation of the group) and their appearance (bristly hair, visible tumor, cachexia) are observed every day.
Analyse CBA (Cytometric Bead Array) CBA (Cytometric Bead Array) Analysis
Pour la mesure de la sécrétion de cytokines, les cellules cérébrales sont recueillies, cultivées pendant 36 heures (105 cellules dans 200 μΙ_) et stimulées ou non avec des microbilles anti-CD3/CD28 (Dynabeads Dynal). Les surnageants sont alors analysés pour la présence simultanée de onze cytokines murines (ΙΙ_-1 β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-9, IL-10, IL-12p70, IL-17A, IFNy, TNFa, GM-CSF) par cytométrie en flux comme recommandé par le fabriquant (CBA, BD Biosciences). L'acquisition des données se fait sur un cytomètre de flux LSR II au moyen du logiciel Diva (BD Biosciences). For the measurement of the secretion of cytokines, the brain cells are collected, cultured for 36 hours (10 5 cells in 200 μl) and stimulated or not with anti-CD3 / CD28 microbeads (Dynabeads Dynal). The supernatants are then analyzed for the simultaneous presence of eleven murine cytokines (ΙΙ-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-9, IL-10, IL-12p70, IL-17A, IFNγ, TNFα). , GM-CSF) by flow cytometry as recommended by the manufacturer (CBA, BD Biosciences). Data acquisition is done on an LSR II flow cytometer using Diva software (BD Biosciences).
4.3 Résultats 4.3 Results
Les groupes de souris sont comparés par le test de Kaplan-Meier au moyen du test statistique Log-rank. 4.3.1 Etude de l'efficacité de fortes doses d'anticorps LFB-R603 dans le modèle murin LCP The groups of mice are compared by the Kaplan-Meier test using the Log-rank statistical test. 4.3.1 Study of the efficacy of high doses of LFB-R603 antibodies in the LCP murine model
4.3.1 .1 Avec les cellules A20.IIA-GFP-hCD20 (PCL_HO13 et 17) : expérimentation #1  4.3.1 .1 With A20.IIA-GFP-hCD20 cells (PCL_HO13 and 17): experiment # 1
Pour ces expérimentations, six groupes de souris sont inclus et les expériences sont répétées deux fois (n=5 par groupe d'expériences) :  For these experiments, six groups of mice are included and the experiments are repeated twice (n = 5 per group of experiments):
- souris contrôle injectées à jour -7 et jour 1 avec 2μΙ_ de PBS 1 X - control mice injected at day -7 and day 1 with 2μΙ_ of PBS 1 X
- souris traitées avec 2μΙ_ de PBS 1 X mice treated with 2 μl of PBS 1 X
- souris traitées avec LFB-R603 à 10 pg/2 L  - mice treated with LFB-R603 at 10 μg / 2 L
- souris traitées avec LFB-R603 à 20 pg/2 L  mice treated with LFB-R603 at 20 μg / 2 L
- souris traitées avec LFB-R603 à 50 pg/5 L  mice treated with LFB-R603 at 50 μg / 5 L
- souris traitées avec LFB-R603 à 20 pg/5 L  mice treated with LFB-R603 at 20 μg / 5 L
Chaque groupe est injecté avec des cellules tumorales (excepté le groupe contrôle), suivi 7 jours après par l'injection de PBS 1 X (contrôle et groupe non traité) ou LFB-R603 mAB.  Each group is injected with tumor cells (except the control group), followed 7 days later by injection of 1X PBS (control and untreated group) or LFB-R603 mAB.
Résultats : De manière intéressante, 20% (2 sur 10) des souris traitées avec 10 g de LFB-R603 mAb et 30% de souris traitées avec 20 g de LFB-R603 mAb ne montrent aucun signe de maladie et sont encore en vie plus de 100 jours après l'implantation de la tumeur. Results: Interestingly, 20% (2 of 10) of the mice treated with 10 g of LFB-R603 mAb and 30% of mice treated with 20 g of LFB-R603 mAb show no signs of disease and are still alive. 100 days after the implantation of the tumor.
4.3.1 .2 Avec les cellules A20.IIA-GFP-hCD20 (cl. 20) : expérience #2 Pour cette expérience, six groupes sont testés et cette expérience est répétée deux fois avec cinq souris par groupe : 4.3.1.2 With A20.IIA-GFP-hCD20 cells (Cl.20): experiment # 2 For this experiment, six groups were tested and this experiment was repeated twice with five mice per group:
- 5 souris contrôle injectées à jour -7 et jour 1 avec 2 μΙ de PBS 1 X, 5 control mice injected at day 7 and day 1 with 2 μl of 1X PBS,
- 5 souris traitées avec 2 μΙ_ de PBS 1 X, 5 mice treated with 2 μl of 1X PBS,
- 5 souris traitées avec LFB-R603 à 10 g/2 μΙ_,  5 mice treated with LFB-R603 at 10 g / 2 μl,
- 5 souris traitées avec LFB-R603 à 20 g/2 μΙ_,  5 mice treated with LFB-R603 at 20 g / 2 μl,
- 5 souris traitées avec LFB-R603 à 50 g/5 μΙ_,  5 mice treated with LFB-R603 at 50 g / 5 μl,
- 5 souris traitées avec LFB-R603 à 100 pg/2 μΙ_. Chaque groupe subi une injection de cellules tumorales (excepté le groupe contrôle) suivi sept jours plus tard par une injection de PBS 1 X (groupe contrôle et groupe non traité) ou une injection thérapeutique. Résultats : La figure 12 représente le suivi de la survie pour différents groupes expérimentaux suivant le protocole expérimental #2, poolant 2 groupes expérimentaux différents. 5 mice treated with LFB-R603 at 100 μg / 2 μl. Each group was injected with tumor cells (except the control group) followed seven days later by an injection of 1X PBS (control group and untreated group) or a therapeutic injection. Results: Figure 12 shows survival monitoring for different experimental groups following experimental protocol # 2, pooling 2 different experimental groups.
