WO2011068260A1 - 인슐린신호경로를 조절하는 마이크로알엔에이 및 그 표적의 작용을 제어하는 물질의 스크리닝 방법 - Google Patents

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이정현
현서강
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Definitions

  • the present invention relates to a method for screening substances that control the action of genes that regulate insulin signaling pathways.
  • the activated PI3K complexes were enzymatically active subunits (p110; in Drosophila).
  • dp110) and regulatory subunit p85 ⁇ ; dp60 in Drosophila
  • Phosphorylated Akt p-Akt contains many proteins, including forkhead box O transcription factors (FOXO), which are involved in cell death, cell proliferation, metabolism, and longevity regulation.
  • FEZO forkhead box O transcription factors
  • the growth of organisms can be achieved not only by cell-autonomous regulation but also by non-cell-autonomous regulation through the circulation of growth hormones (Baker, J et al., 2004, Cell 116, 281-297; Edgar, BA 2006, Nat Rev Genet 7, 907-916; Lupu, F et al., 2001, Dev Biol 229, 141-162; Mirth, CK, and Riddiford, LM 2007, Bioessays 29 344-355; Velloso, CP 2008, Br J Pharmacol 154, 557-568).
  • MicroRNA is approximately 22 nt of untranslated RNA that acts as a post-transcriptional inhibitor through base binding to the 3 ′ untranslated region (UTR) site of mRNA (Bartel, 2004). The physiological function of each miRNA is still unknown.
  • Microarrays (Lim, LP et al., 2005, Nature 433, 769-773), proteomic analysis (Baek, D et al., 2008, Nature 455, 64-71) and miRNA-mRNA complexes to identify true targets Biochemical separation of (Beitzinger, M et al., 2007, RNA Biol 4, 76-84; Chi, SW et al., 2009, Nature 460, 479-486; Easow, G et al., 2007, RNA 13, 1198-1204; Karginov, FV et al., 2007, Proc Natl Acad Sci USA 104, 19291-19296; Landthaler, M et al., 2008, RNA 14, 2580-25915).
  • the present inventors found that using Drosophila as a model system, the conserved miRNA miR-8 regulates the body population by targeting the Drosophila gene called u-shaped (ush ) in fat cells.
  • miR-8 and USH were also conserved in mammals, and it was found that FOG2, the human homologous gene of USH, functions in direct binding with the regulatory subunit of PI3K.
  • the target gene of miR-200 a human homologous gene of Drosophila miR-8 miRNA, is FOG2.
  • Inhibition of miR-200 expression or expression of FOG2 in human cancer cell lines showed that PI3K activity promoting cell growth was decreased and cell growth was reduced. Therefore, miR-200 and FOG2 were used for the screening of insulin signaling pathway regulators. The present invention has been completed by confirming that it can be usefully used.
  • test compound 1) treating the test compound to a cell line expressing miR-200 family miRNA or miR-8 miRNA;
  • step 3) to provide a method for screening an insulin signaling regulatory substance comprising the step of selecting a test compound of which the expression or activity of the FOG2 or USH protein is changed in the cells of step 1) compared to the control.
  • Another object of the present invention is to provide a third object of the present invention.
  • test compound 1) treating the test compound to a cell line expressing FOG2 or USH;
  • step 3) to provide a method for screening insulin signaling regulatory substances comprising the step of selecting a test compound in which the expression or activity of the FOG2 or USH protein is changed in the cells of step 1) compared to the control.
  • Another object of the present invention is to provide a third object of the present invention.
  • 3) providing a method for screening an insulin signaling regulatory substance comprising the step of selecting a test compound having a changed degree of binding between the FOG2 protein and the p85 ⁇ protein in a test tube of step 2) compared to a control which is not treated with the test compound.
  • Another object of the present invention is to provide a third object of the present invention.
  • step 3 screening for an insulin signaling regulatory substance comprising the step of selecting a test compound having a changed degree of binding between the USH protein and the dp60 (Drosophila p60) protein in the test tube of step 2) compared to the control which was not treated with the test compound.
  • Another object of the present invention is to provide a third object of the present invention.
  • 3) to provide a screening method of an insulin signaling regulatory substance comprising the step of selecting a test compound having a change in the binding degree of the FOG2 protein and p85 ⁇ protein in the cells of step 1) compared to the control group not treated with the test compound.
  • Another object of the present invention is to provide a third object of the present invention.
  • 3) to provide a screening method of an insulin signaling regulatory substance comprising the step of selecting a test compound having a change in the degree of binding of USH protein and dp60 protein in the cells of step 1) compared to the control group not treated with the test compound.
  • Another object of the present invention to provide a composition for regulating insulin signal transduction containing a substance that changes the expression or activity of FOG2 or USH protein as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a use of a substance that modulates the expression or activity of FOG2 or USH protein in the manufacture of a composition for regulating insulin signaling.
  • test compound 1) treating the test compound to a cell line expressing miR-200 family miRNA or miR-8 miRNA;
  • 3) It provides a screening method of insulin signaling regulatory substance comprising the step of selecting a test compound in which the expression or activity of the FOG2 or USH protein is changed in the cells of step 1) compared to the control.
  • test compound 1) treating the test compound to a cell line expressing FOG2 or USH;
  • 3) It provides a screening method of insulin signaling regulatory substance comprising the step of selecting a test compound in which the expression or activity of the FOG2 or USH protein is changed in the cells of step 1) compared to the control.
  • 3) provides a screening method of an insulin signaling regulatory substance comprising the step of selecting a test compound of which the degree of binding between the FOG2 protein and the p85 ⁇ protein is changed in the test tube of step 2) compared to a control which is not treated with the test compound.
  • step 3 screening for an insulin signaling regulatory substance comprising the step of selecting a test compound having a changed degree of binding between the USH protein and the dp60 (Drosophila p60) protein in the test tube of step 2) compared to the control which was not treated with the test compound.
  • a method for screening an insulin signaling regulatory substance comprising the step of selecting a test compound having a change in the binding degree of FOG2 protein and p85 ⁇ protein in the cells of step 1) compared to a control that is not treated with the test compound.
  • a method for screening an insulin signaling regulatory substance comprising the step of selecting a test compound having a change in the degree of binding of USH protein and dp60 protein in the cells of step 1) compared to a control that is not treated with the test compound.
  • the present invention also provides a composition for regulating insulin signal transduction, which contains a substance that changes the expression or activity of FOG2 or USH protein as an active ingredient.
  • the present invention provides a use of a substance that changes the expression or activity of FOG2 or USH protein in the manufacture of a composition for regulating insulin signaling.
  • Drosophila a conserved miRNA that regulates the body's sphere by targeting u-shaped (ush ) in adipocytes.
  • the target gene of miR-200 a human homologous gene of Drosophila miR-8 miRNA
  • FOG2 human homologous gene of Drosophila miR-8 miRNA
  • FIG. 5 and 6 are Western blots confirming the activity and gene expression of proteins involved in insulin signaling in miR-8 null Drosophila (Fig. 5) and the expression level of 4EBP through Q-PCR in miR-8 null larva It is a figure which shows the confirmed result (FIG. 6).
  • FIG. 7 and 8 show immunostaining in fat bodies, cuticles and brain tissues of stage 3 larvae (96 hours after spawning) of mir-8 enhancer trap GAL4 strain Drosophila ( mir-8 gal4 ).
  • FIG. 9 and 10 show the results of comparing the weights of mir8 CgG4> mir8 and mir8 pplG4 and wild type fruit flies (FIG. 9) and (FIG. 10) mir8 elavG4 and mir8 elavG4> mir8 .
  • 11 is a diagram comparing the homology of human miR-200 family miRNA and Drosophila miR-8.
  • FIG. 12 and 13 show the results of confirming that the miR-200 family promotes cell proliferation in human cell line MCF7 (FIG. 12) and a schematic diagram of an algorithm applied to target gene and ortholog selection using a target prediction program. (FIG. 13).
  • FIG. 13 and 14 are target gene candidates for Drosophila miR-8 and human miR-200 miRNAs screened using miRanda, miTarget, microT, PicTar and Target Scan (FIG. 13) and 3′UTR sites of the gene candidates. Is applied to the luciferase expression system to select seven gene pairs that respond to both miR-8 and mir-200 family miRNA (Fig. 14).
  • FIG. 19 to 21 show that the expression of USH mRNA selected as a target gene of miR-8 in miR-8 null Drosophila is actually increased by quantitative RT-PCR (FIG. 19).
  • Western blot confirmed the increase (Fig. 20), and the regulation of miR-8 ush 3 'UTR of the miR target site was confirmed by measuring the luciferase activity by introducing a mutation in the miR-8 target site ( Fig. 21) is a diagram showing that;
  • FIG. 22 is a diagram showing the results of measuring the body size and wing cell numbers of Drosophila when Drosophila fat was inhibited in insulin signaling.
  • FIG. 23 and FIG. 24 show PI3K activity and nuclear localization of FOXO in the fat body of miR-8 null Drosophila and confirmed that there is a defect in insulin signaling in fat body of miR-8 null Drosophila (FIG. 23) and wild type JNK and Akt phosphorylation levels in the fat tissue of larvae or miR-8 null larvae confirmed by Western blot (Fig. 24).
  • FIG. 25 shows the results of observing PI3K activity and cell size through immunostaining in mosaic adipocytes overexpressing miR-8.
  • FIG. 26 and FIG. 29 show that twin spots of miR-8 null clones are produced more slowly than wild type clones (arrows) and have a lower DNA content through Twin-spot analysis (mitotic clone analysis).
  • FIG. 26 PI3K activity was confirmed in adipocytes and wild-type cells overexpressing USH (FIG. 27).
  • FIG. 30 and 34 confirm the cell size (FIG. 30), PI3K activity (FIG. 31) and FOXO signal in the nucleus (FIG. 32) via immunostaining in USH overexpressing cells, and PI3K in USH knockdown mosaic adipocytes.
  • 33 shows the results of confirming the activity (FIG. 33) and the FOXO signal (FIG. 34) of the nucleus.
  • 35 is CgG4, mir8 CgG4, mir8 CgG4> mir8 and mir8 Cg> ush i of Drosophila fat body cells ush that by increasing the expression of miR-8 null suppression of insulin signaling in fat body in larvae target gene of FOXO Inr And it shows the results confirmed by performing quantitative RT-PCR for step mRNA.
  • FIG. 36 and 37 show the result of searching for the predicted binding site of miR-8 in ush mRNA (FIG. 36), and the result of searching for the predicted binding site of miR-200 family miRNA in FOG2 (FIG. 37). .
  • Figure 39 shows the correlation between the expression of FOG2 protein and miR-200c cluster miRNA in human cell lines from different organs, respectively, by Western blot and Northern blot for expression of FOG2 protein and miR-200 family miRNA in each cell line, respectively. The figure which showed the confirmed result.
  • FIG. 40-42 When the mih-141 / 200a or miR-200b / c / 429 were transformed in Huh7 cells, which are hepatocellular carcinoma, Western blot confirmed the expression level of FOG and the degree of phosphorylation of Akt (FIG. 40). Expression of FOG and Akt Levels of AsPC1 Cells Treated with 2'-O-methyl Oligonuclelotides Antisense against miR-141 / 200a or miR-200b / c / 429 Fig. 41 shows the result of confirming the degree of phosphorylation by Western blot and the result of confirming the expression level of FOG and the degree of phosphorylation of Akt when the FAO cell line was treated with siFOG2 (Fig. 42).
  • FIG. 43 is a diagram showing the results of confirming the effect of FOG2 on PI3K activity by transforming pCK-flag and pCK-FOG2 in Hep3B cell line and then immunocomplex kinase analysis.
  • Fig. 44 to 47 are transformed pCK-flag and pCK-FOG2 in the Hep3B cell line, and then confirmed the degree of Akt phosphorylation according to whether IGF-1 and FOG2 treatment by Western blot (Fig. 44), 8 FOXO
  • a cell transformed with a luciferase reporter plasmid (pFK1tk-luc) having a binding site a change in the activity of luciferase according to whether miR-200 miRNA was transduced (FIG. 45) and complementary oligonucleotides
  • Fig. 46 shows the results of measuring the change in activity of luciferase according to the transduction of (Fig. 46) and the result of measuring the change in activity of luciferase when overexpressing FOG2 in Hep3B cell line (Fig. 47).
  • FIG. 48 and 49 show the introduction of miR-200 family miRNA (FIG. 48) and miR-200 through MTT (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide) analysis in Hep3B cells
  • Fig. 49 shows the results of measuring cell viability according to the introduction of oligonucleotides complementary to the family miRNA (Fig. 49).
  • FIG. 50 is a diagram showing the results confirmed by immunoprecipitation analysis of the formation of the IRS-1 / p85 ⁇ p110 complex when FOG2 is expressed or not expressed in Hep3B cell line.
  • FIG. 51 and FIG. 52 show Western blots of FOG2 expression in nuclear and cytoplasmic fractions of Hela or PANC1 cells (FIG. 51), and results of confirming FOG2 position by immunostaining in HepG2 cells (FIG. 52). .
  • FIG. 55 shows the results obtained by immunoprecipitation analysis of FOG2 mutations binding to p85 ⁇ when each FOG2 mutation and p85 ⁇ were expressed together in human cell lines derived from various tissues.
  • FIG. 56 and 58 show the results of measuring the PI3K activity according to the increase in the amount of FOG2 expression treated with mutant FOG2_1-412, mutant FOG2_413-789, and mutant FOG2_802-1151 in PANC1 cells (FIG. 56), GST-fusion recombinant p85 ⁇ protein. And in vitro binding assay to confirm that mutant FOG2_413-789 or mutant FOG2_802-1151 binds directly (FIG. 57), and when FOG2_413-789 or mutant FOG2_802-1151 is added to the immunoprecipitated PI3K complex, PI3K activity was observed. The figure which showed the confirmed result (FIG. 58).
  • 61 is a schematic diagram showing the intracellular signal transduction process of USH / FOG2.
  • test compound 1) treating the test compound to a cell line expressing miR-200 family miRNA or miR-8 miRNA;
  • 3) It provides a screening method of insulin signaling regulatory substance comprising the step of selecting a test compound in which the expression or activity of the FOG2 or USH protein is changed in the cells of step 1) compared to the control.
  • test compound 1) treating the test compound to a cell line expressing FOG2 or USH;
  • 3) It provides a screening method of insulin signaling regulatory substance comprising the step of selecting a test compound in which the expression or activity of the FOG2 or USH protein is changed in the cells of step 1) compared to the control.
  • 3) provides a screening method of an insulin signaling regulatory substance comprising the step of selecting a test compound of which the degree of binding between the FOG2 protein and the p85 ⁇ protein is changed in the test tube of step 2) compared to a control which is not treated with the test compound.
  • step 3 screening for an insulin signaling regulatory substance comprising the step of selecting a test compound having a changed degree of binding between the USH protein and the dp60 (Drosophila p60) protein in the test tube of step 2) compared to the control which was not treated with the test compound.
  • a method for screening an insulin signaling regulatory substance comprising the step of selecting a test compound having a change in the binding degree of FOG2 protein and p85 ⁇ protein in the cells of step 1) compared to a control that is not treated with the test compound.
  • a method for screening an insulin signaling regulatory substance comprising the step of selecting a test compound having a change in the degree of binding of USH protein and dp60 protein in the cells of step 1) compared to a control that is not treated with the test compound.
  • MiR-8 is known as the sole homolog of the miR-200 family (see FIG. 13) that promotes the proliferation of human cancer cells (Ibanez-Ventoso et al. , 2008).
  • the present inventors attempted to reveal the biological function of miR-200 using Drosophila. It is known that the larvae become smaller when the larval stage of insects grows slowly and / or when pupariation occurs rapidly (Colombani et al. , 2003; Edgar, 2006; Mirth and Riddiford). , 2007).
  • the body size and body weight of miR-8 null fruit flies, the body volume of miR-8 null larvae are quite small (see FIGS.
  • the present inventors confirmed the activity of proteins related to insulin signaling in miR-8 null fruit flies to find out why miR-8 null fruit flies grow slowly, resulting in a significant decrease in insulin signaling in miR-8 null fruit flies. It was found that there was (see Figs. 5 and 6).
  • Drosophila fat is an important organ in regulating energy metabolism and growth (Colombani et al. , 2005; Colombani et al. , 2003; Edgar, 2006; Leopold, P, and Perrimon, N 2007, Nature 450, 186-188).
  • the present inventors confirmed that miR-8 expression of the larval fat body is important for Drosophila body regulation, and that the function of the miR-8 fat body differs from the neuron in a spatio-temporally specific manner (FIG. 10 and FIG. 11).
  • the present inventors sought to find out miR-8 target genes that regulate the body's structure to further investigate the function of miR-8 molecules.
  • miR-8 is a highly conserved miRNA and that the target gene of miR-8 may also be involved in the cell proliferation phenotype because the human homolog of miR-8 promotes cell proliferation in human cells (see FIG. 6). It was.
  • Target gene candidates for Drosophila miR-8 and human miR-200 miRNAs using a target prediction program (see FIG. 14). Candidates selected for target were classified into two groups: Drosophila and human genes.
  • Drosophila genes known as tumor suppressors or negative regulators of cell proliferation in at least one species in the target target candidate list ush Lap1, CG8445, dbo, Lar , Ced-12, CG12333, cbt, Scr, pan, pnut, Spri, Shc, Rassf and CG5 targets 8 , target human orthologs of each Drosophila gene FOG2, SEPT7, RIN2, SHC1, HOXB5, KLF11, TCF7L1, ERBB2IP, ELMO2, BAP1, WDR37, KLHL20, PTPRD, RASSF2 and VAC14 were selected as target genes.
  • Drosophila gene u-shaped (ush ) and its human homologous Friend of GATA 2 (FOG2, ZFPM2 ) were the most conserved among the predicted genes in these two species.
  • the inventors have selected seven pairs of genes that respond to both miRNAs as targets of the miR-8 and miR-200 family miRNAs among the selected target genes (see FIG. 15), and then target genes of miR-8 miRNAs. Is ush, and miR-8's ability to prevent neurodegeneration (Karres et al. , 2007) is isolated at the molecular level as well as spatially and with respect to body growth (see FIG. 16). Confirmation of inhibition (see FIG. 18) showed that miR-8 inhibited ush in fat body (see FIG. 19). This shows that ush is more strongly inhibited in fat than other body parts. In addition, USH protein levels were observed to be significantly reduced than mRNA levels (see FIG. 20), indicating that miR-8 inhibits USH expression through both destabilization and translation inhibition of USH mRNA.
  • miR-8 binds directly to the predicted target site of USH and mediates expression inhibition (see FIG. 21).
  • the predicted target site for miR-8 is D.virilis and Since it was found in all Drosophilid species, including D.grimshawi , it was found that ush is a true target of miR-8.
  • Drosophila has a small body size and a small number of wing cells (see FIG. 22), similar to miR-8 null Drosophila (see FIG. 4), when USS suppresses insulin signaling in Drosophila fat.
  • the assumption was that inhibition of delivery would inhibit body growth, and that the inhibition of Drosophila growth was inhibited when insulin signaling was inhibited in larval fat bodies. It can be seen that the collapse (see Fig. 18, 23 and 24).
  • the present inventors have the further out the function of miR-8 in adipose tissue results, and by miR-8 is activated, the PI3K a cell autonomous (cell-autonomous) method promotes cell growth (see Fig. 25), cell growth It was confirmed that the effect of miR-8 in can vary depending on the tissue expressed (see Fig. 26, 28, 29).
  • Excessive insulin signaling is known to reduce the levels of insulin receptor ( Inr ) and cytohesin Steppke (step ) through negative feedback of FOXO (Fuss, B et al., 2006, Nature 444, 945-948; Puig , O, and Tjian, R 2005, Genes Dev 19, 2435-2446).
  • the inventors have confirmed that the reduction of insulin signaling when miR-8 is not expressed is recovered through knockdown of USH, and as a result, an increase in ush expression in the fat body of miR-8 null larvae is at least partly due to the lack of insulin signaling. It was found to affect (see Fig. 35).
  • the miRNA target gene search showed that ush mRNA had a predicted binding site of miR-8, whereas ush 's mammalian ortholog , FOG2, had a predicted binding site of at least three miR-200 family miRNAs. 36 and 37).
  • the inventors confirmed that human miR-200 family miRNAs bind directly to 3 'UTR of fog2 mRNA and regulate expression as Drosophila miR-8 miRNA directly binds to 3' UTR of ush mRNA and regulates expression ( See FIG. 38).
  • FOG2 is expressed in the heart, brain, testes, liver, lungs and skeletal muscle (Holmes, M et al., 1999, J Biol Chem 274, 23491-23498; Lu, JR et al., 1999, Mol Cell Biol 19, 4495 -4502; Svensson, EC et al., 1999, Proc Natl Acad Sci USA 96, 956-961; Tevosian, SG et al., 1999, Proc Natl Acad Sci USA 96, 950-955).
  • FOG2 Despite the widespread expression of FOG2 in adult tissues, little is known about the function of FOG2 except in its role in embryonic heart development (Fossett, N, and Schulz, RA 2001, Trends Cardiovasc Med 11, 185-190).
  • miR-200 miRNA is known to be expressed in various adult organs, including the pituitary gland, thyroid gland, islet, testis, prostate, ovary, breast and liver (Landgraf, P et al., 2007, Cell 129, 1401-). 1414).
  • the expression levels of miR-200c cluster member and FOG2 had negative correlation ( 39).
  • FOG2 was actually reduced by miR-200 miRNA (see FIGS. 40, 41 and 39), and that Drosophila human miR-200 was conserved in the regulation of insulin signaling as in the case of miR-8 miRNA. It was confirmed that it has a role (see Figs. 40, 41 and 42). In addition, it was confirmed that FOG2 inhibited PI3K (see FIG. 43), and that phosphorylation of Akt was reduced by FOG2 (see FIG. 44).
  • Akt inhibits FOXO activity, and analysis of the effect of miR-200 miRNA on the downstream transducer of Akt confirms that FOXO activity is decreased by miR-200 miRNA and FOXO activity is increased by FOG2 (FIG. 45, FIG. 46 and FIG. 47).
  • the present inventors confirmed that miR-200 specifically affects the insulin signaling pathway, and it was found that miR-200 specifically regulates PI3K-Akt-FOXO signaling (see FIGS. 44 and 45). .
  • FOG2 is known to be a nuclear transcription co-regulator
  • studies have reported that FOG2 is also located in the cytoplasm (Bielinska, M et al., 2005, Endocrinology 146, 397M 3984; Clugston, RD et al., 2008, Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 294, L665-675). This suggests that FOG2 is responsible for function in the cytoplasm (see FIGS. 53 and 54).
  • the cell line expressing the miR-200 family miRNA is a human cell line derived from heart, brain, testes, liver, lung and skeletal muscle tissue, and the cell line expressing the miR-8 miRNA is a Drosophila cell line derived from adipose tissue. Preferred but not limited to this.
  • Determination of the expression level of the FOG2 or USH protein is any one selected from the group consisting of Western blot, immunostaining, fluorescence staining and reporter assay (reporter assay), the binding of the FOG2 and p85 ⁇ or USH and dp60
  • the measurement of p85 ⁇ / p110 / IRS-1 complex formation is preferably performed by a co-immunoprecipitation method, but is not limited thereto.
  • the test compound of step 1) is any one selected from the group consisting of natural compounds, synthetic compounds, RNA, DNA, polypeptides, enzymes, proteins, ligands, antibodies, antigens, bacteria or fungi metabolites and bioactive molecules, It is preferable to use substances whose antitumor effect is not known to those skilled in the art.
  • the activity of the FOG2 or USH protein is the same.
  • the activity of the p85 ⁇ / p110 complex is a measure of the kinase activity of PI3K or the degree of phosphorylation of AKT protein It may be measured by measuring, but is not limited thereto.
  • the binding between the proteins can be measured by any one method selected from the group consisting of SPR, protein chip, gel shift assay, immunoprecipitation, co-immunoassay, fluorescence immunoassay and radioimmunoassay.
  • the present invention is not limited thereto, and may be measured through any method for measuring binding of proteins commonly used in the art.
  • the present invention also provides a composition for regulating insulin signal transduction, which contains a substance that changes the expression or activity of FOG2 or USH protein as an active ingredient.
  • the substance that changes the expression of the FOG2 or USH protein may be an expression inhibitor of the FOG2 or USH protein, and the expression inhibitor of the FOG2 or USH protein may be an antisense nucleotide or small interfering RNA that complementarily binds to the mRNA of the fog2 or ush gene. (small interfering RNA, siRNA).
  • the substance that changes the activity of the FOG2 or USH protein may be an activity inhibitor of the FOG2 or USH protein, the activity inhibitor of the FOG2 or USH protein is a cytotoxic compound, peptide, It is preferably any one selected from the group consisting of peptide mimetics and antibodies, but is not limited thereto.
  • the siRNA is an antisense sequence that complementarily binds to the sense sequence of 15 to 30 mers selected from the base sequence of the mRNA of the gene encoding FOG2 or USH (SEQ ID NO: 42 or SEQ ID NO: 15).
  • the sense sequence is not particularly limited thereto, but is preferably composed of 19-27 bases, and more preferably has a nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 119 in the case of FOG2 protein expression inhibitor.
  • antisense nucleotides as defined in Watson-click base pairs, bind (hybridize) the complementary sequencing of DNA, immature-mRNA or mature mRNA to hinder the flow of genetic information as a protein in DNA.
  • the nature of antisense nucleotides specific to the target sequence makes them exceptionally multifunctional. Since antisense nucleotides are long chains of monomeric units they can be easily synthesized for the target RNA sequence. Many recent studies have demonstrated the usefulness of antisense nucleotides as biochemical means for studying target proteins (Rothenberg et al., J. Natl . Cancer Inst. , 81: 1539-1544, 1999).
  • antisense nucleotides can be considered as a new type of inhibitor because of recent advances in nucleotide synthesis and in the field of nucleotide synthesis that exhibit improved cell adsorption, target binding affinity and nuclease resistance.
  • Peptide Minetics are peptides or non-peptides that inhibit the binding domain of FOG2 or USH protein and inhibit the activity of FOG2 or USH protein.
  • Major residues of the non-hydrolyzable peptide analogs include ⁇ -turn dipeptide core (Nagai et al . 1985, Tetrahedron Lett 26: 647), keto-methylene pseudopeptides (Ewenson et al . 1986, J Med Chem 29: 295; And Ewenson et al . 1985, in Peptides: Structure and Function (Proceedings of the 9th American Peptide Symposium) Pierce Chemical Co. Rockland, Ill., Huffman et al .
  • composition of the present invention comprises 0.0001 to 50% by weight of the active ingredient based on the total weight of the composition.
