WO2011055091A2 - Dispositif et procede pour isoler et cultiver des cellules vivantes sur filtre ou extraire leur materiel genetique - Google Patents

Dispositif et procede pour isoler et cultiver des cellules vivantes sur filtre ou extraire leur materiel genetique Download PDF

Info

Publication number
WO2011055091A2
WO2011055091A2 PCT/FR2010/052380 FR2010052380W WO2011055091A2 WO 2011055091 A2 WO2011055091 A2 WO 2011055091A2 FR 2010052380 W FR2010052380 W FR 2010052380W WO 2011055091 A2 WO2011055091 A2 WO 2011055091A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
filter
compartment
needle
cells
vacuum tube
Prior art date
Application number
PCT/FR2010/052380
Other languages
English (en)
Other versions
WO2011055091A3 (fr
WO2011055091A4 (fr
Inventor
Yvon Cayre
Original Assignee
Screencell
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=42309692&utm_source=***_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=WO2011055091(A2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority to EP10795419.0A priority Critical patent/EP2635669B1/fr
Priority to ES10795419.0T priority patent/ES2547429T3/es
Priority to JP2012535912A priority patent/JP2013526835A/ja
Priority to CN201080070000.9A priority patent/CN103201374B/zh
Priority to PT107954190T priority patent/PT2635669E/pt
Application filed by Screencell filed Critical Screencell
Priority to DK10795419.0T priority patent/DK2635669T3/en
Priority to US13/387,039 priority patent/US8709786B2/en
Publication of WO2011055091A2 publication Critical patent/WO2011055091A2/fr
Publication of WO2011055091A3 publication Critical patent/WO2011055091A3/fr
Publication of WO2011055091A4 publication Critical patent/WO2011055091A4/fr
Priority to IL219095A priority patent/IL219095A/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
    • C12M47/02—Separating microorganisms from the culture medium; Concentration of biomass
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M33/00—Means for introduction, transport, positioning, extraction, harvesting, peeling or sampling of biological material in or from the apparatus
    • C12M33/04—Means for introduction, transport, positioning, extraction, harvesting, peeling or sampling of biological material in or from the apparatus by injection or suction, e.g. using pipettes, syringes, needles
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/40—Concentrating samples
    • G01N1/4077—Concentrating samples by other techniques involving separation of suspended solids
    • G01N2001/4088—Concentrating samples by other techniques involving separation of suspended solids filtration

