WO2010092963A1 - 薬物運搬体並びにこれを利用したアジュバントおよびワクチン - Google Patents

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seq
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新川　武
健 宮田
吾朗 松崎
敬文 坪井
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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to a novel drug carrier, and more specifically, it is highly versatile and safe, and can effectively reach a target cell or tissue, and is particularly equipped with an adjuvant or a vaccine.
  • the present invention relates to a drug carrier capable of improving the immunostimulatory effect of an adjuvant and the immunogenicity of a vaccine, and an adjuvant and a vaccine using the same.
  • Patent Document 1 a technique that uses a fusion protein of an antigen and complement 4-binding protein (C4bp) as a vaccine has been proposed.
  • C4bp complement 4-binding protein
  • mucosal vaccines especially oral and nasal mucosal vaccines
  • the immune response on the mucosal surface is low, so even if an antigen with a high protective effect is found, without an effective mucosal adjuvant (immunostimulatory functional substance)
  • the actual situation is that a sufficient effect cannot be obtained.
  • Aluminum salts and the like are known as clinically applicable adjuvants, but their effectiveness cannot be shown in the mucosa, and there is also a concern of inducing side reactions.
  • Cholera toxin (CT) is known as a mucosal adjuvant, but it is a toxin-related molecule and is only used at an experimental level from the viewpoint of safety.
  • these adjuvants are administered in combination with vaccines. However, in such a method of use, the adjuvant may not be able to cross the mucosal barrier, and sufficient effects may not be exhibited.
  • Patent Document 2 a technique for improving the solubility and stability of a protein fused with a protein forming a coiled coil structure has been proposed (Patent Document 2), and the creation of a new functional substance using a coiled coil structure protein is expected. .
  • Patent Document 3 a drug targeting and delivery system technique using a peptide fused to a coiled coil protein using a protein that forms a coiled coil structure has been proposed (Patent Document 3). This is a method for producing nanoparticles using a coiled-coil protein, and is a technique used as a scaffold for delivering a fused peptide. However, this is not efficient because it is a technique that delivers the fused peptide passively rather than actively.
  • the peptide For active delivery, it is necessary to use the peptide as a targeting functional substance, but in the case of nanoparticle structure, the fused peptide exerts its function of binding to the target receptor sufficiently due to a three-dimensional structural obstacle. There is a problem of not.
  • An object of the present invention is to provide such a drug carrier and a vaccine or adjuvant using the drug carrier.
  • the inventors of the present invention do not form a nanoparticle structure, and the immune-responsive cell has a compact coiled-coil multimeric protein and a design that reduces the three-dimensional structural disorder.
  • the present invention has been found that by mounting a vaccine or an adjuvant molecule on a carrier fused with a ligand molecule for a receptor, it can be efficiently transported to a target tissue or cell and exhibits an excellent immunostimulatory effect. It came to complete.
  • the present invention is a drug carrier comprising a multimeric protein having a coiled coil structure and a ligand molecule for a receptor of an immunocompetent cell.
  • the present invention is an adjuvant formed by binding an adjuvant molecule to the drug carrier.
  • the present invention is a vaccine in which a vaccine molecule is bound to the drug carrier.
  • the adjuvant or vaccine can be effectively reached to the target tissue or cells, and the immunogenicity of the vaccine or the immunostimulatory effect of the adjuvant can be enhanced.
  • the degree of freedom in designing the molecular groups constituting it is high, it is highly versatile and has excellent safety.
  • FIG. 6 is a diagram showing ELISA data in Example 3.
  • FIG. It is a figure which shows the result of the malaria parasite propagation inhibition analysis in Example 4. It is a figure which shows the result of targeting to the B cell in Example 5. It is a figure which shows the ELISA data in Example 8. It is a figure which shows the result of the malaria parasite propagation inhibition analysis in Example 9. It is a figure which shows the result of the antibody response with respect to the antigen of the malaria merozoite phase in Example 11.
  • the drug carrier of the present invention contains a multimeric protein having a coiled coil structure and a ligand molecule for a receptor of an immunocompetent cell.
  • Various proteins can be used as a multimeric protein having a coiled-coil structure.
  • the structure-of- ⁇ -helical-coiled-coils (Adv-Protein-Chem.-2005; 70: 37-78-Andrei-N. Lupas, Markus-Gruber et al.) Can be exemplified.
  • the number of monomers constituting the multimeric protein is not particularly limited, but a 2- to 7-mer is preferable, and a 2- to 5-mer is particularly preferable. Within this range, the thermostability is excellent, the affinity with the receptor of the immunocompetent cell is improved, and the immunogenicity is enhanced.
  • the number of amino acid residues is not particularly limited, but is usually about 20 to 80, preferably 50 to 60. This range is preferable because it is stable and compact and has an advantage of functioning as a scaffold for chemically binding antigens and the like.
  • coiled-coiled multimeric proteins include COMP (cartilage oligomeric matrix protein, pentamer), tetrabrachion coiled core (TBCC, tetramer) derived from the thermophilic bacterium Staphylothermus marinus up to 130 ° C. ), A multimeric protein having a parallel coiled-coil structure such as ⁇ 1 protein (trimer) derived from reovirus and presenting in the mucosal epithelium and exhibiting M cell adhesion.
  • COMP and TBCC are preferably used. COMP is preferable because it is very stable as a coiled coil structure and has high heat resistance.
  • TBCC is more preferable when combining unstable molecules because it retains extreme thermal stability of 130 ° C. (J. Mol. Biol. 1995; 245, 385-401 Peter J, Nitsch M et al.).
  • hepatitis delta antigen HDAg, dimer
  • Such an anti-parallel type coiled-coil structure is advantageous because it itself has a spacer function and can bind to an immunocompetent cell receptor in a more compact state.
  • SEQ ID NO: 1 is COMP
  • SEQ ID NO: 2 is tetrabrachion
  • SEQ ID NO: 3 is ⁇ 1 protein
  • SEQ ID NO: 4 is hepatitis delta antigen
  • SEQ ID NO: 34 is the amino acid sequence of TBCC.
  • the coiled-coil multimeric protein of the present invention may be a polypeptide comprising an amino acid sequence of an oligomerization domain (OD) among these amino acid sequences.
  • SEQ ID NO: 5 is the OD of COMP
  • SEQ ID NO: 6 is a storage region.
  • a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in these amino acid sequences is also included.
  • a polypeptide comprising an amino acid sequence having a homology with the amino acid sequence of 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more is also included.
  • polypeptides oligosaccharides, nucleic acids, lipids, and the like can be used as ligand molecules for immunocompetent cell receptors.
  • antibody binding domains derived from Staphylococcus protein A Group B1 domain (SpG-B) of G protein derived from G) Streptococcus G148 (SpG), L protein from Finegoldia magna (Peptostreptococcus magnus), complement system molecule C3d Yersinia ⁇ ⁇ ⁇ pseudotuberculosis invasin and the like.
  • SEQ ID NO: 7 is an antibody-binding domain (Z domain) derived from protein A
  • SEQ ID NO: 8 is the B1 domain of G protein derived from Streptococcus G148
  • SEQ ID NO: 9 is an L protein derived from Fine Gordia magna (Peptostreptococcus magnus)
  • SEQ ID NO: 10 is the complement system molecule C3d
  • SEQ ID NO: 11 is the amino acid sequence of Yersinia pseudotuberculosis invasin.
  • the ligand molecule for the immunocompetent cell receptor includes the specific amino acid sequence described above.
  • a polypeptide comprising an amino acid sequence having a homology with the amino acid sequence of 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more is also included.
  • the Staphylococcus protein A-derived antibody binding domain is composed of 58 amino acid residues and is a protein with a molecular weight of about 6 kDa, but its structure takes a compact shape consisting of three ⁇ -helix. One ⁇ -helix interacts with the Fc or Fab region of an immunoglobulin.
  • the B1 domain (SpG-B), which is a constituent domain of SpG, has a high binding force with the B cell receptor (BCR).
  • the complement system molecule C3d which is one of the innate immune effector factors, binds to CR2 (CD21), one of the complement receptors present in B cells and follicular dendritic cells, and CR2 is a B cell co-receptor complex.
  • CR2 CD21
  • a B cell co-receptor complex an important component of the body, it is preferable because it functions not only as a ligand molecule but also as an adjuvant.
  • Yersinia pseudotuberculosis invasin is used, ⁇ 1 integrin expressed on M cells can be targeted.
  • the drug carrier of the present invention is obtained by chemically or genetically linking a multimeric protein having a coiled-coil structure and a ligand molecule for a receptor of an immunocompetent cell. It expresses a fusion protein consisting of a monomeric protein that constitutes a highly multimeric protein and a ligand protein for the receptor of an immunocompetent cell, and forms a multimer by association in vivo or in vitro. Preferably there is.
  • the fusion of two domains in the fusion protein may be at either the N-terminal or C-terminal position, and the ligand protein for the receptor of the immunocompetent cell is a monomeric protein constituting a multimeric protein having a coiled-coil structure.
  • the ligand protein can be fused directly or via a linker sequence to a monomeric protein constituting a multimeric protein having a coiled coil structure.
  • the ligand protein has 4 to 30 amino acid residues, preferably 10 to 25 amino acid residues.
  • Such a linker sequence is not particularly limited, and for example, a sequence by a combination of GPGP or GGGGS (G 4 S) can be used. It can also be used as a linker by using a sequence ((G 4 S) 1 to (G 4 S) 3 ) in which (G 4 S) is repeated 1 to 4 times, and this can be combined with GPGP. Good.
  • a purification tag may be inserted into the linker sequence, for example, Hisx6 (H 6 ) can be inserted into the linker sequence.
  • a preferred example is GPGP (G 4 S) H 6 (G 4 S) GPGP. In this sequence, the (G 4 S) part can be changed to a repeated sequence ((G 4 S) 1 to 3).
  • GPGPH 6 GPGPGP and G 4 SH 6 G 4 S sequences can also be used as linker sequences.
  • a fusion protein containing a monomeric protein constituting a multimeric protein having the above coiled coil structure and a ligand molecule for a receptor of an immunocompetent cell can be produced by an ordinary genetic engineering technique. That is, an expression vector comprising a DNA base sequence encoding an amino acid sequence of a monomeric protein constituting a multimeric protein having the coiled coil structure and a DNA base sequence encoding an amino acid sequence of a ligand protein for a receptor of an immunocompetent cell By ligating above and transforming an appropriate host using this expression vector, an expression product (target fusion protein) of the fusion gene can be obtained.
  • expression vectors examples include plasmid vectors, phage vectors, virus vectors, artificial chromosome vectors, and the like, but plasmid vectors are preferred from the viewpoint of easy handling and cost. Specific examples include pET-22b and pET-21d when the host is E. coli. Expression vectors may contain regulatory sequences such as promoters and enhancers that have a regulatory role in gene expression. Ligation of the DNA sequence encoding the fusion protein to the expression vector can be performed by a known method such as restriction enzyme terminal ligation.
  • a transformed cell containing the expression vector can be obtained by transforming the host with the expression vector thus prepared.
  • the host include known ones such as Escherichia coli, yeast and mammalian cell lines.
  • E. coli include BL21 strain and DH5 alpha.
  • yeast include Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, and the like.
  • the introduction of the expression vector into the host cell can be performed by a known method according to the host cell, and examples thereof include a calcium phosphate method, an electroporation method, a lipofection method and the like.
  • a transformed cell in which the expression vector has been introduced into a host cell can be selected by culturing in a medium containing a selection marker.
  • a fusion protein can be produced by culturing the transformed cells obtained as described above under suitable conditions.
  • the expressed fusion protein spontaneously oligomerizes to form a multimer, and accumulates in the cell or is secreted outside the cell.
  • the obtained protein can be further isolated and purified by a general purification means.
  • the purification means include various purification methods such as affinity chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography, and gel filtration chromatography.
  • Examples of the drug carrier comprising the fusion protein obtained as described above include those containing a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by Sequence Listing 23. This is because the COMP oligomer oligomerization domain conserved region (SEQ ID NO: 6) and Staphylococcus protein A-derived antibody binding domain (SEQ ID NO: 7) are flexible linkers (GPGP (G 4 S) H 6 (G 4 S) GPGP). And forms a pentamer.
  • the drug carrier of the present invention includes not only the protein represented by this amino acid sequence, but also a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in these amino acid sequences. . Further, a polypeptide comprising an amino acid sequence having a homology with the amino acid sequence of 80% or higher, preferably 90% or higher, more preferably 95% or higher is also included.
  • the drug carrier comprising the fusion protein thus obtained can be loaded with various drugs, for example, adjuvant molecules, vaccine molecules, bioactive molecules (drug molecules), etc. It is preferable to mount molecules.
  • the adjuvant molecule or vaccine molecule that can be used is not particularly limited, and conventionally known ones can be used.
  • adjuvant molecules include cholera toxin (CT), cholera toxin B subunit (CTB), cholera toxin A subunit (CTA), pertussis toxin (PT), pertussis toxin S1 subunit (PTS1), Examples include Toll-like receptor 9 (TLR9) ligand and Toll-like receptor 4 (TLR4) ligand.
  • CTA and PTS1 are preferred because they can induce activation of the NF- ⁇ B pathway.
  • TLR9 ligand include oligodeoxynucleotides (CpG ODN) having an unmethylated CpG motif
  • TLR4 ligand include Monophosphoryl lipid A obtained by detoxifying lipid A which is a part of endotoxin. (MPLA) etc. can be illustrated.
  • the mechanism of action when these adjuvants are used is the main uptake route of the foreign antigen presentation route by MHC class II through endosomes, and is considered to be an immunostimulatory effect mainly by enhancing antibody response.
  • a cationic peptide having a membrane permeability function can also be used as an adjuvant molecule, and specific examples include membrane translocation sequences such as polyarginine, polylysine, Tat 49-57 peptide, penetratin, and signal sequence-derived peptides. These are also effective for induction of cellular immunity, and are considered effective for intracellular parasitic bacteria, cancer, allergies and the like.
  • various arthropod-borne diseases, parasite-derived, bacterial or viral infectious disease vaccine candidate antigens can be used, specifically, Japanese encephalitis virus outer shell protein, malaria parasite surface layer Examples include proteins, antigens derived from pathogens such as Schistosoma japonicum, and polypeptides containing these epitopes are included. These are considered effective for induction of antibody production and cellular immunity.
