WO2012014942A1 - 静電結合型ベシクル - Google Patents

静電結合型ベシクル Download PDF

Info

Publication number
WO2012014942A1
WO2012014942A1 PCT/JP2011/067138 JP2011067138W WO2012014942A1 WO 2012014942 A1 WO2012014942 A1 WO 2012014942A1 JP 2011067138 W JP2011067138 W JP 2011067138W WO 2012014942 A1 WO2012014942 A1 WO 2012014942A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
group
integer
thiol
alkyl
segment
Prior art date
Application number
PCT/JP2011/067138
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
顕広 岸村
片岡　一則
ステファニー リー
泰孝 安楽
彩 小出
酒井　満
秋明 郁
Original Assignee
国立大学法人東京大学
帝人株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 国立大学法人東京大学, 帝人株式会社 filed Critical 国立大学法人東京大学
Priority to US13/812,383 priority Critical patent/US9051437B2/en
Priority to JP2012526534A priority patent/JP5679357B2/ja
Priority to EP11812531.9A priority patent/EP2599834B1/en
Publication of WO2012014942A1 publication Critical patent/WO2012014942A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G81/00—Macromolecular compounds obtained by interreacting polymers in the absence of monomers, e.g. block polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
    • A61K9/1273—Polymersomes; Liposomes with polymerisable or polymerised bilayer-forming substances
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • A61K9/1605—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/1629—Organic macromolecular compounds
    • A61K9/1641—Organic macromolecular compounds obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyethylene glycol, poloxamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L77/00—Compositions of polyamides obtained by reactions forming a carboxylic amide link in the main chain; Compositions of derivatives of such polymers
    • C08L77/04—Polyamides derived from alpha-amino carboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G69/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a carboxylic amide link in the main chain of the macromolecule
    • C08G69/02—Polyamides derived from amino-carboxylic acids or from polyamines and polycarboxylic acids
    • C08G69/08—Polyamides derived from amino-carboxylic acids or from polyamines and polycarboxylic acids derived from amino-carboxylic acids
    • C08G69/10—Alpha-amino-carboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G73/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a linkage containing nitrogen with or without oxygen or carbon in the main chain of the macromolecule, not provided for in groups C08G12/00 - C08G71/00
    • C08G73/02—Polyamines
    • C08G73/0233—Polyamines derived from (poly)oxazolines, (poly)oxazines or having pendant acyl groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L2205/00—Polymer mixtures characterised by other features
    • C08L2205/02—Polymer mixtures characterised by other features containing two or more polymers of the same C08L -group
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T428/00—Stock material or miscellaneous articles
    • Y10T428/29—Coated or structually defined flake, particle, cell, strand, strand portion, rod, filament, macroscopic fiber or mass thereof
    • Y10T428/2982—Particulate matter [e.g., sphere, flake, etc.]
    • Y10T428/2989—Microcapsule with solid core [includes liposome]

