WO2010071217A1 - 抗歯周病菌剤及びそれを用いた医療用または歯科用材料 - Google Patents

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protamine
medical
complex
dental material
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忠男 福島
徹 早川
岡畑　恵雄
誠 御手洗
啓司 庵原
宏之 江成
治知 関戸
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株式会社マルハニチロ食品
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Definitions

  • the present invention relates to protamine showing growth inhibitory activity against periodontal pathogens, or a derivative thereof, an anti-periodontal fungus agent containing a hydrolyzate, and an anti-tooth containing a complex formed from them and an anionic polymer.
  • the present invention relates to a peripheral disease fungus and a medical or dental material.
  • Periodontal disease is caused by host factors and lifestyle habits such as smoking in addition to the involvement of multiple periodontal pathogens, and it is said that about 80% of adults in Japan are affected. .
  • Periodontal disease not only reduces the support function of the teeth, but also causes a decrease in quality of life (QOL) due to masticatory dysfunction associated with tooth loss, as well as cardiovascular diseases (endocarditis, coronary heart) Disease), pneumonia, premature birth, low-weight infant birth and other systemic disease risk factors have been reported. Therefore, the role played by the prevention and treatment of periodontal disease is not only significant in improving the quality of life of citizens in many countries such as Japan, but also in the clinical field.
  • QOL quality of life
  • Periodontal disease is the periodontal pathogen itself or the protease produced by the pathogen, which causes gingivitis, and when it progresses further, the inflammation spreads to the periodontal tissue and becomes periodontitis.
  • Most of the periodontal pathogens are Gram-negative obligate anaerobic bacteria, and typical pathogens include Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola, Tannerera forseisensis, Prevoterra intermedia, Aggregate bacter Actinomycetemcomitans ,and so on.
  • ⁇ -lactam, macrolide, and quinolone antibacterial agents are used as antibacterial agents against these periodontal pathogens. Depending on the progress, it is necessary to select or use an antibacterial agent. On the other hand, when the dose and the number of administrations increase, there may be a problem of side effects. As a result, the main treatment of periodontitis is the mechanical removal of plaque, tartar, root surface endotoxin, and surgical removal of inflammatory tissue. It is used only as an adjunct treatment except during acute attacks of peritonitis.
  • protamine a basic protein obtained from fish testis (Shirako)
  • Gingivalis a protease produced by Gingivalis (Kotani M, 5 others) “Inhibitory effects of protamines on proteolytic and adhesive activities of Porphiromonas gingivalis.”, Infection Immunity, 1999, Vol. 67, No. 9, p.4917-4920).
  • periodontal inflammation caused by periodontal pathogens can be effectively suppressed by containing protamine or a derivative thereof and tranexamic acid and / or epsilon aminocaproic acid (see JP 2007-169201 A). ).
  • protamines are generally used as food preservatives and are promising as alternatives to conventional fungicides and antibiotics because of their high safety.
  • protamine exhibits a growth inhibitory effect on Streptococcus mutans, which is a causative causative bacterium (see JP-A-11-228526), and an adhesion inhibitory effect on oral bacteria (see JP-A-2001-89436). It is disclosed. In addition, the present applicants have found that a hydrolyzate of protamine exhibits antifungal activity against fungi such as Candida that cause oral candidiasis (see JP 2008-133253 A).
  • protamine or its derivatives are known not only to exhibit antibacterial activity but also to suppress inflammation of periodontal disease, but until now, no growth inhibitory activity against periodontal pathogens has been known. .
  • protamine since protamine is water-soluble, it has been considered difficult to maintain a growth inhibitory action against periodontal pathogens in the oral cavity for a long time.
  • protamine is a kind of polycation, it is known to electrostatically bond with an anionic polymer to form a water-insoluble complex.
  • DNA obtained from the testis of fish has many phosphate groups as anionic binding elements in the DNA molecule, and exhibits electrostatic affinity for cationic substances. It is possible to form an electrostatic reactant with the cationic substance.
  • DNA molecules have poor formability and are water-soluble, so there was a difficulty in adjusting the metabolic diffusion rate in vivo, but by binding DNA molecules and cationic artificial lipids electrostatically, It is disclosed that a water-insoluble, self-supporting transparent film can be prepared (see JP-A-8-239398).
  • the DNA / lipid complex film disclosed in this publication has a DNA molecule that is a biopolymer holding a regular double helix structure, and various low molecules in the space between the DNA bases of the double helix structure. It is possible to intercalate a compound, and to groove bind the same low molecular weight compound to the two grooves (main groove and sub groove) of DNA, where the medicinal components are intercalated and / or grooved.
  • a method for producing a medical material by binding is invented (see JP 2001-327591 A).
  • chitosan which is already used as a medical and / or dental material, is a cationic substance, and the complex of DNA molecules and chitosan retains a DNA-specific double helix structure. And insoluble in water, invented to have biocompatibility, antibacterial properties, and good formability (see JP-A-2005-289252).
  • the DNA / chitosan complex is suspended in a phosphate buffer to easily form it into a thread, ball, or disk (see Japanese Patent Application Laid-Open No. 2007-97884), and pressure molding under heating To invent a method for producing a film (see Japanese Patent Application Laid-Open No. 2008-110852).
  • These DNA / chitosan complexes and molded products thereof are promising as medical and / or dental materials because they have excellent biocompatibility and biostability.
  • the present invention has been made in view of the above-described prior art, and a first object of the present invention is to provide a highly safe anti-periodontal disease fungus without worrying about side effects.
  • the purpose of is to provide dental materials and / or medical materials that exhibit antibacterial activity of periodontal pathogens, are insoluble in water, have good shapeability, and have high biocompatibility. .
  • the first invention in the first invention according to the present invention (hereinafter referred to as the first invention), protamine or its derivatives and hydrolysates exhibit antibacterial activity against periodontal disease bacteria. I found out. Protamine has already been used as a food preservative and is known to be highly safe for the human body, so it can be used as a substitute for conventional fungicides and antibiotics in the prevention and treatment of periodontal disease. It was found to be effective.
  • the complex of protamine or its derivative or hydrolyzate and anionic polymer exhibits antibacterial activity against periodontal disease bacteria.
  • they found that they were insoluble in water and excellent in shaping, and found that these complexes were effective for effective prevention and treatment of periodontal disease over a long period of time in the oral cavity, leading to the second invention. .
  • the third invention in the present invention (hereinafter referred to as the third invention), attention is paid to DNA as an anionic polymer in the second invention, and antibacterial action that could not be achieved by conventional DNA compounds and high biocompatibility. It has been found that it is promising as a dental material and / or a medical material.
  • the anti-periodontal fungus agent which is the first invention of the present invention is an anti-tooth which contains at least one of protamine, a derivative thereof or a hydrolyzate as an active ingredient and exhibits a growth inhibitory action against periodontal pathogens. It is a peri-pathogenic agent.
  • the anti-periodontal fungus agent according to the second invention of the present invention comprises a complex in which at least one active ingredient of protamine, a derivative thereof or a hydrolyzate and an anionic polymer are electrostatically bound. It is an anti-periodontal fungus agent characterized in that it is insoluble in water and has formability, and exhibits growth inhibitory action against periodontal pathogens.
  • the medical or dental material according to the third aspect of the present invention is a composite in which at least one active ingredient of protamine, a derivative thereof or a hydrolyzate is electrostatically bound to an anionic polymer. It is a medical or dental material characterized in that it is insoluble in water and has a formability, and exhibits growth inhibitory action against periodontal pathogens.
  • the protamine / DNA complex is excellent in biocompatibility and in-vivo stability, and in particular, is excellent in formability, so that periodontal tissue regeneration induction (GTR) film As a bone regeneration induction (GBR) method, it can be used as an antibacterial denture application agent, an antibacterial agent for oral cavity, a hemostatic agent, various hygiene products, and the like.
  • GTR periodontal tissue regeneration induction
  • protamine / DNA complex can intercalate or groove bind low molecular weight compounds, it retains drugs such as growth factors (b-FGF, BMP, etc.) and antibiotics, and the necessary parts such as affected areas.
  • DDS delivery system
  • a membrane, film, lined material, or coating material for a delivery system (DDS) that can be delivered to and delivered to.
  • DDS delivery system
  • medical materials such as scaffolding materials for regenerative medicine (scaffold materials), wound covering materials, infection prevention membranes, adhesion prevention membranes, transplantation materials, etc. It is also possible.
  • FIG. 3 is a diagram in which a protamine / DNA complex forms a blocking circle against Staphylococcus aureus (staphylococcus aureus).
  • FIG. 5 is a diagram in which a protamine / DNA complex forms a blocking circle for Escherichia coli (Escherichia coli).
  • FIG. 5 is a diagram in which a protamine / DNA complex forms a blocking circle against periodontal disease bacteria (Porphyromonas gingivalis).
  • FIG. 2 is a diagram in which a protamine / DNA complex forms a blocking circle against periodontal disease bacteria (Prevotella intermedia). It is the figure of the tissue section 3 days after implanting the protamine / DNA complex subcutaneously in the rat.
  • (A) is X-ray CT of the sagittal direction of a rat skull skeleton defect
  • (A) is the X-ray CT image of the sagittal direction of a rat skull skeleton defect
  • Protamine or its derivatives and hydrolysates exhibit antibacterial activity against at least one periodontal pathogen represented by Porphyromonas gingivalis and Prevotella intermedia, and should be used as an anti-periodontitis agent in the oral cavity
  • effects such as prevention, alleviation or treatment of periodontal disease can be obtained.