Definitions

  • the present invention relates to a device and a method for isolating and / or culturing living cells or fixed on a filter in order to carry out all cellular analyzes (cytology, immunocytochemistry, FISH tests, etc.) or to extract possibly amplified genetic material of living or fixed cells isolated on a filter. It applies, in particular, to isolate and / or cultivate particular cells present in a liquid, especially blood, or to extract the genetic material of these particular cells.
  • Certain particular cells of the blood for example tumor cells or trophoblasts, are in a very small proportion and must be counted prior to cytological analyzes.
  • the present invention aims to remedy these drawbacks and to meet this need by making it possible to collect, under conditions compatible with routine laboratory tests, living cells that can be subsequently cultured in suitable media in the presence of adequate growth factors. .
  • the present invention also relates to the extraction of the possibly amplified genetic material of cells isolated on filter and the detection of mutations and levels of the expression of genes of sensitivity and resistance to targeted therapies or genetic abnormalities.
  • the present invention also aims to overcome these drawbacks and to meet this need by allowing to collect under conditions compatible with routine laboratory tests, a large proportion of the cellular material, in particular, RNA and DNA, cells considered, in good condition. It should also be noted that the present invention allows the isolation of fixed cells using a fixative containing or not formaldehyde.
  • the present invention provides a device for isolating fixed or living cells on a filter, characterized in that it comprises: a compartment having an interior volume for receiving a liquid comprising said cells, a lower opening and an air inlet,
  • a filter at least temporarily, integral with said opening of the compartment, adapted to retain said cells during the passage of the liquid through the filter
  • a needle at least temporarily secured to said opening of the compartment, in leaktight manner, the filter being located between the needle and the interior volume of the compartment, said needle being adapted to perforate a vacuum tube plug having a depression with respect to the ambient pressure for drawing liquid through said filter.
  • This device thus allows the isolation and the filter recovery of living cells of interest fixed, or living in conditions perfectly compatible with their culture to continue cytological characterization tests, and cytogenetics, for any other cellular examination or to extract their genetic material.
  • Isolated cells can be used before or after culture, for cell or molecular biology examinations.
  • the device which is the subject of the present invention also makes it possible to collect cell material from particular cells quickly and efficiently, for example, after production:
  • the device which is the subject of the present invention has many advantages:
  • the filtration can be performed on a rack or by holding the device by hand, which represents a saving of time and a material saving of material (one avoids a vacuum pump and a box of adaptation, in particular),
  • Filtration may be performed in a sterile hood.
  • the filtration can be performed with the device in oblique position, or almost horizontal.
  • the conditions are perfectly standardized, the sampling tube being produced in a standardized way with a predefined vacuum capacity.
  • the conditions of use have high safety conditions, the operation can be performed entirely in a sterile hood; in addition, the vacuum tube, once filled, can be eliminated as a usual blood collection tube, the recovered blood not being in contact with the operator.
  • the device which is the subject of the present invention, as briefly described above, furthermore comprises a means of connection between the compartment and a protection cylinder surrounding the needle and intended to surround, at least partially , the vacuum tube during the suction of the liquid through the filter.
  • the device which is the subject of the present invention comprises, at least temporarily, said protection cylinder.
  • said connecting means is temporary and allows the withdrawal of the protective cylinder together with that of the vacuum tube and the needle.
  • said protective cylinder comprises a removable film closing its opening opposite to the connecting means, opening through which the vacuum tube is introduced into the protective cylinder.
  • the user before inserting the vacuum tube, the user removes the film.
  • This film provides both better protection of the user and the needle and reduces the risk of contamination of the sample.
  • the device which is the subject of the present invention further comprises a removable surgical steel filter support adapted to be temporarily secured to the lower opening of the compartment.
  • the thickness of said ring is adapted to allow it to pass through a scanner.
  • said ring carries an identifier.
  • the device that is the subject of the present invention further comprises means that are movable relative to said compartment for applying a force on the filter support and releasing said filter support.
  • the entire filtration module being sterile and prepared in standards usually applied for molecular biology, one can avoid any contamination or deterioration of living cells on the filter or genetic material.
  • the contents of the compartment are kept sterile when manipulated under a laminar flow hood. Thus, all the steps to isolate and grow the cells or to extract and analyze their genetic material can be carried out under sterile conditions.
  • the filter is retained during filtration and then released for its recovery by removing the tip and moving respective moving means and the compartment to apply the force that releases the filter support.
  • the present invention provides a method for isolating living cells on a filter or extracting their genetic material, characterized in that it comprises:
  • a step of insertion of a liquid comprising said cells in said compartment a step of solidahsation, at least temporarily of a needle at said opening of the compartment, in a sealed manner, the filter being located between the needle and the interior volume of the compartment,
  • the method which is the subject of the present invention furthermore comprises:
  • the vacuum tube is inserted into the protection cylinder.
  • FIG. 1 represents, schematically and in perspective, the assembly of the parts of a first embodiment of the device which is the subject of the present invention
  • FIGS. 2A to 2D show, schematically and in axial sections perpendicular to one another, the first embodiment of the device before use
  • FIGS. 3A to 30 show, schematically, in elevation or in section, steps of implementation of the first embodiment of the device which is the subject of the present invention
  • FIG. 4 represents, in the form of a logic diagram, the steps implemented in a first particular embodiment of the method that is the subject of the present invention
  • FIG. 5 represents, schematically and in perspective, the assembly of the parts of a second particular embodiment of the device that is the subject of the present invention
  • FIGS. 6A to 6D show, schematically and in axial sections perpendicular to one another, the second embodiment of the device before use
  • FIGS. 7A to 7L show, schematically, in elevation or in section, stages of implementation of the second embodiment of the device which is the subject of the present invention
  • FIG. 8 represents, in section, a filter support integrated in the second embodiment of the device which is the subject of the present invention
  • FIG. 9 represents, in the form of a logic diagram, the steps implemented in a second particular embodiment of the method that is the subject of the present invention.
  • FIG. 10 represents, schematically, a particular embodiment of the device, before use
  • FIG. 11 schematically represents the embodiment of the device illustrated in FIG. 10, after removal of a protective film and before insertion of a vacuum tube;
  • FIG. 12 schematically represents the embodiment of the device illustrated in FIGS. 10 and 11, after insertion of the vacuum tube;
  • FIG. 13 represents, schematically, the embodiment of the device illustrated in FIGS. 10 to 12, during removal from the vacuum tube and from a protective cylinder and
  • FIG. 14 represents, in the form of a logic diagram, the steps implemented in a particular embodiment of the method that is the subject of the present invention.
  • a system for filtering liquid, especially blood, comprising withdrawal means is envisaged.
  • a filter support In the following description of the figures, a system for filtering liquid, especially blood, comprising withdrawal means is envisaged. a filter support.
  • the present invention is not limited to these preferred embodiments but extends, on the contrary, to any system comprising a compartment for receiving a liquid, a filter mounted, at least temporarily, on an opening of this compartment and a needle mounted, at least temporarily, in a sealed manner, on this opening of the compartment so that, during the piercing of a preconditioned vacuum tube plug, the needle conveys a suction of the liquid through the filter and that cells of interest be retained on this filter.
  • the needle has a very fine end adapted to penetrate the plug of the vacuum tube (see FIGS. 3B to 3D) and a wider mouth adapted to receive the lower end of the compartment or a filter support.
  • the vacuum tube has a very large vacuum and a volume greater than the volume of liquid to be filtered.
  • the mouth of the needle is nested on the opening of the compartment and then perforate the stopper of the vacuum tube with the thin end of the needle. Under the effect of the depression, the filtration of the liquid is carried out automatically, typically in 60 seconds.
  • the filtration can be carried out by holding the device by hand, which represents a saving of time and a saving of material material, in particular because it is no longer necessary to provide a vacuum pump or a housing. adaptation of the compartment on the pump.
  • the filtration can be performed in a sterile hood, the device can be tilted, or almost horizontal.
  • FIG. 1 shows a reservoir, or compartment, 102, a nozzle 104, a seal 106, a filter with its support 108, a mobile means 1 10, a seal 1 12 and a plug 1 14 having an inlet of air (not shown).
  • the compartment 102 is of cylindrical general shape. Its upper end can be closed, in a sealed manner, except the air inlet, by the stopper 14.
  • the lower end of the compartment 102 has, on its outer face, discontinuous rings whose discontinuities guide legs of the means. mobile 1 10, said rings guiding the body of the moving means 1 10.
  • This movable means 1 10 has a generally cylindrical shape provided with two lugs 1 16 extending towards the endpiece 104 and narrowing in this direction so as to be separated, between them, by a distance less than the diameter of the filter support 108.
  • this particular form, in particular that of the lugs 116 bent towards each other, allows the moving means 1 10, after removal of the tip 104, to push the support filter 108 to release it and its filter from the compartment 102 during the movement of the moving means towards the filter support 108.
  • the end of the lugs 1 16 of the movable means 1 10 and the lower end of the compartment 102 are adapted to penetrate into a box or well, culture.
  • the extreme discontinuous ring of the compartment 102 has a diameter adapted to bear on the edge of the box, or well, of culture.
  • a tip, or adapter, 104 which encloses the outer wall of the compartment 102 and has a tapered lower opening smaller in diameter than that of the compartment 102.
  • This tapered lower opening of the tip, or adapter, 104 has a length sufficient to allow the sealed mechanical engagement of the mouth of a needle (see Figures 3B to 3D).
  • the tip 104 has, in a manner coordinated with the shape of the lower end of the compartment 102, which has lateral pins 1 18, rotationally locking means for gripping said lugs, in a manner known per se.
  • the tip 104 thus ensures the holding in position of the filter holder during the filtration steps.
  • the tip 104 protects the filter against splashing and contamination.
  • the lower end of the compartment 102 has an opening opening, after mounting, on the filter carried by the filter support 108, itself retained in position, on the one hand, by the lower end of the compartment 102 and, on the other hand, by the tip 104.
  • the filter support 108 takes, in the first embodiment, the form of a ring-shaped washer.
  • the filter is micro-perforated and welded under the filter support 108 and then inserted with it into the lower end of the compartment 102.
  • the removable filter support 108 is annular and made of surgical steel. Steel is, in fact, not toxic to the cells collected on the filter.
  • a surgical steel filter holder is easier to remove than if it is plastic and more rigid.
  • the thickness of said ring is adapted to allow it to pass through a scanner.
  • this ring carries an identifier. Thus, this identifier, and thus the collected cells, can be associated with a patient. This avoids errors.
  • the filter support 108 is made of PVC and has a thickness less than or equal to 0.4 mm, and preferably less than 0.3 mm. Its outside diameter is, for example, 12.6 mm. The diameter of the filter carried by the filter support 108 is, for example, 5.9 mm.
  • the compartment 102, the nozzle 104 and the mobile means 1 10 are made, for example, of polypropylene.
  • the seals 106 and 12 are, for example, silicone.
  • FIGS. 2A and 2C are axial sections, perpendicular to one another, of the first embodiment of the device that is the subject of the present invention, once the parts illustrated in FIG. 1 have been assembled.
  • Figs. 2B and 2D are enlarged detail views of portions of Figs. 2A and 2C, respectively.
  • FIGS. 2A to 2D show the elements described with reference to FIG.
  • FIG. 3A shows the device in elevation, in its storage configuration.
  • FIG. 3B shows the endpiece 104 when it is inserted into the mouthpiece 181 of a needle 180 which presents another end 182 very thin and bevelled to facilitate the drilling of a vacuum tube plug.
  • the mouth 181 of the needle 180 is preferably made of plastic.
  • the end 182 of the needle 180 is preferably metallic.
  • the introduction of the needle 180 on the tip 104 can be done either before or after introduction of liquid (not shown), for example blood, into the compartment 102, through its upper opening.
  • FIG. 3C illustrates the beginning of piercing of the stopper 186 of the vacuum tube 185, once the needle 180 is sealingly connected to the endpiece 104.
  • FIG. 3D illustrates the complete piercing of the stopper 186 by the needle 180, putting into communication, through the filter 108, the inside of the vacuum tube 185, in depression, and the volume of the compartment 102 comprising the liquid containing the cells interest.
  • the internal volume of the vacuum tube 185 is greater than the volume of liquid to be filtered.
  • the end piece 104 is removed after a rotation releasing it from the lugs 1 18. Then, as illustrated in FIGS. 3G and 3H, the end of the compartment 102 is inserted into a box, or a well, culture 130.
  • the close end of the lugs 1 16 of the movable means 1 10 and the lower end of the compartment 102 are adapted to penetrate a box or well, culture.
  • the extreme discontinuous ring of the compartment 102 has a diameter adapted to that it bears on the edge of the box, or well, of culture 130.
  • the mobile means 1 10 can still, in this position, move parallel to the axis of the compartment 102.
  • the lugs 1 16 of the moving means set in motion by the fingers of an operator, exert a vertical force, from top to bottom, on the filter support 108 and release it the bottom end of the compartment 102.
  • the filter and its support 108 then fall into the box, or well, culture 130.
  • the compartment 102 and the mobile means 1 10 are removed from the culture box or well 130.
  • a step 202 the parts of the device are assembled.
  • the cap 1 is removed.
  • the tip 104 is inserted into the mouth 181 of the needle 180.
  • a liquid for example, blood, containing cells to be isolated and possibly cultivated, by the upper end of the compartment 102.
