WO2011036316A2 - Uso de extractos vegetales como prebióticos, composiciones y alimentos que los contienen - Google Patents

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    • A23V2400/515—Animalis

Definitions

  • the present invention claims the use of plant extracts and various combinations of said extracts, some additionally including a probiotic, which enable a synergistic effect between the bioactive components thereof, for the preparation of dietary supplements, functional foods / beverages, food additives and medications for use in human health care.
  • the invention describes the use of an olive extract standardized to hydroxytyrosol (MEDITEANOX ®) and extract standardized punicalagins Granada (POMANOX ®) as prebiotic ingredients.
  • MEDITEANOX ® olive extract standardized to hydroxytyrosol
  • POMANOX ® extract standardized punicalagins Granada
  • the use of the mentioned pomegranate and olive extracts with prebiotic properties in combination with a probiotic for the production of a symbiotic is also described (defined as that food containing a specific mixture of probiotic bacteria and prebiotic substances).
  • the invention describes the combinations of pomegranate and / or olive extracts with prebiotic effect or of other prebiotics or of a dietary fiber with a vegetable extract containing glucosinolates, e.g.
  • the digestive tract of an adult contains a flora composed of approximately 10 14 microorganisms, with around 400-500 different bacterial species.
  • the dominant population consists of strict anaerobic bacteria: Bacteroides, Bifidobacterium, Eubacterium and Peptostreptococcus.
  • the subdominant flora comprises bacteria that belong to the genera Streptococcus and Lactobacillus, and to a lesser extent, Enterococcus, Clostridium and yeasts. Most of these species have a beneficial role, but others are potentially pathogenic, such as some species of Clostridium, although its small number and competition with other bacteria prevent its proliferation and pathogenic action.
  • the gastrointestinal flora performs various functions in the body. Its importance is mainly defensive, since it prevents colonization by pathogenic microorganisms and modulates the immune system by inducing tolerance and the production of non-inflammatory immunostimulants.
  • the metabolism of the flora is an important source of energy for the intestinal wall due to the fermentation of carbohydrates to organic acids, it also produces the synthesis of some vitamins, such as K and some B. No less important, it is the role that the microorganisms exert in the regulation of the intestinal transit.
  • the stability of the gastrointestinal flora depends on various parameters: physiological, such as age, menopause and stress situations; certain diseases, especially diarrhea, colitis and Crohn's disease and the use of drugs, especially antibiotics; and nutritional. In this last aspect is where the consumption of probiotics, prebiotics and symbiotics comes into play.
  • Probiotics are non-pathogenic microorganisms that, when ingested, exert a positive influence on the health or physiology of the host.
  • Commercial preparations of probiotics are mainly formed by bacteria of the genus Bifidobacterium and / or Lactobacillus.
  • a prebiotic is defined as a non-digestible food ingredient that has the potential to improve host health, by selectively stimulating the growth and / or activity of one or a limited number of bacteria in the colon (Gibson et al., 2004).
  • an ingredient to be considered as a prebiotic it must meet three requirements: i) that it is not absorbed or hydrolyzed in the stomach; ii) it is a selective substrate for one or a limited number of potentially beneficial bacteria in the colon, stimulating the growth and / or metabolic activity of the same / s; iii) that as a consequence of the above, it is capable of altering the composition of the intestinal flora towards a composition richer in beneficial bacteria.
  • a symbiotic is defined as that food that contains a specific mixture of probiotic bacteria and prebiotic substances.
  • inulin and fructooligosaccharides stand out. These significantly affect the composition of the intestinal flora, reduce the incidence of gastrointestinal, respiratory and atopic dermatitis infections and also produce an increase in the population of Bifidobacterium in the colon. Other oligo and polysaccharides can act as prebiotics.
  • dietary fiber eg soluble fiber
  • soluble fiber can act by sequestering bile acids in the intestine itself, which leads to them not being reabsorbed and consequently the liver responds using endogenous cholesterol to synthesize more bile fatty acids in sending them to the intestine
  • a second mechanism of action implies that when soluble fiber undergoes fermentation in the intestine, it increases the production of short-chain fatty acids such as propionate. Propionate is absorbed in the colon through the portal vein and has been shown to inhibit HMGR in the liver.
  • Application ES 2 198 126 T3 describes the use of D-tagatose carbohydrate as a prebiotic food component. Its consumption induces the production of butyrate in the colon, which may have a protective effect against colon cancer.
  • the application ES 2 278 021 T3 describes the use of a composition comprising a prebiotic to decrease the inflammatory process and abnormal activation of non-specific immunological parameters.
  • the prebiotic comprises an oligosaccharide produced from glucose, galactose, xylose, maltose, sucrose, lactose, starch, xylan, hemicellulose, inulin, gum (for example acacia gum) or a mixture thereof.
  • the ES 2 320 988 T3 application describes a method to prevent or alleviate the symptoms of malabsorption through the gastrointestinal tract by administration of a prebiotic that can be inulin, modified inulin, hydrolyzed inulin, fructo-oligosaccharides, galactomannan and its hydrolysates, arabinogalactan and its hydrolysates, trans-galacto-oligosaccharides, rhamnose, pectin and hydrolysates of pectin, resistant and hydrolyzed starch thereof, dextrin indigestible and hydrolysed thereof, indigestible polydextrose, beta-glucan and hydrolysed thereof, and combinations of these oligo and polysaccharides.
  • a prebiotic that can be inulin, modified inulin, hydrolyzed inulin, fructo-oligosaccharides, galactomannan and its hydrolysates, arabinogalactan and its hydrolysates, trans-galacto-oligosacc
  • the application WO 02/091833 describes a pharmaceutical composition comprising a prebiotic, a prebiotic and a microorganism with alkaline pH stability and high urease activity.
  • the prebiotic described is oligosaccharide, inulin, lactulose and other vegetable fibers.
  • the US 2009/0022849 A1 application describes the prebiotic effect of red fruit and red fruit juices, such as redcurrant, cranberry and pomegranate, and its use to promote the growth of beneficial bacteria of the gastrointestinal flora, such as Bifidobacterium and Lactobacillus, as well as inhibit the growth of harmful bacteria of the gastrointestinal flora, such as Clostridium and Bacteroides.
  • beneficial bacteria of the gastrointestinal flora such as Bifidobacterium and Lactobacillus
  • harmful bacteria of the gastrointestinal flora such as Clostridium and Bacteroides.
  • the authors do not indicate which are the compounds present in red fruits and in their juices that provide them with the properties to promote the growth of beneficial bacteria and inhibit the growth of harmful bacteria, nor therefore propose the standardization of juices to compounds capable of promoting such effects.
  • microbiota microorganisms are responsible for the production of urolithins and it is undoubtedly of great interest their identification and use as probiotics to enhance the production of urolithins in view of the fact that the effect of urolithins has been described in cancer chemoprevention.
  • US5411986 describes that isothiocyanates such as sulforaphane, which was isolated by the authors From broccoli, a potent inducer of the main enzymes of phase II of liver detoxification, they can be used in the field of oncology for their chemopreventive properties.
  • US5725895 describes a method for preparing foods rich in glucosinolates and / or isothiocyanates from crucifix seeds and sprouts obtained therefrom.
  • Cids and notably broccoli contain a high content of glucosinolates (chemically they are thioglycosides) and are accompanied in these vegetables by the enzyme myrosinase (it has thioglucosidase activity).
  • myrosinase it has thioglucosidase activity.
  • myrosinase it has thioglucosidase activity.
  • the plant's enzyme catalyzes the conversion of the different glucosinolates into their corresponding aglycones that are called isothiocyanates and are bioactive products.
  • glucorapanin is hydrolyzed by myrosinase to form sulforaphane.
  • ESP epitionitriles
  • cyano-epitioalkanes are also formed. It is the proteins called ESP (epithiospecifier proteins) that are responsible for the formation of these nitriles and epitionitriles. These compounds are inactive for cancer chemoprevention or even unhealthy for humans. ESP proteins require Fe for their activity and are denatured with heat, for example when cooking vegetables rich in glucosinolates.
  • Some genera of the microbiota of the colon in humans have an activity similar to myrosinase.
  • In vitro incubation of human feces with a food containing cooked glucosinolates to completely denature myrosinase results in the appearance of isothiocyanates.
  • certain bacteria in the colon can hydrolyze glucosinolates. consumed in a meal with cooked vegetables rich in glucosinolates and release hydrolysis products directly into the lumen of the colon.
  • pomegranate and / or olive extracts with prebiotic effect or of other prebiotics or of a dietary fiber with a plant extract containing glucosinolates e.g. an extract of broccoli
  • a selective stimulation of certain populations of the microflora of the colon e.g Bifidobacterium and Lactobacillus genera, improves the bioavailability in our body of isothiocyanates formed from its precursors, glucosinolates, in the colon.
  • Olive polyphenols mostly hydroxytyrosol, have demonstrated potential health benefits in several aspects: prevention of cardiovascular diseases, prevention of degenerative diseases, reduction of the risk of cancer diseases, anti-inflammatory properties, reduction of the consequences caused by stress Oxidative induced by tobacco and protection from skin damage.
  • Pomegranagines of pomegranate have shown potential health benefits in various aspects: prevention of cardiovascular diseases, prevention of degenerative diseases, decreased risk of cancer diseases, anti-inflammatory properties, antiparasitic, antiviral and antimicrobial activity, treatment of individuals with low amounts and / or sperm quality and erectile dysfunction treatment.
  • an olive extract rich in hydroxytyrosol and an extract of pomegranate rich in punicalagins act as prebiotics promoting the growth of beneficial bacteria of the gastrointestinal flora and inhibiting the growth of potentially pathogenic bacteria thereof.
  • An object of the present invention is the use as a prebiotic of a pomegranate extract containing punicalagins and free ellagic acid, in which the content of punicalagins is at least 2% (w / w) and the content of free ellagic acid is such that the ratio of punicalagins / free ellagic acid (% w / w), is in the range of 10/1 to 35/1, and additionally the total phenolic content is at least 5% (w / w) ( expressed as equivalent gallic acid), and the water solubility is at least 3% (w / w) (30 g pomegranate extract / L), taking into account that said pomegranate extract is not a pomegranate juice as It is known in the prior art.
  • composition of the pomegranate extract indicated above is especially useful for use as a prebiotic, due to its richness in punicalagins that can selectively stimulate in the colon the growth of bacteria of the genera Bifidobacterium and Lactobacillus, and the very low content that they present with ellagic acid free, such that the ratio of punicalagins / free ellagic acid (% w / w), is in the range of 10/1 to 35/1.
  • ellagic acid is one of the molecules that most inhibited microbial growth. Therefore, it is desirable that pomegranate extracts that are developed for use as prebiotics have a free punicalagin / ellagic acid ratio (% w / w), as high as possible.
  • the best quality commercially available pomegranate juice contains between 2400-4000 mg / L of total polyphenols (expressed as equivalent gallic acid) of which the punicalagin content is in the range 500-2000 mg / L.
  • the mentioned juice has a Brix grade of 16 and can be subsequently concentrated about 5 times, which in punicalagine content never reaches more than 10 g / L (1% w / w).
  • the ratio of punicalagins / free ellagic acid in pomegranate juices they do not exceed 8/1 and even during the concentration it is usual to reduce due to the hydrolysis suffered by complex elagitannins such as punicalagins with the consequent release of ellagic acid in Free form.
  • Another object of the invention is the use of an olive extract, alone or in combination with a dietary fiber, as a prebiotic, taking into account that said olive extract It is not an olive oil.
  • a preferred olive extract is one obtained by the process according to the application WO 2008/090460 A1, and which has a hydroxytyrosol content of at least 0.5% (w / w), and a hydroxytyrosol purity of at least 40% (by HPLC at 280 nm).
  • This extract is free of organic solvents (the residual content of organic solvents is less than 1ppb and preferably is 0 ppm) and substantially free of salts, and the hydroxytyrosol content of said extract is at least 0.5% (p / p) and the purity of hydroxytyrosol is at least 40% (by HPLC at 280 nm).
  • the hydroxytyrosol content is at least 10% (w / w), and more preferably at least 35% (w / w). and preferably the purity of hydroxytyrosol is 80% and more preferably 90% (by HPLC at 280 nm).
  • Another preferred pomegranate extract is one obtained according to the application EP 1967079, and having a punicalagin content of at least 5% (w / w), preferably at least 20% (w / w) and more preferably of at least 30% (w / w), the punicalagin purity being at least 55%, and a free ellagic acid content such that the punicalagin / free ellagic acid ratio (% w / w) is situated in the range of 10/1 to 35/1, the total phenolic content is at least 10% (w / w) preferably at least 20% (w / w) and more preferably at least 50% (w / w) (expressed as equivalent gallic acid), the water solubility is at least 3% (w / w) (30 g pomegranate extract / L).
  • the extract has a residual organic solvent content of less than 1 ppb and more preferably is 0 ppm).
  • Another preferred pomegranate extract in the present invention for use as a prebiotic is that obtained according to the application EP 1967079 (where in a scenario of the invention from an extract rich in punicalagins is obtained, through the use of an enzyme capable of hydrolyzing punicalagins, an extract rich in punicalins) characterized by being an extract of pomegranate containing at least 1.5% (w / w) of punicalins, and having a free punicalin / ellagic acid ratio (% w / w), in the range from 10/1 to 35/1.
  • the polyphenols present in the olives are responsible for their bitterness, being the ones that best correlate with this attribute oleuropein and the aldehyde form of oleuropein aglycone.
  • the use of Olive extracts containing oieuropein and / or the aldehyde form of oieuropein aglycone can modify the taste of the food in which said extract is incorporated, causing less acceptance by consumers.
  • the olive extract rich in hydroxytyrosol obtained according to WO 2008/090460 A1, is virtually free of oieuropein and the aldehyde form of oieuropein aglycone, the sum of both compounds being less than 5 ppm, because no one is used Organic solvent, where you are much more hydrophobic molecules than hydroxytyrosol are more soluble, during the extraction of the extract, and the combination of purification steps used, chromatographic columns, to obtain the extract.
  • An additional advantage of the above-mentioned extracts, both of pomegranate and olive is the purification against residues of phytosanitary compounds present in the raw material, that is, in olives and pomegranates.
  • potentially toxic substances such as insecticides, herbicides, fungicides, rodenticides, etc., for example: diuron, terbutylazine, simazine, ⁇ -endosulfan, and ⁇ -endosulfan may be present in the starting material.
  • All these pesticides have molecular structures (example: the triazine nucleus) capable of interacting with the absorption resins and then be eluted from the resin together with the other components of the extract when organic solvents are used.
  • the procedures for preparing olive and / or pomegranate extracts based on the use of an absorbent resin and its subsequent elution with organic solvents should maximize the quality control of the raw material with respect to pesticide residues, since The absorption resin can act as a trap for these pesticides, concentrate them on the resin and subsequently elute them when an organic solvent is used to recover the hydroxytyrosol or punicalagins present in the olive and pomegranate extracts respectively.
  • 967 079 A1 is free of alkaloids because no organic solvent is used in any of the production stages of the extract.
  • olive extract and pomegranate extract promote the growth of bacteria of the genera Bifidobacterium and Lactobacillus and inhibit the growth of bacteria of the genera Clostridium and Bacteroides.
  • pomegranate and olive extracts can act at lower doses (less than 1 g of extract per day) than classic prebiotics (eg, inulin, FOS etc, require between 4-20 g day to be effective) and even present less side effects (eg flatulence, bloating, diarrhea, etc.), while presenting a high specificity, which represents an additional advantage of prebiotic compositions based on these extracts.
  • classic prebiotics eg, inulin, FOS etc, require between 4-20 g day to be effective
  • side effects eg flatulence, bloating, diarrhea, etc.
  • the present invention demonstrates that it is possible to incorporate an extract of olive rich in hydroxytyrosol and / or an extract of pomegranate rich in punicalagins, in a food matrix to produce foods that act as prebiotics promoting the growth of beneficial bacteria of the gastrointestinal flora and inhibiting the growth of potentially pathogenic bacteria from it.
  • the incorporation of the extract does not alter the organoleptic properties of the food, and hydroxytyrosol or punicalagins have adequate stability in the different food matrices, for which in some food matrices the use of commonly used food additives such as ascorbic acid and citric acid.
  • a refreshing fruit drink stands out, with a content of at least 12% grape juice, combined or not with other fruit juices, with an ascorbic acid content from 0 to ppm at 9000 ppm, with a citric acid content between 0% and 5% and with a pomegranate extract content, between 50 ppm and 10,000 ppm.
  • extracts of pomegranate powder containing citric acid between 0.5% and 10% (w / w) and ascorbic acid between 0.05% and 5% ( p / p) also constitute one of the objects of the present invention.
  • the use as a food additive of the pomegranate extract rich in punicalagins and the olive extract rich in hydroxytyrosol as an alternative to other food additives obtained by chemical synthesis and which are being shown as potentially harmful to health is discussed , such as the antioxidants butijhydroxyanisole, BHA, butylhydroxytoluol, BHT, and terbutylhydroxynone, TBHQ, or preservatives such as benzoic acid, benzoates and their derivatives, nitrates, nitrites and their derivatives, and also for the replacement of dyes such as tartrazine and erythrosine
  • pomegranate and olive extracts have antioxidant and antimicrobial properties, but also in the present invention its prebiotic effect is demonstrated.
  • the present invention demonstrates that it is possible to incorporate an olive extract rich in hydroxytyrosol or an extract of pomegranate rich in punicalagins, together with a probiotic bacteria or a mixture of probiotic bacteria, in a food matrix to produce foods that They act as symbiotics.
  • a probiotic bacteria or a mixture of probiotic bacteria in a food matrix to produce foods that They act as symbiotics.
  • the prebiotic selectively favors the prebiotic component, although the meaning of the The invention is broader also referring to the synergistic effect that the prebiotic component and the prebiotic component can exert to achieve its beneficial effect on health.
  • the incorporation of the prebiotic extract and the probiotic do not alter the stability of hydroxytyrosol or punicalagins when stored under suitable conditions.
  • the probiotic used for the preparation of the symbiotic is preferably a strain of Lactobacillus or Bifidobacterium.
  • strains that only produce L (+) lactic acid are used.
  • Some examples of preferred Lactobacillus species are Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei and Lactobacillus reuteri.
  • Particularly preferred strains are Lactobacillus rhamnosus ATCC 53103, Lactobacillus rhamnosus CGMCC 1.3724, Lactobacillus reuteri ATCC 55730, Lactobacillus paracasei CNCM 1-2116 and Lactobacillus casei DN 114-001.
  • Bifidobacterium animalis Bifidobacterium animalis
  • Bifidobacterium lactis Bifidobacterium breve
  • Bifidobacterium longum Bifidobacterium animalis DN-173 010
  • Bifidobacterium lactis marketed by the Danish company Christian Hansen under the trademark BB-12
  • Bifidobacterium longum ATCC BAA-999 marketed by the Japanese company Morinaga Milk Industry Co. Ltd. under the brand BB536 commercial.
  • the symbiotic preparation of the invention should contain between 10 2 and 0 10 CFU of the prebiotic bacteria / g of symbiotic and between 0.001% and 1% of the olive extract rich in hydroxytyrosol or the extract of pomegranate rich in punicalagins.
  • the strain of selected probiotic bacteria can be grown according to any suitable method, available in the prior art for incorporation into the symbiotic preparation.
  • the strain of probiotic bacteria can be purchased from a specialized supplier such as the Christian Hansen and Morinaga companies, so that it is prepared in a manner suitable for addition to the symbiotic.
  • the invention relates to the use of an olive extract rich in hydroxytyrosol and / or an extract of pomegranate rich in punicalagines, as well as the products produced from them (food and beverages enriched with these extracts, dietary supplements, symbiotics and antioxidant food additives with prebiotic properties), to promote the beneficial effects associated with prebiotic ingredients and changes in the gastrointestinal flora.
  • beneficial effects are the regulation of intestinal transit, the modulation of the immune system, the absorption of minerals, the regulation of lipid metabolism and the prevention of cancer.
  • Another object of the present invention is the use of these new prebiotics, an extract of olive rich in hydroxytyrosol and / or an extract of pomegranate rich in punicalagins, and of oral compositions containing them in reducing the risk factors associated with the syndrome. metabolic and its consequences, being the most prominent, atherosclerosis, cardiovascular diseases, hypercholesterolemia and type 2 diabetes mellitus.
  • Metabolic syndrome is called the set of metabolic and cardiovascular disorders that are related to insulin resistance and abdominal obesity.
  • metabolic factors ovalbumin, type 2 diabetes, dyslipidemia, hyperglycemia
  • non-metabolic factors arterial hypertension, inflammatory, prothrombotic
  • HDl_ cholesterol less than 40 mg / dL.
  • CRP C-reactive protein
  • IL-6 interleukin 6
  • TNF- ⁇ tumor necrosis factor alpha
  • leptin leptin
  • a combination of a pomegranate extract or an olive extract can be combined with a food fiber to obtain prebiotic compositions that can act synergistically in the human organism.
  • the combination of a pomegranate extract with dietary fiber can not only reduce hypercholesterolemia through the bioactivity of the pomegranate extract compounds, but also the dietary fiber, (Ex: soluble fiber) when undergoing fermentation in the intestine increases the production of short chain fatty acids such as propionate. Propionate is absorbed in the colon through the portal vein and has been shown to inhibit HMGR
  • a vegetable source rich in glucosinolates with a source of dietary fiber, such as soluble fiber and in a preferred scenario a soluble fiber rich in betaglucan obtained from oats or barley or its mixtures, or with a prebiotic selected from: prebiotic oligosaccharides (fructooligosaccharides, xylooligosaccharides, polydextrose, galaactooligoccharides, manoligosaccharides, or mixtures thereof), tagatose, soy, inulin (obtained from sources such as achicoria and jicama), raw oats, unrefined wheat, unrefined barley and unrefined jicama or soy or their mixtures.
  • prebiotic oligosaccharides fructtooligosaccharides, xylooligosaccharides, polydextrose, galaactooligoccharides, manoligosaccharides, or mixtures thereof
  • the combinations of pomegranate and / or olive extracts with prebiotic effect or of other prebiotics or of a dietary fiber with a vegetable extract containing glucosinolates, such as a broccoli extract are found upon finding that a selective stimulation of certain populations of the microflora of the colon, eg genera Bifidobacterium and Lactobacillus, improves the bioavailability in our body of isothiocyanates formed from their precursors, glucosinolates, in the colon.
  • Table 1 shows the sequence of oligonucleotides used in real-time PCR reactions with SYBR Green for the quantification of the corresponding bacteria in the samples.
  • Figures 1A and 1 B show the growth of bifidobacteria in the tests performed and described in Examples 1 and 2 respectively.
  • the concentration of bifidobacteria expressed as LOG / ml is shown on the coordinate axis.
  • the incubation time is shown on the abscissa axis: 0 and 48 hours.
  • the numbers shown in the graph correspond to the concentration of bifidobacteria, at time 0 (initial concentration of 4.9) and at time 48 hours (various values for the control group, the three groups with pomegranate extract and the two groups with olive extract at different concentrations).
  • Figure 2 shows the results described in Example 3, of the quantification of bacteria of the genus Bifidobacterium expressed as% with respect to the total bacteria in the fecal matter of the test mice.
  • Group 1 corresponds to the control group.
  • Groups 2 and 3 were given a pomegranate extract and an olive extract respectively.
  • Table 2 shows the results described in Example 4 of the quantification by real-time quantitative PCR of the amount of bacteria of the genus Lactobacillus expressed as% with respect to the total bacteria in the fecal matter of the test subjects.
  • Table 3 shows the results described in Example 4 of the quantification by real-time quantitative PCR of the number of bacteria in the genus.
  • Figure 3A shows the relationship between the% of fruit in a pineapple juice drink prepared with pomegranate extract and the losses of punicalagines during the preparation of the products.
  • Figure 3B shows the relationship between the% citric acid incorporated in a pineapple juice drink (containing 50% pineapple) prepared with pomegranate extract and the losses of punicalagines during the preparation of the products.
  • Figure 3C shows the relationship between the% of ascorbic acid incorporated in a pineapple juice drink (containing 20% pineapple, and citric acid at different concentrations) prepared with pomegranate extract and losses of punicalagines during preparation of the products.