Concernant les groupes non traités, tous les animaux sont morts 52 jours après l'implantation de la tumeur. A des doses de 20 à 100 g, 18%, soit 5 souris sur 27 (dont deux traitées avec 20 g ou 100 g et une traitée avec 50 g) rejettent leur tumeur et sont encore en vie 90 jours après l'implantation de la tumeur. Aucune différence statistique ne peut être mesurée entre les 3 groupes, suggérant que la dose 20 g de LFB-R603 donne l'effet le plus élevé contre la tumeur cérébrale des souris.  For untreated groups, all animals died 52 days after tumor implantation. At doses of 20 to 100 g, 18%, or 5 of 27 mice (two treated with 20 g or 100 g and one treated with 50 g) reject their tumor and are still alive 90 days after implantation of the tumor. No statistical difference can be measured between the 3 groups, suggesting that the 20g dose of LFB-R603 gives the highest effect against brain tumor of mice.
4.3.2 Etude de l'efficacité de fortes doses de rituximab dans le modèle PCL murin et comparaison avec l'anticorps LFB-R603 mAb : protocole expérimental #3 4.3.2 Study of the efficacy of high doses of rituximab in the murine PCL model and comparison with the LFB-R603 mAb antibody: experimental protocol # 3
Pour ce protocole expérimental, six groupes sont testés et cette expérience est répétée deux fois avec cinq souris par groupe :  For this experimental protocol, six groups are tested and this experiment is repeated twice with five mice per group:
- 5 souris contrôle injectée à jour -7 et jour 1 par 2 μί de PBS 1 X, 5 control mice injected at day 7 and day 1 with 2 μl of 1 X PBS,
- 5 souris traitées avec 2 μΙ_ de PBS 1 X, 5 mice treated with 2 μl of 1X PBS,
- 5 souris traitées avec rituximab à 10 g/ 2 μΙ_,  5 mice treated with rituximab at 10 g / 2 μl,
- 5 souris traitées avec rituximab à 20 g/ 2 μΙ_,  - 5 mice treated with rituximab at 20 g / 2 μΙ_,
- 5 souris traitées avec rituximab à 50 g/ 5 μΙ_,  5 mice treated with rituximab at 50 g / 5 μl,
- 5 souris traitées avec LFB-R603 à 20 g/ 2 μΙ_.  - 5 mice treated with LFB-R603 at 20 g / 2 μl.
Chaque groupe subit une injection par les cellules A20.IIA-GFP-hCD20 (excepté le groupe contrôle), suivi sept jours plus tard par PBS 1 X (groupe contrôle et groupe non traité) ou l'injection thérapeutique.  Each group is injected with A20.IIA-GFP-hCD20 cells (except the control group), followed seven days later by 1X PBS (control group and untreated group) or therapeutic injection.
Résultats : Les résultats sont présentés sur la figure 13. Concernant le temps de survie médian des groupes traités avec le rituximab, aucune différence statistique n'est notée avec le groupe traité au PBS, quelle que soit l'expérimentation. Toutefois, deux souris survivent après le traitement avec 50 pg de rituximab dans l'expérience PCL_HO-15. Par comparaison, une différence statistique (p=0,02) est notée entre le temps de survie médian du groupe traité avec 20 pg LFB-R603 et le groupe non traité dans l'expérience PCL_HO-15, et une souris a rejeté sa tumeur, ce qui n'a été observé dans aucune autre expérience. Results: The results are shown in Figure 13. Regarding the median survival time of groups treated with rituximab, no statistical difference is noted with the group treated with PBS, regardless of the experiment. However, two mice survive after treatment with 50 μg of rituximab in the PCL_HO-15 experiment. In comparison, a statistical difference (p = 0.02) is noted between the median survival time of the group treated with 20 μg LFB-R603 and the untreated group in experiment PCL_HO-15, and a mouse rejected its tumor , which has not been observed in any other experiment.
4.3.3 Etrude de l'efficacité des anticorps anti-hCD20 LFB-R603 dans le modèle murin PCL après injection intrathécale 4.3.3 Etrude of the efficacy of the anti-hCD20 LFB-R603 antibodies in the PCL mouse model after intrathecal injection
3.3.3.1 Validation de la méthode d'injection  3.3.3.1 Validation of the injection method
Afin d'estimer si les solutions injectées atteignent le fluide cérébrospinal de la souris, une expérience préliminaire a été réalisée au moyen d'encre de Chine (n=2). Les souris sont anesthésiées et subissent une injection d'environ 10 μΙ_ d'encre de Chine dans leur cisterna magna, localisée derrière le cou. Les souris sont euthanasiées après 15 minutes et leur système nerveux central est disséqué. Les résultats montrent que les systèmes nerveux centraux sont marqués après injection d'encre de Chine. Les vaisseaux à la surface du cerveau ou du cervelet sont indubitablement noirs. Le marquage est également évident autour de la moelle épinière (données non montrés). Après séparation des différentes parties de l'encéphale, un marquage faible des ventricules latéraux est révélé. De manière importante, au moment où la seringue est enlevée de la cisterna magna, il y a un reflux de la solution, probablement mélangée avec du fluide cérébrospinal.  In order to estimate whether the injected solutions reach the cerebrospinal fluid of the mouse, a preliminary experiment was carried out using Indian ink (n = 2). The mice are anesthetized and are injected with about 10 μΙ of Indian ink in their cisterna magna, located behind the neck. The mice are euthanized after 15 minutes and their central nervous system is dissected. The results show that the central nervous systems are marked after injection of Chinese ink. The vessels on the surface of the brain or cerebellum are undoubtedly black. Marking is also evident around the spinal cord (data not shown). After separation of the different parts of the brain, weak labeling of the lateral ventricles is revealed. Importantly, when the syringe is removed from the cisterna magna, there is reflux of the solution, probably mixed with cerebrospinal fluid.
