WO2011118778A1 - 細胞増殖抑制剤及びそのスクリーニング方法 - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to a growth inhibitor for cells in which expression of a predetermined antisense RNA of CTBP1 gene, such as prostate cancer cells, is enhanced, a method for screening a cell growth inhibitor, and the like.
- Prostate cancer is the most common cancer affecting men in the West. In Japan, the number of patients with prostate cancer has increased dramatically with the westernization of eating habits and the aging of the population.
- surgical treatment including prostatectomy, chemotherapy with anticancer agents, and radiation treatment are widely applied.
- Surgical treatment is the first choice, but treatment methods other than surgical treatment are selected when the diagnosis has already been made in cancer, or when surgery is difficult due to recurrence after surgery.
- Androgens are steroid hormones that have functions such as sex differentiation into men, maintenance of reproductive organ function, expression of secondary sexual characteristics, spermatogenesis, and promotion of protein anabolism in skeletal muscles.
- DHT dihydrotestosterone
- Testosterone is synthesized in testicular stromal cells, then transported to the target cells, such as prostate cells, by the blood stream, converted into DHT by 5 ⁇ -hydrogenase in the cells, and then the androgen receptor (AR) in the cytoplasm To join.
- AR bound to DHT is converted into an active form, transported into the nucleus, binds to an androgen response element on the target gene, and functions as a transcription factor that activates expression of the target gene.
- hormonal therapy that inhibits the production and function of androgen is often used as a treatment other than surgical treatment of prostate cancer, and extremely good effects are often obtained.
- androgen-independent prostate cancer may relapse within a few years after hormone therapy. Therefore, control of androgen-independent cancer is an important issue.
- An object of the present invention is to provide a cell growth inhibitor that is also effective for androgen-independent prostate cancer.
- CTBP1 a transcription product of sense DNA near the AR binding site of the CTBP1 gene, that is, an antisense RNA near the AR binding site of the CTBP1 gene, is strongly induced by androgen. Therefore, when the function of the antisense RNA is suppressed by the RNAi method, the expression of CTBP1 increases at both the mRNA level and the protein level, while the transcriptional activity of AR is suppressed and the proliferation of prostate cancer cells is also suppressed. It was confirmed. In addition, the expression level of the antisense RNA is significantly higher in prostate cancer and its metastatic cancer cells than in the normal prostate, and the expression level of CTBP1 is higher in the prostate cancer and its metastasis than in the normal prostate.
- CTBP1 gene antisense RNA comprising a partial sequence of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1
- an antisense RNA of the CTBP1 gene comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 5, and (iii) a mutant, variant or variant of the antisense RNA according to (i) or (ii) above )
- antisense RNA in which one or several bases are deleted, added or substituted A growth inhibitor of cells expressing any of the antisense RNAs (hereinafter referred to as “CTBP1-AS”), A cell growth inhibitor comprising a CTBP1-AS expression inhibitor or function inhibitor as an active ingredient;
- CTBP1-AS is an antisense RNA consisting of the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 17 to 20
- the cell growth inhibitor according to [3] above comprising a base sequence complementary to the base sequence shown in any of the above; [6] The cell growth inhibitor according to any one of [1] to [5] above, wherein the cells expressing CTBP1-AS are prostate cancer cells and / or metastasized cancer cells thereof; [7] A pharmaceutical composition comprising the cell growth inhibitor according to any one of [1] to [6] above; [8] A method for preventing or treating prostate cancer, comprising administering a therapeutically effective amount of the cell growth inhibitor according to any one of [1] to [6] above; [9] A screening method for a growth inhibitor of cells expressing CTBP1-AS, comprising contacting cells expressing CTBP1-AS or a cell extract thereof with a test compound in the presence of androgen Measuring the expression level of CTBP1-AS; and selecting a test compound that reduces the expression level of CTBP1-AS as compared to when measured in the absence of the test compound.
- a screening method for a growth inhibitor of cells expressing CTBP1-AS comprising contacting a cell expressing CTBP1 gene or a cell extract thereof with a test compound in the presence of androgen And; measuring the expression level of the CTBP1 gene; and selecting a test compound that increases the expression level of the CTBP1 gene compared to when measured in the absence of the test compound.
- the cell growth inhibitor of the present invention by inhibiting the expression or function of CTBP1-AS, it is possible to efficiently suppress the proliferation of cells such as prostate cancer cells in which CTBP1-AS expression is enhanced. . Since the cell growth inhibitor of the present invention suppresses the transcriptional activity of the downstream signal of AR by inhibiting the expression or function of CTBP1-AS, androgen non-activation in which the AR signal is activated by mutation or amplification of AR It is thought to be effective against dependent cancers. If a double-stranded nucleic acid having an RNAi effect on CTBP1-AS is used as the cell growth inhibitor of the present invention, the target selection system is high, and the mechanism inherent to the cell is used, so that the safety is also high.
- the present invention also provides a screening method for efficiently selecting a growth inhibitor of cells with enhanced expression of CTBP1-AS from a test compound, a method for preventing or treating prostate cancer, and determining the prognosis of prostate cancer Inspection methods are also provided.
- FIG. 1 shows the results of measuring the expression level of CTBP1-AS after administering siRNA or control double-stranded RNA against CTBP1-AS to LNCaP cells.
- CTBP1-AS expression was induced with androgen (R1881) and suppressed by administration of siRNA against CTBP1-AS.
- FIG. 2 shows the results of measuring the expression level (mRNA level) of CTBP1 after administering siRNA or control double-stranded RNA against CTBP1-AS to LNCaP cells.
- the expression of CTBP1 was suppressed by androgen, and the suppression effect by androgen decreased by administration of siRNA against CTBP1-AS.
- FIG. 3 shows the results of measuring the expression level (protein level) of CTBP1 after administering siRNA or control double-stranded RNA against CTBP1-AS to LNCaP cells.
- the expression of CTBP1 was suppressed by androgen, and the suppression effect by androgen decreased by administration of siRNA against CTBP1-AS.
- FIG. 4A shows the results of confirming the effect of CTBP1-AS on AR transcriptional activity by introducing a PSA luciferase vector into LNCaP cells and administering siRNA or control double-stranded RNA against CTBP1-AS. Luciferase activity, ie, transcriptional activity of AR, was increased by androgen and was suppressed by administration of siRNA against CTBP1-AS.
- FIG. 4B and 4C show the results of examining the expression of an androgen response gene in the same cell.
- the expression level of the androgen response gene was increased by androgen, but was suppressed by administration of siRNA.
- FIG. 5 shows the results of examining the effect of CTBP1-AS function suppression on LNCaP cell proliferation by MTS assay. When siRNA against CTBP1-AS was administered, cell proliferation was suppressed.
- FIG. 6 shows the results of confirming the effect on tumor volume by CTBP1-AS function suppression in a mouse tumor model. The growth of tumor cells implanted subcutaneously in mice was significantly suppressed by administration of siRNA against CTBP1-AS.
- FIG. 7 shows the results of confirming the effect on tumor weight due to CTBP1-AS function suppression in a mouse tumor model.
- the growth of tumor cells implanted subcutaneously in mice was significantly suppressed by administration of siRNA against CTBP1-AS.
- FIG. 8 shows the results of measuring the expression levels of CTBP1-AS and CTBP1 RNA levels in a mouse tumor model.
- Administration of siRNA to CTBP1-AS decreased the expression level of CTBP1-AS in the tumor and increased the expression level of CTBP1.
- FIG. 9 shows the results of measuring the protein level expression level of CTBP1 in a mouse tumor model.
- Administration of siRNA to CTBP1-AS increased the expression level of CTBP1 protein in the tumor.
- FIG. 11A shows the results of evaluating the expression of CTBP1 in prostate cancer cells by immunostaining. Compared with normal cells, the expression level of CTBP1 was decreased in prostate cancer cells.
- FIG. 11B shows the results of comparing the survival rates of the CTBP1 high expression group and the low expression group. CTBP1 high expression group had significantly higher survival rate than low expression group.
- FIG. 11C shows images of representative sections of normal prostate and prostate cancer by immunostaining.
- FIG. 12 is a schematic diagram showing the sequences of CTBP1-ASa, CTBP1-ASb, and CTBP1-ASd whose presence was confirmed as a result of searching for CTBP1-AS other than CTBP1-ASd using the 3 ′ RACE PCR method.
- FIG. 13 shows the results of Northern blotting in which the expression of CTBP1-AS was confirmed using RNA derived from LNCaP cells. A transcript with a length of about 5 kb was detected, suggesting that CTBP1-ASb was mainly expressed.
- Fig. 14 shows the results of analyzing the localization of CTBP1-AS by Northern blotting using nuclear RNA and cytoplasmic RNA (Fig.
- FIGS. 15a and b show the results of analyzing the effects of androgen stimulation on the expression of CTBP1 and CTBP1-AS by Western blotting and Northern blotting in LNCaP cells and LTAD cells serving as an androgen depletion resistance model.
- FIGS. 15c and d show the results of comparison of cell proliferative ability in LNCaP cells or LTAD cells with and without androgen stimulation, and suppression of CTBP1-AS expression by the RNAi method.
- FIG. 16 shows transplantation of androgen depletion resistance model LTAD cells into nude mice, local injection of siRNA against CTBP1-AS, tumor volume (b), expression level of CTBP1-AS at mRNA level (c), CTBP1 It is the result of measuring the expression level (c) at the protein level.
- FIG. 17 shows the results of confirming that PSF, an RNA-binding transcription repressor, is involved in the suppression of CTBP1 expression. Repression of PSF transcription by RNAi decreased the degree of suppression of CTBP1 expression by androgen stimulation.
- FIG. 18 shows the results of immunoprecipitation showing that PSF and CTBP1-AS bind in an androgen-dependent manner.
- FIG. 19 shows the results of analyzing the localization of PSF and CTBP1-AS by RNA-FISH. The localization of PSF and CTBP1-AS was almost consistent.
- FIG. 20 shows the result of analyzing the relationship between PSF and cell cycle.
- FIG. 21 shows the results of analyzing the control of SMAD3 and p53 by PSF by qRT-PCR (a) and Western blotting (b) using siRNA for PSF.
- FIG. 22 shows the results of examining the control of cell cycle-related factors by CTBP1-AS using siRNA against CTBP1-AS.
- FIG. 23 is an explanatory diagram showing a gene expression control mechanism by CTBP1-AS and PSF.
- FIG. 24 shows the results of examining the effect of suppressing CTBP1-AS expression on 26 types of siRNA.
- the cell growth inhibitor according to the present invention is characterized by suppressing the growth of cells expressing CTBP1-AS, and contains a CTBP1-AS expression inhibitor or function inhibitor as an active ingredient.
- CTBP1 means C-terminal binding protein (C-terminal binding protein 1)
- CTBP1 gene means a gene encoding CTBP1 protein.
- CTBP1 is known to function as a co-repressor in the nucleus (Kim JH, et al. Nat Struct Mol Biol. 12, 2005, 423-428, Senyuk V, et al. Arch Biochem Biophys. 441, 2005, 168-173). For example, it is reported to be involved in transcriptional repression of the ZEB1 gene and the like, and is generally considered to negatively regulate transcription (Chinnadurai G, Int J Biochem Cell Biol. 39, 2007, 1593-1607).
- CTBP1 is significantly decreased in prostate cancer cells, and is suppressed by androgen in both expression of mRNA level and protein level. I found out.
- CTBP1-AS means an antisense RNA of the CTBP1 gene of any one of the following (i) to (iii) that is expressed in the vicinity of the AR binding site of the CTBP1 gene.
- an antisense RNA of the CTBP1 gene containing a base sequence shown in SEQ ID NO: 5 and
- Antisense RNA Antisense RNA means a transcription product produced using a sense strand (sense DNA) as a template in the double-stranded DNA of a gene.
- CTBP1-AS is a molecule that is a target of the cell growth inhibitor according to the present invention.
- (i) to (iii) will be specifically described.
- Antisense RNA of CTBP1 gene containing a partial sequence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1
- the antisense RNA of the CTBP1 gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 has its cDNA known as Accession Number: AX747592 (SEQ ID NO: 2), and is the sense DNA near the AR binding site of the CTBP1 gene. It is a transcript.
- Antisense RNA of CTBP1 gene containing a partial sequence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1
- Antisense RNA consisting of only a part of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1
- An antisense RNA comprising a partial sequence comprising the 5 ′ end of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, and further having one or more bases bound to the 5 ′ end
- An antisense RNA comprising a partial sequence containing the 3 ′ end of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and further having one or more bases bound to the 3 ′ end is exemplified.
- all the antisense RNAs expressed in the living body correspond to the antisense RNA of (i), but the target for the cell growth inhibitor of the present invention
- an antisense RNA consisting of a partial sequence containing the 3 ′ end of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, and a partial sequence containing the 3 ′ end of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1
- Antisense RNA in which one or more bases are bound to the 3 ′ end is particularly preferred.
- partial sequence including the 3 ′ end of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 for example, the partial sequence from the 1300th position to the 3 ′ end of the base sequence described in SEQ ID NO: 1, the 1200th position To a 3 ′ end, a partial sequence from the 800th position to the 3 ′ end, and the like, but are not limited thereto.
- CTBP1 gene antisense RNA comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5
- Antisense RNA of CTBP1 gene containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 includes antisense RNA consisting only of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 and 3 ′ of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5.
- An antisense RNA in which one or more bases are bonded to the terminal and / or the 5 ′ terminal is mentioned.
- the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 corresponds to positions 2348 to 2372 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
- the number of bases bound to the 3 ′ end and / or the 5 ′ end is not particularly limited.
- a CTBP1-AS expression inhibitor or function inhibitor containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 is suitable as an active ingredient of the cell growth inhibitor of the present invention.
- an antisense RNA containing the base sequence set forth in SEQ ID NO: 23 is also preferable.
- mutant or variant of the antisense RNA described in (i) or (ii) include, for example, various variants including splicing variants such as 5 ′ alternative splicing and 3 ′ alternative splicing, single nucleotide polymorphism (SNP), Examples include polymorphisms such as copy number variation (CNV) and mutants (for example, mutants caused by cancer).
- mutants and variants can also be expressed as sense DNA transcripts in the vicinity of the AR binding site of the CTBP1 gene, and can be targets of the cell growth inhibitor according to the present invention.
- the antisense RNA according to (i) or (ii) one or several bases are deleted, added or substituted, and the number of bases to be deleted is the AR of CTBP1 gene. It is not particularly limited as long as it is a transcript of sense DNA in the vicinity of the binding site, but it is 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably about 1 to 3, or within 10% of the total length, preferably Within 5%, more preferably within 1%.
- the location of the base to be deleted is not particularly limited, and may be the 5 ′ end or 3 ′ end of each antisense RNA, or may be a base other than the end. Further, it may be deleted, added and / or substituted at a plurality of positions.