  • the pointed end 182 of the needle 180 is applied approximately to the center of the stopper 186 and a pressure is applied to the compartment 102 to penetrate the needle into the stopper 186 to that the end of the needle reaches the internal volume, in depression or empty, of the vacuum tube 185.
  • filtration is carried out by suction in the vacuum tube 185, cells smaller than the cells of interest, the possible lysed cells, and the main liquid present in the compartment 102, the cells of interest remaining retained on the filter 108.
  • a step 212 the vacuum tube 185 and the needle 180 are removed.
  • the nozzle 104 is removed.
  • a step 216 the end of the nozzle is inserted. compartment 102 in a box, or well, culture.
  • the moving means and the compartment are respectively set in motion to exert a force on the filter support 108 and release it so that it falls with its filter into the culture box or well 130 .
  • the compartment 102 and the mobile means 1 10 are removed from the box, or well, of culture 130.
  • the culture is carried out, in known manner, in the culture well 130. It is observed that the presence of the support 108 around the upper face of the filter, the face that carries the isolated cells on the filter, allows to prevent these cells from leaving the filter.
  • the filter is, for example, covered with a thin layer of Matrigel (or brought into contact with a layer of Matrigel, trademark, previously placed at the bottom of the plate well and / or the culture flask and on which it rests) containing factors adapted to the growth of the cells of interest.
  • a thin layer of Matrigel or brought into contact with a layer of Matrigel, trademark, previously placed at the bottom of the plate well and / or the culture flask and on which it rests
  • the filter support 108 is grabbed, the capture of which with a tweezer is facilitated by the presence of lateral cylindrical holes, or notches, in the upper face of the filter support 108.
  • the filter support 108 can be placed on a glass slide and a disc-shaped glass slide of diameter adapted to the free upper surface of the filter is applied to the filter.
  • the analysis of the cells or the extraction of their genetic material is carried out in a manner known per se.
  • FIG. 5 shows a reservoir, or compartment, 302, a tip 304, a seal 306, a filter support 308, a movable means 310, a seal 312 and a stopper 314.
  • the compartment 302 is of cylindrical general shape. Its upper end can be sealed, with the exception of an air inlet (not shown), by the plug 314.
  • the lower end of the compartment 302 has, on its outer face, a separate cylinder 350 the body of the compartment 302, except by mechanical links in the form of lateral ribs 352.
  • This cylinder 350 has an outer diameter which corresponds to the internal diameter of the body of the movable means 310, to guide it in displacement.
  • the cylinder 350 is provided with apertures 354 adapted to let the tabs 316 of the movable means 310 penetrate and slide longitudinally.
  • the movable means 310 has a generally cylindrical shape provided with two tabs 316 extending towards the end piece 304 and narrowing in this direction so as to be separated from each other by a distance smaller than the diameter of the filter support 308. As will be seen later, this particular form, in particular that of the tabs 316 bent toward each other, allows the movable means 310, after removal of the tip 304, to push the filter support 308 to to release it from the compartment 302 during the movement of the moving means towards the filter support 308.
  • the tip 304 has, in a manner coordinated with the shape of the lower end of the compartment 302, which has lateral lugs 318, locking means by rotation, to grip said lugs, in a manner known per se.
  • the tip 304 thus ensures the holding in position of the filter holder during the filtration steps.
  • the tip 304 protects the filter against splashing and contamination.
  • the lower end of the compartment 302 has an opening opening, after mounting, on the filter carried by the filter support 308, itself retained in position, on the one hand, by the lower end of the compartment 302 and, on the other hand, by the tip 304.
  • the filter support 308 takes, in the second embodiment, a shape coordinated with that of an Eppendorf tube.
  • the support 308 has, in its inner upper part, the shape of the inner upper part of an Eppendorf tube, which makes it possible to close the upper opening of said support with an Eppendorf tube stopper and
  • the support 308 in its upper outer part simulates the shape of the upper inner part of an Eppendorf tube, which allows the filter support 308 to fit into the upper part of an Eppendorf tube.
  • the filter support 308 has a column function to allow the lysis of the cells retained on the filter and the transfer by centrifugation. cell lysate and genetic material from the filter support to the Eppendorf tube.
  • the filter support 308 is preferably made of polycarbonate.
  • the compartment 302, the tip 304 and the moving means 310 are made, for example, of polypropylene.
  • the seals 306 and 312 are, for example, silicone.
  • FIGS. 6A and 6C are axial sections, mutually perpendicular to one another, of the second embodiment of the device that is the subject of the present invention, once the parts illustrated in FIG. 5 are assembled.
  • FIGS. 6B and 6D are views of enlarged details of parts Figures 6A and 6C, respectively. In FIGS. 6A to 6D, the elements described with reference to FIG. 5 are found.
  • FIGS. 7B to 7D are identical to FIGS. 3B to 3D, except that the tip is referenced 304.
  • the end piece 304 is removed after a rotation freeing it from the pins 318. Then, as illustrated in FIGS. 7G, 7H and 71, the end of the compartment 302 is inserted into an Eppendorf tube support 328 equipped with an Eppendorf 330 tube.
  • the moving means 310 is then moved downwards, parallel to the axis of the compartment 302.
  • the tabs 316 of the moving means 310 set in motion by the fingers of an operator, exert a vertical force, from top to bottom, on the filter support 308 and releases it from the lower end of the compartment 302.
  • the filter support 308 then sinks into the Eppendorf tube 330.
  • a step 402 the parts of the device are assembled.
  • the plug 314 is removed.
  • the tip 304 is inserted into the mouth 181 of the needle 180.
  • step 405 introducing a liquid, for example, blood, containing cells to be filtered and optionally cultivated, by the upper end of the compartment 302.
  • the pointed end 182 of the needle 180 is applied approximately to the center of the plug 186 and a pressure is applied to the compartment 302 to make the needle penetrate the plug 186 to that the end of the needle reaches the internal volume, in depression or empty, of the vacuum tube 185.
  • filtration is carried out by suction in the vacuum tube 185 of cells smaller than the cells of interest and the possible lysed cells and the principal of the liquid present in the compartment 302.
  • the vacuum tube 185 and the needle 180 are removed.
  • the end piece 304 is removed.
  • the end of the end piece is removed. compartment 302 in an Eppendorf tube holder.
  • the moving means and the compartment are respectively moved to exert a force on the filter support and release it so that it sinks into the Eppendorf tube.
  • the compartment 302 and the moving means 310 are removed and the plug of the Eppendorf tube is closed.
  • the implementation of the Eppendorf tube is then carried out in a manner known per se, for example with lysis, centrifugation and recovery stages of the genetic material with or without pre-amplification of the overall genome.
  • an analysis of the genetic material is carried out, in particular the DNA or RNA of the desired cells, collected at the bottom of an Eppendorf tube after centrifugation.
  • the amplified DNA is used as a template to detect mutations in sensitivity or resistance to targeted therapies.
  • the cDNA (“cDNA", "c” meaning "complementary") derived from the RNA by conversion by RT and amplified is used as a template to detect the level of expression of genes for sensitivity or resistance to targeted therapies.
  • This genetic material when obtained from trophoblasts filtered from the blood of pregnant women, can be used to identify potential genetic abnormalities.
  • a defined volume of the amplified genetic material, in particular DNA, is taken to detect mutations in sensitivity or resistance to targeted therapies using primer and antisense pairs of primers. pairs of probes and during a quantitative and real-time PCR (acronym for polymerase chain reaction).
  • the principle of the search for mutations of sensitivity or resistance to targeted therapies implemented in the embodiment shown is as follows.
  • the allele discrimination or "SNP genotyping assay” (SNP being the acronym for "single nucleotide polymorphism” for single nucleotide polymorphism) allows to inform on the presence or absence of a point mutation at the level of a gene.
  • the first step, 422, of an allelic discrimination is a real-time quantitative PCR reaction carried out with two primers to amplify the sequence of interest and two probes, for example of the TaqMan (registered trademark) type. One of the probes recognizes the mutated sequence and the other recognizes the normal sequence.
  • the two probes are associated with different fluorochromes, for example "VIC” for the probe hybridizing to the normal sequence and "FAM” for the probe hybridizing to the mutated sequence.
  • the second step, 424 uses an allelic discrimination program measuring the initial fluorescence and the final fluorescence emitted by the FAM or / and VIC fluorochromes. This program makes it possible to distinguish between the different sequences present in each sample:
  • a defined volume of genetic material including RNA, converted to cDNA by RT (acronym for "reverse transcription") and amplified is taken to detect the level of gene expression of sensitivity or resistance to targeted therapies using sense and antisense primer pairs and a probe and during a quantitative and real-time polymerase chain reaction (PCR), for example with 50 cycles .
  • PCR polymerase chain reaction
  • the filter is made of polycarbonate with a hydrophilic surface treatment.
  • the use of such a filter improves the retention rate of the particular cells and reduces the adhesion of other cells or their contents, when they have been specifically lysed.
  • the filter preferably has a pore diameter centered on a lower value, for example 1 ⁇ , at the corresponding value implemented for the same cells fixed, that is to say made rigid.
  • the pore diameter was centered on 7.5 ⁇ , it is here centered on a lower value, for example 6.5 ⁇ . Due to the dispersion of the diameters, practically no pore then has a diameter greater than 7 ⁇ .
  • the filter has pores whose density is between 50,000 and 200,000 pores / cm 2 and preferably about 100,000 pores / cm 2 .
  • the necessary depression is much more limited than in the systems of the prior art, up to four times less, which avoids damaging the cells that are aimed at collect on the filter.
  • the filter support 108 or 308 is mechanically connected to the moving means until the application, by movement of the compartment towards the culture well or the Eppendorf tube, of the force which releases the filter support from the moving means.
  • the role reversal of the lower end of the compartment 102 or 302 and the moving means 1 or 310 so that it is the latter which holds the filter support in or in front of a glass slide, a culture well or a tube Eppendorf and the first that releases it when pressing on the upper end of the compartment is an easy adaptation, within the reach of those skilled in the art from the description of the embodiments given above.
  • Figures 10 to 14 relate to particular embodiments of the device and method of the present invention which implement a protective cylinder and guide the vacuum tube.
  • FIGS. 10 to 13 show the compartment 102, the moving means 1 10 and a protection cylinder 502 connected to the compartment 102 by a two-part connection means 504 and 520.
  • the protective cylinder 502 includes the portion 504 of the connecting means, a frosted portion 506, a transparent portion 508 and, on an opening opposite the compartment 102, a film 510.
  • the portion 520 is formed in the end of the compartment 102.
  • FIG. 13 shows a particular embodiment of the portion 520 consisting of four teeth 522 formed laterally on a coaxial cylindrical portion with the compartment 102.
  • the portion 504 is in this embodiment, consisting of four grooves 524 whose profiles correspond to that of the teeth. These grooves 524 extend, helically, from an opening adapted to receive a tooth 522 towards the inside of the protection cylinder 502 so that the rotation of the protection cylinder 502 indicated by an arrow in FIG. advancing each tooth 522 in the corresponding groove 524 and tightening the protection cylinder 502 on the compartment 102.
  • the fixing of the protection cylinder 502 on the endpiece comprising the needle 180 is as follows.
  • the needle 180 is embedded in the part lower part 524, which is the portion opposite the compartment 502.
  • the portion 524 is mounted in force in the portion 506 with four fins.
  • the fins are on part 504 and are inserted into four grooves on part 506.
  • the frosted portion 506 serves to mask the needle 180.
  • the transparent portion 508 allows the user to check the state of the filtration and its completion.
  • Film 510 which covers and closes the entire bottom opening of cylinder 502, is provided with a side portion extending a short distance from cylinder 502 (shown in Figure 10). This lateral part allows the easy removal of the film 510.
  • the film 510 protects the user against access to the needle 180.
  • the film 510 also protects the needle 180 against the risk of fouling and / or contamination.
  • the cylinder 502 is discretely colored, for example in blue, green or yellow, depending on the destination of the filtration device (cytological studies, molecular biology, culture, respectively).
  • the depression initially present in the vacuum tube 185 causes the liquid present in the compartment 102 to be filtered.
  • the protective cylinder 502 and the needle 180 that it encloses are jointly removed.
  • a step 602 the parts of the device are assembled.
  • the stopper 14 is removed.
  • a liquid for example, blood, containing cells to be isolated and possibly cultivated, is introduced through the upper end of the compartment 102.
  • the vacuum tube 185 is introduced into the protection cylinder 502, which has the effect of applying the pointed end 182 of the needle 180 approximately to the center of the stopper 186, and it is applied , on the compartment 102 and on the vacuum tube 185, opposing forces to make the needle 180 penetrate into the stopper 186 until the end of the needle reaches the interior volume, under vacuum or under vacuum of the vacuum tube 185, in a step 606.
  • filtration is carried out by suction in the vacuum tube 185, cells smaller than the cells of interest, the possible lysed cells, and the main liquid present in the compartment 102, the cells of interest remaining retained on the filter 108.
  • the protective cylinder 502, vacuum tube 185 and the needle 180 are removed.
  • the device that is the subject of the present invention comprises, at least temporarily, said protection cylinder.
  • mounting is done just before use.
  • the connecting means is temporary and allows the removal of the protective cylinder jointly to that of the vacuum tube.
  • the removal of these two parts is separated into two successive steps.
  • the presentation of the device that is the subject of the present invention takes the form of a kit comprising, in an outer bag, two inner bags of which:
  • the first comprises the mounted device, as illustrated in FIGS. 2A, 6A or 10, and
  • the second comprises the needle, the vacuum tube, the culture well and a circular blade and / or an Eppendorf tube or any other accessory useful for the implementation of the device.
  • the implementation of the present invention avoids risky sampling of cells, for example amniotic fluid cells while allowing cultures, for example for amniocentesis.
  • cells for example amniotic fluid cells
  • cultures for example for amniocentesis.
  • FISH fluorescence in situ hybridization