4.3.3.2 Thérapie intrathécale après injection avec les cellules A20.IIA-GFP-hCD20 (PCL_HO16) : protocole expérimental #4.  4.3.3.2 Intrathecal Therapy after Injection with A20.IIA-GFP-hCD20 (PCL_HO16) Cells: Experimental Protocol # 4.
Pour ce protocole expérimental, six groupes de 5 souris par groupe sont testées et reçoivent :  For this experimental protocol, six groups of 5 mice per group are tested and receive:
- aucun traitement : 2 μί de PBS 1 X,  - no treatment: 2 μί of 1X PBS,
- 10 pg de LFB-R603 / 2 μΙ_,  10 μg of LFB-R603 / 2 μl,
- 20 pg de LFB-R603 / 2 μΙ_, - 50 μg de LFB-R603 / 5 μΙ_, 20 μg of LFB-R603 / 2 μΙ, - 50 μg of LFB-R603 / 5 μΙ_,
- 20 pg de LFB-R603 / 5 μΙ_,  20 μg of LFB-R603 / 5 μΙ,
- 20 pg LFB-R603 / 2 μΙ_ (injection intratumorale).  20 μg LFB-R603 / 2 μl (intratumoral injection).
Chaque groupe reçoit une injection intratumorale suivie sept jours après par une unique injection thérapeutique. Excepté pour le dernier groupe cité recevant les anticorps directement dans la masse tumorale, toutes les autres souris sont traitées par injection dans la cisterna magna (injection intrathécale. Un groupe de souris contrôle ayant subi une injection avec du PBS à la place des cellules tumorale et traitées par du PBS est aussi inclus.  Each group receives an intratumoral injection followed seven days later by a single therapeutic injection. Except for the last group receiving the antibodies directly into the tumor mass, all the other mice are treated by injection into cisterna magna (intrathecal injection) A group of control mice injected with PBS in place of the tumor cells and treated with PBS is also included.
Résultats : les résultats obtenus sont présentés en figure 14. 40% des souris (2/5) traitées avec 10 g d'anticorps ne montre aucun signe de maladie au jour 1 10. Pour le groupe traité avec 20 g, toutes les souris dans un volume final de 2 μΙ_ sont morts au jour 77 alors que ceux traités avec un volume final de 5 μΙ_, 20% ont survécu. De manière similaire, deux souris (40%) ayant reçu 50 g de LFB-R603 semblent avoir rejeté leur tumeur. Results: the results obtained are shown in FIG. 14. 40% of the mice (2/5) treated with 10 g of antibody showed no sign of disease on day 1 10. For the group treated with 20 g, all the mice in a final volume of 2 μΙ_ died on day 77 whereas those treated with a final volume of 5 μΙ_, 20% survived. Similarly, two mice (40%) receiving 50 g of LFB-R603 appear to have rejected their tumor.
Finalement, les souris injectées avec 20 g d'anticorps thérapeutique en intracérébral ne montrent pas de temps de survie amélioré de manière significative comparé au groupe intrathécal, mais 40% de souris rejettent aussi leur tumeur. Ces résultats suggèrent donc que l'anticorps LFB- Finally, mice injected with 20 g of intracerebral therapeutic antibody showed no significantly improved survival time compared to the intrathecal group, but 40% of mice also shed their tumor. These results suggest that the LFB-
R603 est capable d'éliminer un lymphome intracérébral après une injection intrathécale. De plus, il semble que pour la même quantité d'anticorps, un volume de 5 μΙ_ est plus efficace qu'un volume de 2 μΙ_, ce qui peut être dû au reflux observé durant l'injection d'encre de Chine. R603 is able to eliminate intracerebral lymphoma after intrathecal injection. In addition, it appears that for the same amount of antibody, a volume of 5 μΙ_ is more effective than a volume of 2 μΙ_, which may be due to the reflux observed during the injection of China ink.
4.3.4 Thérapie intrathécale après injection avec les cellules A20.IIA- GFP-hCD20 (cl. 20) (PCL_HO26 et 27) : protocole expérimental #5 Six groupes de cinq souris par groupe sont inclus. Les expériences sont répétées deux fois mais avec une différence : pour l'expérience PCL_HO26, le traitement est administré dans un volume final de 2 μΙ_ et de 5 μΙ_ pour4.3.4 Intrathecal Therapy After Injection with A20.IIA-GFP-hCD20 Cells (Cl.20) (PCL_HO26 and 27): Experimental Protocol # 5 Six groups of five mice per group are included. The experiments are repeated twice but with one difference: for experiment PCL_HO26, the treatment is administered in a final volume of 2 μΙ_ and 5 μΙ_ for
PCL_HO27. Les animaux sont traités de la manière suivante : PCL_HO27. The animals are treated as follows:
- aucun traitement : 2 ou 5 μί PBS 1 X - 10 μg LFB-R603 / 2 ou 5 μΙ_ - no treatment: 2 or 5 μί PBS 1 X - 10 μg LFB-R603 / 2 or 5 μΙ_
- 20 μg LFB-R603 / 2 ou 5 μΙ_  - 20 μg LFB-R603 / 2 or 5 μΙ_
- 50 [ig LFB-R603 / 2 ou 5 [il  - 50 [ig LFB-R603 / 2 or 5 [il
- 100 [ig LFB-R603 / 2 ou 5 [il  - 100 [ig LFB-R603 / 2 or 5 [il
Chaque groupe reçoit une injection tumorale suivie sept jours plus tard d'une unique injection thérapeutique dans la cisterna magna (injection intrathécale) dans un volume final de 2 μΙ_ (PCL_HO26) ou de 5 μΙ_ (PCL_HO27). Un groupe de souris contrôle injectées avec du PBS à la place des cellules tumorales et traité par du PBS est aussi inclus.  Each group received a tumor injection followed seven days later by a single therapeutic injection in cisterna magna (intrathecal injection) in a final volume of 2 μl (PCL_HO26) or 5 μl (PCL_HO27). A group of control mice injected with PBS in place of the tumor cells and treated with PBS is also included.