Definitions

  • the present invention relates to a vesicle formed of a water-soluble and charged polymer. More specifically, the present invention relates to an electrostatic binding vesicle using a polymer into which a thiol group or a disulfide group is introduced. The present invention relates to a vesicle having a useful function as a material.
  • a polymer whose primary structure is precisely controlled can spontaneously form a structure and form a higher order structure.
  • Specific examples thereof include structures such as micelles and vesicles.
  • Such a polymer self-organized structure can be designed in various ways, and can be a structure having a new function in addition to the properties inherent to the polymer. The use of such a polymer self-assembled structure has been studied in various fields including drug delivery systems and material science.
  • Patent Document 1 JP-A-8-188541 discloses an electrostatically coupled polymer micelle drug carrier made of a block copolymer having an uncharged segment and a charged segment.
  • Patent Document 2 discloses a vesicle composed of a film formed by the interaction of two copolymers as an electrostatic coupling type vesicle.
  • Non-Patent Document 1 Helmut Schlaad et al., Macromolecules, 2003, 36 (5), 1417-1420 (Non-Patent Document 1) includes a block copolymer consisting of a poly (1,2-butadiene) block and a poly (cesium methacrylate) block. It is disclosed that a vesicle called a polymersome can be formed by using a polymer and a block copolymer composed of a polystyrene block and a poly (1-methyl-4-vinylpyridinium iodide) block.
  • Non-Patent Document 2 Anraku Y. et al., J. Am. Chem. Soc., 2010, 132 (5), 1631-1636 (Non-Patent Document 2) describes a block co-polymer with an uncharged hydrophilic segment and a charged segment.
  • a vesicle obtained by self-assembling a polymer (for example, polyethylene glycol (PEG) -polyanion or the like) and a copolymer (for example, polycation or the like) charged to a charge opposite to the chargeable segment is the present inventors. Is disclosed by a part of.
  • a vesicle composed of a single electrostatic coupling film having a diameter of 100 to 400 nm and having a uniform size can be easily produced simply by mixing two kinds of polymer aqueous solutions.
  • vesicles obtained by self-assembly of macromolecules can be used by including and supporting various substances in the voids and releasing inclusions under appropriate circumstances.
  • Non-patent Document 3 Soft Matter, 2006, 2, 940-949
  • Non-patent document 4 "New development of liposome application", supervised by Kazunari Akiyoshi, NTS, 2005 (non-patent document 4), Akihiro Kishimura, Kazunori Kataoka, Artificial Blood, 2009, 17, 73-81 (Non-patent Document 5)). Therefore, establishment of a simple crosslinking method and a method for controlling the sustained release ability and stability of the vesicle in an environmentally responsive manner is also demanded for the above-described electrostatically coupled vesicles.
  • An object of the present invention is to provide a vesicle formed of a water-soluble and charged polymer.
  • the present inventor introduced a thiol group and / or a disulfide group into a water-soluble and charged block copolymer, whereby a vesicle by a charged segment portion was obtained.
  • the inventors have found a technique for cleaving the cross-linked structure in an environmentally responsive manner even after vesicle cross-linking, thereby completing the present invention.
  • the present invention provides a film formed by the following first polymer (a) or (b) and the following second polymer (c) or (d) (provided that (b) and (a combination with (d)), which is a vesicle comprising a membrane in which a part of the cationic segment and anionic segment in the polymer is crosslinked.
  • First polymer (a) Block copolymer I having an uncharged hydrophilic segment and a cationic segment I
  • Second polymer (c) Block copolymer II having uncharged hydrophilic segment and anionic segment II
  • the bridge has a structure containing a disulfide bond at the site.
  • the membrane has a three-layer structure including an outer layer, an intermediate layer, and an inner layer, and the outer layer and the inner layer are constituted by an uncharged hydrophilic segment, and the intermediate layer is a cationic segment and an anion. It consists of sex segments.
  • uncharged hydrophilic segment examples include polyethylene glycol and / or poly (2-oxazoline).
  • examples of the cationic segment include those represented by the following formula (1).
  • R 2 represents a hydrogen atom, an acetyl group, a trifluoroacetyl group, an acryloyl group or a methacryloyl group
  • R 11 and R 13 each independently represent — (CH 2 ) 3 NH 2 or —CONH (CH 2 ) s —X 1 , wherein s is an integer of 0 to 20, and X 1 is -NH 2 , pyridyl group, morpholyl group, 1-imidazolyl group, piperazinyl group, 4- (C 1-6 alkyl) -piperazinyl group, 4- (amino C 1-6 alkyl) -piperazinyl group, pyrrolidin-1-yl Group, N-methyl-N-phenylamino group, piperidinyl group, guanidino group, diisopropylamino group, dimethylamino group, diethylamino group,-(CH 2 ) t NH 2 and-
  • o is an integer of 1 to 15, preferably an integer of 1 to 10.
  • s is an integer of 0 to 20, preferably an integer of 2 to 8.
  • examples of the anionic segment include those represented by the following formula (2).
  • R 2 represents a hydrogen atom, an acetyl group, a trifluoroacetyl group, an acryloyl group or a methacryloyl group
  • R 3 each independently represents a methylene group or an ethylene group
  • R 31 and R 32 each independently represent a methylene group or an ethylene group
  • R 33 and R 34 each independently represents a single bond, a methylene group or an ethylene group
  • R 41 and R 42 are each independently a benzyloxycarbonyl group, a thiol group, a C 1-12 alkyl group containing a thiol group, —SR 30 (R 30 is a benzyl group, a 4-methoxybenzyl group, a 4- A methylbenzyl group, an N- (acetyl) aminomethyl group, a tert-butyl group, a trityl group, a 2-
  • c1 and c2 are each an integer from 0 to 5,000, d1 and d2 are each an integer from 0 to 5,000, and c1 + c2 + d1 + d2 is 2 to 5,000,
  • the notation “/” indicates that the arrangement order of each monomer unit is arbitrary.
  • R 2 is a hydrogen atom
  • R 3 is a methylene group
  • R 31 , R 32 , R 33 and R 34 are methylene groups
  • R 41 and R 42 are thiol groups or- CONH (CH 2 ) S -SH (s is an integer of 2 to 8)
  • c1 and c2 are integers of 0 to 200
  • d1 and d2 are integers of 0 to 200
  • examples of the block copolymer I include those represented by the following formula (3) or (4).
  • R 2 represents a hydrogen atom, an acetyl group, a trifluoroacetyl group, an acryloyl group or a methacryloyl group
  • R 11 and R 13 each independently represent — (CH 2 ) 3 NH 2 or —CONH (CH 2 ) s —X 1 , wherein s is an integer of 0 to 20, and X 1 is -NH 2 , pyridyl group, morpholyl group, 1-imidazolyl group, piperazinyl group, 4- (C 1-6 alkyl) -piperazinyl group, 4- (amino C 1-6 alkyl) -piperazinyl group, pyrrolidin-1-yl Group, N-methyl-N-phenylamino group, piperidinyl group, guanidino group, diisopropylamino group,
  • R 8 represents a linear or branched C 1-12 alkyl group
  • a1 and a2 are each an integer of 0 to 5,000
  • b1 and b2 are each an integer of 0 to 5,000
  • a1 + a2 + b1 + b2 is 2 to 5,000
  • e is an integer from 5 to 2,500
  • f is an integer from 5 to 2,500
  • the notation “/” indicates that the arrangement order of each monomer unit is arbitrary. ]
  • R 11 and R 13 are each independently —CONH (CH 2 ) S —NH 2 (s is an integer of 2 to 8),
  • R 12 and R 14 are each independently a thiol group, -CONH (CH 2 ) S -SS- (CH 2 ) t NH 2 , -CONH (CH 2 ) S -SH, -CONH (CH 2 ) S NHCO ( CH 2 ) u SH or —CONH (CH 2 ) S NHC ( ⁇ NH) (CH 2 ) v SH (s is an integer of 2 to 8, t is an integer of 0 to 15, and u is 1 to 8 And v is an integer of 1 to 8),
  • R 2 is a hydrogen atom
  • R 4 is a methyl group
  • a1 and a2 are integers from 0 to 200
  • b1 and b2 are integers from 0 to 200
  • a1 + a2 + b1 + b2 is from 10 to 200, e
  • examples of the block copolymer II include those represented by the following formula (5) or (6).
  • R 2 represents a hydrogen atom, an acetyl group, a trifluoroacetyl group, an acryloyl group or a methacryloyl group
  • R 3 each independently represents a methylene group or an ethylene group
  • R 31 and R 32 each independently represent a methylene group or an ethylene group
  • R 33 and R 34 each independently represents a single bond, a methylene group or an ethylene group
  • R 41 and R 42 are each independently a benzyloxycarbonyl group, a thiol group, a C 1-12 alkyl group containing a thiol group, —SR 30 (R 30 is a benzyl group, a 4-methoxybenzyl group, a 4- A methylbenzyl group, an N- (acetyl) aminomethyl group, a tert-butyl group, a trityl
  • R 4 represents a hydrogen atom or an optionally substituted linear or branched C 1-12 alkyl group
  • R 5 represents — (CH 2 ) g NH—, and g is an integer of 0 to 5
  • R 6 and R 7 are the same as R 4 and R 5 , respectively.
  • R 8 represents a linear or branched C 1-12 alkyl group
  • c1 and c2 are each an integer from 0 to 5,000
  • d1 and d2 are each an integer from 0 to 5,000
  • c1 + c2 + d1 + d2 is 2 to 5,000
  • i and j are each an integer of 5 to 2,500
  • the notation “/” indicates that the arrangement order of each monomer unit is arbitrary. ]
  • R 2 represents a hydrogen atom
  • R 3 represents a methylene group
  • R 31 , R 32 , R 33 and R 34 represent a methylene group
  • R 4 represents a methyl group
  • R 6 represents a methyl group
  • R 8 represents -CH (CH 3 ) 2 and c1 and c2 are each an integer of 0 to 200, d1 and d2 are each an integer of 0 to 200, and c1 + c2 + d1 + d2 is 10 to 200
  • i is an integer from 10 to 300
  • It is preferable that j is an integer of 10 to 300.
  • R 2 represents a hydrogen atom
  • R 3 represents a methylene group
  • R 31 , R 32 , R 33 and R 34 represent a methylene group
  • R 41 and R 42 represent a thiol group
  • R 4 represents a methyl group
  • R 6 represents a methyl group
  • R 8 represents -CH (CH 3 ) 2 and c1 and c2 are each an integer of 0 to 200, d1 and d2 are each an integer of 0 to 200, and c1 + c2 + d1 + d2 is 10 to 200, i is an integer from 10 to 300, More preferably, j is an integer of 10 to 300
  • block copolymer I is represented by the above formula (3)
  • block copolymer II is represented by the above formula (5).
  • the vesicle contains a compound.
  • an electrostatic coupling type vesicle is provided.
  • a thiol group or a disulfide group is introduced into the charged segment portion, the inside and outside of the membrane are hydrophilic, a drug or the like can be enclosed in the hollow portion in the membrane, and a cation
  • the bond between the ionic segment and the anionic segment can be adjusted.
  • the formed electrostatic binding film can be used for spontaneous cross-linking based on disulfide formation between thiol groups, and for responsiveness to disulfide bond reducing environments, oxidizing environments, or environments where radicals can be generated. Based on this, it is possible to control the vesicle decay induction and controlled release. Therefore, the vesicle of the present invention is extremely useful in that it can be used in a drug delivery system (DDS).
  • DDS drug delivery system
  • the vesicle of the present invention does not require the use of an organic solvent in its production, and can be advantageously used in the field of biomaterials and DDS. Further, the vesicle of the present invention has a space (central void) inside the membrane, and can enclose a large amount of a substance such as a compound. Can be advantageously used as a reactor fine particle or the like having an enzyme reaction field. Furthermore, the vesicle of the present invention can stably maintain its structure in the presence of physiological saline or serum, and can impart various functions such as semi-permeability to the membrane.
  • the charged segments are cross-linked by a disulfide bond or the like, and the bond can be released by exposure under reducing conditions. Therefore, the vesicle of the present invention can be advantageously used as a biomaterial or drug delivery system excellent in structural stability and environmental responsiveness.
  • the “vesicle” means a basic structure having a void inside and closed by a membrane.
  • alkyl or “alkoxy” as a group or part of a group means a straight, branched, or cyclic alkyl or alkoxy group.
  • a "C 1-12” as referred to as "C 1-12 alkyl group” means that the carbon number of the alkyl group has 1 to 12.
  • C 1-12 alkyl group means methyl group, ethyl group, n-propyl group, isopropyl group, n-butyl group, sec-butyl group, tert-butyl group, n-pentyl group, n- A hexyl group, a decyl group, an undecyl group, etc. are mentioned.
  • the “C 1-6 alkyl group” includes methyl group, ethyl group, n-propyl group, isopropyl group, n-butyl group, sec-butyl group, tert-butyl group, n-pentyl group, n-hexyl group and the like. Can be mentioned.
  • aryl means phenyl, naphthyl, anthnyl, pyrenyl and the like.
  • halogen atom means a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, or an iodine atom.
  • an alkyl group is “optionally substituted” means that one or more hydrogen atoms on the alkyl group are substituted by one or more substituents (which may be the same or different). It means that it may be. It will be apparent to those skilled in the art that the maximum number of substituents can be determined depending on the number of substitutable hydrogen atoms on the alkyl. For groups other than alkyl groups, “optionally substituted” is interpreted in the same manner as described above.
  • the substituent is a halogen atom, aryl group, hydroxyl group, amino group, carboxyl group, cyano group, formyl group, dimethylacetalized formyl group, diethylacetalized formyl group, C 1-6 alkoxycarbonyl group, C 2-7 It is selected from the group consisting of an acylamide group, a tri-C 1-6 alkylsiloxy group (wherein C 1-6 alkyl may be the same or different), a siloxy group and a silylamino group.
  • the vesicle of the present invention is characterized in that it includes a film formed by the interaction of water-soluble and charged polymers.
  • the vesicle of the present invention has a film (excluding the combination of (b) and (d)) formed by the following first polymer and second polymer. This membrane is obtained by crosslinking a part of the cationic segment and the anionic segment in the polymer.
  • First polymer (a) Block copolymer I having an uncharged hydrophilic segment and a cationic segment I (b) Amino acid polymer I having a cationic segment Second polymer: (c) Block copolymer II having uncharged hydrophilic segment and anionic segment II (d) Amino acid polymer having an anionic segment II
  • the outer side and the inner side of the membrane of the present invention are preferably hydrophilic, and the combination of the amino acid polymers (b) and (d) is excluded.
  • FIG. 1 is a schematic view showing a structure of a vesicle of the present invention and a mechanism for forming the vesicle according to one embodiment.
  • the first and second polymers are both block copolymers of uncharged hydrophilic segments and charged segments (combination of the above (a) and (c)). explain.
  • a first block copolymer 101 has an uncharged hydrophilic segment 102 and a positively charged charged segment (cationic segment) 103, while the second block copolymer 201 Has an uncharged hydrophilic segment 202 and a negatively charged charged segment (anionic segment) 203.
  • the first block copolymer 101 and the second block copolymer 201 self-assemble when placed in a system where charge interaction can occur, and as shown in FIG.
  • the intermediate layer 20 of the ion complex composed of 203 and two hydrophilic layers (the outer layer 31 and the inner layer 32) composed of the non-charged hydrophilic segments 102 and 202 are formed, and vesicles having the structure (B) as a film ( C) is produced.
  • FIG. 1A a first block copolymer 101 has an uncharged hydrophilic segment 102 and a positively charged charged segment (cationic segment) 103, while the second block copolymer 201 Has an uncharged hydrophilic segment 202 and a negatively charged charged
  • FIG. 1B is a schematic enlarged view showing the inside of the frame in FIG. 1C.
  • the side chain of the charged segment has a thiol group or the like, and can form a disulfide bond, for example, under oxidizing conditions (FIG. 1 (D)).
  • oxidizing conditions in addition to air oxidation, iodine, hydrogen peroxide, potassium permanganate, copper sulfate, lead dioxide, Fe 3+ complex, NO, N 2 O 4 , NO 2 and other nitrogen oxides as oxidants, A general method using dimethyl sulfoxide or the like can be mentioned.
  • the vesicle of the present invention is formed mainly by electrostatic interaction between charged segments and crosslinking such as disulfide bonds. Therefore, it is possible to control the formation and dissociation of vesicles and the permeability of the membrane through ionic strength, pH change in the living body and redox reaction. As a result, the vesicle of the present invention exhibits excellent environmental responsiveness. can do.
  • the vesicle film has a three-layer structure including an outer layer 31, an intermediate layer 20, and an inner layer 32.
  • an inner layer comprised from an uncharged hydrophilic segment, an aqueous medium can be contained in the center space
  • the form of the vesicle of the present invention is usually spherical.
  • the particle size of the vesicle of the present invention is not particularly limited as long as it has a hollow structure, but is preferably 10 ⁇ m or less, more preferably 50 nm to 1 ⁇ m.
  • the vesicle of the present invention is an endoplasmic reticulum having a polyion complex (PIC) formed in the intermediate layer. Therefore, the vesicle of the present invention is sometimes referred to as “PICsome”.
  • segment contained in the first polymer and the chargeable segment contained in the second polymer can be charged to opposite charges.
  • the charged segment contained in one polymer is a cationic segment, and the charged segment contained in the second polymer is an anionic segment.
  • a polyamine when used as the cationic segment, it can be positively charged by acid addition to the polyamine.
  • the type of acid to be added is appropriately determined according to the usage of vesicles and the like.
  • the cationic segment of the first polymer is represented by the following formula (1).
  • R 2 represents a hydrogen atom, an acetyl group, a trifluoroacetyl group, an acryloyl group or a methacryloyl group.
  • R 11 and R 13 are each independently - (CH 2) 3 NH 2 or -CONH (CH 2) represents a s -X 1, where, s is an integer of 0 ⁇ 20, X 1 Are —NH 2 , pyridyl group, morpholyl group, 1-imidazolyl group, piperazinyl group, 4- (C 1-6 alkyl) -piperazinyl group, 4- (amino C 1-6 alkyl) -piperazinyl group, pyrrolidine-1 -Yl group, N-methyl-N-phenylamino group, piperidinyl group, guanidino group, diisopropylamino group, dimethylamino group, diethylamino group,-(CH 2 ) t NH 2
  • R 12 and R 14 are each independently a thiol group, a C 1-12 alkyl group containing a thiol group, —SR 30 (R 30 is a benzyl group, a 4-methoxybenzyl group, a 4-methylbenzyl group, an N -(Acetyl) aminomethyl group, tert-butyl group, trityl group, 2-pyridinesulfenyl group or 3-nitro-2-pyridinesulfenyl group), or -CONH (CH 2 ) s -X 2 Where s is an integer from 0 to 20, X 2 is a thiol group, a C 1-12 alkyl group containing a thiol group, SR 30 (R 30 is as defined above), and a thiol group, C 1-12 alkyl group or SR 30 containing a thiol group (R 30 is the same as the a) pyridyl group substituted by, 1-imidazolyl group,
  • Examples of the C 1-12 alkyl group containing a thiol group include a mercaptomethyl group, 2-mercaptoethyl group, 3-mercaptopropyl group, 3-mercaptobutyl group, 4-mercaptobutyl group, 6-mercaptohexyl group, 3 -Mercaptohexyl group, 8-mercaptooctyl group, 12-mercaptododecyl group and the like.
  • a1 and a2 are each an integer of 0 to 5,000
  • b1 and b2 are each an integer of 0 to 5,000
  • a1 + a2 + b1 + b2 is 2 to 5,000.
  • R 30 is a protecting group for a thiol group.
  • R 30 is a protecting group for a thiol group.
  • X 1 may be the same functional group for each repeating unit of the charged segment, Or it may be a different functional group.
  • R 11 and R 13 are each independently —CONH (CH 2 ) S —NH 2 (s is an integer of 2 to 8).
  • a thiol group or a thiol group was sulfenylated on the cationic segment and the anionic segment Group or the like, or (ii) the cationic segment must contain a disulfide bond. Therefore, in the case of crosslinking according to the embodiment (i), at least one of a2 and b2 is preferably not 0 in the formula (1).
  • a linker can also be used to crosslink both segments.
  • the type of the linker moiety for crosslinking both segments is not particularly limited as long as the disulfide bond is formed at both ends of the linker and the particles are stabilized.
  • Crosslinkers for introducing linkers include sulfenylation synthesized from alkyldithiols, thiosulfinates (eg 1,2-dithiane-t-4, t-5-diol r-1-oxide) and alkyldithiols. Agents and the like.
  • the type of the cross-linking agent is not limited, and can be appropriately selected according to the use of the vesicle, the type of the first polymer and the second polymer, the type of other film components, and the like.
  • a charged group for example, a cation group such as an amino group
  • an anionic group such as a carboxyl group
  • a crosslinking agent that does not react with the encapsulated substance is preferable.
  • cross-linking agent examples include a cross-linking agent that cross-links an amino group (for example, glutaraldehyde, dimethyl-suberimidate-dihydrochloride (DMS), dimethyl 3,3′-dithiobispropionimidate (dimethyl 3,3).
  • a cross-linking agent that cross-links an amino group for example, glutaraldehyde, dimethyl-suberimidate-dihydrochloride (DMS), dimethyl 3,3′-dithiobispropionimidate (dimethyl 3,3).
  • DTBP '-dithiobispropionimidate
  • a crosslinking agent that crosslinks by condensing an amino group and a carboxyl group eg, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropy ) carbodiimide: EDC
  • a crosslinking agent that crosslinks a phosphate group for example, metal ions such as calcium ions
  • glutaraldehyde and EDC are preferable, and EDC is particularly preferable.
  • one type of crosslinking agent may be used alone, but two or more types of crosslinking agents may be used in any combination and ratio.
  • a crosslinking agent When a crosslinking agent is used, the amount thereof can be appropriately set by those skilled in the art depending on the properties of the crosslinking agent or the properties of the crosslinking group.
  • a crosslinking agent that crosslinks by condensing an amino group and a carboxyl group 0.05 to 20 equivalents, preferably 0.1 to 20 equivalents, for example, 0.1, 0.5, 1.0, 5.0, or 10 equivalents can be used.
  • 0.05 to 20 equivalents, preferably 0.1 to 10 equivalents can be used with respect to the thiol group on the carboxyl group side or amino group side.
  • the cationic segment can be represented by the above formula (1), and one end on the opposite side of R 2 is -NH (CH 2 ) k-1 CH 3 , -NH- (CH 2 ) k-1 -C (triple bond) CH (k is an integer of 1 or more), etc., and -NH (CH 2 ) 3 CH 3 is preferred.
  • the amino acid polymer I is composed of a cationic segment.
  • the anionic segment of the second polymer is represented by the following formula (2).
  • R 2 represents a hydrogen atom, an acetyl group, a trifluoroacetyl group, an acryloyl group or a methacryloyl group
  • R 3 each independently represents a methylene group or an ethylene group
  • R 31 and R 32 each independently represent a methylene group or an ethylene group
  • R 33 and R 34 each independently represent a single bond or a methylene group or an ethylene group.
  • R 41 and R 42 are each independently a benzyloxycarbonyl group, a thiol group, a C 1-12 alkyl group containing a thiol group, —SR 30 (R 30 is a benzyl group, a 4-methoxybenzyl group, a 4- Methylbenzyl group, N- (acetyl) aminomethyl group, tert-butyl group, trityl group, 2-pyridinesulfenyl group or 3-nitro-2-pyridinesulfenyl group), or -CONH (CH 2 ) s -X 3 , wherein s is an integer of 0 to 20, and X 3 is a thiol group, a C 1-12 alkyl group containing a thiol group, or -SR 30 (R 30 is as defined above). ).
  • R 3 may be the same functional group or a different functional group for each repeating unit of the charged segment.
  • R 2 represents a hydrogen atom
  • R 3 represents a methylene group
  • R 31 , R 32 , R 33 and R 34 represent a methylene group.
  • R 41 and R 42 are a thiol group or —CONH (CH 2 ) S —SH (s is an integer of 2 to 8)
  • c1 and c2 are integers of 0 to 200
  • d1 and d2 are The integer is 0 to 200
  • c1 + c2 + d1 + d2 is 10 to 200.
  • a disulfide bond can be formed between the segments. Therefore, when a thiol group or a group in which the thiol group is sulfenylated is introduced into the cationic segment, it is preferable to form a disulfide bond with the anionic segment.
  • both c2 and d2 may be 0 in the formula (2) as long as the side chain of the cationic segment contains a disulfide bond. Then, an amide bond is formed between the amino group at the end of the side chain of the cationic segment and the carboxyl group at the end of the side chain of the anionic segment, and both segments are cross-linked.
  • the kind and combination of the crosslinking agents are the same as described above.
  • the anionic segment when the second polymer forms an amino acid polymer II having an anionic segment, the anionic segment can be represented by the above formula (2), and one end on the opposite side of R 2 is -NH (CH 2 ) w-1 CH 3 , -NH- (CH 2 ) w-1 -C (triple bond) CH (w is an integer of 1 or more) and the like, -NH (CH 2 ) 3 CH 3 is preferred.
  • the amino acid polymer II is composed of an anionic segment.
  • Uncharged hydrophilic segment is a polymer segment having uncharged and hydrophilic properties.
  • “uncharged” means that the segment is neutral as a whole. An example is when the segment has no positive or negative charge. Even if the segment has positive and negative charges in the molecule, the local effective charge density is not high, and the charge of the entire segment is neutralized to the extent that it does not interfere with the formation of vesicles due to self-organization. If so, it falls under “uncharged”.
  • “Hydrophilic” means to be soluble in an aqueous medium.
  • uncharged hydrophilic segments contained in the block copolymer include polyalkylene glycols such as polyethylene glycol, poly (2-methyl-2-oxazoline), and poly (2-ethyl-2-oxazoline).
  • poly (2-oxazoline) such as poly (2-normalpropyl-2-oxazoline) and poly (2-isopropyl-2-oxazoline), and polysaccharides, polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, polyacrylamide, polyacrylamide Examples thereof include methacrylamide, polyacrylic acid ester, polymethacrylic acid ester, poly (2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine), peptides having isoelectric point near 7, proteins, and derivatives thereof.
  • the block copolymer is stably present in an aqueous solution without associating and precipitating, and a vesicle can be efficiently constructed. Furthermore, the vesicle can hold
  • the uncharged hydrophilic segment of the first and second polymers is polyethylene glycol and / or poly (2-isopropyl-2-oxazoline), preferably polyethylene glycol. is there.
  • polyethylene glycol as the uncharged hydrophilic segment is advantageous for imparting biocompatibility to the vesicle.
  • the molecular weight of polyethylene glycol is preferably 500 to 15,000, more preferably 1,000 to 5,000.
  • the use of an uncharged hydrophilic segment having the above-described molecular weight for the block copolymer is advantageous in forming vesicles preferentially rather than forming micelles.
  • Block copolymer (1) Block copolymer having cationic segment I According to a preferred embodiment of the present invention, the block copolymer I having a cationic segment is represented by the following formula (3) or (4).
  • R 2 represents a hydrogen atom, an acetyl group, a trifluoroacetyl group, an acryloyl group or a methacryloyl group
  • R 11 and R 13 each independently represent — (CH 2 ) 3 NH 2 or —CONH (CH 2 ) s —X 1 , wherein s is an integer of 0 to 20, and X 1 is -NH 2 , pyridyl group, morpholyl group, 1-imidazolyl group, piperazinyl group, 4- (C 1-6 alkyl) -piperazinyl group, 4- (amino C 1-6 alkyl) -piperazinyl group, pyrrolidin-1-yl Group, N-methyl-N-phenylamino group, piperidinyl group, guanidino group, diisopropylamino group, dimethylamino group, diethylamino group,-(CH 2 ) t NH 2 and-
  • R 12 and R 14 are each independently a thiol group, a C 1-12 alkyl group containing a thiol group, —SR 30 (R 30 is a benzyl group, a 4-methoxybenzyl group, a 4-methylbenzyl group, an N -(Acetyl) aminomethyl group, tert-butyl group, trityl group, 2-pyridinesulfenyl group or 3-nitro-2-pyridinesulfenyl group), or -CONH (CH 2 ) s -X 2 Where s is an integer from 0 to 20, X 2 is a thiol group, a C 1-12 alkyl group containing a thiol group, SR 30 (R 30 is as defined above), and a thiol group, C 1-12 alkyl group or SR 30 containing a thiol group (R 30 is the same as the a) pyridyl group substituted by, 1-imidazolyl group,
  • R 8 represents a linear or branched C 1-12 alkyl group
  • a1 and a2 are each an integer of 0 to 5,000
  • b1 and b2 are each an integer of 0 to 5,000
  • a1 + a2 + b1 + b2 is 2 to 5,000
  • e is an integer from 5 to 2,500
  • f is an integer from 5 to 2,500
  • the notation “/” indicates that the arrangement order of each monomer unit is arbitrary.
  • R 11 and R 13 represent -CONH (CH 2 ) s -X 1
  • X 1 is the same functional group for each repeating unit of the block copolymer. There may be different functional groups.
  • R 11 and R 13 are each independently —CONH (CH 2 ) S —NH 2 (s is from 2 to 8).
  • R 12 and R 14 are each independently a thiol group, -CONH (CH 2 ) S -SS- (CH 2 ) t NH 2 , -CONH (CH 2 ) S -SH, -CONH (CH 2 ) S NHCO (CH 2 ) u SH or —CONH (CH 2 ) S NHC ( ⁇ NH) (CH 2 ) v SH (s is an integer of 2 to 8, t is an integer of 0 to 15 And u is an integer of 1 to 8, v is an integer of 1 to 8, R 2 is a hydrogen atom, R 4 is a methyl group, and a1 and a2 are integers of 0 to 200 B1 and b2 are integers of 0 to 200, a1 + a2 + b1 +
  • Block copolymer II having an anionic segment According to a preferred embodiment of the present invention, the block copolymer II having an anionic segment is represented by the following formula (5) or (6).
  • R 2 represents a hydrogen atom, an acetyl group, a trifluoroacetyl group, an acryloyl group or a methacryloyl group
  • R 3 each independently represents a methylene group or an ethylene group
  • R 31 and R 32 each independently represent a methylene group or an ethylene group
  • R 33 and R 34 each independently represents a single bond, a methylene group or an ethylene group
  • R 41 and R 42 are each independently a benzyloxycarbonyl group, a thiol group, a C 1-12 alkyl group containing a thiol group, —SR 30
  • R 30 is a benzyl group, a 4-methoxybenzyl group, a 4- A methylbenzyl group, an N- (acetyl) aminomethyl group, a tert-butyl group, a trityl group, a 2-pyridinesulfenyl group or a 3-nitro-2-pyridines
  • R 4 represents a hydrogen atom or an optionally substituted linear or branched C 1-12 alkyl group
  • R 5 represents — (CH 2 ) g NH—, and g is an integer of 0 to 5
  • R 6 and R 7 are the same as R 4 and R 5 , respectively.
  • R 8 represents a linear or branched C 1-12 alkyl group
  • c1 and c2 are each an integer from 0 to 5,000
  • d1 and d2 are each an integer from 0 to 5,000
  • c1 + c2 + d1 + d2 is 2 to 5,000
  • i and j are each an integer of 5 to 2,500
  • the notation “/” indicates that the arrangement order of each monomer unit is arbitrary.
  • R 3 may be the same functional group or a different functional group for each repeating unit of the block copolymer.
  • R 2 is a hydrogen atom
  • R 3 is a methylene group
  • R 31 , R 32 , R 33 and R 34 is a methylene group
  • R 4 is a methyl group
  • R 6 is a methyl group
  • R 8 is —CH (CH 3 ) 2
  • c1 and c2 are each an integer of 0 to 200
  • d1 and d2 are each an integer from 0 to 200
  • c1 + c2 + d1 + d2 is from 10 to 200
  • i is an integer from 10 to 300
  • j is an integer from 10 to 300.
  • R 2 is a hydrogen atom
  • R 3 is a methylene group
  • R 31 , R 32 , R 33 and R 34 is methylene group
  • R 41 and R 42 represents a thiol group
  • R 4 is a methyl group
  • R 6 is a methyl group
  • R 8 is -CH (CH 3) 2
  • c1 and c2 is an integer from 0 to 200
  • d1 and d2 are each an integer from 0 to 200
  • c1 + c2 + d1 + d2 is from 10 to 200
  • i is an integer from 10 to 300
  • j Is an integer from 10 to 300.
  • the vesicle of the present invention can contain a substance such as a compound in its central space.
  • the vesicle according to the present invention can also insert a substance such as a compound into its membrane.
  • the said substance can be suitably selected according to the use and the property of a vesicle, a drug, protein, a fluorescent pigment
  • the vesicle of the present invention is formed by utilizing electrostatic interaction and cross-linking between charged segments, the first polymer I and the second polymer II are mixed in an aqueous solution. Thus, it can be easily manufactured.
  • vesicles can be produced without using an organic solvent, it can be advantageously used in the field of biomaterials and DDS.
  • the ratio between the first charged segment and the second charged segment (the ratio between the cationic segment and the anionic segment) and the ratio between the uncharged hydrophilic segment and the charged segment are also arbitrary. From the viewpoint of promoting self-organization of the first polymer and the second polymer and efficiently producing a homogeneous vesicle, the selection is preferably made according to the following criteria.
  • the C / A ratio defined in the following formula (i) is usually 0.3, preferably 0.5 or more, more preferably 0.6 or more, and usually less than 3.0, preferably Is preferably adjusted to 2.0 or less, more preferably 1.7 or less.
  • the number of moles of the cation group and the anion group in the first and second polymers is a value depending on the structures of the cationic segment and the anionic segment, but a general potential difference (acid / base) titration is performed. It is possible to obtain by
  • a first aqueous solution containing the first polymer I and a second aqueous solution containing the second polymer II are prepared.
  • the first and second aqueous solutions may be purified by filtration, if desired.
  • the ratio of the total charge number of the first polymer I in the first aqueous solution to the total charge number of the second polymer II in the second aqueous solution is preferably 5: 1 to 1: 5, More preferably, it is about 1: 1.
  • the total number of charges in the block copolymer depends on the number of repeating units constituting the chargeable segment in the block copolymer and the number of charges of the repeating unit. As appropriate. Using two polymers in the above ratio is advantageous for efficiently producing a homogeneous vesicle.
  • the concentration of the first polymer I in the first aqueous solution and the concentration of the second polymer II in the second aqueous solution are the ratio of the total number of charges between the polymers and the aqueous solution of the polymer. It is appropriately determined in consideration of the solubility of the vesicle, the size of the vesicle to be prepared, the formation efficiency of the vesicle, and the like.
  • the solvent in the first and second aqueous solutions is preferably water or a buffer, more preferably 10 ⁇ mM Tris / HCl buffer, phosphate buffer. And HEPES buffer.
  • the pH in the first and second aqueous solutions may be appropriately adjusted within a range that does not interfere with the formation of vesicles, preferably pH 5 to pH 9, and more preferably about pH 7.
  • the pH can be easily adjusted by using a buffer as a solvent in the aqueous solution. Adjusting and using the pH of the first and second aqueous solutions is advantageous for maintaining the charged state of the block copolymer and forming vesicles efficiently.
  • the temperature of the first and second aqueous solutions is appropriately determined according to the solubility of the polymer in the solvent, but is preferably 4 to 80 ° C., more preferably 15 to 50 ° C.
  • the ionic strength in the first and second aqueous solutions may be appropriately adjusted within a range that does not interfere with the formation of vesicles, and is preferably 0 to 300 ⁇ m, more preferably 0 to 150 ⁇ m.
  • the first aqueous solution and the second aqueous solution are mixed.
  • the mixing method is not particularly limited, and the second aqueous solution may be added to the first aqueous solution, or the first aqueous solution may be added to the second aqueous solution. Further, the first aqueous solution and the second aqueous solution may be simultaneously added to the container and mixed. The mixed solution of the first aqueous solution and the second aqueous solution thus obtained may be appropriately stirred.
  • the temperature at the time of mixing the first aqueous solution and the second aqueous solution is not particularly limited as long as it does not interfere with the formation of vesicles, but is set in consideration of the solubility according to the temperature of the polymer. It is preferable.
  • the mixing temperature is, for example, 15 to 50 ° C.
  • a vesicle is produced
  • the formed vesicle may be immediately used for a desired application, but in order to equilibrate the system, a time for allowing the mixed solution to stand may be provided.
  • the time for which the mixed solution is allowed to stand varies depending on conditions such as vesicle formation efficiency, but is preferably 50 hours or less, and more preferably 30 hours or less.
  • the diameter of the formed vesicle tends to increase with time, and therefore it may be preferable not to provide a standing time.
  • the time for which the mixed solution is allowed to stand varies depending on the formation efficiency of the vesicle, but for example, the vesicle production system may involve particle growth, and thus the standing time may be short. In this case, the standing time is 2 to 30 minutes. Further, when sufficient equilibration of the system is intended, it is 30 minutes or more, preferably 30 to 50 hours.
  • the size of the obtained vesicle can be changed by standing for a short time (for example, 2 to 30 minutes) and standing for a long time (for example, 30 to 50 hours).
  • the crosslinking agent may be added and mixed with the mixed solution of the first and second aqueous solutions.
  • the crosslinking agent may be used for mixing as it is, but an aqueous solution containing the crosslinking agent may be prepared and mixed.
  • Preparation conditions such as an aqueous solvent, pH, temperature, and ionic strength in the preparation of the aqueous solution of the crosslinking agent are the same as those described above for the first and second aqueous solutions.
  • the crosslinking ratio between the charged segments is changed, and (i) the crosslinking agent And (ii) control of the structure of the film after cross-linking by adjusting the chemical structure of the cross-linking agent.
  • the cross-linking agent having a long alkyl chain or oligoethylene oxide chain can be expected to control the hydrophobicity, hydrophilicity, and flexibility of the film.
  • the substance when a substance such as a compound is included in the vesicle of the present invention, for example, the substance is added to the vesicle by adding the substance to the mixed solution containing the first and second polymers during vesicle formation. Can be included.
  • the substance may be encapsulated in the vesicle by previously adding the substance to one or both of the first and second aqueous solutions and preparing a mixed solution thereof. Therefore, the production method of the present invention preferably includes a step of adding a substance such as a compound for inclusion in a vesicle.
  • operations such as dialysis, dilution, concentration, and stirring can be added as appropriate.
  • the same technique as described above can also be used when a substance is inserted into a vesicle film.
  • An example of a preferred polymer for producing the vesicle of the present invention is shown in FIG.
  • Cystamine free base (Cyst) was distilled under reduced pressure after extraction and used. NMP was used by distillation under reduced pressure.
  • the obtained solution was filtered and lyophilized to obtain a disulfide-containing polycation homo-P (Asp-AP-Cyst).
  • “Homo-P (Asp-AP-Cyst)” is apparently a random copolymer, but it is expressed as such in this specification because it is made from homo-PBLA.
  • Other polymers for example, homo-P (Asp-AP)
  • FOG. 2 From the size exclusion chromatography, a unimodal peak was confirmed and the progress of the appropriate reaction was confirmed (FIG. 2).
  • the introduction ratio of DAP and Cyst into the final product was adjusted by adjusting the feed ratio from 1: 1 to 1:20. From the 1 H NMR spectrum, polycations with different Cyst contents (number of side chain residues) 20-75%) can be synthesized.
  • FIGS. 2 and 3 show the analysis results of the polymer homo-P (Asp-AP 0.8 -Cyst 0.2 ) 48 containing 20% of Cyst.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of size-exclusion chromatography (SEC) of homo-P (Asp-AP-Cyst).
  • the column was Superdex® 200/10/300 GL column (manufactured by GE Healthcare), and the eluent was 10 ⁇ mM phosphate buffer (500 ⁇ mM NaCl, pH 7.4), the flow rate was 0.5 ⁇ mL / min, and the temperature was 25 ° C.
  • a system manufactured by JASCO was used for chromatography.
  • FIG. 3 is a diagram showing the measurement results of 1 H NMR.
  • 38 units (peak ce; 6H) and 10 units (peak f, g; 4H) of DAP were introduced. confirmed that the introduced, Cyst20% containing polymer homo-P (Asp-AP 0.8 -Cyst 0.2) with the result the mating of 2 was identified as 48.
  • JNM-AL 300 JEOL, Japan
  • the measurement was performed at 80 ° C. in heavy water.
  • FIG. 4 is a conceptual diagram of a preparation scheme of PICsome.
  • PICsome can be obtained by mixing a homopolycation and a PEG polyanion.
  • the PICsome was identified by observation with a transmission electron microscope (TEM) described later and dynamic light scattering (DLS) measurement.
  • the resulting PICsome of polyion complex (PIC) film EDC solution to crosslink the (10 mg / mL) -COO - was added to a 10 equivalents relative to the side chain.
  • a PICsome containing no disulfide was prepared by using homo-P (Asp-AP) instead of homo-P (Asp-AP-Cyst).
  • FIG. 5 is a TEM observation photograph (taken after uranyl acetate staining) of the obtained PICsome. A characteristic image of the vesicle-derived hollow structure (appearance corresponding to the hollow portion being dented by drying) was confirmed.
  • Cyst45% -PICsome was measured for (a) no crosslinking and (b) after crosslinking (addition of 10 equivalents of EDC). After the crosslinking, no change was observed in the particle size even when NaCl was added.
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of DLS measurement in 10 mM phosphate buffer (0 mM NaCl, pH 7.4, 25 ° C.).
  • A Particle size and
  • b Polydispersity index (b) before and after the addition of 20 mM DTT.
  • PDI Polydispersity index with time.
  • Control Cyst0% -PICsome 45cyst: Cyst45% -PICsome
  • Cyst0% -PICsome there was no change in particle size and PDI over time before and after DTT addition, whereas Cyst45% -PICsome showed a sudden increase in particle size and PDI after a while after DTT addition. . From the above, the responsiveness of disulfide-containing PICsome to the reducing environment was confirmed.
  • FIG. 8 is a diagram showing the measurement results of DLS in 10 mM phosphate buffer (0 mM NaCl, pH 7.4, 25 ° C.).
  • FCS fluorescence correlation spectroscopy
  • FIG. 9 is a diagram showing the results of FCS measurement in a 10 mM phosphate buffer (150 mM NaCl, pH 7.4, 25 ° C.), showing the time-dependent change in translational diffusion time with or without 5 mM DTT.
  • ⁇ -methoxy- ⁇ -amino poly (ethylene glycol) (PEG-NH 2 ) (molecular weight 2,000) was purchased from NOF Corporation (Tokyo). n-Butylamine (Bu-NH 2 ) was distilled and used. 1,5-diaminopentane (DAP) was purchased from Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. (Tokyo).
  • the precipitate was filtered and washed several times with ether, and then the filtrate was dried under reduced pressure to obtain a thiol-containing block copolymer PEG-PCys-PBLA.
  • the obtained product was subjected to 1 H NMR measurement, and the peak in the vicinity of 7 to 9 ppm derived from the Mob group and the Npys group disappeared, confirming the deprotection reaction of the thiol group.
  • PCH-P (Asp-AP) was measured by 1 H NMR, and the total polymerization number of PAsp and PCys was estimated from the proton ratio of the PEG ethylene chain peak near 3.5 ppm to the PAsp and PCys methylene peaks near 2.6 ppm. Calculated as 100. From this result, it was confirmed that the deprotection reaction of PBLA proceeded quantitatively.
  • Examples 3 to 5 show synthesis examples of the first polymer and the second polymer.
  • PEG-P (Asp-r-Cys) was subjected to 1 H NMR measurement, and the total number of polymerizations of PAsp and PCys was determined from the proton ratio between the PEG ethylene chain peak near 3.5 ppm and the PAsp and PCys methylene peaks near 2.6 ppm. Was calculated to be about 90. From this result, it was confirmed that the deprotection reaction of PBLA proceeded quantitatively.
  • the recovered product was dissolved in 2.5 mL of NMP, added to a solution of DAP (25-40 equivalents to PBLA), and stirred vigorously at 5 ° C. for 1 hour.
  • the reaction mixture was neutralized with 20 wt% acetic acid at 0-5 ° C and dialyzed against 0.01 M hydrochloric acid for 3 days, followed by pure water for 3 days.
  • the internal solution was recovered by lyophilization to obtain P ((Asp-AP) -r-Cys), which is a thiol-containing cationic amino acid polymer.
  • the precipitate was filtered and washed several times with ether, and then the filtrate was dried under reduced pressure to obtain a thiol-containing block copolymer PEG-PCys-PBLA-PCys.
  • the obtained product was subjected to 1 H NMR measurement, and the peak in the vicinity of 7 to 9 ppm derived from the Mob group and the Npys group disappeared, confirming the deprotection reaction of the thiol group.
  • the precipitate was filtered and washed several times with ether, and the filtrate was dried under reduced pressure to obtain a thiol-containing polymer PCys-PBLA-PCys.
  • the obtained product was subjected to 1 H NMR measurement, and the peak in the vicinity of 7 to 9 ppm derived from the Mob group and the Npys group disappeared, confirming the deprotection reaction of the thiol group.
  • the recovered thiol-containing polymer PCys-PBLA-PCys was dissolved in 2.5 mL of NMP, added to a solution of DAP (25 to 40 equivalents relative to PBLA), and vigorously stirred at 5 ° C. for 1 hour.
  • the reaction mixture was neutralized with 20 wt% acetic acid at 0-5 ° C and dialyzed against 0.01 M hydrochloric acid for 3 days, followed by pure water for 3 days.
  • the internal solution was recovered by lyophilization to obtain a thiol-containing cationic amino acid polymer PCys-P (Asp-AP) -PCys.
  • PCys-P for (Asp-AP) -PCys performed 1 H NMR measurement, a peak derived from the end-butyl group, P a proton ratio of the methylene peaks of P (Asp-AP) and PCys near 2.6 ppm (Asp The total polymerization number of -AP) and PCys was calculated to be about 90. From this result, it was confirmed that the deprotection reaction of PBLA proceeded quantitatively.
  • the resulting solution was lyophilized to obtain a cationic amino acid polymer P (Asp-AP-IM) containing a 1-imino-4-mercaptobutyl (IM) group at the side chain amino terminus. From size exclusion chromatography, a unimodal peak was confirmed and the progress of the appropriate reaction was confirmed. From 1 H NMR, it was confirmed that the starting material homo-P (Asp-AP) was almost 100% reacted. By changing the amount of 2-iminothiolane added, it is possible to control the IM introduction rate from 0 to 100%.
  • PICsome disulfide cross-linked vesicles
  • a 10 mM phosphate buffer (0 mM NaCl, pH 7.4) solution (1 mg / mL) of PEG-PCys-PAsp and PCys-P (Asp-AP) was separately prepared. Each solution was mixed so that the ratio of charged side chains contained in the solution was equal, that is, the number of —COO ⁇ and —NH 3 + was equal, and stirred for 2 minutes to obtain PICsome.
  • 1,2-dithiane-t-4, t-5-diol r-1-oxide was added to this PICsome solution so that the thiol group on the PEG-PCys-PAsp side would be 0.5-10 equivalents.
  • Crosslinking was performed.
  • cytochrome c-encapsulated vesicles ⁇ Material> 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) was purchased from Sigma (St. Louis, CO, USA). Hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) was purchased from Wako Pure Chemical Industries, Ltd. (Osaka). PD-10 desalting column was purchased from GE Healthcare.
  • an electrostatic bond type vesicle having a disulfide bond introduced is provided.
  • the vesicle of the present invention is useful as a drug delivery system and various materials because a substance such as a compound can be encapsulated inside the membrane.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Polyamides (AREA)
  • Compositions Of Macromolecular Compounds (AREA)
  • Manufacturing Of Micro-Capsules (AREA)

