WO2010122270A1 - System for detecting hybridization complexes of probes with specific ligands and uses thereof - Google Patents

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Jacques Jean René BONNET
Cathy Guasch
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Definitions

  • the present invention relates to the field of the detection of the presence of ligands of interest in samples, for application in particular in the field of research in biology, including in the genomic domain, and in the field of medical and veterinary diagnosis.
  • Biosensors consisting of supports on which probe compounds are immobilized, such as nucleic acid probes, are increasingly used in research laboratories and in industry. These biosensors are a very important tool for analyzing the qualitative and quantitative constitution of a sample of DNA or RNA molecules.
  • these biosensors also referred to as "DNA chips” consist of a solid support on the surface of which a plurality of distinct probes are immobilized in a predetermined order, generally in the form of a two-dimensional network of "spots” .
  • These biosensors are primarily used in methods of gene expression analysis, including gene transcription analysis, in nucleic acid synthesis methods, in methods for screening candidate drugs, in methods nucleic acid sequencing, or in methods for detecting and analyzing mutations.
  • biosensors comprising several hundred thousand distinct probes.
  • Some biosensors therefore represent sample analysis tools whose detection capacity can cover the entire genome, including the entire human genome.
  • the molecules of interest for example the nucleic acid molecules
  • a detectable molecule for example a radioactive marker, a fluorochrome type marker or even metal particles such as than colloidal gold. Then, the biosensor is brought into contact with the sample to be tested, which leads to the possible formation of complexes between (i) some of the probes immobilized on the surface of the solid support of the biosensor and (ii) molecules of interest capable of be contained in the sample to be tested.
  • the detection step is carried out by scanning illumination of each point on the surface of the biosensor, at the excitation wavelength of the fluorochrome, and the presence of complexes. hybridization is detected, at each surface point, by measuring the fluorescence signal, at the emission wavelength of said fluorochrome.
  • laser fluorescence microscopy detection systems are generally used.
  • the present invention relates to a system for the detection of hybridization complexes between (i) probes and (ii) ligand molecules specifically hybridizing with said probes, said system comprising: a) a biosensor (10) for carrying out hybridization complexes between (i) probes and (ii) ligands specifically hybridizing with said probes, said biosensor consisting of a circular support material (1 1) comprising a first and a second face and whose first face comprises a electroconductive coating surface (12) on which one or more probes (13) are immobilized, said biosensor comprising, on said first face, an electrically detectable mark identifying a fixed position as reference of angular origin, b) means ( 30) for rotating the biosensor (10) at a controlled rate, c) a non-vibrating contactless capacitive sensor (40), d) a means
  • the present invention also relates to a planar biosensor comprising a first and a second face, and wherein: a) the first face is coated with a layer of electrically conductive material on which one or more target nucleic acids are immobilized, and b) the second face comprises a coating for reading or for optical data recording.
  • the present invention also relates to a method for the detection of hybridization complexes between probes and ligand molecules hybridizing specifically with said probes, said method comprising the following steps: a) contacting a biosensor as defined above with a sample to be tested, for a time sufficient for the formation of hybridization complexes between the probes immobilized on said biosensor and ligand molecules likely to be contained in said sample to be tested, b) placing the biosensor in a test system. detection as defined above, and c) detecting any hybridization complexes formed on said biosensor.
  • Figure 1 illustrates a planar biosensor (10) in the form of a disk on the surface of which probes (13) are immobilized.
  • FIG. 2 illustrates an embodiment of a detection system (20) comprising a biosensor (10) and a non-vibrating non-contact capacitive sensor (40). (21) built;
  • Figure 3 illustrates an embodiment of a capacitive sensor without non-vibrating contact. (41) cutting face; (42) metal rod; (43) cylinder of insulating material; (44) shielding;
  • (50) sensor displacement system comprising: (51) carriage; (52) read-write laser diode: (53) worm gear; (54) engine;
  • (80) sensor holding system comprising: (81) lever arm; (82) articulation; (83) spring; (84) stop (screw nut).
  • Figure 4 illustrates an embodiment of the electrical contact system (90) on the face of the biosensor. (91) metal cap; (92) sliding graphite contact;
  • Figure 5 illustrates a measuring means (60) comprising: (40) sensor; (61) amperometric amplifier; (62) digital analog converter; (63) digital computer; (64) filtering; (65) filtering; (66) electronic card; (70) electrically conductive means.
  • Figure 6 shows a diagram illustrating the different steps of the method of manufacturing a biosensor according to the invention.
  • Figure 6A illustrates the starting support disk, which consists of a CD-ROM type optical disk. In Fig. 6A, the face for optical recording is not visible.
  • FIG. 6B illustrates an intermediate product, in which the support material of the optical disk has been coated with a coating layer of a first electroconductive material, on which has been deposited a mark of a second electroconductive material, said mark materializing the angular origin of the biosensor.
  • Figure 6C illustrates the finished biosensor, with the plurality of sets of probes or "spots" immobilized on the surface of the electroconductive coating.
  • the applicant has endeavored to develop a new biosensor and a new reading system adapted to this new biosensor, easier to use than known systems and biosensors, and having a manufacturing cost as well as a cost reduced use.
  • the current techniques resort to a fluorescence detection step, or a radioactivity signal measurement step, to hybridization between the immobilized probes and the labeled molecules of interest.
  • the realization of a final step of detection of the hybridization complexes obliges the implementation of a preliminary step of labeling with a detectable compound (fluorochrome, radioactive molecule, etc.) molecules of interest possibly present in the sample to be tested.
  • the applicant has therefore sought to design a new biosensor and a reading system adapted to this new biosensor, which avoids in particular the use of a preliminary step of labeling the molecules of interest contained in the sample to be tested, that it is a labeling by a fluorochrome detectable molecule or by any other type of detectable molecule.
  • the Applicant has designed a novel biosensor whose general characteristics make it compatible with a variety of reading systems, suitable for the detection of hybridization complexes between immobilized probes and molecules of interest.
  • the Applicant has devised a hybridization complex detection system that is specifically adapted to the newly developed sensor, as detailed in this disclosure.
  • a biosensor whose support on which the probes are immobilized comprises an electroconductive coating.
  • the presence, on the surface of a biosensor of a suitable type, of complexes formed between (i) probes immobilized on said surface, and (ii) ligand molecules initially contained in a sample to be tested, can be detected by measuring the change of electrical potential at the surface of the biosensor, or by measuring changing the dielectric constant at the surface of the biosensor, using a measuring device consisting of a non-contact and non-vibrating capacitive sensor.
  • the dielectric permittivity of the space located between the measuring head of the sensor and the electroconductive surface of the support varies depending on whether (i) said space is constituted by the surrounding atmospheric gaseous fluid, (ii) said space is at least partially occupied by probes immobilized on the support or (iii) said space is at least partially occupied by hybridization complexes between immobilized probes on the support and ligand molecules binding to said immobilized probes.
  • dielectric permittivity is meant the physical property which accounts for the response of the space located between the measuring electrode of the sensor and the electroconductive surface of the support of the invention to the electric field generated between the capacitive sensor without contact. and not vibrating and the electroconductive surface of the support.
  • a biosensor adapted to the detection of hybridization complexes between target probes and ligands binding, preferably specifically, to said target probes, consisting of a flat circular solid support comprising a first and second faces, with the first face comprising on its surface an electroconductive coating, said first face also comprising a plurality of probes, or a plurality of sets of probes, immobilized on its surface, the probes, or the sets of probes , being disposed on said first face along polar coordinates (p, ⁇ ).
  • the location of a specific probe, or of a determined set of probes is defined by the combination of its polar coordinates in which: (i) p is the radial coordinate, this is at say the distance of said probe, or said set of probes, with respect to the center of the circular support, along the axis of the radius, and (ii) ⁇ is the angular coordinate, ie the measurement, in the trigonometrical direction , of the angle between the location of the probes and the half-line of 0 ° angle, also called polar axis, which is previously fixed as original reference.
  • polar coordinates in which: (i) p is the radial coordinate, this is at say the distance of said probe, or said set of probes, with respect to the center of the circular support, along the axis of the radius, and (ii) ⁇ is the angular coordinate, ie the measurement, in the trigonometrical direction , of the angle between the location of the probes and the half-line of 0 °
  • the present invention also provides a system for the detection of hybridization complexes between probes and ligands binding, preferably specifically, to said probes, said system being adapted to the implementation of the circular biosensor defined in a manner general above.
  • the detection of the formation of hybridization complexes between the probes immobilized on the biosensor and ligands binding to said probes is carried out dynamically by a single sensor device, by measuring the variation of the electrical intensity of the current generated in said single sensor when the circular biosensor is rotating, that is to say when the surface of the biosensor is in relative displacement vis-à-vis the electrode, said single sensor.
  • the single sensor that equips the above detection system consists of a capacitive sensor without non-vibrating contact, which allows the detection of electrical potential changes, electrical load variations, variations of dipole moment or variations of dielectric permittivity, each of these variations being produced because of the presence, between the electrode of said single sensor and the surface of the biosensor, of probes immobilized on the biosensor, or of hybridization complexes between said immobilized probes and specific ligands of said probes.
  • the present invention relates to a system for the detection of hybridization complexes between (i) immobilized probes on a support and (ii) ligand molecules specifically hybridizing with said probes, said system comprising: a) a biosensor (10) for carrying out hybridization complexes between (i) probes and (ii) ligands specifically hybridizing with said probes, said biosensor (10) consisting of a planar circular support material (1 1) comprising a first and a second face and whose first face comprises an electroconductive coating surface (12) on which are immobilized one or more probes (13), said biosensor comprising, on said first face, an electrically detectable mark identifying the fixed position as reference angular origin (14), b) means (30) for rotating the biosensor (10) at a controlled speed, c) a non-vibrating contactless capacitive sensor (40), d) means (50) for moving said capacitive non-contacting capacitive sensor
  • said system also comprises g) electroconductive means (95) for grounding the surface of the biosensor (10).
  • said electroconductive means (95) may consist of an electrical cable (95) having a first end connected to the earth and a second end is electrically connected, directly or indirectly, to the biosensor (10).
  • the electric cable (95) is indirectly electrically connected to the biosensor (10) by means of a series of electrically conductive parts electrically connected to each other, respectively (i) a graphite rod (92) in contact, on the one hand with one end of the cable (95) and on the other hand with a metal cap (91) which is placed on the central axis of rotation of the biosensor (10) and is in electrical contact with said biosensor (10).
  • the metal cap (91) has a fixed position with respect to the surface of the biosensor (10), i.e.
  • the electroconductive rod (92) is merely in contact with the cap (91) and therefore does not rotate with the cap (91).
  • maintaining contact of the rod (92) with the surface of the upper part of the cap (91) is ensured by the mechanical connection of the rod (92) with a pushing means of said rod downwards, in general a spring, said rod (92) sliding along an axis perpendicular to the main surface of the biosensor (10).
  • the second end of the electroconductive means (95) may be grounded in a variety of ways known to those skilled in the art. With reference to FIG. 4, the second end of the electroconductive cable is electrically connected to the chassis carrying the detection system of the invention, via the metal bracket (94), said chassis being itself connected to the ground, the stem (95) and the frame being in this embodiment both metal. According to other embodiments, the electroconductive means (95) can be directly connected to the earth via a conventional ground.
  • hybridization complex is meant according to the invention the complex formed between a probe immobilized on the surface (1 1) of the biosensor (10) and one or more ligand molecules non-covalently bound to said probe. .
  • a probe with a single ligand molecule specifically binding to said probe is generally complexed.
  • the ligand molecule is generally bound to the probe by weak non-covalent bonds, which includes hydrogen bonds, electrostatic bonds, ionic bonds or Van der Waals forces.
  • ligand is meant according to the invention any type of molecule having the ability to bind to a probe by non-covalent bonds.
  • the chemical nature of a ligand can be very varied and includes in particular nucleic acids and polypeptides.
  • the probe consists of a nucleic acid
  • the ligand will generally consist of a nucleic acid having a sequence at least partially complementary to the probe nucleic acid with which it has the ability to bind.
  • the ligand may consist of a polypeptide, for example in the embodiments of a system according to the invention in which the probes immobilized on the surface of the biosensor consist of aptamer nucleic acids, that is, that is to say nucleic acids previously selected for their ability to selectively bind to polypeptides, for example by selection according to the Selex method well known to those skilled in the art.
  • probe is meant according to the invention a molecule capable of being immobilized on a solid support and which has the capacity to bind, preferably specifically, non-covalently to one or more other molecules, called “ligands” to form a hybridization complex.
  • the probe molecules can be of varied nature and include, in particular, polypeptide molecules and nucleic acid molecules.
  • the probe molecules also include inorganic or organic substances, other than polypeptides or nucleic acids, having the ability to bind non-covalently to one or more ligand molecules.
  • nucleic acid is meant according to the invention polymers comprising purine and pyrimidine bases, which includes polyribonucleotides, including RNA, and polydeoxyribonucleotides, including DNA. Nucleic acids include both single-stranded and double-stranded molecules.
  • the circular planar biosensor (10) comprises a first face (16) and a second face (17), of which only the first face (16) is visible in the figure.
  • the support material (1 1) is, on the first face (16), covered at least on a part of its surface, and preferably on almost all or even all of its surface, with an electroconductive coating (12). ).
  • probes (13), or sets or “spots” of probes (13) are immobilized on the surface of the support (1 1) and exposed to the external environment.
  • each probe (13), or each set of probes (13), is known and is preferably determined by its polar coordinates (p, ⁇ ), it being understood that the polar coordinates are determined (i) for p, in arbitrary units of distance from the center of the circular biosensor, and (ii) for ⁇ , in arbitrary units of angle measurement, with respect to a single reference mark (14) defining the angular origin half-line of radial axis.
  • the second face (17), not visible in FIG. 1, is preferably coated with a material suitable for recording and optical reading of information, of the type of materials used in the manufacture of known optical disks, for example optical discs of the CD-ROM or DVD-ROM type.
  • the arbitrary units used for locating each probe (13), or each set of probes (13), can be (i) for p, in micrometers and (ii) for ⁇ , in degrees of arc. .
  • a half-face (16) subjected to hybridization and a half-face (17) not subject to hybridization are simultaneously represented.
  • the half-face (16) and the half-face (17) have no difference in structure.
  • the distinction between the half-face (16) and the half-face (17) can be made only after the hybridization step, that is to say after the step of contacting the biosensor (10) with a sample that may contain one or more ligands specifically binding to the immobilized probes.
  • the detection system (20) consists of a structure or frame, which may also be called “frame”, on which are implanted the essential means, including the capacitive sensor (40) contactless non-vibrating and the biosensor (10).
  • the biosensor (10) which is removable, is placed on a rotating plate whose central axis coincides with the central axis of the plane circular biosensor (10).
  • the turntable, which is the controlled speed rotational means (30) of the biosensor (10) is mechanically connected to a variable controlled speed motor, which is not shown in the figure.
  • a shield (22) electrically isolates the biosensor (10) from the outside environment.
  • the upper face of the biosensor (10) is the "first face" of the biosensor at least partially covered with an electroconductive coating, on which are immobilized the probes or sets of probes.
  • the capacitive sensor (40) without non-vibrating contact is secured to a holding support (80) which is movable along a horizontal axis which coincides with the radial axis of the biosensor (10).
  • a sensor displacement means (50) allows the controlled linear translation of the carrier (80) / sensor (40) assembly.
  • the electrode of the sensor (40) is located at a constant distance from the electroconductive coating surface of the biosensor (10), regardless of the position of the sensor (40) along its translation axis.
  • a laser diode for reading or optical information recording is arranged facing the second face of the biosensor (10) opposite to the first face.
  • the means (50) for displacing the sensor (40) is designed to allow a translation of the sensor (40) and the laser diode on at least a portion of the axis of the main plane of the biosensor (10), respectively of the next to the first and second side of the biosensor (10).
  • the electrode of the sensor (40) is electrically connected by the link (70) to a means (60) for measuring an electrical signal generated by the sensor (40).
  • the biosensor (10) is placed at a controlled electric potential value via an electrical connection (90) between the biosensor (10) and a voltage generator not shown in FIG. 2.
  • the non-vibrating non-contact capacitive sensor (40) comprises a single electrode, which is arranged on the upper part of the support (80), the end of said electrode, placed at a fixed distance from the electroconductive coating surface of the "first face" of the biosensor (10) and being able to translate on at least a part of the radial axis of said biosensor (40). It is this embodiment of the non-vibrating contactless capacitive sensor (40) which is shown in detail in FIG.
  • Figure 3 shows a vertical section of an embodiment of the non-vibrating capacitive sensor (40) without contact.
  • the electrode of the sensor (40) comprises a metal rod (42) whose end facing the surface of the biosensor (10) forms a cutting face (41) of section parallel to the translation axis of the sensor (40).
  • the metal rod (42) is included in a cylinder of insulating material (43), itself electrically isolated from the external environment by a metal shielding shell (44).
  • the electrode of the sensor (40) is connected to a means for measuring the electrical signal generated therein by means of an electroconductive link (70) in contact with the end of the metal rod (42) opposite to the end (41).
  • the electrode of the sensor (40) is integral with a carriage (51), which is movable along an axis which coincides with the axis of the main plane of the biosensor (10).
  • the carriage (51) is equipped with a sensor holding system (40) respectively comprising (A) a lever arm (81) movable about a horizontal transverse axis, perpendicular to the translation axis of the carriage (51) through the hinge (82), and (B) a return spring (83) which cooperates with a stop (84) of adjustable height, to maintain fixed the position of the electrode when the system is in operation.
  • the linear displacement of the carriage (51) along its axis is achieved by the rotation of a worm (53) which is engaged in the axis equipped with a thread passing through the base of the carriage (51), the worm (53) being mechanically connected to a motor (54), for example a stepper motor, by means of which the end (41) of the integral electrode of the carriage (51) can take a determined position any along the axis parallel to the main axis of the biosensor (10).
  • a motor for example a stepper motor
  • FIG. 4 illustrates a vertical section of a detail of the detection system, in which is schematized the electrical contact fitted to the detection system of the invention, making it possible to set the potential value of the electroconductive coating surface of the biosensor (10), by grounding.
  • the contacting system comprises a bracket (94) which is fixed at one of its ends to the base of the detection system and whose other end is equipped with the combination of means for assigning to the surface of the biosensor (10) the selected electrical potential value.
  • This combination of means comprises a hollow cylindrical metal cap (91) whose central hollow portion is nested in the axis of the rotary displacement means (30) of the biosensor (10) and whose lower edges are in contact with the electroconductive coating surface of the biosensor (10).
  • the cylindrical cap (91) is in contact with an electroconductive rod (92), preferably graphite, which is movable by vertical translation along a radial axis of the rotary displacement means (30).
  • a first end of the electroconductive rod is in contact with the metal cap (91), the opposite end being connected, via an electroconductive link, to a voltage generating device, which is not shown on the figure 4.
  • FIG. 5 represents a general diagram of the means constituting the measuring means (60) to which reference has already been made in the description of FIG. 2.
  • the various elements constituting the measuring means (60) of the system are symbolically represented by boxes.
  • the sensor (40) is connected to an amperometric amplifier (61) via the electroconductive link (70).
  • the amperometric amplifier (61) is electrically connected to a means (62) for converting the analog signal from said amplifier (61) to a digital signal which is transmitted to a digital computer (63), the digital signal generated by the converter ( 62) being previously processed by means (64, 65) for filtering the signal.
  • the assembly consisting of the amplifier (61) and the converter (62) is implanted on an electronic card (66) which equips the digital computer (63).
  • the memory of the digital computer (63) is loaded with a set of instructions for determining the presence of hybridization complexes between the probes immobilized on the biosensor (10) and ligand molecules, at any point on the useful surface of the "First face" of the biosensor (10).
  • the value of the intensity of the electric current "I" measured by the measuring means (60) increases with: - (i) the difference between the potential V 0 of the coating surface (12) and the potential ⁇ ⁇ at locations of probes location,
  • the end of the measuring electrode of the surface capacitive sensor (40) "S” positioned at a distance "E” of the support (12) has a capacity C 0 , with the following relation (A):
  • ⁇ 0 means the dielectric permittivity value of the air included in the inter-electrode space
  • S represents the surface value of the measuring electrode of the capacitive sensor (40)
  • - C 0 means the capacity value of the capacitive sensor (40)
  • - V 0 means the potential of the coating surface (12) of the biosensor (10) defined with respect to the potential of the electrode of the non-vibrating capacitive sensor.
  • the load qi of the capacitive sensor ( 40) of capacity Ci can be calculated according to the following relation (C): (C), in which:
  • qi means the electrical charge of the capacitive sensor (40),
  • Ci means the capacitance value of the capacitive sensor (40), and
  • Vi means the potential of the coating surface (12) of the biosensor (10) on which the probes (13) are immobilized and defined with respect to the potential of the non-vibrating capacitive sensor electrode.
  • Ci is obtained according to the following relation (D): (D), in which,
  • - C 1 means the capacity value of the capacitive sensor (40)
  • - E 1 means the global dielectric permittivity value of the inter-electrode space
  • S is the surface value of the electrode of the capacitive sensor (40).
  • e is the inter-electrode distance value between the capacitive sensor (40) and the surface of the support (12).
  • - q 2 means the electrical charge of the capacitive sensor (40)
  • - C 2 means the capacitance value of the capacitive sensor (40)
  • V 2 means the potential of the coating surface (12) of the biosensor (10) covered with hybridization complexes (14), and defined with respect to the potential of the non-vibrating capacitive sensor electrode.
  • C 2 ⁇ 2 .S / e (F), in which, - C 2 means the capacitance value of the capacitive sensor (40),
  • S is the surface value of the electrode of the capacitive sensor (40).
  • e is the inter-electrode distance value.
  • - C 1 means the capacity value of the capacitive sensor (40) "facing the coating (12) on which a probe is immobilized" (13), - V 0 means the potential of the coating surface (12) of the biosensor (10) ), at a surface point without an immobilized probe, defined with respect to the potential of the non-vibrating capacitive sensor electrode.
  • V 1 means the potential of the coating surface (12) of the biosensor (10), at a surface point comprising at least one immobilized probe, defined with respect to the potential of the non-vibrating capacitive sensor electrode.
  • dx is the distance value of the displacement made by the sample under the probe during the tempd "dt"
  • the above measure is a measure of potential.