  • Table 4 summarizes the keys used for the assessment by scales of the different attributes, in the sensory analysis of fruit juice drinks with and without pomegranate extract prepared and evaluated according to examples 6 to 9.
  • Table 5 summarizes the assessment by scales of the different attributes made by the tasters during the sensory analysis of the 100% apple drink as described in example 7.
  • Figures 5A and 5B graphically show the results described in Example 9, of the difference test and the preference test, respectively, performed by the tasters during the sensory analysis of the Pineapple / Plum drink.
  • Figures 5C and 5D graphically show the results described in Example 9, of the difference test and the preference test, respectively, performed by the tasters during the sensory analysis of the Peach / Apple Drink.
  • Table 6 summarizes the scale evaluation of the different attributes made by the tasters during the sensory analysis of the Pineapple / Plum drink as described in example 9.
  • Figure 6 shows the oxidative stability of margarine samples prepared according to Example 12, measured by the Rancimat method at 98 ° C and 10 l / hour.
  • the graph shows a linear correlation between the oxidative stability of the food matrix and the% of olive extract added to the food matrix.
  • Table 7 summarizes the scale evaluation of the different attributes made by the tasters during the sensory analysis of the Peach / Apple drink as described in example 9.
  • Table 8 shows the results described in Example 15 of the HPLC quantification of the amount of total isothiocyanates, expressed as% with respect to the total total isothiocyanates ingested in the form of broccoli extract, in the urine 24 hours a day. test individuals.
  • Quantitative PCR in real time with SYBR Green evaluated the amount of bifidobacteria in each of the Falcon tubes using the BidF and BidR oligonucleotides (Table 1).
  • Quantitative PCR in real time with SYBR Green evaluated the amount of bifidobacteria in each of the Falcon tubes using the BidF and BidR oligonucleotides (Table 1).
  • mice were fed for 20 days with commercial feed and with a daily dose of 12.8 mg of pomegranate extract per mouse (equivalent to a daily intake of 320 mg ext. Pomegranate / Kg body mass) (group 2), or with a dose daily of 0.9 mg of olive extract per mouse (equivalent to a daily intake of 22.9 mg ext. olive / Kg body mass) (group 3) or without pomegranate extract (group 1, control). After this period, fecal matter from each group was collected to isolate bacterial DNA from 0.2 g of it.
  • Quantitative PCR in real time evaluated the amount of beneficial bacteria in the stool, expressed as follows:% bacteria of the genus Bifidobacterium / total bacteria. BidF and BidR oligonucleotides were used (Table 1). Relative quantification was performed using the method described by Liu and Saint, 2002, making each measurement in triplicate.
  • Group 1 control 0.0248 ⁇ 0.0021
  • Group 2 pomegranate extract 0.1069 ⁇ 0.0341
  • EXAMPLE 4 Prebiotic effect of a pomegranate extract in a study of human intervention: changes in the gastrointestinal flora
  • the trial was conducted with 6 healthy individuals aged between 28 and 53 years. Each individual took 1 capsule daily containing 575 mg of pomegranate extract at mealtime. Volunteers were instructed to avoid consuming products of prebiotic capacity (such as fructooligosaccharides, inulin, etc.), antibiotics, laxatives and especially products with prebiotics (e.g., unpasteurized yogurts, fermented milk drinks, etc). The 6 volunteers began to follow these restrictions in their usual diet from the 14 days prior to the treatment phase of the intervention study, continuing with them during the 28 days of the treatment, where they should consume a capsule with pomegranate extract daily.
  • prebiotic capacity such as fructooligosaccharides, inulin, etc.
  • antibiotics e.g., unpasteurized yogurts, fermented milk drinks, etc.
  • Fecal sample was taken from each of the individuals at time 0 (after 14 days prior to administration of pomegranate extract) and after 28 days of administration. From the stool, an isolation of the bacterial DNA was performed.
  • the quantity of beneficial bacteria in the stool was evaluated using real-time quantitative PCR, expressed as follows:% bacteria of the genus Lactobacillus / total bacteria or% bacteria of the genus Bifidobacterium / total bacteria.
  • the oligonucleotides LacF, LacR, BidF and BidR were used (Table 1).
  • the amount of potentially pathogenic bacteria in the stool was evaluated, expressed as follows:% bacteria of the species Clostridium perfringens / total bacteria or% bacteria of the genus Bacteroides / total bacteria.
  • the oligonucleotides CperF, CperR, BacF and BacR were used (Table 1). Relative quantification was performed using the method described by Liu and Saint, 2002, making each measurement in triplicate.
  • A) Beneficial bacteria Lactobacillus: 5 of the 6 individuals (83.3%) presented a significant increase (p ⁇ 0.05 or p ⁇ 0.01 as the case may be) in the percentage of bacteria of this genus after 28 days of administration of pomegranate extract .
  • Bifidobacterium 5 of the 6 individuals (83.3%) presented a significant increase (p ⁇ 0.05 or p ⁇ 0.01 depending on the case) in the percentage of bacteria of this genus after 28 days of administration of pomegranate extract .
  • Clostridium perfringens 5 of the 6 individuals (83.3%) presented a significant decrease (p ⁇ 0.05 or p ⁇ 0.01 as the case may be) in the percentage of bacteria of this genus after 28 days of administration of extract of pomegranate.
  • Bacteroides 4 of the 6 individuals (66.7%) presented a significant decrease (p ⁇ 0.05 or p ⁇ 0.01 depending on the case) in the percentage of bacteria of this genus after 28 days of administration of pomegranate extract .
  • EXAMPLE 5 Prebiotic effect of a pomegranate extract in a human model: regulation of intestinal transit
  • Example 4 During the trial conducted with 6 individuals described in Example 4, each of them was questioned about their digestive health during the administration of the pomegranate extract.
  • EXAMPLE 6 Preparation of a prebiotic fruit juice or nectar with a pomegranate extract, evaluation of the stability of the pomegranate extract in the food matrix after preparation and subsequent storage.
  • a sample of pomegranate extract with a punicalagine content of 61, 12%) (w / w) obtained according to application EP 1967079 A1 was used to prepare pineapple and apple juices and peach nectar containing the aforementioned extract concentration of 624 mg ex. Pomegranate / kg of food matrix (381, 4 mg punicalagins / Kg of food matrix).
  • the raw materials used were: pineapple juice concentrate 60 0 BRIX, apple juice concentrate 70 0 BRIX and peach puree.
  • the control (without extract) and prebiotic (with 624 ppm of pomegranate extract) prototypes of the three food matrices with and without pomegranate extract were prepared according to the following recipes:
  • the 6 prototypes were pasteurized at 100 ° C for 15 seconds and aseptically packaged in glass containers at a temperature of 85-87 ° C.
  • the 6 glass containers containing the prototypes were immersed in water to cool them Quickly and then, the losses of the pomegranate extract incorporated in the 3 types of juices / nectars was measured by determining the punicalagin content by HPLC method.
  • pomegranate extract has a stability dependent on the food matrix. Only apple juice showed an ideal behavior for the application of prebiotic pomegranate extract. In the case of apple juice, when adding pomegranate extract, it cannot be called juice, since the legislation only allows the addition to vitamin and mineral juices, so even though it contains 100% fruit, it will be called Beverage of Apple.
  • control (without extract) and prebiotic (with 624 ppm of pomegranate extract) prototypes of the multifruit nectar with and without pomegranate extract were prepared according to the following recipe:
  • the 2 prototypes were pasteurized at 100 ° C for 15 seconds and aseptically packaged in glass containers at a temperature of 85-87 ° C.
  • the 2 glass containers containing the prototypes were immersed in water to cool them quickly and then, the losses of the pomegranate extract incorporated in the multifruit nectar was measured by determining the punicalagin content by HPLC method.
  • the main conclusions are that it is possible to stably incorporate the pomegranate extract with prebiotic properties into food matrices of the type of juices / nectars (containing 100% fruit, and at least 50% fruit respectively)
  • the matrix plus Optimal is apple juice, followed by grape juice but also matrices with several fruits conveniently stabilized by incorporating between 90 and 900 ppm of ascorbic and between 0.3 and 0.5 of citric acid show an excellent incorporation of Pomegranate Extract
  • bottles with the prototypes of apple drink and multifruit nectar were stored at 5 ⁇ 3 ° C and 25 ⁇ 2 ° C.
  • the losses of the pomegranate extract incorporated in the apple drink and in the multifruit nectar were analyzed by determining the punicalagin content by HPLC method. After 6 months of stability test, the loss of punicalagins was less than 5% in both conditions under test: a) 5 ⁇ 3 ° C.
  • EXAMPLE 7 Sensory analysis of a prebiotic juice or fruit nectar with pomegranate extract.
  • the Sensory Analysis of apple juice and multifruit nectar with and without pomegranate extract prepared according to example 6 was carried out.
  • a taste tasting session was carried out, consisting of a Sensory Evaluation designed by the panel of judges. experts, in order to identify the characteristics and / or attributes of the product with and without the incorporation of pomegranate extract.
  • the tasting sessions are formed by a panel composed of 10-12 semi-trained tasters in the products.
  • the Apple Drink that contains the pomegranate extract is valued positively from the sensory point of view, even more favorably than the Apple Drink without extract.
  • pomegranate extract on Apple, Grape, Kiwi and Plum Drink does not provide unpleasant colors, aromas or flavors.
  • the Multifruit Drink that contains the pomegranate extract is valued positively from the sensory point of view.
  • EXAMPLE 8 Preparation of a fruit drink / prebjotic tea extract with a pomegranate extract, evaluation of the stability of the pomegranate extract in the food matrix.
  • a sample of pomegranate extract with a punicalagin content of 61.12% (w / w) obtained according to the application EP 1967079 A1 was used to Prepare fruit drinks with or without tea extracts containing pomegranate extract at the concentration of 624 mg ex. Pomegranate / kg of food matrix (381, 4 mg punicalagins / Kg of food matrix). Control (without extract) and prebiotic (with 624 ppm of pomegranate extract) prototypes of various food matrices with and without pomegranate extract were prepared according to the following recipes:
  • the 8 prototypes were pasteurized at 100 ° C for 15 seconds and aseptically packaged in glass containers at a temperature of 85-87 ° C.
  • the 8 glass containers containing the prototypes were immersed in water to cool them quickly and then, the losses of the pomegranate extract incorporated in the Fruit Beverages was measured by determining the punicalagin content by HPLC method.
  • the main conclusions are that it is possible to stably incorporate the pomegranate extract with prebiotic properties in food matrices of the type of fruit drinks with or without tea extracts (containing from 5 to 50% of fruit and from 0 , 01 to 1% of red, black, white, green tea extracts, etc.)
  • the most optimal matrices contain as main base apple juice and / or grape juice and the incorporation of between 90 and 900 ppm of ascorbic and between 0.3 and 0.5 citric acid provides excellent stability for the incorporation of pomegranate extract.
  • bottles with the prototypes of peach / apple drink and pineapple / plum drink were stored at 5 ⁇ 3 ° C and at 25 ⁇ 2 ° C.
  • the losses of the pomegranate extract incorporated in both fruit drinks were analyzed by determining the punicalagin content by HPLC method: After 6 months of stability test, the loss of punicalagins was less than 5% in both conditions under test:
  • EXAMPLE 9 Sensory analysis of a fruit drink / prebiotic tea extract with a pomegranate extract.
  • the Sensory Analysis was carried out, as described in example 7, of the pineapple and plum drink and the peach and apple drink with and without pomegranate extract prepared according to example 8.
  • sample containing the pomegranate extract is preferred by 7 of the 11 tasters.
  • a sample of pomegranate extract with a punicalagine content of 61.12% (w / w) obtained according to the application EP 1967079 A1 was used to prepare fruit drinks with pomegranate extract at the concentration of 624 mg ex. Pomegranate / kg of food matrix (381, 4 mg punicalagins / Kg of food matrix).
  • the fruit drink with pomegranate extract was prepared according to the following recipe:
  • the fruit drink with pomegranate extract was pasteurized at 100 ° C for 15 seconds and aseptically packaged in glass containers at a temperature of 85-87 ° C. Glass containers containing the fruit drink prototypes with pomegranate extract were immersed in water to cool them quickly. After reaching 25 ° C, the bottles with the drink were transferred to a laminar flow hood where the probiotic bacterium Bifidobacterium lactis marketed by the Danish company Christian Hansen under the trademark BB- was added as a lyophilized product. 12.
  • the bottles were sealed again, shaken manually to achieve the dissolution of the lyophilized powder of the probiotic and stored in a cold chamber at a temperature of 5 ⁇ 3 ° C.
  • the content in CFU / g of beverage was determined by the plate count method at 0 and 30 days from the beginning of storage.
  • the main conclusions are that it is possible to stably incorporate the pomegranate extract with prebiotic properties together with a strain of probiotic bacteria in food matrices of the type of fruit drinks containing from 5 to 50% of fruit and from 0 to 9000 ppm of ascorbic acid and from 0 to 5% of citric acid.
  • the content of live probiotic bacteria after 1 month of storage of the symbiotic fruit drink was greater than 10 7 CFU / g of symbiotic drink.
  • the invention contemplates a food comprising a beverage with a content of at least 10% apple juice, combined or not with other fruit juices, with an ascorbic acid content from 0 to ppm to 9000 ppm, with a citric acid content between 0% and 5%, with a content of probiotic bacteria in a range between 10 2 to 10 10 CFU / g of composition and with a content of pomegranate extract or olive extract, between 50 ppm and 10,000 ppm
  • EXAMPLE 11 Preparation of a powdered grenade extract with improved stability by the addition of ascorbic acid and citric acid.
  • the other 10 L sample serves as a control and no ascorbic acid or citric acid is added.
  • the two samples of pomegranate extract in the form of dry powder were obtained following the drying procedure described in example 8 of the application EP 1 967 079 A1.
  • the control sample was dried without additives (rose 1) and then after cleaning the atomizer, the sample was dried with the additives (rose 2).
  • the two batches of pomegranate extract were packed in heat-sealed aluminum bags containing 10 g per bag and 5 samples of each rose. All bags were placed in a climatic incubation chamber to carry out an accelerated stability study at a temperature of 70 ⁇ 2 ° C and a humidity of 75 ⁇ 5%.
  • the stability of the pomegranate extract in samples of sublot 1 and 2 was measured at different times by determining the punicalagin content by HPLC method.
  • the 8 samples were melted in a 55 ° C water bath and the olive extract was added in the desired quantity, except for the two control samples where the legally permitted dose, 200 mg / kg was incorporated instead of olive extract , of the synthetic antioxidant terbutylhydroquinone (TBHQ). After homogenizing the samples, they got into a cold chest to make them solid.
  • TBHQ terbutylhydroquinone
  • the stability of the olive extract incorporated at the concentrations of 0.02 and 0.13% in the 2 types of margarines was measured by determining the hydroxytyrosol content by HPLC method between 0 and 6 months of the stability study at 5 + 3 ° C, finding that the variation of the hydroxytyrosol content, that is, the losses of the active ingredient, in the two margarines at the end of the 6 months of the trial was less than 5% under the conditions tested.
  • EXAMPLE 13 Inhibition of enzymes involved in the hydrolysis of carbohydrates in the digestive tract by means of a pomegranate extract.
  • 1967079 A1 was used to study the in vitro inhibition of the alpha-amylase and alpha-glucosidase enzymes.
  • the enzymes tested were obtained from the following sources: pig pancreatic alpha-amylase and Saccharomices cerevisiae alpha-glucosidase (purchased from Sigma) and pig alpha-glucosidase (isolated from the small intestine of pig according to Menakshy et al. 2008) .
  • alpha-amylase and alpha-glucosidase activities were carried out according to the procedures supplied by Sigma together with the acquired enzymes. Briefly, alpha-glucosidase activity was determined spectrophotometrically at 400 nm, with p-Nitrophenyl ⁇ -D-Glucoside (PNP) as a substrate, and alpha-amylase activity was determined spectrophotometrically at 540 nm, with soluble potato starch as substrate. As a positive control, measurements were made with the acarbose inhibitor.
  • PNP p-Nitrophenyl ⁇ -D-Glucoside
  • Pomegranate Extract (650 micrograms / ml) 88.7 ⁇ 1.4 Test% Yeast alpha-glucosidase activity
  • pomegranate extract at the concentrations evaluated inhibits the alpha-amylase and alpha-glucosidase activities with respect to the control, as does the addition of acarbose.
  • a therapeutic approach to lower postprandial glucose is to delay the absorption of glucose by inhibiting enzymes involved in the hydrolysis of carbohydrates in the digestive tract, such as alpha-amylase and alpha-glucosidase.
  • Acarbose a potent alpha-glucosidase inhibitor is the active substance in medications used as a treatment for type II diabetes mellitus.
  • the pomegranate extract can delay the absorption of glucose by inhibiting enzymes involved in the hydrolysis of carbohydrates in the digestive tract and therefore decrease postprandial glucose and therefore be useful for the treatment, co-treatment or prevention of type II diabetes mellitus.
  • pomegranate extract can be useful for the treatment, co-treatment or prevention of obesity through the decrease in energy efficiency of carbohydrate-rich foods.
  • EXAMPLE 14 Activation of paraoxonase 1 and Inhibition of hydroxymethylglutaryl-CoA reductase by a pomegranate extract.
  • HMGR 3- hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase
  • PON 1 Paraoxonase 1
  • the addition of the pomegranate extract at the concentrations evaluated inhibits the HMGR activity and activates the PON 1 activity.
  • HMGR endogenous cholesterol biosynthesis by inhibiting the key enzyme of the biosynthetic pathway, HMGR.
  • numerous medications to treat hypercholesterolemia have been developed from statins, potent HMGR inhibitors.
  • statins potent HMGR inhibitors.
  • the combination of pomegranate extract with dietary fiber can not only reduce hypercholesterolemia through the bioactivity of the compounds of the pomegranate extract, but that the food fiber, (eg: soluble fiber) when undergoing fermentation in the intestine increases the production of short-chain fatty acids such as propionate. Propionate is absorbed in the colon through the portal vein and has been shown to inhibit HMGR.
  • statins increase serum PON 1 activity
  • the same protein as pomegranate extract is an activator.
  • PON 1 protects lipids in lipoproteins (eg in HDL), and in macrophages against oxidative stress caused by oxidation.
  • PON 1 has other antiatherogenic properties, such as reducing the formation of macrophage cell foams, which are involved in the progression of atherosclerotic lesions.
  • the pomegranate extract can act as an HMGR inhibitor and activator of PON 1 and therefore be useful for treatment, co-treatment or prevention of hypercholesterolemia.
  • pomegranate extract can be useful for the treatment, co-treatment or prevention of the formation of an atheroma plaque in the middle and intimate layer of the arteries through mechanisms such as the activation of PON 1 among others.
  • EXAMPLE 15 Effect of a pomegranate extract on the bioavailability of the bioactive components of a broccoli extract in a human intervention study: changes in the urinary excretion of total isothiocyanates including dithiocarbamates.
  • a commercial sample of broccoli seeds of the Calabfese variety was acquired, 120 g of the seeds were taken and added on boiling water, approx. 20 volumes of water with respect to the weight of the seeds, and they were boiled for 30 minutes. Then, the seeds were homogenized in the cooking water with an ultra-turrax model T25 and at the end of the homogenization treatment the homogenate was again boiled keeping it at 100 ° C for another 10 minutes. Next, the thick solids were separated by filtration of the extract and finally the extract was clarified by centrifugation, reserving the supernatant, approximately 460 ml, containing 2.17 mg of glucorapanin / mL.
  • the extract was fractionated into 23 ml aliquots in sterile falcon tubes and frozen at -20 ° C until consumption. Each 23 ml fraction contained approximately 50 mg of glucorapanin, according to the analyzes performed by HPLC determination of this analyte.
  • the human intervention study was carried out in parallel to the intervention study of the prebiotic effect of a pomegranate extract described in Example 4. As already detailed, 6 healthy individuals took 1 daily capsule of pomegranate extract at mealtime. , which means 575 mg of extract.
  • prebiotic capacity such as fructooligosaccharides, inuiine, etc.
  • antibiotics such as antibiotics, laxatives and especially products with prebiotics (e.g., unpasteurized yogurts, fermented milk drinks, etc).
  • prebiotic capacity such as fructooligosaccharides, inuiine, etc.
  • antibiotics e.g., laxatives
  • products with prebiotics e.g., unpasteurized yogurts, fermented milk drinks, etc.
  • Urine samples were analyzed by HPLC after derivatization of total isothiocyanates according to the cyclocondensation method with 1,3-benzodithiol-2-thione (Kristensen et al., 2007), for the determination of urinary excretion of the Total isothiocyanates (ITCs) (which include free isothiocyanates and conjugated forms of isothiocyanates with the N-acetylcysteine (called dithiocarbamates, DTCs) of each individual within 24 hours of ingesting a broccoli extract.
  • ITCs Total isothiocyanates
  • DTCs dithiocarbamates
  • a prebiotic such as pomegranate extract, or a symbiotic can improve the transformation into isothiocyanates of glucosinolates of a plant extract in the human colon, thus improving the bioavailability of isothiocyanates , by stimulating the microflora of the colon.
  • EXAMPLE 16 Preparation of a powder extract from broccoli sprouts.
  • the thick solids were separated by filtration of the extract and finally the extract was clarified by centrifugation, reserving the supernatant that was approximately 5500 ml_. Then, the extract was concentrated by rotaevaporation to obtain a concentrated extract of approx. 300 mL containing 3.12 mg of glucorapanin / mL. Finally, 60 g of dietary fiber were dissolved in the extract and the product was dried in an atomizer. For this, a peristaltic pump was used to feed the previously balanced atomizer with an intake air temperature of 150 ° C. The feed rate was adjusted to obtain an outlet air temperature of less than 90 ° C. 51.8 g of powder are obtained with a humidity of 6.72% (thermobalance at 110 ° C to constant weight), and a glucorapanin richness of 1.69%.
  • EXAMPLE 17 Preparation of functional foods, rich in edible vegetables as nutritional components, by incorporating a broccoli extract and a dietary fiber and assessing the stability of glucorapanin in the food matrix.
  • 3 matrices were prepared adjusting to 100 mg of glucorapanin per L of food matrix.
  • the extract was specifically added to 0 (control), and 0.6% (functionalized matrices).
  • the dietary fiber that was used for drying the extract means that by adding 0.6% of the extract we are also adding 5.4 g of dietary fiber per L of the food matrix. 6 product samples were prepared each of approximately 1 kg of total weight.
  • the matrices used for the trial were:
  • the 6 prototypes were pasteurized at 100 ° C for 15 seconds and aseptically packaged in glass containers at a temperature of 85-87 ° C.
  • the 6 glass containers containing the prototypes were immersed in water to cool them quickly and then.
  • samples corresponding to the 3 products were opened to evaluate the losses of the broccoli extract incorporated in the food matrices by determining the glucorapanin content measured by HPLC method.
  • mice were fed for 30 days with commercial feed and with a daily dose of 12.8 mg of pomegranate extract per mouse (equivalent to a daily intake of 320 mg ext. Pomegranate / kg mass body) (group 2), or with a daily dose of 0.9 mg of olive extract per mouse (equivalent to a daily intake of 22.9 mg ext. olive / Kg body mass) (group 3) or without pomegranate extract (group, control).
  • group 2 a daily dose of pomegranate extract per mouse
  • group 3 0.9 mg of olive extract per mouse
  • group were sacrificed and the liver was extracted from each and stored at -80 ° C.
  • a pool was made with a fragment of the same liver weight of each of the mice in each group. RNA was isolated from it, which was subjected to rigorous quality controls prior to testing.
  • Differential gene expression analysis was performed using microarrays. Specifically, GeneChip ® Mouse Genome 430 2.0 Array (Affymetrix) chips were used, which allows the analysis of the expression of approximately 14,000 genes described in mice. The chips showed intensity data dependent on the amount of messenger RNA of each gene in the form of Log 2 . From them, by differential signal between each group with respect to the control, the differential gene expression is calculated due to the treatment with a pomegranate extract and the treatment with an olive extract.