  • Protamine is a strongly basic protein that exists as nucleoprotamine bound to DNA in the sperm nuclei of fish such as salmon, herring, trout, and is called salmine (salmon), curpain (herring), etc., depending on the raw material. Any protamine can be used, although each has a slightly different structure.
  • the protamine derivative refers to a salt of protamine and an inorganic acid or an organic acid, an inorganic base, or a salt of an organic base.
  • the acid or base can be selected according to the use of the salt, but the following pharmaceutically acceptable salts are preferable in consideration of the use for foods, cosmetics, pharmaceuticals and the like.
  • the acid addition salt include hydrochloride, nitrate, sulfate, methanesulfonate, p-toluenesulfonate, and dicarboxylic acid such as oxalic acid, malonic acid, succinic acid, maleic acid, or fumaric acid.
  • salts with monocarboxylic acids such as acetic acid, propionic acid or butyric acid.
  • Inorganic bases suitable for forming a salt of the peptide compound obtained in the present invention are, for example, hydroxides such as ammonia, sodium, lithium, calcium, magnesium and aluminum, carbonates and bicarbonates.
  • Examples of salts with organic bases include mono-, di- and tri-alkylamine salts such as methylamine, dimethylamine and triethylamine, mono-, di- and tri-hydroxyalkylamine salts, guanidine salts, N- Examples thereof include methyl glucosamine salt.
  • the hydrolyzate of protamine is a product of protamine hydrolyzed with acid, alkali, proteolytic enzyme, or a combination thereof, and is preferably hydrolyzed using a proteolytic enzyme. More specifically, the hydrolysis method is as follows. Deionized water is added to protamine, and sodium hydroxide or hydrochloric acid is added to adjust the pH to the optimum pH of the enzyme. After warming to the optimal temperature of the enzyme, the enzyme is added and the enzyme reaction is carried out with stirring. After completion of the reaction, the reaction solution may be heated to 80 to 100 ° C. and inactivated by heating for 5 to 60 minutes to adjust the pH to a neutral range, and then the reaction solution may be lyophilized to obtain a protamine degradation product. it can.
  • protamine degradation product prepared by the above-described method a product obtained by completely decomposing protamine exhibits almost no antibacterial property, so it is desirable to partially decompose so that the molecular weight is distributed in the range of 500 to 4,000.
  • Bacillus eg, Bacillus subtilis, Bacillus thermoproteoticus, Bacillus licheniformis, etc.
  • Aspergillus genus eg Aspergillus oryzae, Aspergillus niger
  • Rhizopus for example, Rhizopus niveus, Rhizopus deremer
  • pepsin pancreatin, and papain.
  • Proteolytic enzymes are classified into endopeptidases that specifically recognize and cleave the internal sequence of proteins and exopeptidases that cleave 1-2 amino acid residues from the end. Therefore, if necessary, various peptide chains can be generated by a combination of endopeptidase and exopeptidase.
  • hydrolysis with an enzyme 0.001 to 10% of the enzyme is added to the substrate, and the solution is hydrolyzed at the optimum pH of the enzyme to be used.
  • the anti-periodontal fungus agent uses at least one of protamine, a protamine derivative, or a hydrolyzate of protamine as an active ingredient, and if necessary, secondary agents such as a carrier, a diluent, and various additives. It can also be provided as a composition with a component selected from the components.
  • the carrier or secondary component (typically pharmaceutically acceptable depending on the use) contained in the antibacterial agent against periodontal pathogens may vary depending on the use and form, but water, various Examples include organic solvents, various buffers and other fillers, extenders, binders, wetting agents, surfactants, excipients, dyes, and fragrances.
  • the anti-periodontal disease agent according to the present invention is a complex obtained as an electrostatic reaction product of at least one of protamine, a protamine derivative and a hydrolyzate of protamine as an active ingredient and an anionic polymer. It can be set as a form.
  • the complex has antibacterial activity against periodontal disease bacteria, is insoluble in water, and has formability.
  • a medical or dental material can be obtained using this composite.
  • anionic polymer used as the raw material of the complex examples include alginic acid, alginates or alginic acid derivatives, DNA, RNA, pectin, carrageenan, gellan gum, or polycarboxylic acid such as carboxymethyl cellulose, carboxymethyl amylose, and polyglutamic acid.
  • Anionic polyamino acids carboxymethyl starch, hyaluronic acid, polyacrylic acid, polymethacrylic acid, etc., as polysulfuric acid, dextran sulfate, heparin, heparan sulfate, chondroitin sulfate, keratan sulfate, dermatan sulfate, polyvinyl potassium sulfate, etc.
  • alginates or alginic acid derivatives include, but are not limited to, sodium alginate, propylene glycol alginate, and alginate oligo.
  • complexes using DNA as an anion retain a double helix structure peculiar to DNA in at least a part of the DNA forming the complex, and the complex has substantially no solubility in water.
  • This is a material that is particularly preferable as a medical or dental material.
  • Naturally-derived DNA and synthetic DNA can be used as the DNA.
  • naturally-derived DNA include bacterial ⁇ phage DNA, Escherichia coli chromosomal DNA, calf thymus DNA, salmon, herring, trout and other fish sperm DNA.
  • Synthetic DNA can be synthesized by a synthesizer using poly (dA), poly (dT), poly (dG), poly (dC), poly (dA-dT), poly (dG-dC), etc. Synthesized by a synthesis device using various synthetic DNAs with different base sequences: poly (A), poly (T), poly (G), poly (U), poly (AT), poly (GU), etc.
  • DNA / RNA such as poly (dG), poly (U), poly (G), poly (dC), poly (dA-dT), poly (AT), etc.
  • DNA / RNA hybrids having complementary base pairs that can be synthesized by a synthesizer using the hybrid. These can be used alone or in combination as required.
  • the molecular weight of DNA is not particularly limited as long as it has a certain degree of double helix structure.
  • DNA DNA of 10 bp to 30,000 bp can be used. However, if the molecular weight is too large, it is difficult to prepare an aqueous solution, and conversely, if the molecular weight is too small, the recovery rate of the complex is lowered. It is desirable to use DNA having a center of molecular weight distribution at 300 bp to 7,000 bp.
  • Such DNA has various groups (for example, phosphate-containing groups) on four types of bases [cytosine (C), guanine (G), adenine (A), thymine (T)] forming a double helix.
  • the whole DNA has an anionic property due to, for example, a phosphate group bonded to the above-mentioned terminal.
  • Such a DNA itself is a string having a double helix structure, and since this DNA dissolves in water, the DNA itself has no moldability.
  • a DNA / polycation complex can be obtained by electrostatically reacting an anionic DNA with a cationic polycation compound. By forming a complex in this manner, DNA is substantially not dissolved in water. Moreover, the solubility with respect to an organic solvent also becomes low.
  • a complex using DNA as an anion can be prepared by reacting DNA with at least one of protamine, a protamine derivative, and a protamine hydrolyzate in an aqueous medium. For example, these can be reacted by adding and mixing an aqueous solution of DNA to a stirring protamine aqueous solution.
  • the compounding ratio of at least one of DNA, protamine, protamine derivative and protamine hydrolyzate can be selected according to the use of this complex. For example, it can be selected from the range of 1/9 to 9/1, preferably 1/1 to 1 / 1.5 (weight ratio).
  • Precipitation of the complex occurs by reacting DNA with at least one of protamine, a protamine derivative and a protamine hydrolyzate in an aqueous medium.
  • the precipitate is washed with water or various buffer solutions, and further washed with water as necessary. Excess water is removed by centrifugation or the like, followed by drying to obtain a dried product of the complex. Drying can be performed by appropriately selecting a drying method according to the purpose, such as a room temperature drying method, a heat drying method, a freeze drying method, or a vacuum drying method.
  • Buffers for washing the precipitate include Tris buffer, borate buffer, HEPES buffer, acetate buffer, citrate buffer, glycine buffer, barbiturate buffer, phthalate buffer, cacodylate buffer Solution, carbonate buffer solution, Bis-Tris buffer solution, Bis-Tris-propane buffer solution, MES buffer solution, ADA buffer solution, PIPES buffer solution, ACES buffer solution, collamine chloride buffer solution, BES buffer solution, MOPS buffer solution, It can be selected from TES buffer, HEPPS buffer, Tricine buffer, glycinamide buffer, Bicine buffer, TAPS buffer, CHES buffer, CAPS buffer, phosphate buffer, and the like. The concentration and pH of the buffer solution can be freely selected so as to obtain the desired properties and physical properties of the DNA / protamine complex.
  • the composite dried material thus obtained is pulverized as necessary, and molded into various forms such as paste, gel, paste, string, rod, sphere, disk, and film according to the purpose. Can be used.
  • this complex the double helix structure of the DNA is almost completely left without being destroyed. Therefore, by using this complex, the function of the DNA can be stably and efficiently used.
  • a complex using DNA as an anion is prepared by adding an appropriate amount of water and kneading it in a mortar. It can be in a state where it can be easily molded.
  • a string-like molded product can be obtained by extruding a composite paste using DNA as an anion into a phosphate buffer solution using a syringe. Further, by filling a mold according to the purpose, it is possible to easily obtain molded products having various shapes such as a rod shape, a spherical shape, and a disk shape.