- Such an antisense RNA can also be expressed as a transcription product of sense DNA in the vicinity of the AR binding site of the CTBP1 gene, and can be a target for the cell growth inhibitor according to the present invention.
- CTBP1-AS include RNA having the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 17-21.
- the RNA consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 17 includes the 3 'end from position 698 of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1, and further has a total length of 3710 bases in which RNA of 522 bases is bound to the 3' end RNA (hereinafter referred to as “CTBP1-ASc”).
- CTBP1-ASc 3 RNA consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 18 includes the 3 ′ end from position 698 of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1, and further has a total length of 5041 bases in which an RNA of 1853 bases is bound to the 3 ′ end.
- RNA (hereinafter referred to as “CTBP1-ASb”).
- the RNA comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 19 includes the 3 ′ end from the 698th position of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1, and further has a total length of 15756 bases in which RNA of 12568 bases is bound to the 3 ′ end.
- RNA (hereinafter referred to as “CTBP1-ASa”).
- the RNA consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 20 is an RNA with a total length of 3189 bases corresponding to the 697th position to the 3 ′ end of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 (hereinafter referred to as “CTBP1-ASd”). Call it.) Any of these antisense RNAs has been confirmed to be expressed as a transcription product of sense DNA in the vicinity of the AR binding site of the CTBP1 gene, and can be a target for the cell growth inhibitor according to the present invention.
- CTBP1-AS is a non-coding RNA that does not encode a protein motif.
- the expression level of CTBP1-AS is elevated in prostate cancer cells.
- CTBP1-AS when combined with PSF, an RNA-binding transcriptional repressor, forms a complex that suppresses transcription of genes that suppress the cell cycle (eg, SMAD3, p53). To do. As a result, cell proliferation is promoted.
- CTBP1-AS and PSF also represses transcription of CTBP1 in cooperation with histone deacetylase. Since CTBP1 originally has a function of suppressing transcription of the androgen receptor, transcriptional activation by the androgen receptor is enhanced by suppressing the transcription of CTBP1. As a result, it leads to cell proliferation. Therefore, when the expression of CTBP1-AS is suppressed, its proliferation can be suppressed even in androgen-resistant cancer cells, as shown in Examples described later. In the present specification, to suppress cell growth means to stop or delay cell growth.
- the cell growth inhibitor according to the present invention is effective for all cells expressing CTBP1-AS, but is particularly useful for inhibiting the growth of cells in which CTBP1-AS expression is enhanced.
- a cell in which the expression of CTBP1-AS is enhanced means a cell in which the expression level of CTBP1-AS is significantly increased compared to normal non-dividing cells.
- Examples of cells in which CTBP1-AS expression is enhanced include, but are not limited to, prostate cancer cells and metastatic cancer cells thereof.
- the metastatic cancer cell of a prostate cancer means the cancer cell in the metastatic focus of a prostate cancer.
- CTBP1-AS expression inhibitor means a substance that completely inhibits transcription of CTBP1-AS, that is, transcription that produces CTBP1-AS using the CTBP1 gene DNA as a template, or significantly reduces the transcription. It means the substance to be made.
- expression refers to transcription in which complementary RNA is produced by a transcriptase using DNA as a template, synthesis of protein based on genetic information possessed by DNA, and protein based on genetic information possessed by mRNA. Contains the translation that is synthesized.
- CTBP1-AS function-inhibiting substance means a substance that acts on CTBP1-AS itself to completely inhibit the function, or a substance that significantly reduces the function. Examples include, but are not limited to, a substance that promotes the degradation of CTBP1-AS and a substance that hybridizes to CTBP1-AS.
- the function of CTBP1-AS means suppressing the expression of CTBP1 and activating the AR downstream signal. Therefore, inhibiting the function of CTBP1-AS means increasing CTBP1 expression and suppressing activation of AR downstream signals.
- the CTBP1-AS expression-inhibiting substance or function-inhibiting substance used in the present invention may be any substance as long as it has the above-mentioned functions, for example, a low molecular compound; a high molecular compound; ; Single-stranded DNA, double-stranded DNA, single-stranded RNA, double-stranded RNA, chimeric nucleic acid containing single-stranded or double-stranded DNA and RNA, other artificial nucleic acids (peptide nucleic acid (PNA), locked nucleic acid (LNA)) and the like.
- PNA peptide nucleic acid
- LNA locked nucleic acid
- CTBP1-AS expression inhibitor or function inhibitor for example, the following are preferably used.
- A An antisense nucleic acid for CTBP1-AS or a part thereof
- b A nucleic acid having a ribozyme activity that specifically cleaves CTBP1-AS
- c A double-stranded nucleic acid having an RNAi effect on CTBP1-AS
- d Nucleic acid capable of expressing the nucleic acid according to any one of (a) to (c) above
- the antisense nucleic acid method is well known as an expression inhibition method. Introducing a single-stranded nucleic acid (antisense nucleic acid) having a base sequence complementary to the target gene (basically, mRNA, which is a transcription product) into the cell, and hybridizing to the target gene, the expression of the gene is achieved. It is a method of inhibiting.
- the antisense nucleic acid used in the present invention is preferably a sequence complementary to a part of CTBP1-AS, but may not be completely complementary.
- the antisense nucleic acid has complementarity to a part of CTBP1-AS.
- the length of the antisense nucleic acid is not particularly limited as long as the function inhibiting effect of CTBP1-AS can be obtained, but is generally 10 to 100 bases, preferably 15 to 30 bases.
- An antisense nucleic acid can be appropriately designed and synthesized by those skilled in the art using known software or the like based on the base sequence of CTBP1-AS.
- the antisense nucleic acid may be any of DNA, RNA, chimeric nucleic acid containing DNA and RNA, and may be modified. Examples of the modified nucleic acid include those in which a phosphate group is substituted with a thiophosphate group or a methylphosphonate group.
- Nucleic acid having ribozyme activity that specifically cleaves CTBP1-AS examples include nucleic acids that have ribozyme activity that specifically cleaves CTBP1-AS.
- a ribozyme is a nucleic acid molecule that catalytically hydrolyzes a target RNA, and is composed of an antisense region having a sequence complementary to the target RNA and a catalytic central region responsible for a cleavage reaction (for example, Ribozyme: Biochemistry and Biotechnology (Krupp, G.
- Ribozymes that specifically cleave CTBP1-AS can also be designed according to methods known to those skilled in the art. Is an RNA molecule, but a DNA-RNA chimeric molecule can also be used.
- RNAi is a sequence-specific gene expression suppression mechanism induced by a double-stranded nucleic acid.
- the target specificity is very high, and it is highly safe because it uses a gene expression suppression mechanism that originally exists in vivo.
- siRNA When used in mammalian cells, a double-stranded small RNA (siRNA) of about 19 to 30 bases, preferably about 21 to 25 bases is usually used. However, longer double-stranded RNA that can be cleaved by an enzyme (Dicer) in a cell to become siRNA may be used.
- the target RNA molecule is cleaved by RNAi.
- siRNA is made into single strands by single-sided strand cleaving with a protein called Argonaute or unwinding with RNA helicase, and then combined with Argonaute to form a working complex RISC (RNA induced silencing complex ).
- RISC RNA induced silencing complex
- siRNA functions as a guide molecule that searches for target RNA
- Argonaute functions as an RNase (Slicer) that cleaves target RNA.
- a general siRNA has a 19-base completely complementary double-stranded region, and has 2 base overhangs at the 3 ′ end of each of the sense and antisense strands.
- a blunt end type without an overhang may be used.
- a 25-base blunt-end RNA has the advantage of minimizing activation of interferon responsive genes, preventing off-target effects from the sense strand, and being very stable in serum, for use in vivo Also suitable for.
- the siRNA used in the present invention is a region having no sequence similar to other genes from the sequence of CTBP1-AS, including a consensus sequence of highly active siRNA, and having a 3-base periodicity in the sequence It can be designed according to a known method for obtaining highly active siRNA such as a GC content of about 35 to 45%.
- a known activity prediction algorithm can also be used, and as such activity prediction algorithm, siExplorer, siDirect, BIOPREDsi and the like are disclosed.
- the double-stranded nucleic acid having an RNAi effect may be a double-stranded RNA, a DNA-RNA chimeric double-stranded nucleic acid, or may contain an artificial nucleic acid.
- the chimera type is obtained by replacing a part of double-stranded RNA having RNAi effect with DNA, and is known to have high serum stability and low immune response induction.
- the above double-stranded nucleic acid is modified with 2'-OH group, backbone phosphorothioate substitution or boranophosphate group, introduction of LNA (locked nucleic acid) with ribose 2 and 4 cross-linked Can also enhance resistance and stabilization against nucleases, and such modified double-stranded nucleic acids are also encompassed by the present invention.
- nucleic acid capable of expressing the nucleic acid according to any of the above (a) to (c) are all nucleic acids and can be administered to a living body after synthesis.
- a nucleic acid encoding the above nucleic acid may be introduced into a living body, and the above nucleic acids (a) to (c) may be expressed in cells.
- the RNA expressed in the cell will function as a CTBP1-AS. Can inhibit.
- a vector containing DNA encoding each strand of double-stranded RNA having an RNAi effect on CTBP1-AS may be introduced into the cell.
- the RNAi effect on CTBP1-AS is exerted by expressing and hybridizing each double strand in the cell.
- a vector containing DNA encoding single-stranded RNA in which each strand of double-stranded RNA is bound via a loop can also be used.
- the expressed single-stranded RNA forms a short hairpin RNA by hybridizing within the molecule, and the loop structure is cleaved by Dicer to become siRNA.
- a construct capable of expressing a target nucleic acid in a cell can be appropriately designed by a person skilled in the art and introduced into the cell.
- double-stranded nucleic acid having an RNAi effect on CTBP1-AS for example, in the base sequence of CTBP1-AS shown in SEQ ID NO: 1, positions 1804 to 1828 (SEQ ID NO: 3), Examples include those targeting the regions of positions 1894 to 1918 (SEQ ID NO: 4), 2348 to 2372 (SEQ ID NO: 5), and 3063 to 3087 (SEQ ID NO: 6).
- Double-stranded nucleic acids that target these include those in which any one is an RNA having a base sequence complementary to these targets and the other is an RNA having a base sequence complementary to it. .
- Such double-stranded nucleic acids include those shown in the following table.
- the double-stranded nucleic acid targeting the above four regions any one is an RNA having a 1-3 base mismatch with the target RNA, and the other is an RNA having a complementary base sequence.
- siRNA targeting the region shown in SEQ ID NO: 5 for example, siRNA [3]
- the double-stranded nucleic acid having an RNAi effect on CTBP1-AS includes those targeting the sequence represented by SEQ ID NOs: 24-52 in CTBP1-AS.
- double-stranded nucleic acids examples include double-stranded nucleic acids of RNA having a base sequence represented by SEQ ID NOs: 53 to 78 and RNA complementary to each.
- the nucleic acids No. 3, 4, 6, 10, 12, 18 and 24 are highly effective in suppressing the expression of CTBP1-AS.
- the pharmaceutical composition of the present invention contains the above-described cell growth inhibitor. Therefore, the pharmaceutical composition of the present invention exerts a growth inhibitory effect on cells when CTBP1-AS expression is enhanced, so that it can prevent AR-dependent cell growth or prevent diseases. It is particularly useful as a therapeutic agent. Examples of the disease involving AR-dependent cell proliferation include AR-dependent cancer (typically prostate cancer) and prostatic hypertrophy.
- the pharmaceutical composition of the present invention may contain a pharmaceutically acceptable carrier or additive.
- Such carriers include pharmaceutically acceptable organic solvents such as water, saline, phosphate buffer, dextrose, glycerol, ethanol, collagen, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, carboxyvinyl polymer, sodium carboxymethylcellulose, polyacrylic.
- pharmaceutically acceptable organic solvents such as water, saline, phosphate buffer, dextrose, glycerol, ethanol, collagen, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, carboxyvinyl polymer, sodium carboxymethylcellulose, polyacrylic.
- the pharmaceutical composition of the present invention can be in various forms such as a liquid (for example, injection), a dispersion, a suspension, a tablet, a pill, a powder, a suppository, and the like.
- a preferred embodiment is an injection, which is preferably administered parenterally (for example, intravenously, transdermally, intraperitoneally, intramuscularly).
- the pharmaceutical composition of the present invention contains a nucleic acid such as the above (a) to (c) as a cell growth inhibitor
- a nucleic acid such as the above (a) to (c) as a cell growth inhibitor
- it is formulated by encapsulating the nucleic acid in a carrier such as a liposome, polymer micelle, or cationic carrier.
- a carrier such as a liposome, polymer micelle, or cationic carrier.
- a nucleic acid carrier such as protamine may also be used. It is also preferable to target the affected area by binding an antibody or the like to these carriers. It is also possible to increase the retention in blood by binding cholesterol or the like to the nucleic acid.
- the cell growth inhibitor includes a nucleic acid encoding the nucleic acid according to any one of the above (a) to (c)
- the nucleic acid is used as a viral vector such as a retrovirus, adenovirus, or Sendai virus, or a liposome. And can be administered into cells.
- the method for preventing or treating prostate cancer according to the present invention is characterized by administering a therapeutically effective amount of the cytostatic agent of the present invention.
- a therapeutically effective amount refers to the amount of an agent by which one or more symptoms of the disease being treated are alleviated to some extent.
- at least one of reduced tumor size; inhibition of tumor metastasis (delayed or stopped); inhibition of tumor growth (delayed or stopped) and alleviation of one or more symptoms associated with cancer Means an amount.
- the cytostatic agent can be administered as the pharmaceutical composition described above.
- a first aspect of the method for screening a cell growth inhibitor according to the present invention comprises a step of contacting a test compound with a cell or cell extract expressing CTBP1-AS in the presence of androgen, and expression of CTBBP1-AS. Measuring the level, and selecting a test compound that decreases the expression level of CTBP1-AS as compared to the measurement in the absence of the test compound.
- the cell expressing CTBP1-AS is not particularly limited as long as it is a cell expressing CTBP1-AS.
- various human cancer cells can be used.
- prostate cancer cells such as LNCap cells
- cervical cancer cell line HeLa cell, kidney-derived cell line 293 cell, breast cancer cell line MCF7 cell and the like can also be used.
- Cells that do not sufficiently express CTBP1-AS can also be used as cells that express CTBP1-AS by introducing an expression vector containing DNA encoding CTBP1-AS.
- a cell extract can be used instead of the cells themselves.
- the cell extract can be prepared by a method known to those skilled in the art.
- test compound used in the screening method of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include organic compounds, inorganic compounds, nucleic acids (antisense nucleic acids, ribozymes, siRNA, RNA adapters, etc.), peptides, proteins (antibodies, etc.), sugars, etc. Is mentioned.