  • the above measurement is a measure of dielectric permittivity.
  • the capacitive sensor (40) passes, in a duration "dt", a position "facing the coating (12) bare” at a position "facing the coating (12) on which a hybridization complex is immobilized” (14), the same equations as above can be used by replacing the parameters "C 1; V 1 "by the parameters” C 2 , V 2 , ", characteristics of the capacitance and potential values in the presence of a hybridization complex.
  • the comparison of current measurements I obtained with and / or without Hybridization complex makes it possible to detect the occurrence of formation of a hybridization complex between said probe and at least one ligand molecule.
  • the speed D relative displacement of said sensor (40) is preferably controlled or known at any time of use of the system of the invention, in order to increase the discrimination accuracy, at a given location of the surface (1).
  • the relative displacement speed D of the capacitive sensor (40) is substantially constant, or better constant, during the entire path of said sensor (40) above the surface (1 1).
  • the relative displacement speed D of the capacitive sensor (40) above the surface (1 1) can be controlled continuously.
  • said biosensor comprises, on the surface (12), both (i) locations with conductive coating (12) naked at potential V 0 , (ii) locations with probes (13) immobilized, at potential ⁇ and (iii) localizations with hybridization complexes between probes (13) and ligands of the tested sample, at potential V 2 .
  • the potential V 0 is substantially constant with the time of use of the biosensor (10) in the detection system of the invention.
  • the potential V 0 can be maintained substantially constant thanks in particular to the system of grounding, or grounding, of said biosensor through the electroconductive means (95).
  • the potential ⁇ is significantly different from the potential V 0 and the potential V 2 , because, on a biosensor (10), the probes (13) which are immobilized are generally of the same chemical nature, for example nucleic acids or proteins.
  • the probes (13) consist of nucleic acids
  • said nucleic acids generally have lengths and similar compositions and thus generate a Vi potential of equally similar value.
  • the probes (13) consist of proteins or peptides, their size and composition may be variable, resulting in a set of distinct Vi potential values, but which are significantly different from V 0 .
  • the potential V 2 is substantially constant, or at least significantly different from the potential V 0 and the potential Vi, although the ligands capable of being fixed on the probes (13) may be of a different nature and / or size.
  • the potential V 2 may therefore be variable, depending on the hybrid ligands to the probes, but may in all cases be discriminated both from the potential V 0 and from a potential value V 1 .
  • the potential value V 0 for a given biosensor (10), the potential value V 0 , and sometimes the value (s) of potential V 1 , are known in advance.
  • the system of detection can be implemented by immersing the entire surface (12) of the biosensor.
  • V 2 potential values are measured exclusively at the location locations of the probes (13), which can be distinguished from the known values V 0 and ⁇ ⁇ .
  • the biosensor (10) is a disc of the type of optical discs used for the production of CDs, DVDs, etc.
  • the surface (10) of the biosensor (10) advantageously consists of the unregistered or non-recordable face of an optical disk.
  • the means for moving the capacitive sensor (40) can be of the same type as that of the plates that equip the optical disk reading or recording devices, namely that said means for the displacement comprises at least the combination of:
  • a controlled speed drive motor for relative displacement of the sensor (30) relative to the surface (12) of the biosensor, at a given distance from the center of the biosensor (10), in the main plane of said biosensor, and (ii) radial displacement means of the sensor (50) perpendicular to the vertical axis of the biosensor (10), identical to that of the optical reading or recording head (52).
  • FIGS. 2 and 3 A particular embodiment of such a moving means is illustrated in FIGS. 2 and 3.
  • the electroconductive coating (12) of the biosensor (10) consists of a metal coating.
  • This metal coating may comprise, or consist of, a metal chosen for example from iron, steel, stainless steel, gold, copper, nickel, chromium, aluminum, silver, platinum, palladium or an alloy of a combination of at least two of these metals.
  • the electroconductive coating may comprise, or consist of, a metal oxide, for example a metal oxide selected from silicon dioxide, tin oxide, tin oxide doped with fluorine, indium / tin oxide, antimony-doped tin oxide, aluminum-doped zinc oxide, indium oxide, zinc oxide, oxide zinc doped with indium, cadmium stannate, cadmium oxide, palladium oxide, as well as mixtures of at least two of the aforementioned metal oxides.
  • a metal oxide for example a metal oxide selected from silicon dioxide, tin oxide, tin oxide doped with fluorine, indium / tin oxide, antimony-doped tin oxide, aluminum-doped zinc oxide, indium oxide, zinc oxide, oxide zinc doped with indium, cadmium stannate, cadmium oxide, palladium oxide, as well as mixtures of at least two of the aforementioned metal oxides.
  • Various methods of deposition of an electroconductive coating have been known
  • the electroconductive coating (12) of the biosensor (10) consists of a polymer coating in the mass of which are dispersed metal particles. Such polymeric materials, as well as their methods of manufacture and deposition are well known to those skilled in the art.
  • the electroconductive coating (12) of the biosensor (10) consists of a polymeric material, for example a polymeric material having electroconductive properties of the type of those required for semiconductor materials. Mention may in particular be made of electrically conductive polymer materials formed from thiophene, 3-methylthiophene, 1-benzothiophene, aniline or even pyridine, which are well known to those skilled in the art, some of which are described.
  • FIG. 6 illustrates an embodiment of a method for manufacturing a biosensor
  • FIG. 6 On the upper part of FIG. 6, there is shown a known optical disk, in this case an optical disk of the CD-RW type, which is used as a starting product in the manufacture of a biosensor (10) according to the invention .
  • the optical starting disk is first subjected to a metallization step of the "first face", which may be the non-writable face of an optical disk of the CD-RW type, as represented in the middle part of FIG.
  • the "first face” is subjected to a deposit of a layer of gold on all or almost all of its surface.
  • a subsequent step of depositing a layer of a second metal, for example chromium, is carried out, the coating by the second metal being located along at least a radial half-line above the layer of the first metal.
  • the radial line of coating by the second metal is used as reference mark of the angular origin, for calculating the polar coordinates of each point of the surface of the electroconductive coating of the biosensor (10), and more particularly for the expression of the coordinates of each of the regions of the electroconductive coating surface on which is then immobilized a probe or a set of probes.
  • each of the probes, or each set of probes is grafted covalently to the surface of the electroconductive coating at a determined location, as shown in the lower part of FIG. 6, in order to obtain a biosensor (10) ready for use.
  • each probe of known structure, or each set of probes of known structure (s) is immobilized at a point on the surface of the coating.
  • electroconductor which is known and determined by its polar coordinates with respect to (i) the origin p which is the central axis of the disk and (ii) the radial origin ⁇ which is the radial half-line of the second deposited metal.
  • the information relating to (i) the coordinates of each immobilized probe, or each set of immobilized probes, as well as, where appropriate, (ii) the structural characteristics of each probe, for example the nucleotide sequence or amino acid characteristics, is recorded in a digital format on the "second face" of the biosensor (10), which is preferably the optical reading or writing surface of a optical disk of known type.
  • the capacitive non-contactless non-vibrating sensor (40) consists of the cutting face (41) of a metal rod (42). This rod is crimped in a cylinder of insulating material (43). This insulating material and a large length of rod are protected by a shield (44) put at the potential of the mass by the shielding of the electrically conductive element (70). Clamping makes it possible to fix the sensor rigidly to a support (81).
  • the means (60) for measuring the intensity value "I" of the current flowing through the capacitive sensor (40) can be of any known type.
  • the measuring means (60) may in particular be an analog ammometric amplifier device (61).
  • the measuring means (60) can also be followed by an analog / digital converter (62), in which the analog measurement signal is converted into a digital signal which can then be transmitted to a digital processing device of said signal (63). ), preferably to a digital calculator.
  • the signal can be filtered and processed before (64) and / or after (65) digital analog conversion.
  • the speed of the rotation of the disk makes it possible to consider repeating the measurements and accumulating them so as to increase the value of the signal-to-noise ratio.
  • the measuring means (60) and the processing of the measurement may consist of an electronic card (66) connected to a digital computer in the memory of which are loaded the instructions for processing the measurement signal. intensity "I" of the current flowing through the capacitive sensor (40).
  • the measuring means (60) is connected to the capacitive sensor (40) by electroconductive means (70), generally shielded electrical wires or electrically conductive tracks located in an electrically insulating support, or even an electrical or optical transmission system.
  • said system comprises a device for reading or recording optical disks, for example a device of the CD or DVD player or recorder type, which has been associated with the capacitive sensor (40).
  • said system is advantageously connected by an electrical or optical means to a digital computer which comprises in particular: means for controlling and controlling the relative speed of displacement D of the capacitive sensor (40) with respect to the surface (12) of the rotating disc,
  • means for acquiring data for measuring the intensity "I" of the current flowing through the capacitive sensor (40) at a given instant optionally, means for storing the position data on the disk and the identity of the nucleic acids immobilized on the coating (12), and
  • the probes are immobilized in an orderly manner on the surface of the coating (12).
  • each nucleic acid which is characterized by a unique nucleotide sequence, is immobilized at a known position of the coating surface (12), which position may be referenced as a pair of coordinates according to (i) an axis p and (ii) an angle ⁇ in polar coordinates, the value of the teta angle being determined with respect to an identifiable angular origin reference (14) or detectable on the surface of the biosensor (10).
  • the collection of probes immobilized on the surface of the coating (12) can be described in a data table in which a single position (p, ⁇ ) is assigned to a nucleic acid structurally identified by its nucleotide sequence (SEQ ID N 0 ).
  • This table can be used to create a graphical image (cartography) of the data and the results, in linear form (variations of the potential as a function of the angle ⁇ for each circle or turn of the sweep), in the form of a 3D image seen from above or in perspective variations of potential for the set of values of p and ⁇ scanned, or in the form of an interpreted 3D image, for example symbolizing on an image of the surface (1 1) of the biosensor (10) the position of each of the probes that formed a hybridization complex.
  • Separate probes immobilized on the coating (12), or separate sets of probes immobilized on the coating (12), are preferably arranged in concentric tracks or spiral tracks.
  • the coordinates (p, ⁇ ) of a given probe make it possible to unequivocally distinguish a given probe, or a given set of probes, from other probes, or from other sets of probes of distinct and localized sequences.
  • a given position (p, ⁇ ) on the surface of the coating (12) are immobilized a plurality of probes of sequence (A) given, as is the case for known DNA chips.
  • the total number of molecules on the surface of the biosensor (10) depends on the number of probe molecules of the same sequence immobilized at a position (p, ⁇ ).
  • the probe molecules of the same sequence located at a given position (p, ⁇ ) are immobilized in the form of a collection of high surface density, also referred to as "spot".
  • the usability of the biosensor (10) is related to a combination of parameters including (i) the surface of said biosensor (10) and (ii) the area occupied by each "spot" of immobilized probes. It is easy to understand that the capacity of using a biosensor (10) which has the dimensions of an optical disk of the CD types or commercially available DVDs, which have a diameter of about 120 millimeters, is less than the usability of a biosensor (10) having a diameter of 300 millimeters.
  • the diameter of the biosensor (10) can vary from 20 millimeters to 300 millimeters.
  • the total number of spots contained in a biosensor is at least equal to the number of distinct probes (13).
  • the number of probe molecules immobilized on the surface of the coating (12) of a biosensor (10) can be expressed according to the following formula: (an1.A1) + (an2.A2) + ... + (anX.AX) in which:
  • otai is the total number of probes
  • A1, A2, ..., AX represent the nucleic acids of single nucleotide sequences A1, A2, ..., AX;
  • X is an integer whose maximum value is equal to the total number of nucleic acids of unique sequences contained in the biosensor (10);
  • anX represent the number of identical nucleic acid molecules immobilized on the coating (12) of the biosensor (10) for each of the sequences A1, A2, ..., AX respectively and represent, independently from one another, an integer from 0 to 100, advantageously from 0 to 50, and preferably from 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 or 20;
  • This sequential list may be coded on the face (15) of the biosensor (10) which is not used for the immobilization of the probes, and which is designated "second face" of the biosensor, by reference to the "first face” of the biosensor on which the probes are immobilized.
  • a first scanning phase of the biosensor (10) is carried out making it possible to reach all the values of (p, ⁇ ), prior to a step of contacting the biosensor (10) with the sample to be tested.
  • This first scanning step of the first face of the biosensor (10) makes it possible to measure the variations of "I” and to correlate these variations with the sequential list of spots, and thus to assign to each spot ("i") a pair of coordinates (pi, ⁇ i).
  • This variation information of the value of "I” associated with the coordinates of the spots on the surface of the biosensor (10) can be recorded on the writable side or second face of the biosensor (10).
  • any other type of useful information may be encoded on the second face of the disk.
  • the second face (15) of the biosensor (10) may contain information data incorporated into the structure of the disk itself, for example by pressing, etching, ablation by laser irradiation, as known in the state of the art for recording data on an optical disk medium.
  • These information data incorporated into the structure of the second face of the biosensor (10) can be detected or read by laser optics, in particular a specially dedicated laser diode (52), located in the system positioned opposite the coating of the second face (15) of the biosensor (10).
  • the coating (15) of the second face of the biosensor (10) consists of a conventional coating for an optical disk, well known in the art.
  • the detection system of the invention also comprises a device for reading or recording data on an optical disk of a known type.
  • the system of the invention also preferably comprises means for controlling and controlling said reading or optical recording device.
  • the present invention also relates to a biosensor of the type described above, which consists of a plane biosensor comprising a first and a second face, and wherein: a) the first face is coated with a layer of electrically conductive material on which one or more probes are immobilized, and b) the second face comprises a coating for reading or for optical data recording.
  • the biosensor can be used with a wide variety of probe hybridization detection systems with specific ligands.
  • said biosensor is used with the sensing system comprising a non-vibrating non-contact capacitive sensor which is described in detail in the present description.
  • said biosensor may be used with a detection system having the same characteristics as the detection system which is described in detail in the present description, but in which the non-vibrating non-contact capacitive sensor is replaced by another type of sensor known to those skilled in the art.
  • the senor can be of any known type, including a sensor an optical sensor, a vibrating capacitive sensor, a non-vibrating capacitive sensor, etc.
  • non-vibrating capacitive sensor makes it possible to measure the variations of the electrical signal from one point to the other of the rotating biosensor.
  • a non-vibrating capacitive type sensor is preferentially used because it allows a much faster acquisition of the signal than with the vibrating sensors.
  • Non-vibrating capacitive sensors include capacitive sensors consisting of a flat disk-shaped metal electrode (or any other shape: sphere, cone, etc.) of adjustable diameter according to (i) the surface area occupied on the surface (12) by an immobilized probe or a set of immobilized probes or “spot” and (ii) the minimum distance on the surface (1 1) between two immobilized probes, or two sets of immobilized probes, it being understood that said minimum distance can vary in general from a few millimeters (mm) to a few hundred micrometers ( ⁇ m).
  • the minimum distance on the surface (12) between two immobilized probes, or two sets of immobilized probes can also be at the nanoscale.
  • the known sensors used may be those of atomic force microscopes or electrostatic forces usable in non-vibrating mode.
  • said biosensor is in the form of a planar disk.
  • the dimensions of said flat disk are compatible with the reading or recording of data by known systems and formats for reading or recording optical disks of the CD or DVD type.
  • the present invention also relates to a method for the detection of hybridization complexes between probes and ligand molecules hybridizing specifically with said probes, said method comprising the following steps: a) contacting a biosensor (10) of the type specified in the present description with a test sample, for a time sufficient for the formation of hybridization complexes between the probes immobilized on said biosensor and ligand molecules likely to be contained in said sample to be tested, b) place the biosensor in a detection system according to the invention, c) detecting the hybridization complexes possibly formed on said biosensor.
  • a biosensor according to the invention is used in step a) under conditions similar to or identical to those used for the use of a conventional DNA chip.
  • the conditions for bringing the biosensor into contact with the sample to be tested are determined with the same parameters as with a conventional DNA biosensor, including the parameters of duration, hybridization temperature, ionic strength and concentration. saline hybridization solution, etc.
  • the biosensor is subjected to one or more washing steps, under conditions easily determined by those skilled in the art, in order to eliminate the molecules contained in the test sample which did not form hybridization complexes with the nucleic acids immobilized on the biosensor of the invention.
  • step c) the biosensor is placed on a suitable "reading" plate, that is to say the detection system described above, so that the entire surface of said biosensor on which are immobilized nucleic acids can be swept by the capacitive sensor (40) of the system according to the invention.
  • a suitable "reading" plate that is to say the detection system described above, so that the entire surface of said biosensor on which are immobilized nucleic acids can be swept by the capacitive sensor (40) of the system according to the invention.
  • FIG. 2 A particular embodiment of such a reading plate is illustrated in FIG. 2.
  • step c) the means for controlling and controlling the displacement of the capacitive sensor (40) make it possible to measure the intensity "I" of current flowing through said capacitive sensor (40) over part or the entire surface of the coating (12) on which the nucleic acids are immobilized.
  • the analog intensity measurement signal "I” is converted into digital data which is then processed by the Central Processing Unit (CPU) of a digital computer, according to a sequence of logical instructions stored in the memory of said digital computer.
  • CPU Central Processing Unit
  • each position data (p, ⁇ ) of the capacitive sensor (40) is associated with the corresponding intensity value "I" measured at this position. Peaks of intensity value "I” are measured at the positions (p, ⁇ ) for which hybridization complexes have formed.
  • the data of a data matrix table in which a single position (p, ⁇ ) is assigned to a nucleic acid structurally identified by its nucleotide sequence is preferentially stored beforehand in storage means. of the numerical calculator. If appropriate, when a biosensor (10) with two functional faces is used for the implementation of the method, the matrix data table can be registered beforehand on the second face of the biosensor which has a read or write coating. optical recording.
  • the second column comprises the intensity value "I" of the current flowing through the capacitive sensor (40) at said position (p, ⁇ ),
  • the third column comprises the nucleotide sequence information of said nucleic acid.
  • said table includes only the data relating to the biosensor positions (p, ⁇ ) for which the measured intensity value "I" is greater than a minimum threshold value.
  • the minimum threshold value of the intensity "I" is the expected minimum intensity value generated by the presence, at said position (p, ⁇ ) of a hybridization complex with the corresponding immobilized nucleic acid.
  • the digital computer can directly provide the user with the identity of each of the nucleic acids having formed a hybridization complex with a ligand molecule contained in the test sample.
  • the potential value V 0 of the biosensor (10), or the corresponding intensity value I 0 is stored in the memory of the digital computer, if necessary after reading the information of the value V 0 previously coded on the second side of said biosensor which has a reading coating or optical recording.
  • the potential value ⁇ ⁇ of the biosensor (10), or the corresponding intensity value I 1 is stored in the memory of the digital computer, if necessary after reading the information of the value V 1 previously coded on the second side of said biosensor which has a reading coating or optical recording.
  • the data generated in step c) of the method can be recorded on the second side of the biosensor comprising a coating for reading and optical recording.
  • the detection method according to the invention can be used in all fields of application of conventional DNA chips.
  • the clean CD-RW disc (10) is introduced into a vacuum evaporation chamber.
  • a gold deposit (12) is made by thermal evaporation on the non-writable face (1 1) of the disk. It extends from the center of the disk to the periphery or its neighborhood.
  • a second deposit is made by thermal evaporation of another metal, for example chromium in the form of one or more neighboring rays (14). It will be used to determine the original position of measurement of the angles of rotation. For this, a cache is used. The entire disc is then rinsed with pure water.
  • another metal for example chromium in the form of one or more neighboring rays (14). It will be used to determine the original position of measurement of the angles of rotation. For this, a cache is used. The entire disc is then rinsed with pure water.
  • the probes (13) are deposited by hand or by a robot in the form of spots in a predetermined arrangement (information 1). These probes were previously thiolated in order to attach to the golden support.
  • the deposit After drying, the deposit is followed by a rinsing phase.
  • a first detection of the variations of the electrical signal is carried out (information 2).
  • the metal layer covering the entire non-writable face of the disc can be made of another metal, for example with chromium.
  • Plots and the locating radii of the angular position 0 can be made of gold.
  • the thiolated probe spots will then be deposited on these gold pads.
  • Example 2 Detailed Description of an Embodiment of the Detection Method According to the Invention
  • the biosensor (10) prepared as described in Example 1 is immersed for 4 hours in a solution that may contain molecules of one or more ligands of interest, at laboratory temperature.
  • Rinsing is performed to remove from the surface of the biosensor (10) molecules that have not formed hybridization complexes with the immobilized probes.
  • a step of detecting the variations of the electrical signal is carried out on the entire surface (1 1) of the biosensor (10) on which the probes are immobilized.
  • the information is recorded on the second side of the biosensor (10).
  • Information 1, 2 and 3 are compared to correlate the data. Neither soaking nor rinsing affects the writable side of the disc.
  • the hybridization will then be carried out by dipping the single half-face (16). It will be followed by a complete rinsing of the disc, followed by drying.
  • the apparatus will thus acquire under the same experimental conditions the signal read on the possibly hybrid spots of the half-face (16) and on the definitely unhybrid spots of the half-face ( 17).
  • Example 3 Detailed Description of an Embodiment of a Detection System According to the Invention
  • Example 3 The particular embodiment of a detection system according to the invention which is detailed in Example 3 is illustrated in particular in Figures 2 to 5.
  • the realization of a detection system can be carried out from a CD / DVD player.
  • the plate (21) consists of a computer CD player plate, driven by a motor (31), said plate being originally equipped to perform the centering and mechanical retention of the disk (32).
  • the carriage (51) carrying the reading or writing laser diode (52) is driven by an endless screw (53) set in motion by a motor (54).
  • a first adaptation is to carry by the carriage the electrical measuring probe (40) which will perform the measurements on the non-writable face (12).
  • This can be achieved by using a lever arm (81) integral with the carriage (51). To allow the insertion of the disc (10) on the centering device (32), this lever arm must have an articulation
  • the lever arm So that the probe carried by the lever arm is always repositioned at a good distance from the face of the disc (12), the lever arm is recalled by the pulling of a spring (83) which puts it in contact with a stop mechanical adjustable by a screw-nut system (84).
  • the second adaptation comes from the fact that the electric potential of the non-writable face of the disc (12) must be fixed, for example to OV.
  • the platen centering device (32) is covered with a metal cap (91) which is brought into contact with the metal deposit made on the disc (12).
