WO2010103857A1 - ケイ素含有保護基を用いた糖ペプチド固相合成方法および合成装置 - Google Patents

ケイ素含有保護基を用いた糖ペプチド固相合成方法および合成装置 Download PDF

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WO2010103857A1
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silicon
glycopeptide
amino acid
fmoc
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PCT/JP2010/001797
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紳一郎 西村
健 嶋脇
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国立大学法人北海道大学
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
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    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Definitions

  • the present invention relates to a glycopeptide solid phase synthesis method and synthesis apparatus using a silicon-containing protecting group.
  • Naturally occurring proteins often have sugar chains modified after translation by side chain amide groups of asparagine residues or side chain hydroxyl groups of serine and threonine residues. These glycoprotein sugar chains have been found to be involved in various life phenomena such as cell proliferation / differentiation or canceration. Many of these life phenomena involving glycoproteins are played by the polypeptide part of the protein, but there are known examples in which the accompanying sugar chains add various functions. In order to discuss the importance of the above, it should be based on experiments using the whole glycoprotein molecule or its functional domain, glycopeptide. However, since glycoprotein sugar chains have a highly heterogeneous structure, it is rare that the correlation between the sugar chain structure and its function can be clarified.
  • Non-patent Document 1 Non-patent Document 1
  • Non-Patent Document 1 H. Kunz et al, Chem. Rev. 2000, 100, 4495-4537.
  • Non-Patent Document 2 S. Nishimura et al, J. Am. Chem. Soc, 2005, 127, 11804-11818.
  • Non-Patent Document 3 Y. Kajihara et al, Angew. Chem. Int. Ed. 2003, 42, 2537-2540. The entire descriptions of Non-Patent Documents 1 to 3 are specifically incorporated herein by reference.
  • the present inventors have established an efficient method for synthesizing glycoproteins and are synthesizing glycoproteins having a uniform sugar chain structure to approach the detailed functions of the sugar chains. Under such circumstances, several solid-phase synthesis methods have been established in glycoprotein synthesis, but have the following problems.
  • the Boc (benzyloxycarbonyl) method used in the early glycopeptide solid-phase synthesis uses strongly acidic conditions for excision of synthetic glycopeptides from resins and deprotection of the Boc group. It cannot be applied to the synthesis of stable sialic acid-containing glycopeptides.
  • Non-patent Document 1 an acetyl group is generally used as a glycoprotective group of a glycopeptide (Non-patent Document 1), but this also uses basic conditions in the final stage of deprotection. For this reason, depending on the sugar chain structure and glycopeptide structure, a long reaction time is required, and therefore, the possibility of epimerization at the ⁇ -position of amino acids and ⁇ -elimination of sugar residues cannot be excluded.
  • Non-patent Document 2 Synthesis of sialic acid-containing glycopeptides carried out to date is carried out using an sialic acid transferase followed by sialic acid transferase (Non-patent Document 2), or an unprotected benzyl-protected sialic acid carboxyl group only. Only those using sugar amino acid building blocks and requiring strict conditions for amino acid condensation and deprotection (Non-Patent Document 3).
  • an object of the present invention is to allow various glycopeptides including sialic acid-containing glycopeptides to be deprotected and cleaved from the resin under weakly acidic to weakly basic conditions and to epimerize the ⁇ -position of amino acids. It is another object of the present invention to provide a novel glycopeptide synthesis method and synthesis apparatus that do not cause the problem of ⁇ -elimination of sugar residues. Another object of the present invention is to provide a new synthetic intermediate used for glycopeptide synthesis.
  • the present inventors have made various studies to achieve the above object, and as a result, found that a novel glycopeptide solid phase synthesis method using a silicon protecting group and a silicon linker resin is a method that can achieve the above object.
  • the present invention has been completed.
  • the present invention for achieving the above object is as follows. [1] The N-terminus is protected, the C-terminus is immobilized on a solid phase via a silicon linker, and the reactive group possessed by the sugar residue and the reactive group possessed by the amino acid side chain constituting the peptide are protected by the silicon-containing group.
  • a glycopeptide comprising a step of obtaining a glycopeptide derivative, and a step of treating the glycopeptide derivative with a silicon-containing group and a silicon linker detaching agent to perform deprotection and release from the solid phase to obtain a glycopeptide.
  • Solid phase synthesis method Solid phase synthesis method.
  • Alkylsilyl group is TMS (trimethylsilyl) group, TES (triethylsilyl) group, TBDMS (t-butyldimethylsilyl) group, TBDPS (t-butyldiphenylsilyl) group, TIPS (triisopropylsilyl) group, TMS (trimethylsilyl) ethyl
  • TMS trimethylsilyl ethyl
  • the method according to [2] which is a sulfonyl group or a TMS (trimethylsilyl) ethylcarbonyl group.
  • the silicon-containing group for the reactive group of the amino acid side chain constituting the peptide is TIPS (triisopropylsilyl) group, TMS (trimethylsilyl) ethylsulfonyl group, TMS (trimethylsilyl) ethylcarbonyl group, or DTBS (di-t-butyl)
  • TIPS triisopropylsilyl
  • TMS trimethylsilyl
  • TMS trimethylsilyl ethylsulfonyl group
  • TMS trimethylsilyl ethylcarbonyl group
  • DTBS di-t-butyl
  • the leaving agent for the silicon-containing group and the silicon linker is hydrogen fluoride / pyridine or TBAF (tetrabutylammonium fluoride) / acetic acid.
  • the silicon linker is a dimethylsilyl group or a diisopropylsilyl group, the silyl group of the dimethylsilyl group or the diisopropylsilyl group is directly or indirectly bonded to the C-terminal of the glycopeptide derivative, and the other bond of the silyl group is: The method according to any one of [1] to [7], wherein the method is bound directly or indirectly to the solid phase.
  • the glycopeptide derivative has an N-terminal protected amino acid and the C-terminal is immobilized on a solid phase via a silicon linker.
  • the reactive group of the sugar residue and amino acid side chain is a silicon-containing group.
  • Peptide solid-phase synthesis in which any one of (1) a sugar amino acid protected with (2) an amino acid whose side chain has a reactive group protected with a silicon-containing group, and (3) an amino acid having no reactive group
  • [Ten] The method according to [9], wherein the amino acid of the sugar amino acid is threonine, serine or asparagine.
  • the N-terminus is protected, the C-terminus is immobilized on a solid phase via a silicon linker, and the reactive group possessed by the sugar residue and the reactive group possessed by the amino acid side chain constituting the peptide are protected by the silicon-containing group.
  • Reaction vessel for condensing the glycopeptide derivative reaction vessel for treating the N-terminal Fmoc (fluorenylmethoxycarbonyl) group with a desorbing agent, and the above condensation and deprotection of the N-terminal Fmoc group can be automatically synthesized repeatedly
  • a reaction vessel, a reaction vessel for treatment with a silicon-containing group and a silicon linker leaving agent, Desorption agent storage container, condensation agent storage container, And a glycopeptide solid-phase synthesis apparatus comprising means for transferring a desorbing agent and a condensing agent from the storage container to the reaction container.
  • the apparatus according to [11] further comprising means for synthesizing the glycopeptide derivative.
  • the apparatus according to [12], wherein the means for synthesizing the glycopeptide derivative includes a storage container for the raw material of the glycopeptide derivative and a means for transferring the raw material from the storage container to the reaction container.
  • any of condensation, deprotection and excision from a resin in the synthesis of various glycopeptides including sialic acid-containing glycopeptides can be carried out under weakly acidic to weakly basic conditions. Therefore, an undesirable side reaction can be avoided. Furthermore, according to the method for synthesizing a glycopeptide of the present invention, the problem of epimerization at the ⁇ -position of amino acids and ⁇ -elimination of sugar residues does not occur. Furthermore, according to the present invention, a synthesizer that can be used for the synthesis of a new glycopeptide can also be provided.
  • the solid phase synthesis method of the glycopeptide of the present invention comprises: (1) The N-terminal is protected, the C-terminal is immobilized on a solid phase via a silicon linker, and the reactive group possessed by the sugar residue and the reactive group possessed by the amino acid side chain constituting the peptide are silicon-containing groups Obtaining a glycopeptide derivative protected with (2) It includes a step of treating the glycopeptide derivative with a silicon-containing group and a silicon linker detaching agent to perform deprotection and release from the solid phase to obtain a glycopeptide.
  • step (1) each reactive group of the glycopeptide is protected with a silicon-containing group, and a derivative in which the N-terminus is protected and the C-terminus is immobilized on a solid phase via a silicon linker is obtained.
  • sugar of the sugar residue that the glycopeptide has there are no particular limitations on the sugar of the sugar residue that the glycopeptide has, but examples include sugars that exist in vivo, and specific examples include xylose, N-acetylglucosamine, mannose, fucose, and sial. It can be acid, galactose, glucose, N-acetylgalactosamine, glucuronic acid. However, the present invention is not limited to these, and can be applied to all sugars in principle.
  • the silicon-containing group with respect to the reactive group of the sugar residue can be, for example, an alkylsilyl group.
  • the reactive group possessed by the sugar residue is, for example, a hydroxyl group, a carboxyl group or the like, and any of these can be protected with an alkylsilyl group.
  • the carboxyl group has glucuronic acid and sialic acid.
  • the amino acid of the sugar amino acid that the sugar residue has can be, for example, threonine, serine, or asparagine.
  • the alkylsilyl group includes, for example, TMS (trimethylsilyl) group, TES (triethylsilyl) group, TBDMS (t-butyldimethylsilyl) group, TBDPS (t-butyldiphenylsilyl) group, TIPS (triisopropylsilyl) group, TMS ( It can be a trimethylsilyl) ethylsulfonyl group or a TMS (trimethylsilyl) ethylcarbonyl group.
  • TMS trimethylsilyl
  • TES triethylsilyl
  • TBDMS t-butyldimethylsilyl
  • TBDPS t-butyldiphenylsilyl
  • TIPS triisopropylsilyl
  • TMS It can be a trimethylsilyl) ethylsulfonyl group or a TMS (trimethylsilyl) ethylcarbonyl
  • the alkylsilyl group is a monovalent protecting group, but depending on the type of reactive group possessed by the sugar residue, DTBS (di-t-butylsilylene), which is a divalent protecting group used in the examples, is used.
  • DTBS di-t-butylsilylene
  • the reactive group of the amino acid side chain constituting the peptide is also protected by a silicon-containing group.
  • silicon-containing group examples include TIPS (triisopropylsilyl) group, TMS (trimethylsilyl) ethylsulfonyl group, TMS (trimethylsilyl) ethylcarbonyl.
  • DTBS di-t-butylsilylene
  • TIPDS 1,3- (1,1,3,3-tetraisopropyldisiloxanyldiene)] group
  • TBDS 1,1,3,3-tetra -t-butoxydisiloxanilidene
  • the N-terminal protection of the glycopeptide derivative is performed, for example, with an Fmoc (fluorenylmethoxycarbonyl) group.
  • Fmoc fluorenylmethoxycarbonyl
  • the Fmoc group is preferred because it can be deprotected under weakly basic conditions. Protection of the N-terminus of the glycopeptide derivative can be carried out by conventional methods.
  • the C-terminus of the glycopeptide derivative is immobilized on the solid phase via a silicon linker.
  • the silicon linker include a dimethylsilyl group or a diisopropylsilyl group.
  • the silyl group of the dimethylsilyl group or the diisopropylsilyl group is directly or indirectly bonded (for example, via an alkylene chain) to the C-terminus of the glycopeptide derivative, and the other bond of this silyl group is directly or indirectly It can bind to a resin (eg, a bead) that is a solid phase (eg, via an alkylene chain).
  • Dimethylsilyl linkers are described in Y, Nakahara et al, Tetrahedron, 2000, 56, 6235-6243.
  • Diisopropylsilyl linkers are described in S. J. Danishefsky et al, J. Org. Chem, 1999, 64, 4183-4186.
  • These silicon linkers are also commercially available, and commercially available products can be used as appropriate. For example, it is possible to use a silicon linker formed by treating diisopropylsilane presented on polystyrene beads with trifluoromethanesulfonic acid to induce the active form and condense with an N-terminal protected amino acid.
  • the amino group is protected at the N-terminus and the C-terminus is immobilized on a solid phase via a silicon linker.
  • a sugar amino acid in which the reactive group is protected with a silicon-containing group, (2) an amino acid in which the reactive group of the side chain is protected with a silicon-containing group, and (3) an amino acid having no reactive group It is synthesized by the peptide solid phase synthesis method to be linked.
  • the amino acid whose N-terminal is protected and whose C-terminal is immobilized on a solid phase via a silicon linker uses a commercially available silicon linker (Si reagent) and is protected by the N-terminal Fmoc group.
  • Si reagent silicon linker
  • the synthesis of a silyl-protected amino acid, which is an amino acid whose C-terminal is immobilized on a solid phase via a silicon linker can be carried out, for example, by the method shown in Scheme 1 below.
  • R is an amino acid side chain
  • Z is a benzyloxycarbonyl group
  • Si is a solid phase via a silicon linker.
  • a specific example is shown in Example 1.
  • a sugar amino acid in which a reactive group of a sugar residue and a reactive group of an amino acid side chain are protected with a silicon-containing group will be described later.
  • the amino acid of the sugar amino acid that the sugar residue has can be, for example, threonine, serine, or asparagine.
  • the peptide solid phase synthesis method itself includes an amino acid in which the N-terminus is protected and the C-terminus is immobilized on a solid phase via a silicon linker, and (1) a reactive group possessed by a sugar residue and an amino acid side chain.
  • a sugar amino acid protected with a silicon-containing group (2) an amino acid in which the reactive group of the side chain is protected with a silicon-containing group, and (3) an amino acid having no reactive group
  • known peptide solid phase synthesis methods can be used as they are.
  • step (2) the glycopeptide derivative obtained in step (1) is treated with a silicon-containing group and a silicon linker-eliminating agent to perform deprotection and release from the solid phase to obtain a glycopeptide.
  • Deprotection and release from the solid phase is performed under mildly acidic to weakly basic conditions. Deprotection and release from the solid phase under such conditions can be carried out using a desorbing agent such as hydrogen fluoride / pyridine or TBAF (tetrabutylammonium fluoride) / acetic acid.
  • hydrogen fluoride / pyridine commercially available
  • the concentration of hydrogen fluoride / pyridine is 6.5 mol / L in THF solvent.
  • TBAF tetrabutylammonium fluoride
  • TBAF tetrabutylammonium fluoride
  • acetic acid concentration may be 1 mol / L TBAF mixed with acetic acid at a volume ratio of 1: 1.
  • deprotection can be performed with weak basicity, and amino acid condensation, deprotection of the silicon protecting group, and cleaving from the resin can be performed under weakly acidic conditions.
  • deprotection under weakly acidic to weakly basic conditions and release from the solid phase are conditions that can suppress undesirable side reactions with respect to glycopeptides.
  • Mucin is the main glycoprotein component of mucus that covers the lumen of the digestive tract such as the trachea, gastrointestinal tract, and gonads, and has a sugar chain that binds to serine / threonine in the polypeptide.
  • the mucin-type sugar chain is characterized in that N-acetylgalactosamine is ⁇ -glycoside-bonded to the hydroxyl group of serine / threonine, and by adding galactose, N-acetylglucosamine, fucose, sialic acid, etc. It is known that various types of mucin-type sugar chains can be formed.
  • the silicon linker amino acid block (3) synthesized from Fmoc-serine (10) and silicon linker (9) is an amino acid in which the N-terminus in the present invention is protected and the C-terminus is immobilized on a solid phase via a silicon linker. is there.
  • Each synthesized silicon-protected amino acid block (4,5,6) and commercially available Fmoc-amino acid (7,8) are linked as needed by the Fmoc method to give glycopeptide derivative 2. The steps so far correspond to step (1).
  • step (2) the step of finally cleaving the glycopeptide derivative 2 from the resin and deprotecting it simultaneously with, for example, hydrogen fluoride / pyridine and leading to the glycopeptide 1 corresponds to step (2).
  • the synthesis of each compound will be described in more detail in Example 1 described later.