  • Such an adjuvant molecule or vaccine molecule is chemically or genetically coupled to a drug carrier, which is a fusion protein, directly or via a linker sequence.
  • the binding between the adjuvant molecule or vaccine molecule and the carrier fusion protein may be at any possible position, with respect to the monomer protein constituting the multimeric protein having a coiled-coil structure, and the ligand protein to the receptor of the immunocompetent cell. It may be bonded to the opposite N-terminal or C-terminal, or may be bonded to a reactive substituent in the monomeric protein constituting the multimeric protein, but is preferably fusion to the terminal.
  • a crosslinker As a chemical coupling method, using a crosslinker, it can be coupled using amino groups and thiol groups (SH groups) present in proteins, aldehyde groups of sugar chains present in proteins, There is no restriction
  • a method of reacting an SH group of a monomeric protein constituting a multimeric protein having a coiled-coil structure with an amino group in an adjuvant or vaccine protein more specifically, dithiothreitol (DTT), etc.
  • DTT dithiothreitol
  • One or more adjuvant molecules or vaccine molecules may be bound to a multimeric protein having a coiled-coil structure.
  • a homo-functional type or a hetero-functional type made of a chemical substance can be used, and the use is not limited.
  • it can also chemically couple
  • the base sequence of DNA encoding the amino acid sequence of the monomeric protein constituting the multimeric protein having the above coiled coil structure and the amino acid sequence of the ligand protein for the receptor of the immunocompetent cell are determined.
  • the DNA sequence to be encoded is ligated and subcloned into an expression vector. It is also possible to continuously link the base sequence of DNA encoding the amino acid sequence of the adjuvant protein or vaccine protein, and the gene of the entire fusion gene composed of three parts by expressing in the same manner as described above A fusion protein can be obtained as an expression product.
  • the expressed adjuvant or vaccine-carrier fusion protein also self-assembles to form multimers.
  • the fusion adjuvant or vaccine thus obtained can be administered by any route such as oral, nasal, subcutaneous, intravenous and intraperitoneal.
  • the dose of the adjuvant or vaccine is appropriately set depending on the type of the adjuvant or vaccine. For example, in the case of a vaccine conjugated with Pvs25 which is a transmission-inhibiting antigen of Plasmodium falciparum, it is usually 5 per adult dose. About 100 ⁇ g.
  • the adjuvant or vaccine of the present invention can efficiently reach the target cells / tissues and can enhance the immunostimulatory effect or immunogenicity, but this presents the antigen directly to the immunocompetent cells. It is possible to promote the efficiency of antigen uptake, enhance the antibody production response and cell-mediated immunity, and form multimers in order to agglutinate and cross-link the immunocompetent cell receptors, thereby enabling immunocompetent cells This is probably because cell physiological stimulation is efficiently applied to the cells, and the subsequent induction of intracellular signal transduction is enhanced.
  • COMP-Z carrier (COMP OD cloning)
  • COMP oligomerization domain (OD) was cloned by the following method. That is, in order to obtain a product in which (G 4 S) 3 amino acid sequence was added as a spacer sequence to 55 amino acid residues (SEQ ID NO: 5) of COMP OD, the sense primer of SEQ ID NO: 12 and the antisense primer of SEQ ID NO: 13 were used. After being prepared and annealed, it was introduced into the pCR2.1 vector and subcloned.
  • the COMP OD gene was amplified by PCR again using the sense primer of SEQ ID NO: 14 and the antisense primer of SEQ ID NO: 15, treated with restriction enzymes NcoI and XhoI, and then E. coli. It was subcloned into the NcoI-XhoI site of pET-22b, an expression vector, and transformed into Escherichia coli DH5alpha by a general calcium phosphate method. Furthermore, screening was performed using ampicillin, which is a drug resistance marker present in the vector, and the target gene-introduced clone was selected. The clone was transformed again into the protein-expressing E.
  • coli strain BL21 (DE3) by the calcium phosphate method, and after screening with ampicillin, a COMP OD expression construct was constructed.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside
  • the protein expression was induced. After induction of expression, the culture supernatant is centrifuged (8,000 rpm, 20 min, 4 ° C, 2 times), filtered through a 0.45 micrometer filter, and purified by affinity chromatography using a His-tag column. The 15% acrylamide concentration SDS-PAGE was performed to confirm the expression of the COMP OD portion.
  • COMP OD using only a more compact sequence (SEQ ID NO: 6) of 46 amino acid sequence was expressed by the following method (COMP (Gly27-Gly72)).
  • COMP Gly27-Gly72
  • PCR was performed using the sense primer of SEQ ID NO: 16 and the antisense primer of SEQ ID NO: 17, and COMP ( Gly27-Gly72) was amplified, treated with restriction enzymes NcoI and XhoI, and then subcloned into the NcoI-XhoI site of the expression vector pET-22b to construct an expression construct for COMP (Gly27-Gly72) (pET-22b -COMP (Gly27-Gly72)). After confirming the nucleotide sequence, expression analysis was performed, and it was found that this construct secreted and expressed COMP (Gly27-Gly72) predominantly
  • linker region was introduced into the COMP (Gly27-Gly72) portion.
  • a linker region consisting of GPGP (G 4 S) H 6 (G 4 S) GPGP (SEQ ID NO: 18) combining GPGP and G 4 S as the linker region, and further using Hisx6 used as a protein purification tag in the linker region It was introduced at the C-terminal part of COMP OD.
  • pET-22b-COMP As a specific linker introduction method, after annealing the linker region using a sense primer of SEQ ID NO: 19 and an antisense primer of SEQ ID NO: 20 phosphorylated 5 ′, pET-22b-COMP (Gly27-Gly72) It was constructed by subcloning into the XhoI site (pET-22b-COMP (Gly27-Gly72) -flexible linker). After confirming the nucleotide sequence, expression analysis was performed, and it was found that this construct secreted and expressed COMP (Gly27-Gly72) -flexible linker in the culture supernatant in the same manner as COMP (Gly27-Gly72).
  • the ligand part was constructed in the above-mentioned COMP (Gly27-Gly72) -flexible linker by the following method.
  • the antibody binding domain (Z domain) which is a B domain homologue derived from protein A (SpA) derived from Staphylococcus aureus was used as a ligand (SEQ ID NO: 7). This Z domain was fused by genetic engineering to the C-terminal side of the previously constructed COMP (Gly27-Gly72) -flexible linker.
  • a synthetic oligo of the sense primer of SEQ ID NO: 21 and the antisense primer of SEQ ID NO: 22 was prepared, annealed and then introduced into the pCR2.1 vector to complete the cloning of the Z domain. After confirming the base sequence, after treatment with restriction enzymes SalI and XhoI, construction was completed by subcloning into the XhoI site of pET-22b-COMP (Gly27-Gly72) -flexible linker (pET-22b-COMP-Z) .
  • IPTG isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside
  • a purification column was prepared by packing 10 ml of IgG Sepharose resin (GE Healthcare) into an open column. Equilibrate the column with 2 to 3 times the column volume of TST buffer (pH 8.0) until the pH reaches 8.0, then use 2 to 3 times the column volume of 0.5 M acetic acid solution (pH 3.5). ). This was also equilibrated until the pH was 3.5, this step was repeated twice, and finally equilibrated with TST buffer (pH 8.0) until the pH was 8.0 (TST ⁇ acetic acid ⁇ TST ⁇ acetic acid ⁇ TST). .
  • the prepared sample solution was dropped naturally or applied to a column with a peristaltic pump or the like, and affinity chromatography was performed. After sample application was completed, washing was performed. Wash with 10 volumes of TST buffer (pH 8.0) and then with 2 volumes of 0.5 M ammonium acetate solution (pH 5.5). After washing, elution was carried out at 50 ml using an elution buffer (0.5 M acetic acid solution (pH 3.5). The culture supernatant, the pass-through fraction, the washed fraction, and the eluted fraction were analyzed by 15% acrylamide concentration SDS-PAGE.
  • the expression pattern was confirmed, and when expression was confirmed in the eluted fraction, it was concentrated with an ultrafiltration membrane (Amicon Ultra-4 50K) and replaced with PBS.PIERCE BCA Protein Assay Reagent (bicinchoninic acid ) When quantified by the BCA method using a reagent, the concentration of the COMP-Z fusion protein was 6 mg / ml, and the total protein amount was 30 mg.
  • COMP-Z is a high molecular weight protein, whereas endotoxin is about 10 kDa, so it was treated with a 50 kDa dialysis membrane.
  • PBS dialysis external solution
  • the dialysis external solution PBS was used, and the external solution was changed every 4 hours at 4 ° C., and finally dialyzed overnight (dialyzed with about 4 to 5 times of 1 L PBS).
  • This dialyzed sample was applied to an endotoxin removal column (PIERCE; Detoxi-Gel Endotoxin Removal Gel) to remove endotoxin.
  • the sample after the endotoxin removal column was quantified with BCA, and the endotoxin concentration was assayed by the Limulus test (LAL). That is, the test was carried out using a sample diluted to a final volume of 0.25 ml using 25 times of LAL Pyrogen Single Test. Endotoxin-free water was used for sample dilution.
  • the sample solution adjusted to the required concentration was poured into a vial with a syringe, mixed gently, placed in a box or the like so as not to overturn, and reacted at 37 ° C. for 1 hour. After the reaction, it was gently taken out and turned upside down, and if it was coagulated, it was judged as endotoxin positive, and if it did not coagulate or the solution was partially dissolved and dropped, it was judged as endotoxin negative.
  • the end point before the dilution point that becomes negative is defined as the end point.From this, the number of endotoxin units is calculated, and if it is above the level of 500 pg endotoxin / ⁇ g of protein, the endotoxin removal column is added again. The same operation was repeated until the level became 500 pg endotoxin / ⁇ g of protein or less.
  • Example 2 Preparation of vaccine-carrier fusion (1): Pvs25, a Plasmodium vivax transmission-inhibiting antigen, was fused to COMP-Z by chemical linkage using the SH group present inside COMP-Z.
  • Pvs25 a Pvs25H A form (Pvs25H-A) having a uniform conformation expressed in the yeast Pichia pastoris was used. SPDP was used as a crosslinker necessary for fusion, and the fusion COMP-Z / Pvs25H-A was completed by the following reaction pathway.
  • the concentration of the vaccine fusion carrier was quantified by BCA. 100 ⁇ g of the obtained vaccine fusion carrier (compound-Z per) and 100 ⁇ g of COMP-Z obtained in Example 1 as a control were filled up to 300 ⁇ l in total, and IgG sepharose (equilibrated with TST, 50% Slurry) was reacted with 200 ⁇ l and adsorbed using a rotator at 4 ° C. for 2 hours. Centrifugation (600 ⁇ g 2 min) and the supernatant (500 ⁇ l) was collected. Next, it was washed with 1000 ⁇ l of TST, centrifuged (600 ⁇ g 2 min), and washed fraction 1 was collected.
  • the ratio of the bound partner molecule was calculated by calculating back from the amount of applied protein. Since the amount of protein applied first is 115.7 ⁇ g, the ratio is 85.5698 ⁇ g for Pvs25H-A and 30.1302 ⁇ g for COMP-Z. In Pvs25H-A 85.35698 ⁇ g, 48.82326 ⁇ g (the amount of protein in the supernatant and the washed fraction) was not bound, that is, 36.53338 ⁇ g was bound. When calculated in mol, 1773.3 pmol of Pvs25H-A is bound.
  • COMP-Z / Pvs25H-A fusion confirmation Using the property that COMP-Z binds to the Fc region of immunoglobulin, it was confirmed that Pvs25H-A was physically bound to COMP-Z molecule by Pvs25H-A specific ELISA.
  • 50 ⁇ l of human IgG (hIgG) as a capture antibody is applied to each well at a concentration of 5 ⁇ g / ml on a SUMILON 96-well ELISA plate S type, reacted at 4 ° C. overnight and coated.
  • a 1% BSA in PBS solution was added to an ELISA plate coated with hIgG at 150 ⁇ l / well and reacted at 37 ° C.
  • each applied sample was added with COMP-Z or COMP-Z / Pvs25H-A fusion molecule at a concentration of 2 ⁇ g / well per COMP-Z and reacted at 37 ° C. for 2 hours.
  • both constructs are captured by the binding between Fc / Z.
  • an excess amount of hIgG (5 ⁇ g / ml) was applied to each well at 50 ° C for 2 hours at 37 ° C to mask the "free" Z domain that may not be bound to the capture antibody (hIgG). Reacted.
  • anti-Pvs25 mouse IgG antiserum (diluted 200 times) was applied as a primary antibody at 50 ⁇ l / well and reacted at 37 ° C. for 2 hours.
  • AP conjugate anti-mouse antibody (diluted 3000 times) was applied as a secondary antibody at 50 ⁇ l / well and reacted at 37 ° C. for 2 hours.
  • OD415nm was measured at an appropriate reaction time (5min, 10min, 20min), thereby detecting a Pvs25H-A antigen-specific signal.
  • the difference in signal between COMP-Z and COMP-Z / Pvs25H-A directly proved that Pvs25H-A was bound to COMP-Z.
  • a sample (M) obtained by mixing 30 ⁇ g of Pvs25H-A and 10.6 ⁇ g of COMP-Z or 40.6 ⁇ g of COMP-Z / Pvs25H-A (L) obtained in Example 2 was administered.
  • cholera toxin C; LBL
  • samples S, L, and M prepared to 30 ⁇ g per Pvs25H-A were administered intranasally (in / CT).
  • a mixture of Freund's adjuvant (IFA) in the same amount as the antigen administration volume (here, 100 ⁇ l) and 30 ⁇ g of sample S was subcutaneously administered.
  • IFA Freund's adjuvant
  • S, M, and L prepared to 30 ⁇ g per Pvs25H-A were subcutaneously administered. Partial blood sampling was performed at 1, 3 and 5 weeks, and an increase in antibody titer against Pvs25H-A at 5 weeks was confirmed, and final blood sampling was performed at 6 weeks.
  • Antibody titer analysis was performed by ELISA. Measure OD415nm by AP substrate using 50-fold diluted serum of 6 weeks, Pvs25H-A (5 ⁇ g / ml) as coat antigen, 50-fold diluted serum, 3000-fold diluted AP conjugate anti-mouse antibody It was done by doing. Non-immune group serum was used as a negative control. The results are shown in Figure 1.
