이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples are only for illustrating the present invention, it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not to be construed as being limited by these examples.
실시예 1. 만노스-6-인산 이성화효소 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터 및 형질전환 미생물의 제조Example 1 Preparation of Recombinant Expression Vector and Transgenic Microorganism Comprising Mannose-6-Phosphate Isomerase Gene
1-1:1-1:
써머스 써모필러Thermos Thermofiller
스((
Thermus thermophilusThermus thermophilus
) 균주로부터 유래한 만노스-6-인산 이성화효소) Mannose-6-phosphate isomerase derived from strain
본 발명의 만노스-6-인산 이성화효소를 제조하기 위하여, 써머스 써모필러스(Thermus thermophilus) 균주로부터 유래한 만노스-6-인산 이성화효소를 먼저 분리하였다.In order to produce a mannose-6-phosphate isomerase of the present invention, a mannose-6-phosphate isomerase derived from Thermococcus sseomeoseu pillar's (Thermus thermophilus) strain it was first separated.
구체적으로, 유전자 염기서열과 아미노산 서열이 이미 특정되어 있는 써머스 써모필러스 KCCM 40897 균주를 선별하고, 이로부터 유래한 만노스-6-인산 이성화효소의 공지의 DNA 염기서열(Genebank Accession No. AP008226)을 기초로 하여 다음의 프라이머(primer)를 고안하였다.Specifically, the Thermos Thermophilus KCCM 40897 strain, in which the gene sequence and the amino acid sequence are already specified, is selected, and a known DNA sequence (Genebank Accession No. AP008226) of mannose-6-phosphate isomerase derived therefrom is selected. On the basis of the following primers were devised.
서열번호 13(정방향 프라이머): 5'-TTTCATATGAGGCGGTTGGAGCCCAA-3'SEQ ID NO: 13 (Forward primer): 5'-TTT CATATG AGGCGGTTGGAGCCCAA-3 '
서열번호 14(역방향 프라이머): 5'-TTTGAATTCACTCACGCCCCCTCCTT-3'SEQ ID NO: 14 (Reverse primer): 5'-TTT GAATTC ACTCACGCCCCCTCCTT-3 '
상기 프라이머는 각각 Nde Ⅰ과 EcoR Ⅰ 제한효소 절단부분으로 설계되었으며, 상기 프라이머를 이용한 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실시하여 해당 유전자의 염기서열을 증폭하였다. The primers were designed with Nde I and EcoR I restriction enzyme cleavage portions, respectively, and amplified the nucleotide sequence of the gene by polymerase chain reaction (PCR).
대량으로 얻은 만노스-6-인산 이성화효소 유전자는 제한효소 Nde Ⅰ 및 EcoR Ⅰ을 사용하여 플라스미드 벡터 pET 28(+)(Novagen사 제품)에 삽입하여 pET 28(+)a/만노스-6-인산 이성화효소를 제작하였다. A large amount of mannose-6-phosphate isomerase gene was inserted into the plasmid vector pET 28 (+) (manufactured by Novagen) using restriction enzymes Nde I and EcoR I and isomerized to pET 28 (+) a / mannose-6-phosphate An enzyme was produced.
상기와 같이 얻은 재조합 발현벡터는 통상적인 형질전환 방법에 의하여 대장균 ER 2566 균주에 형질 전환하고, 상기 형질전환 된 미생물은 20% 글리세린(glycerine) 용액을 첨가하여 엘-리보스의 생산을 위한 배양을 실시하기 전에 냉동 보관하였다.The recombinant expression vector thus obtained is transformed into E. coli ER 2566 strain by a conventional transformation method, the transformed microorganism is cultured for the production of L-ribose by adding 20% glycerin (glycerine) solution Frozen before.
1-2:1-2:
지오바실러스 써모디니트리피칸스 Geo Bacillus Thermodini Tripicans
((
Geobacillus thermodenitrificansGeobacillus thermodenitrificans
) 균주로부터 유래한 만노스-6-인산 이성화 효소) Mannose-6-phosphate isomerase derived from strain
만노스-6-인산 이성화 효소를 제조하기 위하여, 지오바실러스 써모디니트리피칸스 (Geobacillus thermodenitrificans) 균주로부터 유래한 만노스-6-인산 이성화 효소를 먼저 분리하였다. Mannose-6-phosphate for the production of isomerase, and separating the geo Bacillus Thermo di NITRY pecan's one mannose-6-phosphate isomerase derived from (Geobacillus thermodenitrificans) strains before.
구체적으로 유전자 염기서열과 아미노산 서열이 이미 특정되어 있는 지오바실러스 써모디니트리피칸스 균주를 선별하고(Dae-Heoun Baek, Yujin Lee, Hong-Sig Sin, and Deok-Kun (2004) J Microbiol. Biotechnol. 14: 312-316), 이로부터 유래한 만노스-6-인산 이성화 효소의 공지의 DNA 염기서열(Genebank Accession Number CP000557)을 기초로 하여 다음의 프라이머(primer)를 고안하였다.Specifically, gene sequence and amino acid sequence of the chipping chamber Russ Thermo di NITRY already specified screened pecan's strain and (Dae-Heoun Baek, Yujin Lee , Hong-Sig Sin, and Deok-Kun (2004) J Microbiol. Biotechnol. 14: 312-316) and the following primers were devised based on the known DNA sequence (Genebank Accession Number CP000557) of mannose-6-phosphate isomerase derived therefrom.
만노스-6-인산 이성화 효소 Mannose-6-phosphate isomerase
서열번호 15(정방향 프라이머): 5'-TTTGAATTCATGCATCAAGAACCGATTTTTC-3'SEQ ID NO: 15 (Forward primer): 5'-TTT GAATTC ATGCATCAAGAACCGATTTTTC-3 '
서열번호 16(역방향 프라이머): 5'-TTTAAGCTTTTATTTGCTTGTCCGTGG-3'SEQ ID NO: 16 (Reverse primer): 5'-TTT AAGCTT TTATTTGCTTGTCCGTGG-3 '
상기 만노스-6-인산 이성화 효소 유전자의 프라이머는 EcoR Ⅰ과 Hind Ⅲ 제한효소 절단부분으로 설계되었다. 상기 프라이머를 이용한 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실시하여 해당 유전자의 염기서열을 증폭하였다. 대량으로 얻은 만노스-6-인산 이성화 효소 유전자는 각각의 제한효소를 사용하여 플라스미드 벡터 pTRC 99a(Novagen 사)에 삽입하여 pTRC 99a/만노스-6-인산 이성화 효소를 제작하였다.The primers of the mannose-6-phosphate isomerase gene were designed with EcoR I and Hind III restriction enzyme cleavage portions. PCR was performed using the primers to amplify the nucleotide sequence of the gene. A large amount of mannose-6-phosphate isomerase gene was inserted into the plasmid vector pTRC 99a (Novagen) using each restriction enzyme to prepare pTRC 99a / mannose-6-phosphate isomerase.
상기와 같이 얻은 재조합 발현 벡터는 통상적인 형질전환 방법에 의하여 대장균 ER 2566 균주에 형질 전환하였다. 또한, 상기 형질전환된 미생물은 20% 글리세린(glycerine) 용액을 첨가하여 리보스의 생산을 위한 배양을 실시하기 전에 냉동 보관하였다.The recombinant expression vector thus obtained was transformed into E. coli ER 2566 strain by a conventional transformation method. In addition, the transformed microorganism was stored frozen before the culture for the production of ribose by adding a 20% glycerin (glycerine) solution.