  • composition of the present invention may contain one or more active ingredients exhibiting the same or similar function in addition to the substance for changing the expression or activity of the FOG2 or USH protein.
  • composition of the present invention may be prepared by including one or more pharmaceutically acceptable carriers in addition to the above-described active ingredients for administration.
  • Pharmaceutically acceptable carriers may be used in combination with saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol, liposomes, and one or more of these components, as needed.
  • Other conventional additives such as buffer, bacteriostatic and the like can be added.
  • Nucleotides or nucleic acids used in the present invention can be prepared for the purpose of oral, topical, parenteral, intranasal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intraocular, transdermal and the like.
  • the nucleic acid or vector is used in injectable form.
  • the area to be treated may be mixed with any pharmaceutically acceptable vehicle for injectable compositions for direct infusion.
  • the composition of the present invention may in particular comprise an isotonic sterile solution or a lyophilized composition which allows the composition of an injectable solution upon the addition of dry, in particular sterile water or a suitable physiological saline solution.
  • nucleic acid used can be adjusted by various parameters, in particular by gene, vector, mode of administration used, disease in question or alternatively desired duration of treatment. In addition, the range varies depending on the weight, age, sex, health status, diet, administration time, administration method, excretion rate and severity of the patient.
  • the daily dosage is about 0.01 to 12.5 mg / kg, preferably 1.25 to 2.5 mg / kg, preferably administered once to several times a day.
  • composition for controlling insulin signaling of the present invention is useful for molecular biological studies of the insulin signaling pathway and for the prevention or treatment of diseases caused by abnormally functioning insulin signaling pathways such as cancer, diabetes and obesity. Can be used.
  • the present invention provides a use of a substance that changes the expression or activity of FOG2 or USH protein in the manufacture of a composition for regulating insulin signaling.
  • the substance that changes the expression of the FOG2 or USH protein may be an expression inhibitor of the FOG2 or USH protein, and the expression inhibitor of the FOG2 or USH protein may be an antisense nucleotide or small interfering RNA that complementarily binds to the mRNA of the fog2 or ush gene. (small interfering RNA, siRNA).
  • the substance that changes the activity of the FOG2 or USH protein may be an activity inhibitor of the FOG2 or USH protein, the activity inhibitor of the FOG2 or USH protein is a cytotoxic compound, peptide, It is preferably any one selected from the group consisting of peptide mimetics and antibodies, but is not limited thereto.
  • the siRNA is 15 to 30 mer sense sequences selected from the base sequence of the mRNA of the gene encoding FOG2 or USH (SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 38) and antisense sequences that complementarily bind to the sense sequence
  • the sense sequence is not particularly limited thereto, but is preferably composed of 19-27 bases, and more preferably has a nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 119 in the case of FOG2 protein expression inhibitor.
  • the characteristics, sources and references of the transgenic Drosophila used in the present invention are shown in Table 1.
  • the fruit flies were incubated in standard Drosophila medium at 25 ° C. and used for the experiment.
  • Table 1 Drosophila Characteristic Where to get Reference mir-8 ⁇ 2 miR-8 null Drosophila Steve Cohen Karres et al. , 2007 mir-8 gal4 Expression of GFP by regulating mir-8 enhancer in combination with UAS-GFP Kyoto Stock Center Karres et al. , 2007 ush1513 Drosophila containing ush1513 low-order gene (hypomorph) that contains mutations in the promoter region and expresses ush at low levels Pat simpson Cubadda, Y et al., 1997 Cg gal4 Gal4 expression in fat body and anterior lymph gland Young Joon Kim Takata et al., 2004 ppl gal4 Adipose-specific expression of Gal4 / attenuated in salivary glands M. Pankratz Zinke et al. , 1999
  • Example 2 Cell line culture
  • the cell lines of Table 2 purchased from the American Cell Line Bank (ATCC) were incubated at 37 ° C., 5% CO 2 conditions.
  • Cell lines cultured above were removed from 75-cell culture flasks by trypsin-ethylenediamine tetraacetic acid (Invitrogen, USA) treated with trypsin-EDTA, and then inactivated trypsin by adding medium containing serum, followed by centrifugation. Precipitated. After removing the supernatant, the cells were suspended by adding culture medium for each cell line. Living cells were stained with trypan blue dye exclusion test and counted using a hemocytometer, followed by subculture at 5 ⁇ 10 5 cells / flask in a 100 mm dish.
  • Example 3 small body phenotype of mir-8 mutant Drosophila
  • miR-200b has-miR-200b, SEQ ID NO: 3: 5'-UAAUACUGCCUGGUAAUGAUGA-3'
  • miR-429 has-miR-429, SEQ ID NO: 4: 5 '-UAAUACUGUCUGGUAAAACCGU-3'
  • miR-29b known to inhibit cell proliferation
  • the miR-200 family has increased expression in cancer cells, including uterine cancer (Iorio, MV et al., 2007, Cancer Res 67, 8699-8707; Nam, EJ et al., 2008, Clin Cancer Res 14, 2690 -2695), highly conserved in bilaterian animals, and miR-8 is known as the homologous homologue of miR-200 in Drosophila melanogaster (Ibanez-Ventoso et al. , 2008). Thus, the present inventors used fruit flies to reveal the biological function of miR-200.
  • the present inventors first miR-8 null (null) Drosophila [mir-8 ⁇ 2 (Karres , JS et al., 2007, Cell 131, 136-145)] in the body composition and body weight significantly when compared to the wild-type Drosophila phenotype hayeoteul Small ones were observed (FIGS. 1 and 2).
  • the body weight of the fruit flies was measured after ice anesthesia of 5 to 3 day old fruit flies after the incubation of each group.
  • the miR-8 null fruit flies are known to have high frequency of apoptosis in the brain and high frequency of malformed legs and wings (Karres et al. , 2007).
  • the inventors have taken 8 to 10 wings of miR-8 null fruit flies and wild type fruit flies to determine whether the small body phenotype is due to a decrease in cell size and / or cell number.
  • the relative size of the cells was calculated by counting the number of wing hairs, and the relative size of the cells was measured by dividing the whole wing pack cell region into the cell pixel region.
  • miR-8 null fruit flies did not show a significant difference in the size of the wing cells compared to wild-type fruit flies, but the number of wing cells was smaller (FIG. 4). From the above results, it can be seen that the reason for reducing the growth of the terminal tissue of miR-8 null Drosophila is not the decrease of the cell size but the decrease of the number of cells.
  • the isolated protein was transferred to a PVDF membrane using a semi-dry transfer method, incubated in a 2% BSA solution, blocked, and then subjected to anti-phosphorylation-Akt (P-Akt) antibody [1: 1,000, ( # 9271S, Ser473) Cell Signaling Technology, USA] in 2% BSA solution containing. Then, incubated in a 2% BSA solution containing a peroxidase-attached anti-mouse secondary antibody (SantaCruz, USA), and then using a chemiluminescence substrate (Chemiluminescence, Roche, USA) using immunochemistry was developed on the X-ray film to check the band. As a result, it was confirmed that the level of p-Akt was reduced in miR-8 null Drosophila, it was found that the Akt signal transduction process is not properly performed without miR-8 (Fig. 5).
  • P-Akt anti-phosphorylation-Akt
  • Activated p-Akt is known to phosphorylate and inactivate FOXO. Phosphorylation of FOXO prevents nuclear localization, which reduces transcription of the FOXO target gene.
  • the present inventors investigated the expression level of 4EBP, a FOXO target gene, through 4EBP gene Q-PCR in miR-8 null larvae. First, the whole RNA was extracted from the wild-type and miR-8 null Drosophila larvae (96 hours after incubation) using Trizol reagent, and then distilled water was added to 1 ⁇ g of total RNA and 1 ⁇ l of Oligo-dT (Invitrogen, USA).
  • RT-PCR reaction was performed in a SuperScript First-Strand Synthesis System (Invitrogen, USA).
  • CDNA was synthesized by reacting at 65 ° C. for 6 minutes, 4 ° C. for 5 minutes, 42 ° C. for 60 minutes, 95 ° C. for 5 minutes, and 4 ° C. for 5 minutes.
  • primer pairs of 4ebp sense primers SEQ ID NO: 5'-ATGCAGCAACTGCCAAATC-3 '
  • 4ebp antisense primers SEQ ID NO 6: 5'-CCGAGAGAACAAACAAGGTGG--3'
  • ABI SYBR PCR master mix Applied Biosystems, USA
  • the rp49 gene was PCR together as a quantitative control using primer pairs of rp49 sense primer (SEQ ID NO: 5'-AGGGTATCGACAACAGAGTG-3 ') and rp49 antisense primer (SEQ ID NO: 8: 5'-CACCAGGAACTTCTTGAATC-3').
  • 4ebp mRNA expression was converted to a relative value according to the amount of rp49 mRNA, and Ct (comparative cycle threshold) value was analyzed according to the manual (User Bulletin 2, Applied Biosystems, USA). The experiment was repeated three times, and then showed an average value in the graph (Fig. 6). From this, it can be seen that insulin signaling is significantly reduced in miR-8 null Drosophila.
  • Example 5 Identification of miR-8 expression level in Drosophila tissue
  • RNA was isolated from the total larvae, fat body, intestine, brain and cuticles and the miR-8 expression level was confirmed through Northern blot. Specifically, the whole RNA was extracted using Trizol reagent (Invitrogen, USA) from fat, intestine, brain, and cuticle dissected by dissecting the entire miR-8 Gal4 Drosophila and the miR-8 Gal4 Drosophila, and then total RNA of each tissue. 5.4 ⁇ g was run on a 12.5% urea-polyacrylamide gel. The unfolded RNA was delivered with current through a Zeta probe GT membrane (Biorad, USA).
  • Oligonucleotides corresponding to miR-8 were end-labeled with [ ⁇ - 32 ATP] and used as probes of the northern blot.
  • the membrane treated with the probe was exposed to a phosphorylated imaging plate (fugi film, Japan), and then confirmed using a BAS-2500 system (Fugi).
  • Fugi BAS-2500 system
  • Drosophila fat is an important organ in regulating energy metabolism and growth (Colombani et al. , 2005; Colombani et al. , 2003; Edgar, 2006; Leopold and Perrimon, 2007).
  • the inventors performed cloning as follows to prepare transgenic Drosophila expressing miR-8 miRNA and miR-200c miRNA cluster.
  • genomic DNA is extracted from Drosophila using Trizol reagent, and then the genomic DNA (3 ⁇ PCR was performed using primer pairs of SEQ ID NO: 10 (5'-TCACAAAGAATTCCTTATCGCCA-3 ') and SEQ ID NO: 11 (5'-GCTCTAGAATTTTCAGCCGCTTGTCTTCGC-3') and PCR Mastermix (Promega, USA) It was.
  • PCR products of miR-8 generated after the completion of the reaction were digested with restriction enzymes of Eco RI, respectively, and then inserted into pUAS vectors digested with the same restriction enzymes to prepare UAS-mir-8 vectors.
  • cloning was performed as follows. First, genomic DNA was extracted from the cell line HeLa cell line expressing “miR-200c cluster” described in SEQ ID NO: 12 using Trizol reagent, and then the genomic DNA (3-5 ⁇ g) was used as a template.
  • MiR-200c using primer pairs of (5'-CGGAATTCACGGTCGAGGGGCTTCGGAG-3 ') and SEQ ID NO: 14 (5'-GCTCTAGACATGCTCCCAAGGCGGGAAGAC-3') and PCR Mastermix (Promega, USA) And mir-141 PCR products for polynucleotides encoding human miR-200c clusters were obtained.
  • the PCR product Eco RI Xba Each was digested with a restriction enzyme of I and then inserted into a pUAS vector digested with the same restriction enzyme UAS- Human miR-200c Cluster vectors were prepared.
  • mir-8 ⁇ 2 And Cg gal4 Crosses and miR-8 is missing Cg gal4 Drosophila mir8 CgG4 Drosophila were selected. Also, in Table 1 mir-8 ⁇ 2 And ppl gal4 Crosses and miR-8 is missing ppl gal4 Drosophila mir8 pplG4 Drosophila were selected. Each mir-8 ⁇ 2 , Cg gal4, ppl gal4 Drosophila is bred with a double balancer Drosophila to standard breeding mir8 CgG4 And mir8 pplG4 I made fruit flies.
  • Example 1-1 UAS-mir-8 Vector mir8 CgG4 And mir8 pplG4 By P-element-mediated germ line transformation, a method known in the art. mir8 CgG4> mir8 And mir8 pplG4> mir8 Drosophila was obtained (Rubin GM et al., 1982, 357 Science 218: 348-353).
  • Example 1-1 UAS- Human miR-200c Cluster vector mir8 CgG4 And mir8 pplG4 By transforming in the same manner as above mir8 CgG4> 200c And mir8 pplG4> 200c Drosophila was obtained.
  • the inventors have found that the body weight of Cg gal4, mir8 CgG4, mir8 CgG4> mir8 and mir8 CgG4> 200c, or ppl gal4, mir8 pplG4, mir8 pplG4> mir8 and mir8 pplG4> 200c with fat-specific Gal4 drivers Cg and ppl As measured in the same manner as in Example 3, when miR-8 null Drosophila specifically expressed miR-8 in the fat body ( mir8 CgG4> mir8 and mir8 pplG4 ), wild-type Drosophila ( Cg gal4 and ppl gal4 ) It was confirmed that the weight is increased to a similar degree (Fig. 9).
  • miR-8 is expressed in the central nervous system and is known to prevent neurodegeneration (Karres et al. , 2007).
  • mir8 elavG4 an elav gal4 Drosophila that lacks miR-8 by crossing mir-8 ⁇ 2 and elav gal4 in Table 1 were selected Drosophila. made in Drosophila as into the mir-8 ⁇ 2 and elav gal4 using each mir-8 ⁇ 2 and elav gal4 fruit fly Drosophila, the double balancer and each mating to standard mating method.
  • the UAS-mir-8 vector prepared in Example 1-1 was transformed into mir8 elavG4 in the same manner as above to obtain mir8 elavG4> mir8 fruit flies.
  • the weights of mir8 elavG4 and mir8 elavG4> mir8 showed that the weight of fruit flies was similar regardless of whether miR-8 was expressed in neurons (FIG. 10). This means that the function in the fat body of miR-8 is SPATIO-temporally specific to neurons.
  • the present inventors sought to find out miR-8 target genes that regulate the body's structure to further investigate the function of miR-8 molecules.
  • miR-8 is a highly conserved miRNA, and that the human gene of miR-8 promotes cell proliferation in human cells (FIG. 12), so that the target gene of miR-8 may also be involved in the cell proliferation phenotype.
  • FIG. 14 Five target prediction programs (FIG. 14) to select target gene candidates for Drosophila miR-8 and human miR-200 miRNA: miRanda (John et al. , 2004), miTarget (Kim et al.
  • Candidates selected above were classified into two groups: Drosophila and human genes, Ensembl Orthologous data (//www.ensembl.org/) and NCBI Homologene data (//www.ncbi.nlm.nih.gov/Homologene/) And Inparanoid data (//inparanoid.sbc.su.se/) were used to identify species homologous gene pairs in the two groups (FIG. 13).
  • Drosophila genes known as tumor suppressors or negative regulators of cell proliferation in at least one species in the target candidate list ush Lap1, CG8445, dbo, Lar, Ced-12, CG12333, cbt, Scr, pan, pnut , Spri, Shc, Rassf and CG5608 , target human orthologs FOG2, SEPT7, RIN2, SHC1, HOXB5, KLF11, TCF7L1, ERBB2IP, ELMO2, BAP1, WDR37, KLHL20, PTPRD, RASSF2 and VAC14 Were selected. Drosophila gene u-shaped (ush ) and its human homologous Friend of GATA 2 (FOG2, ZFPM2 ) were the most conserved among the predicted genes in these two species.
  • Example 8 Target gene selection of miR-8 plays an important role in the regulation of body growth
  • the inventors inserted a luciferase gene downstream of the 3 'UTR of each target gene including the miRNA target site to confirm that the target gene selected in Example 7 was actually a target of miR-8 and miR-200 family miRNAs. Cloning was carried out. Specifically, in order to obtain cDNA of each target gene, after extracting the total RNA from Drosophila S2 cell line or human Hela cell line using RNeasy mini kit (QIAGEN, USA), 1 ⁇ g total RNA and 1 ⁇ l Oligo-dT (Invitrogen , USA) was filled with 50 ⁇ l of distilled water, and then placed in a SuperScript First-Strand Synthesis System (Invitrogen, USA) for RT-PCR reaction.
  • RNeasy mini kit QIAGEN, USA
  • CDNA was synthesized by reacting at 65 ° C. for 6 minutes, 4 ° C. for 5 minutes, 42 ° C. for 60 minutes, 95 ° C. for 5 minutes, and 4 ° C. for 5 minutes.
  • FOG 2 , SEPT 7 , HOXB 5, KLF 11 , ERBB 2IP, ELMO 2, BAP 1 , PTPRD use Xba I and Eco RI restriction enzymes;
  • RIN 2 SHC 1 , WDR 37 , KLHL 20 , RASSF 2 , VAC 14 use Xba I restriction enzymes; And,
  • TCF 7l1 uses Eco RI and Eco RV restriction enzymes.
  • a reporter plasmid having a miR-8 or miR-200 family target sequence in the 3 'UTR sequence of the luciferase gene was prepared by inserting into a pAC5.1 luciferase vector (a kind gift of Elisa Izaurralde) digested with the same restriction enzyme. This is shown in Table 4.
  • Each miRNA of -3 ') was purchased from Samchully and transformed together with Drosophila S2 cell line or human Hela cell line, and then luciferase activity was measured using a dual-luciferase assay ( Promega, USA). ) And the results are shown in Table 5. Seven gene pairs were selected that responded
  • Ts Targetscan
  • pt Pictar
  • mr Miranda
  • mt miTarget
  • mc microT
  • Example 9 a target gene of miR-8 that regulates body growth
  • Example 8-2 The following experiment was performed to confirm whether the target gene selected in Example 8-2 has a physiologically corresponding activity with the phenotype observed in miR-8 null fruit flies. Specifically, dsRNA is expressed in the mir8 CgG4 Drosophila prepared in Example 6-2, ush, Lap1, Ced-12, CG8445, and CG12333 , which are target genes, and atro (known to prevent neurodegeneration), which are target genes.
  • the mir8 CgG4 was transformed in the same manner as in example 6-2 to larvae ush, Lap1, Ced-12, CG8445, CG12333 and atro each fat body-specific knockdown in that the mir8 Cg> ush i, mir8 Cg> Lap1 i, mir8 Cg> Ced- 12i , mir8 Cg> CG8445 i, mir8 Cg> CG12333 i and mir8 Cg> atro i transformed Drosophila were prepared.
  • Atro atrophin
  • the present inventors performed the following experiments to determine whether atro is expressed in fat body and is involved in body regulation. Atro is known to be expressed in the fat body of larvae along the Drosophila atlantic (atlas, first cervical spine) (Chintapalli, VR et al., 2007, Nat Genet 39, 715-720). However, atro knockdown of fat did not heal the small body phenotype of miR-8 null Drosophila (FIG. 16). From this, it can be seen that the function of preventing miR-8 neurodegeneration (Karres et al. , 2007) is separated at the molecular level as well as the function of body growth.
  • ush1513 Drosophila Cubadda, Y et al., 1997, Genes Dev 11, 3083-3095
  • wild-type Drosophila w 1118
  • miR-8 null miR-8 null ush1513 heterozygotes
  • mir-8 ⁇ 2 ush1518 were prepared by crossing the fruit flies (mir-8 ⁇ 2 ). Each mir-8 ⁇ 2 and ush1513 flies were crossed with a double balancer Drosophila to produce a Drosophila with each mutation in one individual using standard hybridization methods.
  • the w 1118 , w 1118 ush1518, mir-8 ⁇ 2 and mir-8 ⁇ 2 ush1518 fruit flies were measured in the same manner as in Example 3, and as a result, the ush1513 heterozygote was larger in adult size than the wild type flies.
  • the miR-8 null Drosophila a small body phenotype was alleviated when ush was expressed at low levels (FIG. 18). It was found that USH inhibited body growth.
  • the present inventors confirmed by performing quantitative RT-PCR whether the expression of mRNA of USH selected as a target gene of miR-8 is actually increased in miR-8 null Drosophila.
  • Intrinsic ush mRNA levels were determined by performing quantitative RT-PCR in the same manner as in Example 4 above on total RNA isolated from larvae or larvae.
  • primer pairs of an ush sense primer SEQ ID NO: 102: 5'-CGAATTCCGATGTATCCAACG-3 '
  • a ush antisense primer SEQ ID NO: 103: 5'-GGAGTTGTTGTTCTCGTGCACC-3'
  • the inventors performed a Western blot to see if the expression of the protein of USH selected as the target gene of miR-8 is actually increased in miR-8 null Drosophila.
  • the present inventors performed the following cloning to determine whether a change in regulation by miR-8 occurs when mutations are introduced into the miR-8 target site of the 3 'UTR of ush .
  • PCR products for the 3 'UTR region of the ush obtained by PCR in 8-1, respectively were digested with Bam H1 and Sac I restriction enzymes, and then pGL3_CMV vector (modified from Promega's pGL3) was digested with the same restriction enzymes.
  • pGL3_CMV vector modified from Promega's pGL3
  • the Luc- ush in SEQ ID NO: 3'UTR 104 (5'-CAACCATCGACGACAACTCTCCCGGAAAATCTCC-3 ') and SEQ ID NO: 105 (5'-GGAGATTTTCCGGGAGAGTTGTCGTCGATGG TTG-3 ' primer pair), and the QuickChange Site-Directed Mutagenesis kit (Stratagene , USA ) was introduced into the miR-8 target site of the 3 'UTR of ush and named " Lucush 3'UTR mut".
  • the pGL3_CMV vector (Luc null, positive control), Luc- ush 3'UTR or Luc- ush 3'UTR mut prepared in Example 10-3-1, was used for Ac mir8 and renilla luciferase expression vectors (Rehwinkel J et al. , RNA, 2005) were co-transformed using the known method DDAB method (Han, 1996), and then luciferase activity was measured using a fluorometer using a dual-luciferase assay (Promega, USA). luminometer, Biorad).
  • the CgC4 Drosophila of Table 1 was crossed with a PI3K DN Drosophila (Drosophila that expresses a dominant negative PI3K) or a dsInR Drosophila (Drosophila that expresses a dsRNA for InR) to Cg> PI3K DN (fatty-specific dominant negative PI3K ) And Cg> dsInR (fatty-specifically expressing dsRNA for InR) were prepared.
  • CgC4, Cg> PI3K DN and Cg> dsInR Drosophila body size was measured and compared in the same manner as in Example 3, and as a result, Cg> PI3K DN and Cg> dsInR. Drosophila had a smaller adult population than CgC4 fruit flies. In addition, CgC4 and Cg> PI3K DN The cell size of the fruit flies was measured and compared in the same manner as in Example 3, but there was no significant difference.
  • Example 12 Identification of Specific Disruption of Insulin Signaling in the Fatty Acids of miR-8 Null Drosophila
  • PI3K activity can be measured by detecting membrane-attached PIP3 via the GFP signal expressed by tGFP. have.
  • PI3K activity was down-regulated in the fat body of miR-8 null Drosophila (FIG. 23) as compared to the wild type, further increasing the nuclear localization of FOXO (FIG. 23).
  • anti-p-Akt phosphorylated-Akt
  • Ser505 Cell Signaling
  • anti-Akt antibody Cell Signaling, US
  • Western blot using anti-p-JNK (phosphorylated-JNK) antibody (Santa cruz, USA) and anti-JNK antibody (Santa cruz, USA).
  • anti-p-JNK phosphorylated-JNK
  • anti-JNK antibody Sura cruz, USA
  • anti-JNK antibody Sura cruz, USA
  • Example 13 miR-8 activates PI3K to promote cell growth in a cell-voluntary way
  • the present inventors prepared a mosaic clone overexpressing GAL4 when a miR-8 is expressed in a fat body of a miR-8 heterozygous conjugate using a known method (Seth S. Blair, Generating Imaginal Disc Clones in Drosophila, CSH Protocols , 2007; pdb.prot4793).
  • Anti-GFP antibody cell membrane staining, PI3K activity measurement
  • anti-CD2 antibody miR-8 null cell staining
  • the GFP signal was increased in the cell membrane of miR-8 overexpressing cells, and the cell size was larger than that of miR-8 null cells (FIG. 25). This suggests that miR-8 promotes cell growth by activating PI3K in a cell-voluntary manner.
  • Mitotic null clones of miR-8 were prepared using the FLP / FRT system (Golic, KG . And Lindquist, S, 1989). At this time, when the thermal shock is given, chromosome recombination occurs specifically, and after cell division, one cell becomes a null clone and the other cell becomes a twin-spot having two phenotypes. Cells of miR-8 null clones were smaller than the surrounding cells of twin spots (cells obtained from miR-8 wild type copy) (FIGS. 26 and 27).
  • miR-8 also promotes fat cell growth, as predicted that miR-8 enhanced insulin signaling in fat bodies.
  • the inventors found that when clones were induced in embryonic or newly hatched larvae, few null clone cells were generated near the twin spot cells. This means that during the development of the larvae the failure of proliferation / survival of miR-8 null cells is frequent (FIG. 26). When twin-spot analysis was performed on the wing or eye disc in the same manner as above, miR-8 null clones were generated, but the growth inhibition of the organ was minimal (Karres et al. , 2007) (FIG. 28).
  • Example 14 Identify the role of ush in insulin signaling
  • the present inventors prepared a mosaic clone of adipocytes overexpressing USH in the same manner as in Example 13-1 to confirm whether USH negatively regulates insulin signaling.
  • the tGPH vector was transformed in the same manner as in Example 12, followed by immunostaining using anti-GFP antibody (cell membrane staining, PI3K activity measurement) and anti-LacZ antibody (USH expressing cell staining).
  • USH-overexpressing cells were smaller in size compared to the surrounding wild-type cells, showed a significantly lower tGPH signal in the cell membrane (FIGS. 30 and 31), and a high FOXO signal in the nucleus (FIG. 32).
  • the present inventors prepared mosaic adipocytes expressing dsRNA for ush in the same manner as in Example 13-1 to observe the ush knockdown phenotype.
  • tGPH vectors were transformed in the same manner as in Example 12, followed by immunostaining using anti-GFP antibody (membrane membrane staining, PI3K activity measurement) and anti-CD2 antibody (miR-null cell staining).