  • EXAMPLE 19 Properties of pomegranate extract and olive extract, in the modulation of the immune system, helping to strengthen the body's natural defenses.
  • IL7 is produced by epithelial cells of the intestine and is essential for the proliferation of T lymphocytes and for the organization of lymphoid tissue associated with the mucosa.
  • the IL7 receptors are found on the surface of the intraepithelial lymphocytes of the intestine. IL7 and its receptor are involved in the regulation of the immune response in the intestinal mucosa.
  • the essential role of IL7R in the formation of Peyer's plaques has been demonstrated, where the immune response of the intestine is mainly initiated.
  • the product of the Dmbtl gene is a membrane glycoprotein that contains multiple SRCR (multiple cysteine-rich receptor scavenger) domains involved in the recognition of a wide range of pathogenic bacteria. It has been demonstrated in vitro a binding to Salmonella enteric serotype Typhimurium and subsequent bacterial aggregation, it reduces the invasion of epithelial cells. In addition, this glycoprotein interacts with at least two different types of viruses, HIV and influenza A, resulting in an inhibition of viral infection in vitro. The protein also interacts with several molecules involved in immunity, such as SP-D, IgA and C1q. Therefore, the Dmbtl gene product has a very important function in innate immunity.
  • SRCR multiple cysteine-rich receptor scavenger
  • the Tff2 gene product belongs to a family of small proteins (TFF) that are produced mainly in the gastrointestinal tract and that are involved. in the protection and repair of the mucosa, maintaining the integrity of the gastrointestinal tract.
  • TfF small proteins
  • Dmbtl gene could be a receptor of the product of the 77/2 gene.
  • the activation of the expression of both genes acts synergistically in the protection of the gastrointestinal mucosa.
  • the product of the Cyp39a1 gene is an oxystole 7 ⁇ -hydroxylase enzyme that participates in cholesterol metabolism. Specifically, the enzyme catalyzes the passage of 24S-hydroxycholesterol to 7a, 24-dihydroxycholesterol, within the path of conversion of cholesterol into bile acids in the liver. Bile acids give the intestinal mucosa protection against bacteria. In the distal intestine the antibacterial capacity of bile acids is due to the activation of the FXR receptor (Farnesoid X Receptor), which induces the expression of genes whose products prevent bacterial growth and promote the integrity of the gastrointestinal epithelium.
  • FXR receptor Fearnesoid X Receptor
  • the product of the Scara5 gene is a protein that belongs to the family of scavenger-like receptors, which are involved in innate immunity related to the recognition of pathogens, since their ability to bind to a wide variety of these has been demonstrated.
  • the Scara5 gene is expressed in epithelial cells and also has the ability to bind to pathogens.
  • the product of the Cfd gene is a serine protease (complement factor D) that participates in the activation of the complement system, specifically in the alternative route, involved in the recognition and elimination of pathogens.
  • complement factor D serine protease
  • the D factor of complement participates in the formation of the C3bBb complex (C3 convertase of the alternative pathway).
  • C3 convertase is involved in the opsonization of pathogenic microorganisms and in the neutralization of viruses.
  • the product of the C7 gene is a glycoprotein (complement factor C7) involved in the activation of the classical pathway of the complement system.
  • C7 protein deficiency causes abnormalities in processes such as neutrophil chemotaxis, phagocytosis and opsonization.
  • EXAMPLE 20 Properties of pomegranate extract and olive extract, in the regulation of lipid metabolism.
  • the product of the Cyp39a1 gene is an oxystole 7 ⁇ -hydroxylase enzyme that participates in cholesterol metabolism. Specifically, the enzyme catalyzes the passage of 24S-hydroxycholesterol to 7a, 24-dihydroxycholesterol, within the path of conversion of cholesterol into bile acids in the liver.
  • the mRNA of this enzyme is constitutively expressed in the liver. Biosynthesis of bile acids is the most important way to eliminate excess cholesterol in mammals.
  • the product of the serpinel gene is called a plasminogen activator inhibitor type 1 (PAI-1). It has been shown that a diet high in cholesterol in mice causes activation of serpinel expression in the liver. Plasma PAI-1 levels in humans with hypercholesterolemia are high and statins have been shown to inhibit serpinel gene expression in human endothelial cells.
  • Statins are HMG CoA reductase enzyme inhibitor drugs indicated to lower cholesterol levels in patients with hypercholesterolemia.
  • An inhibitor of intestinal absorption of dietary cholesterol (ezetimibe), also indicated in hypercholesterolemia, represses the expression of the serpinel gene in aorta and adipose tissue of mice.
  • the product of the Cyp17a1 gene is an enzyme involved in the biosynthesis of steroid hormones from cholesterol. Specifically, the enzyme catalyzes the 17a-hydroxylation of the C21 steroids, pregnolone and progesterone, and the subsequent processing (17.20 lyase) to obtain the C19 steroids of dehydroepiandrosterone and androstenedione, respectively. Low levels of Cyp17a1 have been related to hypertension.
  • the product of the Mt4 gene is a cytoplasmic protein that binds minerals such as copper and zinc.
  • Metallothioneins are involved in homeostasis of Zn and Cu and their detoxification when they reach high concentrations
  • EXAMPLE 22 Properties of pomegranate extract and olive extract, in the treatment, co-treatment and prevention of different cancer processes / diseases.
  • mice of example 18 that took a pomegranate extract there was repression of the un, myc and fos oncogenes with respect to the control group of 3.04, 3.27 and 6.43 times, respectively.
  • Jun and fos products are transcription factors that dimerize to form the transcription complex called AP-1 (Activating Protein-).
  • AP-1 is a transcription factor that regulates the expression of genes induced by growth factors and tumor promoters. Overexpression of the jun and / or fos oncogenes is associated with several types of cancer, such as breast, ovarian, colon, osteosarcoma, cervical, lung and bladder cancer. Therefore, AP-1 is used as a target for the chemotherapeutic treatment of cancer.
  • the product of the oncogen myc is a protein that regulates the expression of the transcription factor E2F and the phosphatase responsible for the activation of the Cdc cyclins, which are involved in the regulation of the cell cycle.
  • the myc oncogene is overexpressed in numerous human cancers, such as pancreatic, cervical, breast and colon cancer.
  • the myc oncogene product is also used as a target for cancer treatment.
  • the Adamtsl gene product is a protein that has a metalloproteinase domain and a disintegrated domain. This protein is involved in inflammatory processes and in the development of cancerous cachexia, according to tests with animal models in colon cancer. Overexpression of the Adamtsl gene has been demonstrated in breast cancer with high metastatic activity. It has been speculated that overexpression of this gene could promote tumor growth by recruiting fibroblasts.
  • the product of the ATF3 gene is a transcription factor that is expressed in conditions of stress and DNA damage in various tissues. Overexpression of the ATF3 gene has been described in various breast tumors. This protein is used as a marker of prostate cancer since its involvement in the development of this type of cancer has been proven and is, therefore, a possible therapeutic target.
  • the product of the Dmbtl gene is a membrane glycoprotein with a receptor function with SRCR-like domains (domains rich in scavenger-type cysteine) whose lack of function was associated with breast cancer. In addition, it is considered a suppressor gene for colon, digestive and lung tumors.
  • the product of the Tff2 gene belongs to a family of small proteins (TFF) that are produced mainly in the gastrointestinal tract and that are involved in the protection and repair of the mucosa, maintaining the integrity of the gastrointestinal tract.
  • Tff2 gene A repression in the expression of the Tff2 gene is associated with the proliferation of digestive cancer.
  • the product of the Nuprl gene is a nuclear protein (NURP1 or p8) that participates in various biological processes by regulating transcription. It has been shown in vitro that overexpression of this protein reduces the growth of prostate cancer cells. Therefore, the p8 protein has been described as a suppressor of prostate tumors.
  • a high overexpression of the Nurpl gene mediated by the action of 1,225-dihydroxyvitamin D3, a potent inhibitor of breast cancer cells in vivo and in vitro has been demonstrated, which implies a participation of the p8 protein in the mechanism of inhibition.
  • the FAM107A gene product is a nuclear protein called TU3A involved in the regulation of the cell cycle. It was identified as a tumor suppressor protein in kidney cancer. Repression of FAM107A gene expression has been demonstrated in various types of cancer, such as prostate cancer. In the group of mice of example 18 that took a pomegranate extract there was activation in the expression of the Ddit4 gene (DNA-damage-inducible transcrippt 4) with respect to the control group of 2.92 times.
  • the product of the Ddit4 gene is a protein called RTP801 or Reddl, which inhibits the mTOR / S6K1 pathway, involved in cell proliferation.
  • the inhibitors of the mentioned route are being evaluated as cancer therapy. In mice it has been described that the deficiency in the Ddt ⁇ 4 gene promotes tumor growth, while in humans it has been described repression of the gene in several types of cancer.
  • the product of the Egr1 gene is a transcription factor involved in various cellular processes and its involvement in the growth and survival of prostate cancer cells has been demonstrated. In animal models of prostate cancer it has been shown that the lack of the Egr1 gene retards tumor growth.
  • the Sox9 gene produces a protein that acts as a transcription factor with DNA binding domains type HMG (High Mobility Group).
  • HMG High Mobility Group
  • mice of example 18 that took a pomegranate extract, repression occurred in the expression of the 1 alpha interleukin gene (IL1á) with respect to the 2.97-fold control group.
  • IL1á 1 alpha interleukin gene
  • IL1a is a cytokine involved in inflammation processes.
  • the IL1a gene is overexpressed in various types of cancer, such as lung, colon and melanoma cancer.
  • colon cancer IL1 stimulates cell migration and angiogenesis and its expression is induced by prostaglandin E2.
  • IL1a gene In a human test, it was demonstrated that in the intestinal mucosa there is repression in the expression of the IL1a gene after infusion of the membrane with a strain of Lactobacillus.
  • the products of the Gadd45b and Gadd45g genes are proteins related to cell cycle control. In models of mice with melanoma it has been shown that the lack of function of Gadd45b produces greater tumor growth. The product of this gene is necessary for the activation of p38 kinase. The p38 protein is involved in tumor suppression. The expression of the Gadd45b and Gadd45g genes is repressed in various types of cancer.
  • EXAMPLE 23 Properties of pomegranate extract and olive extract, in the treatment, co-treatment and prevention of colon cancer.
  • mice of example 18 that took a pomegranate extract there was repression of the un, myc and fos oncogenes with respect to the control group of 3.04, 3.27 and 6.43 times, respectively.
  • Jun and fos products are transcription factors that dimerize to form the transcription complex called AP-1 (Activating Prote / n-1).
  • AP-1 is a transcription factor that regulates the expression of genes induced by growth factors and tumor promoters. Overexpression of the jun and / or fos oncogenes is associated with colon cancer.
  • the product of the myc oncogene is a protein that regulates the expression of the transcription factor E2F and the phosphatase responsible for the activation of the Cdc cyclins, which are involved in the regulation of the cell cycle.
  • the myc oncogene is overexpressed in colon cancer. Both AP-1 and the myc oncogene product are also used as a target for cancer treatment.
  • the Fam84A gene product is a protein known as NSE1 (neurologic sensory protein 1) that is located in the subcellular membrane and is involved in cellular mobility. The expression of this gene is activated in colon cancer.
  • NSE1 neurologic sensory protein 1
  • the NSE1 protein could be involved in the mobility of colon cancer cells and therefore participate in the progression of this type of cancer.
  • the Adamtsl gene product is a protein that has a metalloproteinase domain and a disintegrated domain. This protein is involved in inflammatory processes and in the development of cancerous cachexia, according to tests with animal models in colon cancer.
  • the product of the Dmbtl gene is a membrane glycoprotein with receptor function with SRCR-like domains (scavenger-like cysteine-rich domains). This protein is considered a colon tumor suppressor gene.
  • the Sox9 gene produces a protein that acts as a transcription factor with DNA binding domains like HMG ⁇ High Mobility Group). Overexpression of the Sox9 gene has been demonstrated in various colon cancer cell lines.
  • mice of example 18 that took a pomegranate extract, repression occurred in the expression of the 1 alpha interleukin gene (IL1á) with respect to the 2.97-fold control group.
  • IL1á 1 alpha interleukin gene
  • IL1a is a cytokine involved in inflammation processes.
  • the IL1ct gene is overexpressed colon cancer.
  • colon cancer IL1a stimulates cell migration and angiogenesis and its expression is induced by prostaglandin E2.
  • EXAMPLE 24 Properties of pomegranate extract and olive extract, in the treatment of obesity and diabetes mellitus.
  • PAI-1 plasminogen activator inhibitor type 1
  • type 1 and type 2 diabetes high plasma levels of the PAI-1 protein have been observed, more pronounced in the case of type 2 diabetes.
  • the high levels in this type of diabetes are due to the direct effect of glucose in the synthesis.
  • PAI-1 in the arteries and the effect of insulin on the synthesis of PAI-1 in the liver.
  • the PAI-1 protein inhibits the insulin signal through its binding and stabilization with vitronectin.
  • Thiazolidinedones or glitazones are agonist drugs of the PPAR- ⁇ receptor indicated in type 2 diabetes, and cause a decrease in PAI-1 levels.
  • the product of the ppargda gene is a transcriptional factor that participates in the regulation of genes involved in energy metabolism, by activating the PPAR- ⁇ receptor.
  • This hormonal receptor has an important role in the regulation of carbohydrate and lipid metabolism, by increasing insulin sensitivity.
  • PPAR- ⁇ receptor agonist substances are being used as drugs for the treatment of type 2 diabetes. These include thiazolidinediones. As pharmacological activators of the PPARy receptor, thiazolidinediones exert an important metabolic effect by improving glycidic metabolism (lower production and higher glucose clearance) and decreasing insulin resistance associated with obesity, metabolic syndrome and type 2 diabetes mellitus. In addition, these drugs have effects significant on plasma lipids, being useful in the treatment of dyslipidemia. Hydroxytyrosol has been shown to cause an activation of the ppargda gene in adipocytes. Gene expression of this receptor is repressed in mice with type 1 diabetes.
  • the product of the adipoq gene is a cytokine (adiponectin) synthesized primarily in adipose tissue and abundant in plasma. In animal and human models, a low level of plasma adiponectin has been demonstrated in cases of diabetes. Plasma levels of this cytokine are increased with the treatment of diabetes with thiazolidinediones.
  • Adiponectin is also related to obesity. In obese mice a repression of the adipoq gene has been described. In humans, plasma adiponectin levels are lower in patients with obesity. The levels of this cytokine in women are inversely related to the body mass index.
  • adiponectin or substances that stimulate its production, could be used for the treatment of type 2 diabetes and obesity.
  • the product of the Lpinl gene is a protein of the lipin family that was described in mice whose lack of function produced lipodystrophy. This protein participates in adipogenesis and triglyceride metabolism. It also participates, together with the product of the ppargda gene, in the transcriptional activation in liver of the PPAR- ⁇ receptor. Lpinl gene levels in adipose tissue are inversely related to insulin resistance. In this tissue, an increase in the expression of the Lpinl gene has been demonstrated after treatment with thiazolidinediones, drugs whose mechanism of action is the increase in insulin sensitivity.
  • the product of the lepr gene is the leptin receptor, which is a hormone involved in the regulation of metabolism.
  • Leptin is involved in the regulation of adipose tissue, acting at the level of the central nervous system, where it seems to decrease food intake and increase energy expenditure.
  • Trials developed in mice that did not produce leptin or its receptor were shown to develop obesity. In the case of obese mice that did not produce leptin, a treatment with this hormone was successfully performed. After this treatment, an increase in the expression of the leptin receptor gene in the liver was observed. Therefore, the liver seems to have an important role in the regulation of circulating leptin levels.
  • EXAMPLE 25 Differential gene expression by quantitative RT-PCR
  • Examples 19 to 24 of differential gene expression derived from the results of the microarrays were confirmed by calculation of the differential gene expression by quantitative RT-PCR. From the same RNA isolated from the liver of the mice, an RT-PCR reaction was performed with SYBR Green. Relative quantification was performed using as a mouse GAPDH reference gene, constitutive expression. The method used for relative quantification was that described by Pfaffl, 2001.
  • EXAMPLE 26 Characterization of the elagitannins of a pomegranate extract by
  • HPLC-DAD and mass spectrometry detectors In order to deepen the characterization of the elagitannins present in the pomegranate extracts, the extracts were sub-fractionated, for a subsequent analysis of each of the fractions of interest in order to detect the maximum possible compounds.
  • HPLC liquid chromatography

Abstract

La presente invención reivindica el uso de extractos vegetales de olivo (Olea europaea L.) y granado (Punica granatum) y de diversas combinaciones de dichos extractos, algunas adicionalmente incluyendo un probiótico, que posibilitan un efecto sinérgico entre los componentes bioactivos de los mismos, para la preparación de suplementos dietarios, alimentos/bebidas funcionales, aditivos alimentarios y medicamentos para su uso en el cuidado de la salud humana.

Description

USO DE EXTRACTOS VEGETALES COMO PREBIÓTICOS. COMPOSICIONES Y
ALIMENTOS QUE LOS CONTIENEN
Campo de la invención
La presente invención reivindica el uso de extractos vegetales y de diversas combinaciones de dichos extractos, algunas adicionalmente incluyendo un probiótico, que posibilitan un efecto sinérgico entre los componentes bioactivos de los mismos, para la preparación de suplementos dietarios, alimentos/bebidas funcionales, aditivos alimentarios y medicamentos para su uso en el cuidado de la salud humana.
Más concretamente, la invención describe el uso de un extracto de oliva estandarizado a hidroxitirosol (MEDITEANOX®) y de un extracto de granada estandarizado a punicalaginas (POMANOX®) como ingredientes prebióticos. Dentro del alcance reivindicado se describe también el uso de los extractos de granada y oliva mencionados con propiedades prebióticas en combinación con un probiótico para la producción de un simbiótico (se define como aquel alimento que contiene una mezcla específica de bacterias probióticas y sustancias prebióticas). Además, la invención describe las combinaciones de los extractos de granada y/o oliva con efecto prebiotico o bien de otros prebióticos o de una fibra dietariá con un extracto vegetal conteniendo glucosinolatos, ej. un extracto de brócoli, al encontrar que una estimulación selectiva de determinadas poblaciones de la microflora del colon, ej géneros Bifidobacterium y Lactobacillus, mejora la biodisponibilidad en nuestro organismo de isotiocianatos formados en el colon a partir de sus precursores, los glucosinolatos.
Se ha de hacer constar que cuando en esta invención se hace referencia al uso de un alimento, se entiende comprendido en esta acepción igualmente un suplemento dietario, un alimento funcional, un aditivo alimentario o un medicamento.
Antecedentes de la invención
El tracto digestivo de un adulto contiene una flora compuesta aproximadamente por 1014 microorganismos, cón alrededor de 400-500 especies bacterianas distintas. La población dominante se compone de bacterias anaerobias estrictas: Bacteroides, Bifidobacterium, Eubacterium y Peptostreptococcus. La flora subdominante comprende bacterias que pertenecen a los géneros Streptococcus y Lactobacillus, y en menor medida, Enterococcus, Clostridium y levaduras. La mayoría de estas especies tiene un papel beneficioso, pero otras son potencialmente patógenas, como algunas especies de Clostrídium, aunque su reducido número y competencia con otras bacterias impiden su proliferación y su acción patógena.
La flora gastrointestinal realiza en el organismo diversas funciones. Su importancia es principalmente defensiva, ya que previene la colonización por microorganismos patógenos y modula el sistema inmune mediante la inducción de tolerancia y la producción de inmunoestimulantes no inflamatorios. Por otra parte, el metabolismo de la flora supone una importante fuente de energía para la pared intestinal debido a la fermentación de carbohidratos a ácidos orgánicos, además produce la síntesis de algunas vitaminas, como K y algunas B. No menos importante, es el papel que ejercen los microorganismos en la regulación del tránsito intestinal.
La estabilidad de la flora gastrointestinal depende de diversos parámetros: fisiológicos, como la edad, la menopausia y las situaciones de estrés; ciertas enfermedades, en especial diarrea, colitis y enfermedad de Crohn y el consumo de fármacos, en especial los antibióticos; y nutricionales. En este último aspecto es donde entra en juego el consumo de probióticos, prebióticos y simbióticos.
Los probióticos son microorganismos no patógenos que, cuando se ingieren, ejercen una influencia positiva sobre la salud o fisiología del huésped. Las preparaciones comerciales de probióticos están formadas principalmente por bacterias de los géneros Bifidobacterium y/o Lactobacillus.
Un prebiótico se define como un ingrediente alimenticio no digerible que tiene el potencial de mejorar la salud del huésped, por estimular selectivamente el crecimiento y/o actividad de una o un número limitado de bacterias en el colon (Gibson y col., 2004). Para que un ingrediente sea considerado como prebiótico debe cumplir tres requisitos (Collins y Gibson, 1999): i) que no sea absorbido ni hidrolizado en el estómago; ii) que sea un sustrato selectivo para una o un limitado número de bacterias potencialmente beneficiosas en el colón, estimulando el crecimiento y/o la actividad metabólica de la/s misma/s; iii) que como consecuencia de las anteriores, sea capaz de alterar la composición de la flora intestinal hacia una composición más rica en bacterias beneficiosas.
Un simbiótico se define como aquel alimento que contiene una mezcla específica de bacterias probióticas y sustancias prebióticas.
Diversas sustancias han demostrado su actividad como prebióticos, entre las que destacan la inulina y los fructooligosacáridos (FOS). Estos afectan significativamente la composición de la flora intestinal, reducen la incidencia de infecciones gastrointestinales, respiratorias y de la dermatitis atópica y además producen un aumento de la población de Bifidobacterium en el colon. Otros oligo y polisacáridos pueden actuar como prebióticos.
Existe una amplia bibliografía que define los efectos beneficiosos para la salud del consumo de ingredientes prebióticos (véase revisión de Venter, 2007), en ensayos desarrollados \n vitro, así como in vivo con modelos animales y en humanos. La investigación ha derivado en la identificación de marcadores biológicos capaces de demostrar los efectos de los prebióticos. Estos marcadores son: i) cambios en la flora gastrointestinal y en el metabolismo global del ambiente gástrico, destacando la producción de ácidos orgánicos; ii) modulación del sistema inmune, valorando procesos inflamatorios e inmunoglobulinas; iii) incremento de la absorción de minerales en el colón, como calcio, zinc o magnesio; iv) regulación del metabolismo lípídico, disminuyendo el nivel de colesterol; v) prevención de cáncer de colón. Éste último punto ha despertado enorme interés en los últimos años y diversas publicaciones demuestran el efecto preventivo de los prebióticos en este cáncer (véanse las revisiones de Pool- Zoobel, 2005 y Liong, 2008).
En ocasiones parte del efecto puede producirse a nivel del propio intestino, pero esto no implica que el efecto no pueda transmitirse a otros órganos diana del organismo humano. Como ejemplo, la fibra alimentaria, (Ej: fibra soluble) puede actuar secuestrando ácidos biliares en el propio intestino, lo que lleva a que no puedan ser reabsorbidos y en consecuencia el hígado responde utilizando el colesterol endógeno para sintetizar más ácidos grasos biliares in enviarlos al intestino. Pero un segundo mecanismo de acción implica que cuando la fibra soluble sufre fermentación en el intestino incrementa la producción de ácidos grasos de cadena corta como el propionato. El propionato es absorbido en el colon a través de la vena portal y se ha demostrado que inhibe a la HMGR en el hígado.
La aplicación ES 2 198 126 T3 describe el uso del carbohidrato D-tagatosa como componente alimenticio prebiótico. Su consumo induce la producción de butirato en el colón, lo que posiblemente tenga un efecto protector frente al cáncer de colón.
La aplicación ES 2 278 021 T3 describe el empleo de una composición que comprende un prebiótico para disminuir el proceso inflamatorio y activación anormal de parámetros inmunológicos no específicos. El prebiótico comprende un oligosacárido producido a partir de glucosa, galactosa, xilosa, maltosa, sucrosa, lactosa, almidón, xilano, hemicelulosa, inulina, goma (por ejemplo goma acacia) o una mezcla de los mismos.