Abstract

　本発明は、ジスルフィド結合又はチオール基を導入した静電結合型ベシクルの提供を目的とする。本発明は、以下の(a)又は(b)の第一の重合体と、以下の(c)又は(d)の第二の重合体とにより形成された膜（但し(b)と(d)との組み合わせを除く）であって前記重合体中のカチオン性セグメント及びアニオン性セグメントの一部が架橋された膜を有してなる、ベシクルに関する。　第一の重合体： (a) 非荷電親水性セグメントとカチオン性セグメントとを有するブロック共重合体I、(b) カチオン性セグメントを有するアミノ酸重合体I　第二の重合体：(c) 非荷電親水性セグメントとアニオン性セグメントとを有するブロック共重合体II、(d) アニオン性セグメントを有するアミノ酸重合体II。

Description

静電結合型ベシクル
　本発明は、水溶性でありかつ荷電した重合体により形成されるベシクルに関し、さらに詳しくは、チオール基、ジスルフィド基を導入した重合体を用いた静電結合型ベシクルであって薬物送達システム、各種材料として有用な機能を有するベシクルに関する。
　一次構造が精密に制御された高分子は、自発的に組織化を生じ、高次構造体を形成しうることが知られている。その具体例としては、ミセル、ベシクル等の構造体が挙げられる。このような高分子の自己組織化した構造体は、多様な分子設計が可能であり、高分子が本来有している性質に加えて、新たな機能を備えた構造体となり得る。このような高分子の自己組織化した構造体を利用することが、薬物送達システムや材料科学をはじめとする種々の分野において、従前検討されている。
　例えば、特開平８－１８８５４１号公報（特許文献１）には、非荷電性セグメントと荷電性セグメントとを有するブロック共重合体からなる静電結合型高分子ミセル薬剤担体が開示されている。また、WO2006/118260号（特許文献２）には、静電結合型ベシクルとして、二つの共重合体の相互作用により形成される膜からなるベシクルが開示されている。
　さらに、Helmut Schlaad et al., Macromolecules, 2003, 36(5), 1417-1420（非特許文献１）には、ポリ（１，２－ブタジエン）ブロック及びポリ（セシウム メタクリレート）ブロックからなるブロック共重合体と、ポリスチレンブロック及びポリ（１－メチル－４－ビニルピリジウム アイオダイド）ブロックからなるブロック共重合体とを用い、ポリマーソームと称されるベシクルを形成しうることが開示されている。
　高分子材料により形成される構造体は、優れた有用性が期待されるにもかかわらず、製造時にクロロホルム等の有機溶媒を用いることがしばしば必要とされる。さらに、高分子材料の自己組織化した構造体の製造にあっては、数工程に及ぶ煩雑な操作が要求されることがある。従って、有用性を備え、かつ簡便な操作により製造することが可能な構造体の創出が望まれるといえる。
　Anraku Y. et al., J. Am. Chem. Soc., 2010, 132(5), 1631-1636（非特許文献２）には、非荷電親水性セグメントと荷電性セグメントとを有するブロック共重合体（例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－ポリアニオン等）と、前記荷電性セグメントとは逆の電荷に荷電した共重合体（例えばポリカチオン等）とを自己組織化させてなるベシクルが、本発明者らの一部によって開示されている。この手法によれば、二種のポリマー水溶液を混合するだけで直径100-400 nmでサイズの揃った一枚の静電結合性膜からなるベシクルを簡便に製造することができる。通常、高分子の自己組織化により得られるベシクルは、その空隙部に各種の物質を包含・担持させ、適切な状況下において内包物を放出して利用することが考えられる（概説につきH. Nyin et al., Soft Matter, 2006, 2, 940-949（非特許文献３）及び「リポソーム応用の新展開」、秋吉一成等監修、エヌ・ティー・エス、2005年（非特許文献４）、岸村顕広、片岡一則、人工血液、2009, 17, 73-81（非特許文献５）参照）。従って、上記の静電結合型ベシクルについても簡便な架橋法、かつ環境応答的にベシクルの徐放能や安定性を制御する手法の確立が求められている。
特開平8-188541号公報 WO2006/118260号
Helmut Schlaad et al., Macromolecules, 2003, 36(5), 1417-1420 Anraku Y. et al., J. Am. Chem. Soc., 2010, 132(5), 1631-1636 H. Nyin et al., Soft Matter, 2006, 2, 940-949 「リポソーム応用の新展開」、秋吉一成・辻井薫監修、エヌ・ティー・エス、2005年 岸村顕広、片岡一則、人工血液、2009, 17, 73-81
　本発明は、水溶性でありかつ荷電した重合体により形成されるベシクルを提供することを目的とする。
　本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、水溶性でありかつ荷電したブロック共重合体にチオール基及び／又はジスルフィド基を導入することにより、荷電性セグメント部分によるベシクルを簡便に作製し得るだけでなく、架橋によって安定化したベシクルを取得するとともに、ベシクル架橋後も架橋構造部を環境応答的に開裂する手法を見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、以下の(a)又は(b)の第一の重合体と、以下の(c)又は(d)の第二の重合体とにより形成された膜（但し(b)と(d)との組み合わせを除く）であって前記重合体中のカチオン性セグメント及びアニオン性セグメントの一部が架橋された膜を有してなる、ベシクルである。
　第一の重合体：
　(a) 非荷電親水性セグメントとカチオン性セグメントとを有するブロック共重合体I
　(b) カチオン性セグメントを有するアミノ酸重合体I
　第二の重合体：
　(c) 非荷電親水性セグメントとアニオン性セグメントとを有するブロック共重合体II
　(d) アニオン性セグメントを有するアミノ酸重合体II
　本発明において、架橋は、その部位にジスルフィド結合が含まれる構造を有するものである。
　また、本発明の別の態様において、前記膜は、外層、中間層及び内層からなる三層構造を有し、外層及び内層は非荷電親水性セグメントにより構成され、中間層はカチオン性セグメント及びアニオン性セグメントにより構成される。
　非荷電親水性セグメントとしては、ポリエチレングリコール及び／又はポリ（２－オキサゾリン）が挙げられる。
　さらに、前記カチオン性セグメントとしては、下記式(1)で示されるものが挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
〔式中、
　R2は、水素原子、アセチル基、トリフルオロアセチル基、アクリロイル基またはメタクリロイル基を表し、
　R11及びR13は、それぞれ独立して-(CH2)3NH2又は-CONH(CH2)s-X1を表し、ここで、sは０～20の整数であり、X1は、-NH2、ピリジル基、モルホリル基、１－イミダゾリル基、ピペラジニル基、４－（C1-6アルキル）－ピペラジニル基、４－（アミノC1-6アルキル）－ピペラジニル基、ピロリジン－１－イル基、Ｎ－メチル－Ｎ－フェニルアミノ基、ピペリジニル基、グアニジノ基、ジイソプロピルアミノ基、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、-(CH2)tNH2及び-(NR9(CH2)o)pNHR10からなる群から選択される少なくとも一つであり、ここで、R9は水素原子又はメチル基を表し、R10は、水素原子、アセチル基、トリフルオロアセチル基、ベンジルオキシカルボニル基、-C(=NH)-NH2、又はｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基を表し、oは１～15の整数であり、pは１～５の整数であり、tは０～15の整数であり、
　R12及びR14は、それぞれ独立してチオール基（-SH基）、チオール基を含有するC1-12アルキル基、-SR30（R30は、ベンジル基、４－メトキシベンジル基、４－メチルベンジル基、Ｎ－（アセチル）アミノメチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、トリチル基、２－ピリジンスルフェニル基又は３－ニトロ－２－ピリジンスルフェニル基を表す）、又は-CONH(CH2)s-X2を表し、ここで、sは０～20の整数であり、X2は、チオール基、チオール基を含有するC1-12アルキル基、SR30(R30は前記と同様である)、及びチオール基、チオール基を含有するC1-12アルキル基又はSR30（R30は前記と同様である）によって置換されたピリジル基、１－イミダゾリル基、ピペラジニル基、４－（C1-6アルキル）－ピペラジニル基、４－（アミノC1-6アルキル）－ピペラジニル基、ピロリジン－１－イル基、Ｎ－メチル－Ｎ－フェニルアミノ基及びピペリジニル基、並びに-S-S-(CH2)tNH2、-S-S-(NR9(CH2)o)pNHR10、-(CH2)tNHCO(CH2)uSH及び-(CH2)tNHC(=NH)(CH2)vSHからなる群から選択される少なくとも一つであり、ここで、R9、R10、o、p、tは前記と同様であり、uは０～15の整数であり、vは０～15の整数であり、
　m及びnは１又は２であり、
　a1及びa2はそれぞれ０～5,000の整数であり、b1及びb2はそれぞれ０～5,000の整数であり、かつa1+a2+b1+b2は２～5,000であり、
　「／」の表記は、各モノマー単位の配列順序が任意であることを表す。〕
　本明細書において、oは１～15の整数、好ましくは１～10の整数である。
　本明細書において、sは０～20の整数、好ましくは２～８の整数である。
　上記式(1)において、好ましくは、R11及びR13がそれぞれ独立して-CONH(CH2)S-NH2(sは２～８の整数である)であり、R12及びR14がそれぞれ独立してチオール基、-CONH(CH2)S-S-S-(CH2)tNH2、-CONH(CH2)S-SH、-CONH(CH2)SNHCO(CH2)uSH又は-CONH(CH2)SNHC(=NH)(CH2)vSH(sは２～８の整数であり、tは０～15の整数であり、uは１～８の整数であり、vは１～８の整数である）であり、
　R2が水素原子であり、
　a1及びa2がそれぞれ０～200の整数であり、b1及びb2が０～200の整数であり、かつa1+a2+b1+b2が10～200である。
　さらに、本発明において、アニオン性セグメントとしては下記式(2)で示されるものが挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 〔式中、
　R2は、水素原子、アセチル基、トリフルオロアセチル基、アクリロイル基又はメタクリロイル基を表し、
　R3は、それぞれ独立してメチレン基又はエチレン基を表し、
　R31及びR32は、それぞれ独立してメチレン基又はエチレン基を表し、
　R33及びR34は、それぞれ独立して単結合又はメチレン基若しくはエチレン基を表し、
　R41及びR42は、それぞれ独立してベンジルオキシカルボニル基、チオール基、チオール基を含有するC1-12アルキル基、-SR30（R30は、ベンジル基、４－メトキシベンジル基、４－メチルベンジル基、Ｎ－（アセチル）アミノメチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、トリチル基、２－ピリジンスルフェニル基又は３－ニトロ－２－ピリジンスルフェニル基を表す）、又は-CONH(CH2)s-X3を表し、ここで、sは０～20の整数であり、X3は、チオール基、チオール基を含有するC1-12アルキル基又は-SR30（R30は前記と同様である）であり、
　c1及びc2はそれぞれ０～5,000の整数であり、d1及びd2はそれぞれ０～5,000の整数であり、かつc1+c2+d1+d2は２～5,000であり、
　「／」の表記は、各モノマー単位の配列順序が任意であることを表す。〕
　上記式(2)において、R2が水素原子であり、R3がメチレン基であり、R31、R32、R33及びR34がメチレン基であり、R41及びR42がチオール基又は-CONH(CH2)S-SH (sは２～８の整数である）であり、c1及びc2が０～200の整数であり、d1及びd2が０～200の整数であり、かつc1+c2+d1+d2が10～200であるものが好ましい。
　さらに、本発明において、ブロック共重合体Iとしては、下記式(3)又は(4)で示されるものを例示することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 〔式中、
　R2は、水素原子、アセチル基、トリフルオロアセチル基、アクリロイル基又はメタクリロイル基を表し、
　R11及びR13は、それぞれ独立して-(CH2)3NH2又は-CONH(CH2)s-X1を表し、ここで、sは０～20の整数であり、X1は、-NH2、ピリジル基、モルホリル基、１－イミダゾリル基、ピペラジニル基、４－（C1-6アルキル）－ピペラジニル基、４－（アミノC1-6アルキル）－ピペラジニル基、ピロリジン－１－イル基、Ｎ－メチル－Ｎ－フェニルアミノ基、ピペリジニル基、グアニジノ基、ジイソプロピルアミノ基、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、-(CH2)tNH2及び-(NR9(CH2)o)pNHR10からなる群から選択される少なくとも一つであり、ここで、R9は水素原子又はメチル基を表し、R10は、水素原子、アセチル基、トリフルオロアセチル基、ベンジルオキシカルボニル基、-C(=NH)-NH2、又はｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基を表し、oは１～15の整数であり、pは１～５の整数であり、tは０～15の整数であり、
　R12及びR14は、それぞれ独立してチオール基、チオール基を含有するC1-12アルキル基、-SR30（R30は、ベンジル基、４－メトキシベンジル基、４－メチルベンジル基、Ｎ－（アセチル）アミノメチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、トリチル基、２－ピリジンスルフェニル基又は３－ニトロ－２－ピリジンスルフェニル基を表す）、又は-CONH(CH2)s-X2を表し、ここで、sは０～20の整数であり、X2は、チオール基、チオール基を含有するC1-12アルキル基、SR30(R30は前記と同様である)、及びチオール基、チオール基を含有するC1-12アルキル基又はSR30（R30は前記と同様である）によって置換されたピリジル基、１－イミダゾリル基、ピペラジニル基、４－（C1-6アルキル）－ピペラジニル基、４－（アミノC1-6アルキル）－ピペラジニル基、ピロリジン－１－イル基、Ｎ－メチル－Ｎ－フェニルアミノ基及びピペリジニル基、並びに-S-S-(CH2)tNH2、-S-S-(NR9(CH2)o)pNHR10、-(CH2)tNHCO(CH2)uSH及び-(CH2)tNHC(=NH)(CH2)vSHからなる群から選択される少なくとも一つであり、ここで、R9、R10、o、p、tは前記と同様であり、uは０～15の整数であり、vは０～15の整数であり、
　m及びnは１又は２であり、
　R4は、水素原子又は置換されていてもよい直鎖若しくは分岐鎖のC1-12アルキル基を表し、
　R5は、-(CH2)gNH-を表し、かつgは０～５であり、
　R6及びR7は、それぞれR4及びR5と同様であり、
　R8は、直鎖又は分岐鎖のC1-12アルキル基を表し、
　a1及びa2はそれぞれ０～5,000の整数であり、b1及びb2はそれぞれ０～5,000の整数であり、かつa1+a2+b1+b2は２～5,000であり、
　eは５～2,500の整数であり、fは５～2,500の整数であり、
　「／」の表記は、各モノマー単位の配列順序が任意であることを表す。〕
　さらに、上記式(3)又は(4)においては、R11及びR13がそれぞれ独立して-CONH(CH2)S-NH2(sは２～８の整数である)であり、
　R12及びR14がそれぞれ独立してチオール基、-CONH(CH2)S-S-S-(CH2)tNH2、-CONH(CH2)S-SH、-CONH(CH2)SNHCO(CH2)uSH又は-CONH(CH2)SNHC(=NH)(CH2)vSH(sは２～８の整数であり、tは０～15の整数であり、uは１～８の整数であり、vは１～８の整数である)であり、
　R2が水素原子であり、
　R4がメチル基であり、
　a1及びa2が０～200の整数であり、b1及びb2が０～200の整数であり、かつa1+a2+b1+b2が10～200であり、eが10～300の整数であり、fが10～300の整数であるものが好ましい。
　本発明において、ブロック共重合体IIとしては、下記式(5)又は(6)で示されるものを例示することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 〔式中、
　R2は、水素原子、アセチル基、トリフルオロアセチル基、アクリロイル基又はメタクリロイル基を表し、
　R3は、それぞれ独立してメチレン基又はエチレン基を表し、
　R31及びR32は、それぞれ独立してメチレン基又はエチレン基を表し、
　R33及びR34は、それぞれ独立して単結合又はメチレン基若しくはエチレン基を表し、
　R41及びR42は、それぞれ独立してベンジルオキシカルボニル基、チオール基、チオール基を含有するC1-12アルキル基、-SR30（R30は、ベンジル基、４－メトキシベンジル基、４－メチルベンジル基、Ｎ－（アセチル）アミノメチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、トリチル基、２－ピリジンスルフェニル基又は３－ニトロ－２－ピリジンスルフェニル基を表す）、又は-CONH(CH2)s-X3を表し、ここで、sは０～20の整数であり、X3は、チオール基、チオール基を含有するC1-12アルキル基又は-SR30（R30は前記と同様である）であり、
　R4は、水素原子又は置換されていてもよい直鎖若しくは分岐鎖のC1-12アルキル基を表し、
　R5は、-(CH2)gNH-を表し、かつgは０～５の整数であり、
　R6及びR7はそれぞれR4及び R5と同様であり、
　R8は直鎖又は分岐鎖のC1-12アルキル基を表し、
　c1及びc2はそれぞれ０～5,000の整数であり、d1及びd2はそれぞれ０～5,000の整数であり、かつc1+c2+d1+d2は２～5,000であり、
　i及びjはそれぞれ５～2,500の整数であり、
　「／」の表記は、各モノマー単位の配列順序が任意であることを表す。〕
　上記式(5)又は(6)において、R2が水素原子を表し、
　R3がメチレン基を表し、
　R31、R32、R33及びR34がメチレン基を表し、
　R4がメチル基を表し、
　R6がメチル基を表し、
　R8が-CH(CH3)2を表し、
　c1及びc2がそれぞれ０～200の整数であり、d1及びd2がそれぞれ０～200の整数であり、かつc1+c2+d1+d2が10～200であり、
　iが10～300の整数であり、
　jが10～300の整数であるものが好ましい。
　さらに、上記式(5)又は(6)において、R2が水素原子を表し、
　R3がメチレン基を表し、
　R31、R32、R33及びR34がメチレン基を表し、
　R41及びR42がチオール基を表し、
　R4がメチル基を表し、
　R6がメチル基を表し、
　R8が-CH(CH3)2を表し、
　c1及びc2がそれぞれ０～200の整数であり、d1及びd2がそれぞれ０～200の整数であり、かつc1+c2+d1+d2が10～200であり、
　iが10～300の整数であり、
　jが10～300の整数であるものがより好ましい
　さらに、本発明においては、ブロック共重合体Iが前記式(3)で示されるものであり、ブロック共重合体IIが前記式(5)で示されるものが挙げられる。
　本発明の一態様において、ベシクルは、化合物を内包するものである。
　本発明により、静電結合型ベシクルが提供される。本発明のベシクルは、荷電性セグメント部分にチオール基やジスルフィド基が導入されており、膜の内側及び外側が親水性であり、膜内の中空部に薬物等を封入することができるとともに、カチオン性セグメントとアニオン性セグメントとの結合を調整することができる。さらに、形成された静電結合性膜がチオール基間のジスルフィド形成に基づく自発的架橋形成や、ジスルフィド結合の還元性環境、酸化性環境、あるいはラジカルが発生しうるような環境への応答性に基づき、ベシクルの崩壊誘起や徐放性の制御が可能である。従って、本発明のベシクルは、ドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）に利用できる点で極めて有用である。
ベシクルの構造及びその形成メカニズムを示す図の一例である。 homo-P(Asp-AP-cyst)のサイズ排除クロマトグラフィーの結果を示す図である。 1H NMRの測定結果を示す図である。 本発明のベシクル（PICsome）の調製スキームの概念図の一例である。 本発明のベシクルの透過型電子顕微鏡写真である。 本発明のベシクルの粒径を測定した結果を示す図である。 本発明のベシクルの粒径の経時変化を測定した結果を示す図である。 本発明のベシクルの粒径及びPDIの経時変化を測定した結果を示す図である。 本発明のベシクルのFCS測定結果を示す図である。 本発明のチオール含有ベシクルのDLS測定結果を示す図である。 シトクロムc封入ベシクルにおけるペルオキシダーゼ活性測定結果を示す図である。
　以下、本発明を詳細に説明する。
１．概要
　本発明者らは、正に荷電したセグメント及び負に荷電したセグメントを含む二つの重合体を用い、さらにこれらのセグメントを架橋することにより、構造安定性、環境応答性に優れた新規ベシクルを得られるとの知見を得た。また、本発明者らは、上記二つの重合体を水性溶液中で混合することにより、簡易に新規ベシクルを製造しうるとの知見を得た。本発明はこれら知見に基づいて完成されたものである。
　本発明のベシクルは、その製造において有機溶媒を用いる必要がなく、バイオマテリアルの分野やＤＤＳにおいて有利に利用することができる。また、本発明のベシクルは、膜の内側に空間（中央空隙）を有しており、大量の化合物等の物質を封入することができ、従って、生体内物質及び薬物の輸送キャリアーや、中央空隙を酵素の反応場とするリアクター微粒子等として有利に利用することができる。さらに、本発明のベシクルは、生理食塩水や血清の存在下でその構造を安定に保持することができ、その膜には半透性等の多様な機能を付与することが可能である。さらに、本発明のベシクルは、荷電性セグメント同士がジスルフィド結合等により架橋されており、還元条件下に曝すことにより結合を解除することができる。従って、本発明のベシクルは構造安定性や環境応答性に優れたバイオマテリアル又は薬物送達システムとして有利に利用することができる。
　本明細書において、「ベシクル」とは、内部に空隙を有し、膜により閉鎖された基本構造体を意味する。
　本明細書において、特に断らない限り、基または基の一部としての「アルキル」または「アルコキシ」という語は、基が直鎖状、分枝鎖状、または環状のアルキルまたはアルコキシを意味する。また、例えば「C1-12アルキル基」という場合の「C1-12」とは、該アルキル基の炭素数が１～12個であることを意味する。
　本発明において、「C1-12アルキル基」は、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、ｎ－ヘキシル基、デシル基、ウンデシル基等が挙げられる。「C1-6アルキル基」は、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、ｎ－ヘキシル基等が挙げられる。
　本明細書において、特に断らない限り、「アリール」とは、フェニル、ナフチル、アンスニルまたはピレニル等を意味する。