  • the third adaptation comes from the electromagnetic radiation of the motors, which must be screened by a shield (22).

Abstract

The invention relates to a system for detecting hybridization complexes between (i) probes immobilized on a substrate and (ii) and ligand molecules specifically hybridizing with said probes, said system being described in detail in the description.

Description

SYSTEME POUR LA DETECTION DE COMPLEXES D ' HYBRIDATION DE SONDES AVEC DES LIGANDS SPECIFIQUES SYSTEM FOR DETECTING PROBE HYBRIDIZING COMPLEXES WITH SPECIFIC LIGANDS
DOMAINE DE L'INVENTIONFIELD OF THE INVENTION
La présente invention se rapporte au domaine de la détection de la présence de ligands d'intérêt dans des échantillons, à des fins d'application notamment dans le domaine de la recherche en biologie, y compris dans le domaine génomique, et dans le domaine du diagnostic médical et vétérinaire.The present invention relates to the field of the detection of the presence of ligands of interest in samples, for application in particular in the field of research in biology, including in the genomic domain, and in the field of medical and veterinary diagnosis.
ART ANTERIEURPRIOR ART
Les biocapteurs constitués de supports sur lesquels sont immobilisées des composés sondes, telles que des sondes d'acides nucléiques sont utilisés de manière croissante dans les laboratoires de recherche et dans l'industrie. Ces biocapteurs constituent un outil très important d'analyse de la constitution qualitative et quantitative d'un échantillon en molécules d'ADN ou d'ARN. Classiquement, ces biocapteurs aussi désignés « puces à ADN » sont constitués d'un support solide sur la surface duquel une pluralité de sondes distinctes sont immobilisées dans un ordre prédéterminé, en général sous la forme d'un réseau à deux dimensions de « spots ». Ces biocapteurs sont principalement utilisés dans des procédés d'analyse d'expression de gènes, y compris d'analyse de la transcription de gènes, dans des procédés de synthèse d'acides nucléiques, dans des procédés de criblage de médicaments candidats, dans des procédés de séquençage d'acides nucléiques, ou encore dans des procédés de détection et d'analyse de mutations.Biosensors consisting of supports on which probe compounds are immobilized, such as nucleic acid probes, are increasingly used in research laboratories and in industry. These biosensors are a very important tool for analyzing the qualitative and quantitative constitution of a sample of DNA or RNA molecules. Conventionally, these biosensors also referred to as "DNA chips" consist of a solid support on the surface of which a plurality of distinct probes are immobilized in a predetermined order, generally in the form of a two-dimensional network of "spots" . These biosensors are primarily used in methods of gene expression analysis, including gene transcription analysis, in nucleic acid synthesis methods, in methods for screening candidate drugs, in methods nucleic acid sequencing, or in methods for detecting and analyzing mutations.
Les perfectionnements successifs apportés aux techniques de fabrication de ces biocapteurs ont permis de réaliser des biocapteurs comprenant plusieurs centaines de milliers de sondes distinctes. Certains biocapteurs représentent donc des outils d'analyse d'échantillons dont la capacité de détection peut couvrir la totalité d'un génome, y compris la totalité du génome humain.Successive improvements made to the techniques for manufacturing these biosensors made it possible to produce biosensors comprising several hundred thousand distinct probes. Some biosensors therefore represent sample analysis tools whose detection capacity can cover the entire genome, including the entire human genome.
Dans les procédés courants, les molécules d'intérêt, par exemple les molécules d'acide nucléique, contenues dans un échantillon à tester sont marquées avec une molécule détectable, par exemple un marqueur radioactif, un marqueur de type fluorochrome ou encore des particules métalliques tel que l'or colloïdal. Puis, le biocapteur est mis en contact avec l'échantillon à tester ce qui entraîne la formation éventuelle de complexes entre (i) certaines des sondes immobilisées sur la surface du support solide du biocapteur et (ii) des molécules d'intérêt susceptibles d'être contenues dans l'échantillon à tester. A titre illustratif, lorsque les sondes sont marquées par un fluorochrome, l'étape de détection est réalisée par illumination par balayage de chaque point de la surface du biocapteur, à la longueur d'onde d'excitation du fluorochrome, et la présence de complexes d'hybridation est détectée, en chaque point de surface, par mesure du signal de fluorescence, à la longueur d'onde d'émission dudit fluorochrome. Dans ce type de procédés, on utilise en général des systèmes de détection par microscopie de fluorescence à laser.In current methods, the molecules of interest, for example the nucleic acid molecules, contained in a test sample are labeled with a detectable molecule, for example a radioactive marker, a fluorochrome type marker or even metal particles such as than colloidal gold. Then, the biosensor is brought into contact with the sample to be tested, which leads to the possible formation of complexes between (i) some of the probes immobilized on the surface of the solid support of the biosensor and (ii) molecules of interest capable of be contained in the sample to be tested. By way of illustration, when the probes are labeled with a fluorochrome, the detection step is carried out by scanning illumination of each point on the surface of the biosensor, at the excitation wavelength of the fluorochrome, and the presence of complexes. hybridization is detected, at each surface point, by measuring the fluorescence signal, at the emission wavelength of said fluorochrome. In this type of method, laser fluorescence microscopy detection systems are generally used.
Les systèmes de lecture de biocapteurs à ADN actuellement utilisés sont satisfaisants dans de nombreuses applications. Toutefois, pour certaines applications, on a remarqué que la sélectivité ou la sensibilité des capteurs existants était insuffisante et nécessitait en conséquence d'être améliorée.Currently used DNA biosensor read systems are satisfactory in many applications. However, for some applications, it has been noted that the selectivity or sensitivity of the existing sensors is insufficient and therefore needs to be improved.
De plus, comme dans d'autres techniques utilisées de manière récurrente dans le temps et à grande échelle, il existe un besoin du public pour des procédés mettant en oeuvre des biocapteurs qui soient plus économiques que les procédés connus, ainsi que pour des biocapteurs eux-mêmes qui soient moins onéreux que les biocapteurs connus.Moreover, as in other techniques used over a long period of time and on a large scale, there is a public need for processes using biosensors which are more economical than the known processes, as well as for biosensors themselves. even less expensive than known biosensors.
De manière générale, il existe un besoin dans l'état de la technique pour des systèmes de lecture de biocapteurs, ou pour des biocapteurs, alternatifs ou améliorés par rapport aux systèmes connus.In general, there is a need in the state of the art for biosensor reading systems, or for biosensors, alternative or improved over known systems.
RESUME DE L'INVENTIONSUMMARY OF THE INVENTION
II est fourni selon l'invention à la fois de nouveaux biocapteurs et de nouveaux systèmes de détection les utilisant, qui possèdent de nombreux avantages techniques par rapport aux biocapteurs et aux systèmes connus, comme cela sera détaillé plus loin dans la présente description. La présente invention a pour objet un système pour la détection de complexes d'hybridation entre (i) des sondes et (ii) des molécules ligands hybridant spécifiquement avec lesdites sondes, ledit système comprenant : a) un biocapteur (10) pour la réalisation de complexes d'hybridation entre (i) des sondes et (ii) des ligands hybridant spécifiquement avec lesdites sondes, ledit biocapteur étant constitué d'un matériau support circulaire (1 1 ) comprenant une première et une seconde face et dont la première face comprend une surface de revêtement électro-conducteur (12) sur laquelle sont immobilisées une ou plusieurs sondes (13), ledit biocapteur comprenant, sur ladite première face, une marque électriquement détectable repérant une position fixée comme référence d'origine angulaire, b) un moyen (30) de mise en rotation du biocapteur (10) à une vitesse contrôlée, c) un capteur capacitif sans contact non vibrant (40), d) un moyen (50) pour le déplacement dudit capteur capacitif sans contact non vibrant (40) suivant l'axe radial du biocapteur (10), et e) un moyen de mesure (60) de la valeur d'intensité « I » du courant traversant le capteur capacitif sans contact non vibrant (40), ledit moyen de mesure (60) étant relié audit capteur capacitif (40) par des moyens électroconducteurs (70), et f) un moyen (80) permettant de maintenir sensiblement constante la distance séparant le capteur (40) de la surface du revêtement électroconducteur (12).It is provided according to the invention both new biosensors and new detection systems using them, which have many technical advantages over biosensors and known systems, as will be detailed later in the present description. The present invention relates to a system for the detection of hybridization complexes between (i) probes and (ii) ligand molecules specifically hybridizing with said probes, said system comprising: a) a biosensor (10) for carrying out hybridization complexes between (i) probes and (ii) ligands specifically hybridizing with said probes, said biosensor consisting of a circular support material (1 1) comprising a first and a second face and whose first face comprises a electroconductive coating surface (12) on which one or more probes (13) are immobilized, said biosensor comprising, on said first face, an electrically detectable mark identifying a fixed position as reference of angular origin, b) means ( 30) for rotating the biosensor (10) at a controlled rate, c) a non-vibrating contactless capacitive sensor (40), d) a means (50) for moving said non-vibrating non-contact capacitive probe (40) along the radial axis of the biosensor (10), and e) a means (60) for measuring the intensity value "I" of the current flowing through the capacitive sensor without non-vibrating contact ( 40), said measuring means (60) being connected to said capacitive sensor (40) by electrically conductive means (70), and f) means (80) for maintaining substantially constant the distance separating the sensor (40) from the surface electroconductive coating (12).
La présente invention est également relative à un biocapteur plan comprenant une première et une seconde face, et dans lequel : a) la première face est revêtue d'une couche de matériau électro-conducteur sur laquelle sont immobilisés un ou plusieurs acides nucléiques cibles, et b) la seconde face comprend un revêtement pour la lecture ou pour l'enregistrement optique de données. La présente invention concerne aussi un procédé pour la détection de complexes d'hybridation entre des sondes et des molécules ligands s'hybridant spécifiquement avec lesdites sondes, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a) mettre en contact un biocapteur tel que défini ci-dessus, avec un échantillon à tester, pendant une durée suffisante à la formation de complexes d'hybridation entre les sondes immobilisées sur ledit biocapteur et des molécules ligand susceptibles d'être contenues dans ledit échantillon à tester, b) placer le biocapteur dans un système de détection tel que défini ci-dessus, et c) détecter les complexes d'hybridation éventuellement formés sur ledit biocapteur.The present invention also relates to a planar biosensor comprising a first and a second face, and wherein: a) the first face is coated with a layer of electrically conductive material on which one or more target nucleic acids are immobilized, and b) the second face comprises a coating for reading or for optical data recording. The present invention also relates to a method for the detection of hybridization complexes between probes and ligand molecules hybridizing specifically with said probes, said method comprising the following steps: a) contacting a biosensor as defined above with a sample to be tested, for a time sufficient for the formation of hybridization complexes between the probes immobilized on said biosensor and ligand molecules likely to be contained in said sample to be tested, b) placing the biosensor in a test system. detection as defined above, and c) detecting any hybridization complexes formed on said biosensor.
DESCRIPTION DES FIGURESDESCRIPTION OF THE FIGURES
La Figure 1 illustre un biocapteur plan (10) sous la forme d'un disque sur la surface duquel sont immobilisées des sondes (13). (1 1 ) matériau support ; (12) revêtement conducteur ;Figure 1 illustrates a planar biosensor (10) in the form of a disk on the surface of which probes (13) are immobilized. (1 1) support material; (12) conductive coating;
(13) sondes immobilisées ; (14) marquage à l'origine des angles ; (15) face inscriptible du biocapteur ; (16) demi face du biocapteur soumise à l'hybridation ; (17) demi face du biocapteur non soumise à l'hybridation(13) immobilized probes; (14) marking at the origin of the angles; (15) writable face of the biosensor; (16) half face of the biosensor subjected to hybridization; (17) half face of the biosensor not subject to hybridization
La Figure 2 illustre un mode de réalisation d'un système (20) pour la détection comprenant un biocapteur (10) et un capteur capacitif sans contact non vibrant (40). (21 ) bâtis ;Figure 2 illustrates an embodiment of a detection system (20) comprising a biosensor (10) and a non-vibrating non-contact capacitive sensor (40). (21) built;
(22) blindage ; (30) système de déplacement du capteur à vitesse contrôlée ; (31 ) moteur d'entraînement ; (32) centrage et maintien mécanique du disque ; (50) système de déplacement du capteur ; (60) Moyen de mesure ; (70) liaison électro-conductrice ; (80) système de maintien du capteur ; (90) système de prise de contact électrique sur la surface du biocapteur, pour mise à la terre.(22) shielding; (30) controlled speed sensor displacement system; (31) drive motor; (32) centering and mechanical retention of the disk; (50) sensor displacement system; (60) Means of measurement; (70) electrically conductive link; (80) sensor holding system; (90) electrical contact system on the surface of the biosensor, for grounding.
La Figure 3 illustre un mode de réalisation d'un capteur capacitif sans contact non vibrant. (41 ) face de coupe ; (42) tige métallique ; (43) cylindre de matière isolante ; (44) blindage ;Figure 3 illustrates an embodiment of a capacitive sensor without non-vibrating contact. (41) cutting face; (42) metal rod; (43) cylinder of insulating material; (44) shielding;
(50) système de déplacement du capteur comprenant : (51 ) chariot ; (52) diode laser de lecture- écriture : (53) vis sans fin ; (54) moteur ;(50) sensor displacement system comprising: (51) carriage; (52) read-write laser diode: (53) worm gear; (54) engine;
(80) système de maintien du capteur comprenant : (81 ) bras de levier ; (82) articulation ; (83) ressort ; (84) butée (vis écrou). La Figure 4 illustre un mode de réalisation du système (90) de prise de contact électrique sur la face du biocapteur. (91 ) capuchon métallique ; (92) contact graphité glissant ;(80) sensor holding system comprising: (81) lever arm; (82) articulation; (83) spring; (84) stop (screw nut). Figure 4 illustrates an embodiment of the electrical contact system (90) on the face of the biosensor. (91) metal cap; (92) sliding graphite contact;
(93) ressort ; (94) potence ; (95) liaison filaire.(93) spring; (94) gallows; (95) wired link.
La Figure 5 illustre un moyen de mesure (60) comprenant : (40) capteur ; (61 ) amplificateur ampérométrique ; (62) convertisseur analogique numérique ; (63) calculateur numérique ; (64) filtrage ; (65) filtrage ; (66) carte électronique ; (70) moyen électro-conducteur. La Figure 6 représente un schéma illustrant les différentes étapes du procédé de fabrication d'un biocapteur selon l'invention. La figure 6A illustre le disque support de départ, qui consiste en un disque optique de type CD-ROM. Sur la figure 6A, la face pour l'enregistrement optique n'est pas visible. La figure 6B illustre un produit intermédiaire, dans lequel le matériau support du disque optique a été revêtu d'une couche de revêtement d'un premier matériau électroconducteur, sur lequel a été déposé une marque d'un second matériau électroconducteur, ladite marque matérialisant l'origine angulaire du biocapteur. La figure 6C illustre le biocapteur fini, avec la pluralité d'ensembles de sondes ou « spots » immobilisés à la surface du revêtement électroconducteur.Figure 5 illustrates a measuring means (60) comprising: (40) sensor; (61) amperometric amplifier; (62) digital analog converter; (63) digital computer; (64) filtering; (65) filtering; (66) electronic card; (70) electrically conductive means. Figure 6 shows a diagram illustrating the different steps of the method of manufacturing a biosensor according to the invention. Figure 6A illustrates the starting support disk, which consists of a CD-ROM type optical disk. In Fig. 6A, the face for optical recording is not visible. FIG. 6B illustrates an intermediate product, in which the support material of the optical disk has been coated with a coating layer of a first electroconductive material, on which has been deposited a mark of a second electroconductive material, said mark materializing the angular origin of the biosensor. Figure 6C illustrates the finished biosensor, with the plurality of sets of probes or "spots" immobilized on the surface of the electroconductive coating.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTIONDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Le demandeur s'est attaché à mettre au point un nouveau biocapteur à et un nouveau système de lecture adapté à ce nouveau biocapteur, d'utilisation plus simple que les systèmes et les biocapteurs connus, et ayant un coût de fabrication ainsi qu'un coût d'utilisation réduits. Comme cela a déjà été mentionné précédemment, pour utiliser les systèmes de lecture de biocapteurs à sondes immobilisées connus, les techniques actuelles ont recours à une étape de détection par fluorescence, ou bien une étape de mesure d'un signal de radioactivité, des complexes d'hybridation entre les sondes immobilisées et les molécules d'intérêt marquées. La réalisation d'une étape finale de détection des complexes d'hybridation rend obligatoire la mise en oeuvre d'une étape préalable de marquage par un composé détectable (fluorochrome, molécule radioactive, etc.) des molécules d'intérêt éventuellement présentes dans l'échantillon à tester.The applicant has endeavored to develop a new biosensor and a new reading system adapted to this new biosensor, easier to use than known systems and biosensors, and having a manufacturing cost as well as a cost reduced use. As already mentioned above, in order to use the known immobilized probe biosensor reading systems, the current techniques resort to a fluorescence detection step, or a radioactivity signal measurement step, to hybridization between the immobilized probes and the labeled molecules of interest. The realization of a final step of detection of the hybridization complexes obliges the implementation of a preliminary step of labeling with a detectable compound (fluorochrome, radioactive molecule, etc.) molecules of interest possibly present in the sample to be tested.
Le demandeur a donc cherché à concevoir un nouveau biocapteur et un système de lecture adapté à ce nouveau biocapteur, qui permet d'éviter notamment le recours à une étape préalable de marquage des molécules d'intérêt contenues dans l'échantillon à tester, qu'il s'agisse d'un marquage par une molécule détectable fluorochrome ou par tout autre type de molécule détectable.The applicant has therefore sought to design a new biosensor and a reading system adapted to this new biosensor, which avoids in particular the use of a preliminary step of labeling the molecules of interest contained in the sample to be tested, that it is a labeling by a fluorochrome detectable molecule or by any other type of detectable molecule.
Après de longues recherches, le demandeur a conçu un nouveau biocapteur dont les caractéristiques générales le rendent compatible avec une variété de systèmes de lecture, adaptés à la détection des complexes d'hybridation entre des sondes immobilisées et des molécules d'intérêt. De plus, le demandeur a conçu un système de détection des complexes d'hybridation qui est spécifiquement adapté au nouveau capteur mis au point, comme cela est détaillé dans la présente description.After extensive research, the applicant has designed a novel biosensor whose general characteristics make it compatible with a variety of reading systems, suitable for the detection of hybridization complexes between immobilized probes and molecules of interest. In addition, the Applicant has devised a hybridization complex detection system that is specifically adapted to the newly developed sensor, as detailed in this disclosure.
En particulier, il a été mis au point selon l'invention un biocapteur dont le support sur lequel sont immobilisées les sondes comprend un revêtement électro-conducteur.In particular, it has been developed according to the invention a biosensor whose support on which the probes are immobilized comprises an electroconductive coating.
On a montré selon l'invention que la présence, à la surface d'un biocapteur d'un type approprié, de complexes formés entre (i) des sondes immobilisées sur ladite surface, et (ii) des molécules ligands initialement contenues dans un échantillon à tester, peut être détectée par mesure du changement de potentiel électrique à la surface du biocapteur, ou bien par mesure du changement de la constante diélectrique à la surface du biocapteur, à l'aide d'un dispositif de mesure constitué d'un capteur capacitif sans contact et non vibrant.It has been shown according to the invention that the presence, on the surface of a biosensor of a suitable type, of complexes formed between (i) probes immobilized on said surface, and (ii) ligand molecules initially contained in a sample to be tested, can be detected by measuring the change of electrical potential at the surface of the biosensor, or by measuring changing the dielectric constant at the surface of the biosensor, using a measuring device consisting of a non-contact and non-vibrating capacitive sensor.
On a aussi montré selon l'invention que, lorsque la surface du support solide possédant un revêtement électro-conducteur possède un potentiel électrique de surface de valeur V0, défini par rapport au potentiel de l'électrode du capteur capacitif non vibrant, la présence d'une sonde immobilisée sur ledit support porte le potentiel électrique de ladite surface à une valeur V1, également défini par rapport au potentiel de l'électrode du capteur capacitif non vibrant, et la présence d'un complexe d'hybridation entre ladite sonde immobilisée et un ligand porte le potentiel électrique de ladite surface à une valeur V2, également défini par rapport au potentiel de l'électrode du capteur capacitif non vibrant, On a montré selon l'invention que le changement local de potentiel pouvait être détecté à l'aide d'un capteur capacitif sans contact et non vibrant en déplacement relatif par rapport à la surface dudit biocapteur.It has also been shown according to the invention that, when the surface of the solid support having an electroconductive coating has an electrical surface potential of value V 0 , defined with respect to the potential of the electrode of the non-vibrating capacitive sensor, the presence a probe immobilized on said support carries the electrical potential of said surface at a value V 1 , also defined with respect to the potential of the non-vibrating capacitive sensor electrode, and the presence of a hybridization complex between said probe immobilized and a ligand carries the electrical potential of said surface to a value V 2 , also defined with respect to the potential of the electrode of the non-vibrating capacitive sensor. It has been shown according to the invention that the local change of potential could be detected at using a capacitive sensor without contact and non-vibrating relative displacement relative to the surface of said biosensor.
On a aussi montré que, avec la combinaison d'un capteur capacitif sans contact et non vibrant et d'un support électro-conducteur comme décrit ci-dessus, la permittivité diélectrique de l'espace localisé entre la tête de mesure du capteur et la surface électroconductrice du support varie selon que (i) ledit espace est constitué du fluide gazeux atmosphérique environnant, que (ii) ledit espace est au moins partiellement occupé par des sondes immobilisées sur le support ou que (iii) ledit espace est au moins partiellement occupé par des complexes d'hybridation entre des sondes immobilisées sur le support et des molécules ligand se liant auxdites sondes immobilisées.It has also been shown that, with the combination of a non-contact and non-vibrating capacitive sensor and an electrically conductive support as described above, the dielectric permittivity of the space located between the measuring head of the sensor and the electroconductive surface of the support varies depending on whether (i) said space is constituted by the surrounding atmospheric gaseous fluid, (ii) said space is at least partially occupied by probes immobilized on the support or (iii) said space is at least partially occupied by hybridization complexes between immobilized probes on the support and ligand molecules binding to said immobilized probes.