실시예 2. 만노스-6-인산 이성화효소의 제조Example 2 Preparation of Mannose-6-Phosphate Isomerase
본 발명의 만노스-6-인산 이성화효소를 대량 생산하기 위하여, 냉동 보관된 재조합 대장균 ER 2566 균주를 LB 배지 3㎖가 들어있는 시험관(test tube)에 접종하고, 600㎚에서 흡광도가 2.0이 될 때까지 37℃의 진탕 배양기로 종균 배양을 실시하였다. 그런 다음, 상기 종균 배양된 배양액을 LB 배지 500㎖가 들어있는 2,000㎖ 플라스크에 첨가하여 본 배양을 실시하였다.In order to mass produce the mannose-6-phosphate isomerase of the present invention, the frozen E. coli ER 2566 strain was inoculated into a test tube containing 3 ml of LB medium, and the absorbance was 2.0 at 600 nm. The spawn culture was performed with a shake incubator at 37 ° C. until. Then, the seed cultured culture was added to a 2,000 ml flask containing 500 ml of LB medium to carry out the main culture.
또한, 600㎚에서 흡광도가 0.6이 될 때, 0.1mM IPTG를 첨가하여 만노스-6-인산 이성화효소의 대량 발현을 유도하였다. 이때, 교반 속도는 200rpm, 배양 온도는 37℃로 유지하였으며, IPTG 첨가 후에는 교반 속도 150rpm, 배양 온도 16℃로 조정하여 배양하였다.In addition, when the absorbance reached 0.6 at 600 nm, 0.1 mM IPTG was added to induce mass expression of mannose-6-phosphate isomerase. At this time, the stirring speed was maintained at 200rpm, the culture temperature was maintained at 37 ℃, after the addition of IPTG was adjusted to the stirring speed 150rpm, culture temperature 16 ℃ and incubated.
또한, 상기와 같이 과발현 되어 생산된 만노스-6-인산 이성화효소는, 상기 형질전환된 균주의 배양액을 6,000×g로 4℃에서 30분 동안 원심분리하여 0.85% 염화나트륨(NaCl)으로 두 번 세척한 다음, 50mM 제일인산나트륨, 300mM 염화나트륨, 10mM 이미다졸(immidazole), 0.1mM 단백분해 효소 저해제(phenylmethylsulfonyl fluoride)를 첨가하여 상기 세포 용액을 파쇄기(sonicator)로 파쇄하였다. 상기 세포 파쇄물은 다시 13,000×g로 4℃에서 20분 동안 원심분리하고, 세포 펠렛을 제거한 후 세포 상등액만을 얻어 고속 단백질 액체 크로마토그래피(fast protein liquid chromatography system; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)에 히스텍(His-tag)를 이용한 히스트램 에이치피(Histrap HP) 흡착 컬럼을 장착하여 엘-리보스 생산에 사용되는 효소액으로서 분리하였다.In addition, the mannose-6-phosphate isomerase produced by overexpression as described above, the culture medium of the transformed strain was washed twice with 0.85% sodium chloride (NaCl) by centrifugation at 6,000 × g for 30 minutes at 4 ℃. Next, 50 mM sodium phosphate, 300 mM sodium chloride, 10 mM imidazole and 0.1 mM protease inhibitor (phenylmethylsulfonyl fluoride) were added to disrupt the cell solution with a sonicator. The cell lysate was again centrifuged at 13,000 × g for 20 minutes at 4 ° C., the cell pellet was removed, and only the cell supernatant was obtained for a fast protein liquid chromatography system (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Histrap HP adsorption column using His-tag was used as an enzyme solution for the production of L-ribose.
실시예 3. 만노스-6-인산 이성화효소의 금속 특이성 조사Example 3 Investigation of Metal Specificity of Mannose-6-Phosphate Isomerase
상기 실시예 2에서 얻은 만노스-6-인산 이성화효소의 금속이온에 대한 특이성을 조사하기 위하여, 상기 효소의 활성은 10mM EDTA로 처리하고 금속 이온(Mn2+, Zn2+, Ba2+, Cu2+, Co2+, Ca2+, Mg2+, Ni2+, Fe2+)을 첨가하여 반응시킨 후 다음과 같이 활성을 측정하였다.In order to investigate the specificity of mannose-6-phosphate isomerase obtained in Example 2 for metal ions, the activity of the enzyme was treated with 10 mM EDTA, and metal ions (Mn 2+ , Zn 2+ , Ba 2+ , Cu). 2+ , Co 2+ , Ca 2+ , Mg 2+ , Ni 2+ , Fe 2+ ) and the reaction was measured as follows.
효소반응은 10mM 엘-리불로오스, 각각의 금속이온과 0.05unit/㎖ 효소가 포함된 50mM PIPES(piperazine-N,N'-bis(2-ethane sulfonic acid)) 완충용액(pH 7.0)을 사용하여 75℃에서 5분 동안 수행하고, 다시 최종 농도 200mM 염화수소(HCl)를 첨가하여 상기 반응을 정지시켰다.Enzyme reaction was performed using 50 mM PIPES (piperazine- N, N' -bis (2-ethane sulfonic acid)) buffer solution (pH 7.0) containing 10 mM L-ribulose, each metal ion and 0.05 unit / ml enzyme. 5 minutes at 75 ° C, and the reaction was stopped again by adding a final concentration of 200 mM hydrogen chloride (HCl).
본 발명에서 효소활성은 엘-리불로오스를 기질로 사용해 측정하였으며, 상기 효소활성의 효소 1단위(unit)는 pH 7.0과 75℃에서 분당 1μmol의 엘-리보스를 생산하는 양으로 정의하여 비교 분석하였다. In the present invention, the enzyme activity was measured using L-ribulose as a substrate, and the enzyme activity (unit) of the enzyme activity was defined as the amount to produce 1 μmol of L-ribose per minute at pH 7.0 and 75 ° C. It was.
또한, 효소활성 측정 시 리보스 및 리불로오스의 농도, 그리고 다른 당들의 분석은 전기화학적 검출기(electrochemical detector) 및 카보팩 피에이(CarboPacPA) 칼럼이 장착된 바이오 액체 크로마토그래피(Bio-LC) 시스템(Dionex ICS-3000, Sunnylvale, CA, USA)을 이용하였으며, 이때 상기 카보팩 피에이 컬럼은 30℃에서 1㎖/분 속도로 200mM 수산화나트륨(NaOH)을 통과시켰다.In addition, the concentration of ribose and ribulose, and the analysis of other sugars in the determination of enzymatic activity can be determined by using a bio-liquid chromatography (Bio-LC) system equipped with an electrochemical detector and a CarboPacPA column ( Dionex ICS-3000, Sunnylvale, Calif., USA), wherein the Carbopack PA column was passed 200 mM sodium hydroxide (NaOH) at 1 ° C./min at 30 ° C.