  • the new vaccine fusion prepared this time was able to achieve a response higher than the antibody titer seen in the antigen-only mixed group in the presence of IFA, which is considered to be a general vaccine effect, without the presence of IFA.
  • this novel vaccine fusion can induce antibody production without the existing adjuvant in subcutaneous immunization, and the antibody binding domain that is the ligand used this time acts on the immunoglobulin present on the surface of B cells, It is presumed that a production response was observed.
  • Example 4 Propagation stop analysis: The serum obtained in Example 3 was mixed in each group (sc / IFA S, scS, scM, scL, inS, in / CT S, in / CT M, in / CT L), and the mixed serum was used as a sample. .
  • the assay used blood from four patients (protozoan malaria parasites). 180 ⁇ l mixed with 90 ⁇ l of mixed serum and 90 ⁇ l of normal human serum was added to 180 ⁇ l of patient blood, placed in a membrane feeder, and sucked by a mosquito (Anopheles dirus). The number of oocysts in the mosquito midgut was measured by microscopic observation. The results are shown in FIG.
  • the newly produced malaria vaccine fusion molecule produced this time is a group in which the antibody production is predominantly increased and has the ability to completely kill the actual Plasmodium falciparum. Furthermore, since the killing ability increases in the order of S, M, and L, the antibody induced by the molecule prepared this time has the ability to recognize the actual protozoan, and the effect is further increased by adding a ligand. I was able to prove that. In addition, since the mixed group showed some effects, the prepared COMP-Z molecule itself may have adjuvant activity.
  • Example 5 Cell target function analysis: The cell target function of COMP-Z obtained in Example 1 was analyzed using a flow cytometry technique. That is, a spleen is extracted from a 7-week-old Balb / c mouse to prepare spleen cells. About 10 5 cells of the obtained spleen cells were detected with a labeled B cell marker and labeled COMP-Z, and the target function was examined. As a B cell marker, FITC-labeled anti-CD19 antibody was used at a concentration of 0.2 mg / ml. COMP-Z was biotinylated with Maleimide-PEO2-Biotin and further detected with PE-Streptavidin (SA-PE) at a concentration of 0.0001 mg / ml.
  • SA-PE PE-Streptavidin
  • biotinylated COMP-Z 0.01 mg was mixed with 10 5 cells / 100 ml of spleen cells suspended in 1% BSA in PBS, and reacted in ice for 30 min.
  • hIgG was added at a concentration of 50 mg / ml and reacted at 4 ° C. for 30 min.
  • hamster immunoglobulin was added as an Fc receptor inhibitor and reacted at 4 ° C. for 30 min. Thereafter, the supernatant is discarded by centrifugation (1500 rpm, 5 min) and suspended in 100 ml of 1% BSA in PBS.
  • FITC-anti-CD19 antibody and SA-PE were added and reacted at 4 ° C. for 30 min. Thereafter, the supernatant was discarded by centrifugation (1500 rpm, 5 min), and suspended in 100 ml of 1% BSA in PBS. Subsequently, the mixture was centrifuged again (1500 rpm, 5 min), the supernatant was discarded, and finally suspended in 1% formaldehyde to obtain a sample for flow cytometry. As a sample without ligand, COMP OD was used simultaneously as a negative control. Flow cytometry analysis was performed according to the BD FACS system manual. The results are shown in FIG.
  • Example 6 Preparation of TBCC-Z carrier: (Cloning of TBCC (wt)-flexible linker) Fusions were made using TBCC as the core molecule.
  • TBCC uses the wild type sequence (SEQ ID NO: 34) as TBCC (wt).
  • SEQ ID NO: 34 wild type sequence
  • COMP-Z a flexible linker was introduced after cloning of COMP, but in the case of TBCC, cloning was performed simultaneously for convenience.
  • TBCC (wt) -flexible linker was cloned.
  • a sense primer of SEQ ID NO: 25 and an antisense primer of SEQ ID NO: 26 were prepared, annealed, and then transferred to the pCR2.1 vector. Introduced and subcloned. After treatment with restriction enzymes Nco I and Xho I, the resultant was subcloned into the Nco I-Xho I site of pET-21d, an E. coli expression vector, and transformed into E. coli DH5alpha by a general calcium phosphate method.
  • a ligand moiety was constructed in the above-described TBCC (wt) -flexible linker by the following method.
  • the antibody binding domain (Z domain) which is a B domain homolog derived from protein A (SpA) derived from Staphylococcus aureus was used as a ligand (SEQ ID NO: 7). This Z domain was constructed by genetic engineering fusion to the C-terminal side of the previously constructed TBCC (wt) -flexible linker.
  • a synthetic oligo of the sense primer of SEQ ID NO: 21 and the antisense primer of SEQ ID NO: 22 was prepared, introduced into the pCR2.1 vector after annealing, and the cloning of the Z domain was completed. After confirmation of the nucleotide sequence, treatment with restriction enzymes Sal I and Xho I was followed by subcloning into the Xho I site of pET-21d-TBCC (wt) -flexible linker to complete the construction (pET-21d-TBCC (wt ) -Z).
  • TBCC (Cys) -Z) TBCC (wt) -Z (SEQ ID NO: 27) is a construct in which a cysteine residue is introduced because it does not have a cysteine residue to be used for chemical fusion, although it can be genetically engineered with a vaccine antigen.
  • TBCC (S52C) -Z SEQ ID NO: 28
  • TBCC (C60) -Z SEQ ID NO: 29
  • TBCC (C60) -Z is a construct in which a cysteine residue is inserted into the 60th amino acid of TBCC (wt) -Z. Cys was introduced using QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene). Specifically, TBCC (S52C) -Z uses TBCC (wt) -Z as a template and the sense primer of SEQ ID NO: 30 and the antisense primer of SEQ ID NO: 31. TBCC (C60) -Z is TBCC (wt) -Z The target product was amplified by the PCR method using the sense primer of SEQ ID NO: 32 and the antisense primer of SEQ ID NO: 33 as a template.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside
  • washing buffer (20 mM imidazole, 20 mM phosphate buffer, pH 7.4) was applied 5 times the column volume.
  • the prepared sample was applied to the equilibrated column using a perista pump, and affinity chromatography was performed. After completion of sample application, washing and elution were then performed.
  • the column was washed with a 5-fold amount of washing buffer, and then eluted with a 5-fold amount of elution buffer (500 mM imidazole, 20 mM phosphate buffer, pH 7.4).
  • an ultrafiltration membrane Amicon Ultra-15 30 kDa
  • the washing buffer was applied 5 times as much as the column, and then eluted with 5 times the elution buffer.
  • Samples before column treatment, flow-through fraction, washed fraction and eluted fraction were analyzed by 15% acrylamide concentration SDS-PAGE. After the electrophoresis, the expression pattern was confirmed. When the expression was confirmed in the eluted fraction, it was concentrated with an ultrafiltration membrane (Amicon Ultra-15 30 kDa) and replaced with PBS.
  • TBCC-Z protein concentration was 3.1 mg for TBCC (wt) -Z, 14.5 mg for TBCC (S52C) -Z, and TBCC (C60) -Z was 10.2 mg.
  • TBCC (S52C) -Z and TBCC (C60) -Z are collectively referred to as TBCC (Cys) -Z.
  • Endotoxin removal treatment of various TBCC-Z Recombinants produced in E. coli are thought to be contaminated with endotoxin, and therefore, endotoxin removal and protein solution endotoxin concentration were assayed during immunization experiments.
  • TBCC-Z has a molecular weight of about 60 kDa
  • endotoxin has a molecular weight of about 10 kDa
  • ultrafiltration was performed with a 50 kDa dialysis membrane.
  • the dialyzed external solution was PBS, and finally dialyzed overnight by exchanging the external solution every 4 hours at 4 ° C.
  • This dialyzed sample was applied to an endotoxin removal column (PIERCE: Detoxi-Gel Endotoxin Removal Gel), and the fraction passed through was collected. Then, BCA quantification was performed and the endotoxin concentration was assayed by the Limulus test (LAL). That is, the test was carried out using a sample diluted to a final volume of 0.25 ml using 25 times of LAL Pyrogen Single Test. Endotoxin-free water was used for sample dilution. The sample solution adjusted to the required concentration was poured into a vial with a syringe, mixed gently, placed in a box or the like so as not to overturn, and reacted at 37 ° C. for 1 hour.
  • LAL Limulus test
  • Example 7 Preparation of vaccine-carrier fusion (2): Pvs25, a P. aeruginosa malaria parasite transmission-inhibiting antigen, was fused to TBCC (Cys) -Z by chemical bonding using the SH group present in TBCC (Cys) -Z.
  • Pvs25 a Pvs25H A form (Pvs25H-A) having a uniform conformation expressed in the yeast Pichia pastoris was used. SPDP was used as a crosslinker necessary for the fusion, and the fusion TBCC-Z / Pvs25H-A was completed by the following reaction method.
  • TBCC-Z tetramer (2 mg: 1.55 ml: 34 nmol)
  • Pvs25H-A 2.8 mg: 1.46 ml: 137.2 nmol
  • a sample (M) obtained by mixing 30 ⁇ g of Pvs25H-A and 21.4 ⁇ g of TBCC (S52C) -Z or 21.4 ⁇ g of TBCC (C60) -Z or TBCC (S52C) -Z / Pvs25H- obtained in Example 6 A (L) or TBCC (C60) -Z / Pvs25H-A (L) 51.4 ⁇ g was administered.
  • cholera toxin C; LBL
  • samples S, M, and L were mixed and administered nasally (in / CT).
  • IFA incomplete Freund's adjuvant
  • Alum adjuvant was mixed subcutaneously (sc / IFA, sc / Alum) with the same volume as the antigen administration volume (here, 100 ⁇ l) and 30 ⁇ g of sample S.
  • S, M, and L prepared to 30 ⁇ g per Pvs25H-A were subcutaneously administered. Partial blood sampling was performed at 1, 3 and 5 weeks, and an increase in antibody titer against Pvs25H-A at 5 weeks was confirmed, and final blood sampling was performed at 6 weeks.
  • Antibody titer analysis was performed by ELISA. Use serum at 6 weeks at 50-fold dilution, Pvs25H-A (5 ⁇ g / ml) as the coat antigen, 50-fold diluted serum, 4000-fold diluted Anti-mouse IgG-AP, and OD415nm with AP substrate This was done by measuring. Non-immune group serum was used as a negative control. The results are shown in FIG.
  • the novel vaccine fusion prepared this time can induce a response equivalent to the antibody titer seen in the antigen-only mixed group in the presence of IFA, which is considered to be a general vaccine effect. It could be further enhanced by mixed administration with an adjuvant.
  • this novel vaccine fusion was able to induce an antibody response without dependence on adjuvant in subcutaneous immunization, but it was shown to induce more effective antibody production when used in combination with a clinically used adjuvant.
  • Example 9 Propagation stop analysis: The serum obtained in Example 8 was used for each group (sc / IFA S, scS, scM, scL, sc / Alum S, sc / Alum M, sc / Alum L, inS, in / CT S, in / CT L). And mixed serum was used as a sample.
  • the assay used blood from four patients (protozoan malaria parasites). 180 ⁇ l mixed with 90 ⁇ l of mixed serum and 90 ⁇ l of normal human serum was added to 180 ⁇ l of patient blood, placed in a membrane feeder, and sucked by a mosquito (Anopheles dirus). The number of oocysts in the mosquito midgut was measured by microscopic observation. The results are shown in FIG.
  • the newly produced malaria vaccine fusion molecule using TBCC produced this time as a core is a group in which the production of antibodies is predominantly increased and has the ability to completely kill the actual Plasmodium falciparum.
  • the killing ability has increased in the order of S, M, and L, and it has been found that the combined use with Alum increases the killing ability and may enhance the effects of existing adjuvants.
  • Example 10 Preparation of vaccine-carrier fusion (3): A fusion loaded with MSP1-19 was prepared and its antibody response function was examined.
  • MSP1-19 is the same malaria antigen as Pvs25, but it is a merozoite-phase antigen, and the propagation-inhibiting antigen Pvs25 is expressed by malaria parasites in mosquitoes, whereas MSP1-19 is It is an antigen expressed by Plasmodium in mammals.
  • MSP1-19 was fused by chemical bonding using the SH group present inside TBCC (Cys) -Z and COMP-Z.
  • MSP1-19 S form (MSP1-19H-S) having a uniform structure expressed in the yeast Pichia pastoris was used.
  • SPDP was used as a crosslinker necessary for fusion, and fusion TBCC (Cys) -Z / MSP1-19H-S and COMP-Z / MSP1-19H-S were completed by the following reaction method.
  • TBCC-Z tetramer 750 ⁇ g: 625 ⁇ l: 12.5 nmol
  • COMP-Z pentamer 750 ⁇ g: 625 ⁇ l: 10.4 nmol
  • MSP1-19H-S 3 mg: 1.5 ml: 210 nmol
  • a 1% BSA in PBS solution was added at 150 ⁇ l / well to an ELISA plate coated with hIgG and reacted at 37 ° C. for 2 hours to perform a blocking reaction.
  • After blocking add TBCC-Z / MSP1-19H-S and COMP-Z / MSP1-19H-S fusion molecules at a concentration of 2 ⁇ g / well for each sample TBCC (Cys) -Z and COMP-Z molecules at 37 ° C.
  • the reaction was performed for 2 hours. In this reaction, both constructs are captured by the binding between Fc / Z.
  • Example 11 Immunogenicity confirmation test To C57B / 6 mice, rabbits, 7 weeks old (Japan SLC), 30 ⁇ g of MSP1-19H-S (S) was administered subcutaneously (sc) three times (0, 2, 4 weeks). Similarly, a sample (M) obtained by mixing 30 ⁇ g of MSP1-19H-S and TBCC (Cys) -Z or COMP-Z 10.6 ⁇ g or TBCC (Cys) -Z / MSP1-19H- obtained in Example 10 S and COMP-Z / MSP1-19H-S (L) 40.6 ⁇ g were administered.
