WO2011024555A1 - Ｌ－アミノ酸の製造法 - Google Patents

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WO2011024555A1
WO2011024555A1 PCT/JP2010/061268 JP2010061268W WO2011024555A1 WO 2011024555 A1 WO2011024555 A1 WO 2011024555A1 JP 2010061268 W JP2010061268 W JP 2010061268W WO 2011024555 A1 WO2011024555 A1 WO 2011024555A1
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amino acid
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秀高 土井
臼田　佳弘
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    • C12Y305/01096—Succinylglutamate desuccinylase (3.5.1.96)
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    • C12Y305/03—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in linear amidines (3.5.3)
    • C12Y305/03023—N-Succinylarginine dihydrolase (3.5.3.23)

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing an L-amino acid using a microorganism.
  • L-amino acids are used in various fields such as seasonings, food additives, feed additives, chemical products, and pharmaceuticals.
  • L-amino acids are industrially produced by fermentation using microorganisms belonging to the genera Brevibacterium, Corynebacterium, Escherichia and the like. In these production methods, strains isolated from nature, artificial mutants of the strains, and microorganisms modified so as to increase the activity of basic L-amino acid biosynthetic enzymes by recombinant DNA technology are used. It is used. (Patent Documents 1 to 9)
  • Escherichia coli has a metabolic pathway called the arginine succinyltransferase pathway as a metabolic pathway for degrading L-arginine, and 97% of L-arginine degradation is performed using this arginine succinyltransferase pathway. It has been reported (Non-Patent Document 1). In this arginine succinyltransferase pathway, it has been reported that L-arginine is degraded using an enzyme group encoded by the astCADBE operon in the genome sequence of Escherichia coli (GenBank Accession No. U00096) ( Non-patent document 1).
  • An object of the present invention is to provide a method for producing an L-amino acid by a fermentation method, which is further improved than before.
  • the present inventors greatly reduced the L-amino acid production ability of Enterobacteriaceae by reducing one or more enzyme activities of the arginine succinyltransferase pathway.
  • the present invention was completed.
  • the present invention is as follows. (1) A bacterium belonging to the family Enterobacteriaceae having L-amino acid-producing ability is cultured in a medium, L-amino acid is produced and accumulated in the medium, and the L-amino acid is collected from the medium.
  • the bacterium is a bacterium modified so that the activity of one or more enzymes of the arginine succinyltransferase pathway is decreased.
  • the enzyme of the arginine succinyltransferase pathway is selected from the group consisting of arginine succinyltransferase, succinylarginine dihydrolase, succinylornithine aminotransferase, succinylglutamate semialdehyde dehydrogenase, and succinylglutamate desuccinylase.
  • arginine succinyltransferase, succinylarginine dihydrolase, succinylornithine aminotransferase, succinylglutamate semialdehyde dehydrogenase and succinylglutamate desuccinylase are encoded by the astA, astB, astC, astD and astE genes, respectively. the method of.
  • the method as described above, wherein the bacteria belonging to the family Enterobacteriaceae are Escherichia bacteria, Enterobacter bacteria, or Pantoea bacteria.
  • the method as described above, wherein the bacterium is Escherichia coli.
  • the L-amino acid is an aspartic acid-based amino acid or an aromatic amino acid.
  • the aspartic acid-based amino acid is one or more amino acids selected from L-lysine, L-threonine, and L-methionine.
  • the aromatic amino acid is one or more amino acids selected from L-tryptophan, L-tyrosine, and L-phenylalanine.
  • the method as described above, wherein the L-amino acid is L-lysine.
  • the medium is a medium containing fatty acid or glycerol as a carbon source.
  • the bacterium used in the present invention is a bacterium belonging to the family Enterobacteriaceae having L-amino acid-producing ability, and the arginine succinyltransferase pathway (hereinafter also referred to as “AST pathway”).
  • AST pathway the arginine succinyltransferase pathway
  • the bacterium of the present invention can be obtained by modifying a bacterium belonging to the family Enterobacteriaceae having an L-amino acid producing ability and having an L-amino acid producing ability so that the enzyme activity of the AST pathway is reduced.
  • the bacterium used as a parent strain of the bacterium of the present invention which is modified so that the enzyme activity of the AST pathway is lowered, and a method for imparting or enhancing L-amino acid producing ability are shown below.
  • the bacterium of the present invention imparts L-amino acid-producing ability to a bacterium belonging to the family Enterobacteriaceae modified so that the enzyme activity of the AST pathway is reduced, or is modified so that the enzyme activity of the AST pathway is reduced. It can also be obtained by enhancing the L-amino acid-producing ability of the bacterium belonging to the family Enterobacteriaceae.
  • a bacterium having an L-amino acid-producing ability refers to a bacterium having an ability to produce L-amino acid and accumulate it in the medium when cultured in the medium.
  • it refers to a bacterium capable of accumulating the target L-amino acid in the medium in an amount of preferably 0.5 g / L or more, more preferably 1.0 g / L or more.
  • the L-amino acid in the present invention is L-lysine, L-glutamic acid, L-threonine, L-valine, L-leucine, L-isoleucine, L-serine, L-aspartic acid, L-asparagine, L-glutamine, L-arginine, L-cysteine (cystine), L-methionine, L-phenylalanine, L-tryptophan, L-tyrosine, L-glycine, L-alanine, L-proline, L-ornithine, L-citrulline, L-homoserine
  • Aspartic acid-based amino acids or aromatic amino acids are particularly desirable.
  • Aspartic acid-based amino acids include L-lysine, L-threonine, and L-methionine.
  • Aromatic amino acids include L-tryptophan, L-phenylalanine, and L-tyrosine.
  • L-amino acids include not only free L-amino acids but also salts including sulfates, hydrochlorides, carbonates, ammonium salts, sodium salts, and potassium salts.
  • Bacteria used as parent strain of the present invention belongs to the family Enterobacteriaceae and have the ability to produce L-amino acids.
  • the Enterobacteriaceae family includes bacteria belonging to genera such as Escherichia, Enterobacter, Erbinia, Klebsiella, Pantoea, Photorhabdus, Providencia, Salmonella, Serratia, Shigella, Morganella, and Yersinia.
  • the bacterium belonging to the genus Escherichia is not particularly limited, but means that the bacterium is classified into the genus Escherichia according to the classification known to experts in microbiology.
  • Examples of bacteria belonging to the genus Escherichia used in the present invention include, but are not limited to, Escherichia coli (E. coli).
  • the bacteria belonging to the genus Escherichia that can be used in the present invention are not particularly limited.
  • Neidhardt et al. Neidhardt, F. C. Ed. 1996. Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology / Second Edition pp 2477-2483.
  • Table 1 1. American Society for Microbiology Press, Washington, DC).
  • Specific examples include Escherichia coli W3110 (ATCC 32525) and Escherichia coli MG1655 (ATCC 47076) derived from the prototype wild type K12 strain.
  • strains can be sold, for example, from the American Type Culture Collection (address P.O. Box 1549 Manassas, VA 20108, United States of America). That is, the registration number corresponding to each strain is given, and it can receive distribution using this registration number. The registration number corresponding to each strain is described in the catalog of American Type Culture Collection.
  • the bacterium belonging to the genus Pantoea means that the bacterium is classified into the genus Pantoea according to the classification known to microbiologists. Certain types of Enterobacter agglomerans were recently reclassified as Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis, Pantoea stewartii and others (Int. J. Syst. Bacteriol., 43, 162-173 (1993)). In the present invention, the bacteria belonging to the genus Pantoea include bacteria that have been reclassified to the genus Pantoea in this way.
  • auxotrophic mutants In order to confer L-amino acid-producing ability, acquisition of auxotrophic mutants, L-amino acid analog resistant strains or metabolic control mutants, and recombinant strains with enhanced expression of L-amino acid biosynthetic enzymes can be applied to the breeding of amino acid-producing bacteria such as coryneform bacteria or Escherichia bacteria (Amino Acid Fermentation, Academic Publishing Center, Inc., May 30, 1986, first edition) Issue, see pages 77-100).
  • the auxotrophy, analog resistance, metabolic control mutation and other properties imparted may be singly or may be two or more.
  • L-amino acid biosynthetic enzymes whose expression is enhanced may be used alone or in combination of two or more. Furthermore, imparting properties such as auxotrophy, analog resistance, and metabolic regulation mutation may be combined with enhancement of biosynthetic enzymes.
  • an auxotrophic mutant an analog resistant strain, or a metabolically controlled mutant having L-amino acid-producing ability
  • the parent strain or wild strain is subjected to normal mutation treatment, that is, irradiation with X-rays or ultraviolet rays, or N-methyl.
  • -Treated with a treatment with a mutant such as -N'-nitro-N-nitrosoguanidine, among the obtained mutant strains shows auxotrophy, analog resistance, or metabolic control mutation, and has an ability to produce L-amino acid It can be obtained by selecting what it has.
  • the imparting or enhancing of the ability to produce L-amino acid can be performed by enhancing the enzyme activity by gene recombination.
  • the enzyme activity can be enhanced by, for example, a method of modifying a bacterium so that expression of a gene encoding an enzyme involved in L-amino acid biosynthesis is enhanced.
  • an amplified plasmid in which a DNA fragment containing the gene is introduced into an appropriate plasmid for example, a plasmid vector containing at least a gene responsible for the replication replication function of the plasmid in a microorganism
  • an appropriate plasmid for example, a plasmid vector containing at least a gene responsible for the replication replication function of the plasmid in a microorganism
  • the activity of an enzyme that catalyzes a reaction that branches from the biosynthetic pathway of the target L-amino acid to produce a compound other than the target L-amino acid may be reduced or eliminated.
  • the decrease or deficiency of the enzyme activity can be carried out in the same manner as the modification that decreases the enzyme activity of the arginine succinyltransferase pathway described below.
  • the promoter for expressing these genes may be any promoter that functions in the family Enterobacteriaceae, and is the promoter of the gene itself used. It may be modified or modified.
  • the expression level of the gene can also be controlled by appropriately selecting a promoter that functions strongly in the family Enterobacteriaceae, or by bringing the ⁇ 35 and ⁇ 10 regions of the promoter closer to the consensus sequence.
  • the method for enhancing the expression of the enzyme gene as described above is described in WO00 / 18935 pamphlet, European Patent Application Publication No. 1010755, and the like.
  • L-threonine producing bacteria Preferred microorganisms having L-threonine producing ability include bacteria having enhanced activity of one or more L-threonine biosynthetic enzymes.
  • L-threonine biosynthesis enzymes include aspartokinase III (lysC), aspartate semialdehyde dehydrogenase (asd), aspartokinase I (thrA), homoserine kinase (thrB), threonine synthase (thrC), aspartate amino Examples include transferase (aspartate transaminase) (aspC).
  • the parentheses are abbreviations for the genes (the same applies to the following description).
  • the L-threonine biosynthesis gene may be introduced into a bacterium belonging to the genus Escherichia in which threonine degradation is suppressed.
  • Escherichia bacterium in which threonine degradation is suppressed include, for example, the TDH6 strain lacking threonine dehydrogenase activity (Japanese Patent Laid-Open No. 2001-346578).
  • the enzyme activity of the L-threonine biosynthetic enzyme is suppressed by the final product, L-threonine. Therefore, in order to construct an L-threonine-producing bacterium, it is desirable to modify the L-threonine biosynthetic gene so that it is not subject to feedback inhibition by L-threonine.
  • the thrA, thrB, and thrC genes constitute the threonine operon, but the threonine operon forms an attenuator structure, and the expression of the threonine operon inhibits isoleucine and threonine in the culture medium. The expression is suppressed by attenuation.
  • This modification can be achieved by removing the leader sequence or attenuator in the attenuation region (Lynn, S. P., Burton, W. S., Donohue, T. J., Gould, R. M ., Gumport, R. I., and Gardner, J. F. J. Mol. Biol. 194: 59-69 (1987); International Publication No. 02/26993; International Publication No. 2005/049808) .
  • a strain resistant to ⁇ -amino- ⁇ -hydroxyvaleric acid (AHV) may be selected. Is possible.
  • the threonine operon modified so as not to be subjected to feedback inhibition by L-threonine has an increased copy number in the host or is linked to a strong promoter to improve the expression level. Is preferred.
  • the increase in copy number can be achieved by transferring the threonine operon on the genome by transposon, Mu-fuzzy, etc., in addition to amplification by plasmid.
  • L-threonine biosynthetic enzyme In addition to the L-threonine biosynthetic enzyme, it is also preferable to enhance the glycolytic system, TCA cycle, genes related to the respiratory chain, genes controlling gene expression, and sugar uptake genes.
  • genes effective for L-threonine production include transhydronase (pntAB) gene (European Patent 733712), phosphoenolpyruvate carboxylase gene (pepC) (International Publication No. 95/06114 pamphlet), phospho Examples include the enol pyruvate synthase gene (pps) (European Patent No. 877090), the pyruvate carboxylase gene of Coryneform bacteria or Bacillus bacteria (International Publication No. 99/18228, European Application Publication No. 1092776).
  • genes that confer resistance include rhtA gene (Res. Microbiol. 154: 123-135 (2003)), rhtB gene (European Patent Application Publication No. 0994190), rhtC gene (European Patent Application Publication No. 1013765) ), YfiK, yeaS gene (European Patent Application Publication No. 1016710).
  • rhtA gene Res. Microbiol. 154: 123-135 (2003)
  • rhtB gene European Patent Application Publication No. 0994190
  • rhtC gene European Patent Application Publication No. 1013765
  • YfiK European Patent Application Publication No. 1016710
  • European Patent Application Publication No. 0994190 and International Publication No. 90/04636 can be referred to.
  • L-threonine-producing bacteria or parent strains for deriving them examples include E. coli TDH-6 / pVIC40 (VKPM B-3996) (US Pat. No. 5,175,107, US Pat. No. 5,705,371), E. coli 472T23 / pYN7 (ATCC 98081) (U.S. Pat.No. 5,631,157), E. coli NRRL-21593 (U.S. Pat.No. 5,939,307), E. coli FERM BP-3756 (U.S. Pat.No. 5,474,918), E. coli FERM BP-3519 And FERM BP-3520 (US Pat.No. 5,376,538), E.
  • E. coli MG442 (Gusyatiner et al., Genetika (in Russian), 14, 947-956 (1978)), strains belonging to the genus Escherichia such as E. coli VL643 and VL2055 (EP 1149911 A), but are not limited thereto.
  • the TDH-6 strain lacks the thrC gene and is sucrose-utilizing, and the ilvA gene has a leaky mutation. This strain also has a mutation in the rhtA gene that confers resistance to high concentrations of threonine or homoserine.
  • the B-3996 strain carries the plasmid pVIC40 in which the thrA * BC operon containing the mutated thrA gene is inserted into the RSF1010-derived vector. This mutant thrA gene encodes aspartokinase homoserine dehydrogenase I which is substantially desensitized to feedback inhibition by threonine.
  • E. coli VKPM B-5318 (EP 0593792B) can also be used as an L-threonine producing bacterium or a parent strain for inducing it.
  • the B-5318 strain is isoleucine non-required, and the control region of the threonine operon in the plasmid pVIC40 is replaced by a temperature sensitive lambda phage C1 repressor and a PR promoter.
  • VKPM B-5318 was assigned to Lucian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia) on May 3, 1990 under the accession number VKPM B-5318. Has been deposited internationally.
  • the thrA gene encoding aspartokinase homoserine dehydrogenase I of Escherichia coli has been clarified (nucleotide numbers 337 to 2799, “GenBank accession” NC_000913.2, “gi”: “49175990”).
  • the thrA gene is located between the thrL gene and the thrB gene in the chromosome of E. coli K-12.
  • the thrB gene encoding homoserine kinase of Escherichia coli has been elucidated (nucleotide numbers 2801 to 3733, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990).
  • the thrB gene is located between the thrA gene and the thrC gene in the chromosome of E. coli K-12.
  • the thrC gene encoding the threonine synthase of Escherichia coli has been elucidated (nucleotide numbers 3734-5020, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990).
  • the thrC gene is located between the thrB gene and the yaaX open reading frame in the chromosome of E. coli K-12. All three of these genes function as a single threonine operon.
  • the attenuator region that affects transcription is preferably removed from the operon (WO2005 / 049808, WO2003 / 097839).
  • mutant thrA gene encoding aspartokinase homoserine dehydrogenase I resistant to feedback inhibition by threonine, and the thrB and thrC genes are one operon from the well-known plasmid pVIC40 present in the threonine producing strain E. coli VKPM B-3996. Can be obtained as Details of plasmid pVIC40 are described in US Pat. No. 5,705,371.
  • the rhtA gene is present on the 18th minute of the E. ⁇ coli chromosome close to the glnHPQ operon, which encodes an element of the glutamine transport system.
  • the rhtA gene is the same as ORF1 (ybiF gene, nucleotide numbers 764 to 1651, GenBank accession number AAA218541, gi: 440181), and is located between the pexB gene and the ompX gene.
  • the unit that expresses the protein encoded by ORF1 is called rhtA gene (rht: resistant to homoserine and threonine).
  • the E. coli asd gene has already been clarified (nucleotide numbers 3572511 to 3571408, GenBank accession NC_000913.1, gi: 16131307), and can be obtained by PCR using primers prepared based on the nucleotide sequence of the gene. (See White, TJ et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)). The asd gene of other microorganisms can be obtained similarly.
  • the aspC gene of E.coli has already been clarified (nucleotide numbers 983742 to 984932, GenBank accession NC_000913.1, gi: 16128895) and can be obtained by PCR.
  • the aspC gene of other microorganisms can be obtained similarly.
  • L-lysine-producing bacteria belonging to the genus Escherichia include mutants having resistance to L-lysine analogs.
  • L-lysine analogues inhibit the growth of bacteria belonging to the genus Escherichia, but this inhibition is completely or partially desensitized when L-lysine is present in the medium.
  • L-lysine analogs include, but are not limited to, oxalysine, lysine hydroxamate, S- (2-aminoethyl) -L-cysteine (AEC), ⁇ -methyllysine, ⁇ -chlorocaprolactam, and the like. .
  • Mutant strains resistant to these lysine analogs can be obtained by subjecting bacteria belonging to the genus Escherichia to normal artificial mutation treatment.
  • Specific examples of bacterial strains useful for the production of L-lysine include Escherichia coli AJ11442 (FERM BP-1543, NRRL B-12185; see US Pat. No. 4,346,170) and Escherichia coli VL611. In these microorganisms, feedback inhibition of aspartokinase by L-lysine is released.
  • L-lysine-producing bacteria or parent strains for inducing them include strains in which one or more activities of L-lysine biosynthetic enzymes are enhanced.
  • L-lysine biosynthetic enzymes include dihydrodipicolinate synthase (dapA), aspartokinase (lysC), dihydrodipicolinate reductase (dapB), diaminopimelate decarboxylase (lysA), diaminopimelate dehydrogenase (ddh) (US Pat.No. 6,040,160).
  • the parent strain is a gene involved in energy efficiency (cyo) (EP 1170376 A), a gene encoding nicotinamide nucleotide transhydrogenase (pntAB) (US Pat. No. 5,830,716), a ybjE gene that is an L-lysine excretion gene ( WO2005 / 073390) or a combination thereof may be increased in expression level.
  • L-lysine-producing bacteria or parent strains for deriving the same include reduction or loss of the activity of enzymes that catalyze reactions that branch off from the L-lysine biosynthetic pathway to produce compounds other than L-lysine. There are also stocks. Examples of enzymes that catalyze reactions that branch off from the biosynthetic pathway of L-lysine to produce compounds other than L-lysine include homoserine dehydrogenase, lysine decarboxylase (US Pat. No. 5,827,698), and malate enzyme ( WO2005 / 010175).
  • a preferred L-lysine-producing bacterium includes Escherichia coli WC196 ⁇ cadA ⁇ ldcC / pCABD2 (WO2006 / 078039). This strain was constructed by disrupting the cadA and ldcC genes encoding lysine decarboxylase and introducing plasmid pCABD2 (US Pat. No. 6,040,160) containing a lysine biosynthesis gene from WC196 strain. The WC196 strain was obtained from the W3110 strain derived from E. coli K-12, and encodes aspartokinase III in which feedback inhibition by L-lysine was released by replacing threonine at position 352 with isoleucine.
  • the WC196 strain was named Escherichia coli AJ13069.
  • WC196 ⁇ cadA ⁇ ldcC was named AJ110692, and was deposited internationally on October 7, 2008, at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, the Patent Biological Deposit Center (1-6 Chuo, 1-chome, 1-chome, Tsukuba, Ibaraki, Japan, 305-8566) The accession number is FERM BP-11027.
  • pCABD2 is a mutant dapA gene encoding dihydrodipicolinate synthase (DDPS) derived from Escherichia coli having a mutation that is desensitized to feedback inhibition by L-lysine, and a mutation that is desensitized to feedback inhibition by L-lysine.
  • a mutant lysC gene encoding aspartokinase III derived from Escherichia coli, dapB gene encoding dihydrodipicolinate reductase derived from Escherichia coli, and ddh encoding a diaminopimelate dehydrogenase derived from Brevibacterium lactofermentum Contains genes (International Publication Nos. WO95 / 16042 and WO01 / 53459).
  • L-methionine-producing bacteria lack the L-methionine biosynthetic repressor (metJ), enhance intracellular homoserine transsuccinylase activity (metA), or S-adenosyl Escherichia bacteria having weakened methionine synthase activity (metK) can be used (Japanese Patent No. 04110641).
  • metalJ L-methionine biosynthetic repressor
  • metalA enhance intracellular homoserine transsuccinylase activity
  • metalK S-adenosyl Escherichia bacteria having weakened methionine synthase activity
  • L-tryptophan, L-phenylalanine, and L-tyrosine are all aromatic amino acids and have a common biosynthetic system.
  • Deoxyarabino-heptulonic acid phosphate synthase is a gene encoding an aromatic amino acid biosynthetic enzyme.
  • aroG chorismate mutase-prefenate dehydratase
  • aroB 3-dehydroquinate synthase
  • aroE shikimate dehydrogenase
  • aroL shikimate kinase
  • 5-enolate pyruvate shikimate 3-phosphate examples thereof include synthase (aroA) and chorismate synthase (aroC) (European Application Publication No. 763127).
  • these genes are known to be controlled by a tyrosine repressor (tyrR), and the biosynthetic enzyme activity of aromatic amino acids may be increased by deleting the tyrR gene (European Patent 763127). No. description).
  • 3-deoxy-D-arabinohepturonic acid-7-phosphate synthase (aroF, aroG) is subject to feedback inhibition by aromatic amino acids, and may be modified so as not to receive feedback inhibition.
  • aroF L-aspartic acid at position 147 from the N-terminus or L-serine at position 181 is another amino acid residue
  • aroG L-aspartic acid at position 146 from the N-terminus, L at position 147 -Metionine, one amino acid residue of L-proline at position 150 or L-alanine at position 202, or a mutant in which two amino acid residues of L-methionine at position 157 and L-alanine at position 219 are substituted with other amino acids
  • Each aromatic amino acid has a common biosynthetic system, and it is preferable to use a strain in which the biosynthetic system specific to the aromatic amino acid other than the target L-amino acid is weakened.
  • the biosynthetic system specific to the aromatic amino acid other than the target L-amino acid is weakened.
  • the target amino acid is L-tryptophan
  • the biosynthesis system specific to L-phenylalanine and L-tyrosine is weakened.
  • the target amino acid is L-phenylalanine
  • the biosynthesis system specific to L-tryptophan and L-tyrosine is used.
  • To weaken a biosynthetic system is to introduce a mutation into a gene encoding an enzyme of the biosynthetic system, or to isolate a strain that requires an L-amino acid synthesized by the biosynthetic system to be weakened. This can be achieved by obtaining using the contained synthetic medium. (US4,371,614)
  • L-tryptophan-producing bacteria examples include E. coli JP4735 / pMU3028 (DSM10122) and JP6015 / pMU91 lacking the tryptophanyl-tRNA synthetase encoded by the mutant trpS gene (DSM10123) (U.S. Pat.No. 5,756,345), E. coli AGX17 (pGX44) (NRRL B-12263) and AGX6 (pGX50) aroP (NRRL B-12264) (U.S. Pat.No.
  • Examples include, but are not limited to, strains belonging to the genus Escherichia such as E. coli AGX17 / pGX50, pACKG4-pps (WO9708333, US Pat. No. 6,319,696) having an increased ability to produce phosphoenolpyruvate.
  • L-tryptophan-producing bacteria belonging to the genus Escherichia with increased activity of the protein encoded by the yedA gene or the yddG gene can also be used (US Patent Application Publications 2003/0148473 A1 and 2003/0157667 A1).