- the contact between the test compound and the cell or cell extract expressing CTBP1-AS can be performed, for example, by adding the test compound to a cell culture medium or cell extract.
- the test compound is a nucleic acid
- the test compound can be introduced into the cell by the cationic liposome method, electroporation method, microinjection method or the like.
- siRNA a commercially available transfection kit may be used according to the instructions. Since the expression of CTBP1-AS can be stably increased by contacting the test compound with the cell or cell extract in the presence of androgen, the effect of the test compound can be confirmed. For example, after contact with a test compound, androgen may be added to the cell culture medium or cell extract three days later.
- the step of measuring the expression level of CTBP1-AS can be performed using any method capable of measuring the expression level of mRNA.
- RNA can be collected from cells, and real-time PCR or Northern hybridization can be used. Can be analyzed. Since CTBP1-AS is a non-coding RNA, the expression level here is the expression at the RNA level.
- the androgen alone is added to the same cell or cell extract that was contacted with the test compound without adding the test compound. It means when the expression level is measured.
- the measured value in this case is compared with the measured value when brought into contact with the test compound, when the latter is significantly lower, the test compound has enhanced expression of CTBP1-AS. Selected as an inhibitor of cell growth.
- the second aspect of the method for screening a cell growth inhibitor according to the present invention comprises a step of contacting a test compound with a cell or cell extract expressing CTBP1 gene in the presence of androgen, and the expression level of CTBBP1 gene.
- the second embodiment uses a cell that expresses the CTBP1 gene, measures the expression level of the CTBP1 gene, and increases the expression level of the CTBP1 gene. The difference is that the test compound is selected.
- Examples of cells that express the CTBP1 gene include prostate cancer cells (LNCap cells and the like) and metastasized cancer cells.
- a cell that expresses the CTBP1 gene can also be prepared by introducing an expression vector containing a DNA encoding the CTBP1 gene into a cell that does not express the CTBP1 gene.
- a part of the CTBP1 gene may be expressed using not only the DNA encoding the full length of the CTBP1 gene but also a DNA encoding a part thereof. Since the CTBP1 gene encodes the CTBP1 protein, expression here includes both transcription and translation.
- the expression level of the CTBP1 gene can be measured by a person skilled in the art according to a method known in the art, both at the mRNA level and at the protein level.
- the mRNA level can be measured using Real-time PCR or Northern hybridization as in CTBP1-AS, for example.
- the measurement can also be performed by an electrophoresis method such as SDS-PAGE or a Western blotting method using an antibody against CTBP1 protein.
- an electrophoresis method such as SDS-PAGE or a Western blotting method using an antibody against CTBP1 protein.
- the screening method according to the present invention further comprises a step of administering a test compound to cells such as prostate cancer cells in which expression of CTBP1-AS is enhanced to conduct a cell proliferation assay (MTS assay), A step of administering to a cancer-bearing animal and confirming the effect on the growth of tumor cells may be included. Through these steps, the effect of the test compound can be further verified.
- a test compound to cells such as prostate cancer cells in which expression of CTBP1-AS is enhanced to conduct a cell proliferation assay (MTS assay)
- MTS assay cell proliferation assay
- the test method for determining the prognosis of prostate cancer comprises the steps of measuring the expression level of CTBP1-AS or CTBP1 gene in cells collected from the prostate of a patient, and comparing the expression level with the expression level in normal prostate cells And a step of performing.
- the present inventors show that the expression level of CTBP1-AS is significantly higher than that of normal cells and the expression level of CTBP1 gene is significantly higher than that of normal cells in prostate cancer cells and metastatic cancer cells of patients. Confirmed that it was low. It was also found that an increase in the expression level of CTBP1-AS or a decrease in the expression level of the CTBP1 gene has a correlation with the prognosis of prostate cancer patients.
- RNA Fish and fluorescent immunostaining An antisense CTBP1-AS probe for detecting CTBP1-AS was prepared using an RNA labeling kit (Roche) according to the instructions for use.
- RNA labeling kit (Roche) according to the instructions for use.
- LNCaP cells were cultured on cover glasses in 24-well culture vessels. 24 hours after androgen treatment, cells were washed with PBS, fixed in 3.6% formaldehyde and 10% acetic acid (in PBS) for 20 minutes at room temperature, and fixed in 0.5% Triton X-100 for 5 minutes at room temperature. The permeation treatment was performed by allowing to stand.
- RNA immunoprecipitation (RIP) Confluent LNCaP cells were collected in a 15 cm dish and resuspended in 1 ml NP40 lysis buffer (50 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% NP40). Antibodies against Sin3A, PSF, NONO or IgG (Santa cruz Biotechnology, Sigma, BD, Sigma, respectively) were added to the supernatant and rotated overnight at 4 ° C. 30 ⁇ L of protein G beads were added and incubated at 4 ° C. for 2 hours with gentle rotation. The beads were washed 3 times with Lysis buffer and resuspended in 1 ml ISOGEN. Co-precipitated RNA was isolated and the mRNA level of CTBP1-AS was analyzed by qRT-PCR.
- RNA of LNCaP cells was recovered with ISOGEN reagent (Nippon Gene).
- ISOGEN reagent Nippon Gene
- Gene chip human exon 1.0 ST array Affymetrix was used according to the instruction manual. Data analysis was performed using Affymetrix Microarray Suite software. The comparative array was normalized using data from all probe sets.
- ChIP and quantitative real-time PCR were performed according to a conventional method (Takayama K, et al. Oncogene 26, 4453-63 (2007)). After the protein and DNA were cross-linked by treatment with 1% formaldehyde for 5 minutes, the cells were collected, and a protein DNA extract was prepared and sonicated. After overnight reaction with specific antibody and non-specific IgG, protein DNA complex was recovered with protein A / G agarose. After washing, the reaction was reacted at 65 ° C overnight to decrosslink. DNA was recovered by ethanol precipitation.
- RNAi MAX reagent (Invitrogen) 48 to 72 hours before the experiment.
- the sequence of siRNA for CTBP1-AS is 5'-UUAUGUCUCCAGCAAGCUUGG.
- LNCaP cells (3 ⁇ 10 6 cells) or LTAD cells (1 ⁇ 10 7 cells) were injected subcutaneously into both sides of 20 5 week old male nude mice. Mice transplanted with LTAD cells were orchidectomized when the tumor volume reached 100 mm 3 . 5 ⁇ g of siRNA against CTBP1-AS or control siRNA was transfected into tumors 3 times a week using Lipofectamine RNAi MAX transfection Reagent. Tumor volume was determined according to the formula 0.5 ⁇ r1 ⁇ r2 ⁇ r3 (r1 ⁇ r2 ⁇ r3).
- Cell proliferation assay Cells were cultured at 3 ⁇ 10 3 cells / well in 96 well plates. A stable cell line of pcDNA3 CTBP1-AS was seeded in RPMI medium containing 1% FBS. For RNAi experiments, cells were transfected with stealth RNA 24 hours after transfer to the plate. The MTS assay was performed using cell titer reagent (Promega) according to the instruction manual. The experiment was repeated 5 times.
- LNCaP cells human prostate cancer cells
- RPMI medium containing 10% FBS, 50 units / ml penicillin, and 50 ⁇ g / ml streptomycin.
- Prior to androgen treatment cells were cultured for 48 to 72 hours in phenol red free medium containing 5% dextran charcoal stripped FBS.
- the antibodies used were Sin3A (AK-11), p53 (Pab-240), p21 (F-5), CyclinD1 (C-20), CyclinA (H-432), CyclinB1 (H-433) (Santa cruz Biotechnology ), CTBP1 (# 612042), NONO (# 611278) (BD bioscience), AcH3K9 (# 07-352) (Upstate), PSF (# 61045) (Novus Biologicals), SMAD3 (# 04-1035) (Millipore).
- Antibodies against AR, AcH3 and ⁇ -actin are described in a report by Takayama et al. (Takayama K, et al. Oncogene 26, 4453-63 (2007); Cancer Res. 69 (1): 137-42 (2009). ); Oncogene 30 (5): 619-30 (2011)).
- Dihydrotestosterone and Bicaltamide were purchased from Wako.
- LNCaP cells were incubated for 24 hours in phenol red free medium supplemented with 5% charcoal stripped FBS prior to transfection. Next, cells were transfected with pGL3 vector containing ARBS and tk-PRL using FuGENE6 reagent (Roche Diagnostics). 24 hours after transfection, luciferase activity was measured according to a conventional method. In the luciferase assay combined with RNAi, RNA transfection was performed 72 hours prior to androgen stimulation.
- Cell cycle analysis After transfection of siRNA to control siRNA or PSF, cells were harvested after 96 hours incubation. The cells were centrifuged, washed with PBS, and fixed by slowly adding 3 ml of ice-cold 70% ethanol while gently shaking. Stored at 4 ° C until use. On the day of cell cycle analysis, the cells were centrifuged, washed with PBS, resuspended at 10 6 cells / ml in PBS containing 100 ⁇ g / ml RNaseA (Takara), and incubated at 37 ° C. for 30 minutes. . To measure DNA content, 30,000 cells were analyzed by FACS Calibur flow cytometry using Cell Quest software (BD Biosciences).
- ChIP-chip analysis was performed at the whole genome level using antibodies of histone H3K9 / K14 acetylated in addition to AR, and AR binding site (ARBS) and histone H3 acetylated site (AcH3) was identified.
- ARBS AR binding site
- AcH3 histone H3 acetylated site
- CAGE CapAnalysis gene expression
- CTBP1-ASd contains a sequence encoding a 330 amino acid sequence. However, analysis using Pfam by the present inventors revealed that this amino acid sequence does not encode a protein motif. In addition, analysis using Netstart revealed that the first methionine is unlikely to function as a protein translation starting point. Furthermore, protein synthesis from CTBP1-ASd was not observed when the IVT method (invitro transcription method) was used (data not shown). These results indicate that CTBP1-ASd is a non-coding RNA that does not encode a protein motif.
- siRNA having RNAi effect on CTBP1-ASd RNAi effect on CTBP1-ASd
- stealth RNAi Invitrogen
- the sequence of siRNA was determined by the RNAi designer on the Invitrogen website.
- the sequence of the prepared siRNA is as follows. In the following examples, the siRNA [3] was administered to the siRNA administration group.
- double-stranded RNA (Stealth tm RNAi Negative Control Medium GC Duplex, Invitrogen 12935-300) that does not show RNAi effect against CTBP1-ASd was administered. .
- CTBP1-AS results of measuring the expression of CTBP1-AS are shown in FIG.
- the expression of CTBP1-AS was promoted in an androgen-dependent manner, whereas the expression of CTBP1-AS was suppressed in the siRNA-administered group depending on the siRNA concentration.
- expression induction by androgen was suppressed by 60-80%.
- luciferase assay In order to confirm the influence of CTBP1-AS on the transcriptional activity of AR, a luciferase assay was performed.
- the luciferase vector was prepared by inserting a promoter and enhancer of PSA (Prostate specific antigen), which is a typical androgen response gene, into the promoter region of pGL3-basic (Promega) (PSA-LUC).
- PSA-LUC has an AR binding site and a promoter is activated in response to androgen.
- LNCaP cells were spread and cultured at a density of 3 ⁇ 10 4 cells / well in a 24-well plate.
- FIG. 4A The result is shown in FIG. 4A.
- luciferase activity was remarkably increased, and administration of androgen increased AR transcriptional activity, indicating that the PSA promoter and enhancer were activated.
- siRNA administration group luciferase activity was significantly suppressed.
- the MTS assay is performed using PES (phenazine ethosulfate) via tetrazolium salt (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfophenyl) -2H-tetrazolium, This is a method for measuring the number of viable cells based on a reduction reaction in which inner salt (MTS) is converted into a formazan product that is a coloring substance. Cell proliferation ability was measured with a microplate reader at an absorbance of 490 nm. The results are shown in FIG. Compared with the control, the cell proliferation was significantly suppressed in the siRNA administration group, and it was found that CTBP1-AS promoted the proliferation of LNCaP cells.
- Gene silencer (Genlantis) was used for injection of siRNA into the tumor. 5 ⁇ g of siRNA was mixed with 5 ⁇ l of Gene silencer and OPTI-MEM, and injected locally into the mouse tumor. The control group was similarly administered with double-stranded RNA consisting of the following base sequences. AAGACGAUCGUUCGGGACAACAUAA (SEQ ID NO: 15) UUAUGUUGUCCCGAACGAUCGUCUU (SEQ ID NO: 16) The siRNA injection was carried out twice a week from 2 weeks after the cells were engrafted subcutaneously after transplantation of cancer cells into mice. Mouse tumor size was measured once a week.
- the major axis (r1) and minor axis (r2, r3) were measured at two locations, and the tumor size was determined according to the formula (r1 ⁇ r2 ⁇ r3) / 2.
- Mice were sacrificed 10 weeks after transplantation, and tumors were removed subcutaneously. Tumors were weighed and partly subjected to RNA extraction by ISOGEN. After cDNA synthesis, the expression levels of CTBP1-AS and CTBP1 RNA levels were measured by Real time-PCR. A part was dissolved in SDS lysis buffer (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 2% SDS, 10% mercaptoethanol) and subjected to protein extraction, and the expression level of CTBP1 was measured by Western blotting.
- FIGS. As shown in FIG. 6, compared to the control, tumor growth was significantly suppressed in the siRNA administration group (p value ⁇ 0.01). In addition, as shown in FIG. 7, it was observed that the increase in weight was also significantly suppressed in the siRNA-administered group in terms of tumor weight (p value ⁇ 0.001).
- FIG. 8 shows the results of measuring the expression level of CTBP1-AS and CTBP1 RNA levels in the tumor by Real time-PCR.
- the expression level of CTBP1-AS in the tumor in 4 mice was decreased by administration of RNAi against CTBP1-AS as compared to the control group.
- the expression level of CTBP1 was increased by administration of RNAi against CTBP1-AS as compared with the control group. From these results, it was revealed that CTBP1 is also negatively controlled by CTBP1-AS in in vivo.
- FIG. 9 shows the results of measuring the protein level expression level of CTBP1 in the tumor by Western blotting. Compared to the control group, the expression level of CTBP1 increased in the RNAi administration group even at the protein level. Based on the above results, the mechanism of CTBP1-suppression by CTBP1-AS is also functioning in tumor growth in vivo in tumor models, and suppression of tumor growth is promoted by suppressing CTBP1-AS as a target. confirmed.