그 결과, 정제된 효소와 EDTA를 처리한 효소는 활성이 없었으며, 실험한 금속염 중에서 써머스 써모필러스(Thermus thermophilus) 균주로부터 유래한 만노스-6-인산 이성화효소는 구리(Cu2+)가 가장 효과적이었고, 농도별 실험 결과 최적 농도는 0.5mM 이었으며, 지오바실러스 써모디니트리피칸스(Geobacillus thermodenitrificans) 유래의 만노스-6-인산 이성화 효소에 의한 리보스 이성화 효소는 코발트(Co2+)가 가장 효과적이었고, 농도별 테스트 결과 효소에 대한 금속염 모두 최적농도는 1 mM이었다.As a result, the purified enzyme and the enzyme treated with EDTA had no activity.Thermos Thermofiller(Thermus thermophilus) Mannose-6-phosphate isomerase derived from2+) Was the most effective, and the optimal concentration was 0.5mM.Geobacillus Thermodinitripicans (Geobacillus)of thermodenitrificans) Ribose isomerase by mannose-6-phosphate isomerase is cobalt (Co2+) Was the most effective, and the optimum concentration of the metal salt for enzyme was 1 mM.
상기 결과로부터, 본 발명의 만노스-6-인산 이성화효소는 구리 또는 코발트 금속 이온의 영향을 받는 것으로 나타나 금속 이온에 대해 의존성 효소임을 확인하였다(도 1, 도 2, 도 11 및 도 12 참조).From the above results, the mannose-6-phosphate isomerase of the present invention was shown to be affected by copper or cobalt metal ions, confirming that it is an enzyme dependent on metal ions (see FIGS. 1, 2, 11, and 12).
실시예 4. 만노스-6-인산 이성화효소의 활성도 조사Example 4 Investigation of Activity of Mannose-6-Phosphate Isomerase
상기 실시예 1에서 얻은 만노스-6-인산 이성화효소의 pH 및 온도 변화에 따른 활성도를 조사하기 위하여, 다양한 pH 및 온도 조건 하에서 효소와 기질을 반응시키고 효소 활성을 비교하였다.In order to investigate the activity of the mannose-6-phosphate isomerase obtained in Example 1 according to the pH and temperature change, the enzyme and the substrate were reacted under various pH and temperature conditions and the enzyme activity was compared.
4-1. 만노스-6-인산 이성화효소 활성에 미치는 pH 효과4-1. PH effect on mannose-6-phosphate isomerase activity
먼저, 상기 효소 활성에 대한 pH 효과를 조사하기 위하여, 기질로서 10mM 엘-리불로오스와 0.5mM 구리(또는 1 mM 코발트;지오바실러스 경우), 1.5 unit(또는 2 unit: 지오바실러스 경우)/㎖ 효소가 포함된 50mM 피페스(PIPES) 완충액 및 10mM 엘-리불로오스, 0.5mM 구리(또는 1 mM 코발트;지오바실러스 경우)와 0.05unit/㎖ 효소가 포함된 EPPS(N-(2-hydroxyethyl) piperazine-N-(3-propane sulfonic acid)) 완충액을 사용하여 pH 7.5에서 pH 8.5 범위까지 효소반응을 실시하되, 구체적으로 75℃에서 5분 동안 수행하고 다시 최종 농도 200mM 염화수소를 첨가하여 반응을 정지시켰다.First, to investigate the pH effect on the enzyme activity, 10 mM L-ribulose and 0.5 mM copper (or 1 mM cobalt; for geobacillus), 1.5 unit (or 2 unit: for geobacillus) / ml as substrates 50 mM PIPES buffer with enzyme and EPPS (N- (2-hydroxyethyl) with 10 mM L-ribulose, 0.5 mM copper (or 1 mM cobalt; for Geobacillus) and 0.05 unit / ml enzyme) Enzymatic reaction is carried out using a piperazine- N- (3-propane sulfonic acid)) buffer from pH 7.5 to pH 8.5. Specifically, the reaction is stopped at 75 ° C. for 5 minutes and stopped again by adding a final concentration of 200 mM hydrogen chloride. I was.
그 결과, 최적 pH는 7.0인 것으로 확인되었다(도 3 및 13 참조).As a result, the optimum pH was found to be 7.0 (see FIGS. 3 and 13).
4-2. 만노스-6-인산 이성화효소 활성에 미치는 온도 효과4-2. Effect of temperature on mannose-6-phosphate isomerase activity
상기 효소의 활성에 대한 온도 효과를 조사하기 위하여, 효소 반응 온도를 60℃에서 90℃ 범위까지 10mM 엘-리불로오스, 0.5mM 구리(또는 1 mM 코발트;지오바실러스 경우), 1.5 unit(또는 2 unit: 지오바실러스 경우)/㎖ 효소가 포함된 50mM 피페스(PIPES) 완충액을 사용하여 각각 20분씩 반응시킨 후 최종 농도 200mM 염화수소를 첨가하여 반응을 정지시켰다.In order to investigate the effect of temperature on the activity of the enzyme, the enzyme reaction temperature was ranged from 60 ° C. to 90 ° C. in a range of 10 mM L-ribulose, 0.5 mM copper (or 1 mM cobalt; for geobacillus), 1.5 units (or 2). unit: in case of Geobacillus) / ml The reaction was carried out for 20 minutes using 50 mM Pipes (PIPES) buffer containing the enzyme, and the reaction was stopped by adding a final concentration of 200 mM hydrogen chloride.
그 결과, 최적 온도는 각각 지오바실러스의 경우에는 70℃이고 써머스의 경우에는 75℃인 것으로 확인되었다(도 4 및 14 참조).As a result, the optimum temperature was found to be 70 ° C. for Geobacillus and 75 ° C. for Thermos, respectively (see FIGS. 4 and 14).
4-3. 만노스-6-인산 이성화효소의 온도 안정성 조사4-3. Investigation of Temperature Stability of Mannose-6-phosphate Isomerase
상기 효소의 온도 안정성을 조사하기 위하여, 온도 65℃에서 85℃까지의 범위에서 10mM 엘-리불로오스, 0.5mM 구리(또는 1 mM 코발트;지오바실러스 경우), 0.05unit/㎖ 효소가 포함된 pH 7.0인 50mM PIPES 완충액을 사용하여 각각 효소활성이 절반으로 줄어드는 시간까지 반응시킨 다음, 최종 농도 200mM 염화수소를 첨가하여 반응을 정지시켜 만노스-6-인산 이성화효소의 활성을 측정하였다.In order to investigate the temperature stability of the enzyme, a pH containing 10 mM L-ribulose, 0.5 mM copper (or 1 mM cobalt; in the case of Geobacillus), 0.05 unit / ml enzyme in the temperature range of 65 to 85 ° C The reaction was carried out using 50 mM PIPES buffer of 7.0 until the time when the enzyme activity was reduced by half, and then the reaction was stopped by adding the final concentration of 200 mM hydrogen chloride to measure the activity of mannose-6-phosphate isomerase.
그 결과, 온도 65℃에서는 22시간, 70℃에서는 10시간, 75℃에서는 5.5시간, 80℃에서는 2.2시간 및 85℃에서는 0.3시간이 경과시 써머스 써모필러스(Thermus thermophilus) 균주로부터 유래한 만노스-6-인산 이성화효소 활성이 절반으로 줄어드는 것을 확인할 수 있었다(도 5 참조).As a result, in the temperature 65 ℃ 22 hours, in 70 ℃ 10 hours, 75 ℃ 5.5 hours, the elapsed time 0.3 hours 2.2 hours and 85 ℃ in 80 ℃ sseomeoseu Thermo filler's mannose derived from (Thermus thermophilus) strain 6-phosphate isomerase activity was found to be reduced by half (see FIG. 5).