  • anti-GFP antibody membrane staining, PI3K activity measurement
  • anti-CD2 antibody miR-null cell staining
  • Example 15 Inhibition of insulin signaling of fat body of miR-8 null larva by increased ush expression
  • Excessive insulin signaling is known to reduce the levels of insulin receptor ( Inr ) and cytohesin Steppke (step ) through negative feedback of FOXO (Fuss et al. , 2006; Puig and Tjian, 2005).
  • the present inventors have determined that the reduction of insulin signaling when miR-8 is not expressed is recovered in the fat cells of CgG4 , mir8 CgG4, mir8 CgG4> mir8 and mir8 Cg> ush i Drosophila to determine whether the reduction of insulin signaling is recovered through knockdown of USH.
  • quantitative RT-PCR for Inr and step mRNAs which are target genes of FOXO, was performed in the same manner as in Example 4.
  • the primers used at this time are shown in Table 7.
  • the two targets of the FOXO were upregulated in the fat body of miR-8 null larvae, it was confirmed that the expression is rapidly reduced by the re-introduction of miR-8 (Fig. 35).
  • mRNA levels of Inr and step FOXO target genes in the fat body of mir8 Cg> ush i were made (FIG. 35). From this, it can be seen that the increase in ush expression in the fat body of miR-8 null larvae at least partially affects the deficiency of insulin signaling.
  • Example 16 FOG2, a target gene of miR-200, regulates PI3K in human cell lines
  • ush mRNA has a predicted binding site of miR-8, while ush mammalian ortholog FOG2 has predicted binding sites of at least three miR-200 family miRNAs.
  • ush mammalian ortholog FOG2 has predicted binding sites of at least three miR-200 family miRNAs.
  • Had FIGS. 36 and 37.
  • Drosophila miR-8 miRNA directly binds to 3' UTR of ush mRNA and regulates expression. The experiment was performed.
  • the total RNA was extracted from the K562 cell line using RNeasy mini kit (QIAGEN, USA), and then 1 ⁇ g total RNA and 1 ⁇ l Oligo-dT (Invitrogen, After filling up to 50 ⁇ l of distilled water, the mixture was placed in a SuperScript First-Strand Synthesis System (Invitrogen, USA) for RT-PCR reaction.
  • CDNA was synthesized by reacting at 65 ° C. for 6 minutes, 4 ° C. for 5 minutes, 42 ° C. for 60 minutes, 95 ° C. for 5 minutes, and 4 ° C. for 5 minutes.
  • FOG2 is expressed in the heart, brain, testes, liver, lungs and skeletal muscle (Holmes et al. , 1999; Lu et al. , 1999; Svensson et al. , 1999; Tevosian et al. , 1999). Despite relatively widespread expression in adult tissues, little is known about the function of FOS2 compared to its role in embryonic heart development (Fossett and Schulz, 2001). On the other hand, miR-200 miRNA is known to be expressed in a variety of adult organs, including the pituitary gland, thyroid gland, islet, testis, prostate, ovary, breast and liver (Landgraf et al. , 2007).
  • Northern blot was isolated in the same manner as in Example 5 after separating total RNA from HepG2, Hep3B, Huh7, FAO, AsPC1, PANC1, SW480, HCT116, HCT116p53KD, MCF7, MDAMB231, U2OS and Hela cell lines using Trizol reagent. Was performed. At this time, oligonucleotides corresponding to miR-141 and miR-200c were end-labeled with [ ⁇ 32 -ATP] and used as probes of the northern blot. As a result, expression levels of miR-200c cluster members and FOG2 generally had a negative correlation supporting the inhibitory role of miR-200 in FOG2 regulation (FIG. 39).
  • Example 17 Confirmation of specific regulation of PI3K-Akt-FOXO signaling by miR-200
  • miR-200 miRNA actually decreases FOG2 and that Drosophila human miR-200 has a conserved role in the regulation of insulin signaling as in the case of miR-8 miRNA, miR-200 and FOG2 Is transformed into 30 nM of synthesized siGFP, miR-141 / 200a or miR-200b / c / 429 in Huh7 cells (FIG. 39), a hepatocellular carcinoma expressed at relatively low but detectable levels, followed by anti-FOG2 Western blot was carried out in the same manner as in Example 4 using the antibody, anti-p-Akt antibody, anti-Akt antibody and anti-GAPDH antibody. As a result, FOG2 protein levels were significantly reduced (FIG. 40).
  • the present inventors transformed the pCK-flag (empty vector) and the pCK-FOG2 prepared in Example 16-1 to the Hep3B cell line, followed by immunocomplex kinase analysis using an antibody against p85 ⁇ for FOG2 for PI3K activity. The effect of was confirmed (FIG. 43). Specifically, pCK-flag (empty vector) and pCK-FOG2 prepared in Example 16-1 were transformed into a Hep3B cell line, followed by a medium without serum or a medium containing 100 ng / ml of IGF-1. I replaced it.
  • proteins were isolated by treatment with lysis buffer (137 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7.4), 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 0.1 mM sodium orthovanadate, 1% NP-40).
  • lysis buffer 137 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7.4
  • CaCl2 1 mM MgCl2, 0.1 mM sodium orthovanadate, 1% NP-40
  • anti-p85 ⁇ monoclonal antibody Santa Cruz
  • Precipitated antibody-PI3K immune complexes were mixed with protein A-Sepharose bead (Pharmacia, Sweden), followed by two 1, wash buffer solutions (0.1 M Tris-HCl ( pH 7.4) with lysis buffer solution. ), 5 mM LiCl, and 0.1 mM sodium orthovanadate).
  • PI3K activity was determined by 60 ⁇ l of the protein-A Sepharose beads / antibody-PI3K immune complex, 10 ⁇ g of sonic-crushed PIP2 (Calbiochem, USA) and 1 ⁇ l of [ ⁇ - 32 P] ATP (500 ⁇ Ci / ml).
  • the kinase assay buffer (containing 10 mM Tris-HCl ( pH 7.4), 150 mM NaCl, 1 mM sodium orthovanadate and 10 ⁇ l of 100 mM MgCl 2) was analyzed. After reaction at 37 ° C. for 20 minutes, the reaction was terminated by adding 20 ⁇ l of 6N HCl.
  • Lipids were extracted with CHCl3: MeOH ( 1: 1) and analyzed using a scintillation counter.
  • the immune complexes were incubated with purified His-labeled FOG2 protein at 4 ° C. for 2 hours.
  • IGF-1 insulin like growth factor-1
  • Luciferase activity was measured in the same manner.
  • an oligonucleotide having a sequence complementary to luciferase, miR-141, miR-200a, miR-200b, miR-200c, or miR-429 is transformed into a Hep3B cell with a pFK1tk-luc vector, followed by the same method as described above. Luciferase activity was measured by.
  • pCK-flag (empty vector) and pCK-FOG2 prepared in Example 16-1 were transformed into Hep3B cell line, and luciferase activity was measured by the same method as described above.
  • Luciferase activity in Hep3B cells was significantly reduced by transduction of miR-200 miRNA and FOG2 knockdown (FIG. 45).
  • FOXO activity was increased in the cells by treatment of miR-200 inhibitors (FIG. 46).
  • FOXO activity was increased when FOG2 was overexpressed (FIG. 47).
  • the present inventors transformed pCK-flag (co-vector) or pCK-FOG2 prepared in Example 16-1 to HepG2 cell line to determine whether miR-200 specifically affects the insulin signaling pathway.
  • pCK-flag co-vector
  • pCK-FOG2 prepared in Example 16-1
  • HepG2 cell line to determine whether miR-200 specifically affects the insulin signaling pathway.
  • After replacement with a medium without serum or a medium containing 100 ng / ml of IGF-1, anti-p-ERK antibody (Sigma, USA), anti-ERK antibody ( Sigma, USA) and Western blots performed with anti-GAPDH antibodies showed that, unlike the components of the PI3K signaling pathway, phosphorylation levels of Erk were similar with or without treatment with FOG2 (FIG. 44).
  • Example 18 FOG2 acts as voice adjuster for PI3K
  • MTT (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5 in Hep3B cells. Cell viability was measured by -diphenyltetrazolium bromide analysis.
  • nM oligonucleotide having a sequence complementary to 200 nM luciferase, miR-141, miR-200a, miR-200b, miR-200c or miR-429 was transformed into Hep3B cells, and then the same as above. MTT analysis was performed by the method. As a result, the introduction of miR-200 miRNA increased cell viability (FIG. 48), and the introduction of the inhibitor of the miRNA showed the opposite effect (FIG. 49).
  • FOG2 To identify the mechanism of action of FOG2, we performed immunoprecipitation against p85 ⁇ in Hep3B cell lines followed by Western blots for p85 ⁇ , p110 and IRS-1 (FIG. 50). In particular, when FOG2 was expressed, the amount of p110 and IRS-1 precipitated with p85 ⁇ decreased. From this, it was found that FOG2 acts as a negative regulator of PI3K by interfering with the formation of the IRS-1 / p85 ⁇ p110 complex.
  • FOG2 is thought to be a nuclear transcription co-regulator
  • several studies have reported that FOG2 is also located in the cytoplasm (Bielinska et al. , 2005; Clugston et al. , 2008).
  • the inventors separated the nuclear and cytoplasmic fractions from Hela or PANC1 cells, and then separated the proteins from each fraction to obtain anti-FOG2 antibodies, anti-Lamin antibodies (nuclear fractions) (Santa Cruz, USA).
  • anti-Tubulin antibody cytoplasmic fraction
  • Western blot was carried out in the same manner as in Example 4, it was observed in the cytoplasm more than the nucleus (Fig. 51).
  • FOG2 inhibits PI3K and is located with p85 ⁇ (FIGS. 38-54).
  • the present inventors performed immunoprecipitation in the same manner as in 17-2 when PANC1 cells were treated with or without 1 ⁇ g (Santa cruz), and then the anti-FOG2 antibody and anti-p85 ⁇ antibody were used.
  • Western blot was performed in the same manner as in Example 4 to confirm the expression of endogenous FOG2, and a significant amount of p85 ⁇ , a regulatory subunit of PI3K, was precipitated with the anti-FOG2 antibody (FIG. 56).
  • FOG 2 [1-412] sense primer; SEQ ID NO: 127, 5'-GGATCCATGTCCCGGCGAAAGCAAAGC-3 ', antisense primer; SEQ ID NO: 128, 5'-GCGGCCGCGTGGCTGGCTGTAAGCTGTC-3 ',
  • FOG2 [413-789] (SEQ ID NO: 129) sense primers; SEQ ID NO: 130, 5'-GGATCCCAGACTTATTGACCAGAAG-3 ', antisense primer; SEQ ID NO: 131 5'-GCGGCCGCGATATCACATCTTGGGTGGTAG-3 ',
  • FOG2 [802-1151] (SEQ ID NO: 132) sense primers; SEQ ID NO: 133, 5'-GGATCCCTCTGACGATCAACAAGTG-3 ', antisense primer; SEQ ID NO: 134 5'-GCGGCCGCTCATTTGACATGTTCTGCTGCATG-3 ',
  • FOG2 [1-506] (SEQ ID NO: 135) sense primers; SEQ ID NO: 136, 5'-GGATCCATGTCCCGGCGAAAGCAAAGC-3 ', antisense primer; SEQ ID NO: 137, 5′-GCGGCCGCTCATTTGACATGTTCTGCTGCATG-3 ′,
  • FOG2 [1-789] (SEQ ID NO: 138) sense primers; SEQ ID NO: 139, 5'-GGATCCATGTCCCGGCGAAAGCAAAGC-3 ', antisense primer; SEQ ID NO: 140, 5'-GCGGCCGCTCATTTGACATGTTCTGCTGCATG-3 ',
  • PCR products obtained above were digested with restriction enzymes of Bam HI and Not I, respectively, and then inserted into pCK-flag vectors digested with the same restriction enzymes to express "pCK-FOG2_1-412", “pCK-FOG2_413-789", Expression vectors for FOG mutations of "pCK-FOG2_802-1151", “pCK-FOG2_1-506" and “pCK-FOG2_1-789" were prepared.
  • the inventors confirmed whether the intermediate region was sufficient to inhibit PI3K (FIG. 56). As a result, the N-terminal site or C-terminal site had no inhibitory effect in PI3K activity, but the intermediate region had a significant PI3K inhibitory effect (FIG. 56).
  • the present inventors digested the PCR product for the p85 ⁇ gene obtained in Example 20-1 with BamHI and EcoRI, and then the pGEX5X-1 vector digested with the same restriction enzyme site. (GE Healthcare, USA) to prepare a GST-fusion recombinant p85 ⁇ expression vector. After the expression vector was transformed into BL21 (Promega, USA) by electroporation, the protein FOG2 protein was expressed and purified in bacteria using a known method (Studier, FW et al ., 1986, J. Mol. Biol.
  • the recombinant FOG2 protein comprises an intermediate region of FOG2 (413-789 aa) that specifically binds to recombinant p85 ⁇ ( Figure 57).
  • the activity of PI3K was significantly reduced when the recombinant FOG2 protein comprising the middle region (with tro PI3K assay) was added to the immunoprecipitated PI3K complex (FIG. 58).
  • FOG2 binds directly to p83, causing inhibition of PI3K activity.
  • Drosophila USH physically interacts with Drosophila p60 (dp60, Drosophila ortholog of p85 ⁇ ) when dp60 is expressed together in USH and human HEK293T cells (FIGS. 59 and 60). This suggests that the activity mechanism of USH / FOG2 is preserved beyond species ( Figure 61).
  • miR-200 and FOG2 may be useful for screening insulin signaling regulators such as anticancer agents. Can be.

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Abstract

본 발명은 인슐린신호경로를 조절하는 miRNA와 그 표적 유전자의 작용을 제어하는 물질을 스크리닝 하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로, 세포 성장을 촉진하는 miR-8 또는 miR-200 miRNA의 표적 유전자인 USH 또는 FOG2의 작용을 제어하는 물질을 스크리닝 하는 방법에 관한 것이다. 본 발명자들은 초파리 지방체 세포에서 u-shaped(ush)를 표적함으로써 체구를 조절하는 보존된 miRNA인 miR-8을 발굴하였다. 또한, 초파리 miR-8 miRNA의 인간 상동 유전자인 miR-200의 표적 유전자가 FOG2임을 확인하였다. 초파리의 miR-8 및 USH가 포유동물에서도 보존되어 있으며, USH의 인간 상동 유전자인 FOG2가 PI3K의 조절 서브유니트와 직접 결합하여 기능함을 발견하였다. 인간 암세포주에서 miR-200의 발현을 억제하거나 FOG2를 발현시켰을 때 세포 성장을 촉진하는 PI3K 활성이 감소되는 것을 확인하였으므로, miR-200 및 FOG2를 인슐린신호경로 조절물질의 스크리닝에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

인슐린신호경로를 조절하는 마이크로알엔에이 및 그 표적의 작용을 제어하는 물질의 스크리닝 방법
본 발명은 인슐린신호경로를 조절하는 유전자의 작용을 제어하는 물질을 스크리닝 하는 방법에 관한 것이다.
비정상적 크기의 동물은 생존에 적합하지 않아 도태되기 때문에 동물의 체구는 안정적인 생존에 중요한 생물학적 파라미터이다. 그래서 체구가 어떤 방법을 통해 결정되는지는 생물학의 근본적 질문이다. 곤충 모델 시스템을 이용한 최근 연구에서 인슐린 신호 전달이 신체 성장을 조절하는데 중요한 부분을 차지한다는 것이 보고 되었다(Chen, C et al., 1996, Endocrinology 137, 846-856; Ikeya, T(2002, Curr Biol 12, 1293-1300; Rulifson, EJ et al., 2002, Science 296, 1118-1120). 인슐린(초파리에서는 Insulin like peptide)이 그의 수용체(IRS; 초파리에서는 chico)에 결합하여 인슐린 수용체 기질, phosphoinositide-3 키나아제(PI3K) 및 Akt/PKB를 포함하는 인산화 캐스케이드를 촉발하는데(Edgar, 2006; Mirth and Riddiford, 2007; Verdu et al., 1999), 활성화된 PI3K 복합체는 효소활성 서브유니트(p110; 초파리에서는 dp110) 및 조절 서브유니트(p85α; 초파리에서는 dp60)로 구성된다. 인산화 Akt(p-Akt)는 세포사, 세포 증식, 대사 및 수명 조절에 관여하는 forkhead box O 전사 인자(FOXO)를 포함한 많은 단백질을 인산화시킨다(Gross, DN et al., 2008, Oncogene 27, 2320-2336). 한번 활성화된 키나아제 캐스케이드는 세포 성장 및 증식을 촉진시킨다.
생물체의 성장은 세포-자율적인(cell-autonomous) 조절뿐만 아니라 성장 호르몬의 순환을 통한 비세포-자율적인(non-cell-autonomous) 조절에 의해서도 이루어질 수 있다(Baker, J et al., 2004, Cell 116, 281-297; Edgar, BA 2006, Nat Rev Genet 7, 907-916; Lupu, F et al., 2001, Dev Biol 229, 141-162; Mirth, CK, and Riddiford, LM 2007, Bioessays 29, 344-355; Velloso, CP 2008, Br J Pharmacol 154, 557-568). 최근의 연구에서 곤충의 전흉선(prothoracic gland) 및 지방체(fat body)와 같은 몇몇의 내분비 기관에서 발달 및 영양 조건을 조정하여 생물체 성장을 조절하는 것이 보고되었다(Caldwell, PE et al., 2005, Curr Biol 15, 1785-1795; Colombani, J et al., 2005, Science 310, 667-670; Colombani, J et al., 2003, Cell 114, 739-749; 및, Mirth, C, et al., 2005, Curr Biol 15, 1796-1807). 그러나 체구가 어떻게 결정되고 조절되는지의 세부 메카니즘은 아직 잘 알려지지 않은 실정이다.
마이크로알엔에이(microRNA; miRNA)는 mRNA의 3' 비번역 영역(UTR) 부위와의 염기결합을 통해 전사후 억제자 역할을 하는 대략 22 nt의 비번역 RNA이다(Bartel, 2004). 각각의 miRNA의 생리학적 기능은 아직 잘 알려져 있지 않은 상황이다. miRNA 기능의 연구는 표적 유전자를 예측하는 컴퓨터 알고리즘에 크게 의존하고 있으나(Grun, D et al., 2005, PLoS Comput Biol 1, e13; John, B et al., 2004, PLoS Biol 2, e363; Kim, SK et al., 2006, BMC Bioinformatics 7, 411; Kiriakidou, M et al., 2004, Genes Dev 18, 1165-1178; Krek, A et al., 2005, Nat Genet 37, 495-500; Lewis, BP et al., 2005, Cell 120, 15-20; Stark, A et al., 2003, PLoS Biol 1, E60), 세포내에서의 조절은 상보적 서열의 접근성과 표적 메시지의 가용성에 의존하기 때문에 이러한 표적 예측 프로그램의 유용성에도 불구하고 많은 허위 양성 표적이 예측되곤 한다. 진짜 표적을 동정하기 위해 마이크로 어레이(Lim, LP et al., 2005, Nature 433, 769-773), 단백질체 분석(Baek, D et al., 2008, Nature 455, 64-71) 및 miRNA-mRNA 복합체의 생화학적 분리(Beitzinger, M et al., 2007, RNA Biol 4, 76-84; Chi, SW et al., 2009, Nature 460, 479-486; Easow, G et al., 2007, RNA 13, 1198-1204; Karginov, FV et al., 2007, Proc Natl Acad Sci U S A 104, 19291-19296; Landthaler, M et al., 2008, RNA 14, 2580-25915)와 같은 다양한 실험적 방법이 개발되었다. 또한 모델 생물체를 이용한 유전학적 접근은 miRNA의 생물학적 역할을 연구하는 유용한 도구가 될 수 있다(J et al., 2003, Cell 113, 25-36; Giraldez, AJ et al., 2005, Science 308, 833-838; Ibanez-Ventoso, C et al., 2008, PLoS ONE 3, e2818; Lee, RC et al., 1993, Cell 75, 843-854; Rodriguez, A et al., 2007, Science 316, 608-611; Thai, TH et al., 2007, Science 316, 604-608; van Rooij, E et al., 2007, Science 316, 575-579; Wightman, B et al., 1993, Cell 75, 855-862; Zhao, Y et al., 2007, Cell 129, 303-317). 이와 같은 발전에도 불구하고, miRNA의 생물학적 기능 및 이의 생리학적으로 중요한 표적을 동정하는 것이 쉽지 않다.
이에, 본 발명자들은 모델 시스템으로 초파리를 사용하여, 보존된 miRNA인 miR-8이 지방체 세포에서 u-shaped(ush)라 불리는 초파리 유전자를 표적함으로써 체구를 조절한다는 사실을 발견하였다. 또한, miR-8 및 USH가 포유동물에서도 보존되어 있으며, USH의 인간 상동 유전자인 FOG2가 PI3K의 조절 서브유니트와 직접 결합하여 기능함을 발견하였다. 또한, 초파리 miR-8 miRNA의 인간 상동 유전자인 miR-200의 표적 유전자가 FOG2임을 확인하였다. 인간 암세포주에서 miR-200의 발현을 억제하거나 FOG2를 발현시켰을 때 세포 성장을 촉진하는 PI3K 활성이 감소되고 세포성장이 감소함을 확인하였으므로, miR-200 및 FOG2를 인슐린신호경로 조절물질의 스크리닝에 유용하게 사용할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은
1) miR-200 패밀리 miRNA 또는 miR-8 miRNA를 발현하는 세포주에 피검화합물을 처리하는 단계;
2) 처리한 상기 단계 1)의 세포에서 FOG2 또는 USH 단백질의 발현량 또는 활성을 측정하는 단계; 및,
3) 대조군과 비교하여 상기 단계 1)의 세포에서 FOG2 또는 USH 단백질의 발현 또는 활성이 변화된 피검화합물을 선별하는 단계를 포함하는 인슐린 신호전달 조절 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은
1) FOG2 또는 USH를 발현하는 세포주에 피검화합물을 처리하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 세포에서 FOG2 또는 USH 단백질의 발현량 또는 활성을 측정하는 단계; 및,
3) 대조군과 비교하여 상기 단계 1)의 세포에서 FOG2 또는 USH 단백질의 발현 또는 활성이 변화된 피검화합물을 선별하는 단계를 포함하는 인슐린 신호전달 조절 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은
1) 피검 화합물의 존재 하에 FOG2 단백질과 p85α단백질을 접촉시키는 단계;
2) 상기 에서 FOG2 단백질 및 p85α단백질 사이의 결합 정도를 측정하는 단계; 및,
3) 피검 화합물을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 상기 단계 2)의 시험관에서 FOG2 단백질 및 p85α단백질 사이의 결합 정도가 변화된 피검화합물을 선별하는 단계를 포함하는 인슐린 신호전달 조절 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은
1) 피검 화합물의 존재 하에 USH 단백질과 dp60 단백질을 접촉시키는 단계;
2) 상기 에서 USH 단백질 및 dp60 단백질 사이의 결합 정도를 측정하는 단계; 및,
3) 피검 화합물을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 상기 단계 2)의 시험관에서 USH 단백질 및 dp60(Drosophila p60) 단백질 사이의 결합 정도가 변화된 피검화합물을 선별하는 단계를 포함하는 인슐린 신호전달 조절 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은
1) FOG2 단백질을 발현하는 세포주에 피검화합물을 처리하는 단계;
2) 처리한 상기 단계 1)의 세포에서 FOG2 단백질 및 p85α단백질의 결합 정도를 측정하는 단계; 및,
3) 피검화합물을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 상기 단계 1)의 세포에서 FOG2 단백질 및 p85α단백질의 결합 정도가 변화된 피검화합물을 선별하는 단계를 포함하는 인슐린 신호전달 조절 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은
1) USH 단백질을 발현하는 세포주에 피검화합물을 처리하는 단계;
2) 처리한 상기 단계 1)의 세포에서 USH 단백질 및 dp60 단백질의 결합 정도를 측정하는 단계; 및,
3) 피검화합물을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 상기 단계 1)의 세포에서 USH 단백질 및 dp60 단백질의 결합 정도가 변화된 피검화합물을 선별하는 단계를 포함하는 인슐린 신호전달 조절 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 FOG2 또는 USH 단백질의 발현 또는 활성을 변화시키는 물질을 유효성분으로 함유하는 인슐린 신호 전달 조절용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 FOG2 또는 USH 단백질의 발현 또는 활성을 변화시키는 물질을 인슐린 신호전달 조절용 조성물의 제조에 이용하는 용도를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
1) miR-200 패밀리 miRNA 또는 miR-8 miRNA를 발현하는 세포주에 피검화합물을 처리하는 단계;
2) 처리한 상기 단계 1)의 세포에서 FOG2 또는 USH 단백질의 발현량 또는 활성을 측정하는 단계; 및,
3) 대조군과 비교하여 상기 단계 1)의 세포에서 FOG2 또는 USH 단백질의 발현 또는 활성이 변화된 피검화합물을 선별하는 단계를 포함하는 인슐린 신호전달 조절 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) FOG2 또는 USH를 발현하는 세포주에 피검화합물을 처리하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 세포에서 FOG2 또는 USH 단백질의 발현량 또는 활성을 측정하는 단계; 및,
3) 대조군과 비교하여 상기 단계 1)의 세포에서 FOG2 또는 USH 단백질의 발현 또는 활성이 변화된 피검화합물을 선별하는 단계를 포함하는 인슐린 신호전달 조절 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 피검 화합물의 존재 하에 FOG2 단백질과 p85α단백질을 접촉시키는 단계;
2) 상기 에서 FOG2 단백질 및 p85α단백질 사이의 결합 정도를 측정하는 단계; 및,
3) 피검 화합물을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 상기 단계 2)의 시험관에서 FOG2 단백질 및 p85α단백질 사이의 결합 정도가 변화된 피검화합물을 선별하는 단계를 포함하는 인슐린 신호전달 조절 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 피검 화합물의 존재 하에 USH 단백질과 dp60 단백질을 접촉시키는 단계;
2) 상기 에서 USH 단백질 및 dp60 단백질 사이의 결합 정도를 측정하는 단계; 및,
3) 피검 화합물을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 상기 단계 2)의 시험관에서 USH 단백질 및 dp60(Drosophila p60) 단백질 사이의 결합 정도가 변화된 피검화합물을 선별하는 단계를 포함하는 인슐린 신호전달 조절 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) FOG2 단백질을 발현하는 세포주에 피검화합물을 처리하는 단계;
2) 처리한 상기 단계 1)의 세포에서 FOG2 단백질 및 p85α단백질의 결합 정도를 측정하는 단계; 및,
3) 피검화합물을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 상기 단계 1)의 세포에서 FOG2 단백질 및 p85α단백질의 결합 정도가 변화된 피검화합물을 선별하는 단계를 포함하는 인슐린 신호전달 조절 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) USH 단백질을 발현하는 세포주에 피검화합물을 처리하는 단계;
2) 처리한 상기 단계 1)의 세포에서 USH 단백질 및 dp60 단백질의 결합 정도를 측정하는 단계; 및,
3) 피검화합물을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 상기 단계 1)의 세포에서 USH 단백질 및 dp60 단백질의 결합 정도가 변화된 피검화합물을 선별하는 단계를 포함하는 인슐린 신호전달 조절 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 FOG2 또는 USH 단백질의 발현 또는 활성을 변화시키는 물질을 유효성분으로 함유하는 인슐린 신호 전달 조절용 조성물을 제공한다.