- CTBP1-AS Expression profile data of prostate and prostate cancer cases using Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 array published by GEO Datasets of NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) (GSE3325) Downloaded. Focusing on the CTBP1-AS (AX747592) specific probe (1563571_at) in each sample of normal, cancer and metastasis, the signal amount was extracted. Mann-Whitney rank test was performed between each group, and the expression level was compared. The results are shown in FIG. The expression level of CTBP1-AS in cancer tissues of cancer and distant metastases was significantly higher than that of normal prostate (p value ⁇ 0.05, Mann-Whitney rank test). From these results, it is considered that CTBP1-AS is involved in carcinogenesis and malignant transformation of cancer.
- FIG. 11C Images of representative sections of normal prostate and prostate cancer are shown in FIG. 11C.
- the CTBP1 positive rate (LI: Labeling Index) in the nucleus was measured for each section, and the expression of CTBP1 protein in normal tissue and cancer tissue was quantified and compared. The results are shown in FIG. 11A. Compared with normal cells, the expression level of CTBP1 was decreased in prostate cancer cells.
- CTBP1 high expression group and low expression group were compared using data that followed the outpatient for 5 years every 3 months after surgery, and Kaplan by Long-rank test -Analyzed using the Meier method.
- the high expression group and the low expression group were classified based on the median value of the Labeling Index representing the expression of CTBP1.
- the results are shown in FIG. 11B.
- CTBP1 high expression group had significantly higher survival rate than low expression group. From the above results, it was confirmed that the mechanism of CTBP1 suppression by CTBP1-AS also functions in tumor growth of actual tumors.
- CTBP1-AS other than CTBP1-ASd RNA was collected 24 hours later. After 1 ⁇ g of RNA was treated with DNaseI ⁇ l (Roche, 10 U / ⁇ l), reverse transcription reaction was performed using RACE Kit (Roche). Next, PCR was performed using the primer from the transcription start point obtained by the CAGE method and the primer having the adapter-specific sequence at the end, and the resulting PCR product was obtained using TA Cloning Kit (Invitrogen). Inserted into the plasmid.
- 3'RACE primer and PCR adapter primer used are as follows.
- 3 'RACE primer 5'-GACCACGCGTATCGATGTCGACTTTTTTTTTTTTTTTTTTV-3' (SEQ ID NO: 21)
- PCR adaptor primer 5'-GACCACGCGTATCGATGTCGAC-3 '(SEQ ID NO: 22)
- CTBP1-ASd there are at least four types of CTBP1-AS shown in FIG.
- One of them was the CTBP1-ASd mentioned above.
- the base sequence of CTBP1-ASa is shown in SEQ ID NO: 19
- the base sequence of CTBP1-ASb is shown in SEQ ID NO: 18
- the base sequence of CTBP1-ASc is shown in SEQ ID NO: 17.
- These CTBP1-ASs all contain the siRNA target sequences described in the above table. Therefore, it is considered that the expression of these CTBP1-AS was also suppressed in the expression suppression experiment with siRNA in the above-mentioned Examples.
- a probe for detecting the region from position 1286 to position 3515 (SEQ ID NO: 23) of the RNA sequence shown in SEQ ID NO: 1 was prepared, and Northern blotting was performed. went.
- the probe was prepared according to the protocol using DIG Northern Starter Kit (Roche).
- LNCaP cells were stimulated with R1881 10 nM and RNA was collected at 0, 6, 12, 18, 24, and 48 hours.
- RNA (1 ⁇ g each) was run on an agarose gel containing formaldehyde and transferred to a membrane.
- the probe 100 ng / ml was hybridized to the membrane and detected using a DIG-specific antibody.
- RNA used in the experiment a probe for ⁇ -actin (Roche) was purchased at the same time and detected using the same membrane. The results are shown in FIG. A transcript with a length of about 5 kb was detected, suggesting that CTBP1-ASb is mainly expressed among the above four types of CTBP1-AS.
- ⁇ Localization of CTBP1-AS> LNCaP cells were treated with R1881 10 nM or Vehicle for 24 hours. Cells were collected, and nuclear RNA and cytoplasmic RNA were extracted using PARIS kit (Ambion). From each sample, 1 ⁇ g of RNA was run and the expression level was analyzed by Northern blot. As loading control, a probe against ⁇ -actin was hybridized and the expression level was measured. The expression level of each gene was corrected by GAPDH. The results are shown in FIG. CTBP1-AS was confirmed to be localized in the nucleus.
- RNA 1 ⁇ g was electrophoresed and transferred, and Northern blotting was performed using a probe for CTBP1-AS.
- FIGS. 15a and b The results are shown in FIGS. 15a and b.
- LTAD cells are cultured in an androgen-depleted state and become a hormone therapy resistant model. When androgen stimulation was performed on LNCaP cells, CTBP1 expression decreased to the same extent as in LTAD cells, and CTBP1-AS expression was significantly increased in LTAD cells.
- LNCaP cells were sprayed at 3 ⁇ 10 3 cells / well in 2.5% charcoal serum and phenol red free medium, and RNAi against CTBP1-AS was transfected the next day. Two days later, the cells were stimulated with Et or R1881, MTS assay was performed on Days 1, 3, and 5, and the proliferation ability was evaluated. Further, LTAD cells were sprayed at 3 ⁇ 10 3 cells / well in 2.5% charcoal serum and phenol red-free medium, and transfected with RNAi against CTBP1-AS the next day, and stimulated with Et or R1881 two days later.
- RNA binding protein PSF in CTBP1 expression suppression The expression of three kinds of genes, PSF, NONO, and Sin3A was suppressed by RNAi.
- LNCaP cells were transfected with siRNAs against PSF, NONO, and Sin3A, and Lysate was collected 2 days later and the expression level was verified by Western blotting. All siRNAs were confirmed to specifically suppress target expression.
- LNCaP cells were treated with ethanol or R1881 for 24 hours and transfected with control siRNA or siRNA against PSF 2 days before stimulation. RNA was collected, cDNA was synthesized, and the expression level of CTBP1 was analyzed by RT-PCR. The result is shown in FIG.
- PSF is an RNA-binding transcription repressor. Therefore, the presence or absence of binding between PSF and CTBP1-AS was analyzed.
- LNCaP cells were treated with ethanol or R1881 for 24 hours and transfected with control siRNA or siRNA against PSF 2 days before stimulation. After extracting the nuclear fraction and recovering Lysate, immunoprecipitation was performed using specific antibodies against Norman IgG PSF and NONO. Immunoprecipitation was performed using Protein G, and after washing, RNA was extracted using Isogen.
- a reverse transcription reaction was performed from the total RNA, and the expression levels of GAPDH, Myoglobin (MG), and CTBP1-AS were measured by real-time RT-PCR. The results are shown in FIG. CTBP1-AS was confirmed to bind to PSF in an androgen-dependent manner.
- RNA FISH RNA FISH
- the localization of PSF and CTBP1-AS in the nucleus was analyzed. After ethanol or R1881 was added to LNCaP cells and reacted for 24 hours, RNA FISH was performed on CTBP1-AS. After fixation with formalin and methanol, the reaction was allowed to proceed overnight at 42 ° C. using a probe against DIG-labeled CTBP1-AS and bound. The next day, a fluorescently labeled antibody against DIG was bound, washed, and then immunostained with an anti-PSF antibody. Detection was carried out by reacting a secondary antibody against a mouse antibody. Nuclei were stained with DAPI. The results are shown in FIG. The localization of PSF and CTBP1-AS was almost the same, suggesting that they were bound.
- LNCaP cells, LTAD cells, and BicR cells were transfected with control siRNA or siRNA for PSF, and the cells were collected 96 hours later.
- the cell cycle was analyzed by FACS.
- the change in the proportion of cell fraction in S phase is shown in FIG. 20b.
- PSF was knocked down
- the proportion of S phase in which DNA was synthesized decreased, and the cell cycle tended to be delayed.
- the same experiment as in FIG. 20a was performed by knocking down CTBP1-AS instead of PSF, and the types of genes for which suppression by androgen was released were compared. The result is shown in FIG. 20c.
- SMAD3 and p53 were decreased at both the mRNA level and the protein level by androgen stimulation, but when the expression of PSF was suppressed, the suppression of the expression by androgen tended to be released. This suggests that SMAD3 and p53 are not easily affected by androgen without PSF, that is, suppression of expression of SMAD3 and p53 by androgen is mediated by PSF.
- LTAD cells which are hormone depletion-resistant prostate cancer cells
- LTAD cells which are hormone depletion-resistant prostate cancer cells
- testicular extraction was performed and siRNA against control siRNA or CTBP1-AS was locally administered.
- the tumor was removed, the protein was collected, and the expression level of the cell cycle-related gene product was analyzed by Western blotting.
- FIG. 23 shows a schematic diagram of the gene expression control mechanism by CTBP1-AS and PSF suggested from the above results.
- CTBP1-AS when the transcription of CTBP1-AS increases locally (in the right frame in the figure), the complex of CTBP1-AS and PSF and histone deacetylase (HDAC) bind and repress the transcription of CTBP1.
- HDAC histone deacetylase
- SEQ ID NO: 1 is a nucleotide sequence of one embodiment of CTBP1-AS.
- SEQ ID NO: 2 is the base sequence of AX747592.
- SEQ ID NO: 3 is the base sequence of the target region of siRNA that inhibits the function of CTBP1-AS.
- SEQ ID NO: 4 is the base sequence of the target region of siRNA that inhibits the function of CTBP1-AS.
- SEQ ID NO: 5 is the base sequence of the target region of siRNA that inhibits the function of CTBP1-AS.
- SEQ ID NO: 6 is the base sequence of the region that is the target of siRNA that inhibits the function of CTBP1-AS.
- SEQ ID NO: 7 is the base sequence of RNA constituting siRNA that inhibits the function of CTBP1-AS.
- SEQ ID NO: 8 is the base sequence of RNA constituting siRNA that inhibits the function of CTBP1-AS.
- SEQ ID NO: 9 is the base sequence of RNA constituting siRNA that inhibits the function of CTBP1-AS.
- SEQ ID NO: 10 is the base sequence of RNA that constitutes the siRNA that inhibits the function of CTBP1-AS.
- SEQ ID NO: 11 is the base sequence of RNA constituting siRNA that inhibits the function of CTBP1-AS.
- SEQ ID NO: 12 is the nucleotide sequence of RNA constituting siRNA that inhibits the function of CTBP1-AS.
- SEQ ID NO: 13 is the base sequence of RNA constituting siRNA that inhibits the function of CTBP1-AS.
- SEQ ID NO: 14 is the base sequence of RNA constituting siRNA that inhibits the function of CTBP1-AS.
- SEQ ID NO: 15 is the base sequence of RNA constituting siRNA used as a control in siRNA in the examples.
- SEQ ID NO: 16 is the base sequence of RNA constituting siRNA used as a control in siRNA in the examples.
- SEQ ID NO: 17 is the base sequence of CTBP1-ASc.
- SEQ ID NO: 18 is the base sequence of CTBP1-ASb.
- SEQ ID NO: 19 is the base sequence of CTBP1-ASa.
- SEQ ID NO: 20 is the base sequence of CTBP1-ASd.
- SEQ ID NO: 21 is the base sequence of 3 ′ Race primer used for 3 ′ RACE PCR.
- SEQ ID NO: 22 is the base sequence of the PCR adaptor primer used for 3 ′ RACE PCR.
- SEQ ID NO: 23 is the base sequence of the probe used for Northern blotting of RNA derived from LNCaP cells.
- SEQ ID NOs: 24-52 are the nucleotide sequences of regions targeted by siRNA that inhibit the function of CTBP1-AS.
- SEQ ID NOs: 53 to 104 are base sequences of RNA constituting siRNA that inhibits the function of CTBP1-AS.
- SEQ ID NOs: 105 to 108 are base sequences of primers used for real-time PCR.
- SEQ ID NOs: 109 to 118 are base sequences of primers used for real-time RT-PCR.