  • a film-like molded product of a complex using DNA as an anion can be obtained by pressurizing a dry powder of this complex, or a paste-like, rod-like, spherical, or disk-like molded product using a heating molding machine. . Furthermore, a transparent film can be easily formed by extending the protamine / DNA complex molded product thinly in a mortar.
  • the temperature at the time of producing the film using the above-mentioned heat molding machine can be variously set according to the film forming material, but is preferably selected from the range of room temperature (for example, 15 ° C. to 25 ° C.) to 120 ° C. be able to. Further, the press pressure at the time of film formation can be selected from the range of 2 to 20 MPa. The pressing time may be such that a film having desired physical properties can be obtained. If the temperature and the pressing pressure are as described above, film formation can be completed in, for example, 1 to 10 minutes. Preferably, by pressing for 5 to 10 minutes, a strong and difficult to tear film can be produced. The thickness of the film can be adjusted by the temperature, pressure, and pressing time during pressing. According to this method, a transparent composite film having a thickness of about 1 to 100 ⁇ m can be obtained.
  • the dental material according to the present invention can be used as a GTR film in a tissue regeneration induction (GTR) method for regenerating lost periodontal tissue.
  • a dental material including a complex using DNA as an anion is excellent in biocompatibility (compatibility) and is particularly preferable as a constituent component of the GTR film.
  • the GTR membrane is an environment forming material for shielding the epithelial tissue that proliferates at the defect site to regenerate alveolar bone, periodontal membrane, cementum and the like. Since this membrane is left in the living body for a certain period of time, it is preferably formed of a material having high biocompatibility, and more preferably has antibacterial properties against periodontal disease bacteria and the like.
  • an absorptive membrane based on collagen or polylactic acid and a non-absorbable membrane using a fluororesin are used.
  • a GTR membrane made of a complex film-like, gel-like, or paste-like shaped product using the DNA of the present invention as an anion has high biocompatibility and should be used stably over a long period of time compared to conventional membranes. Can do.
  • regeneration period can be set longer than the case where the conventional absorptive membrane is used.
  • the dental material according to the present invention can be used as an antibacterial application agent or a cleaning agent for dentures, for example, by forming a paste-like, gel-like, or paste-like shaped product.
  • a complex using DNA as an anion is excellent in stability in a living body, it can exhibit an antibacterial effect against periodontal bacteria and the like over a longer period than conventional denture application.
  • a part of the phosphate group which is an anionic group of DNA, and a cationic group of protamine are electrostatically bonded to express a desired formability.
  • many phosphate groups that are not bound to protamine remain in the DNA molecule.
  • the phosphate group in this DNA and electrostatically binding to a bone morphogenetic factor or a growth factor, it can be used as a carrier for these cytokines and antibiotics. It can also be used as a drug carrier by utilizing intercalation or groove binding due to a double helical structure of DNA.
  • bone morphogenetic factor and a growth factor there are no particular limitations as long as it can be supported on a complex using DNA as an anion.
  • bone morphogenetic protein BMP
  • rhBMP recombinant human bone morphogenetic protein
  • FGF fibroblast growth factor
  • TGF- ⁇ transforming growth factor beta
  • EGF epithelium Growth factor
  • IGF insulin-like growth factor
  • PDGF platelet-derived growth factor
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • NGF neurotrophic factor
  • a complex using DNA as an anion can be mixed with powdered or granular calcium phosphate by a method such as kneading to obtain an admixture having formability.
  • an appropriate amount of water or phosphate buffer can be added as necessary to form a paste with shapeability.
  • the calcium phosphate granules and powder can be shaped.
  • a complex of DNA and anions using calcium phosphate granules or powder can be formed into a free shape by filling a mold, and a complex shaped bone can be formed by filling a syringe and extruding it. It is also possible to fill the defect part.
  • this mixture is to induce or promote the formation of bone in the periodontal tissue regeneration therapy (specifically, alveolar bone, periodontal ligament, cementum) or bone formation in bone defects.
  • the present invention is not limited to these uses.
  • hydroxyapatite HA
  • tricalcium phosphate ⁇ -TCP
  • ⁇ -TCP calcium hydrogen phosphate dihydrate
  • DCPD calcium hydrogen phosphate dihydrate
  • OCP octacalcium phosphate
  • TeCP tetracalcium phosphate
  • CAP Carbonate apatite
  • a complex using DNA as an anion is formed not only as a dental material, but also as a film, a lining material, or a coating material, which is used as a scaffold for regenerative medicine (scaffold material), a wound covering material. Or, it can be used as an anti-adhesion film or anti-adhesion film to improve the biocompatibility when transplanted, or to suppress the biological reaction to foreign substances in the living body. Is also possible.
  • microorganisms and cells used in the following examples are publicly available.
  • Prevoterra intermedia ATCC25611
  • Porphyromonas gingivalis ATCC33277
  • mouse-derived fibroblast L-929 Example 3
  • MC3T3-E1 cell mouse-derived osteoblast-like cell
  • It is also publicly available from cell lines, microbial strains, and gene banks of Sumisho Pharma International.
  • Example 1 Antimicrobial activity of protamine hydrochloride and its hydrolyzate against periodontal bacteria
  • A Sample Protamine hydrochloride (proserve; manufactured by Maruha Nichiro Foods Co., Ltd.) derived from white eggs of white salmon (Oncorinka ketata), hydrolyzate of the above protamine hydrochloride by bromelain (manufactured by Amano Enzyme) ) (Manufactured by Maruha Nichiro Foods), and a hydrolyzate (samoyase degradation product) of protamine hydrochloride Samoaase (manufactured by Amano Enzyme) was used as a sample.
  • the samoyase degradation product was prepared by adding 80 mL of deionized water to 50 g of the above-mentioned reserve (manufactured by Maruha Nichiro Foods Co., Ltd.), adding sodium hydroxide to adjust the pH to 8.0, heating to 65 ° C., and then adding samoyase (( After the completion of the reaction, the reaction solution was heated to 95 ° C. and inactivated by heating for 30 minutes, and adjusted to pH 8.5. The reaction solution was prepared by lyophilization. At this time, the weight average molecular weight (Mw) of the decomposed product of Samoaase was 3,587 Da.
  • the number of bacteria is about 10 6 cfu using GAM bouillon medium (manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.). (Colony forming unit) / mL. The inoculum was streaked about 2 cm using a resin loop (inner diameter: about 1 mm) on the above sensitivity measurement plate, and anaerobically cultured at 37 ⁇ 1 ° C. for 5-7 days. The minimum growth inhibitory concentration (MIC) was defined as the lowest concentration at which bacterial growth was inhibited after culturing for a predetermined time. (C) Test results Table 1 shows the MIC results.
  • the MIC of the hydrolyzate of protamine was 1,250 ppm
  • protamine proserve
  • Example 2 Antimicrobial property of protamine / DNA complex
  • A Sample A 57% (w / v) aqueous solution of protamine sulfate derived from white salmon eggplant (Proserve; manufactured by Maruha Nichiro Foods Co., Ltd.) and DNA derived from white salmon eggplant (molecular weight distribution center is 300 bp, ) 0.5% (w / v) aqueous solution of Maruha Nichiro Foods) was used.
  • 0.875 g of an aqueous protamine sulfate solution was diluted with 100 mL of sterilized distilled water so that the weight of protamine sulfate and DNA was 1: 1, respectively, mixed with 100 mL of DNA solution, and stirred for 1 hour. After collecting the precipitate by centrifugation, the precipitate obtained by washing with water and centrifuging again was collected as a protamine / DNA complex (undried product). This protamine / DNA complex (undried product) was further freeze-dried to obtain 0.61 g of a protamine / DNA complex. The recovery rate of the protamine / DNA complex was 61% (w / w) by weight%.
  • the sample was pulverized, and an appropriate amount of water was added, and then the mold was filled. After releasing from the mold, it was freeze-dried again to prepare a disk-shaped sample having a diameter of about 5 mm and a thickness of about 1 mm.
  • B Antibacterial evaluation method The antibacterial test was qualitatively conducted by a growth inhibition zone formation test in which a sample was left on a medium such as agar smeared uniformly with a test bacterial solution to check for the presence or absence of bacterial growth inhibition. .
  • Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus
  • Escherichia coli Escherichia coli
  • periodontal disease bacteria Porphyromonas gingivalis and Prevotella intermedia. Both of these are publicly available.
  • C Test results The test results are shown in Figs. In contrast to S. aureus, a growth inhibition circle was observed around the protamine / DNA complex sample. A blocking circle was also observed around the sample for E. coli. Furthermore, a blocking circle was observed around the sample for two types of periodontal disease bacteria.
  • Example 3 Cytotoxicity test of protamine / DNA complex
  • A Sample A protamine / DNA complex prepared by the same method as in Example 2 (a) was used. The pulverized powder was sieved to collect a powder of 45 to 100 ⁇ m and used as a sample. The sample was used after radiation sterilization (1.9 sec, 20 KGy, Dynamitron, IBA).
  • B Cytotoxicity evaluation method Mouse-derived fibroblast L-929, which is publicly available, was used as the cell.
  • a cell suspension of 1 ⁇ 10 4 cells / mL was prepared in an ⁇ -MEM medium (Dulbecco's modified Eagle's medium) containing 10% fetal bovine serum (manufactured by Introgen), and a 6-well multiplate 2 mL was dispensed into each well. After culturing at 37 ° C. for 24 hours, the culture medium was replaced with 2 mL of ⁇ -MEM medium containing 1, 2, 4 mg of sample, and further cultured for 5 days. After culturing for 5 days, the culture broth was replaced with 2 mL of medium containing 0.4 mL of CellTiter 96 (R) Aqueous MTS (Promega Corp.), cultured at 37 ° C.