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Le procédé pour isoler des cellules vivantes sur un filtre ou extraire leur matériel génétique, caractérisé en ce qu'il comporte: une étape (202, 402) de solidarisation, au moins temporaire, d'un filtre (108, 308) à une ouverture inférieure d'un compartiment (102, 302) présentant, en outre, une entrée d'air, une étape (204, 404) d'insertion d'un liquide comportant lesdites cellules dans ledit compartiment, une étape de solidarisation (205, 405), au moins temporaire d'une aiguille (180) à ladite ouverture du compartiment, de manière étanche, le filtre se trouvant entre l'aiguille et le volume intérieur du compartiment, une étape de perforation (206, 406), avec ladite aiguille, d'un bouchon (186) de tube à vide (185) présentant une dépression par rapport à la pression ambiante et une étape d'aspiration (210, 410), par le biais de la dépression du tube à vide, du liquide à travers ledit filtre, ledit filtre retenant lesdites cellules.

Description

DISPOSITIF ET PROCEDE POUR ISOLER ET CULTIVER DES CELLULES VIVANTES SUR FILTRE OU EXTRAIRE LEUR MATERIEL GENETIQUE
La présente invention concerne un dispositif et un procédé pour isoler et/ou cultiver des cellules vivantes ou fixées sur un filtre afin de procéder à toutes analyses cellulaires (cytologie, immunocytochimie, essais FISH, etc ...) ou extraire du matériel génétique éventuellement amplifié de cellules vivantes ou fixées isolées sur un filtre. Elle s'applique, en particulier, à isoler et/ou cultiver des cellules particulières présentes dans un liquide, notamment le sang, ou à extraire le matériel génétique de ces cellules particulières.
Certaines cellules particulières du sang, par exemple les cellules tumorales ou les trophoblastes, sont en très faible proportion et doivent être décomptées préalablement à des analyses cytologiques.
II est connu d'appliquer un tampon de fixation à base de formaldéhyde à un échantillon sanguin pour fixer les cellules recherchées, puis de faire passer le liquide résultant dans un filtre poreux. Ce filtre est ensuite utilisé pour y examiner les cellules recherchées sous microscope, en laboratoire. Cependant, cette procédure ne permet pas l'obtention de cellules vivantes.
Or, l'inventeur a déterminé que l'obtention de cellules vivantes permettrait d'envisager l'identification de marqueurs spécifiques et d'appliquer dans de bonnes conditions des techniques de biologie moléculaire, de cytogénétique et de « FISH » (acronyme de « Fluorescence In Situ Hybridization », pour hybridation fluorescente in situ) pour le diagnostic d'anomalies génétiques dans des cellules tumorales ou trophoblastiques.
La présente invention vise à remédier à ces inconvénients et à répondre à ce besoin en permettant de recueillir, dans des conditions compatibles avec des examens de laboratoire de routine, des cellules vivantes pouvant être subséquemment cultivées dans des milieux adaptés en présence de facteurs de croissance adéquats. La présente invention concerne aussi l'extraction du matériel génétique éventuellement amplifié de cellules isolées sur filtre et la détection de mutations et des niveaux de l'expression de gènes de sensibilité et de résistance aux thérapies ciblées ou d'anomalies génétiques.
Elle s'applique, en particulier à recueillir et éventuellement amplifier de façon uniforme l'ADN ou l'ARN de cellules particulières présentes dans un liquide, notamment le sang.
Il est connu, par exemple du document PCT/FR 2006/000562, d'appliquer un tampon de fixation à base de formaldéhyde à un échantillon sanguin pour fixer les cellules recherchées, puis de faire passer le liquide résultant dans un filtre poreux. Ce filtre est ensuite analysé en laboratoire pour y rechercher les cellules sous microscope. On peut, par la suite, les prélever sur le filtre pour des analyses, par exemple par une analyse génétique.
Cependant, cette procédure ne peut faire l'objet d'une reproduction à grande échelle et à un coût raisonnable, du fait du temps, des matériels et de la précision de travail qu'elle implique. Or cette reproduction à grande échelle et moindre coût permettrait la conduite d'analyses de biologie moléculaire à la fois sur des cellules tumorales et sur des cellules trophoblastiques. De plus, la fixation des cellules par le formaldéhyde ne permet pas d'obtenir du matériel génétique de bonne qualité : l'ADN est en partie dégradé et forme des ponts avec des protéines ambiantes et l'extraction d'ARN est pratiquement exclue.
La présente invention vise aussi à remédier à ces inconvénients et à répondre à ce besoin en permettant de recueillir dans des conditions compatibles avec des examens de laboratoire de routine, une grande proportion du matériel cellulaire, en particulier, ARN et ADN, des cellules considérées, en bon état. Il faut aussi noter que la présente invention permet l'isolement de cellules fixées à l'aide d'un fixateur contenant ou non du formaldéhyde.
A cet effet, selon un premier aspect, la présente invention vise un dispositif pour isoler des cellules fixées ou vivantes sur un filtre, caractérisé en ce qu'il comporte : - un compartiment présentant un volume intérieur pour recevoir un liquide comportant lesdites cellules, une ouverture inférieure et une entrée d'air,
- un filtre, au moins temporairement, solidaire de ladite ouverture du compartiment, adapté à retenir lesdites cellules lors du passage du liquide à travers le filtre,
- une aiguille au moins temporairement solidaire de ladite ouverture du compartiment, de manière étanche, le filtre se trouvant entre l'aiguille et le volume intérieur du compartiment, ladite aiguille étant adaptée à perforer un bouchon de tube à vide présentant une dépression par rapport à la pression ambiante pour aspirer le liquide à travers ledit filtre.
Ce dispositif permet ainsi l'isolement et la récupération sur filtre des cellules vivantes d'intérêt fixées, ou vivantes dans des conditions parfaitement compatibles avec leur mise en culture pour poursuivre des examens de caractérisation cytologique, et de cytogénétique, pour tout autre examen cellulaire ou pour extraire leur matériel génétique.
Cette récupération est effectuée directement sur filtre et pratiquement sans perte de cellules recherchées. On recueille ainsi, à moindre coût, une grande proportion des cellules considérées, en bon état, dans des conditions compatibles avec une culture de routine en laboratoire. Les cellules isolées peuvent être utilisées avant ou après culture, pour les examens de biologie cellulaire ou moléculaire.
Le dispositif objet de la présente invention permet aussi de recueillir du matériel cellulaire de cellules particulières, rapidement et efficacement, par exemple, après réalisation :
- d'une étape de filtration au cours de laquelle le principal du liquide et des dites autres cellules passe à travers un filtre dont les micropores ont un diamètre intermédiaire entre celui des dites cellules particulières et celui d'autres cellules,
- d'une étape de lyse suivie ou non d'amplification de l'ADN et/ou de l'ARN dans ledit compartiment et
- d'une étape de récupération du matériel génétique des cellules lysées, sur le filtre. Le dispositif objet de la présente invention présente de nombreux avantages :
1 / la filtration peut être effectuée sur un portoir ou en tenant le dispositif à la main, ce qui représente un gain de temps et une économie de matériel importants (on évite une pompe à vide et un boîtier d'adaptation, notamment),
21 la filtration peut être effectuée dans une hotte stérile.
3/ la filtration peut être effectuée avec le dispositif en position oblique, voire pratiquement horizontal .
4) les conditions sont parfaitement standardisées, le tube de prélèvement étant produit de façon standardisée avec une capacité de vide prédéfinie.
5) les conditions d'utilisation présentent des conditions de sécurité élevées, l'opération pouvant être entièrement réalisée dans une hotte stérile ; de plus, le tube à vide, une fois rempli, peut être éliminé comme un tube habituel de prélèvement sanguin, le sang récupéré n'étant pas en contact avec l'opérateur.
Selon des caractéristiques particulières, le dispositif objet de la présente invention, tel que succinctement exposé ci-dessus, comporte, en outre, un moyen de liaison entre le compartiment et un cylindre de protection entourant l'aiguille et destiné à entourer, au moins partiellement, le tube à vide pendant l'aspiration du liquide à travers le filtre.
Grâce à ces dispositions, l'utilisateur est protégé contre une piqûre accidentelle avec l'aiguille. De plus, la mise en place du tube à vide est facilitée par le guidage offert par le cylindre de protection. La position du tube à vide au cours de l'aspiration est aussi plus rigidement maintenue, ce qui évite son retrait ou un déplacement qui permettrait à de l'air d'entrer dans le tube à vide en passant à côté de l'aiguille dans le bouchon du tube à vide. Le risque de contamination de l'échantillon par l'utilisateur est minimisé car l'utilisateur ne peut toucher l'aiguille par mégarde. Selon des caractéristiques particulières, le dispositif objet de la présente invention, tel que succinctement exposé ci-dessus, comporte, au moins provisoirement, ledit cylindre de protection.
Ainsi, la protection de l'aiguille, de l'échantillon et de l'utilisateur est assurée.
Selon des caractéristiques particulières, ledit moyen de liaison est provisoire et permet le retrait du cylindre de protection conjointement à celui du tube à vide et de l'aiguille.
Ainsi, la protection de l'aiguille et de l'utilisateur est assurée après la séparation du cylindre de protection du compartiment.
Selon des caractéristiques particulières, ledit cylindre de protection comporte une pellicule amovible obturant son ouverture opposée au moyen de liaison, ouverture par laquelle le tube à vide est introduit dans le cylindre de protection.
Grâce à ces dispositions, avant d'insérer le tube à vide, l'utilisateur retire la pellicule. Cette pellicule assure, à la fois, une meilleure protection de l'utilisateur et de l'aiguille et une réduction des risques de contamination de l'échantillon.
Selon des caractéristiques particulières, le dispositif objet de la présente invention comporte, en outre, un support de filtre amovible en acier chirurgical adapté à être solidarisé de manière temporaire à l'ouverture inférieure du compartiment.
Grâce à ces dispositions, on peut extraire le filtre avec son support pour cultiver ou analyser les cellules recueillies sur le filtre ou en extraire le matériel génétique. De plus, l'acier n'est pas toxique pour les cellules recueillies sur le filtre.
Selon des caractéristiques particulières, l'épaisseur dudit anneau est adaptée à permettre son passage dans un scanner.
Selon des caractéristiques particulières, ledit anneau porte un identifiant.
Ainsi, on peut associer cet identifiant, et donc les cellules recueillies, à un patient. On évite ainsi des erreurs. Selon des caractéristiques particulières, le dispositif objet de la présente invention comporte, en outre, un moyen mobile par rapport audit compartiment pour appliquer une force sur le support de filtre et libérer ledit support de filtre.
L'ensemble du module de filtration étant stérile et préparé dans des normes habituellement appliquées pour la biologie moléculaire, on peut éviter toute contamination ou détérioration des cellules vivantes sur le filtre ou du matériel génétique. Le contenu du compartiment est maintenu à l'état stérile lors des manipulations sous une hotte à flux laminaire adaptée. Ainsi, toutes les étapes pour isoler et cultiver les cellules ou pour extraire et analyser leur matériel génétique peuvent être effectuées dans des conditions stériles.
Selon des caractéristiques particulières, le dispositif objet de la présente invention comporte un embout amovible fixé au compartiment de façon étanche et amovible et adapté à interdire le mouvement relatif du moyen mobile et du compartiment qui permet d'appliquer ladite force et libérer ledit support de filtre.
Grâce à ces dispositions, on garantit le maintien en position du porte- filtre. De plus, l'embout peut le protéger contre les éclaboussures et la contamination,
Ainsi, on retient le filtre pendant la filtration puis on le libère, pour sa récupération, en retirant l'embout et en mettant en mouvement respectif le moyen mobile et le compartiment pour appliquer la force qui libère le support de filtre.
Selon un deuxième aspect, la présente invention vise un procédé pour isoler des cellules vivantes sur un filtre ou extraire leur matériel génétique, caractérisé en ce qu'il comporte :
- une étape de solidarisation, au moins temporaire, d'un filtre à une ouverture inférieure d'un compartiment présentant, en outre, une entrée d'air,
- une étape d'insertion d'un liquide comportant lesdites cellules dans ledit compartiment, - une étape de solidahsation, au moins temporaire d'une aiguille à ladite ouverture du compartiment, de manière étanche, le filtre se trouvant entre l'aiguille et le volume intérieur du compartiment,
- une étape de perforation d'un bouchon de tube à vide présentant une dépression par rapport à la pression ambiante avec ladite aiguille et
- une étape d'aspiration, par le biais de la dépression du tube à vide, du liquide à travers ledit filtre, ledit filtre retenant lesdites cellules.
Selon des caractéristiques particulières, le procédé objet de la présente invention, tel que succinctement exposé ci-dessus comporte, en outre :
- une étape de fixation, au moins temporaire, d'un cylindre de protection au compartiment, ledit cylindre de protection entourant alors l'aiguille et
- au cours de l'étape de perforation, on insère le tube à vide dans le cylindre de protection.
Les avantages, buts et caractéristiques particulières de ce procédé étant similaires à ceux du dispositif objet de la présente invention, tel que succinctement exposé ci-dessus, ils ne sont pas rappelés ici.
D'autres avantages, buts et caractéristiques de la présente invention ressortiront de la description qui va suivre, faite, dans un but explicatif et nullement limitatif, en regard des dessins annexés, dans lesquels :
- la figure 1 représente, schématiquement et en perspective, l'assemblage des pièces d'un premier mode de réalisation du dispositif objet de la présente invention,
- les figures 2A à 2D représentent, schématiquement et en sections axiales perpendiculaires entre elles, le premier mode de réalisation du dispositif avant utilisation,
- les figures 3A à 30 représentent, schématiquement, en élévation ou en coupe, des étapes de mise en œuvre du premier mode de réalisation du dispositif objet de la présente invention, - la figure 4 représente, sous forme d'un logigramme, des étapes mises en œuvre dans un premier mode de réalisation particulier du procédé objet de la présente invention,
- la figure 5 représente, schématiquement et en perspective, l'assemblage des pièces d'un deuxième mode de réalisation particulier du dispositif objet de la présente invention,
- les figures 6A à 6D représentent, schématiquement et en sections axiales perpendiculaires entre elles, le deuxième mode de réalisation du dispositif avant utilisation,
- les figures 7A à 7L représentent, schématiquement, en élévation ou en coupe, des étapes de mise en œuvre du deuxième mode de réalisation du dispositif objet de la présente invention,
- la figure 8 représente, en coupe, un support de filtre intégré au deuxième mode de réalisation du dispositif objet de la présente invention,
- la figure 9 représente, sous forme d'un logigramme, des étapes mises en œuvre dans un deuxième mode de réalisation particulier du procédé objet de la présente invention,
- la figure 10 représente, schématiquement, un mode de réalisation particulier du dispositif, avant utilisation,