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Abstract
Description
しかしながら、特に再燃した前立腺癌に対しては、ARの機能や発現を阻害する方法にも限界があり、臨床的に十分な方法は未だ開発されていない。
その結果、核内でコリプレッサーとして機能することが知られるCTBP1タンパク質が、ARの転写抑制因子として機能することを見出した。そして、CTBP1について研究を進めるなかで、CTBP1遺伝子のAR結合部位付近のセンスDNAの転写産物、即ち、CTBP1遺伝子のAR結合部位付近のアンチセンスRNAが、アンドロゲンによって強く誘導されることを見出した。
そこで、RNAi法によって当該アンチセンスRNAの機能を抑制すると、CTBP1の発現がmRNAレベル、タンパク質レベルのいずれにおいても上昇する一方で、ARの転写活性は抑制され、前立腺癌細胞の増殖も抑制されることを確認した。
また、当該アンチセンスRNAの発現量は、正常な前立腺に比較して、前立腺癌及びその転移癌細胞において有意に高く、CTBP1の発現量は、正常な前立腺に比較して、前立腺癌及びその転移癌細胞において有意に低いことを確認した。
ヌードマウスの前立腺癌細胞移植モデルにおいても、当該アンチセンスRNAがCTBP1を負に制御していること、当該アンチセンスRNAに対するRNAi効果を有する二本鎖RNAを投与すると、前立腺癌の増殖が抑制されることを確認した。
さらに、CTBP1-ASを抑制することによって前立腺癌の増殖が抑制されるメカニズムについて、RNA結合性転写抑制因子であるPSFがCTBP1-ASと結合し、この複合体が細胞周期を抑制する遺伝子の転写を抑制することによって、細胞増殖を促進すること;同複合体がCTBP1の発現を抑制する結果、ARによる転写活性化を促進すること;従って、CTBP1-ASの発現を抑制すれば、細胞増殖を抑制し、ARの活性化を抑制すること、を見出し、本発明を完成するに至った。
〔1〕(i)配列番号:1に示される塩基配列の部分配列を含むCTBP1遺伝子のアンチセンスRNA
(ii)配列番号:5に示される塩基配列を含むCTBP1遺伝子のアンチセンスRNA、及び
(iii)前記(i)又は(ii)に記載のアンチセンスRNAの変異体、バリアント、又は、前記(i)及び(ii)に記載のアンチセンスRNAにおいて1又は数個の塩基が欠失、付加若しくは置換されているアンチセンスRNA
のいずれかのアンチセンスRNA(以下、「CTBP1-AS」という。)が発現している細胞の増殖抑制剤であって、
CTBP1-ASの発現阻害物質又は機能阻害物質を有効成分として含む、細胞増殖抑制剤;
〔2〕前記CTBP1-ASが、配列番号17~20のいずれかに記載の塩基配列からなるアンチセンスRNAである、請求項1に記載の細胞増殖抑制剤;
〔3〕前記発現阻害物質又は機能阻害物質が、以下の(a)~(d)からなる群より選択される化合物である、上記〔1〕又は〔2〕に記載の細胞増殖抑制剤、
(a)CTBP1-AS又はその一部に対するアンチセンス核酸
(b)CTBP1-ASを特異的に切断するリボザイム活性を有する核酸
(c)CTBP1-ASに対してRNAi効果を有する二本鎖核酸
(d)(a)乃至(c)のいずれかに記載の核酸をコードする核酸;
〔4〕前記発現阻害物質又は機能阻害物質が、CTBP1-ASに対してRNAi効果を有する二本鎖RNAであって、該二本鎖RNAの一方が、CTBP1-ASにおける連続した19~30塩基の部分に相補的な配列からなる、上記〔3〕に記載の細胞増殖抑制剤;
〔5〕前記発現阻害物質又は機能阻害物質が、CTBP1-ASに対してRNAi効果を有する二本鎖RNAであって、該二本鎖RNAの一方が、配列番号:3~6及び24~52のいずれかに示される塩基配列に相補的な塩基配列からなる、上記〔3〕に記載の細胞増殖抑制剤;
〔6〕前記CTBP1-ASが発現している細胞が、前立腺癌細胞及び/又はその転移癌細胞である、上記〔1〕から〔5〕のいずれか1項に記載の細胞増殖抑制剤;
〔7〕上記〔1〕から〔6〕のいずれか1項に記載の細胞増殖抑制剤を含む医薬組成物;
〔8〕上記〔1〕から〔6〕のいずれか1項に記載の細胞増殖抑制剤を治療有効量投与することを含む、前立腺癌の予防又は治療方法;
〔9〕CTBP1-ASが発現している細胞の増殖抑制剤のスクリーニング方法であって:CTBP1-ASが発現している細胞又はその細胞抽出液と被検化合物とを、アンドロゲン存在下で接触させる工程と;CTBP1-ASの発現レベルを測定する工程と;被検化合物の非存在下で測定した場合と比較して、CTBP1-ASの発現レベルを低下させる被検化合物を選択する工程と、を含む方法;
〔10〕CTBP1-ASが発現している細胞の増殖抑制剤のスクリーニング方法であって:CTBP1遺伝子が発現している細胞又はその細胞抽出液と被検化合物とを、アンドロゲン存在下で接触させる工程と;前記CTBP1遺伝子の発現レベルを測定する工程と;被検化合物の非存在下で測定した場合と比較して、前記CTBP1遺伝子の発現レベルを上昇させる被検化合物を選択する工程と、を含む方法;
〔11〕前記CTBP1-ASが発現している細胞が、前立腺癌細胞及び/又はその転移癌細胞である、上記〔9〕又は〔10〕に記載の方法;
〔12〕前立腺癌の予後を判定する検査方法であって:患者の前立腺から採取した細胞におけるCTBP1-ASの発現レベルを測定する工程と;前記発現レベルを正常な前立腺細胞における発現レベルと比較する工程と、を含む方法;及び
〔13〕前立腺癌の予後を判定する検査方法であって:患者の前立腺から採取した細胞におけるCTBP1遺伝子の発現レベルを測定する工程と;前記発現レベルを正常な前立腺細胞における発現レベルと比較する工程と、を含む方法、
に、関する。
本発明の細胞増殖抑制剤は、CTBP1-ASの発現又は機能を阻害することによってARの下流シグナルの転写活性を抑制するので、ARの変異や増幅によってARのシグナルが活性化されているアンドロゲン非依存性癌に対しても有効であるものと考えられる。
本発明の細胞増殖抑制剤として、CTBP1-ASに対するRNAi効果を有する二本鎖核酸を用いれば、標的選択制が高く、細胞が本来持っている機構を利用するので安全性も高い。
本発明に係る細胞増殖抑制剤は、CTBP1-ASが発現している細胞の増殖を抑制することを特徴とし、CTBP1-ASの発現阻害物質又は機能阻害物質を有効成分として含む。
(i)配列番号:1に示される塩基配列の部分配列を含むCTBP1遺伝子のアンチセンスRNA、及び
(ii)配列番号:5に示される塩基配列を含むCTBP1遺伝子のアンチセンスRNA、及び
(iii)前記(i)又は(ii)に記載のアンチセンスRNAの変異体、バリアント、又は、前記(i)又は(ii)に記載のアンチセンスRNAにおいて1又は数個の塩基が欠失、付加若しくは置換されているアンチセンスRNA
なお、アンチセンスRNAとは、遺伝子の二本鎖DNAのうちセンス鎖(センスDNA)を鋳型として作られる転写産物を意味する。
配列番号:1に示される塩基配列からなるCTBP1遺伝子のアンチセンスRNAは、そのcDNAがAccession Number: AX747592(配列番号:2)として知られるものであり、CTBP1遺伝子のAR結合部位付近のセンスDNAの転写産物である。
配列番号:1に示される塩基配列の部分配列を含むCTBP1遺伝子のアンチセンスRNAとしては、
配列番号:1に示される塩基配列の一部の塩基配列のみからなるアンチセンスRNA;
配列番号:1に示される塩基配列の5’末端を含む部分配列を含み、さらにその5’末端に1以上の塩基が結合しているアンチセンスRNA;及び、
配列番号:1に示される塩基配列の3’末端を含む部分配列を含み、さらにその3’末端に1以上の塩基が結合しているアンチセンスRNA、が挙げられる。
配列番号:1に示される塩基配列の部分配列を含む限り、生体内で発現しているアンチセンスRNAは、すべて(i)のアンチセンスRNAに該当するが、本発明の細胞増殖抑制剤の標的としては、配列番号:1に示される塩基配列の3’末端を含む部分配列からなるアンチセンスRNA、及び、配列番号:1に示される塩基配列の3’末端を含む部分配列を含み、さらにその3’末端に1以上の塩基が結合しているアンチセンスRNAが特に好ましい。ここで、「配列番号:1に示される塩基配列の3’末端を含む部分配列」としては、例えば、配列番号:1に記載の塩基配列の1300位から3’末端までの部分配列、1200位から3’末端までの部分配列、800位から3’末端までの部分配列、等が挙げられるがこれらに限定されない。
配列番号:5に示される塩基配列を含むCTBP1遺伝子のアンチセンスRNAとしては、配列番号:5に記載の塩基配列のみからなるアンチセンスRNA、及び、配列番号:5に記載の塩基配列の3’末端及び/又は5’末端に1以上の塩基が結合しているアンチセンスRNA、が挙げられる。
配列番号:5に示される塩基配列は、配列番号:1に記載の塩基配列の2348位~2372位に相当する。3’末端及び/又は5’末端に結合する塩基の数は特に限定されない。本発明者らは、後述する実施例に示すとおり、この領域を標的とするsiRNAを投与すると、ARの転写活性が抑制され、前立腺癌細胞の増殖も抑制されることを確認した。従って、配列番号:5に示される塩基配列を含むCTBP1-ASの発現阻害物質又は機能阻害物質が、本発明の細胞増殖抑制剤の有効成分として好適であることは明らかである。
(ii)のアンチセンスRNAの例として、配列番号:23に記載の塩基配列を含むアンチセンスRNAも好ましい。
(i)又は(ii)に記載のアンチセンスRNAの変異体又はバリアントとしては、例えば、5’オルタナティブスプライシングや3’オルタナティブスプライシングなどのスプライシングバリアントを含む各種のバリアント、一塩基多型(SNP)やコピー数多型(CNV)などの多型、突然変異体(例えば癌による突然変異体)が挙げられる。
これらの変異体やバリアントも、CTBP1遺伝子のAR結合部位付近のセンスDNAの転写産物として発現し得るものであり、本発明に係る細胞増殖抑制剤の標的となり得る。
(i)又は(ii)に記載のアンチセンスRNAにおいて1又は数個の塩基が欠失、付加若しくは置換されているアンチセンスRNAで、欠失等する塩基の数は、それがCTBP1遺伝子のAR結合部位付近のセンスDNAの転写産物である限り特に限定されないが、1~10個、好ましくは1~5個、より好ましくは1~3個程度、あるいは全体の長さの10%以内、好ましくは5%以内、より好ましくは1%以内である。欠失等する塩基の場所も特に限定されず、それぞれのアンチセンスRNAの5’末端又は3’末端であってもよく、末端以外の塩基であってもよい。また、複数個所において欠失、付加及び/又は置換されていてもよい。
このようなアンチセンスRNAも、CTBP1遺伝子のAR結合部位付近のセンスDNAの転写産物として発現し得るものであり、本発明に係る細胞増殖抑制剤の標的となり得る。
配列番号:17に記載の塩基配列からなるRNAは、配列番号:1に記載の塩基配列の698位から3’末端を含み、さらに3’末端に522塩基のRNAが結合した、全長3710塩基のRNAである(以下、「CTBP1-ASc」と呼ぶ。)。
配列番号:18に記載の塩基配列からなるRNAは、配列番号:1に記載の塩基配列の698位から3’末端を含み、さらに3’末端に1853塩基のRNAが結合した、全長5041塩基のRNAである(以下、「CTBP1-ASb」と呼ぶ。)。
配列番号:19に記載の塩基配列からなるRNAは、配列番号:1に記載の塩基配列の698位から3’末端を含み、さらに3’末端に12568塩基のRNAが結合した、全長15756塩基のRNAである(以下、「CTBP1-ASa」と呼ぶ。)。
配列番号:20に記載の塩基配列からなるRNAは、配列番号:1に記載の塩基配列の697位から3’末端までに相当する全長3189塩基のRNAである(以下、「CTBP1-ASd」と呼ぶ。)。
これらのいずれのアンチセンスRNAも、CTBP1遺伝子のAR結合部位付近のセンスDNAの転写産物として発現していることが確認されたものであり、本発明に係る細胞増殖抑制剤の標的となり得る。
後述する実施例に示されるとおり、CTBP1-ASは、RNA結合性の転写抑制因子であるPSFと結合して複合体を形成すると、細胞周期を抑制する遺伝子(例えばSMAD3、p53)の転写を抑制する。その結果、細胞増殖が促進される。
一方、CTBP1-ASとPSFの複合体は、ヒストン脱アセチル化酵素と協調して、CTBP1の転写も抑制する。本来、CTBP1はアンドロゲン受容体の転写を抑制する機能を有しているので、CTBP1の転写が抑制されることでアンドロゲン受容体による転写活性化が亢進する。その結果、細胞増殖につながる。
従って、CTBP1-ASの発現を抑制すると、後述する実施例に示されるとおり、アンドロゲン抵抗性癌細胞においてもその増殖を抑制することができる。
なお、本明細書において、細胞の増殖を抑制するとは、細胞の増殖を停止又は遅延させることを意味する。
(a)CTBP1-AS若しくはその一部に対するアンチセンス核酸
(b)CTBP1-ASを特異的に切断するリボザイム活性を有する核酸
(c)CTBP1-ASに対してRNAi効果を有する二本鎖核酸
(d)上記(a)乃至(c)のいずれかに記載の核酸を発現し得る核酸
アンチセンス核酸法は、発現阻害方法としてよく知られている。標的遺伝子(基本的には転写産物であるmRNA)に相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸(アンチセンス核酸)を細胞内に導入し、当該標的遺伝子にハイブリダイズさせることによって遺伝子の発現を阻害する方法である。
本発明で用いられるアンチセンス核酸は、CTBP1-ASの一部に相補的な配列であることが好ましいが、完全に相補的でなくてもよい。例えば、アンチセンス核酸の90%以上、好ましくは95%以上、より好ましくは98%以上がCTBP1-ASの一部に相補性を有する。アンチセンス核酸の長さは、CTBP1-ASの機能阻害効果が得られる限り特に限定されないが、一般的には10塩基長~100塩基長、好ましくは15~30塩基長である。
アンチセンス核酸は、CTBP1-ASの塩基配列に基づき、公知のソフトウェア等を用いて当業者が適宜設計し、合成することができる。なお、アンチセンス核酸はDNA、RNA、DNA及びRNAを含むキメラ核酸のいずれであってもよく、また、修飾されていてもよい。修飾された核酸としては、例えば、リン酸エステル基をチオリン酸エステル基又はメチルホスホネート基で置換したもの等が挙げられる。
CTBP1-ASの機能阻害物質としては、CTBP1-ASを特異的に切断するリボザイム活性を有する核酸も挙げられる。リボザイムは、標的RNAを触媒的に加水分解する核酸分子であり、標的RNAと相補的な配列を有するアンチセンス領域と、切断反応を担う触媒中心領域から構成されている(例えば、Ribozyme: Biochemistry and Biotechnology (Krupp, G. & Gaur, R. K. eds: Eaton Publishing, MA, 2000)。CTBP1-ASを特異的に切断するリボザイムも、当業者が公知の方法に従って適宜設計することができる。リボザイムは一般的にはRNA分子であるが、DNA-RNAキメラ型分子を用いることもできる。
CTBP1-ASの機能阻害物質としては、CTBP1-ASに対してRNAi効果を有する二本鎖核酸も好ましい。RNAiは、二本鎖核酸によって誘導される配列特異的な遺伝子発現抑制機構である。標的特異性が非常に高く、生体内にもともと存在する遺伝子発現抑制メカニズムを利用する方法なので安全性が高い。
RNAiによる標的RNA分子の切断は、まず、siRNAがArgonauteと呼ばれるタンパク質による片側鎖切断又はRNAヘリカーゼによる巻き戻しによって一本鎖化され、Argonauteと結合して作動複合体であるRISC(RNA induced silencing complex)を形成する。RISC内では、siRNAは標的RNAを探索するガイド分子として働き、Argonauteは標的RNAを切断するRNA分解酵素(Slicer)として機能する。