  • ⁇ -MEM medium Dulbecco's modified Eagle's medium
  • fetal bovine serum manufactured by Introgen
  • Example 4 Evaluation of biocompatibility of protamine / DNA complex
  • a protamine / DNA complex prepared by the same method as in Example 2 (a) was used.
  • the protamine / DNA complex was placed in a Teflon mold having an inner diameter of 5 mm and a thickness of 0.5 mm, freeze-dried with both sides sandwiched between Teflon plates, and a disk-shaped sample having a diameter of about 5 mm and a thickness of about 1 mm was prepared.
  • the sample was used after radiation sterilization (1.9 sec, 20 KGy, Dynamitron, IBA).
  • Example 5 Evaluation of protamine / DNA / carbonate apatite complex as an osteoblast growth scaffold
  • A Sample A protamine / DNA complex (undried product) prepared by the same method as in Example 2 (a) was mixed with 60% carbonate apatite and an appropriate amount of water on a weight basis, and mixed with a Teflon mold. Using this, a disk-shaped sample having an inner diameter of 5 mm and a thickness of 1 mm was prepared.
  • B Evaluation method The sample was immersed in an ⁇ -MEM medium and seeded with MC3T3-E1 cells. After culturing for 6 hours, the sample was taken out and the sample surface was washed with PBS buffer.
  • Example 6 Insertion test of protamine / DNA / carbonate apatite complex into rat skull skeleton defect
  • A Sample After adding 60% carbonate apatite on a weight basis to the protamine / DNA complex (undried product) prepared by the same method as in Example 2 (a), and mixing with an appropriate amount of water, Teflon mold was used to prepare a disc-shaped sample having an inner diameter of 5 mm and a thickness of 1 mm.
  • B Evaluation method A bone defect was formed on the skull of SP rat (specific pathogen free rat, male, 6 weeks old) with trephine bar (5 mm in diameter).
  • FIG. 9B Two months after sample implantation, sagittal images showed formation of bone-like tissue from the periphery of sample implantation toward the center (Fig. 10 (A)), and even coronal images 1.5 months later It was observed that a bone-like tissue was further formed (FIG. 10B).

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Abstract

　プロタミン、又はその誘導体、加水分解物のうち少なくとも１種を、あるいはプロタミン、又はその誘導体、加水分解物のうち少なくとも１種とアニオン性高分子との複合体を有効成分として医療用または歯科用材料を調製することにより、副作用の心配が無く安全性の高い抗歯周病菌剤、並びに、歯周病原菌の抗菌活性を示すことに加え、水に不溶で良好な賦形性を有する医療用または歯科用材料を提供することができる。

Description

抗歯周病菌剤及びそれを用いた医療用または歯科用材料
　本発明は、歯周病原菌に対し生育阻害活性を示すプロタミン、又はその誘導体、加水分解物を含む抗歯周病菌剤、並びに、それらとアニオン性高分子とから形成された複合体を含む抗歯周病菌剤及び医療用または歯科用材料に関する。
　歯周病は、複数の歯周病原菌の関与に加え、宿主の要因や喫煙などの生活習慣が原因となって発症し、日本国内の成人の約８０％が罹患していると言われている。歯周病は、歯の支持機能を低下させ、歯の喪失に伴う咀嚼機能障害による生活の質（ＱＯＬ）の低下を引き起こすだけでなく、心循環系疾患（心内膜炎、冠状動脈性心疾患）や肺炎、早産・低体重児出産などの全身疾患のリスクファクターになることが報告されている。従って、高齢化が進む日本等の多くの国の国民のＱＯＬの向上のみならず、他に臨床分野においても、歯周病の予防と治療が果たす役割は非常に大きい。
　歯周病の直接の原因は歯周病原菌そのもの、あるいは病原菌が産生するプロテアーゼであり、これらによって歯肉炎が起こり、さらに進行すると歯周組織にまで炎症が拡がり歯周炎となる。歯周病原菌はそのほとんどがグラム陰性偏性嫌気性細菌であり、代表的な病原菌としては、ポルフィロモナス　ジンジバリスやトレポネーマ　デンティコーラ、タンネレラ　フォーサイセンシス、プレボテラ　インターメディア、アグリゲイティバクター　アクチノミセテムコミタンス、などがある。
　現在、これらの歯周病原菌に対する抗菌剤として、βラクタム系、マクロライド系、キノロン系抗菌剤が使用されているが、その抗菌力にはそれぞれ特徴があるため、病原菌の種類や歯周病の進行具合に応じて、抗菌剤を選択或いは併用する必要があり、一方で投与量、投与回数が増えた場合には副作用の問題が生じる場合がある。そのため、実際に歯周炎治療の主体となっているのは、プラークや歯石、根表面の内毒素などの機械的除去や外科的な炎症性組織の切除などであり、抗菌剤の投与は歯周炎急性発作時を除いて、補助的な治療としてしか用いられていない。
　こうした背景の中、魚類の精巣（白子）から得られる塩基性タンパク質であるプロタミンが、ジンジバリス菌が産生するプロテアーゼであるアルジンジパインの阻害活性を示すことが報告されている（Kotani　M、他5名「Inhibitory　effects　of　protamines　on　proteolytic　and　adhesive　activities　of　Porphiromonas　gingivalis.」、Infection　Immunity、1999年、第67巻、第9号、p.4917-4920参照）。さらに、プロタミン又はその誘導体と、トラネキサム酸及び／又はイプシロンアミノカプロン酸とを含有させることで、歯周病原菌による歯周炎症を効果的に抑制できることが開示されている（特開２００７－１６９２０１号公報参照）。これらプロタミンは一般に食品保存料として用いられており、安全性が高いことから従来の殺菌剤、抗生剤に代わる薬剤として有望である。
　一方、プロタミンは齲触原因菌であるストレプトコッカス　ミュータンスに対する生育抑制効果（特開平１１－２２８５２６号公報参照）や、口腔内細菌の付着抑制効果（特開２００１－８９４３６号公報参照）を示すことが開示されている。また、本出願人らはプロタミンの加水分解物が口腔カンジダ症を引き起こすカンジダ属などの真菌に対して抗真菌活性を示すことを見出した（特開２００８－１３３２５３号公報参照）。
　このように、プロタミン又はその誘導体は抗菌作用を示すだけでなく、歯周病の炎症抑制作用も示すことが知られているが、これまでに歯周病原菌そのものに対する生育阻害作用は知られていない。また、プロタミンは水溶性であるために、口腔内において歯周病原菌に対する生育阻害作用を長時間維持することは困難であると考えられていた。
　一方、プロタミンはポリカチオンの一種であるため、アニオン性高分子と静電的に結合を生じ、水に不溶性の複合体を形成することが知られている。