4.3.5 Etude de l'efficacité des anticorps anti-hCD20 rituximab par comparaison avec LFB-R603 dans le modèle murin PCL après injection intrathécale 4.3.5 Study of the efficacy of anti-hCD20 rituximab antibodies compared to LFB-R603 in the PCL mouse model after intrathecal injection
4.3.5.1 Avec les cellules A20.IIA-GFP-hCD20 (PCL_HO20) : protocole expérimental #6  4.3.5.1 With A20.IIA-GFP-hCD20 (PCL_HO20) cells: experimental protocol # 6
Pour ce protocole expérimental, cinq groupes de cinq souris par groupe sont testés et reçoivent :  For this experimental protocol, five groups of five mice per group are tested and receive:
- aucun traitement : 2 μΙ_ PBS 1X  - no treatment: 2 μΙ_ PBS 1X
- 10 μg de rituximab / 2 μΙ_  - 10 μg of rituximab / 2 μΙ_
- 20 μg de rituximab / 2 [il  - 20 μg of rituximab / 2 [he
- 50 μg de rituximab / 5 [il  - 50 μg of rituximab / 5 [he
- 20 μg LFB-R603 / 2 [il  - 20 μg LFB-R603 / 2 [il
Chaque groupe traité reçoit une injection tumorale suivie d'une unique injection thérapeutique intrathécale sept jours plus tard, comme pour les autres expériences, un groupe de cinq souris contrôle est inclus.  Each treated group receives a tumor injection followed by a single intrathecal therapeutic injection seven days later, as for the other experiments, a group of five control mice is included.
Résultats : Les souris traitées au PBS ont un temps de survie moyen de 50 jours avec une souris survivante. Après le traitement avec 50 μg de rituximab, toutes les souris sont mortes au jour 54 et ont un temps de survie médian de 45 jours. Après un traitement avec 20 μg de rituximab, il n'y a pas d'augmentation du temps de survie moyen. Concernant le groupe traité par 10 μg, le temps de survie médian est augmenté en comparaison avec les souris traitées au PBS même si ce n'est pas significatif (p=0,12), certainement à cause du faible nombre de souris. Results: The PBS treated mice had a mean survival time of 50 days with a surviving mouse. After treatment with 50 μg rituximab, all mice died on day 54 and had a median survival time of 45 days. After treatment with 20 μg of rituximab, there is no increase in average survival time. Regarding the group treated with 10 μg, the median survival time is increased in comparison with the mice treated with PBS even if it is not significant (p = 0.12), certainly because of the low number of mice.
En comparaison avec les différents groupes traités avec le rituximab, dans le groupe traité avec le LFB-R603, toutes les souris sont encore en vie 55 jours après l'implantation tumorale. Deux souris sont décédées lors des jours 57 et 61 , et une souris 66 jours après l'implantation tumorale.  In comparison with the different groups treated with rituximab, in the group treated with LFB-R603, all the mice are still alive 55 days after the tumor implantation. Two mice died on days 57 and 61, and one mouse 66 days after tumor implantation.
4.3.5.1 Avec les cellules A20.IIA-GFP-hCD20 (cl. 20) (PCL_HO28) : protocole expérimental #7  4.3.5.1 With A20.IIA-GFP-hCD20 cells (Cl.20) (PCL_HO28): experimental protocol # 7
Pour ce protocole, cinq groupes de cinq souris par groupe sont testés une fois et reçoivent :  For this protocol, five groups of five mice per group are tested once and receive:
- aucun traitement : 5 μΙ_ PBS 1X  - no treatment: 5 μΙ_ PBS 1X
- 10 g rituximab / 5 μί  - 10 g rituximab / 5 μί
- 20 ig rituximab / 5 μΙ_  - 20 μg rituximab / 5 μΙ_
- 50 ig rituximab / 5 μΙ_  - 50 μg rituximab / 5 μΙ_
- 20 pg LFB-R603 / 5 μΙ_  - 20 μg LFB-R603 / 5 μΙ_
Chaque groupe reçoit une injection tumorale suivie d'une unique injection intrathécale thérapeutique sept jours après. Comme pour les autres protocoles, un groupe de cinq souris contrôle recevant une injection avec du PBS seul est inclus.  Each group receives a tumor injection followed by a single therapeutic intrathecal injection seven days later. As for the other protocols, a group of five control mice receiving an injection with PBS alone is included.
4.3.6 Etude de l'avantage de 2 injections thérapeutiques successives intrastriatales avec LFB-R603 dans le modèle murin de PCL (PCL_HO18) protocole expérimental #8 4.3.6 Study of the benefit of 2 successive intrastriatal therapeutic injections with LFB-R603 in the PCL murine model (PCL_HO18) experimental protocol # 8
Pour ce protocole, trois groupes sont testés avec cinq souris par groupe :  For this protocol, three groups are tested with five mice per group:
- des souris non traitées recevant deux fois 2 μΙ_ de PBS 1 X  untreated mice receiving twice 2 μl of PBS 1 X
- des souris traitées une fois avec 20 g/2 μΙ_ LFB-R603 puis avec du PBS  mice treated once with 20 g / 2 μl LFB-R603 and then with PBS
- des souris traitées deux fois avec 20 g/2 μΙ_ LFB-R603  mice treated twice with 20 g / 2 μl LFB-R603
Chaque groupe reçoivent des cellules tumorales et après 7 jours et 21 jours l'injection thérapeutique intrastriatale. Les résultats sont présentés dans la figure 17, qui représente le suivi de la survie pour les trois groupes testés suivant le protocole expérimental #8. 80 jours après l'implantation tumorale, 14% des souris traitées avec 20 g de LFB-R603 et 28% de souris traitées deux fois avec 20 pg de LFB-R603 étaient encore en vie alors que toutes les souris traitées avec le PBS étaient mortes au jour 74. Each group received tumor cells and after 7 days and 21 days the intrastriatal therapeutic injection. The results are shown in Figure 17, which represents survival monitoring for the three groups tested according to Experimental Protocol # 8. 80 days after tumor implantation, 14% of the mice treated with 20 g of LFB-R603 and 28% of mice treated twice with 20 μg of LFB-R603 were still alive whereas all the mice treated with PBS had died. at day 74.