아울러, FOG2 또는 USH 단백질의 발현 또는 활성을 변화시키는 물질을 인슐린 신호전달 조절용 조성물의 제조에 이용하는 용도를 제공한다.
본 발명자들은 모델 시스템으로 초파리를 사용하여, 지방체 세포에서 u-shaped(ush)를 표적함으로써 체구를 조절하는 보존된 miRNA인 miR-8을 발굴하였다. 또한, 초파리 miR-8 miRNA의 인간 상동 유전자인 miR-200의 표적 유전자가 FOG2임을 확인하였다. 초파리의 miR-8 및 USH가 포유동물에서도 보존되어 있으며, USH의 인간 상동 유전자인 FOG2가 PI3K의 조절 서브유니트와 직접 결합하여 기능함을 발견하였다. 인간 암세포주에서 miR-200의 발현을 억제하거나 FOG2를 발현시켰을 때 세포 성장을 촉진하는 PI3K 활성이 감소되는 것을 확인하였으므로, miR-200 및 FOG2를 항암제 등 인슐린신호전달 조절물질의 스크리닝에 유용하게 사용할 수 있다.
도 1 내지 도 4는 miR-8 널(null) 초파리(mir-8 △2 ) 및 야생형 초파리에서 암컷 및 수컷 성체의 표현형(도 1), 체중(도 2), 용화 및 우화(도 3), 및 날개 세포의 크기(도 4)를 비교한 도이다.
도 5 및 도 6은 miR-8 널 초파리에서 인슐린 신호전달에 관련된 단백질의 활성 및 유전자 발현을 웨스턴 블롯으로 확인한 결과(도 5) 및 4EBP의 발현량을 miR-8 널 유충에서 Q-PCR을 통해 확인한 결과(도 6)를 나타낸 도이다.
도 7 및 도 8은 mir-8 인핸서 트랩(trap) GAL4 계통 초파리(mir-8 gal4)의 3기 유충(산란 후 96시간 경과)의 지방체(fat body), 큐티클 및 뇌 조직에서 면역염색을 통해 miR-8의 공간적 발현 패턴을 확인한 결과(도 7) 및 전체 유충, 지방체, 장, 뇌 및 큐티클에서 노던 블롯을 통해 miR-8 발현량을 확인한 결과(도 8)를 나타낸 도이다.
도 9 및 도 10은 mir8 CgG4>mir8 및 mir8 pplG4 및 야생형 초파리의 체중을 비교한 결과(도 9) 및 (도 10) mir8 elavG4 및 mir8 elavG4>mir8의 체중을 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 11는 인간 miR-200 패밀리 miRNA 및 초파리 miR-8의 상동성을 비교한 도이다.
도 12 및 도 13은 인간 세포주인 MCF7에서 miR-200 패밀리가 세포 증식을 촉진하는 것을 확인한 결과(도 12) 및 표적 예측 프로그램을 사용하여 표적 유전자 및 오르쏘로그 선별에 적용한 알고리즘의 모식도를 나타낸 도이다(도 13).
도 13 및 도 14는 miRanda, miTarget, microT, PicTar 및 Target Scan을 사용하여 선별한 초파리 miR-8 및 인간 miR-200 miRNA에 대한 표적 유전자 후보(도 13) 및, 상기 유전자 후보의 3‘UTR 부위를 루시퍼라아제 발현시스템에 적용시켜 miR-8 및 mir-200 패밀리 miRNA 모두에 대하여 반응하는 7개 유전자 쌍을 선별한 결과(도 14)를 나타낸 도이다.
도 16 내지 도 18은 mir8 Cg>ush i, mir8 Cg>Lap1 i, mir8 Cg>Ced-12 i, mir8 Cg>CG8445 i, mir8 Cg>CG12333 i 및 mir8 Cg>atro i 형질전환 초파리의 체중을 측정한 결과(도 16), 상기 초파리에서 각각의 유전자가 녹다운 되었는지 정량적 RT-PCR을 통해 확인한 결과(도 17) 및, w1118, w1118 ush1518, mir-8 Δ2 및 mir-8 Δ2 ush1518 초파리의 체구를 측정한 결과(도 18)를 나타낸 도이다.
도 19 내지 도 21은 miR-8 널 초파리에서 miR-8의 표적 유전자로 선별된 USH의 mRNA의 발현이 실제로 증가되어 있는지 정량적 RT-PCR을 통해 확인한 결과(도 19), USH 단백질의 발현이 실제로 증가되었는지 웨스턴 블롯을 통해 확인한 결과(도 20) 및, miR-8의 ush 3' UTR의 miR 표적 부위에 대한 조절을 miR-8 표적 부위에 돌연변이를 도입시켜 루시퍼라아제 활성 측정을 통해 확인한 결과(도 21)를 나타낸 도이다.
도 22은 초파리 지방체에서 인슐린 신호전달을 억제시켰을 경우, 초파리의 체구 및 날개 세포수를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 23 및 도 24는 miR-8 널 초파리의 지방체에서 PI3K 활성 및 FOXO의 핵위치화를 관찰하여 miR-8 널 초파리의 지방체에서 인슐린 신호전달에 결함이 있는지 확인한 결과(도 23) 및 야생형 유충 또는 miR-8 널 유충의 지방체 조직에서 JNK 및 Akt 인산화 수준을 웨스턴 블롯을 통해 확인한 결과(도 24)를 나타낸 도이다.
도 25는 miR-8을 과발현하는 모자이크 지방 세포에서 면역염색을 통하여 PI3K 활성 및 세포 크기를 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 26 및 도 29는 트윈-스폿 분석[Twin-spot analysis(mitotic clone analysis)]를 통해 miR-8 널 클론의 트윈 스폿이 야생형 클론(화살표)보다 천천히 생성되고, DNA 함량도 더 낮음을 확인한 결과(도 26), USH를 과발현하는 지방체 세포 및 야생형 세포에서 PI3K 활성을 확인한 결과(도 27) 날개 또는 눈 디스크에서 트윈-스폿 분석을 통해 miR-8 널 클론을 생성하였을 때, 상기 기관의 성장 억제 여부를 확인한 결과(도 28) 및, 초파리 유충에서 날개 전구 세포 및 눈 디스크에서 USH 발현을 확인한 결과(도 29)를 타나낸 도이다.
도 30 및 도 34는 USH 과발현 세포에서 면역염색을 통해 세포의 크기(도 30), PI3K 활성(도 31) 및 핵에서의 FOXO 신호(도 32)를 확인한 결과 및, USH 녹다운 모자이크 지방 세포에서 PI3K 활성(도 33) 및 핵의 FOXO 신호(도 34)를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 35는 CgG4, mir8 CgG4, mir8 CgG4>mir8 및 mir8 Cg>ush i 초파리의 지방체 세포 ush 발현의 증가에 의해 miR-8 널 유충의 지방체의 인슐린 신호전달이 억제되는지 FOXO의 표적 유전자인 Inr 및 step mRNA에 대한 정량적 RT-PCR을 수행하여 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 36 및 도 37은 ush mRNA에서 miR-8의 예측된 결합 부위를 탐색한 결과(도 36), FOG2에서 miR-200 패밀리 miRNA의 예측된 결합부위를 탐색한 결과(도 37)를 나타낸 도이다.
도 38은 FOG2 3' UTR의 세 개의 miR-200 표적 부위에 하나(FOG2 m1, FOG2 m2, FOG2 m3), 두 개((FOG2 m12, FOG2 m23) 또는 세 개(FOG2 m123)의 돌연변이를 도입하였을 때, miR-200 miRNA에 대한 조절 여부를 루시퍼라아제 활성 측정을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 39은 각각 다른 기관으로부터 유래한 인간 세포주에서 FOG2 단백질 및 miR-200c 클러스터 miRNA의 발현 사이의 상관관계를 각 세포주에서 FOG2 단백질 및 miR-200 패밀리 miRNA의 발현을 각각 웨스턴 블롯 및 노던 블롯을 수행하여 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 40 내지 도 42 간세포 암종인 Huh7 세포서 miR-141/200a 또는 miR-200b/c/429를 형질전환 시켰을 때 FOG의 발현량 및 Akt의 인산화 정도를 웨스턴 블롯으로 확인한 결과(도 40), 췌장암 세포주인 AsPC1 세포에 miR-141/200a 또는 miR-200b/c/429에 대한 2'-O-메틸 올리고뉴클레오티드 안티센스(2'-O-methyl oligonuclelotides antisense)를 처리하였을 때 FOG의 발현량 및 Akt의 인산화 정도를 웨스턴 블롯으로 확인한 결과(도 41) 및, FAO 세포주에 siFOG2를 처리하였을 때 FOG의 발현량 및 Akt의 인산화 정도를 웨스턴 블롯으로 확인한 결과(도 42)를 나타낸 도이다.
도 43은 Hep3B 세포주에 pCK-flag 및 pCK-FOG2를 형질전환 시킨 다음, 면역복합체 키나아제 분석을 통해 PI3K 활성에 대한 FOG2의 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 44 내지 도 47은 Hep3B 세포주에 pCK-flag 및 pCK-FOG2를 형질전환 시킨 다음, IGF-1 처리 여부 및 FOG2 처리 여부에 따른 Akt 인산화 정도를 웨스턴 블롯으로 확인한 결과(도 44), 8개 FOXO 결합 결합 부위를 가지고 있는 루시퍼라제 리포터 플라스미드(pFK1tk-luc)를 형질전환 시킨 세포에서 miR-200 miRNA의 형질도입 여부에 따른 루시퍼라아제의 활성 변화를 측정한 결과(도 45) 및 상보적인 올리고뉴클레오티드의 형질도입 여부에 따른 루시퍼라아제의 활성 변화를 측정한 결과(도 46) 및, Hep3B 세포주에서 FOG2를 과발현 시킨 경우 루시퍼라아제의 활성 변화를 측정한 결과(도 47)를 나타낸 도이다.
도 48 및 도 49는 Hep3B 세포에서 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 분석을 통하여 miR-200 패밀리 miRNA의 도입(도 48) 및 miR-200 패밀리 miRNA에 상보적인 올리고뉴클레오티드의 도입(도 49)에 따른 세포 생존력을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 50은 Hep3B 세포주에서 FOG2가 발현되거나 발현되지 않는 경우 IRS-1/p85α p110 복합체의 형성 여부를 면역침강분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 51 및 도 52는 Hela 또는 PANC1 세포의 핵 및 세포질 분획에서 FOG2 발현 여부를 웨스턴 블롯으로 확인한 결과(도 51) 및, HepG2 세포에서 면역염색으로 FOG2 위치를 확인한 결과(도 52)를 나타낸 도이다.
도 53 및 도 54는 PANC1 세포에서 FOG2 및 p85α가 함께 위치하고 있는지 면역침전분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 55은 각각의 FOG2 돌연변이 및 p85α를 여러 조직으로부터 유래한 인간 세포주에서 함께 발현시켰을 때 p85α와 결합하는 FOG2 돌연변이를 면역침강분석으로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 56 및 도 58은 PANC1 세포에 , 돌연변이 FOG2_1-412, 돌연변이 FOG2_413-789 및 돌연변이 FOG2_802-1151를 처리한 FOG2 발현량 증가에 따른 PI3K 활성을 측정한 결과(도 56), GST-융합 재조합 p85α단백질과 돌연변이 FOG2_413-789 또는 돌연변이 FOG2_802-1151이 직접 결합하는지 in vitro 결합 분석을 통해 확인한 결과(도 57) 및, FOG2_413-789 또는 돌연변이 FOG2_802-1151를 면역 침강된 PI3K 복합체에 첨가하였을 때, PI3K 활성을 확인한 결과(도 58)를 나타낸 도이다.
도 59 및 도 60 본 발명자들은 dp60이 USH와 인간 HEK293T 세포에서 함께 발현되었을 때, 초파리 USH가 초파리 p60(dp60, p85α의 초파리 오르쏘로그)과 물리적으로 상호작용하는 것을 면역침강분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다: (도 59) USH로 IP, (도 60) dp60으로 IP.
도 61는 USH/FOG2의 세포 내 신호전달과정을 나타낸 모식도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
1) miR-200 패밀리 miRNA 또는 miR-8 miRNA를 발현하는 세포주에 피검화합물을 처리하는 단계;
2) 처리한 상기 단계 1)의 세포에서 FOG2 또는 USH 단백질의 발현량 또는 활성을 측정하는 단계; 및,
3) 대조군과 비교하여 상기 단계 1)의 세포에서 FOG2 또는 USH 단백질의 발현 또는 활성이 변화된 피검화합물을 선별하는 단계를 포함하는 인슐린 신호전달 조절 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) FOG2 또는 USH를 발현하는 세포주에 피검화합물을 처리하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 세포에서 FOG2 또는 USH 단백질의 발현량 또는 활성을 측정하는 단계; 및,
3) 대조군과 비교하여 상기 단계 1)의 세포에서 FOG2 또는 USH 단백질의 발현 또는 활성이 변화된 피검화합물을 선별하는 단계를 포함하는 인슐린 신호전달 조절 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 피검 화합물의 존재 하에 FOG2 단백질과 p85α단백질을 접촉시키는 단계;
2) 상기 에서 FOG2 단백질 및 p85α단백질 사이의 결합 정도를 측정하는 단계; 및,
3) 피검 화합물을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 상기 단계 2)의 시험관에서 FOG2 단백질 및 p85α단백질 사이의 결합 정도가 변화된 피검화합물을 선별하는 단계를 포함하는 인슐린 신호전달 조절 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 피검 화합물의 존재 하에 USH 단백질과 dp60 단백질을 접촉시키는 단계;
2) 상기 에서 USH 단백질 및 dp60 단백질 사이의 결합 정도를 측정하는 단계; 및,
3) 피검 화합물을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 상기 단계 2)의 시험관에서 USH 단백질 및 dp60(Drosophila p60) 단백질 사이의 결합 정도가 변화된 피검화합물을 선별하는 단계를 포함하는 인슐린 신호전달 조절 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) FOG2 단백질을 발현하는 세포주에 피검화합물을 처리하는 단계;
2) 처리한 상기 단계 1)의 세포에서 FOG2 단백질 및 p85α단백질의 결합 정도를 측정하는 단계; 및,
3) 피검화합물을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 상기 단계 1)의 세포에서 FOG2 단백질 및 p85α단백질의 결합 정도가 변화된 피검화합물을 선별하는 단계를 포함하는 인슐린 신호전달 조절 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) USH 단백질을 발현하는 세포주에 피검화합물을 처리하는 단계;
2) 처리한 상기 단계 1)의 세포에서 USH 단백질 및 dp60 단백질의 결합 정도를 측정하는 단계; 및,
3) 피검화합물을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 상기 단계 1)의 세포에서 USH 단백질 및 dp60 단백질의 결합 정도가 변화된 피검화합물을 선별하는 단계를 포함하는 인슐린 신호전달 조절 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
인간 암세포의 증식을 촉진하는 miR-200 패밀리(도 13 참조)의 단독 상동유전자로 miR-8이 알려져 있다(Ibanez-Ventoso et al., 2008). 이에, 본 발명자들은 초파리를 이용하여 miR-200의 생물학적 기능을 밝히고자 하였다. 곤충의 유충기의 성장이 늦는 경우 및/또는 용화(pupariation, 번데기 형성)가 빨리 진행되어 유충 성장기가 짧은 경우에서 체구가 작아지는 것으로 알려져 있다(Colombani et al., 2003; Edgar, 2006; Mirth and Riddiford, 2007). 본 발명자들은 miR-8 널(null) 초파리의 체구 및 체중, miR-8 널 유충의 신체 부피가 상당히 작고(도 1, 도 2 및 도 3 참조), 이러한 miR-8 널 초파리의 작은 체구는 조숙한 용화보다는 유충기 동안의 늦은 성장 때문이고, 세포 크기의 감소 때문이 아니라 세포 수의 감소 때문임을 알 수 있었다(도 3 및 도 4 참조).
또한, 본 발명자들은 miR-8 널 초파리가 왜 천천히 성장하는지 알아보기 위하여, miR-8 널 초파리에서 인슐린 신호전달에 관련된 단백질의 활성을 확인한 결과, miR-8 널 초파리에서 인슐린 신호전달이 상당히 감소되어 있는 것을 알 수 있었다(도 5 및 도 6 참조).
본 발명자들은 유충에서 miR-8의 공간적 발현 패턴 살펴본 결과, 유충의 지방체에서 miR-8 발현량이 가장 많았다(도 7 및 도 8 참조).
최근의 연구에서 초파리 지방체는 에너지 대사 및 성장을 조절하는데 중요한 기관인 것으로 밝혀졌다(Colombani et al., 2005; Colombani et al., 2003; Edgar, 2006; Leopold, P, and Perrimon, N 2007, Nature 450, 186-188). 본 발명자들은 유충의 지방체의 miR-8 발현이 초파리 체구 조절에 중요하고, miR-8의 지방체에서의 기능이 신경세포와 위치-시기(spatio-temporally) 특이적으로 다른 것을 확인하였다(도 10 및 도 11 참조).
본 발명자들은 체구를 조절하는 miR-8 표적 유전자를 찾아내어 miR-8 분자의 기능을 더 알아보고자 하였다. 본 발명자들은 miR-8은 고도로 보존된 miRNA이고, miR-8의 인간 상동유전자가 인간 세포에서 세포 증식을 촉진하므로(도 6 참조) miR-8의 표적 유전자 또한 세포 증식 표현형에 연관되어 있을 것이라고 가정하였다. 본 발명자들은 표적 예측 프로그램을 사용하여 초파리 miR-8 및 인간 miR-200 miRNA에 대한 표적 유전자 후보를 선별하였다(도 14 참조). 표적에서 선별된 후보들은 초파리 및 인간 유전자의 두 그룹으로 분류되었는데, 표적 표적 후보 목록에서 적어도 하나의 종에서 종양 억제자 또는 세포 증식의 음성 조절자로 알려진 초파리 유전자로 ush, Lap1, CG8445, dbo, Lar, Ced-12, CG12333, cbt, Scr, pan, pnut, Spri, Shc, Rassf 및 CG5표적8, 표적 각 초파리 유전자의 인간 오르쏘로그인 FOG2, SEPT7, RIN2, SHC1, HOXB5, KLF11, TCF7L1, ERBB2IP, ELMO2, BAP1, WDR37, KLHL20, PTPRD, RASSF2 및 VAC14를 표적 유전자로 선별하였다. 초파리 유전자인 u-shaped(ush) 및 이의 인간 상동유전자인 Friend of GATA 2(FOG2, ZFPM2)가 상기 두 종에서 예측된 유전자 중에서 가장 보존되어 있었다.
본 발명자들은 상기에서 선별한 표적 유전자 중 miR-8 및 miR-200 패밀리 miRNA의 표적으로 두 miRNA 모두에 대하여 반응하는 7개 유전자 쌍을 선별한 후(도 15 참조), miR-8 miRNA의 표적 유전자가 ush이고, miR-8의 신경 퇴화 예방에 대한 기능(Karres et al., 2007)은 신체 성장에 대한 기능과 공간적으로 뿐만 아니라 분자 수준에서도 분리되어 있으며(도 16 참조), USH가 신체 성장을 억제하는 것을 확인하여(도 18 참조) miR-8이 지방체에서 ush를 억제하는 것을 알 수 있었다(도 19 참조). 이로부터 ush는 다른 신체 부위보다 지방체에서 더 강력하게 억제되어있는 것을 알 수 있었다. 또한, USH 단백질 수준은 mRNA 수준보다 더 현저하게 감소되는 것이 관찰되었는데(도 20 참조), 이는 miR-8이 USH mRNA의 불안정화(destabilization) 및 번역 억제 모두를 통해 USH 발현을 억제하는 것을 가리킨다.
또한, 본 발명자들은 miR-8이 USH의 예측된 표적부위에 직접 결합하여 발현 억제를 매개하는 것을 확인하였고(도 21 참조), miR-8에 대한 예측된 표적 부위는 계통이 먼 D.virilis 및 D.grimshawi를 포함하여 모든 드로소필리드(Drosophilid)종에서 발견되었으므로, ush가 miR-8의 진정한 표적인 것을 알았다.
기존의 연구에서 유충 지방체의 인슐린 신호전달이 비-세포자율적인(non-cell-autonomous) 방식으로 생물체 성장을 조절하는 것이 밝혀진 바 있다(Britton, JS et al., 2002, Dev Cell 2, 239-249; Colombani et al., 2005).
본 발명자들은 초파리 지방체에서 인슐린 신호전달을 억제시켰을 때 miR-8 널 초파리와 유사하게(도 4 참조) 체구가 작고 날개의 세포수가 적은(도 22 참조) 초파리가 나타나는 것으로부터, USH가 인슐린 신호전달을 억제하여 신체 성장을 억제할 것이라는 가정을 하고, 유충 지방체에서 인슐린 신호전달을 억제하였을 때 초파리의 성장이 억제되는지 확인한 결과, miR-8 널 유충의 지방체에서 인슐린 신호전달이 특이적으로 붕괴되어 있음을 알 수 있었다(도 18, 도 23 및 도 24 참조).
또한, 본 발명자들은 지방 세포에서 miR-8의 기능을 더 알아본 결과, miR-8이 세포자율적인(cell-autonomous) 방식으로 PI3K을 활성화시켜 세포성장을 촉진하고(도 25 참조), 세포 성장에서 miR-8의 효과는 발현되는 조직에 따라 달라질 수 있음을 확인하였다(도 26, 도 28, 도 29 참조).
또한, 본 발명자들은 USH가 인슐린 신호전달을 음성적으로 조절하는지 확인한 결과, USH는 PI3K와 평행하거나 상위에서 세포자율적인 방식으로 인슐린 신호 전달을 억제하는 것을 알 수 있었다(도 30, 도 31, 도 32, 도 33 및 도 34 참조).
과도한 인슐린 신호전달은 인슐린 수용체(Inr) 및 사이토헤신cytohesin Steppke(step)의 수준을 FOXO의 음성 피드백을 통하여 감소시키는 것으로 알려져 있다(Fuss, B et al., 2006, Nature 444, 945-948; Puig, O, and Tjian, R 2005, Genes Dev 19, 2435-2446). 본 발명자들은 miR-8이 발현되지 않을 때 인슐린 신호전달이 감소되는 것이 USH의 녹다운을 통해 회복되는지 확인한 결과, miR-8 널 유충의 지방체에서 ush 발현의 증가가 인슐린 신호전달의 결핍에 적어도 일부 영향을 미치는 것을 알 수 있었다(도 35 참조).
상기 miRNA 표적 유전자 탐색 결과 ush mRNA는 하나의 miR-8의 예측된 결합 부위를 가지고 있는데 반해, ush의 포유동물 오르쏘로그인 FOG2는 적어도 세 개의 miR-200 패밀리 miRNA의 예측된 결합부위를 가지고 있었다(도 36 및 도 37 참조). 본 발명자들은 초파리 miR-8 miRNA가 ush mRNA의 3' UTR에 직접 결합하여 발현을 조절했던 것처럼, 인간 miR-200 패밀리 miRNA도 fog2 mRNA의 3' UTR에 직접 결합하여 발현을 조절하는 것을 확인하였다(도 38 참조).
FOG2는 심장, 뇌, 고환, 간, 폐 및 골격근에서 발현된다(Holmes, M et al., 1999, J Biol Chem 274, 23491-23498; Lu, JR et al., 1999, Mol Cell Biol 19, 4495-4502; Svensson, EC et al., 1999, Proc Natl Acad Sci U S A 96, 956-961; Tevosian, SG et al., 1999, Proc Natl Acad Sci U S A 96, 950-955). 성체 조직에서 FOG2가 광범위하게 발현됨에도 불구하고, FOG2의 기능에 대해서는 배아 심장 발달에서의 역할 이외에는 알려진 바가 거의 없다(Fossett, N, and Schulz, RA 2001, Trends Cardiovasc Med 11, 185-190). 한편, miR-200 miRNA는 뇌하수체, 갑상선, 이자섬, 고환, 전립선, 난소, 유방 및 간을 포함하는 다양한 성체 기관에서 발현되는 것으로 알려져 있다(Landgraf, P et al., 2007, Cell 129, 1401-1414). 본 발명자들은 각각 다른 기관으로부터 유래한 인간 세포주에서 FOG2 단백질 및 miR-200c 클러스터 miRNA의 발현 사이의 상관관계를 확인한 결과, 일반적으로 miR-200c 클러스터 일원 및 FOG2의 발현 수준은 음성적 상관관계를 가지고 있었다(도 39 참조).
또한, 본 발명자들은 miR-200 miRNA에 의해 실제로 FOG2가 감소되고(도 40, 도 41 및 도 39 참조), 초파리 인간 miR-200이 miR-8 miRNA의 경우와 같이 인슐린 신호전달의 조절에서 보존된 역할을 가지고 있음을 확인하였다(도 40, 도 41 및 도 42 참조). 또한, FOG2가 PI3K를 억제시키고(도 43 참조), FOG2에 의해 Akt의 인산화가 감소되는 것을 확인하였다(도 44 참조).
Akt는 FOXO 활성을 억제하는데, Akt의 하류 변환자에 대한 miR-200 miRNA의 효과를 분석한 결과 miR-200 miRNA에 의해 FOXO 활성이 감소되고, FOG2에 의해 FOXO 활성이 증가하는 것을 확인하였다(도 45, 도 46 및 도 47 참조).
본 발명자들은 miR-200이 인슐린 신호전달 경로에 특이적으로 영향을 미치는지 확인한 결과, miR-200은 PI3K-Akt-FOXO 신호전달을 특이적으로 조절하는 것을 알 수 있었다(도 44, 도 45 참조).
PI3K 및 AKT의 자극은 세포 증식을 촉진하고, 세포사멸(아폽토시스)을 억제한다고 알려져 있는데(Pollak, 2008), 이와 일치하게 miR-200 miRNA의 도입은 세포 생존력을 증가시켰고(도 50 참조), 상기 miRNA의 억제자의 도입은 이와 반대 효과를 나타내었다(도 50 참조). 또한, FOG2의 활동 메카니즘을 확인한 결과, FOG2는 IRS-1/p85α/p110 복합체의 형성을 방해함으로써 PI3K의 음성 조절자로서 역할을 하는 것을 알 수 있었다(도 51 및 도 52 참조).