또한 도 15에 나타난 바와 같이, 온도 60℃에서는 338시간, 65℃는 73시간, 70℃는 27시간, 75℃는 17시간, 그리고 80℃에서는 6.2시간 경과 시 상기 지오바실러스 써모디니트리피칸스 (Geobacillus thermodenitrificans)유래한 효소 활성이 절반으로 줄어드는 것을 확인할 수 있었다.In addition, as shown in FIG. 15, the geobacillus thermodynic tripicans after 338 hours at 65 ℃, 73 hours at 65 ℃, 27 hours at 70 ℃, 17 hours at 75 ℃, 6.2 hours at 80 ℃ Geobacillus thermodenitrificans The enzyme activity was reduced by half.
4-4. 만노스-6-인산 이성화효소 활성에 미치는 기질 농도 효과4-4. Effect of Substrate Concentration on Mannose-6-Phosphate Isomerase Activity
상기 효소의 활성에 대한 온도 효과를 조사하기 위하여, 온도 75℃에서 85℃까지의 범위에서 50, 100, 200 및 300g/ℓ엘-리불로오스, 0.5mM 구리(또는 1 mM 코발트;지오바실러스 경우), 20unit/㎖ 효소가 포함된 pH 7.0인 50mM PIPES 완충액을 사용하여 3시간 반응시킨 다음, 최종 농도 200mM 염화수소를 첨가하여 반응을 정지시켜 만노스-6-인산 이성화효소의 활성을 측정하였다.In order to investigate the effect of temperature on the activity of the enzyme, 50, 100, 200 and 300 g / L- ribulose, 0.5 mM copper (or 1 mM cobalt; Geobacillus case) in the temperature range from 75 ℃ to 85 ℃ ), And the reaction was stopped for 3 hours using 50 mM PIPES buffer containing pH 7.0 containing 20 units / ml enzyme, and then the reaction was stopped by adding a final concentration of 200 mM hydrogen chloride to measure the activity of mannose-6-phosphate isomerase.
그 결과, 써머스 써모필러스(Thermus thermophilus) 균주로부터 유래한 만노스-6-인산 이성화효소의 경우 기질로 사용한 엘-리불로오스 농도와 무관하게 모두 약 70%의 전환수율을 나타내어 50, 100, 200 및 300g/ℓ의 엘-리불로오스에서 각각 36, 71, 140, 211g/ℓ의 엘-리보스가 생산되었다.As a result, the filler's Thermo sseomeoseu (Thermus thermophilus) for the mannose-6-phosphate isomerase derived from a strain El was used as substrate - regardless of the re-fire agarose concentration of any image shows a conversion yield of about 70% 50, 100, 200 And 36, 71, 140, 211 g / l of el-ribose, respectively, at 300 g / l of el-ribulose.
실시예 5. 만노스-6-인산 이성화효소를 이용한 엘-리보스의 생산Example 5 Production of El-Ribose Using Mannose-6-Phosphate Isomerase
본 발명의 만노스-6-인산 이성화효소를 이용한 엘-리보스의 생산성을 확인하기 위하여, 상기에서 확인한 효소의 최적 pH 7.0 및 효소활성이 절반으로 줄어든 시간을 고려한 온도(75℃)에서 300g/ℓ의 엘-리불로오스를 기질로 하여 엘-리보스의 시간별 생산량을 측정하였다. 이때 사용한 반응 용액은 300g/ℓ엘-리불로오스, 0.5mM 구리, 25unit/㎖ 효소가 포함된 pH 7.0인 50mM PIPES 완충액이었다.In order to confirm the productivity of El-ribose using the mannose-6-phosphate isomerase of the present invention, 300 g / L at the temperature (75 ° C) considering the optimal pH 7.0 and the time when the enzyme activity was reduced by half Hourly production of El-ribose was measured using L-ribulose as a substrate. The reaction solution used was 50 mM PIPES buffer at pH 7.0 containing 300 g / L L-ribulose, 0.5 mM copper, 25 units / ml enzyme.
써머스 써모필러스(Thermus thermophilus) 균주로부터 유래한 효소의 경우 반응 2.5시간 후에 300g/ℓ의 엘-리불로오스에서 213g/ℓ의 엘-리보스가 생산되어 시간당 85.2g/ℓ의 생산성과 71%의 전환수율을 나타내었다(도 6 참조). For enzymes derived from the Thermos thermophilus strain, 213 g / l of L-ribose was produced in 300 g / l of L-ribulose after 2.5 hours of reaction, yielding 85.2 g / l of productivity and 71% of the time. Conversion yield is shown (see FIG. 6).
또한 지오바실러스 써모디니트리피칸스 (Geobacillus thermodenitrificans)유래한 효소의 경우, 반응 2.2 시간 후에 300 g/ℓ의 리불로오스에서 210 g/ℓ의 리보스가 생산되어 시간당 87.5 g/ℓ의 생산성과 70% 전환수율을 나타내었다(도 16 참조).Further Geo Bacillus Thermo di NITRY pecan switch (Geobacillus thermodenitrificans) if the derived enzyme, after reaction 2.2 hours is 300 g / ℓ Li fire agarose in ribose of 210 g / ℓ of the production productivity per hour, 87.5 g / ℓ and 70 % Conversion yield is shown (see FIG. 16).
현재까지 리보스의 생산 중 가장 높은 생산성을 나타낸 것은 Molybdic acid를 사용한 화학합성법은 엘-아라비노스 로부터 23% 전환수율과 시간당 20 g/ℓ 생산성을 나타내었다(Jumppanen, J., J. Nurmi, and O. Pastinen. October 2000. Process for the continuous production of high purity of L-ribose. U.S. patent 6,140,498.). To date, the highest productivity of ribose production has been achieved by chemical synthesis using Molybdic acid, which yields 23% conversion from L-Arabinose and 20 g / l per hour. Productivity was shown (Jumppanen, J., J. Nurmi, and O. Pastinen. October 2000. Process for the continuous production of high purity of L-ribose. U.S. patent 6,140,498.).
실시예 6: 만노스 6-인산 이성화 효소 유전자와 그에 따른 돌연변이를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 형질전환 미생물의 제조Example 6 Preparation of Recombinant Expression Vectors and Transgenic Microorganisms Comprising Mannose 6-Phosphate Isomerase Gene and Mutations accordingly
6-1:6-1:
써머스 써모필러스Thermos Thermophilus
((
Thermus thermophilusThermus thermophilus
) 균주로부터 유래한 만노스 6-인산 이성화 효소 돌연변이체) Mannose 6-phosphate isomerase mutant derived from strain
만노스 6-인산 이성화 효소를 제조하기 위하여, 써머스 써모필러스(Thermus thermophilus) 균주로부터 유래한 만노스 6-인산 이성화 효소를 먼저 분리하였다. For the production of mannose 6-phosphate isomerase, the mannose 6-phosphate isomerase derived from Thermococcus sseomeoseu pillar's (Thermus thermophilus) strain it was first separated.
구체적으로 유전자 염기서열과 아미노산 서열이 이미 특정되어 있는 써머스 써모필러스(Thermus thermophilus) KCCM 40879 균주를 선별하고, 이로부터 유래한 만노스 6-인산 이성화 효소의 공지의 DNA 염기서열(Genebank Accession Number AP008226)을 기초로 하여 프라이머(primer)를 고안하였다.Specifically sseomeoseu Thermo filler's (Thermus thermophilus) DNA base sequence (Genebank Accession Number AP008226) of the known mannose 6-phosphate isomerase, evaluate whether KCCM 40879 strain, and derived therefrom with a gene sequence and amino acid sequence has already been specified Based on the primer (primer) was devised.