4.3.7 Etude de la génération de la réponse mémoire adaptive parmi les souris PCL survivantes 4.3.7 Study of the generation of adaptive memory response among surviving PCL mice
4.3.7.1 Avec les cellules initiales A20.IIA-GFP-hCD20 4.3.7.1 With initial cells A20.IIA-GFP-hCD20
(PCL_HO-21 ) : protocole expérimental #9 (PCL_HO-21): experimental protocol # 9
Pour ce protocole, les 4 souris survivantes des expériences précédentes sont les suivantes :  For this protocol, the 4 surviving mice of the previous experiments are as follows:
- deux souris traitées avec 50 g de rituximab de l'expérience PCL_HO-15  two mice treated with 50 g of rituximab from the PCL_HO-15 experiment
- deux souris traitées avec 20 g de LFB-R603 de l'expérience PCL_HO-15 et PCL_HO-13  two mice treated with 20 g of LFB-R603 from experiment PCL_HO-15 and PCL_HO-13
Chaque souris survivante reçoivent 100 jours après la première implantation tumorale, une nouvelle implantation de cellules tumorales A20.IIA-GFP-hCD20 injectées dans le striatum contralatéral gauche, sans aucun nouveau traitement.  Each surviving mouse receives 100 days after the first tumor implantation, a new implantation of A20.IIA-GFP-hCD20 tumor cells injected into the left contralateral striatum, without any new treatment.
Les résultats, présentés dans la figure 15, montrent le suivi de la survie pour les groupes testés. Les souris naïves commencent à mourir au jour 45 comme prévu et toutes étaient mortes 66 jours après l'implantation tumorale dans le striatum gauche. Les souris survivantes des expérimentations précédentes ne montrent aucun signe de maladie jusqu'à la fin de l'analyse.  The results, shown in Figure 15, show survival monitoring for the groups tested. The naive mice start dying on day 45 as expected and all died 66 days after tumor implantation into the left striatum. The surviving mice of the previous experiments show no sign of disease until the end of the analysis.
L'éradication d'une tumeur (tumeur intrastriatale gauche) au moyen d'une unique injection au jour 7 de LFB-R603 dans la tumeur ipsilatéraleEradication of a tumor (left intrastrital tumor) with a single injection on day 7 of LFB-R603 in the ipsilateral tumor
(tumeur intrastriatale droite) est tentée. 4.3.7.2 Avec les cellules A20.IIA-GFP-hCD20 (cl. 20) (PCLJHO- 23) : protocole expérimental #10 (right intrastriatal tumor) is attempted. 4.3.7.2 With A20.IIA-GFP-hCD20 cells (Cl.20) (PCLJHO-23): experimental protocol # 10
Pour ce protocole expérimental, 23 souris survivantes des expériences précédentes sont concernées :  For this experimental protocol, 23 surviving mice of the previous experiments are concerned:
- 7 souris contrôle de PCL_HO18 et PCL_HO20  - 7 control mice of PCL_HO18 and PCL_HO20
- 4 souris traitées en intrathécal avec LFB-R603 de l'expérience PCL_HO16 (1 souris avec 10 g, 1 souris avec 20 g et 2 souris avec 50 g d'anticorps)  4 mice treated intrathecally with LFB-R603 from the PCL_HO16 experiment (1 mouse with 10 g, 1 mouse with 20 g and 2 mice with 50 g of antibody)
- 2 souris traitées en intratumoral avec LFB-R603 de l'expérience PCL_HO16 (20 pg d'anticorps)  2 mice treated intratumorally with LFB-R603 from experiment PCL_HO16 (20 μg of antibody)
- 3 souris traitées en intratumoral avec LFB-R603 de l'expérience PCL_HO17 (1 avec 10 pg et 2 avec 20 pg d'anticorps)  3 mice treated intratumorally with LFB-R603 from experiment PCL_HO17 (1 with 10 μg and 2 with 20 μg of antibody)
- 2 souris traitées en intratumoral avec LFB-R603 de l'expérience PCL_HO18 (1 avec 20 g d'anticorps puis du PBS et l'autres souris traitée avec deux fois avec 20 g d'anticorps)  2 mice treated intratumorously with LFB-R603 from experiment PCL_HO18 (1 with 20 g of antibody then PBS and the other mouse treated twice with 20 g of antibody)
- 4 souris traitées en intrathécal avec du rituximab de l'expérience PCL_HO16 (3 souris à 10 g et 1 souris à 20 g d'anticorps) 4 mice treated in intrathecal with rituximab of the PCL_HO16 experiment (3 mice at 10 g and 1 mouse at 20 g of antibody)
Chaque souris survivante reçoit 120 jours après leur première implantation tumorale une nouvelle injection de cellules tumorales A20.IIA- GFP-hCD20 (cl. 20) dans le striatum contralatéral gauche, sans aucun nouveau traitement. Each surviving mouse receives 120 days after their first tumor implantation a new injection of A20.IIA-GFP-hCD20 tumor cells (key 20) into the left contralateral striatum, without any new treatment.