FOG2가 핵 전사 공동조절자인 것으로 알려져 있지만, 몇몇의 연구에서 FOG2는 세포질에도 위치하는 것으로 보고되었다(Bielinska, M et al., 2005, Endocrinology 146, 397M 3984; Clugston, RD et al., 2008, Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 294, L665-675). 이는 FOG2가 세포질 내에서 기능을 담당하는 것을 시사하는 것이다(도 53, 도 54 참조).
FOG2가 PI3K와 상호작용하는지 실험한 결과, PI3K의 조절 서브유니트인 p85α와 FOG2가 직접 결합하는 것을 확인하였다(도 55 내지 도 60 참조).
본 발명자들은 p85α와 결합하는 FOG2의 도메인을 규명하기 위하여, 몇몇의 FOG의 절삭(truncated) 돌연변이를 제조하여 확인한 결과, FOG2(507-789 aa)의 중간 영역이 p85α와의 상호작용을 매개하고(도 57 참조), 상기 중간 영역이 PI3K를 억제하는데 중요한 역할을 하는 것을 확인하였다(도 58 참조). 상기 결과는 FOG2가 p83에 직접적으로 결합하여 PI3K 활성의 억제를 야기하는 것을 시사한다. 특히, 본 발명자들은 dp60이 USH와 인간 HEK293T 세포에서 함께 발현되었을 때, 초파리 USH가 초파리 p60(dp60; p85α의 초파리 오르쏘로그)과 물리적으로 상호작용하는 것을 발견하였다(도 61 참조). 이를 통해 USH/FOG2의 활동 메카니즘은 종족을 넘어서 보존된 것임을 알 수 있었다(도 61 참조).
상기 miR-200 패밀리 miRNA를 발현하는 세포주는 심장, 뇌, 고환, 간, 폐 및 골격근 조직으로부터 유래한 인간 세포주이고, 상기 miR-8 miRNA를 발현하는 세포주는 지방체 조직으로부터 유래한 초파리 세포주인 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 FOG2 또는 USH 단백질의 발현량의 측정은 웨스턴 블롯, 면역염색법, 형광염색법 및 리포터 분석(reporter assay)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법으로, 상기 FOG2 및 p85α또는, USH 및 dp60의 결합여부의 측정 및, p85α/p110/IRS-1 복합체 형성의 측정은 공동-면역침전 분석(co-immunoprecipitation) 방법으로 이루어지는 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 단계 1)의 피검화합물은 천연화합물, 합성화합물, RNA, DNA, 폴리펩티드, 효소, 단백질, 리간드, 항체, 항원, 박테리아 또는 진균의 대사산물 및 생활성 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로서, 당업자에게 항암제의 증진 효과가 알려지지 않은 물질들을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 FOG2 또는 USH 단백질의 활성은
ⅰ) p85α/p110 복합체의 활성을 측정하는 단계;
ⅱ) FOXO mRNA 또는 단백질의 발현량을 측정하는 방법; 및,
ⅲ 세포 성장 및 증식을 측정하는 방법으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법으로 측정될 수 있으며, 상기 p85α/p110 복합체(PI3K)의 활성은 PI3K의 인산화효소 활성의 측정이나 AKT 단백질의 인산화 정도를 측정함으로써 측정될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 단백질 사이의 결합은 SPR, 단백질 chip, 겔 쉬프트 분석(gel shift assay), 면역침전법, 공동-면역분석방법, 형광면역분석법 및 방사선면역분석법으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법으로 측정될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 당업계에서 통상적으로 사용되는 단백질의 결합을 측정하는 모든 방법을 통해 측정될 수 있다.
또한, 본 발명은 FOG2 또는 USH 단백질의 발현 또는 활성을 변화시키는 물질을 유효성분으로 함유하는 인슐린 신호 전달 조절용 조성물을 제공한다.
상기 FOG2 또는 USH 단백질의 발현을 변화시키는 물질은 FOG2 또는 USH 단백질의 발현 억제제일 수 있으며, 상기 FOG2 또는 USH 단백질의 발현 억제제는 fog2 또는 ush 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드 또는 작은 간섭 RNA(small interfering RNA, siRNA)인 것이 바람직하다. 또한, 상기 FOG2 또는 USH 단백질의 활성을 변화시키는 물질은 FOG2 또는 USH 단백질의 활성 억제제일 수 있으며, 상기 FOG2 또는 USH 단백질의 활성 억제제는 FOG2 또는 USH 단백질에 상보적으로 결합하는 세포 독성 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 siRNA는 FOG2 또는 USH를 암호화하는 유전자(서열번호 42 또는 서열번호 15)의 mRNA의 염기서열 내에서 선택되는 15 내지 30 머(mer)의 센스 서열 및 상기 센스 서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 서열로 구성되며, 이때, 상기 센스 서열은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 19-27개의 염기로 구성되는 것이 바람직하고, FOG2 단백질 발현 억제제의 경우 서열번호 119로 기재되는 염기서열을 갖는 것이 더욱 바람직하다.
상기 안티센스 뉴클레오티드는 왓슨-클릭 염기쌍에 정의된 바에 따라, DNA, 미성숙-mRNA 또는 성숙된 mRNA의 상보적 염기서열에 결합(혼성화)하여 DNA에서 단백질로서 유전정보의 흐름을 방해하는 것이다. 표적 서열에 특이성이 있는 안티센스 뉴클레오티드의 성질은 그것들을 예외적으로 다기능이 되도록 한다. 안티센스 뉴클레오티드는 모노머 단위의 긴 사슬이기 때문에 이들은 표적 RNA 서열에 대해 쉽게 합성될 수 있다. 최근 많은 연구들은 표적 단백질을 연구하기 위한 생화학적 수단으로 안티센스 뉴클레오티드의 유용성을 증명하였다(Rothenberg et al., J. Natl. Cancer Inst., 81:1539-1544, 1999). 올리고뉴클레오티드 화학 및 향상된 세포흡착, 표적결합 친화도 및 뉴클레아제 내성을 나타내는 뉴클레오티드 합성 분야에서 최근 많은 진보가 있었으므로 안티센스 뉴클레오티드의 사용은 새로운 형태의 억제제로 고려될 수 있다.
상기 펩티드 미메틱스(Peptide Minetics)는 FOG2 또는 USH 단백질의 결합 도메인을 억제하는 펩티드 또는 비펩티드로서 FOG2 또는 USH 단백질의 활성을 억제하는 것이다. 비가수분해성 펩티드 유사체의 주요 잔기로는 β-턴 디펩티드 코어(Nagai et al. 1985, Tetrahedron Lett 26:647), 케토-메틸렌 슈도펩티드류(Ewenson et al. 1986, J Med Chem 29:295; 및 Ewenson et al. 1985, in Peptides: Structure and Function(Proceedings of the 9th American Peptide Symposium) Pierce Chemical Co. Rockland, IL), 아제핀(Huffman et al. 1988, in Peptides: Chemistry and Biology, G.R. Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands), 벤조디아제핀(Freidinger et al. 1988, in Peptides; Chemistry and Biology, G.R. Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands), β-아미노알콜(Gordon et al. 1985, Biochem Biophys Res Commun 126:419) 및 치환 감마 락탐환(Garvey et al., 1988 in Peptides: Chemistry and Biology, G.R. Marshell ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands)을 사용하여 생성할 수 있다.
본 발명의 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 유효성분을 0.0001 내지 50 중량%로 포함한다.
본 발명의 조성물은 상기 FOG2 또는 USH 단백질의 발현 또는 활성을 변화시키는 물질에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균 이등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액이등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화 할 수 있으며, 및 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 및 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아완충당해 기술필요의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 뉴클레오티드 또는 핵산은, 경구, 국소, 비경구, 비 내, 정맥 내, 근육 내, 피하, 안 내, 경피 등의 투여를 목적으로 제조될 수 있다. 바람직하게는, 핵산 또는 벡터가 주사가능한 형태로 사용된다. 이에 따라서 특히 처리될 영역으로는 직접적인 주입을 위하여 주사 가능한 조성물을 위한 임의의 약학적으로 허용되는 매개체와 혼합될 수 있다. 본 발명의 조성물은 특히 등장 멸균 용액 또는 건조 특히 멸균수 또는 적절한 생리 식염수의 첨가에 따라 주사 가능한 용액의 조성을 가능케 하는 동결건조 조성물을 포함할 수 있다. 환자의 종양으로의 핵산의 직접적인 주입은 치료 효율을 감염된 조직에 집중시키도록 하므로 유리하다. 사용되는 핵산의 투여량은 다양한 파라미터, 특히 유전자, 벡터, 사용되는 투여 방식, 문제시되는 질병 또는 대안적으로 요구되는 치료기간에 의해 조절될 수 있다. 또한, 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량은 약 0.01 내지 12.5mg/kg이고, 바람직하게는 1.25 내지 2.5 mg/kg이며, 하루 일회 내지 수회 나누어 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명의 인슐린 신호전달 조절용 조성물은 인슐린 신호전달 경로의 분자 생물학적 연구 및, 예를 들면, 암, 당뇨 및 비만과 같은 인슐린 신호전달 경로가 비정상적으로 작동하여 발생할 수 있는 질병의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.
아울러, 본 발명은 FOG2 또는 USH 단백질의 발현 또는 활성을 변화시키는 물질을 인슐린 신호전달 조절용 조성물의 제조에 이용하는 용도를 제공한다.
상기 FOG2 또는 USH 단백질의 발현을 변화시키는 물질은 FOG2 또는 USH 단백질의 발현 억제제일 수 있으며, 상기 FOG2 또는 USH 단백질의 발현 억제제는 fog2 또는 ush 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드 또는 작은 간섭 RNA(small interfering RNA, siRNA)인 것이 바람직하다. 또한, 상기 FOG2 또는 USH 단백질의 활성을 변화시키는 물질은 FOG2 또는 USH 단백질의 활성 억제제일 수 있으며, 상기 FOG2 또는 USH 단백질의 활성 억제제는 FOG2 또는 USH 단백질에 상보적으로 결합하는 세포 독성 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 siRNA는 FOG2 또는 USH를 암호화하는 유전자(서열번호 11 또는 서열번호 38)의 mRNA의 염기서열 내에서 선택되는 15 내지 30 머(mer)의 센스 서열 및 상기 센스 서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 서열로 구성되며, 이때, 상기 센스 서열은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 19-27개의 염기로 구성되는 것이 바람직하고, FOG2 단백질 발현 억제제의 경우 서열번호 119로 기재되는 염기서열을 갖는 것이 더욱 바람직하다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 형질전환 초파리 및 초파리 배양
본 발명에서 사용한 형질전환 초파리의 특징, 입수처 및 참조문헌을 표 1에 나타내었다. 상기 초파리들을 표준 초파리 배지, 25℃ 조건에서 배양하여 실험에 사용하였다.
표 1
초파리 특징 입수처 참조 문헌
mir-8△2 miR-8 null 초파리 Steve Cohen Karres et al., 2007
mir-8 gal4 UAS-GFP와 조합되어 mir-8 인핸서를 조절함으로써 GFP를 발현 Kyoto Stock Centre Karres et al., 2007
ush1513 프로모터 영역에 돌연변이를 포함하고 있어 낮은 수준으로 ush를 발현하는 ush1513 저차형 유전자(低次型遺傳子, hypomorph)를 포함하는 초파리 Pat Simpson Cubadda, Y et al., 1997
Cg gal4 지방체 및 두부 림프선(anterior lymph gland)에서 Gal4 발현 Young Joon Kim Takata et al., 2004
ppl gal4 지방체 특이적으로 Gal4를 발현/침샘에서는 약화되어 있음 M. Pankratz Zinke et al., 1999
실시예 2. 세포주 배양
미국 세포주 은행(ATCC)에서 구입한 표 2의 세포주를 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
상기에서 배양된 세포주를 트립신-EDTA(Trypsin-ethylenediamine tetraacetic acid, Invitrogen, 미국)를 처리하여 75-세포 배양 플라스크에서 떼어낸 후, 혈청이 함유된 배지를 첨가하여 트립신을 불활성화 시킨 다음, 원심분리하여 침전시켰다. 상등액을 제거한 뒤 각 세포주에 따른 배양 배지를 첨가하여 세포를 현탁시켰다. 살아있는 세포를 트리판블루 색소배제법(trypan blue dye exclusion test)으로 염색한 다음 헤모사이토미터를 이용하여 계수한 후, 100 mm 디쉬에 5×105 세포/플라스크로 계대 배양하였다.
표 2
세포주 배지
HepG2 RPMI-1640
Huh7
AsPC1
PANC1
SW480
MCF7
MDA MB 231
U2OS
HeLa
Hep3B IMDM
HCT116
HCT116p53KD
* IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium, Gibco, 미국): 10% FBS(Gibco) 함유
* RPMI-1640(Gibco): 10% FBS 함유
실시예 3. mir-8 돌연변이 초파리의 작은 체구 표현형
인간 miRNA인 miR-200 패밀리(miR-200a, miR-200b, miR-200c, miR-141, and miR-429)를 인간 세포주에 형질도입했을 경우 세포 성장이 촉진되는 것이 알려진 바 있다(Park, SY et al., 2009, Nat Struct Mol Biol 16, 23-29). 본 발명자들은 아무것도 처리하지 않은 MCF-7 세포주, GFP에 대한 siRNA(siGFP, 서열번호 1: 5'-UGAAUUAGAUGGCGAUGUU-3', 삼천리), miR-200 패밀리[miR-141(has-miR-141, 서열번호 2: 5'-UAACACUGUCUGGUAAAGAUGG-3'), miR-200b(has-miR-200b, 서열번호 3: 5'-UAAUACUGCCUGGUAAUGAUGA-3'), miR-429(has-miR-429, 서열번호 4: 5'-UAAUACUGUCUGGUAAAACCGU-3')] 및 miR-29b(세포 증식을 억제하는 것으로 알려져 있음)를 형질도입한 MCF-7 세포주에서 1, 4, 5, 6, 7 및 8일 째 되는 날 세포 수를 세어 세포 증식을 측정한 결과, miR-200 패밀리를 처리한 경우 아무것도 처리하지 않거나, siGFP를 처리한 경우보다 세포 증식이 증가되고, miR-29b를 처리한 경우 5일째부터 세포 증식이 거의 멈추는 것을 관찰하여, miR-200 패밀리가 인간 세포에서 세포 증식을 촉진하는 것을 다시 한번 확인하였다(도 6).
miR-200 패밀리는 자궁암을 포함하는 암 세포에서 발현이 증가되어 있고(Iorio, MV et al., 2007, Cancer Res 67, 8699-8707; Nam, EJ et al., 2008, Clin Cancer Res 14, 2690-2695), 좌우대칭동물(bilaterian animal)에서 높게 보존되어 있으며, 초파리(Drosophila melanogaster)에서 miR-200의 단독 상동유전자로 miR-8이 알려져 있다(Ibanez-Ventoso et al., 2008). 이에, 본 발명자들은 miR-200의 생물학적 기능을 밝히기 위하여 초파리를 이용하였다. 본 발명자들은 먼저 miR-8 널(null) 초파리[mir-8 △2 (Karres, JS et al., 2007, Cell 131, 136-145)]의 표현형이 야생형 초파리와 비교하였을 때 체구 및 체중이 상당히 작은 것을 관찰하였다(도 1 및 도 2). 상기 초파리의 체중은 각 그룹의 부화(eclusion) 후 3 내지 5일령의 초파리 5마리를 얼음 마취시킨 뒤 측정하였다. 또한, 상기 miR-8 널 초파리는 뇌에서 아폽토시스(apoptosis)가 증가하고 다리 및 날개가 기형인 개체가 나타나는 빈도가 높은 것으로 알려져 있다(Karres et al., 2007).
유충기 동안 곤충의 최종 체구가 결정되는 것은 인간의 청소년기에서 성장이 결정되는 것과 유사하다(Edgar, 2006; Mirth and Riddiford, 2007). 곤충의 유충기의 성장이 늦는 경우 및/또는 용화(pupariation, 번데기 형성)가 빨리 진행되어 유충 성장기가 짧은 경우에서 체구가 작아지는 것으로 알려져 있다(Colombani et al., 2003; Edgar, 2006; Mirth and Riddiford, 2007). 본 발명자들은 부화한지 100시간 째 되는 miR-8 널 유충을 야생형 유충과 비교하였을 때 신체 부피가 상당히 작고(도 3), 각 그룹에서 산란 후 5시간이 지난 알을 회수하여, 매 12시간마다 번데기 및 성충의 수를 세어 측정한 결과, miR-8 널 초파리의 용화는 야생형 초파리와 크게 다르지 않으나(도 3), 우화(羽化, emergence, 번데기에서 탈피하여 성충이 되는 것)는 대략 12시간 정도 지연되는 것을 확인하였다(도 3). miR-8 널 초파리의 작은 체구는 조숙한 용화보다는 유충기 동안의 늦은 성장 때문임을 알 수 있었다.
식품 섭취의 부족은 감소된 섭식 징후에 따른 조숙하거나 지연된 용화를 동반하는 것으로 알려져 있다(Layalle, S et al., 2008, Dev Cell 15, 568-577; Mirth et al., 2005). 그러나 굶주림 조건에서 발현이 감소되는 것으로 알려진 초파리 인슐린-유사 펩티드(Drosophila insulin-like peptides, Dilps)(Colombani et al., 2003; Ikeya et al., 2002)는 miR-8 널 유충에서 발현이 감소되지 않았다. miR-8 널 유충에서 Dilps의 발현량 및 용화 시기에 영향을 미치지 않는 것은 miR-8 널초파리의 작은 체구가 섭식의 감소 때문이 아님을 의미한다.
이에, 본 발명자들은 작은 체구 표현형이 세포 크기 및/또는 세포 수의 감소에 따른 것인지 알아보기 위하여 miR-8 널 초파리 및 야생형 초파리의 날개를 8 내지 10개 회수하여 사진 촬영한 다음, 전체 날개 픽셀당 날개 털의 개수를 세어 세포의 상대적 크기를 계산하였고, 전체 날개 팩셀 영역을 세포 픽셀 영역으로 나누어 세포의 상대적 크기를 측정하였다. 그 결과, miR-8 널 초파리는 야생형 초파리와 비교하였을 때 날개 세포의 크기는 큰 차이가 없었으나 날개 세포의 수가 더 적었다(도 4). 상기 결과로부터 miR-8 널 초파리의 말단 조직의 성장을 감소시킨 이유가 세포 크기의 감소 때문이 아니라 세포 수의 감소 때문임을 알 수 있었다.
실시예 4. miR-8 널 초파리에서 인슐린 신호전달의 감소 확인
본 발명자들은 miR-8 널 초파리가 왜 천천히 성장하는지 알아보기 위하여, miR-8 널 초파리에서 인슐린 신호전달에 관련된 단백질의 활성 및 유전자 발현을 확인하였다. 먼저, 항-인산화 Akt 특이적 항체를 이용하여 활성화된 Akt(p-Akt)의 수준을 웨스턴 블롯으로 확인하였다(도 5). 구체적으로, 야생형 및 miR-8 널 초파리에서 각각 같은 수의 암/수 초파리를 300 ㎕의 용해 완충 용액(1% Triton X-100, 50 mM Tris pH7.4, 500 mM NaCl, 7.5 mM MgCl2, 0.2 mM EDTA, 1 mM NaVO4, 50 mM β-glycerophosphate, 1 mM DTT, 25% glycerol)을 사용하여 공지의 방법으로 균질화(homogenize)한 뒤(Lee, SB et al., 2007, EMBO Rep 8, 360-365), RIPA 버퍼(25 mM Tris, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1% sodium deoxycholate, 0.1% SDS)를 이용하여 분리한 각 그룹의 단백질을 6~10% SDS-PAGE를 이용하여 분리하였다. 분리된 단백질을 반건조 전달(semi-dry transfer) 방식을 이용하여 PVDF 막으로 전달한 후 2% BSA 용액에서 배양하여 블로킹 시킨 다음, 항-인산화-Akt(P-Akt) 항체[1:1,000,(#9271S, Ser473) Cell Signaling Technology, 미국]를 포함하는 2% BSA 용액에서 배양하였다. 이후, 페록시다아제(Peroxidase)가 부착된 항마우스 이차항체(SantaCruz, 미국)가 포함된 2% BSA 용액에서 배양한 후 면역화학법을 이용하여 화학형광 기질(Chemiluminescence, Roche, 미국)을 이용하여 X-ray 필름에 현상시켜 밴드를 확인하였다. 그 결과, miR-8 널 초파리에서 p-Akt의 수준이 감소된 것을 확인하여, miR-8이 없을 경우 Akt 신호 전달 과정이 제대로 이루어지지 않는 것을 알 수 있었다(도 5).
활성화된 p-Akt는 FOXO를 인산화시켜 비활성화시키는 것으로 알려져 있다. FOXO의 인산화는 핵 위치화를 막는데, 이로인해 FOXO 표적 유전자의 전사가 감소된다. 이에 본 발명자들은 FOXO 표적 유전자인 4EBP의 발현량을 miR-8 널 유충에서 4EBP 유전자 Q-PCR을 통해서 발현량을 조사하였다. 우선, 야생형 및 miR-8 널 초파리의 3기 유충(부화 후 96시간 경과)으로부터 Trizol reagent를 이용하여 전체 RNA를 추출한 뒤, 전체 RNA 1 ㎍과 Oligo-dT 1 ㎕(Invitrogen, 미국)에 증류수를 50 ㎕까지 채운 후, SuperScript First-Strand Synthesis System(Invitrogen, 미국)에 넣어 RT-PCR 반응 시켰다. 65℃에서 6분, 4℃에서 5분, 42℃에서 60 분, 95℃에서 5 분, 4℃에서 5 분간 반응하여 cDNA를 합성하였다. 상기 cDNA를 주형으로 하여, 4ebp 센스 프라이머(서열번호 5: 5'-ATGCAGCAACTGCCAAATC-3') 및 4ebp 안티센스 프라이머(서열번호 6: 5'-CCGAGAGAACAAACAAGGTGG--3')의 프라이머 쌍 및 ABI SYBR PCR master mix(Applied Biosystems, 미국)를 이용하여 ABI Prism 7900 Sequence Detection System(Applied Biosystems, 미국)에서 4ebp mRNA에 대한 정량적 PCR을 각각 수행하였다. 이때, rp49 센스 프라이머(서열번호 7: 5'-AGGGTATCGACAACAGAGTG-3') 및 rp49 안티센스 프라이머(서열번호 8: 5'-CACCAGGAACTTCTTGAATC-3')의 프라이머 쌍을 이용하여 rp49 유전자를 정량적 대조군으로서 함께 PCR하였다. 4ebp mRNA 발현량은 rp49 mRNA 양에 따른 상대값으로 환산한 후, Ct(comparative cycle threshold) 값을 매뉴얼(User Bulletin 2, Applied Biosystems, 미국)에 따라 분석하였다. 상기 실험을 3번 반복한 다음, 평균값을(도 6)에 그래프로 나타내었다. 이로부터, miR-8 널 초파리에서 인슐린 신호전달이 상당히 감소되어 있는 것을 알 수 있었다.
실시예 5. 초파리 조직에서 miR-8 발현량 확인
Cohen 등이 초파리의 뇌, 날개 디스크 및 다리 디스크에서 miR-8 발현(Karres et al., 2007)을 확인한 바 있다. 본 발명자들은 유충에서 miR-8의 공간적 발현 패턴을 mir-8 인핸서 트랩(trap) GAL4 계통 초파리(mir-8 gal4)(Karres et al., 2007)의 3기 유충(산란 후 96시간 경과)의 지방체(fat body), 큐티클 및 뇌 조직에서 공지의 방법으로 면역염색을 수행하여 살펴본 결과(Lee, Y et al., 2005, Nat Genet 37, 305-310), 지방체에서 GFP 발현이 가장 높았다(도 7). 또한, 전체 유충, 지방체, 장, 뇌 및 큐티클에서 전체 RNA를 분리하여 노던 블롯을 통해 miR-8 발현량을 확인하였다. 구체적으로, miR-8 Gal4 초파리 전체 및 miR-8 Gal4 초파리를 해부하여 분리한 지방체, 장, 뇌 및 큐티클에서 Trizol reagent(Invitrogen, 미국)을 이용하여 전체 RNA를 추출한 뒤, 각 조직의 전체 RNA 5.4 ㎍을 12.5% 유레아-폴리아크릴아미드 겔에서 전개시켰다. 상기에서 전개된 RNA를 Zeta probe GT 막(Biorad, 미국)으로 전류를 흘려 전달시켰다. miR-8에 상응하는 올리고뉴클레오티드를 [γ-32ATP]로 말단-표지하여 노던 블롯의 프로브로 사용하였다. 상기 프로브를 처리한 막을 인산화 이미징 플레이트(phosphor imaging plate, fugi film, 일본)에 노출시킨 뒤, BAS-2500 시스템(Fugi)을 이용하여 확인하였다. 그 결과 유충의 지방체에서 miR-8 발현량이 가장 많았다(도 8).
실시예 6. miR-8의 지방체(fat body)-특이적 발현에 의한 초파리 체구 증가 확인
최근의 연구에서 초파리 지방체는 에너지 대사 및 성장을 조절하는데 중요한 기관인 것으로 밝혀졌다(Colombani et al., 2005; Colombani et al., 2003; Edgar, 2006; Leopold and Perrimon, 2007). 본 발명자들은 유충의 지방체의 miR-8 발현량이 초파리 체구 조절에 중요할 것이라는 가설을 세우고, miR-8 널 초파리의 지방체 특이적으로 miR-8을 발현시켜주었을 때 초파리의 체중을 관찰하기 위하여 하기 실험을 수행하였다.
<6-1> miR-8 및 miR-200 miRNA 발현 벡터의 제조
본 발명자들은 miR-8 miRNA 및 miR-200c miRNA 클러스터를 발현하는 형질전환 초파리를 제작하기 위하여, 하기와 같이 클로닝을 수행하였다. 먼저, 서열번호 9(5'-TAATACTGTCAGGTAAAGATGTC-3')으로 기재되는 "miR-8 miRNA의 유전체 부위"를 수득하기 위하여, 초파리로부터 Trizol reagent를 이용하여 게놈 DNA를 추출한 뒤, 상기 게놈 DNA(3~5 ㎍)를 주형으로 하여, 서열번호 10(5'-TCACAAAGAATTCCTTATCGCCA-3') 및 서열번호 11(5'-GCTCTAGAATTTTCAGCCGCTTGTCTTCGC-3')의 프라이머 쌍 및 PCR Mastermix(Promega, 미국)를 이용하여 PCR을 수행하였다. 상기의 반응 완료 후 생성된 miR-8의 PCR 산물을 EcoRI의 제한 효소로 각각 절단한 다음, 동일한 제한 효소로 절단한 pUAS 벡터에 삽입하여 UAS-mir-8 벡터를 제조하였다.