Par « permittivité diélectrique », on entend la propriété physique qui rend compte de la réponse de l'espace localisé entre l'électrode de mesure du capteur et la surface électroconductrice du support de l'invention au champ électrique généré entre le capteur capacitif sans contact et non vibrant et la surface électroconductrice du support. Ainsi, il a été mis au point selon l'invention un biocapteur adapté à la détection de complexes d'hybridation entre des sondes cibles et des ligands se liant, de préférence spécifiquement, auxdites sondes cibles, consistant en un support solide circulaire plan comprenant une première et une seconde face, avec la première face comprenant à sa surface un revêtement électroconducteur, ladite première face comprenant également une pluralité de sondes, ou une pluralité d'ensembles de sondes, immobilisés à sa surface, les sondes, ou les ensembles de sondes, étant disposés sur ladite première face suivant des coordonnées polaires (p, θ).By "dielectric permittivity" is meant the physical property which accounts for the response of the space located between the measuring electrode of the sensor and the electroconductive surface of the support of the invention to the electric field generated between the capacitive sensor without contact. and not vibrating and the electroconductive surface of the support. Thus, it has been developed according to the invention a biosensor adapted to the detection of hybridization complexes between target probes and ligands binding, preferably specifically, to said target probes, consisting of a flat circular solid support comprising a first and second faces, with the first face comprising on its surface an electroconductive coating, said first face also comprising a plurality of probes, or a plurality of sets of probes, immobilized on its surface, the probes, or the sets of probes , being disposed on said first face along polar coordinates (p, θ).
Dans un biocapteur selon l'invention, la localisation d'une sonde déterminée, ou d'un ensemble déterminé de sondes, est définie par la combinaison de ses coordonnées polaires dans laquelle : (i) p est la coordonnée radiale, c'est à dire la distance de ladite sonde, ou dudit ensemble de sondes, par rapport au centre du support circulaire, suivant l'axe du rayon, et (ii) θ est la coordonnée angulaire, c'est à dire la mesure, dans le sens trigonométrique, de l'angle entre le point de localisation des sondes et la demi-droite d'angle 0°, encore appelée axe polaire, qui est préalablement fixé comme référence unique d'origine. Les caractéristiques détaillées du biocapteur sont spécifiées plus loin dans la présente description. Comme indiqué précédemment, la présente invention fournit aussi un système pour la détection de complexes d'hybridation entre des sondes et des ligands se liant, de préférence spécifiquement, auxdites sondes, ledit système étant adapté à la mise en oeuvre du biocapteur circulaire défini de manière générale ci-dessus. Avec le système de l'invention, la détection de la formation de complexes d'hybridation entre les sondes immobilisées sur le biocapteur et des ligands se liant auxdites sondes est réalisée de façon dynamique par un dispositif capteur unique, par mesure de la variation de l'intensité électrique du courant généré dans ledit capteur unique lorsque le biocapteur circulaire est en rotation, c'est à dire lorsque la surface du biocapteur est en déplacement relatif vis-à-vis de l'électrode, dudit capteur unique. Plus particulièrement, comme cela sera détaillé plus loin, le capteur unique qui équipe le système de détection ci-dessus consiste en un capteur capacitif sans contact non vibrant, qui permet la détection des modifications de potentiel électrique, des variations de charge électrique, des variations de moment dipolaire ou encore des variations de permittivité diélectrique, chacune de ces variations étant produites du fait de la présence, entre l'électrode dudit capteur unique et la surface du biocapteur, de sondes immobilisées sur le biocapteur, ou de complexes d'hybridation entre lesdites sondes immobilisées et des ligands spécifiques desdites sondes.In a biosensor according to the invention, the location of a specific probe, or of a determined set of probes, is defined by the combination of its polar coordinates in which: (i) p is the radial coordinate, this is at say the distance of said probe, or said set of probes, with respect to the center of the circular support, along the axis of the radius, and (ii) θ is the angular coordinate, ie the measurement, in the trigonometrical direction , of the angle between the location of the probes and the half-line of 0 ° angle, also called polar axis, which is previously fixed as original reference. The detailed characteristics of the biosensor are specified later in this specification. As indicated above, the present invention also provides a system for the detection of hybridization complexes between probes and ligands binding, preferably specifically, to said probes, said system being adapted to the implementation of the circular biosensor defined in a manner general above. With the system of the invention, the detection of the formation of hybridization complexes between the probes immobilized on the biosensor and ligands binding to said probes is carried out dynamically by a single sensor device, by measuring the variation of the electrical intensity of the current generated in said single sensor when the circular biosensor is rotating, that is to say when the surface of the biosensor is in relative displacement vis-à-vis the electrode, said single sensor. More particularly, as will be detailed below, the single sensor that equips the above detection system consists of a capacitive sensor without non-vibrating contact, which allows the detection of electrical potential changes, electrical load variations, variations of dipole moment or variations of dielectric permittivity, each of these variations being produced because of the presence, between the electrode of said single sensor and the surface of the biosensor, of probes immobilized on the biosensor, or of hybridization complexes between said immobilized probes and specific ligands of said probes.
La présente invention a pour objet un système pour la détection de complexes d'hybridation entre (i) des sondes immobilisées sur un support et (ii) des molécules ligands hybridant spécifiquement avec lesdites sondes, ledit système comprenant : a) un biocapteur (10) pour la réalisation de complexes d'hybridation entre (i) des sondes et (ii) des ligands hybridant spécifiquement avec lesdites sondes, ledit biocapteur (10) étant constitué d'un matériau support circulaire plan (1 1 ) comprenant une première et une seconde face et dont la première face comprend une surface de revêtement électro-conducteur (12) sur laquelle sont immobilisées une ou plusieurs sondes (13), ledit biocapteur comprenant, sur ladite première face, une marque électriquement détectable repérant la position fixée comme référence d'origine angulaire (14), b) un moyen (30) de mise en rotation du biocapteur (10) à une vitesse contrôlée, c) un capteur capacitif sans contact non vibrant (40), d) un moyen (50) pour le déplacement dudit capteur capacitif sans contact non vibrantThe present invention relates to a system for the detection of hybridization complexes between (i) immobilized probes on a support and (ii) ligand molecules specifically hybridizing with said probes, said system comprising: a) a biosensor (10) for carrying out hybridization complexes between (i) probes and (ii) ligands specifically hybridizing with said probes, said biosensor (10) consisting of a planar circular support material (1 1) comprising a first and a second face and whose first face comprises an electroconductive coating surface (12) on which are immobilized one or more probes (13), said biosensor comprising, on said first face, an electrically detectable mark identifying the fixed position as reference angular origin (14), b) means (30) for rotating the biosensor (10) at a controlled speed, c) a non-vibrating contactless capacitive sensor (40), d) means (50) for moving said capacitive non-contacting capacitive sensor
(40) suivant l'axe radial du biocapteur (10), et e) un moyen de mesure (60) de la valeur d'intensité « I » du courant traversant le capteur capacitif sans contact non vibrant (40), relié audit capteur capacitif (40) par des moyens électroconducteurs (70), et f) un moyen (80) permettant de maintenir sensiblement constante la distance séparant le capteur (40) de la surface du revêtement électroconducteur (12),(40) along the radial axis of the biosensor (10), and e) a means (60) for measuring the intensity value "I" of the current flowing through the capacitive sensor without non-vibrating contact (40), connected to said sensor capacitive means (40) by electroconductive means (70), and f) means (80) for maintaining substantially constant the distance separating the sensor (40) from the surface of the electroconductive coating (12),
Dans certains modes de réalisation du système de détection ci-dessus, ledit système comprend aussi g) un moyen électroconducteur (95) permettant une mise à la terre de la surface du biocapteur (10) .En référence à la figure 4, ledit moyen électroconducteur (95) peut consister en un câble électrique (95) dont une première extrémité est reliée à la terre et dont une seconde extrémité est reliée électriquement, directement ou indirectement, au biocapteur (10).In some embodiments of the above detection system, said system also comprises g) electroconductive means (95) for grounding the surface of the biosensor (10). With reference to Fig. 4, said electroconductive means (95) may consist of an electrical cable (95) having a first end connected to the earth and a second end is electrically connected, directly or indirectly, to the biosensor (10).
Sur le mode de réalisation de la Figure 4, le câble électrique (95) est relié électriquement de manière indirecte au biocapteur (10), par l'intermédiaire d'un enchaînement de pièces électroconductrices électriquement reliées les unes aux autres, respectivement (i) une tige (92) en graphite en contact, d'une part avec l'une des extrémités du câble (95) et, d'autre part, avec un capuchon métallique (91 ) qui est posé sur l'axe central de rotation du biocapteur (10) et est en contact électrique avec ledit biocapteur (10). Dans le système représenté sur la Figure 4, le capuchon métallique (91 ) a une position fixe par rapport à la surface du biocapteur (10), c'est-à-dire que lorsque le biocapteur (10) est en rotation, ledit capuchon métallique est également en rotation, à une vitesse angulaire identique à la vitesse angulaire du biocapteur (10), donc sans déplacement relatif du capuchon (91 ) par rapport à la surface du biocapteur (10). Dans le système représenté sur la Figure 4, la tige électroconductrice (92) est simplement en contact avec le capuchon (91 ) et n'entre donc pas en rotation avec le capuchon (91 ). De préférence, le maintien du contact de la tige (92) avec la surface de la partie supérieure du capuchon (91 ) est assurée par la liaison mécanique de la tige (92) avec un moyen de poussée de ladite tige vers le bas, en général un ressort, ladite tige (92) coulissant, selon un axe perpendiculaire à la surface principale du biocapteur (10).In the embodiment of FIG. 4, the electric cable (95) is indirectly electrically connected to the biosensor (10) by means of a series of electrically conductive parts electrically connected to each other, respectively (i) a graphite rod (92) in contact, on the one hand with one end of the cable (95) and on the other hand with a metal cap (91) which is placed on the central axis of rotation of the biosensor (10) and is in electrical contact with said biosensor (10). In the system shown in FIG. 4, the metal cap (91) has a fixed position with respect to the surface of the biosensor (10), i.e. when the biosensor (10) is rotating, said cap metal is also rotated, at an angular velocity identical to the angular velocity of the biosensor (10), therefore without relative displacement of the cap (91) relative to the surface of the biosensor (10). In the system shown in Figure 4, the electroconductive rod (92) is merely in contact with the cap (91) and therefore does not rotate with the cap (91). Preferably, maintaining contact of the rod (92) with the surface of the upper part of the cap (91) is ensured by the mechanical connection of the rod (92) with a pushing means of said rod downwards, in general a spring, said rod (92) sliding along an axis perpendicular to the main surface of the biosensor (10).
La seconde extrémité du moyen électroconducteur (95) peut être relié à la terre selon une diversité de manières connues de l'homme du métier. En référence à la Figure 4, la seconde extrémité du câble électroconducteur est reliée électriquement au châssis portant le système de détection de l'invention, par l'intermédiaire de la potence métallique (94) ledit châssis étant lui-même relié à la terre, la potence (95) et le châssis étant dans ce mode de réalisation tous les deux en métal. Selon d'autres modes de réalisation, le moyen électroconducteur (95) peut être relié directement à la terre par l'intermédiaire d'une prise de terre conventionnelle.The second end of the electroconductive means (95) may be grounded in a variety of ways known to those skilled in the art. With reference to FIG. 4, the second end of the electroconductive cable is electrically connected to the chassis carrying the detection system of the invention, via the metal bracket (94), said chassis being itself connected to the ground, the stem (95) and the frame being in this embodiment both metal. According to other embodiments, the electroconductive means (95) can be directly connected to the earth via a conventional ground.
La mise à la terre de la surface électroconductrice du biocapteur (10) est avantageuse pour maintenir sensiblement constante la valeur du potentiel V0 au cours du temps d'utilisation du système de détection selon l'invention. Par « complexe d'hybridation », on entend selon l'invention le complexe formé entre une sonde immobilisée sur la surface (1 1 ) du biocapteur (10) et une ou plusieurs molécules ligand liée(s) de manière non covalente à ladite sonde. Dans un complexe d'hybridation au sens de l'invention, sont en général complexées une sonde avec une seule molécule ligand se liant spécifiquement à ladite sonde. La molécule ligand est en général liée à la sonde par des liaisons non covalentes faibles, ce qui englobe les liaisons hydrogène, les liaisons électrostatiques, les liaisons ioniques ou encore les forces de Van der Waals.The grounding of the electroconductive surface of the biosensor (10) is advantageous for keeping the value of the potential V 0 substantially constant over the time of use of the detection system according to the invention. By "hybridization complex" is meant according to the invention the complex formed between a probe immobilized on the surface (1 1) of the biosensor (10) and one or more ligand molecules non-covalently bound to said probe. . In a hybridization complex within the meaning of the invention, a probe with a single ligand molecule specifically binding to said probe is generally complexed. The ligand molecule is generally bound to the probe by weak non-covalent bonds, which includes hydrogen bonds, electrostatic bonds, ionic bonds or Van der Waals forces.
Par « ligand », on entend selon l'invention tout type de molécule ayant la capacité à se lier à une sonde par des liaisons non covalentes. La nature chimique d'un ligand peut être très variée et englobe notamment les acides nucléiques et les polypeptides. Lorsque la sonde consiste en un acide nucléique, le ligand consistera en général en un acide nucléique ayant une séquence au moins partiellement complémentaire à l'acide nucléique sonde avec lequel il possède la capacité à se lier. Dans d'autres cas, le ligand peut consister en un polypeptide, par exemple dans les modes de réalisation d'un système selon l'invention dans lesquels les sondes immobilisés à la surface du biocapteur consistent en des acides nucléiques aptamères, c'est-à- dire des acides nucléiques préalablement sélectionnés pour leur capacité de fixation sélective sur des polypeptides, par exemple par sélection selon la méthode Selex bien connue de l'homme du métier.By "ligand" is meant according to the invention any type of molecule having the ability to bind to a probe by non-covalent bonds. The chemical nature of a ligand can be very varied and includes in particular nucleic acids and polypeptides. When the probe consists of a nucleic acid, the ligand will generally consist of a nucleic acid having a sequence at least partially complementary to the probe nucleic acid with which it has the ability to bind. In other cases, the ligand may consist of a polypeptide, for example in the embodiments of a system according to the invention in which the probes immobilized on the surface of the biosensor consist of aptamer nucleic acids, that is, that is to say nucleic acids previously selected for their ability to selectively bind to polypeptides, for example by selection according to the Selex method well known to those skilled in the art.
Par « sonde», on entend selon l'invention une molécule susceptible d'être immobilisée sur un support solide et qui possède la capacité à se lier, de préférence spécifiquement, de manière non covalente à une ou plusieurs autres molécules, appelées « ligands », pour former un complexe d'hybridation. Les molécules de sondes peuvent être de nature variée et englobent notamment des molécules polypeptidiques et des molécules d'acide nucléique. Les molécules de sondes englobent aussi des substances minérales ou organiques, autres que les polypeptides ou les acides nucléiques, possédant la capacité à se lier de manière non covalente à une ou plusieurs molécules ligand.By "probe" is meant according to the invention a molecule capable of being immobilized on a solid support and which has the capacity to bind, preferably specifically, non-covalently to one or more other molecules, called "ligands" to form a hybridization complex. The probe molecules can be of varied nature and include, in particular, polypeptide molecules and nucleic acid molecules. The probe molecules also include inorganic or organic substances, other than polypeptides or nucleic acids, having the ability to bind non-covalently to one or more ligand molecules.
Par « acide nucléique », on entend selon l'invention des polymères comprenant des bases purine et pyrimidine, ce qui englobe les polyribonucléotides, y compris l'ARN, et les polydésoxyribonucléotides, y compris l'ADN. Les acides nucléiques englobent à la fois des molécules simple brin et des molécules double brin. Le système de détection de l'invention sera mieux compris au vu de la description de certains de ses modes de réalisation, en référence aux figures.By "nucleic acid" is meant according to the invention polymers comprising purine and pyrimidine bases, which includes polyribonucleotides, including RNA, and polydeoxyribonucleotides, including DNA. Nucleic acids include both single-stranded and double-stranded molecules. The detection system of the invention will be better understood from the description of some of its embodiments, with reference to the figures.
En référence à la figure 1 , le biocapteur plan de forme circulaire (10) comprend une première face (16) et une seconde face (17), dont seule la première face (16) est visible sur la figure. Le matériau support (1 1 ) est, sur la première face (16), recouvert au moins sur une partie de sa surface, et préférentiellement sur la quasi-totalité ou même sur la totalité de sa surface, d'un revêtement électroconducteur (12). Sur ladite première face (16), des sondes (13), ou des ensembles ou « spots » de sondes (13), sont immobilisés à la surface du support (1 1 ) et exposées à l'environnement extérieur. La localisation de chaque sonde (13), ou de chaque ensemble de sondes (13), est connue et est préférentiellement déterminée par ses coordonnées polaires (p, θ), étant entendu que les coordonnées polaires sont déterminées (i) pour p, en unités arbitraires de distance par rapport au centre du biocapteur circulaire, et (ii) pour θ, en unités arbitraires de mesure d'angle, par rapport à une marque de référence unique (14) définissant la demi-droite d'origine angulaire d'axe radial. La seconde face (17), non visible sur la figure 1 , est préférentiellement revêtue d'un matériau adapté à l'enregistrement et à lecture optique d'informations, du type des matériaux utilisés dans la fabrication des disques optiques connus, par exemple de disques optiques de type CD-ROM ou DVD-ROM.With reference to FIG. 1, the circular planar biosensor (10) comprises a first face (16) and a second face (17), of which only the first face (16) is visible in the figure. The support material (1 1) is, on the first face (16), covered at least on a part of its surface, and preferably on almost all or even all of its surface, with an electroconductive coating (12). ). On said first face (16), probes (13), or sets or "spots" of probes (13), are immobilized on the surface of the support (1 1) and exposed to the external environment. The location of each probe (13), or each set of probes (13), is known and is preferably determined by its polar coordinates (p, θ), it being understood that the polar coordinates are determined (i) for p, in arbitrary units of distance from the center of the circular biosensor, and (ii) for θ, in arbitrary units of angle measurement, with respect to a single reference mark (14) defining the angular origin half-line of radial axis. The second face (17), not visible in FIG. 1, is preferably coated with a material suitable for recording and optical reading of information, of the type of materials used in the manufacture of known optical disks, for example optical discs of the CD-ROM or DVD-ROM type.
A titre illustratif, les unités arbitraires utilisées pour la localisation de chaque sonde (13), ou de chaque ensemble de sondes (13), peut être (i) pour p, en micromètres et (ii) pour θ, en degrés d'arc. Sur le mode de réalisation du biocapteur de la figure 1 sont représentées simultanément une demi-face (16) soumise à l'hybridation et une demi-face (17) non soumise à l'hybridation. La demi-face (16) et la demi-face (17) ne présentent aucune différence de structure. La distinction entre la demi-face (16) et la demi-face (17) peut être faite seulement après l'étape d'hybridation, c'est-à-dire après l'étape de mise en contact du biocapteur (10) avec un échantillon susceptible de contenir un ou plusieurs ligands se fixant spécifiquement sur les sondes immobilisées. Dans le mode de réalisation représenté sur la figure 1 , seule la moitié de la surface du biocapteur est mise en contact avec l'échantillon susceptible de contenir un ou plusieurs ligands. Par exemple, on immerge une première moitié (16) du biocapteur (10) dans l'échantillon, la seconde moitié (17) du biocapteur (10) restant émergée, par exemple en contact avec l'air. Après hybridation, seule la demi-face (16) du biocapteur (10) est susceptible de comprendre des complexes d'hybridation entre des sondes immobilisées et des ligands contenus dans l'échantillon.As an illustration, the arbitrary units used for locating each probe (13), or each set of probes (13), can be (i) for p, in micrometers and (ii) for θ, in degrees of arc. . In the embodiment of the biosensor of FIG. 1, a half-face (16) subjected to hybridization and a half-face (17) not subject to hybridization are simultaneously represented. The half-face (16) and the half-face (17) have no difference in structure. The distinction between the half-face (16) and the half-face (17) can be made only after the hybridization step, that is to say after the step of contacting the biosensor (10) with a sample that may contain one or more ligands specifically binding to the immobilized probes. In the embodiment shown in FIG. 1, only half of the surface of the biosensor is brought into contact with the sample that may contain one or more ligands. For example, one immerses a first half (16) of the biosensor (10) in the sample, the second half (17) of the biosensor (10) remaining emerged, for example in contact with the air. After hybridization, only the half-face (16) of the biosensor (10) is likely to comprise hybridization complexes between immobilized probes and ligands contained in the sample.