  • the present invention includes a compound represented by the following general formula (1), which is a synthetic intermediate used in the above step (1).
  • R 1 is TMS (trimethylsilyl) group, TES (triethylsilyl) group, TBDMS (t-butyldimethylsilyl) group, TBDPS (t-butyldiphenylsilyl) group, TIPS (triisopropylsilyl) group , TMS (trimethylsilyl) ethylsulfonyl group, or TMS (trimethylsilyl) ethylcarbonyl group.
  • R 2 is a t-butyl group, a phenyl group or an allyl group
  • R 3 is a t-butyl group, a phenyl group or an allyl group.
  • R 7 is a hydrogen atom or a protecting group
  • R 8 is Z (benzyloxycarbonyl) or Fmoc (fluorenylmethoxycarbonyl) group.
  • R 5 is a hydrogen atom or a nitrogen atom
  • R 6 is an acetyl group or a nitrogen atom.
  • the present invention includes a compound represented by the following general formula (2), which is a synthetic intermediate used in the above step (1).
  • R 11 is TMS (trimethylsilyl) group, TES (triethylsilyl) group, TBDMS (t-butyldimethylsilyl) group, TBDPS (t-butyldiphenylsilyl) group, TIPS (triisopropylsilyl) group , TMS (trimethylsilyl) ethylsulfonyl group, or TMS (trimethylsilyl) ethylcarbonyl group.
  • R 12 is an isopropyl group or a t-butoxy group.
  • R 12 is isopropyl group, it is TIPDS [1,3- (1,1,3,3-tetraisopropyldisiloxanyldiene)] group, and when R 12 is t-butoxy group, TBDS (1, 1,3,3-tetra-t-butoxydisiloxanilidene) group.
  • R 7 is a hydrogen atom or a protecting group
  • R 8 is a Z (benzyloxycarbonyl) or Fmoc (fluorenylmethoxycarbonyl) group.
  • R 14 is a hydrogen atom or a nitrogen atom
  • R 15 is an acetyl group or a nitrogen atom.
  • An example of the compound represented by the general formula (1) is, for example, the compound 4 in the above scheme 2.
  • Compound 4 can be performed according to Scheme 3 shown in Example 1.
  • the compound represented by the general formula (2) can also be synthesized according to the method shown in Scheme 3 shown in Example 1.
  • the present invention also relates to a solid-phase synthesis apparatus for glycopeptides.
  • the solid phase synthesis apparatus for glycopeptides of the present invention comprises: (1) The N-terminal is protected, the C-terminal is immobilized on a solid phase via a silicon linker, and the reactive group possessed by the sugar residue and the reactive group possessed by the amino acid side chain constituting the peptide are silicon-containing groups
  • a reaction vessel for condensing the glycopeptide derivative protected with (2) a reaction vessel for treating the N-terminal Fmoc (fluorenylmethoxycarbonyl) group with a leaving agent; (3) a reaction vessel capable of automatically synthesizing the above condensation and deprotection of the N-terminal Fmoc group repeatedly, (4) a reaction vessel for treatment with a silicon-containing group and a silicon linker leaving agent; (5) storage container for release agent, (6) a condensing agent storage container, and (7) It includes means for transferring the desorbing
  • the glycopeptide solid-phase synthesizer of the present invention can be based on a known or commercially available peptide automatic synthesizer and modified so as to have the above-mentioned containers (1) to (7) or transfer means. .
  • the container and the transfer means can be the same as those used in known or commercially available peptide automatic synthesizers. However, the purpose and function of each container and transfer means are as described above.
  • the solid-phase synthesizer for glycopeptides of the present invention can further have means for synthesizing glycopeptide derivatives.
  • the means for synthesizing the glycopeptide derivative can include, for example, a storage container for the raw material of the glycopeptide derivative, and a means for transferring the raw material from the storage container to the reaction container.
  • Example 1 1-1 Synthesis of GalNAc-threonine (4) (Scheme 3) First, 3,4,6-tri-O-acetyl-D-galactal (11) (commercially available) was used as a starting material, led to 12 using a known reaction, and then p-Methoxyphenol was introduced into the 1st position. 13 After deprotecting the Ac group, a DTBS group was selectively applied at positions 4 and 6, followed by a TIPS group at position 3 to obtain 14. After deprotecting the p-methoxy group with CAN, it was converted to imidate to 15. When this was subjected to a glycosylation reaction with threonine (16), the reaction proceeded ⁇ -selectively and 17 was obtained in a yield of 46%.
  • glycosyl donor 15 (2 g, 3.1 mmol), glycosyl acceptor 16 2) (2.1 g, 6.2 mmol) synthesized according to literature and MSAW300 (1 g) were dissolved in CH 2 Cl 2 (31 ml), The mixture was stirred at room temperature for 30 minutes under a nitrogen atmosphere. After cooling to 0 ° C., TMSOTf (123 ⁇ l, 0.62 mmol) dissolved in CH 2 Cl 2 was slowly added and stirred for 1 hour. Saturated aqueous sodium hydrogen carbonate was added to this solution to stop the reaction, followed by Celite filtration, and the organic layer was washed with brine. After drying over MgSO 4 , filtration, concentration and purification by flash column chromatography, 17 (1.2 g, 46%) was obtained.
  • Serine / threonine is a known compound of 19, 20 respectively, and the t-Bu (t-butyl) group of the side chain hydroxyl group is deprotected with TFA (trifluoroacetic acid), and then the TBS (t-butyldimethylsilyl) group And re-protected it to 5,6.
  • TFA trifluoroacetic acid
  • a condensing agent for Fmoc-sugar amino acid and Fmoc-amino acid 0.4 M HBTU, HOBT / DMF (750 ⁇ l) was used. Further, 104.5 ⁇ l of DIEA added as a base was used.
  • Each condensation reaction was performed by irradiation with microwaves (40 W, 2450 MHz) at 50 ° C. using a Green Motif I reactor. The microwave irradiation time was 20 minutes when Fmoc-sugar amino acid was used, and 5 minutes when Fmoc-amino acid was used. After completion of each polymerization reaction, the resin was washed 5 times with DMF (5 ml).
  • Alloc-Arg (SES) -OH Alloc-Arg-OH (2 g, 6.9 mmol) was dissolved in 80% acetone (acetone 48 ml, 4N NaOHaq 12 ml) and stirred at 0 ° C. with 2- (Trimethylsilyl) ethanesulfonyl chloride (2.5 ml, 2.0 ml). 12.5 ml of the eq) acetone solution was added dropwise. After 6 hours, the solvent was distilled off under reduced pressure, water was added to the residue, and the mixture was washed 3 times with diethyl ether. Acidified with 5% aqueous citric acid solution and extracted twice with AcOEt. The organic layers were combined, washed with saturated brine, and dried over magnesium sulfate. AcOEt was distilled off under reduced pressure to obtain Alloc-Arg (SES) -OH (1.7 g, 73%).
  • TMSEtNPhth Phthalimide (2.8 g, 1.2 eq) and cesium carbonate (6.7 g, 1.2 eq) were dissolved in DMF (150 ml) and stirred for 1 hour.
  • (2-Bromoethyl) trimethylsilane (2.8 ml, 18 mmol) was added dropwise and stirred at 85 ° C. for 8 hours.
  • TMSEtNH 2 ⁇ HCl TMSEtNPhth was dissolved in conc. HCl and stirred vigorously at 110 ° C. for 3 days. The solvent was distilled off under reduced pressure, water was added to the residue, and the mixture was washed twice with diethyl ether. The solvent was distilled off under reduced pressure and recrystallized with methanol / diethyl ether to obtain TMSEtNH 2 .HCl (2 g, 86%).
  • Fmoc-Cys (EtTMS) -OH Fmoc-Cys (EtTMS) -OAllyl (20 mg, 41 umol) was dissolved in MeOH (2 ml). Tetrakis (triphenylphosphine) palladium (0), Pd (PPh 3 ) 4 (2.5 mg, 5 mol%), and dimethylbarbituric acid (13 mg, 2.0 eq) were added with stirring at room temperature. After stirring for 4 hours, the solvent was distilled off under reduced pressure. Water was added to the residue, acidified with 5% aqueous citric acid solution, and extracted with EtOAc. The extract was washed with saturated brine and dried over magnesium sulfate.
  • Fmoc-Ser (OTBS) -OH Fmoc-Ser-OH 500 mg, 1.5 mmol was replaced with nitrogen, and then dissolved in DMF (20 ml). 2,6-luidine (330 ul, 3.0 eq) and TBSOTf (500 ul, 1,5 eq) were added with stirring at 0 ° C. After stirring at room temperature overnight, the solvent was distilled off under reduced pressure. Water was added to the residue, acidified with 5% aqueous citric acid solution, and extracted twice with AcOEt. The organic layers were combined, washed with saturated brine, and dried over magnesium sulfate.
  • H-Ser (OTBS) -OH Z-Ser (OTBS) -OBn 2.5 g, 5.5 mmol was dissolved in EtOAc (25 ml) and MeOH (25 ml), and catalytically reduced by adding 10% Pd-C (750 mg, 30 wt%). .
  • the catalyst was removed by filtration, the solvent was distilled off under reduced pressure, and the resulting H-Ser (OTBS) -OH was directly used for the next Fmoc-conversion reaction.
  • H-Ser (OTBS) -OH Z-Tyr (OTBS) -OBn (3.8 g, 7.3 mmol) was dissolved in EtOAc (35 ml) and MeOH (35 ml), and catalytically reduced by adding 10% Pd-C (1.1 g, 30 wt%). . After removing the catalyst by filtration, the solvent was distilled off under reduced pressure, and the resulting H-Ser (OTBS) -OH was directly used for the next Fmoc-conversion reaction.
  • the known compound 1 (2.9 g, 4.91 mmol) was dissolved in MeOH (100 ml), NaOMe (80 mg, 1.47 mmol) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 4 hours.
  • DOWEX 50W ⁇ 8 [H + ] was added to stop the reaction, followed by filtration and concentration. Dissolve this in DMF (50 ml), add t-Bu 2 Si (OTf) 2 (1.5 ml, 4.50 mmol), 2,6-lutidine (1.9 ml, 16.4 mmol), replace with nitrogen, and then at room temperature for 1 hour Stir.
  • the known compound 4 (6.8 g, 15.6 mmol) was dissolved in MeOH (200 ml), NaOMe (252 mg, 4.67 mmol) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 1 hour.
  • DOWEX 50W ⁇ 8 [H + ] was added to stop the reaction, followed by filtration and concentration. Dissolve this in DMF / THF (1: 1, 200 ml), add t-Bu 2 Si (OTf) 2 (5.5 ml, 17.1 mmol), 2,6-lutidine (7.2 ml, 62.2 mmol), and then replace with nitrogen. And stirred at room temperature for 3 hours. The organic layer was washed with saturated aqueous sodium hydrogen carbonate and brine, and dried over MgSO 4 .
  • glycosyl donor 6 (670 mg, 1.26 mmol), glycosyl acceptor 7 (651 mg, 1.90 mmol), MSAW300 (1 g) was dissolved in CH 2 Cl 2 (40 ml), cooled to 0 ° C under a nitrogen atmosphere, and TMSOTf (75 ⁇ l, 0.38 mmol) dissolved in CH 2 Cl 2 was added. Slowly added and stirred for 1 hour. Saturated aqueous sodium hydrogen carbonate was added to this solution to stop the reaction, followed by Celite filtration, and the organic layer was washed with brine. After drying over MgSO 4 , filtration, concentration and purification by flash column chromatography, 8 (541 mg, 60%: ⁇ only) was obtained.
  • the present invention is useful in fields related to glycopeptides.

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Abstract

【課題】種々の糖ペプチドを脱保護および樹脂からの切り出しのいずれをも弱酸性から弱塩基性条件で実施でき、かつアミノ酸のα位のエピメリ化や糖残基のβ脱離の問題を生じない、新たな糖ペプチドの合成方法と合成装置の提供。糖ペプチド合成に用いる合成中間体の提供。N末端が保護され、C末端がケイ素リンカーを介して固相に固定化され、かつ糖残基が有する反応性基およびペプチドを構成するアミノ酸側鎖が有する反応性基がケイ素含有基で保護された糖ペプチド誘導体を得る工程、並びに前記糖ペプチド誘導体をケイ素含有基およびケイ素リンカーの脱離剤で処理して、脱保護および固相からの遊離を行い、糖ペプチドを得る工程を含む、糖ペプチドの固相合成方法。この方法の糖ペプチド誘導体を得る工程に用いる合成中間体、および糖ペプチドの固相合成装置。

Description

ケイ素含有保護基を用いた糖ペプチド固相合成方法および合成装置 関連出願の相互参照
　本出願は、２００９年３月１２日出願の日本特願２００９－５９２７１号の優先権を主張し、その全記載は、ここに特に開示として援用される。
　本発明は、ケイ素含有保護基を用いた糖ペプチド固相合成方法および合成装置に関する。
　天然に存在するタンパク質は、翻訳後にアスパラギン残基の側鎖アミド基、あるいはセリン、トレオニン残基の側鎖水酸基に糖鎖の修飾を受けていることが多い。これらの糖タンパク質糖鎖は、細胞の増殖・分化あるいは癌化など様々な生命現象に関与していることが分かってきている。これら糖タンパク質が関与する生命現象の多くは、タンパク質のポリペプチド部位がその主役を担っているが、付随する糖鎖が種々の機能を加えている例が知られているため、糖鎖の真の重要性を議論するためには全糖タンパク質分子またはその機能性ドメインである糖ペプチドを用いた実験をもとになされるべきである。しかし糖タンパク質糖鎖は高度に不均一な構造をもつため、糖鎖構造とその機能との間の相関関係が明らかにできることはまれである。よって糖鎖およびその複合体の機能解析には、構造が均一な糖タンパク質分子の安定的な供給が必須である。現段階では、単一の糖鎖構造をもつ糖タンパク質を組み替え技術で調整することは困難なため、化学合成が均質なサンプルを得るための可能な手段となっている(非特許文献１)。
［非特許文献１］H. Kunz et al, Chem. Rev. 2000, 100, 4495-4537.
［非特許文献２］S. Nishimura et al, J. Am. Chem. Soc, 2005, 127, 11804-11818.
［非特許文献３］Y. Kajihara et al, Angew. Chem. Int. Ed. 2003, 42, 2537-2540.