　プロタミンと同じく魚類の精巣から得られるＤＮＡは、ＤＮＡ分子内にアニオン性の結合要素となるリン酸基を多数有しており、カチオン性物質に対して静電的な親和性を示すため、これらカチオン性物質と静電的な反応物を形成させることが可能である。本来、ＤＮＡ分子は賦形性に乏しく、水溶性であるために生体内での代謝拡散速度の調整に難点があったが、ＤＮＡ分子とカチオン性人工脂質を静電的に結合させることで、水不溶性、自己支持性の透明フィルムが調製可能であることが開示されている（特開平８－２３９３９８号公報参照）。
　また、この公報に開示されているＤＮＡ／脂質複合体フィルムは、生体高分子であるＤＮＡ分子が規則正しい二重螺旋構造を保持しており、二重螺旋構造のＤＮＡ塩基の隙間に種々の低分子化合物をインターカレートさせることや、ＤＮＡの持つ２つの溝（主溝、副溝）に同様の低分子化合物をグルーブバインディングさせることが可能であり、ここに薬効成分をインターカレート及び／又はグルーブバインディングさせることによる医療用材料の製造方法が発明されている（特開２００１－３２７５９１号公報参照）。
　本出願人らは、既に医療用及び／又は歯科用材料として利用されているキトサンがカチオン性物質であることに着目し、ＤＮＡ分子とキトサンの複合体がＤＮＡ特有の二重螺旋構造を保持し、且つ水に不溶性で、生体親和性、抗菌性、及び良好な賦形性を有することを発明した（特開２００５－２８９２５２２号公報参照）。また、ＤＮＡ／キトサン複合体をリン酸緩衝液中に懸濁することで、容易に糸状、ボール状、ディスク状に成型する方法（特開２００７－９７８８４号公報参照）、加熱下で加圧成型することによるフィルムの製造方法（特開２００８－１１０９５２号公報参照）を発明した。これらのＤＮＡ／キトサン複合体とその成型物は、優れた生体適合性と生体安定性を有するため医療用及び／又は歯科用材料として有望であった。
　しかしながら、ＤＮＡ／キトサン複合体はラット皮下に埋入したところ、埋入初期に急性炎症反応と見られる好中球の発生が確認されたこと、殺菌剤や抗生剤としての効果が十分でないことなどの問題を有していた。そのため、キトサンよりも優れた生体適合性と抗菌作用を示すカチオン性物質との複合体が望まれていた。特に、歯科の領域では歯周病菌に対する抗菌活性を有する素材の開発が望まれていた。
　本発明は上述した従来技術に鑑みてなされたものであり、本発明の第一の目的は副作用の心配が無く安全性の高い抗歯周病菌剤を提供することであり、本発明の第二の目的は歯周病原菌の抗菌活性を示すことに加え、水に不溶で良好な賦形性を有し、且つ高い生体適合性を有する歯科用材料及び／又は医療用材料を提供することである。
　本発明における第一の発明（以下、第一発明と記載する）では、本発明者らが鋭意研究を重ねた結果、プロタミン又はその誘導体や加水分解物が歯周病菌に対して抗菌活性を示すことを見出した。プロタミンは既に食品保存料として利用されている実績があり、人体への安全性が高いことが知られていることから、従来の殺菌剤、抗生剤に代わる素材として歯周病の予防及び治療に有効であることを知見した。
　本発明における第二の発明（以下、第二発明と記載する）では、プロタミン又はその誘導体や加水分解物とアニオン性高分子との複合体が、歯周病菌に対して抗菌活性を示すことに加え、水に不溶性で賦形性に優れることを見出し、これら複合体が口腔内で長期間にわたる効果的な歯周病の予防及び治療に有効であることを知見し、第二発明に至った。
　本発明における第三の発明（以下、第三発明と記載する）では、第二発明におけるアニオン性高分子としてＤＮＡに着目し、従来のＤＮＡ化合物では成し得なかった抗菌作用と、高い生体適合性を示すことを見出し、歯科用材料及び／又は医療用材料として有望であることを知見した。
　すなわち、本発明の第一発明である抗歯周病菌剤は、プロタミン、又はその誘導体、加水分解物のうち少なくとも１種を有効成分として含み、歯周病原菌に対して生育阻害作用を示す抗歯周病菌剤である。
　本発明の第二発明である抗歯周病菌剤は、プロタミン、又はその誘導体、加水分解物のうちの少なくとも１種の有効成分と、アニオン性高分子とが静電的に結合した複合体を含み、水に不溶で且つ賦形性を有し、歯周病原菌に対して生育阻害作用を示すことを特徴とする抗歯周病菌剤である。
　本発明の第三発明である医療用または歯科用材料は、プロタミン、又はその誘導体、加水分解物のうちの少なくとも１種の有効成分と、アニオン性高分子とが静電的に結合した複合体を含み、水に不溶で且つ賦形性を有し、歯周病原菌に対して生育阻害作用を示すことを特徴とする医療用または歯科用材料である。
　本発明によれば、口腔内の歯周病原菌の生育を直接阻害し、且つ人体への安全性が高いことから、歯周病の予防、治療剤として有効な抗歯周病菌剤を提供することができる。また、アニオン性高分子との化合物は、水不溶性で優れた賦形性を有することから、口腔内での長期間にわたり歯周病原菌の生育を効果的に阻害するものである。
　本発明に係る複合体の中で、プロタミン／ＤＮＡ複合体は、生体適合性及び生体内での安定性に優れる上に特に賦形性に優れているため、歯周組織再生誘導（ＧＴＲ）膜として、骨再生誘導（ＧＢＲ）法として、抗菌性義歯塗布剤として、その他口腔内用抗菌剤、止血剤、各種衛生用品などとしての利用が可能である。さらには、プロタミン／ＤＮＡ複合体が低分子化合物をインターカレーションあるいはグルーブバインディングすることができるため、成長因子（ｂ－ＦＧＦ、ＢＭＰなど）や抗生物質などの薬物を保持し、患部など必要な箇所に送達し、供給することのできる送達システム（ＤＤＳ）用のメンブレン、フィルム、ラインニング材、又はコーティング材として利用することができる。また、歯科用材料にとどまらず、再生医療用の足場材（スキャフォールド材）として、創傷被覆材料として、感染防止膜として、癒着防止膜として、移植材料としてなど、医療用材料として多岐に利用することも可能である。
プロタミン／ＤＮＡ複合体が黄色ブドウ球菌（スタフィロコッカス　アウレウス）に対し阻止円を形成した図である。 プロタミン／ＤＮＡ複合体が大腸菌（エシェリヒア　コリ）に対し阻止円を形成した図である。 プロタミン／ＤＮＡ複合体が歯周病菌（ポルフィロモナス　ジンジバリス）に対し阻止円を形成した図である。 プロタミン／ＤＮＡ複合体が歯周病菌（プレボテラ　インターメディア）に対し阻止円を形成した図である。 プロタミン／ＤＮＡ複合体をラット皮下に埋入した３日後の組織切片の図である。 プロタミン／ＤＮＡ複合体をラット皮下に埋入した１０日後の組織切片の図である。 プロタミン／ＤＮＡ／炭酸アパタイト複合体表面に付着した骨芽細胞を染色した図である。 プロタミン／ＤＮＡ／炭酸アパタイト複合体を埋入した１ヶ月後のラット頭骸骨欠損部のＸ線ＣＴ画像の図であり、（Ａ）はラット頭骸骨欠損部の矢状方向のＸ線ＣＴ画像の図であり、（Ｂ）はラット頭骸骨欠損部の冠状方向のＸ線ＣＴ画像の図である。 プロタミン／ＤＮＡ／炭酸アパタイト複合体を埋入した１．５ヶ月後のラット頭骸骨欠損部のＸ線ＣＴ画像の図であり、（Ａ）はラット頭骸骨欠損部の矢状方向のＸ線ＣＴ画像の図であり、（Ｂ）はラット頭骸骨欠損部の冠状方向のＸ線ＣＴ画像の図である。 プロタミン／ＤＮＡ／炭酸アパタイト複合体を埋入した２ヶ月後のラット頭骸骨欠損部のＸ線ＣＴ画像の図であり、（Ａ）はラット頭骸骨欠損部の矢状方向のＸ線ＣＴ画像の図であり、（Ｂ）はラット頭骸骨欠損部の冠状方向のＸ線ＣＴ画像の図である。
　次に、本発明について詳細に説明する。
　プロタミン又はその誘導体、加水分解物は、ポルフィロモナス　ジンジバリスやプレボテラ　インターメディアに代表される少なくとも一種の歯周病原菌に対して抗菌活性を示すものであり、口腔内で抗歯周病菌剤として用いることで歯周病の予防、緩和、あるいは治療などの効果を得ることができる。
　プロタミンは、サケ、ニシン、マス等魚類の***核中にＤＮＡと結合したヌクレオプロタミンとして存在する強塩基性蛋白質であり、原料の違いによって、例えばサルミン（サケ）、クルペイン（ニシン）等と称され、それぞれ若干構造も異なるが、何れのプロタミンも使用可能である。
　プロタミン誘導体は、プロタミンと無機酸、もしくは有機酸との塩や無機塩基、若しくは有機塩基との塩を指す。酸や塩基としては、塩の用途に応じて選択できるが、食品、化粧品、医薬品などへの用途を考慮すると、以下に挙げる薬学的に許容される塩が好ましい。酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硝酸塩、硫酸塩、メタンスルホン酸塩、p－トルエンスルホン酸塩、更にはシュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、またはフマル酸等のジカルボン酸との塩、更に、酢酸、プロピオン酸、または酪酸等のモノカルボン酸との塩等を挙げる事ができる。又、本発明で得られるペプチド化合物の塩の形成に適した無機塩基は、例えば、アンモニア、ナトリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、アルミニウム等の水酸化物、炭酸塩及び重炭酸塩等である。有機塩基との塩としては、例えば、メチルアミン、ジメチルアミン、トリエチルアミンの様なモノ－、ジ－及びトリ－アルキルアミン塩、モノ－、ジ－及びトリ－ヒドロキシアルキルアミン塩、グアニジン塩、Ｎ－メチルグルコサミン塩等を挙げる事ができる。