En référence à la figure 2, le système de détection (20) est constitué d'une structure ou bâtis, qui peut être appelée aussi « châssis », sur laquelle sont implantés les moyens essentiels, y compris le capteur (40) capacitif sans contact non vibrant et le biocapteur (10). Le biocapteur (10), qui est amovible, est posé sur une platine rotative dont l'axe central se confond avec l'axe central du biocapteur (10) circulaire plan. La platine rotative, qui constitue le moyen de déplacement rotatif (30) à vitesse contrôlée du biocapteur (10) est reliée mécaniquement à un moteur à vitesse contrôlée variable, qui n'est pas représenté sur la figure. Un blindage (22) isole électriquement le biocapteur (10) par rapport à l'environnement extérieur. Sur la figure 2, la face supérieure du biocapteur (10) est la « première face » du biocapteur recouverte au moins partiellement d'un revêtement électroconducteur, sur lequel sont immobilisés les sondes ou les ensembles de sondes. Le capteur (40) capacitif sans contact non vibrant est solidaire d'un support de maintien (80) qui est mobile suivant un axe horizontal qui se confond avec l'axe radial du biocapteur (10). Un moyen (50) de déplacement du capteur (40) permet la translation linéaire contrôlée de l'ensemble support (80)/capteur (40). L'électrode du capteur (40) est située à une distance constante de la surface de revêtement électroconducteur du biocapteur (10), quelle que soit la position du capteur (40) le long de son axe de translation. Une diode laser de lecture ou d'enregistrement optique d'informations est disposée face à la seconde face du biocapteur (10) opposée à la première face. Le moyen (50) de déplacement du capteur (40) est conçu de manière à permettre une translation du capteur (40) et de la diode laser sur au moins une partie de l'axe du plan principal du biocapteur (10), respectivement du côté de la première et du côté de la seconde face du biocapteur (10). L'électrode du capteur (40) est reliée électriquement par la liaison (70) à un moyen de mesure (60) d'un signal électrique généré par le capteur (40). Enfin, le biocapteur (10) est placé à une valeur contrôlée de potentiel électrique par l'intermédiaire d'une liaison électrique (90) entre le biocapteur (10) et un générateur de tension non représenté sur la figure 2.Referring to Figure 2, the detection system (20) consists of a structure or frame, which may also be called "frame", on which are implanted the essential means, including the capacitive sensor (40) contactless non-vibrating and the biosensor (10). The biosensor (10), which is removable, is placed on a rotating plate whose central axis coincides with the central axis of the plane circular biosensor (10). The turntable, which is the controlled speed rotational means (30) of the biosensor (10) is mechanically connected to a variable controlled speed motor, which is not shown in the figure. A shield (22) electrically isolates the biosensor (10) from the outside environment. In Figure 2, the upper face of the biosensor (10) is the "first face" of the biosensor at least partially covered with an electroconductive coating, on which are immobilized the probes or sets of probes. The capacitive sensor (40) without non-vibrating contact is secured to a holding support (80) which is movable along a horizontal axis which coincides with the radial axis of the biosensor (10). A sensor displacement means (50) allows the controlled linear translation of the carrier (80) / sensor (40) assembly. The electrode of the sensor (40) is located at a constant distance from the electroconductive coating surface of the biosensor (10), regardless of the position of the sensor (40) along its translation axis. A laser diode for reading or optical information recording is arranged facing the second face of the biosensor (10) opposite to the first face. The means (50) for displacing the sensor (40) is designed to allow a translation of the sensor (40) and the laser diode on at least a portion of the axis of the main plane of the biosensor (10), respectively of the next to the first and second side of the biosensor (10). The electrode of the sensor (40) is electrically connected by the link (70) to a means (60) for measuring an electrical signal generated by the sensor (40). Finally, the biosensor (10) is placed at a controlled electric potential value via an electrical connection (90) between the biosensor (10) and a voltage generator not shown in FIG. 2.
Dans les modes de réalisation préférés du système (20) de détection de l'invention, le capteur (40) capacitif sans contact non vibrant comprend une seule électrode, qui est disposée sur la partie supérieure du support (80), l'extrémité de ladite électrode, placée à une distance fixe de la surface de revêtement électroconducteur de la « première face » du biocapteur (10) et pouvant se translater sur au moins une partie de l'axe radial dudit biocapteur (40). C'est ce mode de réalisation du capteur (40) capacitif sans contact non vibrant qui est représenté en détail sur la figure 3.In the preferred embodiments of the detection system (20) of the invention, the non-vibrating non-contact capacitive sensor (40) comprises a single electrode, which is arranged on the upper part of the support (80), the end of said electrode, placed at a fixed distance from the electroconductive coating surface of the "first face" of the biosensor (10) and being able to translate on at least a part of the radial axis of said biosensor (40). It is this embodiment of the non-vibrating contactless capacitive sensor (40) which is shown in detail in FIG.
La figure 3 représente une section verticale d'un mode de réalisation du capteur (40) capacitif non vibrant sans contact. Sur le mode de réalisation représenté sur la figure 3, l'électrode du capteur (40) comprend une tige métallique (42) dont l'extrémité orientée vers la surface du biocapteur (10) constitue une face de coupe (41 ), de section parallèle à l'axe de translation du capteur (40). La tige métallique (42) est incluse dans un cylindre de matériau isolant (43), lui-même électriquement isolé par rapport à l'environnement extérieur par une enveloppe de blindage (44) métallique. L'électrode du capteur (40) est reliée à un moyen de mesure du signal électrique généré dans celle-ci par l'intermédiaire d'une liaison électroconductrice (70) en contact avec l'extrémité de la tige métallique (42) opposée à l'extrémité (41 ). L'électrode du capteur (40) est solidaire d'un chariot (51 ), qui est mobile le long d'un axe qui se confond avec l'axe du plan principal du biocapteur (10). Le chariot (51 ) est équipé d'un système de maintien du capteur (40) comprenant respectivement (A) un bras de levier (81 ) mobile autour d'un axe transversal horizontal, perpendiculaire par rapport à l'axe de translation du chariot (51 ) par l'intermédiaire de l'articulation (82), et (B) un ressort de rappel (83) qui coopère avec une butée (84) de hauteur réglable, permettant de maintenir fixe la position de l'électrode lorsque le système est en fonctionnement. Le déplacement linéaire du chariot (51 ) le long de son axe est réalisé par la rotation d'une vis sans fin (53) qui est engagée dans l'axe équipé d'un pas de vis traversant la base du chariot (51 ), la vis sans fin (53) étant reliée mécaniquement à un moteur (54), par exemple un moteur pas-à-pas, grâce auquel l'extrémité (41 ) de l'électrode solidaire du chariot (51 ) peut prendre une position déterminée quelconque le long de l'axe parallèle à l'axe principal du biocapteur (10). Sur la base du chariot (51 ), face à l'extrémité (41 ) de l'électrode du capteur (40), est disposée une diode laser (52) pour la lecture ou l'écriture d'informations sur la « seconde face » du biocapteur (10) dans les modes de réalisation du système de détection dans lesquels la seconde face du biocapteur (10) consiste en un matériau pour la lecture ou l'écriture optique d'informations, du type de celui utilisé pour les disques optiques connus.Figure 3 shows a vertical section of an embodiment of the non-vibrating capacitive sensor (40) without contact. In the embodiment shown in FIG. 3, the electrode of the sensor (40) comprises a metal rod (42) whose end facing the surface of the biosensor (10) forms a cutting face (41) of section parallel to the translation axis of the sensor (40). The metal rod (42) is included in a cylinder of insulating material (43), itself electrically isolated from the external environment by a metal shielding shell (44). The electrode of the sensor (40) is connected to a means for measuring the electrical signal generated therein by means of an electroconductive link (70) in contact with the end of the metal rod (42) opposite to the end (41). The electrode of the sensor (40) is integral with a carriage (51), which is movable along an axis which coincides with the axis of the main plane of the biosensor (10). The carriage (51) is equipped with a sensor holding system (40) respectively comprising (A) a lever arm (81) movable about a horizontal transverse axis, perpendicular to the translation axis of the carriage (51) through the hinge (82), and (B) a return spring (83) which cooperates with a stop (84) of adjustable height, to maintain fixed the position of the electrode when the system is in operation. The linear displacement of the carriage (51) along its axis is achieved by the rotation of a worm (53) which is engaged in the axis equipped with a thread passing through the base of the carriage (51), the worm (53) being mechanically connected to a motor (54), for example a stepper motor, by means of which the end (41) of the integral electrode of the carriage (51) can take a determined position any along the axis parallel to the main axis of the biosensor (10). On the base of the carriage (51), facing the end (41) of the electrode of the sensor (40), is disposed a laser diode (52) for reading or writing information on the "second side Of the biosensor (10) in the embodiments of the detection system in which the second face of the biosensor (10) consists of a material for optical reading or writing of information, of the type used for optical discs known.
La figure 4 illustre une coupe verticale d'un détail du système de détection, dans laquelle est schématisée la prise de contact électrique équipant le système de détection de l'invention, permettant de fixer la valeur de potentiel de la surface de revêtement électroconducteur du biocapteur (10), par mise à la masse. Dans le mode de réalisation représenté sur la figure 4, le système de prise de contact comprend une potence (94) qui est fixée à l'une de ses extrémités à l'embase du système de détection et dont l'autre extrémité est équipée de la combinaison de moyens permettant d'affecter à la surface du biocapteur (10) la valeur de potentiel électrique choisi. Cette combinaison de moyens comprend un capuchon métallique (91 ) cylindrique creux dont la partie creuse centrale est emboîtée dans l'axe du moyen de déplacement rotatif (30) du biocapteur (10) et dont les bords inférieurs sont en contact avec la surface de revêtement électroconducteur du biocapteur (10). Le capuchon cylindrique (91 ) est en contact avec une tige électroconductrice (92), de préférence en graphite, qui est mobile par translation verticale selon un axe radial du moyen de déplacement rotatif (30). Une première extrémité de la tige électroconductrice est en contact avec le capuchon métallique (91 ), l'extrémité opposée étant reliée, par l'intermédiaire d'une liaison électroconductrice, à un dispositif générateur de tension, qui n'est pas représenté sur la figure 4.FIG. 4 illustrates a vertical section of a detail of the detection system, in which is schematized the electrical contact fitted to the detection system of the invention, making it possible to set the potential value of the electroconductive coating surface of the biosensor (10), by grounding. In the embodiment shown in FIG. 4, the contacting system comprises a bracket (94) which is fixed at one of its ends to the base of the detection system and whose other end is equipped with the combination of means for assigning to the surface of the biosensor (10) the selected electrical potential value. This combination of means comprises a hollow cylindrical metal cap (91) whose central hollow portion is nested in the axis of the rotary displacement means (30) of the biosensor (10) and whose lower edges are in contact with the electroconductive coating surface of the biosensor (10). The cylindrical cap (91) is in contact with an electroconductive rod (92), preferably graphite, which is movable by vertical translation along a radial axis of the rotary displacement means (30). A first end of the electroconductive rod is in contact with the metal cap (91), the opposite end being connected, via an electroconductive link, to a voltage generating device, which is not shown on the figure 4.
La figure 5 représente un schéma général des moyens constituant le moyen de mesure (60) auquel il a déjà été fait référence dans la description de la figure 2. Sur la figure 5, les différents éléments constitutifs du moyen de mesure (60) du système de détection sont représentés symboliquement par des boîtes. Le capteur (40) est relié à un amplificateur ampérométrique (61 ) par l'intermédiaire de la liaison électroconductrice (70). L'amplificateur ampérométrique (61 ) est relié électriquement à un moyen (62) de conversion du signal analogique provenant dudit amplificateur (61 ) en un signal numérique qui est transmis à un calculateur numérique (63), le signal numérique généré par le convertisseur (62) étant traité préalablement par des moyens (64, 65) de filtrage du signal. Dans certains modes de réalisation du moyen de mesure (60), l'ensemble constitué de l'amplificateur (61 ) et du convertisseur (62) est implanté sur une carte électronique (66) qui équipe le calculateur numérique (63). La mémoire du calculateur numérique (63) est chargée avec un ensemble d'instructions permettant de déterminer la présence de complexes d'hybridation entre les sondes immobilisées sur le biocapteur (10) et des molécules ligands, en tout point de la surface utile de la « première face » du biocapteur (10).FIG. 5 represents a general diagram of the means constituting the measuring means (60) to which reference has already been made in the description of FIG. 2. In FIG. 5, the various elements constituting the measuring means (60) of the system are symbolically represented by boxes. The sensor (40) is connected to an amperometric amplifier (61) via the electroconductive link (70). The amperometric amplifier (61) is electrically connected to a means (62) for converting the analog signal from said amplifier (61) to a digital signal which is transmitted to a digital computer (63), the digital signal generated by the converter ( 62) being previously processed by means (64, 65) for filtering the signal. In some embodiments of the measuring means (60), the assembly consisting of the amplifier (61) and the converter (62) is implanted on an electronic card (66) which equips the digital computer (63). The memory of the digital computer (63) is loaded with a set of instructions for determining the presence of hybridization complexes between the probes immobilized on the biosensor (10) and ligand molecules, at any point on the useful surface of the "First face" of the biosensor (10).
Dans un système de détection selon l'invention, la valeur de l'intensité du courant électrique « I » mesurée par le moyen de mesure (60) croît avec : - (i) la différence entre le potentiel V0 de la surface de revêtement (12) et le potentiel \Λ aux endroits de localisation des sondes,In a detection system according to the invention, the value of the intensity of the electric current "I" measured by the measuring means (60) increases with: - (i) the difference between the potential V 0 of the coating surface (12) and the potential \ Λ at locations of probes location,
- (ii) la différence entre le potentiel V0 de la surface de revêtement (12) et le potentiel V2 aux endroits de localisation des complexes d'hybridation (13),- (ii) the difference between the potential V 0 of the coating surface (12) and the potential V 2 at the location locations of the hybridization complexes (13),
- (iii) la différence entre le potentiel \Λ aux endroits de localisation des sondes et le potentiel V2 aux endroits de localisation des complexes d'hybridation (13), et- (iii) the difference between the potential \ Λ at the locations of location of the probes and the potential V 2 at the locations of location of the hybridization complexes (13), and
- (ii) la vitesse de déplacement relative du capteur capacitif (40) au-dessus de la surface de revêtement (12).- (ii) the relative speed of displacement of the capacitive sensor (40) above the coating surface (12).
Plus précisément, dans le cas d'une mesure par détection de variations du potentiel de surface, ou de la permittivité diélectrique, l'extrémité de l'électrode de mesure du capteur capacitif plan (40) de surface « S » positionné à une distance « e » du support (12) a une capacité C0, avec la relation (A) suivante :More precisely, in the case of a measurement by detection of variations of the surface potential, or of the dielectric permittivity, the end of the measuring electrode of the surface capacitive sensor (40) "S" positioned at a distance "E" of the support (12) has a capacity C 0 , with the following relation (A):
C0=ε0.S/e (A), dans laquelle,C 0 = ε 0 .S / e (A), in which,
- C0 signifie la valeur de capacité du capteur capacitif (40),- C 0 means the capacitance value of the capacitive sensor (40),
- ε0 signifie la valeur de permittivité diélectrique de l'air compris dans l'espace inter- électrodes, - S signifie la valeur de surface de l'électrode de mesure du capteur capacitif (40), etε 0 means the dielectric permittivity value of the air included in the inter-electrode space, S represents the surface value of the measuring electrode of the capacitive sensor (40), and
- e signifie la valeur de distance inter-électrodes comme définie ci-dessus, c'est-à-dire la distance entre l'extrémité de l'électrode de mesure et la surface du matériau électroconducteur (12) du biocapteur (10). Dans ce cas, la charge électrique q0 du condensateur que constitue le capteur (40) peut être calculée selon la relation suivante (B) : qo=Co.Vo (B), dans laquelle :e is the inter-electrode distance value as defined above, i.e. the distance between the end of the measuring electrode and the surface of the electroconductive material (12) of the biosensor (10). In this case, the electric charge q 0 of the capacitor constituted by the sensor (40) can be calculated according to the following relation (B): q o = C o .V o (B), in which:
- q0 signifie la charge électrique du capteur capacitif (40),q 0 signifies the electrical charge of the capacitive sensor (40),
- C0 signifie la valeur de capacité du capteur capacitif (40), et - V0 signifie le potentiel de la surface de revêtement (12) du biocapteur (10) défini par rapport au potentiel de l'électrode du capteur capacitif non vibrant.- C 0 means the capacity value of the capacitive sensor (40), and - V 0 means the potential of the coating surface (12) of the biosensor (10) defined with respect to the potential of the electrode of the non-vibrating capacitive sensor.
Lorsque ledit capteur capacitif (40) est positionné à la même distance du biocapteur (10) au-dessus d'une partie de la surface de revêtement (12) sur laquelle sont immobilisées des sondes (13), la charge qi du capteur capacitif (40) de capacité Ci peut être calculée suivant la relation (C) suivante : (C), dans laquelle :When said capacitive sensor (40) is positioned at the same distance from the biosensor (10) over a portion of the coating surface (12) on which probes (13) are immobilized, the load qi of the capacitive sensor ( 40) of capacity Ci can be calculated according to the following relation (C): (C), in which:
- qi signifie la charge électrique du capteur capacitif (40),qi means the electrical charge of the capacitive sensor (40),
- Ci signifie la valeur de capacité du capteur capacitif (40), etCi means the capacitance value of the capacitive sensor (40), and
- Vi signifie le potentiel de la surface de revêtement (12) du biocapteur (10) sur laquelle sont immobilisées les sondes (13) et défini par rapport au potentiel de l'électrode du capteur capacitif non vibrant..Vi means the potential of the coating surface (12) of the biosensor (10) on which the probes (13) are immobilized and defined with respect to the potential of the non-vibrating capacitive sensor electrode.
La valeur de Ci est obtenue suivant la relation (D) suivante : (D), dans laquelle,The value of Ci is obtained according to the following relation (D): (D), in which,
- C1 signifie la valeur de capacité du capteur capacitif (40), - E1 signifie la valeur de permittivité diélectrique globale de l'espace inter-électrodes,- C 1 means the capacity value of the capacitive sensor (40), - E 1 means the global dielectric permittivity value of the inter-electrode space,
- S signifie la valeur de surface de l'électrode du capteur capacitif (40), etS is the surface value of the electrode of the capacitive sensor (40), and
- e signifie la valeur de distance inter-électrodes entre le capteur capacitif (40) et la surface du support (12).e is the inter-electrode distance value between the capacitive sensor (40) and the surface of the support (12).
Lorsque ledit capteur capacitif (40) est positionné à la même distance du biocapteur (10) au-dessus d'une partie de la surface de revêtement (12) sur laquelle sont immobilisés des complexes d'hybridation entre des sondes et des molécules ligands (14), la charge q2 du capteur capacitif (40) de capacité C2 peut être calculée suivant la relation (E) suivante : q2=C2.V2 (E), dans laquelle :When said capacitive sensor (40) is positioned at the same distance from the biosensor (10) over a portion of the coating surface (12) on which hybridization complexes between probes and ligand molecules are immobilized ( 14), the load q 2 of the capacitive sensor (40) with capacitance C 2 can be calculated according to the following relation (E): q 2 = C 2 .V 2 (E), in which:
- q2 signifie la charge électrique du capteur capacitif (40), - C2 signifie la valeur de capacité du capteur capacitif (40), et- q 2 means the electrical charge of the capacitive sensor (40), - C 2 means the capacitance value of the capacitive sensor (40), and
- V2 signifie le potentiel de la surface de revêtement (12) du biocapteur (10) recouverte de complexes d'hybridation (14), et défini par rapport au potentiel de l'électrode du capteur capacitif non vibrant.- V 2 means the potential of the coating surface (12) of the biosensor (10) covered with hybridization complexes (14), and defined with respect to the potential of the non-vibrating capacitive sensor electrode.
La valeur de C2 est obtenue suivant la relation (F) suivante : C2=ε2.S/e (F), dans laquelle, - C2 signifie la valeur de capacité du capteur capacitif (40),The value of C 2 is obtained according to the following relation (F): C 2 = ε 2 .S / e (F), in which, - C 2 means the capacitance value of the capacitive sensor (40),
- ε2 signifie la valeur de permittivité diélectrique globale de l'espace inter-électrodes,- ε 2 means the global dielectric permittivity value of the inter-electrode space,
- S signifie la valeur de surface de l'électrode du capteur capacitif (40), et [S is the surface value of the electrode of the capacitive sensor (40), and
- e signifie la valeur de distance inter-électrodes . Lorsque que le capteur capacitif (40) passe, en une durée « dt », d'une position « face au revêtement (12) nu » à une position « face au revêtement (12) sur lequel une sonde est immobilisée »(13), ledit capteur (40) est traversé par un courant de court-circuit d'intensité « I », qui peut être calculée suivante la relation (G) suivante :e is the inter-electrode distance value. When the capacitive sensor (40) passes, in a duration "dt", a position "facing the coating (12) naked" to a position "facing the coating (12) on which a probe is immobilized" (13) said sensor (40) is traversed by a current of short circuit of intensity "I", which can be calculated according to the following relation (G):
I=(C1V1- C0V0) /dx*dx/dt (G), dans laquelle : - 1 signifie la valeur d'intensité de courant traversant le capteur capacitif (40),I = (C 1 V 1 - C 0 V 0 ) / dx * dx / dt (G), in which: - 1 signifies the intensity value of current flowing through the capacitive sensor (40),
- C0 signifie la valeur de capacité du capteur capacitif (40) « face au revêtement (12) nu »,- C 0 means the capacity value of the capacitive sensor (40) "facing the coating (12) naked",
- C1 signifie la valeur de capacité du capteur capacitif (40) « face au revêtement (12) sur lequel une sonde est immobilisée » (13), - V0 signifie le potentiel de la surface de revêtement (12) du biocapteur (10), en un point de surface sans sonde immobilisée, défini par rapport au potentiel de l'électrode du capteur capacitif non vibrant.- C 1 means the capacity value of the capacitive sensor (40) "facing the coating (12) on which a probe is immobilized" (13), - V 0 means the potential of the coating surface (12) of the biosensor (10) ), at a surface point without an immobilized probe, defined with respect to the potential of the non-vibrating capacitive sensor electrode.
- V1 signifie le potentiel de la surface de revêtement (12) du biocapteur (10), en un point de surface comprenant au moins une sonde immobilisée, défini par rapport au potentiel de l'électrode du capteur capacitif non vibrant.- V 1 means the potential of the coating surface (12) of the biosensor (10), at a surface point comprising at least one immobilized probe, defined with respect to the potential of the non-vibrating capacitive sensor electrode.
- dx est la valeur de distance du déplacement effectué par l'échantillon sous la sonde pendant le tempd « dt », etdx is the distance value of the displacement made by the sample under the probe during the tempd "dt", and
- dx/dt est la valeur de vitesse de déplacement D- dx / dt is the displacement speed value D
Si la permittivité diélectrique de l'espace inter-électrodes ne varie pas au cours du déplacement, alors on a la relation (H) C1=C0 qui reste constante et I peut être calculé selon la formule (J) suivante :If the dielectric permittivity of the inter-electrode space does not vary during the displacement, then we have the relation (H) C 1 = C 0 which remains constant and I can be calculated according to the following formula (J):
I= C(V1- V0) /dx*dx/dt (J)I = C (V 1 - V 0 ) / dx * dx / dt (J)
La mesure ci-dessus est une mesure de potentiel.The above measure is a measure of potential.
Si V1=V0 reste constante et égale à V au cours du déplacement, mais que la permittivité diélectrique de l'espace inter-électrodes varie, alors on a la relation (K) suivante : l= (Ci . Co) V/dx*clx/clt. (K)If V 1 = V 0 remains constant and equal to V during displacement, but the dielectric permittivity of the inter-electrode space varies, then we have the following relation (K): l = (Ci.co) V / dx * clx / clt. (K)
La mesure ci-dessus est une mesure de permittivité diélectrique. Lorsque que le capteur capacitif (40) passe, en une durée « dt », d'une position « face au revêtement (12) nu » à une position « face au revêtement (12) sur lequel un complexe d'hybridation est immobilisé » (14), les mêmes équations que ci-dessus peuvent être utilisées en remplaçant les paramètres «C1 ; V1 " par les paramètres «C2,V2,», caractéristiques des valeurs de capacité et de potentiel en présence d'un complexe d'hybridation.The above measurement is a measure of dielectric permittivity. When the capacitive sensor (40) passes, in a duration "dt", a position "facing the coating (12) bare" at a position "facing the coating (12) on which a hybridization complex is immobilized" (14), the same equations as above can be used by replacing the parameters "C 1; V 1 "by the parameters" C 2 , V 2 , ", characteristics of the capacitance and potential values in the presence of a hybridization complex.