　非特許文献１～３の全記載は、ここに特に開示として援用される。
　そこで本発明者らは、効率的な糖タンパク質合成法を確立して均一な糖鎖構造をもつ糖タンパク質を合成し、糖鎖の詳細な機能に迫ろうと考えている。そのような背景の下、いくつかの固相合成法が糖タンパク質合成において確立されているが、以下に示す問題点を有している。
　(1)初期の糖ペプチド固相合成において用いられたBoc（ベンジルオキシカルボニル）法は、合成糖ペプチドの樹脂からの切り出しや、Boc基の脱保護時に強酸性条件を用いるため、酸性条件に不安定なシアル酸含有糖ペプチド合成には適用できない。
　(2)Fmoc（フルオレニルメトキシカルボニル）法はN末端側アミノ基の保護基をFmocにすることにより弱塩基性条件での脱保護が可能となった。しかし樹脂からの切り出しは強酸性条件を用いるため、(1)の欠点を克服しきれていない。
　(3)さらに糖ペプチドの糖保護基として一般的にアセチル基を用いる場合が多い(非特許文献1)が、これも最終段階の脱保護の際に塩基性条件を用いる。そのため、糖鎖構造、糖ペプチド構造によっては、長時間の反応時間を必要とするため、アミノ酸のα位のエピメリ化や糖残基のβ脱離の可能性を排除できない。
　現在までに行われているシアル酸含有糖ペプチドの合成は、アシアロ体で合成した後にシアル酸転移酵素を用いて行う(非特許文献２)か、もしくはシアル酸カルボキシル基のみベンジル保護した無保護体糖アミノ酸ビルディングブロックを用い、アミノ酸縮合かつ脱保護に厳密な条件を必要とするもの(非特許文献３)のみである。
　そこで本発明の目的は、シアル酸含有糖ペプチドを含む種々の糖ペプチドを脱保護および樹脂からの切り出しのいずれをも弱酸性から弱塩基性の条件で実施でき、かつアミノ酸のα位のエピメリ化や糖残基のβ脱離の問題を生じない、新たな糖ペプチドの合成方法と合成装置を提供することにある。さらに本発明は、糖ペプチド合成に用いる新たな合成中間体を提供することも目的とする。
　本発明者らは、上記目的を達成すべく種々検討し、その結果、ケイ素保護基およびケイ素リンカー樹脂を用いた新規な糖ペプチド固相合成法が上記目的を達成できる方法であることを見出して本発明を完成させた。
　上記目的を達成する本発明は以下のとおりである。
[1]
N末端が保護され、C末端がケイ素リンカーを介して固相に固定化され、かつ糖残基が有する反応性基およびペプチドを構成するアミノ酸側鎖が有する反応性基がケイ素含有基で保護された糖ペプチド誘導体を得る工程、並びに
前記糖ペプチド誘導体をケイ素含有基およびケイ素リンカーの脱離剤で処理して、脱保護および固相からの遊離を行い、糖ペプチドを得る工程
を含む、糖ペプチドの固相合成方法。
[2]
糖残基が有する反応性基に対するケイ素含有基が、アルキルシリル基である[1]に記載の方法。
[3]
アルキルシリル基がTMS（トリメチルシリル）基、TES（トリエチルシリル）基、TBDMS（t-ブチルジメチルシリル）基、TBDPS（t-ブチルジフェニルシリル）基、TIPS（トリイソプロピルシリル）基、TMS（トリメチルシリル）エチルスルホニル基、またはTMS（トリメチルシリル）エチルカルボニル基である[2]に記載の方法。
[4]
糖残基の糖が、キシロース、Ｎ－アセチルグルコサミン、マンノース、フコース、シアル酸、ガラクトース、グルコース、N-アセチルガラクトサミン、またはグルクロン酸
である[1]～[3]のいずれかに記載の方法。
[5]
ペプチドを構成するアミノ酸側鎖が有する反応性基に対するケイ素含有基が、TIPS（トリイソプロピルシリル）基、TMS（トリメチルシリル）エチルスルホニル基、TMS（トリメチルシリル）エチルカルボニル基、またはDTBS（ジ-t-ブチルシリレン）基である[1]～[4]のいずれかに記載の方法。
[6]
ケイ素含有基およびケイ素リンカーの脱離剤が、フッ化水素／ピリジンまたはTBAF（テトラブチルアンモニウムフルオライド）/酢酸である[1]～[5]のいずれかに記載の方法。
[7]
N末端の保護がFmoc（フルオレニルメトキシカルボニル）基でなされる[1]～[6]のいずれかに記載の方法。
[8]
ケイ素リンカーは、ジメチルシリル基またはジイソプロピルシリル基であり、ジメチルシリル基またはジイソプロピルシリル基のシリル基が、直接または間接的に糖ペプチド誘導体のC末端と結合し、前記シリル基もうひとつの結合は、直接または間接的に固相と結合している[1]～[7]のいずれかに記載の方法。
[9]
糖ペプチド誘導体が、N末端が保護され、C末端がケイ素リンカーを介して固相に固定化されたアミノ酸に対して、(1)糖残基およびアミノ酸側鎖が有する反応性基がケイ素含有基で保護された糖アミノ酸、(2)側鎖が有する反応性基がケイ素含有基で保護されたアミノ酸、および(3)反応性基を有さないアミノ酸のいずれかを順次連結するペプチド固相合成方法により合成される[1]～[8]のいずれかに記載の方法。
[10]
糖アミノ酸のアミノ酸が、トレオニン、セリンまたはアスパラギンである[9]に記載の方法。
[11]
N末端が保護され、C末端がケイ素リンカーを介して固相に固定化され、かつ糖残基が有する反応性基およびペプチドを構成するアミノ酸側鎖が有する反応性基がケイ素含有基で保護された糖ペプチド誘導体を縮合するための反応容器、N末端Fmoc（フルオレニルメトキシカルボニル）基を脱離剤で処理するための反応容器、上記縮合とN末端Fmoc基の脱保護を繰り返し自動合成できる反応容器、ケイ素含有基およびケイ素リンカーの脱離剤で処理するための反応容器、
脱離剤の貯蔵容器、縮合剤の貯蔵容器、
および前記貯蔵容器から反応容器に脱離剤、縮合剤を移送する手段
を含む糖ペプチドの固相合成装置。
[12]
糖ペプチド誘導体を合成するための手段をさらに有する[11]に記載の装置。
[13]
前記糖ペプチド誘導体を合成するための手段が、糖ペプチド誘導体の原料の貯蔵容器、および貯蔵容器から反応容器に原料を移送する手段を含む[12]に記載の装置。
[14]
下記一般式(1)で示される化合物。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
[式中、R1はTMS（トリメチルシリル）基、TES（トリエチルシリル）基、TBDMS（t-ブチルジメチルシリル）基、TBDPS（t-ブチルジフェニルシリル）基、TIPS（トリイソプロピルシリル）基、TMS（トリメチルシリル）エチルスルホニル基、またはTMS（トリメチルシリル）エチルカルボニル基であり、
R2は、t-ブチル基、フェニル基、またはアリル基であり、
R3は、t-ブチル基、フェニル基、またはアリル基であり、
R4は、MP(p-メトキシフェニル)基、-O-C(=NH)-CCl3、
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
で示される基(但し、R7は、水素原子または保護基であり、R8は、Z（ベンジルオキシカルボニル）またはFmoc（フルオレニルメトキシカルボニル）基である)
R5は、水素原子または窒素原子であり、
R6は、アセチル基または窒素原子である。]
[15]
下記一般式(2)で示される化合物。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
[式中、R11はTMS（トリメチルシリル）基、TES（トリエチルシリル）基、TBDMS（t-ブチルジメチルシリル）基、TBDPS（t-ブチルジフェニルシリル）基、TIPS（トリイソプロピルシリル）基、TMS（トリメチルシリル）エチルスルホニル基、またはTMS（トリメチルシリル）エチルカルボニル基であり、
R12は、イソプロピル基またはt-ブトキシ基であり、
R13は、MP(p-メトキシフェニル)基、-O-C(=NH)-CCl3、
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
で示される基(但し、R7は、水素原子または保護基であり、R8は、Z（ベンジルオキシカルボニル）またはFmoc（フルオレニルメトキシカルボニル）基である)
R14は、水素原子または窒素原子であり、
R15は、アセチル基または窒素原子である。]
　上記新規な糖ペプチド固相合成法では、保護しうる全ての糖水酸基、アミノ酸側鎖をケイ素保護基で保護した(糖)アミノ酸ビルディングブロックを用い、さらに樹脂への固定にはケイ素リンカーを用いることで、ケイ素特異的かつマイルドな条件である脱離剤、例えば、フッ化水素/ピリジンを用いて、脱保護および樹脂からの切り出しが可能である。
　本発明の糖ペプチドの合成方法によれば、シアル酸含有糖ペプチドを含む種々の糖ペプチド合成における縮合、脱保護および樹脂からの切り出しのいずれをも弱酸性から弱塩基性条件で実施できる。そのため、好ましくない副反応を回避することができる。さらに本発明の糖ペプチドの合成方法によれば、アミノ酸のα位のエピメリ化や糖残基のβ脱離の問題を生じない。さらに、本発明によれば、新たな糖ペプチドの合成に用いることができる合成装置も提供することができる。
実施例4で合成した化合物10のNMRチャートである。
[糖ペプチドの固相合成方法]
　本発明の糖ペプチドの固相合成方法は、
(1)N末端が保護され、C末端がケイ素リンカーを介して固相に固定化され、かつ糖残基が有する反応性基およびペプチドを構成するアミノ酸側鎖が有する反応性基がケイ素含有基で保護された糖ペプチド誘導体を得る工程、並びに
(2)前記糖ペプチド誘導体をケイ素含有基およびケイ素リンカーの脱離剤で処理して、脱保護および固相からの遊離を行い、糖ペプチドを得る工程
を含むものである。
工程(1)
　工程(1)では、糖ペプチドが有する各反応性基をケイ素含有基で保護し、かつN末端が保護され、C末端がケイ素リンカーを介して固相に固定化された誘導体を得る。
　糖ペプチドが有する糖残基の糖には特に制限はないが、例えば、生体内に存在する糖を挙げることができ、具体的には、例えば、キシロース、N-アセチルグルコサミン、マンノース、フコース、シアル酸、ガラクトース、グルコース、N-アセチルガラクトサミン、グルクロン酸であることができる。ただし、これらに限らず、本発明は、原理上全ての糖に応用可能である。
　上記糖残基が有する反応性基に対するケイ素含有基は、例えば、アルキルシリル基であることができる。糖残基が有する反応性基は、例えば、水酸基、カルボキシル基等であるが、これらはいずれも、アルキルシリル基で保護することができる。カルボキシル基はグルクロン酸、シアル酸が有する。また、糖残基が有する糖アミノ酸のアミノ酸は、例えば、トレオニン、セリンまたはアスパラギンであることができる。
　アルキルシリル基は、例えば、TMS（トリメチルシリル）基、TES（トリエチルシリル）基、TBDMS（t-ブチルジメチルシリル）基、TBDPS（t-ブチルジフェニルシリル）基、TIPS（トリイソプロピルシリル）基、TMS（トリメチルシリル）エチルスルホニル基、TMS（トリメチルシリル）エチルカルボニル基であることができる。上記アルキルシリル基は、1価の保護基であるが、糖残基が有する反応性基の種類によっては、実施例で用いている2価の保護基であるDTBS（ジ-t-ブチルシリレン）基、TIPDS[1,3-(1,1,3,3-テトライソプロピルヂシロキサニルジエン)]基、TBDS（1,1,3,3-テトラ-t-ブトキシジシロキサニリデン）基等を用いることもできる。
　ペプチドを構成するアミノ酸側鎖が有する反応性基もケイ素含有基で保護され、ケイ素含有基としては、例えば、TIPS（トリイソプロピルシリル）基、TMS（トリメチルシリル）エチルスルホニル基、TMS（トリメチルシリル）エチルカルボニル基、DTBS（ジ-t-ブチルシリレン）基、TIPDS [1,3-(1,1,3,3-テトライソプロピルヂシロキサニルジエン)]基、TBDS（1,1,3,3-テトラ-t-ブトキシジシロキサニリデン）基等を挙げることができる。
　糖ペプチド誘導体のN末端の保護は、例えば、Fmoc（フルオレニルメトキシカルボニル）基でなされる。Fmoc基は、弱塩基性条件で脱保護できることから好ましい。糖ペプチド誘導体のN末端の保護は、常法により実施できる。
　糖ペプチド誘導体のC末端は、ケイ素リンカーを介して固相に固定化されている。ケイ素リンカーとしては、例えば、ジメチルシリル基またはジイソプロピルシリル基を挙げることができる。ジメチルシリル基またはジイソプロピルシリル基のシリル基が、直接または間接的に(例えば、アルキレン鎖を介して)糖ペプチド誘導体のC末端と結合し、このシリル基もうひとつの結合は、直接または間接的に(例えば、アルキレン鎖を介して)固相である樹脂(例えば、ビーズ)と結合することができる。ジメチルシリルリンカーは、Y, Nakahara et al, Tetrahedron, 2000, 56, 6235-6243に記載されている。また、ジイソプロピルシリルリンカーは、S. J. Danishefsky et al, J. Org. Chem, 1999, 64, 4183-4186に記載されている。これらのケイ素リンカーは、市販もされており、市販品を適宜利用することができる。例えば、ポリスチレンビーズに提示されたジイソプロピルシランをトリフルオロメタンスルホン酸処理することにより、活性型へと誘導しN末端保護アミノ酸と縮合しすることで形成されるケイ素リンカーを用いることができる。
　上記糖ペプチド誘導体は、N末端が保護され、C末端がケイ素リンカーを介して固相に固定化されたアミノ酸に対して、(1)糖残基が有する反応性基およびアミノ酸側鎖が有する反応性基がケイ素含有基で保護された糖アミノ酸、(2)側鎖が有する反応性基がケイ素含有基で保護されたアミノ酸、および(3)反応性基を有さないアミノ酸のいずれかを順次連結するペプチド固相合成方法により合成される。
　N末端が保護され、C末端がケイ素リンカーを介して固相に固定化されたアミノ酸は、上記のように、市販のケイ素リンカー(Si reagent)を利用し、かつ、N末端のFmoc基による保護の導入も公知の方法で実施できる。C末端がケイ素リンカーを介して固相に固定化されたアミノ酸であるシリル保護アミノ酸の合成は、例えば、以下のスキーム1に示す方法で実施できる。Rはアミノ酸側鎖であり、Zはベンジルオキシカルボニル基であり、Siはケイ素リンカーを介した固相である。具体例は実施例1に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000005
　(1)糖残基が有する反応性基およびアミノ酸側鎖が有する反応性基がケイ素含有基で保護された糖アミノ酸は、合成方法については後述する。糖残基が有する糖アミノ酸のアミノ酸は、例えば、トレオニン、セリンまたはアスパラギンであることができる。
　(2)側鎖が有する反応性基がケイ素含有基で保護されたアミノ酸は、公知のペプチド固相合成方法で使用されているものをそのまま利用できる。(3) 反応性基を有さないアミノ酸も、公知のペプチド固相合成方法で使用されているものをそのまま利用できる。尚、(1)、(2)および(3)の各アミノ酸も、N末端がFmoc基等で保護されている。
　また、ペプチド固相合成方法自体も、上記N末端が保護され、C末端がケイ素リンカーを介して固相に固定化されたアミノ酸と(1)糖残基およびアミノ酸側鎖が有する反応性基がケイ素含有基で保護された糖アミノ酸とを用いること以外は、(2)側鎖が有する反応性基がケイ素含有基で保護されたアミノ酸、および(3)反応性基を有さないアミノ酸を用いることも含めて、公知のペプチド固相合成方法をそのまま利用することができる。
工程(2)
　工程(2)では、前記工程(1)で得られた糖ペプチド誘導体をケイ素含有基およびケイ素リンカーの脱離剤で処理して、脱保護および固相からの遊離を行い、糖ペプチドを得る。脱保護および固相からの遊離は、弱酸性から弱塩基性条件で実施する。そのような条件での脱保護および固相からの遊離は、例えば、フッ化水素／ピリジンまたはTBAF（テトラブチルアンモニウムフルオライド）/酢酸などの脱離剤を用いて実施できる。フッ化水素／ピリジン（市販品）を用いる場合、フッ化水素／ピリジンの濃度はTHF溶媒中、6.5 mol/Lである。また、TBAF（テトラブチルアンモニウムフルオライド）/酢酸を用いる場合、TBAFの濃度および酢酸の濃度は、1 mol/LのTBAFと酢酸を体積比１：１で混合したものを用いることができる。
　糖ペプチド誘導体のＮ末端がFmoc基で保護されている場合、脱保護は弱塩基性で実施でき、アミノ酸縮合、ケイ素保護基の脱保護、および樹脂からの切り出しは、弱酸性条件で実施できる。このように、弱酸性から弱塩基性条件での脱保護および固相からの遊離は、糖ペプチドに対して好ましくない副反応を抑制できる条件である。ここで弱酸性条件とは、例えば、アミノ酸縮合条件 [HBTU（2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホススフェート)、HOBT（1-ヒドロキシベンゾトリアゾール）、DIEA（ジイソプロピルエチルアミン）、DMF：pH = 7.5）]と、ケイ素保護基脱保護・樹脂切り出し条件[フッ化水素／ピリジン（6.5 mol/L）：pH = 6.0]であることができる。また弱塩基性条件とは、例えば、N末端Fmoc基の脱保護条件（20%ピペリジン／DMF溶液：pH = 8.5）であることができる。
　以下に本発明の糖ペプチドの固相合成方法を、合成ターゲットとして、ムチンの１種であるMUC5AC(1)を選択した場合を例に以下に説明する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000006