상기 프라이머는 각각 Nde I과 EcoR I 제한효소 절단부분으로 설계되었다. 상기 프라이머를 이용한 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실시하여 해당 유전자의 염기서열을 증폭하였다. 대량으로 얻은 만노스 6-인산 이성화 효소 유전자는 제한효소 Nde I 및 EcoR I을 사용하여 플라스미드 벡터 pET 28(+)(Novagen 사)에 삽입하여 pET 28(+)a/만노스 6-인산 이성화 효소를 제작하였다.The primers were designed with Nde I and EcoR I restriction enzyme cleavage sites, respectively. PCR was performed using the primers to amplify the nucleotide sequence of the gene. A large amount of mannose 6-phosphate isomerase gene was inserted into plasmid vector pET 28 (+) (Novagen) using restriction enzymes Nde I and EcoR I to prepare pET 28 (+) a / mannose 6-phosphate isomerase. It was.
만노스 6-인산 이성화 효소의 돌연변이벡터를 제작하기 위하여 프라이머(primer)를 고안하였다(표 1 참조). 상기 프라이머와 Quick-Change kit (Stratagene, Beverly, MA)를 이용하여 돌연변이를 유발하여 pET 28(+)a/만노스 6-인산 이성화 효소 돌연변이벡터를 제작하였다.Primers were designed to construct mutant vectors of mannose 6-phosphate isomerase (see Table 1). Mutation was induced using the primers and the Quick-Change kit (Stratagene, Beverly, MA) to construct a pET 28 (+) a / mannose 6-phosphate isomerase mutant vector.
상기와 같이 얻은 재조합 발현 벡터는 통상적인 형질전환 방법에 의하여 대장균 ER 2566 균주에 형질 전환하였다. 또한, 상기 형질전환된 미생물은 20% 글리세린(glycerine) 용액을 첨가하여 리보스의 생산을 위한 배양을 실시하기 전에 냉동 보관하였다.The recombinant expression vector thus obtained was transformed into E. coli ER 2566 strain by a conventional transformation method. In addition, the transformed microorganism was stored frozen before the culture for the production of ribose by adding a 20% glycerin (glycerine) solution.
표 1은 만노스 6-인산 이성화 효소의 돌연변이벡터를 제작하기 위하여 프라이머(primer)이다.Table 1 shows primers for constructing mutant vectors of mannose 6-phosphate isomerase.
6-2:지6-2:
오바실러스 써모디니트리피칸스Obacillus Thermodini Tripicans
((
Geobacillus thermodenitrificansGeobacillus thermodenitrificans
) 균주로부터 유래한 만노스 6-인산 이성화 효소 돌연변이체) Mannose 6-phosphate isomerase mutant derived from strain
지오바실러스 써모디니트리피칸스(Geobacillus thermodenitrificans) 균주로부터 유래한 만노스-6-인산 이성화 효소의 무작이 돌연변이 (Random mutagenesis)를 유발하기 위하여 PCR mutagenesis kit (ClonTech Laboratories, Palo Alto. CA, USA) 을 이용하여 pTrc99a/만노스-6-인산 이성화 효소 돌연변이벡터를 제작하였다.If five Bacillus Thermo di NITRY pecan switch (Geobacillus thermodenitrificans) PCR mutagenesis kit ( ClonTech Laboratories, Palo Alto. CA, USA) is random in a mannose-6-phosphate isomerase derived from a strain to mutagenic (Random mutagenesis) PTrc99a / mannose-6-phosphate isomerase mutant vector was prepared.
상기와 같이 얻은 재조합 발현 벡터는 통상적인 형질전환 방법에 의하여 대장균 ER 2566 균주에 형질 전환하였다. 또한, 상기 형질전환된 미생물은 20% 글리세린(glycerine) 용액을 첨가하여 리보스의 생산을 위한 배양을 실시하기 전에 냉동 보관하였다.The recombinant expression vector thus obtained was transformed into E. coli ER 2566 strain by a conventional transformation method. In addition, the transformed microorganism was stored frozen before the culture for the production of ribose by adding a 20% glycerin (glycerine) solution.
실시예 7: 만노스 6-인산 이성화효소 및 돌연변이 효소의 제조Example 7 Preparation of Mannose 6-Phosphate Isomerase and Mutant Enzymes
7-1:7-1:
써머스 써모필러스Thermos Thermophilus
((
Thermus thermophilusThermus thermophilus
) 균주로부터 유래한 만노스 6-인산 이성화 효소 돌연변이체) Mannose 6-phosphate isomerase mutant derived from strain
만노스 6-인산 이성화효소 및 돌연변이 효소를 대량 생산하기 위하여, 상기 실시예 6에서 제작하고, 냉동 보관된 재조합 대장균 ER 2566 균주를 LB 배지 3㎖이 들어있는 시험관(test tube)에 접종하고 600㎚에서 흡광도가 2.0이 될 때까지 37℃의 진탕 배양기로 종균 배양을 실시하였다. 그 다음 상기 종균 배양된 배양액을 LB 배지 500㎖이 들어있는 2,000㎖ 플라스크에 첨가하여 본 배양을 실시하였다. 또한, 600㎚에서의 흡광도가 0.6 이 될 때, 0.1mM IPTG를 첨가하여 만노스 6-인산 이성화효소의 대량 발현을 유도하였다. 상기 과정 중의 교반 속도는 200rpm, 배양 온도는 37℃가 유지하도록 조절하고, IPTG를 첨가한 후에 교반 속도는 150rpm, 배양 온도는 16℃로 조정하여 배양하였다.In order to mass produce mannose 6-phosphate isomerase and mutant enzyme, the recombinant E. coli ER 2566 strain prepared in Example 6 was inoculated into a test tube containing 3 ml of LB medium and inoculated at 600 nm. The spawn cultivation was performed by shaking incubator at 37 degreeC until absorbance became 2.0. The seed cultured culture was then added to a 2,000 ml flask containing 500 ml of LB medium to carry out the main culture. In addition, when the absorbance at 600 nm became 0.6, 0.1 mM IPTG was added to induce mass expression of mannose 6-phosphate isomerase. The stirring rate during the process was adjusted to 200rpm, the culture temperature was maintained at 37 ℃, and after the addition of IPTG, the stirring rate was adjusted to 150rpm, the culture temperature was adjusted to 16 ℃.
또한, 상기와 같이 과발현되어 생산된 만노스 6-인산 이성화효소 및 돌연변이 효소는, 상기 형질전환된 균주의 배양액을 6,000×g로 4℃에서 30분 동안 원심분리하고, 0.85% 염화나트륨(NaCl)으로 두번 세척한 다음 50mM 제일인산 나트륨, 300mM 염화나트륨, 10mM 이미다졸(immidazole), 0.1mM 단백분해 효소 저해제(phenylmethylsulfonyl fluoride)를 첨가하여 상기 세포 용액을 파쇄기(sonicator)로 파쇄하였다. 상기 세포 파쇄물은 다시 13,000×g로 4℃에서 20분 동안 원심분리하고 세포 펠렛은 제거한 다음 세포 상등액만을 얻어 고속 단백질 액체 크로마토그라피(fast protein liquid chromatography system(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA))에 히스 텍(His-tag)를 이용한 히스트랩 에이치피(HisTrap HP) 흡착 컬럼을 장착 하여 리보스 생산에 사용되는 효소액으로서 분리하였다.In addition, the mannose 6-phosphate isomerase and the mutant enzyme produced as overexpressed as described above were centrifuged at 6,000 × g for 30 minutes at 6,000 × g and twice with 0.85% sodium chloride (NaCl). After washing, the cell solution was crushed by adding 50 mM sodium phosphate, 300 mM sodium chloride, 10 mM imidazole, 0.1 mM protease inhibitor (phenylmethylsulfonyl fluoride). The cell lysate was again centrifuged at 13,000 × g for 20 minutes at 4 ° C., the cell pellet was removed, and only the cell supernatant was obtained, followed by a fast protein liquid chromatography system (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). ) Was equipped with a HisTrap HP adsorption column using a heat-tag and separated as an enzyme solution used for ribose production.