- la figure 1 1 représente, schématiquement, le mode de réalisation du dispositif illustré en figure 10, après retrait d'une pellicule de protection et avant insertion d'un tube à vide,
- la figure 12 représente, schématiquement, le mode de réalisation du dispositif illustré en figures 10 et 1 1 , après insertion du tube à vide,
- la figure 13 représente, schématiquement, le mode de réalisation du dispositif illustré en figures 10 à 12, en cours de retrait du tube à vide et d'un cylindre de protection et
- la figure 14 représente, sous forme d'un logigramme, des étapes mises en œuvre dans un mode de réalisation particulier du procédé objet de la présente invention.
Dans la description des figures qui va suivre, on envisage un système de filtration de liquide, notamment de sang, comportant des moyens de retrait d'un support de filtre. Cependant, la présente invention ne se limite pas à ces modes de réalisation préférentiels mais s'étend, au contraire, à tout système comportant un compartiment pour recevoir un liquide, un filtre monté, au moins temporairement, sur une ouverture de ce compartiment et une aiguille montée, au moins temporairement, de manière étanche, sur cette ouverture du compartiment pour que, lors du percement d'un bouchon de tube à vide préconditionné, l'aiguille véhicule une aspiration du liquide à travers le filtre et que des cellules d'intérêt soient retenues sur ce filtre.
L'aiguille comporte une extrémité très fine adaptée à pénétrer dans le bouchon du tube à vide (voir figures 3B à 3D) et une embouchure, plus large adaptée à recevoir l'extrémité inférieure du compartiment ou d'un support de filtre. Le tube à vide présente une dépression très importante et un volume supérieur au volume de liquide à filtrer.
Dans des modes de réalisation préférentiels dans lesquels l'aiguille est amovible par rapport au compartiment, une fois le compartiment rempli avec le liquide comportant les cellules d'intérêt, pour récupérer les cellules, on emboîte l'embouchure de l'aiguille sur l'ouverture du compartiment puis on perfore le bouchon du tube à vide avec l'extrémité fine de l'aiguille. Sous l'effet de la dépression, la filtration du liquide s'effectue automatiquement, typiquement en 60 secondes.
Ainsi, la filtration peut être effectuée en tenant le dispositif à la main, ce qui représente un gain de temps et une économie de matériel importants, notamment parce qu'il n'est plus nécessaire de prévoir de pompe à vide ni de boîtier d'adaptation du compartiment sur la pompe.
De plus, la filtration peut être effectuée dans une hotte stérile, le dispositif pouvant être penché, voire pratiquement horizontal.
On va maintenant décrire des modes de réalisation avec un support de filtre amovible et des moyens de l'extraire du compartiment sans le toucher.
On observe, en figure 1 , un réservoir, ou compartiment, 102, un embout 104, un joint 106, un filtre avec son support 108, un moyen mobile 1 10, un joint 1 12 et un bouchon 1 14 présentant une entrée d'air (non représentée). Le compartiment 102 est de forme générale cylindrique. Son extrémité supérieure peut être obturée, de manière étanche, hormis l'entrée d'air, par le bouchon 1 14. L'extrémité inférieure du compartiment 102 présente, sur sa face externe, des anneaux discontinus dont les discontinuités guident des pattes du moyen mobile 1 10, lesdits anneaux guidant le corps du moyen mobile 1 10.
Ce moyen mobile 1 10 présente une forme générale cylindrique munie de deux pattes 1 16 s'étendant vers l'embout 104 et se resserrant dans cette direction de manière à être séparées, entre elles, d'une distance inférieure au diamètre du support de filtre 108. Comme on le verra, par la suite, cette forme particulière, notamment, celle des pattes 1 16 recourbées l'une vers l'autre, permet au moyen mobile 1 10, après retrait de l'embout 104, de pousser le support de filtre 108 afin de le libérer, ainsi que son filtre, du compartiment 102, lors du mouvement du moyen mobile vers le support de filtre 108.
L'extrémité des pattes 1 16 du moyen mobile 1 10 et l'extrémité inférieure du compartiment 102 sont adaptées à pénétrer dans une boîte ou puits, de culture. En revanche, l'anneau discontinu extrême du compartiment 102 possède un diamètre adapté à ce qu'il prenne appui sur le bord de la boîte, ou puits, de culture.
A l'ouverture inférieure du compartiment 102 est placé, de façon étanche, stérile et amovible, un embout, ou adaptateur, 104 qui enserre la paroi extérieure du compartiment 102 et présente une ouverture inférieure effilée de plus petit diamètre que celui du compartiment 102.
Cette ouverture inférieure effilée de l'embout, ou adaptateur, 104 présente une longueur suffisante pour permettre l'emboîtement mécanique étanche de l'embouchure d'une aiguille (voir figures 3B à 3D).
L'embout 104 présente, de manière coordonnée avec la forme de l'extrémité inférieure du compartiment 102, qui possède des ergots latéraux 1 18, des moyens de blocage par rotation, pour enserrer lesdits ergots, de manière connue en soi. L'embout 104 garantit ainsi le maintien en position du porte-filtre pendant les étapes de filtration. De plus, l'embout 104 protège le filtre contre les éclaboussures et la contamination. L'extrémité inférieure du compartiment 102 présente une ouverture débouchant, après montage, sur le filtre porté par le support de filtre 108, lui- même retenu en position, d'une part, par l'extrémité inférieure du compartiment 102 et, d'autre part, par l'embout 104.
Le support de filtre 108 prend, dans le premier mode de réalisation, la forme d'une rondelle de forme annulaire. Le filtre est micro perforé et soudé sous le support de filtre 108 puis inséré avec elle dans l'extrémité inférieure du compartiment 102.
Préférentiellement, le support de filtre 108 amovible est annulaire et en acier chirurgical. L'acier n'est, en effet, pas toxique pour les cellules recueillies sur le filtre. De plus, un support de filtre en acier chirurgical est plus facile à retirer que s'il est en matière plastique et plus rigide. Préférentiellement, l'épaisseur dudit anneau est adaptée à permettre son passage dans un scanner. Préférentiellement, cet anneau porte un identifiant. Ainsi, on peut associer cet identifiant, et donc les cellules recueillies, à un patient. On évite ainsi des erreurs.
En variante, le support de filtre 108 est en PVC et possède une épaisseur inférieure ou égale à 0,4 mm, et préférentiellement, inférieure à 0,3 mm. Son diamètre extérieur est, par exemple, de 12,6 mm. Le diamètre du filtre porté par le support de filtre 108 est, par exemple, de 5,9 mm.
Le compartiment 102, l'embout 104 et le moyen mobile 1 10 sont réalisés, par exemple, en polypropylène. Les joints 106 et 1 12 sont, par exemple, en silicone.
Les figures 2A et 2C sont des sections axiales, perpendiculaires entre elles, du premier mode de réalisation du dispositif objet de la présente invention, une fois assemblées les pièces illustrées en figure 1 . Les figures 2B et 2D sont des vues de détails agrandies de parties des figures 2A et 2C, respectivement. On retrouve, dans les figures 2A à 2D, les éléments décrits en regard de la figure 1 .
La figure 3A représente le dispositif en élévation, dans sa configuration de stockage. La figure 3B représente l'embout 104 lors de son insertion dans l'embouchure 181 d'une aiguille 180 qui présente une autre extrémité 182 très fine et biseauté pour faciliter le percement d'un bouchon de tube à vide. L'embouchure 181 de l'aiguille 180 est, préférentiellement, constituée en matière plastique. L'extrémité 182 de l'aiguille 180 est, préférentiellement métallique. La mise en place de l'aiguille 180 sur l'embout 104 peut se faire soit avant, soit après introduction de liquide (non représenté), par exemple du sang, dans le compartiment 102, à travers son ouverture supérieure.
La figure 3C illustre le début du percement du bouchon 186 du tube à vide 185, une fois l'aiguille 180 solidarisée de manière étanche à l'embout 104.
La figure 3D illustre le percement complet du bouchon 186 par l'aiguille 180, mettant en communication, à travers le filtre 108, l'intérieur du tube à vide 185, en dépression, et le volume du compartiment 102 comportant le liquide comportant les cellules d'intérêt. Le volume intérieur du tube à vide 185 est supérieur au volume de liquide à filtrer.
Lors de l'aspiration, certaines cellules particulières du liquide présent dans le compartiment 102, de plus fort diamètre, sont retenues par le filtre 108 alors que le principal du liquide, du contenu et, le cas échéant, de la paroi des cellules lysées et les cellules de plus petites dimensions que les cellules à recueillir sont aspirés dans le tube à vide 185, à travers le filtre 108.
Puis, comme illustré en figures 3E et 3F, on retire l'embout 104 après une rotation le libérant des ergots 1 18. Puis, comme illustré en figures 3G et 3H, on insère l'extrémité du compartiment 102 dans une boîte, ou un puits, de culture 130.
Comme exposé ci-dessus et comme illustré en figure 31, l'extrémité rapprochée des pattes 1 16 du moyen mobile 1 10 et l'extrémité inférieure du compartiment 102 sont adaptés à pénétrer dans une boîte ou puits, de culture. En revanche, l'anneau discontinu extrême du compartiment 102 possède un diamètre adapté à ce qu'il prenne appui sur le bord de la boîte, ou puits, de culture 130.
Plus précisément, comme illustré en figures 3J et 3K, le moyen mobile 1 10 peut encore, dans cette position, bouger parallèlement à l'axe du compartiment 102. Comme illustré en figures 3N et 3M, lors de ce mouvement, les pattes 1 16 du moyen mobile mis en mouvement par les doigts d'un opérateur, exercent une force verticale, de haut en bas, sur le support de filtre 108 et le libère de l'extrémité inférieure du compartiment 102. Le filtre et son support 108 tombent alors dans la boîte, ou puits, de culture 130.
Enfin, comme illustré en figure 3O, on retire le compartiment 102 et le moyen mobile 1 10 de la boîte, ou puits, de culture 130.
La figure 4 récapitule les étapes ainsi mises en œuvre.
Au cours d'une étape 202, on assemble les pièces du dispositif. Au cours d'une étape 203, on retire le bouchon 1 14. Au cours d'une étape 204, on insert l'embout 104 dans l'embouchure 181 de l'aiguille 180. Au cours d'une étape 205, on introduit un liquide, par exemple, du sang, contenant des cellules à isoler et éventuellement à cultiver, par l'extrémité supérieure du compartiment 102.
Au cours d'une étape 206, on applique l'extrémité pointue 182 de l'aiguille 180 approximativement au centre du bouchon 186 et on applique, sur le compartiment 102, une pression pour faire pénétrer l'aiguille dans le bouchon 186 jusqu'à ce que l'extrémité de l'aiguille atteigne le volume intérieur, en dépression, voire vide, du tube à vide 185.
Au cours d'une étape 210, on effectue une filtration, par aspiration dans le tube à vide 185, des cellules plus petites que les cellules d'intérêt, les éventuelles cellules lysées, et le principal du liquide présent dans le compartiment 102, les cellules d'intérêt restant retenues sur le filtre 108.
Au cours d'une étape 212, on retire le tube à vide 185 et l'aiguille 180. Au cours d'une étape 214, on retire l'embout 104. Au cours d'une étape 216, on insère l'extrémité du compartiment 102 dans une boîte, ou un puits, de culture.
Au cours d'une étape 218, on met en mouvement respectif le moyen mobile et le compartiment pour exercer une force sur le support de filtre 108 et le libérer afin qu'il tombe avec son filtre dans la boîte, ou puits, de culture 130. Au cours d'une étape 220, on retire le compartiment 102 et le moyen mobile 1 10 de la boîte, ou puits, de culture 130. Au cours d'une étape 222, la culture est réalisée, de manière connue, dans le puits de culture 130. On observe que la présence du support 108 autour de la face supérieure du filtre, face qui porte les cellules isolées sur filtre, permet d'éviter que ces cellules ne quittent le filtre.
Lors de l'étape 222 de mise en culture des cellules vivantes d'intérêt sur le filtre, le filtre est, par exemple, recouvert d'une mince couche de Matrigel (ou mis en contact avec une couche de Matrigel, marque déposée, préalablement mis au fond du puits de plaque et/ou du flacon de culture et sur laquelle il repose) contenant des facteurs adaptés à la croissance des cellules d'intérêt.
Lorsque l'on souhaite observer les cellules, ou leur matériel génétique, au cours d'une étape 224, on attrape le support de filtre 108, dont la saisie avec une brucelle est facilitée par la présence de trous cylindriques latéraux, ou encoches, dans la face supérieure du support de filtre 108.
Puis, on peut poser le support de filtre 108 sur une lame de verre et on appliquer, sur le filtre, une lamelle de verre en forme de disque de diamètre adapté à la surface supérieure libre du filtre. L'analyse des cellules ou l'extraction de leur matériel génétique est effectuée de manière connue en soi.
On observe, en figure 5, un réservoir, ou compartiment, 302, un embout 304, un joint 306, un support de filtre 308, un moyen mobile 310, un joint 312 et un bouchon 314.
Le compartiment 302 est de forme générale cylindrique. Son extrémité supérieure peut être obturée, de manière étanche, à l'exception d'une entrée d'air (non représentée), par le bouchon 314. L'extrémité inférieure du compartiment 302 présente, sur sa face externe, un cylindre 350 séparé du corps du compartiment 302, hormis par des liaisons mécaniques en forme de nervures latérales 352. Ce cylindre 350 possède un diamètre extérieur qui correspond au diamètre intérieur du corps du moyen mobile 310, afin de le guider en déplacement. Le cylindre 350 est muni de lumières 354 adaptées à laisser pénétrer et coulisser longitudinalement les pattes 316 du moyen mobile 310. Le moyen mobile 310 présente une forme générale cylindrique munie de deux pattes 316 s'étendant vers l'embout 304 et se resserrant dans cette direction de manière à être séparées, entre elles, d'une distance inférieure au diamètre du support de filtre 308. Comme on le verra, par la suite, cette forme particulière, notamment, celle des pattes 316 recourbées l'une vers l'autre, permet au moyen mobile 310, après retrait de l'embout 304, de pousser le support de filtre 308 afin de le libérer du compartiment 302, lors du mouvement du moyen mobile vers le support de filtre 308.
L'embout 304 présente, de manière coordonnée avec la forme de l'extrémité inférieure du compartiment 302, qui possède des ergots latéraux 318, des moyens de blocage par rotation, pour enserrer lesdits ergots, de manière connue en soi. L'embout 304 garantit ainsi le maintien en position du porte-filtre pendant les étapes de filtration. De plus, l'embout 304 protège le filtre contre les éclaboussures et la contamination.
L'extrémité inférieure du compartiment 302 présente une ouverture débouchant, après montage, sur le filtre porté par le support de filtre 308, lui- même retenu en position, d'une part, par l'extrémité inférieure du compartiment 302 et, d'autre part, par l'embout 304.
Comme illustré en figure 8, le support de filtre 308 prend, dans le deuxième mode de réalisation, une forme coordonnée à celle d'un tube Eppendorf.
En particulier :
- le support 308 présente, dans sa partie supérieure intérieure, la forme de la partie supérieure intérieure d'un tube Eppendorf, ce qui permet de fermer l'ouverture supérieure dudit support avec un bouchon de tube Eppendorf et
- le support 308 présente, dans sa partie supérieure extérieure simule la forme de la partie supérieure intérieure d'un tube Eppendorf ce qui permet au support de filtre 308 de s'insérer dans la partie haute d'un tube Eppendorf.