  • L-tryptophan-producing bacteria or parent strains for inducing them examples include anthranilate synthase (trpE), phosphoglycerate dehydrogenase (serA), 3-deoxy-D-arabinohepturonic acid-7-phosphorus Acid synthase (aroG), 3-dehydroquinate synthase (aroB), shikimate dehydrogenase (aroE), shikimate kinase (aroL), 5-enolate pyruvylshikimate 3-phosphate synthase (aroA), chorismate synthase (aroC ), Prephenate dehydratase, chorismate mutase, and tryptophan synthase (trpAB).
  • trpE anthranilate synthase
  • serA phosphoglycerate dehydrogenase
  • aroG 3-deoxy-D-arabinohepturonic acid-7-phosphorus Acid synthas
  • strains of the activity of an enzyme selected from tryptophan synthase are also included. Since both anthranilate synthase and phosphoglycerate dehydrogenase are subject to feedback inhibition by L-tryptophan and L-serine, mutations that cancel the feedback inhibition may be introduced into these enzymes. Specific examples of strains having such mutations include E. coli SV164 (trpE8) that retains desensitized anthranilate synthase and a mutant serA that encodes phosphoglycerate dehydrogenase from which feedback inhibition has been released. An example is SV1645 (pGH5) obtained by introducing plasmid pGH5 containing the gene into E.coli SV164.
  • E. coli SV164 (trpE8) introduces a mutant trpE gene encoding an anthranilate synthase desensitized to feedback inhibition by L-tryptophan into E. coli KB862 (DSM7196), a trpE deletion strain (WO94 / 08031, JP 7-507693).
  • E. coli SV164p (pGH5) was obtained by introducing plasmid pGH5 (WO94 / 08031) containing a mutant serA5 gene encoding phosphoglycerate dehydrogenase desensitized to feedback inhibition by serine into this SV164 strain.
  • Stocks. E.coli SV164 (pGH5) produces not only L-tryptophan but also L-serine (US Pat. No. 7,045,320).
  • E. coli KB862 is named AJ13828, and on December 21, 2000, the Institute of Biotechnology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (currently ⁇ National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Deposit Center, 305-8566 ⁇ Ibaraki, Japan) It has been deposited internationally in accordance with the Budapest Treaty at Higashi 1-chome, 1-chome, 1-chome, Tsukuba, Prefecture, and has been assigned a deposit number of FERM BP-7405.
  • L-tryptophan-producing bacteria or parent strains for inducing them include strains with increased 3-phosphoserine phosphatase (serB) activity (US4,371,614), phosphoenolpyruvate carboxykinase (pckA) Increased strain (WO2004 / 090125), strain in which malate synthase, isocitrate triase, isocitrate dehydrogenase kinase / phosphatase operon (ace operon) is constitutively expressed, or expression of the operon is enhanced (WO2005) / 103275).
  • serB 3-phosphoserine phosphatase
  • pckA phosphoenolpyruvate carboxykinase
  • ace operon ace operon
  • L-tryptophan-producing bacteria or parent strains for deriving them include strains into which a tryptophan operon containing a gene encoding an inhibitory anthranilate synthase has been introduced (Japanese Patent Laid-Open Nos. 57-71397 and 57). 62-244382, US Pat. No. 4,371,614). Furthermore, L-tryptophan-producing ability may be imparted by increasing the expression of a gene encoding tryptophan synthase in the tryptophan operon (trpBA). Tryptophan synthase consists of ⁇ and ⁇ subunits encoded by trpA and trpB genes, respectively. Furthermore, L-tryptophan production ability may be improved by increasing the expression of the isocitrate triase-malate synthase operon (WO2005 / 103275).
  • L-phenylalanine producing bacteria examples include E. coli AJ12479 (FERM BP-4796) (EP 1484410A), chorismate mutase-prefenate dehydrogenase and tyrosine repressor.
  • E. coli AJ12739 tyrA :: Tn10, tyrR) (VKPM B-8197) deficient
  • E. coli HW1089 ATCC carrying the mutant pheA34 gene encoding chorismate mutase-prefenate dehydratase with desensitized feedback inhibition 55371) (U.S. Pat.No.
  • E. coli MWEC101-b KR8903681
  • E. coli NRRL B-12141 E. coli NRRL B-12145
  • NRRL B-12146 E. coli NRRL B-12147
  • Strains belonging to the genus Escherichia but are not limited thereto.
  • E. coli K-12 [W3110 (tyrA) / pPHAB] E. coli K that retains the gene encoding chorismate mutase-prefenate dehydratase whose feedback inhibition has been released.
  • L-phenylalanine producing bacteria can be modified to incorporate by-products into cells, for example, to improve the expression level of L-tryptophan uptake genes tnaB and mtr and L-tyrosine uptake gene tyrP.
  • a strain that efficiently produces L-phenylalanine can be obtained (EP1484410).
  • L-tyrosine-producing bacteria examples include Escherichia bacteria (European Patent Application Publication No. 1616940) having a desensitized prefenate dehydratase gene (tyrA) that is not inhibited by tyrosine.
  • Escherichia bacteria European Patent Application Publication No. 1616940
  • tyrA desensitized prefenate dehydratase gene
  • the gene to be used is not limited to the gene having the genetic information described above or a gene having a known sequence, but variants of those genes, that is, encoded proteins As long as these functions are not impaired, genes having conservative mutations such as homologues and artificially modified variants of those genes can also be used. That is, it may be a gene encoding a protein having a sequence including substitution, deletion, insertion or addition of one or several amino acids at one or several positions in the amino acid sequence of a known protein.
  • “one or several” differs depending on the position of the amino acid residue in the three-dimensional structure of the protein and the type of amino acid residue, but specifically, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10 Means, more preferably 1-5.
  • a typical conservative mutation is a conservative substitution.
  • Conservative substitution is a polar amino acid between Phe, Trp, and Tyr when the substitution site is an aromatic amino acid, and between Leu, Ile, and Val when the substitution site is a hydrophobic amino acid.
  • substitutions considered as conservative substitutions include substitution from Ala to Ser or Thr, substitution from Arg to Gln, His or Lys, substitution from Asn to Glu, Gln, Lys, His or Asp, Asp to Asn, Glu or Gln, Cys to Ser or Ala, Gln to Asn, Glu, Lys, His, Asp or Arg, Glu to Gly, Asn, Gln, Lys or Asp Substitution, Gly to Pro substitution, His to Asn, Lys, Gln, Arg or Tyr substitution, Ile to Leu, Met, Val or Phe substitution, Leu to Ile, Met, Val or Phe substitution, Substitution from Lys to Asn, Glu, Gln, His or Arg, substitution from Met to Ile, Leu, Val or Phe, substitution from Phe to Trp, Tyr, Met, Ile or Leu, Ser to Thr or Ala Substitution, substitution from Trp to Phe or Tyr, substitution
  • amino acid substitutions, deletions, insertions, additions, or inversions as described above include naturally occurring mutations (mutants or variants) such as those based on individual differences or species differences of the microorganism from which the gene is derived. Also included by Such a gene can be modified, for example, by site-directed mutagenesis so that the amino acid residue at a specific site of the encoded protein contains substitutions, deletions, insertions or additions. Can be obtained by:
  • the gene having a conservative mutation as described above has a homology of 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, particularly preferably 97% or more with respect to the entire encoded amino acid sequence.
  • each codon in the gene sequence may be replaced with a codon that is easy to use in the host into which the gene is introduced.
  • the gene having a conservative mutation may be one obtained by a method usually used for mutation treatment such as treatment with a mutation agent.
  • a gene is a DNA that hybridizes with a probe complementary to a known gene sequence or a probe that can be prepared from the complementary sequence under stringent conditions and encodes a protein having a function equivalent to that of a known gene product. Also good.
  • stringent conditions refers to conditions under which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed.
  • DNAs having high homology for example, 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, particularly preferably 97% or more, are hybridized to each other.
  • Conditions under which DNAs with low homology do not hybridize or conditions for washing of ordinary Southern hybridization, 60 ° C., 1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, preferably 0.1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, more preferably The conditions include washing once at a salt concentration and temperature corresponding to 68 ° C., 0.1 ⁇ SSC, and 0.1% SDS, more preferably 2 to 3 times.
  • a part of the complementary sequence of the gene can also be used.
  • Such a probe can be prepared by PCR using an oligonucleotide prepared on the basis of a known gene sequence as a primer and a DNA fragment containing these base sequences as a template.
  • hybridization washing conditions include 50 ° C., 2 ⁇ SSC, and 0.1% SDS.
  • gene variants also applies to the following genes encoding enzymes of the arginine succinyltransferase pathway and other genes described herein.
  • the bacterium used in the present invention may be any bacterium that can assimilate sugars commonly used for amino acid fermentation, such as glucose and sucrose, and is particularly preferably a bacterium having glycerol or fatty acid assimilation ability. It may be a bacterium having glycerol or fatty acid utilization, a recombinant strain imparted with glycerol or fatty acid utilization, or a mutant strain having enhanced glycerol or fatty acid utilization.
  • the L-amino acid-producing bacterium in the present invention may be modified so as to enhance the utilization ability of glycerol.
  • the ability of glycerol to assimilate can be achieved by modifying a gene involved in glycerol metabolism.
  • glpR gene As genes involved in glycerol metabolism, the expression of glpR gene (EP1715056) is weakened to increase the utilization of glycerol, or glpA, glpB, glpC, glpD, glpE, glpF, glpG, glpK, glpQ, Expression of glycerol metabolic genes (EP1715055A) such as glpT, glpX, tpiA, gldA, dhaK, dhaL, dhaM, dhaR, fsa and talC genes may be enhanced.
  • glycerol dehydrogenase glycerol dehydrogenase
  • dhaKLM dihydroxyacetone kinase
  • fsaB fructose-6-phosphate aldolase
  • the L-amino acid-producing bacterium in the present invention may be modified so as to enhance the ability to assimilate fat hydrolysates and fatty acids.
  • modifications include, for example, deletion of a gene encoding a transcription factor FadR that has a DNA binding ability to regulate fatty acid metabolism found in enteric bacteria (DiRusso, C. C. et al. 1992). J. Biol. Chem. 267: 8685-8691; DiRusso, C. C. et al. 1993. Mol. Microbiol. 7: 311-322).
  • the Escherichia coli fadR gene is located at base numbers 1,234,161 to 1,234,880 on the genome sequence of Escherichia coli MG1655 registered under GenBank Accession No. U00096, and GenBank accession No. Examples include genes encoding proteins registered in AAC74271.
  • fadL gene in the present invention means a gene encoding an outer membrane transporter having an ability to take in long-chain fatty acids found in enteric bacteria (Kumar, GB and Black, PN 1993. J. Biol. Chem. 268: 15469-15476; Stenberg, F. et al. 2005. J. Biol. Chem. 280: 34409-34419).
  • FadL include the gene located at nucleotide numbers 2453322 to 2460668 of the Escherichia coli genome sequence (GenBank Accession No. U00096) as the fadL gene of Escherichia coli. .
  • the “fadD gene” in the present invention refers to a gene encoding an enzyme that catalyzes fatty acyl-CoA synthetase activity that generates fattyfaacyl-CoA from long-chain fatty acids found in enteric bacteria, and at the same time, is incorporated through the inner membrane. Meaning (Dirusso, C. C. and Black, P. N. 2004. J. Biol. Chem. 279: 49563-49566; Schmelter, T. et al. 2004. J. Biol. Chem. 279: 24163-24170 ).
  • FadD include the gene located at nucleotide numbers 1877770 to 1860885 (complementary chain) of the Escherichia coli genome sequence (GenBank Accession No. U00096) as the fadD gene of Escherichia coli. can do.
  • the “fadE gene” in the present invention means a gene encoding an enzyme that catalyzes an acyl-CoA dehydrogenase activity that oxidizes fatty acyl-CoA found in enteric bacteria (O'Brien, W. J. and Frerman, F. E. 1977. J. Bacteriol. 132: 532-540; Campbell, J. W. and Cronan, J. E. 2002. J. Bacteriol. 184: 3763759-3764).
  • FadE As a gene encoding FadE, specifically, as the fadE gene of Escherichia coli, SEQ ID NO: located at nucleotide numbers 243303 to 240859 (complementary strand) of the Escherichia coli genome sequence (GenBank Accession No. U00096) A gene having the base sequence shown in 7 can be exemplified. SEQ ID NO: 8 shows the amino acid sequence encoded by the same gene.
  • the “fadB gene” in the present invention is an ⁇ component of fatty acid oxidation complex found in the intestinal bacteria group, enoyl-CoA hydratase, 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase, 3-hydroxyacyl-CoA epimerase, ⁇ 3-cis- A gene encoding an enzyme that catalyzes four activities of ⁇ 2-trans-enoyl-CoA isomerase (Pramanik, A. et al. 1979. J. Bacteriol. 137: 469-473; Yang, S. Y. and Schulz, H. 1983. J. Biol. Chem. 258: 9780-9785).
  • FadB The gene encoding FadB is specifically exemplified by the gene located at nucleotide numbers 4089994 to 4026805 (complementary strand) of the Escherichia coli genomic sequence (GenBank Accession No. U00096) as the fadB gene of Escherichia coli can do.
  • the “fadA gene” in the present invention is a ⁇ component of fatty acid oxidation complex found in the intestinal bacteria group, and means a gene encoding an enzyme that catalyzes 3-ketoacyl-CoA thiolase activity (Pramanik, A. et al. 1979. J. Bacteriol. 137: 469-473).
  • Specific examples of the gene encoding FadA include the gene located at base numbers 4026795 to 4025632 (complementary chain) of the Escherichia coli genome sequence (GenBank Accession No. U00096) as the fadA gene of Escherichia coli. can do.
  • Fatty acid oxidation complex found in the intestinal bacteria group is known to have a complex of FadB and FadA, and the fadBA operon as a gene (Yang, angS. Y. et al 1990. J. Biol. Chem. 265: 10424-10429). Therefore, the entire operon can be amplified as the fadBA operon.
  • CyoABCDE in the present invention is a group of genes encoding each subunit of a cytochrome bo type terminal oxidase complex (cytochrome ⁇ bo terminal oxidase complex), which is one of the terminal oxidases found in the intestinal bacteria group, cyoB encodes subunit I, cyoA encodes subunit II, cyoC encodes subunit III, cyoC encodes subunit IV, and cyoE encodes an enzyme that catalyzes heme Ohemsynthase activity (Gennis, R.
  • genes encoding cyoA include the gene located at nucleotide numbers 450834 to 449887 (complementary chain) of the Escherichia coli genome sequence (GenBank Accession No. U00096) as the cyoA gene of Escherichia coli can do.
  • Specific examples of the gene encoding cyoB include the genes located at nucleotide numbers 449865 to 447874 (complementary strands) of the Escherichia coli genome sequence (GenBank Accession No. U00096) as the Escherichia coli cyoB gene. can do.
  • Specific examples of the gene encoding cyoC include the gene located at nucleotide numbers 478884 to 447270 (complementary chain) of the Escherichia coli genome sequence (GenBank Accession No. U00096) as the Escherichia coli cyoC gene. can do.
  • Specific examples of the gene encoding cyoD include the gene located at nucleotide numbers 447270 to 446941 (complementary strand) of the Escherichia coli genome sequence (GenBank Accession No. U00096) as the Escherichia coli cyoD gene. can do.
  • the gene encoding the cyoE gene is a gene located at nucleotide numbers 446929 to 446039 (complementary chain) of the Escherichia coli genome sequence (GenBank Accession No. U00096) as the Escherichia coli cyoE gene. It can be illustrated.
  • the bacterium of the present invention may be a strain modified so that the activity of pyruvate synthase or pyruvate: NADP + oxidoreductase is increased. (See WO2009 / 031565)
  • the “pyruvate synthase” in the present invention is an enzyme (EC 1.2) that reversibly catalyzes the following reaction for producing pyruvate from acetyl-CoA and CO 2 in the presence of an electron donor, for example, in the presence of ferredoxin or flavodoxin. .7.1).
  • Pyruvate synthase is sometimes abbreviated as PS and is sometimes named pyruvate oxidoreductase, pyruvate ferredoxin oxidoreductase, pyruvate flavodoxin oxidoreductase, or pyruvate oxidoreductase.
  • As the electron donor ferredoxin or flavodoxin can be used.
  • Confirmation that the activity of pyruvate synthase is enhanced is achieved by preparing a crude enzyme solution from the microorganism before enhancement and the microorganism after enhancement and comparing the activity of pyruvate synthase.
  • the activity of pyruvate synthase can be measured, for example, according to the method of Yoon et al. (Yoon, K. S. et al. 1997. Arch. Microbiol. 167: 275-279).
  • the amount of reduced methyl viologen that increases due to decarboxylation of pyruvic acid is measured spectroscopically. It can be measured by measuring.
  • One unit (U) of enzyme activity is expressed as a reduction amount of 1 ⁇ mol of methyl viologen per minute.
  • the enzyme activity is preferably 1.5 times or more, more preferably 2 times or more, and even more preferably 3 times or more that of the parent strain.
  • pyruvate synthase is produced by introducing the pyruvate synthase gene, but the enzyme activity is enhanced to such an extent that it can be measured. Is preferably 0.001 U / mg (bacterial protein) or more, more preferably 0.005 U / mg or more, and still more preferably 0.01 U / mg or more. Pyruvate synthase is sensitive to oxygen and is generally difficult to express and measure (Buckel, W.and Golding, B. T. 2006. Ann. Rev. of Microbiol. 60: 27-49). Therefore, when measuring enzyme activity, it is preferable to carry out the enzyme reaction by reducing the oxygen concentration in the reaction vessel.
  • pyruvate synthase As a gene encoding pyruvate synthase, it is possible to use a pyruvate synthase gene of a bacterium having a reductive TCA cycle such as Chlorobium tepidum, Hydrogenobacter thermophilus, etc. . It is also possible to use a pyruvate synthase gene derived from bacteria belonging to the group of enterobacteria such as Escherichia coli.
  • genes encoding pyruvate synthase are autotrophic methane producers such as Methanococcus maripaludis, Methanococcus janasti, Methanothermobacter thermautotrophicus, and other methanothermobacter thermautotrophicus (Autotrophic (methanogens) pyruvate synthase gene can be used.
  • pyruvate: NADP + oxidoreductase is an enzyme that reversibly catalyzes the following reaction for producing pyruvate from acetyl-CoA and CO 2 in the presence of an electron donor, for example, in the presence of NADPH or NADH. (EC 1.2.1.15).
  • Pyruvate: NADP + oxidoreductase is sometimes abbreviated as PNO and sometimes as pyruvate dehydrogenase.
  • pyruvate dehydrogenase activity is an activity that catalyzes a reaction of oxidatively decarboxylating pyruvate to produce acetyl-CoA, as described later.
  • Acid dehydrogenase is a separate enzyme from pyruvate: NADP + oxidoreductase.
  • the amount of reduced methyl viologen that increases due to the decarboxylation of pyruvate is measured spectroscopically. It can be measured by measuring.
  • One unit (U) of enzyme activity is expressed as a reduction amount of 1 ⁇ mol of methyl viologen per minute.
  • the enzyme activity is preferably increased 1.5 times or more, more preferably 2 times or more, and even more preferably 3 times or more compared to the parent strain. Is desirable.
  • pyruvate: NADP + oxidoreductase activity it is sufficient that pyruvate: NADP + oxidoreductase is generated by introducing the pyruvate synthase gene, but the enzyme activity is measured. It is preferably strengthened to the extent possible, preferably 0.001 U / mg (bacterial protein) or more, more preferably 0.005 U / mg or more, and still more preferably 0.01 U / mg or more.
  • Pyruvate: NADP + oxidoreductase is sensitive to oxygen and is generally difficult to express and measure activity (Inui, H. et al. 1987. J. Biol. Chem. 262: 9130). -9135; Rotte, C. et al. 2001. Mol. Biol. Evol. 18: 710-720).
  • NADP + oxidoreductase is a photosynthetic eukaryotic microorganism and is also classified as a protozoan.
  • the Euglena gracilis pyruvate: NADP + oxidoreductase gene can be used. (GenBank Accession No. AB021127).
  • the microorganism of the present invention is modified by increasing the activity of recycling the oxidized form of the electron donor necessary for the activity of pyruvate synthase to the reduced form as compared with the parent strain, for example, a wild strain or an unmodified strain,
  • the microorganism may be modified so that the activity of pyruvate synthase is increased.
  • Examples of the activity of recycling the oxidized form of the electron donor to the reduced form include ferredoxin-NADP + reductase activity.
  • the microorganism may be modified so that the activity of pyruvate synthase is increased by modifying the activity to increase pyruvate synthase activity.
  • the parent strain may have a gene that inherently encodes the electron donor recycling activity, or originally does not have the electron donor recycling activity. Activity may be imparted by introducing a gene to be encoded, and L-amino acid producing ability may be improved.
  • “Ferredoxin-NADP + reductase” refers to an enzyme (EC 1.18.1.2) that reversibly catalyzes the following reaction.
  • This reaction is a reversible reaction, and reduced ferredoxin can be produced in the presence of NADPH and oxidized ferredoxin.
  • Ferredoxin can be substituted for flavodoxin, and what is named flavodoxin-NADP + reductase also has an equivalent function.
  • Ferredoxin-NADP + reductase has been confirmed to exist widely from microorganisms to higher organisms (Carrillo, N. and Ceccarelli, EA 2003. Eur. J. Biochem. 270: 1900-1915; Ceccarelli, EA et al. 2004. Biochim Biophys. Acta. 1698: 155-165), some have been named ferredoxin-NADP + oxidoreductase, NADPH-ferredoxin oxidoreductase.
  • Confirmation that the activity of ferredoxin-NADP + reductase is enhanced is achieved by preparing a crude enzyme solution from the microorganism before modification and the microorganism after modification, and comparing the activity of ferredoxin-NADP + reductase.
  • the activity of ferredoxin-NADP + reductase can be measured, for example, according to the method of Blaschkowski et al. (Blaschkowski, H. P. et al. 1982. Eur. J. Biochem. 123: 563-569). For example, it can be measured by spectroscopically measuring the decreasing amount of NADPH using ferredoxin as a substrate.
  • One unit (U) of enzyme activity is expressed as an oxidation amount of 1 ⁇ mol NADPH per minute.
  • the parent strain has ferredoxin-NADP + reductase activity, it is not necessary to enhance if the activity of the parent strain is sufficiently high, but it is preferably 1.5 times or more, more preferably 2 times or more as compared with the parent strain, Preferably, the enzyme activity is increased by 3 times or more.
  • ferredoxin-NADP + reductase A gene encoding ferredoxin-NADP + reductase has been found in many biological species, and any gene having activity in the target L-amino acid-producing strain can be used.
  • the fpr gene In Escherichia coli, the fpr gene has been identified as flavodoxin-NADP + reductase (Bianchi, V. et al. 1993. J. Bacteriol. 175: 1590-1595). It is also known that Pseedomonas putida has NADPH-Putidaredoxin reductase gene and Putidaredoxin gene as operons (Koga, H. et al. 1989). J. Biochem. (Tokyo) 106: 831-836).
  • Escherichia coli flavodoxin-NADP + reductase examples include the fpr gene located at base numbers 4111749 to 4112495 (complementary strand) of the genome sequence of Escherichia coli K-12 strain (GenBank Accession No. U00096) it can. Further, a ferredoxin-NADP + reductase gene has been found at the base numbers 25526234 to 2527211 of the genome sequence of Corynebacterium glutamicum (GenBank Accession No. BA00036) (GenBank Accession No. BAB99777).
  • the activity of pyruvate synthase requires that ferredoxin or flavodoxin be present as an electron donor. Therefore, the microorganism may be modified so that the activity of pyruvate synthase is increased by modifying the ferredoxin or flavodoxin so as to improve the production ability. Further, in addition to modification so that pyruvate synthase activity, or flavodoxin-NADP + reductase and pyruvate synthase activities are enhanced, modification may be made so that ferredoxin or flavodoxin production ability is improved.
  • the “ferredoxin” in the present invention is a protein that contains a non-heme iron atom (Fe) and a sulfur atom and binds an iron-sulfur cluster called a 4Fe-4S, 3Fe-4S, or 2Fe-2S cluster.
  • “Flavodoxin” refers to a protein that functions as a one- or two-electron transmitter containing FMN (Flavin-mononucleotide) as a prosthetic genus.
  • FMN Fevin-mononucleotide
  • the parent strain used for the modification may have a gene that inherently encodes ferredoxin or flavodoxin, or originally has no ferredoxin or flavodoxin gene, but introduces a ferredoxin or flavodoxin gene. Thus, activity may be imparted and L-amino acid producing ability may be improved.
  • ferredoxin or flavodoxin production is improved compared to the parent strain, for example, wild strain or unmodified strain, should be detected by SDS-PAGE, two-dimensional electrophoresis, or Western blot using an antibody.
  • the production amount may be any as long as it is improved as compared to the wild strain or the unmodified strain, but for example, 1.5 times or more, more preferably 2 times or more, more preferably compared to the wild strain or the non-modified strain. It is desirable that it rises 3 times or more.