Si, l'hybridation d'une sonde avec une molécule ligand a provoqué une variation de capacité de la valeur C1 vers la valeur C2, ou provoqué une variation de potentiel de la valeur V1 vers la valeur V2, la comparaison des mesures de courant I obtenues avec et/ou sans complexe d'hybridation permet de détecter l'occurrence de formation d'un complexe d'hybridation entre ladite sonde et au moins une molécule ligand.If the hybridization of a probe with a ligand molecule caused a capacitance variation from the value C 1 to the value C 2 , or caused a potential variation from the value V 1 to the value V 2 , the comparison of current measurements I obtained with and / or without Hybridization complex makes it possible to detect the occurrence of formation of a hybridization complex between said probe and at least one ligand molecule.
Il ressort également de ce qui précède que la valeur d'intensité « I » du courant traversant le capteur capacitif (40) croit proportionnellement avec la vitesse D de déplacement relatif dudit capteur, par rapport à la surface (12).It also follows from the foregoing that the intensity value "I" of the current flowing through the capacitive sensor (40) increases proportionally with the speed D relative displacement of said sensor, relative to the surface (12).
Par ailleurs, la vitesse D de déplacement relatif dudit capteur (40) est préférentiellement contrôlée ou connue à tout moment d'utilisation du système de l'invention, afin d'accroître la précision de discrimination, à une localisation donnée de la surface (1 1 ) du biocapteur (10), entre la présence d'une sonde immobilisée et la présence d'un complexe d'hybridation entre une sonde immobilisée et un ligand. Préférentiellement, la vitesse D de déplacement relatif du capteur capacitif (40) est sensiblement constante, ou mieux constante, durant la totalité du parcours dudit capteur (40) au-dessus de la surface (1 1 ).Moreover, the speed D relative displacement of said sensor (40) is preferably controlled or known at any time of use of the system of the invention, in order to increase the discrimination accuracy, at a given location of the surface (1). 1) of the biosensor (10), between the presence of an immobilized probe and the presence of a hybridization complex between an immobilized probe and a ligand. Preferably, the relative displacement speed D of the capacitive sensor (40) is substantially constant, or better constant, during the entire path of said sensor (40) above the surface (1 1).
Le biocapteur (10) étant circulaire, la vitesse D de déplacement relatif du capteur capacitif (40) au-dessus de la surface (1 1 ) peut être contrôlée de manière continue. Dans les modes d'utilisation du biocapteur (10) dans lesquels seule une partie de la surface (12) sur laquelle sont immobilisées les sondes (13), ledit biocapteur comprend, sur la surface (12), à la fois (i) des localisations avec le revêtement conducteur (12) nu au potentiel V0, (ii) des localisations avec des sondes (13) immobilisées, au potentiel \Λ et (iii) des localisations avec des complexes d'hybridation entre les sondes (13) et des ligands de l'échantillon testé, au potentiel V2.Since the biosensor (10) is circular, the relative displacement speed D of the capacitive sensor (40) above the surface (1 1) can be controlled continuously. In the modes of use of the biosensor (10) in which only a portion of the surface (12) on which the probes (13) are immobilized, said biosensor comprises, on the surface (12), both (i) locations with conductive coating (12) naked at potential V 0 , (ii) locations with probes (13) immobilized, at potential Λ and (iii) localizations with hybridization complexes between probes (13) and ligands of the tested sample, at potential V 2 .
De manière générale, le potentiel V0 est sensiblement constant avec le temps d'utilisation du biocapteur (10) dans le système de détection de l'invention. Le potentiel V0 peut être maintenu sensiblement constant grâce notamment au système de mise à la masse, ou de mise à la terre, dudit biocapteur grâce au moyen électroconducteur (95). Le potentiel \Λ est significativement différent du potentiel V0 et du potentiel V2, du fait que, sur un biocapteur (10), les sondes (13) qui sont immobilisées sont en général de même nature chimique, par exemple des acides nucléiques ou des protéines. Lorsque les sondes (13) consistent en des acides nucléiques, lesdits acides nucléiques possèdent en général des longueurs et des compositions similaires et génèrent donc un potentiel Vi de valeur également similaire. Lorsque les sondes (13) consistent en des protéines ou des peptides, leur taille et leur composition peut être variable, ce qui entraîne un ensemble de valeurs de potentiel Vi distinctes, mais qui sont significativement différentes de V0.In general, the potential V 0 is substantially constant with the time of use of the biosensor (10) in the detection system of the invention. The potential V 0 can be maintained substantially constant thanks in particular to the system of grounding, or grounding, of said biosensor through the electroconductive means (95). The potential Λ is significantly different from the potential V 0 and the potential V 2 , because, on a biosensor (10), the probes (13) which are immobilized are generally of the same chemical nature, for example nucleic acids or proteins. When the probes (13) consist of nucleic acids, said nucleic acids generally have lengths and similar compositions and thus generate a Vi potential of equally similar value. When the probes (13) consist of proteins or peptides, their size and composition may be variable, resulting in a set of distinct Vi potential values, but which are significantly different from V 0 .
Le potentiel V2 est sensiblement constant, ou au moins significativement différent du potentiel V0 et du potentiel Vi, bien que les ligands susceptibles de se fixer sur les sondes (13) puissent être de nature et/ou de taille distinctes. Le potentiel V2 peut donc être variable, selon les ligands hybrides aux sondes, mais peut être dans tous les cas discriminé à la fois du potentiel V0 et d'une valeur de potentiel V1.The potential V 2 is substantially constant, or at least significantly different from the potential V 0 and the potential Vi, although the ligands capable of being fixed on the probes (13) may be of a different nature and / or size. The potential V 2 may therefore be variable, depending on the hybrid ligands to the probes, but may in all cases be discriminated both from the potential V 0 and from a potential value V 1 .
Dans certains modes de réalisation de l'utilisation d'un système de détection selon l'invention, pour un biocapteur (10) donné, la valeur de potentiel V0, et parfois la ou les valeur(s) de potentiel V1, sont connues à l'avance. Dans ces modes de réalisation, le système de détection peut être mis en œuvre en immergeant la totalité de la surface (12) du biocapteur. Dans ces modes de réalisation, si toutes les sondes sont hybridées à des ligands, on mesure exclusivement des valeurs de potentiel V2 aux endroits de localisation des sondes (13), qui peuvent être distinguée des valeurs V0 et \Λ connues. Préférentiellement, le biocapteur (10) est un disque du type des disques optiques utilisés pour la fabrication des CD, des DVD, etc. Dans un tel mode de réalisation préféré, la surface (10) du biocapteur (10) consiste avantageusement en la face non enregistrée, ou non enregistrable, d'un disque optique. Dans ce mode de réalisation préféré, le moyen pour le déplacement du capteur capacitif (40) peut être du même type que celui des platines qui équipent les dispositifs de lecture ou d'enregistrement de disques optiques, à savoir que ledit moyen pour le déplacement comprend au moins la combinaison de :In certain embodiments of the use of a detection system according to the invention, for a given biosensor (10), the potential value V 0 , and sometimes the value (s) of potential V 1 , are known in advance. In these embodiments, the system of detection can be implemented by immersing the entire surface (12) of the biosensor. In these embodiments, if all the probes are hybridized to ligands, V 2 potential values are measured exclusively at the location locations of the probes (13), which can be distinguished from the known values V 0 and \ Λ. Preferably, the biosensor (10) is a disc of the type of optical discs used for the production of CDs, DVDs, etc. In such a preferred embodiment, the surface (10) of the biosensor (10) advantageously consists of the unregistered or non-recordable face of an optical disk. In this preferred embodiment, the means for moving the capacitive sensor (40) can be of the same type as that of the plates that equip the optical disk reading or recording devices, namely that said means for the displacement comprises at least the combination of:
(i) un moteur d'entraînement à vitesse contrôlée permettant le déplacement relatif du capteur (30) par rapport à la surface (12) du biocapteur, à une distance donnée du centre du biocapteur (10), selon le plan principal dudit biocapteur, et (ii) un moyen de déplacement radial du capteur (50) perpendiculairement à l'axe vertical du biocapteur (10), identique à celui de la tête de lecture ou d'enregistrement optique (52).(i) a controlled speed drive motor for relative displacement of the sensor (30) relative to the surface (12) of the biosensor, at a given distance from the center of the biosensor (10), in the main plane of said biosensor, and (ii) radial displacement means of the sensor (50) perpendicular to the vertical axis of the biosensor (10), identical to that of the optical reading or recording head (52).
Un mode particulier de réalisation d'un tel moyen de déplacement est illustré sur les figures 2 et 3.A particular embodiment of such a moving means is illustrated in FIGS. 2 and 3.
Dans certains modes de réalisation du système de l'invention, le revêtement électro- conducteur (12) du biocapteur (10) consiste en un revêtement métallique. Ce revêtement métallique peut comprendre, ou consister en, un métal choisi par exemple parmi le fer, l'acier, l'acier inoxydable, l'or, le cuivre, le nickel, le chrome, l'aluminium, l'argent, le platine, le palladium ou un alliage d'une combinaison d'au moins deux de ces métaux. Dans d'autres aspects, le revêtement électro-conducteur peut comprendre, ou consister en, un oxyde métallique, par exemple un oxyde métallique choisi parmi le dioxyde de silicium, l'oxyde d'étain, l'oxyde d'étain dopé par le fluor, l'oxyde d'indium/étain, l'oxyde d'étain dopé par l'antimoine, l'oxyde de zinc dopé par l'aluminium, l'oxyde d'indium, l'oxyde de zinc, l'oxyde de zinc dopé par l'indium, le stannate de cadmium, l'oxyde de cadmium, l'oxyde de palladium, ainsi que les mélanges d'au moins deux des oxydes métalliques précités. Divers procédés de déposition d'un revêtement électro-conducteur sont connus depuis très longtemps par l'homme du métier.In some embodiments of the system of the invention, the electroconductive coating (12) of the biosensor (10) consists of a metal coating. This metal coating may comprise, or consist of, a metal chosen for example from iron, steel, stainless steel, gold, copper, nickel, chromium, aluminum, silver, platinum, palladium or an alloy of a combination of at least two of these metals. In other aspects, the electroconductive coating may comprise, or consist of, a metal oxide, for example a metal oxide selected from silicon dioxide, tin oxide, tin oxide doped with fluorine, indium / tin oxide, antimony-doped tin oxide, aluminum-doped zinc oxide, indium oxide, zinc oxide, oxide zinc doped with indium, cadmium stannate, cadmium oxide, palladium oxide, as well as mixtures of at least two of the aforementioned metal oxides. Various methods of deposition of an electroconductive coating have been known for a very long time by those skilled in the art.
Dans d'autres modes de réalisation du système selon l'invention, le revêtement électroconducteur (12) du biocapteur (10) consiste en un revêtement polymère dans la masse duquel sont dispersées des particules métalliques. De tels matériaux polymères, ainsi que leurs procédés de fabrication et de déposition sont bien connus de l'homme du métier. Dans encore d'autres modes de réalisation du système selon l'invention, le revêtement électro-conducteur (12) du biocapteur (10) consiste en un matériau polymère, par exemple un matériau polymère possédant des propriétés d'électro-conductivité du type de celles exigées pour des matériaux semi-conducteurs. On peut citer notamment les matériaux polymères électro-conducteurs formés à partir de thiophène, de 3-méthylthiophène, de 1 -benzothiophène, d'aniline ou encore de pyridine, bien connus de l'homme du métier, dont certains sont décrits dans la demande de brevet américain n0 US 2004/0260016. On peut aussi citer les matériaux polymères particulièrement bien adaptés pour l'immobilisation de biomolécules, du type de ceux décrits notamment dans le brevet américain n0 US 6,197,881 et dans la demande de brevet américain n 0 US 2006/0047067. De nombreuses méthodes d'immobilisation de sondes (13) à la surface de supports solides sont connues dans l'état de la technique. On peut citer par exemple les techniques d'immobilisation d'acides nucléiques par adsorption à la surface de revêtement d'un alliage de palladium et d'oxyde de palladium, comme décrit par exemple par Millan et al. (1994, Anal Chem, Vol. 66 : 2943). On peut citer aussi l'immobilisation de dérivés thiolés d'acides nucléique sur un revêtement d'or, comme décrit par Mucic et al. (1996, Chem Commun, page 555). On peut aussi citer les techniques d'immobilisation d'acides nucléiques sur une grande variété de revêtements métalliques, qui sont décrites dans la demande internationale PCT n0 WO 2004/1 13872, pour la mise en oeuvre desquelles on a recours à l'utilisation de dérivés thiolés d'acides nucléiques. La figure 6 illustre un mode de réalisation d'un procédé de fabrication d'un biocapteurIn other embodiments of the system according to the invention, the electroconductive coating (12) of the biosensor (10) consists of a polymer coating in the mass of which are dispersed metal particles. Such polymeric materials, as well as their methods of manufacture and deposition are well known to those skilled in the art. In still other embodiments of the system according to the invention, the electroconductive coating (12) of the biosensor (10) consists of a polymeric material, for example a polymeric material having electroconductive properties of the type of those required for semiconductor materials. Mention may in particular be made of electrically conductive polymer materials formed from thiophene, 3-methylthiophene, 1-benzothiophene, aniline or even pyridine, which are well known to those skilled in the art, some of which are described. in US Patent Application No. 0 US 2004/0260016. We can also mention the polymer materials particularly suitable for the immobilization of biomolecules, such as those described in particular in US Patent No. US 6,197,881 and 0 in US patent application No. US 2006/0047067 0. Numerous methods for immobilizing probes (13) on the surface of solid supports are known in the state of the art. For example, techniques for immobilizing nucleic acids by adsorption on the coating surface of an alloy of palladium and palladium oxide, as described for example by Millan et al. (1994, Anal Chem, Vol 66: 2943). It is also possible to mention the immobilization of thiolated derivatives of nucleic acids on a gold coating, as described by Mucic et al. (1996, Common Chem, page 555). One can also cite the immobilization techniques of nucleic acids on a variety of metallic coatings, which are described in PCT International Application No. WO 2004/1 13872 0, for the implementation of which is resorted to the use thiolated derivatives of nucleic acids. FIG. 6 illustrates an embodiment of a method for manufacturing a biosensor
(10) de l'invention, qui est détaillé par ailleurs dans les exemples.(10) of the invention, which is further detailed in the examples.
Sur la partie supérieure de la figure 6, est représenté un disque optique connu, en l'occurrence un disque optique de type CD-RW, qui est utilisé comme produit de départ dans la fabrication d'un biocapteur (10) selon l'invention. Le disque optique de départ est d'abord soumis à une étape de métallisation de la « première face », qui peut être la face non inscriptible d'un disque optique du type CD-RW, comme représenté dans la partie médiane de la figure 6. Par exemple, dans cette première étape de traitement, la « première face » est soumise à un dépôt d'une couche d'or sur la totalité ou la quasi-totalité de sa surface. Préférentiellement, on procède à une étape ultérieure de dépôt d'une couche d'un second métal, par exemple de chrome, le revêtement par le second métal étant localisé selon au moins une demi-droite radiale au-dessus de la couche du premier métal. La ligne radiale de revêtement par le second métal est utilisée comme marque de référence de l'origine angulaire, pour le calcul des coordonnées polaires de chaque point de la surface du revêtement électroconducteur du biocapteur (10), et plus particulièrement pour l'expression des coordonnées de chacune des régions de la surface de revêtement électroconducteur sur lesquelles est ensuite immobilisée une sonde ou un ensemble de sondes. Puis, dans une troisième étape de traitement, chacune des sondes, ou chacun des ensembles de sondes, est greffé de manière covalente à la surface du revêtement électroconducteur à une localisation déterminée, comme représenté dans la partie inférieure de la figure 6, afin d'obtenir un biocapteur (10) prêt à l'emploi. Ainsi, dans le biocapteur (10) final représenté sur la partie inférieure de la figure 6, chaque sonde de structure connue, ou chaque ensemble de sondes de structure(s) connue(s), est immobilisé en un point de la surface du revêtement électroconducteur qui est connu et déterminé par ses coordonnées polaires par rapport (i) à l'origine p qui est l'axe central du disque et (ii) à l'origine radiale θ qui est la demi-droite radiale du second métal déposé. Dans des modes de réalisation préférés du système de détection de l'invention, les informations relatives (i) aux coordonnées de chaque sonde immobilisée, ou de chaque ensemble de sondes immobilisées, ainsi que, le cas échéant, (ii) les caractéristiques de structure de chaque sonde, par exemple les caractéristiques de séquence nucléotidique ou d'acides aminés, est enregistrée dans un format numérique sur la « seconde face » du biocapteur (10), qui est préférentiellement la surface optique de lecture ou d'écriture d'un disque optique de type connu.On the upper part of FIG. 6, there is shown a known optical disk, in this case an optical disk of the CD-RW type, which is used as a starting product in the manufacture of a biosensor (10) according to the invention . The optical starting disk is first subjected to a metallization step of the "first face", which may be the non-writable face of an optical disk of the CD-RW type, as represented in the middle part of FIG. For example, in this first processing step, the "first face" is subjected to a deposit of a layer of gold on all or almost all of its surface. Preferably, a subsequent step of depositing a layer of a second metal, for example chromium, is carried out, the coating by the second metal being located along at least a radial half-line above the layer of the first metal. . The radial line of coating by the second metal is used as reference mark of the angular origin, for calculating the polar coordinates of each point of the surface of the electroconductive coating of the biosensor (10), and more particularly for the expression of the coordinates of each of the regions of the electroconductive coating surface on which is then immobilized a probe or a set of probes. Then, in a third treatment step, each of the probes, or each set of probes, is grafted covalently to the surface of the electroconductive coating at a determined location, as shown in the lower part of FIG. 6, in order to obtain a biosensor (10) ready for use. Thus, in the final biosensor (10) shown in the lower part of FIG. 6, each probe of known structure, or each set of probes of known structure (s), is immobilized at a point on the surface of the coating. electroconductor which is known and determined by its polar coordinates with respect to (i) the origin p which is the central axis of the disk and (ii) the radial origin θ which is the radial half-line of the second deposited metal. In preferred embodiments of the detection system of the invention, the information relating to (i) the coordinates of each immobilized probe, or each set of immobilized probes, as well as, where appropriate, (ii) the structural characteristics of each probe, for example the nucleotide sequence or amino acid characteristics, is recorded in a digital format on the "second face" of the biosensor (10), which is preferably the optical reading or writing surface of a optical disk of known type.
En référence plus particulièrement à la figure 3, le capteur capacitif sans contact non vibrant (40) est constitué de la face de coupe (41 ) d'une tige métallique (42). Cette tige est sertie dans un cylindre de matière isolante (43). Cette matière isolante et une longueur importante de tige sont protégées par un blindage (44) mis au potentiel de la masse par le blindage de l'élément électro-conducteur (70). Un serrage permet de fixer rigidement le capteur à un support (81 ). Le moyen de mesure (60) de la valeur d'intensité « I » du courant traversant le capteur capacitif (40) peut être de tout type connu. Le moyen de mesure (60) peut être notamment un dispositif amplificateur ampèrométrique analogique (61 ). Le moyen de mesure (60) peut aussi être suivi d'un convertisseur analogique/numérique (62), dans lequel le signal analogique de mesure est converti en un signal numérique qui peut ensuite être transmis à un dispositif de traitement numérique dudit signal (63), préférentiellement à un calculateur numérique. Le signal peut être filtré et traité avant (64) et/ou après (65) la conversion analogique numérique. La rapidité de la rotation du disque permet d'envisager de répéter les mesures et de les accumuler de façon à augmenter la valeur du rapport signal/bruit. Selon ce dernier mode de réalisation, le moyen de mesure (60) et de traitement de la mesure peuvent consister en une carte électronique (66) reliée à un calculateur numérique dans la mémoire duquel sont chargées les instructions de traitement du signal de mesure de l'intensité « I » du courant traversant le capteur capacitif (40).Referring more particularly to Figure 3, the capacitive non-contactless non-vibrating sensor (40) consists of the cutting face (41) of a metal rod (42). This rod is crimped in a cylinder of insulating material (43). This insulating material and a large length of rod are protected by a shield (44) put at the potential of the mass by the shielding of the electrically conductive element (70). Clamping makes it possible to fix the sensor rigidly to a support (81). The means (60) for measuring the intensity value "I" of the current flowing through the capacitive sensor (40) can be of any known type. The measuring means (60) may in particular be an analog ammometric amplifier device (61). The measuring means (60) can also be followed by an analog / digital converter (62), in which the analog measurement signal is converted into a digital signal which can then be transmitted to a digital processing device of said signal (63). ), preferably to a digital calculator. The signal can be filtered and processed before (64) and / or after (65) digital analog conversion. The speed of the rotation of the disk makes it possible to consider repeating the measurements and accumulating them so as to increase the value of the signal-to-noise ratio. According to this last embodiment, the measuring means (60) and the processing of the measurement may consist of an electronic card (66) connected to a digital computer in the memory of which are loaded the instructions for processing the measurement signal. intensity "I" of the current flowing through the capacitive sensor (40).