De plus, le support de filtre 308 présente une fonction colonne pour permettre la lyse des cellules retenues sur filtre et le transfert par centrifugation du lysat cellulaire et du matériel génétique du support de filtre vers le tube Eppendorf.
Le support de filtre 308 est, préférentiellement, en polycarbonate. Le compartiment 302, l'embout 304 et le moyen mobile 310 sont réalisés, par exemple, en polypropylène. Les joints 306 et 312 sont, par exemple, en silicone.
Les figures 6A et 6C sont des sections axiales, perpendiculaires entre elles, du deuxième mode de réalisation du dispositif objet de la présente invention, une fois assemblées les pièces illustrées en figure 5. Les figures 6B et 6D sont des vues de détails agrandies de parties des figures 6A et 6C, respectivement. On retrouve, dans les figures 6A à 6D, les éléments décrits en regard de la figure 5.
La figure 7A représente le dispositif en élévation, dans sa configuration de stockage. Les figures 7B à 7D sont identiques aux figures 3B à 3D, à ceci près que l'embout est référencé 304.
Comme illustré en figures 7E et 7F, on retire l'embout 304 après une rotation le libérant des ergots 318. Puis, comme illustré en figures 7G, 7H et 71, on insère l'extrémité du compartiment 302 dans un support de tube Eppendorf 328 muni d'un tube Eppendorf 330.
Comme illustré en figures 7J et 7K, le moyen mobile 310 est ensuite mis en mouvement vers le bas, parallèlement à l'axe du compartiment 302. Lors de ce mouvement, les pattes 316 du moyen mobile 310 mis en mouvement par les doigts d'un opérateur, exercent une force verticale, de haut en bas, sur le support de filtre 308 et le libère de l'extrémité inférieure du compartiment 302. Le support de filtre 308 s'enfonce alors dans le tube Eppendorf 330.
Enfin, comme illustré en figure 7L, on retire le compartiment 302 et le moyen mobile 310.
La figure 9 récapitule les étapes ainsi mises en œuvre.
Au cours d'une étape 402, on assemble les pièces du dispositif. Au cours d'une étape 403, on retire le bouchon 314. Au cours d'une étape 404, on insert l'embout 304 dans l'embouchure 181 de l'aiguille 180. Au cours d'une étape 405, on introduit un liquide, par exemple, du sang, contenant des cellules à filtrer et éventuellement cultiver, par l'extrémité supérieure du compartiment 302.
Au cours d'une étape 406, on applique l'extrémité pointue 182 de l'aiguille 180 approximativement au centre du bouchon 186 et on applique, sur le compartiment 302, une pression pour faire pénétrer l'aiguille dans le bouchon 186 jusqu'à ce que l'extrémité de l'aiguille atteigne le volume intérieur, en dépression, voire vide, du tube à vide 185.
Au cours d'une étape 410, on effectue une filtration, par aspiration dans le tube à vide 185, des cellules plus petites que les cellules d'intérêt et les éventuelles cellules lysées et le principal du liquide présent dans le compartiment 302.
Au cours d'une étape 412, on retire le tube à vide 185 et l'aiguille 180. Au cours d'une étape 414, on retire l'embout 304. Au cours d'une étape 416, on insère l'extrémité du compartiment 302 dans un support de tube Eppendorf.
Au cours d'une étape 418, on met en mouvement respectif le moyen mobile et le compartiment pour exercer une force sur le support de filtre et le libérer afin qu'il s'enfonce dans le tube Eppendorf. Enfin, au cours d'une étape 420, on retire le compartiment 302 et le moyen mobile 310 et on referme le bouchon du tube Eppendorf.
La mise en œuvre du tube Eppendorf est ensuite réalisée de manière connue en soi, par exemple avec des étapes de lyse, de centrifugation et de récupération du matériel génétique avec ou sans pré-amplification du génome global.
Au cours d'étapes 422 et 424, on effectue une analyse du matériel génétique, notamment l'ADN ou l'ARN des cellules recherchées, recueilli au fond d'un tube Eppendorf après centrifugation. L'ADN amplifié est utilisé comme matrice pour détecter les mutations de sensibilité ou de résistance aux thérapies ciblées. De plus, ou alternativement, l'ADNc (en anglais « cDNA », « c » signifiant « complémentaire ») provenant de l'ARN par conversion par RT et amplifié est utilisé comme matrice pour détecter le niveau d'expression de gènes de sensibilité ou de résistance aux thérapies ciblées. Ce matériel génétique, lorsqu'il est obtenu de trophoblastes filtrés à partir du sang de femmes enceintes, peut être utilisé pour permettre l'identification d'anomalies génétiques éventuelles.
Un volume défini du matériel génétique amplifié, notamment l'ADN, est prélevé pour détecter les mutations de sensibilité ou de résistance aux thérapies ciblées à l'aide de couples d'amorces (en anglais « primers ») sens et anti-sens et de couples de sondes et au cours d'une PCR (acronyme de « polymerase chain reaction ») quantitative et en temps réel.
Le principe de la recherche de mutations de sensibilité ou de résistance aux thérapies ciblées mis en œuvre dans le mode de réalisation représenté est le suivant. La discrimination allélique ou « SNP genotyping assay » (SNP étant l'acronyme de « single nucleotide polymorphism » pour polymorphisme nucléotide simple) permet de renseigner sur la présence ou l'absence d'une mutation ponctuelle au niveau d'un gène. La première étape, 422, d'une discrimination allélique est une réaction de PCR quantitative en temps réel réalisée avec deux amorces pour amplifier la séquence d'intérêt et deux sondes, par exemple de type TaqMan (marque déposée). L'une des sondes reconnaît la séquence mutée et l'autre reconnaît la séquence normale. Les deux sondes sont associées à des fluorochromes différents, par exemple « VIC » pour la sonde s'hybridant à la séquence normale et « FAM » pour la sonde s'hybridant à la séquence mutée. La seconde étape, 424, fait appel à un programme de discrimination allélique mesurant la fluorescence initiale et la fluorescence finale émise par les fluorochromes FAM ou/et VIC. Ce programme permet de faire la distinction entre les différentes séquences présentes dans chaque échantillon :
- une augmentation de la fluorescence uniquement en VIC indique un profil homozygote pour la séquence normale,
- une augmentation de la fluorescence uniquement en FAM indique un profil homozygote pour la séquence mutée,
- une augmentation de la fluorescence à la fois en VIC et en FAM indique un profil hétérozygote. Les sondes s'apparient entre les deux amorces et révèlent la présence ou l'absence d'une mutation du fait de leur couleur de fluorescence associée.
Dans d'autres modes de réalisation, un volume défini du matériel génétique notamment l'ARN, converti en ADNc par RT (acronyme de « reverse transcription ») et amplifié, est prélevé pour détecter le niveau d'expression de gène de sensibilité ou de résistance aux thérapies ciblées à l'aide de couples d'amorces sens et anti-sens et d'une sonde et au cours d'une PCR (acronyme de « polymerase chain reaction ») quantitative et en temps réel, par exemple avec 50 cycles.
Dans chacun des modes de réalisation décrits ci-dessus, préférentiellement, le filtre est réalisé en polycarbonate avec un traitement de surface hydrophile. L'utilisation d'un tel filtre améliore le taux de retenu des cellules particulières et réduit l'adhérence des autres cellules ou de leur contenu, lorsqu'elles ont été spécifiquement lysées.
Le filtre présente, préférentiellement, un diamètre de pores centré sur une valeur inférieure, par exemple de 1 μηη, à la valeur correspondante mise en œuvre pour les mêmes cellules fixées, c'est-à-dire rendues rigides.
Par exemple, si, pour les cellules fixées, le diamètre des pores aurait été centré sur 7,5 μηη, il est ici centré sur une valeur inférieure, par exemple de 6,5 μηη . Du fait de la dispersion des diamètres, pratiquement aucun pore ne possède alors un diamètre supérieur à 7 μηη .
Pour une application de l'invention à des cellules sanguines, le filtre présente des pores dont la densité est entre 50.000 et 200.000 pores/cm2 et, préférentiellement d'environ 100.000 pores/cm2.
Grâce à l'usage d'un filtre en polycarbonate, la dépression nécessaire est beaucoup plus limitée que dans les systèmes de l'art antérieur, jusqu'à être quatre fois moindre, ce qui évite de détériorer les cellules que l'on vise à recueillir sur le filtre.
Dans des variantes, le support 108 ou 308 de filtre est mécaniquement lié au moyen mobile jusqu'à l'application, par mouvement du compartiment vers le puits de culture ou le tube Eppendorf, de la force qui libère le support de filtre du moyen mobile. L'inversion des rôles de l'extrémité inférieure du compartiment 102 ou 302 et du moyen mobile 1 10 ou 310 pour que ce soit ce dernier qui tienne le support de filtre dans ou devant une lame de verre, un puits de culture ou un tube Eppendorf et le premier qui le libère lors d'un appui sur l'extrémité supérieure du compartiment est une adaptation aisée, à la portée de l'homme du métier à partir de la description des modes de réalisation donnée ci-dessus.
Les figures 10 à 14 concernent des modes de réalisation particuliers du dispositif et du procédé objets de la présente qui mettent en œuvre un cylindre de protection et de guidage du tube à vide.
Bien que ces modes de réalisations particuliers complètent l'un ou l'autre des modes de réalisation décrits ci-dessus, on a choisi, pour réaliser les figures 10 à 14, de les adapter au mode de réalisation illustré aux figures 1 à 4.
On observe, en figures 10 à 13, le compartiment 102, le moyen mobile 1 10 et un cylindre de protection 502 lié au compartiment 102 par un moyen de liaison en deux parties, 504 et 520.
Le cylindre de protection 502 comporte la partie 504 du moyen de liaison, une partie dépolie 506, une partie transparente 508 et, sur une ouverture opposée au compartiment 102, une pellicule 510.
La partie 520 est formée dans l'extrémité du compartiment 102. La figure 13 montre un mode de réalisation particulier de la partie 520 constituée de quatre dents 522 formées latéralement sur une partie cylindrique co-axiale avec le compartiment 102. La partie 504 est, dans ce mode de réalisation, constituée de quatre gorges 524 dont les profils correspondent à celui des dents. Ces gorges 524 s'étendent, de manière héliptique, depuis une ouverture adaptée à recevoir une dent 522 vers l'intérieur du cylindre de protection 502 de telle manière que la rotation du cylindre de protection 502 indiquée par une flèche sur la figure 13 provoque l'avancée de chaque dent 522 dans la gorge 524 correspondante et le serrage du cylindre de protection 502 sur le compartiment 102.
La fixation du cylindre de protection 502 sur l'embout comportant l'aiguille 180 est la suivante. L'aiguille 180 est enchâssée dans la partie inférieure de la partie 524, qui est la partie opposée au compartiment 502. La partie 524 est montée en force dans la partie 506 grâce à quatre ailettes. Les ailettes se trouvent sur la partie 504 et sont insérées dans quatre gorges qui se trouvent sur la partie 506.
La partie dépolie 506 sert à masquer l'aiguille 180. La partie transparente 508 permet à l'utilisateur de vérifier l'état de la filtration et sa complétion.
La pellicule 510, qui recouvre et obture l'intégralité de l'ouverture inférieure du cylindre 502 est munie d'une partie latérale s'étendant à courte distance du cylindre 502 (illustrée en figure 10). Cette partie latérale permet le retrait aisé de la pellicule 510.
La pellicule 510 protège l'utilisateur contre l'accès à l'aiguille 180. La pellicule 510 protège aussi l'aiguille 180 contre les risques d'encrassement et/ou de contamination.
Le cylindre 502 est discrètement coloré, par exemple en bleu, vert ou jaune, selon la destination du dispositif de filtration (études cytologiques, biologie moléculaire, culture, respectivement).
On observe, en figure 1 1 , qu'après insertion du liquide à filtrer dans le compartiment 102 et retrait de la pellicule 510, on insère le tube à vide 185 muni de son bouchon 186, dans le cylindre de protection et de guidage 502. On appuie ensuite sur le tube à vide 185 pour que l'aiguille 180 perce le bouchon 186, comme exposé plus haut.
Dans l'assemblage ainsi constitué, illustré en figure 12, la dépression initialement présente dans le tube à vide 185 provoque le filtrage du liquide présent dans le compartiment 102.
Une fois le filtrage terminé, comme illustré en figure 13, on retire conjointement le cylindre de protection 502 et l'aiguille 180 qu'il renferme.
La figure 14 récapitule les étapes ainsi mises en œuvre.
Au cours d'une étape 602, on assemble les pièces du dispositif. Au cours d'une étape 603, on retire le bouchon 1 14. Au cours d'une étape 604, on introduit un liquide, par exemple, du sang, contenant des cellules à isoler et éventuellement à cultiver, par l'extrémité supérieure du compartiment 102. Au cours d'une étape 605, on introduit le tube à vide 185 dans le cylindre de protection 502, ce qui a pour effet d'appliquer l'extrémité pointue 182 de l'aiguille 180 approximativement au centre du bouchon 186, et on applique, sur le compartiment 102 et sur le tube à vide 185, des forces opposées pour faire pénétrer l'aiguille 180 dans le bouchon 186 jusqu'à ce que l'extrémité de l'aiguille atteigne le volume intérieur, en dépression, voire sous vide, du tube à vide 185, au cours d'une étape 606.
Au cours d'une étape 610, on effectue une filtration, par aspiration dans le tube à vide 185, des cellules plus petites que les cellules d'intérêt, les éventuelles cellules lysées, et le principal du liquide présent dans le compartiment 102, les cellules d'intérêt restant retenues sur le filtre 108.
Au cours d'une étape 612, on retire le cylindre de protection 502, tube à vide 185 et l'aiguille 180.
Les étapes suivantes ont déjà été exposées en regard des autres modes de réalisation et dépendent de ces modes de réalisation. Elles ne sont donc pas décrites, de nouveau, ici.
A la lecture de ce qui précède, on comprend que, tant que le cylindre de protection est lié au compartiment, l'utilisateur est protégé contre une piqûre accidentelle avec l'aiguille. De plus, la mise en place du tube à vide est facilitée par le guidage offert par le cylindre de protection. La position du tube à vide au cours de l'aspiration est aussi plus rigidement maintenue, ce qui évite son retrait ou un déplacement qui permettrait à de l'air d'entrer dans le tube à vide en passant à côté de l'aiguille dans le bouchon du tube à vide. Le risque de contamination de l'échantillon par l'utilisateur est minimisé car l'utilisateur ne peut toucher l'aiguille par mégarde.
Préférentiellement, comme illustré aux figures 10 à 13, le dispositif objet de la présente invention comporte, au moins provisoirement, ledit cylindre de protection. Dans d'autres modes de réalisation, le montage est effectué juste avant utilisation.
Préférentiellement, comme illustré aux figures 10 à 13, le moyen de liaison est provisoire et permet le retrait du cylindre de protection conjointement à celui du tube à vide. Dans des variantes, le retrait de ces deux parties est séparé en deux étapes successives.
Dans des modes de réalisation, la présentation du dispositif objet de la présente invention prend la forme d'un kit comportant, dans un sachet externe, deux sachets internes dont :
- le premier comporte le dispositif monté, tel qu'illustré en figures 2A, 6A ou 10 et
- le second comporte l'aiguille, le tube à vide, le puits de culture et une lame circulaire et/ou un tube Eppendorf ou tout autre accessoire utile à la mise en œuvre du dispositif.
La mise en œuvre de la présente invention permet d'éviter des prélèvements risqués de cellules, par exemple de cellules du liquide amniotiques tout en permettant des cultures, par exemple pour une amniocentèse. De plus, du fait de la forme en réservoir du support 108 du filtre, on peut réaliser directement dans ce support des réactions d'immunocytochimie ou d'hybridation fluorescente in situ (« FISH »).