　本明細書において、「ハロゲン原子」とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、またはヨウ素原子を意味する。
　本明細書において、アルキル基が「置換されていてもよい」とは、アルキル基上の１またはそれ以上の水素原子が１またはそれ以上の置換基（同一または異なっていてもよい）により置換されていてもよいことを意味する。置換基の最大数はアルキル上の置換可能な水素原子の数に依存して決定できることは当業者に明らかである。アルキル基以外の基についても、「置換されていてもよい」は上記と同様に解釈される。
　ここで置換基は、ハロゲン原子、アリール基、水酸基、アミノ基、カルボキシル基、シアノ基、ホルミル基、ジメチルアセタール化ホルミル基、ジエチルアセタール化ホルミル基、C1-6アルコキシカルボニル基、C2-7アシルアミド基、トリC1-6アルキルシロキシ基（ここで、C1-6アルキルは同一であっても異なっていてもよい）、シロキシ基及びシリルアミノ基からなる群から選択されるものである。
２．ベシクル
　本発明のベシクルは、水溶性でありかつ荷電した重合体の相互作用により形成される膜を含むことを一つの特徴とする。
　本発明のベシクルは、以下の第一の重合体と第二の重合体とにより形成された膜（但し(b)と(d)との組み合わせを除く）を有する。この膜は、前記重合体中のカチオン性セグメント及びアニオン性セグメントの一部が架橋されたものである。
　第一の重合体：
　(a) 非荷電親水性セグメントとカチオン性セグメントとを有するブロック共重合体I
　(b) カチオン性セグメントを有するアミノ酸重合体I
　第二の重合体：
　(c) 非荷電親水性セグメントとアニオン性セグメントとを有するブロック共重合体II
　(d) アニオン性セグメントを有するアミノ酸重合体II
　但し、本発明の膜の外側及び内側は親水性であることが好ましく、上記(b)及び(d)のアミノ酸重合体同士の組み合わせは除く。
　図１は、一つの態様として、本発明のベシクルの構造及びその形成されるメカニズムを示した模式図である。図１においては、便宜上、第一及び第二の重合体は、いずれも非荷電親水性セグメントと荷電性セグメントとのブロック共重合体（上記(a)と(c)との組み合わせ）を例として説明する。
　図1Aにおいて、第一のブロック共重合体101は、非荷電親水性セグメント102と、正に荷電した荷電性セグメント（カチオン性セグメント）103とを有し、他方、第二のブロック共重合体201は、非荷電親水性セグメント202と、負に荷電した荷電性セグメント（アニオン性セグメント）203とを有する。そして、第一のブロック共重合体101と第二のブロック共重合体201とは、電荷の相互作用が生じ得る系に置かれると自己集合し、図1Bに示される通り、荷電性セグメント103及び203からなるイオンコンプレックスの中間層20と、非荷電親水性セグメント102及び202からなる二つの親水性層（外層31及び内層32）とが形成され、この構造体(B)を膜とするベシクル(C)を生じる。なお、図1Bは、図1Cの枠内を模式的に拡大して示した図である。
　そして、荷電性セグメントの側鎖にはチオール基等がついており、例えば酸化条件下でジスルフィド結合を形成することができる（図1(D)）。
　酸化条件としては、空気酸化の他、酸化剤としてヨウ素、過酸化水素、過マンガン酸カリウム、硫酸銅、二酸化鉛、Fe3+錯体、NO、N2O4、NO2等の窒素酸化物、ジメチルスルホキシド等を用いる一般的な方法が挙げられる。
　上述の通り、本発明のベシクルは、荷電性セグメント間の静電相互作用及びジスルフィド結合等の架橋を主な駆動力として形成されるものである。従って、イオン強度や生体内のpH変化や酸化還元反応によってベシクルの形成、解離や膜の物質透過性を制御することが可能であり、その結果、本発明のベシクルは優れた環境応答性を発揮することができる。
　また、図1Cに示す通り、ベシクルの膜は、外層31、中間層20、及び内層32からなる三層構造を有する。
　また、本発明のベシクルは、非荷電親水性セグメントから構成される内層を有することから、その中央空隙には水性媒体を含めることができる。
　本発明のベシクルの形態は、通常は球状である。また、本発明のベシクルの粒径は、中空構造を取る限り特に限定されないが、好ましくは10μm以下であり、より好ましくは50 nm～１μmである。
　本発明のベシクルは、中間層においてポリイオンコンプレックス（PIC）を形成した小胞体である。従って、本発明のベシクルを「PICsome」と呼ぶこともある。
３．セグメント
　以下、本発明のベシクルを構成するセグメントについて説明する。
（１）荷電性セグメント
　第一の重合体に含まれる荷電性セグメントと、第二の重合体に含まれる荷電性セグメントとは、互いに反対の電荷に荷電することができ、本発明においては、第一の重合体に含まれる荷電性セグメントはカチオン性セグメントであり、第二の重合体に含まれる荷電性セグメントはアニオン性セグメントである。
　また、本発明において、カチオン性セグメントとしてポリアミンを用いる場合、ポリアミンに酸付加して陽性に荷電させることができる。付加する酸の種類は、ベシクルの用法等に従って適宜決定される。
　本発明の好ましい態様によれば、第一の重合体のカチオン性セグメントは、下記式(1)で示されるものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
　上記式(1)において、R2は、水素原子、アセチル基、トリフルオロアセチル基、アクリロイル基又はメタクリロイル基を表す。
　また、R11及びR13は、それぞれ独立して-(CH2)3NH2又は-CONH(CH2)s-X1を表し、ここで、sは０～20の整数であり、X1は、-NH2、ピリジル基、モルホリル基、１－イミダゾリル基、ピペラジニル基、４－（C1-6アルキル）－ピペラジニル基、４－（アミノC1-6アルキル）－ピペラジニル基、ピロリジン－１－イル基、Ｎ－メチル－Ｎ－フェニルアミノ基、ピペリジニル基、グアニジノ基、ジイソプロピルアミノ基、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、-(CH2)tNH2及び-(NR9(CH2)o)pNHR10からなる群から選択される少なくとも一つであり、ここで、R9は水素原子又はメチル基を表し、R10は、水素原子、アセチル基、トリフルオロアセチル基、ベンジルオキシカルボニル基、-C(=NH)-NH2、又はｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基を表し、oは１～15の整数であり、pは１～５の整数であり、tは０～15の整数である。
　R12及びR14は、それぞれ独立してチオール基、チオール基を含有するC1-12アルキル基、-SR30（R30は、ベンジル基、４－メトキシベンジル基、４－メチルベンジル基、Ｎ－（アセチル）アミノメチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、トリチル基、２－ピリジンスルフェニル基又は３－ニトロ－２－ピリジンスルフェニル基を表す）、又は-CONH(CH2)s-X2を表し、ここで、sは０～20の整数であり、X2は、チオール基、チオール基を含有するC1-12アルキル基、SR30(R30は前記と同様である)、及びチオール基、チオール基を含有するC1-12アルキル基又はSR30（R30は前記と同様である）によって置換されたピリジル基、１－イミダゾリル基、ピペラジニル基、４－（C1-6アルキル）－ピペラジニル基、４－（アミノC1-6アルキル）－ピペラジニル基、ピロリジン－１－イル基、Ｎ－メチル－Ｎ－フェニルアミノ基及びピペリジニル基、並びに-S-S-(CH2)tNH2、-S-S-(NR9(CH2)o)pNHR10、-(CH2)tNHCO(CH2)uSH及び-(CH2)tNHC(=NH)(CH2)vSHからなる群から選択される少なくとも一つであり、ここで、R9、R10、o、p、tは前記と同様であり、uは０～15の整数であり、vは０～15の整数であり、
　m及びnは１又は２である。
　チオール基を含有するC1-12アルキル基としては、例えばメルカプトメチル基、２－メルカプトエチル基、３－メルカプトプロピル基、３－メルカプトブチル基、４－メルカプトブチル基、６－メルカプトヘキシル基、３－メルカプトヘキシル基、８－メルカプトオクチル基、１２－メルカプトドデシル基等が挙げられる。
　a1及びa2はそれぞれ０～5,000の整数であり、b1及びb2はそれぞれ０～5,000の整数であり、かつa1+a2+b1+b2は２～5,000である。
　また、「／」の表記は、各モノマー単位の配列順序が任意であることを表す。
　ここで、チオール基は保護基により保護されていてもよい。R30はチオール基の保護基であり、例えばベンジル基、４－メトキシベンジル基、４－メチルベンジル基、Ｎ－（アセチル）アミノメチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、トリチル基、２－ピリジンスルフェニル基又は３－ニトロ－２－ピリジンスルフェニル基等が挙げられる。
　上記式(1)において、R11及びR13が-CONH(CH2)s-X1を表す場合、X1は、荷電性セグメントの繰り返し単位ごとに、同一の官能基であってもよく、または異なる官能基であってもよい。
　さらに、本発明のより好ましい態様によれば、上記式(1)において、R11及びR13がそれぞれ独立して-CONH(CH2)S-NH2(sは２～８の整数である)であり、R12及びR14がそれぞれ独立してチオール基、-CONH(CH2)S-S-S-(CH2)tNH2、-CONH(CH2)S-SH、-CONH(CH2)SNHCO(CH2)uSH又は-CONH(CH2)SNHC(=NH)(CH2)vSH(sは２～８の整数であり、tは０～15の整数であり、uは１～８の整数であり、vは１～８の整数である)であり、R2が水素原子であり、a1及びa2がそれぞれ０～200の整数であり、b1及びb2が０～200の整数であり、かつa1+a2+b1+b2が10～200である。
　ここで、カチオン性セグメントとアニオン性セグメントとの間でジスルフィド結合等を含む架橋構造を形成するためには、(i)カチオン性セグメント及びアニオン性セグメントにチオール基又はチオール基がスルフェニル化された基等が含まれているか、あるいは(ii)カチオン性セグメントにジスルフィド結合が含まれていることが必要である。従って、上記(i)の態様により架橋する場合は、式(1)においてa2及びb2の少なくとも一方は０ではないことが好ましい。
　両セグメントを架橋するためにリンカーを使用することもできる。両セグメントを架橋するためのリンカー部分の種類は特に限定されるものではなく、リンカーの両端でジスルフィド結合が形成され、粒子が安定化されればよい。リンカーを導入するための架橋剤としてはアルキルジチオール、チオスルフィネート（例えば、1,2-dithiane-t-4,t-5-diol r-1-oxide）及びアルキルジチオールより合成したスルフェニル化剤等が挙げられる。
　他方、上記(ii)の態様により架橋する場合は適切な縮合剤存在下において、カチオン性セグメントの側鎖の末端のアミノ基と、アニオン性セグメントの側鎖の末端のカルボキシル基との間にアミド結合が形成されて両セグメントを架橋することが可能である。
　架橋剤を使用する場合、架橋剤の種類は制限されず、ベシクルの用途や第一の重合体及び第二の重合体の種類、他の膜成分の種類等に応じて適宜選択することができるが、効率的に架橋を行うとともに、物質内包ベシクルの安定性を高める観点からは、第一の重合体及び第二の重合体の荷電性セグメントが有する荷電性基（例えばアミノ基等のカチオン基やカルボキシル基等のアニオン基）と反応し、被内包物質とは反応しない架橋剤が好ましい。架橋剤の具体例としては、アミノ基を架橋する架橋剤（例えば、グルタルアルデヒド、スベリンイミド酸ジメチルニ塩酸塩（dimethyl suberimidate dihydrochloride：ＤＭＳ）、３，３’－ジチオビスプロピオンイミド酸ジメチル（dimethyl 3,3'-dithiobispropionimidate：ＤＴＢＰ））、アミノ基とカルボキシル基を縮合することで架橋する架橋剤（例えば、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropy)carbodiimide：ＥＤＣ）等）、リン酸基を架橋する架橋剤（例えばカルシウムイオン等の金属イオン）等が挙げられるが、グルタルアルデヒド、ＥＤＣ等が好ましく、ＥＤＣが特に好ましい。また、１種の架橋剤を単独で使用してもよいが、２種以上の架橋剤を任意の組み合わせ及び比率で使用してもよい。
　架橋剤を使用する場合、その量は架橋剤の性質又は架橋する基の性質等に依存して当業者であれば適宜設定することができる。例えば、アミノ基とカルボキシル基を縮合することで架橋する架橋剤の場合は、カルボキシル基またはアミノ基に対して０．０５～２０当量、好ましくは０．１～２０当量、例えば、０．１、０．５、１．０、５．０、又は１０当量用いることができる。また、チオスルフィネート等を用いて架橋する場合は、カルボキシル基側またはアミノ基側のチオール基に対し０．０５～２０当量、好ましくは０．１～１０当量用いることができる。
　本発明において、第一の重合体がカチオン性セグメントを有するアミノ酸重合体Iを形成するときは、カチオン性セグメントは上記式(1)で表すことができ、そのR2の反対側の片末端は-NH(CH2)k-1CH3、-NH-(CH2)k-1-C(三重結合)CH (kは1以上の整数)等が挙げられ、-NH(CH2)3CH3が好ましい。
　本発明の一つの態様において、上記アミノ酸重合体Iは、カチオン性セグメントからなるものである。
　また、本発明の好ましい態様によれば、第二の重合体のアニオン性セグメントは、下記式(2)で示されるものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　上記式(2)において、R2は、水素原子、アセチル基、トリフルオロアセチル基、アクリロイル基又はメタクリロイル基を表し、R3は、それぞれ独立してメチレン基又はエチレン基を表す。
　また、R31及びR32は、それぞれ独立してメチレン基又はエチレン基を表し、R33及びR34は、それぞれ独立して単結合又はメチレン基若しくはエチレン基を表す。
　R41及びR42は、それぞれ独立してベンジルオキシカルボニル基、チオール基、チオール基を含有するC1-12アルキル基、-SR30（R30は、ベンジル基、４－メトキシベンジル基、４－メチルベンジル基、Ｎ－（アセチル）アミノメチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、トリチル基、２－ピリジンスルフェニル基又は３－ニトロ－２－ピリジンスルフェニル基を表す）、又は-CONH(CH2)s-X3を表し、ここで、sは０～20の整数であり、X3は、チオール基、チオール基を含有するC1-12アルキル基又は-SR30（R30は前記と同様である）である。
　c1及びc2はそれぞれ０～5,000の整数であり、d1及びd2はそれぞれ０～5,000の整数であり、かつc1+c2+d1+d2は２～5,000であり、
　「／」の表記は、各モノマー単位の配列順序が任意であることを表す。
　上記式(2)において、R3は、荷電性セグメントの繰り返し単位ごとに、同一の官能基であってもよく、又は異なる官能基であってもよい。
　さらに、本発明のより好ましい態様によれば、上記式(2)において、R2が水素原子を表し、R3がメチレン基を表し、R31、R32、R33及びR34がメチレン基を表し、R41及びR42がチオール基又は-CONH(CH2)S-SH (sは２～８の整数である)であり、c1及びc2が０～200の整数であり、d1及びd2が０～200の整数であり、かつc1+c2+d1+d2が10～200である。
　また、前述の通り、カチオン性セグメント及びアニオン性セグメントにチオール基又はチオール基がスルフェニル化された基等を導入すると、両セグメント間でジスルフィド結合を形成することができる。従って、カチオン性セグメントにチオール基又はチオール基がスルフェニル化された基等を導入する場合、アニオン性セグメントとの間でジスルフィド結合を形成するようにすることが好ましい。従って、このような場合は、アニオン性セグメントの側鎖にチオール基を導入するため、式(2)において、c2及びd2の少なくとも一方は0ではないことが好ましく、c1及びd1の少なくとも一方並びにc2及びd2の少なくとも一方は０ではないことがより好ましい。
　また、前述の通り、カチオン性セグメントの側鎖にジスルフィド結合が含まれていれば、式(2)においてc2及びd2の両者は０でもよい。そして、カチオン性セグメントの側鎖の末端のアミノ基と、アニオン性セグメントの側鎖の末端のカルボキシル基との間でアミド結合が形成されて両セグメントが架橋される。
　架橋剤の種類及び組合せは前記と同様である。
　本発明において、第二の重合体がアニオン性セグメントを有するアミノ酸重合体IIを形成するときは、アニオン性セグメントは上記式(2)で表すことができ、そのR2の反対側の片末端は-NH(CH2)w-1CH3、-NH-(CH2)w-1-C(三重結合)CH (wは1以上の整数)等が挙げられ、-NH(CH2)3CH3が好ましい。
　本発明の一つの態様において、上記アミノ酸重合体IIは、アニオン性セグメントからなるものである。
（２）非荷電親水性セグメント
　非荷電親水性セグメントは、非荷電かつ親水性の性質を有するポリマーセグメントである。ここで「非荷電」とは、セグメントが全体として中性であることをいう。例としてはセグメントが正・負の電荷を有さない場合が挙げられる。また、セグメントが正・負の荷電を分子内に有する場合であっても、局所的な実効電荷密度が高くなく、自己組織化によるベシクルの形成を妨げない程度にセグメント全体の荷電が中和されていれば、やはり「非荷電」に該当する。また、「親水性」とは水性媒体に対して溶解性を示すことをいう。
　ブロック共重合体に含まれる非荷電親水性セグメントとしては、例えば、ポリエチレングリコールをはじめとするポリアルキレングリコール、あるいは、ポリ（２－メチル－２－オキサゾリン）、ポリ（２－エチル－２－オキサゾリン）、ポリ（２－ノルマルプロピル－２－オキサゾリン）、ポリ（２－イソプロピル－２－オキサゾリン）等のポリ（２－オキサゾリン）が挙げられ、さらに、ポリサッカライド、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリアクリル酸エステル、ポリメタクリル酸エステル、ポリ（２－メタクロイルオキシエチルホスホリルコリン）、等電点が７付近のペプチド、タンパク質、及びそれらの誘導体等が挙げられる。上記の非荷電親水性セグメントを含むことにより、ブロック共重合体は、水性溶液中で会合、沈殿することなく安定に存在し、効率的にベシクルを構築することができる。さらに、上記の非荷電親水性セグメントを含むブロック共重合体によって構築されることにより、ベシクルは水性溶液中で安定した構造を保持することができる。
　そして、本発明の好ましい態様によれば、第一及び第二の重合体の非荷電親水性セグメントは、ポリエチレングリコール及び／又はポリ（２－イソプロピル－２－オキサゾリン）であり、好ましくはポリエチレングリコールである。非荷電親水性セグメントとしてポリエチレングリコールを用いることは、ベシクルに生体適合性を付与する上で有利である。
　そして、非荷電親水性セグメントとしてポリエチレングリコールを用いる場合、ポリエチレングリコールの分子量は、好ましくは500～15,000であり、より好ましくは1,000～5,000である。ブロック共重合体に上記の分子量を有する非荷電親水性セグメントを用いることは、ミセルを形成するよりも優先的にベシクルを形成させる上で有利である。
４．ブロック共重合体
（１）カチオン性セグメントを有するブロック共重合体I
　本発明の好ましい態様によれば、カチオン性セグメントを有するブロック共重合体Iは、下記式(3)又は(4)で表されるものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
〔式中、
　R2は、水素原子、アセチル基、トリフルオロアセチル基、アクリロイル基又はメタクリロイル基を表し、
　R11及びR13は、それぞれ独立して-(CH2)3NH2又は-CONH(CH2)s-X1を表し、ここで、sは０～20の整数であり、X1は、-NH2、ピリジル基、モルホリル基、１－イミダゾリル基、ピペラジニル基、４－（C1-6アルキル）－ピペラジニル基、４－（アミノC1-6アルキル）－ピペラジニル基、ピロリジン－１－イル基、Ｎ－メチル－Ｎ－フェニルアミノ基、ピペリジニル基、グアニジノ基、ジイソプロピルアミノ基、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、-(CH2)tNH2及び-(NR9(CH2)o)pNHR10からなる群から選択される少なくとも一つであり、ここで、R9は水素原子又はメチル基を表し、R10は、水素原子、アセチル基、トリフルオロアセチル基、ベンジルオキシカルボニル基、-C(=NH)-NH2、又はｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基を表し、oは１～15の整数であり、pは１～５の整数であり、tは０～15の整数である。
　R12及びR14は、それぞれ独立してチオール基、チオール基を含有するC1-12アルキル基、-SR30（R30は、ベンジル基、４－メトキシベンジル基、４－メチルベンジル基、Ｎ－（アセチル）アミノメチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、トリチル基、２－ピリジンスルフェニル基又は３－ニトロ－２－ピリジンスルフェニル基を表す）、又は-CONH(CH2)s-X2を表し、ここで、sは０～20の整数であり、X2は、チオール基、チオール基を含有するC1-12アルキル基、SR30(R30は前記と同様である)、及びチオール基、チオール基を含有するC1-12アルキル基又はSR30（R30は前記と同様である）によって置換されたピリジル基、１－イミダゾリル基、ピペラジニル基、４－（C1-6アルキル）－ピペラジニル基、４－（アミノC1-6アルキル）－ピペラジニル基、ピロリジン－１－イル基、Ｎ－メチル－Ｎ－フェニルアミノ基及びピペリジニル基、並びに-S-S-(CH2)tNH2、-S-S-(NR9(CH2)o)pNHR10、-(CH2)tNHCO(CH2)uSH及び-(CH2)tNHC(=NH)(CH2)vSHからなる群から選択される少なくとも一つであり、ここで、R9、R10、o、p、tは前記と同様であり、uは０～15の整数であり、vは０～15の整数であり、
　m及びnは１又は２であり、
　R4は、水素原子又は置換されていてもよい直鎖若しくは分岐鎖のC1-12アルキル基を表し、
　R5は、-(CH2)gNH-を表し、かつgは０～５であり、
　R6及びR7は、それぞれR4及びR5と同様であり、
　R8は、直鎖又は分岐鎖のC1-12アルキル基を表し、
　a1及びa2はそれぞれ０～5,000の整数であり、b1及びb2はそれぞれ０～5,000の整数であり、かつa1+a2+b1+b2は２～5,000であり、
　eは５～2,500の整数であり、fは５～2,500の整数であり、
　「／」の表記は、各モノマー単位の配列順序が任意であることを表す。〕
　上記式(3)及び(4)において、R11及びR13が-CONH(CH2)s-X1を表す場合、X1は、ブロック共重合体の繰り返し単位ごとに、同一の官能基であってもよく、または異なる官能基であってもよい。
　また、本発明のより好ましい態様によれば、上記式(3)及び(4)において、R11及びR13がそれぞれ独立して-CONH(CH2)S-NH2(sは２～８の整数である)であり、R12及びR14がそれぞれ独立してチオール基、-CONH(CH2)S-S-S-(CH2)tNH2、-CONH(CH2)S-SH、-CONH(CH2)SNHCO(CH2)uSH又は-CONH(CH2)SNHC(=NH)(CH2)vSH(sは２～８の整数であり、tは０～15の整数であり、uは１～８の整数であり、vは１～８の整数である)であり、R2が水素原子であり、R4がメチル基であり、a1及びa2が０～200の整数であり、b1及びb2が０～200の整数であり、かつa1+a2+b1+b2が10～200であり、eが10～300の整数であり、fが10～300の整数である。