  • a mixture of Freund's adjuvant (IFA) in the same amount as the antigen administration volume (here, 100 ⁇ l) and 30 ⁇ g of sample S was subcutaneously administered. Partial blood sampling was performed at 1, 3, and 5 weeks, and an increase in the antibody titer against MSP1-19H-S at 5 weeks was confirmed, and antibody titer was analyzed at 6 weeks. Antibody titer analysis was performed by ELISA. OD415nm with AP substrate using 6 weeks of serum at 50-fold dilution, MSP1-19H-S (5 ⁇ g / ml) as coat antigen, 3,000-fold dilution of AP conjugate anti-mouse antibody at 50-fold dilution was performed by measuring. Non-immune group serum was used as a negative control. The results are shown in FIG.
  • the newly produced malaria vaccine fusion molecule with a modified antigen was significantly higher in immune response than the antigen alone.
  • the antigen loaded on TIPs may be able to enhance immunogenicity regardless of the type.
  • the result proved the versatility of TIPs.
  • the drug carrier of the present invention has high versatility because of the high degree of freedom in the design of the molecular groups constituting it, and is excellent in safety, and efficiently transports the drug to the target cell or tissue. It is possible to enhance the action of. Therefore, it is extremely useful as a drug delivery system platform for infectious diseases and the like.

Abstract

　本発明は、ワクチンやアジュバント等を標的とする細胞や組織に効率的に到達させるとともに、ワクチンの免疫原性を向上させ得る、またはアジュバントの免疫賦活作用を増強し得る薬物運搬体およびこれを利用したワクチンまたはアジュバントを提供することを目的とする。当該薬物運搬体は、　コイルドコイル構造を有する多量体タンパク質および免疫細胞のレセプターに対するリガンド分子とを含むことを特徴とする。

Description

薬物運搬体並びにこれを利用したアジュバントおよびワクチン
　本発明は、新規な薬物運搬体に関し、より詳細には、汎用性および安全性が高く、薬剤を効果的に標的細胞または組織に到達させることが可能であり、特にアジュバントやワクチンを搭載することにより、アジュバントの免疫賦活効果やワクチンの免疫原性を向上させることが可能な薬物運搬体並びにこれを利用したアジュバントおよびワクチンに関する。
　感染症予防や癌などに対する新たな治療法の確立のために、細胞・組織特異的な薬物運搬システムの開発が行われている。感染症予防に対してこれまで様々なワクチンやアジュバント（免疫賦活機能性物質）が開発されてきた。従来ワクチンは、ウイルスや細菌を弱毒化したり不活化したものが主であったが、近年の遺伝子工学技術の発達により、特定の病原体由来の抗原を大量に生産できるようになり、より安全性の高いコンポーネントワクチンの開発が可能となった。しかしながら、その反面、高純度に精製されたリコンビナントタンパク質の免疫原性が低下するという問題も生じていた。
　コンポーネントワクチンの免疫原性を向上させるために、抗原と補体４結合タンパク質（C4bp）との融合タンパク質をワクチンとして利用する技術が提案されている（特許文献１）。しかしながら、この技術では抗原を会合させることは可能であるが、抗原を部位特異的に運搬する能力はないという問題があった。
　また、ワクチンの中でも、特に経口および経鼻などの粘膜ワクチンは粘膜面での免疫応答が低いため、防御効果の高い抗原を見出しても、有効な粘膜アジュバント（免疫賦活機能性物質）なしには十分な効果が得られないのが実情であった。臨床応用可能なアジュバントとしては、アルミニウム塩などが知られているが、粘膜では有効性は示すことができず、さらに副反応誘発の懸念もある。粘膜アジュバントとしてはコレラトキシン（CT）が知られているが、毒素関連分子であり安全性の面から実験的なレベルでの使用にとどまっている。さらに、これらのアジュバントはワクチンと混合投与されているが、このような使用方法ではアジュバントが粘膜のバリアを超えることができず十分な効果が発揮されない場合もあった。
　一方、コイルドコイル構造を形成するタンパク質と融合させたタンパク質の可溶性や安定性を向上させる技術が提案されており（特許文献２）、コイルドコイル構造タンパク質を用いた新しい機能性物質の創製が期待されている。また、コイルドコイル構造を形成するタンパク質を用いて、コイルドコイルタンパク質に融合させたペプチドによる薬物ターゲッティング及び送達システムの技術が提案されている（特許文献３）。これはコイルドコイルタンパク質を利用したナノ粒子を作製する方法であり、融合させたペプチドを送達させる為の足場として利用する技術である。しかしながら、これは融合させたペプチドを能動的でなく、受動的に送達する技術であるため効率的ではない。能動的に送達するためにはペプチドを標的化機能性物質として用いる必要があるが、ナノ粒子構造の場合は融合させたペプチドが立体構造的な障害によって、標的レセプターへの結合機能を十分に発揮しないという問題がある。
特表２００７－５２８２１０号公報 特表２００８－５１４５８５号公報 特表２００６－５１９７８１号公報
　したがって、ワクチンやアジュバント等を標的とする細胞や組織に効率的に到達させるとともに、ワクチンの免疫原性を向上させ得る、またはアジュバントの免疫賦活作用を増強し得る運搬システムの開発が切望されており、本発明はそのような薬物運搬体およびこれを利用したワクチンまたはアジュバントを提供することを課題とするものである。
　本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、ナノ粒子構造を形成せずに、コンパクトな状態のコイルドコイル構造の多量体タンパク質と、立体構造障害を軽減させるデザインで免疫応答細胞レセプターに対するリガンド分子とを融合した担体に、ワクチンやアジュバント分子を搭載することにより、効率的に標的組織または細胞に運搬することが可能であるとともに、優れた免疫賦活効果を示すことを見出し本発明を完成するに至った。
　すなわち本発明はコイルドコイル構造の多量体タンパク質および免疫担当細胞のレセプターに対するリガンド分子とを含む薬物運搬体である。
　また本発明は、上記薬物運搬体にアジュバント分子が結合してなるアジュバントである。
　さらに本発明は、上記薬物運搬体にワクチン分子が結合してなるワクチンである。
　本発明によれば、標的組織または細胞へアジュバントまたはワクチンを有効に到達させることができ、またワクチンの免疫原性あるいはアジュバントの免疫賦活効果を増強することが可能である。さらに、構成する分子群の設計の自由度が高いため汎用性が高く、かつ安全性にも優れるものである。
実施例３におけるELISAデータを示す図である。 実施例４におけるマラリア原虫伝搬阻止解析の結果を示す図である。 実施例５におけるB細胞への標的化の結果を示す図である。 実施例８におけるELISAデータを示す図である。 実施例９におけるマラリア原虫伝搬阻止解析の結果を示す図である。 実施例１１におけるマラリアメロゾイト期の抗原に対する抗体応答の結果を示す図である。
　本発明の薬物運搬体は、コイルドコイル構造を有する多量体タンパク質および免疫担当細胞のレセプターに対するリガンド分子とを含むものである。
　コイルドコイル構造の多量体タンパク質としては、種々のものが使用可能であり、例えば「The structure of α-helical coiled coils 」（Adv Protein Chem. 2005;70:37-78 Andrei N.Lupas, Markus Gruberら）に記載のタンパク質が例示できる。多量体タンパク質を構成する単量体の数は特に限定されないが、2～7量体が好ましく、特に2～5量体が好ましい。この範囲であると、熱安定性に優れるとともに、免疫担当細胞のレセプターと親和性が向上し免疫原性が増強される。また、アミノ酸残基の数も特に限定されないが、通常20～80程度であり、好ましくは50～60である。この範囲であると、安定でコンパクトかつ抗原等を化学的に結合させる際の足場として機能する優位性があるために好ましい。
　好ましいコイルドコイル構造の多量体タンパク質として具体的には、COMP（cartilage oligomeric matrix protein、5量体）、好熱菌Staphylothermus marinus由来で130℃までの耐熱性をもつテトラブラキオンコイルドコア（TBCC、4量体）、レオウイルス（Reovirus）由来で粘膜上皮に存在するM細胞接着性を示すσ1タンパク質（3量体）等のパラレル型コイルドコイル構造の多量体タンパク質が例示できる。これらの中でもCOMP、TBCCが好適に用いられる。COMPは、コイルドコイル構造として非常に安定で、熱耐性が高いために好ましい。またTBCCは130℃という極度な熱安定性を保持しているために不安定な分子を組み合わせる場合にさらに好ましい（J.Mol.Biol.1995;245,385-401 Peter J, Nitsch Mら）。一方、アンチパラレル型コイルドコイル構造を持つヘパチチスデルタウイルス（Hepatitis delta virus）由来のヘパチチスデルタ抗原（HDAg、2量体）を使用することもできる。このようなアンチパラレル型コイルドコイル構造はそれ自身がスペーサー的機能を有し、よりコンパクトな状態で免疫担当細胞レセプターとの結合が可能であるため有利である。
　配列番号１はCOMP、配列番号２はテトラブラキオン、配列番号３はσ1タンパク質、配列番号４は、ヘパチチスデルタ抗原、配列番号３４はTBCCのアミノ酸配列である。本発明のコイルドコイル構造の多量体タンパク質は、これらのアミノ酸配列のうち、オリゴマー形成ドメイン（OD）のアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよい。配列番号５は、COMPのODであり、配列番号６は、そのうちの保存領域である。また、これらのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドも包含される。さらに上記アミノ酸配列との相同性が、80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上であるアミノ酸配列からなるポリペプチドも包含される。
　一方、免疫担当細胞レセプターに対するリガンド分子は、種々のポリペプチド、オリゴ糖、核酸、脂質等が使用可能であるが、具体的には、スタフィロコッカス（Staphylococcus）プロテインA由来の抗体結合ドメイン、Group G ストレプトコッカス（Streptococcus）G148由来Gタンパク質（SpG）のB1ドメイン(SpG-B)、ファインゴルディア・マグナ（ペプトストレプトコッカス・マグナス）（Finegoldia magna(Peptostreptococcus magnus）)由来のLタンパク質、補体系分子C3d、およびエルシニア・シュードチュベルキュロシスインベーシン（Yersinia pseudotuberculosis invasin）等が例示できる。配列番号７はプロテインA由来の抗体結合ドメイン（Zドメイン）、配列番号８はストレプトコッカスG148由来Gタンパク質のB1ドメイン、配列番号９はファインゴルディア・マグナ（ペプトストレプトコッカス・マグナス）由来のLタンパク質、配列番号１０は補体系分子C3d、配列番号１１は、エルシニア・シュードチュベルキュロシスインベーシンのアミノ酸配列であり、本明細書において、免疫担当細胞レセプターに対するリガンド分子には、上記特定のアミノ酸配列で示されるタンパク質だけでなく、これらのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドが包含される。また、上記アミノ酸配列との相同性が、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上であるアミノ酸配列からなるポリペプチドも包含される。
　これらのうち、スタフィロコッカスプロテインA由来抗体結合ドメインは58アミノ酸残基から構成され、分子量にして約6 kDaのタンパク質であるが、構造は三つのα-helixから成るコンパクトな形状をとり、この中のひとつのα-helixがイムノグロブリンのFc或いはFab領域と相互作用する。またSpGの構成ドメインであるB1ドメイン（SpG-B）は、B細胞レセプター（BCR）との結合力が高い。一方、自然免疫のエフェクター因子のひとつである補体系分子C3dは、B細胞や濾胞状樹状細胞に存在する補体レセプターのひとつCR2(CD21)に結合するとともに、CR2はB細胞の補助レセプター複合体の重要な成分でB細胞の抗原に対する感受性を高めるために、リガンド分子のみならずアジュバントとしても機能するために好ましい。さらに、エルシニア・シュードチュベルキュロシスインベーシンを用いると、M細胞上に発現するβ1インテグリンを標的とすることができる。
　本発明の薬物運搬体は、コイルドコイル構造を有する多量体タンパク質と、免疫担当細胞のレセプターに対するリガンド分子とが化学的または遺伝子工学的に結合されたものであるが、中でもコイルドコイル構造を有する分子的安定性の高い多量体タンパク質を構成する単量体タンパク質と、免疫担当細胞のレセプターに対するリガンドタンパク質とが結合した融合タンパク質を発現させ、それをin vivo或いはin vitroで会合により多量体形成させたものであることが好ましい。融合タンパク質中の２つのドメインの融合化には、N末端、C末端のいずれの位置でもよく、免疫担当細胞のレセプターに対するリガンドタンパク質が、コイルドコイル構造を有する多量体タンパク質を構成する単量体タンパク質のN末端またはC末端に融合してもよい。または、単量体タンパク質中の反応性置換基と化学的に結合してもよいが、好ましくは、末端への遺伝子工学的結合である。リガンドタンパク質は、直接あるいはリンカー配列を介して、コイルドコイル構造を有する多量体タンパク質を構成する単量体タンパク質に融合させることができるが、例えば、4～30個のアミノ酸残基、好ましくは10～25個のアミノ酸残基を有するペプチドであるリンカー配列を介して融合させることにより、レセプターとの結合において立体構造形成における分子間相互干渉を低減させることができ、またその柔軟性によってレセプターとの結合時において有利に作用するために好ましい。