Claims

REVENDICATIONS
1 . Dispositif pour isoler des cellules fixées ou vivantes sur un filtre, caractérisé en ce qu'il comporte :
- un compartiment (102, 302) présentant un volume intérieur pour recevoir un liquide comportant lesdites cellules, une ouverture inférieure et une entrée d'air,
- un filtre (108, 308), au moins temporairement, solidaire de ladite ouverture du compartiment, adapté à retenir lesdites cellules lors du passage du liquide à travers le filtre et
- une aiguille (180) au moins temporairement solidaire de ladite ouverture du compartiment, de manière étanche, le filtre se trouvant entre l'aiguille et le volume intérieur du compartiment, ladite aiguille étant adaptée à perforer un bouchon (186) de tube à vide (185) présentant une dépression par rapport à la pression ambiante pour aspirer le liquide à travers ledit filtre.
2. Dispositif selon la revendication 1 , qui comporte, en outre, un moyen de liaison entre le compartiment et un cylindre de protection entourant l'aiguille et destiné à entourer, au moins partiellement, le tube à vide pendant l'aspiration du liquide à travers le filtre.
3. Dispositif selon la revendication 2, qui comporte, au moins provisoirement, ledit cylindre de protection.
4. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 2 ou 3, dans lequel ledit moyen de liaison est provisoire et permet le retrait du cylindre de protection conjointement à celui du tube à vide.
5. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, dans lequel ledit cylindre de protection comporte une pellicule amovible obturant son ouverture opposée au moyen de liaison, ouverture par laquelle le tube à vide est introduit dans le cylindre de protection.
6. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, qui comporte, en outre, un support de filtre amovible en acier chirurgical adapté à être solidarisé de manière temporaire à l'ouverture inférieure du compartiment.
7. Dispositif selon la revendication 6, dans lequel l'épaisseur dudit anneau est adaptée à permettre son passage dans un scanner.
8. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 6 ou 7, dans lequel ledit anneau porte un identifiant.
9. Procédé pour isoler des cellules vivantes sur un filtre ou extraire leur matériel génétique, caractérisé en ce qu'il comporte :
- une étape (202, 402) de solidarisation, au moins temporaire, d'un filtre (108, 308) à une ouverture inférieure d'un compartiment (102, 302) présentant, en outre, une entrée d'air,
- une étape (204, 404) d'insertion d'un liquide comportant lesdites cellules dans ledit compartiment,
- une étape de solidarisation (205, 405), au moins temporaire d'une aiguille (180) à ladite ouverture du compartiment, de manière étanche, le filtre se trouvant entre l'aiguille et le volume intérieur du compartiment,
- une étape de perforation (206, 406), avec ladite aiguille, d'un bouchon (186) de tube à vide (185) présentant une dépression par rapport à la pression ambiante et
- une étape d'aspiration (210, 410), par le biais de la dépression du tube à vide, du liquide à travers ledit filtre, ledit filtre retenant lesdites cellules.
10. Procédé selon la revendication 9, qui comporte, en outre :
- une étape de fixation, au moins temporaire, d'un cylindre de protection au compartiment, ledit cylindre de protection entourant alors l'aiguille et
- au cours de l'étape de perforation, on insère le tube à vide dans le cylindre de protection.
PCT/FR2010/052380 2009-11-04 2010-11-04 Dispositif et procede pour isoler et cultiver des cellules vivantes sur filtre ou extraire leur materiel genetique WO2011055091A2 (fr)