La aplicación ES 2 320 988 T3 describe un método para prevenir o aliviar los síntomas de malabsorción a través del tracto gastrointestinal mediante la administración de un prebiótico que puede ser inulina, inulina modificada, inulina hidrolizada, fructo- oligosacáridos, galactomanano y sus hidrolizados, arabinogalactano y sus hidrolizados, trans-galacto-oligosacáridos, ramnosa, pectina e hidrolizados de pectina, almidón resistente e hidrolizados del mismo, dextrina indigerible e hidrolizados de la misma, polidextrosa indigerible, beta-glucano e hidrolizados del mismo, y combinaciones de estos oligo y polisacáridos.
La aplicación WO 02/091833 describe una composición farmacéutica que comprende un prebiótico, un prebiótico y un microorganismo con estabilidad a pH alcalino y elevada actividad ureasa. El prebiótico descrito es oligosacárido, inulina, lactulosa y otras fibras vegetales.
La aplicación US 2009/0022849 A1 describe el efecto prebiótico de la fruta roja y zumos de fruta roja, como grosella, arándano y granada, y su uso para promover el crecimiento de bacterias beneficiosas de la flora gastrointestinal, como Bifidobacterium y Lactobacillus, así como inhibir el crecimiento de bacterias nocivas de la flora gastrointestinal, como Clostridium y Bacteroides. No obstante los autores no indican cuáles son los compuestos presentes en las frutas rojas y en sus zumos que les proporcionan las propiedades para promover el crecimiento de bacterias beneficiosas e inhibir el crecimiento de bacterias nocivas, ni por tanto proponen la estandarización de los zumos a los compuestos capaces de promover dichos efectos.
Se ha descrito que los elagitaninos, entre los que se encuentran las punicalaginas, y el ácido elágico, que puede ser liberado por la hidrólisis de las punicalaginas, son metabolizados en parte por la microbiota del colon en humanos. Como resultado de su metabolismo por la microbiota del colon se producen una serie de compuestos que químicamente son dibenzopiranonas de las cuales las de mayor significancia in vivo son las conocidas como urolitinas A y B.
Sin embargo, se desconoce por completo que microorganismos de la microbiota son responsables de la producción de urolitinas y sin duda es de gran interés su identificación y uso como probióticos para potenciar la producción de urolitinas en vista de que se ha descrito el efecto de las urolitinas en la quimioprevención del cáncer.
En el contexto de la quimioprevención, entendido como el uso de medicamentos, u otras sustancias para tratar de reducir el riesgo de cáncer, retardarlo o evitar que retorne, la patente US5411986 describe que los isotiocianatos tales como el sulforafano, que fue aislado por los autores a partir del brócoli, un potente inductor de las principales enzimas de la fase II de la detoxificación hepática, pueden ser usados en el campo de la oncología por sus propiedades quimiopreventivas. La patente US5725895 describe un método para preparar alimentos ricos en glucosinolatos y/o isotiocianatos a partir de semillas de cruciferas y los germinados obtenidos a partir de las mismas.
Las cruciferas y destacadamente el brócoli contienen un elevado contenido en glucosinolatos (químicamente son tioglucósidos) y están acompañados en estos vegetales de la enzima mirosinasa (presenta actividad tioglucosidasa). Cuando el vegetal se corta o se mastica la enzima de la planta cataliza la conversión de los diferentes glucosinolatos en sus correspondientes agliconas que son denominadas isotiocianatos y son productos bioactivos. Así por ejemplo, la glucorapanína es hidrolizada por la mirosinasa para formar el sulforafano. No obstante, durante la hidrólisis de los glucosinolatos por la mirosinasa de las plantas se forman también nítrilos, epitionitrilos y ciano-epitioalkanos. Son las proteínas denominadas ESP (epithioespecifier proteins) las responsables de la formación de estos nítrilos y epitionitrilos. Estos compuestos son inactivos para la químioprevencíón del cáncer o incluso poco saludables para los humanos. Las proteínas ESP requieren Fe para su actividad y se desnaturalizan con el calor, por ejemplo al cocinar las verduras ricas en glucosinolatos.
En general consumimos los vegetales de la familia de las cruciferas tras su procesamiento. La mirosinasa y las ESP se desnaturalizan por el calor que se aplica al cocinar estos alimentos lo cual tiene importantes implicaciones para la biodisponibilidad de los isotiocianatos. Cuando se consumen en crudo estos vegetales, la propia mirosinasa del vegetal produce una rápida hidrólisis de los glucosinolatos y la liberación de los isotiocianatos tiene lugar en la parte superior del aparato digestivo. En esta situación los isotiocianatos son absorbidos y se excretan rápidamente como conjugados en la orina. El consumo de estos vegetales tras cocinarlos con aplicación de calor y desnaturalizarse la mirosinasa, permite que los glucosinolatos lleguen intactos hasta el colon, donde pueden sufrir hidrólisis por la microbiota del colon liberando los isotiocianatos en el propio colon. El sitio del tracto digestivo donde se hidrolizan los glucosinolatos y el sitio donde se absorben los isotiocianatos tienen implicaciones para las propiedades de protección contra el cáncer que se asocian a los vegetales ricos en glucosinolatos.
Algunos géneros de la microbiota del colon en humanos (ej. Bifidobacterium, Lactobacillus y Bacteroides) poseen una actividad similar a la mirosinasa. Incubación in vitro de heces humanas con un alimento conteniendo glucosinolatos cocinado para desnaturalizar por completo a la mirosinasa da lugar a la aparición de isotiocianatos. Así pues, determinadas bacterias del colon pueden hidrolizar los glucosinolatos consumidos en una comida con vegetales cocinados ricos en glucosinolatos y liberar los productos de hidrólisis directamente en el lumen del colon. Debido a la disponibilidad de suplementos prebióticos y probióticos y al potencial para expresar actividad similar a la mirosinasa de algunas bacterias de los géneros Lactobacillus y Bifidobacterium, una investigación sobre el efecto de la estimulación de algunas poblaciones bacterianas del colon, en el metabolismo de los glucosinolatos en humanos es de extraordinario interés.
Es por ello que en la presente invención se describe las combinaciones de los extractos de granada y/o oliva con efecto prebiótico o bien de otros prebióticos o de una fibra dietaria con un extracto vegetal conteniendo glucosinolatos, ej. un extracto de brócoli, al encontrar que una estimulación selectiva de determinadas poblaciones de la microflora del colon, ej géneros Bifidobacterium y Lactobacillus, mejora la biodisponibilidad en nuestro organismo de isotiocianatos formados a partir de sus precursores, los glucosinolatos, en el colon.
Descripción de la invención
Los polifenoles de la oliva, mayoritariamente el hidroxitirosol, han demostrado unos beneficios potenciales sobre la salud en varios aspectos: prevención de enfermedades cardiovasculares, prevención de enfermedades degenerativas, disminución del riesgo de enfermedades cancerígenas, propiedades antiinflamatorias, reducción de las consecuencias producidas por el estrés oxidativo inducidas por el tabaco y protección de daños en la piel.
Las punicalaginas de la granada han demostrado unos beneficios potenciales sobre la salud en diversos aspectos: prevención de enfermedades cardiovasculares, prevención de enfermedades degenerativas, disminución del riesgo de enfermedades cancerígenas, propiedades antiinflamatorias, actividad antiparasitaria, antiviral y antimicrobiana, tratamiento de individuos con baja cantidad y/o calidad de esperma y tratamiento de disfunción eréctil.
Cabe destacar que los extractos de oliva conteniendo hidroxitirosol y los extractos de granada conteniendo punicalaginas presentan actividad antimicrobiana. Sorprendentemente, los autores han encontrado que los extractos vegetales estandarizados en cuanto al contenido de estos mismos compuestos, el hidroxitirosol y las punicalaginas, tienen la capacidad de promover específicamente el crecimiento de ciertas bacterias beneficiosas de la flora gastrointestinal en humanos, lo cual no se había demostrado hasta el momento. Mediante la presente invención se ha demostrado que un extracto de oliva rico en hidroxitirosol y un extracto de granada rico en punicalaginas, preferiblemente los obtenidos según las aplicaciones WO 2008/090460 A1 y EP 1 967 079 A1 (siendo el aplicante Probelte Pharma y ambas se incluyen aquí por referencia) respectivamente, actúan como prebióticos promoviendo el crecimiento de bacterias beneficiosas de la flora gastrointestinal e inhibiendo el crecimiento de bacterias potencialmente patógenas de la misma.
Un objeto de la presente invención es el uso como prebiótico de un extracto de granada conteniendo punicalaginas y ácido elágico libre, en el cual el contenido en punicalaginas es de al menos un 2% (p/p) y el contenido de ácido elágico libre es tal que la relación punicalaginas/ácido elágico libre (%p/p), se sitúa en el rango de 10/1 a 35/1 , y adicionalmente el contenido en fenoles totales es de al menos un 5% (p/p) (expresado como ácido gálico equivalente), y la solubilidad en agua es de al menos un 3% (p/p) (30 g extracto granada/L), teniendo en cuenta que dicho extracto de granada no es un zumo de granada tal y como se conoce en el arte previo.
La composición del extracto de granada arriba indicado es especialmente útil para su uso como prebiótico, debido a su riqueza en punicalaginas que pueden estimular selectivamente en el colon el crecimiento de bacterias de los géneros Bifidobacterium y Lactobacillus, y al bajísimo contenido que presentan de ácido elágico libre, tal que la relación punicalaginas/ácido elágico libre (%p/p), se sitúa en el rango de 10/1 a 35/1. Varios autores han descrito que entre las distintas fracciones que componen el extracto de granada, el ácido elágico es una de las moléculas que más inhibía el crecimiento microbiano. Por lo tanto, es deseable que los extractos de granada que se desarrollen para su uso como prebióticos presenten una relación punicalaginas/ácido elágico libre (%p/p), lo más alta posible.
El zumo de granada de mejor calidad disponible comercialmente contiene entre 2400-4000 mg/L de polifenoles totales (expresados como ácido gálico equivalente) de los cuales el contenido en punicalaginas está en el rango 500-2000 mg/L. El mencionado zumo presenta un grado Brix de 16 pudiéndose concentrar posteriormente unas 5 veces con lo cual en contenido en punicalaginas no alcanza nunca más de 10 g/ L (1% p/p). Respecto de la relación punicalaginas/ácido elágico libre, en los zumos de granada no superan 8/1 e incluso durante la concentración es habitual que se reduzca debido a la hidrólisis que sufren los elagitaninos complejos como las punicalaginas con la consiguiente liberación de ácido elágico en forma libre.
Otro objeto de la invención es el uso de un extracto de oliva, solo o combinado con una fibra dietética, como prebiótico, teniendo en cuenta que dicho extracto de oliva no es un aceite de oliva.
Más particularmente, un extracto de oliva preferido es aquel obtenido mediante el proceso de acuerdo a la aplicación WO 2008/090460 A1 , y que tiene un contenido en hidroxitirosol de al menos un 0.5% (p/p), y una pureza del hidroxitirosol de al menos un 40% (por HPLC a 280 nm). Este extracto está libre de disolventes orgánicos (el contenido residual de disolventes orgánicos es menor de 1ppb y preferiblemente es de 0 ppm) y sustancialmente libre de sales, y el contenido de hidroxitirosol de dicho extracto es de al menos un 0,5% (p/p) y la pureza del hidroxitirosol es de al menos un 40% (por HPLC a 280 nm). Preferiblemente el contenido en hidroxitirosol es de al menos un 10% (p/p), y más preferiblemente de al menos un 35% (p/p). y preferiblemente la pureza del hidroxitirosol es un 80% y más preferiblemente un 90% (por HPLC a 280 nm).
Otro extracto de granada preferido es aquel obtenido de acuerdo a la aplicación EP 1967079, y que tiene un contenido en punicalaginas de al menos un 5% (p/p), preferiblemente de al menos un 20% (p/p) y más preferiblemente de al menos un 30% (p/p), siendo la pureza de las punicalaginas de al menos un 55%, y un contenido de ácido elágico libre tal que la relación punicalaginas/ácido elágico libre (% w/w), se sitúa en el rango de 10/1 a 35/1 , el contenido en fenoles totales es de al menos un 10% (p/p) preferiblemente de al menos un 20% (p/p) y más preferiblemente de al menos un 50% (p/p) (expresado como ácido gálico equivalente), la solubilidad en agua es de al menos un 3% (p/p) (30 g extracto granada/L). Preferiblemente, el extracto tiene un contenido residual de disolventes orgánicos menor de 1 ppb y más preferiblemente es de 0 ppm).
Otro extracto de granada preferido en la presente invención para su uso como prebiótico es aquel obtenido de acuerdo a la aplicación EP 1967079 (donde en un escenario de la invención a partir de un extracto rico en punicalaginas se obtiene, mediante el uso de una enzima capaz de hidrolizar las punicalaginas, un extracto rico en punicalinas) caracterizado por ser un extracto de granada conteniendo al menos un 1.5% (p/p) de punicalinas, y que presenta una relación punicalinas/ácido elágico libre (% p/p), en el rango de 10/1 a 35/1.
La ausencia sustancial de incluso mínimas trazas de disolventes orgánicos tales como metanol, etanol, isopropanol que son empleados en las etapas de purificación comúnmente empleadas en el arte, resulta ser de gran importancia para el uso de los extractos arriba mencionados.
Adicionalmente, algunos de los polifenoles presentes en las olivas son responsables de su amargor, siendo los que mejor correlacionan con este atributo la oleuropeina y la forma aldehido de la oleuropeina aglicona. De este modo, el uso de extractos de oliva conteniendo oieuropeina y/o la forma aldehido de la oieuropeina aglicona puede modificar el sabor de los alimentos en los que dicho extracto es incorporado, provocando una menor aceptación por los consumidores.
El extracto de oliva rico en hidroxitirosol, obtenido según la WO 2008/090460 A1 , está virtualmente libre de oieuropeina y de la forma aldehido de la oieuropeina aglicona, siendo la suma de ambos compuestos menor de 5 ppm, debido a que no se emplea ningún disolvente orgánico, donde estás moléculas mucho más hidrofóbicas que el hidroxitirosol son más solubles, durante la obtención del extracto, y a la combinación de etapas de purificación empleadas, columnas cromatográficas, para la obtención del extracto.
Una ventaja adicional de los extractos arriba mencionados, tanto de granada como de oliva, es la purificación frente a los residuos de los compuestos fitosanitarios presentes en la materia prima, o sea en las olivas y las granadas. De este modo, sustancias poténcialmente tóxicas como insecticidas, herbicidas, fungicidas, rodenticidas, etc, como pór ejemplo: diuron, terbutilazina, simazina, α-endosulfan, y β- endosulfan pueden estar presentes en el material de partida.
Todos estos pesticidas presentan estructuras moleculares (ejemplo: el núcleo de las triazinas) capaces de interaccionar con las resinas de absorción y ser a continuación eluidas de la resina junto con el resto de componentes del extracto cuando se emplean disolventes orgánicos. De este modo los procedimientos de preparación de extractos de oliva y/o granada basados en el uso de una resina absorbente y su posterior elución con disolventes orgánicos, deben de extremar el control de calidad de la materia prima respecto de los residuos de pesticidas, pues la resina de absorción puede actuar como una trampa de estos pesticidas, concentrarlos en la resina y posteriormente eluirlos cuando un disolvente orgánico es empleado para recuperar el hidroxitirosol o las punicalaginas presentes en los extractos de oliva y de granada respectivamente.
El problema arriba mencionado fue solucionado en la preparación de un extracto de oliva rico en hidroxitirosol y un extracto de granada rico en punicalaginas obtenidos según las aplicaciones WO 2008/090460 A1 y EP 1 967 079 A1 , dado a que se seleccionaron específicamente las resinas de absorción no iónicas para que fuera posible eluir los compuestos activos de los mencionados extractos mediante el solo uso de agua o de una solución acuosa basificada y no mediante el empleo de disolventes orgánicos.
Adicionalmente, es importante considerar otro punto importante. Varios autores han encontrado que ciertos alcaloides tóxicos (ej. peletierina, isopeletierina y pseudopeletierina) pueden estar presentes, cuando se utilizaban alcoholes para la obtención de los extractos de granada, sin embargo no se detectan alcaloides cuando los extractos de granada son preparados utilizando solo agua tal y como sucede cuando el extracto de granada rico en punicalaginas es obtenido según la aplicación EP 1 967 079 A1.
El extracto de granada rico en punicalaginas, obtenido según la aplicación EP 1
967 079 A1 , está libre de alcaloides debido a que no se emplea ningún disolvente orgánico en ninguna de las etapas de producción del extracto.
En concreto, el extracto de oliva y el extracto de granada promueven el crecimiento de bacterias de los géneros Bifidobacterium y Lactobacillus e inhiben el crecimiento de bacterias de los géneros Clostridium y Bacteroides.
Sorprendentemente, los extractos de granada y de oliva pueden actuar a dosis más bajas (menos de 1 g de extracto por día) que los prebióticos clásicos (ej: inulina, FOS etc precisan entre 4-20 g día para ser efectivos) e incluso presentan menos efectos secundarios (Ej: flatulencia, sensación de hinchazón, diarrea, etc.), al tiempo que presentan una elevada especificidad, lo cual supone una ventaja adicional de las composiciones prebióticas basadas en estos extractos.
En otro escenario la presente invención se demuestra que es posible la incorporación de un extracto de oliva rico en hidroxitirosol y/o un extracto de granada rico en punicalaginas, en una matriz alimentaria para producir alimentos que actúan como prebióticos promoviendo el crecimiento de bacterias beneficiosas de la flora gastrointestinal e inhibiendo el crecimiento de bacterias potencialmente patógenas de la misma. Tal y como se describe en los correspondientes ejemplos de la invención la incorporación del extracto no altera las propiedades organolépticas del alimento, y el hidroxitirosol o las punicalaginas presentan una estabilidad adecuada en las diferentes matrices alimentarias, para lo cual en algunas matrices alimentarias se seleccionó el uso de aditivos alimentarios corrientemente utilizados como el ácido ascórbico y el ácido cítrico.
Entre las matrices alimentarias preferidas destaca una bebida refrescante de frutas, con un contenido de al menos un 12 % de zumo de uva, combinado o no con otros zumos de frutas, con un contenido de ácido ascórbico desde 0 a ppm a 9000 ppm, con un contenido de ácido cítrico entre 0 % y 5 % y con un contenido de extracto de granada, entre 50 ppm y 10000 ppm.
Ante la sorprendente mejora de la estabilidad de los componentes bioactivos del extracto de granada, como las punicalaginas, cuando este era incorporado en bebidas de frutas donde se añadía ácido ascórbico y ácido cítrico en las proporciones adecuadas comparativamente a cuando no se añadían los mencionados aditivos, se estudio como influía la adición de ácido ascórbico y ácido cítrico en la estabilidad del extracto de granada obtenido según el proceso descrito en la aplicación EP 1 967 079 A1 mejorado ahora con la adición de ácido ascórbico (entre el 0.01 % y el 5 %) y ácido cítrico (entre el 0.1 % y el 10 %) al extracto de granada en forma de líquido concentrado justo en la etapa previa a su secado en forma de polvo mediante atomización. Los resultados se describen en uno de los ejemplos posteriores y por su excepcional interés, los extractos de granada en polvo conteniendo ácido cítrico entre un 0.5 % y un 10 % (p/p) y ácido ascórbico entre un 0.05 % y un 5 % (p/p) constituyen también uno de los objetos de la presente invención.
Adicionalmente la incorporación de los extractos con propiedades prebióticas a los alimentos consigue una importantísima mejora de la estabilidad oxidativa de los mismos, lo cual lleva a los autores a revindicar el uso de los mencionados extractos para la producción de aditivos alimentarios antioxidantes con propiedades prebióticas.
En otro escenario de la presente invención se discute el uso como aditivos alimentarios del extracto de granada rico en punicalaginas y del extracto de oliva rico en hidroxitirosol como alternativa a otros aditivos alimentarios obtenidos mediante síntesis química y que se están demostrando como potencialmente perjudiciales para la salud, tales como los antioxidantes butijhidroxianisol, BHA, butilhidroxitoluol, BHT, y terbutilhidroxinona, TBHQ, o los conservantes como el ácido benzoico, los benzoatos y sus derivados, los nitratos, nitritos y sus derivados, y también para la sustitución de colorantes como tartracina y eritrosina. Tal y como se comentó previamente, los extractos de granada y de oliva presentan propiedades antioxidantes y antimicrobianas, pero además en la presente invención se demuestra su efecto prebiótico. La combinación de estás propiedades lleva a que sorprendentemente se puedan emplear como aditivos alimentarios bioactivos, de manera que podrían actuar de acuerdo a un modo bifuncional. De este modo durante la preparación y el almacenaje del alimento tendrían una primera función como aditivo alimentario de origen natural en sustitución de aditivos de síntesis química como los arriba mencionados, y una vez ingerido el alimento desarrollarían su segundo nivel de función como prebióticos con los consiguientes beneficios para la salud humana.
En otro escenario la presente invención se demuestra que es posible la incorporación de un extracto de oliva rico en hidroxitirosol o un extracto de granada rico en punicalaginas, conjuntamente con una bacteria probiótica o una mezcla de bacterias probióticas, en una matriz alimentaria para producir alimentos que actúan como simbióticos. Dentro de estos simbióticos, podemos encontrar casos en los que el prebiótico favorece selectivamente al componente prebiótico, si bien el sentido de la invención es más amplio refiriéndose también al efecto sinérgico que pueden ejercer el componente prebiótico y el componente prebiótico para conseguir su efecto beneficioso sobre la salud. Tal y como se describe en los correspondientes ejemplos de la invención la incorporación del extracto prebiótico y del probiótico no alteran la estabilidad del hidroxitirosol o de las punicalaginas cuando se almacenan en condiciones adecuadas.
El probiótico usado para la preparación del simbiótico es preferiblemente una cepa de Lactobacillus o de Bifidobacterium. Preferiblemente, se usan cepas que solo producen ácido L (+) láctico. Algunos ejemplos de las especies preferidas de Lactobacillus son Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei y Lactobacillus reuteri. Las cepas particularmente preferidas son Lactobacillus rhamnosus ATCC 53103, Lactobacillus rhamnosus CGMCC 1.3724, Lactobacillus reuteri ATCC 55730, Lactobacillus paracasei CNCM 1-2116 y Lactobacillus casei DN 114-001. ejemplos de las especies preferidas de Bifidobacterium son Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium breve y Bifidobacterium longum. Las cepas particularmente preferidas son Bifidobacterium animalis DN-173 010, Bifidobacterium lactis comercializado por la compañía danesa Christian Hansen bajo la marca comercial BB-12 y Bifidobacterium longum ATCC BAA-999 comercializada por la compañía japonesa Morinaga Milk Industry Co. Ltd. bajo la marca comercial BB536.
La preparación simbiótica de la invención debe contener entre 102 y 010 UFC de la bacteria prebiótica/g de simbiótico y entre 0,001 % y 1% del extracto de oliva rico en hidroxitirosol o del extracto de granada rico en punicalaginas.
La cepa de bacteria probiótica seleccionada puede ser cultivada de acuerdo a cualquier método adecuado, disponible en el arte previo para su incorporación a la preparación simbiótica. Alternativamente, la cepa de bacteria probiótica puede ser adquirida a un suministrador especializado como las compañías Christian Hansen y Morinaga, de manera que venga preparado de una forma adecuada para su adición al simbiótico.
De este modo la invención se refiere al uso de un extracto de oliva rico en hidroxitirosol y/o un extracto de granada rico en punicalaginas, así como de los productos producidos a partir de ellos (alimentos y bebidas enriquecidos con estos extractos, suplementos dietarios, simbióticos y aditivos alimentarios antioxidantes con propiedades prebióticas), para promover los efectos beneficiosos asociados a los ingredientes prebióticos y cambios en la flora gastrointestinal. Estos efectos beneficiosos son la regulación del tránsito intestinal, la modulación del sistema inmune, la absorción de minerales, la regulación del metabolismo lipídico y la prevención del cáncer.