　ムチンは気管、胃腸などの消化管、生殖腺などの内腔を覆う粘液の主要な糖タンパク質成分であり、ポリペプチド中のセリン/トレオニンに結合する糖鎖をもつ。ムチン型糖鎖は、セリン/トレオニンの水酸基に対し、N-アセチルガラクトサミンがα-グリコシド結合することを特徴としており、さらにガラクトース、N-アセチルグルコサミン、フコース、シアル酸などが付加されることによって、様々な種類のムチン型糖鎖ができることが知られている。
　MUC5AC(1)の逆合成における戦略は以下のスキーム2に示すとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000007
　まずMUC5ACのタンデムリピート領域はAPTTSTTSであることから、Fmoc-セリン(10)の側鎖をケイ素リンカー(9)へ連結することとした。Fmoc-セリン(10)およびケイ素リンカー(9)から合成したケイ素リンカーアミノ酸ブロック(3)が、本発明におけるN末端が保護され、C末端がケイ素リンカーを介して固相に固定化されたアミノ酸である。それぞれ合成したケイ素保護アミノ酸ブロック(4,5,6)、かつ市販品のFmoc-アミノ酸（7,8）を、Fmoc法により随時連結して糖ペプチド誘導体2とする。ここまでが工程(1)に相当する。次いで、糖ペプチド誘導体2を最終的に、例えば、フッ化水素／ピリジンを用いて、樹脂からの切り出し、脱保護を同時に行い糖ペプチド1へと導く工程が、工程(2)に相当する。各化合物の合成について、後述する実施例1でさらに詳しく説明する。
[合成中間体]
　本発明は、上記工程(1)で使用される合成中間体である下記一般式(1)で示される化合物を包含する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000008
　上記式(1)中、R1はTMS（トリメチルシリル）基、TES（トリエチルシリル）基、TBDMS（t-ブチルジメチルシリル）基、TBDPS（t-ブチルジフェニルシリル）基、TIPS（トリイソプロピルシリル）基、TMS（トリメチルシリル）エチルスルホニル基、またはTMS（トリメチルシリル）エチルカルボニル基である。
R2は、t-ブチル基、フェニル基またはアリル基であり、
R3は、t-ブチル基、フェニル基またはアリル基である。
R4は、MP(p-メトキシフェニル)基、-O-C(=NH)-CCl3、
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000009
で示される基である。後半3つの一般式はそれぞれセリン、トレオニンおよびアスパラギンを示す式である。但し、式中、R7は、水素原子または保護基であり、R8は、Z（ベンジルオキシカルボニル）またはFmoc（フルオレニルメトキシカルボニル) 基である。
　R5は、水素原子または窒素原子であり、R6は、アセチル基または窒素原子である。
　さらに本発明は、上記工程(1)で使用される合成中間体である下記一般式(2)で示される化合物を包含する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000010
　上記式(2)中、R11はTMS（トリメチルシリル）基、TES（トリエチルシリル）基、TBDMS（t-ブチルジメチルシリル）基、TBDPS（t-ブチルジフェニルシリル）基、TIPS（トリイソプロピルシリル）基、TMS（トリメチルシリル）エチルスルホニル基、またはTMS（トリメチルシリル）エチルカルボニル基である。
　R12は、イソプロピル基またはt-ブトキシ基である。R12がイソプロピル基の場合がTIPDS[1,3-(1,1,3,3-テトライソプロピルヂシロキサニルジエン)]基であり、R12がt-ブトキシ基の場合がTBDS（1,1,3,3-テトラ-t-ブトキシジシロキサニリデン）基となる。
　R13は、MP(p-メトキシフェニル)基、-O-C(=NH)-CCl3、
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000011
で示される基である。後半3つの一般式はそれぞれセリン、トレオニンおよびアスパラギンを示す式である。但し、式中、R7は、水素原子または保護基であり、R8は、Z（ベンジルオキシカルボニル）またはFmoc（フルオレニルメトキシカルボニル）基である。
　R14は、水素原子または窒素原子であり、R15は、アセチル基または窒素原子である。
　一般式(1)で示される化合物の例は、例えば、上記スキーム2中の化合物4である。化合物4は、実施例1に示すスキーム3に従って、実施できる。一般式(2)で示される化合物も、実施例1に示すスキーム3に示す方法に準じて合成することができる。
[糖ペプチドの固相合成装置]
　本発明は、糖ペプチドの固相合成装置にも関する。本発明の糖ペプチドの固相合成装置は、
(1)N末端が保護され、C末端がケイ素リンカーを介して固相に固定化され、かつ糖残基が有する反応性基およびペプチドを構成するアミノ酸側鎖が有する反応性基がケイ素含有基で保護された糖ペプチド誘導体を縮合するための反応容器、
(2)Ｎ末端Fmoc（フルオレニルメトキシカルボニル）基を脱離剤で処理するための反応容器、
(3)上記縮合とＮ末端Fmoc基の脱保護を繰り返し自動合成できる反応容器、
(4)ケイ素含有基およびケイ素リンカーの脱離剤で処理するための反応容器、
(5)脱離剤の貯蔵容器、
(6)縮合剤の貯蔵容器、および
(7)前記貯蔵容器から反応容器に脱離剤、縮合剤を移送する手段
を含むものである。
　ペプチド自動合成装置は、市販され、一般に利用されている。本発明の糖ペプチドの固相合成装置は、公知または市販のペプチド自動合成装置を基本とし、かつ上記(1)～(7)の容器または移送手段を有するように改変したものであることができる。容器および移送手段自体は、公知または市販のペプチド自動合成装置で用いられるものと同様とすることができる。ただし、各容器および移送手段の目的および機能は上記のとおりである。
　本発明の糖ペプチドの固相合成装置は、糖ペプチド誘導体を合成するための手段をさらに有することもできる。糖ペプチド誘導体を合成するための手段は、例えば、糖ペプチド誘導体の原料の貯蔵容器、および貯蔵容器から反応容器に原料を移送する手段を含むことができる。
　以下本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
実施例１
1-1 GalNAc-トレオニン(4)の合成（スキーム3）
　まず3,4,6-トリ-Ｏ-アセチル-Ｄ-ガラクタール(11)(市販品)を出発原料として用い,既知反応を用いて12へと導いた後、p-Methoxyphenolを１位に導入して13とした。Ac基を脱保護した後、4,6位に選択的にDTBS基をかけ、続けて3位にTIPS基をかけて14とした。CANでp-methoxy基を脱保護した後イミデート化して15とした。これをトレオニン(16)とグリコシル化反応を行ったところα選択的に反応が進行し、17を46%の収率で得た。チオ酢酸でアジドをN-アセチル化して18とした後、Z（ベンジルオキシカルボニル）基、Bn（ベンジル）基を水添で除去後、アミンをFmoc化して目的化合物4を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000012
Fmoc-Thr(GalNAc-Si)-OH (4)の合成
　3,4,6,-Tri-O-Acetyl-D-Galactal(11)(20 g, 74 mmol)をCH3CN (368 ml)に溶かし、-25℃に冷却した。これにCAN(147 g, 268mmol)とNaN3(7.2 g, 110 mmol)を加え、フラスコ内を窒素置換した後、-15℃で8時間攪拌した。有機層を水、飽和重曹水、ブラインで洗浄してMgSO４で乾燥した。ろ過、濃縮後、酢酸(144 ml, 2.5 mol)と酢酸ナトリウム(9.7 g, 118 mmol)を加え、100℃で2時間撹拌した。有機層を水、飽和重曹水、ブラインで洗浄してMgSO４で乾燥した。ろ過、濃縮後、フラッシュカラムクロマトグラフィーで精製し、121)(12.6 g, 2 steps 46%)を得た。
　12(11.9 g, 31.9 mmol)をCH２Cl2 (319 ml)に溶かし、p-Methoxyphenol(5.2 g, 41.5 mmol)とBF3・Et2O(6 ml, 47.9 mmol)とMS4A(4 g)を加え、フラスコ内を窒素置換した後、室温で3時間攪拌した。その後TMSOTf(1.3 ml, 6.4 mmol)を加えさらに室温で3時間撹拌した。セライトでMS4Aをろ過した後、有機層を水、飽和重曹水、ブラインで洗浄し、MgSO4で乾燥した。ろ過、濃縮後、フラッシュカラムクロマトグラフィーで精製し、13(10.2 g, 73%)を得た。13はα/β体は分離せずそのまま次の反応に用いた。
　13(12.8 g, 29.3 mmol)をMeOH(293 ml)に溶かし、NaOMe(471 mg, 8.7 mmol)を加え室温で１時間攪拌した。DOWEX 50W×8［Ｈ＋］を加えて反応をとめた後、ろ過、濃縮した。これをCH２Cl2(293 ml)に溶かし、t-Bu2Si(OTf)2(10.4 ml, 32.2 mmol)と2,6-lutidine(13.7 ml, 117.2 mmol)を加え、フラスコ内を窒素置換した後、室温で3時間撹拌した。有機層を飽和重曹水、ブラインで洗浄後、MgSO4で乾燥した。ろ過、濃縮後、フラッシュカラムクロマトグラフィーで精製し、中間体(11.4 g, 86%)を得た。この中間体(3.1 g, 6.9 mmol)をCH3CN (69 ml)に溶かし、TIPSOTf(3.7 ml, 13.8 mmol)と2,6-lutidine(3.2 ml, 27.6 mmol)を加え、フラスコ内を窒素置換した後、室温で3時間撹拌した。有機層を1NHCl水溶液、飽和重曹水、ブラインで洗浄後、MgSO4で乾燥した。ろ過、濃縮後、フラッシュカラムクロマトグラフィーで精製し、14(3.7 g, 3 steps 53%, α：β=1:1)を得た。
14 （α体） : 1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ 7.04 (2H, d, J = 9.1 Hz, Ph), 6.83 (2H, d, J = 9.1 Hz, Ph), 5.49 (1H, d, J = 3.4 Hz, H1), 4.49 (1H, d, J = 2.6 Hz, H4), 4.35 (1H, dd, J = 10.2, 2.9 Hz, H3), 4.23 (1H, dd, J = 12.6, 1.5 Hz, H6), 4.11 (1H, dd, J = 12.4, 1.7 Hz, H6), 3.83 (1H, s, H5), 3.81 (1H, dd, J = 10.3, 3.4 Hz, H2) 3.77 (3H, s, OMe), 1.18-1.15 (21H, m, TIPS), 1.07-1.05 (18H, m, t-Bu).
14 （β体）: 1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ 7.05 (2H, d, J = 9.0 Hz, Ph), 6.82 (2H, d, J = 9.0 Hz, Ph), 4.66 (1H, d, J = 8.1 Hz, H1), 4.33 (1H, d, J = 3.0 Hz, H4), 4.24 (2H, s, H6), 3.86 (1H, dd, J = 8.3, 1.4 Hz, H2), 3.78 (3H, s, OMe), 3.58 (1H, dd, J = 9.9, 3.1 Hz, H3), 3.36 (1H, s, H5), 1.15-1.09 (21H, m, TIPS), 1.08-1.05 (18H, m, t-Bu).
　14(3.6 g, 5.9 mmol)をCH3CN：トルエン：水＝27 ml ：18 ml ：18 mlに溶かし、CAN(9.8 g, 17.8 mmol)を加え１時間攪拌した。有機層を水、飽和重曹水、ブラインで洗浄し、MgSO4で乾燥した。ろ過、濃縮後フラッシュカラムクロマトグラフィーで精製し、中間体(2.3 g, 77%)を得た。その中間体(2 g, 4 mmol)をCH２Cl２(40 ml)に溶かした後、0℃に冷却しCCl3CN(4 ml, 40 mmol)と、DBU (176 μl, 1.2 mmol)を加え30分間攪拌した。これをそのまま濃縮しフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し、15(2.0 g, 78%, α:β=1:2)を得た。
15 （α体）: 1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ 8.64 (1H, s, NH), 6.49 (1H, d, J = 3.2 Hz, H1), 4.49 (1H, d, J = 2.1 Hz, H4), 4.27 (1H, dd, J = 10.5, 2.4 Hz, H3), 4.23 (1H, d, J = 1.5 Hz, H6), 4.18 (1H, dd, J = 12.7, 1.4 Hz, H6), 4.08 (1H, dd, J = 10.1, 3.2 Hz, H2), 3.86 (1H, s, H5), 1.15-1.10 (21H, m, TIPS), 1.06-1.02 (18H, m, t-Bu).
15 （β体）: 1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ 8.66 (1H, s, NH), 5.60 (1H, d, J = 8.5 Hz, H1), 4.36 (1H, d, J = 2.3 Hz, H4), 4.27-4.21 (2H, m, H6), 3.90 (1H, t, J = 9.0 Hz, H2), 3.66 (1H, dd, J = 9.9, 2.9 Hz, H3), 3.49 (1H, s, H5), 1.14-1.11 (21H, m, TIPS), 1.06-1.04 (18H, m, t-Bu).
　合成したグリコシルドナー15(2 g, 3.1 mmol)と、文献に従い合成したグリコシルアクセプター16 2)(2.1 g, 6.2 mmol)と、MSAW300(1 g)をCH2Cl2(31 ml)に溶かし、窒素雰囲気下、室温で30分攪拌した。0℃に冷却した後、CH2Cl2に溶かしたTMSOTf(123 μl, 0.62 mmol)をゆっくりと加え1時間攪拌した。この溶液に飽和重曹水を加えて反応をとめた後、セライトろ過し、有機層をブラインで洗浄した。MgSO4で乾燥後、ろ過、濃縮してフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し、17(1.2 g, 46%)を得た。
17 : 1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ 7.37-7.35 (10H, m, 2Ph), 5.66 (1H, d, J = 9.2 Hz, NH), 5.27-5.13 (4H, m, Bn), 4.82 (1H, d, J = 3.1 Hz, H1), 4.38-4.39 (1H, m, Thr-α), 4.38-4.39 (1H, m, Thr-β), 4.37 (1H, s, H4), 4.20 (1H, dd, J = 12.4, 2.0 Hz, H6), 4.07 (1H, dd, J = 12.5, 1.4 Hz, H6), 4.01 (1H, dd, J = 8.0, 2.2 Hz, H3), 3.60 (1H, s, H5), 3.58 (1H, dd, J = 3.2, 1.4 Hz, H2), 1.23-1.22 (3H, m, Thr-Me), 1.15-1.10 (21H, m, TIPS), 1.04-1.01 (18H, m, (t-Bu)2Si).
　17(330 mg, 0.4 mmol)にpyridine(2.5 ml)とAcSH(5 ml)を加え、室温で20時間攪拌した。有機層を1NHCl水溶液、飽和重曹水、ブラインで洗浄後、MgSO4で乾燥した。ろ過、濃縮後、フラッシュカラムクロマトグラフィーで精製し、18(260 mg, 77%)を得た。
18 : 1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ 7.38-7.35 (10H, m, 2Ph), 5.58 (1H, d, J = 9.4 Hz, GalNAc-NH), 5.36 (1H, d, J = 9.4 Hz, Thr-NH), 5.18-5.13 (4H, m, Bn), 4.75 (1H, d, J = 3.4 Hz, H1), 4.61 (1H, ddd, J = 10.3, 3.4 Hz, H2), 4.38-4.37 (1H, m, H4), 4.38-4.37 (1H, m, Thr-α), 4.38-4,37 (1H, m, Thr-β), 4.21 (1H, d, J = 12.4 Hz, H6), 4.06 (1H, d, J = 12.4 Hz, H6), 3.88 (1H, dd, J = 10.5, 2.1 Hz, H3), 3.59 (1H, s, H5), 2.04-2.03 (3H, m, Ac), 1.23-1.26 (3H, m, Thr-Me), 1.08-1.06 (21H, m, TIPS), 1.03-1.04 (18H, m, t-Bu).