（２）アニオン性セグメントを有するブロック共重合体II
　また、本発明の好ましい態様によれば、アニオン性セグメントを有するブロック共重合体IIは、下記式(5)又は(6)で表されるものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
〔式中、
　R2は、水素原子、アセチル基、トリフルオロアセチル基、アクリロイル基又はメタクリロイル基を表し、
　R3は、それぞれ独立してメチレン基又はエチレン基を表し、
　R31及びR32は、それぞれ独立してメチレン基又はエチレン基を表し、
　R33及びR34は、それぞれ独立して単結合又はメチレン基若しくはエチレン基を表し、
　R41及びR42は、それぞれ独立してベンジルオキシカルボニル基、チオール基、チオール基を含有するC1-12アルキル基、-SR30（R30は、ベンジル基、４－メトキシベンジル基、４－メチルベンジル基、Ｎ－（アセチル）アミノメチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、トリチル基、２－ピリジンスルフェニル基又は３－ニトロ－２－ピリジンスルフェニル基を表す）、又は-CONH(CH2)s-X3を表し、ここで、sは０～20の整数であり、X3は、チオール基、チオール基を含有するC1-12アルキル基又は-SR30（R30は前記と同様である）であり、
　R4は、水素原子又は置換されていてもよい直鎖若しくは分岐鎖のC1-12アルキル基を表し、
　R5は、-(CH2)gNH-を表し、かつgは０～５の整数であり、
　R6及びR7はそれぞれR4及び R5と同様であり、
　R8は直鎖又は分岐鎖のC1-12アルキル基を表し、
　c1及びc2はそれぞれ０～5,000の整数であり、d1及びd2はそれぞれ０～5,000の整数であり、かつc1+c2+d1+d2は２～5,000であり、
　i及びjはそれぞれ５～2,500の整数であり、
　「／」の表記は、各モノマー単位の配列順序が任意であることを表す。〕
　上記式(5)及び(6)において、R3は、ブロック共重合体の繰り返し単位ごとに、同一の官能基であってもよく、または異なる官能基であってもよい。
　また、本発明の別のより好ましい態様によれば、上記式(5)及び(6)において、R2が水素原子であり、R3がメチレン基であり、R31、R32、R33及びR34がメチレン基であり、R4がメチル基であり、R6がメチル基であり、R8が-CH(CH3)2であり、c1及びc2がそれぞれ０～200の整数であり、d1及びd2がそれぞれ０～200の整数であり、かつc1+c2+d1+d2が10～200であり、iが10～300の整数であり、jが10～300の整数である。
　また、本発明の別のより好ましい態様によれば、上記式(5)及び(6)において、R2が水素原子であり、R3がメチレン基であり、R31、R32、R33及びR34がメチレン基であり、R41及びR42がチオール基を表し、R4がメチル基であり、R6がメチル基であり、R8が-CH(CH3)2であり、c1及びc2がそれぞれ０～200の整数であり、d1及びd2がそれぞれ０～200の整数であり、かつc1+c2+d1+d2が10～200であり、iが10～300の整数であり、jが10～300の整数である。
５．ベシクルの製造
　本発明のベシクルは、その中央空隙に化合物等の物質を内包することができる。本発明によるベシクルはまた、その膜に化合物等の物質を挿入することができる。上記物質は、ベシクルの用途及びその性質に応じて適宜選択することができるが、例えば、薬物、タンパク質、蛍光色素、核酸、微粒子等が挙げられる。
　本発明のベシクルは、荷電性セグメント間の静電相互作用及び架橋を利用して形成されることから、第一の重合体Iと第二の重合体IIとを、水性溶液中で混合することにより、簡易に製造することができる。さらに、本発明の製造方法によれば、有機溶媒を用いなくともベシクルを製造することができることから、バイオマテリアルの分野やＤＤＳにおいて有利に利用することができる。
　また、第一の荷電性セグメントと第二の荷電性セグメントとの比率（カチオン性セグメントとアニオン性セグメントとの比率）、及び、非荷電親水性セグメントと荷電性セグメントとの比率も任意であるが、第一の重合体と第二の重合体との自己組織化を促し、均質なベシクルを効率的に製造する観点からは、以下の基準で選択することが好ましい。
　まず、カチオン性セグメントとアニオン性セグメントとの比率については、下記式（ｉ）に規定するＣ／Ａ比が、通常0.3、好ましくは0.5以上、より好ましくは0.6以上、また、通常3.0未満、好ましくは2.0以下、より好ましくは1.7以下となるように調整することが望ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000013
　ここで、第一及び第二の重合体中におけるカチオン基及びアニオン基のモル数は、カチオン性セグメント及びアニオン性セグメントの構造に依存する値であるが、一般的な電位差（酸・塩基）滴定により求めることが可能である。
　本発明の製造にあっては、まず、第一の重合体Iを含む第一の水性溶液と、第二の重合体IIを含む第二の水性溶液とを用意する。ここで、第一及び第二の水性溶液は、所望により濾過して精製してもよい。
　上記第一の水性溶液における第一の重合体Iの総電荷数と、第二の水性溶液における第二の重合体IIの総電荷数との比率は、好ましくは５：１～１：５、より好ましくは約１：１である。重合体がブロック共重合体の場合、ブロック共重合体における総電荷数は、ブロック共重合体中の荷電性セグメントを構成する繰り返し単位の数及びその繰り返し単位が有する電荷数等に応じて当業者により適宜決定される。上記の比率にて２つの重合体を用いることは、均質なベシクルを効率的に製造する上で有利である。
　また、第一の水性溶液における第一の重合体I、及び第二の水性溶液における第二の重合体IIの濃度は、上記の重合体間の総電荷数の比率及び重合体の水性溶液への溶解度、作製したいベシクルのサイズ、ベシクルの形成効率等を勘案して適宜決定される。
　また、親水性セグメントを有する重合体は水溶性であることから、第一及び第二の水性溶液における溶媒は、好ましくは水、バッファーであり、より好ましくは10 mM Tris/HClバッファー、リン酸バッファー、HEPESバッファー等が挙げられる。
　また、第一及び第二の水性溶液におけるpHは、ベシクルの形成を妨げない範囲で適宜調整してよく、好ましくはpH５～pH９であり、より好ましくはpH約７である。pHの調整は、水性溶液における溶媒としてバッファーを用いることにより簡易に行うことができる。第一及び第二の水性溶液のpHを調整して用いることは、ブロック共重合体の荷電状態を保持し、効率的にベシクルを形成するために有利である。
　さらに、上記第一及び第二の水性溶液の温度は、重合体の溶媒に対する溶解度に応じて適宜決定されるが、好ましくは４～80℃であり、より好ましくは15～50℃である。
　さらに、上記第一及び第二の水性溶液におけるイオン強度は、ベシクルの形成を妨げない範囲で適宜調整してよく、好ましくは０～300 mMであり、より好ましくは０～150 mMである。
　次に、本発明においては、第一の水性溶液と第二の水性溶液とを混合する。混合方法は特に限定されず、第一の水性溶液に第二の水性溶液を加えてもよく、第二の水性溶液に第一の水性溶液を加えてもよい。また、容器に第一の水性溶液と第二の水性溶液とを同時に加えて混合してもよい。このようにして得られる、第一の水性溶液と第二の水性溶液との混合液は適宜攪拌してもよい。
　第一の水性溶液と第二の水性溶液とを混合する際の温度は、ベシクルの形成を妨げない範囲であれば特に限定されないが、重合体の温度に応じた溶解度を勘案して設定されることが好ましい。このような混合する際の温度としては、例えば15～50℃である。
　そして、本発明の製造方法にあっては、上記混合液を静置することにより、混合溶液中にてベシクルを生成させる。混合後、形成されたベシクルをすぐに所望の用途に供してもよいが、系を平衡化させるために、混合液を静置する時間を設けてもよい。混合液を静置する時間は、ベシクルの形成効率等の条件によって異なるが、好ましくは50時間以下、より好ましくは30時間以下である。但し、前述のように架橋剤を用いない場合、形成されたベシクルの径が経時的に増大する傾向があるので、静置時間を設けないことが好ましい場合もある。混合液を静置する時間は、ベシクルの形成効率によって異なるが、例えば、ベシクルの生成系は粒子成長を伴う場合があるため、静置時間は短くてよい。その場合の静置時間は２～30分である。また、系の十分な平衡化を意図する場合は、30分以上であり、好ましくは30～50時間である。
　短時間の静置（例えば２～30分）と長時間の静置（例えば30～50時間）により、得られるベシクルのサイズを変えることができる。
　架橋剤を用いる場合、上記の第一及び第二の水性溶液の混合溶液に、当該架橋剤を加えて混合すればよい。架橋剤はそのまま混合に用いてもよいが、架橋剤を含有する水性溶液を調製し、これを混合してもよい。架橋剤の水性溶液の調製における水性溶媒、ｐＨ、温度、イオン強度等の調製条件は、第一及び第二の水性溶液について上述した条件と同様である。
　本発明においては、上記第一及び第二の重合体の量と縮合剤又は架橋剤の量との関係を適宜調節することにより、荷電性セグメント間における架橋割合を変化させ、(i)架橋剤の添加量による架橋割合の調節、(ii)架橋剤の化学構造の調整による架橋後の膜の構造の制御等を行うことができる。例えば、架橋を密に施すことにより、膜の透過性を下げることが期待でき、ベシクルの安定性を上げる、あるいは、応答時間を延ばすことが期待できる。あるいは、長いアルキル鎖やオリゴエチレンオキシド鎖を有する架橋剤を用いることで、膜の疎水性や親水性、柔軟性を制御することが期待できる。
　また、本発明のベシクルに化合物等の物質を内包させる場合、例えば、ベシクル形成の間に、第一及び第二の重合体を含む混合液中に物質を添加することにより、ベシクル中に物質を内包させることができる。また、第一及び第二の水性溶液のいずれか一方または両方に予め物質を添加し、これらの混合溶液を調製することにより、ベシクル中に物質を内包させてもよい。従って、本発明の製造方法は、好ましくはベシクルに内包するための化合物等の物質を添加する工程を含む。物質をベシクルに内包させる際には、さらに、透析、希釈、濃縮、撹拌等の操作を適宜に付加することができる。また、物質をベシクルの膜に挿入する場合にも上記と同様の手法を用いることができる。
　本発明のベシクルを製造するのに好ましい重合体の例を図４に示す。
　以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
ベシクルの製造１
＜材料＞
　1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC), Dithiothreitol (DTT), N-methyl-2-pyrrolidone (NMP)は和光純薬工業株式会社（大阪）より購入した。1,5-diaminopentane (DAP)は東京化成工業株式会社（東京）より購入した。2-2’-Dithiobis(ethylamine) (Cystamine) dihydrochloride はSigma (St. Louis, CO、アメリカ)より購入した。Cy3-monoreactive dye pack，PD-10脱塩カラムはGEヘルスケアより購入した。
　Cystamine free base (Cyst) は抽出後に減圧下蒸留を行い、使用に供した。NMPは減圧下蒸留することにより使用に供した。アニオン性ブロック共重合体PEG-poly(a,b-aspartic acid) (PEG-P(Asp); Mn of PEG = 2,000, DP(Degree of Polymerization) of P(Asp) = 75 or 85)、蛍光ラベル化アニオン性ブロック共重合体PEG-P(Asp)-Cy3、poly(β-benzyl L-aspartate）（homo-PBLA）、及びpoly([5-aminopentyl] -a,b-aspartamide) (homo-P(Asp-AP); DP of P(Asp-AP) = 82) は文献記載の方法（Anraku Y. et al., J. Am. Chem. Soc., 2010, 132(5), 1631-1636）により合成した。
＜ジスルフィド側鎖を有するカチオン性アミノ酸重合体の合成＞
　凍結乾燥したhomo-PBLA (DP = 72, 50 mg) を2.5 mLのNMPに溶解し、 続けてDAP (PBLAに対して２～25 当量) 及び2-2’-Dithiobis(ethylamine)(Cyst) (PBLAに対して25～40当量) を溶液に加え、５℃にて1時間激しく撹拌した。反応混合物は０～５℃において20 wt％酢酸で中和し、分画分子量3,500の透析膜を用い、0.01 M塩酸に対して３日間、続いて純水に対して３日間の透析を行った。
　得られた溶液をろ過し、凍結乾燥することで、ジスルフィド含有ポリカチオンhomo-P(Asp-AP-Cyst)を得た。なお、「homo-P(Asp-AP-Cyst)」は、見かけ上ランダム共重合体であるが、homo-PBLAを原料としているため、本明細書ではこのように表記する。他の重合体（例えばhomo-P(Asp-AP)）も同様に表記する場合がある。
　サイズ排除クロマトグラフィーから、単峰性のピークを確認し、適切な反応の進行を確認した（図２）。
　DAPとCystの最終生成物への導入比は、仕込み比を1:1～1:20で調節することで行い、1H NMRスペクトルから、それぞれCyst含有率の異なるポリカチオン（側鎖残基数に対し、20～75％）が合成可能であることが明らかになった。
　以降、得られたポリマーをhomo-P(Asp-APx-Cysty)n(x+y=1, nはカチオン連鎖の総重合度)と表記する。図２及び３にCyst20％含有ポリマー homo-P(Asp-AP0.8-Cyst0.2)48の分析結果を示す。
　図２は、homo-P(Asp-AP-Cyst)のサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）の結果を示す図である。
　カラムは、Superdex 200 10/300 GL column (GEヘルスケア製)を用い、溶離液10 mM リン酸バッファー（500 mM NaCl, pH 7.4）, 流速0.5 mL/min, 25℃で分析を行った。クロマトグラフィーは、日本分光製のシステムを用いた。
　図３は、1H NMRの測定結果を示す図である。図３では、DAPが38ユニット(ピークc-e; 6H)、Cystが10ユニット(ピークf, g; 4H)導入されたことが確認でき、カチオン性側鎖48量体に対し、約20％Cystが導入されたことが確認され、図２の結果と合わせてCyst20％含有ポリマー homo-P(Asp-AP0.8-Cyst0.2)48として同定された。測定には、JNM-AL 300 (JEOL, Japan)を用い、重水中80℃で測定を行った。なお、図３中、共重合体中の「m」及び「n」は重合数（m = 38, n = 10）を示す。
＜ジスルフィド含有ベシクル（PICsome）の調製＞
　PEG-P(Asp)85とhomo-P(Asp-AP-cyst)48の10 mM リン酸バッファー(0 mM NaCl, pH 7.4)溶液をそれぞれ別途作製した（本実施例においてポリマー濃度は、全て1 mg/mL）。それぞれの溶液を、溶液中に含まれる荷電側鎖の比が等しくなるよう、即ち、-COO-と-NH3 +の数が等しくなるように混合し、2分間撹拌しPICsomeを得た（図４参照）。図４は、PICsomeの調製スキームの概念図である。ホモポリカチオンとPEGポリアニオンを混合することにより、PICsomeを得ることができる。なお、図４（a）中、共重合体中の「m」及び「n」は重合数（m = 45, n = 75あるいは85）を示す。図４（b）中、共重合体中の「m」及び「n」は重合数（m = 38, n = 10）を示す。
　PICsomeの同定は、後述の透過型電子顕微鏡（TEM）観察と動的光散乱（DLS）測定により行った。得られたPICsomeのポリイオンコンプレックス（PIC）膜を架橋するためにEDC溶液（10 mg/mL）を-COO-側鎖に対して10当量になるように加えた。比較例として、ジスルフィドを含有しないPICsomeをhomo-P(Asp-AP-Cyst)の代わりにhomo-P(Asp-AP)を用いることで作製した。
＜TEM観察によるPICsomeの構造確認＞
　上記のプロセスにより製造されたPICsomeの構造確認を透過型電子顕微鏡（TEM）により行った。製造したPICsomeを架橋後にウラニル染色し、TEMグリッド状で乾燥後観察に供した。観察には、日立製透過型電子顕微鏡H-7000を用いた。
　その結果、ジスルフィド含有PICsomeはユニラメラ型のベシクルであることが示唆された(図５)。
　図５は、得られたPICsomeのTEM観察写真（酢酸ウラニル染色後、撮影）である。
　ベシクル由来の中空構造に特徴的な像（中空部位が乾燥によりへこむのに対応した見え方）を確認した。
　(a)：Cyst20％-PICsome: (+) homo-P(Asp-AP0.8-Cyst0.2)48/ (-) PEG-P(Asp)85
　(b)：Cyst45％-PICsome: (+) homo-P(Asp-AP0.55-Cyst0.45)45/ (-) PEG-P(Asp)85
＜DLS測定によるPICsomeの塩安定性の確認＞
　ジスルフィド含有PICsomeの生理条件下での安定性について評価を行うため、先に調製したCyst45％-PICsome (10 mM リン酸バッファー; 0mM NaCl, pH 7.4, 25℃)について、150 mM NaCl添加の粒子に与える影響を動的光散乱解析装置（DLS）による粒径（直径）測定により評価した。
　その結果、適切なEDC架橋（側鎖-COO-に対して１当量以上のEDC添加）を施すことで、塩安定性が賦与されることを確認した（図６）。
　図６は、150 mM NaCl添加の有無に対応したDLS測定の結果を示す図である。
　Cyst45％-PICsomeについて、(a)架橋なし、(b)架橋後（10当量のEDC添加）について測定を行ったが、架橋後はNaClを添加しても粒径に変化は見られなかった。
＜ジスルフィド含有PICsome（無架橋型）の還元剤に対する応答性のDLSによる評価＞
　架橋を施さないCyst45％-PICsomeの還元剤に対する応答性を、DTT溶液添加後にDLS測定を行うことで評価した。DTTによる還元は、20 mM DTT溶液をPICsome溶液全量に対して25％量添加することで行った。
　ジスルフィドを含有するCyst45％-PICsomeと、ジスルフィドを含有しないCyst0％-PICsome [(+) homo-P(Asp-AP)82/(-) PEG-P(Asp)85]を用いて比較検討を行った結果を図７に示す。
　図７は、10 mMリン酸バッファー（0mM NaCl, pH 7.4, 25℃）中におけるDLSの測定結果を示す図であり、20 mM DTT添加前後における(a)粒径及び(b)多分散指数（PDI）の経時変化を示す。
　Control: Cyst0％-PICsome
　45cyst: Cyst45％-PICsome
　Cyst0％-PICsomeでは、DTT添加前後において粒径及びPDIに経時変化は見られなかったのに対し、Cyst45％-PICsomeでは、DTT添加後しばらくして急激な粒径及びPDIの増大が見られた。以上より、ジスルフィド含有PICsomeの還元環境への応答性が確認された。
＜ジスルフィド含有PICsome（架橋型）の還元剤に対する応答性のDLSによる評価＞
　架橋を施したCyst45％-PICsomeの還元剤に対する応答性を、DTT溶液添加後にDLS測定を行うことで評価した。架橋は、EDC添加当量を0.1～5.0で変えた４種を用意した（図８）。DTT添加は、20 mM DTT溶液をPICsome溶液全量に対して25％量添加することで行った。
　図８は、10mMリン酸バッファー（0mM NaCl, pH 7.4, 25℃）中におけるDLSの測定結果を示す図であり、20 mM DTT添加後における(a)粒径及び(b)PDIの経時変化を示す（EDC0.1：EDC 0.1当量，EDC0.5：EDC 0.5当量，EDC1.0：EDC 1.0当量，EDC5.0：EDC 5.0当量）。5.0当量のEDCを添加した条件を除き、粒径及びPDIともにDTT添加後に何らかの影響を受けた。EDC5.0当量添加の場合のみ、DTT添加の影響を受けずに一定の粒径、PDIを示した。これより、本発明のベシクルは架橋状態に応じて、応答性が変化させられる材料であることが示唆された。
＜架橋型PICsomeの還元剤に対する応答性のFCSによる評価＞
　架橋を施したCyst58％-PICsomeの還元剤に対する応答性を、DTT溶液添加後に蛍光相関分光法（FCS）測定を行うことで評価した。PEG-P(Asp)75の末端をCy3で蛍光ラベル化したPEG-P(Asp)75-Cy3を用いて、蛍光ラベル化PICsomeを製造した。蛍光ラベル化Cyst58％-PICsome及び蛍光ラベル化Cyst０％-PICsomeにEDC ５当量をそれぞれ添加して架橋した。DTTによる還元は、５ mM DTT溶液をPICsome溶液全量に対して25％量添加することで行った。FCS測定は、励起波長543 nmで３回行った。
　図９は10 mMリン酸バッファー（150 mM NaCl, pH 7.4, 25 ℃）中におけるFCS測定の結果を示す図であり、５ mM DTT添加、あるいは添加しない条件における並進拡散時間の経時変化を示す。
　58cyst(+):Cyst58％-PICsome + DTT
　58cyst(-):Cyst58％-PICsome
　Normal（+/-）：Cyst０％-PICsome（+/-）DTT
　Cyst０％-PICsomeでは、DTT添加の有無に関わらず、並進拡散時間に経時変化は見られなかったのに対し、Cyst58％-PICsomeでは、DTT添加のみ徐々に並進拡散時間の増大が見られた。
　以上より、本発明のベシクルは還元環境への応答性を示すことが示唆された。
ベシクルの製造２
＜材料＞
　(R)-2-amino-3-(4-methoxybenzylthio)propanoic acid (H-Cys(Mob)-OH)はSigma (St. Louis, CO、アメリカ)より購入した。トリホスゲン、トリブチルホスフィン、3-Nitro-2-pyridinesulfenyl chloride(NpysCl)、2-iminothiolane、 Diisopropylethylamine、脱水THF、脱水DMF、脱水NMP、脱水CH2Cl2は和光純薬工業株式会社（大阪）より購入した。α-methoxy-ω-amino poly(ethylene glycol)(PEG-NH2)(分子量2,000)は日油株式会社（東京）より購入した。n-Butylamine (Bu-NH2)は蒸留し、使用に供した。1,5-diaminopentane (DAP)は東京化成工業株式会社（東京）より購入した。
＜保護システインカルボン酸無水物の合成＞
　H-Cys(Mob)-OH ４gをTHFに溶解し、２当量のトリホスゲンと50℃で２時間反応させ、得られた溶液をヘキサンで沈殿させた。得られた沈殿物をCH2Cl2に溶解させ、ヘキサンで再結晶にて精製した。LC-MSと1H NMRから、４－メトキシベンジルシステイン Ｎ－カルボン酸無水物（Cys(Mob)-NCA）が合成されていることを確認した。
＜保護チオール含有ブロック共重合体の合成＞
　凍結乾燥を行い、水分を除去したPEG-NH2 100 mgにDMF/CH2Cl2 = 1：4の混合溶媒５mLを加え、PEG-NH2溶液を得た。また、DMF/CH2Cl2 = 1：4の混合溶媒５mlにCys(Mob)-NCA 10当量を加えて得られた溶液を、シリンジを用いてPEG-NH2溶液の入ったナスフラスコへ撹拌しながら加えた。溶液の入ったナスフラスコを35℃で撹拌しながら１日間反応させた。