또한, 본 발명자들은 miR-200c 및 mir-141를 포함하는 인간 miR-200c 클러스터를 발현하는 형질전환 초파리를 제작하기 위하여, 하기와 같이 클로닝을 수행하였다. 먼저, 서열번호 12로 기재되는 "miR-200c 클러스터"를 발현하는 세포주 HeLa 세포주로 부터 Trizol reagent를 이용하여 게놈 DNA를 추출한 뒤, 상기 게놈 DNA(3~5 ㎍)를 주형으로 하여, 서열번호 13(5'-CGGAATTCACGGTCGAGGGGCTTCGGAG-3') 및 서열번호 14(5'-GCTCTAGACATGCTCCCAAGGCGGGAAGAC-3')의 프라이머 쌍 및 PCR Mastermix(Promega, 미국)를 이용하여 miR-200c 및 mir-141를 포함하는 인간 miR-200c 클러스터를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 대한 PCR 산물을 수득하였다. 상기 PCR 산물을 EcoRI과 XbaI의 제한 효소로 각각 절단한 다음, 동일한 제한 효소로 절단한 pUAS 벡터에 삽입하여 UAS-인간 miR-200c 클러스터 벡터를 제조하였다.
<6-2> 지방체 특이적으로 miR-8을 발현시키는 miR-8 결손 초파리의 제조
표 1의 mir-8 △2 및 Cg gal4를 교배하여 miR-8이 결손된 Cg gal4 초파리인 mir8 CgG4 초파리를 선별하였다. 또한, 표 1의 mir-8 △2 및 ppl gal4를 교배하여 miR-8이 결손된 ppl gal4 초파리인 mir8 pplG4 초파리를 선별하였다. 각각의 mir-8 △2 , Cg gal4, ppl gal4 초파리들을 더블 밸런서 초파리와 교배하여 표준 교배 방법으로 mir8 CgG4 및 mir8 pplG4 초파리를 만들었다. 이후, 상기 실시예 1-1에서 제조한 UAS-mir-8 벡터를 mir8 CgG4 및 mir8 pplG4에 공지의 방법인 P-인자 매개 생식세포 형질전환(P-element-mediated germ line transformation)을 통해 형질전환하여 mir8 CgG4>mir8 및 mir8 pplG4>mir8 초파리를 수득하였다(Rubin GM et al., 1982, 357 Science 218: 348-353). 또한, 상기 실시예 1-1에서 제조한 UAS-인간 miR-200c 클러스터 벡터를 mir8 CgG4 및 mir8 pplG4에 상기와 동일한 방법을 통해 형질전환하여 mir8 CgG4>200c 및 mir8 pplG4>200c 초파리를 수득하였다.
<6-3> miR-8 결손 초파리에서 지방체 특이적인 miR-8 발현이 초파리 성장에 미치는 영향 확인
본 발명자들은 지방체-특이적 Gal4 드라이버인 Cg 및 ppl을 가지는 Cg gal4, mir8 CgG4, mir8 CgG4>mir8 및 mir8 CgG4>200c 또는, ppl gal4, mir8 pplG4, mir8 pplG4>mir8 및 mir8 pplG4>200c의 체중을 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 측정한 결과, miR-8 널 초파리에서 지방체 특이적으로 miR-8을 발현시켰을 때(mir8 CgG4>mir8 및 mir8 pplG4), 야생형 초파리(Cg gal4 및 ppl gal4)와 유사한 정도로 체중이 증가되는 것을 확인하였다(도 9). 이는 miR-8이 지방체 특이적으로 기능하는 것을 뒷받침하고, 지방체의 miR-8이 전체 신체 성장에 중요함을 시사한다. 또한, 인간 miR-200 클러스터를 초파리 지방체에서 발현시켰을 경우(mir8 CgG4>mir8 및 mir8 pplG4>mir8)에도 초파리의 체중이 증가되었다(도 9). 두 염색체 클러스터에 존재하는 인간 miR-200 패밀리 miRNA는 miR-8과 매우 상동성이 높다(도 11). 인간 miR-200c 클러스터가 miR-8의 역할을 효과적으로 대체한다는 사실은 인간 miRNA가 초파리 miRNA 프로세싱 기구를 통해 프로세싱되었기 때문이며, 이는 그들이 보존된 생물학적 기능을 공유하는 것을 의미한다.
<6-4> miR-8 결손 초파리에서 신경세포 특이적인 miR-8 발현이 초파리 성장에 미치는 영향 확인
전술한 바와 같이, miR-8 은 중추신경계에서 발현되어 신경퇴화를 예방하는 것으로 알려져있다(Karres et al., 2007). miR-8이 신경세포에서도 간접적으로 섭식 행동을 조절하여 생물체 성장의 조절에 관여하는지 알아보기 위하여 표 1의 mir-8 △2 및 elav gal4를 교배하여 miR-8이 결손된 elav gal4 초파리인 mir8 elavG4 초파리를 선별하였다.각각의 mir-8 △2 및 elav gal4 초파리를 더블 밸런서 초파리와 각각 교배하여 표준 교배 방법을 이용해 mir-8 △2 와 elav gal4가 같이 들어가 있는 초파리를 만들었다. 상기 실시예 1-1에서 제조한 UAS-mir-8 벡터를 mir8 elavG4에 상기와 동일한 방법을 통해 형질전환하여 mir8 elavG4>mir8 초파리를 수득하였다. mir8 elavG4 및 mir8 elavG4>mir8의 체중을 측정한 결과, 초파리의 체중이 신경세포에서 miR-8의 발현 여부와 상관없이 유사하였다(도 10). 이는 miR-8의 지방체에서의 기능이 신경세포와 위치-시기(spatio-temporally) 특이적으로 다른 것을 의미한다.
실시예 7. miR-8 및 miR-200의 표적 유전자 선별
본 발명자들은 체구를 조절하는 miR-8 표적 유전자를 찾아내어 miR-8 분자의 기능을 더 알아보고자 하였다. 본 발명자들은 miR-8은 고도로 보존된 miRNA이고, miR-8의 인간 상동유전자가 인간 세포에서 세포 증식을 촉진하므로(도 12) miR-8의 표적 유전자 또한 세포 증식 표현형에 연관되어 있을 것이라고 가정하였다. 본 발명자들은 다섯 가지의 표적 예측 프로그램(도 14)을 사용하여 초파리 miR-8 및 인간 miR-200 miRNA에 대한 표적 유전자 후보를 선별하였다: miRanda(John et al., 2004), miTarget(Kim et al., 2006), microT(Kiriakidou et al., 2004), PicTar(Krek et al., 2005), 및 Target Scan(Lewis et al., 2005). 상기에서 선별된 후보들은 초파리 및 인간 유전자의 두 그룹으로 분류되었는데, Ensembl Orthologous data(//www.ensembl.org/), NCBI Homologene data(//www.ncbi.nlm.nih.gov/Homologene/) 및 Inparanoid data(//inparanoid.sbc.su.se/)를 사용하여 상기 두 그룹에서 종간 상동성 유전자쌍을 동정하였다(도 13). 본 발명자들은 상기 표적 후보 목록에서 적어도 하나의 종에서 종양 억제자 또는 세포 증식의 음성 조절자로 알려진 초파리 유전자로 ush, Lap1, CG8445, dbo, Lar, Ced-12, CG12333, cbt, Scr, pan, pnut, Spri, Shc, Rassf 및 CG5608, 상기 각 초파리 유전자의 인간 오르쏘로그인 FOG2, SEPT7, RIN2, SHC1, HOXB5, KLF11, TCF7L1, ERBB2IP, ELMO2, BAP1, WDR37, KLHL20, PTPRD, RASSF2 및 VAC14를 표적 유전자로 선별하였다. 초파리 유전자인 u-shaped(ush) 및 이의 인간 상동유전자인 Friend of GATA 2(FOG2, ZFPM2)가 상기 두 종에서 예측된 유전자 중에서 가장 보존되어 있었다.
실시예 8. 신체 성장의 조절에서 중요한 역할을 하는 miR-8의 표적 유전자 선별
<8-1> miR-8 및/또는 miR-200 miRNA의 표적 유전자에 대한 리포터 유전자 발현 벡터의 제조
본 발명자들은 상기 실시예 7에서 선별한 표적 유전자가 실제로 miR-8 및 miR-200 패밀리 miRNA의 표적인지 확인하기 위하여 miRNA 표적 부위를 포함하는 각 표적 유전자의 3' UTR의 하류에 루시퍼라제 유전자를 삽입시키는 클로닝을 수행하였다. 구체적으로, 각 표적 유전자들의 cDNA를 수득하기 위하여, 초파리 S2 세포주 또는 인간 Hela 세포주로부터 RNeasy mini kit(QIAGEN, 미국)를 이용하여 전체 RNA를 추출한 뒤, 전체 RNA 1 ㎍과 Oligo-dT 1 ㎕(Invitrogen, 미국)에 증류수를 50 ㎕까지 채운 후, SuperScript First-Strand Synthesis System(Invitrogen, 미국)에 넣어 각각 RT-PCR 반응 시켰다. 65℃에서 6분, 4℃에서 5분, 42℃에서 60 분, 95℃에서 5 분, 4℃에서 5 분간 반응하여 cDNA를 합성하였다. 상기 cDNA(3~5 ㎍)을 주형 합성하여, 표 3의 각 유전자에 대한 프라이머 쌍 및 PCR Mastermix(Promega, 미국)를 이용하여 상기 실시예 7에서 선별한 표적 유전자 중 ush, Lap1, CG8445, dbo, Lar, Ced-12, CG12333, cbt, FOG2, SEPT7, RIN2, SHC1, HOXB5, LF11, TCF7L1, ERBB2IP, ELMO2, BAP1, WDR37, KLHL20, PTPRD, RASSF2 및 VAC14의 3' UTR에 대한 PCR을 각각 수행하였다. 이때 초파리 대조 유전자로 atro에 대한 PCRP,함께 수행하였다. 상기의 반응 완료 후 생성된 각 유전자의 3' UTR 부위에 대한 PCR 산물을 하기의 제한 효소로 각각 절단하였다:
ush, atro, CG8445, cbt, lap1, Ced-12, CG12333, dbo, lar은 SacI과 BamHI 제한효소 사용;
FOG2, SEPT7, HOXB5, KLF11, ERBB2IP, ELMO2, BAP1, PTPRD는 XbaI과 EcoRI 제한효소 사용;
RIN2, SHC1, WDR37, KLHL20, RASSF2, VAC14는 XbaI 제한효소 사용; 및,
TCF7l1은 EcoRI과 EcoRV 제한효소 사용.
동일한 제한 효소로 절단한 pAC5.1 루시퍼라제 vector(a kind gift of Elisa Izaurralde)에 삽입하여 루시퍼라제 유전자의 3' UTR 서열에 miR-8 또는 miR-200 패밀리 표적 서열을 가지는 리포터 플라스미드를 제조하였으며, 이를 표 4에 나타내었다.
표 3
유래 유전자 서열번호 프라이머 서열
서열번호 센스 프라이머 서열번호 안티센스 프라이머
초파리 ush 서열번호 15 서열번호 16 5'-ATCGATGAGCTCGAAAGCCAGCTGCGGTGGGAG-3' 서열번호 17 5'-ACGCGGATCCGGCAGCACTCAAATCGTTCGTTG-3'
초파리 atro 서열번호 18 서열번호 19 5'-ATCGATGAGCTCGTGGACAGACAGCAATTGTAGAGAGC-3' 서열번호 20 5'-ACGCGGATCCGCAGAGAAGGTTTTCTGGGATTTGG-3'
초파리 CG8445 서열번호 21 서열번호 22 5'-ATCGATGAGCTCCCAGACGACCAGCATGTACATG-3' 서열번호 23 5'-ACGCGGATCCCAATAACGTTAGGATTCACCCGATT-3'
초파리 cbt 서열번호 24 서열번호 25 5'-ATCGATGAGCTCGAAGAGCAATGCGAGCAGCATC-3' 서열번호 26 5'-ACGCGGATCCGATTGGAATCGTGCGATGATCC-3'
초파리 Lap1 서열번호 27 서열번호 28 5'-GAGCTCTTATTGTCCAATCGATCGAAGTGTC-3' 서열번호 29 5'-GGATCCGCGTGTGTTCTTCAATAATGCA-3'
초파리 Ced-12 서열번호 30 서열번호 31 5'-GAGCTCCATAACGAGCACAATTACTTCACG-3' 서열번호 32 5'-GGATCCCGTCACCAGTTTGTTCATTTTG-3'
초파리 CG12333 서열번호 33 서열번호 34 5'-GAGCTCTCTGCGAAATCCCAAACATCT-3' 서열번호 35 5'-GGATCCCGCTATGCCACGACTATTTGG-3'
초파리 dbo 서열번호 36 서열번호 37 5'-GAGCTCTGTTTATTTGGTAGAGCCTAAAGCG-3' 서열번호 38 5'-GGATCCCCACCGGCAACATTTAGATAT-3'
초파리 Lar 서열번호 39 서열번호 40 5'-GAGCTCCAATGGGATTGCCAGGTCCAC-3' 서열번호 41 5'-GGATCCTCCCCCAAAGAATCGTAATGG-3'
인간 FOG2 서열번호 42 서열번호 43 5'-GCTCTAGACAGTCACCTTTGGTATCAGTGTTTAG-3' 서열번호 44 5'-CGGAATTCCATACTTGCAGCATTGAGTTTAGGG-3'
인간 SEPT7 서열번호 45 서열번호 46 5'-GCTCTAGAGACCACCAGTTAACGTATTAGTTGCC-3' 서열번호 47 5'-CGGAATTCGAGGCCATGATTCCCATTTCTAGT-3'
인간 RIN2 서열번호 48 서열번호 49 5'-GCTCTAGACTTCCCAGTGGTGCATCCAAAGG-3' 서열번호 50 5'-CATAAGTTTAATTTCACTGCAGGTTCTG-3'
인간 SHC1 서열번호 51 서열번호 52 5'-GCTCTAGACTAGCGCTCTCTTCCAGAAGATGC-3' 서열번호 53 5'-GTACTCAGGAACTGCAGGTTTTGC-3'
인간 HOXB5 서열번호 54 서열번호 55 5'-GCTCTAGACAGAGGAGCCCAGCGGCCCA-3' 서열번호 56 5'-CGGAATTCCACTGAGACAGGCCCCGCAAAGACA-3'
인간 KLF11 서열번호 57 서열번호 58 5'-TCTAGAGGTCCATTAGGACATCACTC-3' 서열번호 59 5'-GAATTCCTGCCCAGGCAATAAAGTG-3'
인간 TCF7L1 서열번호 60 서열번호 61 5'-GAATTCGACCCCTGCAGGCTGTCAC-3' 서열번호 62 5'-GATATCGGGAGTTTAAATTGCTCC-3'
인간 ERBB2IP 서열번호 63 서열번호 64 5'-GGGGAGAGCTACGTGGTAGTATG 서열번호 65 5'-CCAATACTTTCAAAGAAAACTT-3'
인간 ELMO2 서열번호 66 서열번호 67 5'-CTCTAGAAGACCCCAGGAAGTTGGCCTT-3' 서열번호 68 5'-GAATTCCCCCAAGGTTCCATCCTAAGA-3'
인간 BAP1 서열번호 69 서열번호 70 5'-CTCTAGACCTGACTCTGCAGCCCACTCTT-3' 서열번호 71 5'-GAATTCAGGAAGAGCTGAGTGGTGCCAG-3'
인간 WDR37 서열번호 72 서열번호 73 5'-TCTAGAGTCTGGGTGTCTTAGGATGATGG-3' 서열번호 74 5'-TCTAGAGTTCAATTTCTAGCTCATCGTGATG-3'
인간 KLHL20 서열번호 75 서열번호 76 5'-TCTAGAAGAAAAATCTTTGAATAAGACTAAC-3' 서열번호 77 5'-TCTAGAAGCTAAAATTTTTTTAATGGTAA-3'
인간 PTPRD 서열번호 78 서열번호 79 5'-CTCTAGACGTTATGTGGCTTTGCCATCC-3' 서열번호 80 5'-GAATTCGTAACAAATGGAACTTGTGTCAGC-3'
인간 RASSF2 서열번호 81 서열번호 82 5'-TCTAGATGTGTGCACACATGGTACGTGTC-3' 서열번호 83 5'-TCTAGATGTATGGCTCCCTTGCTGAGG-3'
인간 VAC14 서열번호 84 서열번호 85 5'-TCTAGAAACACTAAGGGTCGTCACGCC-3' 서열번호 86 5'-TCTAGACTTTGTGCTGGTGCCTACGTG-3'
표 4
유전자 GenBank 접근 번호 3'UTR의 클로닝 부위 벡터 명칭
초파리 유전자 ush NM_057432.2 4154-4168 pAC-ush
atro NM_206303.1 6524-8298 pAC-atro
CG8445 NM_176194.1 1718-2091 pAC-CG8445
cbt NM_164384.1 1495-2003 pAC-cbt
Lap1 NM_137163.3 3817-4029 pAC-Lap1
Ced-12 NM_135704.2 2285-2451 pAC-Ced-12
CG12333 NM_142466.2 1761-1948 pAC-CG12333
dbo NM_080250.2 2416-2604 pAC-dbo
Lar NM_078880.2 6218-6458 pAC-Lar
인간 유전자 FOG2 NM_012082.2 3494-4322 pAC-FOG2
SEPT7 NM_001788.4 1518-2410 pAC-SEPT7
RIN2 NM_018993.2 2738-3963 pAC-RIN2
SHC1 NM_003029.3 1552-2860 pAC-SHC1
HOXB5 NM_002147.3 877-1759 pAC-HOXB5
KLF11 NM_003597.4 1704-3867 pAC-KLF11
TCF7L1 NM_031283.1 1851-2717 pAC-TCF7L1
ERBB2IP NM_018695.2 5022-6826 pAC-ERBB2IP
ELMO2 NM_133171.3 3235-3554 pAC-ELMO2
BAP1 NM_004656.2 2317-3244 pAC-BAP1
WDR37 NM_014023.3 3627-4589 pAC-WDR37
KLHL20 NM_014458.3 3229-3462 pAC-KLHL20
PTPRD NM_002839.2 9771-10044 pAC-PTPRD
RASSF2 NM_014737.2 1436-5354 pAC-RASSF2
VAC14 NM_018052.3 2649-3040 pAC-VAC14
<8-2> miR-8 및/또는 miR-200 miRNA의 표적 유전자에 대한 조절 확인
표 4의 각 리포터 플라스미드 및 레닐라 루시퍼라제 발현 벡터(Promega, 미국)와 miR-141, miR-200a(hsa-miR-200a, 서열번호 87: 5'-UAACACUGUCUGGUAACGAUGU-3'), miR-200b, miR-200c(has-miR-200c, 서열번호 88: 5'-UAAUACUGCCGGGUAAUGAUGGA-3') 및 miR-429의 miR-200 패밀리 및 miR-8(dme-miR-8, 서열번호 89: 5'-UAAUACUGUCAGGUAAAGAUGUC-3')의 각 miRNA를 삼천리 사로부터 구입하여 초파리 S2 세포주 또는 인간 Hela 세포주에 함께 형질전환 시킨 다음, 루시퍼라아제 활성을 dual-luciferase assay(Promega, 미국)을 이용하여 형광측정기(luminometer, Biorad)에서 측정하였고 그 결과를 표 5에 나타내었다. 초파리 및 인간 세포 각각에서 miR-8 및 mir-200 패밀리 miRNA 모두에 대하여 반응하는 7개 유전자 쌍을 선별하였다(도 15)
표 5
Figure PCTKR2009007161-appb-T000001
※ Ts: Targetscan; pt: Pictar;, mr: Miranda; mt: miTarget; mc: microT
※ 최소 두 번의 독립적인 실험에서의 발현량에 대한 배수의 평균을 나타냄
※ 0.8배 이하로 감소된 값은 볼드체로 나타냄
※ n.d.: 검출되지 않음
실시예 9. 신체 성장을 조절하는 miR-8의 표적 유전자인 ush
<9-1> miR-8 표적 유전자가 나타내는 표현형 확인
상기 실시예 8-2에서 선별된 표적 유전자가 miR-8 널 초파리에서 관찰된 표현형과 생리적으로 상응되는 활성을 가지는지 확인하기 위하여 하기 실험을 수행하였다. 구체적으로, 상기 실시예 6-2에서 제조한 mir8 CgG4 초파리에 표적 유전자인 ush, Lap1, Ced-12, CG8445 및 CG12333 및, 대조 유전자인 atro(신경퇴화를 예방한다고 알려져 있음)에 대한 dsRNA를 발현하는 UAS 벡터(Vienna RNAi Library Centre)를 mir8 CgG4 유충에 상기 실시예 6-2와 동일한 방법으로 형질전환시켜 ush, Lap1, Ced-12, CG8445, CG12333 및 atro가 각각 지방체 특이적으로 녹다운된 mir8 Cg>ush i, mir8 Cg>Lap1 i, mir8 Cg>Ced-12 i, mir8 Cg>CG8445 i, mir8 Cg>CG12333 i 및 mir8 Cg>atro i 형질전환 초파리를 제조하였다.
상기 녹다운 초파리들에서 각 유전자가 실제로 녹다운 되었는지 정량적-RT-PCR을 통해 확인하였다. 구체적으로, 상기 형질전환 초파리의 3기 유충(부화 후 96시간 경과)으로부터 전체 RNA를 추출하여 표 6의 각 유전자에 대한 프라이머 쌍을 이용하여 상기 실시예 4와 동일한 방법으로 ush, Lap1, Ced-12, CG8445, CG12333 또는 atro mRNA에 대한 정량적 PCR을 각각 수행하였다. 이때, 실시예 4의 rp49에 대한 프라이머 쌍을 이용하여 rp49 유전자를 정량적 대조군으로서 함께 PCR하였다. ush, Lap1, Ced-12, CG8445, CG12333 및 atro mRNA 발현량은 rp49 mRNA 양에 따른 상대값으로 환산한 후, Ct(comparative cycle threshold) 값을 매뉴얼(User Bulletin 2, Applied Biosystems, 미국)에 따라 분석하였다. 상기 실험을 3번 반복한 다음, 평균값을(도 17)에 그래프로 나타내었다. 상기 정량적-RT-PCR 결과, Lap1을 제외한 다른 유전자들이 녹다운 된 것을 확인하였다(도 17).
표 6
유전자 프라이머
센스 프라이머 안티센스 프라이머
ush 서열번호 90 5'-ATTAAATCGGAGCCTCTGGA-3' 서열번호 91 5'-GGCTGTCGCTGGCCT-3'
Ced-12 서열번호 92 5'-GTGCCGGAAAACTCATTC-3' 서열번호 93 5'-GTACAGCTGGTGGGTCATCT-3'
CG8445 서열번호 94 5'-CATGAATCACGGCGG-3' 서열번호 95 5'-TGAACTTATCGTAGTTGTGGGT-3'
CG12333 서열번호 96 5'-GGACTTCCGAGAGGCAAT-3' 서열번호 97 5'-ATCGCAGTCCAGCAGC-3'
Lap1 서열번호 98 5'-CACAACAAGTGCAATATACGG-3' 서열번호 99 5'-TGCTATTCAAAGCATCTTGGT-3'
atro 서열번호 100 5'-AGCAGGATACGCCCAAC-3' 서열번호 101 5'-TGCGGCTACCGGACT-3'
<9-2> miR-8 miRNA의 표적 유전자인 ush
표 1의 CgG4(야생형), 상기 실시예 6-2에서 제조한 mir8 CgG4(miR-8 널 초파리) 및 mir8 Cg>mir8(miR-8 널 초파리에서 지방체 특이적으로 miR-8을 발현시킨 초파리) 및, 상기 실시예 9-1에서 제조한 mir8 Cg>ush i, mir8 Cg>Lap1 i, mir8 Cg>Ced-12 i, mir8 Cg>CG8445 i, mir8 Cg>CG12333 i 및 mir8 Cg>atro i 초파리 계통의 체중을 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 측정한 결과, miR-8 널 초파리에서 지방체 특이적으로 miR-8을 발현시켰을 때 야생형과 유사한 정도로 체중이 증가되었고, miR-8 널 초파리에서 지방체 특이적으로 ush를 녹다운 시킨 경우에서 같은 효과가 나타났다(도 16). 이로부터 miR-8 miRNA의 표적 유전자가 ush인 것을 확인하였다.
miR-8가 atrophin(atro)를 표적하여 신경세포 퇴화를 예방하는 것이 보고된 바 있었다(Karres et al., 2007). 본 발명자들은 atro가 지방체에서 발현되어 체구 조절에도 관여하는지 확인하기 위하여 하기 실험을 수행하였다. atro는 초파리 환추(環椎, Atlas, 제 1 경추)를 따라, 유충의 지방체에서 발현되는 것이 알려져 있다(Chintapalli, VR et al., 2007, Nat Genet 39, 715-720). 그러나 지방체의 atro 녹다운은 miR-8 널 초파리의 작은 체구 표현형을 치유하지 못했다(도 16). 이로부터 miR-8의 신경 퇴화 예방에 대한 기능(Karres et al., 2007)은 신체 성장에 대한 기능과 공간적으로 뿐만 아니라 분자 수준에서도 분리되어 있는 것을 알 수 있었다.
<9-3> ush 녹다운 초파리의 표현형 확인
본 발명자들은 dsRNA에 의한 ush 녹다운의 비표적 효과의 가능성을 배재하기 위하여 ush1513 초파리(Cubadda, Y et al., 1997, Genes Dev 11, 3083-3095)를 야생형 초파리(w1118) 또는 miR-8 널 초파리(mir-8 Δ2)와 교배하여 ush1513 이형 접합체(w1118 ush1518) 및 miR-8 널 ush1513 이형 접합체(mir-8 Δ2 ush1518)를 제조하였다. 각각의 mir-8 Δ2 및 ush1513 파리를 더블 밸런서 초파리와 교배하여 표준 교배 방법을 이용하여 각각의 돌연변이가 한 개체에 들어가 있는 초파리를 만들었다. 상기 w1118, w1118 ush1518, mir-8 Δ2 및 mir-8 Δ2 ush1518 초파리의 체구를 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 측정하여 비교한 결과, ush1513 이형 접합체는 야생형 초파리에 비해 성충의 체구가 더 크고, miR-8 널 초파리에서 ush가 낮은 수준으로 발현되는 경우에서 작은 체구 표현형이 완화되는 것을 관찰할 수 있었다(도 18). 이로써 USH가 신체 성장을 억제하는 것을 알 수 있었다.