　18(200 mg, 0.24 mmol)をMeOH/EtOAc（1.2 ml：1.2 ml）に溶かし、Pd/C(60 mg, 30%Wt)を加え水素雰囲気下、室温で5時間攪拌した。セライトろ過、濃縮後、DMF(2.4 ml)に溶かしFmoc-OSu(121.4 mg, 0.36 mmol)とNaHCO3(30.2 mg, 0.36 mmol)を加え室温で2時間攪拌した。有機層を5% citric acid水溶液、ブラインで洗浄後、MgSO4乾燥した。ろ過、濃縮後フラッシュカラムクロマトグラフィーで精製し、その後ゲルろ過クロマトグラフィー（Sephadex G-10）によりDMFを除去し、4(190 mg, 71%)を得た。
4 : 1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ 7.90-7.29 (10H, m, 2Ph), 4.69 (1H, d, J = 3.4 Hz, H1), 4.44 (1H, t, J = 7.7 Hz, GalNAc-NH), 4.41 (1H, s, Thr-NH), 4.37-4.36 (1H, m, Thr-α), 4.37-4,36 (1H, m, Thr-β), 4.34 (1H, d, J = 3.1 Hz, H2), 4.32 (1H, d, J = 14.6 Hz, H4), 4.24-4.21 (2H, m, H6), 4.11 (2H, d, J = 8.5 Hz, Fmoc-α), 4.00 (1H, d, J = 11.5 Hz, H5), 3.88 (1H, d, J = 10.5 Hz, H3), 3.75 (1H, s, OH), 1.90-1.80 (3H, m, Ac), 1.13-1.12 (3H, m, Thr-Me), 1.07-1.06 (21H, m, TIPS), 1.00-0.90 (18H, m, (t-Bu)2Si).
参考文献
　1) Alberto, M.; Francoise, G.; Pierre, S.  Tetrahedron, 1991, 47, 5149-5160
　2) Bryan, L; Martin, B; Richard, B.  J. Org. Chem., 2006, 71, 9045-9050
　尚、上記合成スキームの15から17の反応(下記にスキームを抽出した)において、糖の保護基として下記に示すDTBS（ジ-t-ブチルシリレン）基を用いている。この反応において4,6位にまたがったシリル基の効果で、グリコシル化反応の際のα選択性が向上した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000013
1-2 アミノ酸（セリン／スレオニン）ビルディングブロックの合成（スキーム4）
　セリン／スレオニンはそれぞれ既知化合物である19,20を用い、側鎖水酸基のt-Bu（ｔ－ブチル）基をTFA（トリフルオロ酢酸）で脱保護した後、TBS(ｔ－ブチルジメチルシリル)基で再保護して5,6へと導いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000014
1-3 ケイ素リンカー樹脂を用いた糖アミノ酸重合反応
　市販されているケイ素リンカー(21)を既知反応によりトリフラート体(9)へと変換した後、Fmoc-Ser(10)を導入して3とした（スキーム5）。10の導入効率はFmocを脱離させた22の吸光度を測定することにより求めた。それぞれ樹脂の量30,50 mgに対し10を2当量、5当量それぞれ導入したが、いずれの場合も30～40%程度の導入率であった。これは市販の樹脂が1.4 mmol/gとハイロードであり、嵩高い10は導入効率が悪いためであると考えられる。そこで10を導入した際の残ったトリフラート体はメタノールでキャッピングをすることとした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000015
　その後Fmoc法を用いて、ケイ素保護アミノ酸(5,6)、糖アミノ酸(4)、市販のFmoc-Ala(7)、Fmoc-Pro(8)を縮合して23とした（スキーム6）。最後にフッ化水素／ピリジンの条件に付し、ケイ素保護基の脱保護、リンカーからの切り出しを行ったところ、アミノ酸のエピマー化、糖残基のβ脱離などの副反応が起こることなく目的化合物1を得ることができた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000016
糖ペプチド合成
(4-Methoxyphenyl) diisopropylsilyl propyl polystyrenes (21)
　固体担体21をCH2Cl2で2回洗い、12時間真空ポンプで乾燥させた。そしてCH2Cl2で1時間膨潤させた。その後、4%TfOH/CH2Cl2溶液を加え、室温で30分間振とうし、9を得た。CH2Cl2で3回洗い、CH2Cl2と2,6-lutidineを加え室温で15分間振とうした後CH2Cl2にあらかじめ溶かした10を加え、室温で10 h振とうした。そしてMeOHを加え室温で30分間振とうした後、CH2Cl2で5回洗い、3を得た。
　3(42.9 mg)に、以下のFmoc-アミノ酸またはFmoc-糖アミノ酸を順にマイクロ波照射下にて縮合反応させた：Fmoc-Thr(TBDMS)-Opfp（111.9 mg）、Fmoc-Thr(TBDMS)-Opfp(111.9 mg）、Fmoc-Ser(TBDMS)-Opfp（109.4 mg）、Fmoc-Thr(GalNAc-Si)-OH（75.7 mg）、Fmoc-Thr(TBDMS)-Opfp（111.9 mg）、Fmoc-Pro-OH（202.44 mg）、Fmoc-Ala-OH（186.8 mg）。
　Fmoc-糖アミノ酸およびFmoc-アミノ酸の縮合剤は0.4 M HBTU,HOBT/DMF（750 μl）を用いた。また、塩基として添加したDIEAは、104.5μlを用いた。
　各縮合反応は、グリーン・モチーフI反応装置を用いて、50℃においてマイクロ波（40W、2450MHｚ）を照射して行った。マイクロ波照射時間は、Fmoc-糖アミノ酸を用いる場合には20分間、Fmoc-アミノ酸を用いる場合においては5分間とした。各重合反応終了後、樹脂をDMF（5ml）で5回洗浄した。
　次いで、20％ピペリジン/DMF溶液（15ml）を添加し、同様にマイクロ波を照射した。3分後、マイクロ波照射を停止し、樹脂をDMF（5ml）で5回洗浄した。このようにして、縮合反応と脱保護を繰り返し、ペプチド鎖の伸長反応を行い、23を得た。
　全伸長反応終了後、脱Fmoc化し、DMF（5ml）で5回、DCM（5ml）で5回洗浄して20時間乾燥させた。
固体担体からの切り出し
　樹脂に、THF（3 ml）とHF/Pyridine(500μl)を加えて3時間振とうさせて固相担体から糖ペプチド鎖を切り出し、MeOTMS(4 ml)を加えて反応を止め、糖ペプチドを含む反応溶液を回収した。水とH/A=1を加え、水層を回収して凍結乾燥し、粗ペプチドを得た。
　粗ペプチドを水（1 ml）に溶かし、HPLCにより精製し、1を得た。回収された糖ペプチドの収率は39％であった。
実施例２
2-1 シリル保護シアル酸の合成(スキーム7)
　シリル保護シアル酸は以下のスキーム7に従って合成することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000017
実施例３
アミノ酸ビルディングブロックの合成
3-1 ～Arg～（Z体の合成）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000018
・Z-Arg-OH
　Arginine(20 g, 115 mmol)を水(250 ml)に溶解し、この溶液に炭酸水素ナトリウム(32 g, 3.3 eq)を加えた後ZCl(16.4 ml, 1.0 eq)を滴下して室温にて激しく3時間攪拌した。析出した結晶を濾取してジエチルエーテル、水で洗浄しZ-Arg-OH（33 g、94 %)を得た。
※参考：続 医薬品の化学p.98
・Z-Arg(SES)-OH
　Z-Arg-OH(2 g, 6.5 mmol)を80%アセトン（アセトン40 ml, 4N NaOHaq 10 ml）に溶解し、0℃にて攪拌しながら、2-(Trimethylsilyl)ethanesulfonyl chloride（2.5 ml, 2.0 eq）のアセトン溶液12.5mlを滴下した。6時間後、溶媒を減圧留去して残渣に水を加え、ジエチルエーテルで3回洗浄した。5%クエン酸水溶液で酸性にしてAcOEtで2回抽出した。有機層を合わせ飽和食塩水で洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥した。AcOEtを減圧留去しZ-Arg(SES)-OH（2.3 g、75 %)を得た。
1H NMR (500 MHz, MeOD): σ = 7.33-7.25 (m, 5H, 5×CH2), 5.05 (s, 2H, CH2), 4.15-4.12 (dd, 1H J = 4.7, 4.1 Hz, CH), 3.17 (m, 2H, CH2), 2.89-2.85 (dt, 2H, J = 8.4, 4.2 Hz, CH2), 1.85 (m, 1H, CH2), 1.67-1.59 (m, 3H, 2×CH2), 0.97-0.94 (dt, 2H, J = 8.9, 5.0 Hz, CH2), 0 ppm (s, 9H, 3×CH3)
13C NMR (125 MHz, MeOD):σ = 0, 13.5, 31.9, 32.0, 45.9, 53.1, 57.0, 69.6, 124.1, 130.8, 131.0, 131.5, 132.2, 140.2, 161.0, 175.0 ppm
HRMS(ESI-TOF): m/z: calculated for C19H32O6N4NaSSi:495.17040, found:495.17092 [M+Na]+
※参考：Y. Konda et al. / Tetrahedron 57 (2001) 4311　＜Z-Arg(Mbs)-OH合成＞
・H-Arg(SES)-OH
　Z-Arg(SES)-OH(1.4 g, 3 mmol)をEtOAc(15 ml)とMeOH(15 ml)に溶解し、10%Pd-C(420 mg, 30 wt%)を加えて接触還元した。触媒をろ去後に溶媒を減圧留去してH-Arg(SES)-OHを得た。該化合物は単離精製せず次の反応に用いた。
・Fmoc-Arg(SES)-OH
　H-Arg(SES)-OHをDMF(30 ml)に溶解した。炭酸ナトリウム（630 mg, 2.5 eq)の水溶液（10 ml）を加え、0℃にて攪拌しながら、FmoOSu(1.5 g, 1.5 eq)を加えた。室温にて終夜攪拌した後、溶媒を減圧留去した。残渣に水を加えてジエチルエーテルで洗浄した。5%クエン酸水溶液で酸性にし、AcOEtで2回抽出した。有機層を合わせ飽和食塩水で洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥した。AcOEtを減圧留去した後にフラッシュカラムクロマトグラフィー(CHCl3 : MeOH = ∞ : 0 → 20 : 1)にて精製し、Fmoc-Arg(SES)-OH（930 mg、55 %)を得た。
1H NMR (500 MHz, MeOD): σ = 7.76-7.75 (d, 2H, J = 7.4 Hz, 2×CH), 7.65-7.62 (t, 2H, J = 8.8 Hz, 2×CH), 7.36-7.34 (t, 2H, J = 7.4 Hz, 2×CH), 7.29-7.26 (t, 2H, J = 7.4 Hz, 2×CH), 4.34-4.29 (m, 2H, CH2), 4.20-4.13 (m, 2H, 2×CH), 3.20 (m, 2H, CH2), 2.93-2.90 (dt, 2H, J = 8.8, 5.0 Hz, CH2), 1.87 (m, 1H, CH2), 1.68-1.60 (m, 3H, 2×CH2), 1.00-0.96 (dt, 2H, J = 8.9, 4.9 Hz, CH2), 0 ppm (s, 9H, 3×CH3)
13C NMR (125 MHz, MeOD):σ = 0, 13.6, 28.9, 31.9, 43.5, 51.0, 53.2, 57.0, 122.9, 128.0, 128.3, 130.1, 136.7, 139.4, 144.6, 147.3, 160.7, 177.6 ppm
HRMS(ESI-TOF): m/z: calculated for C26H36O6N4NaSSi: 583.20170, found: 583.20126 [M+Na]+
3-2 ～Arg～（Alloc体の合成）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000019
・Alloc-Arg-OH
　Arginine(5 g, 29 mmol)を水(50 ml)に溶解して、この溶液に水酸化ナトリウム(3 g, 2.6 eq)を加えた。0℃にて攪拌しながら、Allyl chloroformate(3.0 ml, 1.0 eq)を滴下した。終夜攪拌した後、1N HClを用いて中性にして溶媒を濃縮した。残渣を濾過して冷水で洗浄し、Alloc-Arg-OH（7.7 g、91 %)を得た。※Peter Wipf and Joey-Lee Methot / Org. Lett. 2 (2000) 26
・Alloc-Arg(SES)-OH
　Alloc-Arg-OH(2 g, 6.9 mmol)を80%アセトン（アセトン48 ml, 4N NaOHaq 12 ml）に溶解し、0℃にて攪拌しながら、2-(Trimethylsilyl)ethanesulfonyl chloride（2.5 ml, 2.0 eq）のアセトン溶液12.5mlを滴下した。6時間後、溶媒を減圧留去して残渣に水を加え、ジエチルエーテルで3回洗浄した。5%クエン酸水溶液で酸性にし、AcOEtで2回抽出した。有機層を合わせ飽和食塩水で洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥した。AcOEtを減圧留去し、Alloc-Arg(SES)-OH（1.7 g、73 %）を得た。
1H NMR (600 MHz, MeOD): σ = 5.91-5.85 (m, 1H, CH), 5.28-5.25 (d, 1H, J = 17.1 Hz, CH2), 5.14-5.12 (d, 1H, J = 10.4 Hz, CH2), 4.50-4.49 (d, 2H, J = 4.8 Hz, CH2), 4.11-4.09 (dd, 1H, J = 4.6, 3.8 Hz, CH), 3.16 (m, 2H, CH2), 2.91-2.84 (m, 2H, CH2), 1.84 (m, 1H, CH2), 1.65-1.58 (m, 3H, 2×CH2), 1.00-0.92 (dt, 2H, J = 10.3, 3.6 Hz, CH2), 0 ppm (s, 9H, 3×CH3)
13C NMR (150 MHz, MeOD):σ = 0, 13.5, 32.0, 45.8, 51.0, 53.2, 68.6, 119.6, 136.3 ppm
HRMS(ESI-TOF): m/z: calculated for C15H30O6N4NaSSi: 445.15475, found: 445.15496 [M+Na]+
※参考：Y. Konda et al. / Tetrahedron 57 (2001) 4311　＜Z-Arg(Mbs)-OH合成＞
・H-Arg(SES)-OH
　Alloc-Arg(SES)-OH(500 mg, 1.2 mmol)をMeOH(15 ml)に溶解した。50℃にて攪拌しながら、Tetrakis(triphenylphosphine)palladium(0), Pd(PPh3)4(65 mg, 5 mol%)、およびdimethylbarbituric acid(370 mg, 2.0 eq)を加えた。6時間攪拌した後に溶媒を減圧留去した。ジエチルエーテルで3回洗浄後、飽和炭酸ナトリウム水溶液を用いて中性にした。溶媒を減圧留去し、次のFmoc化反応に供した。
※参考：H. Tsukamoto, T. Suzuki, Y. Kondo / Synlett 20 (2007) 3131 ＜Allyl系保護基の脱保護＞
・Fmoc-Arg(SES)-OH
　H-Arg(SES)-OHをDMF(10 ml)に溶解した。炭酸ナトリウム(190 mg, 2.5 eq)の水溶液（3 ml）を加え、0℃にて攪拌しながら、Fmoc-OSu(600 mg, 1.5 eq)を加えた。室温にて終夜攪拌した後に溶媒を減圧留去した。残渣に水を加えてジエチルエーテルで洗浄した。5%クエン酸水溶液で酸性にし、AcOEtで2回抽出した。有機層を合わせ飽和食塩水で洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥した。AcOEtを減圧留去し、フラッシュカラムクロマトグラフィー(CHCl3 : MeOH = ∞ : 0 → 20 : 1)にて精製し、Fmoc-Arg(SES)-OH （400m g、70 %)を得た。
3-3 ～Asn～（TMSEtNH2の合成から着手）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000020
・TMSEtNPhth
　Phthalimide(2.8 g, 1.2 eq)と炭酸セシウム(6.7 g, 1.2 eq)をDMF(150 ml)に溶解して1時間攪拌した。(2-Bromoethyl)trimethylsilane(2.8 ml, 18 mmol)を滴下して85℃にて8時間攪拌した。溶媒を減圧留去して残渣にジエチルエーテルを加え、濾過した後に溶媒を減圧留去した。フラッシュカラムクロマトグラフィー(Hexane : EtOAc = 8 : 1)にて精製し、TMSEtNPhth（2 g、49 %)を得た
※参考：Lee et al. / J. Org. Chem. 61 (1996) 10
・TMSEtNH2・HCl