　プロタミンの加水分解物は、プロタミンを酸、アルカリ、蛋白質分解酵素、又はそれらの組合せにより加水分解したものであるが、蛋白質分解酵素を用いて加水分解することが望ましい。加水分解の方法は、より詳細には次の通りである。プロタミンに脱イオン水を加え、水酸化ナトリウム又は塩酸を加えてｐＨを酵素の至適ｐＨに調整する。酵素の至適温度に加温した後、酵素を添加して、攪拌しながら酵素反応を行う。反応終了後、反応液を８０～１００℃に加温して５～６０分間加熱失活させｐＨを中性域となるように調整後、反応液を凍結乾燥し、プロタミン分解物を得ることができる。
　上述の方法により調製したプロタミン分解物では、プロタミンを完全に分解したものは抗菌性を殆ど示さないため、分子量が５００～４，０００の範囲に分布するように部分分解することが望ましい。
　プロタミンの加水分解に用いることのできる蛋白質分解酵素としては、例えばバシラス属（例えばバシラス　サチリス、バシラス　サーモプロテオティカス、バシラス　リシェニフォルミスなど）の産生する酵素、アスペルギルス属（例えばアスペルギルス　オリーゼ、アスペルギルス　ニガー、アルペルギルス　メレンスなど）の産生する酵素、リゾパス属（例えばリゾパス　ニベウス、リゾパス　デレマーなど）の産生する酵素、ペプシン、パンクレアチン、パパイン等が挙げられる。これらの酵素は単独、又は２種以上を組み合わせても良い。また、蛋白質分解酵素は、蛋白質の内部配列を特異的に認識して切断するエンドペプチダーゼと、末端から１～２アミノ酸残基ずつ切断するエキソペプチダーゼに分類される。従って、必要に応じて、エンドペプチダーゼとエキソペプチダーゼの組合せにより、様々なペプチド鎖を生成させることが可能である。酵素により加水分解する場合には、基質に対して、酵素０．００１～１０％を添加し、溶液を使用される酵素の至適ｐＨとして加水分解する。
　本発明にかかる抗歯周病菌剤は、プロタミン又はプロタミン誘導体、あるいはプロタミンの加水分解物の少なくとも１種を有効成分として用い、必要に応じて、担体、希釈剤、各種添加剤などの副次的成分から選択された成分とともに組成物として提供することもできる。歯周病原菌に対する抗菌剤に含まれる担体又は副次的成分（典型的には用途に応じて薬学的に許容され得るもの）としては、用途や形態に応じて適宜異なり得るが、水、種々の有機溶媒、種々の緩衝液その他充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、表面活性剤、賦形剤、色素、香料等が挙げられる。
　次に、本発明にかかる抗歯周病菌剤は、有効成分であるプロタミン、プロタミン誘導体及びプロタミンの加水分解物の少なくとも１種と、アニオン性高分子との静電的反応物として得られる複合体としての形態とすることができる。当該複合体は歯周病菌に対する抗菌活性を有し、さらに水に不溶であり、かつ賦形性を有する。この複合体を用いて医療用または歯科用材料を得ることができる。
　上述した複合体の原料となるアニオン性高分子としては、アルギン酸、アルギン酸塩類若しくはアルギン酸誘導体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペクチン、カラギーナン、ジェランガム、またはポリカルボン酸としては、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルアミロース、ポリグルタミン酸などのアニオン性ポリアミノ酸、カルボキシメチルスターチ、ヒアルロン酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸等が、ポリ硫酸としては、デキストラン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸、ポリビニル硫酸カリウム等の中から選択可能であり、これらのうち一つ乃至は複数の化合物を選択することができる。アルギン酸塩類若しくはアルギン酸誘導体としては、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸プロピレングリコールエステル、アルギン酸オリゴなどを例示できるが、これらに限定されるわけではない。
　これらの中でアニオンとしてＤＮＡを用いた複合体は、複合体を形成するＤＮＡの少なくとも一部にＤＮＡ特有の二重螺旋構造が保持されており、且つ当該複合体が、水に対する溶解性を実質的に有しておらず、更に生体適合性を有しており、医療用または歯科用材料として特に好ましい材料である。
　ＤＮＡとしては、天然由来ＤＮＡ及び合成ＤＮＡを利用することができる。天然由来ＤＮＡとしては、細菌ウイルスのλファージＤＮＡ、大腸菌染色体ＤＮＡ、仔牛胸腺ＤＮＡ、サケ、ニシン、マスなど魚類***ＤＮＡを挙げることができる。また、合成ＤＮＡは、ポリ（ｄＡ）、ポリ（ｄＴ）、ポリ（ｄＧ）、ポリ（ｄＣ）、ポリ（ｄＡ－ｄＴ）、ポリ（ｄＧ－ｄＣ）などを用いて合成装置によって合成可能な、塩基配列の異なる種々の合成ＤＮＡ；ポリ（Ａ）、ポリ（Ｔ）、ポリ（Ｇ）、ポリ（Ｕ）、ポリ（Ａ－Ｔ）、ポリ（Ｇ－Ｕ）などを用いて合成装置により合成可能な、塩基配列の異なる種々の合成ＲＮＡ；ポリ（ｄＧ）、ポリ（Ｕ）、ポリ（Ｇ）、ポリ（ｄＣ）、ポリ（ｄＡ－ｄＴ）、ポリ（Ａ－Ｔ）などのＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを用いて合成装置によって合成可能な、相補的塩基対を有するＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを挙げることができる。これらは必要に応じて単独であるいは組み合わせて使用することができる。
　ＤＮＡの分子量は特に制限されず、ある程度の二重螺旋構造を保持していれば良い。ＤＮＡの分子量としては、１０ｂｐ～３０，０００ｂｐのＤＮＡを用いることができるが、分子量が大きすぎると水溶液の調製が困難となり、逆に分子量が小さすぎると複合体の回収率が低くなるため、好ましくは３００ｂｐ～７，０００ｂｐに分子量分布の中心を持つＤＮＡを用いることが望ましい。
　このようなＤＮＡは、二重らせんを形成している四種類の塩基［シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ)］に種々の基（例えばリン酸含有基を末端に有する基）などが結合した構造を有しており、このＤＮＡ全体としては、例えば上記の末端に結合したリン酸基などに起因してアニオン性を示す。
　このようなＤＮＡ自体は、二重らせん構造を有する紐状物であり、また、このＤＮＡは水に溶解することから、このＤＮＡ自体に成形性はない。ＤＮＡがアニオン性を有していることを利用して、アニオン性のＤＮＡと、カチオン性のポリカチオン化合物とを静電的に反応させることでＤＮＡ／ポリカチオン複合体を得ることができる。このようにして複合体となることで、ＤＮＡは実質的に水に溶解しなくなる。また、有機溶剤に対する溶解性も低くなる。
　ＤＮＡをアニオンとして用いた複合体は、ＤＮＡと、プロタミン、プロタミン誘導体及びプロタミン加水分解物の少なくとも１種を、水性媒体中で反応させることにより調製することができる。例えば、ＤＮＡの水溶液を、攪拌しているプロタミン水溶液に添加して混合することによりこれらを反応させることができる。
　ＤＮＡと、プロタミン、プロタミン誘導体及びプロタミン加水分解物の少なくとも１種の配合比は、この複合体の用途に応じて選択することができる。例えば、１／９から９／１、好ましくは１／１から１／１．５（重量比）の範囲から選択することができる。
　ＤＮＡと、プロタミン、プロタミン誘導体及びプロタミン加水分解物の少なくとも１種を水性媒体中で反応させることにより複合体の沈殿を生じる。この沈殿を水あるいは各種の緩衝液で洗浄し、必要に応じて、更に水洗し、余分な水分を遠心分離などで除去してから、乾燥することで複合体の乾燥物を得ることができる。乾燥は、常温乾燥法、加熱乾燥法、凍結乾燥法、減圧乾燥法など目的に応じた乾燥方法を適宜選択して行うことができる。
　沈殿の洗浄用の緩衝液としては、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、グリシン緩衝液、バルビツール酸緩衝液、フタル酸緩衝液、カコジル酸緩衝液、炭酸緩衝液、Ｂｉｓ－トリス緩衝液、Ｂｉｓ－トリスープロパン緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、ＡＤＡ緩衝液、ＰＩＰＥＳ緩衝液、ＡＣＥＳ緩衝液、コラミンクロリド緩衝液、ＢＥＳ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、ＴＥＳ緩衝液、ＨＥＰＰＳ緩衝液、Ｔｒｉｃｉｎｅ緩衝液、グリシンアミド緩衝液、Ｂｉｃｉｎｅ緩衝液、ＴＡＰＳ緩衝液、ＣＨＥＳ緩衝液、ＣＡＰＳ緩衝液、リン酸緩衝液などの中から選択することができる。緩衝液の濃度やｐＨも目的とするＤＮＡ／プロタミン複合体の性状や物性が得られるように自由に選択することができる。
　このようにして得られた複合体乾燥物を必要に応じて粉砕し、目的に応じてペースト状、ゲル状、糊状、紐状、棒状、球状、ディスク状、フィルム状など様々な形態に成型して利用することができる。この複合体では、ＤＮＡの二重らせん構造が破壊されずにほぼ完全に残されているので、この複合体を用いることでＤＮＡの機能を安定して効率良く利用することが可能となる。