　別のナスフラスコに、上記のCys(Mob)-NCAと同様の方法で、β-benzyl-L-aspartateを原料として合成したBLA-NCA 790 mg（90当量）、DMF/CH2Cl2 = 1：4の混合溶媒25 mLを加えて溶液を得た。この溶液を、シリンジを用いて上述の反応溶液中へ撹拌しながら加えた。35℃で撹拌しながら２日間反応させた。所定時間後、反応溶液に５倍量程度のエーテルを加えて沈殿物を得た。この沈殿物をろ過し、エーテルで数回洗浄した後、ろ物を減圧下で乾燥させ、ブロック共重合体PEG-PCys(Mob)-PBLAを得た。
　PEG-PCys(Mob)-PBLAについて、1H NMR測定を行い、Mob基に由来する７及び7.8 ppm付近のピーク及びPEGエチレン鎖ピークとのプロトン比から、PCys(Mob)の重合数が約９、PBLAの重合数が約80と見積もられた。またサイズ排除クロマトグラフィーから、単峰性のピークを確認し、適切な反応の進行を確認した。原料の混合比率を変更することで、PCys(Mob)の重合数が５～30、PBLAの重合数が30～150のブロック共重合体を合成することが可能である。
＜チオール含有ブロック共重合体の合成＞
　合成したPEG-PCys(Mob)-PBLA 100 mgに、CH2Cl2 10 mL、NpysCl 30 mg (３当量)を加え、室温で５時間反応させ、システインの保護基である４－メトキシベンジル(Mob)基から、3-Nitro-2-pyridinesulfenyl (Npys)基への置換反応を行った。続いて、反応溶液にトリブチルホスフィン 200μlを加え、10分間室温で反応させた。得られた反応溶液に５倍量程度のエーテルを加えて沈殿物を得た。この沈殿物をろ過し、エーテルで数回洗浄した後、ろ物を減圧下で乾燥し、チオール含有ブロック共重合体PEG-PCys-PBLAを得た。
　得られた生成物は1H NMR測定を行い、Mob基及びNpys基に由来する７～９ppm付近のピークが消失し、チオール基の脱保護反応を確認した。
＜チオール含有アニオン性ブロック共重合体の合成＞
　合成したPEG-PCys-PBLA 100 mgを少量のアセトニトリルに溶解させ、続いて１M NaOH水溶液を10 ml加え、室温にて１時間撹拌した。得られた反応溶液を透析チューブ(MWCO 3,500)に入れ、蒸留水を外液として透析を３日間行った。外液を数回交換し、内液を回収した後、凍結乾燥を行い、チオール含有アニオン性ブロック共重合体であるPEG-PCys-PAspを得た。
　PEG-PCys-PAspについて1H NMR測定を行い、3.5 ppm付近のPEGエチレン鎖ピークと、2.6 ppm付近のPAsp及びPCysのメチレンピークとのプロトン比からPAspとPCysの合計重合数を約85と算出した。この結果から、PBLAの脱保護反応が定量的に進行したことを確認した。
＜チオール含有重合体の合成＞
　Bu-NH2のDMF溶液（10 mg/mL） 365μLにDMF/CH2Cl2 = 1：4の混合溶媒 10 mLを加えた。また、別途調製したDMF/CH2Cl2= 1：4の混合溶媒 10 mL とCys(Mob)-NCA 134 mg（10当量）を加えて得られた溶液を、シリンジを用いてBu-NH2溶液の入ったナスフラスコへ撹拌しながら加えた。溶液の入ったナスフラスコを35℃で撹拌しながら１日間反応させた。
　別のナスフラスコにBLA-NCA 1122 mg（90当量）、DMF/CH2Cl2 = 1：4の混合溶媒 20 mLを加えて得た溶液を、シリンジを用いて上述の反応溶液中へ撹拌しながら加えた。35℃で撹拌しながら２日間反応させた。所定時間後、反応溶液に５倍量程度のエーテルを加えて沈殿物を得た。この沈殿物をろ過し、エーテルで数回洗浄した後、ろ物を凍結乾燥させ、保護チオール含有重合体PCys(Mob)-PBLAを得た。
　PCys(Mob)-PBLAについて1H NMR測定を行い、Mob基に由来する７及び7.8 ppm付近のピークが見られ、末端ブチル基に由来するピークとのプロトン比から、PCys(Mob)の重合数が約10、PBLAの重合数が約95と見積もられた。またサイズ排除クロマトグラフィーから、単峰性のピークを確認し、適切な反応の進行を確認した。原料の混合比率を変更することで、PCys(Mob)の重合数が５～30、PBLAの重合数が30～150のアミノ酸重合体を合成することが可能である。
　得られたPCys(Mob)-PBLA 200 mgに、CH2Cl2 10 mL、NpysCl 30 mg（３当量）を加え、室温で５時間反応させ、システインの保護基であるMob基から、Npys基への置換反応を行った。続いて、反応溶液にトリブチルホスフィン 200μL を加え、10分間室温で反応させた。得られた反応溶液に５倍量程度のエーテルを加えて沈殿物を得た。この沈殿物をろ過し、エーテルで数回洗浄した後、ろ物を減圧下で乾燥し、チオール含有重合体PCys-PBLA を得た。
　得られた生成物は1H NMR測定を行い、Mob基及びNpys基に由来する７～９ppm付近のピークが消失し、チオール基の脱保護反応を確認した。
＜チオール含有カチオン性アミノ酸重合体の合成＞
　回収したチオール含有重合体PCys-PBLAをNMP 2.5 mLに溶解し、続けてDAP (PBLAに対して25～40 当量)を溶液に加え、５℃にて1時間激しく撹拌した。反応混合物は０～５℃において20 wt％酢酸で中和し、0.01 M塩酸に対して３日間、続いて純水に対して３日間の透析を行った。内液を凍結乾燥により回収し、チオール含有カチオン性アミノ酸重合体であるPCys-P(Asp-AP)を得た。
PCys-P(Asp-AP)について1H NMR測定を行い、3.5 ppm付近のPEGエチレン鎖ピークと、2.6 ppm付近のPAsp及びPCysのメチレンピークとのプロトン比からPAspとPCysの合計重合数を約100と算出した。この結果から、PBLAの脱保護反応が定量的に進行したことを確認した。
＜チオール含有ベシクル（PICsome）の調製と酸化＞
　上記のように合成したアニオン性共重合体とカチオン性アミノ酸重合体をTCEP(Tris(2-carboxyethyl)phosphine)還元し、PD-10脱塩カラムで精製後、凍結乾燥したものを用いて、チオール含有ベシクルの調製を行った。
　アニオン性共重合体PEG-PCys-PAspとカチオン性アミノ酸重合体PCys-P(Asp-AP)の10 mM リン酸バッファー(0 mM NaCl, pH 7.4)溶液をそれぞれ別途作製した（本実施例において、ポリマー濃度は全て1 mg/mL）。それぞれの溶液を、溶液中に含まれる荷電側鎖の比が等しくなるよう、即ち、-COO-と-NH3 +の数が等しくなるように混合し、２分間撹拌しPICsomeを得た。
　PICsomeの粒径をDLSで測定した。結果を図10に示す。得られたPICsomeの懸濁液は自発的に空気酸化が進行し、ジスルフィド結合が形成され、生理条件下で安定であることが確認できた。
　以下、実施例３～５に第一の重合体及び第二の重合体の合成例を示す。
＜チオール含有アニオン性ブロック共重合体の合成＞
　凍結乾燥を行い、水分を除去したPEG-NH2 100 mgにDMF/CH2Cl2 = 1：4の混合溶媒５mLを加え、PEG-NH2溶液を得た。また、DMF/CH2Cl2 = 1：4の混合溶媒25 mLにCys(Mob)-NCA 133.65 mg（10当量）とBLA-NCA 1121.49 mg（90当量）を加えて得られた溶液を、シリンジを用いてPEG-NH2溶液の入ったナスフラスコへ撹拌しながら加えた。溶液の入ったナスフラスコを35 ℃で撹拌しながら２日間反応させた。所定時間後、反応溶液に５倍量程度のエーテルを加えて沈殿物を得た。この沈殿物をろ過し、エーテルで数回洗浄した後、ろ物を減圧下で乾燥させ、ブロック共重合体PEG-P(BLA-r-Cys(Mob))を得た。
　なお、ここで式中の-r-はアミノ酸の主鎖にシステインがランダムに配置されていることを示す。
　PEG-P(BLA-r-Cys(Mob))について、1H NMR測定を行い、Mob基に由来する７及び7.8 ppm付近のピーク及びPEGエチレン鎖ピークとのプロトン比から、PCys(Mob)の重合数が約９、PBLAの重合数が約88と見積もられた。原料の混合比率を変更することで、PCys(Mob)の重合数が５～30、PBLAの重合数が30～150のブロック共重合体を合成することが可能である。またサイズ排除クロマトグラフィーから、単峰性のピークを確認し、適切な反応の進行を確認した。
　合成したPEG-P(BLA-r-Cys(Mob))200 mgに、CH2Cl2 10 mL， NpysCl 30 mg（３当量）を加え、室温で５時間反応させ、システインの保護基であるMob基から、Npys基への置換反応を行った。続いて反応溶液にトリブチルホスフィン 200 μLを加え、10分間室温で反応させた。得られた反応溶液に５倍量程度のエーテルを加えて沈殿物を得た。この沈殿物をろ過し、エーテルで数回洗浄した後、ろ物を減圧下で乾燥し、チオール含有ブロック共重合体PEG-P(BLA-r-Cys)を得た。
　得られた生成物は1H NMR測定を行い、Mob基及びNpys基に由来する７～９ppm付近のピークが消失し、チオール基の脱保護反応を確認した。
　合成したPEG-P(BLA-r-Cys)100 mgを少量のアセトニトリルに溶解させ、続いて１M NaOH水溶液　10 mL加え、室温にて１時間撹拌した。得られた反応溶液を透析チューブ（MWCO 3,500）に入れ、蒸留水を外液として透析を３日間行った。外液を数回交換し、内液を回収した後、凍結乾燥を行い、チオール含有アニオン性ブロック共重合体であるPEG-P(Asp-r-Cys)を得た。
　PEG-P(Asp-r-Cys)について1H NMR測定を行い、3.5 ppm付近のPEGエチレン鎖ピークと、2.6 ppm付近のPAsp及びPCysのメチレンピークとのプロトン比からPAspとPCysの合計重合数を約90と算出した。この結果から、PBLAの脱保護反応が定量的に進行したことを確認した。
＜チオール含有カチオン性アミノ酸重合体の合成＞
　Bu-NH2のDMF溶液（10 mg/mL） 366μLにDMF/CH2Cl2 = 1：4の混合溶媒 10 mLを加えた。また、別途調製したDMF/CH2Cl2= 1：4の混合溶媒25 mLにCys(Mob)-NCA 134 mg（10当量）とBLA-NCA 1121 mg（90当量）を加えて得られた溶液を、シリンジを用いてBu-NH2溶液の入ったナスフラスコへ撹拌しながら加えた。溶液の入ったナスフラスコを35 ℃で撹拌しながら２日間反応させた。所定時間後、反応溶液に５倍量程度のエーテルを加えて沈殿物を得た。この沈殿物をろ過し、エーテルで数回洗浄した後、ろ物を減圧下で乾燥させ、保護チオール含有重合体P(BLA-r-Cys(Mob))を得た。
　P(BLA-r-Cys(Mob))について1H NMR測定を行い、Mob基に由来する７及び7.8 ppm付近のピークが見られ、末端ブチル基に由来するピークとのプロトン比から、PCys(Mob)の重合数が約10、PBLAの重合数が約95と見積もられた。原料の混合比率を変更することで、PCys(Mob)の重合数が５～30、PBLAの重合数が30～150の重合体を合成することが可能である。またサイズ排除クロマトグラフィーから、単峰性のピークを確認し、適切な反応の進行を確認した。
　得られたP(BLA-r-Cys(Mob)) 200 mgに、CH2Cl2 10 mL、NpysCl 30 mg（３当量）を加え、室温で５時間反応させ、システインの保護基であるMob基からNpys基への置換反応を行った。続いて、反応溶液にトリブチルホスフィン 200 μL を加え、10分間室温で反応させた。得られた反応溶液に５倍量程度のエーテルを加えて沈殿物を得た。この沈殿物をろ過し、エーテルで数回洗浄した後、ろ物を減圧下で乾燥し、チオール含有重合体P(BLA-r-Cys)を得た。
　得られた生成物は1H NMR測定を行い、Mob基及びNpys基に由来する７～９ppm付近のピークが消失し、チオール基の脱保護反応を確認した。
　回収した生成物をNMP 2.5 mLに溶解し、DAP (PBLAに対して25～40 当量)の溶液に加え、５℃ にて１時間激しく撹拌した。反応混合物は０～５℃ において20 wt％酢酸で中和し、0.01 M塩酸に対して３日間、続いて純水に対して３日間の透析を行った。内液を凍結乾燥により回収し、チオール含有カチオン性アミノ酸重合体であるP((Asp-AP)-r-Cys)を得た。P((Asp-AP)-r-Cys)について1H NMR測定を行い、末端ブチル基に由来するピークと、2.6 ppm付近のP(Asp-AP)及びPCysのメチレンピークとのプロトン比からP(Asp-AP)とPCysの合計重合数を約100と算出した。この結果から、PBLAの脱保護反応が定量的に進行したことを確認した。
＜チオール含有アニオン性ブロック共重合体の合成＞
　凍結乾燥を行い、水分を除去したPEG-NH2 100mg にDMF/CH2Cl2 = 1：4の混合溶媒５mLを加え、PEG-NH2溶液を得た。また、DMF/CH2Cl2 = 1：4の混合溶媒５mLにCys(Mob)-NCA 133.65 mg（10当量）を加えて得られた溶液を、シリンジを用いてPEG-NH2溶液の入ったナスフラスコへ撹拌しながら加えた。溶液の入ったナスフラスコを35 ℃で撹拌しながら１日間反応させた。
　別のナスフラスコにBLA-NCA 996.88 mg（80当量）、DMF/CH2Cl2= 1：4の混合溶媒 25 mLを加えて溶液を得た。この溶液をシリンジを用いて上述の反応溶液中へ撹拌しながら加えた。35 ℃で撹拌しながら２日間反応させた。
　その後、また別のナスフラスコにCys(Mob)-NCA 133.65 mg（10当量）、DMF/CH2Cl2= 1：4の混合溶媒 ５mLを加えて溶液を得た。この溶液をシリンジを用いて上述の反応溶液中へ撹拌しながら加えた。35 ℃で撹拌しながら１日間反応させた。
　所定時間後、反応溶液に５倍量程度のエーテルを加えて沈殿物を得た。この沈殿をろ過し、エーテルで数回洗浄した後、ろ物を減圧下で乾燥させ、ブロック共重合体PEG-PCys(Mob)-PBLA-PCys(Mob)を得た。
　PEG-PCys(Mob)-PBLA-PCys(Mob)について、1H NMR測定を行い、Mob基に由来する７及び7.8 ppm付近のピーク及びPEGエチレン鎖ピークとのプロトン比から、PCys(Mob)の重合数が約18、PBLAの重合数が約75と見積もられた。原料の混合比率を変更することで、PCys(Mob)の重合数が５～30、PBLAの重合数が30～150のブロック共重合体を合成することが可能である。またサイズ排除クロマトグラフィーから、単峰性のピークを確認し、適切な反応の進行を確認した。
　合成したPEG-PCys(Mob)-PBLA-PCys(Mob) 200 mgに、CH2Cl2 10 mL，NpysCl 60 mg (３当量)を加え、室温で５時間反応させ、システイン保護基であるMob基から、Npys基への置換反応を行った。続いて、反応溶液にトリブチルホスフィン 400 μLを加え、10分間室温で反応させた。得られた反応溶液に５倍量程度のエーテルを加えて沈殿物を得た。この沈殿物をろ過し、エーテルで数回洗浄した後、ろ物を減圧下で乾燥し、チオール含有ブロック共重合体PEG-PCys-PBLA-PCysを得た。
　得られた生成物は1H NMR測定を行い、Mob基及びNpys基に由来する７～９ppm付近のピークが消失し、チオール基の脱保護反応を確認した。
　合成したPEG-PCys-PBLA-PCys 100 mgを少量のアセトニトリルに溶解させ、続いて１M NaOH水溶液 10 mL加え、室温にて１時間撹拌した。得られた反応溶液を透析チューブ（MWCO 3,500）に入れ、蒸留水を外液として透析を３日間行った。外液を数回交換し、内液を回収した後、凍結乾燥を行い、チオール含有アニオン性ブロック共重合体であるPEG-PCys-PAsp-PCysを得た。
　PEG-PCys-PAsp-PCysについて1H NMR測定を行い、3.5 ppm付近のPEGエチレン鎖ピークと、2.6 ppm付近のPAsp及びPCysのメチレンピークとのプロトン比からPAspとPCysの合計重合数を約90と算出した。この結果から、PBLAの脱保護反応が定量的に進行したことを確認した。
＜チオール含有カチオン性アミノ酸重合体の合成＞
　Bu-NH2のDMF溶液（10 mg/mL） 365 μLにDMF/CH2Cl2 = 1：4の混合溶媒 10 mLを加えた。また、別途調製したDMF/CH2Cl2= 1：4の混合溶媒 10 mL とCys(Mob)-NCA 134 mg（10当量）を加えて得られた溶液を、シリンジを用いてBu-NH2溶液の入ったナスフラスコへ撹拌しながら加えた。溶液の入ったナスフラスコを35 ℃で撹拌しながら１日間反応させた。
　別のナスフラスコにBLA-NCA 996.88 mg（80当量）、DMF/CH2Cl2 = 1：4の混合溶媒 20 mLを加えて得た溶液を、シリンジを用いて上述の反応溶液中へ撹拌しながら加えた。35 ℃で撹拌しながら２日間反応させた。
　その後、また別のナスフラスコにCys(Mob)-NCA 133.65 mg（10当量）、DMF/CH2Cl2 = 1：4の混合溶媒 ５mLを加えて溶液を得た。この溶液をシリンジを用いて上述の反応溶液中へ撹拌しながら加えた。35 ℃で撹拌しながら1日間反応させた。
　所定時間後、反応溶液に５倍量程度のエーテルを加えて沈殿物を得た。この沈殿をろ過し、エーテルで数回洗浄した後、ろ物を減圧下で乾燥させ、重合体PCys(Mob)-PBLA-PCys(Mob)を得た。
　PCys(Mob)-PBLA-PCys(Mob)について1H NMR測定を行い、Mob基に由来する７及び7.8 ppm付近のピークが見られ、末端ブチル基に由来するピークとのプロトン比から、PCys(Mob)の重合数が約16、PBLAの重合数が約80と見積もられた。原料の混合比率を変更することで、PCys(Mob)の重合数が５～30、PBLAの重合数が30～150の重合体を合成することが可能である。またサイズ排除クロマトグラフィーから、単峰性のピークを確認し、適切な反応の進行を確認した。
　得られたPCys(Mob)-PBLA-PCys(Mob) 200 mgに、CH2Cl2 10 mL， NpysCl 60 mg (３当量)を加え、室温で５時間反応させ、システインの保護基であるMob基から、Npys基への置換反応を行った。続いて、反応溶液にトリブチルホスフィン 400 μL を加え、10分間室温で反応させた。得られた反応溶液に５倍量程度のエーテルを加えて沈殿物を得た。この沈殿をろ過し、エーテルで数回洗浄した後、ろ物を減圧下で乾燥し、チオール含有重合体PCys-PBLA-PCysを得た。
　得られた生成物は1H NMR測定を行い、Mob基及びNpys基に由来する７～９ppm付近のピークが消失し、チオール基の脱保護反応を確認した。
　回収したチオール含有重合体PCys-PBLA-PCysをNMP 2.5 mLに溶解し、DAP (PBLAに対して25～40 当量)の溶液に加え、５℃にて1時間激しく撹拌した。反応混合物は０～５℃ において20 wt％酢酸で中和し、0.01 M塩酸に対して３日間、続いて純水に対して３日間の透析を行った。内液を凍結乾燥により回収し、チオール含有カチオン性アミノ酸重合体PCys-P(Asp-AP)-PCysを得た。
　PCys-P(Asp-AP)-PCysについて1H NMR測定を行い、末端ブチル基に由来するピークと、2.6 ppm付近のP(Asp-AP)及びPCysのメチレンピークとのプロトン比からP(Asp-AP)とPCysの合計重合数を約90と算出した。この結果から、PBLAの脱保護反応が定量的に進行したことを確認した。
＜側鎖末端にチオールを含有するカチオン性アミノ酸重合体の合成＞
　合成したhomo-P(Asp-AP) (DP = 77, 75 mg) をNMP ２mLに溶解し、続けて2-iminothiolane 58.2 mg及びdiisopropylethylamine 250μLを溶液に加え、室温にて約1時間撹拌した。続いて反応溶液にLiCl 100 mgを加え、約1時間撹拌した。反応混合物は0.01M塩酸で中和し、純水に対して3日間の透析を行った。
　得られた溶液を凍結乾燥することで、側鎖アミノ末端に1-imino-4-mercaptobutyl（IM）基を含有するカチオン性アミノ酸重合体 P(Asp-AP-IM)を得た。サイズ排除クロマトグラフィーから、単峰性のピークを確認し、適切な反応の進行を確認した。また1H NMRより、原料のhomo-P(Asp-AP)がほぼ100％反応したと確認された。2-iminothiolaneの加える量を変化させることで、IMの導入率を０～100％でコントロールすることが可能である。
ベシクルの製造３
＜材料＞
　1,2-dithiane-4,5-diolは東京化成工業株式会社（東京）より購入した。
＜環状ジスルフィドの合成＞
　1,2-dithiane-t-4,t-5-diol r-1-oxideは1,2-dithiane-4,5-diolを原料として、文献記載の方法（Pramod K.S. et al., J. Org. Chem., 1988, 53, 2608-2612）により合成した。
＜ジスルフィド架橋型ベシクル（PICsome）の製造＞
　PEG-PCys-PAspとPCys-P(Asp-AP)の10 mM リン酸バッファー（0 mM NaCl, pH 7.4）溶液（１mg/mL）をそれぞれ別途作製した。それぞれの溶液を、溶液中に含まれる荷電側鎖の比が等しくなるよう、即ち、-COO-と-NH3 +の数が等しくなるように混合し、２分間撹拌しPICsomeを得た。
　このPICsome溶液に1,2-dithiane-t-4,t-5-diol r-1-oxideをPEG-PCys-PAsp側のチオール基に対し0.5～10当量になるように加え、両ポリマー間の架橋を行った。
シトクロムc封入ベシクルの製造と評価
＜材料＞
　2, 2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) はSigma (St. Louis, CO、アメリカ)より購入した。hydrogen peroxide (H2O2) は和光純薬工業株式会社（大阪）より購入した。PD-10脱塩カラムはGEヘルスケアより購入した。
＜ボルテックス法によるジスルフィド含有ベシクル（PICsome）への物質封入＞
　実施例１で製造したジスルフィド含有ベシクル45cyst PICsomeの懸濁液を、再びボルテックスで撹拌させながら、シトクロムｃのリン酸バッファー溶液（12.4 mg/mL）を５v/v（％）添加することで、シトクロムｃをPICsomeに封入させた。EDC溶液（-COO-側鎖に対し10当量）を加え、４℃で一晩反応させた。過剰量のEDC及び未封入シトクロムcはPD-10カラム及び透析（MWCO 300,000）により除去した。
＜ジスルフィド含有ベシクルに封入されたシトクロムｃのペルオキシダーゼ活性評価＞
　45cyst PICsomeに封入されたシトクロムｃのペルオキシダーゼ活性は、H2O2及びABTS溶液添加後の吸光度変化（418 nm）にて評価した。ジスルフィドを含有する45cyst PICsome及びジスルフィドを含有しないNormal PICsome [(+) homo-P(Asp-AP)82/(-) PEG-P(Asp)75] の懸濁液に、11.25 mM H2O2溶液及び0.9 mM ABTS溶液を添加することで行った。結果を図11に示す。ジスルフィドの有無に関わらず、ベシクルに封入したシトクロムcの活性が確認された。このことからベシクルの薬物送達システム及びバイオリアクターとしての有用性を示すことができた。
　本発明により、ジスルフィド結合が導入された静電結合型ベシクルが提供される。本発明のベシクルは、膜の内側に化合物等の物質を内包できることから、薬物送達システム、各種材料として有用である。