Les résultats sont présentés dans la figure 16 et montrent le suivi de la survie des groupes testés. Les souris naïves commencent à mourir au jour 55 après l'implantation tumorale dans le striatum gauche, et toutes étaient mortes au jour 80. Concernant les souris survivantes des expériences précédentes, elles ne montrent aucun signe de maladie durant tout le temps de l'analyse, suggérant qu'elles bénéficient d'un temps de survie augmenté et probablement d'une réponse mémoire immune efficace. Ces résultats suggèrent que la thérapie intrathécale avec l'anti-hCD20 est capable de développer une réponse mémoire immune contre les tumeurs cérébrales. 4.3.8 Etude du microenvironnement cytokinique après traitement de lymphome cérébral avec des anticorps monoclonaux anti-hCD20 The results are shown in Figure 16 and show the survival of the tested groups. The naive mice begin to die on day 55 after tumor implantation into the left striatum, and all had died by day 80. Regarding the surviving mice of the previous experiments, they show no signs of disease during the entire time of the analysis. , suggesting that they benefit from increased survival time and possibly an effective immune memory response. These results suggest that intrathecal therapy with anti-hCD20 is able to develop an immune memory response against brain tumors. 4.3.8 Cytokine microenvironment study after treatment of cerebral lymphoma with anti-hCD20 monoclonal antibodies
3 groupes de 5 souris par groupe sont inclus. Toutes les souris reçoivent la tumeur au jour 1 et sont traitées 7 jours après comme suit :  3 groups of 5 mice per group are included. All mice receive the tumor on day 1 and are treated 7 days later as follows:
- aucun traitement : 2 μΙ_ de PBS 1 X  - no treatment: 2 μΙ_ of PBS 1 X
- 20 pg de LFB-R603 / 2 μΙ_  20 μg of LFB-R603 / 2 μl
- 20 ig de rituximab / 2 μΙ_  - 20 μg of rituximab / 2 μΙ_
40 jours après la thérapie, les cerveaux sont recueillis et les cellules cérébrales isolées et chaque échantillon divisé en 2. Les cellules sont cultivées pendant 36 heures avec (première moitié) ou sans (deuxième moitié) une stimulation anti-CD3/CD28. La présence de différentes cytokine est évaluée dans les surnageants par un test avec des billes de cytokines.  40 days after the therapy, the brains are collected and the brain cells isolated and each sample divided into 2. The cells are cultured for 36 hours with (first half) or without (second half) anti-CD3 / CD28 stimulation. The presence of different cytokines is evaluated in the supernatants by a cytokine bead assay.
La figure 17 représente la sécrétion de cytokines par les cellules du cerveau 14 jours après la thérapie anti-hCD20. Dans les animaux non traités, toutes les cytokines peuvent être détectées mais à un taux faible, montrant l'environnement inhibiteur de la tumeur. Après la stimulation CD3/CD28, NL- 2 et les cytokines inflammatoires IFNg et IL-17A sont grandement augmentées, reflétant l'infiltration par des cellules T de phénotype Th1 et/ou Th17. La stimulation est presque identique chez les animaux traités avec du rituximab. De manière intéressante, les animaux traités avec LFB-R603 ne donnent pas les mêmes résultats : chez ces animaux, aucune cytokine ne peut être mesuré à un taux élevé, et la stimulation anti-CD3/CD28 ne permet pas d'augmenter la concentration en cytokine, montrant l'absnece de cellules T résiduelles dans le cerveau. Sachant que presque aucune tumeur ne peut être détectée dans le cerveau de ce groupe de souris par cytométrie en flux, ces résultats tendent à prouver que la thérapie au moyen de LFB-R603 permet une élimination complète de la tumeur et par conséquent aucune cellule T ne reste dans ce site. 4.3.9 Tracking in vivo de la progression tumorale : transfection de cellules tumorales avec le gène de la luciférase Des cellules A20.IIA-GFP-hCD20 (cl. 20) sont transfectées avec un vecteur codant pour le gène Iuc2 sous contrôle du promoteur CMV (Promega). Les cellules sont mélangées avec un vecteur dans un tampon spécifique et soumis à électroporation comme recommandé par le fabricant (Amaxa System, Lonza, Bâle, Suisse). Figure 17 shows cytokine secretion by brain cells 14 days after anti-hCD20 therapy. In untreated animals, all cytokines can be detected but at a low level, showing the tumor-inhibiting environment. Following CD3 / CD28 stimulation, NL-2 and inflammatory cytokines IFNg and IL-17A are greatly increased, reflecting infiltration by Th1 and / or Th17 phenotype T cells. Stimulation is almost identical in animals treated with rituximab. Interestingly, animals treated with LFB-R603 do not give the same results: in these animals, no cytokine can be measured at a high level, and anti-CD3 / CD28 stimulation does not make it possible to increase the concentration. cytokine, showing the absnece of residual T cells in the brain. Knowing that almost no tumors can be detected in the brain of this group of mice by flow cytometry, these results tend to prove that therapy with LFB-R603 allows complete elimination of the tumor and therefore no T cell stay in this site. 4.3.9 In vivo tracking of tumor progression: transfection of tumor cells with the luciferase gene A20.IIA-GFP-hCD20 cells (cl 20) are transfected with a vector coding for the Iuc2 gene under the control of the CMV promoter (Promega). The cells are mixed with a vector in a specific buffer and electroporated as recommended by the manufacturer (Amaxa System, Lonza, Basel, Switzerland).
5 jours après la transfection, les cellules survivantes sont cultivées sous pression de sélection. Les cellules résistantes sont clonées par dilution limite. 42 clones sont obtenus et sont testés pour leur expression de l'antigène hCD20 par cytométrie en flux. Les 10 clones testés exprimant les forts taux de hCD20 sont choisis et sont analysés pour la présence de la protéine luciférase par analyse de luminescence.  5 days after transfection, the surviving cells are cultured under selection pressure. The resistant cells are cloned by limiting dilution. 42 clones are obtained and are tested for their expression of the hCD20 antigen by flow cytometry. The 10 clones tested expressing the high levels of hCD20 are selected and analyzed for the presence of the luciferase protein by luminescence analysis.