7-2:지7-2:
오바실러스 써모디니트리피칸스Obacillus Thermodini Tripicans
((
Geobacillus thermodenitrificansGeobacillus thermodenitrificans
) 균주로부터 유래한 만노스 6-인산 이성화 효소 돌연변이체) Mannose 6-phosphate isomerase mutant derived from strain
지오바실러스 써모디니트리피칸스(Geobacillus thermodenitrificans) 균주로부터 유래한 만노스-6-인산 이성화효소 돌연변이체를 대량 생산하기 위하여, 상기 실시예 5에서 제작하고, 냉동 보관된 재조합 대장균 ER 2566 균주를 LB 배지 3㎖이 들어있는 시험관(test tube)에 접종하고 600㎚에서 흡광도가 2.0이 될 때까지 37℃의 진탕 배양기로 종균 배양을 실시하였다. 그 다음 상기 종균 배양된 배양액을 LB 배지 500㎖이 들어있는 2,000㎖ 플라스크에 첨가하여 본 배양을 실시하였다. 또한, 600㎚에서의 흡광도가 0.6 이 될 때, 0.1mM IPTG를 첨가하여 만노스-6-인산 이성화효소의 대량 발현을 유도하였다. 상기 과정 중의 교반 속도는 200rpm, 배양 온도는 37℃가 유지하도록 조절하고, 아이피티지를 첨가한 후에 같은 조건으로 5시간동안 배양하였다.If five Bacillus Thermo di NITRY pecan switch (Geobacillus thermodenitrificans) In order to mass-produce a mannose-6-phosphate isomerase mutant derived from the strain, produced in Example 5, and stored frozen The recombinant E. coli strain ER 2566 to LB The seed was inoculated into a test tube containing 3 ml of medium, and the seed culture was performed with a shake incubator at 37 ° C. until absorbance was 2.0 at 600 nm. The seed cultured culture was then added to a 2,000 ml flask containing 500 ml of LB medium to carry out the main culture. In addition, when the absorbance at 600 nm became 0.6, 0.1 mM IPTG was added to induce mass expression of mannose-6-phosphate isomerase. The stirring speed during the process was adjusted to 200rpm, the culture temperature was maintained at 37 ℃, and after incubating for 5 hours under the same conditions after the addition of the IP.
또한, 상기와 같이 과발현되어 생산된 만노스-6-인산 이성화효소 돌연변이체는, 상기 형질전환된 균주의 배양액을 6,000× g로 4℃에서 30분 동안 원심분리하고, 0.85% 염화나트륨(NaCl)으로 두번 세척한 다음 50 mM PIPES (pH 7.0)완충용액과 0.1 mM 단백분해 효소 저해제(phenylmethylsulfonyl fluoride)를 첨가하여 상기 세포 용액을 초음파파쇄기(sonicator)로 파쇄하였다. 상기 세포 파쇄물은 70℃에서 10분간 열처리를 한 후 다시 13,000× g로 4℃에서 20분 동안 원심분리하고 세포 펠렛은 제거한 다음 세포 상등액만을 얻어 고속 단백질 액체 크로마토그라피(fast protein liquid chromatography system(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA))에 음이온 수지인 하이트랩 에이치피(Hi TrapTM HP) 흡착 컬럼을 장착 하여 엘-리보스 생산에 사용되는 효소액으로서 분리하였다.In addition, the mannose-6-phosphate isomerase mutant produced by overexpression as described above was centrifuged at 6,000 × g for 30 minutes at 6,000 × g, and twice with 0.85% sodium chloride (NaCl). After washing, the cell solution was crushed with a sonicator by adding 50 mM PIPES (pH 7.0) buffer solution and 0.1 mM protease inhibitor (phenylmethylsulfonyl fluoride). The cell lysate was heat-treated at 70 ° C. for 10 minutes and then again centrifuged at 13,000 × g at 4 ° C. for 20 minutes, cell pellets were removed, and only cell supernatant was obtained to obtain a fast protein liquid chromatography system. Rad Laboratories, Hercules, Calif., USA) was equipped with an anion resin Hi Trap TM HP adsorption column and separated as an enzyme solution used for the production of L-ribose.
실시예 8: 만노스 6-인산 이성화효소와 돌연변이 효소의 엘-리불로오스에 대한 specific activity 및 kinetic parameterExample 8 Specific Activity and Kinetic Parameters of Mannose 6-Phosphate Isomerase and Mutant Enzyme for L-Ribulose
8-1:8-1:
써머스 써모필러스Thermos Thermophilus
((
Thermus thermophilusThermus thermophilus
) 균주로부터 유래한 만노스 6-인산 이성화 효소 돌연변이체) Mannose 6-phosphate isomerase mutant derived from strain
만노스 6-인산 이성화효소 및 돌연변이 효소의 엘-리불로오스에 대한 specific activity를 측정 및 비교하는 실험을 수행하였다.Experiments were performed to measure and compare the specific activity of mannose 6-phosphate isomerase and mutant enzymes against el-ribulose.
상기 효소 반응은 10 mM 리불로오스, 0.5 mM Cu2+의 금속 이온이 포함된 50 mM PIPES 완충용액(pH 7.0)을 사용하여 75℃에서 5분 동안 수행하였고, 다시 최종 농도 200 mM 염화 수소을 첨가하여 상기 반응을 정지시켰다. 본 발명에서는 효소 활성은 리보오스를 기질로 사용하여 측정되었고, 상기 효소 활성의 효소 1 단위(unit)는 pH 7.0와 75℃에서 분당 1 nmole의 리보오스를 생산하는 양으로 정의하여 비교분석을 원활히 하였다. 또한, 효소 활성의 측정 시 리보오스 농도 및 리불로오스 농도 그리고 다른 당들의 분석은 전기화학적 검출기(electrochemical detector) 및 카보팩 피에이(CarboPacPA) 컬럼 이 장착된 바이오 액체 크로마토그래피(Bio-LC) 시스템 (Dionex ICS-3000, Sunnylvale, CA)을 이용하여 진행되었다. 이 때, 상기 카보팩 피에이(CarboPacPA) 컬럼은 30℃에서 1 ㎖/분 속도로 200 mM 수산화 나트륨을 통과시키도록 하였다.The enzymatic reaction was performed at 75 ° C. for 5 minutes using 50 mM PIPES buffer solution (pH 7.0) containing 10 mM ribulose, 0.5 mM Cu 2+ metal ions, followed by addition of 200 mM hydrogen chloride. The reaction was stopped. In the present invention, the enzyme activity was measured using ribose as a substrate, and the enzyme activity (unit) of the enzyme activity was defined as the amount to produce 1 nmole of ribose per minute at pH 7.0 and 75 ℃ to facilitate the comparative analysis. In addition, the analysis of ribose and ribulose concentrations and other sugars in the measurement of enzyme activity was carried out using a bio-liquid chromatography (Bio-LC) system equipped with an electrochemical detector and a CarboPacPA column. Dionex ICS-3000, Sunnylvale, CA). At this time, the CarboPacPA column was allowed to pass 200 mM sodium hydroxide at 30 ° C. at a rate of 1 ml / min.