　TMSEtNPhthをconc. HClに溶解し、110℃にて3日間激しく攪拌した。溶媒を減圧留去して残渣に水を加え、ジエチルエーテルで2回洗浄した。溶媒を減圧留去してメタノール/ジエチルエーテルで再結晶させてTMSEtNH2・HCl（2 g、86 %)を得た。
※参考：DANZIN et al. / Bioorganic Chemistry 24 (1996) 178 ＜塩酸によるPhthHの脱保護＞
・Z-Asn(EtTMS)-OBn
　Z-Asp-OBn(7 g, 3.0 eq)をCH2Cl2(120 ml)に溶解し、0℃にて攪拌しながらDCC(4.4 g, 3.3 eq)、およびDMAP(480 mg, 0.6 eq)を加え、TMSEtNH2・HCl(1 g, 6.5 mmol)とDIEA(1.1 ml, 1.0 eq)のCH2Cl2溶液(50 ml)を滴下した。室温にて5時間攪拌した後、溶媒を減圧留去した。残渣にジエチルエーテルを加えてウレアをろ去し、ろ液を減圧留去した。フラッシュカラムクロマトグラフィー(Hexane : EtOAc = 4 : 1)にて精製し、Z-Asn(EtTMS)-OBn（3.2 g、89 %)を得た。
1H NMR (600 MHz, CDCl3): σ = 7.47-7.29 (m, 10H, 10×CH), 6.07-6.06 (d, 1H, J = 7.8 Hz, NH), 5.38-5.21 (t, 1H, J = 4.2 Hz, NH), 5.19-5.12 (m, 2H, CH2), 5.10 (s, 2H, CH2), 4.59-4.58 (t, 1H, J = 3.8 Hz, CH), 3.23-3.16 (dt, 2H, J = 8.8, 5.1 Hz, CH2), 2.89-2.86 (dd, 1H, J = 15.8, 4.0 Hz, CH2), 2.68-2.66 (dd, 1H, J= 15.4, 3.3 Hz, CH2), 0.72-0.69 (t, 2H, J = 8.7 Hz, CH2), 0 ppm (s, 9H, 3×CH3)
13C NMR (150 MHz, CDCl3):σ = 0, 19.4, 37.8, 39.5, 52.7, 68.6, 69.1, 119.2, 124,4, 129.9, 130.0,  130.5, 130.6, 132.4, 137.2, 170.8, 172.6 ppm
HRMS(ESI-TOF): m/z: calculated for C24H32O5N2NaSi: 479.19727, found: 479.19789 [M+Na]+
・H-Asn(EtTMS)-OH
　Z-Ans(EtTMS)-OBn(2 g, 4.4 mmol)をEtOAc(20 ml)とMeOH(20 ml)に溶解し、10%Pd-C(1 g, 50 wt%)を加えて接触還元した。触媒をろ去した後にろ液を減圧留去し、そのまま次のFmoc化反応に供した。
・Fmoc-Asn(EtTMS)-OH
　H-Asn(EtTMS)-OHをDMF(30 ml)に溶解して炭酸ナトリウム(700 mg, 1.5 eq)の水溶液（10 ml）を加え、0℃にて攪拌しながらFmoc-OSu(2.2 g, 1.5 eq)を加えた。室温にて終夜攪拌した後、溶媒を減圧留去した。残渣に水を加えてジエチルエーテルで洗浄した。5%クエン酸水溶液で酸性にし、AcOEtで2回抽出した。有機層を合わせ飽和食塩水で洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥した。AcOEtを減圧留去した後、フラッシュカラムクロマトグラフィー(CHCl3 : MeOH = ∞ : 0 → 25 : 1)にて精製し、Fmoc-Asn(EtTMS)-OH（1.1 g、55 %)を得た。
1H NMR (500 MHz, MeOD): σ = 7.77-7.76 (d, 2H, J = 7.5 Hz, 2×CH), 7.64-7.63 (d, 2H, J = 7.4 Hz, 2×CH), 7.38-7.35 (t, 2H, J = 7.4 Hz, 2×CH), 7.30-7.27 (t, 2H, J = 7.3 Hz, 2×CH), 4.58 (m, 1H, CH), 4.30 (m, 2H, CH2), 4.20 (m, 1H, CH), 3.23-3.20 (t, 2H, J = 8.5 Hz, CH2), 2.74 (m, 1H, CH2), 2.69 (m, 1H, CH2), 0.82-0.79 (t, 2H, J = 8.5 Hz, CH2), 0 ppm (s, 9H, 3×CH3)
13C NMR (125 MHz, MeOD):σ = 0, 19.9, 38.5, 40.4, 50.4, 54.0, 70.4, 122.6, 127.9, 129.8, 130.1, 144.1, 146.8, 159.8, 173.3, 176.8 ppm
HRMS(ESI-TOF): m/z: calculated for C24H30O5N2NaSi: 477.18162, found: 477.18233 [M+Na]+
3-4 ～Asp～
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000021
・Z-Asp(EtTMS)-OBn
　Z-Asp-OH(5 g, 14 mmol)をCH2Cl2(140 ml)に溶解した。0℃にて攪拌しながら、DCC(3.2 g, 1.1 eq)、およびDMAP(340 mg, 0.2 eq)を加え、2-(Trimethylsilyl)ethanol(6.0 ml, 3.0 eq) を滴下した。室温にて終夜攪拌した後、溶媒を減圧留去した。残渣にジエチルエーテルを加えてウレアをろ去した後、溶媒を減圧留去した。フラッシュカラムクロマトグラフィー(Hexane : EtOAc = 8 : 1)にて精製し、Z-Asp(EtTMS)-OBn（5.1 g、81 %)を得た。
1H NMR (600 MHz, CDCl3): σ = 7.32-7.28 (m, 10H, 2×CH), 5.84-5.83 (d, 1H, J = 8.2 Hz, NH), 5.19-5.15 (m, 2H, CH2), 5.13 (s, 2H, CH2), 4.66-4.64 (t, 1H, J = 4.0 Hz, CH), 4.10-4.07 (t, 2H, J = 8.6 Hz, CH2), 3.01-2.97 (dd, 1H, J = 12.9, 4.1 Hz, CH2), 2.82-2.78 (dd, 1H, J = 10.6, 4.2 Hz, CH2), 0.86-0.84 (dt, J = 6.7, 3.3 Hz, CH2), 0 ppm (s, 9H, 3×CH3)
13C NMR (150 MHz, CDCl3):σ = 0, 18.6, 37.9, 51.9, 64.8, 68.4, 68.9, 129.5, 129.6, 129.8, 130.0, 136.7, 137.6, 157.4, 172.0, 172.2 ppm
HRMS(ESI-TOF): m/z: calculated for C24H31O6NNaSi: 480.18129, found: 480.18137 [M+Na]+
・H-Asp(EtTMS)-OH
　Z-Asp(EtTMS)-OBn(3 g, 6.5 mmol)をEtOAc(30 ml)とMeOH(30 ml)に溶解し、10%Pd-C(900 mg, 30 wt%)を加えて接触還元した。触媒をろ去した後に溶媒を減圧留去し、そのまま次のFmoc化反応に供した。
・Fmoc-Asp(EtTMS)-OH
　H-Asp(EtTMS)-OHをDMF(60 ml)に溶解した。炭酸ナトリウム(1 g, 1.5 eq)の水溶液（20 ml）を加えて0℃にて攪拌しながら、Fmoc-OSu(2.8 g, 1.5 eq)を加えた。室温にて4時間攪拌した後に溶媒を減圧留去した。残渣に水を加えてジエチルエーテルで洗浄した。5%クエン酸水溶液で酸性にし、AcOEtで2回抽出した。有機層を合わせて飽和食塩水で洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥した。AcOEtを減圧留去した後、フラッシュカラムクロマトグラフィー(CHCl3 : MeOH = ∞ : 0 → 25 : 1)にて精製し、Fmoc-Asp(EtTMS)-OH（1.5 g、60 %)を得た。
3-5 ～Cys～
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000022
・Fmoc-Cys(Trt)-OAllyl
　Fmoc-Cys(Trt)-OH(7 g, 12 mmol)をDMF(75 ml)に溶解した。0℃にて攪拌しながらDIEA(4 ml, 2.0 eq)を加え、AllylBr(4 ml, 4 eq)を滴下した。終夜攪拌した後、EtOAcを加えて水、飽和食塩水で洗浄した。硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒を減圧留去してそのまま脱Trt化反応に供した。
・Fmoc-Cys-Oallyl
　Fmoc-Cys(Trt)-OAllylをCH2Cl2 / TFA(5 ml : 45 ml)に溶解した。Triisoprpylsilane(10 ml, 4 eq)を加えて室温にて3時間攪拌した。溶媒を減圧留去した後、フラッシュカラムクロマトグラフィー（Hexane : EtOAc = 3 : 1）にて精製し、Fmoc-Cys-Oallyl（4.24 g、96 %)を得た。
※参考：Chi-Huey Wong et al. / Chem. Eur. J. 14 (2008) 3620
・FmocCys(EtTMS)-OAllyl
　Fmoc-Cys-Oallyl(100 mg, 260 umol)と炭酸セシウム(170 mg, 2.0 eq)をDMF(3 ml)に溶解した。0℃にて攪拌しながら(2-Bromoethyl)trimethylsilane(100 ul, 2.0 eq)を滴下した。8時間攪拌した後、溶媒を減圧留去した。残渣にEtOAcを加えて水、飽和食塩水で洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去した後、フラッシュカラムクロマトグラフィー(Hexane : EtOAc = 6 : 1)にて精製し、FmocCys(EtTMS)-OAllyl（28 mg、22 %)を得た。
1H NMR (600 MHz, CDCl3): σ = 7.76-7.75 (d, 2H, J = 7.5 Hz, 2×CH), 7.60-7.59 (d, 2H, J = 7.1 Hz, 2×CH), 7.40-7.38 (t, 2H, J = 7.4 Hz, 2×CH), 7.31-7.29 (t, 2H, J = 7.4 Hz, 2×CH), 5.95-5.88 (m, 1H, CH), 5.67-5.66 (d, 1H, J = 7.6 Hz, NH), 5.37-5.34 (d, 1H, J = 17.1 Hz, CH2), 5.27-5.26 (d, 1H, J = 10.3 Hz, CH2), 4.67-4.60 (m, 3H, CH+CH2), 4.42-4.34 (m, 2H, CH2), 4.24-4.22 (t, 1H, J = 7.1 Hz, CH2), 3.03 (m, 2H, CH2), 2.59-2.56 (t, 2H, J = 8.5 Hz, CH2), 0.85-0.83 (t, 2H, J = 8.7 Hz, CH2), 0 ppm (s, 9H, 3×CH3)
13C NMR (150 MHz, CDCl3):σ = 0, 19.0, 30.4, 36.1, 48.9, 55.5, 68.1, 69.1, 120.8, 121.8, 126.9, 128.9, 129.5, 129.6, 133.1, 143.1, 145.6, 157.5, 172.4 ppm
HRMS(ESI-TOF): m/z: calculated for C26H33O4NNaSi: 506.17918, found: 506.17870 [M+Na]+
※参考：Sarah Bregant and Alethea B. Tabor / J. Org. Chem. 70 (2005) 7 2433 ＜SH基の保護＞
・Fmoc-Cys(EtTMS)-OH
　Fmoc-Cys(EtTMS)-OAllyl(20 mg, 41 umol)をMeOH(2 ml)に溶解した。室温にて攪拌しながら、Tetrakis(triphenylphosphine)palladium(0), Pd(PPh3)4 (2.5 mg, 5 mol%)、およびdimethylbarbituric acid(13 mg, 2.0 eq)を加えた。4時間攪拌した後、溶媒を減圧留去した。残渣に水を加え5%クエン酸水溶液で酸性にし、EtOAcで抽出した。飽和食塩水で洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去した後、フラッシュカラムクロマトグラフィー(CHCl3 : MeOH = ∞ : 0 → 20 : 1)にて精製し、Fmoc-Cys(EtTMS)-OH （16 mg、89 %)を得た。
1H NMR (500 MHz, MeOD): σ = 7.78-7.77 (d, 2H, J = 7.5 Hz, 2×CH), 7.68-7.66 (d, 2H, J = 7.3 Hz, 2×CH), 7.39-7.37 (t, 2H, J = 7.4 Hz, 2×CH), 7.31-7.28 (t, 2H, J = 7.4 Hz, 2×CH), 4.33-4.31 (m, 3H, CH+CH2), 4.23-4.21 (t, 1H, J = 6.9 Hz, CH), 3.03-3.02 (dd, 1H, J = 8.2, 4.3 Hz, CH2), 2.87-2.84 (dd, 1H, J= 8.3, 5.1 Hz, CH2), 2.64-2.60 (t, 2H, J = 8.5 Hz, CH2), 0.85-0.82 (t, 2H, J = 6.6 Hz, CH2), 0 ppm (s, 9H, 3×CH3)
13C NMR (125 MHz, MeOD):σ = 0, 16.7, 27.4, 33.2, 47.6, 54.0, 66.8, 100.0, 119.5, 120.2, 124.6, 126.8, 127.4, 130.9, 141.2, 143.8, 157.1, 173.1 ppm
HRMS(ESI-TOF): m/z: calculated for C23H29O4NNaSSi: 466.14788, found: 466.14842 [M+Na]+
3-6 ～Gln～
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000023
・Z-Gln(EtTMS)-OBn
　Z-Glu-OBn(2.2 g, 3.0 eq)をCH2Cl2(50 ml)に溶解した。0℃にて攪拌しながらDCC(1.3 g, 3.3 eq)、およびDMAP(150 mg, 0.6 eq)を加え、TMSEtNH2・HCl(300 mg, 2 mmol)とDIEA(340 ul, 1.0 eq)のCH2Cl2溶液(20 ml)を滴下した。室温にて5時間攪拌した後、溶媒を減圧留去した。残渣にジエチルエーテルを加えてウレアをろ去し、ろ液を減圧留去した。フラッシュカラムクロマトグラフィー(Toluene : EtOAc = 4 : 1)にて精製し、Z-Gln(EtTMS)-OBn（570 mg、63 %)を得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3): σ = 7.33-7.30 (m, 10H, 10×CH), 5.73-5.71 (d, 1H, J = 7.6 Hz, NH), 5.64 (s, 1H, NH), 5.16-5.15 (d, 2H, J = 8.5 Hz, CH2), 5.09 (s, 2H, CH2), 4.37 (m, 1H, CH), 3.23-3.20 (dt, 2H, J = 8.6, 2.7 Hz, CH2), 2.19-2.15 (m, 3H, CH+CH2), 1.98 (m, 1H, CH2), 0.76-0.72 (dt, 2H, J = 8.2, 3.0 Hz, CH2), 0 ppm (s, 9H, 3×CH3)
13C NMR (125 MHz, CDCl3):σ = 0, 19.4, 30.2, 35.6, 37.7, 55.6, 68.9, 70.0, 130.1, 136.9, 137.9, 158.0, 172.9, 173.5 ppm
HRMS(ESI-TOF): m/z: calculated for C25H34O5N2NaSi: 493.21292, found: 493.21369 [M+Na]+
・H-Gln(EtTMS)-OH
　Z-Gln(EtTMS)-OBn(800 mg, 1.7 mmol)をEtOAc(8 ml)とMeOH(8 ml)に溶解し、10%Pd-C(400 mg, 50 wt%)を加えて接触還元した。触媒をろ去して溶媒を減圧留去し、そのまま次のFmoc化反応に供した。
・Fmoc-Gln(EtTMS)-OH
　H-Gln(EtTMS)-OHをDMF(15 ml)に溶解した。炭酸ナトリウム(270 mg, 1.5 eq)の水溶液（5 ml）を加えて0℃にて攪拌しながらFmoc-OSu(890 mg, 1.5 eq)を加えた。室温にて終夜攪拌した後に溶媒を減圧留去した。残渣に水を加えてジエチルエーテルで洗浄した。5%クエン酸水溶液で酸性にし、AcOEtで2回抽出した。有機層を合わせ飽和食塩水で洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥した。AcOEtを減圧留去した後、フラッシュカラムクロマトグラフィー(CHCl3 : MeOH = ∞ : 0 → 20 : 1)にて精製し、Fmoc-Gln(EtTMS)-OH（780 mg、98 %)を得た。