La figure 18 représente l'activité luciférase des clones obtenus après transfection des cellules A20.IIA-GFP-hCD20 (cl.20) avec un vecteur codant pour le gène Iuc2. 2 clones expriment indubitablement le gène de la luciférase.  Figure 18 shows the luciferase activity of clones obtained after transfection of A20.IIA-GFP-hCD20 cells (cl.20) with a vector coding for the Iuc2 gene. 2 clones undoubtedly express the luciferase gene.
Les effets du traitement avec l'anti-hCD20 sur les métastases (par exemple des yeux, des ganglions lymphatiques, de la rate), au moyen de la lignée de cellule tumorale exprimant Iuc2, sont étudiés. The effects of treatment with anti-hCD20 on metastases (eg, eyes, lymph nodes, spleen), using the tumor cell line expressing Iuc2, are studied.
4.4 Conclusions : dans les différentes conditions expérimentales testées, il a été démontré que : 4.4 Conclusions: In the different experimental conditions tested, it has been shown that:
- 1 injection d'anticorps anti-hCD20 LFB-R603 dans le site tumoral induit de manière efficace un effet anti-tumoral (suivi de la survie) dans environ 20% des souris. De plus fortes doses d'anticorps (par exemple jusqu'à 100 g) n'augmentent pas le temps de survie ni le pourcentage de souris survivantes, ce qui suggOre que 20 g est la dose la plus efficace de LFB-R603 pour ce modèle,  1 injection of anti-hCD20 LFB-R603 antibody into the tumor site effectively induces an anti-tumor effect (survival monitoring) in about 20% of the mice. Higher doses of antibody (eg, up to 100 g) do not increase the survival time or percentage of surviving mice, suggesting that 20 g is the most effective dose of LFB-R603 for this model. ,
- 1 injection de rituximab anti-hCD20 dans le site de la tumeur induit un effet anti-tumoral (suivi de la survie) mais pour une dose plus forte que pour le LFB-R603, La voie intrathécale d'injection est réalisable et a démontré la possibilité de rejet de la tumeur dans certaine souris, - 1 injection of anti-hCD20 rituximab into the tumor site induces an anti-tumor effect (survival monitoring) but for a higher dose than for LFB-R603, The intrathecal route of injection is feasible and has demonstrated the possibility of rejection of the tumor in certain mice,
2 expériences consistant en une ré-administration de cellulues tumorales hCD20 positives dans des souris atteintes de PCL traitées et survivantes démontrent qu'une réponse immune adaptive a été généré, ce qui confirme les résultats précédents. La réponse immune mémoire s'instale après injection intrastriatale et intrathécale d'anticorps LFB-R603, 2 experiments consisting of re-administration of hCD20 positive tumor cells in treated and surviving PCL mice demonstrate that an adaptive immune response was generated, confirming the above results. The memory immune response is instituted after intrastriatal and intrathecal injection of LFB-R603 antibodies,
Il a également été démontré ici qu'après la thérapie LFB-R603, aucune cytokine inflammatoire n'a pu être détectée, contrairement au animaux non traités ou traités avec le rituximab, portant encore un environnement inflammatoire dans leur cerveau,  It has also been shown here that after the LFB-R603 therapy, no inflammatory cytokine could be detected, unlike untreated or rituximab-treated animals, still carrying an inflammatory environment in their brains,
2 lignées cellulaires exprimant le gène Iuc2 ont été générées et sont utiles pour suivre la progression tumorale et les métastases in vivo. 2 cell lines expressing the Iuc2 gene have been generated and are useful for monitoring tumor progression and metastasis in vivo.
Listes des références List of references
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Claims

REVENDICATIONS
1 . Anticorps monoclonal dirigé contre l'antigène CD20, dont la région variable de chacune des chaînes légères est codée par la séquence d'acides nucléiques murine SEQ ID NO : 1 , dont la région variable de chacune des chaînes lourdes est codée par la séquence d'acides nucléiques murine SEQ ID NO : 2, et dont les régions constantes des chaînes légères et des chaînes lourdes proviennent d'une espèce non murine, pour son utilisation dans le traitement du lymphome cérébral primitif. 1. A monoclonal antibody directed against the CD20 antigen, whose variable region of each of the light chains is encoded by the murine nucleic acid sequence SEQ ID NO: 1, whose variable region of each of the heavy chains is encoded by the sequence of murine nucleic acids SEQ ID NO: 2, and whose constant regions of the light and heavy chains come from a non-murine species, for its use in the treatment of primary brain lymphoma.
2. Anticorps selon la revendication 1 , dont les régions constantes de chacune des chaînes légères et de chacune des chaînes lourdes sont des régions constantes humaines. An antibody according to claim 1, wherein the constant regions of each of the light chains and each of the heavy chains are human constant regions.
3. Anticorps selon la revendication 1 ou 2, dont la région constante de chacune des chaînes lourdes est codée par la séquence d'acide nucléique humaine SEQ ID NO : 3 et dont la région constante de chacune des chaînes légères est codée par la séquence d'acides nucléiques humaine SEQ ID NO : 4. An antibody according to claim 1 or 2, wherein the constant region of each of the heavy chains is encoded by the human nucleic acid sequence SEQ ID NO: 3 and whose constant region of each of the light chains is encoded by the sequence of human nucleic acids SEQ ID NO: 4.
4. Anticorps selon l'une quelconque des revendications précédentes, dont chacune des chaînes légères est codée par la séquence d'acides nucléiques chimérique murine-humaine SEQ ID NO : 5, et dont chacune des chaînes lourdes est codée par la séquence d'acides nucléiques chimérique murine- humaine SEQ ID NO : 6. An antibody according to any one of the preceding claims, each of which is light-chain encoded by the chimeric murine-human nucleic acid sequence SEQ ID NO: 5, and wherein each of the heavy chains is encoded by the acid sequence. Chimeric murine-human nuclei SEQ ID NO: 6.