그 결과, R142N 돌연변이 효소에서 wild 효소에 비해 엘-리불로오스를 기질로 하였을때 활성이 1.4배 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 이에따른 kinetic 실험을 수행한 결과 catalytic efficiency가 374 mM-1s-1 인 wild 효소에 비해 R142N 돌연변이 효소는 579 mM-1s-1 로써 1.5배 향상됨을 확인 할 수 있었다. 이는 현재까지 엘 리불로스에서 엘 리보오스 전환하는 효소 반응 중에서 가장 높은 수치임을 확인할 수 있었다(표 2 참조).As a result, it was confirmed that the activity was increased by 1.4-fold when L- ribulose substrate as compared to wild enzyme in the R142N mutant enzyme. As a result of the kinetic experiments, it was confirmed that the R142N mutant enzyme was 579 mM -1 s -1, which is 1.5 times higher than the wild enzyme having a catalytic efficiency of 374 mM -1 s -1 . It was confirmed that this is the highest level of enzyme reaction of el ribose to el ribose to date (see Table 2).
표 2는 만노스 6-인산 이성화 효소와 그 돌연변이 효소의 엘-리불로스에 대한 specific activity 및 kinetic parameters를 나타낸 것이다.Table 2 shows the specific activity and kinetic parameters of mannose 6-phosphate isomerase and its mutant enzymes for el-ribulose.
8-2:지8-2:
오바실러스 써모디니트리피칸스Obacillus Thermodini Tripicans
((
Geobacillus thermodenitrificansGeobacillus thermodenitrificans
) 균주로부터 유래한 만노스 6-인산 이성화 효소 돌연변이체) Mannose 6-phosphate isomerase mutant derived from strain
지오바실러스 써모디니트리피칸스(Geobacillus thermodenitrificans) 균주로부터 유래한 만노스-6-인산 이성화효소와 그 돌연변이체의 엘-리불로오스에 대한 효소 활성을 측정 및 비교하는 실험을 수행하였다.If five Bacillus Thermo di NITRY pecan switch (Geobacillus thermodenitrificans) derived from a strain mannose-6-phosphate isomerase and El of the mutant-enzyme activity for the re-fire agarose was carried out the measurement and the comparison experiments.
상기 효소 반응은 10 mM 리불로오스, 1 mM Co2+의 금속 이온이 포함된 50 mM PIPES 완충용액(pH 7.0)을 사용하여 70℃에서 5분 동안 수행하였고, 다시 최종 농도 200 mM 염화 수소을 첨가하여 상기 반응을 정지시켰다. 본 발명에서는 효소 활성은 엘-리불로오스를 기질로 사용하여 측정되었고, 상기 효소 활성의 효소 1 단위(unit)는 pH 7.0와 70℃에서 분당 1 nmole의 리보오스를 생산하는 양으로 정의하여 비교분석을 원활히 하였다. 또한, 효소 활성의 측정 시 리보오스 농도 및 리불로오스 농도 그리고 다른 당들의 분석은 전기화학적 검출기(electrochemical detector) 및 카보팩 피에이(CarboPacPA) 컬럼 이 장착된 바이오 액체 크로마토그래피(Bio-LC) 시스템 (Dionex ICS-3000, Sunnylvale, CA)을 이용하여 진행되었다. 이 때, 상기 카보팩 피에이(CarboPacPA) 컬럼은 30℃에서 1 ㎖/분 속도로 200 mM 수산화 나트륨을 통과시키도록 하였다.The enzymatic reaction was performed for 5 minutes at 70 ° C. using 50 mM PIPES buffer solution (pH 7.0) containing 10 mM ribulose, 1 mM Co 2+ metal ions, followed by addition of 200 mM hydrogen chloride. The reaction was stopped. In the present invention, the enzyme activity was measured using L-ribulose as a substrate, and the enzyme activity of 1 unit (unit) of the enzyme activity was defined as the amount to produce 1 nmole of ribose per minute at pH 7.0 and 70 ℃, comparative analysis It was smooth. In addition, the analysis of ribose and ribulose concentrations and other sugars in the measurement of enzyme activity was carried out using a bio-liquid chromatography (Bio-LC) system equipped with an electrochemical detector and a CarboPacPA column. Dionex ICS-3000, Sunnylvale, CA). At this time, the CarboPacPA column was allowed to pass 200 mM sodium hydroxide at 30 ° C. at a rate of 1 ml / min.
그 결과, 4개의 돌연변이 효소에서 wild 효소에 비해 엘 리불로오스를 기질로 하였을 때 활성이 1.2~1.4배 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 이때 엘 리불로스에 대한 wild 효소의 specific activity 는 504 U/mg 임을 확인하였다 (표 1 참조). 그에 따른 돌연변이 효소의 DNA 염기 서열및 아미노산 서열을 wild 효소와 비교해본결과, 1~3개의 포인트가 돌연변이가 유발된 것을 확인할 수 있었다. 이는 현재까지 리보스의 생산 중 가장 높은 생산성을 나타낸 것은 지오바실러스 써모디니트리피칸스(Geobacillus thermodenitrificans) 균주 유래의 만노스-6-인산 이성화 효소였지만, 그에 따른 돌연 변이 효소가 보다 높은 활성을 보임을 확인할 수 있었다. 이것은 돌연변이 효소가 보고된 생물학적 엘-리보스 생산에서 가장 높은 생산성을 가진 지오바실러스 써모디니트리피칸스(Geobacillus thermodenitrificans)로부터 유래한 만노스-6-인산 이성화 효소를 능가하는 엘-리보스 생산 효소임을 나타낸다.As a result, it was confirmed that activity was increased by 1.2-1.4 times when erythrose was used as a substrate in comparison with wild enzyme in four mutant enzymes. At this time, it was confirmed that the specific activity of wild enzyme for elibulose was 504 U / mg (see Table 1). As a result of comparing the DNA base sequence and amino acid sequence of the mutant enzyme with the wild enzyme, it was confirmed that 1 to 3 points of mutation were induced. This is not to show a five Bacillus Thermo di NITRY pecan switch (Geobacillus thermodenitrificans), but mannose-6-phosphate isomerase strain derived, mutant enzyme has higher activity hence showing the highest productivity of the production of ribose to the present I could confirm it. It biological El with a mutant enzyme report shows that the enzyme produces ribose - if five Bacillus Thermo di NITRY pecan switch (Geobacillus thermodenitrificans) a mannose-6-phosphate isomerase El surpassing derived from having the highest productivity in the production of ribose .