1H NMR (500 M Hz, MeOD): σ = 7.76-7.75 (d, 2H, J = 7.5 Hz, 2×CH), 7.67-7.63 (t, 2H, J = 8.6 Hz, 2×CH), 7.37-7.34 (t, 2H, J = 7.5 Hz, 2×CH), 7.29-7.27 (t, 2H, J = 7.4, 2×CH), 4.32 (m, 2H, CH+CH2), 4.19 (m, 1H, CH2), 4.18 (m, 1H, CH), 3.22-3.18 (dd, 2H, J = 6.2, 4.3 Hz, CH2), 2.30-2.28 (t, 2H, J = 3.7 Hz, CH2), 2.20 (m, 1H, CH2), 1.98 (m, 1H, CH2), 0.82-0.78 (dt, 2H, J = 8.5, 2.5 Hz, CH2), 0 ppm (s, 9H, 3×CH3)
13C NMR (125 MHz,MeOD ):σ = 0, 19.8, 30.3, 35.1, 38.5, 50.6, 56.5, 75.1, 122.5, 127.8, 129.7, 130.7, 144.0, 146.7, 160.0, 175.8, 176.9 ppm
HRMS(ESI-TOF): m/z: calculated for C25H32O5N2NaSi: 491.19727, found: 491.19845 [M+Na]+
3-7 ～Glu～
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000024
・Z-Glu(EtTMS)-OBn
　Z-Glu-OH(3 g, 8 mmol)をCH2Cl2(140 ml)に溶解した。0℃にて攪拌しながらDCC(1.8 g, 1.1 eq)およびDMAP(200 mg, 0.2 eq)を加えて2-(Trimethylsilyl)ethanol(3.4 ml, 3.0 eq) を滴下した。室温にて終夜攪拌した後、溶媒を減圧留去した。残渣にジエチルエーテルを加えてウレアをろ去し、溶媒を減圧留去した。フラッシュカラムクロマトグラフィー(Hexane : EtOAc = 8 : 1)にて精製し、Z-Glu(EtTMS)-OBn（3.5 g、92 %)を得た。　　　　　　
1H NMR (600 MHz, CDCl3): σ = 7.31-7.23 (m, 10H, 10×CH), 5.43-5.42 (d, 1H, J = 7.3 Hz, NH), 5.15 (s, 2H, CH2), 5.07 (s, 2H, CH2), 4.43-4.42 (t, 1H, J = 4.7 Hz, CH), 4.13-4.10 (t, 2H, J = 8.4 Hz, CH2), 2.37-2.26 (m, 2H, CH2), 2.19-2.14 (m, 1H, CH2), 1.99-1.95 (m, 1H, CH2), 0.95-0.92 (m, 2H, CH2), 0 ppm (s, 9H, 3×CH3)
13C NMR (150 MHz, CDCl3):σ = 0, 18.7, 29.1, 31.9, 55.1, 64.5, 68.9, 129.6, 129.7, 129.8, 130.0, 130.1, 136.7, 137.7, 157.5, 173.2, 174.3 ppm
HRMS(ESI-TOF): m/z: calculated for C25H33O6NNaSi: 494.19694, found: 494.19718 [M+Na]+
・H-Glu(EtTMS)-OH
　Z-Glu(EtTMS)-OBn(3.3 g, 7 mmol)をEtOAc(35 ml)とMeOH(35 ml)に溶解し、10%Pd-C(1 g, 30 wt%)を加えて接触還元した。触媒をろ去した後に溶媒を減圧留去し、そのまま次のFmoc化反応へ供した。
・Fmoc-Glu(EtTMS)-OH
　H-Glu(EtTMS)-OHをDMF(60 ml)に溶解した。炭酸ナトリウム(1.1 g, 1.5 eq)の水溶液（20 ml）を加えて0℃にて攪拌しながらFmoc-OSu(3.9 g, 1.5 eq)を加えた。室温にて4時間攪拌した後、溶媒を減圧留去した。残渣に水を加えてジエチルエーテルで洗浄した。5%クエン酸水溶液で酸性にし、AcOEtで2回抽出した。有機層を合わせて飽和食塩水で洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥した。AcOEtを減圧留去した後、フラッシュカラムクロマトグラフィー(CHCl3 : MeOH = ∞ : 0 → 20 : 1)にて精製し、Fmoc-Glu(EtTMS)-OH（1 g、30 %)を得た。
3-8 ～Lys～
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000025
・Z-Lys(Boc)-OBn
　Z-Lys(Boc)-OH(5 g, 13 mmol)と炭酸セシウム(4.2 g, 1.0 eq)をDMF(130 ml)に溶解した。0℃にて攪拌しながらBnBr(3 ml, 2.0 eq)を滴下した。室温にて2時間激しく攪拌した後、溶媒を減圧留去した。残渣にEtOAcを加えて水、飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去した後、フラッシュカラムクロマトグラフィー(Hexane : EtOAc = 1 : 1)にて精製し、Z-Lys(Boc)-OBn（5.8 g、97 %)を得た。
・Z-Lys-OBn
　Z-Lys(Boc)-OBn(2.6 g, 5.5 mmol)をCH2Cl2(50 ml)に溶解した。室温にて攪拌しながらTFA(10 ml)を加えた。2時間攪拌した後に溶媒を減圧留去し、得られたZ-Lys-OBnをそのまま次のSES化へ供した。
・Z-Lys(SES)-OBn
　Z-Lys(SES)-OBn(930 mg, 2.5 mmol)と炭酸ナトリウム(530 mg, 2.0 eq)をTHFに溶解した。0℃にて攪拌しながら2-(Trimethylsilyl)ethanesulfonyl chloride(1.0 ml, 2.0 eq)を滴下した。6時間攪拌した後、溶媒を減圧留去した。残渣にEtOAcを加えて水、飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去した後、フラッシュカラムクロマトグラフィー(Hexane : EtOAc = 8 : 1)にて精製し、Z-Lys(SES)-OBn（400 mg、30 %)を得た。
1H NMR (600 MHz, CDCl3): σ = 7.30-7.26 (m, 10H, 10×CH), 5.30-5.28 (d, 1H, J = 7.6 Hz, NH), 5.14-5.03 (m, 4H, 2×CH2), 4.37-4.36 (dd, 1H, J = 6.6, 4.7 Hz, CH), 4.15-4.08 (t, 1H, J = 5.5 Hz, NH), 2.99-2.98 (m, 2H, CH2), 2.86-2.83 (dt, 2H, J = 8.4, 4.5 Hz, CH2), 1.84-1.76 (m, 1H, CH2), 1.64-1.62 (m, 1H, CH2), 1.46-1.45 (m, 2H, CH2), 1.35-1.34 (m, 1H, CH2), 1.28-1.26 (m, 1H, CH2), 0.96-0.93 (dt, 2H, J= 9.7, 4.5 Hz, CH2), 0 ppm (s, 9H, 3×CH3)
13C NMR (150 MHz, CDCl3):σ = 0, 12.6, 24.0, 31.7, 34.3, 45.0, 50.8, 55.5, 69.1, 69.3, 130.1, 130.2, 130.4, 130.5, 130.6, 130.7, 137.2, 138.1 ppm
HRMS(ESI-TOF): m/z: calculated for C26H38O6N2NaNSSi: 557.21121, found: 557.20986 [M+Na]+
・H-Lys(SES)-OH
　Z-Lys(SES)-OBn(350 mg, 650 umol)をEtOAc(3 ml)とMeOH(3 ml)に溶解し、10%Pd-C(110 mg, 30 wt%)を加えて接触還元した。触媒をろ去した後に溶媒を減圧留去し、得られたH-Lys(SES)-OHをそのまま次のFmoc化反応へ供した。
・Fmoc-Lys(SES)-OH
　H-Glu(EtTMS)-OHをDMF(10 ml)に溶解した。炭酸ナトリウム(110 mg, 1.5 eq)の水溶液（3 ml）を加えて0℃にて攪拌しながらFmoc-OSu(500 mg, 1.5 eq)を加えた。室温にて終夜攪拌した後、溶媒を減圧留去した。残渣に水を加えて5%クエン酸水溶液で酸性にし、AcOEtで2回抽出した。有機層を合わせ飽和食塩水で洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥した。AcOEtを減圧留去した後、フラッシュカラムクロマトグラフィー(CHCl3 : MeOH = ∞ : 0 → 25 : 1)にて精製し、Fmoc-Lys(SES)-OH（15 mg、29 %)を得た。
1H NMR (500 MHz, MeOD): σ = 7.74-7.73 (d, 2H, J = 7.4 Hz, 2×CH), 7.63-7.60 (t, 2H, J = 7.8, 2×CH), 7.34-7.31 (t, 2H, J = 7.4 Hz, 2×CH), 7.27-7.24 (t, 2H, J = 7.5 Hz, 2×CH), 4.30-4.29 (dd, 2H, J = 6.0, 1.4 Hz, CH2), 4.18-4.16 (t, 1H, J = 7.0 Hz, CH), 4.09-4.08 (dd, 1H, J = 4.9, 4.8 Hz, CH), 2.99-2.96 (t, 2H, J = 6.9 Hz, CH2), 2.90-2.86 (dt, 2H, J = 9.0, 4.2 Hz, CH2), 1.80 (m, 1H, CH2), 1.64 (m, 1H, CH2), 1.52-1.49 (m, 2H, CH2), 1.43-1.41 (m, 2H, CH2), 0.93-0.90 (dt, 2H, J = 9.3, 4.3 Hz, CH2), o ppm (s, 9H, 3×CH3)
13C NMR (125 MHz, MeOD):σ = 0, 13.5, 26.1, 32.9, 34.3, 45.8, 50.5, 51.2, 57.3, 70.0, 122.9, 128.3, 130.2, 130.8, 144.6, 147.4 ppm
HRMS(ESI-TOF): m/z: calculated for C26H36O6N2NaSSi: 555.19556, found: 555.19509 [M+Na]+
3-9 ～Ser～
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000026
・Fmoc-Ser(OTBS)-OH
　Fmoc-Ser-OH(500 mg, 1.5 mmol)を窒素置換した後にDMF(20 ml)に溶解した。0℃にて攪拌しながら2,6-luidine(330 ul, 3.0 eq)およびTBSOTf(500 ul, 1,5 eq)を加えた。室温にて終夜攪拌した後、溶媒を減圧留去した。残渣に水を加えて5%クエン酸水溶液で酸性にし、AcOEtで2回抽出した。有機層を合わせて飽和食塩水で洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥した。AcOEtを減圧留去した後、フラッシュカラムクロマトグラフィー(CHCl3 : MeOH = ∞ : 0 → 20 : 1)にて精製し、Fmoc-Ser(OTBS)-OH （200 mg、31 %)を得た。
3-10 ～Ser～
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000027
・Z-Ser-OBn
　Z-Ser-OH(10 g, 42 mmol)と炭酸セシウム(14 g, 1.0 eq)をDMF(200 ml)に溶解した。0℃にて攪拌しながらBnBr(15 ml, 3.0 eq)を滴下した。室温にて2時間激しく攪拌した後、溶媒を減圧留去した。残渣にEtOAcを加えて水、飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去した後、フラッシュカラムクロマトグラフィー(Hexane : EtOAc = 2 : 1)にて精製し、Z-Ser-OBn（12 g、87 %)を得た。
・Z-Ser(OTBS)-OBn
　Z-Ser-OBn(2 g, 6 mmol)を窒素置換した後、CH2Cl2(60 ml)に溶解した。0℃にて攪拌しながら2,6-luidine(2.0 ml, 3.0 eq)、TBSOTf(1.7 ml, 1,2 eq)を加えた。室温にて終夜攪拌した後、溶媒を減圧留去した。残渣に水を加えて5%クエン酸水溶液で酸性にし、AcOEtで2回抽出した。有機層を合わせて飽和食塩水で洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥した。AcOEtを減圧留去した後、フラッシュカラムクロマトグラフィー(Hexane : EtOAc = 20 : 1)にて精製し、Z-Ser(OTBS)-OBn（2.6 g 、97 %)を得た。
・H-Ser(OTBS)-OH
　Z-Ser(OTBS)-OBn(2.5 g, 5.5 mmol)をEtOAc(25 ml)とMeOH(25 ml)に溶解し、10%Pd-C(750 mg, 30 wt%)を加えて接触還元した。触媒をろ去して溶媒を減圧留去し、得られたH-Ser(OTBS)-OHをそのまま次のFmoc化反応へ供した。
・Fmoc-Ser(OTBS)-OH
　H-Ser(OTBS)-OHをDMF(50 ml)に溶解した。炭酸ナトリウム(870 mg, 1.5 eq)の水溶液（10 ml）を加えて0℃にて攪拌しながらFmoc-OSu(2.8 g, 1.5 eq)を加えた。室温にて終夜攪拌した後、溶媒を減圧留去した。残渣に水を加えて5%クエン酸水溶液で酸性にし、AcOEtで2回抽出した。有機層を合わせて飽和食塩水で洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥した。AcOEtを減圧留去した後、フラッシュカラムクロマトグラフィー(CHCl3 : MeOH = ∞ : 0 → 20 : 1)にて精製し、Fmoc-Ser(OTBS)-OH（1 g、42 %)を得た。
3-11 ～Thr～
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000028
・Fmoc-Thr(OTBS)-OH
　Fmoc-Thr-OH(2 g, 5.8 mmol)を窒素置換した後、DMF(20 ml)に溶解した。0℃にて攪拌しながら2,6-luidine(1.4 ml, 3.0 eq)およびTBSOTf(2 ml, 1,5 eq)を加えた。室温にて終夜攪拌した後、溶媒を減圧留去した。残渣に水を加えて5%クエン酸水溶液で酸性にし、AcOEtで2回抽出した。有機層を合わせ飽和食塩水で洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥した。AcOEtを減圧留去した後、フラッシュカラムクロマトグラフィー(CHCl3 : MeOH = ∞ : 0 → 20 : 1)にて精製し、Fmoc-Thr(OTBS)-OH（1 g、39 %)を得た。
3-12 ～Tyr～
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000029
・Z-Tyr-OBn
　Z-Tyr-OH(4.6 g, 15 mmol)と炭酸セシウム(4.8 g, 1.0 eq)をDMF(200 ml)に溶解した。0℃にて攪拌しながらBnBr(4.5 ml, 3.0 eq)を滴下した。室温にて終夜攪拌した後、溶媒を減圧留去した。残渣にEtOAcを加えて水、飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、フラッシュカラムクロマトグラフィー(Hexane : EtOAc = 2 : 1)にて精製し、Z-Tyr-OBn（4.4 g、75 %)を得た。
・Z-Tyr(OTBS)-OBn
　Z-Tyr-OBn(4.2 g, 10 mmol)を窒素置換した後、CH2Cl2(100 ml)に溶解した。0℃にて攪拌しながら2,6-luidine(2.4 ml, 2.0 eq)およびTBSOTf(3.6 ml, 1,5 eq)を加えた。室温にて3時間攪拌した後、溶媒を減圧留去した。残渣に水を加えて5%クエン酸水溶液で酸性にし、AcOEtで2回抽出した。有機層を合わせて飽和食塩水で洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥した。AcOEtを減圧留去した後、フラッシュカラムクロマトグラフィー(Hexane : EtOAc = 10 : 1)にて精製し、Z-Tyr(OTBS)-OBn（5 g、93 %)を得た。
・H-Ser(OTBS)-OH
　Z-Tyr(OTBS)-OBn(3.8 g, 7.3 mmol)をEtOAc(35 ml)とMeOH(35 ml)に溶解し、10%Pd-C(1.1 g, 30 wt%)を加えて接触還元した。触媒をろ去した後に溶媒を減圧留去し、得られたH-Ser(OTBS)-OHをそのまま次のFmoc化反応へ供した。
・Fmoc-Ser(OTBS)-OH
　H-Ser(OTBS)-OHをDMF(70 ml)に溶解した。炭酸ナトリウム(1.2 g, 1.5 eq)の水溶液（30 ml）を加えて0℃にて攪拌しながら、Fmoc-OSu(3.6 g, 1.5 eq)を加えた。室温にて終夜攪拌した後、溶媒を減圧留去した。残渣に水を加えて5%クエン酸水溶液で酸性にし、AcOEtで2回抽出した。有機層を合わせて飽和食塩水で洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥した。AcOEtを減圧留去した後、フラッシュカラムクロマトグラフィー(CHCl3 : MeOH = ∞ : 0 → 20 : 1)にて精製し、Fmoc-Ser(OTBS)-OH（1.8 g、51 %)を得た。