  • the activity of ferredoxin and flavodoxin can be measured by adding to an appropriate redox reaction system.
  • Boyer et al. Discloses a method of reducing the produced ferredoxin with ferredoxin-NADP + reductase and quantifying the reduction of cytochrome C by the resulting reduced ferredoxin (Boyer, ME et al. 2006. Biotechnol. Bioeng. 94: 128-138).
  • the activity of flavodoxin can be measured by the same method using flavodoxin-NADP + reductase.
  • the gene encoding ferredoxin or flavodoxin is widely distributed, and any encoded ferredoxin or flavodoxin can be used as long as pyruvate synthase and an electron donor regeneration system are available.
  • the fdx gene exists as a gene encoding ferredoxin having a 2Fe-2S cluster (Ta, D. T. and Vickery, L. E. 1992. J. Biol. Chem. 267: 11120 -11125), the yfhL gene is predicted as a ferredoxin gene having a 4Fe-4S cluster.
  • the flavodoxin gene includes fldA gene (Osborne, C. et al. 1991. J. Bacteriol.
  • ferredoxin I and ferredoxin II have been identified as 4Fe-4S type ferredoxin genes that serve as electron acceptors for pyruvate synthase (Yoon, K. S Et al. 2001. J. Biol. Chem. 276: 44027-44036).
  • Ferredoxin genes or flavodoxin genes derived from bacteria having a reductive TCA cycle such as Hydrogenobacter thermophilus can also be used.
  • the ferredoxin gene of Escherichia coli the fdx gene located at base numbers 2654770-2655105 (complementary strand) of the genome sequence of Escherichia coli K-12 strain (GenBank Accession No. U00096), and the base number Examples include the yfhL gene located at 2697685 to 2697945.
  • Examples of the Escherichia coli flavodoxin gene include the fldA gene located at nucleotide numbers 710688 to 710158 (complementary strand) of the genome sequence of Escherichia coli K-12 strain (GenBank Accession No. U00096), and nucleotide numbers 3037877 to 3038398
  • the fldB gene located in can be exemplified.
  • the ferredoxin gene of Chlorobium tepidum (Chelorobium tepidum) is located in the ferredoxin I gene located at nucleotide numbers 1184078 to 1184266 and nucleotide numbers 1184476 to 1184664 in the genome sequence of Chlorobium tepidum (GenBank Accession No. NC_002932)
  • a ferredoxin II gene can be exemplified.
  • the Ferrobacter thermophilus ferredoxin gene (GenBank Accession No. BAE02673) and the Sulfolobusolosolfataricus genome sequence 2345414-2345728 are shown.
  • An example is the ferricoxin gene of Taricus.
  • the genera Chlorobium, Desulfobacter, Aquifex, Hydrogenobacter, Thermoproteus, Thermoproteus May be cloned from bacteria belonging to the genus Pyrobaculum, and also ⁇ -proteobacteria such as Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Erbinia, Yersinia, Corynebacterium glutamicum, etc.
  • coryneform bacteria such as Brevibacterium lactofermentum, Pseudomonas bacteria such as Pseudomonas aeruginosa, and Mycobacterium bacteria such as Mycobacterium tuberculosis.
  • arginine succinyltransferase pathway is a pathway that governs the following reaction that decomposes arginine to produce glutamic acid and succinic acid in five steps (hereinafter sometimes referred to as “AST pathway”).
  • Arginine succinyltransferase is also expressed as arginine succinyltransferase, arginine succinyltransferase, arginine N-succinyltransferase, arginine and ornithine N 2 -succinyltransferase, succinyl-CoA: L-arginine 2-N-succinyltransferase, AST, AOST (J Bacteriol. 1998 Vol. 180, No. 16 4278-4286).
  • AstA is encoded by the astA gene (Synonyms: ECK1745, b1747, ydjV).
  • Examples of the astA gene of Escherichia coli include a gene having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 located at base numbers 1827755 to 1828789 of the genome sequence of Escherichia coli (GenBank Accession No. U00096).
  • SEQ ID NO: 2 shows the amino acid sequence encoded by the same gene.
  • the enzyme activity of arginine succinyltransferase can be measured by referring to the method of Wauven CV, et al (1988) Arch Microbiol 150: 400-404.
  • Succinyl arginine dihydrolase is also referred to as arginyl succinate dihydrolase, N-succinylarginine dihydrolase, N 2 -succinylarginine dihydrolase, arginine succinylhydrolase, 2-N-succinyl-L-arginine iminohydrolase, SAD (J. Bacteriol. 1998 Vol. .180, No. 16 4278-4286).
  • AstB is encoded by the astB gene (Synonyms: ECK1743, b1745, ydjT).
  • Examples of the astB gene of Escherichia coli include a gene having the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 located at base numbers 1824940-1826283 of the Escherichia coli genomic sequence (GenBank Accession No. U00096).
  • SEQ ID NO: 4 shows the amino acid sequence encoded by the same gene.
  • the enzyme activity of succinylarginine dihydrolase can be measured with reference to the method of Tocilj A, “etal” (2005) “J. Biol. Chem.” 280: 15800-15808.
  • Succinylornithine aminotransferase is also expressed as succinylornithine aminotransferase, Succinylornithine transaminase, N 2 -succinylornithine 5-aminotransferase, 2-N-succinyl-L-ornithine: 2-oxoglutarate 5-aminotransferase, SOT.
  • AstC is encoded by the astC gene (Synonyms: ECK1746, ydjW, b1748, argM, cstC, ydhW).
  • a gene having the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 located at base numbers 1828786 to 1830006 of the genome sequence of Escherichia coli (GenBank Accession No. U00096) can be exemplified as the astC gene.
  • SEQ ID NO: 6 shows the amino acid sequence encoded by the same gene.
  • the enzyme activity of succinylornithine aminotransferase can be measured with reference to the method of Schneider BL, et al (1998) J. Bacteriol 180: 4278-4286.
  • Succinyl glutamate semialdehyde dehydrogenase is also expressed as succinyl glutamate semialdehyde dehydrogenase, succinylglutamic semialdehyde dehydrogenase, N-succinylglutamate 5-semialdehyde dehydrogenase, and SGSDH.
  • AstD is encoded by the astD gene (Synonyms: ECK1744, b1746, ydjU).
  • Examples of the astD gene of Escherichia coli include a gene having the base sequence shown in SEQ ID NO: 7 located at base numbers 1826280 to 1827758 of the genome sequence of Escherichia coli (GenBank Accession No. U00096).
  • SEQ ID NO: 8 shows the amino acid sequence encoded by the same gene.
  • the enzyme activity of succinyl glutamate semialdehyde dehydrogenase can be measured with reference to the method of Schneider BL, et al (1998) J. Bacteriol 180: 4278-4286.
  • Succinyl glutamate desuccinylase is also referred to as succinyl glutamate desuccinylase, N 2 -succinylglutamate desuccinylase, SGDS.
  • AstE is encoded by the astE gene (Synonyms: ECK1742, b1744, ydjS). Specifically, as an astE gene of Escherichia coli, a gene having the base sequence shown in SEQ ID NO: 9 located in base numbers 1823979-1824947 of the Escherichia coli genome sequence (GenBank Accession No. U00096) Can do. SEQ ID NO: 10 shows the amino acid sequence encoded by the same gene. The enzyme activity of succinylglutamate desuccinylase can be measured with reference to the method of Itoh Y.et al 1: J Bacteriol. 1997 Dec; 179 (23): 7280-90.
  • Examples of enzymes of the AST pathway include proteins having the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, and 10 for Escherichia coli, but as long as the function of the protein is not changed, It may have an amino acid sequence containing a conservative mutation. That is, a protein having a sequence including substitution, deletion, insertion, or addition of one or several amino acids in the amino acid sequence of a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10 Also good.
  • “one or several” differs depending on the position of the amino acid residue in the three-dimensional structure of the protein and the type of amino acid residue, for example, 1 to 20, preferably 1 to 10, more preferably Mean 1-5.
  • a typical conservative mutation is a conservative substitution.
  • Conservative substitution is a polar amino acid between Phe, Trp, and Tyr when the substitution site is an aromatic amino acid, and between Leu, Ile, and Val when the substitution site is a hydrophobic amino acid.
  • Gln and Asn when it is a basic amino acid
  • Lys, Arg, and His when it is an acidic amino acid
  • Asp and Glu when it is an amino acid having a hydroxyl group Is a mutation that substitutes between Ser and Thr.
  • substitutions considered conservative substitutions include Ala to Ser or Thr substitution, Arg to Gln, His or Lys substitution, Asn to Glu, Gln, Lys, His or Asp substitution, Asp to Asn, Glu Or Gln, Cys to Ser or Ala, Gln to Asn, Glu, Lys, His, Asp or Arg, Glu to Asn, Gln, Lys or Asp, Gly to Pro Substitution, substitution from His to Asn, Lys, Gln, Arg or Tyr, substitution from Ile to Leu, Met, Val or Phe, substitution from Leu to Ile, Met, Val or Phe, Lys to Asn, Glu, Gln , His or Arg substitution, Met to Ile, Leu, Val or Phe substitution, Phe to Trp, Tyr, Met, Ile or Leu substitution, Ser to Thr or Ala substitution, Thr to Ser or Ala Substitution, Trp to Phe or Tyr substitution, Tyr to His, Phe or Trp substitution, and Val
  • amino acid substitutions, deletions, insertions, additions, or inversions as described above include naturally occurring mutations (mutants or variants) such as those based on individual differences or species differences of the microorganism from which the gene is derived. Also included by Such a gene can be modified, for example, by site-directed mutagenesis so that the amino acid residue at a specific site of the encoded protein contains substitutions, deletions, insertions or additions. Can be obtained by:
  • the gene encoding the enzyme for the AST pathway encodes arginine succinyl transferase, succinyl arginine dihydrolase, succinyl ornithine aminotransferase, succinyl glutamate semialdehyde dehydrogenase, or succinyl glutamate desuccinylase, SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, or It may be a DNA that hybridizes under stringent conditions with a base sequence complementary to the base sequence consisting of 9 or a probe that can be prepared from the base sequence. “Stringent conditions” refers to conditions under which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed.
  • DNAs having high homology for example, 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 97% or more, particularly preferably 99% or more, are hybridized to each other. 60 ° C., 1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, preferably 0.1 ⁇ SSC, 0.1%, which is a condition in which DNAs having low homology do not hybridize with each other or washing conditions of ordinary Southern hybridization SDS, more preferably, conditions of washing once at a salt concentration and temperature corresponding to 68 ° C., 0.1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, more preferably 2 to 3 times.
  • a part of the complementary sequence of the gene can also be used.
  • Such a probe can be prepared by PCR using an oligonucleotide prepared based on a known gene sequence as a primer and a DNA fragment containing these base sequences as a template.
  • the length of the probe is appropriately selected depending on the hybridization conditions, but is usually 100 bp to 1 Kbp.
  • hybridization washing conditions include 50 ° C., 2 ⁇ SSC, and 0.1% SDS.
  • “Modified so that the activity of the enzyme of the AST pathway is reduced” means that the enzyme activity of each AST pathway per bacterial cell is higher than that of an unmodified strain, for example, a strain belonging to the wild-type Enterobacteriaceae family. It means that it became low. For example, the case where the number of enzyme molecules per cell is reduced or the case where the enzyme activity per molecule is reduced is applicable.
  • the enzyme activity per cell can be compared, for example, by comparing the enzyme activities contained in the cell extract of bacteria cultured under the same conditions.
  • the “decrease” in activity includes a case where the activity is completely lost.
  • the enzyme that decreases the activity may be any of AstA, AstB, AstC, AstD, and AstE, and may be one or more. It is preferable to reduce the activity of the enzyme upstream of the AST pathway, and it is particularly preferable that the enzyme is modified so that at least the activity of AstA is reduced.
  • the enzyme activity of the AST pathway is reduced when, for example, the enzyme activity of each AST pathway is 50% or less, preferably 30% or less, more preferably 10%, compared to an unmodified strain, for example, a wild strain.
  • wild-type bacteria belonging to the genus Escherichia that serve as a comparative control include Escherichia coli MG1655 strain. It can be measured by the above-mentioned method whether each enzyme activity fell.
  • the modification that decreases the activity of the enzyme of the AST pathway specifically deletes part or all of the astA, astB, astC, astD, or astE gene on the chromosome, or removes these genes or these genes. It is achieved by modifying expression control sequences such as promoters of operons and Shine-Dalgarno (SD) sequences. Decreased expression includes reduced transcription and reduced translation. Moreover, gene expression can also be reduced by modifying non-translated regions other than the expression regulatory sequences. The entire target gene may be deleted, including sequences before and after the target gene on the chromosome.
  • the gene encoding the AST pathway has the astCADBE operon structure including the astC, astA, astD, astB, and astE structural genes in this order, and transcription starts from the promoter upstream of astC. (Schneider, BL et al. (1998) J. Bacteriol. 180, 4278-4286).
  • the downstream gene may not be normally expressed.
  • the upstream region of the operon for example, ast
  • a mutation is introduced into the astA gene, it is presumed that the activities of AstD, AstB, and AstE are reduced in addition to AstA.
  • each gene is preferably performed by gene recombination.
  • the gene recombination method uses homologous recombination to delete the expression regulatory sequence of the target gene on the chromosome, for example, the promoter region, the coding region, or a part or all of the non-coding region. Or inserting other sequences into these regions, introducing frameshifts, nonsense mutations, missense mutations.
  • the modification of the expression regulatory sequence is preferably 1 base or more, more preferably 2 bases or more, particularly preferably 3 bases or more.
  • the region to be deleted can be any of the N-terminal region, internal region, and C-terminal region. It may be the entire code area. Usually, the longer region to be deleted can surely inactivate the target gene. Further, it is preferable that the reading frames upstream and downstream of the region to be deleted do not match.
  • the insertion position When inserting other sequences into the coding region, the insertion position may be any region of the target gene, but the longer the sequence to be inserted, the more reliably the target gene can be inactivated.
  • the sequences before and after the insertion site preferably do not match the reading frame.
  • Other sequences are not particularly limited as long as they reduce or eliminate the function of the protein encoded by the target gene. Examples include antibiotic resistance genes and transposons carrying genes useful for L-amino acid production. It is done.
  • a deletion type gene is prepared by deleting a partial sequence of the target gene and modifying it so as not to produce a protein that functions normally. This can be accomplished by replacing the target gene on the chromosome with the deleted gene by transforming bacteria with the contained DNA and causing homologous recombination between the deleted gene and the target gene on the chromosome. Even if the protein encoded by the deletion-type target gene is produced, it has a three-dimensional structure different from that of the wild-type protein, and its function decreases or disappears.
  • a method using linear DNA such as a method (see WO2005 / 010175), a plasmid containing a temperature-sensitive replication origin,
  • a method using a plasmid capable of conjugation transfer and a method using a suicide vector which does not have an origin of replication in the host (US Pat. No. 6,303,383 or Japanese Patent Laid-Open No. 05-007491).
  • Confirmation that the enzyme activity of the AST pathway has decreased is performed by the above-described enzyme activity measurement method.
  • (1) Confirmation that the transcription amount of the target gene has decreased can be performed by comparing the amount of mRNA transcribed from the target gene with a wild strain or an unmodified strain. Examples of methods for evaluating the amount of mRNA include Northern hybridization, RT-PCR, and the like (Molecular cloning (Cold spring spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001)).
  • the decrease in the amount of transcription may be any as long as it is reduced compared to the wild strain or the unmodified strain, but for example, at least 75% or less, 50% or less, 25% or less, compared to the wild strain or the unmodified strain, Alternatively, it is desirable that the concentration is reduced to 10% or less, and it is particularly preferable that no expression occurs.
  • the decrease in the amount of protein may be any as long as it is lower than that of the wild strain or non-modified strain, but for example, at least 75% compared to the wild strain or non-modified strain compared to the wild strain or non-modified strain. In the following, it is desirable to decrease to 50% or less, 25% or less, or 10% or less, and it is particularly preferable that no protein is produced (the activity is completely lost).
  • the astA, astB, astC, astD, or astE gene can be mutated to obtain a gene encoding low activity AstA, AstB, AstC, AstD, or AstE.
  • Escherichia bacteria are irradiated with ultraviolet rays, N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine (NTG), nitrous acid, etc.
  • NTG N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine
  • 1 or 2 of the arginine succinyltransferase pathway belongs to the family Enterobacteriaceae and has the ability to produce L-amino acid.
  • Bacteria modified so as to reduce the activity of the above enzyme are cultured, L-amino acid is produced and accumulated in the culture, and L-amino acid is collected from the culture.
  • the L-amino acid an aspartic acid-based amino acid or an aromatic amino acid is preferable.
  • a medium conventionally used in the fermentation production of L-amino acids using bacteria can be used. That is, a normal medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic ions, and other organic components as required can be used.
  • the carbon source saccharides such as glucose, sucrose, lactose, galactose, fructose and starch hydrolysate, alcohols such as glycerol and sorbitol, organic acids such as fumaric acid, citric acid and succinic acid are used. be able to. Of these, glucose, fructose, and sucrose are preferably used as the carbon source.
  • stock which does not have sucrose utilization capability it will become possible to use sucrose as a carbon source by introduce
  • glycerol or fatty acid is preferably used as a carbon source.
  • Glycerol may be used at any concentration that is suitable for producing L-amino acids. When used as a single carbon source in the medium, it is preferably about 0.1 w / v% to 50 w / v%, more preferably about 0.5 w / v% to 40 w / v%, particularly preferably 1 w / v% to About 30 w / v% is contained in the medium.
  • Glycerol can also be used in combination with other carbon sources such as glucose, fructose, sucrose, molasses, starch hydrolysates.
  • glycerol and the other carbon source can be mixed in any ratio, but the ratio of glycerol in the carbon source is 10% by weight or more, more preferably 50% by weight or more, more preferably 70% by weight. % Or more is desirable.
  • Preferred as other carbon sources are glucose, fructose, sucrose, lactose, galactose, molasses, sugars such as sugar hydrolyzate obtained by hydrolysis of starch hydrolyzate or biomass, alcohols such as ethanol, fumaric acid, Organic acids such as citric acid and succinic acid. Among these, glucose is preferable.
  • the preferred initial concentration of glycerol at the start of the culture is as described above, but glycerol may be added depending on the consumption of glycerol during the culture.
  • the glycerol used may be pure glycerol or crude glycerol.
  • Crude glycerol refers to glycerol containing impurities produced industrially. Crude glycerol is produced industrially by contacting and hydrolyzing fats and oils with water under high temperature and high pressure, or by an esterification reaction for biodiesel fuel production.
  • Biodiesel fuel is fatty acid methyl ester that is produced by transesterification from oil and methanol, and crude glycerol is produced as a by-product of this reaction (Fukuda, H., Kondo, A., and Noda, H 2001, J. Biosci. Bioeng. 92, 405-416).
  • an alkali catalyst method is often used for transesterification, and an acid is added during neutralization, so that crude glycerol having a purity of about 70 to 95% by weight containing water and impurities is produced.
  • Crude glycerol produced in biodiesel fuel production contains, in addition to water, residual methanol and alkali salts such as NaOH as a catalyst and salts of acids such as K 2 SO 4 used for neutralization as impurities. .
  • alkali salts such as NaOH as a catalyst and salts of acids such as K 2 SO 4 used for neutralization as impurities.
  • salts and methanol reach several percent.
  • ions derived from alkali or acid used for neutralization thereof such as sodium, potassium, chloride ion and sulfate ion are 2 to 7%, preferably 3 to 6% based on the weight of crude glycerol. More preferably, the content is 4 to 5.8%.
  • Methanol may not be contained as an impurity, but it is preferably contained in 0.01% or less.
  • crude glycerol may contain trace amounts of metals, organic acids, phosphorus, fatty acids and the like.
  • the organic acid included include formic acid and acetic acid.
  • the organic acid may not be included as an impurity, but preferably 0.01% or less.
  • the trace metal contained in the crude glycerol is preferably a trace metal necessary for the growth of microorganisms, and examples thereof include magnesium, iron, calcium, manganese, copper, and zinc.
  • Magnesium, iron, and calcium are preferably contained in a total amount of 0.00001 to 0.1%, preferably 0.0005 to 0.1%, more preferably 0.004 to 0.05%, and still more preferably 0.007 to 0.01%, based on the weight of the crude glycerol.
  • Manganese, copper, and zinc are preferably contained in a total amount of 0.000005 to 0.01%, more preferably 0.000007 to 0.005%, and still more preferably 0.00001 to 0.001%.
  • the purity of glycerol in the crude glycerol may be 10% or more, preferably 50% or more, more preferably 70% or more, and particularly preferably 80% or more. As long as the content of impurities satisfies the above range, the purity of glycerol may be 90% or more.
  • the crude glycerol may be added to the medium so that the concentration of glycerol is the above concentration depending on the purity of glycerol. Further, both glycerol and crude glycerol may be added to the medium.
  • the fatty acid refers to a monovalent carboxylic acid of a long-chain hydrocarbon that can be represented by the general formula CnHmCOOH (n + 1 and m + 1 represent the number of carbon atoms and the number of hydrogen contained in the fatty acid, respectively). In general, those having 12 or more carbon atoms are often called long-chain fatty acids. Various types of fatty acids exist depending on the number of carbon atoms and the degree of unsaturation. In addition, fatty acids are constituents of fats and oils, and it is known that the composition of fatty acids varies depending on the type of fats and oils. Myristic acid (C 13 H 27 COOH) is a saturated fatty acid having 14 carbon atoms, and is contained in palm oil and palm oil.
  • Palmitic acid (C 15 H 31 COOH) is a saturated fatty acid having 16 carbon atoms and is generally abundant in vegetable oils.
  • Stearic acid (C 17 H 35 COOH) is a saturated fatty acid having 18 carbon atoms, and is abundant in animal fats and vegetable oils.
  • Oleic acid (C 17 H 33 COOH) is a monovalent unsaturated fatty acid having 18 carbon atoms, and is abundant in animal fats and vegetable oils.
  • Linoleic acid (C 17 H 31 COOH) is a polyunsaturated fatty acid having 18 carbon atoms and two cis-type double bonds at the 9th and 12th positions.
  • As the fatty acid a mixture of the above-mentioned long chain fatty acids can also be used.
  • the mixing ratio of the fatty acids may be any concentration ratio as long as the bacteria used in the method of the present invention can assimilate as the carbon source. It is also possible to use a mixture of fatty acids excluding glycerol from the hydrolyzate of fats and oils.
  • a hydrolyzate of fats and oils can also be used.
  • Fats and oils are esters of fatty acids and glycerol, also called triglycerides.
  • any oils such as fatty oils that indicate liquids at room temperature and fats that indicate solids can be used as long as hydrolysis reaction is possible.
  • animal-derived (including fish) fats and oils and plant-derived fats and oils can be used, and one kind or a combination of two or more kinds can be used.
  • the fats and oils used as a raw material may be pure fats and oils or a mixture containing substances other than fats and oils.
  • fats and oils are a plant origin
  • the plant extract containing fats and oils or its fraction is mentioned.
  • animal fats include butter, pork fat, beef tallow, sheep fat, whale oil, sardine oil, herring oil and the like.
  • vegetable oils include, but are not limited to, palm oil, olive oil, rapeseed oil, soybean oil, rice bran oil, walnut oil, sesame oil, and peanut oil. Palm oil is an oil and fat that can be obtained from the fruit of oil palm, and its use as a biodiesel fuel has been increasing in recent years, resulting in an increase in production. Oil palm is a general term for plants classified into the genus Elaeis.
  • Crude palm oil generally refers to unrefined palm oil produced in a mill and is traded as crude palm oil.
  • microalgae are known to accumulate oils and fats (Chisti, Y. 2007. Biotechnol Adv. 25: 294-306), and can be extracted from algal bodies.
  • organic substances such as saccharides, proteins, and amino acids are contained in the algae, but a mixture containing these may be hydrolyzed and used as a carbon source.
  • fatty acid species generated by hydrolysis are those that can be utilized as a carbon source by the bacteria used in the method of the present invention, and fats and oils having a higher content thereof are desirable. Examples of long-chain fatty acid species that can be assimilated by bacteria having L-amino acid-producing ability include lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid, and oleic acid.
  • the oil and fat hydrolyzate in the present invention refers to a product obtained by chemically or enzymatically hydrolyzing the above fat and oil, and refers to a mixture of fatty acid and glycerol.
  • an industrial hydrolysis method a continuous high-temperature hydrolysis method in which oil and fat are in alternating current contact under high temperature (250-260 ° C.) and high pressure (5-6 MPa) is generally performed.
  • the reaction is carried out industrially at a low temperature (around 30 ° C.) using an enzyme (Jaeger, K. E. et al. 1994. FEMS Microbiol. Rev. 15: 29-63).
  • the enzyme lipase which catalyzes the hydrolysis reaction of fats and oils can be used.