　このようなリンカー配列としては、特に限定されないが、例えばGPGPもしくはGGGGS(G4S)の組み合わせによる配列を用いることができる。また、(G4S)が1～4回繰り返された配列((G4S)1～(G4S)3)を用いてリンカーとして使用することもでき、さらにこれにGPGPを組み合わせてもよい。さらに、リンカー配列中に、精製タグを挿入してもよく、例えば、Hisx6（H6）をリンカー配列に挿入することができる。好ましい例として、GPGP(G4S) H6 (G4S)GPGPが例示できる。この配列中、(G4S)部分を繰り返し配列((G4S)1～3)に変えることも可能である。またGPGPH6GPGPやG4SH6G4Sの配列もリンカー配列として利用可能である。
　上記コイルドコイル構造を有する多量体タンパク質を構成する単量体タンパク質および免疫担当細胞のレセプターに対するリガンド分子とを含む融合タンパク質は、通常の遺伝子工学的手法によって製造することが可能である。すなわち、上記コイルドコイル構造を有する多量体タンパク質を構成する単量体タンパク質のアミノ酸配列をコードするDNAの塩基配列と免疫担当細胞のレセプターに対するリガンドタンパク質のアミノ酸配列をコードするDNAの塩基配列とを発現ベクター上で連結し、この発現ベクターを用いて適切な宿主を形質転換することにより融合遺伝子の発現産物（目的の融合タンパク質）が得られる。
　発現ベクターとしては、プラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター、人工染色体ベクター等が挙げられるが、簡便な取り扱いとコストの観点からプラスミドベクターが好ましい。具体的には、例えば、宿主が大腸菌の場合には、pET-22b、pET-21d等が挙げられる。発現ベクターには、遺伝子発現に調節的役割を持つプロモーター、エンハンサー等の調節配列が含まれていてもよい。発現ベクターに融合タンパク質をコードするDNAの塩基配列を連結するには、制限酵素末端連結等の公知方法により行うことができる。
　このようにして作製された発現ベクターで宿主を形質転換することにより、発現ベクターを含有する形質転換細胞を得ることができる。宿主としては、大腸菌、酵母、哺乳動物細胞株等の公知のものが挙げられる。大腸菌としては、BL21株、DH5アルファ等が例示できる。酵母としては、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces serevisiae）等が挙げられる。
　宿主細胞への発現ベクターの導入は、宿主細胞に応じて公知の方法によって行うことができ、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法等が例示できる。導入後、選択マーカーを含む培地で培養することにより、前記発現ベクターが宿主細胞中に導入された形質転換細胞を選択することができる。
　以上のようにして得られた形質転換細胞を好適な条件下で培養することにより、融合タンパク質を産生することができる。発現した融合タンパク質は、自発的にオリゴマー化して多量体を形成し、細胞内で蓄積あるいは細胞外へ分泌される。得られたタンパク質は、一般的な精製手段により、さらに単離・精製することができる。ここで精製手段としては、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトフラフィー等各種精製法が挙げられる。
　上記のようにして得られる融合タンパク質からなる薬物運搬体として、配列表２３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むものが例示できる。これはCOMPのオリゴマー形成ドメインの保存領域（配列番号６）とスタフィロコッカスプロテインA由来抗体結合ドメイン（配列番号７）がフレキシブルリンカー(GPGP(G4S)H6(G4S)GPGP)を介して結合したものであり、5量体を形成する。本発明の薬物運搬体には、このアミノ酸配列で示されるタンパク質だけでなく、これらのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドが包含される。また、上記アミノ酸配列との相同性が、80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上であるアミノ酸配列からなるポリペプチドも包含される。
　かくして得られた融合タンパク質からなる薬物運搬体には、種々の薬物を搭載することができ、例えば、アジュバント分子、ワクチン分子、生理活性分子（薬物分子）等が例示できるが、特にアジュバント分子またはワクチン分子を搭載することが好ましい。使用可能なアジュバント分子またはワクチン分子としては、特に限定されず、従来公知のものが使用できる。具体的には、アジュバント分子として、コレラトキシン（CT）、コレラトキシンBサブユニット（CTB）、コレラトキシンAサブユニット（CTA）、百日咳菌毒素（PT）、百日咳菌毒素S1サブユニット（PTS1）、Toll様受容体9（TLR9）リガンド、Toll様受容体4(TLR4)リガンド等が例示できる。これらのうち、CTAとPTS1は、NF-κB経路の活性化を誘導できるために好ましい。また、TLR9リガンドとしては、例えば、非メチル化CpGモチーフを有するoligodeoxynucleotides(CpG ODN)等が例示でき、TLR4リガンドとしては、内毒素（endotoxin）の一部であるリピッドAを無毒化したMonophosphoryl lipid A(MPLA)等が例示できる。
　これらのアジュバントを利用した場合の作用機構としては、エンドソームを介したMHC class IIによる外来抗原提示ルートが主たる取り込み経路であり、主に抗体応答増強による免疫賦活効果と考えられる。
　一方、膜透過性機能を有するカチオン性ペプチドもアジュバント分子として使用でき、具体的には、ポリアルギニン、ポリリジン、Tat49-57ペプチド、ペネトラチン等の膜転位配列、シグナル配列由来ペプチド等が例示できる。これらは細胞性免疫の誘導に対しても有効であり、細胞内寄生性細菌、がん、アレルギー等に有効であると考えられる。
　ワクチン分子としては、種々の節足動物媒介性疾患、寄生虫起因、細菌性またはウイルス性の感染症ワクチン候補抗原が利用可能であり、具体的には、日本脳炎ウイルス外殻タンパク質、マラリア原虫表層タンパク質、日本住血吸虫などの病原体由来の抗原が例示でき、これらのエピトープを含むポリペプチドが包含される。これらは抗体産生や細胞性免疫の誘導に対して有効であると考えられる。
　このようなアジュバント分子またはワクチン分子は、融合タンパク質である薬物運搬体と直接あるいはリンカー配列を介して化学的または遺伝子工学的に結合される。アジュバント分子またはワクチン分子と運搬体融合タンパク質との結合は、いずれの可能な位置でもよく、コイルドコイル構造を有する多量体タンパク質を構成する単量体タンパク質に対して、免疫担当細胞のレセプターに対するリガンドタンパク質と反対のN末端またはC末端に結合してもよく、あるいは、多量体タンパク質を構成する単量体タンパク質中の反応性置換基に結合してもよいが、好ましくは、末端への融合である。
　化学的に結合させる手法としては、クロスリンカーを用いて、タンパク質に存在するアミノ基やチオール基（SH基）、タンパク質に存在する糖鎖のアルデヒド基などを利用して結合させる事ができるが、用いる官能基に制限はない。例えば、コイルドコイル構造を有する多量体タンパク質を構成する単量体タンパク質のSH基とアジュバントまたはワクチンタンパク質中のアミノ基とを反応させる方法が例示でき、より具体的には、ジチオトレイトール（DTT）等の還元剤により還元処理した融合タンパク質と、N－スクシニル－3－（2－ピリジルジチオ）プロプリオネート（SPDP)によりピリジルジスルフィド基を導入したアジュバントまたはワクチンタンパク質とをインキュベートすることによって結合させることができる。結合させるアジュバント分子またはワクチン分子は、コイルドコイル構造を有する多量体タンパク質に対して、1分子以上であってもよい。クロスリンカーには化学物質からなるホモファンクショナルタイプ、ヘテロファンクショナルタイプなどが利用でき、その利用に制限はない。さらにビオチン、アビジンなどの生体分子同士の相互作用を利用した結合を利用することで化学的に結合することもできる。
　一方、遺伝子工学的に結合させる場合には、上記コイルドコイル構造を有する多量体タンパク質を構成する単量体タンパク質のアミノ酸配列をコードするDNAの塩基配列と免疫担当細胞のレセプターに対するリガンドタンパク質のアミノ酸配列をコードするDNAの塩基配列とを連結させ、発現ベクターにサブクローニングする。また、アジュバントタンパク質またはワクチンタンパク質のアミノ酸配列をコードするDNAの塩基配列をも連続して連結させることが可能であり、上記と同様にして発現させることにより三部から構成される融合遺伝子全体の遺伝子発現産物として融合タンパク質を得ることができる。発現したアジュバントまたはワクチン－運搬体融合タンパク質も、自己集合して多量体を形成する。
　かくして得られた融合体アジュバントまたはワクチンは、経口、経鼻、皮下、静脈内、腹腔内等任意の経路で投与できる。また、アジュバントまたはワクチンの用量は、アジュバントまたはワクチンの種類等によって適宜設定されるが、例えば、三日熱マラリア原虫の伝搬阻止抗原であるPvs25を結合したワクチンの場合、成人１用量あたり、通常5～100μg程度である。
　本発明のアジュバントまたはワクチンは、効率的に標的細胞・組織に到達可能であるとともに、免疫賦活効果または免疫原性を増強させることができるものであるが、これは免疫担当細胞に直接抗原を提示できる能力により、抗原取り込みの効率化を促進し、抗体産生応答及び細胞性免疫を増強するとともに、多量体を形成するため、免疫担当細胞の受容体を凝集、クロスリンクさせることによって、免疫担当細胞に対し効率良く細胞生理学的な刺激を与え、それに続く細胞内シグナル伝達誘導が増強されるためと考えられる。
　次に実施例等を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例等に限定されるものではない。
　実施例１
　　COMP-Z運搬体の作製：
（COMP ODのクローニング）
　下記の方法によりCOMPのオリゴマー化ドメイン（oligomerization domain：OD）をクローニングした。すなわち、COMP ODの55アミノ酸残基（配列番号５）にスペーサー配列として(G4S)3のアミノ酸配列を付加した産物を得るため、配列番号１２のセンスプライマーと配列番号１３のアンチセンスプライマーを作製し、アニールさせた後にpCR2.1ベクターに導入し、サブクローニングした。
　COMP ODのサブクローニング完了後、塩基配列を確認し、再度配列番号１４のセンスプライマーおよび配列番号１５のアンチセンスプライマーを用いてPCRでCOMP OD遺伝子を増幅し、制限酵素NcoI, XhoIで処理した後に大腸菌発現ベクターであるpET-22bのNcoI-XhoI部位にサブクローニングし、大腸菌DH5アルファに一般的なリン酸カルシウム法によって形質転換した。さらに、ベクターに存在する薬剤耐性マーカーであるアンピシリンによってスクリーニングを行ない、目的の遺伝子導入クローンを選択した。そのクローンをタンパク質発現大腸菌株であるBL21(DE3)に再度、リン酸カルシウム法によって形質転換し、アンピシリンによるスクリーニング後、COMP ODの発現コンストラクトを構築した。本発現株は一般的なLB-アンピシリン含有(LB-Amp)培地100ｍｌで37℃一昼夜、前培養し、つづいて250ｍｌのLB-Amp培地４本にOD600 nm = 0.1になるように植菌し、37℃で1.5時間培養した。この時点で濁度OD 600 nｍを測定し、OD = 0.4から0.6であることを確認し、最終濃度が1mMになるようにイソプロピル-β-チオガラクトピラノシド(IPTG)を加えて、37℃で一昼夜培養し、タンパク質の発現誘導を行なった。発現誘導後、培養上清を遠心分離し（8,000 rpm、20min、4℃、2times）、0.45マイクロメートルのフィルターで濾過後にHis-tagカラムを用いてアフィニティークロマトグラフィーで精製し、精製タンパク質の一部を15％アクリルアミド濃度SDS-PAGEを行なうことで、COMP OD部分の発現を確認した。
　さらにCOMP ODの保存領域だけを選択し46アミノ酸配列のよりコンパクトな配列(配列番号６)だけを使用したCOMP ODを以下の方法により発現させた(COMP(Gly27-Gly72))。
　COMP(Gly27-Gly72)部分だけを増幅するために先に構築したpET-22b-COMP ODを鋳型にし、配列番号１６のセンスプライマーおよび配列番号１７のアンチセンスプライマーを用いてPCRを行い、COMP(Gly27-Gly72)部分を増幅し、制限酵素NcoI、XhoIで処理した後に発現ベクターであるpET-22bのNcoI-XhoI部位にサブクローニングし、COMP(Gly27-Gly72)の発現コンストラクトを構築した（pET-22b-COMP(Gly27-Gly72)）。塩基配列を確認後、発現解析を行い、本コンストラクトは培養上清にCOMP(Gly27-Gly72)を優位に分泌発現することが分かった。
　（リンカー領域の導入）
　次にCOMP(Gly27-Gly72)部分にリンカー領域を導入した。リンカー領域としてGPGPとG4Sを組み合わせ、さらにリンカー領域にタンパク質精製用タグとして使われるHisx6を併用したGPGP(G4S)H6(G4S)GPGP（配列番号１８）からなるリンカー領域をCOMP ODのC末端部分に導入した。具体的なリンカー導入方法としては5’をリン酸化した配列番号１９のセンスプライマーおよび配列番号２０のアンチセンスプライマーを用いてリンカー領域をアニールさせた後、pET-22b-COMP(Gly27-Gly72)のXhoI部位にサブクローニングして構築を行った(pET-22b-COMP(Gly27-Gly72)-flexible linker)。塩基配列を確認後、発現解析を行い、本コンストラクトはCOMP(Gly27-Gly72)同様に培養上清にCOMP(Gly27-Gly72)-flexible linkerを優位に分泌発現することが分かった。
　（リガンド部分の融合）
　上記COMP(Gly27-Gly72)-flexible linkerに下記方法によりリガンド部分の構築を行なった。リガンドとしてStaphylococcus aureus 由来タンパク質Protein A (SpA)由来のBドメインホモログである抗体結合ドメイン(Zドメイン)を用いた（配列番号７）。このZドメインを先に構築したCOMP(Gly27-Gly72)-flexible linkerのC末端側に遺伝子工学的に融合させ構築した。具体的には配列番号２１のセンスプライマーおよび配列番号２２のアンチセンスプライマーの合成オリゴを作製し、アニールさせた後にpCR2.1ベクターに導入し、Zドメインのクローニングを完了した。塩基配列を確認後、制限酵素SalI、XhoIで処理した後に、pET-22b-COMP(Gly27-Gly72)-flexible linkerのXhoI部位にサブクローニングして構築を完了させた(pET-22b-COMP-Z)。
（COMP-Zタンパク質の培養、発現誘導及び精製方法）