RNAi効果を有する二本鎖核酸は、二本鎖RNAであってもよいし、DNA-RNAキメラ型二本鎖核酸であってもよく、人工核酸を含んでいてもよい。キメラ型はRNAi効果を有する二本鎖RNAの一部をDNAに換えたものであり血清中での安定性が高く、免疫応答誘導性が低いことが知られている。
また、上記二本鎖核酸は、2’-OH基の修飾、バックボーンのホスホロチオエートによる置換やボラノホスフェート基による修飾、リボースの2位と4位が架橋されたLNA(locked nucleic acid)の導入などによって、ヌクレアーゼに対する耐性や安定化を高めることもでき、このような修飾された二本鎖核酸も本発明に包含される。
上記(a)~(c)はいずれも核酸であり、合成後に生体に投与することもできるが、これらの核酸をコードする核酸を生体内に導入し、細胞内で上記(a)~(c)の核酸を発現するように構成してもよい。
例えば、転写によってアンチセンス核酸を発現しうるDNA、又は転写によってリボザイム活性を有する核酸を発現しうるDNAを含むベクターを細胞内に導入すれば、細胞内で発現したRNAがCTBP1-ASの機能を阻害しうる。
また、CTBP1-ASに対してRNAi効果を有する二本鎖RNAの各鎖をコードするDNAを含むベクターを細胞内に導入すればよい。細胞内で二本鎖がそれぞれ発現しハイブリダイズすることによって、CTBP1-ASに対するRNAi効果が発揮される。また、RNAi効果を有する二本鎖RNAを発現させるために、二本鎖RNAの各鎖がループを介して結合した一本鎖RNAをコードするDNAを含むベクターを用いることもできる。発現した一本鎖RNAは分子内でハイブリダイズしてshort hairpin RNAを構成し、Dicerによってループ構造部分が切断され、siRNAとなる。
このように、目的の核酸を細胞内で発現させることができるコンストラクトは、当業者が適宜設計し、細胞内に導入することが可能である。
これらを標的とする二本鎖核酸は、いずれか一本がこれらの標的と相補的な塩基配列を有するRNAであり、もう一本がそれに相補的な塩基配列を有するRNAであるものが挙げられる。このような、二本鎖核酸としては以下の表に示すものがある。
CTBP1-ASの機能阻害物質又は発現阻害物質としては、配列番号:5に示される領域を標的とするsiRNA(例えば、siRNA[3])が特に好ましい。
また、(c)CTBP1-ASに対してRNAi効果を有する二本鎖核酸としては、CTBP1-ASにおける配列番号:24~52で表される配列を標的とするものも挙げられる。かかる二本鎖核酸としては、配列番号:53~78で表される塩基配列からなるRNAと、それぞれに相補的なRNAとの二本鎖核酸が挙げられる。中でも、No.3、4、6、10、12、18及び24の核酸はCTBP1-ASの発現を抑制する効果が高い。
本発明の医薬組成物は、上述した本発明に係る細胞増殖抑制剤を含む。従って、本発明の医薬組成物は、CTBP1-ASの発現が亢進している細胞に投与すると当該細胞に対して増殖抑制効果を発揮するので、AR依存的な細胞増殖が関与する疾患の予防又は治療薬として特に有用である。AR依存的な細胞増殖が関与する疾患としては、例えば、AR依存的な癌(典型的には前立腺癌)や前立腺肥大症が挙げられる。
本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される担体や添加物を含んでいてもよい。かかる担体としては、例えば、水、食塩水、リン酸緩衝液、デキストロース、グリセロール、エタノール等薬学的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ぺクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、界面活性剤、賦形剤、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられるがこれらに限定されない。
本発明に係る前立腺癌の予防又は治療方法は、本発明の細胞増殖抑制剤を治療有効量投与することを特徴とする。
本明細書において、治療有効量とは、治療する疾患の一つ又は複数の症状が、それによりある程度緩和される作用物質の量を意味する。従って前立腺癌の場合、腫瘍サイズの低下;腫瘍の転移の阻害(遅延又は停止);腫瘍増殖の阻害(遅延又は停止)、及び癌と関連する一つ又は複数の症状の緩和、の少なくとも1つを示す量を意味する。細胞増殖抑制剤は、上述した医薬組成物として投与することができる。
本発明に係る細胞増殖抑制剤のスクリーニング方法の第一の態様は、CTBP1-ASを発現する細胞又は細胞抽出液と被検化合物とを、アンドロゲン存在下で接触させる工程と、CTBBP1-ASの発現レベルを測定する工程と、被検化合物の非存在下で測定した場合と比較して、CTBP1-ASの発現レベルを低下させる被検化合物を選択する工程と、を含む。
本発明のスクリーニング方法では、細胞自体ではなく、細胞抽出液を用いることもできる。細胞抽出液は、当業者が公知の方法によって調製することが可能である。
また、被検化合物が核酸の場合は、カチオニック・リポソーム法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法などによって細胞内に被検化合物を導入することができる。被検化合物がsiRNAの場合は、市販のトランスフェクションキットを用い、指示書に従って行ってもよい。
被検化合物と細胞又は細胞抽出液との接触をアンドロゲン存在下で行うことにより、CTBP1-ASの発現を安定的に上昇させられるので、被検化合物の効果を確認することができる。例えば、被検化合物と接触させた後、3日後に細胞の培地や細胞抽出液にアンドロゲンを添加するとよい。
CTBP1-ASの発現レベルを測定する工程は、mRNAの発現量を測定可能なあらゆる方法を用いて行うことができるが、例えば、細胞からRNAを回収し、Real-time PCRやノーザンハイブリダイゼーション法によって解析することができる。なお、CTBP1-ASはノンコーディングRNAであるため、ここでいう発現レベルとはRNAレベルでの発現である。
被検化合物の非存在下で測定した場合とは、被検化合物を接触させたのと同じ細胞又は細胞抽出液に、被検化合物を添加せずにアンドロゲンのみを添加して、CTBP1-ASの発現レベルを測定した場合を意味する。この場合の測定値と、被検化合物と接触させた場合の測定値とを比較して、後者のほうが有意に低い値であった場合、当該被検化合物は、CTBP1-ASの発現が亢進している細胞の増殖抑制剤として選択される。
第二の態様は、第一の態様と比較して、CTBP1遺伝子を発現している細胞を使用する点と、CTBP1遺伝子の発現レベルを測定する点、及び、CTBP1遺伝子の発現レベルを上昇させる被検化合物を選択する点が異なる。
上述のとおり、CTBP1-ASの発現又は機能を阻害することにより、CTBP1タンパク質の発現は上昇し、ARの転写活性は抑制され、CTBP1-ASの発現が亢進している細胞の増殖も抑制される。従って、被検化合物の非存在下で測定した場合と比較して、CTBP1遺伝子の発現レベルを上昇させる被検化合物を選択すれば、CTBP1-ASの発現が亢進している細胞に対する増殖抑制剤を得ることができる。
本発明の前立腺癌の予後を判定する検査方法は、患者の前立腺から採取した細胞におけるCTBP1-AS又はCTBP1遺伝子の発現レベルを測定する工程と、その発現レベルを正常な前立腺細胞における発現レベルと比較する工程と、を含む。
本発明者らは、患者の前立腺癌細胞及びその転移癌細胞においては、CTBP1-ASの発現量が正常細胞に比較して有意に高く、CTBP1遺伝子の発現量が正常細胞に比較して有意に低いことを確認した。また、CTBP1-ASの発現量の上昇、又は、CTBP1遺伝子の発現量の減少が、前立腺癌患者の予後と相関関係を有することを見出した。
従って、本発明の検査方法による検査の結果、CTBP1-ASの発現が正常細胞に比較して有意に高い場合、予後は不良となる可能性が高いものと予測することができ、CTBP1の発現が正常細胞に比較して有意に低い場合、予後は良好となる可能性が高いものと予測することができる。
以下の実施例において使用された方法を説明する。
[RNA Fishならびに蛍光免疫染色]
CTBP1-ASを検出するためのアンチセンスCTBP1-ASプローブは、RNA labeling kit(Roche社)を用い、その使用説明書に従って作製した。colocalization studyのために、LNCaP細胞は、24ウェルの培養容器においてカバーグラス上で培養した。アンドロゲン処理から24時間後に、PBSで細胞を洗浄し、3.6%ホルムアルデヒドと10%酢酸(in PBS)中に20分室温で静置して固定し、0.5%Triton X-100中に5分室温で静置して透過処理を行った。PBS洗浄後、プローブとハイブリダイズさせた(湿室で42℃、一晩)。Alexa555を結合させたロバ抗DIG抗体で検出した。次に内因性PSFは、ウサギ抗PSF抗体と4℃で一晩反応させた後、Alexa488を結合させた抗ウサギIgG抗体で検出した。共焦点顕微鏡で撮像した。
15cmディッシュでコンフルエントなLNCaP細胞を回収し、1mlのNP40 lysis buffer(50mM Tris pH8.0、150mM NaCl、1%NP40)に再懸濁した。Sin3A、PSF、NONOに対する抗体又はIgG(それぞれ、Santa cruz Biotechnology社、Sigma社、BD社、Sigma社)を上清に加え、4℃で一晩回転させた。30μLのプロテインGビーズを加え、4℃で2時間、穏やかに回転させながらインキュベートした。Lysis bufferを用いてビーズを3回洗浄し、1mlのISOGENに再懸濁した。共沈したRNAを単離し、CTBP1-ASのmRNAレベルをqRT-PCRで解析した。
アンチセンスCTBP1-ASプローブの調製と、それに続くノーザンブロッティングによる解析は、Northern blot starter kit(Roche社)を用い、使用説明書に従って行った。1μgのトータルRNAを変性させ、ホルムアルデヒド含有アガロースゲル(1×MOPS buffer中)にローディングした。RNAをHybond-XL membrane(Roche社)に移し、DIGで標識した、CTBP1-ASの中央部にわたるRNAプローブで検出した。
LNCaP細胞のトータルRNAをISOGEN試薬(Nippon Gene社)で回収した。発現解析マイクロアレイとして、Gene chip human exon 1.0 ST array(Affymetrix社)を使用説明書に従って用いた。データ解析は、Affymetrix Microarray Suite softwareを用いて行った。比較用アレイについては、すべてのプローブセットからのデータを用いて標準化した。
ChIPは常法に従って行った(Takayama K, et al. Oncogene 26, 4453-63 (2007))。1%ホルムアルデヒド5分間処理により蛋白、DNA架橋を行った後、細胞を回収し蛋白DNA抽出液を作成し超音波処理を行った。特異抗体および非特異的IgGにより一晩反応させた後、protein A/G アガロースにより蛋白DNA複合体を回収した。洗浄した後、65度一晩反応させ脱架橋した。DNAはエタノール沈殿により回収した。IgGコントロールに対するFold enrichmentは、SYBR green I fluorescenceを用いて、SYBR green PCR master mix(Applied Biosystems社)と、ABI Prism 7000 system(Applied Biosystems社)とにより、リアルタイムPCRで定量した。それぞれのPCR産物は、Comparative cycle threshold法(Ct法)により相対的に定量した。外部標準としてはGAPDHを用いた。使用したプライマーの配列は下表に示す。
トータルRNAをISOGEN試薬を用いて単離した。最初のcDNA鎖はPrimescript RT reagent kit(Takara社)を用いて産生した。mRNAはリアルタイムPCRで定量した。
使用したプライマーを下表に示す。
CTBP1-AS、CTBP1(HSS102437)、NONO (HSS143135)、PSF (HSS109643)、Sin3A (HSS177954)を標的とするStealth RNAiシステムと、ネガティブコントロールをInvitrogen社から購入した。細胞のトランスフェクションは、Lipofectamine RNAi MAX reagent(Invitrogen社)を用いて、実験の48から72時間前に行った。CTBP1-ASに対するsiRNAの配列は、5’-UUAUGUCUCCAGCAAGCUUGGである。
LNCaP細胞(3×106細胞)又はLTAD細胞(1×107細胞)を、5週齢のオスのヌードマウス20匹の両側に皮下注射した。LTAD細胞を移植したマウスは、腫瘍体積が100mm3に達した時点で精巣摘出を行った。5μgのCTBP1-ASに対するsiRNA又はコントロールsiRNAを、Lipofectamine RNAi MAX transfection Reagentを用いて、週に3回、腫瘍中にトランスフェクトした。腫瘍体積は、0.5×r1×r2×r3(r1<r2<r3)の式に従って求めた。
細胞は、96ウェルプレートで、3×103細胞/ウェルで培養した。pcDNA3 CTBP1-ASの安定な細胞株を1%FBSを含むRPMI培地に播種した。RNAi実験のためには、細胞は、プレートに移した24時間後にステルスRNAでトランスフェクトした。MTSアッセイは、cell titer reagent(Promega社)を用い、使用説明書に従って行った。実験は5回ずつ繰り返した。
LNCaP細胞(ヒト前立腺癌細胞)は、10%FBS、50units/mlのペニシリン、及び50μg/mlのストレプトマイシンを含むRPMI培地で培養した。アンドロゲン処理に先立ち、細胞は、5%dextran charcoal stripped FBSを含むフェノールレッドフリー培地で48時間から72時間培養した。使用した抗体は、Sin3A (AK-11)、p53 (Pab-240)、p21 (F-5)、CyclinD1 (C-20)、CyclinA (H-432)、CyclinB1 (H-433) (Santa cruz Biotechnology社)、CTBP1 (#612042)、NONO (#611278)(BD bioscience社)、AcH3K9 (#07-352) (Upstate社)、PSF (#61045) (Novus Biologicals社)、SMAD3 (#04-1035) (Millipore社)。AR、AcH3およびβ-actinに対する抗体は、Takayamaらの報告に述べられている(Takayama K, et al. Oncogene 26, 4453-63 (2007);Cancer Res. 69(1):137-42(2009);Oncogene 30(5):619-30(2011))。Dihydrotestosterone, BicaltamideはWako社より購入した。
常法に従って行った(Takayama K, et al. Oncogene 26, 4453-63 (2007))。細胞をNP40バッファーにより回収し蛋白抽出液を作成した。適当量をLaemmli sample バッファー中で5分間沸騰させ、SDS-PAGEにより分離した。PVDF膜に転写したのち5%スキムミルクによりブロッキングを行い一次抗体と4℃にて一晩反応させた。ウサギもしくはマウスIgGに対する二次抗体と一時間反応させたのち発色し撮影を行った。