Le moyen de mesure (60) est relié au capteur capacitif (40) par des moyens électroconducteurs (70), en général des fils électriques blindés ou des pistes électro-conductrices localisées dans un support électriquement isolant, voire un système de transmission électrique ou optique. Dans certains modes de réalisation d'un système de détection selon l'invention, ledit système comprend un dispositif de lecture ou d'enregistrement de disques optiques, par exemple un dispositif du type lecteur ou enregistreur de CDs ou de DVDs, auquel on a associé le capteur capacitif (40). Dans ces modes de réalisation, ledit système est avantageusement relié par un moyen électrique ou optique à un calculateur numérique qui comprend notamment : - des moyens de contrôle et de commande de la vitesse de déplacement relatif D du capteur capacitif (40) par rapport à la surface (12) du disque en rotation,The measuring means (60) is connected to the capacitive sensor (40) by electroconductive means (70), generally shielded electrical wires or electrically conductive tracks located in an electrically insulating support, or even an electrical or optical transmission system. . In certain embodiments of a detection system according to the invention, said system comprises a device for reading or recording optical disks, for example a device of the CD or DVD player or recorder type, which has been associated with the capacitive sensor (40). In these embodiments, said system is advantageously connected by an electrical or optical means to a digital computer which comprises in particular: means for controlling and controlling the relative speed of displacement D of the capacitive sensor (40) with respect to the surface (12) of the rotating disc,
- des moyens de contrôle et de commande de la position du capteur capacitif (40) sur l'axe radial dudit disque,means for controlling and controlling the position of the capacitive sensor (40) on the radial axis of said disk,
- des moyens d'acquisition des données de mesure de l'intensité « I » du courant traversant le capteur capacitif (40) à un instant donné, - facultativement, des moyens de stockage des données de position sur le disque et d'identité des acides nucléiques immobilisés sur le revêtement (12), etmeans for acquiring data for measuring the intensity "I" of the current flowing through the capacitive sensor (40) at a given instant, optionally, means for storing the position data on the disk and the identity of the nucleic acids immobilized on the coating (12), and
- le cas échéant, des instructions logiques chargées dans la mémoire permettant d'informer l'utilisateur de l'identité de la ou des sondes immobilisées ayant formé des complexes d'hybridation avec des ligands.where appropriate, logical instructions loaded into the memory making it possible to inform the user of the identity of the immobilized probe (s) having formed hybridization complexes with ligands.
De manière générale, les sondes sont immobilisées de manière ordonnée à la surface du revêtement (12). En référence aux modes de réalisation du système de détection dans lesquels les sondes consistent en des acides nucléiques, chaque acide nucléique, qui est caractérisé par une séquence nucléotidique unique, est immobilisé à une position connue de la surface de revêtement (12), laquelle position peut-être référencée comme un couple de coordonnées selon (i) un axe p et (ii) un angle θ en coordonnées polaires, la valeur de l'angle téta étant déterminé par rapport à une référence d'origine angulaire (14) identifiable ou détectable sur la surface du biocapteur (10). Ainsi, la collection de sondes immobilisées à la surface du revêtement (12) peut être décrite dans un tableau de données dans lequel une position unique (p,θ) est affectée à un acide nucléique structurellement identifié par sa séquence nucléotidique (SEQ ID N0). Ce tableau pourra être utilisé pour réaliser une image graphique (cartographie) des données et des résultats, sous forme linéaire (variations du potentiel en fonction de l'angle θ pour chaque cercle ou spire du balayage), sous forme d'image 3D vue de dessus ou en perspective des variations de potentiel pour l'ensemble des valeurs de p et θ balayées, ou encore sous forme d'image 3D interprétée, par exemple symbolisant sur une image de la surface (1 1 ) du biocapteur (10) la position de chacune des sondes qui ont formé un complexe d'hybridation..In general, the probes are immobilized in an orderly manner on the surface of the coating (12). With reference to the embodiments of the detection system in which the probes consist of nucleic acids, each nucleic acid, which is characterized by a unique nucleotide sequence, is immobilized at a known position of the coating surface (12), which position may be referenced as a pair of coordinates according to (i) an axis p and (ii) an angle θ in polar coordinates, the value of the teta angle being determined with respect to an identifiable angular origin reference (14) or detectable on the surface of the biosensor (10). Thus, the collection of probes immobilized on the surface of the coating (12) can be described in a data table in which a single position (p, θ) is assigned to a nucleic acid structurally identified by its nucleotide sequence (SEQ ID N 0 ). This table can be used to create a graphical image (cartography) of the data and the results, in linear form (variations of the potential as a function of the angle θ for each circle or turn of the sweep), in the form of a 3D image seen from above or in perspective variations of potential for the set of values of p and θ scanned, or in the form of an interpreted 3D image, for example symbolizing on an image of the surface (1 1) of the biosensor (10) the position of each of the probes that formed a hybridization complex.
Les sondes distinctes immobilisés sur le revêtement (12), ou les ensembles distincts de sondes immobilisées sur le revêtement (12), sont préférentiellement ordonnés selon des pistes concentriques ou bien des pistes en spirales.Separate probes immobilized on the coating (12), or separate sets of probes immobilized on the coating (12), are preferably arranged in concentric tracks or spiral tracks.
Dans la plupart des cas, les coordonnées (p,θ) d'une sonde donnée permettent de distinguer de manière univoque une sonde donnée, ou un ensemble donné de sondes, des autres sondes, ou des autres ensembles de sondes de séquences distinctes et localisés aux positions (p',θ') les plus adjacentes. Dans la pratique, à une position (p,θ) donnée sur la surface du revêtement (12) sont immobilisées une pluralité de sondes de séquence (A) donnée, comme c'est le cas pour les puces à ADN connues.In most cases, the coordinates (p, θ) of a given probe make it possible to unequivocally distinguish a given probe, or a given set of probes, from other probes, or from other sets of probes of distinct and localized sequences. at the most adjacent positions (p ', θ'). In practice, at a given position (p, θ) on the surface of the coating (12) are immobilized a plurality of probes of sequence (A) given, as is the case for known DNA chips.
Le nombre total de molécules à la surface du biocapteur (10) dépend du nombre de molécules sonde de même séquence immobilisées à une position (p,θ). Préférentiellement, les molécules sonde de même séquence localisées à une position (p,θ) donnée sont immobilisées sous la forme d'une collection de grande densité de surface, aussi désignée par le terme « spot ».The total number of molecules on the surface of the biosensor (10) depends on the number of probe molecules of the same sequence immobilized at a position (p, θ). Preferably, the probe molecules of the same sequence located at a given position (p, θ) are immobilized in the form of a collection of high surface density, also referred to as "spot".
En d'autres termes, la capacité d'utilisation du biocapteur (10) est liée à une combinaison de paramètres incluant (i) la surface dudit biocapteur (10) et (ii) la surface occupée par chaque « spot » de sondes immobilisées. On comprend aisément que la capacité d'utilisation d'un biocapteur (10) qui possède les dimensions d'un disque optique des types CD ou DVD couramment commercialisés, qui ont un diamètre d'environ 120 millimètres, est inférieure à la capacité d'utilisation d'un biocapteur (10) ayant un diamètre de 300 millimètres.In other words, the usability of the biosensor (10) is related to a combination of parameters including (i) the surface of said biosensor (10) and (ii) the area occupied by each "spot" of immobilized probes. It is easy to understand that the capacity of using a biosensor (10) which has the dimensions of an optical disk of the CD types or commercially available DVDs, which have a diameter of about 120 millimeters, is less than the usability of a biosensor (10) having a diameter of 300 millimeters.
On précise que, de manière générale, le diamètre du biocapteur (10) peut varier de 20 millimètres à 300 millimètres. De manière générale, le nombre total de spots contenus dans un biocapteur est au moins égal au nombre de sondes distinctes (13).It is specified that, in general, the diameter of the biosensor (10) can vary from 20 millimeters to 300 millimeters. In general, the total number of spots contained in a biosensor is at least equal to the number of distinct probes (13).
Ainsi, le nombre de molécules sondes immobilisées sur la surface du revêtement (12) d'un biocapteur (10) peut être exprimé selon la formule suivante :
Figure imgf000021_0001
(an1.A1 ) + (an2.A2) + ...+ (anX.AX) dans laquelle :Thus, the number of probe molecules immobilized on the surface of the coating (12) of a biosensor (10) can be expressed according to the following formula:
Figure imgf000021_0001
(an1.A1) + (an2.A2) + ... + (anX.AX) in which:
- N,otai est le nombre total de sondes ; et- N, otai is the total number of probes; and
- A1 , A2, ..., AX représentent les acides nucléiques de séquences nucléotidiques uniques A1 , A2, ..., AX ;- A1, A2, ..., AX represent the nucleic acids of single nucleotide sequences A1, A2, ..., AX;
- X est un entier dont la valeur maximale est égal au nombre total d'acides nucléiques de séquences uniques contenus dans le biocapteur (10);X is an integer whose maximum value is equal to the total number of nucleic acids of unique sequences contained in the biosensor (10);
- an1 , an2, ..., anX représentent le nombre de molécules d'acides nucléiques identiques immobilisées sur le revêtement (12) du biocapteur (10) pour chacune des séquences A1 , A2, ..., AX respectivement et représentent, indépendamment l'un de l'autre, un entier compris entre 0 et 100, avantageusement entre 0 et 50, et sont de préférence égaux à 0, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 ;- an1, an2, ..., anX represent the number of identical nucleic acid molecules immobilized on the coating (12) of the biosensor (10) for each of the sequences A1, A2, ..., AX respectively and represent, independently from one another, an integer from 0 to 100, advantageously from 0 to 50, and preferably from 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 or 20;
De manière générale, la liste séquentielle des sondes immobilisées sur une spirale ou sur chaque cercle concentrique (selon la géométrie du dépôt) doit être connue, et le point de référence d'origine angulaire (θ=0) doit être matérialisé par un signal repérable sur le disque (14). Cette liste séquentielle peut être codée sur la face (15) du biocapteur (10) qui n'est pas utilisée pour l'immobilisation des sondes, et qui est désignée « seconde face » du biocapteur, par référence à la « première face » du biocapteur sur laquelle sont immobilisés les sondes.In a general way, the sequential list of the probes immobilized on a spiral or on each concentric circle (according to the geometry of the deposit) must be known, and the reference point of angular origin (θ = 0) must be materialized by a detectable signal on the disk (14). This sequential list may be coded on the face (15) of the biosensor (10) which is not used for the immobilization of the probes, and which is designated "second face" of the biosensor, by reference to the "first face" of the biosensor on which the probes are immobilized.
Selon un mode préféré d'utilisation du système de détection de l'invention dans un procédé de détection de complexes d'hybridation entres des sondes et des ligands, on réalise une première phase de balayage du biocapteur (10) permettant d'atteindre toutes les valeurs de (p,θ), préalablement à une étape de mise en contact du biocapteur (10) avec l'échantillon à tester. Cette première étape de balayage de la première face du biocapteur (10) permet de mesurer les variations de « I » et de corréler ces variations à la liste séquentielle des spots, et ainsi attribuer à chaque spot (« i ») un couple de coordonnées (pi,θi). Ces informations de variation de la valeur de « I » associées aux coordonnées des spots sur la surface du biocapteur (10) peuvent être enregistrées sur la face inscriptible ou seconde face du biocapteur (10).According to a preferred mode of use of the detection system of the invention in a method for detecting hybridization complexes between probes and ligands, a first scanning phase of the biosensor (10) is carried out making it possible to reach all the values of (p, θ), prior to a step of contacting the biosensor (10) with the sample to be tested. This first scanning step of the first face of the biosensor (10) makes it possible to measure the variations of "I" and to correlate these variations with the sequential list of spots, and thus to assign to each spot ("i") a pair of coordinates (pi, θi). This variation information of the value of "I" associated with the coordinates of the spots on the surface of the biosensor (10) can be recorded on the writable side or second face of the biosensor (10).
En particulier, dans certains modes de réalisation du système de détection selon l'invention, tout autre type d'information utile peut être codé sur la seconde face du disque. A titre illustratif, la seconde face (15) du biocapteur (10) peut contenir des données d'information incorporées dans la structure du disque elle-même, par exemple par pressage, gravure, ablation par irradiation laser, comme cela est connu dans l'état de la technique pour l'enregistrement de données sur un support de disque optique. Ces données d'information incorporées dans la structure de la seconde face du biocapteur (10) peuvent être détectées ou lues par des optiques laser, en particulier une diode laser spécialement dédiée (52), localisée dans le système positionné en face du revêtement de la seconde face (15) du biocapteur (10).In particular, in some embodiments of the detection system according to the invention, any other type of useful information may be encoded on the second face of the disk. As an illustration, the second face (15) of the biosensor (10) may contain information data incorporated into the structure of the disk itself, for example by pressing, etching, ablation by laser irradiation, as known in the state of the art for recording data on an optical disk medium. These information data incorporated into the structure of the second face of the biosensor (10) can be detected or read by laser optics, in particular a specially dedicated laser diode (52), located in the system positioned opposite the coating of the second face (15) of the biosensor (10).
Dans les modes de réalisation particuliers décrits ci-dessus, le revêtement (15) de la seconde face du biocapteur (10) consiste en un revêtement classique pour un disque optique, bien connu dans l'art antérieur.In the particular embodiments described above, the coating (15) of the second face of the biosensor (10) consists of a conventional coating for an optical disk, well known in the art.
Dans ces modes de réalisation du système de détection selon l'invention, on peut utiliser, pour réaliser un biocapteur (10), un disque dont la seconde face est recouverte d'un revêtement classique de disque optique, du type des disques optiques CD-DA, CD-ROM, CD- R, CD-RW, DVD-ROM, DVD-R, DVD+/-RW, DVD-RAM et autres types apparentés, connus dans l'état de la technique. Dans ces modes de réalisation, le système de détection de l'invention comprend aussi un dispositif de lecture ou d'enregistrement de données sur un disque optique, d'un type connu. Dans ces modes de réalisation, le système de l'invention comprend aussi préférentiellement des moyens de contrôle et de commande dudit dispositif de lecture ou d'enregistrement optique.In these embodiments of the detection system according to the invention, it is possible to use, for producing a biosensor (10), a disk whose second face is covered with a conventional optical disk coating, of the type of CD-optical disks. DA, CD-ROM, CD-R, CD-RW, DVD-ROM, DVD-R, DVD +/- RW, DVD-RAM and other related types known in the state of the art. In these embodiments, the detection system of the invention also comprises a device for reading or recording data on an optical disk of a known type. In these embodiments, the system of the invention also preferably comprises means for controlling and controlling said reading or optical recording device.
La présente invention est également relative à un biocapteur du type décrit ci-dessus, qui consiste en un biocapteur plan comprenant une première et une seconde face, et dans lequel : a) la première face est revêtue d'une couche de matériau électro-conducteur sur laquelle sont immobilisés une ou plusieurs sondes, et b) la seconde face comprend un revêtement pour la lecture ou pour l'enregistrement optique de données. Ledit biocapteur peut être utilisé avec une grande variété de systèmes de détection de complexes d'hybridation de sondes avec des ligands spécifiques.The present invention also relates to a biosensor of the type described above, which consists of a plane biosensor comprising a first and a second face, and wherein: a) the first face is coated with a layer of electrically conductive material on which one or more probes are immobilized, and b) the second face comprises a coating for reading or for optical data recording. The biosensor can be used with a wide variety of probe hybridization detection systems with specific ligands.
Dans certains modes de réalisation, on utilise ledit biocapteur avec le système de détection comprenant un capteur capacitif sans contact non vibrant qui est décrit en détail dans la présente description. Dans d'autres modes de réalisation, ledit biocapteur peut être utilisé avec un système de détection ayant les mêmes caractéristiques que le système de détection qui est décrit en détail dans la présente description, mais dans lequel le capteur capacitif sans contact non vibrant est remplacé par un autre type de capteur connu de l'homme du métier.In some embodiments, said biosensor is used with the sensing system comprising a non-vibrating non-contact capacitive sensor which is described in detail in the present description. In other embodiments, said biosensor may be used with a detection system having the same characteristics as the detection system which is described in detail in the present description, but in which the non-vibrating non-contact capacitive sensor is replaced by another type of sensor known to those skilled in the art.
Ainsi, le capteur peut être de tout type connu, y compris un capteur un capteur optique, un capteur capacitif vibrant, un capteur capacitif non vibrant, etc.Thus, the sensor can be of any known type, including a sensor an optical sensor, a vibrating capacitive sensor, a non-vibrating capacitive sensor, etc.
L'utilisation d'un capteur capacitif vibrant permet l'obtention d'une mesure électrique en chaque point du biocapteur (10).The use of a vibrating capacitive sensor makes it possible to obtain an electrical measurement at each point of the biosensor (10).
L'utilisation d'un capteur capacitif non vibrant permet la mesure des variations du signal électrique d'un point à l'autre du biocapteur en rotation. On utilise préférentiellement un capteur de type capacitif non vibrant car il permet une acquisition du signal beaucoup plus rapide qu'avec les capteurs vibrants.The use of a non-vibrating capacitive sensor makes it possible to measure the variations of the electrical signal from one point to the other of the rotating biosensor. A non-vibrating capacitive type sensor is preferentially used because it allows a much faster acquisition of the signal than with the vibrating sensors.
Les capteurs capacitifs non vibrants englobent les capteurs capacitifs constitués d'une électrode métallique en forme de disque plan, (ou de toute autre forme : sphère, cône...) de diamètre ajustable selon (i) la valeur de surface occupée sur la surface (12) par une sonde immobilisées ou un ensemble de sondes immobilisées ou « spot » et (ii) la distance minimale sur la surface (1 1 ) entre deux sondes immobilisées, ou deux ensembles de sondes immobilisées, étant entendu que ladite distance minimale peut varier en général de quelques millimètres (mm) à quelques centaines de micromètres (μm). La distance minimale sur la surface (12) entre deux sondes immobilisées, ou deux ensembles de sondes immobilisées, peut aussi être à l'échelle nanométrique. Dans ce cas les capteurs connus mis en œuvre peuvent être ceux des microscopes à Forces Atomiques ou à forces électrostatiques utilisables en mode non vibrant.Non-vibrating capacitive sensors include capacitive sensors consisting of a flat disk-shaped metal electrode (or any other shape: sphere, cone, etc.) of adjustable diameter according to (i) the surface area occupied on the surface (12) by an immobilized probe or a set of immobilized probes or "spot" and (ii) the minimum distance on the surface (1 1) between two immobilized probes, or two sets of immobilized probes, it being understood that said minimum distance can vary in general from a few millimeters (mm) to a few hundred micrometers (μm). The minimum distance on the surface (12) between two immobilized probes, or two sets of immobilized probes, can also be at the nanoscale. In this case the known sensors used may be those of atomic force microscopes or electrostatic forces usable in non-vibrating mode.
Dans certains modes de réalisation préférés, ledit biocapteur se présente sous la forme d'un disque plan. Préférentiellement, les dimensions dudit disque plan sont compatibles avec la lecture ou l'enregistrement de données par des systèmes et des formats connus de lecture ou d'enregistrement de disques optiques du type CD ou DVD.In some preferred embodiments, said biosensor is in the form of a planar disk. Preferably, the dimensions of said flat disk are compatible with the reading or recording of data by known systems and formats for reading or recording optical disks of the CD or DVD type.
La présente invention a également pour objet un procédé pour la détection de complexes d'hybridation entre des sondes et des molécules ligands s'hybridant spécifiquement avec lesdites sondes, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a) mettre en contact un biocapteur (10) du type spécifié dans la présente description avec un échantillon à tester, pendant une durée suffisante à la formation de complexes d'hybridation entre les sondes immobilisées sur ledit biocapteur et des molécules ligands susceptibles d'être contenues dans ledit échantillon à tester, b) placer le biocapteur dans un système de détection selon l'invention, c) détecter les complexes d'hybridation éventuellement formés sur ledit biocapteur.The present invention also relates to a method for the detection of hybridization complexes between probes and ligand molecules hybridizing specifically with said probes, said method comprising the following steps: a) contacting a biosensor (10) of the type specified in the present description with a test sample, for a time sufficient for the formation of hybridization complexes between the probes immobilized on said biosensor and ligand molecules likely to be contained in said sample to be tested, b) place the biosensor in a detection system according to the invention, c) detecting the hybridization complexes possibly formed on said biosensor.
Sur le principe, un biocapteur selon l'invention est utilisé à l'étape a) dans des conditions proches ou identiques à celles qui sont mises en oeuvre pour l'utilisation d'une puce à ADN classique. Notamment, les conditions de mise en contact du biocapteur avec l'échantillon à tester sont déterminées avec les mêmes paramètres qu'avec un biocapteur à ADN conventionnel, y compris les paramètres de durée, de température d'hybridation, de force ionique et de concentration saline de la solution d'hybridation, etc. Egalement, à la fin de l'étape a), le biocapteur est soumis à une ou plusieurs étapes de lavage, dans des conditions aisément déterminées par l'homme du métier, afin d'éliminer les molécules contenues dans l'échantillon à tester qui n'ont pas formé de complexes d'hybridation avec les acides nucléiques immobilisés sur le biocapteur de l'invention.In principle, a biosensor according to the invention is used in step a) under conditions similar to or identical to those used for the use of a conventional DNA chip. In particular, the conditions for bringing the biosensor into contact with the sample to be tested are determined with the same parameters as with a conventional DNA biosensor, including the parameters of duration, hybridization temperature, ionic strength and concentration. saline hybridization solution, etc. Also, at the end of step a), the biosensor is subjected to one or more washing steps, under conditions easily determined by those skilled in the art, in order to eliminate the molecules contained in the test sample which did not form hybridization complexes with the nucleic acids immobilized on the biosensor of the invention.
A l'étape c), le biocapteur est placé sur une platine de « lecture » adaptée, c'est-à-dire le système de détection décrit précédemment, de manière à ce que la totalité de la surface dudit biocapteur sur laquelle sont immobilisés les acides nucléiques puisse être balayée par le capteur capacitif (40) du système selon l'invention. Un mode de réalisation particulier d'une telle platine de lecture est illustrée sur la figure 2.In step c), the biosensor is placed on a suitable "reading" plate, that is to say the detection system described above, so that the entire surface of said biosensor on which are immobilized nucleic acids can be swept by the capacitive sensor (40) of the system according to the invention. A particular embodiment of such a reading plate is illustrated in FIG. 2.
A l'étape c), les moyens de contrôle et de commande de déplacement du capteur capacitif (40) permettent la réalisation d'une mesure de l'intensité « I » de courant traversant ledit capteur capacitif (40) sur une partie ou sur la totalité de la surface du revêtement (12) sur lequel sont immobilisés les acides nucléiques.In step c), the means for controlling and controlling the displacement of the capacitive sensor (40) make it possible to measure the intensity "I" of current flowing through said capacitive sensor (40) over part or the entire surface of the coating (12) on which the nucleic acids are immobilized.
Dans les modes de réalisation préférés du procédé, du type de celui illustré sur la figureIn the preferred embodiments of the method, of the type illustrated in FIG.