  • Lipase is an industrially important enzyme and has various industrial uses (Hasan, F. et al. 2006. Enzyme and Microbiol. Technol. 39: 235-251).
  • the hydrolyzate of fats and oils is a mixture of a fatty acid and glycerol, and it is known that the weight ratio of glycerol to fatty acids contained in a general hydrolyzate of fats and oils such as palm oil is about 10%.
  • the hydrolyzate of fats and oils is not particularly limited as long as it contains a fatty acid.
  • a hydrolyzate of fats and oils can be used as it is, it can be used by removing a part of the fatty acid and glycerol, or can be used by adding the fatty acid and glycerol.
  • the weight ratio of glycerol to fatty acid at this time is preferably 5 to 20: 100, more preferably 7.5 to 15: 100.
  • the amount of fatty acid or fat hydrolyzate contained in the medium used in the method of the present invention may be any amount as long as the bacterium used in the method of the present invention can assimilate as a carbon source.
  • it is preferably contained at 10 w / v% or less, preferably 5 w / v% or less, more preferably 2 w / v% or less.
  • it is desirable that it be contained at 0.2 w / v% or more, preferably 0.5 w / v% or more, more preferably 1.0 w / v% or more.
  • the concentration in the medium after fed-batch is 5 w / v% or less, preferably 2 w / v% or less, more preferably It is preferably contained at 1 w / v% or less.
  • it should be controlled in an amount of 0.01 w / v% or more, preferably 0.02 w / v% or more, more preferably 0.05 w / v% or more. Is preferred.
  • the fatty acid concentration is determined by gas chromatography (Hashimoto, K. et al. 1996. Biosci.Biotechnol. Biochem. 70: 22-30) or HPLC (Lin, J. T. et al. 1998. J. Chromatogr. A 808: It can be measured according to 43-49).
  • the fatty acid added to the medium or the fatty acid contained in the hydrolyzate of oils and fats is desirably used as an alkali metal salt with sodium or potassium that micelles into water.
  • the solubility of sodium and potassium salts of fatty acids may not be sufficient for use as a fermentation raw material. Therefore, it is preferable to add a step for promoting homogenization, such as emulsification, so that bacteria having L-amino acid-producing ability can efficiently assimilate fatty acids as a carbon source.
  • an emulsification accelerator or a surfactant may be added as an emulsification method.
  • examples of the emulsification promoter include phospholipids and sterols.
  • nonionic surfactant polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester such as poly (oxyethylene) sorbitan monooleate (Tween ⁇ ⁇ 80), alkyl glucoside such as n-octyl ⁇ -D-glucoside, Examples thereof include sucrose fatty acid esters such as sucrose stearate and polyglycerin fatty acid esters such as polyglycerin stearate.
  • the zwitterionic surfactant include N, N-dimethyl-N-dodecylglycine betaine which is an alkylbetaine.
  • Triton X-100 Triton X-100
  • polyoxyethylene (20) cetyl ether Brij-58
  • nonylphenol ethoxylate Tegitol NP-40
  • This operation may be any operation as long as it promotes emulsification and homogenization of fatty acids.
  • Specific examples include homogenizer treatment, homomixer treatment, ultrasonic treatment, high pressure treatment, high temperature treatment, and the like, and homogenizer treatment, ultrasonic treatment, and combinations thereof are more preferable. It is particularly preferable to combine the treatment with the surfactant with the homogenizer treatment and / or the ultrasonic treatment, and it is desirable that these treatments be performed under alkaline conditions where the fatty acid is more stable.
  • the alkaline condition is preferably pH 9 or higher, more preferably pH 10 or higher.
  • a normal medium containing a nitrogen source, inorganic ions and other organic components as required can be used in addition to the carbon source.
  • a nitrogen source contained in the culture medium of the present invention ammonium salts such as ammonia, ammonium sulfate, ammonium carbonate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium acetate, urea and the like can be used, and used for pH adjustment. Ammonia gas and aqueous ammonia can also be used as a nitrogen source.
  • peptone, yeast extract, meat extract, malt extract, corn steep liquor, soybean hydrolyzate and the like can also be used.
  • nitrogen sources Only one of these nitrogen sources may be included in the medium, or two or more thereof may be included. These nitrogen sources can be used for both the initial medium and the fed-batch medium. In addition, the same nitrogen source may be used for both the initial culture medium and the feed medium, or the nitrogen source of the feed medium may be changed to the initial culture medium.
  • the medium of the present invention preferably contains a phosphate source and a sulfur source in addition to a carbon source and a nitrogen source.
  • phosphoric acid source phosphoric acid polymers such as potassium dihydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate and pyrophosphoric acid can be used.
  • the sulfur source may be any one containing sulfur atoms, but sulfates such as sulfates, thiosulfates and sulfites, and sulfur-containing amino acids such as cysteine, cystine and glutathione are desirable. However, ammonium sulfate is desirable.
  • the medium may contain a growth promoting factor (a nutrient having a growth promoting effect) in addition to the carbon source, nitrogen source, and sulfur source.
  • a growth promoting factor a nutrient having a growth promoting effect
  • the growth promoting factor include trace metals, amino acids, vitamins, nucleic acids, and peptone, casamino acid, yeast extract, soybean protein degradation products, and the like containing these.
  • trace metals include iron, manganese, magnesium, calcium, and vitamins include vitamin B1, vitamin B2, vitamin B6, nicotinic acid, nicotinamide, and vitamin B12.
  • the medium it is preferable to supplement the medium with nutrients required in the case of using an auxotrophic mutant strain that requires amino acids for growth.
  • many L-lysine-producing bacteria that can be used in the present invention have enhanced L-lysine biosynthesis pathways and weakened L-lysine resolution as described above. It is desirable to add one or more selected from homoserine, L-isoleucine, and L-methionine.
  • the initial medium and fed-batch medium may have the same or different medium composition.
  • the initial culture medium and the fed-batch medium may have the same or different medium composition.
  • the composition of each feeding medium may be the same or different.
  • the culture is preferably carried out by aeration culture at a fermentation temperature of 20 to 45 ° C, particularly preferably 33 to 42 ° C.
  • the oxygen concentration is adjusted to 5 to 50%, preferably about 10%.
  • calcium carbonate can be added or neutralized with an alkali such as ammonia gas or ammonia water.
  • the concentration of the accumulated L-amino acid is higher than that of the wild strain and may be any concentration as long as it can be collected and collected from the medium, but it is 50 g / L or more, preferably 75 g / L or more, more preferably 100 g / L or more. is there.
  • the culture of microorganisms may be performed separately in seed culture and main culture, and the seed culture is performed in a flask culture or a batch culture.
  • the main culture may be performed by fed-batch culture or continuous culture, and both seed culture and main culture may be performed by batch culture.
  • the pH during the culture is controlled to 6.5 to 9.0, and the pH of the medium at the end of the culture is controlled to 7.2 to 9.0.
  • fermentation may be performed by a method in which the bicarbonate ion and / or carbonate ion is used as a counter ion of a cation mainly composed of a basic amino acid, and production may be performed by a method of recovering the target basic amino acid (special feature). (See Kai 2002-065287).
  • L-amino acids from fermentation broth is usually performed by ion exchange resin method (Nagai, H. et al., Separation, Science and Technology, 39 (16), 3691-3710), precipitation method, membrane separation method No. 164323, JP-A-9-173792), crystallization methods (WO2008 / 078448, WO2008 / 078646), and other known methods can be combined.
  • ion exchange resin method Naagai, H. et al., Separation, Science and Technology, 39 (16), 3691-3710
  • precipitation method precipitation method
  • membrane separation method No. 164323 JP-A-9-173792
  • crystallization methods WO2008 / 078448, WO2008 / 078646
  • other known methods can be combined.
  • L-amino acid accumulates in the microbial cells, for example, the microbial cells are crushed by ultrasonic waves, etc., and the microbial cells are removed by centrifugation. Can be recovered.
  • the recovered L-amino acid may contain bacterial cells, medium components, water, and bacterial metabolic byproducts in addition to the L-amino acid.
  • the purity of the collected L-amino acid is 50% or more, preferably 85% or more, particularly preferably 95% or more (JP1214636B, USP 5,431,933, 4,956,471, 4,777,051, 4946654, 5,840,358, 6,238,714, US2005 / 0025878)).
  • L-amino acid is precipitated in the medium, it can be recovered by centrifugation or filtration.
  • the L-amino acid precipitated in the medium may be isolated together after crystallization of the L-amino acid dissolved in the medium.
  • the phenylalanine produced by the method of the present invention can be used, for example, for the production of ⁇ -L-aspartyl-L-phenylalanine lower alkyl ester (also referred to as “aspartame”). That is, the method of the present invention includes a method for producing a lower alkyl ester of ⁇ -L-aspartyl-L-phenylalanine using L-phenylalanine as a raw material. This method includes a step of synthesizing a lower alkyl ester of ⁇ -L-aspartyl-L-phenylalanine from L-phenylalanine produced by the above-described method of the present invention and aspartic acid or a derivative thereof. Examples of the lower alkyl ester include methyl ester, ethyl ester, and propyl ester.
  • a method for synthesizing a lower alkyl ester of ⁇ -L-aspartyl-L-phenylalanine from L-phenylalanine and aspartic acid or a derivative thereof is obtained by synthesizing L-phenylalanine or lower alkyl ester of ⁇ -L-aspartyl-L-phenylalanine.
  • a lower alkyl ester of ⁇ -L-aspartyl-L-phenylalanine can be produced by the following method (US Pat. No. 3,786,039).
  • L-phenylalanine is esterified to a lower alkyl ester of L-phenylalanine.
  • This L-phenylalanine alkyl ester is reacted with a derivative of L-aspartic acid in which the ⁇ -carboxyl group is protected and the ⁇ -carboxyl group is esterified and activated.
  • derivatives include N-acyl-L-aspartic anhydride, such as N-formyl-, N-carbobenzoxy-, or Np-methoxycarbobenzoxy-L-aspartic anhydride.
  • Example 1 Construction of L-lysine-producing bacterium with reduced AST pathway enzyme activity ⁇ 1-1> Construction of astA gene-disrupted strain encoding arginine succinyltransferase
  • an arginine succinyltransferase non-producing strain was constructed using the Escherichia coli wild type strain MG1655.
  • pMW118 (attL-Cm-attR) ⁇ (described in U.S. Pat.No. 7,306,933)
  • sequences corresponding to both ends of the attachment sites of att phage and lambda phage at the 3 ′ end of the primer and the target gene PCR was performed using the synthetic oligonucleotides shown in SEQ ID NOs: 11 and 12 at the 5 ′ end of the primer corresponding to a part of the astA gene as primers.
  • the MG1655 ⁇ astA :: att-Cm strain was constructed using the ⁇ -red method described in US Pat. No. 7,306,933.
  • Cm-resistant recombinants are plated on an L-agar medium containing Cm (chloramphenicol) (40 mg / L) at 37 ° C., and a strain that forms a colony is selected. I got it.
  • the obtained astA gene-disrupted strain was designated as MG1655 ⁇ astA :: att-Cm strain.
  • a part of the coding region of the astA gene on the genome is replaced with a Cm resistance gene.
  • the strain was transformed with the plasmid pCABD2 for L-lysine production (International Publication No. WO01 / 53459 pamphlet) carrying the dapA, dapB and lysC genes according to a conventional method, and recombination with chloramphenicol resistance and streptomycin resistance was achieved.
  • L-lysine production International Publication No. WO01 / 53459 pamphlet
  • a WC196 ⁇ cadA ⁇ ldcC ⁇ astA :: att-Cm / pCABD2 strain was constructed. Chloramphenicol resistant and streptomycin resistant recombinants were plated at 37 ° C.
  • the glycerol stock of the strain obtained in Example 1 was thawed, 100 ⁇ L of each was uniformly applied to an L plate containing 20 mg / L of streptomycin, and statically cultured at 37 ° C. for 24 hours. Approximately 1/4 amount of the cells on the obtained plate was suspended in 0.5 mL of physiological saline, and turbidity at a wavelength of 600 nm was measured with a spectrophotometer U-2000 (manufactured by Hitachi).
  • the suspension containing the obtained bacteria is inoculated into 40 mL of a fermentation medium containing 20 mg / L streptomycin (shown below) in a 500 mL baffle Erlenmeyer flask with a final OD 600 of 0.2,
  • the cells were cultured for 48 hours at 37 ° C. with a rotary stirring speed of 200 rpm in a rotary shaking culture device InnOva 4430 (manufactured by New Brunswick Scientific).
  • a carbon source in the main culture sodium oleate, glucose, or glycerol is used, and poly (oxyethylene) sorbitan monooleate (Tween 80: manufactured by Nacalai Tesque) is used as an emulsification accelerator at a final concentration of 0.5% (w / What was added so that it might become v) was used.
  • the total carbon source amount was 10 g / L.
  • the inability of Escherichia coli to assimilate Tween-80 was confirmed separately using M9 minimal medium (see Current Protocols, Molecular, Biology, Ausubel, FFA, Etal, John Wiley, Sons Inc, New York).
  • the culture was performed for 48 hours under the above conditions, and the amount of L-lysine accumulated in the medium was measured using Biotech Analyzer AS310 (manufactured by Sakura Seiki Co., Ltd.). In addition, all the carbon sources added to the medium were consumed, gas chromatography GC-2014 (manufactured by Shimadsu) for oleic acid, Biotech Analyzer AS310 for glucose, and Biotech Analyzer BF-5 (Oji for glycerol). It was confirmed separately using a measuring instrument).
  • composition of the fermentation medium used for the main culture is shown below (units g / L and% (converted to volume / volume). All indicate final concentrations).
  • carbon source sodium oleate (first grade manufactured by Junsei Chemical Co., Ltd.), glucose, or reagent glycerol was used.
  • Carbon source 10 g / L The pH was adjusted to 7.5 with HCl and autoclaved at 120 ° C. for 20 minutes.
  • Tween 80 0.5% Tween 80 was sterilized with a Nalgene 0.45 ⁇ m filter (Nalge).
  • MgSO 4 ⁇ 7H 2 O 1 g / L MgSO 4 ⁇ 7H 2 O was autoclaved at 120 ° C.