LNCaP細胞は、トランスフェクションに先立って、5%のcharcoal stripped FBSを加えたフェノールレッドフリー培地で24時間インキュベートした。次に、FuGENE6 reagent(Roche Diagnostics社)を用い、ARBSを含むpGL3ベクターならびにtk-PRLを細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションの24時間後、常法に従ってルシフェラーゼ活性を測定した。RNAiを組み合わせたルシフェラーゼアッセイでは、RNAのトランスフェクションは、アンドロゲン刺激の72時間前に行った。
コントロールsiRNA又はPSFに対するsiRNAのトランスフェクションのあと、96時間インキュベートしてから細胞を回収した。細胞は遠心処理し、PBSで洗浄した後、穏やかに振とうしながら、3mlの氷冷した70%エタノールをゆっくり加えて固定した。使用時までに4℃で保管した。細胞周期解析の日、細胞を遠心処理し、PBSで洗浄した後、100μg/mlのRNaseA(Takara社)を含むPBS中に、106個/1mlで再懸濁し、37℃で30分インキュベートした。DNA含有量を測定するため、30,000個の細胞をFACS Calibur flow cytometryで、Cell Quest software(BD Biosciences社)を用いて解析した。
CTBP1-ASに対するsiRNAと、PSFに対するsiRNAを用いたマイクロアレイ解析をそれぞれ独立に行った。PSFに対するsiRNAを用いた実験により、700の遺伝子がPSFにより抑制を受ける遺伝子であるものと推測された。これらの標的遺伝子の機能の特定にはDAVIDを用い、パスウェイ解析にはREACTOMEを用いた。両方の解析において、コントロールサンプルから300の遺伝子がアンドロゲンにより抑制される遺伝子として同定された。
本発明者らは、ARの下流シグナルの阻害が前立腺癌治療の治療標的として有効であると考え、クロマチン免疫沈降法とタイリングアレイを組み合わせる方法(ChIP-chip法)により、ARが直接標的とする遺伝子を解明する方法を確立した(Takayama K. et al. Oncogene 26, 2007, 4453-4463、Takayama K. et al. Cancer Res. 69, 2009, 137-142)。さらに、アンドロゲンによる転写ネットワークを解明するため、ARに加えてヒストンH3K9/K14アセチル化の抗体を用いてヒト全ゲノムレベルでChIP-chip解析を行い、AR結合部位(ARBS)とヒストンH3アセチル化部位(AcH3)を同定した。
また、CTBP1のARBS付近に、アンドロゲンで活性化されるアンチセンスのTCを見出した。GENBANKによれば、これはAX747506のex3を転写開始点とするものであることがわかった。そこで、このアンチセンスRNAをCTBP1-ASdと名付けた(配列番号:20)。
siRNAは、CTBP1-ASdの塩基配列を基に設計したstealth RNAi(Invitrogen社)を用いた。一般的なsiRNAより長い25塩基長のブラントエンド型二本鎖RNAであり、インターフェロン応答遺伝子の活性化を最小にできる、センス鎖由来のオフターゲット効果を防ぐことができる、血清中での安定性が非常に高い、等の特徴を有し、in vivoでの使用実績もある。
siRNAの配列は、Invitrogen社のウェブサイトのRNAiデザイナーにより最適部位を決定した。作製したsiRNAの配列は以下のとおりである。
実験には、AR陽性のヒト前立腺細胞株LNCaP細胞を用いた。細胞培養には、10%ウシ胎児血清(FBS,Sigma社)、100μg/mlストレプトマイシン、100U/mlペニシリン(Invitrogen社)を含むRPMI1640(Sigma社)を細胞培養液として用いた。空気中に5%の炭酸ガスを含む培養器内にて37℃で培養した。
LNCaP細胞1×105個を6穴プレートで培養した。翌日、20nM、50nMのsiRNAを、Hiperfect Transfection Reagent(Quiagen社)と、OPTI-MEM(Invitrogen社)を用いて細胞内に導入した。48時間後に10nMのアンドロゲンR1881またはVehicleにより刺激した。さらに24時間培養した後、ISOGEN(Nippon gene社)を用いてRNAを回収した。
mRNAの発現解析をReal-time PCR(Prism7000システム;Applied biosystems社)により行った。Real-time PCR法により得られる増幅曲線から、細胞内での転写産物の発現量をΔΔCt法で求めた。GADPH遺伝子の発現量を基準に発現量を補正した。
また、10nMのR1881で処理し、24時間後にタンパク質を回収してウエスタンブロット法によりCTBP1のタンパク質レベルでの発現量を測定した。結果を図3に示す。タンパク質レベルでもアンドロゲン投与により発現が抑制されるが、siRNA投与により、発現抑制効果がsiRNAの濃度依存的に減少した。
CTBP1-ASによるARの転写活性への影響を確認するため、ルシフェラーゼアッセイを行った。
ルシフェラーゼベクターは、pGL3-basic(Promega社)のプロモータ領域に、代表的なアンドロゲン応答遺伝子であるPSA(Prostate specific antigen)のプロモータとエンハンサーを挿入して作製した(PSA-LUC)。PSA-LUCは、AR結合部位を有し、アンドロゲン応答性にプロモータが活性化される。
LNCaP細胞を24穴プレート3×104個/ウェルとなるように散布し培養した。2.5%チャコール血清含有フェノールレッドフリー培地にて2日間培養後、PSA-LUCを導入し、翌日、10nMのR1881又はVehicleにより刺激した。24時間後に細胞を回収した。ルシフェラーゼ活性をDual-Luciferase Reporter Assay System(Promega社)を用いて測定した。
siRNA及びコントロール二本鎖RNAは、ベクターを細胞に導入する2日前に前述の方法で投与した。
以上の結果から、CTBP1-ASを抑制するとARの転写活性も抑制されることが確認された。
CTBP1-ASによるLNCaP細胞への細胞レベルの影響をMTSアッセイにより解析した。
96穴プレートに、LNCaP細胞を3×103個/ウェルになるように継代培養した。ルシフェラーゼアッセイと同様に、翌日siRNAを投与した。48時間、72時間、96時間後にCell titer 96(Promega社)を用いて1時間反応させた。
MTSアッセイは、PES(phenazine ethosulfate)を介して、テトラゾリウム塩(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium, inner salt;MTS)を発色物質であるホルマザン産物へ変換する還元反応に基づいて、生細胞数を測定する方法である。マイクロプレートリーダーにて、吸光度490nmで細胞増殖能を測定した。
結果を図5に示す。コントロールに比較して、siRNA投与群では細胞増殖が有意に抑制され、CTBP1-ASがLNCaP細胞の増殖を促進していることがわかった。
CTBP1-AS、及びCTBP1-ASの機能抑制が、in vivoで腫瘍増殖に与える影響を解析した。
LNCaP細胞をマウスの皮下に移植するために、PBS及びマトリゲル(BD bioscience社)と混合した。マウス1匹あたり、1×107個、PBS100μl、マトリゲル100μlとなるようにし、20匹分を一度に調製した。
6週齢のオスのBALB/cヌードマウス(日本クレア社)の皮下に、25G注射針を用いて注入した。
AAGACGAUCGUUCGGGACAACAUAA (配列番号:15)
UUAUGUUGUCCCGAACGAUCGUCUU (配列番号:16)
siRNAの注入は、マウスへの癌細胞移植後、細胞が皮下に生着したと考えられる2週間後より、週2回行った。
マウスの腫瘍の大きさは週1回計測した。長径(r1)及び短径(r2、r3)を2ヶ所計測し、(r1×r2×r3)/2の式に従って腫瘍の大きさを求めた。
移植後10週にマウスを犠牲死させ、腫瘍を皮下から摘出した。腫瘍は重量を計測した後、一部はISOGENによるRNA抽出に供し、cDNA合成後、Real time-PCRによりCTBP1-AS及びCTBP1のRNAレベルの発現量を測定した。一部はSDS lysis buffer(10mM Tris-HCl,pH7.5、2%SDS、10%メルカプトエタノール)により溶解してタンパク質抽出に供し、ウエスタンブロット法によりCTBP1の発現量を測定した。
図6に示されるように、コントロールと比較して、siRNA投与群では、腫瘍の増殖が有意に抑制された(p値<0.01)。また、図7に示されるように、腫瘍の重量においても、siRNA投与群では重量の増加が著しく抑制されることが観察された(p値<0.001)。
以上の結果から、CTBP1-ASによるCTBP1の抑制のメカニズムが腫瘍モデルにおけるin vivoの腫瘍増殖においても機能していること、CTBP1-ASを標的として抑制することにより腫瘍増殖の抑制が促されることが確認された。
NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)のGEO Datasetsより公開されているアフィメトリックス社Human Genome U133 Plus 2.0アレイを用いた前立腺、および前立腺癌症例の発現プロファイルのデータ(GSE3325)をダウンロードした。
正常、癌、転移それぞれのサンプルのCTBP1-AS(AX747592)特異的なprobe(1563571_at)に着目しシグナル量を抽出した。各群の間でMann-Whitney順位検定を行い、発現量の比較検討を行った。
結果を図10に示す。癌及び遠隔転移の癌組織におけるCTBP1-ASの発現量は、正常の前立腺に比較して有意に高かった(p値< 0.05、Mann-Whitney順位検定)。この結果から、CTBP1-ASは発癌、癌の悪性化にかかわるものと考えられる。
実際の前立腺癌におけるCTBP1の発現を免疫染色法により評価した。免疫染色法は、鈴木らの方法に従った(Suzuki T. et al. Clin. Cancer Res. 2005 Sep 1;11(17):6148-54)。
症例は東京大学医学部附属病院泌尿器科で1987年より2001年に摘出された前立腺癌の手術標本を有する104症例から選択された。正常部位にあたる切片99例と前立腺癌に該当する切片101例につき、ホルマリン固定後、パラフィン切片を作成した。一次抗体はCTBP1特異的マウスモノクローナル抗体(BD バイオサイエンス社製)を用いた。染色は、免疫組織染色のキットHistofine Kit(ニチレイ社)を用い、3,3'-diaminobenzidine solution[1 mmol/L 3,3'-diaminobenzidine, 50 mmol/L Tris-HCl buffer (PH7.6), and 0.006% H2O2]により発色させた。正常前立腺と前立腺癌の代表的な切片の像を図11Cに示す。
各切片につきCTBP1の核内での陽性率(LI: Labeling Index)を計測し、正常組織及び癌組織におけるCTBP1タンパク質の発現を定量化し比較検討した。
結果を図11Aに示す。正常細胞に比較して、前立腺癌細胞ではCTBP1の発現量は低下していた。
また、前立腺癌の101例について、手術後3ヶ月ごとに5年間外来で経過を追ったデータを使用して、CTBP1高発現群と低発現群の生存率を比較し、Long-rank検定によるKaplan-Meier法を用いて解析した。なお、高発現群と低発現群は、CTBP1の発現を表すLabeling Indexの中央値を基準に分類した。
結果を図11Bに示す。CTBP1高発現群は、低発現群に比較して生存率が有意に高かった。
以上の結果から、CTBP1-ASによるCTBP1の抑制のメカニズムが実際の腫瘍の腫瘍増殖においても機能していることが確認された。
前立腺癌細胞に発現しているCTBP1-ASd以外のCTBP1-ASを以下の方法で探索した。
LNCaP細胞にR1881 10 nMにて刺激した後、24時間後にRNAを回収した。RNA1μgをDNaseIμl(Roche社、10 U/μl)処理をしたのちRACE Kit (Roche社)をもちいて逆転写反応を行った。つぎにCAGE法により得られた転写開始点付近からのprimerおよび末端のアダプター特異的な配列を有するprimerをもちいてPCR反応を行い、得られたPCR産物をTA Cloning Kit(Invitrogen社)を用いてプラスミドへ挿入した。プラスミドのシークエンスを行いPCR反応により得られた転写産物の配列を解析した。得られた配列をヒトゲノム配列へマッピングを行い転写産物の範囲を決定した。
使用した3’RACE primerとPCR adaptor primerは以下のとおりである。
3' RACE primer : 5'-GACCACGCGTATCGATGTCGACTTTTTTTTTTTTTTTTV-3' (配列番号:21)
PCR adaptor primer : 5'-GACCACGCGTATCGATGTCGAC-3' (配列番号:22)
これらのCTBP1-ASは、いずれも上表に記載のsiRNAの標的配列を含むものである。従って、上述の実施例におけるsiRNAによる発現抑制実験では、これらのCTBP1-ASの発現も抑制されていたと考えられる。
LNCaP細胞にR1881 10 nM刺激を行い0, 6, 12, 18, 24, 48時間にRNAを回収した。RNA(各1μg)はホルムアルデヒド入りのアガロースゲルにて泳動しメンブレンに転写した。メンブレンに上記のプローブ(100 ng/ml)をハイブリダイゼーションさせ、DIG特異抗体を用いて検出した。
実験に用いたRNA量を測定するため同時にβアクチンに対するプローブ(Roche社)を購入し同じメンブレンを用いて検出した。
結果を図13に示す。約5kbの長さの転写産物が検出され、上記4種類のCTBP1-ASのうち、CTBP1-ASbがおもに発現していることが示唆された。
LNCaP細胞をR1881 10nM又はVehicleにて24時間処理した。細胞を回収し、PARIS kit(Ambion社)を用いて核内RNA、細胞質RNAをそれぞれ抽出した。それぞれのサンプルより、RNA 1μgを泳動し、ノーザンブロットにより発現量を解析した。Loading Controlとしてβ-actinに対するプローブをハイブリダイズさせ、発現量を測定した。それぞれの遺伝子の発現量は、GAPDHで補正した。
結果を図14に示す。CTBP1-ASは核内に局在することが確認された。
LTAD細胞、ならびにLNCaP細胞(2.5 % チャコール血清 3日間培養, R1881 刺激, R1881 + Bicaltamide添加) のLysateを回収し、CTBP1抗体を用いてウェスタンブロッティングを行った。β-actinに対するプローブをRoding Controlとして用いた。
また、CTBP1-ASのLTAD、LNCaP細胞における発現量を比較するために、LTAD細胞,とLNCaP細胞(2.5 % チャコール血清 3日間培養, R1881 刺激, R1881 + Bicaltamide添加)のTotal RNAを回収した。RNA 1μgを泳動、転写し、CTBP1-ASに対するプローブを用いてノーザンブロッティングを行った。
結果を図15a及びbに示す。LTAD細胞は、アンドロゲン枯渇状態で培養され、ホルモン療法抵抗性モデルとなる。LNCaP細胞にアンドロゲン刺激を行うと、CTBP1の発現はLTAD細胞の場合と同程度に低下し、LTAD細胞においてはCTBP1-ASの発現が著しく増加した。
LNCaP細胞を2.5%チャコール血清、フェノールレッドフリー培地にて3×103個/well散布し、翌日CTBP1-ASに対するRNAiをtransfectionした。2日後、EtまたはR1881にて刺激し、Day1、3、5にMTS assayを行い、増殖能を評価した。