実施例４
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000030
　既知化合物1(2.9 g, 4.91 mmol)をMeOH (100 ml)に溶かし、NaOMe (80 mg, 1.47 mmol)　を加え室温で4時間攪拌した。DOWEX　50W×8［H＋］を加えて反応を止めた後、ろ過、濃縮した。これをDMF (50 ml)に溶かし、t-Bu2Si(OTf)2(1.5 ml, 4.50 mmol)、2,6-lutidine (1.9 ml, 16.4 mmol)を加え、窒素置換後、室温で1時間撹拌した。その後、TBSOTf (3.8 ml, 16.4 mmol)、2,6-lutidine(953 μl, 8.18 mmol)を加え、室温で3時間撹拌した。有機層を1NHCl水溶液、飽和重曹水、ブラインで洗浄後、MgSO4で乾燥した。ろ過、濃縮後、フラッシュカラムクロマトグラフィーで精製し、2 (1.9 g, 3 steps 49%)を得た。
2: 1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ 7.80-7.23 (5H, Ph), 4.98 (1H, m, NH), 4.27 (1H, m, H9), 4.15 (1H, m, H9), 4.10 (1H, m, H7), 3.80-3.48 (3H, m, H4, H5, H8), 3.41 (3H, s, Me), 2.59 (1H, dd, J = 7.8, 1.8 Hz, H3), 1.91 (3H, s, Ac), 1.79 (1H, t, J = 7.8 Hz, H3), 1.05-0.88 (36H, m, t-Bu×4), 0.41-0.00 (12H, Me×4)
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000032
　2 (1.3 g, 1.66 mmol)をMeOH/CHCl3(100 ml)に溶かした後、2NKOHaq (50ml)を加え、室温で4時間撹拌した。分液ロートで水相を除いた後、1NHClaq、飽和重曹水、ブラインで洗浄後、MgSO4で乾燥した。ろ過、濃縮後、これをCH2Cl2に溶かした後、TMS ethanol (473 μl, 3.32 mmol)を加えた。さらにDCC (411 mg, 1.99 mmol)、DMAP (cat)を加えて室温で5時間撹拌した。有機層を飽和重曹水、ブラインで洗浄後、MgSO4で乾燥した。ろ過、濃縮後、フラッシュカラムクロマトグラフィーで精製し3 (1.23 g, 2 steps 85%)を得た。
3: 1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ 7.75-7.16 (5H, Ph), 5.34 (1H, m, NH), 4.21 (1H, d, J = 8.0 Hz, H9), 3.89 (1H, dd, J = 8.0, 1.8 Hz, H9), 3.80-3.68 (4H, m, H4, H5, H7, H8), 3.65 (2H, m, TMSEt), 2.71 (1H, dd, J = 7.8, 1.8 Hz, H3), 1.89 (3H, s, Ac), 1.79 (1H, t, J = 7.8 Hz, H3), 1.05-0.88 (36H, m, t-Bu×4), 0.89 (2H, m, TMSEt), 0.21-0.00 (15H, Me×5)
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000033
　既知化合物4(6.8 g, 15.6 mmol)をMeOH (200 ml)に溶かし、NaOMe (252 mg, 4.67 mmol)を加え室温で１時間攪拌した。DOWEX　50W×8［H＋］を加えて反応をとめた後、ろ過、濃縮した。これをDMF/THF (1: 1, 200 ml)に溶かし、t-Bu2Si(OTf)2(5.5 ml, 17.1 mmol)、2,6-lutidine (7.2 ml, 62.2 mmol)を加え窒素置換後、室温で3時間撹拌した。有機層を飽和重曹水、ブラインで洗浄後、MgSO4で乾燥した。ろ過、濃縮後、フラッシュカラムクロマトグラフィーで精製し、ジアステレオマー混合物を得た。これをTHFに溶かした後、NaH (6.2 g, 155.5 mmol)、Allylbromide (6.7 ml, 77.8mmol)、TBAI (cat)を加え、室温で3時間撹拌した。有機層を1NHCl水溶液、飽和重曹水、ブラインで洗浄後、MgSO4で乾燥した。ろ過、濃縮後、フラッシュカラムクロマトグラフィーで精製し、ジアステレオマー混合物5 (3.2 g, 3 steps 36%)を得た。ジアステレオマー混合物は分離できないため、そのまま次の反応に用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000034
　5(3.0 g, 5.26 mmol)をCH3CN：トルエン：水＝60 ml：40 ml：40 mlに溶かし、CAN (14.4 g, 26.3 mmol)を加え1時間攪拌した。酢酸エチルで希釈した後、有機層を水、飽和重曹水、ブラインで洗浄し、MgSO4で乾燥した。ろ過、濃縮後、粗生成物をCH2Cl2(100 ml)に溶かした後、0℃に冷却しCCl3CN (2.6 ml, 26.3 mmol)、DBU (154 μl, 1.05 mmol)を加え30分間攪拌した。これをそのまま濃縮しフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し、6 (2.3 g, 2 steps 83%)を得た。
6: 1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ 8.64 (1H, s, NH), 6.01 (1H, m), 5.67 (1H, d, J = 3.1 Hz, H1), 5.45-5.20 (2H, allyl×2), 4.51 (1H, d, J = 2.0 Hz, H4), 4.30 (2H, m, H6×2), 4.23 (2H, allyl×2), 4.05 (1H, dd, J = 10.1, 3.2 Hz, H2), 3.49 (1H, s, H5), 3.3 (1H, dd, J = 10.5, 2.4 Hz, H3), 1.05 (18H, m, t-Bu)
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000035
　合成したグリコシルドナー6(670 mg, 1.26 mmol)、グリコシルアクセプター7 (651 mg, 1.90 mmol)、MSAW300 (1 g)をCH2Cl2(40 ml)に溶かし、窒素雰囲気下0℃に冷却後、CH2Cl2に溶かしたTMSOTf (75 μl, 0.38 mmol)をゆっくりと加え1時間攪拌した。この溶液に飽和重曹水を加えて反応をとめた後、セライトろ過し、有機層をブラインで洗浄した。MgSO4で乾燥後、ろ過、濃縮してフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し、8 (541 mg, 60%: α only)を得た。
8: 1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ 7.40-7.21 (10H, Ph), 5.95 (1H, m, allyl), 5.67 (1H, d, NH), 5.40-5.19 (2H, allyl×2), 5.20 (2H, Bn), 5.17 (2H, Bn), 4.72 (1H, d, J = 2.1 Hz, H1), 4.53 (1H, s,H4), 4.47 (1H, m, Thr-α), 4.17 (2H, m, H6×2), 4.15 (2H, allyl×2), 3.75-3.07 (3H, m, H3, H5, H2), 1.05 (18H, m, t-Bu), 0.89 (3H, m, Thr-β)
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000036
　8(750 mg, 1.06 mmol)にpyridine (2.0 ml)、AcSH (4.0 ml)を加え、室温で20時間攪拌した。その後ポリエチレン容器へと移し、HF/pyridine (200 μl, 6.33 mmol)を加え室温で1時間撹拌した。有機層を飽和重曹水、ブラインで洗浄後、MgSO4で乾燥した。ろ過、濃縮後、フラッシュカラムクロマトグラフィーで精製し、9 (380 mg, 2 steps 61%)を得た。
9: 1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ 7.35-7.18 (10H, Ph), 5.95 (1H, m, allyl), 5.85 (1H, d, NH), 5.51 (1H, d, J = 2.1 Hz, H1), 5.39-5.15 (4H, allyl×2, Bn×4), 4.81 (1H, s, H4), 4.40 (1H, m, Thr-α), 4.49-4.19 (2H, allyl×2), 4.15 (2H, m, H6×2), 3.89-3.51 (3H, m, H3, H5, H2), 1.23 (3H, m, Thr-β)
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000037
　合成したシアル酸グリコシルドナー3(1.4 g, 1.66 mmol)、グリコシルアクセプター9(650 mg, 1.11 mmol)、NIS (499 mg, 2.22 mmol), MS4A (1 g)をCH3CN (30 ml)に溶かし、窒素雰囲気下-40℃でTBSOTf (76 μl, 0.332 mmol)を加えた。その後1時間反応させた後、30分かけて0℃まで昇温しさらに1時間攪拌した。この溶液に飽和重曹水を加えて反応をとめた後、セライトろ過し、有機層をブラインで洗浄した。MgSO4で乾燥後、ろ過、濃縮してフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し、10 (542 mg, 36%, α:β = 1.5:1)を得た。α/β比はNMRチャートの積分比より求めた。
　ジアステレオマーを分離することはできなかったが、NMRチャート（図１）によりドナー、アクセプターに由来するピークが観測されたため、そのまま次の反応に付すことにした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000038
　10(120 mg, 0.0891 mmol)を80%AcOH (3 ml)に溶かし、PdCl2(350 mg)を加え室温で2日間攪拌した。酢酸エチルで希釈した後、飽和重曹水、ブラインで洗浄後、MgSO4で乾燥した。ろ過、濃縮後、TBSOTf (99 μml, 0.4305 mmol)と2,6-lutidine (100 μl, 0.861 mmol)　を加え、フラスコ内を窒素置換した後、室温で3時間撹拌した。有機層を飽和重曹水、ブラインで洗浄後、MgSO4で乾燥した。ろ過、濃縮後、フラッシュカラムクロマトグラフィーで精製し、11 (80 mg, 58%)を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000039
　11 (80 mg, 0.0521 mmol)をMeOH/EtOAc (1: 1, 4.0 ml)に溶かし、Pd/C (30 mg)を加え、水素ガス雰囲気下、室温で3時間撹拌した。ろ過、濃縮後、DMF(3 ml)に溶かし、Fmoc-OSu (35 mg, 0.104), DIEAを加え室温下で1時間撹拌した。これをゲルろ過クロマトグラフィーで精製し、12 (30 mg, 38%, α：β=1.5:1)を得た。
 
　本発明は、糖ペプチドに関連する分野に有用である。

Claims (15)

  1. N末端が保護され、C末端がケイ素リンカーを介して固相に固定化され、かつ糖残基が有する反応性基およびペプチドを構成するアミノ酸側鎖が有する反応性基がケイ素含有基で保護された糖ペプチド誘導体を得る工程、並びに
    前記糖ペプチド誘導体をケイ素含有基およびケイ素リンカーの脱離剤で処理して、脱保護および固相からの遊離を行い、糖ペプチドを得る工程
    を含む、糖ペプチドの固相合成方法。
  2. 糖残基が有する反応性基に対するケイ素含有基が、アルキルシリル基である請求項1に記載の方法。
  3. アルキルシリル基がTMS（トリメチルシリル）基、TES（トリエチルシリル）基、TBDMS（t-ブチルジメチルシリル）基、TBDPS（t-ブチルジフェニルシリル）基、TIPS（トリイソプロピルシリル）基、TMS（トリメチルシリル）エチルスルホニル基、またはTMS（トリメチルシリル）エチルカルボニル基である請求項2に記載の方法。
  4. 糖残基の糖が、キシロース、N-アセチルグルコサミン、マンノース、フコース、シアル酸、ガラクトース、グルコース、N-アセチルガラクトサミン、またはグルクロン酸である請求項1～3のいずれかに記載の方法。
  5. ペプチドを構成するアミノ酸側鎖が有する反応性基に対するケイ素含有基が、TIPS（トリイソプロピルシリル）基、TMS（トリメチルシリル）エチルスルホニル基、TMS（トリメチルシリル）エチルカルボニル基、またはDTBS（ジ-t-ブチルシリレン）基である請求項1～4のいずれかに記載の方法。
  6. ケイ素含有基およびケイ素リンカーの脱離剤が、フッ化水素／ピリジンまたはTBAF（テトラブチルアンモニウムフルオライド）/酢酸である請求項1～5のいずれかに記載の方法。
  7. N末端の保護がFmoc（フルオレニルメトキシカルボニル）基でなされる請求項1～6のいずれかに記載の方法。
  8. ケイ素リンカーは、ジメチルシリル基またはジイソプロピルシリル基であり、ジメチルシリル基またはジイソプロピルシリル基のシリル基が、直接または間接的に糖ペプチド誘導体のC末端と結合し、前記シリル基もうひとつの結合は、直接または間接的に固相と結合している請求項1～7のいずれかに記載の方法。
  9. 糖ペプチド誘導体が、N末端が保護され、C末端がケイ素リンカーを介して固相に固定化されたアミノ酸に対して、(1)糖残基およびアミノ酸側鎖が有する反応性基がケイ素含有基で保護された糖アミノ酸、(2) 側鎖が有する反応性基がケイ素含有基で保護されたアミノ酸、および(3) 反応性基を有さないアミノ酸のいずれかを順次連結するペプチド固相合成方法により合成される請求項1～8のいずれかに記載の方法。
  10. 糖アミノ酸のアミノ酸が、トレオニン、セリンまたはアスパラギンである請求項9に記載の方法。
  11. N末端が保護され、C末端がケイ素リンカーを介して固相に固定化され、かつ糖残基が有する反応性基およびペプチドを構成するアミノ酸側鎖が有する反応性基がケイ素含有基で保護された糖ペプチド誘導体を縮合するための反応容器、Ｎ末端Fmoc（フルオレニルメトキシカルボニル）基を脱離剤で処理するための反応容器、上記縮合とＮ末端Fmoc基の脱保護を繰り返し自動合成できる反応容器、ケイ素含有基およびケイ素リンカーの脱離剤で処理するための反応容器、
    脱離剤の貯蔵容器、縮合剤の貯蔵容器、
    および前記貯蔵容器から反応容器に脱離剤、縮合剤を移送する手段
    を含む糖ペプチドの固相合成装置。
  12. 糖ペプチド誘導体を合成するための手段をさらに有する請求項11に記載の装置。
  13. 前記糖ペプチド誘導体を合成するための手段が、糖ペプチド誘導体の原料の貯蔵容器、および貯蔵容器から反応容器に原料を移送する手段を含む請求項12に記載の装置。
  14. 下記一般式(1)で示される化合物。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000040
    [式中、R1はTMS（トリメチルシリル）基、TES（トリエチルシリル）基、TBDMS（t-ブチルジメチルシリル）基、TBDPS（t-ブチルジフェニルシリル）基、TIPS（トリイソプロピルシリル）基、TMS（トリメチルシリル）エチルスルホニル基、またはTMS（トリメチルシリル）エチルカルボニル基であり、
    R2は、t-ブチル基、フェニル基、またはアリル基であり、
    R3は、t-ブチル基、フェニル基、またはアリル基であり、
    R4は、MP(p-メトキシフェニル)基、-O-C(=NH)-CCl3、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000041
    で示される基(但し、R7は、水素原子または保護基であり、R8は、Z（ベンジルオキシカルボニル）またはFmoc（フルオレニルメトキシカルボニル）基である)
    R5は、水素原子または窒素原子であり、
    R6は、アセチル基または窒素原子である。]
  15. 下記一般式(2)で示される化合物。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000042
    [式中、R11はTMS（トリメチルシリル）基、TES（トリエチルシリル）基、TBDMS（t-ブチルジメチルシリル）基、TBDPS（t-ブチルジフェニルシリル）基、TIPS（トリイソプロピルシリル）基、TMS（トリメチルシリル）エチルスルホニル基、またはTMS（トリメチルシリル）エチルカルボニル基であり、
    R12は、イソプロピル基またはt-ブトキシ基であり、
    R13は、MP(p-メトキシフェニル)基、-O-C(=NH)-CCl3、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000043
    で示される基(但し、R7は、水素原子または保護基であり、R8は、Z（ベンジルオキシカルボニル）またはFmoc（フルオレニルメトキシカルボニル）基である)
    R14は、水素原子または窒素原子であり、
    R15は、アセチル基または窒素原子である。]
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