5, le signal analogique de mesure de l'intensité « I » est converti en données numériques qui sont ensuite traitées par l'Unité Centrale de Traitement (CPU pour « Central Processing Unit ») d'un calculateur numérique, selon une suite d'instructions logiques stockées dans la mémoire dudit calculateur numérique.5, the analog intensity measurement signal "I" is converted into digital data which is then processed by the Central Processing Unit (CPU) of a digital computer, according to a sequence of logical instructions stored in the memory of said digital computer.
Dans certains modes de réalisation du procédé, à chaque donnée de position (p,θ) du capteur capacitif (40) est associée la valeur correspondante d'intensité « I » mesurée à cette position. Des pics de valeur d'intensité « I » sont mesurés aux positions (p,θ) pour lesquels des complexes d'hybridation se sont formés.In some embodiments of the method, each position data (p, θ) of the capacitive sensor (40) is associated with the corresponding intensity value "I" measured at this position. Peaks of intensity value "I" are measured at the positions (p, θ) for which hybridization complexes have formed.
Comme déjà mentionné précédemment dans la présente description, les données d'un tableau matriciel de données dans lequel une position unique (p,θ) est affectée à un acide nucléique structurellement identifié par sa séquence nucléotidique est préférentiellement stockée au préalable dans un moyen de stockage de données du calculateur numérique. Le cas échéant, lorsqu'un biocapteur (10) à deux faces fonctionnelles est utilisé pour la mise en oeuvre du procédé, le tableau matriciel de données peut être enregistré au préalable sur la seconde face du biocapteur qui possède un revêtement de lecture ou d'enregistrement optique.As already mentioned previously in the present description, the data of a data matrix table in which a single position (p, θ) is assigned to a nucleic acid structurally identified by its nucleotide sequence is preferentially stored beforehand in storage means. of the numerical calculator. If appropriate, when a biosensor (10) with two functional faces is used for the implementation of the method, the matrix data table can be registered beforehand on the second face of the biosensor which has a read or write coating. optical recording.
Après l'opération de « lecture » du biocapteur, ou simultanément à l'opération de « lecture » du biocapteur, on génère un nouveau tableau matriciel de données comprenant trois colonnes et une pluralité de lignes et dont chaque ligne comprend respectivement :After the "reading" operation of the biosensor, or simultaneously with the "reading" operation of the biosensor, generating a new data matrix table comprising three columns and a plurality of lines and each line of which comprises respectively:
- une première colonne contenant les coordonnées de position (p,θ) d'un acide nucléique donné,a first column containing the position coordinates (p, θ) of a given nucleic acid,
- la seconde colonne comprend la valeur d'intensité « I » du courant traversant le capteur capacitif (40) à ladite position (p,θ) ,the second column comprises the intensity value "I" of the current flowing through the capacitive sensor (40) at said position (p, θ),
- la troisième colonne comprend l'information de séquence nucléotidique dudit acide nucléique.the third column comprises the nucleotide sequence information of said nucleic acid.
Dans certains modes de réalisation dudit tableau matriciel de données ci-dessus, ledit tableau comprend exclusivement les données relatives aux positions (p,θ) du biocapteur pour lesquelles la valeur mesurée d'intensité « I » est supérieure à une valeur seuil minimale.In some embodiments of said above data matrix table, said table includes only the data relating to the biosensor positions (p, θ) for which the measured intensity value "I" is greater than a minimum threshold value.
La valeur seuil minimale de l'intensité « I » est la valeur minimale attendue d'intensité générée par la présence, à ladite position (p,θ) d'un complexe d'hybridation avec l'acide nucléique immobilisé correspondant. Dans ces modes de réalisation du procédé, le calculateur numérique peut fournir directement à l'utilisateur l'identité de chacun des acides nucléiques ayant formé un complexe d'hybridation avec une molécule ligand contenue dans l'échantillon testé.The minimum threshold value of the intensity "I" is the expected minimum intensity value generated by the presence, at said position (p, θ) of a hybridization complex with the corresponding immobilized nucleic acid. In these embodiments of the method, the digital computer can directly provide the user with the identity of each of the nucleic acids having formed a hybridization complex with a ligand molecule contained in the test sample.
Dans certains modes de réalisation, la valeur de potentiel V0 du biocapteur (10), ou la valeur d'intensité I0 correspondante, est stockée dans la mémoire du calculateur numérique, le cas échéant après lecture de l'information de la valeur V0 préalablement codée sur la seconde face dudit biocapteur qui possède un revêtement de lecture ou d'enregistrement optique.In some embodiments, the potential value V 0 of the biosensor (10), or the corresponding intensity value I 0 , is stored in the memory of the digital computer, if necessary after reading the information of the value V 0 previously coded on the second side of said biosensor which has a reading coating or optical recording.
Dans certains modes de réalisation, la valeur de potentiel \Λ du biocapteur (10), ou la valeur d'intensité I1 correspondante, est stockée dans la mémoire du calculateur numérique, le cas échéant après lecture de l'information de la valeur V1 préalablement codée sur la seconde face dudit biocapteur qui possède un revêtement de lecture ou d'enregistrement optique.In some embodiments, the potential value \ Λ of the biosensor (10), or the corresponding intensity value I 1 , is stored in the memory of the digital computer, if necessary after reading the information of the value V 1 previously coded on the second side of said biosensor which has a reading coating or optical recording.
Dans certains modes de réalisation du procédé dans lesquels un biocapteur à deux faces fonctionnelles tel que précédemment décrit est mis en œuvre, les données générées à l'étape c) du procédé, y compris le cas échéant les données contenues dans le tableau matriciel décrit ci-dessus, peuvent être enregistrées sur la seconde face du biocapteur comprenant un revêtement pour la lecture et l'enregistrement optique.In some embodiments of the method in which a biosensor with two functional faces as previously described is implemented, the data generated in step c) of the method, including where appropriate the data contained in the matrix table described herein. above, can be recorded on the second side of the biosensor comprising a coating for reading and optical recording.
Le procédé de détection selon l'invention peut être utilisé dans la totalité des domaines d'application des puces à ADN conventionnelles.The detection method according to the invention can be used in all fields of application of conventional DNA chips.
La présente invention est en outre illustrée, sans pour autant y être limitée, aux exemples suivants.The present invention is further illustrated, but not limited to, the following examples.
EXEMPLESEXAMPLES
Exemple 1 : Procédé de fabrication d'un biocapteur (10) à deux faces fonctionnelles Les étapes principales du procédé de l'exemple 1 sont illustrées sur la figure 6.EXAMPLE 1 Method for Manufacturing a Biosensor (10) with Two Functional Faces The main steps of the method of Example 1 are illustrated in FIG.
Le disque CD-RW (10) propre est introduit dans une enceinte d'évaporation sous vide. Un dépôt d'or (12) est réalisé par évaporation thermique sur la face non inscriptible (1 1 ) du disque. Il s'étend du centre du disque jusques à la périphérie ou à son voisinage.The clean CD-RW disc (10) is introduced into a vacuum evaporation chamber. A gold deposit (12) is made by thermal evaporation on the non-writable face (1 1) of the disk. It extends from the center of the disk to the periphery or its neighborhood.
Un second dépôt est réalisé par évaporation thermique d'un autre métal, par exemple du Chrome sous forme d'un ou de plusieurs rayons voisins (14). Il servira à déterminer la position d'origine de mesure des angles de rotation. Pour cela, un cache est utilisé. L'ensemble du disque est alors rincé à l'eau pure.A second deposit is made by thermal evaporation of another metal, for example chromium in the form of one or more neighboring rays (14). It will be used to determine the original position of measurement of the angles of rotation. For this, a cache is used. The entire disc is then rinsed with pure water.
Les sondes (13) sont déposées à la main ou par un robot sous forme de spots selon un arrangement prédéterminé (information 1 ). Ces sondes ont au préalable été thiolées afin de se fixer sur le support doré.The probes (13) are deposited by hand or by a robot in the form of spots in a predetermined arrangement (information 1). These probes were previously thiolated in order to attach to the golden support.
Après séchage, le dépôt est suivi d'une phase de rinçage.After drying, the deposit is followed by a rinsing phase.
Une première détection des variations de signal électrique est effectuée (information 2).A first detection of the variations of the electrical signal is carried out (information 2).
Les informations 1 et 2 sont gravées sur la face inscriptible du disque (15). Variante de réalisation du biocapteur (10) :The information 1 and 2 are engraved on the writable side of the disc (15). Embodiment variant of the biosensor (10):
En raison du coût de la dorure, la couche métallique couvrant l'ensemble de la face non inscriptible du disque peut être réalisée en un autre métal, par exemple avec du chrome. Des plots et les rayons de repérage de la position angulaire 0 peuvent être réalisés en or.Due to the cost of gilding, the metal layer covering the entire non-writable face of the disc can be made of another metal, for example with chromium. Plots and the locating radii of the angular position 0 can be made of gold.
Les spots de sondes thiolées seront alors déposés sur ces plots d'or.The thiolated probe spots will then be deposited on these gold pads.
Exemple 2 : Description détaillée d'un mode de réalisation du procédé de détection selon l'inventionExample 2: Detailed Description of an Embodiment of the Detection Method According to the Invention
Le biocapteur (10) préparé comme décrit dans l'exemple 1 est immergé pendant 4 heures dans une solution susceptible de contenir des molécules d'un ou plusieurs ligands d'intérêt, à température du laboratoire.The biosensor (10) prepared as described in Example 1 is immersed for 4 hours in a solution that may contain molecules of one or more ligands of interest, at laboratory temperature.
On réalise un rinçage, afin d'éliminer de la surface du biocapteur (10) les molécules qui n'ont pas formé de complexes d'hybridation avec les sondes immobilisées.Rinsing is performed to remove from the surface of the biosensor (10) molecules that have not formed hybridization complexes with the immobilized probes.
Après séchage, on réalise une étape de détection des variations de signal électrique (information 3) sur la totalité de la surface (1 1 ) du biocapteur (10) sur laquelle les sondes sont immobilisées. Les informations sont enregistrées sur la seconde face du biocapteur (10).After drying, a step of detecting the variations of the electrical signal (information 3) is carried out on the entire surface (1 1) of the biosensor (10) on which the probes are immobilized. The information is recorded on the second side of the biosensor (10).
Les informations 1 , 2 et 3 sont comparées afin de corréler les données. Ni le trempage ni le rinçage n'affectent la face inscriptible du disque.Information 1, 2 and 3 are compared to correlate the data. Neither soaking nor rinsing affects the writable side of the disc.
Variante de réalisation du biocapteur (10) et du procédé de détection : Afin de se prémunir contre une variation accidentelle du potentiel de l'électrode de mesure électrique, on réalise le dépôt des sondes sur une moitié (16) de la face non inscriptible du disque et on le répète symétriquement sur l'autre demi-face (17).Modification variant of the biosensor (10) and of the detection method: In order to protect against an accidental variation of the potential of the electrical measurement electrode, the probes are deposited on one half (16) of the non-writable face of the disc and repeat it symmetrically on the other half-face (17).
L'hybridation sera alors effectuée par trempage de la seule demi-face(16). Elle sera suivie d'un rinçage complet du disque, suivi d'un séchage.The hybridization will then be carried out by dipping the single half-face (16). It will be followed by a complete rinsing of the disc, followed by drying.
Au cours de la lecture du signal électrique l'appareil fera ainsi l'acquisition dans les mêmes conditions expérimentales du signal lu sur les spots éventuellement hybrides de la demi- face (16) et sur les spots certainement non hybrides de la demi-face (17).During the reading of the electrical signal, the apparatus will thus acquire under the same experimental conditions the signal read on the possibly hybrid spots of the half-face (16) and on the definitely unhybrid spots of the half-face ( 17).
Exemple 3 : Description détaillée d'un mode de réalisation d'un système de détection selon l'inventionExample 3: Detailed Description of an Embodiment of a Detection System According to the Invention
Le mode de réalisation particulier d'un système de détection selon l'invention qui est détaillé à l'exemple 3 est illustré notamment sur les figures 2 à 5.The particular embodiment of a detection system according to the invention which is detailed in Example 3 is illustrated in particular in Figures 2 to 5.
La réalisation d'un système de détection peut être effectuée à partir d'un lecteur de CD / DVD.The realization of a detection system can be carried out from a CD / DVD player.
La platine (21 ) consiste en une platine de lecteur de CD d'ordinateur, entraînée par un moteur (31 ), ladite platine étant déjà équipée à l'origine pour réaliser le centrage et le maintien mécanique du disque (32). Le chariot (51 ) portant la diode laser de lecture ou d'écriture (52) est entraîné par une vis sans fin (53) mise en mouvement par un moteur (54).The plate (21) consists of a computer CD player plate, driven by a motor (31), said plate being originally equipped to perform the centering and mechanical retention of the disk (32). The carriage (51) carrying the reading or writing laser diode (52) is driven by an endless screw (53) set in motion by a motor (54).
Une première adaptation consiste à faire porter par le chariot la sonde de mesure électrique (40) qui effectuera les mesures sur la face non inscriptible (12). Cela peut être réalisé en utilisant un bras de levier (81 ) solidaire du chariot (51 ). Pour permettre l'introduction du disque (10) sur le dispositif de centrage (32), ce bras de levier doit posséder une articulationA first adaptation is to carry by the carriage the electrical measuring probe (40) which will perform the measurements on the non-writable face (12). This can be achieved by using a lever arm (81) integral with the carriage (51). To allow the insertion of the disc (10) on the centering device (32), this lever arm must have an articulation
(82). Afin que la sonde portée par le bras de levier se repositionne toujours à une bonne distance de la face du disque (12), le bras de levier est rappelé par la traction d'un ressort (83) qui le met en contact avec une butée mécanique ajustable par un système de vis-écrou (84). La seconde adaptation vient du fait que le potentiel électrique de la face non inscriptible du disque (12) doit être fixé, par exemple à OV. Afin de prendre un contact électrique sur cette face du disque, le centreur de la platine (32) est recouvert d'un capuchon métallique (91 ) qui est mis en contact avec le dépôt métallique effectué sur le disque (12). Un contact graphité glissant(82). So that the probe carried by the lever arm is always repositioned at a good distance from the face of the disc (12), the lever arm is recalled by the pulling of a spring (83) which puts it in contact with a stop mechanical adjustable by a screw-nut system (84). The second adaptation comes from the fact that the electric potential of the non-writable face of the disc (12) must be fixed, for example to OV. In order to make electrical contact on this face of the disc, the platen centering device (32) is covered with a metal cap (91) which is brought into contact with the metal deposit made on the disc (12). A sliding graphite contact
(92) est centré sur ce capuchon et légèrement pressé par un ressort (93). Une potence (94) solidaire du bâtis (21 ) du lecteur de CD maintient mécaniquement ce dispositif. Le contact glissant est maintenu à un potentiel fixe (ici OV) grâce à une liaison filaire (95).(92) is centered on this cap and slightly squeezed by a spring (93). A bracket (94) integral with the frame (21) of the CD player mechanically maintains this device. The sliding contact is maintained at a fixed potential (here OV) through a wire link (95).
La troisième adaptation vient du rayonnement électromagnétique des moteurs, qui doit être écranté par un blindage (22). The third adaptation comes from the electromagnetic radiation of the motors, which must be screened by a shield (22).

Claims

REVENDICATIONS
1 . Système pour la détection de complexes d'hybridation entre (i) des sondes immobilisées sur un support et (ii) des molécules ligands hybridant spécifiquement avec lesdites sondes, ledit système comprenant : a) un biocapteur (10) pour la réalisation de complexes d'hybridation entre (i) des sondes et (ii) des ligands hybridant spécifiquement avec lesdites sondes, ledit biocapteur (10) étant constitué d'un matériau support circulaire plan (1 1 ) comprenant une première et une seconde face et dont la première face comprend une surface de revêtement électro- conducteur (12) sur laquelle sont immobilisées une ou plusieurs sondes (13), ledit biocapteur comprenant, sur ladite première face, une marque électriquement détectable repérant une position fixée comme référence d'origine angulaire, b) un moyen (30) de mise en rotation du biocapteur (10) à une vitesse contrôlée, c) un capteur capacitif sans contact non vibrant (40), d) un moyen (50) pour le déplacement dudit capteur capacitif sans contact non vibrant (40) suivant l'axe radial du biocapteur (10), et e) un moyen de mesure (60) de la valeur d'intensité « I » du courant traversant le capteur capacitif sans contact non vibrant (40), ledit moyen de mesure (60) étant relié audit capteur capacitif (40) par des moyens électroconducteurs (70), et f) un moyen permettant de maintenir sensiblement constante la distance séparant le capteur (40) de la surface du revêtement électroconducteur (12).1. A system for the detection of hybridization complexes between (i) supported immobilized probes and (ii) ligand molecules specifically hybridizing with said probes, said system comprising: a) a biosensor (10) for producing complexes of hybridization between (i) probes and (ii) ligands specifically hybridizing with said probes, said biosensor (10) consisting of a planar circular support material (1 1) comprising a first and a second face and whose first face comprises an electroconductive coating surface (12) on which one or more probes (13) are immobilized, said biosensor comprising, on said first face, an electrically detectable mark identifying a fixed position as a reference of angular origin, b) a means (30) rotating the biosensor (10) at a controlled rate, c) a non-vibrating non-contacting capacitive sensor (40), d) means (50) for moving said sensor non-vibrating non-contacting capacitive capacitor (40) along the radial axis of the biosensor (10), and e) measuring means (60) of the intensity value "I" of the current flowing through the capacitive sensor without non-vibrating contact ( 40), said measuring means (60) being connected to said capacitive sensor (40) by electrically conductive means (70), and f) means for maintaining substantially constant the distance separating the sensor (40) from the surface of the electroconductive coating (12).
2. Système selon la revendication 1 , caractérisé en ce qu'il comprend de plus g) un moyen électroconducteur (95) permettant une mise à la terre de la surface du biocapteur (10).2. System according to claim 1, characterized in that it further comprises g) an electroconductive means (95) for grounding the surface of the biosensor (10).
3. Système selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le biocapteur (10) consiste en un disque plan.3. System according to one of claims 1 and 2, characterized in that the biosensor (10) consists of a flat disc.
4. Système selon la revendication 3, caractérisé en ce que le moyen de déplacement (50) comprend au moins la combinaison de :4. System according to claim 3, characterized in that the moving means (50) comprises at least the combination of:
(i) un moteur d'entraînement à vitesse contrôlée permettant le déplacement relatif du capteur (40) par rapport à la surface (12), à une distance donnée du capteur (40) par rapport au centre du biocapteur (10), selon le plan principal dudit biocapteur, et(i) a controlled speed drive motor for relative movement of the sensor (40) relative to the surface (12), at a given distance from the sensor (40) relative to the center of the biosensor (10), according to the main plane of said biosensor, and
(ii) un moyen de déplacement radial du capteur (50) perpendiculairement à l'axe vertical du biocapteur (10),(ii) radial displacement means of the sensor (50) perpendicular to the vertical axis of the biosensor (10),
5. Système de détection selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le revêtement électroconducteur (12) du biocapteur (10) consiste en un revêtement métallique.5. Detection system according to any one of claims 1 to 4, characterized in that the electroconductive coating (12) of the biosensor (10) consists of a metal coating.
6. Système de détection selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le revêtement électroconducteur (12) du biocapteur (10) consiste en un revêtement polymère dans la masse duquel sont dispersées des particules métalliques. 6. Detection system according to any one of claims 1 to 4, characterized in that the electroconductive coating (12) of the biosensor (10) consists of a polymer coating in the mass of which are dispersed metal particles.
7. Système de détection selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le revêtement électro-conducteur (12) du biocapteur (10) consiste en un matériau polymère électro-conducteur.7. Detection system according to any one of claims 1 to 4, characterized in that the electroconductive coating (12) of the biosensor (10) consists of an electrically conductive polymer material.
8. Système de détection selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il comprend de plus un dispositif de lecture ou d'enregistrement de disques optiques.8. Detection system according to any one of claims 1 to 7, characterized in that it further comprises a device for reading or recording optical discs.
9. Biocapteur plan comprenant une première et une seconde face, et dans lequel : a) la première face est revêtue d'une couche de matériau électroconducteur sur laquelle sont immobilisés un ou plusieurs acides nucléiques, et b) la seconde face comprend un revêtement pour la lecture ou pour l'enregistrement optique de données.9. A planar biosensor comprising a first and a second face, and wherein: a) the first face is coated with a layer of electroconductive material on which one or more nucleic acids are immobilized, and b) the second face comprises a coating for reading or for optical data recording.
10. Procédé pour la détection de complexes d'hybridation entre des acides nucléiques et des molécules ligands s'hybridant spécifiquement avec lesdits acides nucléiques, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a) mettre en contact un biocapteur tel que défini dans l'une des revendications 1 , 2, 3, 5 à 7 et 9, avec un échantillon à tester, pendant une durée suffisante à la formation de complexes d'hybridation entre les acides nucléiques immobilisés sur ledit biocapteur et des molécules ligands susceptibles d'être contenues dans ledit échantillon à tester, b) placer le biocapteur dans un système de détection selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, c) détecter les complexes d'hybridation éventuellement formés sur ledit biocapteur.A method for detecting hybridization complexes between nucleic acids and ligand molecules hybridizing specifically with said nucleic acids, said method comprising the steps of: a) contacting a biosensor as defined in one of the claims 1, 2, 3, 5 to 7 and 9, with a sample to be tested, for a time sufficient for the formation of hybridization complexes between the nucleic acids immobilized on said biosensor and ligand molecules capable of being contained in said sample to be tested, b) placing the biosensor in a detection system according to any one of claims 1 to 8, c) detecting the hybridization complexes possibly formed on said biosensor.
1 1 . Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'à l'étape c), les moyens de contrôle et de commande de déplacement du capteur capacitif (40) permettent la réalisation d'une mesure de l'intensité « I » de courant traversant ledit capteur capacitif (40) sur une partie ou sur la totalité de la surface du revêtement (12) sur lequel sont immobilisés les acides nucléiques. 1 1. A method according to claim 10, characterized in that in step c), the control means and displacement control of the capacitive sensor (40) allow the realization of a measurement of the intensity "I" of current through said capacitive sensor (40) on part or all of the surface of the coating (12) on which the nucleic acids are immobilized.
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