Otro objeto de la presente invención es el uso de estos nuevos prebióticos, un extracto de oliva rico en hidroxitirosol y/o un extracto de granada rico en punicalaginas, y de composiciones orales que los contengan en la disminución de los factores de riesgo asociados al síndrome metabólico y a sus consecuencias, siendo las más destacadas, la aterosclerosis, las enfermedades cardiovasculares, la hipercolesterolemia y la diabetes mellitus tipo 2.
Se denomina síndrome metabólico al conjunto de alteraciones metabólicas y cardiovasculares que están relacionadas con la resistencia a la insulina y la obesidad abdominal. Uno de cada seis europeos, y hasta uno de cada tres ciudadanos en algunos países de la UE, padecen el síndrome metabólico, un trastorno que aumenta en gran medida el riesgo de sufrir diabetes de tipo 2, enfermedades cardiovasculares y puede provocar una muerte prematura. El rápido incremento del sobrepeso y la obesidad a edades cada vez más tempranas explican la gran prevalencia de este síndrome. Dentro de los factores del síndrome metabólico destacan los metabólicos (obesidad, diabetes tipo 2, dislipemia, hiperglucemia) y los no metabólicos (hipertensión arterial, inflamatorios, protrombóticos). El síndrome metabólico se diagnostica cuando una persona presenta tres o más de las siguientes características:
- obesidad abdominal (contorno de cintura: mayor de 102 cm en hombres o mayor de 88 cm en mujeres).
- niveles elevados de triglicéridos (mayores de 150 mg/dL).
- niveles bajos de colesterol HDl_( menores de 40 mg/dL).
- presión arterial alta (mayores de 130 mm Hg /85 mm Hg).
- Hiperglucemia en ayunas (mayores de 100 mg/dL).
En los individuos obesos con historia familiar de diabetes mellitus tipo 2, es más frecuente la existencia de un aumento de la resistencia periférica a la insulina y de hiperinsulinemia posprandial. Asimismo, los marcadores biológicos de la inflamación son predictores de enfermedad cardiovascular, siendo la elevación de los niveles séricos de la proteína C reactiva (PCR), la interleuquina 6 (IL-6), el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) y la leptina, los que presentan una mayor correlación con las alteraciones que constituyen el síndrome metabólico, así como la disminución de los niveles de adiponectina e interleuquina-10 (IL-10).
Todavía hay mucho que aprender sobre el síndrome metabólico, pero lo que sí se sabe es que la gente con síndrome metabólico tiene un mayor riesgo de sufrir un ataque cardíaco o una enfermedad arterial coronaria. En otro escenario de la presente invención se revindica como una combinación de un extracto de granada o de un extracto de oliva puede combinarse con una fibra alimentaria para obtener composiciones prebióticas que pueden actuar sinérgicamente en el organismo humano. Así por ejemplo, la combinación de un extracto de granada con fibra dietética no solo puede reducir la hipercolesterolemia a través de la bioactividad de los compuestos del extracto de granada, sino que la fibra alimentaria, (Ej: fibra soluble) al sufrir fermentación en el intestino incrementa la producción de ácidos grasos de cadena corta como el propionato. El propionato es absorbido en el colon a través de la vena portal y se ha demostrado que inhibe a la HMGR
En otro escenario de la presente invención se describe como una combinación de un extracto de granada, estandarizado a punicalaginas, con propiedades prebióticas con una mezcla específica de bacterias probióticas (simbiótico) es de gran utilidad para potenciar la producción de urolitinas en el lumen del colon en humanos y sin duda es de gran interés en vista de su aplicación en la quimioprevención del cáncer (uso para tratar de reducir el riesgo de cáncer, retardarlo o evitar que retorne).
En otro escenario de la presente invención se investigaron combinaciones de un extracto con propiedades prebióticas capaces de estimular el crecimiento de bacterias de los géneros Bifidobacterium y Lactobacillus en el colon humano con un extracto de brócoli donde previamente se había ¡nactivado la mirosinasa del vegetal. Se demostró que la excreción urinaria de los conjugados de los ¡sotiocianatos presentes en el brócoli se elevaba tras un consumo del extracto de granada lo cual sorprendentemente conseguía la estimulación especifica de bacterias del colon que mejoran la transformación en el lumen del colon de los glucosinolatos en los correspondientes ¡sotiocianatos que eran absorbidos apareciendo posteriormente en la orina.
A la luz de los resultados obtenidos se plantea igualmente la utilidad de las combinaciones de una fuente vegetal rica en glucosinolatos con una fuente de fibra dietaria, como por ejemplo la fibra soluble y en un escenario preferido una fibra soluble rica en betaglucano obtenida a partir de la avena o de la cebada o de sus mezclas , o con un prebiótico seleccionado entre: oligosacáridos prebióticos (fructooligosacáridos, xilooligosacáridos, polidextrosa, galaactooligocáridos, manooligosacáridos, o sus mezclas), tagatosa, soja, inulina (obtenida de fuentes tales como achicoria, alcachofa y jicama), avena cruda, trigo sin refinar, cebada sin refinar y jicama o soja sin refinar o sus mezclas.
Las combinaciones citadas pueden conseguir, tal y como se encontró con el extracto de granada, la estimulación especifica de bacterias del colon que mejoran la transformación en el lumen del colon de los glucosinolatos en los correspondientes isotiocianatos con las implicaciones beneficiosas para la salud humana que ello conlleva.
Por tanto, en la presente invención de revindican las combinaciones de los extractos de granada y/o oliva con efecto prebiótico o bien de otros prebióticos o de una fibra dietaria con un extracto vegetal conteniendo glucosinolatos, como por ejemplo un extracto de brócoli, al encontrar que una estimulación selectiva de determinadas poblaciones de la microflora del colon, ej géneros Bifidobacterium y Lactobacillus, mejora la biodisponibilidad en nuestro organismo de isotiocianatos formados a partir de sus precursores, los glucosinolatos, en el colon.
Descripción de las tablas y las figuras
La Tabla 1 muestra la secuencia de los oligonucleótidos empleados en las reacciones de PCR a tiempo real con SYBR Green para la cuantificación de las correspondientes bacterias en las muestras.
Las Figuras 1A y 1 B muestran el crecimiento de las bifidobacterias en los ensayos realizados y descritos en los Ejemplos 1 y 2 respectivamente. En el eje de coordenadas se muestra la concentración de bifidobacterias expresada como LOGio/ml.
En el eje de abscisas se muestra el tiempo de incubación: 0 y 48 horas. Los números que se muestran en la gráfica corresponden a la concentración de bifidobacterias, a tiempo 0 (concentración inicial de 4,9) y a tiempo 48 horas (diversos valores para el grupo control, los tres grupos con extracto de granada y los dos grupos con extracto de oliva a distintas concentraciones).
La figura 2 muestra los resultados descritos en el Ejemplo 3, de la cuantificación de bacterias del género Bifidobacterium expresada como% con respecto al total de bacterias en la materia fecal de los ratones del ensayo. El grupo 1 corresponde al grupo control. A los grupos 2 y 3 se les administró un extracto de granada y un extracto de oliva respectivamente.
La Tabla 2 muestra los resultados descritos en el Ejemplo 4 de la cuantificación mediante PCR cuantitativa a tiempo real de la cantidad de bacterias del género Lactobacillus expresada como% con respecto al total de bacterias en la materia fecal de los individuos del ensayo.
La Tabla 3 muestra los resultados descritos en el Ejemplo 4 de la cuantificación mediante PCR cuantitativa a tiempo real de la cantidad de bacterias del género
Bifidobacterium expresada como% con respecto al total de bacterias en la materia fecal de los individuos del ensayo. La Figura 3A, muestra la relación existente entre el% de fruta en una bebida de zumo de piña preparada con extracto de granada y las perdidas de punicalaginas durante la preparación de los productos.
La Figura 3B, muestra la relación existente entre el% de ácido cítrico incorporado en una bebida de zumo de piña (conteniendo un 50% de piña) preparada con extracto de granada y las perdidas de punicalaginas durante la preparación de los productos.
La Figura 3C, muestra la relación existente entre el% de ácido ascórbico incorporado en una bebida de zumo de piña (conteniendo un 20% de piña, y ácido cítrico a distintas concentraciones) preparada con extracto de granada y las perdidas de punicalaginas durante la preparación de los productos.
La Tabla 4 resume las claves empleadas para la valoración por escalas de los diferentes atributos, en el análisis sensorial de las bebidas de zumo de frutas con y sin extracto de granada preparadas y evaluadas de acuerdo a los ejemplos 6 a 9.
Las Figuras 4A y 4B muestras gráficamente los resultados descritos en el
Ejemplo 7, de la prueba de diferencia y de la prueba de preferencia, respectivamente, efectuada por los catadores durante el análisis sensorial de la bebida 100% manzana.
La Tabla 5 resume la valoración por escalas de los diferentes atributos efectuada por los catadores durante el análisis sensorial de la bebida 100 % manzana según lo descrito en el ejemplo 7.
Las Figuras 5A y 5B muestras gráficamente los resultados descritos en el Ejemplo 9, de la prueba de diferencia y de la prueba de preferencia, respectivamente, efectuada por los catadores durante el análisis sensorial de la bebida de Piña/Ciruela.
Las Figuras 5C y 5D muestras gráficamente los resultados descritos en el Ejemplo 9, de la prueba de diferencia y de la prueba de preferencia, respectivamente, efectuada por los catadores durante el análisis sensorial de la Bebida de Melocotón/Manzana.
La Tabla 6 resume la valoración por escalas de los diferentes atributos efectuada por los catadores durante el análisis sensorial de la bebida de Piña/Ciruela según lo descrito en el ejemplo 9.
La Figura 6 muestra la estabilidad oxidativa, de las muestras de margarina preparadas de acuerdo al Ejemplo 12, medida por el método Rancimat a 98°C y 10 l/hora. El gráfico muestra una correlación lineal entre la estabilidad oxidativa de la matriz alimentaria y el% de extracto de oliva adicionado a la matriz alimentaria. La Tabla 7 resume la valoración por escalas de los diferentes atributos efectuada por los catadores durante el análisis sensorial de la bebida de Melocotón/Manzana según lo descrito en el ejemplo 9.
La Tabla 8 muestra los resultados descritos en el Ejemplo 15 de la cuantificación mediante HPLC de la cantidad de isotiocianatos totales, expresada como% con respecto al total de isotiocianatos totales ingeridos en forma de extracto de brócoli, en la orina de las 24 h de los individuos del ensayo.
EJEMPLOS EJEMPLO 1. Efecto bifidogénico de un extracto de granada
Se prepararon tubos Falcon estériles con un volumen final de 50 mi que contenían leche semidesnatada, 0,4 gr de un yogurt comercial que contenía 108 bifidobacterias/gr y una solución estéril de extracto de granada en agua para obtener las siguientes concentraciones finales de extracto de granada: 0,5%; 0,1%; 0,05%; 0% (% p/V). Los tubos se incubaron a 30 °C durante 48 horas. Los ensayos se realizaron por duplicado.
Mediante PCR cuantitativa a tiempo real con SYBR Green se evaluó la cantidad de bifidobacterias en cada uno de los tubos Falcon utilizando los oligonucleótidos BidF y BidR (Tabla 1). La cuantificación absoluta de las bifidobacterias se calculó con una recta de regresión obtenida previamente: y = - 0,3792x + 17,62, donde y es el Log10 de la cantidad de bifidobacterias y x es el valor Ct de la reacción de PCR cuantitativa.
La presencia del extracto de granada en las tres concentraciones evaluadas promueve el crecimiento de las bifidobacterias respecto al control (Figura 1A). Tabla 1
Oligonucleótidos Secuencia (5' - 3 Diana
AIIBF TCCTACGGGAGGCAGCAG Todas las bacterias
AIIBR GGACTACCAGG GTATCTAATC CTG Todas las bacterias
LacF TGGATGCCTTGGCACTAGGA Lactobacillus sp
LacR AAATCTCCGGATCAAAGCTTACTTA Lactobacillus sp
BidF GATTCTGGCTCAGGATGAACG Bifídobacteríum sp
BidR GATAGGACGCGACCCCAT Bifídobacteríum sp
CperF CGCATAACGTTGAAAGATGG Clostridium perfríngens
CperR CCTTGGTAGGCCGTTACCC Clostrídium perfríngens
BacF ATCATGAGTTCACATGTCCG Bacteroídes sp
BacR CCTGCCTCTACTGTACTC Bacteroides sp EJEMPLO 2. Efecto bifidogénico de un extracto de oliva
Se prepararon tubos Falcon estériles con un volumen final de 50 mi que contenían leche semidesnatada, 0,4 gr de un yogurt comercial que contenía 108 bifidobacterias/gr y una solución estéril de extracto de oliva en agua para obtener las siguientes concentraciones finales de extracto de oliva: 0,05%; 0,01 %; 0% (% p/V). Los tubos se incubaron a 30 °C durante 48 horas. Los ensayos se realizaron por duplicado.
Mediante PCR cuantitativa a tiempo real con SYBR Green se evaluó la cantidad de bifidobacterias en cada uno de los tubos Falcon utilizando los oligonucleótidos BidF y BidR (Tabla 1). La cuantificación absoluta de las bifidobacterias se calculó con uha recta de regresión obtenida previamente: y = - 0,3792x + 17,62, donde y es el Log10 de la cantidad de bifidobacterias y x es el valor Ct de la reacción de PCR cuantitativa.
La presencia del extracto de oliva en las dos concentraciones evaluadas promueve el crecimiento de las bifidobacterias con respecto al control (Figura 1 B).
EJEMPLO 3. Efecto prebiótico de un extracto de granada en un modelo animal
El ensayo se realizó con tres grupos de 10 ratones cada uno. Los ratones fueron alimentados durante 20 días con pienso comercial y con una dosis diaria de 12.8 mg de extracto de granada por ratón (equivalente a una ingesta diaria de 320 mg ext. granada/Kg masa corporal) (grupo 2), o con una dosis diaria de 0.9 mg de extracto de oliva por ratón (equivalente a una ingesta diaria de 22.9 mg ext. oliva/Kg masa corporal) (grupo 3) o sin extracto de granada (grupo 1 , control). Tras este periodo, la materia fecal de cada grupo se recogió para aislar ADN bacteriano a partir de 0,2 gr de la misma.
Mediante PCR cuantitativa a tiempo real se evaluó la cantidad de bacterias beneficiosas en la materia fecal, expresada de la siguiente manera:% bacterias del género Bifidobacteríum /total de bacterias. Se utilizaron los oligonucleótidos BidF y BidR (Tabla 1). La cuantificación relativa se realizó mediante el método descrito por Liu y Saint, 2002, realizando cada medida por triplicado.
A continuación, se muestran los resultados que demuestran un claro efecto en la administración del extracto de granada y del extracto de oliva en promover el crecimiento de bacterias del género Bifidobacteríum. La representación gráfica de los resultados se muestra en la Figura 2.
% Bifidobacteríum /Total
Grupo 1 (control) 0,0248 ± 0,0021 Grupo 2 (extracto de granada) 0,1069 ± 0,0341
Grupo 3 (extracto de oliva) 0,0336 ± 0,0038
En los grupos 2 y 3, hay una diferencia significativa ( p< 0,05) con respecto al grupo 1 (control).
EJEMPLO 4. Efecto prebiótico de un extracto de granada en un estudio de intervención humano: cambios en la flora gastrointestinal
El ensayo se realizó con 6 individuos sanos de edad comprendida entre 28 y 53 años. Cada individuo tomó 1 cápsula diaria conteniendo 575 mg de extracto de granada a la hora de la comida. Se les indicó a los voluntarios que evitaran consumir productos de capacidad prebiótica (como fructooligosacáridos, inulina, etc), antibióticos, laxantes y especialmente productos con prebióticos (ej.:yogures sin pasteurizar, bebidas de leche fermentada, etc). Los 6 voluntarios comenzaron a seguir estas restricciones en su dieta habitual desde los 14 días previos a la fase de tratamiento del estudio de intervención, continuando con las mismas durante los 28 días del tratamiento, donde debían consumir a diario una capsula con extracto de granada.
Se tomó muestra fecal de cada uno de los individuos a tiempo 0 (tras los 14 días previos a la administración del extracto de granada) y tras los 28 días de administración. A partir de la materia fecal se realizó un aislamiento del ADN bacteriano.
Mediante PCR cuantitativa a tiempo real se evaluó la cantidad de bacterias beneficiosas en la materia fecal, expresada de la siguiente manera:% bacterias del género Lactobacillus /total de bacterias o% bacterias del género Bifidobacterium /total de bacterias. Se utilizaron los oligonucleotidos LacF, LacR, BidF y BidR (Tabla 1). Por otro lado, se evaluó la cantidad de bacterias potencialmente patógenas en la materia fecal, expresada de la siguiente manera:%bacterias de la especie Clostridium perfringens /total de bacterias o% bacterias del género Bacteroides /total de bacterias. Se utilizaron los oligonucleotidos CperF, CperR, BacF y BacR (Tabla 1). La cuantificación relativa se realizó mediante el método descrito por Liu y Saint, 2002, realizando cada medida por triplicado.
Los resultados se muestran a continuación:
A) Bacterias beneficiosas: Lactobacillus: 5 de los 6 individuos (83,3%) presentaron un aumento significativo (p< 0,05 ó p< 0,01 según el caso) en el porcentaje de bacterias de este género tras 28 días de administración de extracto de granada.
Tabla 2
Figure imgf000022_0001
Bifídobacterium: 5 de los 6 individuos (83,3%) presentaron un aumento significativo (p< 0,05 ó p< 0,01 según el caso) en el porcentaje de bacterias de este género tras 28 días de administración de extracto de granada.
Tabla 3
Figure imgf000022_0002
B) Bacterias patógenas:
Clostrídium perfringens: 5 de los 6 individuos (83,3%) presentaron un descenso significativo (p< 0,05 ó p< 0,01 según el caso) en el porcentaje de bacterias de este género tras 28 días de administración de extracto de granada. Bacteroides: 4 de los 6 individuos (66,7%) presentaron un descenso significativo (p< 0,05 ó p< 0,01 según el caso) en el porcentaje de bacterias de este género tras 28 días de administración de extracto de granada. EJEMPLO 5. Efecto prebiótico de un extracto de granada en un modelo humano: regulación del tránsito intestinal
Durante el ensayo realizado con 6 individuos descrito en el ejemplo 4 se interrogó a cada uno de ellos sobre su salud digestiva durante la administración del extracto de granada.
Todos los individuos (100%) declararon no haber tenido ningún problema digestivo durante el tratamiento.
5 individuos (83,3%) declararon haber conseguido una regularidad no habitual en ellos en el tránsito intestinal. El otro individuo declaró no haber observado cambios en sus hábitos, que de por sí ya eran regulares.
EJEMPLO 6. Preparación de un zumo o un néctar de frutas prebiótico con un extracto de granada, evaluación de la estabilidad del extracto de granada en la matriz alimentaria tras la preparación y el posterior almacenaje.
Una muestra de extracto de granada con un contenido en punicalaginas del 61 ,12%) (p/p) obtenido de acuerdo a la aplicación EP 1967079 A1 fue utilizada para preparar zumos de piña y manzana y néctar de melocotón conteniendo el mencionado extracto a la concentración de 624 mg ex. granada/kg de matriz alimentaria (381 ,4 mg punicalaginas/Kg de matriz alimentaria). Las materias primas empleadas fueron: concentrado de zumo de piña con 60 0 BRIX, concentrado de zumo de manzana con 70 0 BRIX y puré de melocotón. Los prototipos control (sin extracto) y prebiótico (con 624 ppm de extracto de granada) de las tres matrices alimentarias con y sin extracto de granada se prepararon de acuerdo a las siguientes recetas:
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Con y Sin Extracto de Granada.
Con Extracto: 624 mg./l.
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Los 6 prototipos fueron pasteurizados a 100° C, durante 15 segundos y envasados asépticamente en envases de vidrio a una temperatura de 85 - 87 °C. Los 6 envases de vidrio conteniendo los prototipos se sumergieron en agua para enfriarlos rápidamente y seguidamente, las perdidas del extracto de granada incorporado en los 3 tipos de zumos/néctares fue medida mediante la determinación del contenido en punicalaginas mediante método HPLC.
A continuación se muestran los resultados:
Zumo/néctar con ex. de granada Pérdidas de ex. de granada, %
Zumo de piña 43,2% (156 mg punicalaginas)
Zumo de manzana 1 ,1 % (4,3 mg punicalaginas)
Néctar de melocotón 39,8% (152 mg punicalaginas)
La primera conclusión es que el extracto de granada presenta una estabilidad dependiente de la matriz alimentaria. Solo el zumo de manzana mostró ün comportamiento idóneo para la aplicación del extracto de granada prebiótico. En el caso de zumo de manzana, al adicionarle extracto de granada, no se puede denominar zumo, ya que la legislación solamente permite la adición a los zumos de vitaminas y minerales, por lo que aún conteniendo un 100% de fruta, se denominará Bebida de Manzana.
Con el propósito de preparar bebidas de piña y de melocotón con extracto de granada, se llevo a cabo un estudio de los factores que influían sobre las perdidas del extracto de granada en estas matrices alimentarias, encontrándose 3 factores importantes:% de fruta,% cítrico y [ascórbico] (ver figuras 3A, 3B y 3C referidas a la bebida de piña; los datos para la bebida de melocotón no se muestran pero resultaron en la misma línea.
Tras descubrir sorprendentemente que la incorporación estable del extracto de granada a las matrices alimentarias del tipo zumo/néctar de fruta se veía favorecida por la inclusión en la formulación de ácido cítrico, por la suplementación con ascórbico y la presencia de una base de zumo de manzana, procedimos a preparar un nuevo prototipo de néctar multifruta con extracto de granada.
Los prototipos control (sin extracto) y prebiótico (con 624 ppm de extracto de granada) del néctar multifruta con y sin extracto de granada se prepararon de acuerdo a la siguiente receta:
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Los 2 prototipos fueron pasteurizados a 100° C, durante 15 segundos y envasados asépticamente en envases de vidrio a una temperatura de 85 - 87 °C. Los 2 envases de vidrio conteniendo los prototipos se sumergieron en agua para enfriarlos rápidamente y seguidamente, las perdidas del extracto de granada incorporado en el néctar multifruta fue medida mediante la determinación del contenido en punicalaginas mediante método HPLC.
A continuación se muestran los resultados: Zumo/néctar con ex. de granada Pérdidas de ex. de granada, %
Néctar multifruta 1 ,5% (5,7 mg punicalaginas)
Las conclusiones principales son que es posible incorporar de forma estable el extracto de granada con propiedades prebióticas en matrices alimentarias del tipo de los zumos/néctares (que contienen un 100% de fruta, y al menos un 50% de fruta respectivamente) La matriz más óptima es el zumo de manzana, seguida del zumo de uva pero también las matrices con varias frutas convenientemente estabilizadas mediante la incorporación de entre 90 y 900 ppm de ascórbico y entre un 0,3 y 0,5 de ácido cítrico muestran una excelente incorporación del extracto de granada.
Adicionalmente, se almacenaron botellines con los prototipos de bebida de manzana y de néctar multifruta a 5±3 °C y a 25±2 °C. Las perdidas del extracto de granada incorporado en la bebida de manzana y en el néctar multifruta fueron analizadas mediante la determinación del contenido en punicalaginas mediante método HPLC. Tras 6 meses de ensayo de estabilidad la perdida de punicalaginas fue menor del 5% en las dos condiciones bajo ensayo: a) 5±3 °C.
b) 25±2 °C con una humedad de 60 ±5 RH
EJEMPLO 7. Análisis sensorial de un zumo o un néctar de frutas prebiótico con extracto de granada.
Se procedió al Análisis Sensorial del zumo de manzana y del néctar multifruta con y sin extracto de granada preparados de acuerdo al ejemplo 6. Se realizó una sesión de cata por sabor, consistente en la realización de una Evaluación Sensorial diseñada por parte del panel de jueces expertos, con el fin de identificar las características y/o atributos del producto con y sin la incorporación del extracto de granada.
• Las sesiones de cata están formadas por un panel compuesto por 10-12 catadores semientrenados en los productos.
• Las catas consistieron en:
Diseño de un cuestionario específico que comprende los atributos más significativos de apariencia, sabor, aroma y textura, así como apreciación global. Dicho cuestionario fue aprobado por catadores expertos.