Claims (15)

  1. 　以下の(a)又は(b)の第一の重合体と、以下の(c)又は(d)の第二の重合体とにより形成された膜（但し(b)と(d)との組み合わせを除く）であって前記重合体中のカチオン性セグメント及びアニオン性セグメントの一部が架橋された膜を有してなる、ベシクル。
    第一の重合体：
    (a) 非荷電親水性セグメントとカチオン性セグメントとを有するブロック共重合体I
    (b) カチオン性セグメントを有するアミノ酸重合体I
    第二の重合体：
    (c) 非荷電親水性セグメントとアニオン性セグメントとを有するブロック共重合体II
    (d) アニオン性セグメントを有するアミノ酸重合体II
  2. 　架橋は、その部位にジスルフィド結合が含まれる構造を有するものである請求項１に記載のベシクル。
  3. 　前記膜は、外層、中間層及び内層からなる三層構造を有し、外層及び内層は非荷電親水性セグメントにより構成され、中間層はカチオン性セグメント及びアニオン性セグメントにより構成されるものである、請求項１に記載のベシクル。
  4. 　ブロック共重合体I及びIIのうち一方のブロック共重合体の非荷電親水性セグメントが前記外層を形成し、他方のブロック共重合体の非荷電親水性セグメントが前記内層を形成する、請求項３に記載のベシクル。
  5. 　非荷電親水性セグメントが、ポリエチレングリコール及び／又はポリ（２－オキサゾリン）である、請求項１に記載のベシクル。
  6. 　前記カチオン性セグメントが、下記式(1)で示されるものである、請求項１に記載のベシクル。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
      