실시예 10. miR-8에 의한 USH의 발현 억제 확인
<10-1> miR-8 널 초파리에서 ush mRNA의 발현량 확인
본 발명자들은 miR-8 널 초파리에서 miR-8의 표적 유전자로 선별된 USH의 mRNA의 발현이 실제로 증가되어 있는지 정량적 RT-PCR을 수행하여 확인해보았다. 유충 또는 유충의 지방체로부터 분리한 전체 RNA에서 상기 실시예 4와 동일한 방법으로 정량적 RT-PCR을 수행하여 내재적 ush mRNA 수준을 결정하였다. 이때, ush 센스 프라이머(서열번호 102: 5'-CGAATTCCGATGTATCCAACG-3') 및 ush 안티센스 프라이머(서열번호: 103: 5'-GGAGTTGTTGTTCTCGTGCACC-3')의 프라이머 쌍을 사용하였고, 실시예 4의 rp49에 대한 프라이머 쌍을 이용하여 rp49를 정량적 대조군으로 함께 PCR 하였다.
그 결과, ush mRNA는 miR-8 널 유충 전체(~1.3 배)보다 유충의 지방체(~2.0 배)에서 더욱 발현이 증가되어 있었는데, 이는 miR-8이 지방체에서 ush를 억제하는 것을 가리킨다(도 19). 이로부터 ush는 다른 신체 부위보다 지방체에서 더 강력하게 억제되어있는 것을 알 수 있었다.
<10-2> miR-8 널 초파리에서 USH 단백질의 발현량 확인
본 발명자들은 miR-8 널 초파리에서 miR-8의 표적 유전자로 선별된 USH의 단백질의 발현이 실제로 증가되어 있는지 웨스턴 블롯을 수행하여 확인해보았다.
또한, 유충 또는 유충의 지방체에서 항-USH 항체(Peptron, 한국)를 이용하여 상기 실시예 4와 동일한 방법으로 웨스턴 블롯을 수행하였다. 이때, 항-ACTIN 항체를 사용하여 ACTIN의 발현량을 함께 관찰하여 정량적 대조군으로 사용하였다.
그 결과, USH 단백질 수준은 mRNA 수준보다 더 현저하게 감소되는 것이 관찰되었는데(도 20), 이는 miR-8이 USH mRNA의 불안정화(destabilization) 및 번역 억제 모두를 통해 USH 발현을 억제하는 것을 가리킨다.
<10-3> miR-8의 ush 3' UTR의 miR 표적 부위에 대한 조절 확인
<10-3-1> 돌연변이 ush 3' UTR miR 표적 부위를 가지는 벡터 제조
본 발명자들은 ush의 3' UTR의 miR-8 표적 부위에 돌연변이를 도입시켰을 때 miR-8에 의한 조절에 변화가 생기는지 확인하기 위하여 하기 클로닝을 수행하였다.
구체적으로, 상기 8-1에서 PCR을 통해 수득한 ush의 3' UTR 부위에 대한 PCR 산물을 BamH1 및 Sac I 제한 효소로 각각 절단한 다음, 동일한 제한 효소로 절단한 pGL3_CMV 벡터(modified from Promega's pGL3, Kim et al., Nucleic Acid Research, 2009) 에 삽입하여 루시퍼라제 유전자의 3' UTR 서열에 miR-8 표적 서열을 가지는 리포터 플라스미드를 제조하였으며, “Luc-ush 3'UTR”로 명명하였다.
또한, 상기 Luc-ush 3'UTR에 서열번호 104(5'-CAACCATCGACGACAACTCTCCCGGAAAATCTCC-3') 및 서열번호 105(5'-GGAGATTTTCCGGGAGAGTTGTCGTCGATGG TTG-3')의 프라이머 쌍 및 QuickChange Site-Directed Mutagenesis kit(Stratagene, 미국)을 사용하여 ush의 3' UTR의 miR-8 표적 부위에 점돌연변이를 도입하여“Luc-ush 3'UTR mut”로 명명하였다.
아울러, 상기 실시예 6-1에서 PCR을 통해 수득한 miR-8 miRNA의 유전체 부위를 EcoRI 과 XbaI 의 제한 효소로 각각 절단한 다음, 동일한 제한 효소로 절단한 pAC 5.1 벡터(Invitrogen)에 삽입하여 “Acmir8 ”벡터를 제조하였다.
<10-3-2> ush 3' UTR의 돌연변이 miR 표적 부위에 도입된 돌연변이에 서 miR-8에 의한 조절 여부 확인
초파리 S2 세포에 pGL3_CMV 벡터(Luc null, 양성대조군), 상기 실시예 10-3-1에서 제조한 Luc-ush 3'UTR 또는 Luc-ush 3'UTR mut를 Acmir8 및 renilla 루시퍼라제 발현 벡터(Rehwinkel J et al., RNA,2005)를 공지의 방법인 DDAB 방법을 이용하여 공동 형질전환시킨 다음(Han, 1996), 루시퍼라아제 활성을 dual-luciferase assay(Promega, 미국)을 이용하여 형광측정기(luminometer, Biorad)에서 측정하였다. 그 결과, 루시퍼라아제의 3' UTR에 포함된 miR-8 표적 부위가 돌연변이 되었을 경우 루시퍼라제 활성은 양성 대조군 만큼 증가하는 것을 확인하였다(도 21). 이는 miR-8이 의 예측된 표적부위에 직접 결합하여 발현 억제를 매개하는 것을 가리킨다. miR-8에 대한 예측된 표적 부위는 계통이 먼 D.virilis 및 D.grimshawi를 포함하여 실험한 모든 드로소필리드(Drosophilid)종에서 발견되었다. 이로써, ush가 miR-8의 진정한 표적인 것을 알았다.
실시예 11. miR-8 및 USH에 의한 PI3K 조절 확인
몇몇의 연구에서 유충 지방체의 인슐린 신호전달이 비자발적인 방법으로 생물체 성장을 조절하는 것이 밝혀진 바 있다(Britton et al., 2002; Colombani et al., 2005). 이를 확인하기 위하여 본 발명자들은 유충 지방체에서 인슐린 신호전달을 억제하였을 때 초파리의 성장이 억제되는지 확인하기 위하여 하기 실험을 수행하였다. 구체적으로, 표 1의 CgC4 초파리를 PI3K DN 초파리(지배적 네거티브 PI3K를 발현하는 초파리) 또는 dsInR 초파리(InR에 대한 dsRNA를 발현하는 초파리)와 교배하여 Cg>PI3K DN(지방체 특이적으로 지배적 네거티브 PI3K를 발현) 및 Cg>dsInR(지방체 특이적으로 InR에 대한 dsRNA를 발현)를 제조하였다. 상기 CgC4, Cg>PI3K DN 및 Cg>dsInR 초파리의 체구를 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 측정하여 비교한 결과, Cg>PI3K DN 및 Cg>dsInR 초파리는 CgC4 초파리에 비해 성충의 체구가 더 작았다. 또한, CgC4 및 Cg>PI3K DN 초파리의 날개의 세포 크기를 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 측정하여 비교하였으나, 유의한 차이는 없었고, CgC4 및 Cg>dsInR 초파리의 날개의 세포 수를 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 측정하여 비교하였을 때 Cg>dsInR 초파리의 날개 세포 수가 CgC4 초파리보다 적었다(도 18).
실시예 12. miR-8 널 초파리의 지방체에서 인슐린 신호전달의 특이적 붕괴 확인
본 발명자들은 초파리 지방체에서 인슐린 신호전달을 억제시켰을 때 miR-8 널 초파리와 유사하게(도 4) 체구가 작고 날개의 세포수가 적은(도 22)초파리가 나타나는 것으로부터, USH가 인슐린 신호전달을 억제하여 신체 성장을 억제할 것이라는 가정을 하고, miR-8 널 초파리의 지방체에서 인슐린 신호전달에 결함이 있는지 살펴보았다. 구체적으로, tGPH 벡터(PH 도메인에 융합된 GFP 단백질을 발현하는 벡터, Britton et al., 2002)를 야생형 유충 또는 miR-8 널 유충에 상기 실시예 6-2와 동일한 방법으로 형질도입해 발현시킨 다음, 각 그룹의 3기 유충을 해부하여 지방체에서 상기 실시예 5와 동일한 방법으로 면역 염색을 수행하였다. 이때, tGFP 염색시에는 고정을 위해 Zamboni's fixative(4% paraformaldehyde, 7.5% saturated picric acid in PBS)를 사용하였고, 항 GFP 항체(Sigma, 미국) 및 항-FOXO 항체(1:200, O. Puig로부터 얻음)를 사용하였다. phalloidin 및 DAPI으로 상기 야생형 유충 또는 miR-8 널 유충의 지방체 조직 시료를 염색하여 액틴 및 핵을 각각 관찰하였다. PH 도메인은 PI3K에 의해 생성된 세포막-부착 PIP3(membraneanchored phosphatidylinositol-3,4,5-triphosphate)와 결합하므로, tGFP에 의해 발현되는 GFP 신호를 통해 세포막-부착 PIP3를 탐지하여 PI3K 활성을 측정할 수 있다. 본 발명자들은 야생형과 비교하였을 때 miR-8 널 초파리의 지방체에서 PI3K 활성이 하향 조절되어(도 23) FOXO의 핵위치화가 더 증가된 것(도 23)을 확인하였다. 또한, 야생형 유충 또는 miR-8 널 유충의 지방체 조직에서 상기 실시예 4와 동일한 방법으로 항-p-Akt(인산화-Akt) 항체(Ser505, Cell Signalling), 항-Akt 항체(Cell Signalling, 미국), 항-p-JNK(인산화-JNK) 항체(Santa cruz, 미국) 및 항-JNK 항체(Santa cruz, 미국)를 이용하여 웨스턴 블롯을 수행한 결과 miR-8 널 초파리의 지방체에서 대조군과 비교하였을 때 인산화-JNK의 수준은 차이가 없었지만 인산화-Akt는 상당히 감소되어 있었다(도 24). 이로부터 miR-8 널 유충의 지방체에서 인슐린 신호전달이 특이적으로 붕괴되어 있음을 알 수 있었다.
실시예 13. miR-8이 PI3K을 활성화시켜 세포-자발적인 방법으로 세포성장을 촉진
<13-1> miR-8에 의한 PI3K 활성화 여부 확인
본 발명자들은 지방 세포에서 miR-8의 기능을 더 알아보기 위하여, miR-8 이형 접합체의 지방체에서 miR-8이 발현될 때 GAL4가 과발현되는 모자이크 클론을 공지의 방법을 이용하여 제조하였다(Seth S. Blair, Generating Imaginal Disc Clones in Drosophila, CSH Protocols, 2007; pdb.prot4793). miR-8을 과발현하는 모자이크 지방 세포에서 상기 실시예 12와 동일한 방법으로 tGPH 벡터를 형질전환한 후 항-GFP 항체(세포막 염색, PI3K 활성 측정) 및 항-CD2 항체(miR-8 널 세포 염색)를 이용하여 면역염색을 실시한 결과, miR-8 과발현 세포의 세포막에서 GFP 신호가 증가하였고, 세포 크기도 miR-8 널 세포에 비해 큰 것을 관찰하였다(도 25). 이는 miR-8이 세포-자발적인 방법으로 PI3K을 활성화시켜 세포성장을 촉진하는 것을 시사한다.
<13-2> miR-8의 지방체 조직 특이적인 세포-자발적 성장 촉진 확인
본 발명자들은 다음으로 트윈-스폿 분석[Twin-spot analysis(mitotic clone analysis)]를 통해 기능 결핍 표현형(loss of function phenotype)을 관찰하고자 하였다. FLP/FRT 시스템을 사용하여 miR-8의 유사분열 널 클론(mitotic null clone)을 제조하였다(Golic, K.G. and Lindquist, S, 1989). 이때, 열충격을 주었을 때 특이적으로 크로모좀 리컴비네이션이 일어나 세포분열후 한 쪽 세포는 널 클론이 되고 다른 한쪽 세포는 두개의 표현형을 갖는 트윈-스폿이 된다. miR-8 널 클론의 세포는 트윈 스폿(miR-8 야생형 카피에서 얻은 세포)의 주변 세포보다 더 작았다(도 26 및 도 27). 이는 지방체에서 miR-8이 인슐린 신호전달을 증진시켰던 것에서 예견된 바에 의하면, miR-8이 지방 세포의 성장도 촉진한다는 것을 가리킨다. 본 발명자들은 배아기 또는 새로 부화된 유충기에서 클론을 유도하였을 때 트윈 스팟 세포 근처에 널 클론 세포가 거의 생기기 않는 것을 발견하였다. 이는 유충의 발달동안 miR-8 널 세포의 증식/생존의 실패가 빈번하다는 것을 의미한다(도 26). 날개 또는 눈 디스크에서 상기와 동일한 방법으로 트윈-스폿 분석을 실시하였을 때, miR-8 널 클론은 생성되었지만, 상기 기관의 성장 억제는 미미했다(Karres et al., 2007)(도 28). 이로부터 세포 성장에서 miR-8의 효과는 조직 형태에 의존적인 것을 알 수 있었고, 이는 USH가 지방체에는 존재하지만 날개 전구 세포 또는 눈 디스크에서는 존재하지 않는 사실로부터 설명될 수 있을 것이다(Cubadda et al., 1997)(도 29).
실시예 14. 인슐린 신호전달 과정에서 ush 의 역할 확인
<14-1> 인슐린 신호전달 과정에서 USH의 역할 확인
본 발명자들은 USH가 인슐린 신호전달을 음성적으로 조절하는지 확인하기 위하여 USH를 과발현하는 지방세포의 모자이크 클론을 상기 실시예 13-1과 동일한 방법으로 제조하였다. 상기 USH-과발현 모자이크 클론에서 상기 실시예 12와 동일한 방법으로 tGPH 벡터를 형질전환한 후 항-GFP 항체(세포막 염색, PI3K 활성 측정) 및 항-LacZ 항체(USH 발현 세포 염색)를 이용하여 면역염색을 실시한 결과, USH-과발현 세포는 주변의 야생형 세포와 비교하였을 때 크기가 작았고, 세포막에서 상당히 낮은 tGPH 신호가 나타났으며(도 30 및 도 31), 핵에서 FOXO 신호가 높았다(도 32).
<14-2> 인슐린 신호전달 경로에서 USH의 조절 위치 확인
본 발명자들은 ush 녹다운 표현형을 관찰하기 위하여 ush에 대한 dsRNA를 발현하는 모자이크 지방 세포를 상기 실시예 13-1과 동일한 방법으로 제조하였다. 상기 모자이크 ush 돌연변이 세포에서 상기 실시예 12와 동일한 방법으로 tGPH 벡터를 형질전환한 후 항-GFP 항체(세포막 염색, PI3K 활성 측정) 및 항-CD2 항체(miR-널 세포 염색)를 이용하여 면역염색을 실시한 결과, tGPH 신호가 상당히 증가되었고(도 33), 핵의 FOXO 신호는 감소된 것을 확인하였다(도 34). 이로부터, 세포 자발적인 방법에서 USH는 PI3K와 평행하거나 상위에서 인슐린 신호 전달을 억제하는 것을 알 수 있었다.
실시예 15. ush 발현의 증가에 의한 miR-8 널 유충의 지방체의 인슐린 신호전달 억제 확인
과도한 인슐린 신호전달은 인슐린 수용체(Inr) 및 사이토헤신cytohesin Steppke(step)의 수준을 FOXO의 음성 피드백을 통하여 감소시키는 것으로 알려져 있다(Fuss et al., 2006; Puig and Tjian, 2005). 본 발명자들은 miR-8이 발현되지 않을 때 인슐린 신호전달이 감소되는 것이 USH의 녹다운을 통해 회복되는지 확인하기 위하여 CgG4, mir8 CgG4, mir8 CgG4>mir8 및 mir8 Cg>ush i 초파리의 지방체 세포에서 전체 RNA를 분리한 뒤 FOXO의 표적 유전자인 Inr 및 step mRNA에 대한 정량적 RT-PCR을 상기 실시예 4와 동일한 방법으로 수행하였다. 이때, 사용한 프라이머를 표 7에 나타내었다. 그 결과, 상기 FOXO의 두 표적은 miR-8 널 유충의 지방체에서 상향 조절되어 있었고, miR-8의 재도입에 의해 급격히 발현이 감소되는 것을 확인하였다(도 35). 특히, mir8 Cg>ush i의 지방체에서 FOXO 표적 유전자인 Inr 및 step의 mRNA 수준이 시켰다(도 35). 이로부터, miR-8 널 유충의 지방체에서 ush 발현의 증가가 인슐린 신호전달의 결핍에 적어도 일부 영향을 미치는 것을 알 수 있었다.
표 7
유전자 프라이머
센스 프라이머 안티센스 프라이머
Inr 서열번호 106 5'-AACAGTGGCGGATTCGGTT-3' 서열번호 107 5'-TACTCGGAGCATTGGAGGCAT-3'
step 서열번호 108 5'-CACCAGGAACTTCTTGAATC-3' 서열번호 109 5'-TTCTTTGTACCAGGATGTCA-3'
실시예 16. miR-200의 표적 유전자인 FOG2가 인간 세포주에서 PI3K를 조절
<16-1> fog2 3' UTR의 돌연변이 miR 표적 부위에 도입된 돌연변이에 서 miR-200에 의한 조절 여부 확인
상기 실시예 7의 miRNA 표적 유전자 탐색 결과 ush mRNA는 하나의 miR-8의 예측된 결합 부위를 가지고 있는데 반해, ush의 포유동물 오르쏘로그인 FOG2는 적어도 세 개의 miR-200 패밀리 miRNA의 예측된 결합부위를 가지고 있었다(도 36 및 37). 본 발명자들은 초파리 miR-8 miRNA가 ush mRNA의 3' UTR에 직접 결합하여 발현을 조절했던 것처럼, 인간 miR-200 패밀리 miRNA도 fog2 mRNA의 3' UTR에 직접 결합하여 발현을 조절하는지 확인하기 위하여 하기 실험을 수행하였다. 구체적으로, 서열번호 110으로 기재되는 FOG2의 cDNA를 수득하기 위하여, K562 세포주로부터 RNeasy mini kit(QIAGEN, 미국)를 이용하여 전체 RNA를 추출한 뒤, 전체 RNA 1 ㎍과 Oligo-dT 1 ㎕(Invitrogen, 미국)에 증류수를 50 ㎕까지 채운 후, SuperScript First-Strand Synthesis System(Invitrogen, 미국)에 넣어 RT-PCR 반응 시켰다. 65℃에서 6분, 4℃에서 5분, 42℃에서 60 분, 95℃에서 5 분, 4℃에서 5 분간 반응하여 cDNA를 합성하였다. 상기 cDNA(3~5 ㎍)을 주형으로 하여, 서열번호 111(5'-GGATCCATGTCCCGGCGAAAGCAAAGC-3') 및 서열번호 112(5'-GCGGCCGCTCATTTGACATGTTCTGCTGCATG -3')의 프라이머 쌍 및 PCR Mastermix(Promega, 미국)를 이용하여 PCR을 수행하였다. 상기의 반응 완료 후 생성된 FOG2의 PCR 산물을 BamHI 및 NotI의 제한 효소로 각각 절단한 다음, 동일한 제한 효소로 절단한 pCK-flag vector(Heo I et al., Cell , 2009)에 삽입하여 "pCK-FOG2" 벡터를 제조하였다. 상기 pCK-FOG2, 표 8의 프라이머 및 QuickChange Site-Directed Mutagenesis kit를 사용하여 FOG2 3' UTR의 세 개의 miR-200 표적 부위에 하나(FOG2 m1, FOG2 m2, FOG2 m3), 두 개((FOG2 m12, FOG2 m23) 또는 세 개(FOG2 m123)의 돌연변이를 도입하였다. Hela 세포주에 야생형 FOG2(FOG2 wt), FOG2 m1, FOG2 m2, FOG2 m3, FOG2 m12, FOG2 m23 또는 FOG2 m123을 레닐라 루시퍼라제 발현 벡터 및, 합성된 siGFP, miR-141/200a 또는 miR-200b/c/429와 함께 형질전환 시킨 다음, 상기 실시예 8-2와 동일한 방법으로 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 상기 합성 miRNA는 각 씨드 서열을 포함하는 miRNA를 같은 양으로 혼합하여 사용하였다. 그 결과, fog2 mRNA의 3' UTR의 모든 추정된 표적 부위를 돌연변이 시켰을 때(도 38, m123), miR-200 패밀리 miRNA에 의해 루시퍼라제의 발현이 억제되지 않았다. 따라서 상기 fog2 mRNA의 3' UTR에 존재하는 예측된 표적 부위를 통해 miR-200-매개 FOG2 발현 억제가 조절되는 것을 시사한다. 한편, 씨드 서열에 하나의 뉴클레오티드 미스매치를 가지고 있는 miR-200a 및 miR-141은 다른 구성원에 비해 덜 효과적이기는 하나 루시퍼라제 발현을 억제시켰다. 이는 비정규 표적부위도 표적유전자의 발현 감소를 야기할 수 있음을 시사한다(Bartel, DP 2009, Cell 136, 215-233; Brennecke, J et al., 2005, PLoS Biol 3, e85).
<16-2> 조직별 FOG2 단백질 및 miR-200c 클러스터 miRNA의 발현 사이의 상관관계 확인
FOG2는 심장, 뇌, 고환, 간, 폐 및 골격근에서 발현된다(Holmes et al., 1999; Lu et al., 1999; Svensson et al., 1999; Tevosian et al., 1999). 성충 조직에서는 상대적으로 광범위하게 발현됨에도 불구하고, FOS2의 기능에 대해서 배아 심장 발달에서의 역할에 비하여 알려진 바가 적다(Fossett and Schulz, 2001). 한편, miR-200 miRNA는 뇌하수체, 갑상선, 이자섬, 고환, 전립선, 난소, 유방 및 간을 포함하는 다양한 성충 기관에서 발현되는 것으로 알려져 있다(Landgraf et al., 2007). 본 발명자들은 각각 다른 기관으로부터 유래한 인간 세포주에서 FOG2 단백질 및 miR-200c 클러스터 miRNA의 발현 사이의 상관관계를 각 세포주에서 FOG2 단백질 및 miR-200 패밀리 miRNA의 발현을 각각 웨스턴 블롯 및 노던 블롯을 수행하여 확인하였다. 구체적으로, HepG2, Hep3B, Huh7, FAO, AsPC1, PANC1, SW480, HCT116, HCT116p53KD, MCF7, MDAMB231, U2OS 및 Hela 세포주에서 항-FOG2 항체(Santa cruz) 및 항-GAPDH 항체(Santa cruz)를 이용하여 상기 실시예 4의 방법과 동일한 방법으로 웨스턴 블롯을 수행하였다. 또한, HepG2, Hep3B, Huh7, FAO, AsPC1, PANC1, SW480, HCT116, HCT116p53KD, MCF7, MDAMB231, U2OS 및 Hela 세포주에서 Trizol reagent를 이용하여 전체 RNA를 분리한 후 상기 실시예 5와 동일한 방법으로 노던 블롯을 수행하였다. 이때, miR-141 및 miR-200c에 상응하는 올리고뉴클레오티드를 [γ32-ATP]로 말단-표지하여 노던 블롯의 프로브로 사용하였다. 그 결과, 일반적으로 miR-200c 클러스터 일원 및 FOG2의 발현 수준은 FOG2 조절에서 miR-200의 억제 역할을 뒷받침하는 음성적 상관관계를 가지고 있었다(도 39).
표 8
유전자 프라이머
센스 프라이머 안티센스 프라이머
m1 서열번호 113 5'-TTAATTTATTTTACCAGTGACATTCATAGCTGTGGTT-3' 서열번호 114 5'-AACCACAGCTATGAATGTCACTGGTAAAATAAATTAA-3'
m2 서열번호 115 5'-ACAAAATTACTGGAAGTGACATTGTAAGTAATGAGG-3' 서열번호 116 5'-CCTCATTACTTACAATGTCACTTCCAGTAATTTTGT-3'
m3 서열번호 117 5'-TTGTAAGTAATGAGGTGACGTTAATCAGTTTTATCT-3' 서열번호 118 5'-AGATAAAACTGATTAACGTCACCTCATTACTTACAA-3'
실시예 17. miR-200에 의한 PI3K-Akt-FOXO 신호전달의 특이적 조절 확인
<17-1> FOG2의 인슐린 신호전달 과정에서의 연관성 확인
본 발명자들은 miR-200 miRNA에 의해 실제로 FOG2가 감소되고, 초파리 인간 miR-200이 miR-8 miRNA의 경우와 같이 인슐린 신호전달의 조절에서 보존된 역할을 가지고 있는지 확인하기 위하여, miR-200 및 FOG2가 상대적으로 낮지만 탐지가능한 수준으로 발현되는 간세포 암종인 Huh7 세포(도 39)에 30 nM의 합성된 siGFP, miR-141/200a 또는 miR-200b/c/429를 형질전환 시킨 다음, 항-FOG2 항체, 항-p-Akt 항체, 항-Akt 항체 및 항-GAPDH 항체를 이용하여 상기 실시예 4와 동일한 방법으로 웨스턴 블롯을 수행하였다. 그 결과, FOG2 단백질 수준이 상당히 감소되었다(도 40). 또한, 상대적으로 높은 수준의 miR-200 miRNA를 발현하는 췌장암 세포주인 AsPC1 세포에 siGFP, miR-141/200a 또는 miR-200b/c/429에 대한 2'-O-메틸 올리고뉴클레오티드 안티센스(2'-O-methyl oligonuclelotides antisense)(표 9, 삼천리)를 200 nM로 처리한 후 상기와 동일한 방법으로 웨스턴 블롯을 수행하여 확인한 결과, FOG2 단백질 수준이 증가되었다(도 41 및 도 39). 상기 결과는 FOG2가 내재적 miR-200 miRNA의 진적한 표적임을 시사한다. miR-200 패밀리를 형질전환 시켰을 경우, 음성 대조군을 형질도입시킨 경우와 비교하여 Akt의 인산화가 증가하였고(도 40), miR-200 패밀리 억제자를 형질전환 시켰을 경우에는 Akt 인산화가 감소되었다(도 41). 또한, FAO 세포주에 siGFP 또는 siFOG2(서열번호 119: 5'-UUAUUCAAGUCCAUCUUCCdTdT-3', 삼천리) 를 처리한 후 상기와 동일한 방법으로 웨스턴 블롯을 수행하여 확인한 결과, FOG2녹다운은 p-Akt 수준을 증가시켜, miR-200 패밀리 miRNA와 유사한 효과를 나타내었다(도 42).