표 3 Enzyme | Mutation point | Relative activity (%) |
Wild | None | 100 |
Mutant 1 | K21E, N74T, M134R | 121 |
Mutant 2 | E67G, T238I | 132 |
Mutant 3 | K124R, L129F | 131 |
Mutant 4 | N90D | 125 |
TABLE 3 Enzyme | Mutation point | Relative activity (%) |
Wild | None | | 100 |
Mutant 1 | K21E, N74T, M134R | 121 |
Mutant 2 | E67G, T238I | 132 |
Mutant 3 | K124R, L129F | 131 |
Mutant 4 | N90D | 125 |
표 3은 만노스-6-인산 이성화 효소와 돌연변이 효소들의 엘-리불로스에 대한 효소 활성을 나타낸 것이다.Table 3 shows the enzymatic activity of mannose-6-phosphate isomerase and mutant enzymes against el-ribulose.
8-3:지8-3:
오바실러스 써모디니트리피칸스Obacillus Thermodini Tripicans
((
Geobacillus thermodenitrificansGeobacillus thermodenitrificans
) 균주로부터 유래한 다른 만노스 6-인산 이성화 효소 돌연변이체Other mannose 6-phosphate isomerase mutants derived from strain
지오바실러스 써모디니트리피칸스(Geobacillus thermodenitrificans) 균주로부터 유래한 만노스-6-인산 이성화효소(mannose 6-phosphate isomerase)를 선별검사(screening)하여 얻은 활성 높은 잔기중에 활성이 가장 높은 두 가지 잔기를 각기 다른 아미노산으로 치환하여 활성이 가장 높은 잔기를 선별하였다.The two most active residues were screened by screening mannose 6-phosphate isomerase derived from the strain of Geobacillus thermodenitrificans. The residues with the highest activity were selected by substitution with different amino acids.
구체적으로 N90잔기와 L129잔기를 각각 다른 성질의 아미노산으로 전환하여 아래 N90A, N90D, N90E, N90H, N90K, N90L, N90Y, L129A, L129F, L129H, L129W, L129Y로 점돌연변이를 진행하여, 기존 야생형(wild type)의 지오바실러스 써모디니트리피칸스 균주로부터 유래한 만노스-6-인산 이성화효소와 활성 실험을 비교하였다. Specifically, the N90 residue and the L129 residue are converted into amino acids having different properties, and then point mutations are performed with the following N90A, N90D, N90E, N90H, N90K, N90L, N90Y, L129A, L129F, L129H, L129W, and L129Y. The activity test was compared with mannose-6-phosphate isomerase derived from wild type Geobacillus thermodinitripicans strain.
본 실험의 선별검사는 Clontech Diversify PCR Random Mutagenesis Kit을 이용하여 실수유발 PCR (error prone PCR)진행하여 케토오스 정량법(ketose assay)를 통해 선별하였다. 그렇게 얻은 돌연변이체(mutant)를 Stratagene에서 나온 QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit를 이용하여 각각 하나의 잔기로 변환, 다른 아미노산으로 치환 혹은 두 개의 돌연변이를 진행하였다. 또한 그 활성은 기존 MPi와 함께 반응을 비교 진행하였다. 반응은 50 mmole/L 피페스버퍼(PIPES buffer)에 보인자(co-factor) 1 mM Co2+를 포함한 0.5 mg/ml의 enzyme을 10 mmol/L 엘-리불로오스(L-ribulose)와 70 에서 10분간 반응하여 고유 활성도(specific activity)를 측정하여 비교하였다.(도 23 및 도 24 참조)The screening test of this experiment was performed by ketose assay using error prone PCR using Clontech Diversify PCR Random Mutagenesis Kit. The resulting mutants were converted to one residue each using a QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit from Stratagene, replaced with another amino acid, or subjected to two mutations. In addition, the activity was compared to the reaction with the existing MPi. The reaction was performed with 10 mmol / L L-ribulose with 0.5 mg / ml of enzyme containing co-factor 1 mM Co 2+ in 50 mmole / L PIPES buffer. The specific activity was measured by comparing the reaction at 70 minutes for 10 minutes (see FIGS. 23 and 24).
8-4: 지오바실러스 써모디니트리피칸스 균주로부터 유래한 만노스-6-인산 이성화효소 두개의 점 돌연변이체 및 생산성 분석8-4: Analysis of Two Point Mutants and Productivity of Mannose-6-Phosphate Isomerase Derived from Geobacillus Thermodinitripicans Strain
지오바실러스 써모디니트리피칸스 균주로부터 유래한 만노스-6-인산 이성화효소를 선별 검사하여 얻은 활성 높은 잔기들중 활성이 가장 높은 두가지 잔기를 한번에 double mutation시켜 그 활성을 비교하였다.Among the highly active residues obtained by screening for mannose-6-phosphate isomerase derived from the Geobacillus thermodinitripicans strain, the two most active residues were double-mutated and compared for their activities.
구체적으로 N90A와 L129F를 함께 doble mutation시켜 더 높아지는 활성을 확인하였다(도 25 참조)Specifically, doble mutations of N90A and L129F together confirmed higher activity (see FIG. 25).
실시예 9: 만노스 6-인산 이성화효소와 돌연변이 효소를 이용한 엘 리불로오스로부터 엘 리보스의 전환 비교Example 9 Comparison of El Ribose to El Ribose Conversion Using Mannose 6-Phosphate Isomerase and Mutant Enzymes
만노스 6-인산 이성화효소와 돌연변이 효소를 이용한 리보스의 생산 방법을 개발하기 위하여, 상기에서 확인한 효소의 최적 pH 7.0 및 효소활성이 절반으로 줄어든 시간을 고려한 온도(65 ℃)에서 10 mM 리불로오스를 가지고 리보스의 시간별 생산량을 측정하였다.In order to develop a method for producing ribose using mannose 6-phosphate isomerase and a mutant enzyme, 10 mM ribulose was prepared at a temperature (65 ° C) considering the optimum pH 7.0 and the time when the enzyme activity was reduced by half. The hourly yield of ribose was measured.
그 결과, 반응 70분 후에 10 mM의 리불로오스에서 리보스로 전환되는 전환율이 wild 효소에서는 51%, R142N 돌연변이 효소는 64% 임을 확인하였다( 도 7 참조). 이는 현재까지 리보스의 생산 중 가장 높은 생산성을 나타낸 것은 써머스 써모필러스(Thermus thermophilus) 유래의 만노스 6-인산 이성화 효소였지만, 그에 따른 돌연 변이 효소인 R142N 돌연변이 효소가 보다 높은 활성을 보임을 확인 할 수 있었다. 이것은 R142N 돌연변이 효소가 보고된 생물학적 엘-리보스 생산에서 가장 높은 생산성 및 생산농도를 가진 써머스 써모필러스(Thermus thermophilus)로부터 유래한 만노스 6-인산 이성화 효소를 능가하는 엘-리보스 생산 효소임을 나타낸다.As a result, it was confirmed that 70 minutes after the reaction, the conversion rate from ribulose to ribose was 51% for wild enzyme and 64% for R142N mutant enzyme (see FIG. 7). This can be confirmed to show it's sseomeoseu Thermo filler (Thermus thermophilus) The origin of the mannose 6-phosphate isomerase, but, mutant enzymes, R142N mutant enzyme is higher activities hence showing the highest productivity of the production of ribose to the present there was. Biological El with a mutant enzyme R142N report shows that the enzyme produces ribose-El that surpassed the mannose 6-phosphate isomerase derived from Thermococcus sseomeoseu pillar's (Thermus thermophilus) with the highest productivity and production levels in ribose production.
이상, 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다. As described above, specific portions of the contents of the present invention have been described in detail, and for those skilled in the art, these specific techniques are merely preferred embodiments, and the scope of the present invention is not limited thereto. Will be obvious. Thus, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.