Caracterización
Se llevó a cabo por comparación pareada de muestras que contenían el extracto de granada y muestras que no lo contenían.
En este cuestionario se evaluaron las siguientes pruebas:
Prueba de diferencia, en la cual se preguntó a los catadores si detectaban alguna diferencia entre las muestras presentadas respecto a diferentes atributos.
^ Prueba de preferencia, en la cual se preguntó a los catadores cual de las muestras le gustaba más.
Pruebas de valoración de intensidad, en la que se pregunto a los catadores cuál de las muestras presentaba mayor intensidad en diferentes atributos.
Pruebas de valoración por escalas de los diferentes atributos (Color, Aroma,
Dulzor/Acidez, Sabor, Astringencia y Valoración General).
Por último, se ha llevado a cabo el análisis estadístico y se ha elaborado un informe con los resultados que se resumen a continuación.
Las claves para las valoraciones de los atributos se resumen en la siguiente tabla:
Tabla 4
Color/Aroma/Sabor Dulzor-Acidez: Astringencia: 1. Extremadamente 1. Extremadamente 1.Extremadamente agradable dulce astringente
2. Muy agradable 2. Muy dulce 2. Muy astringente
3. Moderadamente 3. Moderadamente 3. Moderadamente
agradable dulce astringente
4. Ligeramente 4. Ligeramente dulce 4. Ligeramente astringente agradable
5. Ligeramente ácido 5. Nada astringente
5. Ligeramente
6. Moderadamente
desagradable
ácido
6. Moderadamente
7. Muy ácido
desagradable
8. Extremadamente
7. Muy desagradable
ácido
8. Extremadamente
desagradable
Valoración general
1. Me gusta muchísimo
2. Me gusta mucho
3. Me gusta ligeramente
4. Ni me gusta ni me disgusta
5. Me disgusta ligeramente
6. Me disgusta mucho
7. Me disgusta muchísimo
Análisis sensorial de la Bebida de manzana.
En la prueba de diferencia, un mayor número de catadores, en comparación con otros productos, no aprecian diferencias entre las muestras para los atributos estudiados.
En cuanto a Preferencia no hay una decantación general por ninguna de las dos muestras.
La representación gráfica de los resultados se muestra en la Figura 4A.
Los resultados de la prueba de preferencia de la caracterización de la Bebida de Manzana con y sin extracto se muestran en la Figura 4B.
En cuanto a la valoración por escalas de los diferentes atributos, se observan diferencias significativas (p<0.05) en las características de color.
Tabla 5 ATRIBUTO H¡
1- extremadamente agradable
COLOR 2,3 2,0
8- extremadamente desagradable
1- extremadamente agradable
AROMA 3,0 2,9
8- extremadamente desagradable
1- extremadamente dulce
DULZOR/ACIDEZ 4,3 3,8
8- extremadamente ácido
1- extremadamente agradable
SABOR 2,4 2,6
8- extremadamente desagradable
1- extremadamente astringente
ASTRINGENCIA 4,4 4,4
8- nada astringente
1- me gusta muchísimo
VALORACIÓN GENERAL 2,3 2,7
8- me disgusta muchísimo
En función de estos resultados, se puede decir que, la Bebida de Manzana que contiene el extracto de granada, es valorada de forma positiva desde el punto de vista sensorial, incluso más favorablemente que la Bebida de Manzana sin extracto.
Análisis sensorial de la Bebida multifruta.
Resultado valoración:
• Valoración General: el producto fue valorado entre "me gusta mucho" y "me gusta ligeramente".
• Astringencia: ligeramente astringente".
• Sabor: entre "muy y moderadamente agradable".
• Dulzor/acidez: "moderadamente dulce".
• Aroma: "muy agradable".
· Color: entre "muy y moderadamente agradable".
La incorporación del extracto de granada sobre la Bebida de Manzana, Uva, Kiwi y Ciruela no aporta colores, aromas ni sabores desagradables.
En función de estos resultados, se puede decir que, la Bebida multifruta que contiene el extracto de granada, es valorada de forma positiva desde el punto de vista sensorial.
EJEMPLO 8. Preparación de una bebida de frutas/extracto de té prebjótica con un extracto de granada, evaluación de la estabilidad del extracto de granada en la matriz alimentaria.
Una muestra de extracto de granada con un contenido en punicalaginas del 61 ,12% (p/p) obtenido de acuerdo a la aplicación EP 1967079 A1 fue utilizada para preparar bebidas de fruta con o sin extractos de té conteniendo extracto de granada a la concentración de 624 mg ex. granada/kg de matriz alimentaria (381 ,4 mg punicalaginas/Kg de matriz alimentaria). Los prototipos control (sin extracto) y prebiótico (con 624 ppm de extracto de granada) de varias matrices alimentarias con y sin extracto de granada se prepararon de acuerdo a las siguientes recetas:
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Figure imgf000031_0002
Los 8 prototipos fueron pasteurizados a 100° C, durante 15 segundos y envasados asépticamente en envases de vidrio a una temperatura de 85 - 87 °C. Los 8 envases de vidrio conteniendo los prototipos se sumergieron en agua para enfriarlos rápidamente y seguidamente, las perdidas del extracto de granada incorporado en las Bebidas de frutas fue medida mediante la determinación del contenido en punicalaginas mediante método HPLC.
A continuación se muestran los resultados:
Bebida de frutas con ex. de granada Pérdidas de ex. de granada, %
Bebida Piña/Ciruela 0% (0 mg punicalaginas)
Bebida Melocotón/Manzana 7,5% (28,6 mg punicalaginas)
Bebida de frutas y extracto de té rojo 0% (0 mg punicalaginas)
Bebida de frutas y extracto de té negro 0% (0 mg punicalaginas)
Las conclusiones principales son que es posible incorporar de forma estable el extracto de granada con propiedades prebióticas en matrices alimentarias del tipo de las bebidas de fruta con o sin extractos de té (que contienen desde un 5 a un 50% de fruta y desde un 0,01 al 1% de extractos de té rojo, negro, blanco, verde, etc.) Las matrices más óptimas contienen como base principal el zumo de manzana y/o el zumo de uva y la incorporación de entre 90 y 900 ppm de ascórbico y entre un 0,3 y 0,5 de ácido cítrico proporciona una excelente estabilidad para la incorporación del extracto de granada.
Adicionalmente, se almacenaron botellines con los prototipos de bebida de melocotón/manzana y de bebida de piña/ciruela a 5±3 °C y a 25±2 °C. Las perdidas del extracto de granada incorporado en ambas bebidas de frutas fueron analizadas mediante la determinación del contenido en punicalaginas mediante método HPLC: Tras 6 meses de ensayo de estabilidad la perdida de punicalaginas fue menor del 5% en las dos condiciones bajo ensayo:
a) 5±3 °C.
b) 25±2 °C con una humedad de 60 ±5 RH
EJEMPLO 9. Análisis sensorial de una bebida de frutas/extracto de té prebiótica con un extracto de granada. Se procedió al Análisis Sensorial, de acuerdo a lo descrito en el ejemplo 7, de la bebida de piña y ciruela y de la bebida de melocotón y manzana con y sin extracto de granada preparados de acuerdo al ejemplo 8. Análisis sensorial de la Bebida de Piña y ciruela.
En la prueba de diferencia, el 100% de los catadores identifica una diferencia entre las muestras. Estas diferencias son significativas (p<0.05) exclusivamente para el parámetro de Color, donde 10 de los 12 catadores identificaron la muestra con extracto de granada como más oscura. No obstante, la muestra con extracto es preferida por el 50% de los catadores.
La representación gráfica de los resultados se muestra en la Figura 5A.
Los resultados de la prueba de preferencia de la caracterización de la Bebida de Piña/Ciruela con y sin extracto se muestran en la Figura 5B.
En cuanto a la valoración por escalas de los diferentes atributos, los resultados son similares a los obtenidos en la prueba de diferencia/intensidad.
Se observan diferencias significativas (p≤0.05) en las características de color y dulzor/acidez.
Tabla 6
Figure imgf000033_0001
En función de estos resultados, se puede concluir que, la Bebida de Piña y Ciruela que contiene extracto de granada se ha valorado, en todos los atributos analizados, de forma positiva desde el punto de vista sensorial.
Análisis sensorial de la Bebida Melocotón/Manzana. En la prueba de diferencia, el 100% de los catadores identifica una diferencia entre las muestras. Estas diferencias son significativas (p<0.05) para los parámetros de Color, Sabor y Astringencia.
No obstante, la muestra que contiene el extracto de granada es la preferida por 7 de los 11 catadores.
La representación gráfica de los resultados se muestra en la Figura 5C.
Los resultados de la prueba de preferencia de la caracterización de la Bebida de Melocotón/Manzana con y sin extracto se muestran en la Figura 5D.
En cuanto a la valoración por escalas de los diferentes atributos, los resultados son similares a los obtenidos en la prueba de diferencia/intensidad.
Se observan diferencias significativas (p≤0.05) en las características de color, sabor y astringencia.
Tabla 7
Figure imgf000034_0001
En función de estos resultados, se puede concluir que, la Bebida de Melocotón y Manzana que contiene el extracto de granada, aún presentando una ligera astringencia, es valorada de forma positiva desde el punto de vista sensorial. EJEMPLO 10. Preparación de una bebida de frutas simbiótica con una cepa de bacteria probiótica y un extracto de granada, evaluación de la estabilidad del probiótico en la matriz alimentaria.
Una muestra de extracto de granada con un contenido en punicalaginas del 61 ,12% (p/p) obtenido de acuerdo a la aplicación EP 1967079 A1 fue utilizada para preparar bebidas de fruta con extracto de granada a la concentración de 624 mg ex. granada/kg de matriz alimentaria (381 ,4 mg punicalaginas/Kg de matriz alimentaria). La bebida de frutas con extracto de granada se preparó de acuerdo a las siguiente receta:
Figure imgf000035_0001
La bebida de frutas con extracto de granada fue pasteurizada a 100° C, durante 15 segundos y envasada asépticamente en envases de vidrio a una temperatura de 85 - 87 °C. Los envases de vidrio conteniendo los prototipos de bebida de frutas con extracto de granada se sumergieron en agua para enfriarlos rápidamente. Tras alcanzar los 25 °C, los botellines con la bebida se trasladaron a una campana de flujo laminar donde de forma completamente aséptica se adicionó en forma de producto liofilizado la bacteria probiótica Bifidobacterium lactis comercializado por la compañía danesa Christian Hansen bajo la marca comercial BB-12.
Los botellines se volvieron a cerrar herméticamente, se agitaron manualmente para conseguir la disolución del polvo liofilizado del probiótico y se almacenaron en una cámara fría a una temperatura de 5±3 °C. El contenido en UFC/g de bebida fue determinado mediante el método de conteo en placa a los 0 y 30 días desde el comienzo del almacenaje.
A continuación se muestran los resultados:
0 días de almacenaje 4x108 UFC/ g bebida
30 días de almacenaje 9x107 UFC/ g bebida
Las conclusiones principales son que es posible incorporar de forma estable el extracto de granada con propiedades prebióticas junto con una cepa de bacteria probiótica en matrices alimentarias del tipo de las bebidas de fruta que contienen desde un 5 a un 50% de fruta y desde 0 a 9000 ppm de ácido ascórbico y desde el 0 al 5% de ácido cítrico. El contenido de bacterias probióticas vivas tras 1 mes de almacenamiento de la bebida de frutas simbiótica era superior a 107 UFC/g de bebida simbiótica. De este modo la invención contempla un alimento que comprende una bebida con un contenido de al menos un 10 % de zumo de manzana, combinado o no con otros zumos de frutas, con un contenido de ácido ascórbico desde 0 a ppm a 9000 ppm, con un contenido de ácido cítrico entre 0 % y 5 %, con un contenido en bacterias probióticas en un rango entre 102 a 1010 UFC / g de composición y con un contenido de extracto de granada o de extracto de oliva, entre 50 ppm y 10000 ppm.
EJEMPLO 11. Preparación de un extracto de granada en polvo con estabilidad mejorada por la adición de ácido ascórbico y ácido cítrico.
Ante la sorprendente mejora de la estabilidad de los componentes bioactivos del extracto de granada, como las punicalaginas, cuando este era incorporado en bebidas de frutas donde se añadía ácido ascórbico y ácido cítrico en las proporciones adecuadas comparativamente a cuando no se añadían los mencionados aditivos (véanse figuras 3B y 3C), se estudió como influía la adición de ácido ascórbico y ácido cítrico en la estabilidad del extracto. Se separan dos muestras de 10 L del extracto de granada en forma de líquido concentrado justo en la etapa previa a su secado en forma de polvo mediante atomización obtenido de acuerdo al ejemplo 7 de la aplicación EP 1 967 079 A1. Á una de las muestras de 10 L se le adicionan 90 ppm de ácido ascórbico y un 0.5 % de ácido cítrico y se agita para que se disuelvan por completo. La otra muestra de 10 L sirve de control y no se le adiciona ácido ascórbico ni ácido cítrico. A continuación, se obtuvieron las dos muestras de extracto de granada en forma de polvo seco siguiendo el procedimiento de secado descrito en el ejemplo 8 de la aplicación EP 1 967 079 A1. Primero se secó la muestra control sin aditivos (subióte 1) y a continuación tras limpiar el atomizador se secó la muestra con los aditivos (subióte 2). Los dos lotes de extracto de granada se envasaron en bolsas de aluminio termoselladas conteniendo 10 g por bolsa y 5 muestras de cada subióte. Todas las bolsas se colocaron en una cámara climática de incubación para llevar a cabo un estudio de estabilidad acelerada a una temperatura de 70±2 °C y una humedad 75± 5 %.
La estabilidad del extracto de granada en muestras de los sublotes 1 y 2 fue medida a distintos tiempos mediante la determinación del contenido en punicalaginas mediante método HPLC.
Tras 30 días de incubación en las condiciones mencionadas la perdida de punicalaginas fue menor del 5 % para el subióte 2 (muestra con los aditivos), mientras que para el subióte 1 (control sin aditivo) la perdida de punicalaginas fue superior al 15
%: EJEMPLO 12. Preparación de una margarina prebiótica con un extracto de oliva en sustitución del antioxidante químico terbutilhidroquinona, evaluación de su estabilidad oxidativa y de la estabilidad del hidroxitirosol.
Una muestra de extracto de oliva con un contenido en hidroxitirosol del 23.57%
(p/p) obtenido de acuerdo a la aplicación WO 2008/090460 fue utilizada para preparar margarinas conteniendo el mencionado extracto a distintas concentraciones, concretamente al 0, 0.02, 0.13 y 1.00%. Se prepararon 8 muestras de margarina cada una de aproximadamente 100 g de peso total. 4 de las muestras de una margarina contenían los ingredientes normales e iban enriquecidas con vitaminas A, D y E y calcio (Mar:Vit+Ca) y las otras 4 muestras de la otra margarina contenían los ingredientes normales e iban enriquecidas con ácidos grasos omega 3 y 6 (Mar:03+06). Las 8 muestras se fundieron en un baño maría a 55 °C y se les adicionó el extracto de oliva en la cantidad deseada, excepto a las dos muestras control donde en lugar de extracto de oliva se incorporó la dosis legalmente permitida, 200 mg/Kg, del antioxidante sintético terbutilhidroquinona (TBHQ). Tras homogenizar las muestras, se metieron en un arcón frío para hacerlas sólidas.
Después de esto, porciones de las muestras de margarina fueron muestreadas en tubos estériles para llevar a cabo un estudio de estabilidad a 5± 3 °C de las 2 formulaciones de margarinas con extracto de oliva. Por otro lado, con el resto de la muestras de margarina se llevó a cabo un estudio de estabilidad oxidativa. La estabilidad oxidativa de cada una de las 8 muestras de margarina fue medida por el método Rancimat a 98°C y 10 l/hora. La estabilidad oxidativa se expresa en horas y es un parámetro analítico que predice el tiempo que tardará un aceite de oliva en enranciarse. Una hora de estabilidad equivale a una semana aproximadamente en condiciones adecuadas de conservación. En el caso de las margarinas esa equivalencia puede ser algo distinta pero los datos obtenidos si tienen un claro valor comparativo. Cuando se preparó un gráfico con los resultados (ver figura 6) se encontró una correlación lineal entre la estabilidad oxidativa de la matriz alimentaria y el% de extracto de oliva adicionado a la matriz alimentaria. Se encontró que la margarina Mar:Vit+Ca había aumentado su estabilidad oxidativa desde las 23.8 h del control (200 mg/Kg TBHQ, 0% extracto de oliva) hasta 39.4 h, casi el doble cuando se incorporaba a la matriz alimentaria un 0.13% de extracto de oliva. Por otro lado, la otra margarina (Mar:03+06) había aumentado su estabilidad oxidativa desde las 9.2 h del control (200 mg/Kg TBHQ, 0% extracto de oliva) hasta 21.2 h, es decir más del doble cuando se incorporaba a la matriz alimentaria un 0.13% de extracto de oliva. La estabilidad del extracto de oliva incorporado a las concentraciones del 0.02 y 0.13% en los 2 tipos de margarinas fue medida mediante la determinación del contenido en hidroxitirosol mediante método HPLC entre los 0 y 6 meses del estudio de estabilidad a 5+3 °C, encontrando que la variación del contenido en hidroxitirosol, o sea las perdidas del ingrediente activo, en las dos margarinas al finalizar los 6 meses de ensayo era inferior del 5% en las condiciones ensayadas.
EJEMPLO 13. Inhibición de enzimas implicadas en la hidrólisis de carbohidratos en el tracto digestivo mediante un extracto de granada.
Una muestra de extracto de granada obtenido de acuerdo a la aplicación EP
1967079 A1 fue utilizada para estudiar la inhibición in vitro de las enzimas alfa-amilasa y alfa-glucosidasa. Las enzimas ensayadas fueron obtenidas de las siguientes fuentes: alfa-amilasa pancreática de cerdo y alfa-glucosidasa de Saccharomices cerevisiae (adquiridas en Sigma) y alfa-glucosidasa de cerdo (aislada de intestino delgado de cerdo de acuerdo a Menakshy y col. 2008).
Las medidas de las actividades alfa-amilasa y alfa-glucosidasa se llevaron a cabo de acuerdo a los procedimientos suministrados por Sigma junto a las enzimas adquiridas. Brevemente, la actividad alfa-glucosidasa se determinó espectrofotométricamente a 400 nm, con p-Nitrophenyl α-D-Glucoside (PNP) como sustrato, y la actividad alfa-amilasa se determinó espectrofotométricamente a 540 nm, con almidón soluble de patata como sustrato. Como control positivo se realizaron medidas con el inhibidor acarbosa.
Se efectuaron las medidas por triplicado. En el caso de la alfa-glucosidasa porcina la concentración empleada para las medidas del control positivo con acarbosa fue 125 microgramos/ml, mientras que la concentración de extracto de granada ensayada fue de 650 microgramos/ml. En el caso de la alfa-glucosidasa de levadura la concentración de extracto de granada ensayada fue de 1.5 microgramos/ml.
Para las medidas con alfa-amilasa porcina las medidas del control positivo con acarbosa fue 35 microgramos/ml, mientras que la concentración de extracto de granada ensayada fue de 250 microgramos/ml.
Un resumen de los resultados se muestra a continuación:
Ensayo % Actividad alfa-glucosidasa porcina
Control (sin inhibidor) 100,0 ± 3,1
Control positivo (acarbosa; 125 microgramos/ml) 57,0 ± 2,2
Extracto de granada (650 microgramos/ml) 88,7 ± 1 ,4 Ensayo % Actividad alfa-glucosidasa levadura
Control (sin inhibidor) 100,0 ± 3,2
Extracto de granada (1.5 microgramos/ml. ) 4,6 ± 2,5
Ensayo % Actividad alfa-amilasa porcina
Control (sin inhibidor) 100,0 ± 2,1
Control positivo (acarbosa; 35 micrograrnos/ml) 41 ,2 ± 2,3
Extracto de granada (250 microgramos/ml. ) 48,0 ± 1 ,7
*: Valores relativos a que el 100% es el valor de actividad enzimática obtenido sin inhibidor.
La adición del extracto de granada en las concentraciones evaluadas inhibe las actividades alfa-amilasa y alfa-glucosidasa con respecto al control, al igual que la adición de acarbosa.
Una aproximación terapéutica para disminuir la glucosa postprandial es retardar la absorción de glucosa mediante a inhibición de enzimas implicadas en la hidrólisis de carbohidratos en el tracto digestivo, como la alfa-amilasa y la alfa-glucosidasa. La acarbosa, un potente inhibidor de la alfa-glucosidasa es el principio activo de medicamentos empleados como tratamiento de la diabetes mellitus tipo II. A la vista de los resultados obtenidos con el extracto de granada en los ensayos de inhibición in vitro se concluye que el extracto de granada puede retardar la absorción de glucosa mediante a inhibición de enzimas implicadas en la hidrólisis de carbohidratos en el tracto digestivo y por consiguiente disminuir la glucosa postprandial y por tanto ser útil para el tratamiento, cotratamiento o prevención de la diabetes mellitus tipo II. Adicionalmente el extracto de granada puede ser útil para el tratamiento, cotratamiento o prevención de la obesidad a través de la disminución de la eficiencia energética de alimentos ricos en carbohidratos.
EJEMPLO 14. Activación de paraoxonasa 1 e Inhibición de hidroximetilglutaril-CoA- reductasa mediante un extracto de granada.
Una muestra de extracto de granada obtenido de acuerdo a la aplicación EP 1967079 A1 fue utilizada para estudiar la inhibición/activación in vitro de la enzimas 3- hidroxi-3-metilglutaril-CoA reductasa (HMGR) y Paraoxonasa 1 (PON 1). Las enzimas ensayadas fueron obtenidas de Sigma e Invitrogen respectivamente. Las medidas de las actividades HMRG y PON 1 se llevaron a cabo de acuerdo a los procedimientos suministrados por Sigma e Invitrogen junto a los kits enzimáticos adquiridos. Como control positivo de la HMGR se realizaron medidas con el inhibidor pravastatina.
Se efectuaron las medidas por triplicado. En el caso de la HMGR la concentración empleada para las medidas del control positivo con pravastatina fue 500 nanomolar, mientras que la concentración de extracto de granada ensayada fue de 100 microgramos/ml.
En el caso de la PON 1 las concentraciones de extracto de granada ensayadas fueron de 50 y 100 microgramos/ml.
Un resumen de los resultados se muestra a continuación:
Ensayo % Actividad HMGR
Control (sin inhibidor) 100,0 ± 3,2
Control positivo (pravastatina) 9,7 ± 3,4
Test producto (extracto de granada) 29,0 ± 3,5
*: Valores relativos a que el 100% es el valor de actividad enzimática obtenido sin inhibidor.
Ensayo % Actividad PO 1
Control (sin activador) 100,0 ± 4,3
Extracto de granada (50 microgramos/ml. ) 7,2 ± 1 ,2
Extracto de granada (100 microgramos/ml. )28,2 ± 1 ,9
*: Valores relativos a que el 100% es el valor de actividad enzimática obtenido sin activador.
La adición del extracto de granada en las concentraciones evaluadas inhibe la actividad HMGR y activa la actividad PON 1.