  • a solution obtained by separate sterilization divided into the above five sections (1) to (5) was mixed to prepare a fermentation medium using sodium oleate, glucose, or glycerol as a carbon source.
  • Sequence number 1 AstA gene sequence
  • Sequence number 2 AstA amino acid sequence
  • Sequence number 3 AstB gene sequence
  • Sequence number 4 AstB amino acid sequence
  • Sequence number 5 AstC gene sequence
  • Sequence number 6 AstC amino acid sequence
  • Sequence number 7 AstD gene sequence sequence No. 8: AstD amino acid sequence
  • SEQ ID NO: 9 astE gene sequence
  • SEQ ID NO: 10 AstE amino acid sequence
  • SEQ ID NO: 12 primer for destroying astA
  • L-amino acids can be produced efficiently.

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Abstract

Ｌ－アミノ酸生産能を有する腸内細菌科に属する細菌を培地で培養して、Ｌ－アミノ酸を該培地に生成蓄積させ、該培地より前記Ｌ－アミノ酸を採取する、Ｌ－アミノ酸の製造法において、前記細菌は、アルギニンスクシニルトランスフェラーゼ経路の酵素、例えばアルギニンスクシニルトランスフェラーゼ、スクシニルアルギニンジヒドロラーゼ、スクシニルオルニチンアミノトランスフェラーゼ、スクシニルグルタミン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、及び、スクシニルグルタミン酸デサクシニラーゼの１または２以上の酵素の活性が低下するように改変された細菌であることを特徴とする方法。

Description

Ｌ－アミノ酸の製造法
　本発明は、微生物を用いたＬ－アミノ酸の製造法に関する。Ｌ－アミノ酸は、調味料、食品添加物、飼料添加物、化学製品、医薬品などの様々な分野に利用される。
　Ｌ－アミノ酸は、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、エシェリヒア属等に属する微生物を用いた発酵法により工業生産されている。これらの製造法においては、自然界から分離された菌株または該菌株の人工変異株、さらには、組換えDNA技術により塩基性Ｌ－アミノ酸生合成酵素の活性が増大するように改変された微生物などが用いられている。(特許文献１～９）
　エシェリヒア・コリは、Ｌ－アルギニンを分解する代謝経路としてアルギニンスクシニルトランスフェラーゼ経路と呼ばれる代謝経路を保持しており、Ｌ－アルギニン分解の内97％をこのアルギニンスクシニルトランスフェラーゼ経路を利用して行なっていると報告されている（非特許文献１）。また、このアルギニンスクシニルトランスフェラーゼ経路では、エシェリヒア・コリのゲノム配列（GenBank Accession No. U00096）中のastCADBEオペロンによってコードされる酵素群を用いてＬ－アルギニンを分解していることが報告されている(非特許文献1)。
　一方、アルギニンスクシニルトランスフェラーゼ経路とＬ－アミノ酸生産の関係については知られていない。
欧州特許公開EP0643135B 欧州特許公開EP0733712B 欧州特許公開EP1477565A 欧州特許公開EP0796912A 欧州特許公開EP0837134A 国際公開WO01/53459 欧州特許公開EP1170376A 国際公開WO2005/010175 国際公開WO96/17930
J. Bacteriol. 1998 Vol.180,No.16 4278-4286
　本発明は、従来よりもさらに改良された、発酵法によるＬ－アミノ酸の製造法を提供することを課題とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、アルギニンスクシニルトランスフェラーゼ経路の１または２以上の酵素活性を低下させることによって、腸内細菌科のＬ－アミノ酸生産能が大幅に向上することを見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）Ｌ－アミノ酸生産能を有する腸内細菌科に属する細菌を培地で培養して、Ｌ－アミノ酸を該培地に生成蓄積させ、該培地より前記Ｌ－アミノ酸を採取する、Ｌ－アミノ酸の製造法において、前記細菌は、アルギニンスクシニルトランスフェラーゼ経路の１または２以上の酵素の活性が低下するように改変された細菌であることを特徴とする方法。
（２）前記アルギニンスクシニルトランスフェラーゼ経路の酵素が、アルギニンスクシニルトランスフェラーゼ、スクシニルアルギニンジヒドロラーゼ、スクシニルオルニチンアミノトランスフェラーゼ、スクシニルグルタミン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、及び、スクシニルグルタミン酸デサクシニラーゼからなる群から選択される、前記方法。
（３）前記アルギニンスクシニルトランスフェラーゼ、スクシニルアルギニンジヒドロラーゼ、スクシニルオルニチンアミノトランスフェラーゼ、スクシニルグルタミン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、及び、スクシニルグルタミン酸デサクシニラーゼが、それぞれastA、astB、astC、astD、及び、astE遺伝子によりコードされる、前記の方法。
（４）前記遺伝子の発現量を低下させること、又はこれらの遺伝子を破壊することによりアルギニンスクシニルトランスフェラーゼ経路の酵素の活性が低下した前記方法。
（５）少なくともアルギニンスクシニルトランスフェラーゼ活性が低下するように改変された前記方法。
（６）前記腸内細菌科に属する細菌が、エシェリヒア属細菌、エンテロバクター属細菌、または、パントエア属細菌である前記方法。
（７）前記細菌が、エシェリヒア・コリである前記方法。
（８）前記Ｌ－アミノ酸が、アスパラギン酸系アミノ酸、又は、芳香族アミノ酸である、前記方法。
（９）前記アスパラギン酸系アミノ酸が、L－リジン、L－スレオニン、及び、L－メチオニンから選択される１種又は２種以上のアミノ酸である、上記に記載の方法。
（１０）前記芳香族アミノ酸が、L－トリプトファン、L－チロシン、及び、L－フェニルアラニンから選択される１種又は２種以上のアミノ酸である、前記方法。
（１１）前記Ｌ－アミノ酸がＬ－リジンである前記方法。
（１２）前記培地が、脂肪酸またはグリセロールを炭素源として含む培地であることを特徴とする、前記方法。
＜１＞本発明の細菌
　本発明で使用される細菌は、Ｌ－アミノ酸生産能を有する腸内細菌科に属する細菌であり、かつアルギニンスクシニルトランスフェラーゼ経路（以下「AST経路」と呼ぶこともある）の１または２以上の酵素の活性が低下するように改変された細菌である。本発明の細菌は、Ｌ－アミノ酸生産能を有するＬ－アミノ酸生産能を有する腸内細菌科に属する細菌を、AST経路の酵素活性が低下するように改変することによって取得することができる。
　以下に、AST経路の酵素活性が低下するように改変される、本発明の細菌の親株として使用される細菌、及びＬ－アミノ酸生産能の付与又は増強の方法を以下に例示する。尚、本発明の細菌は、AST経路の酵素活性が低下するように改変された腸内細菌科に属する細菌にＬ－アミノ酸生産能を付与するか、AST経路の酵素活性が低下するように改変された腸内細菌科に属する細菌のＬ－アミノ酸生産能を増強することによっても、取得することができる。
　本発明において、Ｌ－アミノ酸生産能を有する細菌とは、培地に培養したとき、L－アミノ酸を生産し、培地中に蓄積する能力を有する細菌をいう。また、好ましくは、目的とするＬ－アミノ酸を、好ましくは0.5g/L以上、より好ましくは1.0g/L以上の量で培地に蓄積させることができる細菌をいう。
　本発明におけるＬ－アミノ酸とは、Ｌ－リジン、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－スレオニン、Ｌ－バリン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－セリン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－グルタミン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－システイン（シスチン）、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－グリシン、Ｌ－アラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－オルニチン、Ｌ－シトルリン、Ｌ－ホモセリンが挙げられるが、特にアスパラギン酸系アミノ酸または芳香族アミノ酸が望ましい。アスパラギン酸系アミノ酸としては、Ｌ－リジン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－メチオニンが挙げられる。また芳香族アミノ酸としてはＬ－トリプトファン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－チロシンが挙げられる。
　なお、本発明において、Ｌ－アミノ酸とは、フリー体のＬ－アミノ酸のみならず、硫酸塩、塩酸塩、炭酸塩、アンモニウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩を含む塩も含む。
＜１－１＞本発明の親株として使用される細菌
本発明の細菌は、腸内細菌科に属し、Ｌ－アミノ酸生産能を有する細菌である。
　腸内細菌科は、エシェリヒア、エンテロバクター、エルビニア、クレブシエラ、パントエア、フォトルハブドゥス、プロビデンシア、サルモネラ、セラチア、シゲラ、モルガネラ、イェルシニア等の属に属する細菌を含む。特に、NCBI (National Center for Biotechnology Information)のデータベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=91347)で用いられている分類法により腸内細菌科に分類されている細菌が好ましい。
　エシェリヒア属に属する細菌とは、特に制限されないが、当該細菌が微生物学の専門家に知られている分類により、エシェリヒア属に分類されていることを意味する。本発明において使用されるエシェリヒア属に属する細菌の例としては、エシェリヒア・コリ（E. coli）が挙げられるが、これに限定されない。
　本発明において使用することができるエシェリヒア属に属する細菌は、特に制限されないが、例えば、ナイトハルトらの著書（Neidhardt, F. C. Ed. 1996. Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology/Second Edition pp. 2477-2483. Table 1. American Society for Microbiology Press, Washington, D.C.）に記述されている系統のものが含まれる。具体的には、プロトタイプの野生株Ｋ１２株由来のエシェリヒア・コリ W3110 （ATCC 27325）、エシェリヒア・コリ MG1655 (ATCC 47076)等が挙げられる。
　これらの菌株は、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所 P.O. Box 1549 Manassas, VA 20108, United States of America）より分譲を受けることが出来る。すなわち各菌株に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることが出来る。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。
　パントエア属に属する細菌とは、当該細菌が微生物学の専門家に知られている分類により、パントエア属に分類されていることを意味する。エンテロバクター・アグロメランスのある種のものは、最近、16S rRNAの塩基配列分析等に基づき、パントエア・アグロメランス、パントエア・アナナティス、パントエア・ステワルティイその他に再分類された(Int. J. Syst. Bacteriol., 43, 162-173 (1993))。本発明において、パントエア属に属する細菌には、このようにパントエア属に再分類された細菌も含まれる。
　以下、前記のような細菌にＬ－アミノ酸生産能を付与する方法、又は前記のような細菌Ｌ－アミノ酸生産能を増強する方法について述べる。
　Ｌ－アミノ酸生産能を付与するには、栄養要求性変異株、Ｌ－アミノ酸のアナログ耐性株又は代謝制御変異株の取得や、Ｌ－アミノ酸の生合成系酵素の発現が増強された組換え株の創製等、従来、コリネ型細菌又はエシェリヒア属細菌等のアミノ酸生産菌の育種に採用されてきた方法を適用することができる（アミノ酸発酵、（株）学会出版センター、1986年５月30日初版発行、第７７～１００頁参照）。ここで、Ｌ－アミノ酸生産菌の育種において、付与される栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質は、単独でもよく、２種又は３種以上であってもよい。また、発現が増強されるＬ－アミノ酸生合成系酵素も、単独であっても、２種又は３種以上であってもよい。さらに、栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質の付与と、生合成系酵素の増強が組み合わされてもよい。
　Ｌ－アミノ酸生産能を有する栄養要求性変異株、アナログ耐性株、又は代謝制御変異株を取得するには、親株又は野生株を通常の変異処理、すなわちＸ線や紫外線の照射、またはＮ－メチル－Ｎ'－ニトロ－Ｎ－ニトロソグアニジン等の変異剤処理などによって処理し、得られた変異株の中から、栄養要求性、アナログ耐性、又は代謝制御変異を示し、かつＬ－アミノ酸生産能を有するものを選択することによって得ることができる。
　また、Ｌ－アミノ酸生産能の付与又は増強は、遺伝子組換えによって、酵素活性を増強することによっても行うことが出来る。酵素活性の増強は、例えば、Ｌ－アミノ酸の生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が増強するように細菌を改変する方法を挙げることができる。遺伝子の発現を増強するための方法としては、遺伝子を含むＤＮＡ断片を、適当なプラスミド、例えば微生物内でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むプラスミドベクターに導入した増幅プラスミドを導入すること、または、これらの遺伝子を染色体上で接合、転移等により多コピー化すること、またこれらの遺伝子のプロモーター領域に変異を導入することにより達成することもできる（国際公開パンフレットWO95/34672号参照）。また、目的のＬ－アミノ酸の生合成経路から分岐して目的のＬ－アミノ酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性を低下または欠損させてもよい。酵素活性の低下又は欠損は、後述のアルギニンスクシニルトランスフェラーゼ経路の酵素の活性を低下させる改変と同様にして行うことができる。
　上記増幅プラスミドまたは染色体上に目的遺伝子を導入する場合、これらの遺伝子を発現させるためのプロモーターは腸内細菌科において機能するものであればいかなるプロモーターであっても良く、用いる遺伝子自身のプロモーターであってもよいし、改変したものでもよい。腸内細菌科で強力に機能するプロモーターを適宜選択することや、プロモーターの－35、－10領域をコンセンサス配列に近づけることによっても遺伝子の発現量の調節が可能である。以上のような、酵素遺伝子の発現を増強する方法は、WO00/18935号パンフレット、欧州特許出願公開1010755号明細書等に記載されている。
　以下、細菌にＬ－アミノ酸生産能を付与する具体的方法、及びＬ－アミノ酸生産能が付与された細菌について例示する。
Ｌ－スレオニン生産菌
　Ｌ－スレオニン生産能を有する微生物として好ましいものは、Ｌ－スレオニン生合成系酵素の１種又は２種以上の活性が増強された細菌が挙げられる。Ｌ－スレオニン生合成系酵素としては、アスパルトキナーゼIII（lysC）、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（asd）、アスパルトキナーゼI（thrA）、ホモセリンキナーゼ（thrB）、スレオニンシンターゼ（thrC）、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ（アスパルテートトランスアミナーゼ）(aspC)が挙げられる。カッコ内は、その遺伝子の略記号である（以下の記載においても同様）。これらの酵素の中では、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アスパルトキナーゼI、ホモセリンキナーゼ、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ、及びスレオニンシンターゼが特に好ましい。Ｌ－スレオニン生合成系遺伝子は、スレオニン分解が抑制されたエシェリヒア属細菌に導入してもよい。スレオニン分解が抑制されたエシェリヒア属細菌としては、例えば、スレオニンデヒドロゲナーゼ活性が欠損したTDH6株（特開2001－346578号）等が挙げられる。
　Ｌ－スレオニン生合成系酵素は、最終産物のＬ－スレオニンによって酵素活性が抑制される。従って、Ｌ－スレオニン生産菌を構築するためには、Ｌ－スレオニンによるフィードバック阻害を受けないようにＬ－スレオニン生合成系遺伝子を改変することが望ましい。また、上記thrA、thrB、thrC遺伝子は、スレオニンオペロンを構成しているが、スレオニンオペロンは、アテニュエーター構造を形成しており、スレオニンオペロンの発現は、培養液中のイソロイシン、スレオニンに阻害を受け、アテニュエーションにより発現が抑制される。この改変は、アテニュエーション領域のリーダー配列あるいは、アテニュエーターを除去することにより達成出来る（Lynn, S. P., Burton, W. S., Donohue, T. J., Gould, R. M., Gumport, R. I., and Gardner, J. F. J. Mol. Biol. 194:59-69 (1987); 国際公開第02/26993号パンフレット; 国際公開第2005/049808号パンフレット参照）。
　スレオニンオペロンの上流には、固有のプロモーターが存在するが、非天然のプロモーターに置換してもよいし（WO98/04715号パンフレット参照）、スレオニン生合成関与遺伝子の発現がラムダファ－ジのリプレッサーおよびプロモーターにより支配されるようなスレオニンオペロンを構築してもよい。（欧州特許第0593792号明細書参照）また、Ｌ－スレオニンによるフィードバック阻害を受けないように細菌を改変するために、α-amino-β-hydroxyvaleric acid （AHV）に耐性な菌株を選抜することも可能である。
　このようにＬ－スレオニンによるフィ－ドバック阻害を受けないように改変されたスレオニンオペロンは、宿主内でコピー数が上昇しているか、あるいは強力なプロモーターに連結し、発現量が向上していることが好ましい。コピー数の上昇は、プラスミドによる増幅の他、トランスポゾン、Mu－ファ－ジ等でゲノム上にスレオニンオペロンを転移させることによっても達成出来る。
　Ｌ－スレオニン生合成系酵素以外にも、解糖系、TCA回路、呼吸鎖に関する遺伝子や遺伝子の発現を制御する遺伝子、糖の取り込み遺伝子を強化することも好適である。これらのＬ－スレオニン生産に効果がある遺伝子としては、トランスヒドロナーゼ（pntAB）遺伝子（欧州特許733712号明細書）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（pepC）(国際公開95/06114号パンフレット)、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ遺伝子（pps）(欧州特許877090号明細書)、コリネ型細菌あるいはバチルス属細菌のピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（国際公開99/18228号パンフレット、欧州出願公開1092776号明細書）が挙げられる。
　また、Ｌ－スレオニンに耐性を付与する遺伝子、Ｌ－ホモセリンに耐性を付与する遺伝子の発現を強化することや、宿主にＬ－スレオニン耐性、Ｌ－ホモセリン耐性を付与することも好適である。耐性を付与する遺伝子としては、rhtA遺伝子(Res. Microbiol. 154:123－135 (2003))、rhtB遺伝子（欧州特許出願公開第0994190号明細書）、rhtC遺伝子（欧州特許出願公開第1013765号明細書）、yfiK、yeaS遺伝子（欧州特許出願公開第1016710号明細書）が挙げられる。また宿主にＬ－スレオニン耐性を付与する方法は、欧州特許出願公開第0994190号明細書や、国際公開第90/04636号パンフレット記載の方法を参照出来る。
　Ｌ－スレオニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、E. coli TDH-6/pVIC40 (VKPM B-3996) (米国特許第5,175,107号、米国特許第5,705,371号)、E. coli 472T23/pYN7 (ATCC 98081) (米国特許第5,631,157号)、E. coli NRRL-21593 (米国特許第5,939,307号)、E. coli FERM BP-3756 (米国特許第5,474,918号)、E. coli FERM BP-3519及びFERM BP-3520 (米国特許第5,376,538号)、E. coli MG442 (Gusyatiner et al., Genetika
(in Russian), 14, 947-956 (1978))、E. coli VL643及びVL2055 (EP 1149911 A)などの
エシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
　TDH-6株はthrC遺伝子を欠損し、スクロース資化性であり、また、そのilvA遺伝子がリーキー(leaky)変異を有する。この株はまた、rhtA遺伝子に、高濃度のスレオニンまたはホモセリンに対する耐性を付与する変異を有する。B-3996株は、RSF1010由来ベクターに、変異thrA遺伝子を含むthrA*BCオペロンを挿入したプラスミドpVIC40を保持する。この変異thrA遺伝子は、スレオニンによるフィードバック阻害が実質的に解除されたアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする。B-3996株は、1987年11月19日、オールユニオン・サイエンティフィック・センター・オブ・アンチビオティクス(Nagatinskaya Street 3-A, 117105 Moscow, Russia)に、受託番号RIA 1867で寄託されている。この株は、また、1987年4月7日、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia) に、受託番号B-3996で寄託されている。
　E. coli VKPM B-5318 (EP 0593792B)も、Ｌ－スレオニン生産菌又はそれを誘導するための親株として使用できる。B-5318株は、イソロイシン非要求性であり、プラスミドpVIC40中のスレオニンオペロンの制御領域が、温度感受性ラムダファージC1リプレッサー及びPRプロモーターにより置換されている。VKPM B-5318は、1990年5月3日、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia)に、受託番号VKPM B-5318で国際寄託されている。
　Escherichia coliのアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードするthrA遺伝子は明らかにされている(ヌクレオチド番号337～2799, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990)。thrA遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrL遺伝子とthrB遺伝子との間に位置する。Escherichia coliのホモセリンキナーゼをコードするthrB遺伝子は明らかにされている(ヌクレオチド番号2801～3733, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990)。thrB遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrA遺伝子とthrC遺伝子との間に位置する。Escherichia coliのスレオニンシンターゼをコードするthrC遺伝子は明らかにされている(ヌクレオチド番号3734～5020, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990)。thrC遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrB遺伝子とyaaXオープンリーディングフレームとの間に位置する。これら三つの遺伝子は、全て、単一のスレオニンオペロンとして機能する。スレオニンオペロンの発現を増大させるには、転写に影響するアテニュエーター領域を、好ましくは、オペロンから除去する(WO2005/049808, WO2003/097839)。
　スレオニンによるフィードバック阻害に耐性のアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする変異thrA遺伝子、ならびに、thrB遺伝子及びthrC遺伝子は、スレオニン生産株E. coli VKPM B-3996に存在する周知のプラスミドpVIC40から一つのオペロンとして取得できる。プラスミドpVIC40の詳細は、米国特許第5,705,371号に記載されている。
　rhtA遺伝子は、グルタミン輸送系の要素をコードするglnHPQ オペロンに近いE. coli染色体の18分に存在する。rhtA遺伝子は、ORF1 (ybiF遺伝子, ヌクレオチド番号764～1651, GenBank accession number AAA218541, gi:440181)と同一であり、pexB遺伝子とompX遺伝子との間に位置する。ORF1によりコードされるタンパク質を発現するユニットは、rhtA遺伝子と呼ばれている(rht: ホモセリン及びスレオニンに耐性)。また、rhtA23変異が、ATG開始コドンに対して-1位のG→A置換であることが判明している(ABSTRACTS of the 17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No. 457, EP 1013765 A)。
　E. coliのasd遺伝子は既に明らかにされており(ヌクレオチド番号3572511～3571408, GenBank accession NC_000913.1, gi:16131307)、その遺伝子の塩基配列に基づいて作製されたプライマーを用いるPCRにより得ることができる(White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)参照)。他の微生物のasd遺伝子も同様に得ることができる。
　また、E. coliのaspC遺伝子も既に明らかにされており(ヌクレオチド番号983742～984932, GenBank accession NC_000913.1, gi:16128895)、PCRにより得ることができる。他の微生物のaspC遺伝子も同様に得ることができる。
Ｌ－リジン生産菌
　エシェリヒア属に属するＬ－リジン生産菌の例としては、Ｌ－リジンアナログに耐性を有する変異株が挙げられる。Ｌ－リジンアナログはエシェリヒア属に属する細菌の生育を阻害するが、この阻害は、Ｌ－リジンが培地に共存するときには完全にまたは部分的に解除される。Ｌ－リジンアナログの例としては、オキサリジン、リジンヒドロキサメート、Ｓ－（２－アミノエチル）－Ｌ－システイン(AEC)、γ－メチルリジン、α－クロロカプロラクタムなどが挙げられるが、これらに限定されない。これらのリジンアナログに対して耐性を有する変異株は、エシェリヒア属に属する細菌を通常の人工変異処理に付すことによって得ることができる。Ｌ－リジンの生産に有用な細菌株の具体例としては、Escherichia coli AJ11442 (FERM BP-1543, NRRL B-12185; 米国特許第4,346,170号参照)及びEscherichia coli VL611が挙げられる。これらの微生物では、アスパルトキナーゼのＬ－リジンによるフィードバック阻害が解除されている。
　Ｌ－リジン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ－リジン生合成系酵素の１種又は２種以上の活性が増強されている株も挙げられる。かかる酵素の例としては、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ(dapA)、アスパルトキナーゼ(lysC)、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ(dapB)、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ(lysA)、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ(ddh) (米国特許第6,040,160号)、フォスフォエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(ppc)、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ(asd)、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ(dapF)、テトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ(dapD)、スクシニルジアミノピメリン酸デアシラーゼ(dapE)及びアスパルターゼ(aspA) (EP 1253195 A)が挙げられるが、これらに限定されない。これらの酵素の中では、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ、フォスフォエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、テトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ、及び、スクシニルジアミノピメリン酸デアシラーゼが特に好ましい。また、親株は、エネルギー効率に関与する遺伝子(cyo) (EP 1170376 A)、ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼをコードする遺伝子(pntAB) (米国特許第5,830,716号)、Ｌ－リジン排出遺伝子であるybjE遺伝子(WO2005/073390)、または、これらの組み合わせの発現レベルが増大していてもよい。
　Ｌ－リジン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ－リジンの生合成経路から分岐してＬ－リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性が低下または欠損している株も挙げられる。Ｌ－リジンの生合成経路から分岐してＬ－リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の例としては、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、リジンデカルボキシラーゼ(米国特許第5,827,698号)、及び、リンゴ酸酵素(WO2005/010175)が挙げられる。
　好ましいＬ－リジン生産菌として、エシェリヒア・コリWC196ΔcadAΔldcC/pCABD2が挙げられる（WO2006/078039）。この菌株は、WC196株より、リジンデカルボキシラーゼをコードするcadA及びldcC遺伝子を破壊し、リジン生合成系遺伝子を含むプラスミドpCABD2（米国特許第6,040,160号）を導入することにより構築した株である。WC196株は、E.coli K-12に由来するW3110株から取得された株で、352位のスレオニンをイソロイシンに置換することによりＬ－リジンによるフィードバック阻害が解除されたアスパルトキナーゼIIIをコードする変異型lysC遺伝子（米国特許第5,661,012号）でW3110株の染色体上の野生型lysC遺伝子を置き換えた後、AEC耐性を付与することにより育種された（米国特許第5,827,698号）。WC196株は、Escherichia coli AJ13069と命名され、1994年12月6日、工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-14690として寄託され、1995年9月29日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-5252が付与されている(米国特許第5,827,698号)。WC196ΔcadAΔldcC自体も、好ましいＬ－リジン生産菌である。WC196ΔcadAΔldcCは、AJ110692と命名され、2008年10月7日独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に国際寄託され、受託番号FERM BP-11027が付与されている。