また、LTAD細胞を2.5%チャコール血清、フェノールレッドフリー培地にて3×103個/well散布し、翌日CTBP1-ASに対するRNAiをtransfectionし、2日後EtまたはR1881にて刺激した。day1、3、5にMTS assayを行い、増殖能を評価した。
結果を図15cに示す。アンドロゲン枯渇抵抗性のLTAD細胞では、アンドロゲン刺激を行わなくても、癌細胞が増殖するが、アンドロゲン依存性の増殖、アンドロゲン非依存性の増殖のいずれも、CTBP1-ASのノックダウンにより抑制された。
in vivoで、ホルモン療法耐性株細胞の増殖におけるCTBP1-ASの役割を解析した。
ヌードマウスにLTAD細胞1×107個/匹を皮下移植した。腫瘍が100mm3径に達したところで精巣摘出を施行し、コントロールsiRNA又はCTBP1-ASに対するsiRNAを局注した(5μg/匹、2回/週)。
結果を図16に示す。in vivoにおいても、CTBP1-ASの発現を抑制することによって、アンドロゲン枯渇抵抗性の腫瘍体積の増加が抑制された(図16a及びb)。また、腫瘍中のCTBP1-ASの発現量をqRT-PCRで測定したところ、mRNAレベルで発現が低下していることが確認された(図16c)。一方、腫瘍中のCTBP1をウェスタンブロッティングで測定したところ、CTBP1-ASのノックダウンにより、CTBP1の発現量が増加していた(図16d)。
PSF、NONO、Sin3Aの3種類の遺伝子の発現を、RNAiにより抑制した。LNCaP細胞に、PSF、NONO、Sin3Aに対するsiRNAをトランスフェクションし、2日後にLysateを回収し、ウェスタンブロッティングにより発現量を検証した。いずれのsiRNAも標的の発現を特異的に抑制することを確認できた。
LNCaP細胞をエタノール又はR1881で24時間処理し、刺激の2日前にコントロールsiRNA又はPSFに対するsiRNAをトランスフェクションした。RNAを回収し、cDNAを合成し、RT-PCRによりCTBP1の発現量を解析した。
結果を図17bに示す。PSFの発現を抑制すると、アンドロゲン刺激によるCTBP1発現の抑制の程度が減少した。
また、AcH3抗体によりChIPを行った。リアルタイムPCRにより、CTBP1、CTBP1-ASのプロモータ領域のヒストンアセチル化レベルを計測し、GAPDHにより補正した。Myoglobin exon領域をネガティブコントロールとして使用した。
結果を図17cに示す。PSFを抑制すると、アンドロゲン刺激によるCTBP1発現の抑制度が低下した。このことは、PSFが、CTBP1の発現にプロモータレベルで関与していることを示唆した。
PSFは、RNA結合性の転写抑制因子である。そこで、PSFとCTBP1-ASとの結合の有無を解析した。
LNCaP細胞をエタノール又はR1881で24時間処理し、刺激の2日前にコントロールsiRNA又はPSFに対するsiRNAをトランスフェクションした。核分画を抽出し、Lysateを回収したのち、Norman IgG PSF、NONOに対する特異抗体を用いて、免疫沈降を行った。Protein Gを利用して免疫沈降を行い、洗浄後、Isogenを用いてRNAを抽出した。トータルRNAより逆転写反応を行い、リアルタイムRT-PCRにより、GAPDH、Myoglobin(MG)、CTBP1-ASの発現量を測定した。
結果を図18に示す。CTBP1-ASはPSFと、アンドロゲン依存的に結合することが確認された。
PSFとCTBP1-ASの核内における局在を解析した。LNCaP細胞にエタノール又はR1881を加えて24時間反応させた後、CTBP1-ASに対してRNA FISHを行った。ホルマリン、メタノールにて固定した後、DIGラベルしたCTBP1-ASに対するプローブを使用して、42℃で一晩反応させ、結合させた。翌日、DIGに対する蛍光標識された抗体を結合させ、洗浄後、抗PSF抗体により免疫染色を行った。マウス抗体に対する2次抗体を反応させて検出した。核は、DAPIにより染色した。
結果を図19に示す。PSFとCTBP1-ASの局在はほぼ一致しており、両者が結合していることが示唆された。
次に、PSFが転写を抑制する他の遺伝子を探索した。
コントロールsiRNA又はPSFに対するsiRNAをトランスフェクションした。エタノール又はR1881による刺激から24時間後にRNAを回収した。RNAを増幅し、マイクロアレイを用いて遺伝子発現を解析した。発現が抑制される遺伝子群と発現が亢進する遺伝子群の中で、アンドロゲンにより変化が抑制される遺伝子を抽出した。アンドロゲンによる遺伝子発現の変化率をLog2変換し、Cluster、Tree viewによりHeat mapを作成した(図20a)。転写に抑制がかかるとより明るい色で示される。
アンドロゲンにより抑制される遺伝子の70%は、siPSFにより当該抑制が解除された。さらに、ほとんどのアンドロゲン仲介性遺伝子の誘導が、siPSFにより抑制された。このことは、PSFがアンドロゲンによる発現抑制を広く介在していることを示唆する。
また、PSFがアンドロゲン作用にかかわる遺伝子群のパスウェイ解析を行った。アンドロゲンにより抑制される遺伝子群の中で、PSF抑制により変化が抑制される遺伝子群について解析したところ、p53やSMAD3など細胞周期に関与する遺伝子が濃縮していた(図中UGT2B15は、アンドロゲンにより発現が抑制されるがPSFによっては影響を受けないネガティブコントロールである。)。
次に、PSF抑制が細胞周期に与える影響をFACSにより解析した。LNCaP細胞、LTAD細胞及びBicR細胞に、コントロールsiRNA又はPSFに対するsiRNAをトランスフェクションし、96時間後に細胞を回収した。FACSにより細胞周期を解析した。S期の細胞分画の割合の変化を、図20bに示す。PSFをノックダウンすると、DNAが合成されるS期の割合が減少し、細胞周期が遅くなる傾向が見られた。
また、図20aと同様の実験を、PSFに代えてCTBP1-ASをノックダウンして行い、アンドロゲンによる抑制が解除される遺伝子の種類を比較した。結果を図20cに示す。PSFのノックダウンによりアンドロゲンによる抑制が解除される細胞のうち約50%は、CTBP1-ASのノックダウンによってもアンドロゲンによる抑制が解除される方向を示した。このことは、CTBP1-ASとPSFがアンドロゲンによる遺伝子発現抑制に強調して関与していることを示唆する。
p53、SMAD3の発現に対するPSFの影響を解析した。
コントロールsiRNA又はPSFに対するsiRNAをLNCaP細胞にトランスフェクションし、48時間後にエタノール又はR1881で刺激した。24時間後にRNA及びタンパク質を回収した。qRT-PCRによるp53とSMAD3の発現量の測定結果を図21aに示す(GAPDHで補正)。ウェスタンブロッティングの結果を図21bに示す(βアクチンをLoading controlとした)。
SMAD3及びp53は、アンドロゲン刺激により、mRNAレベル及びタンパク質レベルのいずれにおいても発現が減少したが、PSFの発現を抑制すると、アンドロゲンによる発現の抑制が解除される傾向があった。このことは、SMAD3やp53は、PSFがないとアンドロゲンによる影響を受けにくいこと、即ち、アンドロゲンによるSMAD3やp53の発現抑制は、PSFを介したものであることを示唆する。
p53、SMAD3の発現に対するCTBP1-ASの影響を解析した。
コントロールsiRNA又はCTBP1-ASに対するsiRNAをLNCaP細胞にトランスフェクションし、48時間後にエタノール又はアンドロゲンにより刺激した。48時間後にRNA及びタンパク質を回収し、p53、p21及びSMAD3の発現量を、ウェスタンブロッティングにより解析した。結果を図22aに示す。
p53、p21及びSMAD3の発現は、いずれもアンドロゲン刺激により減少したが、CTBP1-ASの発現を抑制することにより、その減少度は低下した。
また、ホルモン枯渇抵抗性前立腺癌細胞であるLTAD細胞をヌードマウスに移植し、腫瘍が形成された後、精巣摘出を行い、コントロールsiRNAまたはCTBP1-ASに対するsiRNAを局注した。3週間後に腫瘍を摘出し、タンパク質を回収してウェスタンブロッティングにより、細胞周期関連遺伝子産物の発現量を解析した。結果を図22bに示す(それぞれn=2)。CTBP1-ASの発現を抑制すると、アンドロゲン依存的な細胞周期関連遺伝子産物の発現抑制が解除された。
まず、アンドロゲンがアンドロゲン受容体ARに結合すると、CTBP1-ASの転写が増加する。
これにより、ゲノムのグローバルな領域では(図中左の枠内)、CTBP1-ASがPSFに結合して複合体を形成し、この複合体がSMAD3やp53の発現を抑制する。SMAD3やp53は細胞周期を阻害する遺伝子であるため、その発現が抑制されることにより細胞増殖が促進される。
一方、ローカル(図中右の枠内)には、CTBP1-ASの転写が増加すると、CTBP1-ASとPSFの複合体とヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)が結合し、CTBP1の転写を抑制する。CTBP1はアンドロゲン受容体の転写抑制因子であるため、CTBP1の転写が抑制されると、アンドロゲン受容体の転写が増加し、活性化される。
このように、グローバルにおいても、ローカルにおいても、CTBP1-ASの転写が増加すると癌細胞を増殖させる方向に動く。このメカニズムは、CTBP1-AS又はPSFを抑制することにより、癌細胞の増殖を抑制できることを裏付けるものである。
配列番号:2は、AX747592の塩基配列である。
配列番号:3は、CTBP1-ASの機能を阻害するsiRNAの標的となる領域の塩基配列である。
配列番号:4は、CTBP1-ASの機能を阻害するsiRNAの標的となる領域の塩基配列である。
配列番号:5は、CTBP1-ASの機能を阻害するsiRNAの標的となる領域の塩基配列である。
配列番号:6は、CTBP1-ASの機能を阻害するsiRNAの標的となる領域の塩基配列である。
配列番号:7は、CTBP1-ASの機能を阻害するsiRNAを構成するRNAの塩基配列である。
配列番号:8は、CTBP1-ASの機能を阻害するsiRNAを構成するRNAの塩基配列である。
配列番号:9は、CTBP1-ASの機能を阻害するsiRNAを構成するRNAの塩基配列である。
配列番号:10は、CTBP1-ASの機能を阻害するsiRNAを構成するRNAの塩基配列である。
配列番号:11は、CTBP1-ASの機能を阻害するsiRNAを構成するRNAの塩基配列である。
配列番号:12は、CTBP1-ASの機能を阻害するsiRNAを構成するRNAの塩基配列である。
配列番号:13は、CTBP1-ASの機能を阻害するsiRNAを構成するRNAの塩基配列である。
配列番号:14は、CTBP1-ASの機能を阻害するsiRNAを構成するRNAの塩基配列である。
配列番号:15は、実施例におけるsiRNAでコントロールとして用いられたsiRNAを構成するRNAの塩基配列である。
配列番号:16は、実施例におけるsiRNAでコントロールとして用いられたsiRNAを構成するRNAの塩基配列である。
配列番号:17は、CTBP1-AScの塩基配列である。
配列番号:18は、CTBP1-ASbの塩基配列である。
配列番号:19は、CTBP1-ASaの塩基配列である。
配列番号:20は、CTBP1-ASdの塩基配列である。
配列番号:21は、3’ RACE PCRに用いた3’Race primerの塩基配列である。
配列番号:22は、3’ RACE PCRに用いたPCR adaptor primerの塩基配列である。
配列番号:23は、LNCaP細胞由来RNAのノーザンブロッティングに用いたプローブの塩基配列である。
配列番号:24~52は、CTBP1-ASの機能を阻害するsiRNAの標的となる領域の塩基配列である。
配列番号:53~104は、CTBP1-ASの機能を阻害するsiRNAを構成するRNAの塩基配列である。
配列番号:105~108は、リアルタイムPCRに用いたプライマーの塩基配列である。
配列番号:109~118は、リアルタイムRT-PCRに用いたプライマーの塩基配列である。
Claims (13)
- (i)配列番号:1に示される塩基配列の部分配列を含むCTBP1遺伝子のアンチセンスRNA
(ii)配列番号:5に示される塩基配列を含むCTBP1遺伝子のアンチセンスRNA、及び
(iii)前記(i)又は(ii)に記載のアンチセンスRNAの変異体、バリアント、又は、前記(i)及び(ii)に記載のアンチセンスRNAにおいて1又は数個の塩基が欠失、付加若しくは置換されているアンチセンスRNA
のいずれかのアンチセンスRNA(以下、「CTBP1-AS」という。)が発現している細胞の増殖抑制剤であって、
CTBP1-ASの発現阻害物質又は機能阻害物質を有効成分として含む、細胞増殖抑制剤。 - 前記CTBP1-ASが、配列番号17~20のいずれかに記載の塩基配列からなるアンチセンスRNAである、請求項1に記載の細胞増殖抑制剤。
- 前記発現阻害物質又は機能阻害物質が、以下の(a)~(d)からなる群より選択される化合物である、請求項1又は2に記載の細胞増殖抑制剤。
(a)CTBP1-AS又はその一部に対するアンチセンス核酸
(b)CTBP1-ASを特異的に切断するリボザイム活性を有する核酸
(c)CTBP1-ASに対してRNAi効果を有する二本鎖核酸
(d)(a)乃至(c)のいずれかに記載の核酸をコードする核酸 - 前記発現阻害物質又は機能阻害物質が、CTBP1-ASに対してRNAi効果を有する二本鎖RNAであって、該二本鎖RNAの一方が、CTBP1-ASにおける連続した19~30塩基の部分に相補的な配列からなる、請求項3に記載の細胞増殖抑制剤。
- 前記発現阻害物質又は機能阻害物質が、CTBP1-ASに対してRNAi効果を有する二本鎖RNAであって、該二本鎖RNAの一方が、配列番号:3~6及び24~52のいずれかに示される塩基配列に相補的な塩基配列からなる、請求項3に記載の細胞増殖抑制剤。
- 前記CTBP1-ASが発現している細胞が、前立腺癌細胞及び/又はその転移癌細胞である、請求項1から5のいずれか1項に記載の細胞増殖抑制剤。
- 請求項1から6のいずれか1項に記載の細胞増殖抑制剤を含む医薬組成物。
- 請求項1から6のいずれか1項に記載の細胞増殖抑制剤を治療有効量投与することを含む、前立腺癌の予防又は治療方法。
- CTBP1-ASが発現している細胞の増殖抑制剤のスクリーニング方法であって:
CTBP1-ASが発現している細胞又はその細胞抽出液と被検化合物とを、アンドロゲン存在下で接触させる工程と;
CTBP1-ASの発現レベルを測定する工程と;
被検化合物の非存在下で測定した場合と比較して、CTBP1-ASの発現レベルを低下させる被検化合物を選択する工程と、
を含む方法。 - CTBP1-ASが発現している細胞の増殖抑制剤のスクリーニング方法であって:
CTBP1遺伝子が発現している細胞又はその細胞抽出液と被検化合物とを、アンドロゲン存在下で接触させる工程と;
前記CTBP1遺伝子の発現レベルを測定する工程と;
被検化合物の非存在下で測定した場合と比較して、前記CTBP1遺伝子の発現レベルを上昇させる被検化合物を選択する工程と、
を含む方法。 - 前記CTBP1-ASが発現している細胞が、前立腺癌細胞及び/又はその転移癌細胞である、請求項9又は10に記載の方法。
- 前立腺癌の予後を判定する検査方法であって:
患者の前立腺から採取した細胞におけるCTBP1-ASの発現レベルを測定する工程と;
前記発現レベルを正常な前立腺細胞における発現レベルと比較する工程と、
を含む方法。 - 前立腺癌の予後を判定する検査方法であって:
患者の前立腺から採取した細胞におけるCTBP1遺伝子の発現レベルを測定する工程と;
前記発現レベルを正常な前立腺細胞における発現レベルと比較する工程と、
を含む方法。
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