Una aproximación terapéutica para disminuir el colesterol en el suero sanguíneo es inhibir la biosíntesis endógena de colesterol mediante a inhibición de la enzima clave de la ruta biosintética, la HMGR. De este modo, se han desarrollado a partir de las estatinas, potentes inhibidores de la HMGR, numerosos medicamentos para tratar la hipercolesterolemia. Es interesante remarcar de nuevo que la combinación del extracto de granada con fibra dietética no solo puede reducir la hipercolesterolemia a través de la bioactividad de los compuestos del extracto de granada, sino que la fibra alimentaria, (Ej: fibra soluble) al sufrir fermentación en el intestino incrementa la producción de ácidos grasos de cadena corta como el propionato. El propionato es absorbido en el colon a través de la vena portal y se ha demostrado que inhibe a la HMGR. Por otro lado, curiosamente las estatinas incrementan la actividad PON 1 en suero, la misma proteína de la que el extracto de granada es un activador. Se conoce que PON 1 protege a los lípidos en las lipoproteínas (Ej: en el HDL), y en macrófagos frente al estrés oxidativo que provoca su oxidación. Además PON 1 presenta otras propiedades antiaterogénicas, como reducir la formación de espumas celulares de macrófagos, que están implicadas en la progresión de la lesión aterosclerótica. A la vista de los resultados obtenidos con el extracto de granada en los ensayos de inhibición/activación ¡n vitro se concluye que el extracto de granada puede actuar como inhibidor de HMGR y activador de PON 1 y por tanto ser útil para el tratamiento, cotratamiento o prevención de la hipercolesterolemia. Adicionalmente el extracto de granada puede ser útil para el tratamiento, cotratamiento o prevención de de la formación de una placa de ateroma en la capa media e intima de las arterias a través de mecanismos como la activación de PON 1 entre otros.
EJEMPLO 15. Efecto de un extracto de granada sobre la biodisponibilidad de los componentes bioáctivos de un extracto de brócoli en un estudio de intervención humano: cambios en la excreción urinaria de isotiocianatos totales incluyendo los ditiocarbamatos.
Se adquirió una muestra comercial de semillas de brócoli de la variedad Calabfese, se tomaron 120 g de las semillas y se añadieron sobre agua hirviendo, aprox. 20 volúmenes de agua respecto del peso de las semillas, y se mantuvieron en ebullición 30 minutos. Seguidamente, se homogenizaron las semillas en el agua de cocción con un ultra-turrax modelo T25 y al termino del tratamiento de homogenización se volvió a llevar a ebullición el homogenizado manteniéndolo a 100 °C durante otros 10 minutos. A continuación, se separaron los sólidos gruesos mediante filtración del extracto y por último se clarificó el extracto mediante su centrifugación, reservando el sobrenadante .aproximadamente 460 ml_ conteniendo 2.17 mg de glucorapanina/mL. Finalmente, se fraccionó el extracto en alícuotas de 23 ml_ en tubos falcon estériles y se congelaron a -20 °C hasta su consumo. Cada fracción de 23 ml_ contenía aproximadamente 50 mg de glucorapanina, de acuerdo a los análisis realizados mediante determinación HPLC de este analito. El estudio de intervención humano se realizó paralelamente al estudio de intervención del efecto prebiótico de un extracto de granada descrito en el ejemplo 4. Tal y como ya se detalló, 6 individuos sanos tomaron 1 cápsula diaria de extracto de granada a la hora de la comida, lo que supone 575 mg de extracto. Se les indicó a los voluntarios que evitaran consumir productos de capacidad prebiótica (como fructooligosacáridos, inuiina, etc), antibióticos, laxantes y especialmente productos con prebióticos (ej.:yogures sin pasteurizar, bebidas de leche fermentada, etc). Los 6 voluntarios comenzaron a seguir estas restricciones en su dieta habitual desde las 2 semanas previas a la fase de tratamiento del estudio de intervención, continuando con las mismas durante los 28 días del tratamiento, donde debían consumir a diario una capsula con extracto de granada.
A tiempos t=0 (antes del comienzo de la administración del extracto de granada) y t=28 (tras completas 28 días de administración del extracto de granada), se les administró, previo al almuerzo, una alícuota de 23 ml_ de extracto de semilla de brócoli conteniendo aproximadamente 50 mg de glucorapanina.
Se pidió que recogieran la orina de las 24 h a tiempo 0 (tras los 14 días previos a la administración del extracto de granada), y tras 28 días de administración.
Las muestras de orina fueron analizadas por HPLC tras la derivatización de los isotiocianatos totales de acuerdo al método de ciclocondensación con el 1 ,3-benzoditiol- 2-tiona (Kristensen y col., 2007), para la determinación de la excreción urinaria de los isotiocianatos (ITCs) totales (donde se incluyen los isotiocianatos en forma libre y las formas conjugadas de los isotiocianatos con la N-acetilcisteina (denominados ditiocarbamatos, DTCs) de cada individuo en las 24 h siguientes a la ingesta de un extracto de brócoli.
Igualmente, una alícuota de extracto de brócoli de 23 mL conteniendo aproximadamente 50 mg de glucorapanina, se descongeló y se adiciono mirosinasa para obtener mediante la hidrólisis de Jos glucosinolatos de la muestra los correspondientes isotiocianatos. La muestra tras confirmar por HPLC que se había completado la conversión de los glucosinolatos, fue diluida convenientemente para determinar los ITCs totales de acuerdo al método de ciclocondensación con el 1 ,3- benzoditiol-2-tiona que se utilizó para la determinación de los ITCs totales en las muestras de orina. El valor obtenido se considero el 100% relativo de excreción total de ITCs que era posible encontrar en la orina de 24 h.
Los resultados se muestran resumidos a continuación.
Tabla 8 Paciente n° ITCs*,% a t = 0 ITCs*,% a t = 28 Diferencia
significativa3
1 10.1 16.4 p < 0.001
2 22.5 15.2 —
3 30.7 32.3 p < 0.05
4 14.6 16.1 p < 0.05
5 27.1 41.6 p < 0.001
6 14.1 50.1 p < 0.001
*: Valores relativos a que el 100% es el valor obtenido para los ITCs totales de la ingesta de los 23 ml_ de extracto de brócoli.
$; Análisis estadístico realizado con las medidas por triplicado del valor real de los ITCs totales en orina.
Como se puede observar la excreción de ITCs totales, incluyendo sus formas conjugadas con N-acetilcisteina, ditiocarbamatos, en la orina de las 24 h es significativamente más alta en 5 de los 6 pacientes (83,3%) tras el consumo de un extracto de granada con propiedades prebióticas capaz de estimular en el colon determinadas poblaciones de la microbiota entre las que destacan los géneros Bifidobacterium y Lactobacillus. De lo anterior se puede concluir que el uso de un prebiótico, como por ejemplo el extracto de granada, o de un simbiótico puede mejorar la transformación en isotiocianatos de los glucosinolatos de un extracto vegetal en el colon humano, mejorando así la biodisponibiiidad de los isotiocianatos, mediante la estimulación de la microflora del colon.
EJEMPLO 16. Preparación de un extracto en polvo a partir de germinado de brócoli.
Se adquirieron en un comercio varios sobres, comercializados para su uso en huerta, de semillas de brócoli de la variedad Calabrese, se tomaron 100 g de las semillas y se crecieron en bandejas los brotes en una cámara climática a 25 °C, una humedad del 75% y con un ciclo de 8 h luz y 16 h oscuridad. Después de 5,5 días se cosecharon los brotes, que pesaron 716 g. A continuación, los brotes se añaden sobre agua hirviendo, aprox. 10 volúmenes de agua respecto del peso de los brotes, y se mantienen en ebullición 10 minutos. Seguidamente se homogenizaba los brotes en el agua de cocción con una batidora y se dejaba el homogeneizado para que se completase la extracción acuosa durante 20-40 minutos. A continuación, se separaron los sólidos gruesos mediante filtración del extracto y por último se clarificaba el extracto mediante su centrifugación, reservando el sobrenadante que eran aproximadamente 5500 ml_. A continuación, se concentró mediante rotaevaporación el extracto para obtener un extracto concentrado de aprox 300 mL conteniendo 3.12 mg de glucorapanina/mL. Por último, se disolvieron en el extracto 60 g de fibra dietaria y se seco el producto en un atomizador. Para ello se utilizó una bomba peristáltica para alimentar el atomizador previamente equilibrado con una temperatura de aire de entrada de 150 °C. La velocidad de alimentación se ajustó para obtener una temperatura de aire a la salida menor de 90 °C. Se obtienen 51.8 g de polvo con una humedad del 6.72% (termobalanza a 110 °C hasta peso constante), y una riqueza de glucorapanina del 1.69%.
EJEMPLO 17. Preparación de alimentos funcionales, ricos en vegetales comestibles como componentes nutricionales, mediante la incorporación de un extracto de brócoli y de una fibra dietaria y evaluación de la estabilidad de la glucorapanina en la matriz alimentaria.
Una muestra de extracto de brócoli con un contenido en glucorapanina del 1.69%. (p/p) obtenido de acuerdo al ejemplo 16 fue utilizada para preparar varias matrices alimentarias funcionalizadas con el extracto.
Se prepararon 3 matrices ajusfando a 100 mg de glucorapanina por L de matriz alimentaria. Para ello se adicionó el extracto a concretamente al 0 (control), y 0.6% (matrices funcionalizadas). La fibra dietaria que se utilizó para el secado del extracto supone que al adicionar 0.6% de extracto estemos añadiendo además 5.4 g de fibra dietaria por L de matriz alimentaria. Se prepararon 6 muestras de producto cada una de aproximadamente 1 Kg de peso total.
Las matrices empleadas para el ensayo fueron:
- gazpacho andaluz
- bebida de frutas y verduras
- puré de calabacín
Los 6 prototipos fueron pasteurizados a 100° C, durante 15 segundos y envasados asépticamente en envases de vidrio a una temperatura de 85 - 87 °C. Los 6 envases de vidrio conteniendo los prototipos se sumergieron en agua para enfriarlos rápidamente y seguidamente. Finalmente y de forma estéril se repartieron alícuotas de aprox. 100 mi de cada uno de los productos preparados en botellas de vidrio previamente autoclavazas y se almacenaron a 5±3 °C para la evaluación de la estabilidad del extracto de brócoli en los productos preparados. A los 0, 1 2 y 3 meses se abrieron muestras correspondientes a los 3 productos para evaluar las perdidas del extracto de brócoli incorporado en las matrices alimentarias mediante la determinación del contenido en glucorapanina medido por método HPLC.
Tras 3 meses de ensayo de estabilidad la perdidas de glucorapanina en las 3 matrices fue menor del 5% en las condiciones bajo ensayo (5+3 °C).
EJEMPLO 18. Expresión génica diferencial en un modelo animal
El ensayo se realizó con tres grupos de 10 ratones cada uno que se alimentaron durante 30 días con pienso comercial y con una dosis diaria de 12.8 mg de extracto de granada por ratón (equivalente a una ingesta diaria de 320 mg ext. granada/Kg masa corporal) (grupo 2), o con una dosis diaria de 0.9 mg de extracto de oliva por ratón (equivalente a una ingesta diaria de 22.9 mg ext. oliva/Kg masa corporal) (grupo 3) o sin extracto de granada (grupo , control). Tras el periodo de administración se sacrificaron los ratones y se le extrajo el hígado a cada uno y se conservó a -80 °C. Para que los resultados fuesen representativos del grupo se realizó un pool con un fragmento del mismo peso del hígado de cada uno de los ratones de cada grupo. A partir del mismo se aisló ARN, el cual fue sometido a unos controles de calidad rigurosos de manera previa a los ensayos.
El análisis de expresión génica diferencial se realizó mediante el uso de microarrays. En concreto se utilizaron los chips GeneChip® Mouse Genome 430 2.0 Array (Affymetrix), que permite el análisis de la expresión de aproximadamente 14000 genes descritos en ratón. Los chips mostraron los datos de intensidad dependientes de la cantidad de ARN mensajero de cada gen en forma de Log2. A partir de los mismos, por diferencia de señal entre cada grupo respecto al control, se calcula la expresión génica diferencial debido al tratamiento con un extracto de granada y al tratamiento con un extracto de oliva.
La interpretación biológica de los resultados de la expresión génica diferencial que se muestran en los ejemplos 18 a 22 se llevó a cabo con la información obtenida en las bases de datos siguientes: RefGene (Reference for genes, proteins and antibodies): http://refgene.com/; CTD (The Comparative Toxigenomics Datábase): http://ctd.mdibl.org/; MGI (Mouse Genomics Informatics): http://www.informatics.jax.org/; KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes): http://www.genome.jp/kegg/genes.html. La función biológica de los genes descritos, así como su implicación en los diversos procesos, deriva de la información tanto de los genes de ratón, como de sus homólogos en humanos.
EJEMPLO 19. Propiedades del extracto de granada y del extracto de oliva, en la modulación del sistema inmune, ayudando a reforzar las defensas naturales del organismo.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de oliva se produjo una activación en la expresión del gen del receptor de la interleuquina 7 (IL7R) con respecto al grupo control de 3,21 veces.
La IL7 es producida por las células epiteliales del intestino y es esencial para la proliferación de los linfocitos T y para la organización del tejido linfoide asociado a la mucosa. Los receptores de la IL7 se encuentran en la superficie de los linfocitos intraepiteliales del intestino. La IL7 y su receptor están implicados en la regulación de la respuesta inmune en la mucosa intestinal. Además se ha demostrado el papel esencial de IL7R en la formación de las placas de Peyer, donde se inicia principalmente la respuesta inmunitaria del intestino.
Se ha demostrado una activación en la expresión del gen de IL7R en la mucosa intestinal tras la administración de un probiótico en humanos.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de oliva se produjo una activación en la expresión del gen Dmbtl (deleted in malignant brain tumors 1) con respecto al grupo control de 20,27 veces.
El producto del gen Dmbtl es una glicoproteína de membrana que contiene múltiples dominios SRCR (múltiple scavenger receptor cysteine-rich) implicados en el reconocimiento de un amplio rango de bacterias patógenas. Se ha demostrado in vitro una unión a Salmonella entérica serotipo Typhimurium y una posterior agregación bacteriana, lo reduce la invasión de las células epiteliales. Además, esta glicoproteína interacciona con al menos dos tipos de virus distintos, VIH e influenza A, lo que resulta en un inhibición de la infección viral in vitro. La proteína también interacciona con varias moléculas implicadas en inmunidad, como SP-D, IgA y C1q. Por tanto, el producto del gen Dmbtl tiene una función muy importante en la inmunidad innata.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de oliva se produjo una activación en la expresión del gen Tff2 (trefoil factor 2 (spasmolytic protein 1)) con respecto al grupo control de 12,65 veces.
El producto del gen Tff2 pertenece a una familia de pequeñas proteínas (TFF) que son producidas principalmente en el tracto gastrointestinal y que están implicadas en la protección y en la reparación de la mucosa, manteniendo la integridad del tracto gastrointestinal.
Se ha demostrado que la administración de una mezcla prebiótica en ratas y la administración oral de una cepa de Lactobacillus en ratón promueven la secreción gastrointestinal de las proteínas TFF.
Se ha descrito que el gen Dmbtl podría ser un receptor del producto del gen 77/2. La activación de la expresión de ambos genes actúa de forma sinérgica en la protección de la mucosa gastrointestinal.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de oliva se produjo una activación del gen Cyp39a1 (cytochrome P450, family 39, subfamily a, polypeptide 1) con respecto al grupo control de 2,31 veces.
El producto del gen Cyp39a1 es una enzima oxisterol 7 α-hidroxilasa que participa en el metabolismo del colesterol. Concretamente la enzima cataliza el paso de 24S-hidroxicolesterol a 7a,24-dihidroxicolesterol, dentro de la ruta de conversión del colesterol en ácidos biliares en el hígado. Los ácidos biliares confieren a la mucosa intestinal protección frente a bacterias. En el intestino distal la capacidad antibacteriana de los ácidos biliares se debe a la activación del receptor FXR (Farnesoid X Receptor), lo que induce la expresión de genes cuyos productos previenen el crecimiento bacteriano y promueven la integridad del epitelio gastrointestinal.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de granada se produjo una activación en la expresión del gen Scara5 (scavenger receptor class A, member 5 (putative)) con respecto al grupo control de 2,46 veces.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de oliva se produjo una activación en la expresión del gen Scara5 con respecto al grupo control de 3,37 veces.
El producto del gen Scara5 es una proteína que pertenece a la familia de receptores de tipo scavenger, los cuales están implicados en la inmunidad innata relacionada con el reconocimiento de patógenos, ya que se ha demostrado su capacidad de unión a una gran variedad de éstos. El gen Scara5 se expresa en células epiteliales y también posee capacidad de unión a patógenos.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de oliva se produjo una activación en la expresión del gen Cfd (complement factor D (adipsin) ) con respecto al grupo control de 2,57 veces.
El producto del gen Cfd es una serin proteasa (factor D del complemento) que participa en la activación del sistema del complemento, concretamente en la ruta alternativa, implicado en el reconocimiento y eliminación de patógenos. El factor D del complemento participa en la formación del complejo C3bBb (convertasa C3 de la vía alternativa). La convertasa C3 está implicada en la opsonización de microorganismos patógenos y en la neutralización de virus.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de oliva se produjo una activación en la expresión del gen C7 (complement component 7) con respecto al grupo control de 1 ,85 veces.
El producto del gen C7 es una glicoproteína (factor C7 del complemento) implicada en la activación de la vía clásica del sistema del complemento. En humanos la deficiencia de la proteína C7 provoca anomalías en procesos como la quimiotaxis de neutrófilos, la fagocitosis y la opsonización.
EJEMPLO 20. Propiedades del extracto de granada y del extracto de oliva, en la regulación del metabolismo lipídico.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de oliva se produjo una activación del gen Cyp39a1 (cytochrome P450, family 39, subfamily a, polypeptide 1) con respecto al grupo control de 2,31 veces.
El producto del gen Cyp39a1 es una enzima oxisterol 7 α-hidroxilasa que participa en el metabolismo del colesterol. Concretamente la enzima cataliza el paso de 24S-hidroxicolesterol a 7a,24-dihidroxicolesterol, dentro de la ruta de conversión del colesterol en ácidos biliares en el hígado. El ARNm de está enzima se expresa de manera constitutiva en el hígado. La biosíntesis de ácidos biliares es vía más importante de eliminación del exceso de colesterol en mamíferos.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de granada se produjo una represión del gen serpinel (serpin peptidase inhibitor, clade E„ member 1) con respecto al grupo control de 3,51 veces.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de oliva se produjo una represión del gen serpinel (serpin peptidase inhibitor, clade E„ member 1) con respecto al grupo control de 3,49 veces.
Al producto del gen serpinel se le denomina inhibidor del activador del plasminógeno tipo 1 (PAI-1). Se ha demostrado que una dieta rica en colesterol en ratones produce una activación de la expresión de serpinel en hígado. Los niveles de PAI-1 en plasma en humanos con hipercolesterolemia son elevados y se ha demostrado que las estatinas inhiben la expresión del gen serpinel en células endoteliales humanas. Las estatinas son fármacos inhibidores de la enzima HMG CoA reductasa indicados para disminuir los niveles de colesterol en pacientes con hipercolesterolemia. Un inhibidor de la absorción intestinal del colesterol de la dieta (ezetimiba), indicado también en hipercolesterolemia, reprime la expresión del gen serpinel en aorta y tejido adiposo de ratones.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de oliva se produjo una activación del gen Cyp17a1 (cytochrome P450, family 17, subfamily a, polypeptide 1) con respecto al grupo control de 4,27 veces.
El producto del gen Cyp17a1 es una enzima implicada en la biosíntesis de hormonas esteroides a partir de colesterol. En concreto la enzima cataliza la 17a- hidroxilación de los esteroides C21 , pregnolona y progesterona, y el posterior procesamiento (17,20 liasa) para obtener los esteroides C19 dehidroepiandrosterona y androstenediona, respectivamente. Niveles bajos de Cyp17a1 han sido relacionados con hipertensión.
En consecuencia es posible un cotratamiento de la hipercolesterolemia mediante la administración de una dosis activa de un extracto de granada y una estatina en dosis inferiores a las prescritas cuando el tratamiento se lleva a cabo únicamente con la estatina.
EJEMPLO 21. Regulación de la absorción de minerales de un extracto de granada y un extracto de oliva
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de oliva se produjo una activación del gen Mt4 (metallothionein 4) con respecto al grupo control de 9,1 veces.
El producto del gen Mt4 es una proteína citoplasmática que se une a minerales como el cobre y el zinc. Las metalotioneínas intervienen en la homeostasis del Zn y del Cu y en la detoxificación de los mismos cuando alcanzan concentraciones elevadas
EJEMPLO 22. Propiedades del extracto de granada y del extracto de oliva, en el tratamiento, cotratamiento y prevención de distintos procesos/enfermedades oncológicos.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de granada se produjo una represión de los oncogenes ¡un, myc y fos con respecto al grupo control de 3,04, 3,27 y 6,43 veces, respectivamente.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de oliva se produjo una represión de los oncogenes jun, myc y fos con respecto al grupo control de 2,22, 3,75 y 4,31 veces, respectivamente.
Los productos de jun y fos son factores de trascripción que dimerizan para formar el complejo de trascripción denominado AP-1 (Activating Protein- ). AP-1 es un factor de transcripción que regula la expresión de genes inducidos por factores de crecimiento y promotores tumorales. La sobreexpresión de los oncogenes jun y/o fos está asociada a varios tipos de cáncer, como cáncer de mama, de ovario, de colón, osteosarcoma, cervical, de pulmón y de vejiga. Por tanto, AP-1 se utiliza como diana para el tratamiento quimioterapeútico del cáncer.
El producto del oncogen myc es una proteína que regula la expresión del factor de transcripción E2F y de la fosfatasa responsable de la activación de las ciclinas Cdc, que están implicados en la regulación del ciclo celular. El oncogén myc está sobreexpresado en numerosos cánceres humanos, como cáncer de páncreas, cervical, de mama y de colón. El producto del oncogén myc se utiliza también como diana para el tratamiento del cáncer.
En un ensayo realizado en humanos se demostró que en la mucosa intestinal se produce una represión en la expresión de los oncogenes jun, fos y myc tras la infusión de la membrana con una cepa de Lactobacillus.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de granada se produjo una represión del gen Adamtsl (a disintegrín-like and metalloprotease (reprolysin type) with thrombospondin type 1 motif) con respecto al grupo control de 2,04 veces.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de oliva se produjo una represión del gen Adamtsl con respecto al grupo control de 1 ,84 veces.
El producto del gen Adamtsl es una proteína que tiene un dominio metaloproteinasa y un dominio desintegrina. Está proteína está implicada en procesos inflamatorios y en el desarrolló de la caquexia cancerosa, según ensayos con modelos animales en cáncer de colón. Se ha demostrado una sobreexpresión del gen Adamtsl en cáncer de mama con alta actividad metastásica. Se ha especulado que la sobreexpresión de este gen podría promover el crecimiento tumoral mediante el reclutamiento de fibroblastos.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de granada se produjo una represión del gen ATF3 {activating transcription factor 3) con respecto al grupo control de 4,34 veces.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de oliva se produjo una represión del gen ATF3 con respecto al grupo control de 4,27 veces.
El producto del gen ATF3 es un factor de transcripción que se expresa en condiciones de estrés y daño en el ADN en diversos tejidos. En diversos tumores de mama se ha descrito una sobreexpresión del gen ATF3. Esta proteína se utiliza como un marcador del cáncer de próstata ya que se ha comprobado su implicación en el desarrollo de este tipo de cáncer y es, por tanto, una posible diana terapéutica.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de oliva se produjo una activación en la expresión del gen Dmbtl (deleted in malignant brain tumors 1) con respecto al grupo control de 20,27 veces.
El producto del gen Dmbtl es una glicoproteína de membrana con función de receptor con dominios tipo SRCR (dominios ricos en cisteina tipo scavenger) cuya falta de función se asoció a cáncer de mama. Además, se considera un gen supresor de tumores de colón, digestivo y de pulmón.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de oliva se produjo una activación en la expresión del gen Tff2 (trefoil factor 2 (spasmolytic protein 1)) con respecto al grupo control de 12,65 veces.
El producto del gen Tff2 pertenece a una familia de pequeñas proteínas (TFF) que son producidas principalmente en el tracto gastrointestinal y que están implicadas en la protección y en la reparación de la mucosa, manteniendo la integridad del tracto gastrointestinal. Una represión en la expresión del gen Tff2 está asociada a la proliferación del cáncer digestivo.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de oliva se produjo una activación en la expresión del gen Nuprl (nuclear protein, transcriptional regulator, 1) con respecto al grupo control de 7,9 veces.