     
    〔式中、
    　R2は、水素原子、アセチル基、トリフルオロアセチル基、アクリロイル基またはメタクリロイル基を表し、
    　R11及びR13は、それぞれ独立して-(CH2)3NH2又は-CONH(CH2)s-X1を表し、ここで、sは０～20の整数であり、X1は、-NH2、ピリジル基、モルホリル基、１－イミダゾリル基、ピペラジニル基、４－（C1-6アルキル）－ピペラジニル基、４－（アミノC1-6アルキル）－ピペラジニル基、ピロリジン－１－イル基、Ｎ－メチル－Ｎ－フェニルアミノ基、ピペリジニル基、グアニジノ基、ジイソプロピルアミノ基、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、-(CH2)tNH2及び-(NR9(CH2)o)pNHR10からなる群から選択される少なくとも一つであり、ここで、R9は水素原子又はメチル基を表し、R10は、水素原子、アセチル基、トリフルオロアセチル基、ベンジルオキシカルボニル基、-C(=NH)-NH2、又はｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基を表し、oは１～15の整数であり、pは１～５の整数であり、tは０～15の整数であり、
    　R12及びR14は、それぞれ独立してチオール基、チオール基を含有するC1-12アルキル基、-SR30（R30は、ベンジル基、４－メトキシベンジル基、４－メチルベンジル基、Ｎ－（アセチル）アミノメチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、トリチル基、２－ピリジンスルフェニル基又は３－ニトロ－２－ピリジンスルフェニル基を表す）、又は-CONH(CH2)s-X2を表し、ここで、sは０～20の整数であり、X2は、チオール基、チオール基を含有するC1-12アルキル基、SR30(R30は前記と同様である)、及びチオール基、チオール基を含有するC1-12アルキル基又はSR30（R30は前記と同様である）によって置換されたピリジル基、１－イミダゾリル基、ピペラジニル基、４－（C1-6アルキル）－ピペラジニル基、４－（アミノC1-6アルキル）－ピペラジニル基、ピロリジン－１－イル基、Ｎ－メチル－Ｎ－フェニルアミノ基及びピペリジニル基、並びに-S-S-(CH2)tNH2、-S-S-(NR9(CH2)o)pNHR10、-(CH2)tNHCO(CH2)uSH及び-(CH2)tNHC(=NH)(CH2)vSHからなる群から選択される少なくとも一つであり、ここで、R9、R10、o、p、tは前記と同様であり、uは０～15の整数であり、vは０～15の整数であり、
    　m及びnは１又は２であり、
    　a1及びa2はそれぞれ０～5,000の整数であり、b1及びb2はそれぞれ０～5,000の整数であり、かつa1+a2+b1+b2は２～5,000であり、
    　「／」の表記は、各モノマー単位の配列順序が任意であることを表す。〕
  7. 　R11及びR13がそれぞれ独立して-CONH(CH2)S-NH2(sは２～８の整数であり)であり、
    　R12及びR14がそれぞれ独立してチオール基、-CONH(CH2)S-S-S-(CH2)tNH2、-CONH(CH2)S-SH、-CONH(CH2)SNHCO(CH2)uSH又は-CONH(CH2)SNHC(=NH)(CH2)vSH(sは２～８の整数であり、tは０～15の整数であり、uは１～８の整数であり、vは１～８の整数である）であり、
    　R2が水素原子であり、
    　a1及びa2がそれぞれ０～200の整数であり、b1及びb2が０～200の整数であり、かつa1+a2+b1+b2が10～200である、請求項６に記載のベシクル。
  8. 　アニオン性セグメントが、下記式(2)で示されるものである、請求項１に記載のベシクル。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
      
     
    〔式中、
    　R2は、水素原子、アセチル基、トリフルオロアセチル基、アクリロイル基又はメタクリロイル基を表し、
    　R3は、それぞれ独立してメチレン基又はエチレン基を表し、
    　R31及びR32は、それぞれ独立してメチレン基又はエチレン基を表し、
    　R33及びR34は、それぞれ独立して単結合又はメチレン基若しくはエチレン基を表し、
    　R41及びR42は、それぞれ独立してベンジルオキシカルボニル基、チオール基、チオール基を含有するC1-12アルキル基、-SR30（R30は、ベンジル基、４－メトキシベンジル基、４－メチルベンジル基、Ｎ－（アセチル）アミノメチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、トリチル基、２－ピリジンスルフェニル基又は３－ニトロ－２－ピリジンスルフェニル基を表す）、又は-CONH(CH2)s-X3を表し、ここで、sは０～20の整数であり、X3は、チオール基、チオール基を含有するC1-12アルキル基又は-SR30（R30は前記と同様である）であり、
    　c1及びc2はそれぞれ０～5,000の整数であり、d1及びd2はそれぞれ０～5,000の整数であり、かつc1+c2+d1+d2は２～5,000であり、
    　「／」の表記は、各モノマー単位の配列順序が任意であることを表す。〕
  9. 　R2が水素原子を表し、
    　R3がメチレン基を表し、
    　R31、R32、R33及びR34がメチレン基を表し、
    　R41及びR42がチオール基又は-CONH(CH2)S-SH (sは２～８の整数である）であり、
    　c1及びc2が０～200の整数であり、d1及びd2が０～200の整数であり、かつc1+c2+d1+d2が10～200である、請求項８に記載のベシクル。
  10. 　ブロック共重合体Iが、下記式(3)又は(4)で示されるものである、請求項１に記載のベシクル。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
      

    〔式中、
    　R2は、水素原子、アセチル基、トリフルオロアセチル基、アクリロイル基またはメタクリロイル基を表し、
    　R11及びR13は、それぞれ独立して-(CH2)3NH2又は-CONH(CH2)s-X1を表し、ここで、sは０～20の整数であり、X1は、-NH2、ピリジル基、モルホリル基、１－イミダゾリル基、ピペラジニル基、４－（C1-6アルキル）－ピペラジニル基、４－（アミノC1-6アルキル）－ピペラジニル基、ピロリジン－１－イル基、Ｎ－メチル－Ｎ－フェニルアミノ基、ピペリジニル基、グアニジノ基、ジイソプロピルアミノ基、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、-(CH2)tNH2及び-(NR9(CH2)o)pNHR10からなる群から選択される少なくとも一つであり、ここで、R9は水素原子又はメチル基を表し、R10は、水素原子、アセチル基、トリフルオロアセチル基、ベンジルオキシカルボニル基、-C(=NH)-NH2、又はｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基を表し、oは１～15の整数であり、pは１～５の整数であり、tは０～15の整数であり、
    　R12及びR14は、それぞれ独立してチオール基、チオール基を含有するC1-12アルキル基、-SR30（R30は、ベンジル基、４－メトキシベンジル基、４－メチルベンジル基、Ｎ－（アセチル）アミノメチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、トリチル基、２－ピリジンスルフェニル基又は３－ニトロ－２－ピリジンスルフェニル基を表す）、又は-CONH(CH2)s-X2を表し、ここで、sは０～20の整数であり、X2は、チオール基、チオール基を含有するC1-12アルキル基、SR30(R30は前記と同様である)、及びチオール基、チオール基を含有するC1-12アルキル基又はSR30（R30は前記と同様である）によって置換されたピリジル基、１－イミダゾリル基、ピペラジニル基、４－（C1-6アルキル）－ピペラジニル基、４－（アミノC1-6アルキル）－ピペラジニル基、ピロリジン－１－イル基、Ｎ－メチル－Ｎ－フェニルアミノ基及びピペリジニル基、並びに-S-S-(CH2)tNH2、-S-S-(NR9(CH2)o)pNHR10、-(CH2)tNHCO(CH2)uSH及び-(CH2)tNHC(=NH)(CH2)vSHからなる群から選択される少なくとも一つであり、ここで、R9、R10、o、p、tは前記と同様であり、uは０～15の整数であり、vは０～15の整数であり、
    　m及びnは１又は２であり、
    　R4は、水素原子又は置換されていてもよい直鎖若しくは分岐鎖のC1-12アルキル基を表し、
    　R5は、-(CH2)gNH-を表し、かつgは０～５であり、
    　R6及びR7は、それぞれR4及びR5と同様であり、
    　R8は、直鎖又は分岐鎖のC1-12アルキル基を表し、
    　a1及びa2はそれぞれ０～5,000の整数であり、b1及びb2はそれぞれ０～5,000の整数であり、かつa1+a2+b1+b2は２～5,000であり、
    　eは５～2,500の整数であり、fは５～2,500の整数であり、
    　「／」の表記は、各モノマー単位の配列順序が任意であることを表す。〕
  11. 　R11及びR13がそれぞれ独立して-CONH(CH2)S-NH2(sは２～８の整数である)であり、
    　R12及びR14がそれぞれ独立してチオール基、-CONH(CH2)S-S-S-(CH2)tNH2、-CONH(CH2)S-SH、-CONH(CH2)SNHCO(CH2)uSH又は-CONH(CH2)SNHC(=NH)(CH2)vSH(sは２～８の整数であり、tは０～15の整数であり、uは１～８の整数であり、vは１～８の整数である)であり、
    　R2が水素原子であり、
    　R4がメチル基であり、
    　a1及びa2が０～200の整数であり、b1及びb2が０～200の整数であり、かつa1+a2+b1+b2が10～200であり、eが10～300の整数であり、fが10～300の整数である、請求項１０に記載のベシクル。
  12. 　ブロック共重合体IIが、下記式(5)又は(6)で示されるものである、請求項１に記載のベシクル。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     〔式中、
    　R2は、水素原子、アセチル基、トリフルオロアセチル基、アクリロイル基又はメタクリロイル基を表し、
    　R3は、それぞれ独立してメチレン基又はエチレン基を表し、
    　R31及びR32は、それぞれ独立してメチレン基又はエチレン基を表し、
    　R33及びR34は、それぞれ独立して単結合又はメチレン基若しくはエチレン基を表し、
    　R41及びR42は、それぞれ独立してベンジルオキシカルボニル基、チオール基、チオール基を含有するC1-12アルキル基、-SR30（R30は、ベンジル基、４－メトキシベンジル基、４－メチルベンジル基、Ｎ－（アセチル）アミノメチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、トリチル基、２－ピリジンスルフェニル基又は３－ニトロ－２－ピリジンスルフェニル基を表す）、又は-CONH(CH2)s-X3を表し、ここで、sは０～20の整数であり、X3は、チオール基、チオール基を含有するC1-12アルキル基又は-SR30（R30は前記と同様である）であり、
    　R4は、水素原子又は置換されていてもよい直鎖若しくは分岐鎖のC1-12アルキル基を表し、
    　R5は、-(CH2)gNH-を表し、かつgは０～５の整数であり、
    　R6及びR7はそれぞれR4及び R5と同様であり、
    　R8は直鎖又は分岐鎖のC1-12アルキル基を表し、
    　c1及びc2はそれぞれ０～5,000の整数であり、d1及びd2はそれぞれ０～5,000の整数であり、かつc1+c2+d1+d2は２～5,000であり、
    　i及びjはそれぞれ５～2,500の整数であり、
    　「／」の表記は、各モノマー単位の配列順序が任意であることを表す。〕
  13. 　R2が水素原子を表し、
    　R3がメチレン基を表し、
    　R31、R32、R33及びR34がメチレン基を表し、
    　R41及びR42がチオール基を表し、
    　R4がメチル基を表し、
    　R6がメチル基を表し、
    　R8が-CH(CH3)2を表し、
    　c1及びc2がそれぞれ０～200の整数であり、d1及びd2がそれぞれ０～200の整数であり、かつc1+c2+d1+d2が10～200であり、
    　iが10～300の整数であり、
    　jが10～300の整数である、請求項１２に記載のベシクル。
  14. 　ブロック共重合体Iが前記式(3)で示されるものであり、ブロック共重合体IIが前記式(5)で示されるものである、請求項１に記載のベシクル。
  15. 　物質を内包するものである、請求項１に記載のベシクル。
PCT/JP2011/067138 2010-07-28 2011-07-27 静電結合型ベシクル WO2012014942A1 (ja)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US13/812,383 US9051437B2 (en) 2010-07-28 2011-07-27 Electrostatically bonded vesicle
JP2012526534A JP5679357B2 (ja) 2010-07-28 2011-07-27 静電結合型ベシクル
EP11812531.9A EP2599834B1 (en) 2010-07-28 2011-07-27 Electrostatically bonded vesicle

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2010-168880 2010-07-28
JP2010168880 2010-07-28

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2012014942A1 true WO2012014942A1 (ja) 2012-02-02

Family

ID=45530145

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2011/067138 WO2012014942A1 (ja) 2010-07-28 2011-07-27 静電結合型ベシクル

Country Status (4)

Country Link
US (1) US9051437B2 (ja)
EP (1) EP2599834B1 (ja)
JP (1) JP5679357B2 (ja)
WO (1) WO2012014942A1 (ja)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014058079A1 (ja) 2012-10-12 2014-04-17 帝人株式会社 金属微粒子を含む静電結合型ベシクル
JP6049854B2 (ja) * 2013-03-01 2016-12-27 国立研究開発法人科学技術振興機構 物質内包ベシクル及びその製造方法
WO2018025657A1 (ja) * 2016-07-30 2018-02-08 日本化薬株式会社 新規な高分子誘導体、及びそれらを用いた新規な高分子誘導体イメージングプローブ
US11096991B2 (en) 2015-05-07 2021-08-24 The University Of Tokyo Nanoreactor using polyion complex polymersomes, and method for producing same

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BRPI0721948A2 (pt) * 2007-08-20 2014-04-08 Enzon Pharmaceuticals Inc Ligantes poliméricos contendo frações dissulfeto de piridila
WO2011145745A1 (ja) * 2010-05-21 2011-11-24 独立行政法人科学技術振興機構 物質内包ベシクル及びその製造方法
EP2942348B1 (en) * 2014-05-07 2017-10-25 Johannes Gutenberg-Universität Mainz Thiol-protected amino acid derivatives and uses thereof

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH08188541A (ja) 1995-01-10 1996-07-23 Res Dev Corp Of Japan 静電結合型高分子ミセル薬物担体とその薬剤
JP2001146556A (ja) * 1999-11-19 2001-05-29 Nano Career Kk コア−シェル構造のポリイオンコンプレックスミセル
WO2006118260A1 (ja) 2005-05-02 2006-11-09 The University Of Tokyo 静電結合型高分子ベシクル
WO2009133968A1 (ja) * 2008-04-30 2009-11-05 国立大学法人東京大学 電荷変換型三元系ポリプレックス

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6835394B1 (en) * 1999-12-14 2004-12-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Polymersomes and related encapsulating membranes
US7332527B2 (en) * 2003-05-16 2008-02-19 Board Of Regents Of The University Of Nebraska Cross-linked ionic core micelles
WO2009139856A1 (en) * 2008-05-13 2009-11-19 Biocure, Inc. Vesicles for use in biosensors
WO2011145745A1 (ja) * 2010-05-21 2011-11-24 独立行政法人科学技術振興機構 物質内包ベシクル及びその製造方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH08188541A (ja) 1995-01-10 1996-07-23 Res Dev Corp Of Japan 静電結合型高分子ミセル薬物担体とその薬剤
JP2001146556A (ja) * 1999-11-19 2001-05-29 Nano Career Kk コア−シェル構造のポリイオンコンプレックスミセル
WO2006118260A1 (ja) 2005-05-02 2006-11-09 The University Of Tokyo 静電結合型高分子ベシクル
WO2009133968A1 (ja) * 2008-04-30 2009-11-05 国立大学法人東京大学 電荷変換型三元系ポリプレックス

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Riposomu Ouyou no Shin-tenkai (New development of application of liposome", 2005, NTS
"Riposomu Ouyou no Shin-tenkai", 2005, NTS
AKIHIRO KISHIMURA; KAZUNORI KATAOKA, JINKO KETSUEKI, vol. 17, 2009, pages 73 - 81
ANRAKU Y. ET AL., J. AM. CHEM. SOC., vol. 132, no. 5, 2010, pages 1631 - 1636
H. NYIN ET AL., SOFT MATTER, vol. 2, 2006, pages 940 - 949
HELMUT SCHLAAD ET AL., MACROMOLECULES, vol. 36, no. 5, 2003, pages 1417 - 1420
PRAMOD K.S. ET AL., J. ORG. CHEM., vol. 53, 1988, pages 2608 - 2612
See also references of EP2599834A4

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014058079A1 (ja) 2012-10-12 2014-04-17 帝人株式会社 金属微粒子を含む静電結合型ベシクル
JP5912186B2 (ja) * 2012-10-12 2016-05-11 帝人株式会社 金属微粒子を含む静電結合型ベシクル
EP2907509A4 (en) * 2012-10-12 2016-06-29 Teijin Ltd VESICLES FOR ELECTROSTATIC BINDING WITH METAL MICROPARTICLES
JPWO2014058079A1 (ja) * 2012-10-12 2016-09-05 帝人株式会社 金属微粒子を含む静電結合型ベシクル
JP6049854B2 (ja) * 2013-03-01 2016-12-27 国立研究開発法人科学技術振興機構 物質内包ベシクル及びその製造方法
US10322092B2 (en) 2013-03-01 2019-06-18 Japan Science And Technology Agency Substance-containing vesicle, and production method therefor
US10471019B2 (en) 2013-03-01 2019-11-12 Japan Science And Technology Agency Substance-containing vesicle, and production method therefor
US11096991B2 (en) 2015-05-07 2021-08-24 The University Of Tokyo Nanoreactor using polyion complex polymersomes, and method for producing same
WO2018025657A1 (ja) * 2016-07-30 2018-02-08 日本化薬株式会社 新規な高分子誘導体、及びそれらを用いた新規な高分子誘導体イメージングプローブ
US10869937B2 (en) 2016-07-30 2020-12-22 Nippon Kayaku Kabushiki Kaisha Polymer derivatives, and novel polymer derivative imaging probe using same

Also Published As

Publication number Publication date
EP2599834B1 (en) 2016-06-15
US20130122103A1 (en) 2013-05-16
JP5679357B2 (ja) 2015-03-04
EP2599834A1 (en) 2013-06-05
EP2599834A4 (en) 2014-04-16
US9051437B2 (en) 2015-06-09
JPWO2012014942A1 (ja) 2013-09-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5679357B2 (ja) 静電結合型ベシクル
EP2272897B1 (en) Copolymer including uncharged hydrophilic block and cationic polyamino acid block having lateral chain to which hydrophobic radical is partially introduced, and use of copolymer
Quadir et al. PEG–polypeptide block copolymers as pH-responsive endosome-solubilizing drug nanocarriers
JP5271715B2 (ja) ジスルフィド架橋高分子ミセルを用いた環境応答性ｓｉＲＮＡキャリア
JP6049854B2 (ja) 物質内包ベシクル及びその製造方法
JP5843763B2 (ja) 物質内包ベシクル及びその製造方法
JP5912186B2 (ja) 金属微粒子を含む静電結合型ベシクル
John et al. Biomimetic pH/redox dual stimuli‐responsive zwitterionic polymer block poly (L‐histidine) micelles for intracellular delivery of doxorubicin into tumor cells
EP2044132A1 (en) Composition
Li et al. Dual pH-responsive micelles with both charge-conversional property and hydrophobic–hydrophilic transition for effective cellular uptake and intracellular drug release
JP2006528234A (ja) キャリア粒子
WO2019055996A9 (en) Polymer nanodiscs for biotechnology and medical applications
Zeng et al. Enzyme-mediated in situ formation of pH-sensitive nanogels for proteins delivery
EP1878766A1 (en) Electrostatic bonding type polymer vesicle
Chen et al. Thiol-reactive amphiphilic block copolymer for coating gold nanoparticles with neutral and functionable surfaces
EP3162361A1 (en) Improved magnetically reactive vesicular bodies
Martin et al. Cholesteryl to improve the cellular uptake of polymersomes within HeLa cells
Liu et al. Genipin cross-linked PEG-block-poly (L-lysine)/disulfide-based polymer complex micelles as fluorescent probes and pH-/redox-responsive drug vehicles
WO2011065916A1 (en) Crosslinking branched molecule through thiol-disulfide exchange to form hydrogel
WO2018001256A1 (zh) 具有不对称膜结构的可逆交联聚合物囊泡、抗肿瘤药物及其制备方法
WO2021020275A1 (ja) 脂質膜構造体の表面修飾材
Gulyuz et al. Poly (2-ethyl-2-oxazoline-co-ethyleneimine)-block-poly (ε-caprolactone) based micelles: synthesis, characterization, peptide conjugation and cytotoxic activity
Bacinello Hybrid Polymer and Peptide-Based Nanostructures for Stimuli-Responsive Drug Delivery
Higgins Functionalized Methionine Polypeptides And Their Self Assembly
Verma et al. Biopolymeric vectors for enhancing Gene delivery-A Comparative evaluation

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 11812531

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2012526534

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 13812383

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2011812531

Country of ref document: EP