Priority Applications (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US13/387,039 US8709786B2 (en) 2009-11-04 2010-11-04 Device and process for isolating and cultivating live cells on a filter or extracting their genetic material
ES10795419.0T ES2547429T3 (es) 2009-11-04 2010-11-04 Dispositivo y procedimiento para aislar y cultivar células vivas en filtro o extraer su material genético
JP2012535912A JP2013526835A (ja) 2009-11-04 2010-11-04 生きた細胞をフィルタ上で単離および培養するかまたはその遺伝子材料を抽出するための装置および方法
CN201080070000.9A CN103201374B (zh) 2009-11-04 2010-11-04 在过滤器上分离并且培养活细胞或者从它们之中提取遗传物质的装置和方法
PT107954190T PT2635669E (pt) 2009-11-04 2010-11-04 Dispositivo e processo para isolar e cultivar células sobre filtro ou extrair o seu material genético
EP10795419.0A EP2635669B1 (fr) 2009-11-04 2010-11-04 Dispositif et procede pour isoler et cultiver des cellules vivantes sur filtre ou extraire leur materiel genetique
DK10795419.0T DK2635669T3 (en) 2009-11-04 2010-11-04 CONDITIONS AND PROCEDURE FOR isolate and culture LIVING CELLS ON A FILTER OR OPTION HERE YOUR GENETIC MATERIAL
IL219095A IL219095A (en) 2009-11-04 2012-04-05 A device and process for isolating and cultivating live cells on a filter or extracting their genetic material

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR0957805A FR2952069B1 (fr) 2009-11-04 2009-11-04 Dispositif et procede pour isoler et/ou cultiver des cellules vivantes sur filtre ou extraire leur materiel genetique
FR0957805 2009-11-04

Publications (3)

Publication Number Publication Date
WO2011055091A2 true WO2011055091A2 (fr) 2011-05-12
WO2011055091A3 WO2011055091A3 (fr) 2012-01-12
WO2011055091A4 WO2011055091A4 (fr) 2012-03-01

Family

ID=42309692

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR2010/052380 WO2011055091A2 (fr) 2009-11-04 2010-11-04 Dispositif et procede pour isoler et cultiver des cellules vivantes sur filtre ou extraire leur materiel genetique

Country Status (10)

Country Link
US (1) US8709786B2 (fr)
EP (1) EP2635669B1 (fr)
JP (1) JP2013526835A (fr)
CN (1) CN103201374B (fr)
DK (1) DK2635669T3 (fr)
ES (1) ES2547429T3 (fr)
FR (1) FR2952069B1 (fr)
IL (1) IL219095A (fr)
PT (1) PT2635669E (fr)
WO (1) WO2011055091A2 (fr)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013036819A1 (fr) 2011-09-07 2013-03-14 Dana Farber Cancer Institute, Inc. Procédés d'augmentation du nombre de cellules cibles récupérées d'un échantillon fluide
WO2016094315A1 (fr) 2014-12-08 2016-06-16 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Appareil et procédé pour isoler des cellules cibles à partir d'un échantillon de fluide

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2238236B1 (fr) * 2008-01-09 2017-03-29 Screencell Dispositif et procédé pour isoler et cultiver des cellules vivantes sur filtre ou extraire leur matériel génétique
CN103468568B (zh) * 2013-09-16 2016-03-23 益善生物技术股份有限公司 过滤装置、过滤件及过滤方法
JP6556155B2 (ja) 2013-11-04 2019-08-07 チャールズ リバー ラボラトリーズ， インコーポレイテッド ろ過システム及びその用途
FR3024778B1 (fr) 2014-08-05 2021-01-22 Screencell Procede pour le depistage de la drepanocytose et kit pour sa mise en oeuvre
EP3423189B1 (fr) * 2016-02-29 2022-04-06 Distek, Inc. Sonde d'échantillonnage pour essai de dissolution et similaire
KR102064049B1 (ko) * 2016-07-25 2020-01-08 가부시끼가이샤 옵토니쿠스 세이미쯔 세포의 슬라이드 글래스 표본 제작 방법
JP7083144B2 (ja) * 2017-12-12 2022-06-10 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 吸引管付き細胞封入用デバイス及びその使用
FR3093651A1 (fr) * 2019-03-15 2020-09-18 Seigniory Chemical Products Ltd. - Produits Chimiques Seigneurie Ltee Systeme et procede pour filtrer des echantillons a partir de recipients
CN112481103B (zh) * 2020-11-26 2023-11-28 上海伊弗特生物医药科技有限公司 一种高效免疫细胞取样装置

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2127835A5 (fr) 1971-03-01 1972-10-13 Pelam Inc
US5976824A (en) 1993-11-24 1999-11-02 Abbott Laboratories Method and apparatus for collecting a cell sample from a liquid specimen
US20070105156A1 (en) 2002-11-19 2007-05-10 Sekisui Chemical Co., Ltd. Plasma or serum separation membrane and filter apparatus including the plasma of serum separation membrane

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5284570A (en) * 1991-06-26 1994-02-08 Ppg Industries, Inc. Fluid sample analyte collector and calibration assembly
US6168718B1 (en) * 1996-11-08 2001-01-02 Pall Corporation Method for purifying blood plasma and apparatus suitable therefor
BRPI0418114A (pt) * 2003-12-24 2007-04-17 Becton Dickinson Co plasma em tubo de vazão
US20050214737A1 (en) * 2004-03-26 2005-09-29 Dejneka Matthew J Transparent filtered capillaries
FR2883488B1 (fr) 2005-03-24 2010-12-10 Inst Nat Sante Rech Med Procede et dispositif pour separer par filtration verticale des particules biologiques contenues dans un liquide
EP2238236B1 (fr) * 2008-01-09 2017-03-29 Screencell Dispositif et procédé pour isoler et cultiver des cellules vivantes sur filtre ou extraire leur matériel génétique
FR2926091B1 (fr) * 2008-01-09 2014-09-05 Metagenex Procede et dispositif pour isoler et cultiver des cellules vivantes sur un filtre.

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2127835A5 (fr) 1971-03-01 1972-10-13 Pelam Inc
US5976824A (en) 1993-11-24 1999-11-02 Abbott Laboratories Method and apparatus for collecting a cell sample from a liquid specimen
US20070105156A1 (en) 2002-11-19 2007-05-10 Sekisui Chemical Co., Ltd. Plasma or serum separation membrane and filter apparatus including the plasma of serum separation membrane

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013036819A1 (fr) 2011-09-07 2013-03-14 Dana Farber Cancer Institute, Inc. Procédés d'augmentation du nombre de cellules cibles récupérées d'un échantillon fluide
WO2016094315A1 (fr) 2014-12-08 2016-06-16 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Appareil et procédé pour isoler des cellules cibles à partir d'un échantillon de fluide
US10379018B2 (en) 2014-12-08 2019-08-13 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Apparatus and method for isolating target cells from a fluid sample
EP3561508A1 (fr) 2014-12-08 2019-10-30 Dana Farber Cancer Institute, Inc. Appareil et procédé permettant d'isoler des cellules cibles d'un échantillon de fluide

Also Published As

Publication number Publication date
ES2547429T3 (es) 2015-10-06
IL219095A0 (en) 2012-06-28
DK2635669T3 (en) 2015-09-21
CN103201374A (zh) 2013-07-10
US20120129164A1 (en) 2012-05-24
PT2635669E (pt) 2015-10-16
IL219095A (en) 2017-01-31
EP2635669B1 (fr) 2015-06-17
WO2011055091A3 (fr) 2012-01-12
CN103201374B (zh) 2015-11-25
FR2952069A1 (fr) 2011-05-06
EP2635669A2 (fr) 2013-09-11
US8709786B2 (en) 2014-04-29
FR2952069B1 (fr) 2013-06-28
WO2011055091A4 (fr) 2012-03-01
JP2013526835A (ja) 2013-06-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2635669B1 (fr) Dispositif et procede pour isoler et cultiver des cellules vivantes sur filtre ou extraire leur materiel genetique
EP2238236B1 (fr) Dispositif et procédé pour isoler et cultiver des cellules vivantes sur filtre ou extraire leur matériel génétique
FR2934049A1 (fr) Unite et procede de preparation d'un echantillon pour l'analyse microbiologique d'un liquide.
EP2736324B1 (fr) Système de prélèvement d'au moins un échantillon de tissu animal, dispositif de prélèvement, dispositif de stockage, et procédé de fabrication correspondants
EP3068535B1 (fr) Procédé et dispositif pour transférer une partie d'un liquide contenu dans un récipient
WO2015071597A2 (fr) Nouveau milieu filtrant pour l'obtention de plasma, dispositif et procédé de filtration associés
EP1866091A2 (fr) Procede et dispositif pour separer par filtration verticale des particules biologiques contenues dans un liquide
FR2917095A1 (fr) Dispositif de lyse de microorganismes presents dans un echantillon environnemental ou clinique et d'extraction des acides nucleiques desdits microorganismes aux fins d'analyse.
FR2921491A1 (fr) Procede, dispositif et kit de biologie moleculaire permettant l'extraction du materiel genetique amplifiee.
FR3034519A1 (fr) Dispositif, kit et procede de prelevement et de traitement d'un echantillon biologique
EP3222989A1 (fr) Dispositif d analyse d'un échantillon biologique
FR3023614A1 (fr) Systeme de collecte d'echantillons de matiere fecale
WO2021152097A1 (fr) Dispositif pour analyser des elements solides biologiques et dispositif pour sa mise en oeuvre
FR2872288A1 (fr) Dispositif d'analyse integre, adaptable sur un conteneur d'un echantillon a analyser
FR2935392A1 (fr) Dispositif et procede pour isoler et cultiver des cellules vivantes sur filtre ou extraire leur materiel genetique
FR2926091A1 (fr) Procede et dispositif pour isoler et cultiver des cellules vivantes sur un filtre.
FR3068617B1 (fr) Sachet filtrant comprenant un dispositif pour faciliter le prelevement d'un filtrat
FR2926090A1 (fr) Procede et dispositif pour isoler et cultiver des cellules vivantes sur un filtre.
EP3939700B1 (fr) Système de récipient pour recevoir un échantillon de liquide
EP3654011B1 (fr) Procédé de préparation d'un échantillon à analyser obtenu à partir de matrice alimentaire
WO2023067288A1 (fr) Système pour la détection d'une substance cible dans un échantillon
EP3877741A2 (fr) Dispositif de préparation d'au moins un échantillon par carottage d'un prélèvement de matière

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 10795419

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2010795419

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2012535912

Country of ref document: JP

Ref document number: 13387039

Country of ref document: US

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1397/DELNP/2012

Country of ref document: IN

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 219095

Country of ref document: IL

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WPC Withdrawal of priority claims after completion of the technical preparations for international publication

Ref document number: 0957805

Country of ref document: FR

Date of ref document: 20120424

Free format text: WITHDRAWN AFTER TECHNICAL PREPARATION FINISHED