　pCABD2は、Ｌ－リジンによるフィードバック阻害が解除された変異を有するエシェリヒア・コリ由来のジヒドロジピコリン酸合成酵素（DDPS）をコードする変異型dapA遺伝子と、Ｌ－リジンによるフィードバック阻害が解除された変異を有するエシェリヒア・コリ由来のアスパルトキナーゼIIIをコードする変異型lysC遺伝子と、エシェリヒア・コリ由来のジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードするdapB遺伝子と、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコードするddh遺伝子を含んでいる（国際公開第WO95/16042、WO01/53459号パンフレット）。
Ｌ－メチオニン生産菌
　Ｌ－メチオニン生産菌としては、Ｌ－メチオニン生合成系のリプレッサー（metJ）を欠損し、細胞内のホモセリントランスサクシニラーゼ活性(metA)が増強され、又はＳ－アデノシルメチオニンシンテース活性（metK）が弱化したエシェリヒア属細菌を用いることが出来る（日本特許04110641号公報）。
　Ｌ－トリプトファン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－チロシンは共に芳香族アミノ酸で生合成系が共通しており、芳香族アミノ酸の生合成系酵素をコードする遺伝子としては、デオキシアラビノ－ヘプツロン酸リン酸シンターゼ(aroG)、コリスミン酸ムターゼ－プレフェン酸デヒドラターゼ（pheA）、３－デヒドロキネートシンターゼ（aroB）、シキミ酸デヒドロゲナーゼ（aroE）、シキミ酸キナーゼ（aroL）、５－エノール酸ピルビンシキミ酸３－リン酸シンターゼ（aroA）、コリスミ酸シンターゼ(aroC)が挙げられる（欧州出願公開763127号明細書）。また、これらの遺伝子はチロシンリプレッサー（tyrR）によって制御されることが知られており、tyrR遺伝子を欠損させることによって、芳香族アミノ酸の生合成系酵素活性を上昇してもよい（欧州特許763127号明細書参照）。
　また、３－デオキシ－Ｄ－アラビノヘプツロン酸－７－リン酸シンターゼ（aroF、aroG）は、芳香族アミノ酸によるフィードバック阻害を受けるので、フィードバック阻害を受けないように改変してもよい。例えば、aroFの場合、Ｎ末端より１４７位のＬ－アスパラギン酸または１８１位のＬ－セリンが他のアミノ酸残基に、aroGの場合、Ｎ末端より１４６位のＬ－アスパラギン酸、１４７位のＬ－メチオニン、１５０位のＬ－プロリンもしくは２０２位のＬ－アラニンの１アミノ酸残基、または１５７位のＬ－メチオニン及び２１９位のＬ－アラニンの２アミノ酸残基を他のアミノ酸に置換した変異型aroF、aroG遺伝子を宿主に導入することによって、芳香族生産アミノ酸生産菌を得ることができる（EP0488424）。また、コリスミン酸ムターゼ－プレフェン酸デヒドラターゼも、芳香族アミノ酸によるフィードバック阻害を受けるので、フィードバック阻害を受けないように改変してもよい。
　芳香族アミノ酸はそれぞれ生合成系が共通しており、目的とするＬ－アミノ酸以外の芳香族アミノ酸に固有の生合成系を弱化した株を用いることが好ましい。例えば、目的アミノ酸がＬ－トリプトファンの場合、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－チロシン固有の生合成系を弱化すること、目的アミノ酸がＬ－フェニルアラニンの場合、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン固有の生合成系を弱化することによって、目的Ｌ－アミノ酸を効率よく生産する菌株を得ることができる。生合成系を弱化することは、その生合成系の酵素をコードする遺伝子に変異を導入すること、また弱化したい生合成系により合成されるＬ－アミノ酸を要求する株を、同Ｌ－アミノ酸を含有する合成培地を用いて取得することにより達成できる。（US4,371,614）
Ｌ－トリプトファン生産菌
　Ｌ－トリプトファン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、変異trpS遺伝子によりコードされるトリプトファニル-tRNAシンテターゼが欠損したE. coli JP4735/pMU3028 (DSM10122)及びJP6015/pMU91 (DSM10123) (米国特許第5,756,345号)、トリプトファナーゼが欠損したE. coli AGX17 (pGX44) (NRRL B-12263)及びAGX6(pGX50)aroP (NRRL B-12264) (米国特許第4,371,614号)、フォスフォエノールピルビン酸生産能が増大したE. coli AGX17/pGX50,pACKG4-pps (WO9708333, 米国特許第6,319,696号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。yedA遺伝子またはyddG遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大したエシェリヒア属に属するＬ－トリプトファン生産菌も使用できる(米国特許出願公開2003/0148473 A1及び2003/0157667 A1)。
　Ｌ－トリプトファン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、アントラニレートシンターゼ(trpE)、フォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼ(serA)、３－デオキシ－Ｄ－アラビノヘプツロン酸－７－リン酸シンターゼ(aroG)、３－デヒドロキネートシンターゼ(aroB)、シキミ酸デヒドロゲナーゼ(aroE)、シキミ酸キナーゼ(aroL)、５－エノール酸ピルビルシキミ酸３－リン酸シンターゼ(aroA)、コリスミ酸シンターゼ(aroC)、プレフェン酸デヒドラターゼ、コリスミ酸ムターゼ、及び、トリプトファンシンターゼ(trpAB)から選ばれる酵素の活性の１種又は２種以上が増大した株も挙げられる。アントラニレートシンターゼ及びフォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼは共にＬ－トリプトファン及びＬ－セリンによるフィードバック阻害を受けるので、フィードバック阻害を解除する変異をこれらの酵素に導入してもよい。このような変異を有する株の具体例としては、脱感作型アントラニレートシンターゼを保持するE. coli SV164（trpE8）、及び、フィードバック阻害が解除されたフォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼをコードする変異serA遺伝子を含むプラスミドpGH5をE. coli SV164に導入することにより得られたSV164 (pGH5)が挙げられる。
　前記E. coli SV164 (trpE8)は、Ｌ－トリプトファンによるフィードバック阻害が解除されたアントラニレートシンターゼをコードする変異型trpE遺伝子を、trpE欠失株であるE. coli KB862（DSM7196）に導入することによって得られた株である（WO94/08031、特表平7-507693号）。E. coli SV164 (pGH5)は、このSV164株に、セリンによるフィードバック阻害が解除されたフォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼをコードする変異型serA5遺伝子を含むプラスミドpGH5（WO94/08031）を導入することによって得られた株である。E. coli SV164 (pGH5)は、Ｌ－トリプトファンだけでなく、Ｌ－セリンも生産する（米国特許第7,045,320号）。
　上記E. coli KB862は、AJ13828と命名され、2000年12月21日に工業技術院生命工学工業技術研究所（現　独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）にブダペスト条約に基づいて国際寄託され、受託番号FERM BP-7405が付与されている。
　また、Ｌ－トリプトファン生産菌又はそれを誘導するための親株の例として、３－フォスフォセリンフォスファターゼ（serB）活性を増大した株（US4,371,614）、フォスフォエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（pckA）を増大した株(WO2004/090125)、マレートシンターゼ・イソシトレートリアーゼ・イソシトレートデヒドロゲナーゼキナーゼ／フォスファターゼオペロン（aceオペロン）が構成的に発現するか、又は同オペロンの発現が強化された株（WO2005/103275）が挙げられる。
　Ｌ－トリプトファン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、阻害解除型アントラニレートシンターゼをコードする遺伝子を含むトリプトファンオペロンが導入された株（特開昭57-71397号、特開昭62-244382号、米国特許第4,371,614号）も挙げられる。さらに、トリプトファンオペロン(trpBA)中のトリプトファンシンターゼをコードする遺伝子の発現を増大させることによりＬ－トリプトファン生産能を付与してもよい。トリプトファンシンターゼは、それぞれtrpA及びtrpB遺伝子によりコードされるα及びβサブユニットからなる。さらに、イソシトレートリアーゼ-マレートシンターゼオペロンの発現を増大させることによりＬ－トリプトファン生産能を改良してもよい(WO2005/103275)。
Ｌ－フェニルアラニン生産菌
　Ｌ－フェニルアラニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、E. coli AJ12479(FERM BP-4796)(EP 1484410A)、コリスミ酸ムターゼ－プレフェン酸デヒドロゲナーゼ及びチロシンリプレッサーを欠損したE. coli AJ12739 (tyrA::Tn10, tyrR) (VKPM B-8197)、フィードバック阻害が解除されたコリスミ酸ムターゼ－プレフェン酸デヒドラターゼをコードする変異型pheA34遺伝子を保持するE. coli HW1089 (ATCC 55371) (米国特許第 5,354,672号)、E. coli MWEC101-b (KR8903681)、E. coli NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146及びNRRL B-12147 (米国特許第4,407,952号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。また、親株として、フィードバック阻害が解除されたコリスミ酸ムターゼ－プレフェン酸デヒドラターゼをコードする遺伝子を保持するE. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAB] (FERM BP-3566)、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAD] (FERM BP-12659)、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662)、及びAJ 12604と命名されたE. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB] (FERM BP-3579)も使用できる(EP 488424 B1)。さらに、yedA遺伝子またはyddG遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大したエシェリヒア属に属するＬ－フェニルアラニン生産菌も使用できる(米国特許出願公開2003/0148473 A1及び2003/0157667 A1)。
　また、Ｌ－フェニルアラニン生産菌としては、副生物を細胞内に取り込むように改変すること、例えば、Ｌ－トリプトファンの取り込み遺伝子tnaB、mtrや、Ｌ－チロシンの取り込み遺伝子であるtyrPの発現量を向上させることによっても、効率よくＬ－フェニルアラニンを生産する菌株を取得することができる（EP1484410）。
Ｌ－チロシン生産菌
　Ｌ－チロシン生産菌としては、チロシンによる阻害を受けない脱感作型のプレフェン酸デヒドラターゼ遺伝子(tyrA)を有するエシェリヒア属細菌（欧州特許出願公開1616940号公報）が挙げられる。
　遺伝子組換えにより本発明に用いる細菌を育種する場合、使用する遺伝子は、上述した遺伝子情報を持つ遺伝子や、公知の配列を有する遺伝子に限られず、それらの遺伝子のバリアント、すなわち、コードされるタンパク質の機能が損なわれない限り、それらの遺伝子のホモログや人為的な改変体等、保存的変異を有する遺伝子も使用することができる。すなわち、公知のタンパク質のアミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含む配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。
　ここで、「１若しくは数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、具体的には好ましくは1～20個、より好ましくは1～10個、さらに好ましくは1～5個を意味する。また、保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、遺伝子が由来する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。このような遺伝子は、例えば、部位特異的変異法によって、コードされるタンパク質の特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入または付加を含むように公知の遺伝子の塩基配列を改変することによって取得することができる。
　さらに、上記のような保存的変異を有する遺伝子は、コードされるアミノ酸配列全体に対して、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、特に好ましくは97%以上の相同性を有し、かつ、野生型タンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。
　また、遺伝子の配列におけるそれぞれのコドンは、遺伝子が導入される宿主で使用しやすいコドンに置換したものでもよい。
　保存的変異を有する遺伝子は、変異剤処理等、通常変異処理に用いられる方法によって取得されたものであってもよい。
　また、遺伝子は、公知の遺伝子配列の相補配列又はその相補配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、公知の遺伝子産物と同等の機能を有するタンパク質をコードするDNAであってもよい。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いDNA同士、例えば80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、特に好ましくは97%以上の相同性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いDNA同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、1×SSC、0.1% SDS、好ましくは、0.1×SSC、0.1% SDS、さらに好ましくは、68℃、0.1×SSC、0.1% SDSに相当する塩濃度、温度で、１回、より好ましくは２～３回洗浄する条件が挙げられる。
　プローブとしては、遺伝子の相補配列の一部を用いることもできる。そのようなプローブは、公知の遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、これらの塩基配列を含むDNA断片を鋳型とするPCRによって作製することができる。例えば、プローブとして、300 bp程度の長さのDNA断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件は、50℃、2×SSC、0.1% SDSが挙げられる。
　上記した遺伝子のバリアントに関する記載は、下記のアルギニンスクシニルトランスフェラーゼ経路の酵素をコードする遺伝子及び本明細書に記載した他の遺伝子についても同様に適用される。
　本発明に用いる細菌は、グルコースやスクロース等の通常アミノ酸発酵に使用される糖を資化できる細菌であればいずれでもよいが、特に好ましくはグリセロールまたは脂肪酸の資化性を有する細菌であり、元来グリセロールまたは脂肪酸の資化性を有する細菌、グリセロールまたは脂肪酸の資化性を付与された組換え株、又はグリセロールまたは脂肪酸の資化性が高まった変異株でもよい。
　本発明におけるＬ－アミノ酸生産菌は、グリセロールの資化能力を高めるように改変されていてもよい。グリセロールの資化能力は、グリセロール代謝に関与する遺伝子を改変することによって達成できる。
　グリセロール代謝に関与する遺伝子としては、グリセロールの資化性を高めるために、glpR遺伝子（EP1715056）の発現が弱化されているか、glpA、glpB、glpC、glpD、glpE、glpF、glpG、glpK、glpQ、glpT、glpX、tpiA、gldA、dhaK、dhaL、dhaM、dhaR、fsa及びtalC遺伝子等のグリセロール代謝遺伝子（EP1715055A）の発現が強化されていてもよい。特にグリセロール資化性を高めるために、グリセロールデヒドロゲナーゼ（gldA）、ジハイドロキシアセトンキナーゼ(dhaKLM, dak)遺伝子、フルクトース－６－リン酸アルドラーゼ（fsaB）の発現が強化されていることが好ましい（WO2008/102861）。
　また、グリセロールキナーゼ(glpK)においては、フルクトース-1,6-リン酸によるフィードバック阻害が解除された脱感作型glpK遺伝子を用いることが好ましい（WO2008/081959,WO2008/107277）。
　本発明におけるＬ－アミノ酸生産菌は、油脂の加水分解物や脂肪酸の資化能力を高めるように改変されていても構わない。このような改変には、例えば、腸内細菌群に見出される脂肪酸代謝を調節するDNA結合能を有する転写因子FadRをコードする遺伝子の欠損などが挙げられる（DiRusso, C. C. et al. 1992. J. Biol. Chem. 267: 8685-8691; DiRusso, C. C. et al. 1993. Mol. Microbiol. 7: 311-322）。具体的には、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）のfadR遺伝子は、GenBank Accession No. U00096で登録されているエシェリヒア・コリMG1655株のゲノム配列上の塩基番号1,234,161～1,234,880に位置し、GenBank accession No. AAC74271にて登録されているタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。
　油脂の加水分解物や脂肪酸の資化能力を高めるためには、fadA, fadB, fadI, fadJ, fadL、fadE、fadDから選択される１種または２種以上の遺伝子の発現量を強化してもよい。
　本発明における「fadL遺伝子」とは、腸内細菌群に見出される長鎖の脂肪酸の取り込み能を有する外膜のトランスポーターをコードする遺伝子を意味する（Kumar, G. B. and Black, P. N. 1993. J. Biol. Chem. 268: 15469-15476; Stenberg, F. et al. 2005. J. Biol. Chem. 280: 34409-34419）。FadLをコードする遺伝子としては、具体的には、エシェリヒア・コリのfadL遺伝子として、エシェリヒア・コリのゲノム配列（GenBank Accession No. U00096）の塩基番号2459322～2460668に位置する遺伝子を例示することができる。
　本発明における「fadD遺伝子」とは、腸内細菌群に見出される長鎖の脂肪酸からfatty acyl-CoA を生成するfatty acyl-CoA synthetase活性を触媒すると同時に、内膜を通して取り込む酵素をコードする遺伝子を意味する（Dirusso, C. C. and Black, P. N. 2004. J. Biol. Chem. 279: 49563-49566; Schmelter, T. et al. 2004. J. Biol. Chem. 279: 24163-24170）。FadDをコードする遺伝子としては、具体的には、エシェリヒア・コリのfadD遺伝子として、エシェリヒア・コリのゲノム配列（GenBank Accession No. U00096）の塩基番号1887770～1886085（相補鎖）に位置する遺伝子を例示することができる。
　本発明における「fadE遺伝子」とは、腸内細菌群に見出されるfatty acyl-CoA を酸化するacyl-CoA dehydrogenase活性を触媒する酵素をコードする遺伝子を意味する（O'Brien, W. J. and Frerman, F. E. 1977. J. Bacteriol. 132: 532-540; Campbell, J. W. and Cronan, J. E. 2002. J. Bacteriol. 184: 3759-3764）。
　FadEをコードする遺伝子としては、具体的には、エシェリヒア・コリのfadE遺伝子として、エシェリヒア・コリのゲノム配列（GenBank Accession No. U00096）の塩基番号243303～240859（相補鎖）に位置する、配列番号７に示す塩基配列を有する遺伝子を例示することができる。配列番号８には、同遺伝子がコードするアミノ酸配列を示した。
　本発明における「fadB遺伝子」とは、腸内細菌群に見出されるfatty acid oxidation complexのα componentであり、enoyl-CoA hydratase、3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase、3-hydroxyacyl-CoA epimerase、Δ3-cis-Δ2-trans-enoyl-CoA isomeraseの4つの活性を触媒する酵素をコードする遺伝子を意味する（Pramanik, A. et al. 1979. J. Bacteriol. 137: 469-473; Yang, S. Y. and Schulz, H. 1983. J. Biol. Chem. 258: 9780-9785）。　FadBをコードする遺伝子としては、具体的には、エシェリヒア・コリのfadB遺伝子として、エシェリヒア・コリのゲノム配列（GenBank Accession No. U00096）の塩基番号4028994～4026805（相補鎖）に位置する遺伝子を例示することができる。
　本発明における「fadA遺伝子」とは、腸内細菌群に見出されるfatty acid oxidation complexのβ componentであり、3-ketoacyl-CoA thiolase活性を触媒する酵素をコードする遺伝子を意味する（Pramanik, A. et al. 1979. J. Bacteriol. 137: 469-473）。FadAをコードする遺伝子としては、具体的には、エシェリヒア・コリのfadA遺伝子として、エシェリヒア・コリのゲノム配列（GenBank Accession No. U00096）の塩基番号4026795～4025632（相補鎖）に位置する遺伝子を例示することができる。
　腸内細菌群に見出されるfatty acid oxidation complexは、FadBとFadAが複合体を形成しており、遺伝子としてもfadBAオペロンを形成していることが知られている（Yang, S. Y. et al. 1990. J. Biol. Chem. 265: 10424-10429）。従って、fadBAオペロンとして、オペロン全体を増幅することも可能である。
　また、油脂の加水分解物や脂肪酸の資化能力は、cyoオペロン(cyoABCDE)の増強によっても達成される。本発明における「cyoABCDE」とは、腸内細菌群に見出される末端酸化酵素の一つであるシトクロムbo型酸化酵素複合体（cytochrome bo terminal oxidase complex）の各サブユニットをコードする遺伝子群であり、cyoBがsubunit Iを、cyoAがsubunit IIを、cyoCがsubunit IIIを、cyoCがsubunit IVを、cyoEがheme O synthase活性を触媒する酵素をコードする（Gennis, R. B. and Stewart, V. 1996. p. 217-261. In F. D.Neidhardt (ed.), Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/Second Edition, American Society for Microbiology Press, Washington, D.C; Chepuri et al. 1990. J. Biol. Chem. 265: 11185-11192）。
　cyoAをコードする遺伝子としては、具体的には、エシェリヒア・コリのcyoA遺伝子として、エシェリヒア・コリのゲノム配列（GenBank Accession No. U00096）の塩基番号450834～449887（相補鎖）に位置する遺伝子を例示することができる。cyoBをコードする遺伝子としては、具体的には、エシェリヒア・コリのcyoB遺伝子として、エシェリヒア・コリのゲノム配列（GenBank Accession No. U00096）の塩基番号449865～447874（相補鎖）に位置する遺伝子を例示することができる。cyoCをコードする遺伝子としては、具体的には、エシェリヒア・コリのcyoC遺伝子として、エシェリヒア・コリのゲノム配列（GenBank Accession No. U00096）の塩基番号447884～447270（相補鎖）に位置する遺伝子を例示することができる。cyoDをコードする遺伝子としては、具体的には、エシェリヒア・コリのcyoD遺伝子として、エシェリヒア・コリのゲノム配列（GenBank Accession No. U00096）の塩基番号447270～446941（相補鎖）に位置する遺伝子を例示することができる。cyoE遺伝子をコードする遺伝子としては、具体的には、エシェリヒア・コリのcyoE遺伝子として、エシェリヒア・コリのゲノム配列（GenBank Accession No. U00096）の塩基番号446929～446039（相補鎖）に位置する遺伝子を例示することができる。
　また、本発明の細菌は、ピルビン酸シンターゼ、または、ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼの活性が増大するように改変された菌株であってもよい。（WO2009/031565号参照）
　本発明における「ピルビン酸シンターゼ」とは、アセチル-CoAとCO2からピルビン酸を生成する下記の反応を、電子供与体存在下、例えばフェレドキシンあるいはフラボドキシン存在下で可逆的に触媒する酵素（EC 1.2.7.1）を意味する。ピルビン酸シンターゼは、ＰＳと略称されることもあり、ピルビン酸オキシドレダクターゼ、ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ピルビン酸フラボドキシンオキシドレダクターゼ、または、ピルビン酸オキシドレダクターゼと命名されている場合もある。電子供与体としては、フェレドキシンまたはフラボドキシンを用いることが出来る。
還元型フェレドキシン + アセチル-CoA + CO2 → 酸化型フェレドキシン + ピルビン酸 + ＣｏＡ
　ピルビン酸シンターゼの活性が増強されたことの確認は、増強前の微生物と、増強後の微生物より粗酵素液を調製し、そのピルビン酸シンターゼ活性を比較することにより達成される。ピルビン酸シンターゼの活性は、例えば、Yoonらの方法（Yoon, K. S. et al. 1997. Arch. Microbiol. 167: 275-279）に従って測定できる。例えば、電子受容体としての酸化型メチルビオロゲンとＣｏＡと粗酵素液を含む反応液にピルビン酸を添加した際に、ピルビン酸の脱炭酸反応によって増大する還元型メチルビオロゲンの量を分光学的に測定することによって、測定可能である。酵素活性１ユニット（U）は１分間あたり１μmolのメチルビオロゲンの還元量で表される。親株がピルビン酸シンターゼ活性を有している場合、親株と比較して、好ましくは1.5倍以上、より好ましくは2倍以上、さらに好ましくは3倍以上酵素活性が上昇していることが望ましい。また親株がピルビン酸シンターゼ活性を有していない場合には、ピルビン酸シンターゼ遺伝子を導入することにより、ピルビン酸シンターゼが生成されていればよいが、酵素活性が測定できる程度に強化されていることが好ましく、好ましくは0.001U/mg（菌体タンパク質）以上、より好ましくは0.005U/mg以上、さらに好ましくは0.01U/mg以上が望ましい。ピルビン酸シンターゼは、酸素に対して感受性であり、一般的に活性発現や測定は困難であることも多い（Buckel, W.and Golding, B. T. 2006. Ann. Rev. of Microbiol. 60: 27-49）。したがって、酵素活性の測定に際しては、反応容器中の酸素濃度を低下させて酵素反応を行うことが好ましい。
　ピルビン酸シンターゼをコードする遺伝子は、クロロビウム・テピダム(Chlorobium tepidum)、ハイドロジェノバクター・サーモファイラス（Hydrogenobacter thermophilus）等、還元的ＴＣＡサイクルを持つ細菌のピルビン酸シンターゼ遺伝子を利用することが可能である。また、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）をはじめとする、腸内細菌群に属する細菌由来のピルビン酸シンターゼ遺伝子を利用することも可能である。さらに、ピルビン酸シンターゼをコードする遺伝子は、メタノコッカス・マリパルディス（Methanococcus maripaludis）、メタノカルドコッカス・ジャナスチ（Methanocaldococcus jannaschii）、メタノサーモバクター・サーマトトロフィカス（Methanothermobacter thermautotrophicus）などの独立栄養性メタン生成古細菌（autotrophic methanogens）のピルビン酸シンターゼ遺伝子を利用することが可能である。
　本発明における「ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ」とは、アセチル-CoAとCO2からピルビン酸を生成する下記の反応を、電子供与体存在下、例えばＮＡＤＰＨあるいはＮＡＤＨ存在下で可逆的に触媒する酵素（EC 1.2.1.15）を意味する。ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼは、ＰＮＯと略称されることもあり、ピルビン酸デヒドロゲナーゼと命名されている場合もある。しかしながら、本発明において「ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性」というときは、後述するように、ピルビン酸を酸化的に脱炭酸し、アセチル-CoAを生成する反応を触媒する活性であり、この反応を触媒するピルビン酸デヒドロゲナーゼ（PDH）は、ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼとは別の酵素である。ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼは、電子供与体としては、ＮＡＤＰＨあるいはＮＡＤＨを用いることが出来る。
ＮＡＤＰＨ + アセチル-CoA + CO2 → ＮＡＤＰ+ + ピルビン酸 + CoA
　ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼの活性が増強されたことの確認は、増強前の微生物と、増強後の微生物より粗酵素液を調製し、そのピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ活性を比較することにより達成される。ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼの活性は、例えば、Inuiらの方法（Inui, H. et al. 1987. J. Biol. Chem. 262: 9130-9135）に従って測定できる。例えば、電子受容体としての酸化型メチルビオロゲンとCoAと粗酵素液を含む反応液に、ピルビン酸を添加した際にピルビン酸の脱炭酸反応によって増大する還元型メチルビオロゲンの量を分光学的に測定することによって、測定可能である。酵素活性１ユニット（U）は１分間あたり１μmolのメチルビオロゲンの還元量で表される。親株がピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ活性を有している場合、親株と比較して、好ましくは1.5倍以上、より好ましくは2倍以上、さらに好ましくは3倍以上酵素活性が上昇していることが望ましい。また親株がピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ活性を有していない場合には、ピルビン酸シンターゼ遺伝子を導入することにより、ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼが生成されていればよいが、酵素活性が測定できる程度に強化されていることが好ましく、好ましくは0.001U/mg（菌体タンパク質）以上、より好ましくは0.005U/mg以上、さらに好ましくは0.01U/mg以上が望ましい。ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼは、酸素に対して感受性であり、一般的に活性発現や測定は困難であることも多い（Inui, H. et al. 1987. J. Biol. Chem. 262: 9130-9135; Rotte, C. et al. 2001. Mol. Biol. Evol. 18: 710-720）。
　ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼをコードする遺伝子は、光合成真核微生物で原生動物にも分類されるユーグレナ・グラシリス（Euglena gracilis）のピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ遺伝子（Nakazawa, M. et al. 2000. FEBS Lett. 479: 155-156）、原生生物クリプトスポルジウム・パルバム（Cryptosporidium parvum）のピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ遺伝子（Rotte, C. et al. 2001. Mol. Biol. Evol. 18: 710-720）の他、珪藻タラシオシラ・スードナナ（Tharassiosira pseudonana）にも相同な遺伝子が存在することが知られている（Ctrnacta, V. et al. 2006. J. Eukaryot. Microbiol. 53: 225-231）。
　具体的には、ユーグレナ・グラシリス（Euglena gracilis）のピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ遺伝子が利用できる。（GenBank Accession No. AB021127）。
　本発明の微生物は、ピルビン酸シンターゼの活性に必要な電子供与体の酸化型を還元型にリサイクルする活性が、親株、例えば野生株や非改変株と比べて増大するように改変することによって、ピルビン酸シンターゼの活性が増大するように改変された微生物でもよい。電子供与体の酸化型を還元型にリサイクルする活性としては、フェレドキシン-ＮＡＤＰ+レダクターゼ活性を挙げることができる。また、電子供与体のリサイクル活性の増強に加えて、ピルビン酸シンターゼ活性が増大するように改変することによって、ピルビン酸シンターゼの活性が増大するように改変された微生物でもよい。なお、上記親株は、本来内在的に電子供与体のリサイクル活性をコードする遺伝子を有しているものであってもよいし、本来は電子供与体のリサイクル活性を有さないが、当該活性をコードする遺伝子を導入することにより活性が付与され、Ｌ－アミノ酸生産能が向上するものであってもよい。
　「フェレドキシン-ＮＡＤＰ+レダクターゼ」とは、以下の反応を可逆的に触媒する酵素（EC 1.18.1.2）をいう。
還元型フェレドキシン + NADP+ → 酸化型フェレドキシン + NADPH + H+
　本反応は、可逆反応であり、ＮＡＤＰＨと酸化型フェレドキシン存在下で、還元型フェレドキシンを産生することが可能である。フェレドキシンはフラボドキシンと代替可能でありフラボドキシン-ＮＡＤＰ+レダクターゼと命名されているものも同等の機能を有する。フェレドキシン-ＮＡＤＰ+レダクターゼは微生物から高等生物まで幅広く存在が確認されており（Carrillo, N. and Ceccarelli, E. A. 2003. Eur. J. Biochem. 270: 1900-1915; Ceccarelli, E. A. et al. 2004. Biochim. Biophys. Acta. 1698: 155-165参照）、フェレドキシン-ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ、ＮＡＤＰＨ-フェレドキシンオキシドレダクターゼと命名されているものもある。
　フェレドキシン-ＮＡＤＰ+レダクターゼの活性が増強されたことの確認は、改変前の微生物と、改変後の微生物より粗酵素液を調製し、そのフェレドキシン-ＮＡＤＰ+レダクターゼ活性を比較することにより達成される。フェレドキシン-ＮＡＤＰ+レダクターゼの活性は、例えば、Blaschkowskiらの方法（Blaschkowski, H. P. et al. 1982. Eur. J. Biochem. 123: 563-569）に従って測定できる。例えば、基質としてフェレドキシンを用い、減少するNADPH量を分光学的に測定することによって測定可能である。酵素活性１ユニット（U）は１分間あたり１μmolのNADPHの酸化量で表される。親株がフェレドキシン-ＮＡＤＰ+レダクターゼ活性を有している場合、親株の活性が十分高ければ、増強する必要はないが、親株と比較して、好ましくは1.5倍以上、より好ましくは2倍以上、さらに好ましくは3倍以上酵素活性が上昇していることが望ましい。
　フェレドキシン-ＮＡＤＰ+レダクターゼをコードする遺伝子は、多くの生物種で見出されており、目的のＬ－アミノ酸生産株中で活性を有するものであれば使用することが可能である。エシェリヒア・コリではフラボドキシン-ＮＡＤＰ+レダクターゼとしてfpr遺伝子が同定されている（Bianchi, V. et al. 1993. J. Bacteriol. 175:1590-1595）。また、シュードモナス・プチダ(Psuedomonas putida)には、ＮＡＤＰＨ-プチダレドキシンレダクターゼ（Putidaredoxin reductase）遺伝子とプチダレドキシン（Putidaredoxin）遺伝子がオペロンとして存在することが知られている(Koga, H. et al. 1989. J. Biochem. (Tokyo) 106: 831-836）。
　エシェリヒア・コリのフラボドキシン-ＮＡＤＰ+レダクターゼとしては、エシェリヒア・コリK-12株のゲノム配列（GenBank Accession No. U00096）の塩基番号4111749～4112495（相補鎖）に位置する、fpr遺伝子を例示することができる。また、コリネバクテリウム・グルタミカムのゲノム配列（GenBank Accession No. BA00036）の塩基番号2526234～2527211にフェレドキシン-ＮＡＤＰ+レダクターゼ遺伝子が見出されている（GenBank Accession No. BAB99777）。
　ピルビン酸シンターゼの活性には、フェレドキシン又はフラボドキシンが電子供与体として存在することが必要である。従って、フェレドキシン又はフラボドキシンの産生能が向上するように改変することによって、ピルビン酸シンターゼの活性が増大するように改変された微生物であってもよい。
　また、ピルビン酸シンターゼ活性、又は、フラボドキシン-ＮＡＤＰ+レダクターゼ及びピルビン酸シンターゼ活性が増強するように改変することに加えて、フェレドキシン又はフラボドキシンの産生能が向上するように改変してもよい。
　本発明における「フェレドキシン」とは、非ヘム鉄原子（Fe）と、硫黄原子を含み、4Fe-4S、3Fe-4S、あるいは、2Fe-2Sクラスターと呼ばれる鉄-硫黄クラスターを結合したタンパク質で1電子の伝達体として機能するものを指す。「フラボドキシン」とはFMN（Flavin-mononucleotide）を補欠分子属として含む1あるいは2電子の伝達体として機能するものタンパク質を指す。フェレドキシンとフラボドキシンについては、McLeanらの文献に記載されている（McLean, K. J. et al. 2005. Biochem. Soc. Trans. 33: 796-801）。
　なお、改変に用いる親株は、本来内在的にフェレドキシン又はフラボドキシンをコードする遺伝子を有しているものであってもよいし、本来はフェレドキシン又はフラボドキシン遺伝子を有さないが、フェレドキシン又はフラボドキシン遺伝子を導入することにより活性が付与され、Ｌ－アミノ酸生産能が向上するものであってもよい。
　また、フェレドキシン又はフラボドキシンの産生能が親株、例えば野生株や非改変株と比べて向上していることの確認は、SDS-PAGEや二次元電気泳動あるいは、抗体を用いたウェスタンブロットによって検出することが出来る（Sambrook, J. et al. 1989. Molecular Cloning A Laboratory Manual/Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）。生産量については、野生株あるいは非改変株と比較して、向上していればいずれでもよいが、例えば野生株、非改変株と比べて1.5倍以上、より好ましくは2倍以上、さらに好ましくは3倍以上上昇していることが望ましい。
　フェレドキシン及びフラボドキシンの活性は、適切な酸化還元反応系に加えることで測定することが可能である。例えば、Boyerらにより、産生されたフェレドキシンをフェレドキシン-ＮＡＤＰ+レダクターゼにより還元し、生じた還元型フェレドキシンによるチトクロームCの還元を定量する方法が開示されている（Boyer, M. E. et al. 2006. Biotechnol. Bioeng. 94: 128-138）。また、フラボドキシンの活性は、フラボドキシン-ＮＡＤＰ+レダクターゼを用いることで、同じ方法で測定が可能である。
　フェレドキシン、又はフラボドキシンをコードする遺伝子は、広く分布しており、コードされるフェレドキシン又はフラボドキシンがピルビン酸シンターゼと電子供与体再生系が利用可能なものであれば、どのようなものでも用いることができる。例えば、エシェリヒア・コリには、2Fe-2Sクラスターを有するフェレドキシンをコードする遺伝子としてfdx遺伝子が存在し（Ta, D. T. and Vickery, L. E. 1992. J. Biol. Chem. 267:11120-11125）、4Fe-4Sクラスターを有するフェレドキシン遺伝子としてyfhL遺伝子が予想されている。また、フラボドキシン遺伝子としては、fldA遺伝子（Osborne, C. et al. 1991. J. Bacteriol. 173: 1729-1737）とfldB遺伝子（Gaudu, P. and Weiss, B. 2000. J. Bacteriol. 182:1788-1793）の存在が知られている。コリネバクテリウム・グルタミカムのゲノム配列（GenBank Accession No. BA00036）においては、塩基番号562643～562963番に複数のフェレドキシン遺伝子fdx（GenBank Accession No. BAB97942）及び塩基番号1148953～1149270番にfer（GenBank Accession No. BAB98495）が見出されている。また、クロロビウム・テピダムにおいては、多くのフェレドキシン遺伝子が存在するが、ピルビン酸シンターゼの電子受容体となる4Fe-4S型のフェレドキシン遺伝子としてフェレドキシンＩ及びフェレドキシンIIが同定されている（Yoon, K. S. et al. 2001. J. Biol. Chem. 276: 44027-44036）。ハイドロジェノバクター・サーモファイラス等、還元的ＴＣＡサイクルを持つ細菌由来のフェレドキシン遺伝子あるいはフラボドキシン遺伝子を用いることもできる。
　具体的には、エシェリヒア・コリのフェレドキシン遺伝子として、エシェリヒア・コリK-12株のゲノム配列（GenBank Accession No. U00096）の塩基番号2654770～2655105番（相補鎖）に位置するfdx遺伝子、及び塩基番号2697685～2697945番に位置するyfhL遺伝子を例示することができる。エシェリヒア・コリのフラボドキシン遺伝子としては、エシェリヒア・コリK-12株のゲノム配列（GenBank Accession No. U00096）の塩基番号710688～710158番（相補鎖）に位置するfldA遺伝子、及び塩基番号3037877～3038398 番に位置するfldB遺伝子を例示することができる。
　クロロビウム・テピダム(Chlorobium tepidum)のフェレドキシン遺伝子としては、クロロビウム・テピダムのゲノム配列（GenBank Accession No. NC_002932）の塩基番号1184078～1184266番に位置するフェレドキシンＩ遺伝子、及び塩基番号1184476～1184664番に位置するフェレドキシンII遺伝子を例示することができる。また、ハイドロジェノバクター・サーモファイラス（Hydrogenobacter thermophilus）のフェレドキシン遺伝子（GenBank Accession No. BAE02673）やスルフォロバス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）のゲノム配列中の塩基番号2345414～2345728番で示されるスルフォロバス・ソルファタリカスのフェレドキシン遺伝子を例示することができる。さらに、上記で例示された遺伝子との相同性に基づいて、クロロビウム（Chlorobium）属、デスルホバクター（Desulfobacter）属、アクイフェクス（Aquifex）属、ハイドロジェノバクター（Hydrogenobacter）属、サーモプロテウス（Thermoproteus）属、パイロバキュラム（Pyrobaculum）属細菌等からクローニングされるものであってもよく、さらにはエンテロバクター属、クレブシエラ属、セラチア属、エルビニア属、エルシニア属等のγ-プロテオバクテリア、コリネバクテリウム・グルタミカム、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム等のコリネ型細菌、シュードモナス・アエルジノーサ等のシュードモナス属細菌、マイコバクテリウム・ツベルクロシス等のマイコバクテリウム属細菌等からクローニングされるものであってもよい。
＜１－２＞アルギニンスクシニルトランスフェラーゼ経路の酵素活性の低下
　次に、アルギニンスクシニルトランスフェラーゼ経路の１または２以上の酵素の活性を低下させる改変について説明する。
　本発明において「アルギニンスクシニルトランスフェラーゼ経路」とは、アルギニンを分解し、５段階でグルタミン酸とコハク酸を生成する以下の反応を司る経路である（以下、「AST経路」と呼ぶことがある）。
　Arginine + succinyl CoenzymeA + α-ketoglutarate + NAD+ →
              2 glutamate + succinate + CoA + 2NH3 + CO2 + NADH + 2H+
具体的には以下の５段階の反応によって触媒される。
１）AstA　アルギニンスクシニルトランスフェラーゼ（arginine succinyltransferase EC 2.3.1.109）
　L-arginine + succinyl-CoA → N2-succinyl-L-arginine + coenzyme A
　アルギニンスクシニルトランスフェラーゼは、アルギニンスクシニル転移酵素、アルギニンスクシニル転移酵素、arginine N-succinyltransferase、arginine and ornithine N2-succinyltransferase、succinyl-CoA:L-arginine 2-N-succinyltransferase、AST、AOSTとも表記される（J. Bacteriol. 1998 Vol.180,No.16 4278-4286）。
　AstAは、astA遺伝子（Synonyms:ECK1745, b1747, ydjV）がコードしている。エシェリヒア・コリのastA遺伝子として、エシェリヒア・コリのゲノム配列（GenBank Accession No. U00096）の塩基番号1827755～1828789に位置する、配列番号１に示す塩基配列を有する遺伝子を例示することができる。配列番号２には、同遺伝子がコードするアミノ酸配列を示した。アルギニンスクシニル転移酵素の酵素活性は、Wauven CV ,et al (1988) Arch Microbiol 150:400-404の方法を参照して測定することが出来る。
２）AstB　スクシニルアルギニンジヒドロラーゼ (succinylarginine dihydrolase EC:3.5.3.23)
　N2-succinyl-L-arginine + 2H2O → N2-succinyl-L-ornithine + 2 ammonia + CO2
　スクシニルアルギニンジヒドロラーゼは、アルギニルコハク酸二加水分解酵素、N-succinylarginine dihydrolase、N2-succinylarginine dihydrolase、arginine succinylhydrolase、2-N-succinyl-L-arginine iminohydrolase、SADとも表記される（J. Bacteriol. 1998 Vol.180,No.16 4278-4286）。
　AstBは、astB遺伝子（Synonyms:ECK1743, b1745, ydjT）がコードしている。エシェリヒア・コリのastB遺伝子として、エシェリヒア・コリのゲノム配列（GenBank Accession No. U00096）の塩基番号1824940～1826283に位置する、配列番号３に示す塩基配列を有する遺伝子を例示することができる。配列番号４には、同遺伝子がコードするアミノ酸配列を示した。スクシニルアルギニンジヒドロラーゼの酵素活性は、Tocilj　A, et al (2005) J.Biol.Chem. 280:15800-15808の方法を参照にして測定することが出来る。
３）AstC　スクシニルオルニチンアミノトランスフェラーゼ(succinylornithine aminotransferase  EC:2.6.1.81) 
　N2-succinyl-L-ornithine + 2-oxoglutarate →
　　N2-succinyl-L-glutamate 5-semialdehyde + L-glutamate
　スクシニルオルニチンアミノトランスフェラーゼは、スクシニルオルニチンアミノ基転移酵素、Succinylornithine transaminase、N2-succinylornithine 5-aminotransferase、2-N-succinyl-L-ornithine:2-oxoglutarate 5-aminotransferase、SOTとも表記される。
　AstCは、astC遺伝子（Synonyms: ECK1746, ydjW, b1748, argM, cstC, ydhW）がコードしている。具体的には、astC遺伝子としてエシェリヒア・コリのゲノム配列（GenBank Accession No. U00096）の塩基番号1828786～1830006に位置する、配列番号５に示す塩基配列を有する遺伝子を例示することができる。配列番号６には、同遺伝子がコードするアミノ酸配列を示した。スクシニルオルニチン　アミノトランスフェラーゼの酵素活性は、Schneider BL,et al (1998) J.Bacteriol 180:4278-4286の方法を参考にして測定することが出来る。
４）AstD　スクシニルグルタミン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ (EC:1.2.1.71)
　N2-succinyl-L-glutamate 5-semialdehyde + NAD+ + H2O →
                             N2-succinylglutamate + NADH + 2 H+
　スクシニルグルタミン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼは、スクシニルグルタミン酸セミアルデヒド脱水素酵素、succinylglutamic semialdehyde dehydrogenase、 N-succinylglutamate 5-semialdehyde dehydrogenase、SGSDHとも表記される。
　AstDは、astD遺伝子（Synonyms: ECK1744, b1746, ydjU）がコードしている。エシェリヒア・コリのastD遺伝子として、エシェリヒア・コリのゲノム配列（GenBank Accession No. U00096）の塩基番号1826280～1827758に位置する、配列番号７に示す塩基配列を有する遺伝子を例示することができる。配列番号８には、同遺伝子がコードするアミノ酸配列を示した。
　スクシニルグルタミン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼの酵素活性は、Schneider BL,et al (1998) J.Bacteriol 180:4278-4286の方法を参考にして測定することが出来る。
５）AstE　スクシニルグルタミン酸デサクシニラーゼ(succinylglutamate desuccinylase　EC:3.5.1.96)
　N2-succinylglutamate + H2O → succinate + L-glutamate
　スクシニルグルタミン酸デサクシニラーゼは、スクシニルグルタミン酸脱スクシニル化酵素、N2-succinylglutamate desuccinylase、SGDSとも表記される。
　AstEは、astE遺伝子（Synonyms: ECK1742, b1744, ydjS）がコードしている。具体的には、エシェリヒア・コリのastE遺伝子として、エシェリヒア・コリのゲノム配列（GenBank Accession No. U00096）の塩基番号1823979～1824947に位置する、配列番号９に示す塩基配列を有する遺伝子を例示することができる。配列番号１０には、同遺伝子がコードするアミノ酸配列を示した。スクシニルグルタミン酸デサクシニラーゼの酵素活性は、Itoh Y.et al 1: J Bacteriol. 1997 Dec;179(23):7280-90 の方法を参考にして測定することが出来る。
　AST経路の酵素としては、例えばエシェリヒア・コリに関しては、配列番号２、４、６、８、１０のアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられるが、タンパク質の機能が変わらない限り、これらのアミノ酸配列において、保存的変異を含むアミノ酸配列を有するものであってもよい。すなわち、配列番号２、４、６、８、１０のアミノ酸配列を有するタンパク質のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加等を含む配列を有するタンパクであってもよい。
　ここで、「１若しくは数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、例えば、１～２０個、好ましくは１～１０個、より好ましくは１～５個を意味する。また、保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからAsn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、遺伝子が由来する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。このような遺伝子は、例えば、部位特異的変異法によって、コードされるタンパク質の特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入または付加を含むように公知の遺伝子の塩基配列を改変することによって取得することができる。
　AST経路の酵素をコードする遺伝子は、アルギニンスクシニルトランスフェラーゼ、スクシニルアルギニンジヒドロラーゼ、スクシニルオルニチンアミノトランスフェラーゼ、スクシニルグルタミン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、又はスクシニルグルタミン酸デサクシニラーゼをコードする限り、配列番号１、３、５、７、又は９からなる塩基配列と相補的な塩基配列または同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであってもよい。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば90％以上、好ましくは95％以上、より好ましくは97％以上、特に好ましくは99％以上の相同性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、さらに好ましくは、６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度、温度で、１回より好ましくは２～３回洗浄する条件が挙げられる。
　プローブとしては、遺伝子の相補配列の一部を用いることもできる。そのようなプローブは、公知の遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、これらの塩基配列を含むDNA断片を鋳型とするPCRによって作製することが出来る。プローブの長さは、ハイブリダイゼーションの条件により適宜選択されるが、通常には、100bp～1Kbpである。またプローブとして300bp程度の長さのDNA断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件は、50℃、2×SSC、0.1%SDSが挙げられる。
　「AST経路の酵素の活性が低下するように改変された」とは、細菌の細胞あたりのAST経路のそれぞれの酵素活性が、非改変株、例えば野生型の腸内細菌科に属する菌株よりも低くなったことをいう。例えば、細胞あたりの酵素の分子数が低下した場合や、分子あたりの酵素活性が低下した場合等が該当する。細胞あたりの酵素活性の比較は、例えば、同じ条件で培養した細菌の細胞抽出液に含まれる酵素活性を比較することによって、行うことができる。尚、活性の「低下」には、活性が完全に消失した場合も含まれる。活性を低下させる酵素は、AstA、AstB、AstC、AstD及びAstEのいずれであってもよく、また１種又は２種以上であってもよい。AST経路の上流側の酵素の活性を低下させることが好ましく、少なくともAstAの活性が低下するように改変されていることが特に好ましい。
　AST経路の酵素の活性が低下したとは、例えばAST経路のそれぞれの酵素活性が、非改変株、例えば野生株と比較して、菌株当たり50％以下、好ましくは30％以下、さらに好ましくは10％以下に低下されていることが好ましい。比較の対照となる野生型のエシェリヒア属細菌としては、例えば、エシェリヒア・コリMG1655株などが挙げられる。各酵素活性が低下したかどうかは上述の方法によって測定できる。
　AST経路の酵素の活性が低下するような改変は、具体的には、染色体上のastA、astB、astC、astD又はastE遺伝子の一部または全部を欠損させたり、これらの遺伝子又はこれらの遺伝子を含むオペロンのプロモーターやシャインダルガルノ（SD）配列等の発現調節配列を改変したりすることなどによって達成される。発現の低下には、転写の低下と翻訳の低下が含まれる。また、発現調節配列以外の非翻訳領域の改変によっても、遺伝子の発現を低下させることができる。染色体上の標的遺伝子の前後の配列を含めて、標的遺伝子全体を欠失させてもよい。また、染色体上の遺伝子のコードする領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、また終始コドンを導入すること（ナンセンス変異）、一～二塩基付加・欠失するフレームシフト変異を導入すること、遺伝子の一部分を欠失させることによっても達成出来る。（Journal of biological Chemistry 272:8611-8617（1997） Proceedings of the National Academy of Sciences,USA 95 5511-5515(1998), Journal of Biological Chemistry 266,20833-20839(1991)）
　エシェリヒア・コリでは、AST経路をコードする遺伝子は、astC、astA、astD、astB、及びastEの各構造遺伝子をこの順で含むastCADBEオペロン構造をとっており、astC上流のプロモーターから転写が開始していると推定されている（Schneider, BL et al. (1998) J. Bacteriol. 180, 4278-4286）。従って、上流遺伝子にナンセンス変異、フレームシフト変異が導入されると下流の遺伝子も正常に発現しない可能性があり、AST経路の複数の酵素活性を低下させるためには、オペロンの上流領域、例えばastオペロンの発現調節領域、又はastCもしくはastA遺伝子のコード領域内に、ナンセンス変異、フレームシフト変異、又は欠失変異を導入することが好ましい。例えば、astA遺伝子に変異を導入すると、AstAに加えて、AstD、AstB、及びAstEの活性も低下すると推定される。AST経路全ての酵素の活性を低下させるためには、例えばastオペロンの発現調節領域、又はastCA遺伝子のコード領域内に変異を導入することが好ましい。
　各遺伝子の改変は、遺伝子組換えにより行われることが好ましい。遺伝子組換えによる方法として具体的には、相同組換えを利用して、染色体上の標的遺伝子の発現調節配列、例えばプロモーター領域、又はコード領域、もしくは非コード領域の一部又は全部を欠損させること、又はこれらの領域に他の配列を挿入すること、フレームシフト、ナンセンス変異、ミスセンス変異を導入することが挙げられる。
　発現調節配列の改変は、好ましくは１塩基以上、より好ましくは２塩基以上、特に好ましくは３塩基以上である。また、コード領域を欠失させる場合は、各遺伝子が産生するタンパク質の機能が低下又は欠失するのであれば、欠失させる領域は、Ｎ末端領域、内部領域、Ｃ末端領域のいずれの領域であってもよく、コード領域全体であってよい。通常、欠失させる領域は長い方が確実に標的遺伝子を不活化することができる。また、欠失させる領域の上流と下流のリーディングフレームは一致しないことが好ましい。
　コード領域に他の配列を挿入する場合も、挿入する位置は標的遺伝子のいずれに領域であってもよいが、挿入する配列は長い方が、確実に標的遺伝子を不活化することができる。挿入部位の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。他の配列としては、標的遺伝子がコードするタンパク質の機能を低下又は欠損させるものであれば特に制限されないが、例えば、抗生物質耐性遺伝子やＬ－アミノ酸生産に有用な遺伝子を搭載したトランスポゾン等が挙げられる。
　染色体上の標的遺伝子を上記のように改変するには、例えば、標的遺伝子の部分配列を欠失し、正常に機能するタンパク質を産生しないように改変した欠失型遺伝子を作製し、該遺伝子を含むＤＮＡで細菌を形質転換して、欠失型遺伝子と染色体上の標的遺伝子とで相同組換えを起こさせることにより、染色体上の標的遺伝子を欠失型遺伝子に置換することによって達成できる。欠失型標的遺伝子によってコードされるタンパク質は、生成したとしても、野生型タンパク質とは異なる立体構造を有し、機能が低下又は消失する。このような相同組換えを利用した遺伝子置換による遺伝子破壊は既に確立しており、「Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）、又は、Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002)）とを組合わせた方法（WO2005/010175号参照）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法や、温度感受性複製起点を含むプラスミド、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で複製起点を持たないスイサイドベクターを利用する方法などがある（米国特許第6303383号明細書、または特開平05-007491号公報）。
　AST経路の酵素活性が低下したことの確認は、上述の酵素活性測定法により行う。 標的遺伝子の転写量が低下したことの確認は、標的遺伝子から転写されるmRNAの量を野生株、あるいは非改変株と比較することによって行うことが出来る。mRNAの量を評価する方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、RT-PCR等が挙げられる（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001））。転写量の低下は、野生株あるいは非改変株と比較して低下していれば、いずれでもよいが、例えば野生株、非改変株と比べて少なくとも75%以下、50％以下、25％以下、又は10％以下に低下していることが望ましく、全く発現していないことが特に好ましい。
　標的遺伝子がコードするタンパク質の量が低下したことの確認は、同タンパク質に結合する抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことが出来る（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001））。タンパク質量の低下は、野生株あるいは非改変株と比較して、低下していればいずれでもよいが、例えば野生株、非改変株と比べて、野生株あるいは非改変株と比べて少なくとも75%以下、50％以下、25％以下、又は10％以下以下に減少していることが望ましく、全くタンパク質を産生していない（完全に活性が消失している）ことが特に好ましい。
　また、astA、astB、astC、astD、又はastE遺伝子を変異処理して、低活性のAstA、AstB、AstC、AstD、又はAstEをコードする遺伝子を取得することもできる。