　pET-22b- COMP-Zを含有する大腸菌BL21(DE3)株のフリーズストックから10μlを100 mlの LB-Amp培地に植菌し、37℃で一昼夜前培養した。つづいて250ｍｌのLB-Amp培地４本にOD600 nm = 0.1になるように植菌し、37℃で1.5時間培養した。この時点で濁度OD 600 nｍを測定し、OD = 0.4から0.6であることを確認し、最終濃度が1mMになるようにイソプロピル-β-チオガラクトピラノシド(IPTG)を加えて、37℃で一昼夜培養し、タンパク質の発現誘導を行なった。発現誘導後、全ての培養液を統一し、遠心分離し（8,000 rpm、20min、4℃、2times）、菌体と培養上清に分離した。その際、培養上清の一部を発現解析用に回収した。つづいて、培養上清を0.45 マイクロメートルのフィルターで濾過し、クロマトアプライ用サンプルとして調整した。COMP-ZのアフィニティークロマトグラフィーにはIgGセファロース樹脂（GEヘルスケア社）10 mlをオープンカラムに詰めて精製カラムを用意した。カラムの平衡化溶液としてカラム容量の2～3倍量のTST緩衝液(pH 8.0)でpHが8.0になるまで平衡化し、次にカラム容量の2～3倍量の0.5 M酢酸溶液(pH 3.5)を流した。これもpHが3.5になるまで平衡化し、このステップを二回繰り返し、最終的にTST緩衝液(pH8.0)でpHが8.0になるまで平衡化した（TST→酢酸→TST→酢酸→TST）。
　次に調整したサンプル溶液を自然落下、もしくはペリスタポンプ等でカラムにアプライし、アフィニティークロマトグラフィーを実施した。
　サンプルアプライ終了後、次に洗浄を行なった。10倍量のTST緩衝液(pH 8.0)で洗浄し、次に2倍量の0.5 M酢酸アンモニウム溶液(pH 5.5)で洗浄した。洗浄後、溶出buffer(0.5 M酢酸溶液(pH 3.5)を用いて50 mlで溶出した。培養上清、素通り画分、洗浄画分、溶出画分を15％アクリルアミド濃度SDS-PAGEで解析した。泳動後、発現パターンを確認し、溶出画分に発現が確認出来たら、限外濾過膜（Amicon Ultra-4 50K ）にて濃縮し、PBSで置換した。PIERCE社のBCA Protein Assay Reagent (bicinchoninic acid)試薬を用いたBCA法により定量したところ、COMP-Z融合タンパク質の濃度は6 mg/mlであり、総タンパク質量は30mgとなった。
（COMP-Zのエンドトキシン除去処理）
　大腸菌で作製したリコンビナントはエンドトキシンの混入が考えられるため、免疫実験を行なうにあたってエンドトキシンの除去およびタンパク質溶液のエンドトキシン濃度を検定した。
　COMP-Zは高分子量のタンパク質であるのに対し、エンドトキシンは約10 kDaなので50 kDaの透析膜による処理を行なった。透析外液としてはPBSを用い4℃で数時間毎に外液を交換することで最終的に一昼夜透析した（約4～5回の1LのPBSによって透析した）。
　この透析済みサンプルをエンドトキシン除去カラム（PIERCE社；Detoxi-Gel Endotoxin Removal Gel）にアプライし、エンドトキシンを除去した。エンドトキシン除去カラム後のサンプルをBCA定量し、リムルス試験(LAL)によりエンドトキシン濃度を検定した。
　すなわち、LALのPyrogen Single Test 25回用を用いて最終容量を0.25 mlに希釈したサンプルを用いて検査した。サンプルの希釈にはエンドトキシンフリー水を用いた。必要濃度に調整したサンプル溶液を注射器でバイアルに注入し、軽く混合し、転倒しないように箱等に入れて37℃で一時間反応させた。反応後、静かに取り出して逆さにし、凝固していたら、エンドトキシン陽性、凝固してないもしくは溶液が一部溶けて落ちてくる場合はエンドトキシン陰性と判断した。陰性になる希釈ポイントの一段階前がエンドポイントと定義されるので、そこからエンドトキシンのUnit数を計算し、500 pg エンドトキシン/μg of proteinのレベル以上であった場合には、再度エンドトキシン除去カラムにアプライし、同様の操作を500 pg エンドトキシン/μg of protein以下となるレベルまで繰り返し行った。
　実施例２
　　ワクチン－運搬体融合体の作製（１）：
　三日熱マラリア原虫の伝搬阻止抗原であるPvs25をCOMP-Zの内部に存在するSH基を利用し、化学的結合によってCOMP-Zに融合した。ワクチン抗原Pvs25は酵母Pichia pastorisで発現した均一な立体構造を持つPvs25H Aフォーム(Pvs25H-A)を用いた。融合に必要なクロスリンカーとしてSPDPを用い、以下のような反応経路で融合体COMP-Z/Pvs25H-Aを完了させた。
　融合に関しては、COMP-Z 5量体 (1 mg; 373 μl;13,793 pmol;) Pvs25H-A (2.84 mg; 499 μl; 137,864.08pmol)で行なった（COMP-Zの分子量は72.5 kDa、Pvs25H-Aの分子量は20.6 kDaであり、COMP-Zが1 molに対してPvs25H-A 10 molである。）
（還元処理）
　まずCOMP-ZのSH基を還元型にするために還元処理を行なった。COMP-Zは大腸菌で発現させた状態のままでも還元型SH基を有しているが、最大限利用できるSHの数を増加させるためである。COMP-Z 1ｍｇを1,379.3 nmolのDTTを加えた後、37℃で30分間反応させた。その後、限外濾過膜（Amicon Ultra-4 10K；5000 x g 20 min×4 times with PBS）でDTTを除去した。
（融合処理）
　使用直前にSPDP 2 mgを320 μlのDMSOに溶解し、20 mM SPDP溶液を調製した。20 mM SPDP溶液 45 μlを2.84 mgのPvs25H-A（1.5 mlにPBSで調整）を加え、60分間室温でインキュベートした（Pyridyldithiol-activated Pvs25H-Ａの作製）。限外濾過膜（Amicon Ultra-4 10k；5000 x g 20 min×4 times with PBS）を用いて精製し、化学反応の副産物と過剰なSPDPを除去した。精製したPyridyldithiol-activated Pvs25H-Ａ （solution volumeは200μl）に 還元処理済みの1mg COMP-Z（240μl）を加え、一晩室温でインキュベートした。Amicon Ultra-4 10k（5000 x g 20 min×4 times）を使用し、化学反応の副産物（Pyridine 2-thione）を除去し、PBSにバッファー交換して融合タンパク質COMP-Z/Pvs25H-Aを得た。
（結合パートナー分子の定量）
　ワクチン融合運搬体の濃度をBCAで定量した。得られたワクチン融合運搬体（COMP-Zあたりが）100 μgとコントロールとして実施例１で得られたCOMP-Z 100μgについてTotal 300μlにfill upして、IgGセファロース（TSTで平衡化済み、50% スラリー）200μlと反応させ、４℃で2時間ローテーターを用いて吸着させた。遠心し（600 x g 2 min）、上清(500μl)を回収した。つぎにTST 1000μlで洗浄し、遠心し（600 x g 2 min）、洗浄画分１を回収した。さらに0.5 M酢酸アンモニウム溶液(pH 5.5)200μlで洗浄し、遠心し（600 x g 2 min）、洗浄画分２を回収した。最後に0.5 M酢酸溶液(pH 3.5)100μlで懸濁し、10 min間混合処理を行った後、遠心し（600 x g 2 min）、100μlを回収した。回収した各BCA定量によって算出したタンパク質量から非結合分子量を導きだし、最終的に結合分子量を計算した。
　すなわち、上清と洗浄画分に存在するタンパク質はフリーのパートナー分子（ワクチン抗原）だと仮定し、アプライしたタンパク質量から逆算して、結合したパートナー分子の割合を算出した。最初にアプライしたタンパク質量は115.7μgであるので、割合としてはPvs25H-Aは85.5698μgでCOMP-Zは30.1302μgとなる。Pvs25H-A 85.35698μg中の48.82326μg（上清と洗浄画分のタンパク質量）が結合しなかった量になり、つまり36.53338μgが結合していることになる。molで計算すると1773.3 pmolのPvs25H-Aが結合していることになる。30.1μgのCOMP-Zは415.17pmolなので、つまりPvs25H-A:COMP-Z=4.3:1のモル比となる。最終的に1分子のCOMP-Zに4.3分子のPvs25H-Aが結合した融合体として作製できていることが示された。
（COMP-Z/Pvs25H-Aの融合確認）
　COMP-ZがイムノグロブリンのFc領域に結合する性質を利用し、Pvs25H-A特異的ELISA法によってPvs25H-AがCOMP-Z分子に物理的に結合していることを確認した。まず、SUMILON 96well ELISA plate S typeにキャプチャー抗体としてHuman IgG(hIgG)を5μg/mlの濃度で各wellに50μlずつアプライし、4℃で一昼夜反応させ、コートさせる。hIgGをコートしたELISAプレートに1% BSA in PBS溶液を150μl/wellで加え、37℃2時間反応させ、ブロッキング反応を行なった。ブロッキング後に各アプライサンプルをCOMP-Zあたり2μg/wellの濃度でCOMP-Z或いはCOMP-Z/Pvs25H-A融合分子を加え、37℃2時間反応させた。この反応でFc/Z間の結合により両コンストラクトが捕らえられる。さらに、キャプチャー抗体（hIgG）と結合していない可能性のある「フリー」の状態のZドメインをマスキングする目的で過剰量のhIgG（5μg/ml）を各wellに50μlずつアプライし37℃2時間反応した。その後、一次抗体として抗Pvs25マウスIgG抗血清（200倍希釈）を50μl/wellでアプライし、37℃2時間反応させた。つづいて二次抗体としてAP conjugate抗マウス抗体（3,000倍希釈）を50μl/wellでアプライし、37℃2時間反応させた。最後にAP基質(Bio-Rad社)を用いて37℃で反応させ、適切な反応時間(5min、10min、20min)でOD415nmを測定することで、Pvs25H-A抗原特異的シグナルを検出した結果、COMP-ZとCOMP-Z/Pvs25H-Aのシグナルの違いからCOMP-ZにPvs25H-Aが結合していることが直接的に証明された。
　実施例３
　　免疫原性確認試験：
　Balb/cマウス、♀、7週齢（日本SLC）に、Pvs25H-A（S）30μgを皮下（s.c.）、腹腔内（i.p）、静脈内（i.v.）、経鼻（i.n.）で3回（0、2、4週目）投与した（n=7、静脈内投与群のみn=2）。同様にして、Pvs25H-A 30μgとCOMP-Z 10.6μgを混合した試料（M）または実施例2で得られたCOMP-Z/Pvs25H-A（L）40.6μgを投与した。さらに、コレラ毒素（CT;LBL）1μgと試料S、L、MをPvs25H-Aあたり30μgになるように調製したものを経鼻で投与した（i.n./CT）。またフロイントアジュバント(IFA)を抗原投与容量と同量（ここでは100μl）と試料Sを30μgを混合したものを皮下投与した。さらにIFAの非存在下で、S、M、LをPvs25H-Aあたり30μgになるように調製したものを皮下投与した。1、3、5週目に部分採血を行い、5週目のPvs25H-Aに対する抗体価の上昇を確認し、6週目に最終採血を行った。抗体価の解析はELISA法により行った。6週目の血清を50倍希釈で用い、コート抗原にPvs25H-A(5μg/ml)を用い、50倍希釈の血清、3000倍希釈のAP conjugate抗マウス抗体を用いてAP基質によるOD415nmを測定することによって行なった。ネガティブコントロールとして非免疫群の血清を用いた。結果を図1に示す。
　この結果から、今回作製した新規ワクチン融合体は一般的なワクチンの効果として考えられるIFA存在下の抗原単独混合群で見られた抗体価以上の応答をIFAの存在なしに達成することができた。つまりこの新規ワクチン融合体は皮下免疫において既存のアジュバントなしに優位に抗体産生を誘導することができ、今回用いたリガンドである抗体結合ドメインがB細胞の表面に存在するイムノグロブリンに作用し、抗体の産生応答が見られたと推測される。
　実施例４
　　伝搬阻止解析：
　実施例３で得られた血清を各群（s.c./IFA S、s.c.S、s.c.M、s.c.L、i.n.S、i.n./CT S、i.n./CT M、i.n./CT L）で混合し、混合血清をサンプルとした。アッセイは、4名の患者血液（三日熱マラリア原虫生殖母体）を用いた。患者血液180μｌに、混合血清90μｌと正常ヒト血清90μｌを混合した180μｌを添加し、メンブレンフィーダーに入れて蚊（Anopheles dirus）に吸血させた。蚊の中腸におけるオーシスト形成数を顕微鏡観察によって測定した。結果を図２に示す。
　この結果から、今回作製した新規マラリアワクチン融合分子は抗体産生が優位に上昇した群で、実際の三日熱マラリア原虫を完全に殺傷する能力があることが分かった。さらにS、M 、Lの順番で殺傷能力が上昇していることから、今回作製した分子によって誘導した抗体は実際のマラリア原虫を認識する能力があり、その効果はリガンド付加することでさらに上昇することが証明できた。またMの混合群においてもある程度の効果を示すことから、作製したCOMP-Z分子自身にもアジュバント活性がある可能性が示された。
　実施例５
　　細胞標的機能解析：
　実施例１で得られたCOMP-Zの細胞標的機能をフローサイトメトリーの手法を用いて解析を行った。すなわち、7週齢のBalb/cマウスから脾臓を摘出し、脾臓細胞を調製する。この得られた脾臓細胞約10５cellsを用いて、標識B細胞マーカーと標識COMP-Zで検出し、標的機能を調べた。B細胞マーカーとしてはFITC標識した抗CD19抗体を0.2 mg/mlの濃度で用いた。COMP-ZはMaleimide-PEO2-Biotin によってビオチン化し、更に0.0001 mg/ml の濃度でPE-Streptavidin（SA-PE）を用いて検出を行った。より具体的には、0.01mgのビオチン化COMP-Zを１％BSA in PBSで懸濁した10５cells/100mlに調製した脾臓細胞と混合し、氷中で30min反応させた。次にマスキングとしてhIgGを50 mg/mlの濃度で加えて、4℃で30min反応させた。更にFc受容体阻害剤としてハムスターイムノグロブリンを加えて、4℃で30min反応させた。その後に遠心分離して（1500 rpm, 5min）上清を捨て、100mlの１％BSA in PBSで懸濁する。次にFITC-抗CD19抗体とSA-PEを加えて、4℃で30min反応させた。その後に遠心分離して（1500 rpm, 5min）上清を捨て、100mlの１％BSA in PBSで懸濁した。つづいて再度、遠心分離して（1500 rpm, 5min）上清を捨て、最終的に1%ホルムアルデヒドで懸濁して、フローサイトメトリー用サンプルとした。リガンドのないサンプルとしてCOMP ODを同時に用いてネガティブコントロールとした。フローサイトメトリー解析はBD社のFACSシステムのマニュアルに準じて行った。結果を図３に示す。
　この解析から、COMP ODではB細胞とタンパク質が結合していることを示すURには5.25％の割合であったが、COMP-ZではURは13.15％と上昇しており、これはCOMP-ZがB細胞へ結合していることを示している。
　実施例６
　　TBCC-Z運搬体の作製：