표 9
서열 번호 염기 서열
anti-siGFP 서열번호 120 5'-AACAUCGCCAUCUAAUUCA-3'
anti-miR-141 서열번호 121 5'-CCAUCUUUACCAGACAGUGU UA-3'
anti-miR-200a 서열번호 122 5'-ACAUCGUUACCAGACAGUGU UA-3'
anti-miR-200b 서열번호 123 5'-UCAUCAUUACCAGGCAGUAU UA-3'
anti-miR-200c 서열번호 124 5'-UCCAUCAUUACCCGGCAGUAUUA-3'
anti-miR-429 서열번호 125 5'-ACGGUUUUACCAGACAGUAUUA-3'
<17-2> FOG2의 인슐린 신호전달 과정에서의 역할 확인
본 발명자들은 Hep3B 세포주에 pCK-flag(공벡터) 및 상기 실시예 16-1에서 제조한 pCK-FOG2를 형질전환 시킨 다음, p85α에 대한 항체를 사용하여 면역복합체 키나아제 분석을 통해 PI3K 활성에 대한 FOG2의 효과를 확인하였다(도 43). 구체적으로, Hep3B 세포주에 pCK-flag(공벡터) 및 상기 실시예 16-1에서 제조한 pCK-FOG2를 형질전환 시킨 다음, 혈청이 없는 배지 또는 100 ng/㎖의 IGF-1을 포함하는 배지로 교체해 주었다. 24시간이 지난 후 용해 완충 용액(137 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl(pH 7.4), 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 0.1 mM sodium orthovanadate, 1 % NP-40)으로 처리하여 단백질을 분리한 다음, 상기 시료에 항-p85α단일클론 항체(Santa Cruz)를 처리하여 PI3K를 면역침전 시켰다. 침전된 항체-PI3K 면역 복합체를 단백질 A-세파로즈 비드(protein A-Sepharose bead)(Pharmacia, 스웨덴)와 혼합시킨 다음, 용해 완충 용액으로 두 1, 세척 완충 용액(0.1 M Tris-HCl(pH 7.4), 5 mM LiCl, and 0.1 mM sodium orthovanadate)으로 두 1 세척하였다. PI3K 활성은 상기 단백질-A 세파로즈 비드/항체-PI3K 면역 복합체, 10 ㎍의 음파-분쇄된 PIP2(Calbiochem, 미국) 및 1 ㎕의 [γ-32P]ATP(500 μCi/ml)를 60 ㎕ 키나아제 분석 버퍼[10 mM Tris-HCl(pH 7.4), 150 mM NaCl, 1 mM sodium orthovanadate 및 10 ㎕의 100 mM MgCl2 함유]에 첨가하여 분석하였다. 37℃에서 20분간 반응시킨 뒤 20 ㎕의 6N HCl을 첨가하여 반응을 종료시켰다. 지질은 CHCl3:MeOH(1:1)로 추출하였으며, scintillation counter를 사용하여 분석하였다. in vitro PI3K 활성 분석을 위하여, 상기 면역 복합체를 정제된 His-표지된 FOG2 단백질과 4℃에서 2시간 동안 배양하였다.
그 결과, Hep3B 세포에 FOG2-발현 플라스미드를 형질도입 시켰을 경우, IGF-1(insulin like growth factor-1)은 PI3K 활성을 유도하는데 실패하였고, 이는 POG2가 PI3K를 억제시키는 것을 시사한다(도 43).
또한, 상기와 동일한 조건으로 형질전환 시킨 후 IGF-1을 처리하거나 처리하지 않은 세포주에서 상기 실시예 4와 동일한 방법으로 항-p-Akt 항체, 항-Akt 항체 및 항-GAPDH 항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 수행한 결과, IGF-1-처리된 세포에서 FOG2를 처리했을 때, FOG2를 처리하지 않은 경우와 비교하여 Akt의 인산화가 감소하였다(도 44).
<17-3> miR-8가 인슐린 신호전달 경로에 미치는 영향 확인
본 발명자들은 Akt의 하류 변환자에 대한 miR-200 miRNA의 효과를 분석하였다(도 44 내지 도 47). Akt는 FOXO 활성을 억제시키므로, 본 발명자들은 8개 FOXO 결합 결합 부위를 가지고 있는 루시퍼라제 리포터 플라스미드(pFK1tk-luc)(Biggs, WH et al., 1999, Proc Natl Acad Sci U S A 96, 7421-7426)를 이용하여 배양된 세포에서 FOXO 활성의 수준을 결정하였다. 구체적으로, Hep3B 세포에 합성된 siGFP, miR-141, miR-200a, miR-200b, miR-200c, miR-429 또는 siFOG2를 pFK1tk-luc 벡터와 함께 형질전환 시킨 다음, 상기 실시예 8-2와 동일한 방법으로 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 또한, Hep3B 세포에 루시퍼라제, miR-141, miR-200a, miR-200b, miR-200c 또는 miR-429에 상보적인 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드를 pFK1tk-luc 벡터와 함께 형질전환 시킨 다음 상기와 동일한 방법으로 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 아울러, Hep3B 세포주에 pCK-flag(공벡터) 및 상기 실시예 16-1에서 제조한 pCK-FOG2를 형질전환 시킨 다음, 상기와 동일한 방법으로 루시퍼라제 활성을 측정하였다. Hep3B 세포에서 루시퍼라제의 활성은 miR-200 miRNA의 형질도입 및 FOG2 녹다운에 의해서 상당히 감소되었다(도 45). 또한, 상기 세포에 miR-200 억제자의 처리에 의해 FOXO 활성이 증가되었다(도 46). 이와 일치하게, FOG2가 과발현되었을 경우 FOXO 활성이 증가되었다(도 47).
<17-4> miR-8에 의한 FOG2 발현 조절이 인슐린 신호전달 경로에 미치는 영향 확인
본 발명자들은 miR-200이 인슐린 신호전달 경로에 특이적으로 영향을 미치는지 확인하기 위하여 HepG2 세포주에 pCK-flag(공벡터) 또는 상기 실시예 16-1에서 제조한 pCK-FOG2를 형질전환 시킨 다음, 혈청이 없는 배지 또는 100 ng/㎖의 IGF-1을 포함하는 배지로 교체해 준 다음, 상기 세포에서 상기 실시예 4와 동일한 방법으로 항-p-ERK 항체(Sigma, 미국), 항-ERK 항체(Sigma, 미국) 및 항-GAPDH 항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 수행한 결과, PI3K 신호전달경로의 구성 요소의 경우와 다르게, Erk의 인산화 수준은 FOG2의 처리 여부와 상관없이 유사하였다(도 44). 또한, Huh7 세포주에 합성된 siGFP, miR-141/200a 또는 miR-200b/c/429를 형질전환 시킨 후, 아무것도 처리하지 않거나, Ly294002(PI3K 억제자), SB600125(JNK 억제자) 또는 U0126(Mek1 억제자)을 각각 10 μM로 처리한 다음 상기 실시예 17-3와 동일한 방법으로 FOXO 활성을 측정하였다. 그 결과, JNK 또는 Mek1/2의 억제자는 miR-200-매개 FOXO 조절에 영향을 주지 않았지만, PI3K 억제자를 처리한 경우 miR-200에 의해 FOXO 활성이 감소하지 않았다(도 45). 상기 결과로부터, miR-200은 PI3K-Akt-FOXO 신호전달을 특이적으로 조절하는 것을 알 수 있었다.
실시예 18. PI3K의 음성 조절자로 기능하는 FOG2
PI3K 및 AKT의 자극은 세포 증식을 촉진하고, 아폽토시스를 억제한다고 알려져 있기 때문에(Pollak, 2008), 본 발명자들은 Hep3B 세포에서 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 분석을 통하여 세포 생존력을 측정하였다. 구체적으로, Hep3B 세포를 96-웰 플레이트에 분주한 후, 30 nM의 합성된 siGFP, miR-141, miR-200a, miR-200b, miR-200c, miR-429 또는 siFOG2를 형질전환 시킨 다음, 50 μl의 MTT 용액(2 mg/ml)(Promega, 미국)을 각 웰에 분주한 후 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 이후 각 웰에 150 μl의 DMSO를 첨가한 후 590 nm 파장에서 마이크로플레이트 리더기(Bio-rad, 미국)를 사용하여 측정하였다. 또한, Hep3B 세포에 200 nM의 루시퍼라제, miR-141, miR-200a, miR-200b, miR-200c 또는 miR-429에 각각 상보적인 서열을 가지는 200 nM의 올리고뉴클레오티드를 형질전환 시킨 다음 상기와 동일한 방법으로 MTT 분석을 실시하였다. 그 결과, miR-200 miRNA의 도입은 세포 생존력을 증가시켰고(도 48), 상기 miRNA의 억제자의 도입은 이와 반대 효과를 나타내었다(도 49).
FOG2의 활동 메카니즘을 확인하기 위하여, 본 발명자들은 Hep3B 세포주에서 p85α에 대한 면역 침강법을 수행한 뒤, p85α, p110 및 IRS-1에 대한 웨스턴 블롯을 수행하였다(도 50). 특히, FOG2가 발현될 때, p85α와 함께 침전된 p110 및 IRS-1의 양은 감소하였다. 이로부터, FOG2는 IRS-1/p85αp110 복합체의 형성을 방해함으로써 PI3K의 음성 조절자로서 역할을 하는 것을 알 수 있었다.
실시예 19. p85α와 직접 결합하여 PI3K를 억제하는 FOG2
<19-1> 세포 내에서 FOG2 및 PI3K의 상호작용 확인
FOG2가 핵 전사 공동조절자인 것으로 생각되지만, 몇몇의 연구에서 FOG2는 세포질에도 위치하는 것으로 보고되었다(Bielinska et al., 2005; Clugston et al., 2008). 상기 결과를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 Hela 또는 PANC1 세포에서 핵 및 세포질 분획을 분리한 다음, 각각의 분획에서 단백질을 분리하여 항-FOG2 항체, 항-Lamin 항체(핵 분획)(Santa Cruz, 미국) 및 항-Tubulin 항체(세포질 분획)(Santa Cruz)를 사용하여 상기 실시예 4와 동일한 방법으로 웨스턴 블롯을 수행한 결과, 핵 보다 세포질에서 더 우세하게 관찰되었다(도 51). HepG2 세포에서 DAPI 염색 및, 항-FOG2 항체 및 항-p85α항체를 사용하여 상기 실시예 5와 동일한 방법으로 면역염색을 수행한 결과, FOG2가 세포질에서 위치하는 것을 보여주었고(도 52), 이는 FOG2가 세포질 내에서 기능을 담당하는 것을 시사하는 것이다.
FOG2가 PI3K를 억제하고 p85α와 함께 위치하는 것을 감안할 때(도 38 내지 도 54), 본 발명자들은 FOG2가 PI3K와 상호작용하는 것이 아닌지 의문을 품게 되었다. 본 발명자들은 PANC1 세포에 1 ㎍의 (Santa cruz)를 처리하거나 처리하지 않은 경우에서 상기 17-2와 동일한 방법으로 면역침전을 수행한 뒤, 항-FOG2 항체 및 항-p85α항체를 이용하여 상기 실시예 4와 동일한 방법으로 웨스턴 블롯을 수행하여 내재적 FOG2의 발현을 확인한 결과, PI3K의 조절 서브유니트인 p85α의 상당한 양이 항-FOG2 항체와 함께 침전되었다(도 56).
<19-2> 시험관에서 FOG2 및 PI3K의 상호작용 확인
본 발명자들은 Hep3B 세포주에 pCK-flag(공벡터) 또는 상기 실시예 16-1에서 제조한 pCK-FOG2를 형질전환 시킨 다음, 혈청이 없는 배지 또는 100 ng/㎖의 IGF-1을 포함하는 배지로 교체해 준 다음, 항-85항체를 이용하여 상기 실시예 17-2와 동일한 방법으로 면역침전을 수행한 다음, 항-p85α항체, 항-p110 항체 및 항-FOG2 항체를 이용하여 상기 실시예 4와 동일한 방법으로 웨스턴 블롯을 수행한 결과, FOG2 및 p85α의 상호작용은 상기 두 단백질이 FLAG-표지된 형태로 발현이 유도된 경우에서도 관찰되었다(도 54 및 도 55).
실시예 20. 종간에 보존된 miR-8/miR-200 및 USH/FOG2의 기능
<20-1> p85α와 결합하는 FOG2의 도메인의 맵핑
본 발명자들은 p85α와 결합하는 FOG2의 도메인의 맵핑하기 위하여, 상기 실시예 16-1의 FOG2의 cDNA를 주형으로 하여, 하기의 FOG의 절삭(truncated) 돌연변이에 대한 각각의 프라이머를 사용하여 각각의 FPG 절삭 돌연변이에 대한 폴리뉴클레오티드를 증폭하였다.
FOG2[1-412](서열번호 126): 센스 프라이머; 서열번호 127, 5'-GGATCCATGTCCCGGCGAAAGCAAAGC-3', 안티센스 프라이머; 서열번호 128, 5'-GCGGCCGCGTGGCTGGCTGTAAGCTGTC-3',
FOG2[413-789](서열번호 129) 센스 프라이머; 서열번호 130, 5'-GGATCCCAGACTTATTGACCAGAAG-3', 안티센스 프라이머; 서열번호 131 5'-GCGGCCGCGATATCACATCTTGGGTGGTAG-3',
FOG2[802-1151](서열번호 132) 센스 프라이머; 서열번호 133, 5'-GGATCCCTCTGACGATCAACAAGTG-3', 안티센스 프라이머; 서열번호 134 5'-GCGGCCGCTCATTTGACATGTTCTGCTGCATG-3',
FOG2[1-506](서열번호 135) 센스 프라이머; 서열번호 136, 5'-GGATCCATGTCCCGGCGAAAGCAAAGC-3', 안티센스 프라이머; 서열번호 137, 5‘-GCGGCCGCTCATTTGACATGTTCTGCTGCATG-3',
FOG2[1-789](서열번호 138) 센스 프라이머; 서열번호 139, 5'-GGATCCATGTCCCGGCGAAAGCAAAGC-3', 안티센스 프라이머; 서열번호 140, 5'-GCGGCCGCTCATTTGACATGTTCTGCTGCATG-3',
상기에서 수득한 PCR 산물을 BamHI 및 NotI의 제한 효소로 각각 절단한 다음, 동일한 제한 효소로 절단한 pCK-flag 벡터에 삽입하여 "pCK-FOG2_1-412", "pCK-FOG2_413-789", "pCK-FOG2_802-1151", "pCK-FOG2_1-506" 및 "pCK-FOG2_1-789"의 FOG 돌연변이에 대한 발현벡터를 제조하였다.
상기에서 수득한 N-말단에 FLAG-표지를 포함하는 각각의 돌연변이를 HepG2에서 각각 발현시킨 후, 항-FLAG 항체를 사용하여 상기 실시예 17-2와 동일한 방법으로 면역침강시킨 후, 항-p85α항체 및 항-FOG2 항체를 이용하여 상기 실시예 4와 동일한 방법으로 분석하였다. 그 결과, FOG2(507-789 aa)의 중간 영역이 p85α와의 상호작용을 매개하는 것을 확인하였다(도 55).
<20-2> p85α 결합-FOG2 도메인의 PI3K 활성 억제 확인
본 발명자들은 HepG2 세포에서 상기에서 제조한 돌연변이 FOG2 단백질들을 발현시켰을 때, 상기 중간 영역이 PI3K를 억제하는데 충분한지 확인해보았다(도 56). 그 결과, PI3K 활성에서 N-말단 부위 또는 C-말단 부위는 억제 효과가 없었지만 상기 중간 영역은 상당한 PI3K 억제효과를 가지고 있었다(도 56).
<20-3> 종간에 보존된 FOG2 및 p85α의 직접적인 결합
본 발명자들은 FOG2가 p85α와 직접적으로 결합하는지 실험하기 위하여, 상기 실시예 20-1에서 수득한 p85α유전자에 대한 PCR 산물을 BamHI 과 EcoRI으로 절단한 다음, 동일한 제한효소부위로 절단된 pGEX5X-1 벡터(GE Healthcare, 미국)에 삽입하여 GST-융합 재조합 p85α발현 벡터를 제조하였다. 상기 발현벡터를 BL21(Promega, 미국)에 전기천공법으로 형질전환 시킨 후, 공지의 방법을 이용하여 단백질 FOG2 단백질을 박테리아에서 발현 및 정제하였고(Studier, F.W. et al., 1986, J. Mol. Biol. 189, 113-130), 상기 정제된 GST-융합 재조합 p85α단백질을 하기 in vitro 결합 분석에 사용하였다. 상기 재조합 FOG2 단백질은 재조합 p85α와 특이적으로 결합하는 FOG2(413-789 aa)의 중간 영역을 포함한다(도 57).
본 발명자들은 FOG2가 재조합 FOG2를 이용한 in vitro PI3K 분석과 같이, 직접적으로 p85α를 억제하는지 확인하였다. 중간영역(tro PI3K 분석과)을 포함하는 재조합 FOG2 단백질을 면역침강된 PI3K 복합체에 첨가하였을 때 PI3K의 활성이 상당히 감소되었다(도 58). 이러한 결과는 FOG2가 p83에 직접적으로 결합하여 PI3K 활성의 억제를 야기하는 것을 시사한다. 특히, 본 발명자들은 dp60이 USH와 인간 HEK293T 세포에서 함께 발현되었을 때, 초파리 USH가 초파리 p60(dp60, p85α의 초파리 오르쏘로그)과 물리적으로 상호작용하는 것을 발견하였다(도 59 및 도 60). 이를 통해 USH/FOG2의 활동 메카니즘은 종족을 넘어서 보존된 것임을 알 수 있었다(도 61).
인간 암세포주에서 miR-200의 발현을 억제하거나 FOG2를 발현시켰을 때 세포 성장을 촉진하는 PI3K 활성이 감소되는 것을 확인하였으므로, miR-200 및 FOG2를 항암제 등 인슐린신호전달 조절물질의 스크리닝에 유용하게 사용할 수 있다.

Claims (31)

1) miR-200 패밀리 miRNA 또는 miR-8 miRNA를 발현하는 세포주에 피검화합물을 처리하는 단계;
2) 처리한 상기 단계 1)의 세포에서 FOG2 또는 USH 단백질의 발현량 또는 활성을 측정하는 단계; 및,
3) 대조군과 비교하여 상기 단계 1)의 세포에서 FOG2 또는 USH 단백질의 발현 또는 활성이 변화된 피검화합물을 선별하는 단계를 포함하는 인슐린 신호전달 조절 물질의 스크리닝 방법.
제 1항에 있어서, 상기 miR-200 패밀리 miRNA를 발현하는 세포주는 심장, 뇌, 고환, 간, 폐 및 골격근 조직으로부터 유래한 인간 세포주인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 miR-8 miRNA를 발현하는 세포주는 지방체 조직으로부터 유래한 초파리 세포주인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 피검화합물은 천연화합물, 합성화합물, RNA, DNA, 폴리펩티드, 효소, 단백질, 리간드, 항체, 항원, 박테리아 또는 진균의 대사산물 및 생활성 분자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 2)의 FOG2 또는 USH 단백질의 발현량은 웨스턴 블롯, 면역염색법, 형광염색법 및 리포터 분석(reporter assay)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법으로 측정되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 2)의 FOG2 또는 USH 단백질의 활성은
ⅰ) p85α/p110/IRS-1 복합체의 활성을 측정하는 단계;
ⅱ) FOXO mRNA 또는 단백질의 발현량을 측정하는 방법; 및,
ⅲ 세포 성장 및 증식을 측정하는 방법으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법으로 측정되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 6항에 있어서, 상기 p85α/p110/IRS-1 복합체의 활성은 AKT 단백질의 인산화를 측정함으로써 측정되는 것을 특징으로 하는 방법.
1) FOG2 또는 USH를 발현하는 세포주에 피검화합물을 처리하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 세포에서 FOG2 또는 USH 단백질의 발현량 또는 활성을 측정하는 단계; 및,
3) 대조군과 비교하여 상기 단계 1)의 세포에서 FOG2 또는 USH 단백질의 발현 또는 활성이 변화된 피검화합물을 선별하는 단계를 포함하는 인슐린 신호전달 조절 물질의 스크리닝 방법.
제 8항에 있어서, 상기 FOG2를 발현하는 세포주는 심장, 뇌, 고환, 간, 폐 및 골격근 조직으로부터 유래한 인간 세포주인 것을 특징으로 하는 방법.
제 8항에 있어서, 상기 USH를 발현하는 세포주는 지방체 조직으로부터 유래한 초파리 세포주인 것을 특징으로 하는 방법.
제 8항에 있어서, 상기 피검화합물은 천연화합물, 합성화합물, RNA, DNA, 폴리펩티드, 효소, 단백질, 리간드, 항체, 항원, 박테리아 또는 진균의 대사산물 및 생활성 분자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
제 8항에 있어서, 상기 단계 2)의 FOG2 또는 USH 단백질의 발현량은 웨스턴 블롯, 면역염색법, 형광염색법 및 리포터 분석(reporter assay)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법으로 측정되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 8항에 있어서, 상기 단계 2)의 FOG2 또는 USH 단백질의 활성은
ⅰ) p85α/p110/IRS-1 복합체의 활성을 측정하는 단계;
ⅱ) FOXO mRNA 또는 단백질의 발현량을 측정하는 방법; 및,
ⅲ 세포 성장 및 증식을 측정하는 방법으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법으로 측정되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 13항에 있어서, 상기 p85α/p110/IRS-1 복합체의 활성은 AKT 단백질의 인산화를 측정함으로써 측정되는 것을 특징으로 하는 방법.
1) 피검 화합물의 존재 하에 FOG2 단백질과 p85α단백질을 접촉시키는 단계;
2) 상기 에서 FOG2 단백질 및 p85α단백질 사이의 결합 정도를 측정하는 단계; 및,
3) 피검 화합물을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 상기 단계 2)의 시험관에서 FOG2 단백질 및 p85α단백질 사이의 결합 정도가 변화된 피검화합물을 선별하는 단계를 포함하는 인슐린 신호전달 조절 물질의 스크리닝 방법.
1) 피검 화합물의 존재 하에 USH 단백질과 dp60 단백질을 접촉시키는 단계;
2) 상기 에서 USH 단백질 및 dp60 단백질 사이의 결합 정도를 측정하는 단계; 및,
3) 피검 화합물을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 상기 단계 2)의 시험관에서 USH 단백질 및 dp60(Drosophila p60) 단백질 사이의 결합 정도가 변화된 피검화합물을 선별하는 단계를 포함하는 인슐린 신호전달 조절 물질의 스크리닝 방법.
제 15항 또는 제 16항에 있어서, 상기 피검화합물은 천연화합물, 합성화합물, RNA, DNA, 폴리펩티드, 효소, 단백질, 리간드, 항체, 항원, 박테리아 또는 진균의 대사산물 및 생활성 분자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
제 15항 또는 제 16항에 있어서, 상기 단계 3)의 단백질 사이의 결합은 SPR, 단백질 chip, 겔 쉬프트 분석(gel shift assay), 면역침전법, 공동-면역분석방법, 형광면역분석법 및 방사선면역분석법으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법으로 측정되는 것을 특징으로 하는 방법.
1) FOG2 단백질을 발현하는 세포주에 피검화합물을 처리하는 단계;
2) 처리한 상기 단계 1)의 세포에서 FOG2 단백질 및 p85α단백질의 결합 정도를 측정하는 단계; 및,
3) 피검화합물을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 상기 단계 1)의 세포에서 FOG2 단백질 및 p85α단백질의 결합 정도가 변화된 피검화합물을 선별하는 단계를 포함하는 인슐린 신호전달 조절 물질의 스크리닝 방법.
제 19항에 있어서, 상기 FOG2를 발현하는 세포주는 심장, 뇌, 고환, 간, 폐 및 골격근 조직으로부터 유래한 인간 세포주인 것을 특징으로 하는 방법.
제 19항에 있어서, 상기 단계 2)의 FOG2 단백질 및 p85α단백질의 결합여부는 SPR, 단백질 chip, 겔 쉬프트 분석(gel shift assay), 면역침전법, 공동-면역침전 분석(co-immunoprecipitation), 형광면역분석법 및 방사선면역분석법으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법으로 측정되는 것을 특징으로 하는 방법.
1) USH 단백질을 발현하는 세포주에 피검화합물을 처리하는 단계;
2) 처리한 상기 단계 1)의 세포에서 USH 단백질 및 dp60 단백질의 결합 정도를 측정하는 단계; 및,
3) 피검화합물을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 상기 단계 1)의 세포에서 USH 단백질 및 dp60 단백질의 결합 정도가 변화된 피검화합물을 선별하는 단계를 포함하는 인슐린 신호전달 조절 물질의 스크리닝 방법.
제 22항에 있어서, 상기 USH를 발현하는 세포주는 지방체 조직으로부터 유래한 초파리 세포주인 것을 특징으로 하는 방법.
제 22항에 있어서, 상기 단계 2)의 USH 단백질 및 dp60 단백질의 결합여부는 SPR, 단백질 chip, 겔 쉬프트 분석(gel shift assay), 면역침전법, 공동-면역침전 분석(co-immunoprecipitation), 형광면역분석법 및 방사선면역분석법으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법으로 측정되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 19항 또는 제 22에 있어서, 상기 피검화합물은 천연화합물, 합성화합물, RNA, DNA, 폴리펩티드, 효소, 단백질, 리간드, 항체, 항원, 박테리아 또는 진균의 대사산물 및 생활성 분자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
FOG2 또는 USH 단백질의 발현 또는 활성을 변화시키는 물질을 유효성분으로 함유하는 인슐린 신호 전달 조절용 조성물
제 26항에 있어서, FOG2에 대한 siRNA를 유효성분으로 함유하는 인슐린 신호 전달 조절용 조성물.
제 26항에 있어서, 상기 FOG2에 대한 siRNA는 서열번호 119로 기재되는 것을 특징으로 하는 인슐린 신호 전달 조절용 조성물.
FOG2 또는 USH 단백질의 발현 또는 활성을 변화시키는 물질을 인슐린 신호전달 조절용 조성물의 제조에 이용하는 용도.
제 29항에 있어서, FOG2에 대한 siRNA를 인슐린 신호전달 조절용 조성물의 제조에 이용하는 용도.
제 30항에 있어서, 상기 FOG2에 대한 siRNA는 서열번호 119로 기재되는 것을 특징으로 하는 용도.
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