El producto del gen Nuprl es una proteína nuclear (NURP1 o p8) que participa en diversos procesos biológicos mediante la regulación de la transcripción. Se ha demostrado in vitro que la sobrexpresión de esta proteína reduce el crecimiento de células de cáncer de próstata. Por tanto, se ha descrito la proteína p8 como supresora de tumores de próstata. Se ha demostrado una elevada sobreexpresión del gen Nurpl mediada por la acción de la 1 ,25-dihidroxivitamina D3, un potente inhibidor de células de cáncer de mama in vivo e in vitro, lo que supone una participación de la proteína p8 en el mecanismo de inhibición.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de oliva se produjo una activación en la expresión del gen FAM107A (family with sequence similaríty 107, memberA) con respecto al grupo control de 7,17 veces.
El producto del gen FAM107A es una proteína nuclear denominada TU3A implicada en la regulación del ciclo celular. Se identificó como una proteína supresora de tumores en cáncer de riñon. Se ha demostrado una represión en la expresión del gen FAM107A en diversos tipos de cáncer, como cáncer de próstata. En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de granada se produjo una activación en la expresión del gen Ddit4 (DNA-damage-inducible transcrípt 4) con respecto al grupo control de 2,92 veces.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de oliva se produjo una activación en la expresión del gen Ddit4 con respecto al grupo control de 6,08 veces.
El producto del gen Ddit4 es una proteína denominada RTP801 o Reddl , que inhibe la ruta mTOR/S6K1 , implicada en la proliferación celular. Los inhibidores de la mencionada ruta están siendo evaluados como terapia del cáncer. En ratones se ha descrito que la deficiencia en el gen Ddt¡4 promueve el crecimiento tumoral, mientras que en humanos se ha descrito represión del gen en varios tipos de cáncer.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de granada se produjo una represión en la expresión del gen Egr1 (early growth response 1) con respecto al grupo control de 2,61 veces.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de oliva se produjo una represión en la expresión del gen Egr1 con respecto al grupo control de 1 ,72 veces.
El producto del gen Egr1 es un factor de transcripción implicado en diversos procesos celulares y se ha demostrado su implicación en el crecimiento y supervivencia de células de cáncer de próstata. En modelos animales de cáncer de próstata se ha demostrado que la falta del gen Egr1 retarda el crecimiento tumoral.
Én el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de granada se produjo una represión del gen Sox9 (SRY (sex determining región Y)-box 9) con respecto al grupo control de 2,45 veces.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de oliva se produjo una represión del gen Sox9 con respecto al grupo control de 3,62 veces.
El gen Sox9 produce una proteína que actúa como factor de transcripción con dominios de unión al ADN tipo HMG (High Mobility Group). Se ha demostrado una implicación del producto del gen Sox9 en la proliferación del cáncer de páncreas y una sobreexpresión del mismo en diversas líneas celulares de cáncer de colón.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de granada se produjo una represión en la expresión del gen de la interleuquina 1 alpha (IL1á) con respecto al grupo control de 2,97 veces.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de oliva se produjo una represión en la expresión del gen de la IL1a con respecto al grupo control de 2,14 veces. La IL1a es una citoquina implicada en procesos de inflamación. El gen IL1a está sobreexpresado en diversos tipos de cáncer, como cáncer de pulmón, de colón y melanoma. En cáncer de colón la IL1 a estimula la migración celular y la angiogénesis y su expresión está inducida por la prostaglandina E2. En un ensayo realizado en humanos se demostró que en la mucosa intestinal se produce una represión en la expresión del gen IL1a tras la infusión de la membrana con una cepa de Lactobacillus.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de granada se produjo una activación en la expresión de los genes Gadd45b (growth arrest and DNA- damage-inducible 45 beta) y Gadd45q (growth arrest and DNA-damage-inducible 45 gamma) con respecto al grupo control de 2,24 y 2,57 veces, respectivamente.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de oliva se produjo una activación en la expresión de los genes Gadd45b y Gadd45g con respecto al grupo control de 2,43 y 1 ,73 veces, respectivamente.
Los productos de los genes Gadd45b y Gadd45g son proteínas relacionadas con el control del ciclo celular. En modelos de ratones con melanoma se ha demostrado que la falta de función de Gadd45b produce un mayor crecimiento tumoral. El producto de este gen es necesario para la activación de la quinasa p38. La proteína p38 está implicada en la supresión de tumores. La expresión de los genes Gadd45b y Gadd45g está reprimida en diversos tipos de cáncer.
EJEMPLO 23. Propiedades del extracto de granada y del extracto de oliva, en el tratamiento, cotratamiénto y prevención del cáncer de colon.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de granada se produjo una represión de los oncogenes ¡un, myc y fos con respecto al grupo control de 3,04, 3,27 y 6,43 veces, respectivamente.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de oliva se produjo una represión de los oncogenes jun, myc y fos con respecto al grupo control de 2,22, 3,75 y 4,31 veces, respectivamente.
Los productos de jun y fos son factores de transcripción que dimerizan para formar el complejo de transcripción denominado AP-1 (Activating Prote/n-1 ). AP-1 es un factor de transcripción que regula la expresión de genes inducidos por factores de crecimiento y promotores tumorales. La sobreexpresión de los oncogenes jun y/o fos está asociada a cáncer de colón.
El producto del oncogén myc es una proteína que regula la.expresión del factor de transcripción E2F y de la fosfatasa responsable de la activación de las ciclinas Cdc, que están implicados en la regulación del ciclo celular. El oncogén myc está sobreexpresado en cáncer de colón. Tanto la AP-1 como el producto del oncogén myc se utiliza también como diana para el tratamiento del cáncer.
En un ensayo realizado en humanos se demostró que en la mucosa intestinal se produce una represión en la expresión de los oncogenes jun, fos y myc tras la infusión con una cepa de Lactobacillus.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de granada se produjo una represión del gen Fam84A (family with sequence similarity 84, memberA) con respecto al grupo control de 2,53 veces.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de oliva se produjo una represión del gen Fam84A con respecto al grupo control de 2,52 veces.
El producto del gen Fam84A es una proteína conocida como NSE1 (neurologic sensory protein 1) que se localiza en la membrana subcelular y está implicada en movilidad celular. La expresión de este gen está activada en cáncer de colón. La proteína NSE1 podría estar implicada en la movilidad de las células de cáncer de colón y por tanto participar en la progresión de este tipo de cáncer.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de granada se produjo una represión del gen Adamtsl (a disintegrín-like and metalloprotease (reprolysin type) with thrombospondin type 1 motif) con respecto al grupo control de 2,04 veces.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de oliva se produjo una represión del gen Adamtsl con respecto al grupo control de 1 ,84 veces.
El producto del gen Adamtsl es una proteína que tiene un dominio metaloproteinasa y un dominio desintegrina. Está proteína está implicada en procesos inflamatorios y en el desarrollo de la caquexia cancerosa, según ensayos con modelos animales en cáncer de colón.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de oliva se produjo una activación en la expresión del gen Dmbtl (deleted in malignant brain tumors 1) con respecto al grupo control de 20,27 veces.
El producto del gen Dmbtl es una glicoproteína de membrana con función de receptor con dominios tipo SRCR (dominios ricos en cisteina tipo scavenger). Está proteína se considera un gen supresor de tumores de colón.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de granada se produjo una represión del gen Sox9 (SRY (sex determining región Y)-box 9) con respecto al grupo control de 2,45 veces.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de oliva se produjo una represión del gen Sox9 con respecto al grupo control de 3,62 veces. El gen Sox9 produce una proteína que actúa como factor de transcripción con dominios de unión al ADN tipo HMG {High Mobility Group). Se ha demostrado una sobreexpresión del gen Sox9 en diversas líneas celulares de cáncer de colón.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de granada se produjo una represión en la expresión del gen de la interleuquina 1 alpha (IL1á) con respecto al grupo control de 2,97 veces.
En el grupo de ratones del ejemplo 16 que tomó un extracto de oliva se produjo una represión en la expresión del gen de la lL1a con respecto al grupo control de 2,14 veces.
La IL1a es una citoquina implicada en procesos de inflamación. El gen IL1ct está sobreexpresado cáncer de colón. En cáncer de colón la IL1a estimula la migración celular y la angiogénesis y su expresión está inducida por la prostaglandina E2.
En un ensayo realizado en humanos se demostró que en la mucosa intestinal se produce una represión en la expresión del gen IL1a tras la infusión con una cepa de Lactobacillus.
EJEMPLO 24. Propiedades del extracto de granada y del extracto de oliva, en el tratamiento de la obesidad y diabetes mellitus.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de granada se produjo una represión del gen serpinel (serpin peptidase inhibitor, clade £,, member 1) con respecto al grupo control de 3,51 veces.
En el grupo de ratones del ejemplo 8 que tomó un extracto de oliva se produjo una represión del gen serpinel con respecto al grupo control de 3,49 veces.
Al producto del gen serpinel se le denomina inhibidor del activador del plasminógeno tipo 1 (PAI-1). En diabetes tipo 1 y tipo 2 se han observado altos niveles plasmáticos de la proteína PAI-1 , más acusados en el caso de diabetes tipo 2. Los niveles tan elevados en este tipo de diabetes son debidos al efecto directo de la glucosa en la síntesis de PAI-1 en las arterias y al efecto de la insulina en la síntesis de PAI-1 en el hígado. La proteína PAI-1 inhibe la señal de la insulina a través de su unión y estabilización con vitronectina. Las tiazolidinedíonas o glitazonas son fármacos agonistas del receptor PPAR-γ indicados en diabetes tipo 2, y que provocan una disminución en los niveles de PAI-1. Se ha descrito una correlación entre los niveles altos de glucosa, aún dentro del rango de normalidad, en personas sanas y los niveles de PAI-1. Se ha observado una activación en la expresión de serpinel en hígado de ratas diabéticas. Los niveles elevados de PAI-1 en plasma son la principal causa de la inactivación de la actividad fibrinolítica, que se ha asociado desde hace muchos años a la obesidad. En casos de pérdida de peso en pacientes obesos se ha descrito un descenso en los niveles plasmáticos de PAI-1 , que se recuperan en el caso de ganancia de peso.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de oliva se produjo una activación del gen ppargda (peroxisome proliferative activated receptor, gamma, coactivator 1) con respecto al grupo control de 3,14 veces.
El producto del gen ppargda es un factor transcripcional que participa en la regulación de genes implicados en el metabolismo energético, mediante la activación del receptor PPAR-γ. Este receptor hormonal tiene un importante papel en la regulación del metabolismo de hidratos de carbono y lípidos, mediante el incremento de la sensibilidad a la insulina. Sustancias agonistas del receptor PPAR-γ están siendo utilizados como fármacos para el tratamiento de la diabetes tipo 2. Entre éstos destacan las tiazolidinedionas. Como activadores farmacológicos del receptor PPARy, las tiazolidinedionas ejercen un importante efecto metabólico mejorando el metabolismo glucídico (menor producción y mayor aclaramiento de glucosa) y disminuyendo la resistencia insulínica asociada a obesidad, síndrome metabólico y diabetes mellitus tipo 2. Además, estos fármacos tienen efectos significativos sobre los lípidos plasmáticos, siendo útiles en el tratamiento de las dislipemias. Se ha demostrado que el hidroxitirosol produce una activación del gen ppargda en adipocitos. La expresión del gen de este receptor está reprimida en ratones con diabetes tipo 1.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de oliva se produjo una activación del gen adipog (adiponectin) con respecto al grupo control de 2 veces.
El producto del gen adipoq es una citoquina (adiponectina) sintetizada principalmente en tejido adiposo y abundante en plasma. En modelos animales y en humanos se ha demostrado un nivel bajo de adiponectina en plasma en casos de diabetes. Los niveles plasmáticos de esta citoquina se incrementan con el tratamiento de la diabetes con tiazolidinedionas.
La adiponectina también está relacionada con obesidad. En ratones obesos se ha descrito una represión del gen adipoq. En humanos, los niveles plasmáticos de la adiponectina son menores en pacientes con obesidad. Los niveles de esta citoquina en mujeres están inversamente relacionados con el índice de masa corporal.
Se ha especulado que la adiponectina, o bien sustancias que estimulen su producción, podrían ser utilizadas para el tratamiento de la diabetes tipo 2 y de la obesidad. En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de granada se produjo una activación del gen Lpinl (lipin 1) con respecto al grupo control de 2,35 veces.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de oliva se produjo una represión del gen Lpinl con respecto al grupo control de 2,66 veces.
El producto del gen Lpinl es una proteína de la familia de las lipinas que se describió en ratones cuya falta de función producía lipodistrofia. Esta proteína participa en la adipogénesis y en el metabolismo de los triglicéridos. Además participa, junto con el producto del gen ppargda, en la activación transcripcional en hígado del receptor PPAR-γ. Los niveles del gen Lpinl en tejido adiposo están inversamente relacionados con resistencia a insulina. En este tejido se ha demostrado un aumento en la expresión del gen Lpinl tras tratamiento con tiazolidinedionas, fármacos cuyo mecanismo de acción es el aumento de la sensibilidad a insulina.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de oliva se produjo una activación del gen lepr (leptin recepto ) con respecto al grupo control de 4,25 veces.
El producto del gen lepr es el receptor de leptina, que es una hormona implicada en la regulación del metabolismo. La leptina interviene en la regulación del tejido adiposo, actuando a nivel del sistema nervioso central, donde parece disminuir la ingesta alimentaria y aumentar el gasto energético. En ensayos desarrollados en ratones que no producían leptina o su receptor se demostró que desarrollaban obesidad. En el caso de ratones obesos que no producían leptina, se realizó con éxito un tratamiento con está hormona. Tras este tratamiento se observó un aumento de expresión del gen del receptor de la leptina en hígado. Por tanto, el hígado parece tener un importante papel en la regulación de los niveles circulantes de leptina.
EJEMPLO 25. Expresión génica diferencial mediante RT-PCR cuantitativa
Los resultados mostrados en los Ejemplos 19 a 24 de expresión génica diferencial que derivan de los resultados de los microarrays (véase Ejemplo 16) se confirmaron mediante cálculo de la expresión génica diferencial mediante RT-PCR cuantitativa. A partir del mismo ARN aislado del hígado de los ratones sé realizó una reacción de RT-PCR con SYBR Green. Se realizó una cuantificación relativa utilizando como gen de referencia GAPDH de ratón, de expresión constitutiva. El método utilizado para la cuantificación relativa fue el descrito por Pfaffl, 2001.
EJEMPLO 26. Caracterización de los elagitaninos de un extracto de granada mediante
HPLC-DAD y detectores de espectrometría de masas. Con el fin de profundizar en la caracterización de los elagitaninos presentes en los extractos de granada se procedió al subfraccionamiento de los extractos, para un posterior análisis de cada una de las fracciones de interés con el fin de detectar el máximo de compuestos posible.
Para ello se aplica un método estandarizado que comprende:
■ Un primer fraccionamiento mediante ASE, donde se aplica una secuencia de solventes de menor a mayor grado de polaridad:
- Etapa de desengrasado con Hexano( 3 lavados) _ Fracción Hexano ASE
- Etapa de extracción con Acetato de Etilo (3 lavados) _ Fracción Acetato de Etilo ASE - Etapa de extracción con Acetona (3 lavados) _ Fracción Acetona ASE
- Etapa de extracción con Acetona:Agua (3 lavados) _ Fracción Acetona:Agua ASE
Y una segunda etapa donde se realiza una extracción manual líquido-líquido (LLE) con acetato de etilo (3 lavados) aplicada a la fracción Acetona:Agua obtenida en el ASE, previa eliminación de la acetona:
- Fracción Acetato de Etilo LLE
- Fracción Agua LLE
Posteriormente se ha procedido a caracterizar analíticamente las diferentes fracciones aisladas, utilizando la cromatografía líquida (HPLC) para el análisis de las fracciones polares. En las metodologías mediante HPLC se puso a punto un método cromatográfico de screening con el objetivo de poder identificar el máximo número posible de compuestos de diferentes familias que puedan hallarse en la muestra. Para la identificación de los compuestos se ha utilizado detección mediante diodos en fila (DAD) así como también detectores de espectrometría de masas: tiempo de vuelo (TOF) y trampa iónica (IT).
Un total de 18 compuestos fueron determinados por el procedimiento arriba descrito y se muestra a continuación en la tabla 9.
Figure imgf000059_0002
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HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) BIBLIOG RAFIA
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HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26)

Claims

REIVINDICACIONES
Extracto vegetal de granada que tiene un contenido en polifenoles, con propiedades antimicrobianas, de al menos un 5 % (p/p) (medido como fenoles totales y expresado como ácido gálico equivalente), un contenido en punicalaginas de al menos un 2 % (p/p), y que presenta una relación punicalaginas respecto al ácido elágico libre (% p/p), en el rango de 10/1 a 35/1, para un uso como prebiótico.
Extracto vegetal de granada para el uso de acuerdo a la reivindicación 1 , caracterizado porque la solubilidad de dicho extracto vegetal en agua es de al menos un 3 % (p/p).
Extracto vegetal de granada para el uso de acuerdo a la reivindicación 1 , caracterizado porque dicho extracto de granada tiene un contenido en punicalaginas de al menos un 2 % (p/p), un contenido en ácido cítrico de al menos un 0,5 % (p/p) y/o un contenido en ácido ascórbico de al menos un 0,05
% (P/P).
Extracto vegetal de granada, para el uso de acuerdo a la reivindicación 1 , caracterizado porque dicho extracto vegetal tiene un contenido de punicalinas de al menos un 1 ,5 % (p/p), y presenta una relación punicalinas / ácido elágico libre (% p/p), en el rango de 10/1 a 35/1.
Composición que comprende al menos un extracto vegetal de granada de acuerdo a alguna de las reivindicaciones 1 a 4 para el uso como prebiótico.
Un alimento, incluyendo una composición de acuerdo a la reivindicación 5.
Un alimento, de acuerdo a la reivindicación 6, caracterizado porque dicho alimento es una bebida refrescante de frutas, con un contenido de al menos un 10 % de zumo de manzana, combinado o no con otros zumos de frutas, con un contenido de ácido ascórbico desde 0 a ppm a 9000 ppm, con un contenido de ácido cítrico entre 0 % y 5 % y con un contenido de extracto de granada, entre 50 ppm y 10000 ppm.
Un alimento, de acuerdo a la reivindicación 6, caracterizado porque dicho alimento es una bebida refrescante de frutas, con un contenido de al menos un 12 % de zumo de uva, combinado o no con otros zumos de frutas, con un contenido de ácido ascórbico desde 0 a ppm a 9000 ppm, con un contenido de ácido cítrico entre 0 % y 5 % y con un contenido de extracto de granada, entre 50 ppm y 10000 ppm.
9. Un alimento, de acuerdo a alguna de las reivindicaciones 6 a 8, que contiene una cepa bacteriana probiótica.
10. Un alimento de acuerdo a la reivindicación 9 para el uso como simbiótico.
11. Un alimento simbiótico, de acuerdo a la reivindicación 9, caracterizado porque tiene un contenido en bacterias probióticas en un rango entre 102 a 1010 UFC / g de composición.
12. Un alimento simbiótico de acuerdo a la reivindicación 11 , caracterizado porque dichas bacterias probióticas pertenecen a los géneros Bifidobacterium y/o Lactobacillus.
13. Un alimento simbiótico de acuerdo a la reivindicación 12 caracterizado porque dichas cepas probióticas contenidas en dichas composiciones son Lactobacillus casei DN 114-001 , y/o Bifidobacterium animalis DN-173 010.
14. Un alimento de acuerdo a alguna de las reivindicaciones 6 a 13 para el uso para potenciar la producción de las urolitinas A y B en el lumen del colon humano.
15. Un alimento de acuerdo a alguna de las reivindicaciones 6 a 14, para el uso para tratar, cotratar o prevenir las enfermedades oncológicas tales como el cáncer de próstata, el cáncer de colon, y el cáncer de páncreas.
16. Un alimento, de acuerdo a alguna de las reivindicaciones 6 a 9, para el uso para estimular el crecimiento de bacterias de los géneros Bifidobacterium y Lactobacillus en el colon humano, ayudando a reforzar las defensas naturales del organismo.
17. Un alimento de acuerdo a alguna de las reivindicaciones 6 a 9, para el uso para tratar, cotratar o prevenir el síndrome metabólico.
18. Un alimento de acuerdo a alguna de las reivindicaciones 6 a 9, para el uso para tratar, cotratar o prevenir uno o mas trastornos seleccionados entre la diabetes mellitus tipo II y la obesidad. 19. Un alimento de acuerdo a alguna de las reivindicaciones 6 a 9 para el uso para tratar, cotratar o prevenir la hipercolesterolemia.
20. Un alimento de acuerdo a alguna de las reivindicaciones 6 a 9 para el uso para tratar, cotratar o prevenir la formación de una placa de ateroma en la capa media e intima de las arterias.
21. Un alimento de acuerdo a alguna de las reivindicaciones 6 a 9 para el uso para tratar, cotratar o prevenir las enfermedades cardiovasculares. 22. Un alimento de acuerdo a alguna de las reivindicaciones 6 a 9 para el uso para tratar, cotratar o prevenir el cáncer de colon.
23. Un alimento de acuerdo a alguna de las reivindicaciones 6 a 9 que comprende adicionalmente un extracto vegetal conteniendo glucosinolatos.
24. Un alimento de acuerdo a la reivindicación 23, para el uso para estimular la microflora del colon humano.
25. Un alimento de acuerdo a la reivindicación 23, caracterizado porque dicho extracto vegetal conteniendo glucosinolatos es un extracto de brócoli.
26. Un alimento de acuerdo a la reivindicación 25 donde el extracto de brócoli se prepara a partir de las semillas del brócoli. 27. Un alimento de acuerdo a la reivindicación 25 donde el extracto de brócoli se prepara a partir de un germinado de las semillas del brócoli.
28. Un alimento de acuerdo a la reivindicación 23, donde el glucosinolato mayoritario es la glucorapanina. 29. Un alimento de acuerdo a alguna de las reivindicaciones 23 a 28, que comprende como principales componentes nutricionales hortalizas, verduras y/o frutas, y que esta seleccionado entre el gazpacho andaluz, las sopas vegetales, los purés vegetales, los zumos vegetales con o sin zumo de frutas, las conservas vegetales, los derivados modificados tecnológicamente de los alimentos arriba citados o las mezclas de dos o más de los mismos.
30. Un alimento de acuerdo a alguna de las reivindicaciones 23 a 29, para el uso para tratar, cotratar o prevenir las enfermedades cardiovasculares. 31. Un alimento de acuerdo a alguna de las reivindicaciones 23 a 29, para el uso para el tratamiento, cotratamiento o prevención de la hipertensión arterial.
32. Un alimento de acuerdo a alguna de las reivindicaciones 23 a 29, para el uso para el tratamiento, cotratamiento o prevención de la formación de una placa de ateroma en la capa media e intima de las arterias.
33. Un alimento de acuerdo a alguna de las reivindicaciones 23 a 29, para el uso para el tratamiento, cotratamiento o prevención del síndrome metabólico. 34. Un alimento de acuerdo a alguna de las reivindicaciones 23 a 29, para el uso para el tratamiento, cotratamiento o prevención de enfermedades oncológicas tales como el cáncer de próstata, el cáncer de colon, el cáncer de mama, cáncer de vejiga, cáncer de riñon, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón y cáncer de piel.
35. Un alimento de acuerdo a alguna de las reivindicaciones 6 a 9 que comprende adicionalmente un extracto vegetal de oliva, con un contenido de hidroxitirosol de la menos un 0,5% (p/p) y una pureza de la menos un 40% (por HPLC 280 nm).
36. Un alimento de acuerdo a alguna de las reivindicaciones 23 a 25 que comprende adicionalmente un extracto vegetal de oliva, con un contenido de hidroxitirosol de al menos un 0,5% (p/p) y una pureza de al menos un 40% (por HPLC 280 nm). 37. Un alimento según alguna de las reivindicaciones 35 a 36 para el uso para tratar, cotratar o prevenir las enfermedades cardiovasculares, la hipertensión arterial, la formación de una placa de ateroma en la capa media e intima de las arterias, del síndrome metabólico, de enfermedades oncológicas tales como el cáncer de próstata, el cáncer de colon, el cáncer de mama, cáncer de vejiga, cáncer de riñon, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón y cáncer de piel.
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