　ＤＮＡをアニオンとして用いた複合体は、これに例えば適量の水を加えて乳鉢で錬和することにより、その錬和する時間に応じてペースト状、ゲル状、さらに粘着性を示す糊状などの容易に成型可能な状態とすることができる。
　さらに、ＤＮＡをアニオンとして用いた複合体のペースト状物を、シリンジを用いてリン酸緩衝液中に押し出すことにより、紐状の成型物が得られる。また、目的に応じたモールドに充填することによって、容易に棒状、あるいは球状、ディスク状などの各種の形状の成型物を得ることができる。
　ＤＮＡをアニオンとして用いた複合体のフィルム状成型物は、この複合体の乾燥粉末、あるいはペースト状、棒状、球状、ディスク状成型物を、加熱成型機を用いて加圧することにより得ることができる。さらには、上記プロタミン／ＤＮＡ複合体成型物を、乳鉢で薄く延ばしてやることによっても、容易に透明のフィルムを成型することができる。
　上記の加熱成型機を用いたフィルムの作成時の温度は、フィルム成形用材料に応じて種々設定可能であるが、好ましくは室温（例えば、１５℃～２５℃）～１２０℃の範囲から選択することができる。また、フィルム成形時のプレス圧は、２～２０ＭＰａの範囲から選択することができる。加圧時間は、所望の物性のフィルムが得られる程度でよく、上記の温度およびプレス圧であれば、例えば１～１０分間でフィルム化を完了することができる。好ましくは、５～１０分間プレスすることにより、丈夫で破れにくいフィルムを作製可能である。フィルムの厚さは、プレス時の温度、圧、加圧時間により調節することが可能であり、本方法によれば、１～１００μｍ程度の膜厚の透明な複合体フィルムを得ることもできる。
　本発明にかかる歯科用材料は、喪失された歯周組織の再生を図る組織再生誘導（ＧＴＲ）法において、ＧＴＲ膜として利用することができる。中でも、ＤＮＡをアニオンとして用いた複合体を含む歯科用材料は、生体親和性（適合性）に優れ、ＧＴＲ膜の構成成分として特に好ましい。ＧＴＲ膜は、欠損部位において先行増殖をする上皮組織から遮蔽して、歯槽骨、歯根膜、セメント質などの再生を図るための環境形成材料である。このメンブレンは、一定期間、生体中に留置されるので、生体親和性の高い素材で形成されていることが好ましく、さらには歯周病菌などに対する抗菌性を有していることがさらに好ましい。こうしたメンブレンとしては、コラーゲンあるいはポリ乳酸を基材とした吸収性のメンブレンとフッ素樹脂を使用した非吸収性メンブレンが使用されている。本発明にかかるＤＮＡをアニオンとして用いた複合体のフィルム状、あるいはゲル状、糊状賦形物から成るＧＴＲ膜は、生体親和性が高く、従来のメンブレンよりも長期間にわたって安定に使用することができる。また、本発明の歯科用の材料を用いて製造されたＧＴＲメンブレンを使用すれば、再生期間を従来の吸収性メンブレンを用いた場合よりも長く設定することができる。
　更に、本発明にかかる歯科用材料は、例えばペースト状あるいはゲル状、糊状の賦形物を形成することによって、義歯などへの抗菌性塗布剤、あるいは洗浄剤として利用することができる。中でも、ＤＮＡをアニオンとして用いた複合体は生体内での安定性に優れるため、従来の義歯剤塗布よりも長期間にわたって歯周病菌などに対する抗菌効果を発揮することができる。
　ＤＮＡをアニオンとして用いた複合体では、ＤＮＡの有するアニオン性基であるリン酸基の一部と、プロタミンの有するカチオン性基とが静電的に結合して所望の賦形性を発現させているが、ＤＮＡ分子中にはプロタミンに結合していない多数のリン酸基が残存している。このＤＮＡ中のリン酸基を活用して、骨形成因子または成長因子と静電的に結合させて、これらサイトカインや抗生物質などのキャリアーとして使用することもできる。また、ＤＮＡの二重螺旋構造によるインターカレーションやグルーブバインディングを利用して、薬剤のキャリアーとすることもできる。
　骨形成因子及び成長因子としては、ＤＮＡをアニオンとして用いた複合体に担持可能であれば特に制限なく利用できる。例えば、骨形成因子としては骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、組換えヒト骨形成タンパク質（ｒｈＢＭＰ）を、成長因子としては線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦ―β）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、神経栄養因子（ＮＧＦ）などを挙げることができ、これらの少なくとも１種を用いることができる。
　また、ＤＮＡをアニオンとして用いた複合体を、粉末状または顆粒状のリン酸カルシウムと、練り込みなどの方法により混合することにより、賦形性を有する混和物を得ることができる。この混和物の形成においては、必要に応じて適量の水分またはリン酸緩衝液を追加して賦形性のあるペースト状とすることができる。この混和物の形成によってリン酸カルシウムの顆粒や粉末に賦形性を持たせることが出来る。即ち、ＤＮＡをアニオンとして用いた複合体とリン酸カルシウム顆粒また粉末の練和物は、モールドに充填することで自由な形に成形可能で、またシリンジに充填して押し出すことで、複雑な形状の骨欠損部にも充填することが可能である。また、ペースト状の混和物を所望の形状とした後に乾燥処理をして、混和物の所望の形状を固定することもできる。この混和物は、歯周組織再生療法における歯周組織（具体的には歯槽骨、歯根膜、セメント質）の再生誘導剤もしくは再生促進剤、あるいは骨欠損部における骨形成の誘導もしくは促進を目的とした骨補填材としての応用が可能であるが、これらの用途に限定されるものではない。
　リン酸カルシウムとしては、ハイドロキシアパタイト（ＨＡ）、リン酸三カルシウム（α－ＴＣＰ，β－ＴＣＰ）、リン酸水素カルシウム二水和物（ＤＣＰＤ）、リン酸八カルシウム（ＯＣＰ）、リン酸四カルシウム（ＴｅＣＰ）、炭酸アパタイト（ＣＡＰ）などを挙げることができ、これらの少なくとも１種を用いることができる。
　また、ＤＮＡをアニオンとして用いた複合体は、上記の歯科用材料としてだけではなく、フィルム、ライニング材、コーティング材に形成し、これを再生医療用の足場材（スキャフォールド材）、創傷被覆材料、あるいは感染防止膜や癒着防止膜として用いることにより、移植した際の生体親和性を向上させたり、あるいは生体の異物に対する生体反応を抑制するようにしたことを特徴とする医療用材料としての利用も可能である。
　次に実施例を示して本発明を実施するための最良の形態について、詳細に記載するが、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。なお、以下の実施例において用いた微生物及び細胞は公的入手可能である。例えば、プレボテラ　インターメディア（ＡＴＣＣ２５６１１）、ポルフィロモナス　ジンジバリス（ＡＴＣＣ３３２７７、マウス由来繊維芽細胞Ｌ－９２９（実施例３）、ＭＣ３Ｔ３‐Ｅ１細胞（マウス由来骨芽細胞様細胞）（実施例５）として、住商ファーマインターナショナル(株)の細胞株・微生物株・遺伝子バンクからも公的に入手可能である。
　〔実施例１〕
（プロタミン塩酸塩、及びその加水分解物の歯周病菌に対する抗菌活性）
（ａ）試料
　シロサケ（オンコリンカス　ケタ）の白子由来のプロタミン塩酸塩（プロザーブ；（株）マルハニチロ食品製）、上記プロタミン塩酸塩のブロメライン（(株)天野エンザイム製）による加水分解物（ＨＡＰ１００；(株)マルハニチロ食品製）、同じくプロタミン塩酸塩のサモアーゼ（(株)天野エンザイム製）による加水分解物（サモアーゼ分解物）を試料として用いた。尚、サモアーゼ分解物は、上記プロザーブ（（株）マルハニチロ食品製）５０ｇに脱イオン水８０ｍＬを加え、水酸化ナトリウムを加えてｐＨ８．０に調製した後、６５℃に加温してサモアーゼ（（株）天野エンザイム製）０．４ｇを添加して２時間攪拌しながら酵素反応を行い、反応終了後に反応液を９５℃に加温して３０分間加熱失活させｐＨ８．５に調整した後、反応液を凍結乾燥して調製した。このとき、サモアーゼ分解物の重量平均分子量（Ｍｗ）は３，５８７Ｄａであった。
（ｂ）抗菌活性の判定方法
　精製水を用いて試料の２倍（ｗ／ｖ）希釈系列溶液を調製し、次に、滅菌・溶解後５０±１℃に保ったＰＥＡカブルセラＨＫ寒天培地（極東製薬工業(株)製）に各希釈系列溶液をそれぞれ１／９量加えて十分に混合後、シャーレに分注、固化させて感受性測定用平板とした。次に、ポルフィロモナス　ジンジバリスＪＣＭ８５２５を増菌用培地で３７±１℃、５～７日間嫌気培養後、ＧＡＭブイヨン培地（日水製薬(株)製）を用いて、菌数が約１０６ｃｆｕ　（ｃｏｌｏｎｙ　ｆｏｒｍｉｎｇ　ｕｎｉｔ）／ｍＬとなるように調整し、接種用菌液とした。
上記の感受性測定用平板に接種用菌液を樹脂製ループ（内径約１ｍｍ）を用いて２ｃｍ程度画線塗抹し、３７±１℃、５～７日間嫌気培養した。所定時間培養後、菌の発育が阻止された最低濃度をもって最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）とした。
（ｃ）試験結果
　ＭＩＣの結果を表１に示す。その結果、プロタミンの加水分解物（ブロメライン分解物及びサモアーゼ分解物）のＭＩＣは１，２５０ｐｐｍ、プロタミン(プロザーブ)は６２５ｐｐｍであり、プロザーブは分解物よりも高い効果を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　〔実施例２〕（プロタミン／ＤＮＡ複合体の抗菌性）