5. Anticorps selon la revendication 4, dont chacune des chaînes légères est constituée de la séquence en acides aminés SEQ ID NO : 7 et dont chacune des chaînes lourdes est constituée de la séquence en acides aminés SEQ ID NO : 8. 5. Antibody according to claim 4, each of the light chains consists of the amino acid sequence SEQ ID NO: 7 and each of the heavy chains consists of the amino acid sequence SEQ ID NO: 8.
6. Anticorps selon l'une quelconque des revendications précédentes, produit dans l'hybridome de rat YB2/0 (cellule YB2/3HL.P2.G1 1 .16Ag.20, déposée à l'American Type Culture Collection sous le numéro ATCC CRL- 1662). An antibody according to any one of the preceding claims, produced in the YB2 / 0 rat hybridoma (YB2 / 3HL.P2.G1 1 .16Ag.20 cell, deposited at the American Type Culture Collection under number ATCC CRL - 1662).
7. Anticorps selon la revendication 5, produit par le clone R603 déposé sous le numéro d'enregistrement CNCM I-3529 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM). 7. Antibody according to claim 5, produced by the clone R603 deposited under the registration number CNCM I-3529 to the National Collection of Cultures of Microorganisms (CNCM).
8. Anticorps monoclonal dirigé contre un antigène présent à la surface des cellules de lymphome cérébal primitif pour son utilisation par voie d'administration intrathécale dans le traitement du lymphome cérébral primitif. 8. Monoclonal antibody directed against an antigen present on the surface of primitive ceral lymphoma cells for use by intrathecal administration in the treatment of primary brain lymphoma.
9. Anticorps selon la revendication 8, dans lequel ledit antigène présent à la surface des cellules de lymphome cérébal primitif est choisi parmi CD15, CD19, CD20, CD22, CD30, CD45, CD79a, CD138, MIB-1 , MUM-1 , et des idiotopes d'immunoglobulines membranairesAn antibody according to claim 8, wherein said antigen present on the surface of primitive brain lymphoma cells is selected from CD15, CD19, CD20, CD22, CD30, CD45, CD79a, CD138, MIB-1, MUM-1, and membrane immunoglobulin idiotopes
10. Anticorps selon l'une quelconque des revendications 8 ou 9, dont la région constante de chacune des chaînes lourdes est codée par la séquence d'acide nucléique humaine SEQ ID NO : 3 et dont la région constante de chacune des chaînes légères est codée par la séquence d'acides nucléiques humaine SEQ ID NO : 4. 10. The antibody according to claim 8, wherein the constant region of each of the heavy chains is encoded by the human nucleic acid sequence SEQ ID NO: 3 and whose constant region of each of the light chains is coded. by the human nucleic acid sequence SEQ ID NO: 4.
1 1 . Anticorps selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, produit dans l'hybridome de rat YB2/0 (cellule YB2/3HL.P2.G1 1 .16Ag.20, déposée à l'American Type Culture Collection sous le numéro ATCC CRL-1662). 1 1. An antibody according to any one of claims 8 to 10, produced in the YB2 / 0 rat hybridoma (YB2 / 3HL.P2.G1 1 .16Ag.20 cell, deposited at the American Type Culture Collection under number ATCC CRL -1662).
12. Anticorps selon l'une quelconque des revendications 8 à 1 1 , ledit anticorps se liant spécifiquement à l'antigène CD20. An antibody according to any one of claims 8 to 11, said antibody binding specifically to the CD20 antigen.
13. Anticorps selon la revendication 12, ledit antigène CD20 étant un antigène humain. An antibody according to claim 12, said CD20 antigen being a human antigen.
14. Anticorps selon l'une quelconque des revendications 8 à 13, dont la région variable de chacune des chaînes légères est codée par la séquence d'acides nucléiques murine SEQ ID NO : 1 , et la région variable de chacune des chaînes lourdes est codée par la séquence d'acides nucléiques murine SEQ ID NO : 2. An antibody according to any one of claims 8 to 13, wherein the variable region of each of the light chains is encoded by the murine nucleic acid sequence SEQ ID NO: 1, and the variable region of each of the heavy chains is encoded. by the murine nucleic acid sequence SEQ ID NO: 2.
15. Anticorps selon l'une quelconque des revendications 8 à 14, dont chacune des chaînes légères est codée par la séquence d'acides nucléiques chimérique murine-humaine SEQ ID NO : 5, et dont chacune des chaînes lourdes est codée par la séquence d'acides nucléiques chimérique murine- humaine SEQ ID NO : 6. The antibody of any one of claims 8 to 14, wherein each of the light chains is encoded by the chimeric murine-human nucleic acid sequence SEQ ID NO: 5, and wherein each of the heavy chains is encoded by the sequence of Chimeric murine-human nucleic acids SEQ ID NO: 6.
16. Anticorps selon la revendication 15, dont chacune des chaînes légères est constituée de la séquence en acides aminés SEQ ID NO : 7 et dont chacune des chaînes lourdes est constituée de la séquence en acides aminés SEQ ID NO : 8. An antibody according to claim 15, wherein each of the light chains consists of the amino acid sequence SEQ ID NO: 7 and each of whose heavy chains consists of the amino acid sequence SEQ ID NO: 8.
17. Anticorps selon la revendication 16, produit par le clone R603 déposé sous le numéro d'enregistrement CNCM I-3529 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM). 17. Antibody according to claim 16, produced by the clone R603 deposited under the registration number CNCM I-3529 to the National Collection of Cultures of Microorganisms (CNCM).
18. Utilisation d'un anticorps selon l'une quelconque des revendications18. Use of an antibody according to any one of the claims
1 à 17, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement du lymphome cérébral primitif. 1 to 17 for the manufacture of a medicament for the treatment of primary cerebral lymphoma.
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