（TBCC（wt）- flexible linkerのクローニング）
　コア分子としてTBCCを用いて融合体を作製した。TBCCは野生型配列（配列番号３４）を用いたものをTBCC (wt)と表記する。
　COMP-Zの作製ではflexible linkerはCOMPのクローニング後に導入したが、TBCCの場合は便利性を考えて同時にクローニングを行った。具体的な導入方法としては、まず、最初にTBCC（wt）- flexible linkerのクローニングを行った。すなわち、TBCC（wt）- flexible linkerの７９アミノ残基（配列番号２４）を得るため、配列番号２５のセンスプライマーと配列番号２６のアンチセンスプライマーを作製し、アニールさせた後にpCR2.1ベクターに導入し、サブクローニングした。
　制限酵素Nco I、Xho Iで処理した後に大腸菌発現ベクターであるpET-21dのNco I-Xho I部位にサブクローニングし、大腸菌DH5アルファに一般的なリン酸カルシウム法によって形質転換した。さらに、ベクターに存在する薬剤耐性マーカーであるアンピシリンによってスクリーニングを行い、目的の遺伝子導入クローンを選択した。そのクローンをタンパク質発現大腸菌株であるBL21(DE3)に再度、リン酸カルシウム法によって形質転換し、アンピシリンによるスクリーニング後TBCC（wt）-flexible linkerの発現コンストラクトを構築した。本発現株は一般的なLB-amp培地100mlで37℃一昼夜、前培養し、つづいて250ｍｌのLB-Amp培地４本にOD600 nm = 0.1になるように植菌し、37℃で1.5時間培養した。この時点で濁度OD 600 nｍを測定し、OD = 0.4から0.6であることを確認し、最終濃度が1mMになるようにイソプロピル-β-チオガラクトピラノシド(IPTG)を加えて、37℃で一昼夜培養し、タンパク質の発現誘導を行なった。発現誘導後、培養上清を遠心分離し、0.45 μmのフィルターで濾過後にHis-tagカラムを用いてアフィニティークロマトグラフティー精製し、精製タンパク質の一部を15 %アクリルアミド濃度SDS-PAGEを行うことで、TBCC（wt）-flexible linker部分の発現を確認した。
（リガンド部分の融合）
　上記TBCC（wt）-flexible linkerに下記方法によりリガンド部分の構築を行った。リガンドとしてStaphylococcus aureus由来タンパク質protein A (SpA)由来のBドメインホモログである抗体結合ドメイン（Zドメイン）を用いた（配列番号７）。このZドメインを先に構築したTBCC（wt）-flexible linkerのC末端側に遺伝子工学的に融合させ構築した。具体的には配列番号２１のセンスプライマーおよび配列番号２２のアンチセンスプライマーの合成オリゴ作製し、アニールさせた後にpCR2.1ベクターに導入し、Zドメインのクローニングを完了した。塩基配列を確認後、制限酵素Sal I, Xho Iで処理した後に、pET-21d-TBCC（wt）-flexible linkerのXho I部位にサブクローニングし、構築を完了させた（pET-21d-TBCC（wt）-Z）。
　（Cys残基導入コンストラクトTBCC（Cys）-Zの作製）
　TBCC（wt）-Z(配列番号２７)はワクチン抗原等を遺伝子工学的に結合できるが、化学融合の際に利用するシステイン残基を有していないため、システイン残基を導入したコンストラクトであるTBCC（S52C）-Z(配列番号２８)およびTBCC（C60）-Z(配列番号２９)を作製した。TBCC（S52C）-ZはTBCC（wt）-Zの52番目のセリン残基をシステイン残基に置換したコンストラクトである。TBCC（C60）-ZはTBCC（wt）-Z の60番目のアミノ酸にシステイン残基を挿入したコンストラクトである。Cysの導入方法はQuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit （ストラタジーン社）を用いて行った。具体的にはTBCC（S52C）-ZはTBCC（wt）-Zを鋳型に配列番号３０のセンスプライマーと配列番号３１のアンチセンスプライマーを用い、TBCC（C60）-ZはTBCC（wt）-Zを鋳型に配列番号３２のセンスプライマーと配列番号３３のアンチセンスプライマーを用い、PCR法により目的産物の増幅を行った。得られた各々のPCR増幅産物に対してDpn Iを1μl添加し37℃で1 hrインキュベートした後、大腸菌XLI-Blue株に形質転換を行った。LB-amp培地によってスクリーニングし、得られた各々のクローンを構築し、塩基配列を確認した。その後各々を大腸菌BL21（DE3）株に形質転換した。
　（各種TBCC-Z（野生型、およびCys導入型）のタンパク質の培養、発現誘導及び精製方法）
　各種pET-21d-TBCC-Zを含有する大腸菌BL21（DE3）株のフリーズストックから10μlを100mlのLB-amp培地に植菌し、37℃で一晩培養した。つづいて250ｍｌのLB-Amp培地４本にOD600 nm = 0.1になるように植菌し、37℃で1.5時間培養した。この時点で濁度OD 600 nｍを測定し、OD = 0.4から0.6であることを確認し、最終濃度が1mMになるようにイソプロピル-β-チオガラクトピラノシド(IPTG)を加えて、37℃で一昼夜培養し、タンパク質の発現誘導を行なった。発現誘導後、全ての培養液を統一し、遠心分離し（8,000 rpm、20 min、4℃、2 times）、菌体と培養上清に分離した。培養上清の一部を発現解析用に回収した。
　培養上清に最終濃度20 mMとなるようにイミダゾールを添加後、0.45μmフィルターで濾過し、クロマトアプライ用サンプルとして調整した。HisTrapカラム（GEヘルスケア社） 5 mlに、カラムを平衡化するため、洗浄バッファー（20 mM イミダゾール、20 mMリン酸バッファー、pH 7.4）をカラム容量の5倍アプライした。平衡化したカラムに、調整したサンプルに対しペリスタポンプを利用してアプライし、アフィニティークロマトグラフィーを行った。
　サンプルアプライ終了後、次に洗浄および溶出を行った。カラムに対し5倍量の洗浄バッファーで洗浄し、次にカラムに対し5倍量の溶出バッファー（500 mM イミダゾール、20 mMリン酸バッファー、pH 7.4）で溶出した。培養上清、素通り画分、洗浄画分、溶出画分を15 %アクリルアミド濃度SDS-PAGEで解析した。泳動後、発現パターンを確認し、溶出画分に発現が確認されたら、限外濾過膜（Amicon Ultra-15 30kDa）にて濃縮し、PBSに置換した。次いで、さらに精製度を上げるために、濃縮されたTBCC-Z溶液に最終濃度50 mM DTTを添加後30分間室温で振とうし、PBSにて10倍に希釈し（最終濃度5 mM DTT）、再度HisTrapカラム（5 ml）にアプライした。そして次に洗浄バッファーをカラムの5倍量アプライし、次にカラムに対し5倍量の溶出バッファーで溶出させた。カラム処理前サンプル、素通り画分、洗浄画分、溶出画分を15 %アクリルアミド濃度SDS-PAGEで解析した。泳動後、発現パターンを確認し、溶出画分に発現が確認されたら、限外濾過膜（Amicon Ultra-15 30kDa）にて濃縮し、PBSに置換した。BCA protein Assay Reagent（bicinchoninic acid）（PIERCE社）を用いてタンパク質の定量を行った結果TBCC-Zタンパク質の濃度はTBCC（wt）-Zが3.1 mg、TBCC（S52C）-Zが14.5 mgそしてTBCC（C60）-Zが10.2mgとなった。TBCC（S52C）-ZおよびTBCC（C60）-ZをまとめてTBCC(Cys)-Zと標記する。
（各種TBCC-Zのエンドトキシン除去処理）
　大腸菌で作製したリコンビナントはエンドトキシンの混入が考えられるため、免疫実験を行うにあたってエンドトキシンの除去およびタンパク質溶液のエンドトキシン濃度を検定した。
　TBCC-Zは分子量が約60 kDaであるのに対し、エンドトキシンは分子量が約10 kDaなので50 kDaの透析膜による限外濾過処理を行った。透析外液はPBSを用い、4℃で数時間毎に外液を交換することで最終的に一昼夜透析を行った。
この透析済みサンプルをエンドトキシン除去カラム（PIERCE社：Detoxi-Gel Endotoxin Removal Gel）にアプライし、素通りした画分を回収した後、BCA定量を行いリムルス試験（LAL）によりエンドトキシン濃度を検定した。すなわち、LALのPyrogen Single Test 25回用を用いて最終容量を0.25 mlに希釈したサンプルを用いて検査した。サンプルの希釈にはエンドトキシンフリー水を用いた。必要濃度に調整したサンプル溶液を注射器でバイアルに注入し、軽く混合し、転倒しないように箱等に入れて37℃で一時間反応させた。
1時間後、振動を与えないようにインキュベーターから取り出し、一度転倒させた。サンプル溶液が凝固したならば、エンドトキシン陽性、凝固していないもしくは、一部だけ溶けて落ちる場合はエンドトキシン陰性と判断した。陰性になる希釈ポイントの一段階前がエンドポイントと定義されるので、そこからエンドトキシンのUnit数を計算し、500 pgエンドトキシン/μg of proteinのレベル以上であった場合には、再度エンドトキシン除去カラムにアプライし、同様の操作を500 pgエンドトキシン/μg of protein以下となるレベルまで繰り返し行った。
　実施例７
　　ワクチン－運搬体融合体の作製(２)：
　三日熱マラリア原虫の伝播阻止抗原であるPvs25をTBCC(Cys)-Zの内部に存在するSH基を利用し、化学結合によりTBCC（Cys）-Zに融合した。ワクチン抗原Pvs25は酵母Pichia pastorisで発現した均一な立体構造を持つPvs25H Aフォーム（Pvs25H-A）を用いた。融合に必要なクロスリンカーとしてSPDPを用い、以下の反応方法で融合体TBCC-Z/Pvs25H-Aを完了させた。
　融合に関しては、TBCC-Z tetramer（2 mg： 1.55 ml： 34 nmol）、Pvs25H-A（2.8 mg：1.46 ml：137.2 nmol）で行った。
　（還元処理）
　まず、TBCC（Cys）-ZのSH基を還元型にするために還元処理を行った。TBCC(Cys)-Zは大腸菌で発現させた状態でも還元型SH基を有しているが、最大限利用できるSH基の数を増加させるために、還元処理を行った。TBCC（Cys）-Z （4 mg）溶液に最終濃度50 mMのDTTを添加した後、室温で30分間振とうした。その後、限外濾過膜による処理（Amicon Ultra-4 10k；5000×g　20 min×4 times with PBS）でDTTを除去し、BCA定量法によりタンパク質濃度を決定した。
　（融合処理）
　使用直前にSPDP 2 mgを320 μlのDMSOに溶解し、20 mM SPDP溶液を調製した。20 mM SPDP溶液 84 μlを5.6 mg/2.8 mlのPvs25H-Aを加え、60分間室温でインキュベートした（Pyridyldithiol-activated Pvs25H-Ａの作製）。限外濾過膜（Amicon Ultra-4 10k；5000 x g 20 min×4 times with PBS）を用いて精製し、化学反応の副産物と過剰なSPDPを除去した。精製したPyridyldithiol-activated Pvs25H-Ａ （2.8 mg/1.46 ml）に 還元処理済みの2 mg TBCC（Cys）-Z（1550 μl）を加え、一晩室温でインキュベートした。Amicon Ultra-4 10k（5000 x g 20 min×4 times）を使用し、化学反応の副産物（Pyridine 2-thione）を　除去し、PBSにバッファー交換して融合タンパク質TBCC(Cys)-Z/Pvs25H-Aを得た。
（TBCC-Z/Pvs25H-Aの融合確認）
　TBCC-ZがイムノグロブリンのFc領域に結合する性質を利用し、Pvs25H-A特異的ELISAによってPvs25H-AがTBCC（Cys）-Z分子に物理的に結合していることを確認した。まず、SUMILON 96 well ELISA Plate S typeにキャプチャー抗体としてHuman IgG（h IgG）をバイカーボネートバッファーを用いて5 μg/mlの濃度で各wellに50 μlずつアプライし、４℃で一晩反応させ、コートした。hIgGをコートしたELISAプレートに1 % BSA in PBS溶液を150 μl/wellで加え、37℃で2時間反応させ、ブロッキング反応を行った。ブロッキング後に各サンプルTBCC(Cys)-Zあたり2 μg/wellの濃度でTBCC(Cys)-Z或いはTBCC(Cys)-Z/Pvs25H-A融合分子を加え、37℃で2時間反応させた。この反応でFc/Z間の結合により両コンストラクトが捕らえられる。さらに、キャプチャー抗体（hIgG）と結合していない可能性のある「フリー」状態のZドメインをマスキングする目的で過剰量のhIgG（5 μg/ml）を各wellに50 μlずつアプライし37℃で2時間反応させた。その後、一次抗体として抗Pvs25マウスIgG抗血清（200倍希釈）を50 μl/wellでアプライし、37℃で2時間反応させた。つづいて二次抗体としてAP conjugate抗マウス抗体（3,000倍希釈）を50μl/wellでアプライし、37℃2時間反応させた。最後にAP基質(Bio-Rad社)を用いて37℃で反応させ、適切な反応時間(5min、10min、20min)でOD415nmを測定することで、Pvs25H-A抗原特異的シグナルを検出した結果、TBCC(Cys)-ZとTBCC(Cys)-Z/Pvs25H-Aのシグナルの違いからTBCC(Cys)-ZにPvs25H-Aが結合していることが直接的に証明された。
　実施例８
　　免疫原性確認試験：
　Balb/cマウス、♀、7週齢（日本SLC）に、Pvs25H-A（S）30μgを皮下（s.c.）、経鼻（i.n.）で3回（0、2、4週目）投与した（n = 7）。同様にして、Pvs25H-A 30μgとTBCC（S52C）-Z 21.4μgもしくはTBCC（C60）-Z 21.4μgを混合した試料（M）または実施例６で得られたTBCC（S52C）-Z/Pvs25H-A（L）もしくはTBCC（C60）-Z/Pvs25H-A（L）51.4μgを投与した。さらに、コレラ毒素（CT；LBL）1μgと試料S、M、Lを混合し、経鼻投与した（i.n./CT）。また、不完全フロイントアジュバント（IFA）もしくはAlumアジュバントを抗原投与容量と同量（ここでは100μl）と試料Sを30μgを混合したものを皮下投与した（s.c./IFA、s.c./Alum）。
　さらにIFAの非存在下で、S、M、LをPvs25H-Aあたり30μgになるように調製したものを皮下投与した。1、3、5週目に部分採血を行い、5週目のPvs25H-Aに対する抗体価の上昇を確認し、6週目に最終採血を行った。抗体価の解析はELISA法により行った。6週目の血清を50倍希釈で用い、コート抗原にPvs25H-A(5μg/ml)を用い、50倍希釈の血清、4000倍希釈のAnti-mouse IgG-APを用いてAP基質によるOD415nmを測定することによって行なった。ネガティブコントロールとして非免疫群の血清を用いた。結果を図４に示す。
　この結果から、今回作製した新規ワクチン融合体は一般的なワクチンの効果として考えられるIFA存在下の抗原単独混合群で見られた抗体価と同等な応答を誘導することが可能であり、更にAlumアジュバントとの混合投与においてより増強させることができた。つまりこの新規ワクチン融合体は皮下免疫においてアジュバントの依存なしに抗体応答を誘導できるが、臨床に用いられているアジュバントを併用するとより効果の高い抗体産生を誘導することが示された。