（ａ）試料
　シロサケの白子由来のプロタミン硫酸塩（プロザーブ；(株)マルハニチロ食品製）の５７％（ｗ／ｖ）水溶液と、同じくシロサケの白子由来のＤＮＡ（分子量分布の中心が３００ｂｐ、(株)マルハニチロ食品製）の０．５％（ｗ／ｖ）水溶液を用いた。それぞれプロタミン硫酸塩とＤＮＡの重量が１：１となるように、プロタミン硫酸塩水溶液０．８７５ｇを１００ｍＬの滅菌蒸留水で希釈し、ＤＮＡ溶液１００ｍＬと混合して１時間攪拌した。遠心分離により沈殿物を回収した後、水洗して再度遠心分離して得られた沈殿物をプロタミン／ＤＮＡ複合体（未乾燥品）として回収した。このプロタミン／ＤＮＡ複合体（未乾燥品）を更に凍結乾燥し、プロタミン／ＤＮＡ複合体０．６１ｇを得た。尚、プロタミン／ＤＮＡ複合体の回収率は、重量％で６１％（ｗ／ｗ）であった。試料を粉砕し、水を適量添加した後にモールドに填入した。離型後に再度凍結乾燥し、直径約５ｍｍ、厚さ約１ｍｍの円盤状の試料を作成した。
（ｂ）抗菌性の評価方法
　抗菌試験は、試験菌液を均一に塗抹した寒天等の培地に試料を静置し、細菌の発育阻止の有無を見る発育阻止帯形成試験で定性的に行った。抗菌性を評価した菌は、黄色ブドウ球菌（スタフィロコッカス　アウレウス）、大腸菌（エシェリヒア　コリ）、歯周病菌（ポルフィロモナス　ジンジバリス、及びプレボテラ　インターメディア）である。これらはいずれも公的に入手可能である。
（ｃ）試験結果
　試験結果を図１～４に示す。黄色ブドウ球菌に対し、プロタミン／ＤＮＡ複合体試料の周辺に菌の生育阻止円が観察された。また、大腸菌に対しても、試料周辺に阻止円が観察された。さらに、２種類の歯周病菌に対し、試料周辺に阻止円が観察された。
　〔実施例３〕（プロタミン／ＤＮＡ複合体の細胞毒性試験）
（ａ）試料
　実施例２（ａ）と同じ方法で調製したプロタミン／ＤＮＡ複合体を用いた。粉砕した粉末を篩にかけて４５～１００μｍの粉末を回収し、試料とした。尚、試料は放射線滅菌(１．９ｓｅｃ、２０ＫＧｙ、Ｄｙｎａｍｉｔｒｏｎ、ＩＢＡ)して用いた。
（ｂ）細胞毒性の評価方法
　細胞は、公的に入手可能なマウス由来繊維芽細胞Ｌ－９２９を使用した。１０％ウシ胎児血清（イントロゲン(株)製）を含むα－ＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　ｍｅｄｉｕｍ）にて１×１０４ｃｅｌｌ／ｍＬの細胞浮遊液を作成し、６ウェルマルチプレートの各ウェルに２ｍＬずつ分注した。３７℃で２４時間培養後、培養液を、試料１、２、４ｍｇを含むα－ＭＥＭ培地２ｍＬと交換し、さらに５日間培養した。５日間培養後、培養液を０．４ｍＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ　９６（Ｒ）　Ａｑｕｅｏｕｓ　ＭＴＳ（プロメガ(株)）を含む培地２ｍＬと交換し、３７℃で２時間培養した後、４９２ｎｍの吸光度を測定して細胞生存率（試料未添加の対照群に対する比率）を求めた。尚、試験はｎ＝５で行い、平均を取った。
（ｃ）試験結果
　細胞毒性試験の結果を表２に示す。０．５～２．０ｍｇ／ｍＬの濃度において細胞生存率は非常に高く、プロタミン／ＤＮＡ複合体は細胞毒性を示さないことが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　〔実施例４〕（プロタミン／ＤＮＡ複合体の生体親和性の評価）
（ａ）試料
　実施例２（ａ）と同じ方法で調製したプロタミン／ＤＮＡ複合体を用いた。プロタミン／ＤＮＡ複合体を内径５ｍｍ、厚さ０．５ｍｍのテフロンモールドに入れ、両面をテフロン板で挟んで凍結乾燥し、直径約５ｍｍ、厚さ約１ｍｍの円盤状の試料を作成した。試料は放射線滅菌（１．９ｓｅｃ、２０ＫＧｙ、Ｄｙｎａｍｉｔｒｏｎ、ＩＢＡ）して用いた。
（ｂ）生体適合性の評価方法
　ＳＰＦラット（ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｐａｔｈｏｇｅｎ　ｆｒｅｅ　ｒａｔ、オス、６週齢）の背部皮下を切開し、試料を埋入した。一定期間（３、１０日）の後、組織を採取しＨＥ染色した（ヘマトキシリン　エオジン染色）。
（ｃ）試験結果
　結果の組織図を図５、６に示す。埋入３日後、試料は周囲を肉芽組織に囲まれた状態で皮下組織に存在し、周囲の正常組織とは完全に分画されていた。埋入した試料は断片化され小片（塊）として存在し、小片周囲には僅かに好中球浸潤が確認されたが、これらの所見は試料埋入による極めて軽度の生体の急性炎症反応と考えられた。また、試料埋入に伴う感染などの惹起は確認されなかった。埋入１０日後、皮下の埋入部は全て肉芽組織に置換された。多核巨細胞の貪食反応による埋入試料の断片化が進み、組織学的には典型的な異物肉芽腫の像を呈していた。肉芽組織は線維化が進んでおり、将来的には埋入材料が消失し、完全な器質化（線維性結合組織への置換）により反応が終了することが推測された。埋入３、１０日後の組織学的観察において、使用したプロタミン／ＤＮＡ複合体の生体に対する親和性は、極めて良好であることが示唆された。
　〔実施例５〕（プロタミン／ＤＮＡ／炭酸アパタイト複合体の骨芽細胞増殖足場材としての評価）
（ａ）試料
　実施例２（ａ）と同じ方法で調製したプロタミン／ＤＮＡ複合体（未乾燥品）に対し、重量ベースで６０％の炭酸アパタイトと適量の水を加えて混和し、テフロンモールドを用いて内径５ｍｍ、厚さ１ｍｍの円盤状の試料を作成した。
（ｂ）評価方法
　試料をα―ＭＥＭ培地に浸し、ＭＣ３Ｔ３‐Ｅ１細胞を播種した。６時間培養した後、試料を取り出し、ＰＢＳバッファーで試料表面を洗浄した。その後、試料に接着した細胞をアクチン染色した。
（ｃ）試験結果
　蛍光染色した細胞の画像を図７に示す。細胞がプロタミン／ＤＮＡ／炭酸アパタイト複合体表面に接着している様子が観察され、当該複合体が骨芽細胞増殖の足場となることが確認された。
　〔実施例６〕（プロタミン／ＤＮＡ／炭酸アパタイト複合体のラット頭骸骨欠損部への埋入試験）
（ａ）試料
　実施例２（ａ）と同じ方法で調製したプロタミン／ＤＮＡ複合体（未乾燥品）に対し、重量ベースで６０％の炭酸アパタイトを加え、適量の水とともに混和した後、テフロンモールドを用いて内径５ｍｍ、厚さ１ｍｍの円盤状の試料を作成した。
（ｂ）評価方法
　ＳＰラット（ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｐａｔｈｏｇｅｎ　ｆｒｅｅ　ｒａｔ、オス、６週齢）の頭骸骨にトレフィンバー（直径５ｍｍ）にて骨欠損を形成した。試料を埋入し、埋入１ヶ月後、１．５ヶ月後および２ヶ月後にラットを屠殺して、それぞれＸ線ＣＴ装置（ＳｃａｎＸｍａｔｅ‐ＲＢ０９０ＳＳ１５０、コムスキャンテクノ社製）を用いて頭骸骨欠損部の断層画像を撮影し、骨形成過程の進行の有無を確認した。
（ｃ）試験結果
　試料埋入１ヵ月後、矢状方向および冠状方向のＣＴスキャン画像で不透画像が認められ、骨様組織が形成されていた（図８（Ａ）及び（Ｂ））。試料埋入１．５ヵ月後、矢状方向の画像では１ヵ月後と差は認められなかった（図９（Ａ））が、冠状方向の画像からは１ヵ月後よりも骨様組織の形成が進行している様子が観察された（図９（Ｂ））。試料埋入２ヵ月後、矢状方向の画像で試料埋入周辺部から中心部へ向って骨様組織の形成が認められ（図１０（Ａ））、冠状方向の画像でも１．５ヵ月後よりもさらに骨様組織が形成されている様子が観察された（図１０（Ｂ））。

Claims (10)

  1. 　プロタミン、又はその誘導体、加水分解物のうち少なくとも１種を有効成分として含み、歯周病原菌に対して生育阻害作用を示す抗歯周病菌剤。
  2. 　プロタミン、又はその誘導体、加水分解物のうちの少なくとも１種の有効成分と、アニオン性高分子とが静電的に結合した複合体を含み、水に不溶で且つ賦形性を有し、歯周病原菌に対して生育阻害作用を示すことを特徴とする抗歯周病菌剤。
  3. 　前記有効成分が、ポルフィロモナス　ジンジバリス及びプレボテラ　インターメディアに対して生育阻害作用を示す請求項１または２に記載の抗歯周病菌剤。
  4. 　プロタミン、又はその誘導体、加水分解物のうちの少なくとも１種の有効成分と、アニオン性高分子とが静電的に結合した複合体を含み、水に不溶で且つ賦形性を有すことを特徴とする医療用または歯科用材料。
  5. 　前記アニオン性高分子がＤＮＡであり、生体適合性を有し、該ＤＮＡに薬効成分をインターカレート及び／又はグルーブバインディングにより取り込み可能である請求項４に記載の医療用または歯科用材料。
  6. 　前記アニオン性高分子がＤＮＡであり、さらにリン酸カルシウムを含む請求項４に記載の医療用または歯科用材料。
  7. 　骨欠損部または歯槽骨欠損部への充填を可能とする賦形性を有する請求項６に記載の医療用または歯科用材料。
  8. 　骨形成因子または成長因子を担持させた請求項６または７に記載の医療用または歯科用材料。
  9. 　ＤＮＡに、薬効成分が取り込まれている請求項４から８のいずれかに記載の医療用または歯科用材料。
  10. 　前記有効成分が、ポルフィロモナス　ジンジバリス及びプレボテラ　インターメディアに対して生育阻害作用を示す請求項４～９のいずれかに記載の医療用または歯科用材料。
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