　AST経路の酵素活性を低下させるには、上述の遺伝子操作法以外に、例えば、エシェリヒア属細菌を紫外線照射または、Ｎ-メチル-Ｎ'-ニトロ-Ｎ-ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理し、AST経路の酵素の活性が低下した菌株を選択する方法が挙げられる。
＜２＞本発明のＬ－アミノ酸の製造法
　本発明のＬ－アミノ酸の製造法においては、腸内細菌科に属し、Ｌ－アミノ酸生産能を有し、かつ、アルギニンスクシニルトランスフェラーゼ経路の１または２以上の酵素の活性が低下するように改変された細菌を培養して、培養物中にＬ－アミノ酸を生産蓄積させ、該培養物からＬ－アミノ酸を採取する。Ｌ－アミノ酸としては、アスパラギン酸系アミノ酸、または芳香族アミノ酸が好ましい。
　使用する培地は、細菌を用いたＬ－アミノ酸の発酵生産において従来より用いられてきた培地を用いることができる。すなわち、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地を用いることができる。ここで、炭素源としては、グルコース、シュクロース、ラクトース、ガラクトース、フラクトースやでんぷんの加水分解物などの糖類、グリセロールやソルビトールなどのアルコール類、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類を用いることができる。なかでも、グルコース、フルクトース、シュクロースを炭素源として用いることが好ましい。なお、シュクロース資化能を持たない株については、シュクロース資化遺伝子を導入することにより、シュクロースを炭素源として使用できるようになる（米国特許第5,175,107号）。
　さらに本発明においては、グリセロールまたは脂肪酸を炭素源として用いることが好ましい。グリセロールは、Ｌ－アミノ酸を製造するのに適した濃度であればどのような濃度で用いてもかまわない。培地中の単独の炭素源として用いる場合、好ましくは０．１ｗ／ｖ％～５０ｗ／ｖ％程度、より好ましくは０．５ｗ／ｖ％～４０ｗ／ｖ％程度、特に好ましくは１ｗ／ｖ％～３０ｗ／ｖ％程度培地に含有させる。グリセロールは、グルコース、フラクトース、スクロース、廃糖蜜、澱粉加水分解物などの他の炭素源と組み合わせて用いることも出来る。この場合、グリセロールと他の炭素源は任意の比率で混合することが可能であるが、炭素源中のグリセロールの比率は、１０重量％以上、より好ましくは５０重量％以上、より好ましくは７０重量％以上であることが望ましい。他の炭素原として好ましいのは、グルコース、フラクトース、スクロース、ラクトース、ガラクトース、廃糖蜜、澱粉加水分解物やバイオマスの加水分解により得られた糖液などの糖類、エタノールなどのアルコール類、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類である。これらの中ではグルコースが好ましい。
　培養開始時のグリセロールの好ましい初発濃度は上記のとおりであるが、培養中のグリセロールの消費に応じて、グリセロールを添加してもよい。
　使用するグリセロールは、純粋なグリセロールであってもよいが、粗グリセロールであってもよい。粗グリセロールとは、工業的に生産される不純物を含むグリセロールをいう。粗グリセロールは、油脂を高温、高圧下で水と接触させ加水分解することによって、あるいは、バイオディーゼル燃料生産のためのエステル化反応によって、工業的に生産される。バイオディーゼル燃料とは、油脂とメタノールからエステル交換反応により生成する脂肪酸メチルエステルのことであり、この反応の副生物として粗グリセロールが生成する（Fukuda, H., Kondo, A., and Noda, H. 2001, J. Biosci. Bioeng. 92, 405-416を参照のこと）。バイオディーゼル燃料生産プロセスでは、エステル交換にはアルカリ触媒法が用いられることが多く、中和時に酸を加えるため、水と不純物を含んだ純度７０～９５重量％程度の粗グリセロールが生成する。バイオディーゼル燃料生産において産生される粗グリセロールは、水に加えて、残存メタノールや触媒であるNaOH等のアルカリとその中和に用いられるK2SO4等の酸との塩を不純物として含んでいる。メーカーや製法により差はあるが、このような塩類やメタノールは数パーセントに達する。ここでナトリウム、カリウム、塩化物イオン、硫酸イオン等の、アルカリやその中和に用いられた酸に由来するイオン類は、粗グリセロールの重量に対し、2～7％、好ましくは3～6%、さらに好ましくは4～5.8%含まれていることが好ましい。メタノールは、不純物として含まれていなくてもよいが、望ましくは0.01%以下含まれていることが好ましい。
　さらに、粗グリセロール中には、微量の金属、有機酸、リン、脂肪酸などを含むことがある。含まれる有機酸としては、蟻酸、酢酸等が挙げられ、不純物として含まれていなくてもよいが、望ましくは0.01%以下含まれていることが好ましい。粗グリセロールに含まれる微量の金属としては、微生物の生育に必要な微量金属が好ましく、例えばマグネシウム、鉄、カルシウム、マンガン、銅、亜鉛等が挙げられる。マグネシウム、鉄、カルシウムは、粗グリセロールの重量に対し、合計で0.00001～0.1%、好ましくは0.0005～0.1%、より好ましくは0.004～0.05％、さらに好ましくは0.007～0.01%含まれていることが好ましい。マンガン、銅、亜鉛としては、合計で0.000005～0.01%、より好ましくは0.000007～0.005%、さらに好ましくは0.00001～0.001%含まれていることが好ましい。
　粗グリセロールのグリセロールの純度としては１０％以上であればよく、好ましくは５０％以上であり、さらに好ましくは７０％以上、特に好ましくは８０％以上である。不純物の含有量が上記の範囲を満たす限り、グリセロールの純度は９０％以上であってもよい。
　粗グリセロールを用いる場合は、グリセロールの純度に応じて、グリセロールの量として上記濃度となるように粗グリセロールを培地に添加すればよい。また、グリセロール及び粗グリセロールの両方を培地に添加してもよい。
　脂肪酸とは、一般式 CnHmCOOH（n+1、m+1は、それぞれ、脂肪酸に含まれる炭素数、水素数を表す）で表わすことができる長鎖炭化水素の1価のカルボン酸を指す。一般的に炭素数が12 以上のものを長鎖脂肪酸と呼ぶことが多い。脂肪酸は、その炭素数と不飽和度によって様々な種類が存在する。また、脂肪酸は、油脂の構成成分であり、油脂の種類によって脂肪酸の組成も異なることが知られている。ミリスチン酸（C13H27COOH）は炭素数14の飽和脂肪酸であり、ヤシ油、パーム油に含まれる。パルミチン酸（C15H31COOH）は炭素数16の飽和脂肪酸であり、植物油脂一般に多く含まれる。ステアリン酸（C17H35COOH）は、炭素数18の飽和脂肪酸であり、動物性脂肪・植物性油に多く含まれる。オレイン酸（C17H33COOH）は、炭素数18の一価の不飽和脂肪酸であり、動物性脂肪や植物油に多く含まれる。リノール酸（C17H31COOH）は炭素数18で9位と12位にシス型二重結合を2つ持っている多価不飽和脂肪酸である。脂肪酸としては、上記の長鎖脂肪酸の混合物を用いることも出来る。脂肪酸の混合物を炭素源として用いる場合、脂肪酸の混合比率は、本発明の方法に使用する細菌が炭素源として資化できる濃度比率であればいずれでもかまわない。油脂の加水分解物から、グリセロールを除いた脂肪酸の混合物を利用することも可能である。
　本発明の方法においては、油脂の加水分解物を用いることもできる。
　油脂は、脂肪酸とグリセロールのエステルであり、トリグリセリド（triglyceride）とも呼ばれる。油脂としては、加水分解反応が可能であれば、常温で液体のものを指す脂肪油（oil）、固体のものを指す脂肪（fat）など、どのようなものも使用することが出来る。また、動物由来（魚類を含む）油脂と植物由来油脂のすべてが使用可能であり、１種または２種以上を組み合わせて使用することも出来る。原料として用いる油脂は、純粋な油脂であってもよいし、油脂以外の物質を含む混合物であってもよい。例えば、油脂が植物由来のものである場合は、油脂を含む植物抽出物又はその分画物が挙げられる。
　動物油脂として、バター、豚脂、牛脂、羊脂等、クジラ油、イワシ油、ニシン油等をあげることができる。植物油脂としては、パーム油、オリーブ油、菜種油、大豆油、米糠油、クルミ油、ゴマ油、ピーナッツ油等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。パーム油はアブラヤシの果実からとれる油脂であり、近年バイオディーセル（biodiesel）燃料としての利用が盛んになり、生産量が高まっている。アブラヤシ（oil palm）は、ヤシ科アブラヤシ属（Elaeis）に分類される植物の総称である。粗パーム油（crude palm oil）は、一般的に搾油工場で生産される未精製のパーム油を指し、粗パーム油として取引が行われている。また、微細藻類にも油脂を蓄積するものが知られており（Chisti, Y. 2007. Biotechnol Adv. 25: 294-306）、藻体から抽出することも可能である。藻体内には油脂以外にも糖類、タンパク質、アミノ酸などの有機物が含まれているが、これらを含む混合物を加水分解して炭素源として用いても構わない。
　油脂としては、加水分解により生じる脂肪酸種が、本発明の方法に使用する細菌が炭素源として資化できるものであり、それらの含量がより高い油脂が望ましい。Ｌ－アミノ酸生産能を有する細菌が資化できる長鎖の脂肪酸種としては、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸などが挙げられる。
　本発明における油脂の加水分解物とは、上記油脂を化学的あるいは酵素により加水分解したものを指し、脂肪酸とグリセロールの混合物を指す。工業的な加水分解法としては、高温（250-260℃）、高圧（5-6MPa）下で油脂と水を交流接触させる連続高温加水分解法が一般的に行われている。また、酵素を用いて低温（30℃前後）で反応を行うことも工業的に行われている（Jaeger, K. E. et al. 1994. FEMS Microbiol. Rev. 15: 29-63）。前記酵素としては、油脂の加水分解反応を触媒する酵素リパーゼを用いることが出来る。リパーゼは工業的に重要な酵素であり、様々な産業的利用がなされている（Hasan, F. et al. 2006. Enzyme and Microbiol. Technol. 39: 235-251）。油脂の加水分解物は、脂肪酸とグリセロールの混合物であり、パーム油等の一般的な油脂の加水分解物に含まれる脂肪酸に対するグリセロールの重量比は10%程度であることが知られている。油脂の加水分解物としては、脂肪酸を含む限り特に制限されない。例えば、油脂の加水分解物をそのまま用いることも出来るが、脂肪酸、グリセロールの一部を除いて使うことも可能であるし、脂肪酸やグリセロールを加えて使用することも出来る。この時のグリセロールの脂肪酸に対する重量比は、好ましくは５～２０：１００、より好ましくは７．５～１５：１００である。
　本発明の方法で使用する培地に含まれる、脂肪酸、または、油脂の加水分解物の量は、本発明の方法に使用する細菌が炭素源として資化できる限り幾らでもよいが、培地中に単独の炭素源として添加する場合、１０w/v%以下、好ましくは５w/v%以下、さらに好ましくは２w/v%以下含まれることが好ましい。また、培地中に単独の炭素源として添加する場合、０．２w/v%以上、好ましくは０．５w/v%以上、さらに好ましくは１．０w/v%以上含まれていることが望ましい。
　また、流加培地として使用する場合は、流加培地に単独の炭素源として添加する場合、流加後の培地中の濃度が５w/v%以下、好ましくは２w/v%以下、さらに好ましくは１w/v%以下で含まれることが好ましい。また、流加培地に単独の炭素源として添加する場合、０．０１w/v%以上、好ましくは０．０２w/v%以上、さらに好ましくは０．０５w/v%以上の量にて制御することが好ましい。なお、脂肪酸の濃度は、ガスクロマトグラフィ（Hashimoto, K. et al. 1996. Biosci.Biotechnol. Biochem. 70:22-30）やHPLC（Lin, J. T. et al. 1998. J. Chromatogr. A. 808: 43-49）により測定することが可能である。
　培地に加える脂肪酸、または油脂の加水分解物に含まれる脂肪酸は、水にミセル化するナトリウムやカリウムなどとのアルカリ金属塩として用いることが望ましい。しかしながら、脂肪酸のナトリウム塩やカリウム塩の溶解度も発酵原料として用いるのには十分ではない場合がある。そこで、Ｌ－アミノ酸生産能を有する細菌が炭素源として脂肪酸をより効率よく資化できるようにするために、乳化を行う等、均一化を促進する工程を加えることが好ましい。例えば乳化方法として、乳化促進剤や界面活性剤を加える等が考えられる。ここで乳化促進剤としては、リン脂質やステロールが挙げられる。また界面活性剤としては、非イオン界面活性剤では、ポリ（オキシエチレン）ソルビタンモノオレイン酸エステル（Tween 80）などのポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、n-オクチルβ-D-グルコシドなどのアルキルグルコシド、ショ糖ステアリン酸エステルなどのショ糖脂肪酸エステル、ポリグリセリンステアリン酸エステルなどのポリグリセリン脂肪酸エステル等が挙げられる。両性イオン界面活性剤としては、アルキルベタインであるN,N-ジメチル-N-ドデシルグリシンベタインなどが挙げられる。これ以外にも、トライトンX-100（Triton X-100）、ポリオキシエチレン(20)セチルエーテル（Brij-58）やノニルフェノールエトキシレート（Tergitol NP-40）等の一般的に生物学の分野で用いられる界面活性剤が利用可能である。
　さらに、脂肪酸の乳化や均一化を促進するための操作も有効である。この操作は、脂肪酸の乳化や均一化を促進する操作であれば、どのような操作でも構わない。具体的には、ホモジナイザー処理、ホモミキサー処理、超音波処理、高圧処理、高温処理などが挙げられるが、ホモジナイザー処理、超音波処理およびこれらの組合せがより好ましい。
　上記界面活性剤による処理と、ホモジナイザー処理及び／または超音波処理を組み合わせることが特に好ましく、これらの処理は、脂肪酸がより安定なアルカリ条件下で行われることが望ましい。アルカリ条件としては、pH9以上が望ましく、より望ましくはpH10以上である。
　培地中に添加するその他の成分としては、炭素源に加えて、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地を用いることができる。本発明の培地中に含まれる窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、ウレア等のアンモニウム塩または硝酸塩等が使用することができ、pH調整に用いられるアンモニアガス、アンモニア水も窒素源として利用できる。また、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、コーンスティープリカー、大豆加水分解物等も利用出来る。培地中にこれらの窒素源を１種のみ含まれていてもよいし、２種以上含んでいてもよい。これらの窒素源は、初発培地にも流加培地にも用いることができる。また、初発培地、流加培地とも、同じ窒素源を用いてもよいし、流加培地の窒素源を初発培地と変更してもよい。
　本発明の培地には、炭素源、窒素源の他にリン酸源、硫黄源が含まれていることが好ましい。リン酸源としては、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２カリウム、ピロリン酸などのリン酸ポリマー等が利用出来る。また、硫黄源とは、硫黄原子を含んでいるものであればいずれでもよいが、硫酸塩、チオ硫酸塩、亜硫酸塩等の硫酸塩、システイン、シスチン、グルタチオン等の含硫アミノ酸が望ましく、なかでも硫酸アンモニウムが望ましい。
　また、培地には、炭素源、窒素源、硫黄源の他に、増殖促進因子（増殖促進効果を持つ栄養素）が含まれていてもよい。増殖促進因子とは、微量金属類、アミノ酸、ビタミン、核酸、更にこれらのものを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆たん白分解物等が使用できる。微量金属類としては、鉄、マンガン、マグネシウム、カルシウム等が挙げられ、ビタミンとしては、ビタミンB1、ビタミンB2、ビタミンB6、ニコチン酸、ニコチン酸アミド、ビタミンB12等が挙げられる。これらの増殖促進因子は初発培地に含まれていてもよいし、流加培地に含まれていてもよい。
　また、培地には、生育にアミノ酸などを要求する栄養要求性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補添することが好ましい。特に本発明に用いることができるＬ－リジン生産菌は、前述のようにＬ－リジン生合成経路が強化されており、Ｌ－リジン分解能が弱化されているものが多いので、Ｌ－スレオニン、Ｌ－ホモセリン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－メチオニンから選ばれる１種又は２種以上を添加することが望ましい。初発培地と流加培地は、培地組成が同じであってもよく、異なっていてもよい。また、初発培地と流加培地は、培地組成が同じであってもよく、異なっていてもよい。さらには、流加培地の流加が多段階で行われる場合、各々の流加培地の組成は同じであってもよく、異なっていてもよい。
　培養は、発酵温度２０～４５℃、特に好ましくは３３～４２℃で通気培養を行うことが好ましい。ここで酸素濃度は、５～５０％に、望ましくは１０％程度に調節して行う。また、ｐＨを５～９に制御し、通気培養を行うことが好ましい。培養中にｐＨが下がる場合には、例えば、炭酸カルシウムを加えるか、アンモニアガス、アンモニア水等のアルカリで中和することができる。このような条件下で、好ましくは１０時間～１２０時間程度培養することにより、培養液中に著量のＬ－アミノ酸が蓄積される。蓄積されるＬ－アミノ酸の濃度は野生株より高く、培地中から採取・回収できる濃度であればいずれでもよいが、50g/L以上、望ましくは75g/L以上、さらに望ましくは100g/L以上である。
　本発明においては、Ｌ－アミノ酸蓄積を一定以上に保つために、微生物の培養を種培養と本培養とに分けて行ってもよく、種培養をフラスコ等を用いたしんとう培養、又は回分培養で行い、本培養を流加培養、又は連続培養で行ってもよく、種培養、本培養ともに回分培養で行ってもよい。
　目的アミノ酸が塩基性アミノ酸である場合は、培養中のｐＨが６．５～９．０、培養終了時の培地のｐＨが７．２～９．０となるように制御し、発酵中の発酵槽内圧力が正となるように制御する、又は、炭酸ガスもしくは炭酸ガスを含む混合ガスを培地に供給して、培地中の重炭酸イオン及び／または炭酸イオンが少なくとも20mM以上存在する培養期があるようにし、前記重炭酸イオン及び／または炭酸イオンを塩基性アミノ酸を主とするカチオンのカウンタイオンとする方法で発酵し、目的の塩基性アミノ酸を回収する方法で製造を行ってもよい（特開2002-065287号参照）。
　発酵液からのＬ－アミノ酸の回収は通常イオン交換樹脂法（Nagai,H.et al., Separation Science and Technology, 39(16),3691-3710）、沈殿法、膜分離法（特開平9-164323号、特開平9-173792号）、晶析法(WO2008/078448、WO2008/078646）、その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。なお、菌体内にＬ－アミノ酸が蓄積する場合には、例えば菌体を超音波などにより破砕し、遠心分離によって菌体を除去して得られる上清からイオン交換樹脂法などによって、Ｌ－アミノ酸を回収することができる。
　尚、回収されるＬ－アミノ酸は、Ｌ－アミノ酸以外に細菌菌体、培地成分、水分、及び細菌の代謝副産物を含んでいてもよい。採取されたＬ－アミノ酸の純度は、50％以上、好ましくは85％以上、特に好ましくは95%以上である (JP1214636B, USP 5,431,933, 4,956,471, 4,777,051, 4946654, 5,840,358, 6,238,714, US2005/0025878))。
　また、Ｌ－アミノ酸が培地中に析出する場合は、遠心分離又は濾過等により回収することができる。また、培地中に析出したＬ－アミノ酸は、培地中に溶解しているＬ－アミノ酸を晶析した後に、併せて単離してもよい。
　本発明の方法によって製造されたフェニルアラニンは、例えば、α－L－アスパルチル－L－フェニルアラニンの低級アルキルエステル（「アスパルテーム」とも呼ばれる）の製造に使用することができる。すなわち、本発明の方法は、L－フェニルアラニンを原料として用いるα－L－アスパルチル－L－フェニルアラニンの低級アルキルエステルの製造法を含む。同方法は、上記の本発明の方法によって製造されたL－フェニルアラニン、及びアスパラギン酸又はその誘導体からα－L－アスパルチル－L－フェニルアラニンの低級アルキルエステルを合成する工程を含む。低級アルキルエステルとしては、メチルエステル、エチルエステル及びプロピルエステル等が挙げられる。
　L－フェニルアラニン、及びアスパラギン酸又はその誘導体からα－L－アスパルチル－L－フェニルアラニンの低級アルキルエステルを合成する方法は、α－L－アスパルチル－L－フェニルアラニンの低級アルキルエステルの合成にL－フェニルアラニン又はその誘導体が用いられる限り特に制限されない。具体的には、例えば、α－L－アスパルチル－L－フェニルアラニンの低級アルキルエステルは、以下の方法により製造することができる（米国特許第3,786,039号）。L－フェニルアラニンをL－フェニルアラニンの低級アルキルエステルにエステル化する。このL－フェニルアラニンアルキルエステルを、β－カルボキシル基が保護され、α－カルボキシル基がエステル化されて活性化されたL－アスパラギン酸の誘導体と反応させる。前記誘導体としては、Ｎ－ホルミル－、Ｎ－カルボベンゾキシ－、又はＮ－ｐ－メトキシカルボベンゾキシ－L－アスパラギン酸無水物のようなＮ－アシル－L－アスパラギン酸無水物が挙げられる。この縮合反応により、Ｎ－アシル－α－L－アスパルチル－L－フェニルアラニンと、Ｎ－アシル－β－L－アスパルチル－L－フェニルアラニンの混合物が得られる。この縮合反応を、37℃における酸解離定数が10-4以下の有機酸の存在下で行うと、β－体に対するα－体の割合が上昇する（特開昭51-113841）。続いて、Ｎ－アシル－α－L－アスパルチル－L－フェニルアラニンを混合物から分離し、水素化してα－L－アスパルチル－L－フェニルアラニンを得る。
　以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
〔実施例１〕AST経路の酵素の活性を低下させたL－リジン生産菌の構築
＜１－１＞アルギニンスクシニルトランスフェラーゼをコードするastA遺伝子破壊株の構築
　まず、エシェリヒア・コリ野生型株MG1655株を用いて、アルギニンスクシニルトランスフェラーゼ非産生株の構築を行った。pMW118(attL-Cm-attR) (米国特許7,306,933号公報に記載)プラスミドを鋳型として、λファージのアタッチメントサイトの配列attLとattRの両端に対応する配列をプライマーの3’末端に、目的遺伝子であるastA遺伝子の一部に対応するプライマーの5’末端に有する配列番号１１及び１２に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーに用いてＰＣＲを行った。増幅産物を用いて、米国特許7,306,933号公報に記載のλ-red法を用いてMG1655ΔastA::att-Cm株を構築した。λ-red法において、Cm耐性組換え体は、３７℃でCm（クロラムフェニコール）(40mg/L)を含むL－寒天培地上で平板培養し、コロニーを形成する株を選択することにより取得した。得られたastA遺伝子破壊株を、MG1655ΔastA::att-Cm株と命名した。MG1655ΔastA::att-Cm株においては、ゲノム上のastA遺伝子のコード領域の一部が、Cm耐性遺伝子で置換されている。
＜１－2＞Ast欠損Ｌ－リジン生産菌の構築
　＜１－１＞にて得られたMG1655ΔastA::att-Cm株から、常法に従いP1ライセートを取得した。このP1ライセートを用いて、米国特許出願公開第2006/0160191号公報に記載の方法で構築したＬ－リジン生産菌E. coli WC196ΔcadAΔldcC株（FERM BP-11027）を宿主としてP1形質導入法を用いて、クロラムフェニコール耐性を指標に、WC196ΔcadAΔldcCΔastA::att-Cm株を構築した。さらに、その菌株にdapA、dapB及びlysC遺伝子を搭載したＬ－リジン生産用プラスミドpCABD2（国際公開第WO01/53459号パンフレット）で常法に従い形質転換し、クロラムフェニコール耐性およびストレプトマイシン耐性の組換え体として、WC196ΔcadAΔldcCΔastA::att-Cm/pCABD2株を構築した。クロラムフェニコール耐性およびストレプトマイシン耐性の組み換え体は、３７℃でCm（クロラムフェニコール）(40mg/L)とSm(ストレプトマイシン) (20mg/L)を含むL－寒天培地上で平板培養し、コロニーを形成する株を選択することにより取得した。また、比較対象株としてWC196ΔcadAΔldcC株を用いた。
　これらの株を、20mg/Lのストレプトマイシンを含むＬ培地にて終OD600≒0.6となるように37℃にて培養した後、培養液と等量の40％グリセロール溶液を加えて攪拌した後、適当量ずつ分注し、-80℃に保存した。これをグリセロールストックと呼ぶ。
〔実施例２〕AST経路遮断Ｌ－リジン生産菌のL－リジン生産能の評価
　実施例１にて得られた株のグリセロールストックを融解し、各100μLを、20mg/Lのストレプトマイシンを含むLプレートに均一に塗布し、37℃にて24時間静置培養した。得られたプレートのおよそ1/4量の菌体を、0.5mLの生理食塩水にけん濁し、分光光度計U-2000（日立社製）で波長600nmの濁度を測定した。得られた菌を含むけん濁液を、500mL容バッフル付三角フラスコの、20mg/Lのストレプトマイシンを含む発酵培地（下記に示す）の40mLに、終OD600が0.2になる液量を接種し、ロータリー振とう培養装置InnOva 4430（New Brunswick Scientific社製）で回転攪拌数200rpm、37℃において48時間培養した。
　本培養における炭素源としては、オレイン酸ナトリウム、グルコース、またはグリセロールを用い、乳化促進剤としてポリ（オキシエチレン）ソルビタンモノオレイン酸エステル（Tween 80：ナカライテスク社製）を終濃度0.5%（w/v）となるように添加したものを用いた。総炭素源量は10g/Lとした。エシェリヒア・コリがTween 80を資化できないことは、M9最小培地（Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.A. et al. John Wiley & Sons Inc. New York 参照）を用いて別途確認した。
　上記の条件で、48時間培養を行い、培地中に蓄積したＬ－リジンの量をバイオテックアナライザーAS310（サクラ精機社製）を用いて測定した。また、培地中に添加した炭素源を全て消費したことを、オレイン酸についてはガスクロマトグラフィGC-2014(Shimadsu社製)、グルコースについてはバイオテックアナライザーAS310、グリセロールについてはバイオテックアナライザーBF-5(王子計測機器)を用いて別途確認した。さらに、培養終了直後にTween 80終濃度1.0%（w/v）となるように添加して希釈して分光光度計U-2000（日立社製）で波長600nmの濁度を測定することにより、培養終了時の菌体量を測定した。
　本培養に用いた発酵培地の組成を以下に示す（単位g/Lおよび%(volume/volume換算)。全て終濃度を示す）。炭素源には、オレイン酸ナトリウム（純正化学社製　一級品）、グルコース、又は試薬グリセロールを用いた。
（１）炭素源                           10 g/L
　HClでpH7.5に調整し、120℃で20分オートクレーブを行なった。
（２）Tween 80                         0.5 %
　(Tween 80はNalgene 0.45μmフィルター(Nalge社製)でフィルター滅菌を行なった。)
（３）MgSO4・7H2O                      1 g/L
　(MgSO4・7H2O  は120℃で20分オートクレーブを行なった。)
（４）(NH4)2SO4                        16 g/L
      KH2PO4                           1 g/L
      FeSO4・7H2O                      0.01 g/L
      MnSO4・7H2O                      0.082 g/L
      Yeast Extract(Difco社製)         2 g/L
　((NH4)2SO4 、KH2PO4 、FeSO4・7H2O 、MnSO4・7H2O、 Yeast Extractはこれらを混合した後 KOHでpH7.5に調整し、120℃で20分オートクレーブを行なった。)
（５）PIPES (pH7.5)                    20g/L
　(NaOHでpH7.5に調整し、120℃で20分オートクレーブを行なった。)
　上記（１）～（５）の５つの区に分けて別殺菌して得られた溶液を混合し、オレイン酸ナトリウム、グルコース、又はグリセロールを炭素源とする発酵培地を作製した。
　本培養の結果を表１に示す（Ｌ－リジン(g/L)は、培地に蓄積したＬ－リジン蓄積量を示す）。尚、培養終了後、培地中のいずれの炭素源もすべて消費されていた。表１から分かるように、astA欠損株であるWC196ΔcadAΔldcCΔastA::att-Cm/pCABD2株は、astA遺伝子を欠損していないWC196ΔcadAΔldcC/pCABD2株と比較して、いずれの炭素源を用いても有意にＬ－リジン蓄積速度が向上した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
〔配列表の説明〕
配列番号１：astA遺伝子配列
配列番号２：AstAアミノ酸配列
配列番号３：astB遺伝子配列
配列番号４：AstBアミノ酸配列
配列番号５：astC遺伝子配列
配列番号６：AstCアミノ酸配列
配列番号７：astD遺伝子配列
配列番号８：AstDアミノ酸配列
配列番号９：astE遺伝子配列
配列番号１０：AstEアミノ酸配列
配列番号１１：astA破壊用プライマー
配列番号１２：astA破壊用プライマー
　本発明によれば、効率よくＬ－アミノ酸を製造することができる。

Claims (12)

  1. 　Ｌ－アミノ酸生産能を有する腸内細菌科に属する細菌を培地で培養して、Ｌ－アミノ酸を該培地に生成蓄積させ、該培地より前記Ｌ－アミノ酸を採取する、Ｌ－アミノ酸の製造法において、前記細菌は、アルギニンスクシニルトランスフェラーゼ経路の１または２以上の酵素の活性が低下するように改変された細菌であることを特徴とする方法。
  2. 　前記アルギニンスクシニルトランスフェラーゼ経路の酵素が、アルギニンスクシニルトランスフェラーゼ、スクシニルアルギニンジヒドロラーゼ、スクシニルオルニチンアミノトランスフェラーゼ、スクシニルグルタミン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、及び、スクシニルグルタミン酸デサクシニラーゼからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記アルギニンスクシニルトランスフェラーゼ、スクシニルアルギニンジヒドロラーゼ、スクシニルオルニチンアミノトランスフェラーゼ、スクシニルグルタミン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、及び、スクシニルグルタミン酸デサクシニラーゼが、それぞれastA、astB、astC、astD、及び、astE遺伝子によりコードされるタンパク質である請求項２に記載の方法。
  4. 　前記遺伝子の発現量を低下させること、又はこれらの遺伝子を破壊することによりアルギニンスクシニルトランスフェラーゼ経路の酵素の活性が低下した、請求項３に記載の方法。
  5. 　少なくともアルギニンスクシニルトランスフェラーゼ活性が低下するように改変された、請求項３または４に記載の方法。
  6. 　前記腸内細菌科に属する細菌が、エシェリヒア属細菌、エンテロバクター属細菌、または、パントエア属細菌である請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 　前記細菌が、エシェリヒア・コリである請求項６に記載の方法。
  8. 　前記Ｌ－アミノ酸が、アスパラギン酸系アミノ酸、又は、芳香族アミノ酸である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 　前記アスパラギン酸系アミノ酸が、Ｌ－リジン、Ｌ－スレオニン、及び、Ｌ－メチオニンから選択される１種又は２種以上のアミノ酸である、請求項８に記載の方法。
  10. 　前記芳香族アミノ酸が、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、及び、Ｌ－フェニルアラニンから選択される１種又は２種以上のアミノ酸である、請求項８に記載の方法。
  11. 前記Ｌ－アミノ酸がＬ－リジンである請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  12. 　前記培地が、脂肪酸またはグリセロールを炭素源として含む培地であることを特徴とする、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
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