　実施例９
　　伝搬阻止解析：
　実施例８で得られた血清を各群（s.c./IFA S、s.c.S、s.c.M、s.c.L、s.c./Alum S、s.c./Alum M、s.c./Alum L、i.n.S、i.n./CT S、i.n./CT L）で混合し、混合血清をサンプルとした。アッセイは、4名の患者血液（三日熱マラリア原虫生殖母体）を用いた。患者血液180μｌに、混合血清90μｌと正常ヒト血清90μｌを混合した180μｌを添加し、メンブレンフィーダーに入れて蚊（Anopheles dirus）に吸血させた。蚊の中腸におけるオーシスト形成数を顕微鏡観察によって測定した。結果を図５に示す。
　この結果から、今回作製したTBCCをコアとして用いた新規マラリアワクチン融合分子は抗体産生が優位に上昇した群で、実際の三日熱マラリア原虫を完全に殺傷する能力があることが分かった。さらにS、M 、Lの順番で殺傷能力が上昇しているほか、Alumとの併用投与によって、より殺傷能力が高くなることがわかり、既存のアジュバントの効果を増強させる可能性がある。
　実施例１０
　　ワクチン－運搬体融合体の作製(３)：
　MSP1-19を搭載した融合体を作製し、その抗体応答機能を調べた。MSP1-19はPvs25と同じマラリア抗原ではあるが、メロゾイト期の抗原であり、伝搬阻止抗原であるPvs25は、蚊の中でマラリア原虫が発現するものであるのに対して、MSP1-19は、ほ乳類の中でマラリア原虫が発現する抗原である。
　具体的にはMSP1-19をTBCC(Cys)-ZおよびCOMP-Zの内部に存在するSH基を利用し、化学結合によりに融合した。ワクチン抗原MSP1-19は酵母Pichia pastorisで発現した均一な構造を持つMSP1-19 Sフォーム（MSP1-19H-S）を用いた。融合に必要なクロスリンカーとしてSPDPを用い、以下の反応方法で融合体TBCC(Cys)-Z /MSP1-19H-SおよびCOMP-Z/MSP1-19H-Sを完了させた。
　融合に関しては、TBCC-Z tetramer（750 μg： 625 μl： 12.5 nmol）、COMP-Z pentamer（750 μg： 625 μl： 10.4 nmol）、MSP1-19H-S （3 mg： 1.5ml： 210nmol）で行った。
　（還元処理）
　まず、TBCC(Cys)-ZおよびCOMP-ZのSH基を還元型にするために還元処理を行った。TBCC(Cys)-ZおよびCOMP-Zは大腸菌で発現させた状態でも還元型SH基を有しているが、最大限利用できるSH基の数を増加させるために、還元処理を行った。TBCC(Cys)-ZおよびCOMP-Z （4 mg）溶液に最終濃度50 mMのDTTを添加した後、室温で30分間振とうした。その後、限外濾過膜による処理（Amicon Ultra-4 10k；5000×g　20 min×4 times with PBS）でDTTを除去し、BCA定量法によりタンパク質濃度を決定した。
　（融合処理）
　使用直前にSPDP 2 mgを320 μlのDMSOに溶解し、20 mM SPDP溶液を調製した。20 mM SPDP溶液 84 μlを3 mg/1.5 mlのMSP1-19H-Sを加え、60分間室温でインキュベートした（Pyridyldithiol-activated MSP1-19H-Sの作製）。限外濾過膜（Amicon Ultra-4 10k；5000 x g 20 min×4 times with PBS）を用いて精製し、化学反応の副産物と過剰なSPDPを除去した。精製したPyridyldithiol-activated MSP1-19H-S （3mg/1.5 ml）に 還元処理済みの0.5 mg TBCC(Cys)-ZおよびCOMP-Z（500 μl）を加え、一晩室温でインキュベートした。Amicon Ultra-4 10k（5000 x g 20 min×4 times）を使用し、化学反応の副産物（Pyridine 2-thione）を除去し、PBSにバッファー交換して融合タンパク質TBCC(Cys)-Z /MSP1-19H-SおよびCOMP-Z/MSP1-19H-Sを得た。
（TBCC(Cys)-ZおよびCOMP-Zの融合確認）
　TBCC-ZがイムノグロブリンのFc領域に結合する性質を利用し、MSP1-19H-S特異的ELISAによってMSP1-19H-SがTBCC(Cys)-ZおよびCOMP-Z分子に物理的に結合していることを確認した。まず、SUMILON 96 well ELISA Plate S typeにキャプチャー抗体としてHuman IgG（h IgG）をバイカーボネートバッファーを用いて5 μg/mlの濃度で各wellに50 μlずつアプライし、４℃で一晩反応させ、コートした。hIgGをコートしたELISAプレートに1 % BSA in PBS溶液を150 μl/wellで加え、37℃で2時間反応させ、ブロッキング反応を行った。ブロッキング後に各サンプルTBCC(Cys)-ZおよびCOMP-Z分子あたり2 μg/wellの濃度でTBCC-Z/MSP1-19H-SおよびCOMP-Z/MSP1-19H-S融合分子を加え、37℃で2時間反応させた。この反応でFc/Z間の結合により両コンストラクトが捕らえられる。さらに、キャプチャー抗体（hIgG）と結合していない可能性のある「フリー」状態のZドメインをマスキングする目的で過剰量のhIgG（5 μg/ml）を各wellに50 μlずつアプライし37℃で2時間反応させた。その後、一次抗体として抗MSP1-19マウスIgG抗血清（200倍希釈）を50 μl/wellでアプライし、37℃で2時間反応させた。つづいて二次抗体としてAP conjugate抗マウス抗体（3,000倍希釈）を50 μl/wellでアプライし、37℃2時間反応させた。最後にAP基質(Bio-Rad社)を用いて37℃で反応させ、適切な反応時間(5min、10min、20min)でOD415nmを測定することで、MSP1-19H-S抗原特異的シグナルを検出した結果、TBCC(Cys)-ZおよびCOMP-ZとTBCC(Cys)-Z /MSP1-19H-SおよびCOMP-Z/MSP1-19H-Sのシグナルの違いからTBCC(Cys)-ZおよびCOMP-ZにMSP1-19H-Sが結合していることが直接的に証明された。
　実施例１１
　　免疫原性確認試験：
　C57B/6マウス、♀、7週齢（日本SLC）に、MSP1-19H-S（S）30 μgを皮下（s.c.）、で3回（0、2、4週目）投与した。同様にして、MSP1-19H-S 30 μgとTBCC(Cys)-Z またはCOMP-Z 10.6 μgを混合した試料（M）または実施例１０で得られたTBCC(Cys)-Z /MSP1-19H-SおよびCOMP-Z/MSP1-19H-S（L）40.6 μgを投与した。さらに、フロイントアジュバント(IFA)を抗原投与容量と同量（ここでは100μl）と試料Sを30 μgを混合したものを皮下投与した。1、3、5週目に部分採血を行い、5週目のMSP1-19H-Sに対する抗体価の上昇を確認し、6週目に抗体価の解析を行った。抗体価の解析はELISA法により行った。6週目の血清を50倍希釈で用い、コート抗原にMSP1-19H-S (5 μg/ml)を用い、50倍希釈の血清3,000倍希釈のAP conjugate抗マウス抗体を用いてAP基質によるOD415nmを測定することによって行なった。ネガティブコントロールとして非免疫群の血清を用いた。結果を図６に示す。
　この結果から、今回作製した抗原を変更した新規マラリアワクチン融合分子についても抗原単独に比べて、有意に免疫応答が高かった。つまりTIPsに搭載した抗原は種類に関わらず免疫原性を増強させることができる可能性がある。TIPsの汎用性を証明する結果となった。
　本発明の薬物運搬体は、構成する分子群の設計の自由度が高いため汎用性が高く、かつ安全性にも優れるものであり、標的細胞または組織に効率的に薬物を運搬するとともに、薬物の作用を増強し得るものである。したがって、感染症等に対するドラッグデリバリーシステムのプラットフォームとして極めて有用である。

Claims (30)

  1. 　コイルドコイル構造を有する多量体タンパク質および免疫細胞のレセプターに対するリガンド分子とを含む薬物運搬体。
  2. 　コイルドコイル構造を有する多量体タンパク質を構成する単量体タンパク質と免疫担当細胞のレセプターに対するリガンドタンパク質とが結合した融合タンパク質がオリゴマー化したものである請求項１記載の薬物運搬体。
  3. 　融合タンパク質が、コイルドコイル構造を有する多量体タンパク質を構成する単量体タンパク質と免疫担当細胞のレセプターに対するリガンドタンパク質とがリンカーを介して結合したものである請求項１または２記載の薬物運搬体。
  4. 　コイルドコイル構造を有する多量体タンパク質が2量体から7量体のものである請求項１ないし３のいずれかの項記載の薬物運搬体。
  5. 　コイルドコイル構造を有する多量体タンパク質が、COMP（cartilage oligomeric matrix protein）、テトラブラキオンコイルドコア（TBCC）、レオウイルス（Reovirus）由来のσ1タンパク質およびヘパチチスデルタウイルス（Hepatitis delta virus）由来のヘパチチスデルタ抗原（HDAg）よりなる群から選ばれたものである請求項１ないし４のいずれかの項記載の薬物運搬体。
  6. 　コイルドコイル構造を有する多量体タンパク質が、COMP（cartilage oligomeric matrix protein）である請求項５記載の薬物運搬体。
  7. 　COMP（cartilage oligomeric matrix protein）が、配列番号５で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むものである請求項６記載の薬物運搬体。
  8. 　COMP（cartilage oligomeric matrix protein）が、配列番号５で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むものである請求項６記載の薬物運搬体。
  9. 　COMP（cartilage oligomeric matrix protein）が、配列番号６で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むものである請求項６記載の薬物運搬体。
  10. 　COMP（cartilage oligomeric matrix protein）が、配列番号６で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むものである請求項９記載の薬物運搬体。
  11. 　コイルドコイル構造を有する多量体タンパク質が、テトラブラキオンコイルドコア（TBCC）である請求項５記載の薬物運搬体。
  12. 　テトラブラキオンコイルドコア（TBCC）が、配列番号３４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むものである請求項６記載の薬物運搬体。
  13. 　テトラブラキオンコイルドコア（TBCC）が、配列番号３４で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むものである請求項６記載の薬物運搬体。
  14. 　免疫担当細胞のレセプターに対するリガンドタンパク質が、スタフィロコッカス（Staphylococcus）プロテインA由来の抗体結合ドメイン、Group G ストレプトコッカス（Streptococcus）G148のGタンパク質（SpG）由来のB1ドメイン、ファインゴルディア・マグナ（Finegoldia magna）由来のLタンパク質、補体系分子C3dおよびエルシニア・シュードチュベルキュロシスインベーシン（Yersinia pseudotuberculosis invasin)よりなる群から選ばれたものである請求項１ないし１３のいずれかの項記載の薬物運搬体。
  15. 　免疫担当細胞のレセプターに対するリガンドタンパク質が、スタフィロコッカス（Staphylococcus）プロテインA由来の抗体結合ドメインである請求項１４記載の薬物運搬体。
  16. 　スタフィロコッカス（Staphylococcus）プロテインA由来の抗体結合ドメインが、配列番号７で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むものである請求項１５記載の薬物運搬体。
  17. 　スタフィロコッカス（Staphylococcus）プロテインA由来の抗体結合ドメインが、配列番号７で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むものである請求項１５記載の薬物運搬体。
  18. 　配列番号２３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む請求項１記載の薬物運搬体。
  19. 　配列番号２３で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む請求項１記載の薬物運搬体。
  20. 　配列番号２７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む請求項１記載の薬物運搬体。
  21. 　配列番号２７で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む請求項１記載の薬物運搬体。
  22. 　配列番号２３で表されるアミノ酸配列または配列番号２３で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子。
  23. 　配列番号２７で表されるアミノ酸配列または配列番号２７で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子。
  24. 　請求項１ないし２１の何れかの項に記載の薬物運搬体にアジュバント分子が結合してなるアジュバント。
  25. 　薬物運搬体中のコイルドコイル構造を有する多量体タンパク質を構成する単量体タンパク質にアジュバント分子が結合したものである請求項２４記載のアジュバント。
  26. 　アジュバント分子が、コレラトキシン（CT）、コレラトキシンBサブユニット（CTB）、コレラトキシンAサブユニット（CTA）、百日咳菌毒素（PT）、百日咳菌毒素S1サブユニット（PTS1）、Toll様受容体9（TLR9）リガンド、Toll様受容体4（TLR4）リガンドおよび膜透過性機能を有するカチオン性ペプチドよりなる群から選ばれたものである請求項２４または２５記載のアジュバント。
  27. 　請求項１ないし２１のいずれかの項に記載の薬物運搬体にワクチン分子が結合してなるワクチン。
  28. 　薬物運搬体中のコイルドコイル構造を有する多量体タンパク質を構成する単量体タンパク質にワクチン分子が結合したものである請求項２７記載のワクチン。
  29. 　ワクチン分子が、節足動物媒介性疾患、寄生虫起因、細菌性またはウイルス性の感染症ワクチン候補抗原である請求項２７または２８記載のワクチン。
  30. 　ワクチン分子が、日本脳炎ウイルス外殻タンパク質またはマラリア原虫表層タンパク質である請求項２９記載のワクチン。
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